KR20160144431A - 메토트렉세이트 선택과 연결된 슬리핑 뷰티 트랜스포존에 의한 조작된 t-세포의 생산 - Google Patents

메토트렉세이트 선택과 연결된 슬리핑 뷰티 트랜스포존에 의한 조작된 t-세포의 생산 Download PDF

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KR20160144431A
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selection
sequence
alternatives
concentration range
cells
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KR1020167031069A
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마이클 씨. 젠센
수지에 푼
나탈리 카체로브스키
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시애틀 칠드런즈 호스피탈 디/비/에이 시애틀 칠드런즈 리서치 인스티튜트
유니버시티 오브 워싱톤
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Abstract

본원에서 설명되는 본 발명의 측면은 바이러스 또는 암세포에 의해 제시되는 분자에 대한 수용체를 갖는 유전자 조작된 인간 T-세포를 이용하는, 대상체에서 바이러스 또는 암세포를 치료, 억제, 개선 및/또는 제거하는 방법을 포함하고, 여기서 유전자 조작된 T 세포는 증가하는 농도의 MTX를 사용하는 2단계 MTX 선택을 이용하여 단리된다.

Description

메토트렉세이트 선택과 연결된 슬리핑 뷰티 트랜스포존에 의한 조작된 T-세포의 생산{PRODUCTION OF ENGINEERED T-CELLS BY SLEEPING BEAUTY TRANSPOSON COUPLED WITH METHOTREXATE SELECTION}
관련 출원에 대한 교차 참조
본원은 2014년 10월 2일 출원된 미국 특허 가출원 62/058,973, 2014년 4월 10일 출원된 미국 특허 가출원 61/977,751, 2014년 4월 30일 출원된 미국 특허 가출원 61/986,479, 2014년 12월 9일 출원된 미국 특허 가출원 62/089,730, 2014년 12월 11일 출원된 미국 특허 가출원 62/090845, 및 2014년 12월 5일 출원된 미국 특허 가출원 62/088,363을 기초로 한 우선권을 주장한다. 상기 언급된 출원의 전체 개시내용은 그 전부가 본원에 명백하게 참고로 포함된다.
서열 목록, 표 또는 컴퓨터 프로그램 목록의 참조
본원은 전자 포맷의 서열 목록과 함께 제출된다. 서열 목록은 크기가 4 kb인, 2015년 3월 20일 생성된 SCRI.077PR.TXT로 명명된 파일로서 제공된다. 서열 목록의 전자 포맷의 정보는 그 전부가 본원에 참고로 포함된다.
발명의 분야
본원에서 설명되는 본 발명의 측면은 바이러스 또는 암세포에 의해 제시되는 분자에 대한 수용체를 갖는 유전자 조작된 인간 T-세포를 이용하는, 대상체에서 바이러스 또는 암세포를 치료, 억제, 개선 및/또는 제거하는 방법을 포함한다.
조작된 인간 T-세포는 암 면역요법 및 바이러스 요법을 위한 유망한 치료 경로이다. T-세포 증식, 생존, 또는 종양 지향성 (tumor homing)을 향상시키기 위해 추가의 유전자와 조합된 키메라 항원 수용체를 발현하는 T-세포는 효능을 추가로 개선할 수 있지만, 다수의 안정한 유전자 전달 이벤트를 필요로 할 수 있다. 따라서, 유전자 조작된 다중화 (multiplexed) 세포에 대한 생산 효율을 증가시키는 방법이 필요하다. T-세포의 효율적이고 안정한 형질도입은 뉴클레오펙션 (nucleofection)에 의해 도입되는 미니서클 (minicircle)에 슬리핑 뷰티 트랜스포존 시스템을 사용하여 달성될 수 있다. 대사 억제에 저항성인 돌연변이체 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFRdm)를 발현하는 세포에 대해 메토트렉세이트 (MTX)를 사용한 형질도입 세포의 신속한 선택도 달성될 수 있다.
발명의 개요
바람직하게는 바이러스 또는 암세포에 의해 제시되는 분자에 특이적인 수용체 또는 키메라 수용체를 코딩하는 다수의 트랜스진 (transgene)을 발현하는 T 세포의 우선적인 증폭을 위한 방법이 본원에서 설명된다. 일부 대안에서, 형질전환된 T 세포에 대한 선택 압력은 증가하는 농도의 MTX를 이용하는 2단계 MTX 선택에서 적용된다.
한 대안에서, 핵산의 올리고뉴클레오티드 내로의 안정한 삽입을 위한 유전자 전달 폴리뉴클레오티드가 제공되고, 여기서 삽입을 위한 핵산은 유전자 전달 폴리뉴클레오티드 내의 역위 말단 반복체 유전자 서열의 측면에 위치하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 선택가능하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 제1 역위 말단 반복체 (inverted terminal repeat) 유전자 서열을 포함하는 제1 서열, 제2 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제2 서열, 프로모터 영역 서열을 포함하는 제3 서열, 단백질을 코딩하거나 mRNA 전사를 위한 서열을 코딩하는 적어도 하나의 유전자를 포함하고, 최적화된 제4 서열, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체를 코딩하는 적어도 하나의 선택가능 마커 카세트를 포함하고, 여기서 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 메토트렉세이트에 대해 15,000배 또는 약 15,000배 감소된 친화도를 갖고, 메토트렉세이트는 적어도 하나의 유전자를 발현하는 세포의 비를 향상시키기 위해 유전자 전달 폴리뉴클레오티드로 형질도입된 세포를 선택하기 위해 사용될 수 있는 것인, 최적화된 제5 서열, 제1 부착 부위 (attP)를 포함하는 제6 서열, 제2 부착 부위 (attB)를 포함하는 제7 서열을 포함하고, 여기서 각각의 제1 서열, 제2 서열, 제3 서열, 제4 서열, 제5 서열, 제6 서열, 및 제7 서열은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, 제1 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제1 서열의 3' 말단은 제3 서열의 5' 말단에 인접하고, 제3 서열의 3' 말단은 제4 서열의 5' 말단에 인접하고, 제4 서열의 3' 말단은 제5 서열의 5' 말단에 인접하고, 제5 서열의 3' 말단은 제2 역위 말단 반복체를 포함하는 제2 서열의 5' 말단에 인접한다. 일부 대안에서, 인간 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체를 코딩하는 유전자는 다음 DNA 서열을 포함한다:
Figure pct00001
일부 대안에서, 인간 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 다음 단백질 서열을 포함한다:
Figure pct00002
일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 환상이다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 적어도 1 kB 내지 5 kB이다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 미니서클이다. 일부 대안에서, 프로모터 영역은 EF1 프로모터 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제4 서열은 단백질을 코딩하는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 유전자를 포함한다. 일부 대안에서, 제4 서열은 제4 서열의 총 GC/AT 비를 감소시키기 위해 코돈 최적화된다. 일부 대안에서, 제4 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화에 의해 최적화된다. 일부 대안에서, 제4 서열은 다수의 관련 단백질을 코딩하는 다수의 핵산으로부터 생성된 컨센서스 서열이다. 일부 대안에서, 제4 서열은 다수의 관련 단백질, 예컨대 동일한 에피토프에 특이적인 다수의 항체 결합 도메인을 코딩하는 다수의 핵산으로부터 생성된 컨센서스 서열이다. 일부 대안에서, 다수의 관련 단백질은 다수의 항체 결합 도메인을 포함하고, 다수의 항체 결합 도메인은 동일한 에피토프에 대해 특이적이다. 일부 대안에서, 제5 서열은 인간에서의 발현을 위해 및/또는 제5 서열의 총 GC/AT 비를 감소시키기 위해 코돈 최적화된다. 바람직한 대안에서, 제5 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화에 의해 최적화된다. 일부 대안에서, 단백질은 요법을 위한 단백질이다. 일부 대안에서, 코돈 최적화 및/또는 컨센서스 서열은 다수의 관련 서열에서 이용되는 서열 및/또는 핵염기의 가변성을 비교함으로써 생성된다. 일부 대안에서, 단백질은 항체 또는 그의 일부를 포함하고, 이것은 인간화될 수 있다. 일부 대안에서, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 L22F 및 F31S의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일부 대안에서, T 세포는 전구체 T 세포이다. 일부 대안에서, 전구체 T 세포는 조혈 줄기 세포이다.
일부 대안에서, 입양 (adoptive) T-세포 면역요법을 위한 유전자 조작된 다중화 T-세포의 생성 방법이 제공되고, 여기서 방법은 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 T-세포 내로 도입하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 제공하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 T-세포 내로 도입하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 선택하고, 여기서 선택은 제1 라운드의 선택 및 제2 라운드의 선택을 포함하고, 제1 라운드의 선택은 선택 시약을 제1 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 라운드의 선택은 선택 시약을 제2 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 더 높고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 적어도 1.5배 더 높고, 선택 압력 하에 표현형을 발현하는 T-세포를 단리하는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 제1 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제1 서열, 제2 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제2 서열, 프로모터 영역 서열을 포함하는 제3 서열, 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 유전자를 포함하고, 최적화된 제4 서열, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체를 코딩하는 적어도 하나의 선택가능 마커 카세트를 포함하고, 여기서 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 메토트렉세이트에 대해 15,000배 또는 약 15,000배 감소된 친화도를 갖고, 메토트렉세이트는 유전자 전달 폴리뉴클레오티드로 형질도입된 세포를 선택적으로 증폭하기 위해 선택 메카니즘으로서 사용될 수 있는 것인, 최적화된 제5 서열, 제1 부착 부위 (attP)를 포함하는 제6 서열, 제2 부착 부위 (attB)를 포함하는 제7 서열을 포함하고, 여기서 각각의 제1 서열, 제2 서열, 제3 서열, 제4 서열, 제5 서열, 제6 서열, 및 제7 서열은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, 제1 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제1 서열의 3' 말단은 제3 서열의 5' 말단에 인접하고, 제3 서열의 3' 말단은 제4 서열의 5' 말단에 인접하고, 제4 서열의 3' 말단은 제5 서열의 5' 말단에 인접하고, 제5 서열의 3' 말단은 제2 역위 말단 반복체를 포함하는 제2 서열의 5' 말단에 인접한다. 일부 대안에서, 인간 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체를 코딩하는 유전자는 다음 DNA 서열을 포함한다:
Figure pct00003
일부 대안에서, 인간 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 다음 단백질 서열을 포함한다:
Figure pct00004
일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 환상이다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 적어도 1 kB 내지 5 kB이다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 미니서클이다. 일부 대안에서, 프로모터 영역은 EF1 프로모터 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제4 서열은 단백질을 코딩하는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 유전자를 포함한다. 일부 대안에서, 제4 서열은 제4 서열의 총 GC/AT 비를 감소시키기 위해 코돈 최적화된다. 일부 대안에서, 제4 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화에 의해 최적화된다. 일부 대안에서, 제4 서열은 다수의 관련 단백질을 코딩하는 다수의 핵산으로부터 생성된 컨센서스 서열이다. 일부 대안에서, 제4 서열은 다수의 관련 단백질, 예컨대 동일한 에피토프에 특이적인 다수의 항체 결합 도메인을 코딩하는 다수의 핵산으로부터 생성된 컨센서스 서열이다. 일부 대안에서, 다수의 관련 단백질은 다수의 항체 결합 도메인을 포함하고, 다수의 항체 결합 도메인은 동일한 에피토프에 대해 특이적이다. 일부 대안에서, 제5 서열은 제5 서열의 총 GC/AT 비를 감소시키기 위해 코돈 최적화된다. 일부 대안에서, 제5 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화에 의해 최적화된다. 일부 대안에서, 단백질은 요법을 위한 단백질이다. 일부 대안에서, 코돈 최적화 및/또는 컨센서스 서열은 다수의 관련 서열에서 이용되는 서열 및/또는 핵염기의 가변성을 비교함으로써 생성된다. 일부 대안에서, 단백질은 항체 또는 그의 일부를 포함하고, 이것은 인간화될 수 있다. 일부 대안에서, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 L22F 및 F31S의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일부 대안에서, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 L22F 및 F31S의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일부 대안에서, 도입은 전기천공에 의해 수행된다. 일부 대안에서, 선택은 선택 마커 카세트를 통해 선택 압력을 증가시킴으로써 수행된다. 일부 대안에서, 선택 시약은 선택제를 포함한다. 일부 대안에서, 선택제는 메토트렉세이트이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 50 nM - 100 nM이고, 제2 농도 범위는 적어도 75 내지 150 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도는 50 nM, 60 nM, 70 nM, 80 nM, 90 nM, 또는 100 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이고, 제2 농도 범위는 75 nM, 80 nM, 90 nM, 100 nM, 110 nM, 120 nM, 130 nM, 140 nM, 또는 150 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 75 nM - 150 nM이고, 제2 농도 범위는 적어도 112.5 nM 내지 225 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도는 75 nM, 85 nM, 95 nM, 105 nM, 115 nM, 125 nM, 135 nM, 145 nM, 또는 150 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이고, 제2 농도 범위는 112 nM, 122 nM, 132 nM, 142 nM, 152 nM, 162 nM, 172 nM, 182 nM, 192 nM, 202 nM, 212 nM, 또는 225 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 300 nM - 675 nM이고, 제1 농도 범위는 적어도 450 nM 내지 1012 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도는 300 nM, 350 nM, 400 nM, 450 nM, 500 nM, 550 nM, 600 nM, 650 nM, 또는 675 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이고, 제2 농도 범위는 450 nM, 500 nM, 550 nM, 600 nM, 650 nM, 700 nM, 750 nM, 800 nM, 850 nM, 900 nM, 1000 nM, 또는 1012 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이다. 일부 대안에서, 제1 라운드의 선택은 T-세포를 제2 라운드의 선택 전에 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 라운드의 선택은 T-세포를 단리 전에 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14일 또는 상기 언급된 시점 중 임의의 2개에 의해 규정된 시간 범위 내인 임의의 시간 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 대안에서, T 세포는 전구체 T 세포이다. 일부 대안에서, 전구체 T 세포는 조혈 줄기 세포이다.
일부 대안에서, T-세포에서 단백질 생산을 증가시키는 방법이 제공되고, 여기서 방법은 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 제공하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 T-세포 내로 도입하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 선택하고, 여기서 선택은 제1 라운드의 선택 및 제2 라운드의 선택을 포함하고, 제1 라운드의 선택은 선택 시약을 제1 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 라운드의 선택은 선택 시약을 제2 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 더 높고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 적어도 1.5배 더 높고, 선택 압력 하에 표현형을 발현하는 T-세포를 단리하는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 제1 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제1 서열, 제2 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제2 서열, 프로모터 영역 서열을 포함하는 제3 서열, 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 유전자를 포함하고, 최적화된 제4 서열, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체를 코딩하는 적어도 하나의 선택가능 마커 카세트를 포함하고, 여기서 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 메토트렉세이트에 대해 15,000배 또는 약 15,000배 감소된 친화도를 갖고, 메토트렉세이트는 유전자 전달 폴리뉴클레오티드로 형질도입된 세포를 선택적으로 증폭하기 위해 선택 메카니즘으로서 사용될 수 있는 것인, 최적화된 제5 서열, 제1 부착 부위 (attP)를 포함하는 제6 서열, 제2 부착 부위 (attB)를 포함하는 제7 서열을 포함하고, 여기서 각각의 제1 서열, 제2 서열, 제3 서열, 제4 서열, 제5 서열, 제6 서열, 및 제7 서열은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, 제1 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제1 서열의 3' 말단은 제3 서열의 5' 말단에 인접하고, 제3 서열의 3' 말단은 제4 서열의 5' 말단에 인접하고, 제4 서열의 3' 말단은 제5 서열의 5' 말단에 인접하고, 제5 서열의 3' 말단은 제2 역위 말단 반복체를 포함하는 제2 서열의 5' 말단에 인접한다. 일부 대안에서, 인간 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체를 코딩하는 유전자는 다음 DNA 서열을 포함한다:
Figure pct00005
일부 대안에서, 인간 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 다음 단백질 서열을 포함한다:
Figure pct00006
일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 환상이다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 적어도 1 kB 내지 5 kB이다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 미니서클이다. 일부 대안에서, 프로모터 영역은 EF1 프로모터 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제4 서열은 단백질을 코딩하는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 유전자를 포함한다. 일부 대안에서, 제4 서열은 제4 서열의 총 GC/AT 비를 감소시키기 위해 코돈 최적화된다. 일부 대안에서, 제4 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화에 의해 최적화된다. 일부 대안에서, 제4 서열은 다수의 관련 단백질을 코딩하는 다수의 핵산으로부터 생성된 컨센서스 서열이다. 일부 대안에서, 제4 서열은 다수의 관련 단백질, 예컨대 동일한 에피토프에 특이적인 다수의 항체 결합 도메인을 코딩하는 다수의 핵산으로부터 생성된 컨센서스 서열이다. 일부 대안에서, 다수의 관련 단백질은 다수의 항체 결합 도메인을 포함하고, 다수의 항체 결합 도메인은 동일한 에피토프에 대해 특이적이다. 일부 대안에서, 제5 서열 제5 서열의 총 GC/AT 비를 감소시키기 위해 코돈 최적화된다. 일부 대안에서, 제5 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화에 의해 최적화된다. 일부 대안에서, 단백질은 요법을 위한 단백질이다. 일부 대안에서, 코돈 최적화 및/또는 컨센서스 서열은 다수의 관련 서열에서 이용되는 서열 및/또는 핵염기의 가변성을 비교함으로써 생성된다. 일부 대안에서, 단백질은 항체 또는 그의 일부를 포함하고, 이것은 인간화될 수 있다. 일부 대안에서, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 L22F 및 F31S의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일부 대안에서, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 L22F 및 F31S의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일부 대안에서, 도입은 전기천공에 의해 수행된다. 일부 대안에서, 선택은 선택 마커 카세트를 통해 선택 압력을 증가시킴으로써 수행된다. 일부 대안에서, 선택 시약은 선택제를 포함한다. 일부 대안에서, 선택제는 메토트렉세이트이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 50 nM - 100 nM이고, 제2 농도 범위는 적어도 75 내지 150 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도는 50 nM, 60 nM, 70 nM, 80 nM, 90 nM, 또는 100 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이고, 제2 농도 범위는 75 nM, 80 nM, 90 nM, 100 nM, 110 nM, 120 nM, 130 nM, 140 nM, 또는 150 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 75 nM - 150 nM이고, 제2 농도 범위는 적어도 112.5 nM 내지 225 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도는 75 nM, 85 nM, 95 nM, 105 nM, 115 nM, 125 nM, 135 nM, 145 nM, 150 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이고, 제2 농도 범위는 112 nM, 122 nM, 132 nM, 142 nM, 152 nM, 162 nM, 172 nM, 182 nM, 192 nM, 202 nM, 212 nM, 또는 225 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 300 nM - 675 nM이고, 제2 농도 범위는 적어도 450 nM 내지 1012 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도는 300 nM, 350 nM, 400 nM, 450 nM, 500 nM, 550 nM, 600 nM, 650 nM, 또는 675 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이고, 제2 농도 범위는 450 nM, 500 nM, 550 nM, 600 nM, 650 nM, 700 nM, 750 nM, 800 nM, 850 nM, 900 nM, 1000 nM, 또는 1012 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이다. 일부 대안에서, 제1 라운드의 선택은 T-세포를 제2 라운드의 선택 전에 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 라운드의 선택은 T-세포를 단리 전에 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14일 또는 상기 언급된 시점 중 임의의 2개에 의해 규정된 시간 범위 내인 임의의 시간 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 대안에서, T 세포는 전구체 T 세포이다. 일부 대안에서, 전구체 T 세포는 조혈 줄기 세포이다.
일부 대안에서, 임의의 하나의 방법에 의해 생성된 입양 T-세포 면역요법을 위한 유전자 조작된 다중화 T-세포가 제공된다. 일부 대안에서, 입양 T-세포 면역요법을 위한 유전자 조작된 다중화 T-세포는 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 T-세포 내로 도입하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 제공하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 T-세포 내로 도입하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 선택하고, 여기서 선택은 제1 라운드의 선택 및 제2 라운드의 선택을 포함하고, 제1 라운드의 선택은 선택 시약을 제1 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 라운드의 선택은 선택 시약을 제2 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 더 높고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 적어도 1.5배 더 높고, 선택 압력 하에 표현형을 발현하는 T-세포를 단리하는 것을 포함하는 방법에 의해 생성된다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 제1 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제1 서열, 제2 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제2 서열, 프로모터 영역 서열을 포함하는 제3 서열, 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 유전자를 포함하고, 최적화된 제4 서열, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체를 코딩하는 적어도 하나의 선택가능 마커 카세트를 포함하고, 여기서 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 메토트렉세이트에 대해 15,000배 또는 약 15,000배 감소된 친화도를 갖고, 메토트렉세이트는 유전자 전달 폴리뉴클레오티드로 형질도입된 세포를 선택적으로 증폭하기 위해 선택 메카니즘으로서 사용될 수 있는 것인, 최적화된 제5 서열, 제1 부착 부위 (attP)를 포함하는 제6 서열, 제2 부착 부위 (attB)를 포함하는 제7 서열을 포함하고, 여기서 각각의 제1 서열, 제2 서열, 제3 서열, 제4 서열, 제5 서열, 제6 서열, 및 제7 서열은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, 제1 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제1 서열의 3' 말단은 제3 서열의 5' 말단에 인접하고, 제3 서열의 3' 말단은 제4 서열의 5' 말단에 인접하고, 제4 서열의 3' 말단은 제5 서열의 5' 말단에 인접하고, 제5 서열의 3' 말단은 제2 역위 말단 반복체를 포함하는 제2 서열의 5' 말단에 인접한다. 일부 대안에서, 인간 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체를 코딩하는 유전자는 다음 DNA 서열을 포함한다:
Figure pct00007
일부 대안에서, 인간 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 다음 단백질 서열을 포함한다:
Figure pct00008
일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 환상이다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 적어도 1 kB 내지 5 kB이다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 미니서클이다. 일부 대안에서, 프로모터 영역은 EF1 프로모터 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제4 서열은 단백질을 코딩하는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 유전자를 포함한다. 일부 대안에서, 제4 서열은 제4 서열의 총 GC/AT 비를 감소시키기 위해 코돈 최적화된다. 일부 대안에서, 제4 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화에 의해 최적화된다. 일부 대안에서, 제4 서열은 다수의 관련 단백질을 코딩하는 다수의 핵산으로부터 생성된 컨센서스 서열이다. 일부 대안에서, 제4 서열은 다수의 관련 단백질, 예컨대 동일한 에피토프에 특이적인 다수의 항체 결합 도메인을 코딩하는 다수의 핵산으로부터 생성된 컨센서스 서열이다. 일부 대안에서, 다수의 관련 단백질은 다수의 항체 결합 도메인을 포함하고, 다수의 항체 결합 도메인은 동일한 에피토프에 대해 특이적이다. 일부 대안에서, 제5 서열은 제5 서열의 총 GC/AT 비를 감소시키기 위해 코돈 최적화된다. 일부 대안에서, 제5 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화에 의해 최적화된다. 일부 대안에서, 단백질은 요법을 위한 단백질이다. 일부 대안에서, 코돈 최적화 및/또는 컨센서스 서열은 다수의 관련 서열에서 이용되는 서열 및/또는 핵염기의 가변성을 비교함으로써 생성된다. 일부 대안에서, 단백질은 항체 또는 그의 일부를 포함하고, 이것은 인간화될 수 있다. 일부 대안에서, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 L22F 및 F31S의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일부 대안에서, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 L22F 및 F31S의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일부 대안에서, 도입은 전기천공에 의해 수행된다. 일부 대안에서, 선택은 선택 마커 카세트를 통해 선택 압력을 증가시킴으로써 수행된다. 일부 대안에서, 선택 시약은 선택제를 포함한다. 일부 대안에서, 선택제는 메토트렉세이트이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 50 nM - 100 nM이고, 제2 농도 범위는 적어도 75 내지 150 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도는 50 nM, 60 nM, 70 nM, 80 nM, 90 nM, 또는 100 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이고, 제2 농도 범위는 75 nM, 80 nM, 90 nM, 100 nM, 110 nM, 120 nM, 130 nM, 140 nM, 또는 150 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 75 nM - 150 nM이고, 제2 농도 범위는 적어도 112.5 nM 내지 225 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도는 75 nM, 85 nM, 95 nM, 105 nM, 115 nM, 125 nM, 135 nM, 145 nM, 또는 150 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이고, 제2 농도 범위는 112 nM, 122 nM, 132 nM, 142 nM, 152 nM, 162 nM, 172 nM, 182 nM, 192 nM, 202 nM, 212 nM, 또는 225 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 300 nM - 675 nM이고, 제1 농도 범위는 적어도 450 nM 내지 1012 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도는 300 nM, 350 nM, 400 nM, 450 nM, 500 nM, 550 nM, 600 nM, 650 nM, 또는 675 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이고, 제2 농도 범위는 450 nM, 500 nM, 550 nM, 600 nM, 650 nM, 700 nM, 750 nM, 800 nM, 850 nM, 900 nM, 1000 nM, 또는 1012 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이다. 일부 대안에서, 제1 라운드의 선택은 T-세포를 제2 라운드의 선택 전에 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 라운드의 선택은 T-세포를 단리 전에 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14일 또는 상기 언급된 시점 중 임의의 2개에 의해 규정된 시간 범위 내인 임의의 시간 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 제1 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제1 서열, 제2 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제2 서열, 프로모터 영역 서열을 포함하는 제3 서열, 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 유전자를 포함하고, 최적화된 제4 서열, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체를 코딩하는 적어도 하나의 선택가능 마커 카세트를 포함하고, 여기서 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 메토트렉세이트에 대해 15,000배 또는 약 15,000배 감소된 친화도를 갖고, 메토트렉세이트는 유전자 전달 폴리뉴클레오티드로 형질도입된 세포를 선택적으로 증폭하기 위해 선택 메카니즘으로서 사용될 수 있는 것인, 최적화된 제5 서열, 제1 부착 부위 (attP)를 포함하는 제6 서열, 제2 부착 부위 (attB)를 포함하는 제7 서열을 포함하고, 여기서 각각의 제1 서열, 제2 서열, 제3 서열, 제4 서열, 제5 서열, 제6 서열, 및 제7 서열은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, 제1 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제1 서열의 3' 말단은 제3 서열의 5' 말단에 인접하고, 제3 서열의 3' 말단은 제4 서열의 5' 말단에 인접하고, 제4 서열의 3' 말단은 제5 서열의 5' 말단에 인접하고, 제5 서열의 3' 말단은 제2 역위 말단 반복체를 포함하는 제2 서열의 5' 말단에 인접한다. 일부 대안에서, 인간 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체를 코딩하는 유전자는 다음 DNA 서열을 포함한다:
Figure pct00009
일부 대안에서, 인간 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 다음 단백질 서열을 포함한다:
Figure pct00010
일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 환상이다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 적어도 1 kB 내지 5 kB이다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 미니서클이다. 일부 대안에서, 프로모터 영역은 EF1 프로모터 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제4 서열은 단백질을 코딩하는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 유전자를 포함한다. 일부 대안에서, 제4 서열은 제4 서열의 총 GC/AT 비를 감소시키기 위해 코돈 최적화된다. 일부 대안에서, 제4 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화에 의해 최적화된다. 일부 대안에서, 제4 서열은 다수의 관련 단백질을 코딩하는 다수의 핵산으로부터 생성된 컨센서스 서열이다. 일부 대안에서, 제4 서열은 다수의 관련 단백질, 예컨대 동일한 에피토프에 특이적인 다수의 항체 결합 도메인을 코딩하는 다수의 핵산으로부터 생성된 컨센서스 서열이다. 일부 대안에서, 다수의 관련 단백질은 다수의 항체 결합 도메인을 포함하고, 다수의 항체 결합 도메인은 동일한 에피토프에 대해 특이적이다. 일부 대안에서, 제5 서열은 제5 서열의 총 GC/AT 비를 감소시키기 위해 코돈 최적화된다. 일부 대안에서, 제5 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화에 의해 최적화된다. 일부 대안에서, 단백질은 요법을 위한 단백질이다. 일부 대안에서, 코돈 최적화 및/또는 컨센서스 서열은 다수의 관련 서열에서 이용되는 서열 및/또는 핵염기의 가변성을 비교함으로써 생성된다. 일부 대안에서, 단백질은 항체 또는 그의 일부를 포함하고, 이것은 인간화될 수 있다. 일부 대안에서, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 L22F 및 F31S의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일부 대안에서, 도입은 전기천공에 의해 수행된다. 일부 대안에서, 선택은 선택 마커 카세트를 통해 선택 압력을 증가시킴으로써 수행된다. 일부 대안에서, 선택 시약은 선택제를 포함한다. 일부 대안에서, 선택제는 메토트렉세이트이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 50 nM - 100 nM이고, 제2 농도 범위는 적어도 75 내지 150 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도는 50 nM, 60 nM, 70 nM, 80 nM, 90 nM, 또는 100 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이고, 제2 농도 범위는 75 nM, 80 nM, 90 nM, 100 nM, 110 nM, 120 nM, 130 nM, 140 nM, 또는 150 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 75 nM - 150 nM이고, 제2 농도 범위는 적어도 112.5 nM 내지 225 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도는 75 nM, 85 nM, 95 nM, 105 nM, 115 nM, 125 nM, 135 nM, 145 nM, 또는 150 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이고, 제2 농도 범위는 112 nM, 122 nM, 132 nM, 142 nM, 152 nM, 162 nM, 172 nM, 182 nM, 192 nM, 202 nM, 212 nM, 또는 225 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 300 nM - 675 nM이고, 제1 농도 범위는 적어도 450 nM 내지 1012 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도는 300 nM, 350 nM, 400 nM, 450 nM, 500 nM, 550 nM, 600 nM, 650 nM, 또는 675 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이고, 제2 농도 범위는 450 nM, 500 nM, 550 nM, 600 nM, 650 nM, 700 nM, 750 nM, 800 nM, 850 nM, 900 nM, 1000 nM, 또는 1012 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이다. 일부 대안에서, 제1 라운드의 선택은 T-세포를 제2 라운드의 선택 전에 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 라운드의 선택은 T-세포를 단리 전에 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14일 또는 상기 언급된 시점 중 임의의 2개에 의해 규정된 시간 범위 내인 임의의 시간 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 대안에서, T 세포는 전구체 T 세포이다. 일부 대안에서, 전구체 T 세포는 조혈 줄기 세포이다.
일부 대안에서, 대상체에서 암 또는 질환의 치료, 억제 또는 개선 방법이 제공되고, 이 방법은 대상체에게 아래에서 설명되는 바와 같이 변형된 또는 유전자 조작된 다중화 T-세포를 투여하는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 입양 T-세포 면역요법을 위한 유전자 조작된 다중화 T-세포는 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 T-세포 내로 도입하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 제공하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 T-세포 내로 도입하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 선택하고, 여기서 선택은 제1 라운드의 선택 및 제2 라운드의 선택을 포함하고, 제1 라운드의 선택은 선택 시약을 제1 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 라운드의 선택은 선택 시약을 제2 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 더 높고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 적어도 1.5배 더 높고, 선택 압력 하에 표현형을 발현하는 T-세포를 단리하는 것을 포함하는 방법에 의해 생성된다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 제1 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제1 서열, 제2 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제2 서열, 프로모터 영역 서열을 포함하는 제3 서열, 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 유전자를 포함하고, 최적화된 제4 서열, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체를 코딩하는 적어도 하나의 선택가능 마커 카세트를 포함하고, 여기서 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 메토트렉세이트에 대해 15,000배 또는 약 15,000배 감소된 친화도를 갖고, 메토트렉세이트는 유전자 전달 폴리뉴클레오티드로 형질도입된 세포를 선택적으로 증폭하기 위해 선택 메카니즘으로서 사용될 수 있는 것인, 최적화된 제5 서열, 제1 부착 부위 (attP)를 포함하는 제6 서열, 제2 부착 부위 (attB)를 포함하는 제7 서열을 포함하고, 여기서 각각의 제1 서열, 제2 서열, 제3 서열, 제4 서열, 제5 서열, 제6 서열, 및 제7 서열은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, 제1 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제1 서열의 3' 말단은 제3 서열의 5' 말단에 인접하고, 제3 서열의 3' 말단은 제4 서열의 5' 말단에 인접하고, 제4 서열의 3' 말단은 제5 서열의 5' 말단에 인접하고, 제5 서열의 3' 말단은 제2 역위 말단 반복체를 포함하는 제2 서열의 5' 말단에 인접한다. 일부 대안에서, 인간 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체를 코딩하는 유전자는 다음 DNA 서열을 포함한다:
Figure pct00011
일부 대안에서, 인간 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 다음 단백질 서열을 포함한다:
Figure pct00012
일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 환상이다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 미니서클이다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 적어도 1 kB 내지 5 kB이다. 일부 대안에서, 프로모터 영역은 EF1 프로모터 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제4 서열은 단백질을 코딩하는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 유전자를 포함한다. 일부 대안에서, 제4 서열은 제4 서열의 총 GC/AT 비를 감소시키기 위해 코돈 최적화된다. 일부 대안에서, 제4 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화에 의해 최적화된다. 일부 대안에서, 제4 서열은 다수의 관련 단백질을 코딩하는 다수의 핵산으로부터 생성된 컨센서스 서열이다. 일부 대안에서, 제4 서열은 다수의 관련 단백질, 예컨대 동일한 에피토프에 특이적인 다수의 항체 결합 도메인을 코딩하는 다수의 핵산으로부터 생성된 컨센서스 서열이다. 일부 대안에서, 다수의 관련 단백질은 다수의 항체 결합 도메인을 포함하고, 다수의 항체 결합 도메인은 동일한 에피토프에 대해 특이적이다. 일부 대안에서, 제5 서열은 제5 서열의 총 GC/AT 비를 감소시키기 위해 코돈 최적화된다. 일부 대안에서, 제5 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화에 의해 최적화된다. 일부 대안에서, 단백질은 요법을 위한 단백질이다. 일부 대안에서, 코돈 최적화 및/또는 컨센서스 서열은 다수의 관련 서열에서 이용되는 서열 및/또는 핵염기의 가변성을 비교함으로써 생성된다. 일부 대안에서, 단백질은 항체 또는 그의 일부를 포함하고, 이것은 인간화될 수 있다. 일부 대안에서, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 L22F 및 F31S의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일부 대안에서, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 L22F 및 F31S의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일부 대안에서, T 세포는 전구체 T 세포이다. 일부 대안에서, 전구체 T 세포는 조혈 줄기 세포이다. 일부 대안에서, 도입은 전기천공에 의해 수행된다. 일부 대안에서, 선택은 선택 마커 카세트를 통해 선택 압력을 증가시킴으로써 수행된다. 일부 대안에서, 선택 시약은 선택제를 포함한다. 일부 대안에서, 선택제는 메토트렉세이트이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 50 nM - 100 nM이고, 제2 농도 범위는 적어도 75 내지 150 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도는 50 nM, 60 nM, 70 nM, 80 nM, 90 nM, 또는 100 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이고, 제2 농도 범위는 75 nM, 80 nM, 90 nM, 100 nM, 110 nM, 120 nM, 130 nM, 140 nM, 또는 150 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 75 nM - 150 nM이고, 제2 농도 범위는 적어도 112.5 nM 내지 225 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도는 75 nM, 85 nM, 95 nM, 105 nM, 115 nM, 125 nM, 135 nM, 145 nM, 또는 150 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이고, 제2 농도 범위는 112 nM, 122 nM, 132 nM, 142 nM, 152 nM, 162 nM, 172 nM, 182 nM, 192 nM, 202 nM, 212 nM, 또는 225 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 300 nM - 675 nM이고, 제1 농도 범위는 적어도 450 nM 내지 1012 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도는 300 nM, 350 nM, 400 nM, 450 nM, 500 nM, 550 nM, 600 nM, 650 nM, 또는 675 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이고, 제2 농도 범위는 450 nM, 500 nM, 550 nM, 600 nM, 650 nM, 700 nM, 750 nM, 800 nM, 850 nM, 900 nM, 1000 nM, 또는 1012 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이다. 일부 대안에서, 제1 라운드의 선택은 T-세포를 제2 라운드의 선택 전에 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 라운드의 선택은 T-세포를 단리 전에 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14일 또는 상기 언급된 시점 중 임의의 2개에 의해 규정된 시간 범위 내인 임의의 시간 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 대상체는 인간이다.
일부 대안에서, 입양 T-세포 면역요법을 위한 유전자 조작된 다중화 T-세포의 생성 방법이 제공되고, 이 방법은 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 T-세포 내로 도입하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 제공하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 T-세포 내로 도입하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 선택하고, 여기서 선택은 제1 라운드의 선택 및 제2 라운드의 선택을 포함하고, 제1 라운드의 선택은 선택 시약을 제1 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 라운드의 선택은 선택 시약을 제2 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 더 높고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 적어도 1.5배 더 높고, 선택 압력 하에 표현형을 발현하는 T-세포를 단리하는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 제1 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제1 서열, 제2 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제2 서열, 프로모터 영역 서열을 포함하는 제3 서열, 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 유전자를 포함하고, 최적화된 제4 서열, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체를 코딩하는 적어도 하나의 선택가능 마커 카세트를 포함하고, 여기서 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 메토트렉세이트에 대해 15,000배 또는 약 15,000배 감소된 친화도를 갖고, 메토트렉세이트는 유전자 전달 폴리뉴클레오티드로 형질도입된 세포를 선택적으로 증폭하기 위해 선택 메카니즘으로서 사용될 수 있는 것인, 최적화된 제5 서열, 제1 부착 부위 (attP)를 포함하는 제6 서열, 제2 부착 부위 (attB)를 포함하는 제7 서열을 포함하고, 여기서 각각의 제1 서열, 제2 서열, 제3 서열, 제4 서열, 제5 서열, 제6 서열, 및 제7 서열은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, 제1 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제1 서열의 3' 말단은 제3 서열의 5' 말단에 인접하고, 제3 서열의 3' 말단은 제4 서열의 5' 말단에 인접하고, 제4 서열의 3' 말단은 제5 서열의 5' 말단에 인접하고, 제5 서열의 3' 말단은 제2 역위 말단 반복체를 포함하는 제2 서열의 5' 말단에 인접한다. 일부 대안에서, 인간 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체를 코딩하는 유전자는 다음 DNA 서열을 포함한다:
Figure pct00013
일부 대안에서, 인간 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 다음 단백질 서열을 포함한다:
Figure pct00014
일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 환상이다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 적어도 1 kB 내지 5 kB이다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 미니서클이다. 일부 대안에서, 프로모터 영역은 EF1 프로모터 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제4 서열은 단백질을 코딩하는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 유전자를 포함한다. 일부 대안에서, 제4 서열은 제4 서열의 총 GC/AT 비를 감소시키기 위해 코돈 최적화된다. 일부 대안에서, 제4 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화에 의해 최적화된다. 일부 대안에서, 제4 서열은 다수의 관련 단백질을 코딩하는 다수의 핵산으로부터 생성된 컨센서스 서열이다. 일부 대안에서, 제4 서열은 다수의 관련 단백질, 예컨대 동일한 에피토프에 특이적인 다수의 항체 결합 도메인을 코딩하는 다수의 핵산으로부터 생성된 컨센서스 서열이다. 일부 대안에서, 다수의 관련 단백질은 다수의 항체 결합 도메인을 포함하고, 다수의 항체 결합 도메인은 동일한 에피토프에 대해 특이적이다. 일부 대안에서, 제5 서열은 제5 서열의 총 GC/AT 비를 감소시키기 위해 코돈 최적화된다. 일부 대안에서, 제5 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화에 의해 최적화된다. 일부 대안에서, 단백질은 요법을 위한 단백질이다. 일부 대안에서, 코돈 최적화 및/또는 컨센서스 서열은 다수의 관련 서열에서 이용되는 서열 및/또는 핵염기의 가변성을 비교함으로써 생성된다. 일부 대안에서, 단백질은 항체 또는 그의 일부를 포함하고, 이것은 인간화될 수 있다. 일부 대안에서, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 L22F 및 F31S의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일부 대안에서, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 L22F 및 F31S의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일부 대안에서, 도입은 전기천공에 의해 수행된다. 일부 대안에서, 선택은 선택 마커 카세트를 통해 선택 압력을 증가시킴으로써 수행된다. 일부 대안에서, 선택 시약은 선택제를 포함한다. 일부 대안에서, 선택제는 메토트렉세이트이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 50 nM - 100 nM이고, 제2 농도 범위는 적어도 75 내지 150 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도는 50 nM, 60 nM, 70 nM, 80 nM, 90 nM, 또는 100 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이고, 제2 농도 범위는 75 nM, 80 nM, 90 nM, 100 nM, 110 nM, 120 nM, 130 nM, 140 nM, 또는 150 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 75 nM - 150 nM이고, 제2 농도 범위는 적어도 112.5 nM 내지 225 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도는 75 nM, 85 nM, 95 nM, 105 nM, 115 nM, 125 nM, 135 nM, 145 nM, 또는 150 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이고, 제2 농도 범위는 112 nM, 122 nM, 132 nM, 142 nM, 152 nM, 162 nM, 172 nM, 182 nM, 192 nM, 202 nM, 212 nM, 또는 225 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 300 nM - 675 nM이고, 제1 농도 범위는 적어도 450 nM 내지 1012 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도는 300 nM, 350 nM, 400 nM, 450 nM, 500 nM, 550 nM, 600 nM, 650 nM, 또는 675 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이고, 제2 농도 범위는 450 nM, 500 nM, 550 nM, 600 nM, 650 nM, 700 nM, 750 nM, 800 nM, 850 nM, 900 nM, 1000 nM, 또는 1012 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이다. 일부 대안에서, 제1 라운드의 선택은 T-세포를 제2 라운드의 선택 전에 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 라운드의 선택은 T-세포를 단리 전에 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14일 또는 상기 언급된 시점 중 임의의 2개에 의해 규정된 시간 범위 내인 임의의 시간 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 대안에서, T 세포는 전구체 T 세포를 포함한다. 일부 대안에서, 전구체 T 세포는 조혈 줄기 세포이다.
일부 대안에서, 입양 T-세포 면역요법을 위한 조작된 세포의 생성 방법은 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 전구체 T 세포 내로 도입하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 제공하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 전구체 T 세포 내로 도입하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 포함하는 전구체 T 세포를 선택하고; 여기서 선택은 제1 라운드의 선택 및 제2 라운드의 선택을 포함하고, 제1 라운드의 선택은 선택 시약을 제1 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 라운드의 선택은 선택 시약을 제2 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 더 높고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 적어도 1.5배 더 높고, 선택 압력 하에 표현형을 발현하는 전구체 T-세포를 단리하는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 핵산의 올리고뉴클레오티드 내로의 안정한 삽입을 위한 것이고, 삽입을 위한 핵산은 유전자 전달 폴리뉴클레오티드 내의 역위 말단 반복체 유전자 서열의 측면에 위치하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 선택가능하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 제1 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제1 서열, 제2 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제2 서열, 프로모터 영역 서열을 포함하는 제3 서열, 적어도 하나의 유전자를 포함하고, 적어도 하나의 유전자는 단백질을 코딩하거나 mRNA 전사를 위한 서열을 코딩하는 것인, 최적화된 제4 서열, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체를 코딩하는 적어도 하나의 선택가능 마커 카세트를 포함하고, 여기서 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 메토트렉세이트에 대해 15,000배 또는 약 15,000배 감소된 친화도를 갖고, 메토트렉세이트는 적어도 하나의 유전자를 발현하는 세포의 비를 향상시키기 위해 유전자 전달 폴리뉴클레오티드로 형질도입된 세포를 선택하기 위해 사용될 수 있는 것인, 최적화된 제5 서열, 제1 부착 부위 (attP)를 포함하는 제6 서열, 제2 부착 부위 (attB)를 포함하는 제7 서열을 포함하고; 여기서 각각의 제1 서열, 제2 서열, 제3 서열, 제4 서열, 제5 서열, 제6 서열, 및 제7 서열은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, 제1 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제1 서열의 3' 말단은 제3 서열의 5' 말단에 인접하고, 제3 서열의 3' 말단은 제4 서열의 5' 말단에 인접하고, 제4 서열의 3' 말단은 제5 서열의 5' 말단에 인접하고, 제5 서열의 3' 말단은 제2 역위 말단 반복체를 포함하는 제2 서열의 5' 말단에 인접한다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 환상이다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 적어도 1 kB 내지 5 kB이다. 일부 대안에서, 프로모터 영역은 EF1 프로모터 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제4 서열은 단백질을 코딩하는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 유전자를 포함한다. 일부 대안에서, 제4 서열은 제4 서열의 총 GC/AT 비를 감소시키기 위해 코돈 최적화된다. 일부 대안에서, 제4 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화에 의해 최적화된다. 일부 대안에서, 제4 서열은 다수의 관련 단백질을 코딩하는 다수의 핵산으로부터 생성된 컨센서스 서열이다. 일부 대안에서, 제4 서열은 다수의 관련 단백질, 예컨대 동일한 에피토프에 특이적인 다수의 항체 결합 도메인을 코딩하는 다수의 핵산으로부터 생성된 컨센서스 서열이다. 일부 대안에서, 다수의 관련 단백질은 다수의 항체 결합 도메인을 포함하고, 다수의 항체 결합 도메인은 동일한 에피토프에 대해 특이적이다. 일부 대안에서, 제5 서열은 제5 서열의 총 GC/AT 비를 감소시키기 위해 코돈 최적화된다. 일부 대안에서, 제5 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화에 의해 최적화된다. 일부 대안에서, 코돈 최적화 및/또는 컨센서스 서열은 다수의 관련 서열에서 이용되는 서열 및/또는 핵염기의 가변성을 비교함으로써 생성된다. 일부 대안에서, 단백질은 요법을 위한 단백질이다. 일부 대안에서, 단백질은 항체 또는 그의 일부를 포함하고, 이것은 인간화될 수 있다. 일부 대안에서, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 L22F 및 F31S의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 미니서클이다. 일부 대안에서, 도입은 전기천공에 의해 수행된다. 일부 대안에서, 선택은 선택 마커 카세트를 통해 선택 압력을 증가시킴으로써 수행된다. 일부 대안에서, 선택 시약은 선택제를 포함한다. 일부 대안에서, 선택제는 메토트렉세이트이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 50 nM - 100 nM이고, 제2 농도 범위는 적어도 75 내지 150 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 75 nM - 150 nM이고, 제2 농도 범위는 적어도 112.5 nM 내지 225 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 300 nM - 675 nM이고, 제1 농도 범위는 적어도 450 nM 내지 1012 nM이다. 일부 대안에서, 제1 라운드의 선택은 T-세포를 제2 라운드의 선택 전에 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 라운드의 선택은 T-세포를 단리 전에 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14일 또는 상기 언급된 시점 중 임의의 2개에 의해 규정된 시간 범위 내인 임의의 시간 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 대안에서, T 세포 전구체는 조혈 줄기 세포이다.
일부 대안에서, 전구체 T-세포에서 단백질 생산을 증가시키는 방법이 제공되고, 이 방법은 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 제공하고; 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 전구체 T-세포 내로 도입하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 포함하는 전구체 T 세포를 선택하고, 여기서 선택은 제1 라운드의 선택 및 제2 라운드의 선택을 포함하고, 제1 라운드의 선택은 선택 시약을 제1 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 라운드의 선택은 선택 시약을 제2 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 더 높고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 적어도 1.5배 더 높고, 선택 압력 하에 표현형을 발현하는 전구체 T-세포를 단리하는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 핵산의 올리고뉴클레오티드 내로의 안정한 삽입을 위한 것이고, 삽입을 위한 핵산은 유전자 전달 폴리뉴클레오티드 내의 역위 말단 반복체 유전자 서열의 측면에 위치하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 선택가능하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 제1 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제1 서열, 제2 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제2 서열, 프로모터 영역 서열을 포함하는 제3 서열, 적어도 하나의 유전자를 포함하고, 적어도 하나의 유전자는 단백질을 코딩하거나 mRNA 전사를 위한 서열을 코딩하는 것인, 최적화된 제4 서열, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체를 코딩하는 적어도 하나의 선택가능 마커 카세트를 포함하고, 여기서 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 메토트렉세이트에 대해 15,000배 또는 약 15,000배 감소된 친화도를 갖고, 메토트렉세이트는 적어도 하나의 유전자를 발현하는 세포의 비를 향상시키기 위해 유전자 전달 폴리뉴클레오티드로 형질도입된 세포를 선택하기 위해 사용될 수 있는 것인, 최적화된 제5 서열, 제1 부착 부위 (attP)를 포함하는 제6 서열, 제2 부착 부위 (attB)를 포함하는 제7 서열을 포함하고; 여기서, 각각의 제1 서열, 제2 서열, 제3 서열, 제4 서열, 제5 서열, 제6 서열, 및 제7 서열은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, 제1 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제1 서열의 3' 말단은 제3 서열의 5' 말단에 인접하고, 제3 서열의 3' 말단은 제4 서열의 5' 말단에 인접하고, 제4 서열의 3' 말단은 제5 서열의 5' 말단에 인접하고, 제5 서열의 3' 말단은 제2 역위 말단 반복체를 포함하는 제2 서열의 5' 말단에 인접한다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 환상이다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 적어도 1 kB 내지 5 kB이다. 일부 대안에서, 프로모터 영역은 EF1 프로모터 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제4 서열은 단백질을 코딩하는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 유전자를 포함한다. 일부 대안에서, 제4 서열은 제4 서열의 총 GC/AT 비를 감소시키기 위해 코돈 최적화된다. 일부 대안에서, 제4 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화에 의해 최적화된다. 일부 대안에서, 제4 서열은 다수의 관련 단백질을 코딩하는 다수의 핵산으로부터 생성된 컨센서스 서열이다. 일부 대안에서, 제4 서열은 다수의 관련 단백질, 예컨대 동일한 에피토프에 특이적인 다수의 항체 결합 도메인을 코딩하는 다수의 핵산으로부터 생성된 컨센서스 서열이다. 일부 대안에서, 다수의 관련 단백질은 다수의 항체 결합 도메인을 포함하고, 다수의 항체 결합 도메인은 동일한 에피토프에 대해 특이적이다. 일부 대안에서, 제5 서열은 제5 서열의 총 GC/AT 비를 감소시키기 위해 코돈 최적화된다. 일부 대안에서, 제5 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화에 의해 최적화된다. 일부 대안에서, 코돈 최적화 및/또는 컨센서스 서열은 다수의 관련 서열에서 이용되는 서열 및/또는 핵염기의 가변성을 비교함으로써 생성된다. 일부 대안에서, 단백질은 요법을 위한 단백질이다. 일부 대안에서, 단백질은 항체 또는 그의 일부를 포함하고, 이것은 인간화될 수 있다. 일부 대안에서, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 L22F 및 F31S의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 미니서클이다. 일부 대안에서, 도입은 전기천공에 의해 수행된다. 일부 대안에서, 선택은 선택 마커 카세트를 통해 선택 압력을 증가시킴으로써 수행된다. 일부 대안에서, 선택 시약은 선택제를 포함한다. 일부 대안에서, 선택제는 메토트렉세이트이다.
일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 50 nM - 100 nM이고, 제2 농도 범위는 적어도 75 내지 150 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 75 nM - 150 nM이고, 제2 농도 범위는 적어도 112.5 nM 내지 225 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 300 nM - 675 nM이고, 제2 농도 범위는 적어도 450 nM 내지 1012 nM이다. 일부 대안에서, 제1 라운드의 선택은 세포를 제2 라운드의 선택 전에 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 라운드의 선택은 세포를 단리 전에 적어도 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 전구체 T 세포는 조혈 줄기 세포이다.
도 1은 유전자 전달 미니서클 생산자 플라스미드인 MC_T3/FP-DHFRdm의 전체적인 모식도를 보여준다. 슬리핑 뷰티 트랜스포존의 T3 생성을 보이는 미니서클은 역위 말단 반복체 (ITR, 화살표) 사이에 위치하는, EF1a 프로모터, 형광 단백질 (FP; maxGFP, mCherry, 또는 청색 형광 단백질 (BFP))의 융합체, 토세아 아시그나(Thosea asigna) 바이러스 2A 펩티드 (T2A), 및 메토트렉세이트 (MTX)에 비감수성인 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체 (DHFRdm)를 포함한다. attB/attP 부위에서의 재조합은 미니서클을 생성하고, 이때 나머지 박테리아 백본 (backbone)은 효소에 의해 분해된다.
도 2은 트랜스포존:트랜스포사제 DNA 비의 최적화를 제시하는 일련의 막대 그래프를 보여준다. H9 세포를 2 ㎍의 MC_T3/eGFP-T2A-DHFRdm DNA (트랜스포존) 및 증가량의 MC_SB100X (트랜스포사제) DNA (0.5, 1, 2, 4, 8 ㎍)로 뉴클레오펙션시켰다. 일시적인 및 안정한 형질감염 효율을 평가하기 위해 유동 세포 측정을 뉴클레오펙션 24시간 후에 (줄무늬 막대) 및 7일 후에 (흑색 막대) 수행하였다. 막대 위의 수치는 일시적인 GFP 발현에 대한 안정한 발현의 퍼센트로서 계산된 통합 효율을 나타낸다.
도 3은 선택 과정 동안 MTX 농도의 효과를 제시하는 일련의 막대 그래프를 보여준다. 3일 (백색 막대), 5일 (수평 줄무늬), 7일 (수직 줄무늬), 및 10일 (흑색 막대)에 증가하는 농도의 MTX (0, 50, 100, 및 200 nM)의 존재 하에 성장한 T3/GFP-T2A-DHFRdm 트랜스포존 DNA로 안정적으로 형질감염된 H9 세포 집단의 유동 세포 측정 분석을 수행하였다. 도 3의 패널 A는 퍼센트 GFP+/PI-를 보여주고, 도 3의 패널 B는 평균 GFP 상대 형광 단위 (RFU)를 보여준다.
도 4는 MTX 사용 중지 후에 트랜스진 존속을 제시하는 일련의 막대 그래프를 보여준다. 2주 동안 (흑색 막대) 상이한 농도의 MTX (50, 100, 및 200 nM)로 보충된 배지에서 T3/GFP-T2A-DHFRdm 트랜스포존으로 안정적으로 형질감염된 후, MTX 선택이 중지되고, 그 후 다음과 같이 상이한 시점에서 데이타를 수집한 H9 세포 집단의 유동 세포 측정 분석이 제시된다: 1주 (수평 줄무늬), 2주 (수직 줄무늬), 3주 (체크무늬 막대), 및 4주 (백색 막대). 도 4의 패널 A는 퍼센트 GFP+/PI-를 보여주고; 도 4의 패널 B는 평균 GFP 상대 형광 단위 (RFU)를 보여준다.
도 5A는 인간 반수체 게놈당 트랜스포존 카피수를 보여준다. 게놈 DNA는 상이한 농도의 MTX (50, 100, 및 200 nM)를 사용한 선택 전 및 후에 T3/GFP-T2A-DHFRdm 트랜스포존 DNA로 안정적으로 형질감염된 H9 세포의 집단으로부터 단리하였다. 평균 트랜스포존 카피수는 정량적 PCR에 의해 결정하였다. "절대 표준 (Gold standard)"은 제한 희석 방법에 의해 생성하였다. "분류된" 집단은 본래의 H9 집단 (8%의 통합된 트랜스포존)을 100% GFP 양성 세포로 분류함으로써 생성되었다. 괄호로 묶은 막대 그래프 위의 별표 (*)는 200 nM MTX와 분류된 집단 사이의 차이가 스튜던트 (Student) T-시험 (P=0.04)에 따라 유의하게 상이함을 나타낸다.
도 5B는 트랜스포존 통합 이벤트의 분포를 보여준다. 200 nM MTX를 사용하여 T3/GFP-T2A-DHFRdm 트랜스포존이 통합된 100% 세포로 이전에 선택된 H9 집단으로부터 제한 희석 방법에 의해 60개의 클론을 단리하였다. 게놈 DNA를 단리하고, 트랜스포존 카피수를 상대 RT-qPCR에 의해 결정하였다. 수는 가장 가까운 정수값으로 반올림하였다 (예를 들어, 0.5-1.5는 1로 반올림됨). N = 60; 평균±표준 편차 = 1.78±0.69. 통합 이벤트의 확률 및 표준 오차는 상기 데이타로부터 계산되었다 (삽입도의 표).
도 6은 트랜스포존의 다중화 (multiplexing)에 대한 분석을 나타내는 일련의 파이 그래프를 보여준다. 패널 A-C에, 각각 2 ㎍의 상이한 형광 단백질 (FP) (MC_T3/GFP-T2A-DHFRdm, MC_T3/BFP-T2A-DHFRdm, MC_T3/mCherry-T2A-DHFRdm)을 갖는 트랜스포존을 보유하는 3개의 미니서클 및 6 ㎍의 MC_SB100X DNA로 뉴클레오펙션시킨 H9 세포 집단에 대한 다음과 같이 상이한 시점에서의 유동 세포 측정 분석이 도시된다: (패널 A) 형질감염 24시간 후 (일시적인 발현), (패널 B) 1주 (안정한 통합), 및 (패널 C) 200 nM의 MTX를 사용한 선택의 1주.
도 7은 단일, 이중, 및 삼중 FP의 발현 분포의 단계적인 선택에 대한 막대 그래프 분석을 보여준다. 3개의 트랜스포존으로 안정적으로 형질감염된 H9 세포 집단을 1주 동안 200 nM MTX로 선택한 후, 500 및 1000 nM의 보다 높은 MTX 농도에 노출시켰다.
도 8은 MTX 선택 후에 림프구 내에서 슬리핑 뷰티와 함께 트랜스포존 DNA의 안정한 발현에 대한 유동 분석의 예를 보여준다. 새로 해동한 PBMC 세포를 미니서클 GFP (mcGFP) DNA (MC_T3/GFP-T2A-DHFRdm) 및 슬리핑 뷰티 트랜스포사제 DNA (MC_SB100X)로 전기천공한 후, CD3 및 CD28에 대한 결합에 의해 T-세포를 선택적으로 활성화하는 밀테니이 트랜스액트 (Miltenyi Transact) 비드로 자극하였다. 전기천공의 1주 후에, PBMC 세포의 샘플을 25, 50 및 100 nM MTX를 사용하여 12일 동안 선택하였다 (여기서 50 nM이 제시됨). 패널 A, B, 및 C는 림프구 (A), 단일 세포 (B), 및 살아있는 세포 (C)에 대한 순차적인 선택을 보여준다. 패널 D에는 CD8+ 및 CD8- 집단 둘 모두에서 높은 수준의 GFP 발현이 제시된다. 상기 공여자에 대해, 자극 후의 대부분의 림프구는 CD8+ T 세포임에 주목한다.
도 9는 림프구 내에서 슬리핑 뷰티와 함께 트랜스포존 DNA의 초기 발현의 막대 그래프를 보여준다. PBMC를 mcGFP DNA 단독 (10 ㎍), mcGFP (10 ㎍) 및 MC_SB100X DNA (5 ㎍) (mcGFP:MC_SB100X 비 2:1), mcGFP (10 ㎍) 및 MC_SB100X DNA (10 ㎍) (mcGFP:MC_SB100X 비 1:1), pMAXGFP (10 ㎍) 대조군, 또는 DNA 미함유 대조군으로 형질감염시켰다. 패널 A에 초기 전기천공 효율의 예로서 형질감염 2일 후에 트랜스액트 비드가 첨가되지 않은 세포에 대한 결과가 제시된다. 패널 B에는 5일 후에 트랜스액트 비드에 노출된 세포의 결과가 제시된다. 제5일까지 mcGFP DNA의 수준은 대조군 수준 근처까지 감소하는 반면, 트랜스포사제로 동시-형질감염된 세포에서 mcGFP의 발현은 상승한 상태로 유지된다.
도 10은 MTX 첨가 1주 전에 형질감염된 림프구에서 GFP 트랜스포존 DNA의 발현 및 세포 성장의 수준을 보여준다. PBMC를 mcGFP DNA 단독, mcGFP 및 MC_SB100X DNA (mcGFP:MC_SB100X 비 2:1), mcGFP 및 MC_SB100X DNA (mcGFP:MC_SB100X 비 1:1), pMAXGFP 대조군 (10 ㎍), 또는 DNA 미함유 대조군으로 형질감염시켰다. 패널 A는 제2일로부터 제7일까지 감소하는 수준의 GFP 발현을 보여준다. 패널 B는 d0에 밀테니이 트랜스액트 비드로 처리된 형질감염된 세포 샘플의 제0일로부터 제7일까지의 살아있는 세포의 수준을 보여준다. 패널 C는 트랜스액트 비드의 부재 하에 형질감염된 세포 샘플의 제0일로부터 제7일까지의 살아있는 세포의 수준을 보여준다. 도시된 바와 같이, 밀테니이 트랜스액트 비드의 존재 하에 mcGFP DNA로 형질감염된 세포의 성장은 느리다.
도 11은 MTX 선택 1주 후에 T-세포 내의 슬리핑 뷰티와 함께 트랜스포존 DNA의 안정한 발현을 보여준다. 트랜스포존 DNA 및 슬리핑 뷰티 트랜스포사제 DNA를 사용한 형질감염 후에 GFP를 발현하도록 변형된 T-세포의 GFP 생산 및 증식을 조사한 유동 세포 측정 산포도가 제시된다. 패널 A, B, E, 및 F는 림프구를 확인하기 위한 분산 프로파일을 보여주는 반면, 패널 C, D, G 및 H는 CD8 및 GFP 발현을 보여준다. 패널 A-D는 100 nM MTX로 처리된 세포의 유동 세포 측정 분석을 보여준다. 패널 E-H는 MTX로 처리되지 않은 세포의 유동 세포 측정 분석을 보여준다. 패널 A, C, E 및 G에 mcGFP 단독으로 형질감염된 샘플이 제시된다. 패널 B, D, F 및 H는 2:1의 mcGFP 및 MC_SB100X (슬리핑 뷰티 트랜스포사제) DNA로 형질감염된 세포의 유동 세포 측정 결과를 보여준다. 패널 D에서 입증되는 바와 같이, GFP 유전자가 세포 게놈 내로 안정적으로 삽입되도록 mcGFP 및 SB100X로 동시-형질감염된 T-세포 (CD8+ 및 CD8- 둘 모두)에서, 약 95%의 세포는 100 nM의 MTX의 존재 하에 GFP를 안정적으로 발현하는 반면, MTX의 부재 하에서는 약 23%만이 GFP를 발현한다.
도 12는 MTX 선택 14일 후에 트랜스포존-형질감염된 림프구 내의 증식 및 GFP/CD8 발현을 보여준다. 세포 샘플을 DNA 미함유 (대조군), mcGFP 단독, 2:1의 mcGFP:MC_SB100X 비의 mcGFP 및 MC_SB100X DNA, 또는 1:1의 mcGFP:MC_SB100X 비의 mcGFP 및 MC_SB100X DNA로 형질감염시켰다. 1주 후에, 세포를 0 nM MTX (대조군), 25 nM MTX, 50 nM MTX, 또는 100 nM MTX를 사용하여 선택하였다. 제1, 제3, 제5 및 제7 컬럼에 제시된 림프구 윈도우 (window)는 보다 높은 농도의 MTX의 존재 하에서 오직 안정적으로 형질감염된 세포만 생존함을 입증한다. 살아있는 단일 림프구를 제2, 제4, 제6 및 제8 컬럼에서 GFP 및 CD8 검출을 위해 게이팅하였다. mcGFP 단독으로 형질감염된 세포 샘플에서, GFP 발현은 시간이 경과하면서 상실된다 (제2 컬럼). 그러나, mcGFP 및 MC_SB100X 둘 모두로 형질감염된 세포는 MTX 선택 실시 (>90%) 및 MTX 선택 미실시 (~20%) (컬럼 4 및 6) 둘 모두에서 GFP를 안정적으로 발현한다. mcGFP 및 MC_SB100X DNA로 형질감염된 샘플에 도시된 바와 같이, MTX는 50 및 100 nM MTX의 농도에서 선택을 위해 효과적인 반면, 비 2:1 또는 1:1에서는 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 대부분의 림프구는 CD8+ T-세포이다.
도 13은 MTX 선택 19일 후에 트랜스포존-형질감염된 세포 내의 림프구 윈도우 및 GFP/CD8 발현을 보여준다. 세포 샘플을 DNA 미함유 (대조군), mcGFP 단독, 2:1의 mcGFP:MC_SB100X 비의 mcGFP 및 MC_SB100X DNA, 또는 1:1의 mcGFP:MC_SB100X 비의 mcGFP 및 MC_SB100X DNA로 형질감염시켰다. 세포를 0 nM MTX (대조군), 25 nM MTX, 50 nM MTX, 또는 100 nM MTX를 사용하여 선택하였다. 림프구 윈도우는 제1, 제3, 제5 및 제7 컬럼에 제시되고, MTX의 존재 하에서 오직 안정적으로 형질감염된 세포만 생존함을 보여준다. 살아있는 단일 림프구를 제2, 제4, 제6 및 제8 컬럼에서 GFP 및 CD8 검출을 위해 게이팅하였다. mcGFP 단독으로 형질감염된 세포 샘플에서, GFP 발현은 시간이 경과하면서 상실된다 (제2 컬럼). 그러나, mcGFP 및 MC_SB100X 둘 모두로 형질감염된 세포는 MTX 선택 실시 (>90%) 및 MTX 선택 미실시 (~20%) (컬럼 4 및 6) 둘 모두에서 GFP를 안정적으로 발현한다. mcGFP 및 MC_SB100X DNA로 형질감염된 샘플에 도시된 바와 같이, MTX는 50 및 100 nM MTX의 농도에서 선택을 위해 효과적이고, 25 nM에서는 약간 덜 효과적이었다. 2:1 또는 1:1의 mcGFP:SB 비는 유사하게 효과적이었다.
도 14는 트랜스포존 DNA를 안정적으로 발현하고 MTX 선택을 거친 세포 중 살아있는 세포 계수를 보여준다. 트리판 블루 (Trypan blue) 세포 계수는 형질감염 7, 14, 및 19일 후에 실시하였다. PBMC 샘플을 DNA 미함유 (대조군), mcGFP 단독, 2:1의 mcGFP:MC_SB100X 비의 mcGFP 및 MC_SB100X DNA, 또는 1:1의 mcGFP:MC_SB100X 비의 mcGFP 및 MC_SB100X DNA로 형질감염시켰다. 세포를 제7일에 0 nM MTX (대조군), 25 nM MTX, 50 nM MTX, 또는 100 nM MTX를 사용하여 선택하였다. 패널 A는 MTX의 부재 하에 살아있는 세포의 수준을 보여준다. 패널 B는 100 nM MTX에 대한 노출 후에 살아있는 세포의 수준을 보여준다. 패널 C는 50 nM MTX에 대한 노출 후에 살아있는 세포의 수준을 보여준다. 패널 D는 25 nM MTX에 대한 노출 후에 살아있는 세포의 수준을 보여준다. MTX는 폴산의 대사를 억제함으로써 세포의 성장을 느리게하기 때문에, MTX-내성 유전자 (DHFRdm)를 동시발현하는 mcGFP 트랜스포존 및 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 MC_SB100X 플라스미드 둘 모두로 형질감염된 세포만이 통합된 트랜스포존 DNA의 안정한 발현 때문에 높은 MTX의 존재 하에 증식할 수 있었다.
도 15는 MTX 선택 하에 슬리핑 뷰티 트랜스포사제와 함께 GFP 트랜스포존 DNA를 안정적으로 발현하는 림프구에 의한 GFP 발현의 분석을 보여준다. PBMC 샘플을 mcGFP 단독, 2:1의 mcGFP:MC_SB100X 비의 mcGFP 및 MC_SB100X, 1:1의 mcGFP:MC_SB100X 비의 mcGFP 및 MC_SB100X, pMAXGFP (10 ㎍), 및 DNA 미함유 (대조군)로 형질감염시켰다. 세포를 형질감염 후 제7일에 MTX에 노출시키고, GFP 발현을 살아있는 단일 림프구에 대해 측정하였다. 패널 A는 MTX의 부재 하에 제2, 5, 7, 14, 및 19일의 GFP 발현의 수준을 보여준다. 패널 B는 0 nM, 25 nM, 50 nM 및 100 nM의 MTX 농도에서 MTX 선택 하에 mcGFP 단독으로 형질감염된 림프구의 제7, 14, 및 19일로부터의 GFP 발현의 수준을 보여준다. 패널 C는 0 nM, 25 nM, 50 nM 및 100 nM의 MTX 선택 하에 2:1의 mcGFP:MC_SB100X 비의 mcGFP 및 MC_SB100X로 형질감염된 T-세포의 GFP 발현을 보여준다. 패널 D는 0 nM, 25 nM, 50 nM 및 100 nM의 MTX 선택 농도의 제어 하에 1:1의 mcGFP:MC_SB100X 비의 mcGFP 및 MC_SB100X로 형질감염된 T-세포의 GFP 발현을 보여준다. 도시된 바와 같이, 2:1 및 1:1 비의 mcGFP 및 MC_SB100X를 사용한 형질감염 결과는 유사하였고, MTX 처리 1주 후에 25 nM에서는 약 75% GFP 발현이, 50 및 100 nM에서는 약 90% GFP 발현이 제시되었다. 추가로, 50 nM MTX와 100 nM MTX 처리 사이에 GFP 발현의 최소 차이가 존재하였다.
도 16: 슬리핑 뷰티 트랜스포존: 미니서클 구축물. 본원에서 설명되는 몇몇의 대안에 대해 설계된 몇몇의 슬리핑 뷰티 구축물의 모식도가 도면에 도시된다.
도 17: GFP의 발현을 위한 유전자를 보유하는 슬리핑 뷰티 트랜스포존으로 형질감염된 세포의 몇몇의 산포도가 제시된다. 형질감염 14일 후의 세포가 제시된다. 세포는 SB100X 또는 GFP의 유전자를 보유하는 트랜스포존으로 전기천공되었다.
도 18. 슬리핑 뷰티 트랜스포존 및 MTX: GFP 트랜스포존. 도시된 바와 같이, 세포는 상이한 비의 mcGFP 플라스미드 및 GFP의 발현을 위한 유전자를 보유하는 슬리핑 뷰티 트랜스포존 (1:1 및 2:1 비의 McGFP:SB)으로 형질감염되었다. 도시된 바와 같이, GFP 발현은 MTX가 18일 후에 첨가되지 않을 때 낮았다. 슬리핑 뷰티 트랜스포존을 사용하면, MTX의 존재 하에 GFP 발현이 증가함이 밝혀졌다.
도 19. 슬리핑 뷰티 트랜스포존: 미니서클 구축물. 본원에서 설명되는 몇몇의 대안에 대해 설계된 몇몇의 슬리핑 뷰티 구축물의 모식도가 도면에 도시된다.
도 20. 슬리핑 뷰티 트랜스포존 및 MTX:GFP 트랜스포존-SB100X DNA 및 RNA. 세포는 SB100X (DNA 또는 RNA) 또는 GFP, CAR, 또는 GFP/mCherry/BFP에 대한 유전자를 보유하는 트랜스포존으로 전기천공되었다.
도 21. 슬리핑 뷰티 트랜스포존 및 MTX: GFP 트랜스포존-SB100X DNA 및 RNA. GFP 유전자 보유 트랜스포존으로 형질감염된 세포의 몇몇의 산포도가 도면에 도시된다. 몇몇 세포 샘플은 GFP 발현을 위한 유전자 (2.5 ㎍ 및 5 ㎍)를 포함하는 DNA, mcGFP 단독, 및 RNA (1 ㎍ 및 3 ㎍)로 형질감염된다. 샘플은 분할된 후, 0 μM, 50 μM 및 100 μM의 상이한 MTX 농도의 영향 하에서 성장된다.
도 22. 슬리핑 뷰티 트랜스포존 및 MTX: GFP 트랜스포존-SB100X DNA 및 RNA. 세포는 상부 좌측 패널에 제시된 상이한 농도에서 GFP 발현을 위한 유전자를 보유하는 슬리핑 뷰티 트랜스포존으로 형질감염되었다. 이어서, MTX는 형질감염 후 제7일에 첨가하였다. 도시된 바와 같이, 50 ㎍ 내지 100 ㎍으로 형질감염된 세포는 제7일 후 제14일에 GFP를 발현할 수 있다.
도 23. MTX의 존재 하에 GFP를 발현하는 DNA 및 RNA. 도시된 바와 같이, mcGFP, GFP:SB, and GFP:SB RNA로 형질감염된 세포를 성장시키고, 형질감염 7일 후에 MTX에 노출시켰다. 대조군으로서, 세포를 MTX에 대한 노출 없이 14일 동안 성장시켰다 (상부 좌측 패널).
도 24. GFP: SB로 형질감염된 GFP의 발현. 좌측 패널에 도시된 바와 같이, 세포를 상이한 농도의 GFP: SB (2.5 ㎍, 5 ㎍)로 형질감염시키고, 상이한 농도의 MTX (50 μM 및 100 μM)에 노출시켰다. 도시된 바와 같이, 세포는 5 ㎍의 GFP: SB로 형질감염될 때 50 μM MTX에서 최적으로 MTX의 존재 하에 GFP를 발현할 수 있었다. 상기 실험을 또한 RNA를 사용하여 수행하였지만, DNA가 단백질 발현을 유도하는 더 높은 효율을 나타내었다.
도 25. 슬리핑 뷰티 트랜스포존: 미니서클 구축물. 본원에서 설명되는 몇몇의 대안에 대해 설계된 몇몇의 슬리핑 뷰티 구축물의 모식도가 도면에 도시된다.
도 26. CD19CAR의 발현. CD19CAR에 대한 유전자를 보유하는 슬리핑 뷰티 구축물을 구축하였다 (SB: CD19CAR). 세포를 DNA (2.5 ㎍ 또는 5 ㎍), 또는 RNA (1 ㎍ 또는 3 ㎍)로 형질감염시켰다. 도시된 바와 같이, 두 농도의 DNA 또는 RNA로 형질감염된 세포는 50 μM MTX의 존재 하에 CD19CAR을 발현할 수 있었다. 이것은 또한 100 μM MTX의 존재 하에 1 ㎍의 RNA로 형질감염된 세포에서도 관찰되었다.
도 27. CD19CAR의 발현. CD19CAR에 대한 유전자를 보유하는 슬리핑 뷰티 구축물을 구축하였다 (SB: CD19CAR). 세포를 DNA (2.5 ㎍ 또는 5 ㎍), 또는 RNA (1 ㎍ 또는 3 ㎍)으로 형질감염시켰다. 세포를 성장시키고, 형질감염 후 제7일에 MTX에 노출시켰다. CD19CAR은 또한 EGFRt 태그를 포함하였다. 도시된 바와 같이, 태그의 검출은 CD19CAR의 발현과 상관관계가 있다. MTX에 대한 노출 후에, 태그의 검출은 CAR19에 대한 유전자를 보유하는 슬리핑 뷰티 구축물을 보유하는 DNA로 형질감염된 세포뿐만 아니라, CAR19에 대한 유전자를 보유하는 슬리핑 뷰티 구축물을 보유하는 RNA로 형질감염된 세포에서도 관찰되었다.
도 28. 슬리핑 뷰티 트랜스포존 및 MTX: CD19 CAR: CD8+ 세포 성장. CD19CAR의 발현. CD19CAR에 대한 유전자를 보유하는 슬리핑 뷰티 구축물을 구축하였다 (SB: CD19CAR). 세포를 DNA (2.5 ㎍ 또는 5 ㎍), 또는 RNA (1 ㎍ 또는 3 ㎍)로 형질감염시켰다. 세포를 성장시키고, 형질감염 후 제7일에 MTX에 노출시켰다. 도시된 바와 같이, CD8+ 세포는 보다 낮은 농도의 DNA가 형질감염될 때 성장할 수 있었다. 그러나, RNA를 사용할 경우에는, 보다 높은 농도는 보다 양호한 발현을 유도하지만, 보다 낮은 농도는 보다 우수한 초기 세포 성장을 유도하는 것이 관찰되었다.
도 29. 슬리핑 뷰티 트랜스포존: 미니서클 구축물. 본원에서 설명되는 몇몇의 대안에 대해 설계된 몇몇의 슬리핑 뷰티 구축물의 모식도가 도면에 도시된다.
도 30. 슬리핑 뷰티 트랜스포존 및 MTX: 다중의 3개의 FP. 세포를 DNA 또는 mcFP로 전기천공시키고, MTX의 존재 하에 성장시켰다. 이후에, 세포를 산포도에 의해 표시되는 바와 같이 mCherry, BFP, 및/또는 GFP의 발현에 대해 분석하였다.
도 31. 슬리핑 뷰티 트랜스포존 및 MTX: 다중의 3개의 FP.
도 32. 슬리핑 뷰티 트랜스포존: 미니서클 구축물. 본원에서 설명되는 몇몇의 대안에 대해 설계된 몇몇의 슬리핑 뷰티 구축물의 모식도가 도면에 도시된다.
도 33. 도시된 바와 같이, 슬리핑 뷰티 트랜스포존을 포함하는 DNA로 전기천공된 세포를 제2 라운드의 선택으로서 상이한 농도의 MTX에 적용하였다.
도 34. 상이한 농도의 MTX (2, 100 nM, 250 nM, 및 500 nM)의 존재 하에 슬리핑 뷰티 트랜스포존을 포함하는 DNA로 전기천공된 세포에서 S마커 단백질의 발현.
도 35. 슬리핑 뷰티 트랜스포존: 미니서클 구축물. 본원에서 설명되는 몇몇의 대안에 대해 설계된 몇몇의 슬리핑 뷰티 구축물의 모식도가 도면에 도시된다.
발명의 상세한 설명
하기 정의는 본 발명의 실시양태 또는 대안의 이해를 용이하게 하기 위해 제공된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 부정관사 ("a" 또는 "an")는 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약"은 값이 값을 결정하기 위해 사용되는 방법의 고유한 오차 변동, 또는 실험 중에 존재하는 변동을 포함함을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "핵산" 또는 "핵산 분자"는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA), 올리고뉴클레오티드, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 생성된 단편, 및 임의의 라이게이션, 절단, 엔도뉴클레아제 작용, 및 엑소뉴클레아제 작용에 의해 생성된 단편을 의미한다. 핵산 분자는 천연 생성 뉴클레오티드 (예컨대 DNA 및 RNA)의 단량체, 또는 천연 생성 뉴클레오티드의 유사체 (예를 들어, 천연 생성 뉴클레오티드의 에난티오머 형태), 또는 이 둘의 조합물로 이루어질 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 당 모이어티 (moiety) 및/또는 피리미딘 또는 퓨린 염기 모이어티에 변경을 가질 수 있다. 당 변형은 예를 들어 하나 이상의 히드록실기의 할로겐, 알킬기, 아민 및 아지도기로의 교체를 포함하거나, 또는 당은 에테르 또는 에스테르로서 관능화될 수 있다. 또한, 전체 당 모이어티는 입체적으로 및 전자적으로 유사한 구조, 예컨대 아자-당 및 카르보시클릭 당 유사체로 교체될 수 있다. 염기 모이어티의 변형의 예는 알킬화된 퓨린 및 피리미딘, 아실화된 퓨린 또는 피리미딘, 또는 다른 공지의 헤테로시클릭 치환체를 포함한다. 핵산 단량체는 포스포디에스테르 결합 또는 상기 연결의 유사체에 의해 연결될 수 있다. 포스포디에스테르 연결의 유사체는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트 포스포로디셀레노에이트 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐리데이트, 포스포르아미데이트 등을 포함한다. 용어 "핵산 분자"는 또한 폴리아미드 백본에 부착된 천연 생성 또는 변형된 핵산을 포함하는 소위 "펩티드 핵산"을 포함한다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 본원에서 설명되는 일부 대안에서, 핵산의 유전자 내로의 안정한 삽입을 위한 유전자 전달 폴리뉴클레오티드가 제공된다. "올리고뉴클레오티드"는 핵산과 교환가능하게 사용될 수 있고, DNA 또는 RNA, 이중 가닥 또는 단일 가닥 조각 또는 DNA 또는 RNA를 의미할 수 있다.
"유전자"는 유기체에서 기능하는 폴리펩티드 또는 RNA 사슬을 코딩하는 데옥시리보핵산 (DNA) 및 리보핵산 (RNA)의 일부 스트레치 (stretch)를 설명하는 살아있는 유기체의 유전적 분자 단위이고, 유기체의 게놈에 위치할 수 있는 영역일 수 있다. 본원에서 설명되는 일부 대안에서, 삽입을 위한 핵산이 유전자 전달 폴리뉴클레오티드 내의 역위 말단 반복체 유전자 서열의 측면에 위치하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 선택가능한 것인, 핵산의 유전자 내로의 안정한 삽입을 위한 유전자 전달 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
"염색체"는 DNA, 단백질 및 RNA로 이루어지는, 세포에서 발견되는 거대분자의 복합체인 패키징되고 조직화된 염색질이다. 일부 대안에서, 삽입을 위한 핵산이 유전자 전달 폴리뉴클레오티드 내의 역위 말단 반복체 유전자 서열의 측면에 위치하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 선택가능한 것인, 핵산의 유전자 내로의 안정한 삽입을 위한 유전자 전달 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일부 대안에서, 핵산은 염색체의 유전자 내로 삽입된다.
"프로모터"는 구조 유전자의 전사를 유도하는 뉴클레오티드 서열이다. 일부 대안에서, 프로모터는 구조 유전자의 전사 출발 부위에 근접한, 유전자의 5' 비-코딩 영역에 위치한다. 전사 개시에서 기능하는 프로모터 내의 서열 요소는 종종 컨센서스 뉴클레오티드 서열을 특징으로 한다. 상기 프로모터 요소는 RNA 폴리머라제 결합 부위, TATA 서열, CAAT 서열, 분화-특이적 요소 (DSE; [McGehee et al., Mol. Endocrinol. 7:551 (1993)]; 그 전부는 본원에 참고로 포함됨), 시클릭 AMP 반응 요소 (CRE), 혈청 반응 요소 (SRE; [Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1:47 (1990)]; 그 전부는 본원에 참고로 포함됨), 글루코코르티코이드 반응 요소 (GRE), 및 다른 전사 인자, 예컨대 CRE/ATF (O'Reilly et al., J. Biol. Chem. 267:19938 (1992); 그 전부는 본원에 참고로 포함됨), AP2 (Ye et al., J. Biol. Chem. 269:25728 (1994); 그 전부는 본원에 참고로 포함됨), SP1, cAMP 반응 요소 결합 단백질 (CREB; [Loeken, Gene Expr. 3:253 (1993)]; 그 전부는 본원에 참고로 포함됨) 및 팔량체 인자 (일반적으로, 문헌 [Watson et al., eds., Molecular Biology of the Gene, 4th ed. (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987]; 그 전부는 본원에 참고로 포함됨)), 및 [Lemaigre and Rousseau, Biochem. J. 303:1 (1994)]; 그 전부는 본원에 참고로 포함됨)에 대한 결합 부위를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 프로모터는 구성적 활성, 억제가능 또는 유도가능성일 수 있다. 프로모터가 유도가능 프로모터인 경우, 전사 속도는 유도제에 반응하여 증가한다. 이와 대조적으로, 전사 속도는 프로모터가 구성적 프로모터일 경우 유도제에 의해 조절되지 않는다. 억제가능 프로모터도 알려져 있다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드가 제시된다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 프로모터 서열을 포함한다.
"선택가능 마커 카세트"는 인공 선택을 위한 형질을 부여하는, 벡터 또는 세포 내로 도입되는 유전자이다. 선택가능 마커 카세트는 연구자가 원하는 세포와 원치 않는 세포를 구별하거나 특정 세포 종류를 풍부하게 할 수 있도록 하는 선별가능 마커일 수 있다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드가 제시된다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 선택가능 마커 카세트를 포함한다.
"디히드로폴레이트 리덕타제", 또는 DHFR은 본원에서 설명되는 바와 같이, 1-탄소 전달 화학에서 사용되는 테트라히드로폴레이트 보조인자의 종류들로 전환될 수 있는, 전자 공여자로서 NADPH를 사용하여 디히드로폴산을 테트라히드로폴산으로 환원하는 효소이다. 본원에서 설명되는 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체를 코딩하는 적어도 하나의 선택가능 마커 카세트를 포함한다.
"메토트렉세이트" (MTX)는 본원에서 설명되는 바와 같이, 항대사물 및 항폴레이트제 약물이다. 이것은 폴산의 대사를 억제함으로써 작용한다. 일부 대안에서, 입양 T-세포 면역요법을 위한 조작된 다중화 T-세포의 생성 방법이 제공된다. 가장 넓은 의미에서, 방법은 본원에서 설명되는 임의의 대안의 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 T-세포 내로 도입하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 제공하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 T-세포 내로 도입하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 선택하고, 여기서 선택은 제1 라운드의 선택 및 제2 라운드의 선택을 포함하고, 제1 라운드의 선택은 선택 시약을 제1 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 라운드의 선택은 동일한 선택 시약을 제2 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 더 높고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 적어도 1.5배 더 높고, 상기 선택 압력 하에 표현형을 발현하는 T-세포를 단리하는 것을 포함할 수 있다. 본원에서 설명되는 일부 대안에서, 선택 시약은 선택제를 포함한다. 일부 대안에서, 선택 시약은 MTX이다.
"역위 반복체" 또는 IR은 그의 역 상보체가 하류에 존재하는 뉴클레오티드의 서열이다. 역위 반복체는 많은 중요한 생물학적 기능을 가질 수 있다. 이들은 트랜스포존 내의 경계를 규정할 수 있고, 자가상보성 염기쌍을 형성할 수 있는 영역 (서로 염기쌍을 형성할 수 있는 단일 서열 내의 영역)을 나타낸다. 상기 특성은 게놈 불안정성에서 중요한 역할을 수행하고, 세포 진화, 유전적 다양성 및 또한 돌연변이 및 질환에 기여한다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 제1 역위 말단 반복체 유전자 서열 및 제2 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 2개의 역위 반복 서열 사이에 위치하는 슬리핑 뷰티 트랜스포존을 포함한다.
슬리핑 뷰티 트랜스포사제는 슬리핑 뷰티 트랜스포존의 IR 상에 위치하는 특이적 결합 부위에 결합한다. IR (역위 반복)의 서열은 다음과 같다:
Figure pct00015
"폴리펩티드"는 천연 생성되거나 합성에 의해 생산되거나, 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기의 중합체이다. 약 10개 미만의 아미노산 잔기의 폴리펩티드는 통상적으로 "펩티드"로 언급된다.
"단백질"은 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 거대분자이다. 단백질은 또한 비-펩티드 성분, 예컨대 탄수화물 기를 포함할 수 있다. 탄수화물 및 다른 비-펩티드 치환체는 단백질이 생산되는 세포에 의해 단백질에 첨가될 수 있고, 세포의 종류에 따라 상이할 것이다. 단백질은 본원에서 그의 아미노산 백본 구조의 측면에서 규정되고; 치환체, 예컨대 탄수화물 기는 일반적으로 특정되지 않지만, 존재할 수 있다. 일부 대안에서, 삽입을 위한 핵산이 유전자 전달 폴리뉴클레오티드 내의 역위 말단 반복체 유전자 서열의 측면에 위치하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 선택가능한 것인, 핵산의 유전자 내로의 안정한 삽입을 위한 유전자 전달 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 단백질에 대한 서열을 추가로 포함한다.
"항체"는 본원에서 설명되는 바와 같이, 외래 물질, 예컨대 박테리아 및 바이러스를 확인하고 중화하기 위해 면역 시스템에 의해 사용되는 형질 세포에 의해 생산되는 큰 Y-형 단백질을 의미한다. 항체 단백질은 4개의 폴리펩티드 사슬; 즉 디술피드 결합에 의해 연결된 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄를 포함할 수 있다. 각각의 사슬은 이뮤노글로불린 도메인으로 불리는 구조 도메인으로 이루어진다. 이들 도메인은 약 70-110개의 아미노산을 함유할 수 있고, 그의 크기 및 기능에 따라 상이한 범주로 분류된다. 일부 대안에서, 삽입을 위한 핵산이 유전자 전달 폴리뉴클레오티드 내의 역위 말단 반복체 유전자 서열의 측면에 위치하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 선택가능한 것인, 핵산의 유전자 내로의 안정한 삽입을 위한 유전자 전달 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 단백질에 대한 서열을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 인간화될 수 있는 항체 또는 그의 일부에 대한 서열을 포함할 수 있다.
키메라 T-세포 수용체로도 알려진 "키메라 항원 수용체" (CAR)는 임의의 특이성을 면역 이펙터 세포 상에 이식한 조작된 수용체인 인공 T-세포 수용체를 의미한다. 이들 수용체는 예를 들어 모노클로날 항체의 특이성을 T-세포 상에 이식하기 위해 사용될 수 있고, 그의 코딩 서열의 전달은 레트로바이러스 벡터에 의해 촉진된다. CAR의 구조는 CD3-제타 막횡단 및 엔도도메인에 융합된, 모노클로날 항체로부터 유래된 단일쇄 가변 단편 (scFv)을 포함할 수 있다. 상기 분자는 그의 표적의 scFv에 의한 인식에 반응하여 제타 신호를 전달한다. 일부 대안은 핵산의 유전자 내로의 안정한 삽입을 위한 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 이용하고, 여기서 삽입을 위한 핵산은 유전자 전달 폴리뉴클레오티드 내의 역위 말단 반복체 유전자 서열의 측면에 위치하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 선택가능하다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 단백질에 대한 서열을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 단백질은 키메라 항원 수용체이다. 키메라 수용체는 또한 인공 T 세포 수용체, 키메라 T 세포 수용체, 키메라 면역수용체, 및 키메라 항원 수용체 (CAR)로도 언급될 수 있다. 이들 CAR은 임의의 특이성을 면역 수용체 세포 상에 이식할 수 있는 조작된 수용체이다. 키메라 항원 수용체 또는 "CAR"은 일부 연구자들에 의해 일부 맥락에서 항체 또는 항체 단편, 스페이서, 신호전달 도메인, 및 막횡단 영역을 포함하는 것으로 고려된다. 그러나, CAR의 상이한 성분 또는 도메인, 예컨대 에피토프 결합 영역 (예를 들어, 항체 단편, scFv, 또는 그의 일부), 스페이서, 막횡단 도메인, 및/또는 신호전달 도메인을 변형할 때의 놀라운 효과 때문에, CAR의 성분은 일부 맥락에서 상기 특징부를 독립적인 요소로 포함하는 것으로 본원에서 설명된다. CAR의 상이한 요소의 변화는 예를 들어 특이적 에피토프에 대해 더 강한 결합 친화도를 유도할 수 있다.
인공 T-세포 수용체, 또는 CAR은 입양 세포 전달로 불리는 기술을 사용하여 암 또는 바이러스 감염에 대한 요법으로서 사용될 수 있다. T-세포는 암세포 또는 바이러스, 또는 바이러스-감염 세포에서 제시되는 분자에 특이적인 수용체를 발현하도록 환자로부터 제거되어 변형된다. 암세포 또는 바이러스 감염된 세포를 인식하고 사멸시키거나 또는 바이러스의 청소를 촉진할 수 있는 유전자 조작된 T-세포는 환자 내로 재도입된다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 키메라 항원 수용체에 대한 서열을 포함할 수 있다. 일부 대안에서, 입양 T-세포 면역요법을 위한 조작된 다중화 T-세포의 생성 방법이 제공된다. 가장 넓은 의미에서, 방법은 본원에서 설명되는 임의의 하나의 대안의 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 T-세포 내로 도입하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 제공하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 T-세포 내로 도입하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 선택하고, 여기서 선택은 제1 라운드의 선택 및 제2 라운드의 선택을 포함하고, 제1 라운드의 선택은 선택 시약을 제1 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 라운드의 선택은 선택 시약을 제2 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 적어도 1.5배 더 높고, 선택 압력 하에 표현형을 발현하는 T-세포를 단리하는 것을 포함할 수 있다. 일부 대안에서, 선택 시약은 MTX이다.
T-세포 공동자극은 효과적인 면역 반응의 발생을 위해 요구되고, 이러한 이벤트는 림프구의 활성화 동안 발생한다. 공동자극 신호는 항원 비-특이적이고, 항원 보유 세포 및 T-세포의 막 상에서 발현되는 공동자극 분자 사이의 상호작용에 의해 제공된다. 공동자극 분자는 CD28, CD80, 및 CD86을 포함할 수 있고, 이로 제한되지 않는다. 일부 대안에서, 입양 T-세포 면역요법을 위한 조작된 다중화 T-세포의 생성 방법이 제공된다. 일부 대안에서, T-세포는 키메라 항원 수용체 보유 T-세포이다. 일부 대안에서, 키메라 항원 수용체 보유 T-세포는 공동자극 리간드를 발현하도록 조작된다. 일부 대안에서, 대상체에서 암 또는 바이러스 감염을 치료, 억제 또는 개선하기 위한 방법이 제공된다. 가장 넓은 의미에서, 방법은 대상체에게 본원에서 설명되는 임의의 대안의 T-세포를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 유전자 조작된 T 세포는 암 또는 바이러스 질환을 치료, 억제 또는 개선하기 위해 사용되고, 여기서 유전자 조작된 T 세포는 바이러스 또는 암세포에 의해 제시되는 분자에 특이적인 수용체 또는 키메라 수용체를 코딩하는 다수의 트랜스진을 발현하도록 형질전환된 T 세포의 우선적인 증폭에 의해 얻고, 형질전환된 T 세포에 대한 선택 압력은 증가하는 농도의 MTX를 이용하는 2단계 MTX 선택으로 인가된다. 상기 대안의 일부에서, 대상체는 동물, 예컨대 가축 또는 반려 동물이고, 다른 대안에서, 대상체는 인간이다. 상기 대안의 일부에서, 키메라 항원 보유 T-세포는 공동자극 분자를 발현하도록 조작된다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 공동자극 분자에 대한 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 환상이다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 적어도 1 kB 내지 6 kB이다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 미니서클이다.
"T 세포 전구체"는 본원에서 설명되는 바와 같이, 흉선으로 이동하여 T 세포 수용체를 발현하지 않는 T 세포 전구체가 될 수 있는 림프성 전구체 세포를 의미한다. 모든 T 세포는 골수의 조혈 줄기 세포로부터 기원한다. 조혈 줄기 세포로부터의 조혈 전구세포 (림프성 전구 세포)는 흉선으로 이주하고, 세포 분열에 의해 확장되어 미성숙 흉선세포의 큰 집단을 생성한다. 최초의 흉선세포는 CD4 및 CD8을 발현하지 않고, 따라서 이중-음성 (CD4-CD8-) 세포로 분류된다. 이들은 그 발달 단계가 진행되면서 이중-양성 흉선세포 (CD4+CD8+)가 되고, 최종적으로 단일-양성 (CD4+CD8- 또는 CD4-CD8+) 흉선세포로 성숙한 후, 흉선으로부터 말초 조직으로 방출된다.
약 98%의 흉선세포는 양성 선택 또는 음성 선택에 실패함으로써 흉선에서 발달 과정 동안 죽는 반면, 다른 2%는 생존하고, 흉선에서 방출되어 성숙 면역적격 T 세포가 된다.
전구체 T 세포의 이중 음성 (DN) 단계는 기능적 β-사슬의 생산에 초점을 맞추는 반면, 이중 양성 (DP) 단계는 기능적 α-사슬의 생산에 초점을 맞추어, 궁극적으로 기능적 αβ T 세포 수용체를 생산한다. 흉선세포의 발달이 4개의 DN 단계 (DN1, DN2, DN3, 및 DN4)를 통해 진행되면서, T 세포는 불변 α-사슬을 발현하지만, β-사슬 유전자좌를 재배열한다. 재배열된 β-사슬이 불변 α-사슬과 성공적으로 쌍을 형성하면, β-사슬의 재배열을 종료시키고 (대체 대립유전자 (alternate allele)를 침묵화하고) 세포의 증식을 유도하는 신호가 생성된다. 상기 신호는 세포 표면에 상기 pre-TCR을 필요로 하지만, 신호는 pre-TCR에 대한 리간드 결합에 의존한다. 상기 흉선세포는 이어서 CD4 및 CD8을 모두 발현하고 이중 양성 (DP) 단계로 진행할 것이고, 여기서 α-사슬의 선택이 이루어진다. 재배열된 β-사슬이 어떠한 신호전달도 유도하지 않으면 (예를 들어 불변 α-사슬과 쌍을 형성하는 능력의 부재로 인해), 세포는 무시 (neglect) (신호전달의 결여)에 의해 죽을 수 있다.
"조혈 줄기 세포" 또는 "HSC"는 본원에서 설명되는 바와 같이, 골수양 세포, 예컨대 대식세포, 단핵구, 대식세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 적혈구, 거핵구/혈소판, 수지상 세포 및 림프성 계통 (예컨대, 예를 들어, T-세포, B-세포, NK-세포)을 생성할 수 있는 전구체 세포이다. HSC는 그의 혈액 내의 림프성 대 골수양 자손체의 비 (L/M)에 의해 구분되는, 3개의 줄기 세포 클래스가 존재하는 불균일 집단을 갖는다.
일부 대안에서, 입양 T-세포 면역요법을 위한 조작된 다중화 T-세포의 생성 방법이 제공되고, 이 방법은 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 T-세포 내로 도입하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 제공하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 T-세포 내로 도입하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 선택하고, 여기서 선택은 제1 라운드의 선택 및 제2 라운드의 선택을 포함하고, 제1 라운드의 선택은 선택 시약을 제1 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 라운드의 선택은 선택 시약을 제2 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 더 높고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 적어도 1.5배 더 높고, 선택 압력 하에 표현형을 발현하는 T-세포를 단리하는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 제1 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제1 서열, 제2 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제2 서열, 프로모터 영역 서열을 포함하는 제3 서열, 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 유전자를 포함하고, 최적화된 제4 서열, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체를 코딩하는 적어도 하나의 선택가능 마커 카세트를 포함하고, 여기서 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 메토트렉세이트에 대해 15,000배 또는 약 15,000배 감소된 친화도를 갖고, 메토트렉세이트는 유전자 전달 폴리뉴클레오티드로 형질도입된 세포를 선택적으로 증폭하기 위해 선택 메카니즘으로서 사용될 수 있는 것인, 최적화된 제5 서열, 제1 부착 부위 (attP)를 포함하는 제6 서열, 제2 부착 부위 (attB)를 포함하는 제7 서열을 포함하고, 여기서 각각의 제1 서열, 제2 서열, 제3 서열, 제4 서열, 제5 서열, 제6 서열, 및 제7 서열은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, 제1 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제1 서열의 3' 말단은 제3 서열의 5' 말단에 인접하고, 제3 서열의 3' 말단은 제4 서열의 5' 말단에 인접하고, 제4 서열의 3' 말단은 제5 서열의 5' 말단에 인접하고, 제5 서열의 3' 말단은 제2 역위 말단 반복체를 포함하는 제2 서열의 5' 말단에 인접한다. 일부 대안에서, 인간 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체를 코딩하는 유전자는 다음 DNA 서열을 포함한다:
Figure pct00016
일부 대안에서, 인간 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 다음 단백질 서열을 포함한다:
Figure pct00017
일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 환상이다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 적어도 1 kB 내지 5 kB이다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 미니서클이다. 일부 대안에서, 프로모터 영역은 EF1 프로모터 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제4 서열은 단백질을 코딩하는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 유전자를 포함한다. 일부 대안에서, 제4 서열은 제4 서열의 총 GC/AT 비를 감소시키기 위해 코돈 최적화된다. 일부 대안에서, 제4 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화에 의해 최적화된다. 일부 대안에서, 제4 서열은 다수의 관련 단백질을 코딩하는 다수의 핵산으로부터 생성된 컨센서스 서열이다. 일부 대안에서, 제4 서열은 다수의 관련 단백질, 예컨대 동일한 에피토프에 특이적인 다수의 항체 결합 도메인을 코딩하는 다수의 핵산으로부터 생성된 컨센서스 서열이다. 일부 대안에서, 다수의 관련 단백질은 다수의 항체 결합 도메인을 포함하고, 다수의 항체 결합 도메인은 동일한 에피토프에 대해 특이적이다. 일부 대안에서, 제5 서열은 제5 서열의 총 GC/AT 비를 감소시키기 위해 코돈 최적화된다. 일부 대안에서, 제5 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화에 의해 최적화된다. 일부 대안에서, 단백질은 요법을 위한 단백질이다. 일부 대안에서, 코돈 최적화 및/또는 컨센서스 서열은 다수의 관련 서열에서 이용되는 서열 및/또는 핵염기의 가변성을 비교함으로써 생성된다. 일부 대안에서, 단백질은 항체 또는 그의 일부를 포함하고, 이것은 인간화될 수 있다. 일부 대안에서, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 L22F 및 F31S의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일부 대안에서, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 L22F 및 F31S의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일부 대안에서, 도입은 전기천공에 의해 수행된다. 일부 대안에서, 선택은 선택 마커 카세트를 통해 선택 압력을 증가시킴으로써 수행된다. 일부 대안에서, 선택 시약은 선택제를 포함한다. 일부 대안에서, 선택제는 메토트렉세이트이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 50 nM - 100 nM이고, 제2 농도 범위는 적어도 75 내지 150 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도는 50 nM, 60 nM, 70 nM, 80 nM, 90 nM, 또는 100 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이고, 제2 농도 범위는 75 nM, 80 nM, 90 nM, 100 nM, 110 nM, 120 nM, 130 nM, 140 nM, 또는 150 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 75 nM - 150 nM이고, 제2 농도 범위는 적어도 112.5 nM 내지 225 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도는 75 nM, 85 nM, 95 nM, 105 nM, 115 nM, 125 nM, 135 nM, 145 nM, 또는 150 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이고, 제2 농도 범위는 112 nM, 122 nM, 132 nM, 142 nM, 152 nM, 162 nM, 172 nM, 182 nM, 192 nM, 202 nM, 212 nM, 또는 225 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 300 nM - 675 nM이고, 제1 농도 범위는 적어도 450 nM 내지 1012 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도는 300 nM, 350 nM, 400 nM, 450 nM, 500 nM, 550 nM, 600 nM, 650 nM, 또는 675 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이고, 제2 농도 범위는 450 nM, 500 nM, 550 nM, 600 nM, 650 nM, 700 nM, 750 nM, 800 nM, 850 nM, 900 nM, 1000 nM, 또는 1012 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이다. 일부 대안에서, 제1 라운드의 선택은 T-세포를 제2 라운드의 선택 전에 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 라운드의 선택은 T-세포를 단리 전에 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14일 또는 상기 언급된 시점 중 임의의 2개에 의해 규정된 시간 범위 내인 임의의 시간 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 대안에서, T 세포는 전구체 T 세포를 포함한다. 일부 대안에서, 전구체 T 세포는 조혈 줄기 세포이다.
일부 대안에서, 입양 T-세포 면역요법을 위한 조작된 세포의 생성 방법은 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 전구체 T 세포 내로 도입하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 제공하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 전구체 T 세포 내로 도입하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 포함하는 전구체 T 세포를 선택하고; 여기서 선택은 제1 라운드의 선택 및 제2 라운드의 선택을 포함하고, 제1 라운드의 선택은 선택 시약을 제1 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 라운드의 선택은 선택 시약을 제2 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 더 높고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 적어도 1.5배 더 높고, 선택 압력 하에 표현형을 발현하는 전구체 T-세포를 단리하는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 핵산의 올리고뉴클레오티드 내로의 안정한 삽입을 위한 것이고, 삽입을 위한 핵산은 유전자 전달 폴리뉴클레오티드 내의 역위 말단 반복체 유전자 서열의 측면에 위치하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 선택가능하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 제1 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제1 서열, 제2 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제2 서열, 프로모터 영역 서열을 포함하는 제3 서열, 적어도 하나의 유전자를 포함하고, 적어도 하나의 유전자는 단백질을 코딩하거나 mRNA 전사를 위한 서열을 코딩하는 것인, 최적화된 제4 서열, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체를 코딩하는 적어도 하나의 선택가능 마커 카세트를 포함하고, 여기서 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 메토트렉세이트에 대해 15,000배 또는 약 15,000배 감소된 친화도를 갖고, 메토트렉세이트는 적어도 하나의 유전자를 발현하는 세포의 비를 향상시키기 위해 유전자 전달 폴리뉴클레오티드로 형질도입된 세포를 선택하기 위해 사용될 수 있는 것인, 최적화된 제5 서열, 제1 부착 부위 (attP)를 포함하는 제6 서열, 제2 부착 부위 (attB)를 포함하는 제7 서열을 포함하고; 여기서, 각각의 제1 서열, 제2 서열, 제3 서열, 제4 서열, 제5 서열, 제6 서열, 및 제7 서열은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, 제1 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제1 서열의 3' 말단은 제3 서열의 5' 말단에 인접하고, 제3 서열의 3' 말단은 제4 서열의 5' 말단에 인접하고, 제4 서열의 3' 말단은 제5 서열의 5' 말단에 인접하고, 제5 서열의 3' 말단은 제2 역위 말단 반복체를 포함하는 제2 서열의 5' 말단에 인접한다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 환상이다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 적어도 1 kB 내지 5 kB이다. 일부 대안에서, 프로모터 영역은 EF1 프로모터 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제4 서열은 단백질을 코딩하는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 유전자를 포함한다. 일부 대안에서, 제4 서열은 제4 서열의 총 GC/AT 비를 감소시키기 위해 코돈 최적화된다. 일부 대안에서, 제4 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화에 의해 최적화된다. 일부 대안에서, 제4 서열은 다수의 관련 단백질을 코딩하는 다수의 핵산으로부터 생성된 컨센서스 서열이다. 일부 대안에서, 제4 서열은 다수의 관련 단백질, 예컨대 동일한 에피토프에 특이적인 다수의 항체 결합 도메인을 코딩하는 다수의 핵산으로부터 생성된 컨센서스 서열이다. 일부 대안에서, 다수의 관련 단백질은 다수의 항체 결합 도메인을 포함하고, 다수의 항체 결합 도메인은 동일한 에피토프에 대해 특이적이다. 일부 대안에서, 제5 서열은 제5 서열의 총 GC/AT 비를 감소시키기 위해 코돈 최적화된다. 일부 대안에서, 제5 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화에 의해 최적화된다. 일부 대안에서, 코돈 최적화 및/또는 컨센서스 서열은 다수의 관련 서열에서 이용되는 서열 및/또는 핵염기의 가변성을 비교함으로써 생성된다. 일부 대안에서, 단백질은 요법을 위한 단백질이다. 일부 대안에서, 단백질은 항체 또는 그의 일부를 포함하고, 이것은 인간화될 수 있다. 일부 대안에서, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 L22F 및 F31S의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 미니서클이다. 일부 대안에서, 도입은 전기천공에 의해 수행된다. 일부 대안에서, 선택은 선택 마커 카세트를 통해 선택 압력을 증가시킴으로써 수행된다. 일부 대안에서, 선택 시약은 선택제를 포함한다. 일부 대안에서, 선택제는 메토트렉세이트이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 50 nM - 100 nM이고, 제2 농도 범위는 적어도 75 내지 150 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 75 nM - 150 nM이고, 제2 농도 범위는 적어도 112.5 nM 내지 225 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 300 nM - 675 nM이고, 제1 농도 범위는 적어도 450 nM 내지 1012 nM이다. 일부 대안에서, 제1 라운드의 선택은 T-세포를 제2 라운드의 선택 전에 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 라운드의 선택은 T-세포를 단리 전에 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14일 또는 상기 언급된 시점 중 임의의 2개에 의해 규정된 시간 범위 내인 임의의 시간 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 대안에서, T 세포 전구체는 조혈 줄기 세포이다.
일부 대안에서, 전구체 T-세포에서 단백질 생산을 증가시키는 방법이 제공되고, 이 방법은 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 제공하고; 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 전구체 T-세포 내로 도입하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 포함하는 전구체 T 세포를 선택하고, 여기서 선택은 제1 라운드의 선택 및 제2 라운드의 선택을 포함하고, 제1 라운드의 선택은 선택 시약을 제1 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 라운드의 선택은 선택 시약을 제2 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 더 높고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 적어도 1.5배 더 높고, 선택 압력 하에 표현형을 발현하는 전구체 T-세포를 단리하는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 핵산의 올리고뉴클레오티드 내로의 안정한 삽입을 위한 것이고, 삽입을 위한 핵산은 유전자 전달 폴리뉴클레오티드 내의 역위 말단 반복체 유전자 서열의 측면에 위치하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 선택가능하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 제1 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제1 서열, 제2 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제2 서열, 프로모터 영역 서열을 포함하는 제3 서열, 적어도 하나의 유전자를 포함하고, 적어도 하나의 유전자는 단백질을 코딩하거나 mRNA 전사를 위한 서열을 코딩하는 것인, 최적화된 제4 서열, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체를 코딩하는 적어도 하나의 선택가능 마커 카세트를 포함하고, 여기서 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 메토트렉세이트에 대해 15,000배 또는 약 15,000배 감소된 친화도를 갖고, 메토트렉세이트는 적어도 하나의 유전자를 발현하는 세포의 비를 향상시키기 위해 유전자 전달 폴리뉴클레오티드로 형질도입된 세포를 선택하기 위해 사용될 수 있는 것인, 최적화된 제5 서열, 제1 부착 부위 (attP)를 포함하는 제6 서열, 제2 부착 부위 (attB)를 포함하는 제7 서열을 포함하고; 여기서, 각각의 제1 서열, 제2 서열, 제3 서열, 제4 서열, 제5 서열, 제6 서열, 및 제7 서열은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, 제1 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제1 서열의 3' 말단은 제3 서열의 5' 말단에 인접하고, 제3 서열의 3' 말단은 제4 서열의 5' 말단에 인접하고, 제4 서열의 3' 말단은 제5 서열의 5' 말단에 인접하고, 제5 서열의 3' 말단은 제2 역위 말단 반복체를 포함하는 제2 서열의 5' 말단에 인접한다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 환상이다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 적어도 1 kB 내지 5 kB이다. 일부 대안에서, 프로모터 영역은 EF1 프로모터 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제4 서열은 단백질을 코딩하는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 유전자를 포함한다. 일부 대안에서, 제4 서열은 제4 서열의 총 GC/AT 비를 감소시키기 위해 코돈 최적화된다. 일부 대안에서, 제4 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화에 의해 최적화된다. 일부 대안에서, 제4 서열은 다수의 관련 단백질을 코딩하는 다수의 핵산으로부터 생성된 컨센서스 서열이다. 일부 대안에서, 제4 서열은 다수의 관련 단백질, 예컨대 동일한 에피토프에 특이적인 다수의 항체 결합 도메인을 코딩하는 다수의 핵산으로부터 생성된 컨센서스 서열이다. 일부 대안에서, 다수의 관련 단백질은 다수의 항체 결합 도메인을 포함하고, 다수의 항체 결합 도메인은 동일한 에피토프에 대해 특이적이다. 일부 대안에서, 제5 서열은 제5 서열의 총 GC/AT 비를 감소시키기 위해 코돈 최적화된다. 일부 대안에서, 제5 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화에 의해 최적화된다. 일부 대안에서, 코돈 최적화 및/또는 컨센서스 서열은 다수의 관련 서열에서 이용되는 서열 및/또는 핵염기의 가변성을 비교함으로써 생성된다. 일부 대안에서, 단백질은 요법을 위한 단백질이다. 일부 대안에서, 단백질은 항체 또는 그의 일부를 포함하고, 이것은 인간화될 수 있다. 일부 대안에서, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 L22F 및 F31S의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 미니서클이다. 일부 대안에서, 도입은 전기천공에 의해 수행된다. 일부 대안에서, 선택은 선택 마커 카세트를 통해 선택 압력을 증가시킴으로써 수행된다. 일부 대안에서, 선택 시약은 선택제를 포함한다. 일부 대안에서, 선택제는 메토트렉세이트이다.
일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 50 nM - 100 nM이고, 제2 농도 범위는 적어도 75 내지 150 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 75 nM - 150 nM이고, 제2 농도 범위는 적어도 112.5 nM 내지 225 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 300 nM - 675 nM이고, 제2 농도 범위는 적어도 450 nM 내지 1012 nM이다. 일부 대안에서, 제1 라운드의 선택은 세포를 제2 라운드의 선택 전에 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 라운드의 선택은 세포를 단리 전에 적어도 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 전구체 T 세포는 조혈 줄기 세포이다.
비-숙주 DNA 분자에 의해 코딩되는 펩티드 또는 폴리펩티드는 "이종성" 펩티드 또는 폴리펩티드이다.
"통합된 유전 요소"는 요소가 인간의 조작을 통해 세포 내로 도입된 후, 숙주 세포의 염색체 내로 통합된 DNA의 절편이다. 본 대안 내에서, 통합된 유전 요소는 전기천공 또는 다른 기술에 의해 세포 내로 도입된 미니서클로부터 유래될 수 있다. 통합된 유전 요소는 본래의 숙주 세포로부터 그의 자손체로 전달된다. 일부 대안에서, 통합된 유전 요소는 환상의 유전자 전달 폴리뉴클레오티드에 의해 숙주 세포의 염색체 내로 통합된다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 적어도 1 kB 내지 6 kB이다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 미니서클이다.
"클로닝 벡터" 또는 벡터는 숙주 세포에서 자가 복제하는 능력을 갖는 핵산 분자, 예컨대 미니서클, 플라스미드, 코스미드, 플라스톰 (plastome), 또는 박테리오파지이다. 클로닝 벡터는 일반적으로 벡터의 필수적인 생물학적 기능을 상실하지 않으면서 결정가능한 방식으로 핵산 분자의 삽입을 허용하는 하나 또는 적은 수의 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위, 및 클로닝 벡터로 형질도입된 세포의 확인 및 선택에 사용하기 적합한 마커 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 마커 유전자는 일반적으로 테트라사이클린 내성 또는 암피실린 내성을 제공하는 유전자를 포함하지만, 일부 대안에서 메토트렉세이트 내성 유전자를 포함할 수 있다.
"발현 벡터"는 숙주 세포에서 발현되는 유전자를 코딩하는 핵산 분자이다. 일반적으로, 발현 벡터는 전사 프로모터, 유전자, 및 전사 종결인자를 포함한다. 유전자 발현은 대체로 프로모터의 제어 하에 있고, 상기 유전자는 프로모터에 "작동가능하게 연결된" 것으로 언급된다. 유사하게, 조절 요소 및 코어 프로모터는 조절 요소가 코어 프로모터의 활성을 조절할 경우 작동가능하게 연결된 것이다. 일부 대안에서, 발현 벡터가 제공된다. 일부 대안에서, 발현 벡터는 트랜스포사제를 코딩한다. 일부 대안에서, 트랜스포사제는 슬리핑 뷰티 트랜스포사제이다. 일부 대안에서, 발현 벡터는 환상이다. 일부 대안에서, 발현 벡터는 적어도 1 kB 내지 6 kB이다. 일부 대안에서, 발현 벡터는 미니서클이다.
"미니서클"은 본원에서 설명되는 바와 같이, 모든 원핵 벡터 부분으로부터 자유로운 작은 환상 플라스미드 유도체이다. 미니서클은 포유동물 세포의 유전자 변형을 위한 트랜스진 운반체로서 적용된 발현 벡터로서 기능할 수 있고, 미니서클은 박테리아 DNA 서열을 보유하지 않기 때문에 미니서클이 외래 물질로 인지되어 파괴될 가능성이 낮다는 이점이 존재한다. 따라서, 일반적인 트랜스진 전달 방법은 외래 DNA를 함유하는 플라스미드를 수반한다. 보다 작은 크기의 미니서클은 또한 그의 클로닝 용량을 확장하고, 그의 세포 내로의 전달을 용이하게 한다. 비제한적으로, 미니서클의 제조는 2 단계 절차를 따를 수 있고, 이 절차는 이. 콜라이(E. coli)에서 모 플라스미드 (진핵 삽입물이 존재하는 박테리아 플라스미드)의 생산 및 상기 과정의 종료시에, 그러나 계속 박테리아 내에서 부위-특이적 재조합효소의 유도를 수반할 수 있다. 이들 단계 후에, 삽입물의 두 말단에서 2개의 재조합효소-표적 서열을 통한 원핵 벡터 부분의 절제 및 모세관 겔 전기영동 (CGE)에 의한 생성되는 미니서클 (수용자 세포의 매우 효율적인 변형을 위한 운반체) 및 미니플라스미드의 회수가 수행될 수 있다.
정제된 미니서클은 형질감염, 전기천공, 또는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려진 다른 방법에 의해 수용자 세포 내로 전달될 수 있다. 통상적인 미니서클에는 복제 기점이 결여될 수 있고, 따라서 표적 세포 내에서 복제할 수 있고, 코딩되는 유전자는 세포가 분열하면서 사라질 것이다 (이것은 지속적인 발현 또는 일시적인 발현의 필요성에 따라 이점이 되거나 단점이 될 수 있다). 일부 대안은 핵산의 유전자 내로의 안정한 삽입을 위해 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 이용하고, 여기서 삽입을 위한 핵산은 유전자 전달 폴리뉴클레오티드 내의 역위 말단 반복체 유전자 서열의 측면에 위치하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 선택가능하다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 미니서클이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "뉴클레오펙션"은 외인성 핵산(들)의 숙주 세포 내로의 형질감염 방법을 의미하고, 전기천공에 의해 수행된다. 일부 대안에서, 입양 T-세포 면역요법을 위한 조작된 다중화 T-세포의 생성 방법이 제공된다. 가장 넓은 의미에서, 방법은 본원에서 설명되는 임의의 대안의 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 T-세포 내로 도입하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 선택하고, 여기서 선택은 제1 라운드의 선택 및 제2 라운드의 선택을 포함하고, 제1 라운드의 선택은 선택 시약을 제1 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 라운드의 선택은 선택 시약을 제2 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 더 높고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 적어도 1.5배 더 높고, 선택 압력 하에 표현형을 발현하는 T-세포를 단리하는 것을 포함할 수 있다. 일부 대안에서, 선택 시약은 MTX이다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 T-세포 내로 도입하는 것은 전기천공에 의해 수행될 수 있다.
"숙주 세포"는 본원에서 설명되는 바와 같이, 본 대안에 의해 포함되는 하나 이상의 뉴클레아제, 예를 들어 엔도뉴클레아제, 말단-처리 효소, 및/또는 엔도뉴클레아제/말단-처리 효소 융합 단백질 또는 하나 이상의 뉴클레아제, 예를 들어 엔도뉴클레아제, 말단-처리 효소, 및/또는 엔도뉴클레아제/말단-처리 효소 융합 단백질의 복제, 및/또는 전사 또는 전사 및 번역 (발현)을 지지하는 것을 코딩하는 벡터를 포함하는 세포이다. 일부 대안에서, 본 대안에서 사용하기 위한 숙주 세포는 원핵 세포일 수 있다. 면역 시스템의 숙주 세포는 T-세포를 포함할 수 있다. 일부 대안에서, 입양 T-세포 면역요법을 위한 조작된 다중화 T-세포의 생성 방법이 제공된다. 일부 대안에서, 방법은 본원에서 설명되는 임의의 하나의 대안의 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 T-세포 내로 도입하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 제공하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 T-세포 내로 도입하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 선택하고, 여기서 선택은 제1 라운드의 선택 및 제2 라운드의 선택을 포함하고, 제1 라운드의 선택은 선택 시약을 제1 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 라운드의 선택은 선택 시약을 제2 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 더 높고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 적어도 1.5배 더 높고, 선택 압력 하에 표현형을 발현하는 T-세포를 단리하는 것을 포함할 수 있다. 일부 대안에서, 선택 시약은 MTX이다.
본원에서 설명되는 바와 같이, "전위성 (transposable) 요소" (TE), 트랜스포존 또는 레트로트랜스포존은 게놈 내의 그의 위치를 변경할 수 있는, 때때로 돌연변이를 생성하거나 역전시키고 세포의 게놈 크기를 변경하는 DNA 서열로서 언급될 수 있다. 전위는 종종 TE의 중복 (duplication)을 유도한다. TE는 진핵 세포의 C-값의 큰 비율을 구성할 수 있다. "C-값"은 본원에서 설명되는 바와 같이, 진핵 유기체의 이배체 체세포 내의 양의 절반인 반수체 핵 내에 함유된 DNA의 양 (피코그램)을 의미한다. 일부의 경우에, 용어 C-값 및 게놈 크기는 교환가능하게 사용되지만, 다배체에서 C-값은 동일한 핵 내에 포함된 2 이상의 게놈을 나타낼 수 있다. 특유한 유전자 시스템을 갖는 옥시트리차(Oxytricha)에서, 이것들은 발생에서 매우 중요한 역할을 수행한다. 이것들은 또한 살아있는 유기체 내의 DNA를 변경하기 위한 수단으로서 연구자들에게 매우 유용하다. 일부 대안에서, 삽입을 위한 핵산이 유전자 전달 폴리뉴클레오티드 내의 역위 말단 반복체 유전자 서열의 측면에 위치하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 선택가능한 것인, 핵산의 유전자 내로의 안정한 삽입을 위한 유전자 전달 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 트랜스포존을 포함한다.
"슬리핑 뷰티 트랜스포존 시스템"은 본원에서 설명되는 바와 같이, 슬리핑 뷰티 (SB) 트랜스포사제 및 특정 DNA 서열을 척추동물의 게놈 내로 삽입하기 위해 1997년도에 설계된 트랜스포존으로 이루어진다. DNA 트랜스포존은 간단한 자르고 붙이기 (cut-and-paste) 방식으로 한 DNA 부위로부터 다른 부위로 이동할 수 있다. 전위는 규정된 DNA 절편이 한 DNA 분자로부터 절제되어 동일하거나 상이한 DNA 분자 또는 게놈 내의 또 다른 부위로 이동하는 정밀한 과정이다.
SB 트랜스포사제는 트랜스포존을 수용자 DNA 서열 내의 TA 디뉴클레오티드 염기쌍 내로 삽입할 수 있다. 삽입 부위는 동일한 DNA 분자, 또는 또 다른 DNA 분자 (또는 염색체) 내의 다른 부위일 수 있다. 인간을 포함하는 포유동물 게놈에는, 약 2억 개의 TA 부위가 존재한다. TA 삽입 부위는 트랜스포존 통합 과정에서 중복된다. 상기 TA 서열의 중복은 전위의 특징이고, 일부 실험에서 메카니즘을 확인하기 위해 사용된다. 트랜스포사제는 트랜스포존 내에서 코딩될 수 있거나 또는 트랜스포사제는 또 다른 공급원에 의해 공급될 수 있고, 이 경우 트랜스포존은 비-자가 요소가 된다.
일부 대안에서, 삽입을 위한 핵산이 유전자 전달 폴리뉴클레오티드 내의 역위 말단 반복체 유전자 서열의 측면에 위치하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 선택가능한 것인, 핵산의 유전자 내로의 안정한 삽입을 위한 유전자 전달 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 트랜스포존을 포함한다. 일부 대안에서, 트랜스포존은 슬리핑 뷰티 트랜스포존이다. 일부 대안에서, 삽입되는 핵산은 역위 말단 반복체 유전자 서열의 측면에 위치하는 슬리핑 뷰티 트랜스포존이다.
일부 대안에서, 핵산의 안정한 삽입을 위한 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 미니서클이다. 일부 대안에서, 핵산의 안정한 삽입을 위한 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 슬리핑 뷰티 트랜스포존을 포함한다. 일부 대안에서, 조작된 다중화 T-세포의 생성 방법이 제공된다. 일부 대안에서, 방법은 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 세포에게 전달하는 것을 포함한다. 일부 대안에서, T-세포에서 단백질 생산을 증가시키는 방법이 제공된다. 일부 대안에서, 방법은 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 제공하는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 방법은 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 세포에게 전달하는 것을 포함한다.
"코돈 최적화"는 본원에서 설명되는 바와 같이, 코돈을 요구되는 세포에서 최대 단백질 발현 효율을 증가시키는 것으로 알려진 코돈으로 변경하는 설계 과정을 의미한다. 일부 대안에서, 코돈 최적화는 코돈 최적화가 높은 단백질 수율을 위해 최적화된 합성 유전자 전사체를 생성하기 위해 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려진 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다. 코돈 최적화를 위한 알고리즘을 포함하는 프로그램은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려져 있다. 프로그램은 예를 들어 옵티멈진(OptimumGene)™, 진지피에스(GeneGPS)® 알고리즘 등을 포함할 수 있다. 추가로 합성 코돈 최적화된 서열은 예를 들어 통합된 DNA 기술 및 다른 상업적으로 이용가능한 DNA 서열결정 서비스로부터 상업적으로 얻을 수 있다. 일부 대안에서, 삽입을 위한 핵산이 유전자 전달 폴리뉴클레오티드 내의 역위 말단 반복체 유전자 서열의 측면에 위치하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 선택가능한 것인, 핵산의 유전자 내로의 안정한 삽입을 위한 유전자 전달 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드가 설명되고, 여기서 완전한 유전자 전사체를 위한 유전자는 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 일부 대안에서, 유전자는 인간 세포에서 최대 단백질 발현을 위해 특이적으로 선택된 코돈을 갖도록 최적화되고, 이들은 T-세포의 단백질 또는 CAR의 농도를 증가시킬 수 있다.
코돈 최적화는 또한 폴리뉴클레오티드에서 2차 구조의 발생을 감소시키기 위해 수행될 수 있다. 일부 대안에서, 코돈 최적화는 또한 총 GC/AT 비를 감소시키기 위해 수행될 수 있다. 엄격한 코돈 최적화는 또한 2차 구조를 유도하는 원치 않는 2차 구조 또는 바람직하지 않은 GC 함량을 유도할 수 있다. 따라서, 2차 구조는 전사 효율에 영향을 준다. 프로그램, 예컨대 진옵티마이저 (GeneOptimizer)는 코돈 사용빈도 최적화 후에, 2차 구조 방지 및 GC 함량 최적화를 위해 사용될 수 있다. 상기 추가의 프로그램은 제1 라운드의 최적화 후에 발생할 수 있는 2차 구조를 제한하기 위해 초기의 코돈 최적화 후에 추가의 최적화 및 문제 해결을 사용될 수 있다. 최적화를 위한 다른 프로그램은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려져 있다. 일부 대안에서, 삽입을 위한 핵산이 유전자 전달 폴리뉴클레오티드 내의 역위 말단 반복체 유전자 서열의 측면에 위치하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 선택가능한 것인, 핵산의 유전자 내로의 안정한 삽입을 위한 유전자 전달 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화되고/되거나 2차 구조를 제거하고/하거나 총 GC/AT 비를 감소시키는 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 서열은 2차 구조 방지를 위해 최적화된다. 일부 대안에서, 서열은 총 GC/AT 비를 감소시키기 위해 최적화된다.
일부 대안에서, 입양 T-세포 면역요법을 위한 조작된 다중화 T-세포의 생성 방법이 제공된다. 가장 넓은 의미에서, 방법은 본원에서 설명되는 임의의 하나의 대안의 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 T-세포 내로 도입하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 제공하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 T-세포 내로 도입하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 선택하고, 여기서 선택은 제1 라운드의 선택 및 제2 라운드의 선택을 포함하고, 제1 라운드의 선택은 선택 시약을 제1 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 라운드의 선택은 선택 시약을 제2 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 더 높고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 적어도 1.5배 더 높고, 선택 압력 하에 표현형을 발현하는 T-세포를 단리하는 것을 포함할 수 있다. 일부 대안에서, 선택 시약은 MTX이다.
암 또는 바이러스 질환에 대한 입양 면역요법 .
암에 대한 입양 면역요법의 전제는 악성 세포의 파괴를 용이하게 하기 위해 환자 자신의 종양-특이적 T-세포를 환자 내로 전달하는 것이다. T-세포는 종양-특이적 항원을 인식하고 암세포에 대한 세포독성 활성을 발휘하도록 유전자 조작될 수 있다. 암에 대한 입양 면역요법의 방법은 환자 T-세포를 단리하고 막횡단 절편을 통해 세포내 신호전달 도메인에 연결된 세포외 종양-결합 도메인을 포함하는 막 단백질인 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현시킴으로써 종양 인식능을 도입하는 것이다. "입양 면역요법" 또는 "T-세포 입양 전달"은 암세포 또는 특정 세포 표적을 공격하는 T-세포 기반 세포독성 반응의 사용을 의미한다. 환자의 암에 대해 천연 또는 유전자 조작된 반응성을 갖는 T-세포는 시험과 내에서 생성된 후, 그를 필요로 하는 대상체에게 다시 전달될 수 있다. 비제한적으로, 입양 전달의 예는 암 또는 바이러스 질환이 있는 대상체로부터 T-세포를 분리함으로써 달성될 수 있고, 상기 T 세포는 유전자 조작된 T-세포가 대상체에게 다시 전달된 후, 유전자 조작된 T 세포가 암세포 또는 바이러스 또는 바이러스 감염된 세포를 공격하도록 암세포 또는 바이러스에서 발견되는 바이오마커에 특이적인 수용체를 발현하도록 유전자 조작될 수 있다. 일부 대안에서, 입양 T-세포 면역요법을 위한 조작된 다중화 T-세포의 생성 방법이 제공된다. 일부 대안에서, 파괴를 위한 악성 세포를 표적화하는 방법이 제공된다. 일부 대안에서, 대상체에서 암 또는 바이러스 질환의 치료, 억제 또는 개선 방법이 제공된다. 일부 대안에서, 대상체에서 암 또는 바이러스 질환의 치료, 억제 또는 개선 방법은 대상체에게 입양 T-세포 면역요법을 위한 조작된 다중화 T-세포를 투여하는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 대상체는 인간이다.
추가의 유전자의 동시-통합은 CAR-발현 T-세포의 항-종양 또는 항바이러스 활성을 추가로 증가시킬 수 있다. 종합적인 T-세포 활성화는 CAR에 의한 초기의 종양 또는 바이러스 인식 및 신호 개시 이외에, 종양 또는 바이러스 감염된 대상체의 면역억제 환경 내에 존재하지 않을 수 있는 공동자극성 및 시토카인 수용체의 관여를 필요로 한다. 상기 종양의 면역억제 환경을 처리하기 위해, 예를 들어, 조작된 CAR-발현 T-세포에서 공동자극 리간드, 예컨대 CD80 및 4-1BBL의 발현은 종양 세포 상의 공동자극 리간드의 발현에 비해 자가-공동자극에 의한 보다 큰 T-세포 팽창을 유도할 수 있다. T-세포 면역요법의 또 다른 문제는 환자 내로의 주입 후 세포 생존이다. 항-아폽토시스 (apoptotic) 단백질의 유도된 발현은 T-세포의 생체내 생존을 개선하는 것으로 밝혀졌다. 종양 지향성 및 침윤은 조작된 T-세포 내의 케모카인 수용체의 도입에 의해 증가될 수 있고, 이 방법은 T-세포에 의해 정상적으로는 인식되지 않는 케모카인을 발현하는 종양에 특히 유용할 수 있다. 마지막으로, T-세포는 예를 들어 유도된 시토카인 발현을 통해 면역억제 종양 환경 또는 면역손상된 바이러스 감염된 대상체에 대해 보다 잘 저항하도록 조작될 수 있다. 따라서, 다수의 트랜스진을 발현하는 조작된 T-세포를 신속하게 생성하는 방법은 T-세포 면역요법의 임상 적용을 위해 중요하고 유리하다. 일부 대안에서, 입양 T-세포 면역요법을 위한 조작된 다중화 T-세포의 생성 방법이 제공된다. 일부 대안에서, T-세포는 키메라 항원 수용체를 발현한다. 일부 대안에서, 키메라 항원 수용체를 발현하는 T-세포는 공동자극 리간드를 발현하도록 조작된다. 일부 대안에서, 키메라 항원 수용체를 발현하는 T-세포는 공동자극 리간드를 발현한다. 일부 대안에서, 공동자극 리간드는 CD80이다. 일부 대안에서, 공동자극 리간드는 4-1BBL이다.
입양 세포 전달은 세포, 면역-유래 세포의 동일한 환자 내로의 재전달 또는 상이한 수용자 숙주 내로의 전달을 의미할 수 있다. 입양 전달을 위한 면역 세포의 단리를 위해, 혈액을 항응고제가 담긴 관 내로 뽑아내고, PBM (연층 (buffy coat)) 세포를 일반적으로 밀도 장벽 원심분리에 의해 단리한다. T-세포 기반 요법에서, 세포는 인터류킨-2의 면역조절 작용에 크게 의존하는 세포 배양 방법을 사용하여 시험과 내에서 팽창되고, 매우 많은 수가 활성화된 상태로 정맥 내로 환자에게 재투여될 수 있다. 항-CD3 항체는 배양액에서 T-세포의 증식을 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 인터류킨-21에 대한 연구는 이것이 시험관 내에서 제조된 T-세포 기반 요법제의 효능 증강시에 중요한 역할을 또한 수행할 수 있음을 나타낸다. 입양 세포 전달에 사용되는 세포는 임의의 수의 목적을 달성하기 위해 재조합 DNA 기술을 사용하여 유전자 변형된 림프구를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 본원에서 설명되는 대안에서, 입양 세포 전달은 세포를 대상체 내에 전달하기 위해 사용되고, 여기서 세포는 CAR 발현 림프구이다. 일부 대안에서, CAR 발현 림프구는 입양 T-세포 면역요법을 위한 조작된 다중화 T-세포를 생성하는 방법에서의 숙주 세포이다. 일부 대안에서, 이 방법은 본원에서 설명되는 대안의 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 T-세포 내로 도입하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 제공하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 T-세포 내로 도입하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 선택하고, 여기서 선택은 제1 라운드의 선택 및 제2 라운드의 선택을 포함하고, 제1 라운드의 선택은 선택 시약을 제1 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 라운드의 선택은 선택 시약을 제2 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 더 높고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 적어도 1.5배 더 높고, 선택 압력 하에 표현형을 발현하는 T-세포를 단리하는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 공동자극 리간드에 대한 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 키메라 항원 수용체에 대한 서열을 포함한다. 일부 대안에서, T-세포는 CAR을 발현한다. 본원에서 설명되는 대안에서, CAR 발현 림프구는 미니서클에 의해 유전자 변형되고, 여기서 미니서클은 슬리핑 뷰티 트랜스포존을 포함한다. 일부 대안에서, 선택 시약은 MTX이다.
비제한적인 예를 들어, 유전자 조작된 T-세포는 예를 들어, 종양 또는 바이러스 항원을 인식하도록 전문화된 T-세포 수용체 (TCR) 유전자의 한 카피를 포함하는 전달 바이러스로 환자의 세포를 감염시킴으로써 생성될 수 있다. 전달 바이러스는 세포 내에서 재생성될 수 없지만, 인간 게놈 내로 통합되어야 하는 것이 중요하다. 이것은 새로운 TCR 유전자가 T-세포에서 안정한 상태로 유지되기 때문에 유익하다. 환자 자신의 T-세포는 상기 전달 바이러스에 노출되고, 이어서 유전자 조작된 TCR을 사용하여 비-특이적으로 팽창되거나 자극된다. 세포는 이어서 환자에게 다시 전달되고, 바이러스, 또는 바이러스 감염된 세포에 대한 면역 반응을 개시하도록 준비되어 있다. 유전자 조작된 T-세포를 사용한 입양 세포 전달의 이용은 다양한 암 또는 바이러스 감염의 치료를 위한 유망한 새로운 방안이다. 일부 대안에서, 암에 대한 입양 면역요법이 제공된다. 일부 대안에서, 바이러스 감염에 대한 입양 면역요법이 제공된다.
바이러스 벡터를 사용하여 유전자 조작된 T-세포를 제조하는 방법은 몇몇 단점을 가질 수 있다. T-세포의 유전자 변형은 일반적으로 γ-레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 수행될 수 있다. 효과적이지만, 단점은 생산 비용, 제한된 유전자 패키징 용량, 및 잠재적인 안전성 문제를 포함한다. 트랜스포존 시스템, 예컨대 슬리핑 뷰티 (SB) 또는 피기Bac (piggyBac)을 포함하는 플라스미드는 유전자를 T-세포 내로 안정적으로 도입하기 위한 비-바이러스 방법을 제공한다. 최근에, 피기Bac 시스템은 다수의 트랜스포존의 전달에 의해 다수의 관심 트랜스진을 발현하는 안정적으로-형질감염된 포유동물 세포를 생산하기 위해 사용되었다. 이비스 (Ivics)와 동료들에 의해 포유동물 세포 사용을 위해 처음 재활성화된 SB 시스템은 T-세포 면역요법의 임상 시험에서 유전자 전달 방식으로서 사용되었다. SB에 의한 유전자 통합은 γ-레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터에 비해 전사 단위 및 그의 조절 서열에 대해 보다 약한 선호도를 갖고, 따라서 더 안전한 것으로 생각된다. 본원에서 설명되는 일부 대안에서, 슬리핑 뷰티 시스템을 포함하는 미니서클에 의한 유전자 변형이 고려된다. 본원에서 설명되는 일부 대안에서, 피기Bac 시스템을 포함하는 미니서클에 의한 유전자 변형이 고려된다. 본원에서 설명되는 일부 대안에서, 슬리핑 뷰티 시스템을 포함하는 미니서클에 의한 유전자 변형이 고려된다.
미니서클은 3가지 이유로 형질감염 플랫폼으로서 특히 매력적이다. 먼저, 전기천공에 의한 미니서클의 형질감염 효율은 그의 플라스미드 유사체보다 우수하다. 두 번째로, 전위 효율은 트랜스포사제 효율에 영향을 주는 것으로 밝혀진, 2개의 트랜스포존 말단 사이의 보다 짧은 거리 때문에 미니서클에서 더 높다. 마지막으로, 뉴클레오펙션 후 세포 생존성은 구축물 크기 증가와 함께 감소하기 때문에, 미니서클은 그의 유사한 플라스미드에 비해 그의 더 작은 크기에 비추어 보다 유리하다. 전위 효율을 추가로 개선하기 위해, 그 전부가 본원에 참고로 포함된 문헌 [Izsvak et al. (Nature Genet. 2009, 41, 753-761]에 의해 개발된 최적화된 SB100X 과다활성 트랜스포사제가, 그 전부가 본원에 참고로 포함된 문헌 [Yant et al. (Mol. Cell. Biol. 2004, 24, 9239-9247]에 의한 SB의 T3 생성과 조합하여 사용될 수 있다. 본원에서 설명되는 몇몇 대안에서, 입양 세포 전달을 위해 유전자 변형된 T-세포의 제조 방법이 고려된다. 일부 대안에서, 방법은 미니서클을 T-세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 도입은 전기천공 전달을 포함한다.
T-세포 면역요법의 또 다른 문제는 환자 내로의 주입 후 세포 생존이다. 항-아폽토시스 단백질의 유도된 발현은 T-세포의 생체내 생존을 개선하는 것으로 밝혀졌다. 종양 지향성 및 침윤은 조작된 T-세포 내의 케모카인 수용체의 도입에 의해 증가되었고; 이 방법은 T-세포에 의해 정상적으로는 인식되지 않는 케모카인을 발현하는 종양에 특히 유용할 수 있다. 마지막으로, T-세포는 예를 들어 유도된 시토카인 발현을 통해 면역억제 종양 환경에 대해 보다 잘 저항하도록 조작될 수 있다. 따라서, 다수의 트랜스진을 발현하는 조작된 T-세포를 신속하게 생성하는 방법은 T-세포 면역요법의 임상 적용을 위해 중요하고 유리하다. 본원에서 설명되는 일부 대안에서, CAR-발현 T-세포의 항-종양 활성을 추가로 증가시키기 위해 동시-통합을 위한 추가의 유전자의 동시-통합을 도입하는 방법이 고려된다. 일부 대안에서, 추가의 유전자는 공동자극 리간드를 코딩한다. 일부 대안에서, 공동자극 리간드는 CD80이다. 일부 대안에서, 공동자극 리간드는 4-1BBL이다. 일부 대안에서, 추가의 유전자는 항-아폽토시스 단백질을 코딩한다. 일부 대안에서, 추가의 유전자는 케모카인 수용체를 코딩한다.
일부 대안에서, 입양 T-세포 면역요법을 위한 조작된 다중화 T-세포의 생성 방법이 제공된다. 가장 넓은 의미에서, 방법은 본원에서 설명되는 임의의 대안의 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 T-세포 내로 도입하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 제공하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 T-세포 내로 도입하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 선택하고, 여기서 선택은 제1 라운드의 선택 및 제2 라운드의 선택을 포함하고, 제1 라운드의 선택은 선택 시약을 제1 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 라운드의 선택은 선택 시약을 제2 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 더 높고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 적어도 1.5배 더 높고, 선택 압력 하에 표현형을 발현하는 T-세포를 단리하는 것을 포함할 수 있다. 일부 대안에서, T-세포는 키메라 항원 수용체 (CAR) 발현 T-세포이다. 일부 대안에서, 선택 시약은 MTX이다.
일부 대안에서, T-세포에서 단백질 생산을 증가시키는 방법이 제공된다. 가장 넓은 의미에서, 방법은 본원에서 설명되는 임의의 대안의 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 T-세포 내로 도입하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 제공하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 T-세포 내로 도입하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 선택하고, 여기서 선택은 제1 라운드의 선택 및 제2 라운드의 선택을 포함하고, 제1 라운드의 선택은 선택 시약을 제1 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 라운드의 선택은 선택 시약을 제2 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 더 높고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 적어도 1.5배 더 높고, 선택 압력 하에 표현형을 발현하는 T-세포를 단리하는 것을 포함할 수 있다. 일부 대안에서, 선택 시약은 MTX이다. 일부 대안에서, T-세포는 키메라 항원 수용체 (CAR) 발현 T-세포이다.
본원에서 설명되는 바와 같이, 시스템의 대안은 다음과 같은 3가지의 핵심 특징을 포함하는 유전자 조작된 비-바이러스 유전자 전달 시스템을 포함한다: (1) 안정한 유전자 발현을 위한 슬리핑 뷰티 트랜스포존 시스템, (2) 향상된 형질감염을 위한 미니서클, 및 (3) 선택 메카니즘으로서 인간 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체 (DHFRdm) (도 1).
미니서클은 3가지 이유로 형질감염 플랫폼으로서 특히 매력적이다. 먼저, 전기천공에 의한 미니서클의 형질감염 효율은 그의 플라스미드 유사체보다 우수하다. 두 번째로, 전위 효율은 트랜스포사제 효율에 영향을 주는 것으로 밝혀진, 2개의 트랜스포존 말단 사이의 보다 짧은 거리 때문에 미니서클에서 더 높다. 마지막으로, 뉴클레오펙션 후 세포 생존성은 구축물 크기 증가와 함께 감소하기 때문에, 미니서클은 그의 유사한 플라스미드에 비해 그의 더 작은 크기에 비추어 보다 바람직하다. 전위 효율을 추가로 개선하기 위해, 그 전부가 본원에 참고로 포함된 문헌 [Izsvak et al. (Nature Genet. 2009, 41, 753-761]에 의해 개발된 최적화된 SB100X 과다활성 트랜스포사제가, 그 전부가 본원에 참고로 포함된 문헌 [Yant et al. (Mol. Cell. Biol. 2004, 24, 9239-9247]에 의한 SB 트랜스포존의 T3 생성과 조합하여 사용되었다. 본원에서 설명되는 일부 대안에서, T-세포의 유전자 변형은 미니서클을 사용하여 수행된다. 일부 대안에서, 미니서클은 트랜스포존을 포함한다. 일부 대안에서, 트랜스포존은 슬리핑 뷰티 트랜스포존을 포함한다. 일부 대안에서, 최적화된 SB100X 과다활성 트랜스포사제는 SB 트랜스포존의 T3 생성과 조합하여 사용된다.
조작된 T-세포의 신속한 선택을 위한 선택 메카니즘이 또한 사용될 수 있다. 인간 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체 (아미노산 돌연변이 L22F 및 F31S를 갖는 DHFRdm)는 티미딜레이트 및 퓨린 합성의 차단을 유발하는 DHFR의 효능있는 억제제인 메토트렉세이트에 대해 15,000배 감소된 친화도를 보인다. T-세포에서 DHFRdm의 발현은 증식 능력, T-세포 마커의 발현, 또는 세포용해 능력을 손상시키지 않으면서 MTX 내성을 부여한다. 상기 선택 시스템의 추가의 이점은 임상 등급 MTX의 이용가능성, 비-유전자 독성 약물의 사용 및 DHFRdm의 작은 유전자 크기 (561 bp)를 포함한다. 따라서, MTX는 SB-형질도입된 세포를 선택적으로 증폭하기 위한 선택 메카니즘으로서 사용될 수 있다. 일부 대안에서, 미니서클은 인간 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체를 코딩하는 유전자 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 조작된 T-세포의 신속한 선택을 위한 선택 방법이 제공된다. 일부 대안에서, 선택 방법은 조작된 T-세포를 임상 등급 메토트렉세이트와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 대안에서, T-세포는 인간 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체에 대한 서열을 포함하는 미니서클을 포함한다. 일부 대안에서, 인간 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 메토트렉세이트에 대해 15,000배 또는 약 15,000배 감소된 특이성을 보인다. 일부 대안에서, 메토트렉세이트는 미니서클로 형질도입된 세포를 선택적으로 증폭하기 위해 T-세포를 접촉시키기 위해 사용될 수 있고, 여기서 미니서클은 인간 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체에 대한 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 인간 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체를 코딩하는 유전자는 다음 DNA 서열을 포함한다:
Figure pct00018
일부 대안에서, 인간 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 다음 단백질 서열을 포함한다:
Figure pct00019
SB 트랜스포존을 포함하는 미니서클의 다중화 전달을 사용하여 3개 이하의 트랜스진을 H9 T-세포주 내로 안정하게 전달한 후, 메토트렉세이트 (MTX) 선택을 수행할 수 있다. 보다 많은 수의 유전자 통합을 갖는 세포는 MTX를 사용한 선택 압력을 증가시킴으로써 우선적으로 얻을 수 있다. 2개의 연속적인 MTX 선택 라운드를 통한 2단계 선택 방법을 사용하여, 3개의 트랜스진 산물을 발현하는 50%의 세포를 얻을 수 있다. 일부 대안에서, 트랜스진을 세포주 내로 안정적으로 전달하는 방법이 제공된다. 일부 대안에서, 미니서클을 세포주 내로 전달하는 방법이 제공된다. 일부 대안에서, 미니서클은 슬리핑 뷰티 트랜스포존을 포함한다. 일부 대안에서, 방법은 메토트렉세이트를 사용한 선택 압력의 증가를 추가로 포함하고, 여기서 선택 압력의 증가는 세포주를 증가하는 농도의 메토트렉세이트와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 2 라운드의 메토트렉세이트 선택이 수행된다.
추가의 대안
일부 대안에서, 삽입을 위한 핵산이 유전자 전달 폴리뉴클레오티드 내의 역위 말단 반복체 유전자 서열의 측면에 위치하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 선택가능한 것인, 핵산의 유전자 내로의 안정한 삽입을 위한 유전자 전달 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 가장 넓은 의미에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 제1 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제1 서열, 제2 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제2 서열, 프로모터 영역 서열을 포함하는 제3 서열, 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 유전자를 포함하고, 최적화된 제4 서열, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체를 코딩하는 적어도 하나의 선택가능 마커 카세트를 포함하고, 여기서 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 메토트렉세이트에 대해 15,000배 또는 약 15,000배 감소된 친화도를 갖고, 메토트렉세이트는 유전자 전달 폴리뉴클레오티드로 형질도입된 세포를 선택적으로 증폭하기 위해 선택 메카니즘으로서 사용될 수 있는 것인, 최적화된 제5 서열, 제1 부착 부위 (attP)를 포함하는 제6 서열, 및 제2 부착 부위 (attB)를 포함하는 제7 서열을 포함하고; 여기서, 각각의 제1 서열, 제2 서열, 제3 서열, 제4 서열, 제5 서열, 제6 서열, 및 제7 서열은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, 제1 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제1 서열의 3' 말단은 제3 서열의 5' 말단에 인접하고, 제3 서열의 3' 말단은 제4 서열의 5' 말단에 인접하고, 제4 서열의 3' 말단은 제5 서열의 5' 말단에 인접하고, 제5 서열의 3' 말단은 제2 역위 말단 반복체를 포함하는 제2 서열의 5' 말단에 인접한다. 일부 대안에서, 인간 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체를 코딩하는 유전자는 다음 DNA 서열을 포함한다:
Figure pct00020
일부 대안에서, 인간 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 다음 단백질 서열을 포함한다:
Figure pct00021
일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 환상이다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 적어도 1 kB 내지 6 kB이다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 미니서클이다. 일부 대안에서, 프로모터 영역은 EF1 프로모터 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제4 서열은 단백질을 코딩하는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 유전자를 포함한다. 일부 대안에서, 제4 서열은 제4 서열의 총 GC/AT 비를 감소시키기 위해 코돈 최적화된다. 일부 대안에서, 제4 서열은 다수의 관련 단백질, 예컨대 동일한 에피토프에 특이적인 다수의 항체 결합 도메인을 코딩하는 다수의 핵산으로부터 생성된 컨센서스 서열이다. 일부 대안에서, 제5 서열은 제4 서열의 총 GC/AT 비를 감소시키기 위해 코돈 최적화된다. 일부 대안에서, 코돈 최적화 및/또는 컨센서스 서열은 다수의 관련 서열에서 이용되는 서열 및/또는 핵염기의 가변성을 비교함으로써 생성된다. 일부 대안에서, 단백질은 요법을 위한 단백질이다. 일부 대안에서, 단백질은 항체 또는 그의 일부를 포함한다. 일부 대안에서, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 L22F 및 F31S의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일부 대안에서, 미니서클은 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체에 대한 서열을 포함하고, 이 서열은 다음 DNA 서열을 포함한다:
Figure pct00022
일부 대안에서, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 다음 단백질 서열을 포함한다:
Figure pct00023
일부 대안에서, 입양 T-세포 면역요법을 위한 조작된 다중화 T-세포의 생성 방법이 제공된다. 가장 넓은 의미에서, 방법은 본원에서 설명되는 임의의 대안의 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 T-세포 내로 도입하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 제공하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 T-세포 내로 도입하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 선택하고, 여기서 선택은 제1 라운드의 선택 및 제2 라운드의 선택을 포함하고, 제1 라운드의 선택은 선택 시약을 제1 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 라운드의 선택은 선택 시약을 제2 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 더 높고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 적어도 1.5배 더 높고, 선택 압력 하에 표현형을 발현하는 T-세포를 단리하는 것을 포함할 수 있다. 일부 대안에서, 도입은 전기천공에 의해 수행된다. 일부 대안에서, 선택은 선택 마커 카세트를 통해 선택 압력을 증가시킴으로써 수행된다. 일부 대안에서, 선택 시약은 선택제를 포함한다. 일부 대안에서, 선택제는 메토트렉세이트이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 50 nM - 100 nM이고, 제2 농도 범위는 적어도 75 내지 150 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도는 50 nM, 60 nM, 70 nM, 80 nM, 90 nM, 또는 100 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이고, 제2 농도 범위는 75 nM, 80 nM, 90 nM, 100 nM, 110 nM, 120 nM, 130 nM, 140 nM, 또는 150 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 75 nM - 150 nM이고, 제2 농도 범위는 적어도 112.5 nM 내지 225 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도는 75 nM, 85 nM, 95 nM, 105 nM, 115 nM, 125 nM, 135 nM, 145 nM, 또는 150 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이고, 제2 농도 범위는 112 nM, 122 nM, 132 nM, 142 nM, 152 nM, 162 nM, 172 nM, 182 nM, 192 nM, 202 nM, 212 nM, 또는 225 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 300 nM - 675 nM이고, 제1 농도 범위는 적어도 450 nM 내지 1012 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도는 300 nM, 350 nM, 400 nM, 450 nM, 500 nM, 550 nM, 600 nM, 650 nM, 또는 675 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이고, 제2 농도 범위는 450 nM, 500 nM, 550 nM, 600 nM, 650 nM, 700 nM, 750 nM, 800 nM, 850 nM, 900 nM, 1000 nM, 또는 1012 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이다. 일부 대안에서, 제1 라운드의 선택은 T-세포를 제2 라운드의 선택 전에 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 라운드의 선택은 T-세포를 단리 전에 적어도 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 동안 선택제에 노출시키는것을 포함한다.
일부 대안에서, 세포에서 단백질 생산을 증가시키는 방법에 제공된다. 가장 넓은 의미에서, 방법은 본원에서 설명되는 임의의 하나의 대안의 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 T-세포 내로 도입하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 제공하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 T-세포 내로 도입하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 선택하고, 여기서 선택은 제1 라운드의 선택 및 제2 라운드의 선택을 포함하고, 제1 라운드의 선택은 선택 시약을 제1 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 라운드의 선택은 선택 시약을 제2 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 더 높고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 적어도 1.5배 더 높고, 선택 압력 하에 표현형을 발현하는 T-세포를 단리하는 것을 포함할 수 있다. 일부 대안에서, 도입은 전기천공에 의해 수행된다. 일부 대안에서, 선택은 선택 마커 카세트를 통해 선택 압력을 증가시킴으로써 수행된다. 일부 대안에서, 선택 시약은 선택제를 포함한다. 일부 대안에서, 선택제는 메토트렉세이트이다. 일부 대안에서, 낮은 또는 제1 농도 범위는 적어도 50 nM - 100 nM이고, 더 높은 또는 제2 농도 범위는 적어도 75 내지 150 nM이다. 일부 대안에서, 낮은 또는 제1 농도 범위는 적어도 75 nM - 150 nM이고, 더 높은 또는 제2 농도 범위는 적어도 112.5 nM 내지 225 nM이다. 일부 대안에서, 낮은 또는 제1 농도 범위는 적어도 300 nM - 675 nM이고, 더 높은 또는 제2 농도 범위는 적어도 450 nM 내지 1012 nM이다. 일부 대안에서, 제1 라운드의 선택은 T-세포를 제2 라운드의 선택 전에 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 라운드의 선택은 T-세포를 단리 전에 적어도 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 동안 선택제에 노출시키는것을 포함한다.
일부 대안에서, 임의의 하나의 방법에 의해 생성된 입양 T-세포 면역요법을 위한 조작된 다중화 T-세포가 제공된다. 일부 대안에서, 입양 T-세포 면역요법을 위한 조작된 다중화 T-세포는 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 T-세포 내로 도입하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 제공하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 T-세포 내로 도입하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 선택하고, 여기서 선택은 제1 라운드의 선택 및 제2 라운드의 선택을 포함하고, 제1 라운드의 선택은 선택 시약을 제1 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 라운드의 선택은 선택 시약을 제2 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 더 높고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 적어도 1.5배 더 높고, 선택 압력 하에 표현형을 발현하는 T-세포를 단리하는 것을 포함하는 방법에 의해 생성된다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 제1 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제1 서열, 제2 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제2 서열, 프로모터 영역 서열을 포함하는 제3 서열, 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 유전자를 포함하고, 최적화된 제4 서열, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체를 코딩하는 적어도 하나의 선택가능 마커 카세트를 포함하고, 여기서 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 메토트렉세이트에 대해 15,000배 또는 약 15,000배 감소된 친화도를 갖고, 메토트렉세이트는 유전자 전달 폴리뉴클레오티드로 형질도입된 세포를 선택적으로 증폭하기 위해 선택 메카니즘으로서 사용될 수 있는 것인, 최적화된 제5 서열, 제1 부착 부위 (attP)를 포함하는 제6 서열, 제2 부착 부위 (attB)를 포함하는 제7 서열을 포함하고, 여기서 각각의 제1 서열, 제2 서열, 제3 서열, 제4 서열, 제5 서열, 제6 서열, 및 제7 서열은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, 제1 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제1 서열의 3' 말단은 제3 서열의 5' 말단에 인접하고, 제3 서열의 3' 말단은 제4 서열의 5' 말단에 인접하고, 제4 서열의 3' 말단은 제5 서열의 5' 말단에 인접하고, 제5 서열의 3' 말단은 제2 역위 말단 반복체를 포함하는 제2 서열의 5' 말단에 인접한다. 일부 대안에서, 인간 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체를 코딩하는 유전자는 다음 DNA 서열을 포함한다:
Figure pct00024
일부 대안에서, 인간 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 다음 단백질 서열을 포함한다:
Figure pct00025
일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 환상이다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 적어도 1 kB 내지 5 kB이다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 미니서클이다. 일부 대안에서, 프로모터 영역은 EF1 프로모터 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제4 서열은 단백질을 코딩하는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 유전자를 포함한다. 일부 대안에서, 제4 서열은 제4 서열의 총 GC/AT 비를 감소시키기 위해 코돈 최적화된다. 일부 대안에서, 제4 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화에 의해 최적화된다. 일부 대안에서, 제4 서열은 다수의 관련 단백질을 코딩하는 다수의 핵산으로부터 생성된 컨센서스 서열이다. 일부 대안에서, 제4 서열은 다수의 관련 단백질, 예컨대 동일한 에피토프에 특이적인 다수의 항체 결합 도메인을 코딩하는 다수의 핵산으로부터 생성된 컨센서스 서열이다. 일부 대안에서, 다수의 관련 단백질은 다수의 항체 결합 도메인을 포함하고, 다수의 항체 결합 도메인은 동일한 에피토프에 대해 특이적이다. 일부 대안에서, 제5 서열은 제5 서열의 총 GC/AT 비를 감소시키기 위해 코돈 최적화된다. 일부 대안에서, 제5 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화에 의해 최적화된다. 일부 대안에서, 단백질은 요법을 위한 단백질이다. 일부 대안에서, 코돈 최적화 및/또는 컨센서스 서열은 다수의 관련 서열에서 이용되는 서열 및/또는 핵염기의 가변성을 비교함으로써 생성된다. 일부 대안에서, 단백질은 항체 또는 그의 일부를 포함하고, 이것은 인간화될 수 있다. 일부 대안에서, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 L22F 및 F31S의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일부 대안에서, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 L22F 및 F31S의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일부 대안에서, 도입은 전기천공에 의해 수행된다. 일부 대안에서, 선택은 선택 마커 카세트를 통해 선택 압력을 증가시킴으로써 수행된다. 일부 대안에서, 선택 시약은 선택제를 포함한다. 일부 대안에서, 선택제는 메토트렉세이트이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 50 nM - 100 nM이고, 제2 농도 범위는 적어도 75 내지 150 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도는 50 nM, 60 nM, 70 nM, 80 nM, 90 nM, 또는 100 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이고, 제2 농도 범위는 75 nM, 80 nM, 90 nM, 100 nM, 110 nM, 120 nM, 130 nM, 140 nM, 또는 150 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 75 nM - 150 nM이고, 제2 농도 범위는 적어도 112.5 nM 내지 225 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도는 75 nM, 85 nM, 95 nM, 105 nM, 115 nM, 125 nM, 135 nM, 145 nM, 또는 150 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이고, 제2 농도 범위는 112 nM, 122 nM, 132 nM, 142 nM, 152 nM, 162 nM, 172 nM, 182 nM, 192 nM, 202 nM, 212 nM, 또는 225 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 300 nM - 675 nM이고, 제1 농도 범위는 적어도 450 nM 내지 1012 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도는 300 nM, 350 nM, 400 nM, 450 nM, 500 nM, 550 nM, 600 nM, 650 nM, 또는 675 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이고, 제2 농도 범위는 450 nM, 500 nM, 550 nM, 600 nM, 650 nM, 700 nM, 750 nM, 800 nM, 850 nM, 900 nM, 1000 nM, 또는 1012 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이다. 일부 대안에서, 제1 라운드의 선택은 T-세포를 제2 라운드의 선택 전에 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 라운드의 선택은 T-세포를 단리 전에 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14일 또는 상기 언급된 시점 중 임의의 2개에 의해 규정된 시간 범위 내인 임의의 시간 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 제1 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제1 서열, 제2 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제2 서열, 프로모터 영역 서열을 포함하는 제3 서열, 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 유전자를 포함하고, 최적화된 제4 서열, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체를 코딩하는 적어도 하나의 선택가능 마커 카세트를 포함하고, 여기서 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 메토트렉세이트에 대해 15,000배 또는 약 15,000배 감소된 친화도를 갖고, 메토트렉세이트는 유전자 전달 폴리뉴클레오티드로 형질도입된 세포를 선택적으로 증폭하기 위해 선택 메카니즘으로서 사용될 수 있는 것인, 최적화된 제5 서열, 제1 부착 부위 (attP)를 포함하는 제6 서열, 제2 부착 부위 (attB)를 포함하는 제7 서열을 포함하고, 여기서 각각의 제1 서열, 제2 서열, 제3 서열, 제4 서열, 제5 서열, 제6 서열, 및 제7 서열은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, 제1 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제1 서열의 3' 말단은 제3 서열의 5' 말단에 인접하고, 제3 서열의 3' 말단은 제4 서열의 5' 말단에 인접하고, 제4 서열의 3' 말단은 제5 서열의 5' 말단에 인접하고, 제5 서열의 3' 말단은 제2 역위 말단 반복체를 포함하는 제2 서열의 5' 말단에 인접한다. 일부 대안에서, 인간 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체를 코딩하는 유전자는 다음 DNA 서열을 포함한다:
Figure pct00026
일부 대안에서, 인간 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 다음 단백질 서열을 포함한다:
Figure pct00027
일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 환상이다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 적어도 1 kB 내지 5 kB이다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 미니서클이다. 일부 대안에서, 프로모터 영역은 EF1 프로모터 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제4 서열은 단백질을 코딩하는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 유전자를 포함한다. 일부 대안에서, 제4 서열은 제4 서열의 총 GC/AT 비를 감소시키기 위해 코돈 최적화된다. 일부 대안에서, 제4 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화에 의해 최적화된다. 일부 대안에서, 제4 서열은 다수의 관련 단백질을 코딩하는 다수의 핵산으로부터 생성된 컨센서스 서열이다. 일부 대안에서, 제4 서열은 다수의 관련 단백질, 예컨대 동일한 에피토프에 특이적인 다수의 항체 결합 도메인을 코딩하는 다수의 핵산으로부터 생성된 컨센서스 서열이다. 일부 대안에서, 다수의 관련 단백질은 다수의 항체 결합 도메인을 포함하고, 다수의 항체 결합 도메인은 동일한 에피토프에 대해 특이적이다. 일부 대안에서, 제5 서열은 제5 서열의 총 GC/AT 비를 감소시키기 위해 코돈 최적화된다. 일부 대안에서, 제5 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화에 의해 최적화된다. 일부 대안에서, 단백질은 요법을 위한 단백질이다. 일부 대안에서, 코돈 최적화 및/또는 컨센서스 서열은 다수의 관련 서열에서 이용되는 서열 및/또는 핵염기의 가변성을 비교함으로써 생성된다. 일부 대안에서, 단백질은 항체 또는 그의 일부를 포함하고, 이것은 인간화될 수 있다. 일부 대안에서, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 L22F 및 F31S의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일부 대안에서, 도입은 전기천공에 의해 수행된다. 일부 대안에서, 선택은 선택 마커 카세트를 통해 선택 압력을 증가시킴으로써 수행된다. 일부 대안에서, 선택 시약은 선택제를 포함한다. 일부 대안에서, 선택제는 메토트렉세이트이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 50 nM - 100 nM이고, 제2 농도 범위는 적어도 75 내지 150 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도는 50 nM, 60 nM, 70 nM, 80 nM, 90 nM, 또는 100 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이고, 제2 농도 범위는 75 nM, 80 nM, 90 nM, 100 nM, 110 nM, 120 nM, 130 nM, 140 nM, 또는 150 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 75 nM - 150 nM이고, 제2 농도 범위는 적어도 112.5 nM 내지 225 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도는 75 nM, 85 nM, 95 nM, 105 nM, 115 nM, 125 nM, 135 nM, 145 nM, 또는 150 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이고, 제2 농도 범위는 112 nM, 122 nM, 132 nM, 142 nM, 152 nM, 162 nM, 172 nM, 182 nM, 192 nM, 202 nM, 212 nM, 또는 225 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 300 nM - 675 nM이고, 제1 농도 범위는 적어도 450 nM 내지 1012 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도는 300 nM, 350 nM, 400 nM, 450 nM, 500 nM, 550 nM, 600 nM, 650 nM, 또는 675 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이고, 제2 농도 범위는 450 nM, 500 nM, 550 nM, 600 nM, 650 nM, 700 nM, 750 nM, 800 nM, 850 nM, 900 nM, 1000 nM, 또는 1012 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이다. 일부 대안에서, 제1 라운드의 선택은 T-세포를 제2 라운드의 선택 전에 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 라운드의 선택은 T-세포를 단리 전에 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14일 또는 상기 언급된 시점 중 임의의 2개에 의해 규정된 시간 범위 내인 임의의 시간 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함한다.
일부 대안에서, 대상체에서 암 또는 질환의 치료, 억제 또는 개선 방법이 제공되고, 이 방법은 대상체에게 아래에서 설명되는 바와 같이 변형된 또는 조작된 다중화 T-세포를 투여하는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 입양 T-세포 면역요법을 위한 조작된 다중화 T-세포는 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 T-세포 내로 도입하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 제공하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 T-세포 내로 도입하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 선택하고, 여기서 선택은 제1 라운드의 선택 및 제2 라운드의 선택을 포함하고, 제1 라운드의 선택은 선택 시약을 제1 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 라운드의 선택은 선택 시약을 제2 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 더 높고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 적어도 1.5배 더 높고, 선택 압력 하에 표현형을 발현하는 T-세포를 단리하는 것을 포함하는 방법에 의해 생성된다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 제1 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제1 서열, 제2 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제2 서열, 프로모터 영역 서열을 포함하는 제3 서열, 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 유전자를 포함하고, 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 제4 서열, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체를 코딩하는 적어도 하나의 선택가능 마커 카세트를 포함하고, 여기서 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 메토트렉세이트에 대해 15,000배 또는 약 15,000배 감소된 친화도를 갖고, 메토트렉세이트는 유전자 전달 폴리뉴클레오티드로 형질도입된 세포를 선택적으로 증폭하기 위해 선택 메카니즘으로서 사용될 수 있고, 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화되는 것인 제5 서열, 제1 부착 부위 (attP)를 포함하는 제6 서열, 제2 부착 부위 (attB)를 포함하는 제7 서열을 포함하고, 여기서 각각의 제1 서열, 제2 서열, 제3 서열, 제4 서열, 제5 서열, 제6 서열, 및 제7 서열은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, 제1 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제1 서열의 3' 말단은 제3 서열의 5' 말단에 인접하고, 제3 서열의 3' 말단은 제4 서열의 5' 말단에 인접하고, 제4 서열의 3' 말단은 제5 서열의 5' 말단에 인접하고, 제5 서열의 3' 말단은 제2 역위 말단 반복체를 포함하는 제2 서열의 5' 말단에 인접한다. 일부 대안에서, 인간 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체를 코딩하는 유전자는 다음 DNA 서열을 포함한다:
Figure pct00028
일부 대안에서, 인간 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 다음 단백질 서열을 포함한다:
Figure pct00029
일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 환상이다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 미니서클이다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 적어도 1 kB 내지 5 kB이다. 일부 대안에서, 프로모터 영역은 EF1 프로모터 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제4 서열은 단백질을 코딩하는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 유전자를 포함한다. 일부 대안에서, 제4 서열은 제4 서열의 총 GC/AT 비를 감소시키기 위해 코돈 최적화된다. 일부 대안에서, 제4 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화에 의해 최적화된다. 일부 대안에서, 제4 서열은 다수의 관련 단백질을 코딩하는 다수의 핵산으로부터 생성된 컨센서스 서열이다. 일부 대안에서, 제4 서열은 다수의 관련 단백질, 예컨대 동일한 에피토프에 특이적인 다수의 항체 결합 도메인을 코딩하는 다수의 핵산으로부터 생성된 컨센서스 서열이다. 일부 대안에서, 다수의 관련 단백질은 다수의 항체 결합 도메인을 포함하고, 다수의 항체 결합 도메인은 동일한 에피토프에 대해 특이적이다. 일부 대안에서, 제5 서열은 제5 서열의 총 GC/AT 비를 감소시키기 위해 코돈 최적화된다. 일부 대안에서, 제5 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화에 의해 최적화된다. 일부 대안에서, 단백질은 요법을 위한 단백질이다. 일부 대안에서, 코돈 최적화 및/또는 컨센서스 서열은 다수의 관련 서열에서 이용되는 서열 및/또는 핵염기의 가변성을 비교함으로써 생성된다. 일부 대안에서, 단백질은 항체 또는 그의 일부를 포함하고, 이것은 인간화될 수 있다. 일부 대안에서, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 L22F 및 F31S의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일부 대안에서, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 L22F 및 F31S의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일부 대안에서, 도입은 전기천공에 의해 수행된다. 일부 대안에서, 선택은 선택 마커 카세트를 통해 선택 압력을 증가시킴으로써 수행된다. 일부 대안에서, 선택 시약은 선택제를 포함한다. 일부 대안에서, 선택제는 메토트렉세이트이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 50 nM - 100 nM이고, 제2 농도 범위는 적어도 75 내지 150 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도는 50 nM, 60 nM, 70 nM, 80 nM, 90 nM, 또는 100 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이고, 제2 농도 범위는 75 nM, 80 nM, 90 nM, 100 nM, 110 nM, 120 nM, 130 nM, 140 nM, 또는 150 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 75 nM - 150 nM이고, 제2 농도 범위는 적어도 112.5 nM 내지 225 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도는 75 nM, 85 nM, 95 nM, 105 nM, 115 nM, 125 nM, 135 nM, 145 nM, 또는 150 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이고, 제2 농도 범위는 112 nM, 122 nM, 132 nM, 142 nM, 152 nM, 162 nM, 172 nM, 182 nM, 192 nM, 202 nM, 212 nM, 또는 225 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 300 nM - 675 nM이고, 제1 농도 범위는 적어도 450 nM 내지 1012 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도는 300 nM, 350 nM, 400 nM, 450 nM, 500 nM, 550 nM, 600 nM, 650 nM, 또는 675 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이고, 제2 농도 범위는 450 nM, 500 nM, 550 nM, 600 nM, 650 nM, 700 nM, 750 nM, 800 nM, 850 nM, 900 nM, 1000 nM, 또는 1012 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이다. 일부 대안에서, 제1 라운드의 선택은 T-세포를 제2 라운드의 선택 전에 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 라운드의 선택은 T-세포를 단리 전에 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14일 또는 상기 언급된 시점 중 임의의 2개에 의해 규정된 시간 범위 내인 임의의 시간 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 대상체는 인간이다.
몇몇의 물질 및 방법이 아래에서 보다 상세하게 설명된다.
플라스미드
메토트렉세이트 (MTX)에 비감수성인 EF1a 프로모터, maxGFP 유전자, 토세아 아시그나 바이러스 2A 펩티드 (T2A) 및 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체 (DHFRdm)를 포함하는 T3 SB 트랜스포존 카세트를 보유하는 pMC_T3/GFP-T2A-DHFRdm 미니서클 (MC) 플라스미드는 백본으로서 pMC_T3/eGFP_IRES_FGFR (그 전부가 본원에 참고로 포함된 문헌 [Nucleic Acids Research, 2012, 1-10 doi:10.1093/nar/gks213])을 사용하고, GFP-T2A-DHFRdm 카세트를 생성하기 위해 이전에 문헌 [Cold Spring Harbor Protoc; 2012; doi:10.1101/pdb.ip067876]에 기재된 클로닝 전략을 실시하여 구축하였다. MaxGFP (론자 (Lonza)) 및 pEGFRt-T2A-IMPDHdm-T2A-DHFRdm (마이클 젠센 (Michael Jensen)으로부터 제공받음) 플라스미드를 PCR을 위한 주형으로 사용하였다. BmtI 및 BamHI 부위를 형광 단백질에 대한 유전자를 교환하기 위해 도입하였다. 플라스미드 MC_SB100X는 이전에 그 전부가 본원에 참고로 포함된 문헌 [Nucleic Acids Research, 2012, 1-10 doi:10.1093/nar/gks213])에 기재되었다. 미니서클을 미니서클 DNA 벡터 기술에 대한 시스템 바이오사이언시스 (System Biosciences)에 따라 생산하고 정제하였다. 모든 플라스미드는 엔도프리 (Endofree) 플라스미드 키트 (퀴아겐 (Qiagen))를 사용하여 내독소 미함유 조건 하에 증폭하였다.
H9 배양 및 형질감염.
H9 세포를 10% FBS가 존재하는 DMEM에서 배양하였다. H9 세포에 대한 최적화된 뉴클레오펙션 프로토콜 (론자)을 따랐다 (프로그램 X-001, 뉴클레오펙터 (Nucleofector) 키트 V). 뉴클레오펙션당, 1x106 세포를 MC DNA의 상이한 양과 함께 사용하였다. 세포를 안정한 형질감염을 달성하기 위해 뉴클레오펙션 후 1주 동안 성장시켰다. MTX 선택을 위해, 세포를 상이한 농도의 MTX가 보충된 10% FBS가 존재하는 DMEM에서 배양하였다.
유동 세포 측정 분석.
살아있는 세포는 유동 세포 측정 완충제에 프로피듐 아오다이드를 2 ㎍/ml로 첨가하여 프로피듐 아오다이드 배제를 기초로 하여 선택하였다. 유동 세포 측정 분석은 MACSQuant 분석기 (밀테니이 바이오텍 (Miltenyi Biotec)) 및 LSRII (비디 바이오사이언시스 (BD Biosciences))에서 수행하였다. 수집된 데이타를 FlowJo 소프트웨어로 분석하였다. 적절한 음성 대조군 (프로피듐 아오다이드 염색을 수행하고 수행하지 않은 비형질감염된 H9 세포, 및 GFP, BFP, 및 mCherry에 대한 단일 유전자로 형질감염된 세포)을 보상 및 게이팅을 위해 사용하였다. 벡톤 디킨슨 (Becton Dickinson) FACSAria II를 세포 분류를 위해 사용하였다. 유동 세포 측정 과정의 일부는 UW 면역 유동 세포 측정 설비에서 수행하였다.
트랜스포존 카피수의 결정.
게놈 DNA를 제조자의 지시에 따라 퓨어진 (Puregene) 키트 A (퀴아겐)를 사용하여 추출하고, 유니버셜 (Universal) SYBR 그린 수퍼믹스 (Green Supermix) (바이오라드 (BioRad))를 사용하는 7300 실시간 PCR 시스템 (어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems)을 사용하여 qPCR을 수행하였다. 다음과 같은 qPCR을 위한 프라이머는 프라이머3 소프트웨어를 사용하여 설계하였다: maxGFP 정방향 프라이머: 5'-ACAAGATCATCCGCAGCAAC-3' (서열 식별 번호: 4); 역방향 프라이머: 5'-TTGAAGTGCATGTGGCTGTC-3' (서열 식별 번호: 5); GAPDH 정방향 프라이머: 5'-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3' (서열 식별 번호: 6); GAPDH 역방향 프라이머: 5'-GCCATCACGCCACAGTTTC-3' (서열 식별 번호: 7). MaxGFP 프라이머는 트랜스포존 내의 maxGFP 유전자에 특이적이다. 제한 희석 방법에 의해 얻은 트랜스포존 ("절대 표준")의 단일 삽입이 존재하는 H9 클론의 게놈 DNA를 사용하여 표준 곡선을 생성하였다. 카피수는 ΔΔCT 방법 (그 전부가 본원에 참고로 포함된 문헌 [Schmittgen, T.D. and Livak, K.J. (2008)])을 사용하여 계산하였다.
SBTS 통합 분포의 특성 결정.
200 nM MTX로 선택된 T3/GFP-T2A-DHFRdm 형질감염된-H9 세포의 집단을 5,000 세포/웰의 방사선 조사된 (5000 R) H9 공급자 (feeder) 세포와 함께 DMEM 10%FBS 내에 0.5 세포/웰의 농도로 96웰 플레이트에 플레이팅하였다. 플레이트를 2-3주 동안 인큐베이팅한 후, 클론 집단을 더 큰 플레이트로 옮기고, 팽창시켰다. GFP 발현은 유동 세포 측정에 의해 확인하였다. 트랜스포존 카피수를 결정하기 위해 60개의 개별 클론의 DNA를 사용하여 상대적인 RT-qPCR 분석을 수행하였다.
H9 세포로의 안정한 유전자 전달의 최적화.
박테리아 플라스미드 서열이 제거된 미니서클 구축물을 모든 유전자 전달 연구를 위해 사용되었다. 미니서클은 그 전부가 본원에 참고로 포함된 문헌 [Chen, Z. Y.; He, C. Y.; Ehrhardt, A.; Kay, M. A. Molecular Therapy 2003, 8, 495-500] 및 [Kay, M. A.; He, C. Y.; Chen, Z. Y. Nat. Biotechnol. 2010, 28, 1287-U96]에서 카이 일행과 동료에 의해 이전에 설명된 바와 같이 생성될 수 있다. EF1 알파 프로모터 하에 상이한 형광 단백질 (maxGFP, mCherry, 또는 BFP)을 발현하는 트랜스포존을 포함하는 3개의 리포터 미니서클을 구축하였다. MTX에 대한 대사 내성을 부여하는 선택 유전자인 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체 (DHFRdm)를 T2A 서열 다음에 인 프레임으로 클로닝하였다. 또한, SB100X 트랜스포사제 유전자를 트랜스포존 미니서클과의 동시-전달을 위해 별개의 미니서클 구축물 내에 제조하였다.
트랜스포존에 4개의 트랜스포사제 결합 부위 (역위 말단 반복체당 2개)가 존재한다. 결합된 트랜스포사제는 2개의 트랜스포존 말단의 병치 (juxtaposition)를 촉진하도록 서로 상호작용하는 것으로 제안되었다. 트랜스포사제의 과다발현은 자유 트랜스포사제와 결합된 트랜스포사제의 상호작용 때문에 전위의 억제를 유도하고, 따라서 병치 단계를 억제하는 것으로 가정되었다. 따라서, 최적 트랜스포존/트랜스포사제 비는 이들 유전자가 별개의 구축물로 전달되든 아니든 결정될 필요가 있었다. 억제 현상에 대한 보고는 다양하였다.
일시적인 형질감염의 효율을 유동 세포 측정에 의해 maxGFP를 발현하는 리포터 미니서클을 사용하여 다양한 트랜스포존/트랜스포사제 비에서 뉴클레오펙션 24시간 후에 및 안정한 전위 (뉴클레오펙션 7일 후)에서 평가하였다. 트랜스포존:트랜스포사제 비의 최적화를 보여주는 도 2를 참조한다. H9 T-세포주를 형질감염 시험대 (test-bed)로서 사용하였다. 초기 형질감염 효율은 47.5%±2.2% 내지 66.9%±4.5%이었고, 트랜스포사제 미니서클의 양의 증가와 함께 증가하였다. 트랜스포사제의 부재 하에, 최소의 안정한 형질감염 (<1%)은 뉴클레오펙션 7일 후에 검출되었다. GFP+ 세포의 비율은 트랜스포존/트랜스포사제 비의 증가와 함께 증가하였고, 1:4 비에서 39.2%±3.0%에 도달하였고, 이것은 초기 일시적으로-통합된 집단의 58.6% 통합 효율을 반영한다. 보다 높은 비는 감소된 세포 생존성 때문에 시험되지 않았다. 과다발현 억제 효과는 상기 시험된 트랜스포존/트랜스포사제 비의 범위에서 관찰되지 않았다. 따라서, 이 결과로부터, 형질도입 실험을 상기 1:4의 최적화된 트랜스포존/트랜스포사제 비를 사용하여 수행하였다.
메토트렉세이트를 사용한 조작된 세포의 선택.
세포는 DHFRdm 발현에 대한 증가된 선택 압력 때문에 더 높은 MTX 농도를 사용하여 다수의 통합 이벤트로 선택될 수 있다고 가정되었다. T3/maxGFP-T2A-DHRFdm 트랜스포존으로 안정적으로 형질도입된 세포를 따라서 증가하는 MTX 농도 (50 내지 200 nM)의 존재 하에 성장시키고, GFP 발현을 유동 세포 측정에 의해 10일에 걸쳐 평가하였다. 선택 동안 메토트렉세이트 (MTX) 농도의 효과를 보여주는 도 3을 참조한다. 3일의 MTX 선택 후에 평가된 초기의 선택 효율은 MTX 농도 증가와 함께 감소하였다 (도 3, 패널 A). 그러나, >94% GFP+ 세포를 갖는 집단은 모든 조건 하에서 선택 후 7일까지 얻어졌다. GFP+ 세포의 평균 GFP 형광은 선택 압력과 함께 증가하였고 (도 3, 패널 B); 200 nM MTX로 선택된 평균 형광은 미선택된 세포보다 6.4배 더 높고, 50 nM MTX로 선택된 세포보다 3.3배 더 높았다. 도시된 바와 같이, GFP+ 세포 내의 평균 GFP 발현과 MTX 농도 사이의 양의 상관관계는 증가하는 MTX 농도가 DHFRdm 발현이 증가된, 따라서 다수의 통합 이벤트를 갖는 세포를 선택함을 시사한다.
MTX 처리 2주 후에 선택된 증폭된 세포 집단은 심지어 MTX 사용 중지시에 4주까지 대부분의 그의 트랜스진 발현을 유지하였다. 메토트렉세이트 (MTX) 사용 중지 후에 트랜스진 존속을 보여주는 도 4를 참조한다. MTX 사용 중지 4주 후에, GFP+ 집단은 모든 집단에서 >90%를 유지하였지만 (도 4, 패널 A), 다수의 통합 이벤트를 갖는 세포의 선택 때문에 200 nM MTX를 사용하여 선택된 세포가 최고의 GFP+ 집단 (97%)을 가졌다. 모든 집단 내의 평균 GFP 발현은 MTX 사용 중지 후 4주까지 각각 200 nM, 100 nM, 및 50 nM MTX 선택에 대해 21%, 27%, 및 28% 감소하였다 (도 4, 패널 B). 따라서, 평균 GFP 발현의 감소는 프로모터 침묵화 또는 선택 압력의 부재 하에 보다 낮은 GFP 발현을 보이는 세포의 우선적인 팽창 때문일 수 있다.
통합 분포의 분석.
증가된 MTX 선택 압력이 다수의 통합 이벤트를 갖는 세포를 선택한다는 가설을 시험하기 위해, MTX-선택된 세포 집단에서 트랜스포존 카피수의 평균 수를 GFP 프라이머를 사용한 RT-qPCR에 의해 결정하였다. 먼저, 단일 카피의 통합된 트랜스포존을 갖는 "절대 표준" 클론을 제한 희석 방법에 의해 생성하였다. MTX 선택 전에 본래의 안정적으로-형질도입된 집단에서 통합의 평균 수를 세포 분류에 의해 얻은 GFP+ 세포의 RT-qPCR 분석에 의해 결정하였다. 선택 압력의 증가에 따라 평균 트랜스포존 카피수가 증가하는 경향이 관찰되었다. 인간 반수체 게놈당 트랜스포존 카피수를 보여주는 도 5A를 참조한다. 200 nM MTX로 선택된 세포에서 평균 통합 이벤트는 MTX 선택 전의 GFP+ 세포에서의 1.1±0.02 통합 이벤트에 비해 2.1±0.45이었다. RT-qPCR을 삼중으로 수행하였고, 데이타는 분류된 집단에 대한 단일 생물학적 복제품 및 MTX 선택에 대한 3개의 생물학적 복제품을 나타낸다. 통계적인 차이는 스튜던트 T-시험에 의해 평가하였다.
200 nM MTX로 선택된 세포 내의 통합 이벤트의 분포를 이어서 분석하였다. 60개의 클론을 제한 희석 방법에 의해 생성하고, GFP 발현을 유동 세포 측정에 의해 확인하고, 게놈 DNA를 단리하고, 반수체 게놈당 GFP 유전자의 수를 RT-PCR에 의해 분석하였다. 통합 이벤트의 분포는 도 5B에 제시된다. 대부분의 클론 (~65%)은 다중 카피의 GFP를 포함하였다. 통합 이벤트의 평균 수는 1.8이었고, 이것은 200 nM MTX로 선택된 세포 집단 내의 평균 트랜스포존 카피수와 밀접하게 관련된다 (도 5A).
다중화 유전자 통합의 입증.
200 nM MTX 선택 압력 하에서 증폭된 형질도입된 세포의 대부분의 집단이 다수의 트랜스포존 카피를 포함하는 것이 이전에 입증되었기 때문에, 다중화 유전자 통합을 이어서 상기 조건 하에 평가하였다. H9 세포를 트랜스포존 카세트에 3개의 상이한 리포터 유전자 (maxGFP, mCherry, 및 BFP)를 포함하는 3개의 미니서클 및 SB100X 트랜스포사제 미니서클로 뉴클레오펙션시켰다. 안정적으로-형질도입된 세포를 이어서 7일 동안 200 nM 메토트렉세이트로 선택하고, 세포 집단을 유동 세포 측정 분석에 의해 평가하였다. 각각 2 ㎍의 상이한 형광 단백질 (FP) (MC_T3/GFP-T2A-DHFRdm, MC_T3/BFP-T2A-DHFRdm, MC_T3/mCherry-T2A-DHFRdm)을 갖는 트랜스포존을 보유하는 3개의 미니서클 및 6 ㎍의 MC_SB100X DNA로 뉴클레오펙션시킨 H9 세포 집단에 대한, 형질감염 후 상이한 시점에서의 유동 세포 측정 분석을 보여주는 도 6을 참조한다. 뉴클레오펙션 24시간 후에 평가된 초기 형질감염 효율은 68%이었다 (도 6 패널 A). 안정적으로 형질도입된 집단은 37±1.4%이었고, 이것은 54% 통합 효율을 반영한다. 상기 집단 중에서, 19±0.6%는 2 또는 3개의 상이한 형광 단백질을 발현하였다. 200 nM MTX의 존재 하에서 1주 동안 성장한 안정적으로-형질도입된 세포를 이어서 분석하였고; 상기 선택된 집단의 23±1.0%는 3개의 모든 리포터 단백질을 발현하였다 (도 6 패널 A). 삼중 트랜스진을 발현하는 세포의 집단을 추가로 증가시키기 위해, 200 nM MTX에 의해 선택된 세포를 증가된 MTX 농도를 사용한 제2 선택 단계에 적용하였다. 1주 동안 200 nM MTX로 선택된 후 500 및 1000 nM의 보다 높은 MTX 농도에 노출된, 3개의 트랜스포존으로 안정적으로 형질감염된 H9 세포 집단의 결과를 제시하는 막대 그래프를 보여주는 도 7을 참조한다. 도시된 바와 같이, 추가로 1주 동안 500 nM 또는 1000 nM MTX 내에서 배양된 세포는 삼중 트랜스진을 발현하는 세포의 증가된 집단 (각각 38.5±1.0% 및 53.1±0.3%)을 생성하였다. 세포 생존성은 DHFRdm 유전자의 과다발현에 대한 추가의 선택 때문에 제2 라운드의 선택 동안 ~70%로 다시 상승하였다.
메토트렉세이트 선택을 사용한 T-세포에서 슬리핑 뷰티를 갖는 트랜스포 존 DNA의 안정한 발현.
새로 해동한 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 아막사(Amaxa)™ 뉴클레오펙터™ 기술을 사용하여 전기천공하였다. 세포를 10 ㎍의 미니서클 GFP (MC_T3/GFP-T2A-DHFRdm) 및 상이한 양의 SB100X 과다활성 트랜스포사제 (0, 5, 또는 10 ㎍)로 형질감염시켰다. 대조군 세포는 비-미니서클 pMAXGFP 벡터 (10 ㎍) 또는 DNA 미함유 대조군으로 형질감염시켰다. 세포는 이어서 IL-2 및 IL-15의 존재 하의 형질감염 4 내지 6시간 후에 밀테니이 트랜스액트 비드로 자극하였다. 이어서, 세포를 96-웰 U자형 바닥 플레이트의 웰당 400,000개의 세포가 존재하도록 분취하였다. 세포를 0, 25, 50, 또는 100 nM의 메토트렉세이트로 형질감염 7일 후에 처리하였다. 제2, 5, 7, 14, 및 19일에, 세포를 트리판 블루에 의해 계수하고, 염색하고, 분석하였다.
미니서클 형질감염 후 GFP를 발현하는 림프구에 대한 유동 분석의 예를 보여주는 도 8을 참조한다. 림프구 윈도우 (패널 A)로부터의 단일 세포 (패널 B)를 인비트로겐 (Invitrogen) LIVE/DEAD 적색 염색 (패널 C)을 사용하여 생존성에 대해 분석하였다. 살아있는 림프구는 이어서 CD8 및 GFP 발현에 대해 분석하였다 (패널 D). 도 8 패널 D에 도시된 바와 같이, 50 nM 메토트렉세이트를 사용한 선택 후에, 대부분의 림프구는 CD8+이고, GFP를 발현하였다.
1주 후에 T-세포에서 슬리핑 뷰티를 갖는 트랜스포존 DNA의 안정한 발현.
MTX 선택 1주 전에 미니서클 DNA의 발현을 평가하기 위해, 유동 분석을 수행한 후, pMAXGFP, 1:1 비의 GFP 트랜스포존:SB100X, 1:2 비의 트랜스포존:SB100X, mcGFP 단독, 또는 DNA 미함유 대조군으로 형질감염된 세포와 비교하였다. 전기천공 후 2일 (트랜스액트 비드의 부재 하의) 및 5일 (트랜스액트 비드의 존재 하의)에 세포에 대한 FACS 검정의 결과를 보여주는 도 9를 참조한다. 도시된 바와 같이, MTX 부재 하에 시간에 걸쳐 GFP 발현의 상실이 존재한다. 그러나, GFP 발현은 SB100X 트랜스포사제로 동시 형질감염된 경우에만, GFP 트랜스포존 DNA로 형질감염된 세포에서 지속된다.
제2일부터 7일까지 GFP 발현 수준 및 세포 성장의 그래프를 보여주는 도 10을 참조한다. 도 10의 패널 A에 도시된 바와 같이, GFP 발현 퍼센트는 시간에 걸쳐 감소한다 (pMAXGFP (10 ㎍), mcGFP:MC_SB100X 1:1, 및 mcGFP:MC_SB100X 2:1). 트랜스액트 비드의 존재 하에 살아있는 세포의 느린 증가가 존재하지만 (패널 B), 비드가 없는 경우에는 존재하지 않고 (패널 C), 이것은 세포 성장을 위한 비드의 중요성을 나타낸다.
7일 및 12일 동안 MTX를 사용한 세포 선택.
1주 후에, 형질감염된 세포의 샘플을 미니서클 트랜스포존을 발현하는 세포를 농축하기 위해 상이한 수준의 MTX (25, 50, 또는 100 nM)에 노출시켰다. 트랜스포사제 통합에 의해 DHFRdm MTX-내성 유전자 및 GFP를 안정적으로 발현하는 세포는 보다 높은 MTX 농도에서 생존하여야 한다. 7일 동안 100 nM 메토트렉세이트를 사용한 처리 후에 형질감염된 세포에 대한 FACS 검정의 결과를 보여주는 도 11을 참조한다. 100 nM MTX로 처리된 세포에서, 트랜스포존 및 트랜스포사제 DNA 둘 모두로 형질감염된 세포만 GFP를 발현한다. 도시된 바와 같이, 100 nM MTX 선택은 7일 동안 MTX를 사용한 세포 선택 후에 2:1의 mcGFP:MC_SB100X 비 및 1:1의 mcGFP:MC_SB100X 비에서의 mcGFP 대 SB 비 둘 모두에서 GFP 발현을 위해 효과적이었다.
각각 7일 및 12일 동안 메토트렉세이트로 처리한 후 형질감염된 세포의 FACS 검정 결과를 보여주는 도 12 및 도 13을 참조한다. 살아있는 림프구에 대한 산포도 및 CD8+/GFP 발현이 각각의 조건에 대해 제시된다. 림프구 내의 GFP 발현 퍼센트는 도 12에서 박스에 제시된다.
도 12에 도시된 바와 같이, 7일에, 0 또는 25 nM MTX로 처리된 세포에서 각각 약 25% 또는 75%의 세포가 GFP를 발현한다. 이와 대조적으로, 50 및 100 nM MTX에서는 적어도 90%의 세포가 GFP를 발현한다. 도시된 바와 같이, MTX 선택은 50 nM 및 100 nM에서, 및 2:1의 mcGFP:MC_SB100X 비 및 1:1의 mcGFP:MC_SB100X 비에서의 mcGFP 대 SB 비 둘 모두에서 GFP 발현의 풍부화를 위해 동등하게 효과적이었다. 예상된 바와 같이, SB 트랜스포사제의 부재 하에 및 DNA 미함유 대조군에서, 평가가능한 GFP 발현은 존재하지 않는다. GFP의 발현이 CD8+ 및 CD8- 림프구에서 유사함에 주목한다.
메토트렉세이트 선택-세포 계수를 사용한 T-세포에서 슬리핑 뷰티를 갖는 트랜스포존 DNA의 안정한 발현.
MTX 선택 하에 트랜스포존 DNA를 안정적으로 발현하는 PBMC의 세포 성장을 후에 평가하였다. 트랜스액트 비드에 의한 자극 및 IL2 및 IL-15의 존재 하의 성장 때문에, 대부분의 생존 세포는 1주까지 T 세포이다. 도 14에 도시된 바와 같이, 0 nM, 25 nM, 50 nM, 및 100 nM 메토트렉세이트의 MTX 처리 후에 살아있는 세포의 양을 제7, 14, 및 19일 (MTX 처리 후 제0, 7, 및 12일)에 트리판 블루 세포 계수를 사용하여 결정하였다. 대조군 (0 nM MTX)에서, 살아있는 세포의 수는 모든 DNA 조건에서 시간에 따라 증가하였다. 그러나, MTX의 존재 하에, SB 트랜스포사제 및 GFP 및 DHFRdm 내성 유전자를 동시 발현하는 미니서클 트랜스포존 둘 모두로 형질감염된 세포만이 분열할 수 있었고, 이것은 SB가 트랜스포존의 안정한 발현을 위해 필요함을 나타낸다.
메토트렉세이트 선택- GFP 발현을 사용한 T-세포에서 슬리핑 뷰티를 갖는 트랜스포존 DNA의 안정한 발현.
MTX 선택 동안 T-세포에서 슬리핑 뷰티를 갖는 트랜스포존 DNA의 안정한 발현을 19일에 걸쳐 형질감염된 세포의 GFP 발현을 결정함으로써 평가하였다. 제7일에 출발한 메토트렉세이트 선택 (0, 25, 50, 및 100 nM) 후에 T-세포에서 트랜스포존 DNA 및 슬리핑 뷰티로 형질감염된 세포에서 시간에 걸쳐 증가하는 GFP 발현을 보여주는 도 14를 참조한다. 제2, 5, 7, 14, 및 19일로부터 메토트렉세이트 선택을 실시하지 않은 대조군에 도시된 바와 같이, mcGFP 및 SB로 형질감염된 세포에서 GFP의 발현은 ~20%에서 유지되는 반면, 발현은 mcGFP 단독 및 pMAXGFP 대조군에서 꾸준히 감소한다. MTX 선택의 존재 하에, GFP 발현은 시간에 걸쳐 증가하고, 가장 높은 수준은 50 및 100 nM MTX에서 관찰되었다. 도시된 바와 같이, mcGFP:MC_SB100X의 비는 1:1 및 2:1의 비 사이에서 차이를 보이지 않았다. 추가로, 50 nM 또는 100 nM MTX에 노출된 세포에서 평균 형광 강도의 최소 차이가 존재하였다. MTX의 존재 하에 mcGFP 단독에서 낮은 수준의 GFP 발현 (~20%)은 트랜스포존-비의존성의 안정한 통합에 의한 것일 가능성이 있고, 상기 조건에서 세포의 절대적인 수는 도 14에 제시된 바와 같이 매우 낮다.
한 대안에서, 삽입을 위한 핵산이 유전자 전달 폴리뉴클레오티드 내의 역위 말단 반복체 유전자 서열의 측면에 위치하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 선택가능한 것인, 핵산의 유전자 내로의 안정한 삽입을 위한 유전자 전달 폴리뉴클레오티드가 제공되고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 제1 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제1 서열, 제2 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제2 서열, 프로모터 영역 서열을 포함하는 제3 서열, 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 유전자를 포함하고, 최적화된 제4 서열, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체를 코딩하는 적어도 하나의 선택가능 마커 카세트를 포함하고, 여기서, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 메토트렉세이트에 대해 15,000배 또는 약 15,000배 감소된 친화도를 갖고, 메토트렉세이트는 유전자 전달 폴리뉴클레오티드로 형질도입된 세포를 선택적으로 증폭하기 위해 선택 메카니즘으로서 사용될 수 있는 것인, 최적화된 제5 서열, 제1 부착 부위 (attP)를 포함하는 제6 서열, 제2 부착 부위 (attB)를 포함하는 제7 서열을 포함하고, 여기서 각각의 제1 서열, 제2 서열, 제3 서열, 제4 서열, 제5 서열, 제6 서열, 및 제7 서열은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, 제1 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제1 서열의 3' 말단은 제3 서열의 5' 말단에 인접하고, 제3 서열의 3' 말단은 제4 서열의 5' 말단에 인접하고, 제4 서열의 3' 말단은 제5 서열의 5' 말단에 인접하고, 제5 서열의 3' 말단은 제2 역위 말단 반복체를 포함하는 제2 서열의 5' 말단에 인접한다. 일부 대안에서, 인간 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체를 코딩하는 유전자는 다음 DNA 서열을 포함한다:
Figure pct00030
일부 대안에서, 인간 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 다음 단백질 서열을 포함한다:
Figure pct00031
일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 환상이다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 적어도 1 kB 내지 5 kB이다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 미니서클이다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 미니서클이다. 일부 대안에서, 프로모터 영역은 EF1 프로모터 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제4 서열은 단백질을 코딩하는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 유전자를 포함한다. 일부 대안에서, 제4 서열은 제4 서열의 총 GC/AT 비를 감소시키기 위해 코돈 최적화된다. 일부 대안에서, 제4 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화에 의해 최적화된다. 일부 대안에서, 제4 서열은 다수의 관련 단백질을 코딩하는 다수의 핵산으로부터 생성된 컨센서스 서열이다. 일부 대안에서, 제4 서열은 다수의 관련 단백질, 예컨대 동일한 에피토프에 특이적인 다수의 항체 결합 도메인을 코딩하는 다수의 핵산으로부터 생성된 컨센서스 서열이다. 일부 대안에서, 다수의 관련 단백질은 다수의 항체 결합 도메인을 포함하고, 다수의 항체 결합 도메인은 동일한 에피토프에 대해 특이적이다. 일부 대안에서, 제5 서열은 제5 서열의 총 GC/AT 비를 감소시키기 위해 코돈 최적화된다. 일부 대안에서, 제5 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화에 의해 최적화된다. 일부 대안에서, 단백질은 요법을 위한 단백질이다. 일부 대안에서, 코돈 최적화 및/또는 컨센서스 서열은 다수의 관련 서열에서 이용되는 서열 및/또는 핵염기의 가변성을 비교함으로써 생성된다. 일부 대안에서, 단백질은 항체 또는 그의 일부를 포함하고, 이것은 인간화될 수 있다. 일부 대안에서, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 L22F 및 F31S의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
일부 대안에서, 입양 T-세포 면역요법을 위한 조작된 다중화 T-세포의 생성 방법이 제공되고, 여기서 방법은 본원에서 설명되는 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 T-세포 내로 도입하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 제공하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 T-세포 내로 도입하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 선택하고, 여기서 선택은 제1 라운드의 선택 및 제2 라운드의 선택을 포함하고, 제1 라운드의 선택은 선택 시약을 제1 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 라운드의 선택은 선택 시약을 제2 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 더 높고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 적어도 1.5배 더 높고, 선택 압력 하에 표현형을 발현하는 T-세포를 단리하는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 제1 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제1 서열, 제2 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제2 서열, 프로모터 영역 서열을 포함하는 제3 서열, 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 유전자를 포함하고, 최적화된 제4 서열, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체를 코딩하는 적어도 하나의 선택가능 마커 카세트를 포함하고, 여기서, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 메토트렉세이트에 대해 15,000배 또는 약 15,000배 감소된 친화도를 갖고, 메토트렉세이트는 유전자 전달 폴리뉴클레오티드로 형질도입된 세포를 선택적으로 증폭하기 위해 선택 메카니즘으로서 사용될 수 있는 것인, 최적화된 제5 서열, 제1 부착 부위 (attP)를 포함하는 제6 서열, 제2 부착 부위 (attB)를 포함하는 제7 서열을 포함하고, 여기서 각각의 제1 서열, 제2 서열, 제3 서열, 제4 서열, 제5 서열, 제6 서열, 및 제7 서열은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, 제1 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제1 서열의 3' 말단은 제3 서열의 5' 말단에 인접하고, 제3 서열의 3' 말단은 제4 서열의 5' 말단에 인접하고, 제4 서열의 3' 말단은 제5 서열의 5' 말단에 인접하고, 제5 서열의 3' 말단은 제2 역위 말단 반복체를 포함하는 제2 서열의 5' 말단에 인접한다. 일부 대안에서, 인간 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체를 코딩하는 유전자는 다음 DNA 서열을 포함한다:
Figure pct00032
일부 대안에서, 인간 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 다음 단백질 서열을 포함한다:
Figure pct00033
일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 환상이다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 적어도 1 kB 내지 5 kB이다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 미니서클이다. 일부 대안에서, 프로모터 영역은 EF1 프로모터 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제4 서열은 단백질을 코딩하는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 유전자를 포함한다. 일부 대안에서, 제4 서열은 제4 서열의 총 GC/AT 비를 감소시키기 위해 코돈 최적화된다. 일부 대안에서, 제4 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화에 의해 최적화된다. 일부 대안에서, 제4 서열은 다수의 관련 단백질을 코딩하는 다수의 핵산으로부터 생성된 컨센서스 서열이다. 일부 대안에서, 제4 서열은 다수의 관련 단백질, 예컨대 동일한 에피토프에 특이적인 다수의 항체 결합 도메인을 코딩하는 다수의 핵산으로부터 생성된 컨센서스 서열이다. 일부 대안에서, 다수의 관련 단백질은 다수의 항체 결합 도메인을 포함하고, 다수의 항체 결합 도메인은 동일한 에피토프에 대해 특이적이다. 일부 대안에서, 제5 서열은 제5 서열의 총 GC/AT 비를 감소시키기 위해 코돈 최적화된다. 일부 대안에서, 제5 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화에 의해 최적화된다. 일부 대안에서, 단백질은 요법을 위한 단백질이다. 일부 대안에서, 코돈 최적화 및/또는 컨센서스 서열은 다수의 관련 서열에서 이용되는 서열 및/또는 핵염기의 가변성을 비교함으로써 생성된다. 일부 대안에서, 단백질은 항체 또는 그의 일부를 포함하고, 이것은 인간화될 수 있다. 일부 대안에서, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 L22F 및 F31S의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일부 대안에서, 도입은 전기천공에 의해 수행된다. 일부 대안에서, 선택은 선택 마커 카세트를 통해 선택 압력을 증가시킴으로써 수행된다. 일부 대안에서, 선택 시약은 선택제를 포함한다. 일부 대안에서, 선택제는 메토트렉세이트이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 50 nM - 100 nM이고, 제2 농도 범위는 적어도 75 내지 150 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도는 50 nM, 60 nM, 70 nM, 80 nM, 90 nM, 또는 100 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이고, 제2 농도 범위는 75 nM, 80 nM, 90 nM, 100 nM, 110 nM, 120 nM, 130 nM, 140 nM, 또는 150 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 75 nM - 150 nM이고, 제2 농도 범위는 적어도 112.5 nM 내지 225 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도는 75 nM, 85 nM, 95 nM, 105 nM, 115 nM, 125 nM, 135 nM, 145 nM, 또는 150 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이고, 제2 농도 범위는 112 nM, 122 nM, 132 nM, 142 nM, 152 nM, 162 nM, 172 nM, 182 nM, 192 nM, 202 nM, 212 nM, 또는 225 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 300 nM - 675 nM이고, 제1 농도 범위는 적어도 450 nM 내지 1012 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도는 300 nM, 350 nM, 400 nM, 450 nM, 500 nM, 550 nM, 600 nM, 650 nM, 또는 675 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이고, 제2 농도 범위는 450 nM, 500 nM, 550 nM, 600 nM, 650 nM, 700 nM, 750 nM, 800 nM, 850 nM, 900 nM, 1000 nM, 또는 1012 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이다. 일부 대안에서, 제1 라운드의 선택은 T-세포를 제2 라운드의 선택 전에 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 라운드의 선택은 T-세포를 단리 전에 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14일 또는 상기 언급된 시점 중 임의의 2개에 의해 규정된 시간 범위 내인 임의의 시간 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함한다.
일부 대안에서, T-세포에서 단백질 생산을 증가시키는 방법이 제공되고, 여기서 방법은 본원에서 설명되는 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 제공하고, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 T-세포 내로 도입하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 선택하고, 여기서 선택은 제1 라운드의 선택 및 제2 라운드의 선택을 포함하고, 제1 라운드의 선택은 선택 시약을 제1 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 라운드의 선택은 선택 시약을 제2 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 더 높고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 적어도 1.5배 더 높고, 선택 압력 하에 표현형을 발현하는 T-세포를 단리하는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 도입은 전기천공에 의해 수행된다. 일부 대안에서, 선택은 선택 마커 카세트를 통해 선택 압력을 증가시킴으로써 수행된다. 일부 대안에서, 선택 시약은 선택제를 포함한다. 일부 대안에서, 선택제는 메토트렉세이트이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 50 nM - 100 nM이고, 제2 농도 범위는 적어도 75 내지 150 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도는 50 nM, 60 nM, 70 nM, 80 nM, 90 nM, 또는 100 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이고, 제2 농도 범위는 75 nM, 80 nM, 90 nM, 100 nM, 110 nM, 120 nM, 130 nM, 140 nM, 또는 150 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 75 nM - 150 nM이고, 제2 농도 범위는 적어도 112.5 nM 내지 225 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도는 75 nM, 85 nM, 95 nM, 105 nM, 115 nM, 125 nM, 135 nM, 145 nM, 또는 150 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이고, 제2 농도 범위는 112 nM, 122 nM, 132 nM, 142 nM, 152 nM, 162 nM, 172 nM, 182 nM, 192 nM, 202 nM, 212 nM, 또는 225 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 300 nM - 675 nM이고, 제1 농도 범위는 적어도 450 nM 내지 1012 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도는 300 nM, 350 nM, 400 nM, 450 nM, 500 nM, 550 nM, 600 nM, 650 nM, 또는 675 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이고, 제2 농도 범위는 450 nM, 500 nM, 550 nM, 600 nM, 650 nM, 700 nM, 750 nM, 800 nM, 850 nM, 900 nM, 1000 nM, 또는 1012 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이다. 일부 대안에서, 제1 라운드의 선택은 T-세포를 제2 라운드의 선택 전에 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 라운드의 선택은 T-세포를 단리 전에 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14일 또는 상기 언급된 시점 중 임의의 2개에 의해 규정된 시간 범위 내인 임의의 시간 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함한다.
일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 제1 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제1 서열, 제2 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제2 서열, 프로모터 영역 서열을 포함하는 제3 서열, 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 유전자를 포함하고, 최적화된 제4 서열, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체를 코딩하는 적어도 하나의 선택가능 마커 카세트를 포함하고, 여기서, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 메토트렉세이트에 대해 15,000배 또는 약 15,000배 감소된 친화도를 갖고, 메토트렉세이트는 유전자 전달 폴리뉴클레오티드로 형질도입된 세포를 선택적으로 증폭하기 위해 선택 메카니즘으로서 사용될 수 있는 것인, 최적화된 제5 서열, 제1 부착 부위 (attP)를 포함하는 제6 서열, 제2 부착 부위 (attB)를 포함하는 제7 서열을 포함하고, 여기서 각각의 제1 서열, 제2 서열, 제3 서열, 제4 서열, 제5 서열, 제6 서열, 및 제7 서열은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, 제1 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제1 서열의 3' 말단은 제3 서열의 5' 말단에 인접하고, 제3 서열의 3' 말단은 제4 서열의 5' 말단에 인접하고, 제4 서열의 3' 말단은 제5 서열의 5' 말단에 인접하고, 제5 서열의 3' 말단은 제2 역위 말단 반복체를 포함하는 제2 서열의 5' 말단에 인접한다. 일부 대안에서, 인간 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체를 코딩하는 유전자는 다음 DNA 서열을 포함한다:
Figure pct00034
일부 대안에서, 인간 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 다음 단백질 서열을 포함한다:
Figure pct00035
일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 환상이다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 적어도 1 kB 내지 5 kB이다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 미니서클이다. 일부 대안에서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 미니서클이다. 일부 대안에서, 프로모터 영역은 EF1 프로모터 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제4 서열은 단백질을 코딩하는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 유전자를 포함한다. 일부 대안에서, 제4 서열은 제4 서열의 총 GC/AT 비를 감소시키기 위해 코돈 최적화된다. 일부 대안에서, 제4 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화에 의해 최적화된다. 일부 대안에서, 제4 서열은 다수의 관련 단백질을 코딩하는 다수의 핵산으로부터 생성된 컨센서스 서열이다. 일부 대안에서, 제4 서열은 다수의 관련 단백질, 예컨대 동일한 에피토프에 특이적인 다수의 항체 결합 도메인을 코딩하는 다수의 핵산으로부터 생성된 컨센서스 서열이다. 일부 대안에서, 다수의 관련 단백질은 다수의 항체 결합 도메인을 포함하고, 다수의 항체 결합 도메인은 동일한 에피토프에 대해 특이적이다. 일부 대안에서, 제5 서열은 제5 서열의 총 GC/AT 비를 감소시키기 위해 코돈 최적화된다. 일부 대안에서, 제5 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화에 의해 최적화된다. 일부 대안에서, 코돈 최적화 및/또는 컨센서스 서열은 다수의 관련 서열에서 이용되는 서열 및/또는 핵염기의 가변성을 비교함으로써 생성된다. 일부 대안에서, 단백질은 항체 또는 그의 일부를 포함하고, 이것은 인간화될 수 있다. 일부 대안에서, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 L22F 및 F31S의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일부 대안에서, 도입은 전기천공에 의해 수행된다. 일부 대안에서, 선택은 선택 마커 카세트를 통해 선택 압력을 증가시킴으로써 수행된다. 일부 대안에서, 선택 시약은 선택제를 포함한다. 일부 대안에서, 선택제는 메토트렉세이트이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 50 nM - 100 nM이고, 제2 농도 범위는 적어도 75 내지 150 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도는 50 nM, 60 nM, 70 nM, 80 nM, 90 nM, 또는 100 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이고, 제2 농도 범위는 75 nM, 80 nM, 90 nM, 100 nM, 110 nM, 120 nM, 130 nM, 140 nM, 또는 150 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 75 nM - 150 nM이고, 제2 농도 범위는 적어도 112.5 nM 내지 225 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도는 75 nM, 85 nM, 95 nM, 105 nM, 115 nM, 125 nM, 135 nM, 145 nM, 또는 150 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이고, 제2 농도 범위는 112 nM, 122 nM, 132 nM, 142 nM, 152 nM, 162 nM, 172 nM, 182 nM, 192 nM, 202 nM, 212 nM, 또는 225 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이다. 일부 대안에서, 제1 농도 범위는 적어도 300 nM - 675 nM이고, 제1 농도 범위는 적어도 450 nM 내지 1012 nM이다. 일부 대안에서, 제1 농도는 300 nM, 350 nM, 400 nM, 450 nM, 500 nM, 550 nM, 600 nM, 650 nM, 또는 675 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이고, 제2 농도 범위는 450 nM, 500 nM, 550 nM, 600 nM, 650 nM, 700 nM, 750 nM, 800 nM, 850 nM, 900 nM, 1000 nM, 또는 1012 nM 또는 상기 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해 규정된 농도 범위 내의 임의의 농도이다. 일부 대안에서, 제1 라운드의 선택은 T-세포를 제2 라운드의 선택 전에 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 라운드의 선택은 T-세포를 단리 전에 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14일 또는 상기 언급된 시점 중 임의의 2개에 의해 규정된 시간 범위 내인 임의의 시간 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함한다.
일부 대안에서, 대상체에서 암 또는 질환의 치료, 억제 또는 개선 방법이 제공되고, 이 방법은 대상체에게 본원에서 설명되는 변형된 T-세포를 투여하는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 대상체는 인간이다.
실질적으로 임의의 복수 및/또는 단수 용어의 사용에 대해, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 문맥 및/또는 적용에 적절하게 복수를 단수로 및/또는 단수를 복수로 이해할 수 있다. 다양한 단수/복수 변경이 명확성을 위해 본원에서 분명하게 제시될 수 있다.
일반적으로, 본원에서, 특히 첨부되는 청구항 (예를 들어, 첨부되는 청구항의 본문)에서 사용되는 용어는 일반적으로 "개방된" 용어로 의도됨이 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 이해될 것이다 (예를 들어, 용어 "포함하는"은 "포함하되, 이로 제한되지 않는"으로 해석되어야 하고, 용어 "갖는"은 "적어도 갖는"으로 해석되어야 하고, 용어 "포함하다"는 "포함하되, 이로 제한되지 않는다"로 해석되어야 한다). 도입되는 청구항 설명의 특정 수가 의도될 경우, 상기 의도는 청구항에 명시적으로 설명될 것이고, 상기 설명이 부재할 경우에는 상기 의도가 존재하지 않음이 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 추가로 이해될 것이다. 예를 들어, 이해를 돕기 위해, 하기 첨부되는 청구항은 청구항 설명을 도입하기 위해 도입 문구 "적어도 하나의" 및 "하나 이상의"의 사용을 포함할 수 있다. 그러나, 상기 문구의 사용은 동일한 청구항이 도입 문구 "하나 이상의" 또는 "적어도 하나의" 및 부정관사, 예컨대 "a" 또는 "an" (예를 들어, "a" 및/또는 "an"은 "적어도 하나의" 또는 "하나 이상의"를 의미하는 것으로 해석되어야 한다)를 포함할 때에도, 부정관사 ("a" 또는 "an")에 의한 청구항 설명의 도입은, 상기 도입된 청구항 설명을 포함하는 임의의 특정 청구항을 상기 하나의 설명만을 포함하는 실시양태로 제한한다고 의미하는 것으로 해석되지 않아야 하고; 청구항 설명을 도입하기 위해 사용되는 정관사의 사용도 이와 동일하게 적용된다. 또한, 도입된 청구항 설명의 특정 수가 명시적으로 설명될 경우에도, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 상기 설명이 적어도 설명된 수를 의미하는 것으로 해석되어야 함을 알 것이다 (예를 들어, 다른 수식어 없이 "2개의 설명"이라는 단순한 설명은 적어도 2개의 설명, 또는 2 이상의 설명을 의미한다). 또한, "A, B, 및 C 중 적어도 하나 등"과 유사한 표현이 사용되는 경우, 일반적으로 상기 구조는 관련 기술 분야의 통상의 기술자가 그 표현을 이해하는 의미가 의도된다 (예를 들어, "A, B, 및 C 중 적어도 하나를 갖는 시스템"은 A를 단독으로, B를 단독으로, C를 단독으로, A 및 B를 함께, A 및 C를 함께, B 및 C를 함께, 및/또는 A, B, 및 C를 함께 갖는 시스템 등을 포함하고 이로 제한되지 않을 것이다). "A, B, 또는 C 중 적어도 하나 등"과 유사한 표현이 사용되는 경우, 일반적으로 상기 구조는 관련 기술 분야의 통상의 기술자가 그 표현을 이해하는 의미가 의도된다 (예를 들어, "A, B, 또는 C 중 적어도 하나를 갖는 시스템"은 A를 단독으로, B를 단독으로, C를 단독으로, A 및 B를 함께, A 및 C를 함께, B 및 C를 함께, 및/또는 A, B, 및 C를 함께 갖는 시스템 등을 포함하고 이로 제한되지 않을 것이다). 추가로, 2 이상의 선택적인 용어를 제시하는 실질적으로 임의의 양자택일적 (disjunctive) 단어 및/또는 문구는 상세한 설명, 청구항, 또는 도면에서 사용되든지, 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 그 용어들 중의 하나, 그 용어들 중의 어느 하나 또는 두 용어 모두를 포함할 가능성을 고려하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 문구 "A 또는 B"는 "A" 또는 "B" 또는 "A 및 B"의 가능성을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
또한, 본 개시내용의 특징 또는 측면이 마커쉬 (Markush) 군의 측면에서 설명되는 경우, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 본 개시내용이 또한 마커쉬 군의 임의의 개별적인 구성원 또는 구성원의 하위군의 측면에서 설명됨을 알 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Jensen, Michael C. PUn, Suzie Kacherovsky, Nataly <120> PRODUCTION OF ENGINEERED T-CELLS BY SLEEPING BEAUTY TRANSPOSON COUPLED WITH METHOTREXATE SELECTION <130> SCRI.077PR <140> 62/090,845 <141> 2014-12-11 <160> 7 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 352 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA transposon of copied inverted repeat in description from Tanichthys albonubes <400> 1 cagttgaagt cggaagttta catacactta agttggagtc attaaaactc gtttttcaac 60 tactccacaa atttcttgtt aacaaacaat agttttggca agtcagttag gacatctact 120 ttgtgcatga cacaagtcat ttttccaaca attgtttaca gacagattat ttcacttata 180 attcactgta tcacaattcc agtgggtcag aagtttacat acactaagtt gactgtgcct 240 ttaaacagct tggaaaattc cagaaaatga tgtcatggct ttagaagctt ctgatagact 300 aattgacatc atttgagtca attggaggtg tacctgtgga tgtatttcaa gg 352 <210> 2 <211> 564 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human protein with dihydrofolate reductase double mutation <400> 2 atggttggtt cgctaaactg catcgtcgct gtgtcccaga acatgggcat cggcaagaac 60 ggggacttcc cctggccacc gctcaggaat gaatccagat atttccagag aatgaccaca 120 acctcttcag tagaaggtaa acagaatctg gtgattatgg gtaagaagac ctggttctcc 180 attcctgaga agaatcgacc tttaaagggt agaattaatt tagttctcag cagagaactc 240 aaggaacctc cacaaggagc tcattttctt tccagaagtc tagatgatgc cttaaaactt 300 actgaacaac cagaattagc aaataaagta gacatggtct ggatagttgg tggcagttct 360 gtttataagg aagccatgaa tcacccaggc catcttaaac tatttgtgac aaggatcatg 420 caagactttg aaagtgacac gttttttcca gaaattgatt tggagaaata taaacttctg 480 ccagaatacc caggtgttct ctctgatgtc caggaggaga aaggcattaa gtacaaattt 540 gaagtatatg agaagaatga ttaa 564 <210> 3 <211> 187 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human protein with dihydrofolate reductase double mutation <400> 3 Met Val Gly Ser Leu Asn Cys Ile Val Ala Val Ser Gln Asn Met Gly 1 5 10 15 Ile Gly Lys Asn Gly Asp Phe Pro Trp Pro Pro Leu Arg Asn Glu Ser 20 25 30 Arg Tyr Phe Gln Arg Met Thr Thr Thr Ser Ser Val Glu Gly Lys Gln 35 40 45 Asn Leu Val Ile Met Gly Lys Lys Thr Trp Phe Ser Ile Pro Glu Lys 50 55 60 Asn Arg Pro Leu Lys Gly Arg Ile Asn Leu Val Leu Ser Arg Glu Leu 65 70 75 80 Lys Glu Pro Pro Gln Gly Ala His Phe Leu Ser Arg Ser Leu Asp Asp 85 90 95 Ala Leu Lys Leu Thr Glu Gln Pro Glu Leu Ala Asn Lys Val Asp Met 100 105 110 Val Trp Ile Val Gly Gly Ser Ser Val Tyr Lys Glu Ala Met Asn His 115 120 125 Pro Gly His Leu Lys Leu Phe Val Thr Arg Ile Met Gln Asp Phe Glu 130 135 140 Ser Asp Thr Phe Phe Pro Glu Ile Asp Leu Glu Lys Tyr Lys Leu Leu 145 150 155 160 Pro Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser Asp Val Gln Glu Glu Lys Gly Ile 165 170 175 Lys Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu Lys Asn Asp 180 185 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 acaagatcat ccgcagcaac 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 ttgaagtgca tgtggctgtc 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 acaactttgg tatcgtggaa gg 22 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 gccatcacgc cacagtttc 19

Claims (64)

  1. 삽입을 위한 핵산이 유전자 전달 폴리뉴클레오티드 내의 역위 말단 반복체 유전자 서열의 측면에 위치하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드는 선택가능하고, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드가
    제1 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제1 서열,
    제2 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제2 서열;
    프로모터 영역 서열을 포함하는 제3 서열;
    적어도 하나의 유전자를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 유전자는 단백질을 코딩하거나 mRNA 전사를 위한 서열을 코딩하는 것인, 최적화된 제4 서열;
    디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체를 코딩하는 적어도 하나의 선택가능 마커 카세트를 포함하고, 여기서 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체는 메토트렉세이트에 대해 15,000배 또는 약 15,000배 감소된 친화도를 갖고, 메토트렉세이트는 적어도 하나의 유전자를 발현하는 세포의 비를 향상시키기 위해 유전자 전달 폴리뉴클레오티드로 형질도입된 세포를 선택하기 위해 사용될 수 있는 것인, 최적화된 제5 서열;
    제1 부착 부위 (attP)를 포함하는 제6 서열; 및
    제2 부착 부위 (attB)를 포함하는 제7 서열
    을 포함하고; 여기서, 각각의 제1 서열, 제2 서열, 제3 서열, 제4 서열, 제5 서열, 제6 서열, 및 제7 서열은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, 제1 역위 말단 반복체 유전자 서열을 포함하는 제1 서열의 3' 말단은 제3 서열의 5' 말단에 인접하고, 제3 서열의 3' 말단은 제4 서열의 5' 말단에 인접하고, 제4 서열의 3' 말단은 제5 서열의 5' 말단에 인접하고, 제5 서열의 3' 말단은 제2 역위 말단 반복체를 포함하는 제2 서열의 5' 말단에 인접하는 것인, 핵산의 올리고뉴클레오티드 내로의 안정한 삽입을 위한 유전자 전달 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드가 환상인 유전자 전달 폴리뉴클레오티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드가 적어도 1 kB 내지 5 kB인 유전자 전달 폴리뉴클레오티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터 영역이 EF1 프로모터 서열을 포함하는 것인 유전자 전달 폴리뉴클레오티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제4 서열이 단백질을 코딩하는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 유전자를 포함하는 것인 유전자 전달 폴리뉴클레오티드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제4 서열이 제4 서열의 총 GC/AT 비를 감소시키기 위해 코돈 최적화되는 것인 유전자 전달 폴리뉴클레오티드.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제4 서열이 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화에 의해 최적화되는 것인 유전자 전달 폴리뉴클레오티드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제4 서열이 다수의 관련 단백질을 코딩하는 다수의 핵산으로부터 생성된 컨센서스 서열인 유전자 전달 폴리뉴클레오티드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제4 서열이 다수의 관련 단백질, 예컨대 동일한 에피토프에 특이적인 다수의 항체 결합 도메인을 코딩하는 다수의 핵산으로부터 생성된 컨센서스 서열인 유전자 전달 폴리뉴클레오티드.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 다수의 관련 단백질이 다수의 항체 결합 도메인을 포함하고, 다수의 항체 결합 도메인이 동일한 에피토프에 대해 특이적인 것인 유전자 전달 폴리뉴클레오티드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제5 서열이 제5 서열의 총 GC/AT 비를 감소시키기 위해 코돈 최적화되는 것인 유전자 전달 폴리뉴클레오티드.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제5 서열이 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화에 의해 최적화되는 것인 유전자 전달 폴리뉴클레오티드.
  13. 제6항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 코돈 최적화 및/또는 컨센서스 서열이 다수의 관련 서열에서 이용되는 서열 및/또는 핵염기의 가변성을 비교함으로써 생성되는 것인 유전자 전달 폴리뉴클레오티드.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 요법을 위한 단백질인 유전자 전달 폴리뉴클레오티드.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 인간화될 수 있는 항체 또는 그의 일부를 포함하는 것인 유전자 전달 폴리뉴클레오티드.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 디히드로폴레이트 리덕타제의 이중 돌연변이체가 L22F 및 F31S의 아미노산 돌연변이를 포함하는 것인 유전자 전달 폴리뉴클레오티드.
  17. 제1항 내지 제16항 및 제40항 중 어느 한 항에 따른 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 제공하고;
    유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 T-세포 내로 도입하고;
    슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 제공하고;
    슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 T-세포 내로 도입하고;
    유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 선택하고; 여기서 선택은 제1 라운드의 선택 및 제2 라운드의 선택을 포함하고, 제1 라운드의 선택은 선택 시약을 제1 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 라운드의 선택은 선택 시약을 제2 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 더 높고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 적어도 1.5배 더 높고;
    선택 압력 하에 표현형을 발현하는 T-세포를 단리하는 것
    을 포함하는, 입양 T-세포 면역요법을 위한 조작된 다중화 T-세포의 생성 방법.
  18. 제17항에 있어서, 도입이 전기천공에 의해 수행되는 것인 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 선택이 선택 마커 카세트를 통해 선택 압력을 증가시킴으로써 수행되는 것인 방법.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 선택 시약이 선택제를 포함하는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 선택제가 메토트렉세이트인 방법.
  22. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 농도 범위가 적어도 50 nM - 100 nM이고, 제2 농도 범위가 적어도 75 내지 150 nM인 방법.
  23. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 농도 범위가 적어도 75 nM - 150 nM이고, 제2 농도 범위가 적어도 112.5 nM 내지 225 nM인 방법.
  24. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 농도 범위가 적어도 300 nM - 675 nM이고, 제1 농도 범위가 적어도 450 nM 내지 1012 nM인 방법.
  25. 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 라운드의 선택이 T-세포를 제2 라운드의 선택 전에 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  26. 제17항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 라운드의 선택이 T-세포를 단리 전에 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14일 또는 상기 언급된 시점 중 임의의 2개에 의해 규정된 시간 범위 내인 임의의 시간 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  27. 제1항 내지 제16항 및 제40항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 제공하고;
    폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하고;
    슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 제공하고;
    슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 T-세포 내로 도입하고;
    유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 선택하고; 여기서 선택은 제1 라운드의 선택 및 제2 라운드의 선택을 포함하고, 제1 라운드의 선택은 선택 시약을 제1 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 라운드의 선택은 선택 시약을 제2 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 더 높고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 적어도 1.5배 더 높고;
    선택 압력 하에 표현형을 발현하는 세포를 단리하는 것
    을 포함하는, T-세포에서 단백질 생산을 증가시키는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 도입이 전기천공에 의해 수행되는 것인 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 선택이 선택 마커 카세트를 통해 선택 압력을 증가시킴으로써 수행되는 것인 방법.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 선택 시약이 선택제를 포함하는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 선택제가 메토트렉세이트인 방법.
  32. 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 농도 범위가 적어도 50 nM - 100 nM이고, 제2 농도 범위가 적어도 75 내지 150 nM인 방법.
  33. 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 농도 범위가 적어도 75 nM - 150 nM이고, 제2 농도 범위가 적어도 112.5 nM 내지 225 nM인 방법.
  34. 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 농도 범위가 적어도 300 nM - 675 nM이고, 제2 농도 범위가 적어도 450 nM 내지 1012 nM인 방법.
  35. 제27항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 라운드의 선택이 세포를 제2 라운드의 선택 전에 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  36. 제27항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 라운드의 선택이 세포를 단리 전에 적어도 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  37. 제16항 내지 제36항, 제63항 및 제64항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생성된, 입양 T-세포 면역요법을 위한 조작된 다중화 T-세포.
  38. 대상체에게 제37항에 따른 변형된 T-세포를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암 또는 질환의 치료, 억제 또는 개선 방법.
  39. 제38항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  40. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 전달 폴리뉴클레오티드가 미니서클인 유전자 전달 폴리뉴클레오티드.
  41. 제1항 내지 제16항 및 제40항 중 어느 한 항에 따른 유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 제공하고;
    유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 전구체 T 세포 내로 도입하고;
    슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 제공하고;
    슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 전구체 T 세포 내로 도입하고;
    유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 포함하는 전구체 T 세포를 선택하고; 여기서 선택은 제1 라운드의 선택 및 제2 라운드의 선택을 포함하고, 제1 라운드의 선택은 선택 시약을 제1 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 라운드의 선택은 선택 시약을 제2 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 더 높고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 적어도 1.5배 더 높고;
    선택 압력 하에 표현형을 발현하는 전구체 T-세포를 단리하는 것
    을 포함하는, 입양 T-세포 면역요법을 위한 조작된 세포의 생성 방법.
  42. 제41항에 있어서, 도입이 전기천공에 의해 수행되는 것인 방법.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 선택이 선택 마커 카세트를 통해 선택 압력을 증가시킴으로써 수행되는 것인 방법.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 선택 시약이 선택제를 포함하는 것인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 선택제가 메토트렉세이트인 방법.
  46. 제41항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 농도 범위가 적어도 50 nM - 100 nM이고, 제2 농도 범위가 적어도 75 내지 150 nM인 방법.
  47. 제41항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 농도 범위가 적어도 75 nM - 150 nM이고, 제2 농도 범위가 적어도 112.5 nM 내지 225 nM인 방법.
  48. 제41항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 농도 범위가 적어도 300 nM - 675 nM이고, 제1 농도 범위가 적어도 450 nM 내지 1012 nM인 방법.
  49. 제41항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 라운드의 선택이 T-세포를 제2 라운드의 선택 전에 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  50. 제41항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 라운드의 선택이 전구체 T-세포를 단리 전에 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14일 또는 상기 언급된 시점 중 임의의 2개에 의해 규정된 시간 범위 내인 임의의 시간 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  51. 제41항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 전구체가 조혈 줄기 세포인 방법.
  52. 제1항 내지 제16항 및 제40항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 제공하고;
    폴리뉴클레오티드를 전구체 T 세포 내로 도입하고;
    슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 제공하고;
    슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 코딩하는 벡터를 전구체 T-세포 내로 도입하고;
    유전자 전달 폴리뉴클레오티드를 포함하는 전구체 T 세포를 선택하고; 여기서 선택은 제1 라운드의 선택 및 제2 라운드의 선택을 포함하고, 제1 라운드의 선택은 선택 시약을 제1 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 라운드의 선택은 선택 시약을 제2 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 더 높고, 제2 농도 범위는 제1 농도 범위보다 적어도 1.5배 더 높고;
    선택 압력 하에 표현형을 발현하는 전구체 T 세포를 단리하는 것
    을 포함하는, 전구체 T-세포에서 단백질 생산을 증가시키는 방법.
  53. 제52항에 있어서, 도입이 전기천공에 의해 수행되는 것인 방법.
  54. 제53항 또는 제54항에 있어서, 선택이 선택 마커 카세트를 통해 선택 압력을 증가시킴으로써 수행되는 것인 방법.
  55. 제52항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 선택 시약이 선택제를 포함하는 것인 방법.
  56. 제55항에 있어서, 선택제가 메토트렉세이트인 방법.
  57. 제52항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 농도 범위가 적어도 50 nM - 100 nM이고, 제2 농도 범위가 적어도 75 내지 150 nM인 방법.
  58. 제52항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 농도 범위가 적어도 75 nM - 150 nM이고, 제2 농도 범위가 적어도 112.5 nM 내지 225 nM인 방법.
  59. 제52항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 농도 범위가 적어도 300 nM - 675 nM이고, 제2 농도 범위가 적어도 450 nM 내지 1012 nM인 방법.
  60. 제52항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 라운드의 선택이 세포를 제2 라운드의 선택 전에 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  61. 제52항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 라운드의 선택이 세포를 단리 전에 적어도 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 동안 선택제에 노출시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  62. 제52항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 전구체 T 세포가 조혈 줄기 세포인 방법.
  63. 제17항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포가 전구체 T 세포인 방법.
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