KR20230065251A - 유전적으로 조작된 t 세포를 풍부화시키기 위한 방법 - Google Patents
유전적으로 조작된 t 세포를 풍부화시키기 위한 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20230065251A KR20230065251A KR1020237007441A KR20237007441A KR20230065251A KR 20230065251 A KR20230065251 A KR 20230065251A KR 1020237007441 A KR1020237007441 A KR 1020237007441A KR 20237007441 A KR20237007441 A KR 20237007441A KR 20230065251 A KR20230065251 A KR 20230065251A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- protein
- nucleotide sequence
- cell
- cells
- dhfr
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 314
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 title claims description 199
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 705
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 698
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 585
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 499
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 499
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 claims description 260
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 claims description 244
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 183
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 153
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 claims description 147
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 claims description 147
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 140
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 131
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 claims description 129
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 98
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 95
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 95
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 claims description 90
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 claims description 90
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 77
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 claims description 75
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 58
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims description 54
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 52
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 52
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 claims description 45
- 102100029454 T cell receptor alpha chain MC.7.G5 Human genes 0.000 claims description 45
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 44
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 43
- 102100026967 T cell receptor beta chain MC.7.G5 Human genes 0.000 claims description 42
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 38
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 36
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 36
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 claims description 35
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 claims description 32
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 claims description 32
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 29
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims description 27
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 25
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 25
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 24
- 239000013589 supplement Substances 0.000 claims description 24
- 102100027913 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP1A Human genes 0.000 claims description 23
- 108010006877 Tacrolimus Binding Protein 1A Proteins 0.000 claims description 23
- 238000010446 CRISPR interference Methods 0.000 claims description 22
- 230000001603 reducing effect Effects 0.000 claims description 21
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims description 20
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 19
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 claims description 19
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 19
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 18
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 17
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 16
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 15
- 102100022900 Actin, cytoplasmic 1 Human genes 0.000 claims description 15
- 101100107610 Arabidopsis thaliana ABCF4 gene Proteins 0.000 claims description 15
- 102100026234 Cytokine receptor common subunit gamma Human genes 0.000 claims description 15
- 101710189311 Cytokine receptor common subunit gamma Proteins 0.000 claims description 15
- 102100030801 Elongation factor 1-alpha 1 Human genes 0.000 claims description 15
- 101000756632 Homo sapiens Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 claims description 15
- 101000920078 Homo sapiens Elongation factor 1-alpha 1 Proteins 0.000 claims description 15
- 102100028251 Phosphoglycerate kinase 1 Human genes 0.000 claims description 15
- 101710139464 Phosphoglycerate kinase 1 Proteins 0.000 claims description 15
- 101100068078 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) GCN4 gene Proteins 0.000 claims description 15
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 15
- 230000017730 intein-mediated protein splicing Effects 0.000 claims description 14
- 102100027314 Beta-2-microglobulin Human genes 0.000 claims description 11
- 101000937544 Homo sapiens Beta-2-microglobulin Proteins 0.000 claims description 11
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 11
- 229940121649 protein inhibitor Drugs 0.000 claims description 11
- 239000012268 protein inhibitor Substances 0.000 claims description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 10
- 102100034458 Hepatitis A virus cellular receptor 2 Human genes 0.000 claims description 10
- 101000988834 Homo sapiens Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 claims description 10
- 101001076642 Homo sapiens Inosine-5'-monophosphate dehydrogenase 2 Proteins 0.000 claims description 10
- 101000610604 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10B Proteins 0.000 claims description 10
- 101000801228 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Proteins 0.000 claims description 10
- 101000666896 Homo sapiens V-type immunoglobulin domain-containing suppressor of T-cell activation Proteins 0.000 claims description 10
- 102100029098 Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 claims description 10
- 102100025891 Inosine-5'-monophosphate dehydrogenase 2 Human genes 0.000 claims description 10
- 102100025825 Methylated-DNA-protein-cysteine methyltransferase Human genes 0.000 claims description 10
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 10
- 108010033576 Transferrin Receptors Proteins 0.000 claims description 10
- 102100026144 Transferrin receptor protein 1 Human genes 0.000 claims description 10
- 102100040112 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10B Human genes 0.000 claims description 10
- 102100033732 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Human genes 0.000 claims description 10
- 102100038282 V-type immunoglobulin domain-containing suppressor of T-cell activation Human genes 0.000 claims description 10
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 10
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 10
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 claims description 10
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 9
- 102200015453 rs121912293 Human genes 0.000 claims description 9
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 claims description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 9
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 claims description 9
- 102100029588 Deoxycytidine kinase Human genes 0.000 claims description 8
- 108010033174 Deoxycytidine kinase Proteins 0.000 claims description 8
- -1 IL4RA Proteins 0.000 claims description 8
- 101150012617 TRB gene Proteins 0.000 claims description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 8
- 101150069263 tra gene Proteins 0.000 claims description 8
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 claims description 7
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 claims description 7
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 claims description 7
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims description 7
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 claims description 7
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 claims description 6
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 claims description 6
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims description 6
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000005155 neural progenitor cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 claims description 6
- 102100022089 Acyl-[acyl-carrier-protein] hydrolase Human genes 0.000 claims description 5
- 102100035990 Adenosine receptor A2a Human genes 0.000 claims description 5
- 102100029822 B- and T-lymphocyte attenuator Human genes 0.000 claims description 5
- 101000796998 Bacillus subtilis (strain 168) Methylated-DNA-protein-cysteine methyltransferase, inducible Proteins 0.000 claims description 5
- 101000964894 Bos taurus 14-3-3 protein zeta/delta Proteins 0.000 claims description 5
- 102100024217 CAMPATH-1 antigen Human genes 0.000 claims description 5
- 108010065524 CD52 Antigen Proteins 0.000 claims description 5
- 102100021396 Cell surface glycoprotein CD200 receptor 1 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 claims description 5
- 108700041152 Endoplasmic Reticulum Chaperone BiP Proteins 0.000 claims description 5
- 102100021451 Endoplasmic reticulum chaperone BiP Human genes 0.000 claims description 5
- 102100039950 Eukaryotic initiation factor 4A-I Human genes 0.000 claims description 5
- 102100020760 Ferritin heavy chain Human genes 0.000 claims description 5
- 102100021062 Ferritin light chain Human genes 0.000 claims description 5
- 101150112743 HSPA5 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 108010007707 Hepatitis A Virus Cellular Receptor 2 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000824278 Homo sapiens Acyl-[acyl-carrier-protein] hydrolase Proteins 0.000 claims description 5
- 101000783751 Homo sapiens Adenosine receptor A2a Proteins 0.000 claims description 5
- 101000864344 Homo sapiens B- and T-lymphocyte attenuator Proteins 0.000 claims description 5
- 101000969553 Homo sapiens Cell surface glycoprotein CD200 receptor 1 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000889276 Homo sapiens Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000959666 Homo sapiens Eukaryotic initiation factor 4A-I Proteins 0.000 claims description 5
- 101001002987 Homo sapiens Ferritin heavy chain Proteins 0.000 claims description 5
- 101000818390 Homo sapiens Ferritin light chain Proteins 0.000 claims description 5
- 101001068133 Homo sapiens Hepatitis A virus cellular receptor 2 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000935040 Homo sapiens Integrin beta-2 Proteins 0.000 claims description 5
- 101001083151 Homo sapiens Interleukin-10 receptor subunit alpha Proteins 0.000 claims description 5
- 101001047640 Homo sapiens Linker for activation of T-cells family member 1 Proteins 0.000 claims description 5
- 101001137987 Homo sapiens Lymphocyte activation gene 3 protein Proteins 0.000 claims description 5
- 101000611936 Homo sapiens Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000702132 Homo sapiens Protein spinster homolog 1 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 claims description 5
- 101000662909 Homo sapiens T cell receptor beta constant 1 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000831007 Homo sapiens T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains Proteins 0.000 claims description 5
- 101000934346 Homo sapiens T-cell surface antigen CD2 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000946863 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD3 delta chain Proteins 0.000 claims description 5
- 101000946860 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD3 epsilon chain Proteins 0.000 claims description 5
- 101000738413 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD3 gamma chain Proteins 0.000 claims description 5
- 101000611023 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6 Proteins 0.000 claims description 5
- 101001047681 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase Lck Proteins 0.000 claims description 5
- 102100025390 Integrin beta-2 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100030236 Interleukin-10 receptor subunit alpha Human genes 0.000 claims description 5
- 102100039078 Interleukin-4 receptor subunit alpha Human genes 0.000 claims description 5
- 102000017578 LAG3 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100024032 Linker for activation of T-cells family member 1 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 claims description 5
- 102100037272 T cell receptor beta constant 1 Human genes 0.000 claims description 5
- 108700042075 T-Cell Receptor Genes Proteins 0.000 claims description 5
- 102100024834 T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains Human genes 0.000 claims description 5
- 102100025237 T-cell surface antigen CD2 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100035891 T-cell surface glycoprotein CD3 delta chain Human genes 0.000 claims description 5
- 102100035794 T-cell surface glycoprotein CD3 epsilon chain Human genes 0.000 claims description 5
- 102100037911 T-cell surface glycoprotein CD3 gamma chain Human genes 0.000 claims description 5
- 108010082684 Transforming Growth Factor-beta Type II Receptor Proteins 0.000 claims description 5
- 102000004060 Transforming Growth Factor-beta Type II Receptor Human genes 0.000 claims description 5
- 102100024036 Tyrosine-protein kinase Lck Human genes 0.000 claims description 5
- 101001038499 Yarrowia lipolytica (strain CLIB 122 / E 150) Lysine acetyltransferase Proteins 0.000 claims description 5
- IJJVMEJXYNJXOJ-UHFFFAOYSA-N fluquinconazole Chemical compound C=1C=C(Cl)C=C(Cl)C=1N1C(=O)C2=CC(F)=CC=C2N=C1N1C=NC=N1 IJJVMEJXYNJXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 108040008770 methylated-DNA-[protein]-cysteine S-methyltransferase activity proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 claims description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 4
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L (R)-2-Hydroxy-3-(phosphonooxy)-propanal Natural products O=C[C@H](O)COP([O-])([O-])=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L 0.000 claims description 3
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N D-glyceraldehyde 3-phosphate Chemical compound O=C[C@H](O)COP(O)(O)=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 3
- 230000006735 deficit Effects 0.000 claims description 3
- 238000006356 dehydrogenation reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000009149 molecular binding Effects 0.000 claims description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 3
- 101150076800 B2M gene Proteins 0.000 claims description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 claims description 2
- 108020001775 protein parts Proteins 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 4
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 493
- 230000006870 function Effects 0.000 description 45
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 38
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 37
- 101000861454 Homo sapiens Protein c-Fos Proteins 0.000 description 35
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 29
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 28
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 26
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 description 22
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 description 22
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 21
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 19
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 19
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 18
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 17
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 17
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 14
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 13
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 13
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 12
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 12
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 12
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 11
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 11
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 10
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 10
- 230000003946 protein process Effects 0.000 description 10
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 10
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 10
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 9
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 9
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 9
- 101000908713 Homo sapiens Dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 8
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 8
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 8
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 8
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 8
- 210000004986 primary T-cell Anatomy 0.000 description 8
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 7
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 7
- 230000004844 protein turnover Effects 0.000 description 7
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 6
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 6
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 5
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 5
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 5
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 5
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 5
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 102100025137 Early activation antigen CD69 Human genes 0.000 description 4
- 101000934374 Homo sapiens Early activation antigen CD69 Proteins 0.000 description 4
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 4
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 4
- 102100027268 Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Human genes 0.000 description 4
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 4
- 108010087408 alpha-beta T-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 230000004640 cellular pathway Effects 0.000 description 4
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003198 gene knock in Methods 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- MSTNYGQPCMXVAQ-RYUDHWBXSA-N (6S)-5,6,7,8-tetrahydrofolic acid Chemical compound C([C@H]1CNC=2N=C(NC(=O)C=2N1)N)NC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 MSTNYGQPCMXVAQ-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 3
- 101001065556 Mus musculus Lymphocyte antigen 6G Proteins 0.000 description 3
- 108010073062 Transcription Activator-Like Effectors Proteins 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000011198 co-culture assay Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 230000000447 dimerizing effect Effects 0.000 description 3
- 230000034431 double-strand break repair via homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 230000003938 response to stress Effects 0.000 description 3
- 239000002924 silencing RNA Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 3
- 239000005460 tetrahydrofolate Substances 0.000 description 3
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 3
- 230000009258 tissue cross reactivity Effects 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 description 2
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102210042925 HLA-A*02:01 Human genes 0.000 description 2
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 description 2
- 101001018097 Homo sapiens L-selectin Proteins 0.000 description 2
- 102100033467 L-selectin Human genes 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 2
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 2
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 102000006707 alpha-beta T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000025084 cell cycle arrest Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 2
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 2
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 2
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 2
- 102000054767 gene variant Human genes 0.000 description 2
- 230000008826 genomic mutation Effects 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 101710159080 Aconitate hydratase A Proteins 0.000 description 1
- 101710159078 Aconitate hydratase B Proteins 0.000 description 1
- 201000005943 Barth syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108010001572 Basic-Leucine Zipper Transcription Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000000806 Basic-Leucine Zipper Transcription Factors Human genes 0.000 description 1
- 101100180402 Caenorhabditis elegans jun-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 102100026550 Caspase-9 Human genes 0.000 description 1
- 108090000566 Caspase-9 Proteins 0.000 description 1
- 229940123587 Cell cycle inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108091007741 Chimeric antigen receptor T cells Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 101150097493 D gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 206010013801 Duchenne Muscular Dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000020897 Formins Human genes 0.000 description 1
- 108091022623 Formins Proteins 0.000 description 1
- 230000010337 G2 phase Effects 0.000 description 1
- 230000010558 Gene Alterations Effects 0.000 description 1
- 229940122498 Gene expression inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 1
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101100446641 Homo sapiens FKBP1A gene Proteins 0.000 description 1
- 101000588067 Homo sapiens Metaxin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 description 1
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 101001050288 Homo sapiens Transcription factor Jun Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 101150008942 J gene Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000044126 RNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 101710105008 RNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 210000000662 T-lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- 108091005735 TGF-beta receptors Proteins 0.000 description 1
- 108091028113 Trans-activating crRNA Proteins 0.000 description 1
- 102000016715 Transforming Growth Factor beta Receptors Human genes 0.000 description 1
- 101150117115 V gene Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 208000005980 beta thalassemia Diseases 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- KQNZDYYTLMIZCT-KQPMLPITSA-N brefeldin A Chemical compound O[C@@H]1\C=C\C(=O)O[C@@H](C)CCC\C=C\[C@@H]2C[C@H](O)C[C@H]21 KQNZDYYTLMIZCT-KQPMLPITSA-N 0.000 description 1
- JUMGSHROWPPKFX-UHFFFAOYSA-N brefeldin-A Natural products CC1CCCC=CC2(C)CC(O)CC2(C)C(O)C=CC(=O)O1 JUMGSHROWPPKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150058049 car gene Proteins 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 238000010293 colony formation assay Methods 0.000 description 1
- 210000001608 connective tissue cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 1
- GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N dTMP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- OZRNSSUDZOLUSN-LBPRGKRZSA-N dihydrofolic acid Chemical compound N=1C=2C(=O)NC(N)=NC=2NCC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OZRNSSUDZOLUSN-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 229940014144 folate Drugs 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 238000010445 genetic perturbation technique Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000003966 growth inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000002064 heart cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000055209 human FKBP1A Human genes 0.000 description 1
- 102000047278 human FOS Human genes 0.000 description 1
- 102000047546 human JUN Human genes 0.000 description 1
- 102000051868 human MTX1 Human genes 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000010212 intracellular staining Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N ionomycin Natural products O1C(CC(O)C(C)C(O)C(C)C=CCC(C)CC(C)C(O)=CC(=O)C(C)CC(C)CC(CCC(O)=O)C)CCC1(C)C1OC(C)(C(C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N ionomycin Chemical compound O1[C@H](C[C@H](O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)/C=C/C[C@@H](C)C[C@@H](C)C(/O)=C/C(=O)[C@@H](C)C[C@@H](C)C[C@@H](CCC(O)=O)C)CC[C@@]1(C)[C@@H]1O[C@](C)([C@@H](C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000007721 medicinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000116 mitigating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000007524 negative regulation of DNA replication Effects 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005868 ontogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000004789 organ system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000007859 posttranscriptional regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 238000001498 protein fragment complementation assay Methods 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000016434 protein splicing Effects 0.000 description 1
- 230000018883 protein targeting Effects 0.000 description 1
- 239000002213 purine nucleotide Substances 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000754 repressing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 230000009752 translational inhibition Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0026—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5)
- C12N9/0028—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with NAD or NADP as acceptor (1.5.1)
- C12N9/003—Dihydrofolate reductase [DHFR] (1.5.1.3)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
- C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y105/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH group of donors (1.5)
- C12Y105/01—Oxidoreductases acting on the CH-NH group of donors (1.5) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.5.1)
- C12Y105/01003—Dihydrofolate reductase (1.5.1.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Virology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
유전적으로 조작된 세포의 선택을 위한 방법에 관한 다양한 실시양태가 본원에 개시된다. 일부 실시양태는 본원에 개시된 방법으로 생산되는 세포에 관한 것이다.
Description
임의의 우선권 출원에 대한 참조에 의한 포함
해외 또는 국내 우선권 주장이 본 출원과 함께 제출된 출원 데이터 시트에서 확인되는 임의의 및 모든 출원은 37 CFR 1.57 하에 본원에 참고로 포함된다. 본 출원은 그 전체가 본원에 참고로 포함되는, 2020년 8월 7일자로 제출된 미국 가특허 출원 제63/062854호, 2021년 1월 8일자로 제출된 제63/135460호, 2021년 4월 2일자로 제출된 제63/170269호, 및 2021년 7월 14일자로 제출된 제63/221808호에 대한 우선권을 주장한다.
서열 목록에 대한 참조
본 출원은 전자적 포맷의 서열 목록과 함께 제출되고 있다. 서열 목록은 2021년 8월 4일자로 생성되고, 크기가 70,430 바이트인, SEQUENCE_LISTING_NTBV024WO.txt로 명명된 파일로서 제공된다. 서열 목록의 전자적 포맷 내의 정보는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
배경
발명의 분야
본 발명은 세포 요법 및/또는 유전자 요법 분야 내에 있다. 일부 실시양태는 또한 세포 또는 유전자 조작 분야 내에 있다.
관련 업계의 설명
세포 요법은 예를 들어, 면역요법의 과정에서 세포-매개된 면역력을 통해 암 세포와 싸울 수 있는 T-세포를 이식하거나, 줄기 세포를 접목하여, 질환에 걸린 조직을 재생함으로써 의약 효과를 발효시키기 위해 환자 내로 가변 세포가 주사되거나, 접목되거나, 이식되는 요법이다.
요약
본원에 기재된 일부 실시양태는 유전적으로 조작된 세포의 선택을 위한 방법에 관한 것이다. 방법은 i) 세포에서 발현을 위해 작동가능한 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열을 세포 내로 도입하되, 세포는, 세포가 정상 세포 배양 배지에서 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 억제되는 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질을 갖고, 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열이 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제2-부분 뉴클레오티드 서열이 관심 단백질(예를 들어, 세포에 대해 외인성인 단백질)을 코딩하는 것인, 단계; 및 ii) 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현하는 세포의 선택을 위해 정상 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
본원에 기재된 일부 실시양태는 유전적으로 조작된 세포의 선택을 위한 방법에 관한 것이다. 방법은 i) 세포에서 발현을 위해 작동가능한 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열을 도입하되, 세포는, 세포가 선택된 배양 조건 하에 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 억제되는 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질을 갖고, 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열이 생존 및/또는 증식을 허용하는 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제2-부분 뉴클레오티드 서열이 세포에 대해 외인성인 단백질을 코딩하는 것인, 단계; 및 ii) 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현하는 세포의 풍부화를 허용하는 시험관내(in vitro) 증식 조건 하에 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
본원에 기재된 일부 실시양태는 유전적으로 조작된 세포의 풍부화를 위한 방법에 관한 것이다. 방법은 i) 세포가 정상 시험관내 증식 조건 하에 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 세포의 생존 및/또는 증식을 위해 필수적인 적어도 제1 단백질의 활성을 감소시키는 단계; ii) 세포에서 발현을 위해 작동가능하고 제1 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 제2 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 2-부분 뉴클레오티드 서열을 도입하되, 제2-부분 단백질이 세포에 대해 외인성인 것인, 단계; 및 iii) 제1 단백질 및 제2 단백질 둘 다를 발현하는 세포의 풍부화를 위한 정상 시험관내 증식 조건 하에 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
본원에 기재된 일부 실시양태는 i) 세포가 정상 세포 배양 배지에서 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 억제되는 내인성 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 및 ii) DHFR을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 신생항원 T-세포 수용체 복합체를 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포에 관한 것이다.
본원에 기재된 일부 실시양태는 유전적으로 조작된 세포의 풍부화를 위한 방법에 관한 것이다. 방법은 i) 세포에서 발현을 위해 작동가능하고 선택적 압력에 대한 저항성을 세포에 제공하는 제1 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 제2 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 2-부분 뉴클레오티드 서열을 도입하되, 제2-부분 단백질이 세포에 대해 외인성인, 단계, 및 ii) 제1 단백질 및 제2 단백질 둘 다를 발현하는 세포의 풍부화를 야기하는 적어도 하나의 보충제를 함유하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
본원에 기재된 일부 실시양태는 유전적으로 조작된 T 세포의 풍부화를 위한 방법에 관한 것이다. 방법은 i) 메토트렉세이트-저항성 DHFR 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 TRA 또는 TRB 프로모터의 후속의 2-부분 뉴클레오티드 서열의 통합에 의해 T 세포에서 T-세포 수용체 복합체 또는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 2-부분 뉴클레오티드 서열을 도입하는 단계, 및 ii) 제1 단백질 및 제2 단백질 둘 다를 발현하는 세포의 풍부화를 야기하는 메토트렉세이트를 함유하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
본원에 기재된 일부 실시양태는 외인성 T 세포 수용체 유전자를 발현하도록 조작된 T 세포의 풍부화를 위한 방법에 관한 것이다. 방법은 i) 제1 CRISPR/Cas9 RNP를 사용하여 내인성 TRBC 유전자를 이의 유전자좌로부터 녹-아웃(knock-out)시키는 단계; ii) 제2 CRISPR/Cas9 RNP를 사용하여, 메토트렉세이트-저항성 DHFR 유전자를 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 치료 TCR 유전자를 포함하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 내인성 TRBC 유전자좌 내로 녹-인시키되, 양측 뉴클레오티드 서열이 작동가능하게 연결되어, 내인성 TRBC 프로모터로부터의 발현을 허용하는 것인, 단계; 및 iii) 치료 TCR 및 메토트렉세이트-저항성 DHFR 유전자 둘 다를 발현하는 T 세포의 풍부화를 야기하는 메토트렉세이트를 함유하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
본원에 기재된 일부 실시양태는 i) 세포가 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 메토트렉세이트의 존재에 의해 억제되는 내인성 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 및 ii) 메토트렉세이트-저항성 DHFR 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 내인성 TRA 또는 TRB 프로모터로부터 작동가능하게 발현되는 T-세포 수용체를 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는, T 세포에 관한 것이다.
본원에 기재된 일부 실시양태는 i) 세포가 성장하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 메토트렉세이트의 존재에 의해 억제되는 내인성 DHFR, 및 ii) 제1 결합 도메인에 융합된 메토트렉세이트-저항성 DHFR 단백질의 비-기능적 부분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 뉴클레오티드 및 제2 결합 도메인에 융합된 메토트렉세이트-저항성 DHFR 단백질의 비-기능적 부분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 뉴클레오티드를 포함하여, 양측 뉴클레오티드가 발현될 때, 기능적 메토트렉세이트-저항성 DHFR이 존재하고 제1 및 제2 뉴클레오티드 둘 다를 함유하는 세포의 선택을 가능하게 할 수 있는, 적어도 2 개 뉴클레오티드 서열을 포함하는, T 세포, 또는 외인성 유전자를 발현하도록 조작된 T 세포의 풍부화를 위한 방법에 관한 것이다. 뉴클레오티드 서열 중 임의의 것은 제1 부분이 결합 도메인에 융합된 메토트렉세이트-저항성 DHFR 단백질의 비-기능적 부분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 제2 부분이 외인성 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하도록 2 이상의 부분을 함유할 수 있다. 이들 실시양태에 따른 선택의 특정 방법에 대해, T 세포는 그 다음에 적어도 2 개 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포의 풍부화를 야기하는 메토트렉세이트를 함유하는 세포 배양 배지에서 배양된다.
본원에 기재된 일부 실시양태는 DHFR 단백질이 다중 비-기능적 부분으로 분열되기 위한 기능을 회복하기 위한 결합 도메인에 관한 것이다. 결합 도메인은 DHFR 단백질의 상보성 비-기능적 부분에 융합될 때, DHFR 단백질 기능을 회복할 수 있다. 결합 도메인은 천연 결합 도메인, 천연 단백질과 상호작용하지 않는 조작된 결합 도메인, 또는 유도성 결합 도메인일 수 있다.
또한, 본원은 유전적으로 조작된 세포의 선택을 위한 방법을 개시한다. 일부 실시양태에서, 방법은 세포에서 발현을 위해 작동가능한 적어도 2 개, 2-부분 뉴클레오티드 서열을 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는, 세포가 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 억제되는 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질을 갖는다. 일부 실시양태에서, 제1 2-부분 뉴클레오티드 서열은 제1 결합 도메인에 융합된 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 비-기능적 부분을 포함하는 제1 융합 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 2-부분 뉴클레오티드 서열은 제2 결합 도메인에 융합된 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 비-기능적 부분을 포함하는 제2 융합 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 융합 단백질 둘 다가 세포에서 함께 발현될 때, 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 기능은 회복된다. 일부 실시양태에서, 방법은 제1 및 제2 2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현하는 세포의 선택을 야기하는 조건 하에 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 필수 단백질은 DHFR 단백질이다. 일부 실시양태에서, 제1 또는 제2 2-부분 뉴클레오티드 서열의 제2-부분 뉴클레오티드 서열은 세포에 대해 외인성이다. 일부 실시양태에서, 제1 또는 제2 2-부분 뉴클레오티드 서열의 제2-부분 뉴클레오티드 서열은 TCR이다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 결합 도메인은 GCN4로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 결합 도메인은 FKBP12로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, FKBP12는 F36V 돌연변이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 JUN으로부터 유래되고 제2 결합 도메인은 FOS로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인은 서로에 대한 결합을 보존하는 상보성 돌연변이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인은 천연 결합 파트너에 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인 각각은 3 내지 7 개 상보성 돌연변이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인은 각각 3 개 상보성 돌연변이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인은 각각 4 개 상보성 돌연변이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 필수 단백질의 기능의 회복은 선택적으로 AP1903에 의해 유도된다. 일부 실시양태에서, 배양 단계는 메토트렉세이트의 존재 하에 수행된다.
또한, 본원은 유전적으로 조작된 세포의 풍부화를 위한 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 세포가 정상 시험관내 증식 조건 하에 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 세포의 생존 및/또는 증식을 위해 필수적인 적어도 제1 단백질의 활성을 감소시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 세포에서 발현을 위해 작동가능한 적어도 2 개의 2-부분 뉴클레오티드 서열을 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 2-부분 뉴클레오티드 서열은 제1 결합 도메인에 융합된 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 비-기능적 부분을 포함하는 제1 융합 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 2-부분 뉴클레오티드 서열은 제2 결합 도메인에 융합된 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 비-기능적 부분을 포함하는 제2 융합 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 융합 단백질 둘 다가 세포에서 함께 발현될 때, 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 기능은 회복된다. 일부 실시양태에서, 방법은 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질 둘 다를 발현하는 세포의 풍부화를 야기하는 시험관내 증식 조건 하에 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 필수 단백질은 DHFR 단백질이다. 일부 실시양태에서, 제1 또는 제2 2-부분 뉴클레오티드 서열의 제2-부분 뉴클레오티드 서열은 세포에 대해 외인성이다. 일부 실시양태에서, 제1 또는 제2 2-부분 뉴클레오티드 서열의 제2-부분 뉴클레오티드 서열은 TCR이다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 결합 도메인은 GCN4로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 결합 도메인은 FKBP12로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, FKBP12는 F36V 돌연변이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 JUN으로부터 유래되고 제2 결합 도메인은 FOS로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인은 서로에 대한 결합을 보존하는 상보성 돌연변이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인은 천연 결합 파트너에 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인 각각은 3 내지 7 개 상보성 돌연변이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인은 각각 3 개 상보성 돌연변이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인은 각각 4 개 상보성 돌연변이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 필수 단백질의 기능의 회복은 선택적으로 AP1903에 의해 유도된다. 일부 실시양태에서, 배양 단계는 메토트렉세이트의 존재 하에 수행된다.
본원에 제공된 일부 실시양태는 유전적으로 조작된 세포의 선택 또는 풍부화를 위한 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 세포에서 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현할 수 있는 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열을 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 세포는, 세포가 정상 세포 배양 배지에서 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 감소되는 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질을 갖는다. 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열은 세포에서 발현을 위해 작동가능하거나 표적 게놈에서 사전-결정된 부위 내로 삽입될 때 발현을 위해 작동가능해지고, 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열은 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 또는 이의 변이체, 및 발현될 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 제2-부분 뉴클레오티드 서열은 관심 단백질을 코딩한다. 방법은 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현하는 세포의 선택 또는 풍부화를 위한 약리학적 외인성 선택 압력 없이 정상 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 세포가 정상 시험관내 증식 조건 하에 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 세포의 생존 및/또는 증식을 위해 필수적인 적어도 제1 단백질의 수준을 감소시키는 단계, 세포에서 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현할 수 있고 제1 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 또는 이의 변이체, 및 발현될 제2 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 2-부분 뉴클레오티드 서열을 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열은 세포에서 발현을 위해 작동가능하거나 표적 게놈에서 사전-결정된 부위 내로 삽입될 때 발현을 위해 작동가능해진다. 제2-부분 단백질은 관심 단백질이다. 방법은 제1 단백질 및 제2 단백질 둘 다를 발현하는 세포의 풍부화를 위한 약리학적 외인성 선택 압력 없이 정상 시험관내 증식 조건 하에 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 세포에서 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현할 수 있는 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열을 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 세포는, 세포가 정상 세포 배양 배지에서 생존하고/하거나 증식할 수 없도록 감소되는 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 기능적 활성을 갖는다. 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열은 세포에서 발현을 위해 작동가능하거나 표적 게놈에서 사전-결정된 부위 내로 삽입될 때 발현을 위해 작동가능해진다. 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열은 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질과 실질적으로 동등한 기능을 제공하는 제1 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 제2 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 제2 단백질은 관심 단백질이다. 방법은 제1 단백질 및 제2 단백질 둘 다를 발현하는 세포의 풍부화 또는 선택을 야기하는 적어도 하나의 보충제를 함유하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 세포가 정상 시험관내 증식 조건 하에 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 세포의 생존 및/또는 증식을 위해 필수적인 적어도 제1 단백질의 기능적 활성을 감소시키는 단계; 세포에서 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현할 수 있고 실질적으로 동등한 기능을 제공하는 제1 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 제2 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 2-부분 뉴클레오티드 서열을 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열은 세포에서 발현을 위해 작동가능하거나 표적 게놈에서 사전-결정된 부위 내로 삽입될 때 발현을 위해 작동가능해지고, 제2 단백질은 관심 단백질이다. 방법은 제1 단백질 및 제2 단백질 둘 다를 발현하는 세포의 선택 또는 풍부화를 야기하는 적어도 하나의 보충제를 함유하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 세포에서 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현할 수 있는 적어도 2 개의 2-부분 뉴클레오티드 서열을 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 세포는, 세포가 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 억제되는 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질을 갖는다. 제1 2-부분 뉴클레오티드 서열은 제1 결합 도메인에 융합된 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 비-기능적 부분을 포함하는 제1 융합 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 관심 제1 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 제2 2-부분 뉴클레오티드 서열은 제2 결합 도메인에 융합된 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 비-기능적 부분을 포함하는 제2 융합 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 관심 제2 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 제1 및 제2 융합 단백질 둘 다가 세포에서 함께 발현될 때, 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 기능은 회복된다. 방법은 제1 및 제2 2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현하는 세포의 선택을 야기하는 조건 하에 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 세포가 정상 시험관내 증식 조건 하에 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 세포의 생존 및/또는 증식을 위해 필수적인 적어도 제1 단백질을 억제하는 단계, 및 세포에서 발현될 수 있는 적어도 2 개의 2-부분 뉴클레오티드 서열을 도입하는 단계를 포함한다. 제1 2-부분 뉴클레오티드 서열은 제1 결합 도메인에 융합된 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 비-기능적 부분을 포함하는 제1 융합 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 관심 제1 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 제2 2-부분 뉴클레오티드 서열은 제2 결합 도메인에 융합된 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 비-기능적 부분을 포함하는 제2 융합 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 관심 제2 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 제1 및 제2 융합 단백질 둘 다가 세포에서 함께 발현될 때, 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 기능은 회복된다. 방법은 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질 둘 다를 발현하는 세포의 풍부화를 야기하는 시험관내 증식 조건 하에 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 세포에서 발현을 위해 작동가능한 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열을 도입하는 단계를 포함한다. 세포는, 세포가 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 억제되는 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질을 갖고, 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열은 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 제2-부분 뉴클레오티드 서열은 세포에 대해 외인성인 단백질을 코딩한다. 방법은 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현하는 세포의 선택을 야기하는 조건 하에 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 세포가 정상 시험관내 증식 조건 하에 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 세포의 생존 및/또는 증식을 위해 필수적인 적어도 제1 단백질의 활성을 감소시키는 단계, 세포에서 발현을 위해 작동가능하고 제1 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 제2 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 2-부분 뉴클레오티드 서열을 도입하는 단계를 포함한다. 제2-부분 단백질은 세포에 대해 외인성이고, 제1 단백질 및 제2 단백질 둘 다를 발현하는 세포의 풍부화를 야기하는 시험관내 증식 조건 하에 세포를 배양하는 단계.
또한, 본원은 본 발명의 방법 중 임의의 것에 따라 제조되는 세포를 개시한다.
또한, 본원은 유전적으로 조작된 T 세포의 풍부화를 위한 방법을 개시한다. 일부 실시양태에서, 방법은 메토트렉세이트-저항성 DHFR 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 TRA 또는 TRB 프로모터의 후속의 2-부분 뉴클레오티드 서열의 통합에 의해 T 세포에서 T-세포 수용체 복합체 또는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 2-부분 뉴클레오티드 서열을 도입하는 단계, 및 제1 단백질 및 제2 단백질 둘 다를 발현하는 세포의 풍부화를 야기하는 메토트렉세이트를 함유하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
또한, 본원은 외인성 T 세포 수용체 유전자를 발현하도록 조작된 T 세포의 풍부화를 위한 방법을 개시한다. 일부 실시양태에서, 방법은 제1 CRISPR/Cas9 RNP를 사용하여 내인성 TRBC 유전자를 이의 유전자좌로부터 녹-아웃시키는 단계, 제2 CRISPR/Cas9 RNP를 사용하여, 메토트렉세이트-저항성 DHFR 유전자를 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 치료 TCR 유전자를 포함하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 내인성 TRBC 유전자좌 내로 녹-인시키되, 양측 뉴클레오티드 서열이 작동가능하게 연결되어, 내인성 TRBC 프로모터로부터의 발현을 허용하는 것인, 단계, 및 치료 TCR 및 메토트렉세이트-저항성 DHFR 유전자 둘 다를 발현하는 T 세포의 풍부화를 야기하는 메토트렉세이트를 함유하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
또한, 본원은 T 세포를 개시한다. 일부 실시양태에서, T 세포는 세포가 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 메토트렉세이트의 존재에 의해 억제되는 내인성 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 및 메토트렉세이트-저항성 DHFR 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 내인성 TRA 또는 TRB 프로모터로부터 작동가능하게 발현되는 T-세포 수용체를 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, T 세포는 내인성 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)의 녹-아웃, 및 DHFR 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 또는 이의 변이체, 및 내인성 TRA 또는 TRB 프로모터로부터 작동가능하게 발현되는 T-세포 수용체를 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, T 세포는 세포가 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 메토트렉세이트의 존재에 의해 억제되는 내인성 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 및 적어도 2 개의 2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 제1 2-부분 뉴클레오티드 서열은 DHFR 단백질의 비-기능적 또는 기능장애 부분을 코딩하는 제1 제1-부분 뉴클레오티드 서열 또는 이의 변이체, 및 내인성 TRA 또는 TRB 프로모터로부터 작동가능하게 발현되는 T-세포 수용체를 코딩하는 제1 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 제2 2-부분 뉴클레오티드 서열은 DHFR 단백질의 비-기능적 또는 기능장애 부분을 코딩하는 제2 제1-부분 뉴클레오티드 서열 또는 이의 변이체, 및 내인성 B2M 프로모터로부터 작동가능하게 발현되는 관심 단백질을 코딩하는 제2 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 세포는 DHFR 활성을 갖는다.
본 발명의 이들 및 다른 특징, 양태, 및 이점은 다음 설명 및 첨부된 청구항을 참고하여 양호하게 이해될 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 DFHR 관련된 경로를 포함하는 일부 실시양태를 나타낸다.
도 2는 일부 실시양태의 유전자 구축물을 나타낸다.
도 3은 2 개 공여체로부터의 인간 T 세포에서 sgRNA sgDHFR-1의 녹아웃 효율을 결정하기 위한 TIDE(분해에 의한 인델의 추적(Tracking of Indels by Decomposition))분석의 결과를 도시한다(각각 BC23 및 BC26에 대해 75% 및 18%).
도 4는 2 개 공여체로부터의 인간 T 세포에서 sgRNA sgDHFR-2의 녹아웃 효율을 결정하기 위한 TIDE 분석의 결과를 도시한다(각각 BC23 및 BC26에 대해 34% 및 75%).
도 5는 전기천공 후 6 일차에 2 개 공여체로부터의 T 세포에서 NY-ESO-1 1G4 TCR 녹인(knockin) 효율을 확인하기 위한 FACS 분석의 결과를 도시한다.
도 6은 전기천공 후 10 일차에 2 개 공여체로부터의 T 세포에서 NY-ESO-1 1G4 TCR 녹인 효율을 확인하기 위한 FACS 분석의 결과를 도시한다.
도 7은 TCR 발현 수준이 1G4-TCR KI(녹인) T 세포와 1G4-TCR-DHFR KI + DHFR KO T 세포 사이에 유사하다는 것을 나타내는 좌측 패널을 제공하고; 우측 패널은 TCR 녹인 세포의 총 수가 전기천공 후 12 일차에 양측 공여체 T 세포에서 1G4-TCR 녹인과 1G4-TCR-DHFR KI + DHFR KO T 세포 사이에 유사하다는 것을 나타낸다.
도 8은 전기천공 후 5 일차에 4 개 공여체(BC29, BC30, BC31, 및 BC32)로부터의 T 세포에서 NY-ESO-1 1G4 TCR 녹인 효율을 확인하기 위한 FACS 분석의 결과를 도시한다.
도 9는 도 8의 정량화 데이터를 제공한다.
도 10은 TCR 발현 수준이 1G4-TCR KI와 1G4-TCR-DHFR KI + DHFR KO 세포 사이에 유사하다는 것을 나타내는 좌측 패널을 제공하고; 우측 패널은 1G4-TCR 녹인 조건에 대한 TCR 녹인 세포의 총 수가 4 개 공여체 T 세포에서 1G4-DHFR-KI T 세포 또는 1G4-TCR-DHFR KI + DHFR KO T 세포와 비교하여 높다는 것을 나타낸다.
도 11은 DHFR 발현을 결정하기 위해 MTX-플루오레세인 표지를 사용한 결과를 제공한다.
도 12 좌측 패널은 DHFR을 표적화하는 효율적 안내 RNA를 스크리닝하기 위한 도 11에 기재된 방법을 나타내고; 우측 패널은 DHFR을 표적화하는 효율적 siRNA를 스크리닝하기 위한 도 11에 기재된 방법의 사용을 나타낸다.
도 13a는 대조군 수선 주형 1G4 KI의 녹인을 갖는 T 세포를 나타내는 FACS 플롯이고, 도 13b는 수선 주형 1G4-DHFRm KI의 녹인을 갖는 T 세포를 나타내는 FACS 플롯이고, 도 13c는 3 개 공여체(BC37, BC38, 및 BC39) 및 2 개 기술적 복제물을 이용한 도 13a 및 도 13b의 정량화를 나타내는 막대 차트이다.
도 14는 도 13에 기재된 2 개 녹인 조건의 T 세포 증식을 나타내는 막대 플롯이다.
도 15는 항-CD4 항체를 이용한 염색에 의한 도 13에 기재된 2 개 녹인 조건에서 CD4+ 세포의 비율의 FACS 분석을 나타낸다.
도 16은 항-CD45RA 및 항-CD62L 항체를 이용한 염색에 의한 TCR 녹인 세포의 표현형의 FACS 분석을 나타낸다.
도 17은 항-CD27 및 항-CD28 항체를 이용한 염색에 의한 TCR 녹인 세포의 표현형의 FACS 분석을 나타낸다.
도 18은 종양 세포(공여체 BC37)와의 공동-배양에 의한 T 세포의 세포용해 용량을 결정하기 위한 집락 형성 분석을 나타낸다.
도 19는 2 개 추가 공여체(BC38 및 BC39)로부터 유래된 T 세포를 이용한 종양-T 세포 공동-배양 분석을 나타낸다.
도 20은 종양 세포로 자극될 때, T 세포의 IFNγ 생산 용량을 나타내는 막대 플롯이다.
도 21은 종양 세포로 자극될 때, T 세포의 IFNγ 발현 수준(평균 형광 강도, MFI에 의해 결정됨)을 나타내는 막대 플롯이다.
도 22는 종양 세포로 자극될 때, T 세포의 IL2 생산 용량을 나타내는 막대 플롯이다. 좌측 패널: IL2-생산 세포의 비율. 우측 패널: IL2-생산 세포의 발현 수준.
도 23은 종양 세포로 자극될 때, T 세포 증식 용량을 나타내는 히스토그램이다.
도 24는 내인성 프로모터, 내인성 스플라이스 부위, 및 내인성 종결 신호로부터의 발현을 가능하기 하기 위한 유전자좌 내로의 인-프레임 엑손 통합의 다이어그램이다.
도 25는 내인성 프로모터, 내인성 스플라이스 부위, 및 외인성 종결 신호로부터의 발현을 가능하기 하기 위한 유전자좌 내로의 인-프레임 엑손 통합의 다이어그램이다.
도 26은 내인성 프로모터, 외인성 스플라이스 수용체 부위, 및 외인성 종결 신호로부터의 발현을 가능하게 하기 위한 유전자좌 내로의 인트론 통합의 다이어그램이다.
도 27a는 필수 유전자의 녹 아웃의 다이어그램을 나타낸다. 도 27b는 변경된 필수 단백질 및 제2 단백질을 코딩하는 2-부분 뉴클레오티드 서열을 녹 인하는 다이어그램을 나타낸다.
도 28은 BC45 및 BC46 이중 형질도입의 FACS 결과를 나타낸다.
도 29는 BC 45 세포의 MTX 선택의 결과를 나타낸다.
도 30은 BC 46 세포의 MTX 선택의 결과를 나타낸다.
도 31은 높은 MTX 농도에서 BC 45 세포 선택의 결과를 나타낸다.
도 32는 높은 MTX 농도에서 BC 46 세포 선택의 결과를 나타낸다.
도 33은 유전적으로 조작된 세포에 대한 선택 방법의 일부 실시양태를 나타낸다.
도 34는 인간 DHFR 야생형 단백질 서열인 서열번호 1의 서열을 나타낸다.
도 35는 인간 MTX-저항성 DHFR 돌연변이체 단백질 서열인 서열번호 2의 서열을 나타낸다.
도 36은 야생형 인간 DHFR을 코딩하는 DNA 서열인 서열번호 3의 서열을 나타낸다.
도 37은 야생형 인간 DHFR을 코딩하는 코돈-최적화 및 뉴클레아제-저항성 DNA 서열인 서열번호 4의 서열을 나타낸다.
도 38은 MTX-저항성 인간 DHFR 돌연변이체를 코딩하는 코돈-최적화된 DNA 서열인 서열번호 5의 서열을 나타낸다.
도 39는 TCR의 부위-특이적 통합에 대한 개략도를 나타낸다.
도 40은 선택의 부재 하에 TCR을 이용한 T 세포의 편집에 관한 샘플 데이터를 나타낸다.
도 41은 mDHFR-MTX 선택 전략의 실시양태의 개략도를 나타낸다.
도 42는 mDHFR-MTX 선택 전략의 실시양태의 사용이 있거나 없는 TCR-편집된 T 세포의 요약 비교를 나타낸다.
도 43a-43b는 메토트렉세이트의 2 일 후 JunMUT3AA-FosMUT3AA 기반 분열-DHFR 선택에 대한 FACS 결과를 나타낸다.
도 44a-44d는 메토트렉세이트의 10 일 후 JunMUT3AA-FosMUT3AA 및 JunMUT4AA-FosMUT4AA 기반 분열-DHFR 선택에 대한 FACS 결과를 나타낸다.
도 45a-45b는 메토트렉세이트의 8 일 후 FKBP12F36V 기반 분열-DHFR 선택에 대한 FACS 결과를 나타낸다.
도 46a-46b는 메토트렉세이트의 6 일 후 FKBP12F36V 기반 분열-DHFR 선택 및 JunMUT4AA-FosMUT4AA 기반 분열-DHFR 선택을 비교한 FACS 결과를 나타낸다.
도 47a는 4 일 동안 처치가 없거나 100 nM 메토트렉세이트 처치 후 JunMUT3AA-FosMUT3AA 및 Jun-Fos 기반 CD90.2 및 Ly-6G 선택을 비교한 FACS 결과를 나타낸다.
도 47b는 4 일 동안 처치가 없거나 100 nM 메토트렉세이트 처치 후 Jun-FosMUT3AA 및 JunMUT3AA-Fos 기반 CD90.2 및 Ly-6G 선택을 비교한 FACS 결과를 나타낸다.
도 48은 벡터 쌍 JUNWT-mDHFR_A + FOSWT-mDHFR_B, JUNMUT3AA-mDHFR_A + FOSMUT3AA-mDHFR_B, JUNWT-mDHFR_A + FOSMUT3AA-mDHFR_B, 또는 JUNMUT3AA-mDHFR_A + FOSWT-mDHFR_B를 이용한 감염 후 공여체 A 및 공여체 B에서 조작된 T 세포의 배수-풍부화를 나타내는 막대 차트이다.
도 49는 벡터 쌍 JUNWT-mDHFR_A + FOSWT-mDHFR_B, JUNMUT3AA-mDHFR_A + FOSMUT3AA-mDHFR_B, JUNWT-mDHFR_A + FOSMUT3AA-mDHFR_B, 또는 JUNMUT3AA-mDHFR_A + FOSWT-mDHFR_B를 이용한 감염 4 일 후, 6 일 동안 100 nM 메토트렉세이트 처치 후 공여체 A 및 공여체 B에서 조작된 T 세포의 배수-풍부화를 나타내는 막대 차트이다.
도 50은 벡터 쌍 JUNWT-mDHFR_A + FOSWT-mDHFR_B, JUNMUT4AA-mDHFR_A + FOSMUT4AA-mDHFR_B, JUNWT-mDHFR_A + FOSMUT4AA-mDHFR_B, 또는 JUNMUT4AA-mDHFR_A + FOSWT-mDHFR_B를 이용한 감염 4 일 후, 6 일 동안 100 nM 메토트렉세이트 처치 후 공여체 A 및 공여체 B에서 조작된 T 세포의 배수-풍부화를 나타내는 막대 차트이다.
도 51a 및 51b는 sJUN-mDHFR_A + sFOS-mDHFR_B 또는 쌍 sJUNMUT8AA-mDHFR_A + sFOSMUT8AA-mDHFR_B, sJUN-mDHFR_A + sFOSMUT8AA-mDHFR_B, 또는 sJUNMUT8AA-mDHFR_A + sFOS-mDHFR_B를 이용한 감염 4 일 후, 6 일 동안 처치가 없거나 100 nM 메토트렉세이트 처치 후 CD90.2 및 Ly-6G 선택을 사용한, 공여체 A 및 B로부터의 이중 조작된 T 세포의 FACS 결과를 나타낸다.
도 52는 도 51a-51b로부터의 FACS 플롯에 의해 생성된 바와 같은 조작된 T 세포의 배수 풍부화의 정량화를 나타내는 막대 차트이다.
도 53은 벡터 쌍 FKBP12F36V-mDHFR_A + FKBP12F36V-mDHFR_B를 이용한 감염, 처치가 없거나 10 nM AP1903의 4 시간, 및 100 nM 메토트렉세이트를 이용한 처치 6 일 후 공여체 A 및 공여체 B에서 조작된 T 세포의 배수-풍부화를 나타내는 막대 차트이다.
도 54는 B2M 유전자좌를 표적화하는 5 개 Cas9 RNP 중 하나로 처치된 인간 일차 T 세포에서 녹-아웃 세포의 비율을 나타내는 막대 차트이다.
도 1은 DFHR 관련된 경로를 포함하는 일부 실시양태를 나타낸다.
도 2는 일부 실시양태의 유전자 구축물을 나타낸다.
도 3은 2 개 공여체로부터의 인간 T 세포에서 sgRNA sgDHFR-1의 녹아웃 효율을 결정하기 위한 TIDE(분해에 의한 인델의 추적(Tracking of Indels by Decomposition))분석의 결과를 도시한다(각각 BC23 및 BC26에 대해 75% 및 18%).
도 4는 2 개 공여체로부터의 인간 T 세포에서 sgRNA sgDHFR-2의 녹아웃 효율을 결정하기 위한 TIDE 분석의 결과를 도시한다(각각 BC23 및 BC26에 대해 34% 및 75%).
도 5는 전기천공 후 6 일차에 2 개 공여체로부터의 T 세포에서 NY-ESO-1 1G4 TCR 녹인(knockin) 효율을 확인하기 위한 FACS 분석의 결과를 도시한다.
도 6은 전기천공 후 10 일차에 2 개 공여체로부터의 T 세포에서 NY-ESO-1 1G4 TCR 녹인 효율을 확인하기 위한 FACS 분석의 결과를 도시한다.
도 7은 TCR 발현 수준이 1G4-TCR KI(녹인) T 세포와 1G4-TCR-DHFR KI + DHFR KO T 세포 사이에 유사하다는 것을 나타내는 좌측 패널을 제공하고; 우측 패널은 TCR 녹인 세포의 총 수가 전기천공 후 12 일차에 양측 공여체 T 세포에서 1G4-TCR 녹인과 1G4-TCR-DHFR KI + DHFR KO T 세포 사이에 유사하다는 것을 나타낸다.
도 8은 전기천공 후 5 일차에 4 개 공여체(BC29, BC30, BC31, 및 BC32)로부터의 T 세포에서 NY-ESO-1 1G4 TCR 녹인 효율을 확인하기 위한 FACS 분석의 결과를 도시한다.
도 9는 도 8의 정량화 데이터를 제공한다.
도 10은 TCR 발현 수준이 1G4-TCR KI와 1G4-TCR-DHFR KI + DHFR KO 세포 사이에 유사하다는 것을 나타내는 좌측 패널을 제공하고; 우측 패널은 1G4-TCR 녹인 조건에 대한 TCR 녹인 세포의 총 수가 4 개 공여체 T 세포에서 1G4-DHFR-KI T 세포 또는 1G4-TCR-DHFR KI + DHFR KO T 세포와 비교하여 높다는 것을 나타낸다.
도 11은 DHFR 발현을 결정하기 위해 MTX-플루오레세인 표지를 사용한 결과를 제공한다.
도 12 좌측 패널은 DHFR을 표적화하는 효율적 안내 RNA를 스크리닝하기 위한 도 11에 기재된 방법을 나타내고; 우측 패널은 DHFR을 표적화하는 효율적 siRNA를 스크리닝하기 위한 도 11에 기재된 방법의 사용을 나타낸다.
도 13a는 대조군 수선 주형 1G4 KI의 녹인을 갖는 T 세포를 나타내는 FACS 플롯이고, 도 13b는 수선 주형 1G4-DHFRm KI의 녹인을 갖는 T 세포를 나타내는 FACS 플롯이고, 도 13c는 3 개 공여체(BC37, BC38, 및 BC39) 및 2 개 기술적 복제물을 이용한 도 13a 및 도 13b의 정량화를 나타내는 막대 차트이다.
도 14는 도 13에 기재된 2 개 녹인 조건의 T 세포 증식을 나타내는 막대 플롯이다.
도 15는 항-CD4 항체를 이용한 염색에 의한 도 13에 기재된 2 개 녹인 조건에서 CD4+ 세포의 비율의 FACS 분석을 나타낸다.
도 16은 항-CD45RA 및 항-CD62L 항체를 이용한 염색에 의한 TCR 녹인 세포의 표현형의 FACS 분석을 나타낸다.
도 17은 항-CD27 및 항-CD28 항체를 이용한 염색에 의한 TCR 녹인 세포의 표현형의 FACS 분석을 나타낸다.
도 18은 종양 세포(공여체 BC37)와의 공동-배양에 의한 T 세포의 세포용해 용량을 결정하기 위한 집락 형성 분석을 나타낸다.
도 19는 2 개 추가 공여체(BC38 및 BC39)로부터 유래된 T 세포를 이용한 종양-T 세포 공동-배양 분석을 나타낸다.
도 20은 종양 세포로 자극될 때, T 세포의 IFNγ 생산 용량을 나타내는 막대 플롯이다.
도 21은 종양 세포로 자극될 때, T 세포의 IFNγ 발현 수준(평균 형광 강도, MFI에 의해 결정됨)을 나타내는 막대 플롯이다.
도 22는 종양 세포로 자극될 때, T 세포의 IL2 생산 용량을 나타내는 막대 플롯이다. 좌측 패널: IL2-생산 세포의 비율. 우측 패널: IL2-생산 세포의 발현 수준.
도 23은 종양 세포로 자극될 때, T 세포 증식 용량을 나타내는 히스토그램이다.
도 24는 내인성 프로모터, 내인성 스플라이스 부위, 및 내인성 종결 신호로부터의 발현을 가능하기 하기 위한 유전자좌 내로의 인-프레임 엑손 통합의 다이어그램이다.
도 25는 내인성 프로모터, 내인성 스플라이스 부위, 및 외인성 종결 신호로부터의 발현을 가능하기 하기 위한 유전자좌 내로의 인-프레임 엑손 통합의 다이어그램이다.
도 26은 내인성 프로모터, 외인성 스플라이스 수용체 부위, 및 외인성 종결 신호로부터의 발현을 가능하게 하기 위한 유전자좌 내로의 인트론 통합의 다이어그램이다.
도 27a는 필수 유전자의 녹 아웃의 다이어그램을 나타낸다. 도 27b는 변경된 필수 단백질 및 제2 단백질을 코딩하는 2-부분 뉴클레오티드 서열을 녹 인하는 다이어그램을 나타낸다.
도 28은 BC45 및 BC46 이중 형질도입의 FACS 결과를 나타낸다.
도 29는 BC 45 세포의 MTX 선택의 결과를 나타낸다.
도 30은 BC 46 세포의 MTX 선택의 결과를 나타낸다.
도 31은 높은 MTX 농도에서 BC 45 세포 선택의 결과를 나타낸다.
도 32는 높은 MTX 농도에서 BC 46 세포 선택의 결과를 나타낸다.
도 33은 유전적으로 조작된 세포에 대한 선택 방법의 일부 실시양태를 나타낸다.
도 34는 인간 DHFR 야생형 단백질 서열인 서열번호 1의 서열을 나타낸다.
도 35는 인간 MTX-저항성 DHFR 돌연변이체 단백질 서열인 서열번호 2의 서열을 나타낸다.
도 36은 야생형 인간 DHFR을 코딩하는 DNA 서열인 서열번호 3의 서열을 나타낸다.
도 37은 야생형 인간 DHFR을 코딩하는 코돈-최적화 및 뉴클레아제-저항성 DNA 서열인 서열번호 4의 서열을 나타낸다.
도 38은 MTX-저항성 인간 DHFR 돌연변이체를 코딩하는 코돈-최적화된 DNA 서열인 서열번호 5의 서열을 나타낸다.
도 39는 TCR의 부위-특이적 통합에 대한 개략도를 나타낸다.
도 40은 선택의 부재 하에 TCR을 이용한 T 세포의 편집에 관한 샘플 데이터를 나타낸다.
도 41은 mDHFR-MTX 선택 전략의 실시양태의 개략도를 나타낸다.
도 42는 mDHFR-MTX 선택 전략의 실시양태의 사용이 있거나 없는 TCR-편집된 T 세포의 요약 비교를 나타낸다.
도 43a-43b는 메토트렉세이트의 2 일 후 JunMUT3AA-FosMUT3AA 기반 분열-DHFR 선택에 대한 FACS 결과를 나타낸다.
도 44a-44d는 메토트렉세이트의 10 일 후 JunMUT3AA-FosMUT3AA 및 JunMUT4AA-FosMUT4AA 기반 분열-DHFR 선택에 대한 FACS 결과를 나타낸다.
도 45a-45b는 메토트렉세이트의 8 일 후 FKBP12F36V 기반 분열-DHFR 선택에 대한 FACS 결과를 나타낸다.
도 46a-46b는 메토트렉세이트의 6 일 후 FKBP12F36V 기반 분열-DHFR 선택 및 JunMUT4AA-FosMUT4AA 기반 분열-DHFR 선택을 비교한 FACS 결과를 나타낸다.
도 47a는 4 일 동안 처치가 없거나 100 nM 메토트렉세이트 처치 후 JunMUT3AA-FosMUT3AA 및 Jun-Fos 기반 CD90.2 및 Ly-6G 선택을 비교한 FACS 결과를 나타낸다.
도 47b는 4 일 동안 처치가 없거나 100 nM 메토트렉세이트 처치 후 Jun-FosMUT3AA 및 JunMUT3AA-Fos 기반 CD90.2 및 Ly-6G 선택을 비교한 FACS 결과를 나타낸다.
도 48은 벡터 쌍 JUNWT-mDHFR_A + FOSWT-mDHFR_B, JUNMUT3AA-mDHFR_A + FOSMUT3AA-mDHFR_B, JUNWT-mDHFR_A + FOSMUT3AA-mDHFR_B, 또는 JUNMUT3AA-mDHFR_A + FOSWT-mDHFR_B를 이용한 감염 후 공여체 A 및 공여체 B에서 조작된 T 세포의 배수-풍부화를 나타내는 막대 차트이다.
도 49는 벡터 쌍 JUNWT-mDHFR_A + FOSWT-mDHFR_B, JUNMUT3AA-mDHFR_A + FOSMUT3AA-mDHFR_B, JUNWT-mDHFR_A + FOSMUT3AA-mDHFR_B, 또는 JUNMUT3AA-mDHFR_A + FOSWT-mDHFR_B를 이용한 감염 4 일 후, 6 일 동안 100 nM 메토트렉세이트 처치 후 공여체 A 및 공여체 B에서 조작된 T 세포의 배수-풍부화를 나타내는 막대 차트이다.
도 50은 벡터 쌍 JUNWT-mDHFR_A + FOSWT-mDHFR_B, JUNMUT4AA-mDHFR_A + FOSMUT4AA-mDHFR_B, JUNWT-mDHFR_A + FOSMUT4AA-mDHFR_B, 또는 JUNMUT4AA-mDHFR_A + FOSWT-mDHFR_B를 이용한 감염 4 일 후, 6 일 동안 100 nM 메토트렉세이트 처치 후 공여체 A 및 공여체 B에서 조작된 T 세포의 배수-풍부화를 나타내는 막대 차트이다.
도 51a 및 51b는 sJUN-mDHFR_A + sFOS-mDHFR_B 또는 쌍 sJUNMUT8AA-mDHFR_A + sFOSMUT8AA-mDHFR_B, sJUN-mDHFR_A + sFOSMUT8AA-mDHFR_B, 또는 sJUNMUT8AA-mDHFR_A + sFOS-mDHFR_B를 이용한 감염 4 일 후, 6 일 동안 처치가 없거나 100 nM 메토트렉세이트 처치 후 CD90.2 및 Ly-6G 선택을 사용한, 공여체 A 및 B로부터의 이중 조작된 T 세포의 FACS 결과를 나타낸다.
도 52는 도 51a-51b로부터의 FACS 플롯에 의해 생성된 바와 같은 조작된 T 세포의 배수 풍부화의 정량화를 나타내는 막대 차트이다.
도 53은 벡터 쌍 FKBP12F36V-mDHFR_A + FKBP12F36V-mDHFR_B를 이용한 감염, 처치가 없거나 10 nM AP1903의 4 시간, 및 100 nM 메토트렉세이트를 이용한 처치 6 일 후 공여체 A 및 공여체 B에서 조작된 T 세포의 배수-풍부화를 나타내는 막대 차트이다.
도 54는 B2M 유전자좌를 표적화하는 5 개 Cas9 RNP 중 하나로 처치된 인간 일차 T 세포에서 녹-아웃 세포의 비율을 나타내는 막대 차트이다.
상세한 설명
상기 요약 섹션 및 상세한 설명 섹션, 및 하기 청구항에서, 참조는 본 발명의 특정 특징에 대해 이루어진다. 본 명세서에서 발명의 개시내용은 이러한 특정 특징의 모든 가능한 조합을 포함한다는 것이 이해되어야 한다. 예를 들어, 특정 특징이 발명의 특정 양태 또는 실시양태, 또는 특정 청구항의 맥락에서 개시되는 경우, 상기 특징은 또한 가능한 정도로 발명의 다른 특정 양태 및 실시양태와 조합하고/하거나 이의 맥락에서, 일반적으로 발명에서 사용될 수 있다.
유전자 녹-인으로도 알려진 특정 게놈 부위에서 외인성 DNA 서열의 정확한 도입은 일반적으로 (1) 뉴클레아제에 의한 게놈 부위에서 DNA 이중-가닥 파괴의 도입, 및 (2) 상동성-지시된 수선(HDR) 경로에 의한 상동 수선 주형을 사용한 상기 DNA 파괴의 수선의 2 개 단계를 요구한다. 이 과정은 일반적으로 비효율적이며, 이는 HDR에 대해 요구되는 효소가 세포 주기의 S 및 G2 기 동안만 활성이기 때문이다. 즉, 유전자 녹-인은 분열 세포에 대해 크게 제한된다. 유전자 녹-인 과정의 전체 낮은 효율을 고려하면, 유전자-편집 절차를 성공적으로 겪은 세포를 선택하고 풍부화시킬 수 있는 접근법이 유용할 수 있다.
치료 유전자 구축물의 성공적 녹-인을 이용한 세포의 풍부화를 허용하기 위해, 선택적 압력은 주로 녹-인 이벤트를 갖는 세포가 생존할 수 있는 한편, 녹-인 이벤트가 없는 것이 사멸될 수 있는 것을 보장하기 위해 유용하다.
본원에 기재된 다양한 실시양태는 유전적으로 조작된 세포의 선택을 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법에서, 유전적으로 조작된 세포는 세포에 대해 외인성인(또한 예를 들어, 치료 목적을 위해 유도되는) 적어도 하나의 단백질 및 세포가 생존하고/하거나 증식하기 위해 필요하고 억제된 필수 단백질의 기능을 회복하는 다른 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열의 도입에 의해 선택된다.
세포가 생존하고/하거나 증식하기 위해 필요한 필수 단백질의 기능은 뉴클레아제 또는 단백질 억제제에 의해 억제될 수 있고; 억제는 영구적이거나 일시적일 수 있으며, 억제는 뉴클레오티드 수준 또는 단백질 수준에서 있을 수 있다.
세포가 생존하고/하거나 증식하기 위해 필요한 필수 단백질의 기능은 외인성 선택적 압력에 의해 억제될 수 있으며, 예를 들어 소분자 매개된 억제에 의해 유도될 수 있다.
필수 단백질은 2-부분 뉴클레오티드 서열에서 필수 단백질을 코딩함으로써 회복될 수 있다. 코딩된 필수 단백질은 이의 뉴클레오티드 서열이 뉴클레아제 저항성이거나 단백질이 단백질 억제제 저항성이도록 유전적으로 조작될 수 있다. 이와 같이, 필수 단백질의 성공적 재-도입을 갖는 세포는 야생형 세포에 대해 강한 생존 이점을 가질 것이며 시간에 따라 풍부화될 것이다.
필수 단백질은 하나의 연속 서열로서 도입되거나 별개 도메인으로 분열되어, 다중 외인성 단백질을 이용한 세포의 유전자 조작을 허용할 수 있다.
또한, 본원에 기재된 다양한 실시양태는 유전적으로 조작된 세포의 선택을 위해 본원에 기재된 방법을 사용하는 과정에서 생성되는 세포에 관한 것이다.
본원에 기재된 일부 실시양태는 유전적으로 조작된 세포의 선택을 위한 방법에 관한 것이다. 방법은 i) 세포에서 발현을 위해 작동가능한 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열을 도입하되, 세포는, 세포가 선택된 배양 조건 하에 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 억제되는 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질을 갖고, 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열이 생존 및/또는 증식을 허용하는 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제2-부분 뉴클레오티드 서열이 세포에 대해 외인성인 단백질을 코딩하는 것인, 단계; 및 ii) 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현하는 세포의 풍부화를 허용하는 시험관내 증식 조건 하에 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
본원에 기재된 일부 실시양태는 유전적으로 조작된 세포의 선택을 위한 방법에 관한 것이다. 방법은 i) 세포에서 필수 단백질을, 상기 세포가 정상 배양 배지에서 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 억제하는 단계; ii) 세포에서 발현을 위해 작동가능한 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열을 도입하되, 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열이 생존 및/또는 증식을 허용하는 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 단계; iii) 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현하는 세포의 풍부화를 허용하는 정상 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
본원에 기재된 일부 실시양태는 유전적으로 조작된 세포의 선택을 위한 방법에 관한 것이다. 방법은 i) 세포에서 필수 단백질을, 상기 세포가 적어도 하나의 화합물을 갖는 세포 배양 배지에서 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 억제하는 단계; ii) 게놈 유전자좌 내로의 표적화된 통합에 의해 세포 내로 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열을 도입하여, 세포-내인성 프로모터로부터 세포에서 작동가능한 발현을 달성하되, 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열이 보충된 배지에서 세포의 생존 및/또는 증식을 허용하는 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 단계; iii) 적어도 하나의 화합물을 갖는 배양 배지에서 세포를 배양하여, 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현하는 세포의 풍부화를 허용하는 단계를 포함한다.
본원에 기재된 일부 실시양태는 유전적으로 조작된 세포의 선택을 위한 방법에 관한 것이다. 방법은
i) 세포에서 발현을 위해 작동가능한 적어도 2 개의 2-부분 뉴클레오티드 서열을 도입하되,
세포는, 세포가 선택된 배양 조건 하에 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 억제되는 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질을 갖고,
제1 2-부분 뉴클레오티드 서열이 생존 및/또는 증식을 허용하는 단백질의 제1 부분을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
제2 2-부분 뉴클레오티드 서열이 생존 및/또는 증식을 허용하는 단백질의 제2 부분을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
단백질의 부분이 세포에서 공동-발현될 때 기능적 단백질을 형성할 수 있는 것인,
단계;
ii) 적어도 2 개의 2-부분 뉴클레오티드 서열의 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현하는 세포의 풍부화를 허용하는 시험관내 증식 조건 하에 세포를 배양하는 단계
를 포함한다.
일부 실시양태는 도 33에 나타나 있다. 이들 실시양태의 신규한 양태는
· TCR 및 CAR에 대한 적용
· T 세포에서의 용도
· TCR 유전자좌 내로의 부위-특이적 통합을 이용한 용도
· 암 치료를 위한 용도
를 포함한다.
본원에 기재된 일부 실시양태는 i) 세포가 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 메토트렉세이트의 존재에 의해 억제되는 내인성 DHFR, 및 ii) 제1 결합 도메인에 융합된 메토트렉세이트-저항성 DHFR 단백질의 비-기능적 부분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 뉴클레오티드 및 제2 결합 도메인에 융합된 메토트렉세이트-저항성 DHFR 단백질의 비-기능적 부분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 뉴클레오티드를 포함하여, 양측 뉴클레오티드가 억제될 때, 기능적 메토트렉세이트-저항성 DHFR이 존재하고 제1 및 제2 뉴클레오티드 둘 다를 함유하는 세포의 선택을 가능하게 할 수 있는, 적어도 2 개 뉴클레오티드 서열을 포함하는 T 세포에 관한 것이다.
본원에 기재된 일부 실시양태는 유전적으로 조작된 세포의 선택을 위한 방법에 관한 것이다. 방법은
i) 세포에서 발현을 위해 작동가능한 적어도 2 개의 2-부분 뉴클레오티드 서열을 도입하되,
세포는, 세포가 선택된 배양 조건 하에 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 억제되는 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질을 갖고,
제1 2-부분 뉴클레오티드 서열이 생존 및/또는 증식을 허용하는 단백질의 제1 비-기능적 부분에 융합된 제1 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
제2 2-부분 뉴클레오티드 서열이 생존 및/또는 증식을 허용하는 단백질의 제2 비-기능적 부분에 융합된 제2 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
제1 및 제2 결합 도메인이 세포에서 서로에 대해 결합할 수 있고,
단백질의 제1 및 제2 비-기능적 부분이 세포에서 공동-발현될 때 기능적 단백질을 형성할 수 있는 것인,
단계;
ii) 적어도 2 개의 2-부분 뉴클레오티드 서열의 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현하는 세포의 풍부화를 허용하는 시험관내 증식 조건 하에 세포를 배양하는 단계
를 포함한다.
본원에 기재된 일부 실시양태는 DHFR 단백질이 다중 비-기능적 부분으로 분열하는 기능을 회복하기 위한 결합 도메인에 관한 것이다. 결합 도메인은 DHFR 단백질의 상보성 비-기능적 부분에 융합될 때, DHFR 단백질 기능을 회복할 수 있다. 결합 도메인은 천연 결합 도메인, 천연 단백질과 상호작용하지 않는 조작된 결합 도메인, 또는 유도성 결합 도메인일 수 있다.
본원에 기재된 일부 실시양태는 유전적으로 조작된 세포의 선택 또는 풍부화를 위한 방법에 관한 것이다. 용어 "선택" 및 "풍부화"는 세포의 집단에서 바람직한 유전적으로 조작된 세포의 전체 증가된 비를 지칭한다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 이는 예를 들어, 유전적으로 조작된 세포의 전체 수 증가, 집단에 존재하는 임의의 다른 세포의 수 감소, 유전적으로 조작된 세포 정제, 이의 임의의 조합, 및 다른 유사한 접근법을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 방법은 세포에서 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현할 수 있는 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열을 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는, 세포가 정상 세포 배양 배지에서 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 감소되는 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질을 갖는다. 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열은 세포에서 발현을 위해 작동가능하거나 표적 게놈에서 사전-결정된 부위 내로 삽입될 때 발현을 위해 작동가능해지고, 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열은 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 또는 이의 변이체, 및 발현될 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 제2-부분 뉴클레오티드 서열은 관심 단백질을 코딩한다. 방법은 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현하는 세포의 선택 또는 풍부화를 위한 약리학적 외인성 선택 압력 없이 정상 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 세포가 정상 시험관내 증식 조건 하에 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 세포의 생존 및/또는 증식을 위해 기능하고/하거나 필수적인 적어도 제1 단백질의 수준을 감소시키는 단계, 세포에서 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현할 수 있고 제1 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 또는 이의 변이체, 및 발현될 제2 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 2-부분 뉴클레오티드 서열을 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다.
"필수" 단백질은 주어진 세포에서 성장, 복제, 세포 주기, 유전자 조절(DNA 수선, 전사, 번역, 및 복제를 포함함), 스트레스 반응, 대사, 아폽토시스, 영양분 획득, 단백질 전환, 세포 표면 온전함, 필수 효소 활성, 생존, 또는 이의 임의의 조합에 영향을 주는 임의의 단백질일 수 있다는 것이 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다.
일부 실시양태에서, 필수 단백질의 수준에서의 감소는 영구적이다. 일부 실시양태에서, 필수 단백질의 수준에서의 감소는 일시적, 또는 비-영구적이다. 일부 실시양태에서, 필수 단백질의 수준에서의 감소는 유도성이다. 일부 실시양태에서, 필수 단백질의 수준에서의 감소는 단일 세포 주기 기간을 통해 세포의 생존 및/또는 증식에 영향을 준다. 일부 실시양태에서, 필수 단백질의 수준에서의 감소는 적어도 약 1 분, 적어도 약 10 분, 적어도 약 30 분, 적어도 약 60 분, 적어도 약 2 시간, 적어도 약 5 시간, 적어도 약 10 시간, 적어도 약 20 시간, 적어도 약 1 일, 적어도 약 2 일, 적어도 약 4 일, 적어도 약 1 주, 적어도 약 2 주, 적어도 약 1 개월, 또는 적어도 약 2 개월의 기간 동안 세포의 생존 및/또는 증식에 영향을 준다. 일부 실시양태에서, 필수 단백질의 수준에서의 감소는 증식의 완전 중단을 야기한다. 필수 단백질의 수준에서의 감소는 증식의 부분적 중단을 야기한다. 일부 실시양태에서, 증식은 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100% 중단된다. 일부 실시양태에서, 필수 단백질의 수준에서의 감소는 완전 세포 사멸을 야기한다. 일부 실시양태에서, 필수 단백질의 수준에서의 감소는 집단내 모든 세포에서의 세포 사멸을 개시한다. 필수 단백질의 수준에서의 감소는 집단 내에서 일부 세포에서의 세포 사멸을 개시한다. 일부 실시양태에서, 세포 사멸(또는 생존의 감소된 비율)은 세포의 집단에서 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100% 증가된다. 일부 실시양태에서, 필수 단백질의 수준에서의 감소는 필수 단백질을 코딩하는 유전자의 녹-아웃을 포함한다. 일부 실시양태에서, 필수 단백질의 수준에서의 감소는 필수 단백질을 코딩하는 유전자의 녹-다운을 포함한다. 일부 실시양태에서, 필수 단백질의 수준에서의 감소는 필수 단백질을 억제할 수 있는 유전자의 녹-인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 녹-아웃 및/또는 녹-다운은 CRISPR 리보핵단백질(RNP), TALEN, MegaTAL, 또는 임의의 다른 뉴클레아제에 의해 매개된다. 일부 실시양태에서, 일시적 억제는 siRNA, miRNA, 또는 CRISPR 간섭(CRISPRi)을 통하는 것이다. 녹-아웃, 녹-다운, 및 단백질 수준 감소의 다른 방법은 제한 효소 및 선택 카세트, 선택적 전사 억제, 선택적 번역 억제, 및 분해를 위해 단백질 표적화를 구동하는 것을 포함한 임의의 종래의 방법을 사용하여 수행될 수 있다는 것이 통상의 기술자에게 이해될 것이다. 일부 실시양태에서, 필수 단백질의 수준에서의 감소는 RNA 수준에서 필수 단백질의 수준에서의 일시적 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 필수 단백질의 RNA는 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100% 감소된다. 일부 실시양태에서, 세포는 T 세포, NK 세포, NKT 세포, iNKT 세포, 조혈 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, iPSC, 신경 전구 세포, 망막 유전자 요법에서의 세포 유형 또는 임의의 다른 세포이다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열은 세포에서 발현을 위해 작동가능하거나 표적 게놈에서 사전-결정된 부위 내로 삽입될 때 발현을 위해 작동가능해지고, 제2-부분 단백질은 관심 단백질이다. 일부 실시양태에서, 제1-부분 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열에서 변경되어, 뉴클레아제, siRNA, miRNA 또는 CRISPRi 저항성을 달성한다. 일부 실시양태에서, 제1-부분 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열에서 변경되어, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100% 뉴클레아제, siRNA, miRNA 또는 CRISPRi 저항성을 달성한다. 일부 실시양태에서, 제1 부분 뉴클레오티드 서열은 필수 제1 단백질과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 제1 부분 뉴클레오티드 서열은 필수 제1 단백질과 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 제1-부분 뉴클레오티드 서열은 변경되어, 제1 단백질과 동일한 아미노산 서열을 갖지 않는 변경된 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 변경된 단백질은 제1 단백질이 갖지 않는 특이적 특징을 갖는다. 일부 실시양태에서, 특이적 특징은, 비제한적으로, 감소된 활성, 증가된 활성 및 변경된 반감기 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변경된 단백질의 활성은 제1 단백질과 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100% 변경된다. 일부 실시양태에서, 변경된 단백질의 반감기는 제1 단백질과 비교하여 감소된다. 일부 실시양태에서, 변경된 단백질의 반감기는 제1 단백질과 비교하여 연장된다. 일부 실시양태에서, 변경된 단백질의 반감기는 제1 단백질과 비교하여 적어도 약 1.5 배, 적어도 약 2 배, 적어도 약 5 배, 적어도 약 10 배, 적어도 약 20 배, 적어도 약 50 배, 또는 적어도 약 100 배 연장되거나 감소된다. 일부 실시양태에서, 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다는 동일한 프로모터에 의해 구동된다. 일부 실시양태에서, 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열은 상이한 프로모터에 의해 구동된다. 제2-부분 뉴클레오티드 서열은 적어도 치료 유전자를 포함한다.
"치료" 유전자 또는 단백질은 임의의 질환 또는 장애의 처치, 예방(prevention), 예방(prophylaxis), 완화, 개선, 또는 치유에 유용한 임의의 유전자 또는 단백질일 수 있다는 것이 통상의 기술자에게 이해될 것이다.
일부 실시양태에서, 제2-부분 뉴클레오티드 서열은 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 함유하는 신생항원 T-세포 수용체 복합체(TCR)를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 필수 또는 제1 단백질은 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 이노신 모노포스페이트 탈수소효소 2(IMPDH2), O-6-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라아제(MGMT), 데옥시시티딘 키나아제(DCK), 하이포크산틴 포스포리보실트랜스퍼라아제 1(HPRT1), 인터류킨 2 수용체 서브유닛 감마(IL2RG), 액틴 베타(ACTB), 진핵생물 번역 신장 인자 1 알파 1(EEF1A1), 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH), 포스포글리세레이트 키나아제 1(PGK1) 또는 트랜스페린 수용체(TFRC)이다. 일부 실시양태에서, 제1-부분 뉴클레오티드 서열은 뉴클레아제-저항성 또는 siRNA-저항성 DHFR 유전자를 포함하고, 제2-부분 뉴클레오티드 서열은 TRA 유전자 및 TRB 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1-부분 뉴클레오티드 서열은 뉴클레아제-저항성 또는 siRNA-저항성 DHFR 유전자를 포함하고, 제2-부분 뉴클레오티드 서열은 TRA 유전자 및 TRB 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, TRA, TRB 및 DHFR 유전자는 적어도 하나의 링커에 의해 분리된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 링커는 적어도 하나의 자가-절단 2A 펩티드 및/또는 적어도 하나의 IRES 요소이다. 일부 실시양태에서, DHFR, TRA 및 TRB 유전자는 내인성 TCR 프로모터 또는, 비제한적으로, TRAC, TRBC1/2, DHFR, EEF1A1, ACTB, B2M, CD52, CD2, CD3G, CD3D, CD3E, LCK, LAT, PTPRC, IL2RG, ITGB2, TGFBR2, PDCD1, CTLA4, FAS, TNFRSF1A(TNFR1), TNFRSF10B(TRAILR2), ADORA2A, BTLA, CD200R1, LAG3, TIGIT, HAVCR2(TIM3), VSIR(VISTA), IL10RA, IL4RA, EIF4A1, FTH1, FTL, HSPA5 및 PGK1의 프로모터를 포함하는 임의의 다른 적합한 프로모터에 의해 구동된다. 일부 실시양태에서, 2-부분 뉴클레오티드 서열은 세포의 게놈 내로 통합된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 2 부분 뉴클레오티드 서열은 표적 게놈에서 사전-결정된 부위 내로 삽입될 때 발현을 위해 작동가능해지고 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다는 표적 게놈에서 프로모터에 의해 구동된다. 일부 실시양태에서, 통합은 뉴클레아제-매개된 부위-특이적 통합, 전이인자-매개된 유전자 전달 또는 바이러스-매개 유전자 전달을 통하는 것이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제-매개된 부위-특이적 통합은 CRISPR RNP, 선택적으로 CRISPR/Cas9 RNP를 통하는 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 제1 단백질 및 제2 단백질 둘 다를 발현하는 세포의 풍부화를 위한 약리학적 외인성 선택 압력 없이 정상 시험관내 증식 조건 하에 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
"정상 시험관내 증식 조건"은 세포, 세포주, 또는 조직 샘플이 유지될 수 있지만, 본원에 제공된 바와 같은 방법을 구동하기 위해 의도적으로 생략되거나 첨가된 변수(예를 들어, 과정 또는 성분)를 포함하지 않는 통상적인 조건을 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 스플릿 인테인(split intein) 시스템을 사용하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 도입된 2-부분 뉴클레오티드 서열은 세포의 게놈 내로 통합되지 않는다. 일부 실시양태에서, 내인성 TCR 불변 유전자좌를 표적화하는 CRISPR RNP, 뉴클레아제-저항성 DHFR 유전자를 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 신생항원 TCR을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열은 세포에 전달된다. 일부 실시양태에서, 내인성 TCR 불변 유전자좌는 TCR 알파 불변(TRAC) 유전자좌 또는 TCR 베타 불변(TRBC) 유전자좌일 수 있다. 일부 실시양태에서, 내인성 TCR 불변 유전자좌는 TCR 알파 불변(TRAC) 유전자좌 또는 TCR 베타 불변(TRBC) 유전자좌일 수 있다. 일부 실시양태에서, 내인성 TCR 불변 유전자좌는 TCR 알파 불변(TRAC) 유전자좌 또는 TCR 베타 불변(TRBC) 유전자좌일 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 CRISPR RNP는 녹-인을 위해 TRAC 유전자좌를 절단하는 TRAC RNP이다. 일부 실시양태에서, CRISPR RNP는 CRISPR/Cas9 RNP이다. 일부 실시양태에서, 정상 세포 배양 배지는 비-매개된 세포의 성장 및/또는 증식에 적합한 것이다. 일부 실시양태에서, 정상 세포 배양 배지는 임의의 외인성 선택 압력이 없는 것이다. 일부 실시양태에서, CRISPR RNP가 사용되어, 제2 2-부분 뉴클레오티드를 표적 게놈에서 사전-결정된 부위 내로 녹-인시키고, 선택적으로 표적 게놈에서 사전-결정된 부위는 B2M 유전자이다.
일부 실시양태에서, 방법은 세포에서 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현할 수 있는 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열을 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 세포는, 세포가 정상 세포 배양 배지에서 생존하고/하거나 증식할 수 없도록 감소되는 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 기능적 활성을 갖는다. 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열은 세포에서 발현을 위해 작동가능하거나 표적 게놈에서 사전-결정된 부위 내로 삽입될 때 발현을 위해 작동가능해지고, 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열은 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질과 실질적으로 동등한 기능을 제공하는 제1 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 제2 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 제2 단백질은 관심 단백질이다. 방법은 제1 단백질 및 제2 단백질 둘 다를 발현하는 세포의 풍부화 또는 선택을 야기하는 적어도 하나의 보충제를 함유하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 세포가 정상 시험관내 증식 조건 하에 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 세포의 생존 및/또는 증식을 위해 필수적인 적어도 제1 단백질의 기능적 활성을 감소시키는 단계 및 세포에서 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현할 수 있고 실질적으로 동등한 기능을 제공하는 제1 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 제2 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 2-부분 뉴클레오티드 서열을 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열은 세포에서 발현을 위해 작동가능하거나 표적 게놈에서 사전-결정된 부위 내로 삽입될 때 발현을 위해 작동가능해지고, 제2 단백질은 관심 단백질이다. 방법은 제1 단백질 및 제2 단백질 둘 다를 발현하는 세포의 선택 또는 풍부화를 야기하는 적어도 하나의 보충제를 함유하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포는 T 세포, NK 세포, NKT 세포, iNKT 세포, 조혈 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, iPSC, 신경 전구 세포, 망막 유전자 요법에서의 세포 유형 또는 임의의 다른 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 세포는 래트 또는 마우스이다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간이다. 일부 실시양태에서, 세포는 정립된 또는 표준 세포주로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 세포는 일차 조직 또는 일차 세포로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 제1-부분 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열에서 변경되어, 뉴클레아제, siRNA, miRNA 또는 CRISPRi 저항성을 달성하고, a) 제1 단백질과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하거나 b) 제1 단백질에 대해 조정된 기능성을 갖는 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 제1-부분 뉴클레오티드 서열은 변경되어, 제1 단백질과 동일한 아미노산 서열을 갖지 않는 변경된 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 제1 부분 뉴클레오티드 서열은 제1 단백질과 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 변경된 단백질은 제1 단백질이 갖지 않는 특이적 특징을 갖는다. 특이적 특징은, 비제한적으로, 감소된 활성, 증가된 활성, 변경된 반감기, 소분자 억제에 대한 저항성 및 소분자 결합 후 증가된 활성 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변경된 단백질의 활성은 제1 단백질과 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100% 변경된다. 일부 실시양태에서, 변경된 단백질의 반감기는 제1 단백질과 비교하여 감소된다. 일부 실시양태에서, 변경된 단백질의 반감기는 제1 단백질과 비교하여 연장된다. 일부 실시양태에서, 변경된 단백질의 반감기는 제1 단백질과 비교하여 적어도 약 1.5 배, 적어도 약 2 배, 적어도 약 5 배, 적어도 약 10 배, 적어도 약 20 배, 적어도 약 50 배, 또는 적어도 약 100 배 연장되거나 감소된다. 일부 실시양태에서, 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다는 동일한 프로모터에 의해 구동된다. 일부 실시양태에서, 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열은 상이한 프로모터에 의해 구동된다. 일부 실시양태에서, 제2-부분 뉴클레오티드 서열은 적어도 치료 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2-부분 뉴클레오티드 서열은 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 함유하는 신생항원 T-세포 수용체 복합체(TCR)를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 필수 또는 제1 단백질은 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 이노신 모노포스페이트 탈수소효소 2(IMPDH2), O-6-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라아제(MGMT), 데옥시시티딘 키나아제(DCK), 하이포크산틴 포스포리보실트랜스퍼라아제 1(HPRT1), 인터류킨 2 수용체 서브유닛 감마(IL2RG), 액틴 베타(ACTB), 진핵생물 번역 신장 인자 1 알파 1(EEF1A1), 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH), 포스포글리세레이트 키나아제 1(PGK1) 또는 트랜스페린 수용체(TFRC)이다. 일부 실시양태에서, 제1-부분 뉴클레오티드 서열은 단백질 억제제-저항성 DHFR 유전자를 포함하고, 제2-부분 뉴클레오티드 서열은 TRA 유전자 및 TRB 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, TRA, TRB 및 DHFR 유전자는 단일 개방 판독 프레임으로부터 발현되도록 작동가능하게 구성된다. TRA, TRB, 및 DHFR 유전자는 2 또는 3 개 개방 판독 프레임으로부터 발현된다. 일부 실시양태에서, TRA, TRB 및 DHFR 유전자는 적어도 하나의 링커에 의해 분리된다. 일부 실시양태에서, TRA, TRB, 및 DHFR 유전자는 2 개 링커에 의해 분리된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 링커, TRA, TRB 및 DHFR 유전자의 순서는 TRA - 링커 - TRB - 링커 - DHFR, TRA - 링커 - DHFR- 링커 - TRB, TRB - 링커 - TRA - 링커 - DHFR, TRB - 링커 - DHFR- 링커 - TRA, DHFR - 링커 - TRA - 링커 - TRB, 또는 DHFR - 링커 - TRB - 링커 - TRA이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 링커는 적어도 하나의 자가-절단 2A 펩티드 및/또는 적어도 하나의 IRES 요소이다. 일부 실시양태에서, DHFR, TRA 및 TRB 유전자는 내인성 TCR 프로모터 또는, 비제한적으로, TRAC, TRBC1/2, DHFR, EEF1A1, ACTB, B2M, CD52, CD2, CD3G, CD3D, CD3E, LCK, LAT, PTPRC, IL2RG, ITGB2, TGFBR2, PDCD1, CTLA4, FAS, TNFRSF1A(TNFR1), TNFRSF10B(TRAILR2), ADORA2A, BTLA, CD200R1, LAG3, TIGIT, HAVCR2(TIM3), VSIR(VISTA), IL10RA, IL4RA, EIF4A1, FTH1, FTL, HSPA5 및 PGK1의 프로모터를 포함하는 임의의 다른 적합한 프로모터에 의해 구동된다. 일부 실시양태에서, 2-부분 뉴클레오티드 서열은 세포의 게놈 내로 통합된다. 일부 실시양태에서, 2-부분 뉴클레오티드 서열은 세포의 게놈 내로 통합되지 않는다. 일부 실시양태에서, 2-부분 뉴클레오티드 서열은 세포의 게놈 내로 통합되지 않지만, 적어도 하나의 플라스미드를 통해 세포에 의해 발현된다. 일부 실시양태에서, 2-부분 뉴클레오티드 서열은 세포의 핵 게놈 내로 통합된다. 2-부분 뉴클레오티드 서열은 세포의 미토콘드리아 게놈 내로 통합된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 2 부분 뉴클레오티드 서열은 표적 게놈에서 사전-결정된 부위 내로 삽입될 때 발현을 위해 작동가능해지고 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다는 표적 게놈에서 프로모터에 의해 구동된다. 일부 실시양태에서, 통합은 뉴클레아제-매개된 부위-특이적 통합, 전이인자-매개된 유전자 전달 또는 바이러스-매개 유전자 전달을 통하는 것이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제-매개된 부위-특이적 통합은 CRISPR RNP, 선택적으로 CRISPR/Cas9 RNP를 통하는 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 스플릿 인테인 시스템을 사용하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 내인성 TCR 불변 유전자좌를 표적화하는 CRISPR RNP, 단백질 억제제-저항성 DHFR 유전자를 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 신생항원 TCR을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열은 세포에 전달된다. 일부 실시양태에서, 내인성 TCR 불변 유전자좌는 TCR 알파 불변(TRAC) 유전자좌 또는 TCR 베타 불변(TRBC) 유전자좌일 수 있다. 일부 실시양태에서, 전달은 전기천공, 또는 기계적 또는 화학적 막 투과화를 기초로 하는 방법에 의한 것이다. 일부 실시양태에서, CRISPR RNP는 녹-인을 위해 TRAC 유전자좌를 절단하는 TRAC RNP이다. 일부 실시양태에서, CRISPR RNP는 CRISPR/Cas9 RNP이다. 일부 실시양태에서, 세포의 풍부화 또는 선택을 야기하는 보충제는 유세포분석 또는 자성 비드 풍부화에 의한 세포의 풍부화를 허용하는 항체이다. 일부 실시양태에서, 세포의 풍부화 또는 선택을 야기하는 보충제는 유세포분석 또는 자성 비드 풍부화에 의한 세포의 풍부화를 허용하는 항체이다. 일부 실시양태에서, 제1 단백질은 세포의 생존 및/또는 증식의 보충제 매개된 손상에 대한 세포의 저항성을 매개한다. 일부 실시양태에서, 보충제는 메토트렉세이트이다. 일부 실시양태에서, 제1 단백질은 메토트렉세이트-저항성 DHFR 돌연변이체 단백질이다.
일부 실시양태에서, 방법은 세포에서 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현할 수 있는 적어도 2 개, 2-부분 뉴클레오티드 서열을 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 세포는, 세포가 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 억제되는 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질을 갖고, 제1 2-부분 뉴클레오티드 서열은 제1 결합 도메인에 융합된 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 비-기능적 부분을 포함하는 제1 융합 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 관심 제1 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 제2 2-부분 뉴클레오티드 서열은 제2 결합 도메인에 융합된 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 비-기능적 부분을 포함하는 제2 융합 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 관심 제2 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 제1 및 제2 융합 단백질 둘 다가 세포에서 함께 발현될 때, 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 기능은 회복된다. 방법은 제1 및 제2 2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현하는 세포의 선택을 야기하는 조건 하에 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 세포가 정상 시험관내 증식 조건 하에 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 세포의 생존 및/또는 증식을 위해 필수적인 적어도 제1 단백질을 억제하는 단계 및 세포에서 발현될 수 있는 적어도 2 개의 2-부분 뉴클레오티드 서열을 도입하는 단계를 포함한다. 제1 2-부분 뉴클레오티드 서열은 제1 결합 도메인에 융합된 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 비-기능적 부분을 포함하는 제1 융합 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 관심 제1 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 제2 2-부분 뉴클레오티드 서열은 제2 결합 도메인에 융합된 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 비-기능적 부분을 포함하는 제2 융합 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 관심 제2 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제1 및 제2 융합 단백질 둘 다가 세포에서 함께 발현될 때, 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 기능은 회복된다. 방법은 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질 둘 다를 발현하는 세포의 풍부화를 야기하는 시험관내 증식 조건 하에 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 세포에서 발현을 위해 작동가능한 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열을 도입하는 단계를 포함한다. 세포는, 세포가 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 억제되는 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질을 갖고, 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열은 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 제2-부분 뉴클레오티드 서열은 세포에 대해 외인성인 단백질을 코딩하고; 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현하는 세포의 선택을 야기하는 조건 하에 세포를 배양하는 단계.
일부 실시양태에서, 방법은 세포가 정상 시험관내 증식 조건 하에 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 세포의 생존 및/또는 증식을 위해 필수적인 적어도 제1 단백질의 활성을 감소시키는 단계, 세포에서 발현을 위해 작동가능하고 제1 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 제2 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 2-부분 뉴클레오티드 서열을 도입하는 단계를 포함한다. 제2-부분 단백질은 세포에 대해 외인성이고, 제1 단백질 및 제2 단백질 둘 다를 발현하는 세포의 풍부화를 야기하는 시험관내 증식 조건 하에 세포를 배양하는 단계.
일부 실시양태에서, 세포 생존 및/또는 증식은 적어도 약 1 분, 적어도 약 10 분, 적어도 약 30 분, 적어도 약 60 분, 적어도 약 2 시간, 적어도 약 5 시간, 적어도 약 10 시간, 적어도 약 20 시간, 적어도 약 1 일, 적어도 약 2 일, 적어도 약 3 일, 적어도 약 4 일, 적어도 약 5 일, 적어도 약 6 일, 적어도 약 1 주, 적어도 약 2 주, 적어도 약 1 개월, 또는 적어도 약 2 개월 후 측정된다. 일부 실시양태에서, 생존 및/또는 증식을 위해 필수적인 적어도 제1 단백질의 활성을 감소시키는 단계는 적어도 약 1 분, 적어도 약 10 분, 적어도 약 30 분, 적어도 약 60 분, 적어도 약 2 시간, 적어도 약 5 시간, 적어도 약 10 시간, 적어도 약 20 시간, 적어도 약 1 일, 적어도 약 2 일, 적어도 약 3 일, 적어도 약 4 일, 적어도 약 5 일, 적어도 약 6 일, 적어도 약 1 주, 적어도 약 2 주, 적어도 약 1 개월, 또는 적어도 약 2 개월 동안 지속된다. 일부 실시양태에서, 생존 및/또는 증식을 위해 필수적인 적어도 제1 단백질의 활성을 감소시키는 단계는 영구적이다.
본원에 기재된 일부 실시양태는 본 발명의 방법 중 임의의 것에 따라 제조되는 세포에 관한 것이다.
본원에 기재된 일부 실시양태는 유전적으로 조작된 T 세포의 풍부화를 위한 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 메토트렉세이트-저항성 DHFR 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 TRA 또는 TRB 프로모터의 후속의 2-부분 뉴클레오티드 서열의 통합에 의해 T 세포에서 T-세포 수용체 복합체 또는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 2-부분 뉴클레오티드 서열을 도입하는 단계, 및 제1 단백질 및 제2 단백질 둘 다를 발현하는 세포의 풍부화를 야기하는 메토트렉세이트를 함유하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
본원에 기재된 일부 실시양태는 외인성 T 세포 수용체 유전자를 발현하도록 조작된 T 세포의 풍부화를 위한 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 제1 CRISPR/Cas9 RNP를 사용하여 내인성 TRBC 유전자를 이의 유전자좌로부터 녹-아웃시키는 단계, 제2 CRISPR/Cas9 RNP를 사용하여, 메토트렉세이트-저항성 DHFR 유전자를 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 치료 TCR 유전자를 포함하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 내인성 TRBC 유전자좌 내로 녹-인시키는 단계를 포함한다. 양측 뉴클레오티드 서열은 작동가능하게 연결되어, 내인성 TRBC 프로모터로부터의 발현을 허용하고, 치료 TCR 및 메토트렉세이트-저항성 DHFR 유전자 둘 다를 발현하는 T 세포의 풍부화를 야기하는 메토트렉세이트를 함유하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계.
일부 실시양태에서, 필수 단백질은 DHFR 단백질이다. 일부 실시양태에서, 필수 단백질은 DHFR 모방체 또는 유사체이다. 일부 실시양태에서, 필수 단백질은 DHFR 단백질 또는 이의 부분과 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100% 동일하다. 일부 실시양태에서, 제1 또는 제2 2-부분 뉴클레오티드 서열의 제2-부분 뉴클레오티드 서열은 세포에 대해 외인성이다. 일부 실시양태에서, 제1 또는 제2 2-부분 뉴클레오티드 서열의 제2-부분 뉴클레오티드 서열은 TCR이다. 일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 결합 도메인은 GCN4로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 결합 도메인은 GCN4 모방체 또는 유사체로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 결합 도메인은 GCN4와 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100% 동일한 서열로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 결합 도메인은 서열번호 24를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 결합 도메인은 서열번호 24와 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 융합 단백질 및/또는 제2 융합 단백질은 서열번호 39 및/또는 서열번호 40을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 융합 단백질 및/또는 제2 융합 단백질은 서열번호 39 및/또는 서열번호 40과 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 융합 단백질 및/또는 제2 융합 단백질은 서열번호 35 및/또는 서열번호 36을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 융합 단백질 및/또는 제2 융합 단백질은 서열번호 35 및/또는 서열번호 36과 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 융합 단백질 및/또는 제2 융합 단백질은 서열번호 37 및/또는 서열번호 38을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 융합 단백질 및/또는 제2 융합 단백질은 서열번호 37 및/또는 서열번호 38과 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 융합 단백질 및/또는 제2 융합 단백질은 서열번호 62 및/또는 서열번호 63을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 융합 단백질 및/또는 제2 융합 단백질은 서열번호 62 및/또는 서열번호 63과 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 결합 도메인은 FKBP12로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 결합 도메인은 FKBP12 유사체 또는 모방체로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, FKBP12는 F36V 돌연변이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 결합 도메인은 FKBP12와 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100% 동일한 서열로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 결합 도메인은 서열번호 31을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 결합 도메인은 서열번호 31과 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 결합 도메인은 JUN 및/또는 FOS로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 결합 도메인은 JUN 및/또는 FOS 유사체 또는 모방체로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 결합 도메인은 JUN 및/또는 FOS와 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100% 동일한 서열로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 결합 도메인은 서열번호 26 및/또는 서열번호 29로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 결합 도메인은 서열번호 26 및/또는 서열번호 29와 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100% 동일한 서열로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 결합 도메인은 서열번호 27 및/또는 서열번호 30으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 결합 도메인은 서열번호 27 및/또는 서열번호 30과 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100% 동일한 서열로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인은 서로에 대한 결합을 보존하는 상보성 돌연변이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인은 천연 결합 파트너에 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인 각각은 3 내지 7 개 상보성 돌연변이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인은 각각 3 개 상보성 돌연변이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인은 각각 4 개 상보성 돌연변이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 적어도 2 개의 2-부분 뉴클레오티드 서열은 세포의 게놈 내로 통합된다. 일부 실시양태에서, 적어도 2 개의 2-부분 뉴클레오티드 서열은 세포의 게놈 내로 통합되지 않는다. 일부 실시양태에서, 적어도 2 개의 2-부분 뉴클레오티드 서열은 세포의 핵 게놈 내로 통합된다. 일부 실시양태에서, 적어도 2 개의 2-부분 뉴클레오티드 서열은 세포의 미토콘드리아 게놈 내로 통합된다. 일부 실시양태에서, 적어도 2 개의 2-부분 뉴클레오티드 서열은 세포의 게놈 내로 통합되지 않지만, 적어도 하나의 플라스미드를 통해 세포에 의해 발현된다. 일부 실시양태에서, 적어도 2 개의 2-부분 뉴클레오티드 서열은 표적 게놈에서 사전-결정된 부위 내로 삽입될 때 발현을 위해 작동가능해지고 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다는 표적 게놈에서 프로모터에 의해 구동된다. 일부 실시양태에서, 통합은 뉴클레아제-매개된 부위-특이적 통합, 전이인자-매개된 유전자 전달 또는 바이러스-매개 유전자 전달을 통하는 것이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제-매개된 부위-특이적 통합은 CRISPR RNP를 통하는 것이다. 일부 실시양태에서, 제1 2-부분 뉴클레오티드 서열은 내인성 TCR 불변 유전자좌를 표적화하는 CRISPR RNP에 의해 세포에 전달되고, 제1 제1-부분 뉴클레오티드 서열은 DHFR 단백질의 비-기능적 부분을 코딩하고, 제1 제2-부분 뉴클레오티드 서열은 신생항원 TCR을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 제1 2-부분 뉴클레오티드 서열은 내인성 TCR 불변 유전자좌를 표적화하는 CRISPR RNP에 의해 세포에 전달되고, 제1 제1-부분 뉴클레오티드 서열은 DHFR 단백질의 비-기능적 부분을 코딩하고, 제1 제2-부분 뉴클레오티드 서열은 신생항원 TCR을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 제1 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 제2 제1-부분 뉴클레오티드 서열은, 융합 단백질이 공동-발현될 때, DHFR 활성을 갖는 DHFR 단백질의 비-기능적 부분을 포함하는 융합 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 내인성 TCR 불변 유전자좌는 TCR 알파 불변(TRAC) 유전자좌 또는 TCR 베타 불변(TRBC) 유전자좌일 수 있다. 일부 실시양태에서, TCR 불변 유전자좌 이외의 내인성 유전자좌는 B2M 유전자좌이다. 일부 실시양태에서, 전달은 전기천공, 또는 기계적 또는 화학적 막 투과화를 기초로 하는 방법에 의한 것이다. 일부 실시양태에서, CRISPR RNP는 CRISPR/Cas9 RNP이다.
일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 유전자좌 내로의 인-프레임 엑손 통합을 허용하여, 내인성 프로모터, 내인성 스플라이스 부위, 및 내인성 종결 신호로부터의 발현을 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 유전자좌 내로의 인-프레임 엑손 통합을 허용하여, 내인성 프로모터, 내인성 스플라이스 부위, 및 외인성 종결 신호로부터의 발현을 허용한다. 일부 실시양태에서, 이들 실시양태는 본원에 제공된 실시양태 중 임의의 것의 부분일 수 있다.
일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 유전자좌 내로의 인트론 통합을 허용하여,내인성 프로모터, 외인성 스플라이스 수용체 부위, 및 외인성 종결 신호로부터의 발현을 허용한다. 일부 실시양태에서, 필수 또는 제1 단백질은 적어도 2 개 개별적 기능장애 단백질 부분으로 분열되고, 적어도 2 개 부분 각각은 다량체화 도메인에 융합되고 적어도 2 개 부분 각각은 별개 2-부분 뉴클레오티드 서열 내로 통합되어, 모든 별개 2-부분 뉴클레오티드 서열이 발현되는 세포의 선택을 허용하고, 선택적으로 필수 또는 제1 단백질의 기능은 회복된다. 일부 실시양태에서, 필수 또는 제1 단백질은 적어도 2 개 개별적 기능장애 단백질 부분으로 분열되고, 적어도 2 개 부분 각각은 다량체화 도메인에 융합되고 적어도 2 개 부분 각각은 별개 2-부분 뉴클레오티드 서열 내로 통합되어, 모든 별개 2-부분 뉴클레오티드 서열이 발현되는 세포의 선택을 허용하고, 선택적으로 필수 또는 제1 단백질의 기능은 부분적으로 회복된다. 필수 또는 제1 단백질은 적어도 2 개 개별적 기능장애 단백질 부분으로 분열되고, 적어도 2 개 부분 각각은 다량체화 도메인에 융합되고 적어도 2 개 부분 각각은 별개 2-부분 뉴클레오티드 서열 내로 통합되어, 모든 별개 2-부분 뉴클레오티드 서열이 발현되는 세포의 선택을 허용하고, 선택적으로 필수 또는 제1 단백질의 기능은 이의 정상 수준에 대해 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100% 회복된다. 일부 실시양태에서, 필수 또는 제1 단백질은 기능장애 N-말단 및 C-말단 단백질 절반으로 분열되고, 각각의 절반은 호모- 또는 헤테로다이머화 단백질 파트너 또는 스플릿 인테인에 융합된다. 일부 실시양태에서, 필수 또는 제1 단백질은 DHFR 단백질이다. 일부 실시양태에서, 필수 또는 제1 단백질은 DHFR 단백질 유사체 또는 모방체이다. 일부 실시양태에서, 필수 또는 제1 단백질은 DHFR 단백질과 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100% 동일하다. 일부 실시양태에서, 호모다이머화 단백질은 GCN4, FKBP12 또는 이의 변이체이다. 일부 실시양태에서, 헤테로다이머화 단백질은 Jun/Fos 또는 이의 변이체이다. 일부 실시양태에서, 필수 단백질의 기능의 회복이 유도된다. 일부 실시양태에서, 필수 단백질의 기능의 회복은 AP1903에 의해 유도된다. 일부 실시양태에서, 필수 단백질의 기능의 회복은 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100% 유도된다. 일부 실시양태에서, 배양 단계는 메토트렉세이트의 존재 하에 수행된다. 일부 실시양태에서, 관심 단백질은 T 세포 수용체이다. 일부 실시양태에서, T 세포 수용체는 바이러스 또는 종양 항원에 대해 특이적이다. 일부 실시양태에서, 종양 항원은 종양 신생항원이다. 일부 실시양태에서, 유전적으로 조작된 세포는 일차 인간 T 세포이다.
본원에 기재된 일부 실시양태는 T 세포에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 세포가 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 메토트렉세이트의 존재에 의해 억제되는 내인성 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 및 메토트렉세이트-저항성 DHFR 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 내인성 TRA 또는 TRB 프로모터로부터 작동가능하게 발현되는 T-세포 수용체를 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, T 세포는 내인성 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)의 녹-아웃, 및 DHFR 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 또는 이의 변이체, 및 내인성 TRA 또는 TRB 프로모터로부터 작동가능하게 발현되는 T-세포 수용체를 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, T 세포는 세포가 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 메토트렉세이트의 존재에 의해 억제되는 내인성 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 및 적어도 2 개의 2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 제1 2-부분 뉴클레오티드 서열은 DHFR 단백질의 비-기능적 또는 기능장애 부분을 코딩하는 제1 제1-부분 뉴클레오티드 서열 또는 이의 변이체, 및 내인성 TRA 또는 TRB 프로모터로부터 작동가능하게 발현되는 T-세포 수용체를 코딩하는 제1 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 제2 2-부분 뉴클레오티드 서열은 DHFR 단백질의 비-기능적 또는 기능장애 부분을 코딩하는 제2 제1-부분 뉴클레오티드 서열 또는 이의 변이체, 및 내인성 B2M 프로모터로부터 작동가능하게 발현되는 관심 단백질을 코딩하는 제2 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 세포는 DHFR 활성을 갖는다.
정의
본 명세서에 걸쳐, 단어 "포함하다", 또는 이의 변형, 예컨대 "포함한다" 또는 "포함하는"은 나타낸 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹의 포함을 나타내지만, 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹의 배제를 나타내는 것은 아니라는 것이 이해될 것이다.
용어 및 방법의 다음 설명은 본 발명을 양호하게 기재하고 본 발명의 실시에서 통상의 기술자를 안내하기 위해 제공된다. 단수형 "a", "an", 및 "the"는 맥락이 달리 명확히 나타내지 않는 경우, 하나 또는 하나 초과를 지칭한다. 예를 들어, 용어 "핵산 분자를 포함하는"은 단일 또는 복수 핵산 분자를 포함하고 어구 "적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는"과 동등한 것으로 고려된다. 용어 "또는"은 맥락이 달리 명확히 나타내지 않는 경우, 나타낸 대안적 요소의 단일 요소 또는 2 이상의 요소의 조합을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "포함한다(comprises)"는 "포함한다(includes)"를 의미한다. 따라서, "A 또는 B를 포함하는(comprising)"은 추가 요소를 배제하지 않고 "A, B, 또는 A 및 B를 포함하는(including)"을 의미한다. 달리 나타내지 않는 경우, 본 정의가 다른 가능한 정의와 상이할 수 있을 때, 본원에 제공된 정의가 우선한다.
달리 설명되지 않는 경우, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 업계의 통상의 기술자에게 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 언급된 모든 HUGO 유전자 명명법 위원회(HUGO Gene Nomenclature Committee) 식별자(ID)는 그 전체가 참고로 포함된다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있으나, 적합한 방법 및 물질이 하기에 기재된다. 물질, 방법, 및 예는 예시적일 뿐이며, 제한인 것으로 의도되지 않는다.
"T 세포 수용체" 또는 "TCR"은 주조직적합성 복합체(MHC) 분자에 펩티드로서 결합된 항원을 인식하는 T 세포 또는 T 림프구의 표면 상에서 발견되는 분자를 나타낸다. TCR은 2 개의 상이한 단백질 쇄로 구성된다(즉, 이는 헤테로 다이머임). 인간에서, T 세포의 95%에서 TCR은 알파(α) 쇄 및 베타(β) 쇄(각각 TRA 및 TRB에 의해 코딩됨)로 구성되는 반면, T 세포의 5%에서 TCR은 감마 및 델타(γ/δ) 쇄(각각 TRG 및 TRD에 의해 코딩됨)로 구성된다. 이 비는 개체발생 동안 질환에 걸린 상태(예컨대, 백혈병)에서 변화한다. 이는 또한 종 사이에서 상이하다. 각각의 TCR 쇄는 가변(V) 영역 및 불변(C) 영역의 2 개의 세포외 도메인으로 구성된다. 불변 영역은 세포막에 근접하고, 막관통 영역 및 짧은 세포질 꼬리가 이어지는 한편, 가변 영역은 펩티드/MHC 복합체에 결합한다. TCRα 및 TCRβ 쇄 둘 다의 가변 도메인은 CDR1, CDR2, 및 CDR3으로 나타낸 3 개의 초가변 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는다. 일부 실시양태에서, CDR3은 주요 항원-인식 영역이다. 일부 실시양태에서, TCRα 쇄 유전자는 V 및 J를 포함하고, TCRβ 쇄 유전자는 V, D 및 J 유전자 세그먼트를 포함하며, 이는 TCR 다양성에 기여한다. TCR의 불변 도메인은 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성하는 짧은 연결 서열로 구성되며, 이는 2 개 쇄 사이에 연결을 형성한다.
다른 특징과 함께, T 세포는, 비제한적으로, CD4, CD8, CD25, 및 CD69를 포함하여, 기능성 또는 활성 상태를 나타내는 마커의 발현이 특징일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 T 세포의 특정 서브세트, 예컨대 CD4+ 또는 CD8+ T 세포이다. 일부 실시양태에서, 방법은 T 세포의 특정 서브세트, 예컨대 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에 대해 사용된다. 일부 실시양태에서, 방법은 T 세포의 특정 서브세트, 예컨대 CD4+ 또는 CD8+ T 세포를 생성하는 과정에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 CD25 또는 CD69를 발현하는 세포가 활성화된다. 일부 실시양태에서, 방법은 예를 들어, CD25 또는 CD69를 발현하는, 활성화되는 세포에 대해 사용된다. 일부 실시양태에서, 방법은 예를 들어, CD25 또는 CD69를 발현하는, 활성화되는 세포를 생성하는 과정에서 사용된다.
용어 "치료 TCR" 또는 "치료 TCR 유전자"는 소망하는 기능성을 매개하는, 예를 들어 숙주의 면역계가 질환에 대해 싸우는 것을 용이하게 할 수 있는 TCRα 및 TCRβ 쇄의 특정 조합을 지칭할 수 있다. 치료 TCR 유전자는 파지-, 효모- 또는 T 세포-디스플레이 시스템에 의해 재조합체 TCR 라이브러리로서 발현되는 시험관내 돌연변이된 TCR 쇄로부터 선택될 수 있다. 치료 TCR 유전자는 자가 또는 동종이계일 수 있다.
용어 "관심 단백질"은 본원에 기재된 일부 실시양태에 따라 세포의 생존 및/또는 증식을 위해 필수적인 단백질과 함께 발현되어야 하는 임의의 단백질을 지칭할 수 있다. 관심 단백질은 세포에 대해 외인성일 수 있다. 관심 단백질은 세포에 의해 자연적으로 발현되지만, 과잉발현되어야 하는 단백질일 수 있다. 단백질은 치료, 진단, 조사, 또는 임의의 다른 목적을 위해 관심일 수 있다. 관심 단백질의 예는 TCR, 키메라-항원 수용체, 스위치 수용체, 사이토카인, 효소, 성장 인자, 항체, 및 이의 변형된 버전을 포함한다.
"유전적으로 조작된 세포"는 생물공학을 사용하여 이의 유전자 구성에서 변화를 갖는 세포이다. 이러한 변화는 개선된 또는 신규 유기체 또는 유기체 내에서 개선된 또는 신규 기능성을 생산하기 위한 종 경계의 내부 및 이를 교차하는 유전자의 전달, 새로운 천연 또는 합성 유전자의 도입, 또는 천연 유전자의 제거를 포함한다. 새로운 DNA는 재조합체 DNA 방법을 사용하여 관심 유전자 물질을 단리시키고 복제함으로써 또는 DNA를 인공적으로 합성함으로써 얻어진다. 단리된 또는 합성된 DNA는 유전적으로 조작된 세포 내로의 도입 전에 변형될 수 있다.
"유전적으로 조작된 T 세포"는 생물공학을 사용하여 이의 유전자 구성에서 변화를 갖는 T 세포이다.
"링커"는 단백질 또는 폴리펩티드의 맥락에서 사용될 때, 2 개 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 도메인, 영역, 또는 모티프를 연결하고 2 개 하위-결합 도메인의 상호작용과 양립가능한 스페이서 기능을 제공할 수 있어, 생성된 폴리펩티드가 특정 기능 또는 활성을 함유하는 아미노산 서열을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 링커는 약 2 내지 약 35 개 아미노산 또는 2-35 개 아미노산, 예를 들어 약 4 내지 약 20 개 아미노산 또는 4-20 개 아미노산, 약 8 내지 약 15 개 아미노산 또는 8-15 개 아미노산, 약 15 내지 약 25 개 아미노산 또는 15-25 개 아미노산으로 구성된다. 일부 실시양태에서, 링커는 글리신 및/또는 세린 아미노산이 풍부할 수 있다.
"단백질 인트론"으로도 알려진 "인테인"은 인접 잔기를 결합할 수 있는 단백질 세그먼트 또는 세그먼트들이다. 일부 실시양태에서, 인테인은 단백질 스플라이싱 동안 그 자체를 절단하고/하거나 전구체 폴리펩티드의 나머지 부분을 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인테인은 펩티드 결합을 통해 다른 잔기와 함께 결합한다. "스플릿 인테인"은 전구체 단백질의 인테인이 적어도 2 개 유전자로부터 유래되는 경우를 지칭한다.
용어 "비기능적"은 활성이 없거나 극심하게 감소된 활성을 갖는 분자, 아미노산, 아미노산들, 뉴클레오티드, 뉴클레오티드들, 도메인, 단백질 세그먼트, 단백질, RNA, RNA 세그먼트, DNA, 또는 DNA 세그먼트를 지칭한다.
용어 "기능장애"는 예상되거나 완벽한 방식으로 기능할 수 없고 이상 활성을 갖거나 갖지 않을 수 있는 분자, 아미노산, 아미노산들, 뉴클레오티드, 뉴클레오티드들, 도메인, 단백질 세그먼트, 단백질, RNA, RNA 세그먼트, DNA, 또는 DNA 세그먼트를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "신생항원"은 종양-특이적 게놈 돌연변이로부터 유래된 항원을 지칭한다. 예를 들어, 신생항원은 비-동의 단일 뉴클레오티드 돌연변이로 인한 종양 샘플에서 돌연변이된 단백질의 발현 또는 돌연변이 유도된 프레임-시프트로 인한 대안적 개방 판독 프레임의 발현으로부터 야기될 수 있다. 따라서, 신생항원은 병리학적 병태와 연관될 수 있다. 일부 실시양태에서, "돌연변이된 단백질"은 정규 아미노산 서열의 동일한 위치에서의 아미노산과 상이한 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 단백질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이된 단백질은 정규 아미노산 서열에 대해 판독 프레임 시프트로부터 야기되는 아미노산의 삽입, 결실, 치환, 포함, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. "PTM 신생항원"은 종양 특이적이지만, 게놈 돌연변이를 기초로 하지 않는 항원을 지칭한다. PTM 신생항원의 예는 포스포-신생항원 및 글리칸-신생항원을 포함한다.
"CRISPR/Cas9"는 유전학자 및 의학 연구원이 DNA 서열의 섹션을 제거하거나, 첨가하거나 변경함으로써 게놈의 부분을 편집하게 할 수 있는 기술이다. CRISPR/Cas9 시스템은 DNA 내로 변화를 도입하는 2 개의 핵심 분자: 게놈내 특정 위치에서 DNA의 2 개 가닥을 절단할 수 있는 "분자 가위"의 쌍으로서 작용하여, 소량의 DNA가 그 다음에 첨가되거나 제거될 수 있는, Cas9로 지칭되는 효소; 긴 RNA 스캐폴드 내에 위치한 사전-설계된 RNA 서열(약 20 개 염기 길이)의 작은 조각으로 구성되는, 가이드 RNA(gRNA)로 지칭되는 RNA의 조각으로 구성된다. 스캐폴드 부분은 DNA에 결합하고 사전-설계된 서열은 Cas9를 게놈의 우측 부분으로 "안내한다". 이는 Cas9 효소가 게놈에서 우측 지점에서 절단되는 것을 보장한다. 리보핵단백질(RNP)은 리보핵산 및 RNA-결합 단백질의 복합체이다. 통상의 기술자는 Cas9 이외의 CRISPR 시스템이 본원에 기재된 다양한 실시양태에서 동등하게 사용될 수 있으며 용어 "CRISPR"이, 상기 용어가 기술, 시스템, 또는 방법을 지칭하기 위해 사용될 때, 이러한 시스템의 속을 지칭한다는 것을 인식할 것이다.
CRISPR 간섭(CRISPRi)은 원핵생물 및 진핵생물 세포에서 유전자 발현의 서열-특이적 억제를 허용하는 유전자 섭동 기술이다.
"TALEN", 또는 전사 활성자-유사 이펙터 뉴클레아제는 DNA의 특정 서열을 절단하기 위해 조작될 수 있는 제한 효소이다. 이들은 TAL 이펙터 DNA-결합 도메인을 DNA 절단 도메인(DNA 가닥을 절단하는 뉴클레아제)에 융합함으로써 제조된다. 전사 활성자-유사 이펙터(TALE)는 사실상 임의의 소망하는 DNA 서열에 결합하도록 조작될 수 있어, 뉴클레아제와 조합될 때, DNA는 특정 위치에서 절단될 수 있다.
"MegaTAL"은 전사 활성자-유사(TAL) 이펙터의 DNA 결합 영역이 사용되어, 단일 소망하는 게놈 표적 부위에 인접한 부위-특이적 메가뉴클레아제를 주소지정하는 단일-쇄 희귀-절단 뉴클레아제 시스템이다. 이 시스템은 극히 활성이고 초-특이적인 소형 뉴클레아제의 생성을 허용한다.
"siRNA", 때때로 단간섭 RNA 또는 스플라이싱 RNA로 알려진 소간섭 RNA는 통상적으로 길이가 20-27 개 염기 쌍이고, miRNA와 유사하고, RNA 간섭(RNAi) 경로 내에서 작동하는 이중-가닥 RNA 비-코딩 RNA 분자의 클래스이다. 이는 전사 후 mRNA를 분해하고 번역을 예방함으로써 상보성 뉴클레오티드 서열로 특정 유전자의 발현을 방해한다.
"miRNA"(마이크로RNA)는 식물, 동물 및 일부 바이러스에서 발견되는 작은 비-코딩 RNA 분자(약 22 개 뉴클레오티드를 함유함)이며, 이는 RNA 스플라이싱 및 유전자 발현의 전사후 조절에서 기능한다. miRNA는 miRNA 분자 내에서 상보성 서열과의 염기-페어링을 통해 기능한다. 결과적으로, 이들 mRNA 분자는 침묵된다.
다양한 실시양태
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 유전적으로 조작된 세포의 풍부화를 위한 선택 방법이다. 방법은 세포의 생존 및/또는 증식을 위해 필수적인 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 게놈 유전자좌에서 게놈 녹-아웃을 도입하는 단계를 포함한다. 도 27a "필수 유전자 녹아웃"을 참고한다. 방법은 또한 세포에서 발현을 위해 작동가능하고 적어도 세포의 생존 및/또는 증식을 위해 필수적인 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 도입하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 선택은 외인성 선택 압력 없이 달성된다. "외인성 선택 압력"은 세포의 선택을 허용하는 정상 배양 배지에 첨가된 보충제이다. 외인성 선택 압력은 단백질 또는 세포 과정을 억제하거나 활성화시키는 분자(예를 들어, 약물 분자, 예컨대 메토트렉세이트), 세포의 구성요소에 결합하여, 구성요소를 갖지 않는 세포로부터 구성요소를 갖는 세포의 물리적, 광학적, 또는 자성 분류를 허용하는 분자(예를 들어, 유세포분석 또는 자성 비드 풍부화에 의한 풍부화를 허용하는 항체), 또는 세포 배양 배지에 첨가되어, 변형을 갖지 않는 것으로부터 변형을 갖는 세포의 증식을 차별적으로 촉진할 수 있는 분자일 수 있다. 일부 바람직한 실시양태에서, 외인성 선택 압력은 약리학적 외인성 선택 압력(예를 들어, 메토트렉세이트)이다. 일부 실시양태에서, 재-도입된 유전자는 유전적으로 녹-아웃되지만, 뉴클레오티드 서열에서 변경되어, 뉴클레아제 저항성을 달성하고, 이에 의해 돌연변이체 단백질, 예컨대 DHFR 단백질의 사용을 회피하게 하는 내인성 유전자와 아미노산 서열이 동일하다. 일부 실시양태에서, 도입된 뉴클레오티드 서열은 세포의 게놈 내로 통합될 필요가 있다(즉, 트랜스유전자의 안정적 발현을 위한 요구사항). 필수 단백질을 코딩하는 유전자는 관심 유전자좌 내로 통합될 수 있다. 도 27b "관심 유전자좌 내로의 변경된 필수 유전자 녹인"을 참고한다.
일부 실시양태에서, 방법은 유전적으로 조작된 T 세포의 풍부화를 위한 것이다. 방법은 T 세포의 내인성 DHFR 유전자의 뉴클레아제-매개된 녹-아웃을 도입하는 단계, 및 T 세포 수용체 알파 쇄, T 세포 수용체 베타 쇄 및 DHFR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 T 세포 게놈 내로 도입하되, T 세포 수용체 알파 쇄, T 세포 수용체 베타 쇄 및 DHFR이 모두 동시에 발현되도록 작동가능하게 연결되는 것인, 단계를 포함한다. 도 2를 참고한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 선택 방법 중 임의의 것은 항원 특이성이 세포 요법에 대해 재지시된 유전적으로 조작된 T 세포의 풍부화를 위해 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이는 고형 암의 치료를 위해 완전 개인화된 조작된 TCR 요법에 대해 사용될 수 있다. 이를 허용하기 위해, 이 방법은 개별 환자 기반으로 종양 생검으로부터 신생항원 특이적 TCR 유전자의 확인을 허용하는 많은 방법에 포함될 수 있다. 이들의 확인 후, 이러한 신생항원 TCR 유전자는 그 다음에, 비제한적으로, CRISPR 뉴클레아제-매개된 유전자 녹-인을 포함하는 임의의 기술을 통해 부모 T 세포 내로 도입될 수 있고, 이에 의해 종양 신생항원을 향해 T 세포의 항원 특이성을 재지시할 수 있다. 최종적으로, 유전적으로 조작된 T 세포는 정맥내 주입을 통해 환자에 다시 투여될 수 있다.
최대 치료 효능을 허용하기 위해, 환자에 다시 투여되는 유전적으로 조작된 T 세포의 큰 분획이 관심 신생항원 특이적 TCR 유전자를 발현하는 것이 유용하다. TCR 유전자 녹-인의 효율은 일반적으로 10-30% 범위이기 때문에, 세포 주입 전에 성공적으로 조작된 세포를 풍부화시킬 수 있는 선택 방법이 유용하다. 일부 실시양태에서, 이러한 선택 방법은 TCR 녹-인을 위해 필요한 동일한 분자 구성요소를 사용하게 할 수 있으며, 이는 추가 실험 절차가 T 세포 제조 과정을 위해 요구되지 않는다는 것을 의미한다. 이는 본원에 제공된 다양한 실시양태 중 일부에 의해 달성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 선택 마커로서 사용되는 내인성 유전자(예를 들어, DHFR)가 녹-인으로서 도입되는 경우, 특정 유전자에 대한 유전자 녹아웃을 갖는 세포를 풍부화시키기 위한 전략이 또한 적용가능하다. 일부 실시양태에서, CRISPR/Cas9 리보핵단백질(RNP)(또는 다른 CRISPR 시스템을 포함하는 임의의 다른 뉴클레아제)이 사용되어, 필수 내인성 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 유전자를 녹-아웃시킬 수 있다. 도 2 상부 패널을 참고한다. 제2 CRISPR/Cas9 RNP가 사용되어, 치료 TCR 유전자 및 CRISPR/Cas9 뉴클레아제-저항성 DHFR 유전자를 함유하는 구축물을 내인성 TCR 유전자좌 내로 녹-인시킬 수 있다. 도 2 하부 패널을 참고한다. 이와 같이, TCR 유전자 구축물의 성공적인 녹-인을 갖는 세포는 다른 DHFR 녹-아웃 세포에 대해 강한 생존 이점을 얻을 것이고 시간에 따라 풍부화될 것이다. 본원에 제공된 일부 실시양태가 사용되어, (1) 유전자 전달 방법, (2) 트랜스유전자의 성질 및 (3) 표적 세포 유형과 독립적으로 유전적으로 변형된 세포를 풍부화시킬 수 있다. DFHR 관련된 경로가 도 1에 나타나 있다. DHFR/메토트렉세이트(MTX) 선택이 다중 증폭에 대해 사용되어, 높은 재조합체 단백질 생산 클론을 단리시킨다. DHFR은 폴레이트를 세포 증식을 위한 드노보(de novo) 뉴클레오티드 합성 경로에서 필수 전구체인 테트라하이드로폴레이트로 전환하는 환원효소이다. DHFR이 억제될 때, 세포는 추가 보충제(하이포크산틴 및 티미딘(HT)) 없이 증식할 수 없다. 따라서, DHFR 선택 시스템은 통상의 기술자가 녹인 세포를 선택할 수 있는 지점을 제공한다. 유전자 구축물의 실시양태가 도 2에 나타나 있다. 일부 실시양태에서, 이 풍부화 전략에 대해, 통상의 기술자는 내인성 DHFR을 녹아웃시키고 치료 트랜스유전자(TCRβ 및 TCRα)와 함께 이를 재도입할 수 있다. DHFR 녹아웃을 갖는 세포는 증식을 중지하고/하거나 사멸될 것이고 재-도입된 DHFR을 갖는(트랜스유전자 TCRβ 및 TCRα와 함께) 세포만이 증식 및/또는 생존을 계속할 수 있으며, 따라서 풍부화될 것이고; 재도입된 DHFR은 뉴클레아제-저항성이지만 야생형 DHFR과 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 도 2에서의 실시양태에 대해, 이는 통상의 기술자가 전기천공 동안 3 개 구성요소를 공동-전달하게 한다:
1. 녹인 동안 TRAC 유전자좌를 절단하기 위한 TRAC RNP
2. 내인성 DHFR을 녹아웃시키기 위한 DHFR RNP
3. 1G4-TCR 및 sgRNA-저항성 DHFR을 포함하는 선형 dsDNA 주형. DHFR 녹아웃 세포에 대해, 부수적 sgRNA-저항성 DHFR 녹인을 갖는 세포만이 정상 배지에서 증식될 수 있음.
상기 나타낸 바와 같이, DHFR은 퓨린 뉴클레오티드의 합성 동안 디하이드로폴레이트를 테트라하이드로폴레이트로 전환하는 필수 효소이다(예를 들어, 도 1 참고). 이와 같이, DHFR의 녹-아웃은 DNA 합성 및 수선을 억제하고, 고도로 증식성인 세포, 예컨대 T 세포의 성장을 우선적으로 손상시킨다. 이를 기초로 하여, 예를 들어 세포가, 내인성 DHFR 유전자를 녹 아웃/억제하는 CRISPR/Cas9 RNP 복합체(또는 대안적으로, 임의의 다른 관련 시스템)로 전기천공될 수 있는, 본 유전자-편집 풍부화 전략이 제공되었다. 동시에, 세포는 RNP 복합체가 결합할 수 없는 침묵 돌연변이를 함유하는, 신생항원 TCR 및 뉴클레아제-저항성 DHFR 유전자를 코딩하는 DNA 수선 주형과 함께 내인성 TCR알파 불변(TRAC) 유전자를 표적화하는 RNP 복합체로 전기천공된다. 뉴클레아제-저항성 DHFR 유전자가 항상 도입된 TCR과 공동-발현되는 것을 보장하기 위해, DNA 수선 주형은 TCR베타-2A-뉴클레아제-저항성 DHFR-2A-TCR알파의 순서로 설계될 수 있어, 3 개 단백질은 자가-절단 2A 펩티드를 사용하여 단일 개방 판독 프레임으로부터 발현될 수 있다.
일부 실시양태에서, TRAC RNP 및 DNA 수선 주형의 전기천공 후 10 일에, T 세포의 20% ± 10%는 도입된 TCR 유전자의 성공적인 녹-인을 나타낸다. 특히, 이는 예를 들어, DHFR RNP가 동시에 전기천공될 때, T 세포의 73% ± 12%까지 증가할 수 있다. 이는 기능적 DHFR이 T 세포 생존을 위해 유용하고 뉴클레아제-저항성 DHFR 유전자의 녹-인이 사용되어, 예를 들어 10 일의 배양 기간 동안 ~5 배로 성공적인 TCR 녹-인을 갖는 T 세포의 빈도를 풍부화시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
본원의 실시예에 나타낸 바와 같이, DHFR 선택 전략은 녹인 세포를 효율적으로 풍부화시킬 수 있다. 그러나, sgRNA로 DHFR을 녹아웃시키는 것은 내인성 DHFR 유전자좌를 영구적으로 변경할 수 있다. 또한, 이는 비특이적 비-표적 편집을 도입할 수 있다. 일부 실시양태에서, sgRNA는 siRNA로 치환되어, 내인성 DHFR 발현을 일시적으로 억제하거나, T 세포 발현 동안 임상적으로 승인된 DHFR 억제제인 메토트렉세이트로 치환될 수 있다.
현재 기술을 기초로 하는 몇몇 선택은 유전자-변형된 세포의 풍부화를 위해 사용될 수 있다. 대부분의 시스템은 도입된 트랜스유전자 또는 도입된 마커(예를 들어, EGFR 및 LNGFR과 같은 표면 분자의 절단된 돌연변이체)에 대한 항체 결합을 기초로 하는 변형된 세포의 선택에 의존한다. 이러한 시스템은 제시된 옵션과 근본적으로 상이하며, 이는 이들이 유전적으로 변형된 세포를 풍부화시키기 위해 전용 공정 단계, 시약 및/또는 장비를 요구하기 때문이다.
유전적으로 변형된 세포에 대한 현재 기술을 기초로 하는 선택 시스템과 비교하여, 본 실시양태 중 일부는 다음 중 하나 이상을 포함하는 상당한 이점을 제공한다:
1. 선택을 허용하기 위한 외인성 유전자 서열의 도입이 요구되지 않음: 표면 마커(예를 들어, 절단된 EGFR), 약물 저항성(예를 들어, 메토트렉세이트) 또는 항생제 저항성(예를 들어, 퓨로마이신 또는 블라스티시딘) 매개된 선택을 기초로 하는 대안적 시스템과 달리, 외인성 유전자 서열이 트랜스유전자 이외의 세포 내로 도입되지 않는다. 일부 실시양태에서, 선택은 트랜스유전자와 결합하여 비변경된 아미노산 서열로 재-도입되는 필수 내인성 유전자의 유전자 녹아웃만을 기초로 한다.
2. 유전적으로 조작된 세포의 물리적 선택에 대한 요구가 없음: 당업계에서의 다른 방법과 달리, 발명은 항체-매개된 풍부화(예를 들어, 유세포분석 분류 또는 자성 비드 풍부화에 의함)를 요구하지 않는다. 선택은 트랜스유전자 카세트를 발현하지 않는 세포에서 필수 유전자의 기능의 발현의 손실 또는 억제에 의해 달성되는 한편, 유전적으로 조작된 세포에서의 기능은 트랜스유전자 카세트에 의해 회복된다.
3. 세포 내인성 단백질의 돌연변이체에 대한 요구가 없음: DHFR을 기초로 하는 이전에 기재된 선택 시스템은 메토트렉세이트-저항성 DHFR 돌연변이체의 생성 및 도입을 기초로 한다. DHFR 돌연변이체의 변형된 아미노산 서열은 잠재적으로 면역원성이고 입양 전이 후 세포 거절을 용이하게 할 수 있다. 또한, T 세포의 맥락에서, 유전적으로 조작된 T 세포는 메토트렉세이트에 대해 저항성이 될 것이다. 이는 바람직하지 않으며, 이는 메토트렉세이트가 자가면역 질환을 치료하기 위해 일반적으로 사용되기 때문이다. 돌연변이체 단백질 버전에 대한 요구의 결여는 DHFR에 비해 다른 필수 유전자를 이용한 시스템의 사용을 크게 용이하게 한다. 원칙적으로, 본원에 제공된 관련 다양한 실시양태는 유전자-변형된 세포의 생존을 위해 필수적인 임의의 유전자에 적용될 수 있다.
4. 트랜스유전자 손실에 대한 감소된 위험: 세포 생존을 위해 트랜스유전자 발현을 유지하기 위한 선택적 압력으로 인해, 트랜스유전자의 발현이 필수 단백질 또는 저항성 단백질의 발현을 달성하기 위해 요구되기 때문에, 예를 들어 프로모터 침묵을 통한 트랜스유전자 발현의 손실이 감소될 수 있는 것이 가능하다.
5. 복합 유전자 페이로드(payload)와 양립가능함: 개시된 발명은 단일 유전자좌로부터의 3 개 외인성 도입된 단백질(TCR알파, TCR베타 및 DHFR)을 발현하는 세포의 풍부화를 가능하게 한다. 특히, 더욱 많은 단백질의 발현이 추가 2A 펩티드 서열 또는 IRES 요소를 사용함으로써 공동-풍부화될 수 있다는 것이 이해된다. 또한, 발명은 공동-발생 유전자 조작 이벤트, 예를 들어 2 개의 2-부분 뉴클레오티드 서열(각각 다중 외인성 도입된 단백질을 코딩할 수 있음)의 발현으로 변형된 유전적으로 조작된 세포를 선택하게 한다.
본원에 나타낸 바와 같이, 일부 실시양태는 이들 기재된 이점 중 5 개 전부에 비해 적을 수 있다(예를 들어, 이들 이점 중 하나, 2, 3, 또는 4 개). 예를 들어, (1) 내인성 DHFR이 녹 아웃되는 실시양태에서, 녹-인 DHFR은 야생형 DHFR일 수 있고, (2) 내인성 DHFR이 메토트렉세이트에 의해 억제되는 실시양태에서, 동일한 유전자좌로부터 외인성 발현된 요소를 이용한 선택 압력을 유지하는 동안 메토트렉세이트-저항성 DHFR 또는 분열-DHFR이 사용될 수 있다. 이들 실시양태 및 이점의 집합 각각은 본 발명의 다양한 실시양태와 일치하고 이에 반영된다. 본 발명은 다중 및 다양한 발명을 제공하고 하나의 발명의 요소 전부가 다른 발명을 위해 요구되는 것은 아니라는 것이 통상의 기술자에 의해 인식될 것이다. 따라서, 전부가 아닌(또는 필수적으로 임의의) 본원에 개시된 발명은 상기 실시양태 중 하나 이상을 필수적으로 가질 것이다. 통상의 기술자는 본 발명, 이의 지식, 및/또는 발명 그 자체에 대해 제공된 특정 요소를 고려하여 발명이 상기 이점을 가질 것인지를 결정할 수 있을 것이다.
일부 실시양태에서, siRNA, shRNA, miRNA, 또는 CRISPRi-저항성 DHFR 유전자 변이체를 함유하는 TCR 유전자 구축물 발현과 조합하여 siRNA, shRNA, miRNA, 또는 CRISPR 간섭(CRISPRi) 기술을 사용한 내인성 DHFR의 녹-다운이 내인성 게놈 유전자좌의 영구적 유전자 녹-아웃 대신에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, MTX-저항성 DHFR 유전자를 함유하고 내인성 프로모터, 내인성 스플라이스 부위, 및 내인성 종결 신호로부터의 발현을 가능하게 하기 위해 유전자좌의 엑손 내로 인-프레임 통합되는 트랜스유전자 카세트의 발현과 조합하여 메토트렉세이트(MTX)를 사용한 내인성 DHFR의 억제가 이용될 수 있다.
일부 실시양태에서, MTX-저항성 DHFR 유전자 변이체를 함유하는 TCR 유전자 구축물 발현과 조합하여 메토트렉세이트(MTX)를 사용한 내인성 DHFR의 억제가 이용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 유전자가 세포의 생존 및/또는 증식을 위해 필수적인 것을 조건으로, 선택 원리는 DHFR 이외의 다른 유전자에 대해 적용가능하다.
일부 실시양태에서, 내인성 DHFR은 뉴클레아제에 의해 녹 아웃되거나 녹 다운되고; 치료 유전자가 뉴클레아제-저항성 DHFR 변이체 재-도입에 결합되는 것을 조건으로, 선택 원리는 임의의 다른 치료 유전자에 적용가능하다.
일부 실시양태에서, 선택 원리는 또한 다른 세포 유형, 예를 들어 조혈 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, iPSC, 신경 전구 세포, 섬유아세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 및 망막 유전자 요법에서의 세포 유형 등에 적용가능하다.
일부 실시양태에서, 트랜스유전자는 HDR에 의한 뉴클레아제-매개된 부위-특이적 통합 이외의 다른 경로, 소위 전이인자-매개된 유전자 전달, 미량주사, 리포솜/나노입자-매개 유전자 전달, 바이러스-매개된 유전자 전달, 전기천공, 또는 기계적 또는 화학적 막 투과화를 기초로 하는 방법으로 전달될 수 있다.
일부 실시양태에서, 억제된 기능을 회복시키거나 선택적 압력에 대해 저항성을 제공하는 단백질은 i) 세포 내에서 작동가능하게 조합될 수 있는 2 이상의 부분으로 분열될 수 있고 ii) 각각의 부분은 모든 트랜스유전자 카세트와 동시에 성공적으로 조작된 세포에 대한 선택을 허용하기 위해 트랜스유전자 카세트에 연결된다. 일부 실시양태에서, 억제된 기능을 회복시키는 단백질은 다이머화 도메인에 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 다이머화 도메인은 GCN4, Fos, Jun, 또는 FKBP12 단백질로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, 다이머화는 류신-지퍼 모티프를 사용하여 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 다이머화는 스플릿 인테인 단백질을 사용함으로써 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 다이머화 도메인은 변형될 수 있으며(예를 들어, 아미노산 서열에 대한 변경을 가짐), 이는 내인성 단백질과의 다이머화를 감소시키거나 예방하고, 외인성 단백질과의 다이머화 및/또는 결합을 촉진한다. 일부 실시양태에서, 다이머화 도메인은 변형되어(예를 들어, 아미노산 서열에 대한 변경을 가짐), 다이머화 도메인의 특징(예를 들어, 유도성 다이머화)을 첨가, 제거, 및/또는 변형할 수 있다.
일부 실시양태에서, 트랜스유전자 카세트의 상이한 설계, 예를 들어 6 개 상이한 배향이 이용될 수 있다:
외인성 단백질 1-2A-외인성 단백질 2-2A-선택 이점 단백질
외인성 단백질 1-2A-선택 이점 단백질-2A-외인성 단백질 2
외인성 단백질 2-2A-외인성 단백질 1-2A-선택 이점 단백질
외인성 단백질 2-2A-선택 이점 단백질-2A-외인성 단백질 1
선택 이점 단백질-2A-외인성 단백질 1-2A-외인성 단백질 2
선택 이점 단백질-2A-외인성 단백질 2-2A-외인성 단백질 1
(임의의 2A 요소를 기초로 함)
일부 실시양태에서, 트랜스유전자 카세트의 상이한 설계, 예를 들어 TCRa, TCRb 및 DHFR의 6 개 상이한 배향이 이용될 수 있다:
TCRa-2A-TCRb-2A-DHFR
TCRa-2A-DHFR-2A-TCRb
TCRb-2A-TCRa-2A-DHFR
TCRb-2A-DHFR-2A-TCRa
DHFR-2A-TCRa-2A-TCRb
DHFR-2A-TCRb-2A-TCRa
(임의의 2A 요소를 기초로 함)
일부 실시양태에서, 2-부분 뉴클레오티드 서열은 유전자좌의 엑손 내로 인-프레임 통합되어, 내인성 프로모터, 내인성 스플라이스 부위, 및 내인성 종결 신호로부터의 발현을 가능하게 한다.
일부 실시양태에서, 2-부분 뉴클레오티드 서열은 제1 단백질, 제2 단백질 또는 둘 다의 발현을 가능하게 하는 그 자신의 외인성 프로모터와 함께 통합된다.
일부 실시양태에서, TCRa- 및 TCRb-쇄는 내인성 TCR 프로모터에 의해 구동될 것인 한편, DHFR 단백질은 외인성 유도된 프로모터로부터 구동될 것이고 트랜스유전자 카세트는 다음 설계 중 하나를 갖는다:
TCRa-2A-TCRb-pA-프로모터-DHFR-pA
TCRb-2A-TCRa-pA-프로모터-DHFR-pA
TCRa-2A-TCRb-pA-프로모터-DHFR-2A(내인성 TRAC pA 사용)
TCRb-2A-TCRa-pA-프로모터-DHFR-2A (내인성 TRAC pA 사용)
적어도 2-부분 뉴클레오티드 서열의 요소는 동일하거나 상이한 프로모터로부터 발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, 요소는 동일한 프로모터로부터 발현되고 유전자 링커(각각의 요소는 단백질로서 별도로 발현됨) 또는 단백질 링커(연결된 요소는 단일 단백질로서 발현되고, 이는 번역 후 절단되거나 그렇지 않을 수 있음)에 의해 연결된다. 유전자 링커의 예는 IRES 요소이다. 단백질 링커의 예는 2A 또는 gly-ser 링커를 포함한다. 단백질은 또한 요소 사이에 임의의 링커 없이 융합 단백질로서 발현될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 중 임의의 것은 유전적으로 변형된 T 세포의 풍부화에 대한 사용을 포함할 수 있다. 상기 T 세포에서, 필수 단백질은 억제되어, 동일한 필수 단백질 또는 이의 변이체를 코딩하는 유전적으로 조작된 뉴클레오티드가 상기 세포 내로 재-도입되지 않는 경우, 세포는 생존하거나 증식할 수 없다. 필수 단백질의 성공적 재-도입을 갖는 T 세포는 다른 녹-아웃 세포에 대해 강한 생존 이점을 얻을 것이고 시간에 따라 풍부화될 것이다. 이는 (1) T 세포 수용체 및 키메라 항원 수용체를 포함한 임의의 트랜스유전자뿐 아니라, T 세포의 표현형 및/또는 기능을 변형하기 위한 외인성 유전자(예를 들어, 우성 음성 TGFbeta 수용체, 스위치 수용체 등)의 도입 및/또는 (2) 임의의 T 세포 서브세트(나이브(
) T 세포, 기억 T 세포, 종양 침윤 림프구(TIL) 등)의 사용을 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 상이한 세포 유형 내로 광범위한 트랜스유전자를 전달하기 위해 일반적으로 적용가능하다. 이는 선택 마커로서 사용된 내인성 유전자가 세포 내로 재-도입되는 것을 조건으로 광범위한 유전자-변형(유전자 녹아웃, 녹-인 등)을 풍부화시키기 위해 적용가능하다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은
치료 TCR 또는 CAR 유전자를 발현하는 CRISPR 뉴클레아제 유전자-편집된 T 세포의 풍부화를 위한 해법,
유전적으로 조작된 T 세포의 풍부화를 위한 해법,
항체의 사용 없이 선택을 허용하는 방법,
복합체 및 다중 트랜스유전자 전달을 허용하는 방법
중 하나 이상을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 중 임의의 것은 종양학 이외의 모든 치료 영역, 예컨대 바르트 증후군(Barth syndrome), β-지중해빈혈, 낭포성 섬유증, 듀켄씨근이영양증(Duchenne muscular dystrophy), 혈우병, 낫형세포병, 자가면역 및 감염성 질환에서 유전적으로 조작된 세포의 풍부화를 위해 적용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 뉴클레아제 및 sgRNA를 발현하기 위해 벡터를 사용하는 것을 요구하지 않는다. 일부 실시양태에서, DNA 벡터 대신에 리보핵단백질 복합체(뉴클레아제 단백질 + 가이드 RNA)가 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 이 접근법은 뉴클레아제 및 sgRNA의 일시적 발현을 야기할 수 있을 뿐이다. 이는 게놈에서의 영구적 통합을 회피하는 것을 허용하며, 이는 1) 유전자 파괴를 야기할 수 있는 무작위 통합 및 2) 세포에 대해 면역원성이거나 독성일 수 있는 뉴클레아제의 연속 발현을 회피하는 것을 허용한다.
일부 실시양태에서, 2-부분 뉴클레오티드 서열은 플라스미드-, 전이인자- 또는 바이러스-매개된 무작위 게놈 통합에 의해 매개된 게놈 통합에 의해 세포에서 발현된다. 일부 실시양태에서, 2-부분 뉴클레오티드 서열은 세포의 게놈 내로의 표적화된 부위-특이적 통합에 의해 발현된다. 일부 실시양태에서, 표적화된 부위-특이적 통합은 DNA 파괴의 상동성-지시된 수선에 의해 달성된다. 이는 플라스미드 또는 바이러스가 표적 세포의 게놈 내로 무작위로 통합될 수 있기 때문에 바람직할 수 있다. 일부 실시양태에서, 2-부분 뉴클레오티드 서열은 선형 이중-가닥 DNA, 단일-가닥 DNA, 나노-플라스미드, 아데노-연관 바이러스(AAV) 또는 상동성-지시된 수선을 위해 적합한 임의의 다른 바이러스, 원형, 선형 주형이다. 선형 이중-가닥 DNA는 개방-말단 또는 폐쇄-말단일 수 있다.
일부 실시양태에서, 방법은 트랜스유전자 및 카고(cargo) 발현을 구동하기 위해 별도 프로모터를 사용하지 않으며, 이는 본 수선 주형이 게놈의 특정 부위 내로 통합될 것이고, 따라서 내인성 프로모터가 이의 발현을 구동할 것이기 때문이다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 뉴클레아제 또는 염기 편집자를 필수적으로 요구하지 않는다. 대신에, siRNA, shRNA, miRNA, 또는 CRISPRi가 작동할 것이다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 뉴클레아제의 영구적 통합을 회피하는 2-벡터 시스템을 사용한다. 이는 뉴클레아제의 연속 발현이 독성일 수 있기 때문에 유용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 2 개 프로모터가 사용될 필요는 없으며, 하나가 트랜스유전자의 발현을 결합하고 유전자를 구제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이는 트랜스유전자가 덜 손실되게 할 수 있기 때문에, 유익할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원의 다양한 실시양태는 다음 중 하나 이상을 극복할 수 있다: 유전자 녹인 효율이 낮은(예를 들어, 20% 미만), 녹인 세포 선택을 허용하는 T 세포 공여체 주소지정. cGMP-제조 요구사항에 더욱 적합한 접근법. 세포에 대한 항생제 선택 마커 첨가 회피 또는 추가 항체 선택 방법에 대한 세포 노출.
본원에 기재된 일부 실시양태는 유전적으로 조작된 세포의 풍부화를 위한 방법에 관한 것이다. 방법은 i) 세포가 정상 시험관내 증식 조건 하에 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 세포의 생존 및/또는 증식을 위해 필수적인 적어도 제1 단백질의 활성을 감소시키는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 ii) 세포에서 발현을 위해 작동가능하고 제1 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 제2 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 2-부분 뉴클레오티드 서열을 도입하되, 제2-부분 단백질이 세포에 대해 외인성인 것인, 단계; 및 iii) 제1 단백질 및 제2 단백질 둘 다를 발현하는 세포의 풍부화를 위한 정상 시험관내 증식 조건 하에 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단계 iii)은 제1 단백질 및 제2 단백질 둘 다를 발현하는 세포의 풍부화를 야기하는 시험관내 증식 조건 하에 세포를 배양하는 단계일 수 있다.
이들 실시양태에서, 제1 단백질은 세포의 생존 및/또는 증식을 위해 필수적이다. 필수 또는 제1 단백질은 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 이노신 모노포스페이트 탈수소효소 2(IMPDH2), O-6-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라아제(MGMT), 데옥시시티딘 키나아제(DCK), 하이포크산틴 포스포리보실트랜스퍼라아제 1(HPRT1), 인터류킨 2 수용체 서브유닛 감마(IL2RG), 액틴 베타(ACTB), 진핵생물 번역 신장 인자 1 알파 1(EEF1A1), 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH), 포스포글리세레이트 키나아제 1(PGK1) 또는 트랜스페린 수용체(TFRC)일 수 있다. 필수 단백질의 활성은 뉴클레오티드 또는 단백질 수준에서 억제될 수 있다. 필수 단백질의 활성이 억제되는 경우, 세포는 물질이 배양 배지에 첨가되거나 동일한 필수 단백질을 코딩하는 유전적으로 조작된 뉴클레오티드가 상기 세포 내로 재-도입되지 않는 경우, 정상 시험관내 증식 조건 하에서 더 이상 생존하거나 증식할 수 없다. 예를 들어, DHFR이 억제될 때, 세포는 추가 보충제(하이포크산틴 및 티미딘(HT)) 없이 증식하거나 기능적 DHFR을 상기 세포 내로 재-도입할 수 없다.
2-부분 뉴클레오티드 서열의 제1 부분은 필수 단백질을 코딩하며, 이는 변경된 뉴클레오티드 또는 단백질 서열을 가져, 이는 내인성 필수 단백질의 활성을 억제하기 위해 사용된 물질에 대해 저항성일 수 있을 뿐 아니라, 선택된 시험관내 증식 조건 하에 생존하거나 증식하는 세포의 능력을 회복시키는 능력을 갖는다. 2-부분 뉴클레오티드 서열의 제2 부분은 제2 단백질을 코딩하며, 이는 세포에 대해 외인성이고 치료 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 제2 단백질은 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 함유하는 TCR 복합체일 수 있다. 도 27b는 2-부분 뉴클레오티드 서열의 예를 나타낸다.
2-부분 뉴클레오티드 서열의 성공적 재-도입을 갖는 세포는 필수 단백질을 발현하고 선택된 시험관내 증식 조건 하에 생존하거나 증식하는 세포의 능력을 회복시킬 것이며, 따라서 다른 세포에 대해 강한 생존 이점을 얻고 시간에 따라 풍부화될 것이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드의 제1 부분 및 제2 부분은 단일 개방 판독 프레임으로부터 발현되도록 구성되어, 이들은 세포에서 공동-발현된다. 따라서, 풍부화된 세포는 후속 적용, 예컨대 T 세포 요법을 위해 사용될 수 있다.
본원에 기재된 일부 실시양태는 세포가 억제되는 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질을 가질 때, 유전적으로 조작된 세포의 선택을 위한 방법에 관한 것이다. 방법은 i) 세포에서 발현을 위해 작동가능한 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열을 도입하되, 세포는, 세포가 선택된 배양 조건 하에 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 억제되는 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질을 갖고, 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열이 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제2-부분 뉴클레오티드 서열이 세포에 대해 외인성인 단백질을 코딩하는 것인, 단계를 포함할 수 있다. 방법은 ii) 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현하는 세포의 선택을 야기하는 세포 배양 조건 하에 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
이들 실시양태에서, 2-부분 뉴클레오티드 서열의 성공적 재-도입을 갖는 세포는 다른 세포에 대해 강한 생존 이점을 얻을 것이고 시간에 따라 풍부화될 것이다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포의 선택은 정상 세포 배양 배지에서 가능하다. 일부 실시양태에서, 정상 세포 배양 배지는 비-변형된 세포의 성장 및/또는 증식을 위해 적합한 것이다. 예를 들어, T 세포에 대한 정상 배양 배지는 Thermo Fisher Scientific으로부터의 RPMI 1640이다.
일부 실시양태에서, 정상 세포 배양 배지는 유세포분석 또는 자성 비드 풍부화에 의한 세포의 풍부화를 허용하는 약물 분자, 항체, 또는 임의의 특정 보충제와 같은 외인성 선택 압력이 없다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포의 선택은 외인성 선택적 압력을 야기하는 세포 배양 배지에 대한 구성요소의 첨가를 기초로 하여 가능하다. 일부 실시양태에서, 외인성 선택적 압력은 세포의 생존 및/또는 증식을 위해 필수적인 단백질의 억제를 야기한다. 일부 실시양태에서, 외인성 선택적 압력은 세포 배양 배지에 대한 메토트렉세이트의 첨가를 기초로 한다.
일부 실시양태에서, 활성 감소는 영구적이거나 일시적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 활성 감소 또는 억제는 세포에서 필수 단백질의 양 또는 수준에서의 영구적 또는 일시적 감소에 의해 달성된다. 일부 실시양태에서, 단백질의 수준은 동일하게 유지되지만, 단백질의 기능성은 감소되거나 억제된다. 일부 실시양태에서, 활성 감소 또는 억제는 세포에서 단백질의 수준 감소가 있거나 없는 세포의 기능적 활성에서의 영구적 또는 일시적 감소에 의해 달성된다. 일부 실시양태에서, 활성 감소 또는 억제는 세포에서 단백질의 수준을 별도로 변경하지 않으면서 세포의 기능적 활성에서의 영구적 또는 일시적 감소에 의해 달성된다. 영구적 실시양태에서, 필수 단백질을 코딩하는 유전자는 녹 아웃될 수 있으며, 이는 세포의 게놈으로부터 필수 유전자를 영구적으로 제거한다. 일부 실시양태에서, 녹-아웃은 CRISPR/Cas9 리보핵단백질(RNP), TALEN, MegaTAL, 또는 임의의 다른 뉴클레아제에 의해 매개된다.
일시적 실시양태에서, 필수 단백질의 활성은 일시적으로 억제될 수 있다. 일부 실시양태에서, 일시적 억제는 필수 단백질의 활성이 RNA 수준에서 억제되는, siRNA, miRNA, 또는 CRISPR 간섭(CRISPRi)을 통하는 것이다. 일부 실시양태에서, 일시적 억제는 단백질 수준에서 필수 단백질의 활성을 억제하는 단백질 억제제를 통하는 것이다. 필수 단백질의 활성은 siRNA, miRNA, CRISPR 간섭(CRISPRi), 또는 단백질 억제제가 세포 성장/배양 환경으로부터 제거되면 회복될 것이다.
일부 실시양태에서, 필수 단백질은 DHFR이고 일시적 억제는 메토트렉세이트에 의한 것이다. 메토트렉세이트는 DNA, RNA, 티미딜레이트, 및 단백질의 합성에서 요구되는 것으로 여겨지는, 테트라하이드로폴레이트의 합성에 참여하는 효소인 DHFR을 경쟁적으로 억제하는 단백질 억제제이다. 따라서, 억제된 DHFR을 갖는 세포는 생존하거나 증식할 수 없을 것이다.
일부 실시양태에서, 세포는 T 세포, NK 세포, NKT 세포, iNKT 세포, 조혈 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, iPSC, 신경 전구 세포, 망막 유전자 요법에서의 세포 유형 또는 임의의 다른 세포이다.
일부 실시양태에서, 제1-부분 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열에서 변경되어, 뉴클레아제, siRNA, miRNA, 또는 CRISPRi 저항성을 달성하지만, 제1 단백질과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 서열번호 1(도 34)은 내인성 DHFR 유전자에 비해 변경된 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1-부분 뉴클레오티드 서열이다. 서열번호 1은 내인성 DHFR 유전자에서 특정 뉴클레오티드를 점 돌연변이시킴으로써 생성된다. 변경된 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1 뉴클레아제 저항성을 제공한다. 그러나, 서열번호 1에 의해 코딩된 DHFR 단백질은 내인성 DHFR 단백질과 동일한 아미노산 서열을 갖고, 따라서 동일한 기능을 갖는다.
일부 실시양태에서, 제1-부분 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열에서 변경되어, 제1 단백질과 동일한 아미노산 서열을 갖지 않는 변경된 단백질을 코딩한다. 변경된 단백질은 제1 단백질에 대해 조정된 기능성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 변경된 단백질은 제1 단백질이 갖지 않는 특이적 특징을 갖는다. 일부 실시양태에서, 특이적 특징은, 비제한적으로, 감소된 활성, 증가된 활성, 변경된 반감기, 소분자 억제에 대한 저항성, 및 소분자 결합 후 증가된 활성 중 하나 이상을 포함한다. 예를 들어, 서열번호 2(도 35)는 내인성 DHFR 유전자에서 특정 뉴클레오티드를 점 돌연변이시킴으로써 생성되고 서열번호 2는 내인성 DHFR의 것과 상이한 아미노산 서열을 갖는 변경된 DHFR 단백질을 코딩한다. 변경된 DHFR 단백질은 내인성 DHFR과 유사한 활성을 갖지만, MTX, 단백질 억제제에 대해 저항성이다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열은 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현하기 위해 작동가능하다. 뉴클레오티드 서열은 그것이 유전자 전사를 위한 모든 요소를 가질 때, 발현을 위해 작동가능하다. 요소는, 비제한적으로, 프로모터, 인핸서, TATA 박스, 및 poly(A) 종결 신호를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이들 중 하나 이상은 선택적이다. 일부 실시양태에서, 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다는 동일한 프로모터 또는 상이한 프로모터에 의해 구동될 수 있다.
일부 실시양태에서, 2 부분 뉴클레오티드 서열은 세포에서 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현할 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 (i) 그것이 세포에서 발현을 위해 작동가능하거나 (ii) 표적 게놈 내의 사전-결정된 부위에서 삽입될 때, 세포에서 발현을 위해 작동가능해질 경우, 발현될 수 있으며, 이는 그것이 유전자 전사를 위한 모든 요소를 갖거나 이와 작동가능하게 연결될 것이기 때문이다. 요소는, 비제한적으로, 프로모터, 인핸서, TATA 박스, 및 poly(A) 종결 신호를 포함한다. 모든 요소가 발현을 위해 모든 상황에서 필수적인 것은 아니다. 일부 실시양태에서, 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다는 동일한 프로모터 및/또는 상부 서열(예를 들어, 인핸서) 또는 상이한 프로모터 및/또는 상부 서열(예를 들어, 인핸서)에 의해 구동될 수 있다.
일부 실시양태에서, 제2-부분 뉴클레오티드 서열은 적어도 치료 유전자를 포함한다. 치료 유전자는 질환을 치료하기 위한 약물로서 사용되는 유전자이다. 예를 들어, 특정 암 항원을 표적화하는 T 세포 수용체를 코딩하는 유전자는 치료 유전자로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2-부분 뉴클레오티드 서열은 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 함유하는 신생항원 T-세포 수용체 복합체(TCR)를 코딩한다.
일부 실시양태에서, 제1-부분 뉴클레오티드 서열은 뉴클레아제-저항성, siRNA-저항성, 또는 단백질 억제제-저항성 DHFR 유전자를 포함하고, 제2-부분 뉴클레오티드 서열은 TRA 유전자 및 TRB 유전자를 포함한다. 예를 들어, 서열번호 3(도 36)은 야생형 인간 DHFR을 코딩하는 DNA 서열이고; 서열번호 4(도 37)는 야생형 인간 DHFR을 코딩하는 코돈-최적화 및 뉴클레아제-저항성 DNA 서열이고; 서열번호 5(도 38)는 MTX-저항성 인간 DHFR 돌연변이체를 코딩하는 코돈-최적화된 DNA 서열이다. 일부 실시양태에서, 단백질 억제제-저항성 DHFR 유전자는 메토트렉세이트-저항성 DHFR 유전자이다.
일부 실시양태에서, TRA, TRB, 및 DHFR 유전자는 단일 개방 판독 프레임으로부터 발현되도록 작동가능하게 구성된다. 이 배열의 하나의 이점은 세포가 DHFR을 발현하고 정상 세포 배양 배지에서 생존하는 경우, 세포가 또한 TRA 및 TRB 유전자를 발현하고 후속 적용, 예컨대 T 세포 요법을 위해 사용될 수 있다는 것이다.
일부 실시양태에서, TRA, TRB, 및 DHFR 유전자는 링커에 의해 분리된다. 이들 링커는 단일 개방 판독 프레임 하에 다중 유전자가 발현되게 한다. 일부 실시양태에서, 링커, TRA, TRB, 및 DHFR 유전자의 순서는 다음 순서로 있다:
TRA - 링커 - TRB - 링커 - DHFR,
TRA - 링커 - DHFR - 링커 - TRB,
TRB - 링커 - TRA - 링커 - DHFR,
TRB - 링커 - DHFR - 링커 - TRA,
DHFR - 링커 - TRA - 링커 - TRB, 또는
DHFR - 링커 - TRB - 링커 - TRA.
일부 실시양태에서, 링커는 자가-절단 2A 펩티드 또는 IRES 요소이다. 자가-절단 2A 펩티드 및 IRES 요소 둘 다는 단일 개방 판독 프레임 하에 다중 유전자가 발현되게 한다.
일부 실시양태에서, DHFR, TRA, 및 TRB 유전자는 내인성 TCR 프로모터 또는, 비제한적으로, TRAC, TRBC1/2, DHFR, EEF1A1, ACTB, B2M, CD52, CD2, CD3G, CD3D, CD3E, LCK, LAT, PTPRC, IL2RG, ITGB2, TGFBR2, PDCD1, CTLA4, FAS, TNFRSF1A(TNFR1), TNFRSF10B(TRAILR2), ADORA2A, BTLA, CD200R1, LAG3, TIGIT, HAVCR2(TIM3), VSIR(VISTA), IL10RA, IL4RA, EIF4A1, FTH1, FTL, HSPA5, 및 PGK1의 프로모터를 포함하는 임의의 다른 적합한 프로모터에 의해 구동된다.
일부 실시양태에서, 2-부분 뉴클레오티드 서열은 세포의 게놈 내로 통합된다. 일부 실시양태에서, 통합은 뉴클레아제-매개된 부위-특이적 통합, 전이인자-매개된 유전자 전달, 또는 바이러스-매개 유전자 전달을 통하는 것이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제-매개된 부위-특이적 통합은 CRISPR/Cas9 RNP를 통하는 것이다. 일부 실시양태는 필수 단백질 또는 제1 단백질이 기능장애 N-말단 및 C-말단 단백질 절반으로 분열될 수 있고, 각각이 호모- 또는 헤테로다이머화 단백질 파트너 또는 스플릿 인테인에 융합되는, 스플릿 인테인 시스템을 사용하는 단계를 추가로 포함한다. 필수 또는 제1 단백질의 기능적 재구성은 그 다음에 양측 단백질 절반이 동일한 세포에서 공동-발현될 때만 가능하다. 일부 실시양태에서, 필수 또는 제1 단백질은 DHFR 단백질이다. (Pelletier JN, Campbell-Valois FX, Michnick SW. Oligomerization domain-directed reassembly of active dihydrofolate reductase from rationally designed fragments. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1998 Oct 13;95(21):12141-6; 및 Remy I, Michnick SW. Clonal selection and in vivo quantitation of protein interactions with protein-fragment complementation assays. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1999 May 11;96(10):5394-9, 이들 둘 다는 임의의 목적을 위해 그 전체가 본원에 명확히 참고로 포함됨.)
일부 실시양태에서, 도입된 2-부분 뉴클레오티드 서열은 세포의 게놈 내로 통합되지 않는다.
일부 실시양태에서, 내인성 TCR 불변 유전자좌를 표적화하는 CRISPR/Cas9 RNP, 뉴클레아제-저항성 DHFR 유전자를 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열, 및 신생항원 TCR을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열이 세포에 전달된다. 일부 실시양태에서, 내인성 TCR 불변 유전자좌는 TCR 알파 불변(TRAC) 유전자좌 또는 TCR 베타 불변(TRBC) 유전자좌일 수 있다. 일부 실시양태에서, 전달은 전기천공, 또는 기계적 또는 화학적 막 투과화를 기초로 하는 방법에 의한 것이다.
일부 실시양태에서, 제1 CRISPR/Cas9 RNP가 사용되어, 내인성 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 유전자를 녹-아웃시키고, 제2 CRISPR/Cas9 RNP가 사용되어, CRISPR/Cas9 뉴클레아제-저항성 DHFR 유전자를 포함하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 치료 TCR 유전자를 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 내인성 TCR 불변 유전자좌 내로 녹-인시킨다. 이들 실시양태에서, 내인성 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)는 더 이상 발현되지 않고, 도입된 뉴클레아제-저항성 DHFR 유전자는 뉴클레오티드 서열에서 변경을 갖지만, 대응하는 단백질 서열에서는 그렇지 않다. 일부 실시양태에서, 제2 CRISPR/Cas9 RNP는 녹-인을 위해 TRAC 유전자좌를 절단하는 TRAC RNP이다.
일부 실시양태에서, 메토트렉세이트가 사용되어, 제1 단백질을 억제하고, CRISPR/Cas9 RNP가 사용되어, 메토트렉세이트-저항성 DHFR 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 치료 TCR 유전자를 포함하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 내인성 TCR 불변 유전자좌 내로 녹-인시킨다. 이들 실시양태에서, 내인성 제1 단백질은 여전히 발현되지 않지만, 이의 활성은 메토트렉세이트에 의해 억제되었고; 도입된 뉴클레오티드 서열은 메토트렉세이트-저항성인 DHFR 단백질을 코딩한다.
본원에 기재된 일부 실시양태는 본원에 개시된 방법 중 임의의 것에 따라 제조되는 세포에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 세포는 i) 세포가 정상 세포 배양 배지에서 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준가지 억제되는 내인성 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 및 ii) DHFR을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 신생항원 T-세포 수용체 복합체를 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본원에 기재된 일부 실시양태는 유전적으로 조작된 세포의 풍부화를 위한 방법에 관한 것이다. 방법은 i) 세포에서 발현을 위해 작동가능하고 제1 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 제2 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 2-부분 뉴클레오티드 서열을 도입하되, 제2-부분 단백질이 세포에 대해 외인성인 것인, 단계, 및 ii) 제1 단백질 및 제2 단백질 둘 다를 발현하는 세포의 풍부화를 야기하는 적어도 하나의 보충제를 함유하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 유전적으로 조작된 세포는 일차 인간 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 보충제는 제1 단백질 및 제2 단백질 둘 다를 발현하지 않고 세포의 생존 및/또는 증식을 손상시킨다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 단백질은 세포의 생존 및/또는 증식의 보충제 매개된 손상에 대한 세포의 저항성을 매개한다. 일부 실시양태에서, 보충제는 메토트렉세이트이다. 일부 실시양태에서, 제1 단백질은 메토트렉세이트-저항성 DHFR 돌연변이체 단백질이다.
일부 실시양태에서, 제2 단백질은 T 세포 수용체이다. 일부 실시양태에서, T 세포 수용체는 바이러스 또는 종양 항원에 대해 특이적이다. 일부 실시양태에서, 제1-부분 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열에서 변경되어, 뉴클레아제, siRNA, miRNA, 또는 CRISPRi 저항성을 달성한다.
일부 실시양태에서, 적어도 2-부분 뉴클레오티드 서열의 발현은 세포의 내인성 유전자좌 내로의 부위-특이적 통합에 의해 달성된다. 일부 실시양태에서, 세포의 내인성 유전자좌 내로의 부위-특이적 통합은 CRISPR/Cas9, TALEN, MegaTAL 또는 유전자좌 내로의 무흔적 통합을 허용하여, 유전자좌의 내인성 프로모터로부터의 발현을 가능하게 하는 임의의 다른 뉴클레아제를 사용함으로써 달성된다.
일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 유전자좌 내로의 2-부분 뉴클레오티드 서열의 인-프레임 엑손 통합을 허용하여, 내인성 프로모터, 내인성 스플라이스 부위, 및 내인성 전사 종결 신호로부터의 발현을 가능하게 한다. 이 구성에서, 2-부분 뉴클레오티드 서열의 발현을 제어하는 요소는 모든 내인성 요소이다. 엑손 통합은 2-부분 뉴클레오티드 서열이 유전자좌의 엑손 내로 통합되는 상황을 지칭한다. 이들 실시양태 중 일부의 다이어그램은 도 24에서 찾아볼 수 있다.
일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 유전자좌 내로의 2-부분 뉴클레오티드 서열의 인-프레임 엑손 통합을 허용하여, 내인성 프로모터, 내인성 스플라이스 부위, 및 외인성 전사 종결 신호로부터의 발현을 가능하게 한다. 이 구성에서, 2-부분 뉴클레오티드 서열의 발현을 제어하는 요소는 내인성 및 외인성 요소의 혼합물이다. 이들 실시양태 중 일부의 다이어그램은 도 25에서 찾아볼 수 있다.
일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 유전자좌 내로의 2-부분 뉴클레오티드 서열의 인트론 통합을 허용하여, 내인성 프로모터, 외인성 스플라이스 수용체 부위, 및 외인성 전사 종결 신호로부터의 발현을 가능하게 한다. 이 구성에서, 2-부분 뉴클레오티드 서열의 발현을 제어하는 요소는 내인성 및 외인성 요소의 혼합물이다. 인트론 통합은 2-부분 뉴클레오티드 서열이 유전자좌의 인트론 내로 통합되는 상황을 지칭한다. 이들 실시양태의 다이어그램은 도 26에서 찾아볼 수 있다.
일부 실시양태에서, CRISPR/Cas9 RNP가 사용되어, 메토트렉세이트-저항성 DHFR 돌연변이체 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 치료 TCR 유전자를 포함하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 내인성 TCR 불변 유전자좌 내로 녹-인시킨다.
일부 실시양태는 내인성 TRAC 또는 TRBC 유전자를 녹-아웃시키기 위해 사용되는 제2 CRISPR/Cas9 RNP를 추가로 포함한다.
본원에 기재된 일부 실시양태는 유전적으로 조작된 T 세포의 풍부화를 위한 방법에 관한 것이다. 방법은 i) 메토트렉세이트-저항성 DHFR 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 TRA 또는 TRB 프로모터의 후방의 2-부분 뉴클레오티드 서열의 통합에 의해 T 세포에서 T-세포 수용체 복합체 또는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 2-부분 뉴클레오티드 서열을 도입하는 단계, 및 ii) 제1 단백질 및 제2 단백질 둘 다를 발현하는 세포의 풍부화를 야기하는 메토트렉세이트(25 nM 내지 100 nM)를 함유하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
본원에 기재된 일부 실시양태는 외인성 T 세포 수용체 유전자를 발현하도록 조작된 T 세포의 풍부화를 위한 방법에 관한 것이다. 방법은 i) 제1 CRISPR/Cas9 RNP를 사용하여 내인성 TRBC 유전자를 이의 유전자좌로부터 녹-아웃시키는 단계; ii) 제2 CRISPR/Cas9 RNP를 사용하여, 메토트렉세이트-저항성 DHFR 유전자를 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 치료 TCR 유전자를 포함하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 내인성 TRAC 유전자좌 내로 녹-인시키되, 양측 뉴클레오티드 서열이 작동가능하게 연결되어, 내인성 TRAC 프로모터로부터의 발현을 허용하는 것인, 단계; 및 iii) 치료 TCR 및 메토트렉세이트-저항성 DHFR 유전자 둘 다를 발현하는 T 세포의 풍부화를 야기하는 메토트렉세이트를 함유하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
본원에 기재된 일부 실시양태는 i) 세포가 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 메토트렉세이트의 존재에 의해 억제되는 내인성 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 및 ii) 메토트렉세이트-저항성 DHFR 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 내인성 TRA 또는 TRB 프로모터로부터 작동가능하게 발현되는 T-세포 수용체를 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는, T 세포에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 유전적으로 조작된 세포의 선택을 위한 방법은 i) 세포에서 발현을 위해 작동가능한 적어도 2 개의 2-부분 뉴클레오티드 서열을 도입하는 단계를 포함한다. 세포는, 세포가 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 억제되는 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질을 갖는다. 제1 2-부분 뉴클레오티드 서열은 제1 결합 도메인에 융합된 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 비-기능적 부분을 포함하는 제1 융합 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 제2 2-부분 뉴클레오티드 서열은 제2 결합 도메인에 융합된 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 비-기능적 부분을 포함하는 제2 융합 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 제1 및 제2 융합 단백질 둘 다는 세포에서 함께 발현될 수 있고, 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 기능은 공동-발현에 의해 회복된다. 방법은 ii) 제1 및 제2 2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현하는 세포의 선택을 야기하는 조건 하에 세포를 배양하는 단계을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 과정 중 하나 이상은 반복되고/되거나 생략되고/되거나 본원에 제공된 다른 실시양태 중 임의의 것으로 변형될 수 있다.
일부 실시양태에서, 유전적으로 조작된 세포의 풍부화를 위한 방법은 i) 세포가 정상 시험관내 증식 조건 하에 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 세포의 생존 및/또는 증식을 위해 필수적인 적어도 제1 단백질의 활성을 감소시키는 단계; 및 ii) 세포에서 발현을 위해 작동가능한 적어도 2 개의 2-부분 뉴클레오티드 서열을 도입하는 단계를 포함한다. 제1 2-부분 뉴클레오티드 서열은 제1 결합 도메인에 융합된 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 비-기능적 부분을 포함하는 제1 융합 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 제2 2-부분 뉴클레오티드 서열은 제2 결합 도메인에 융합된 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 비-기능적 부분을 포함하는 제2 융합 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 제1 및 제2 융합 단백질 둘 다는 세포에서 함께 발현될 수 있고, 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 기능은 공동-발현에 의해 회복된다. 방법은 iii) 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질 둘 다를 발현하는 세포의 풍부화를 야기하는 시험관내 증식 조건 하에 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 과정 중 하나 이상은 반복되고/되거나 생략되고/되거나 본원에 제공된 다른 실시양태 중 임의의 것으로 변형될 수 있다.
본원에 기재된 일부 실시양태는 유전적으로 조작된 세포의 선택을 위한 방법에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포"는 임의의 유기체로부터의 임의의 단일 세포, 다중 세포, 또는 세포주를 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 진핵생물이다. 일부 실시양태에서, 세포는 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 세포는 일차 세포이거나 일차 조직으로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 세포는 정립된 세포주로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 세포는 마우스, 래트, 비-인간 영장류, 또는 인간이다. 세포는 임의의 세포, 조직, 기관, 또는 기관계 유형으로부터의 것일 수 있다는 것이 이해될 것이다. 세포의 비-제한적인 예는 T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CAR T 세포, B 세포, 면역 세포, 신경 세포, 근육 세포, 상피 세포, 결합 조직 세포, 줄기 세포, 골세포, 혈액 세포, 내피 세포, 지방 세포, 성세포, 신장 세포, 폐 세포, 뇌 세포, 심장 세포, 근모 세포, 췌장 세포, 및 암 세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 세포에서 발현을 위해 작동가능한 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10 개 서열, 또는 적어도 20 개 뉴클레오티드 서열을 도입하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열은 단일 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열은 적어도 2 개 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 적어도 3 개 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 적어도 4 개 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 적어도 5 개 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 10 개 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 20 개 부분을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포의 생존 및/또는 증식을 위해 필수적인 적어도 하나의 단백질 및/또는 세포 과정은 이와 달리 세포가 독립적으로 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 세포에서 억제된다. "필수" 단백질 또는 세포 시스템은 주어진 세포에서 성장, 복제, 세포 주기, 유전자 조절(DNA 수선, 전사, 번역, 및 복제를 포함함), 스트레스 반응, 대사, 아폽토시스, 영양분 획득, 단백질 전환, 세포 표면 온전함, 필수 효소 활성, 생존, 또는 이의 임의의 조합에 영향을 주는 임의의 단백질 또는 세포 시스템일 수 있다는 것이 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다. 또한, 용어 "억제"는 대조군과 비교하여 세포 사멸, 대사 중단, 세포 주기 중단, 스트레스 유도, 단백질 전환 중단, DNA 스트레스, 및/또는 성장 중단을 완료하기 위해 대조군과 비교하여 세포 사멸, 대사 중단, 세포 주기 중단, 스트레스 유도, 단백질 전환 중단, DNA 스트레스, 및/또는 성장 중단 중 하나 이상의 발생에서의 상당한 증가로부터의 임의의 표현형에 적용될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 일부 실시양태에서, 억제는 부분적이거나 완전할 수 있다(예를 들어, 단백질은, 비제한적으로, 50%, 75%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%를 포함한 적어도 약 일부 검출가능한 양 만큼 수준이 감소되거나 감소된 이의 기능적 활성을 가질 수 있음). 일부 실시양태에서, 억제는 세포에서 단백질의 수준 또는 양을 감소시킴으로써 달성된다(예를 들어, 녹-아웃, 유전자 침묵, siRNA, CRISPRi, miRNA, shRNA). 일부 실시양태에서, 억제는 세포에서 단백질의 수준을 변경하거나 변경하지 않고 단백질의 기능적 활성을 감소시킴으로써 달성된다(예를 들어, 단백질 기능의 소분자 억제제, 결합을 차단하는 항체, 단백질의 기능을 감소시키는 돌연변이).
일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 결합 도메인에 융합된 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 비-기능적 부분을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열의 제1 부분은 결합 도메인에 융합된 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 비-기능적 부분을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열의 제2-부분은 발현될 적어도 하나의 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 제2 결합 도메인에 융합된 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 제2 비-기능적 부분을 포함하는 제2 융합 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 서열 및 발현될 적어도 하나의 단백질을 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열의 제2 부분은 제2 결합 도메인에 융합된 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 제2 비-기능적 부분을 포함하는 제2 융합 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 서열 및 발현될 적어도 하나의 단백질을 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 세포에서 함께 발현될 때, 적어도 하나의 필수 단백질의 성공적 발현을 야기한다. 이는 필수 단백질의 기능성을 세포로 되돌리고, 세포가 생존하게 한다. 본원에 개시된 예 중 많은 것은 2 개 융합 단백질 조합에 관한 것인 한편, 본원에 개시된 동일한 방법은 적어도 하나의 필수 단백질로 성공적으로 조합할 수 있는 다수의 다양한 융합 단백질 하에 사용될 수 있다는 것이 통상이 기술자에게 이해될 것이다.
본원에 개시된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 융합 단백질이 세포에서 함께 발현될 때, 생존 및/또는 증식을 위한 적어도 하나의 필수 단백질의 기능은 회복된다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 융합 단백질이 세포에서 함께 발현될 때, 생존 및/또는 증식을 위한 적어도 하나의 필수 세포 과정의 기능은 회복된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 필수 단백질 또는 세포 과정은 억제된 단백질 또는 세포 과정과 동일한 필수 단백질 또는 세포 과정이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 필수 단백질은 억제된 단백질과 유사한 활성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 필수 단백질은 적어도 하나의 억제된 세포 경로 또는 과정에서 기능한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 필수 단백질은 적어도 2 개의 필수 세포 경로 또는 과정에서 기능한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 필수 단백질의 발현은 억제된 단백질 및/또는 세포 과정의 억제 표현형을 완화하거나, 활성화시키거나, 회복시키거나, 약화시킨다. 일부 실시양태에서, 세포의 생존 및/또는 증식은 적어도 하나의 필수 단백질의 발현시 증가된다. 일부 실시양태에서, 세포의 생존 및/또는 증식은 적어도 하나의 필수 단백질의 발현시 완전히 회복된다.
일부 실시양태에서, 방법은 세포의 선택을 야기하는 조건 하에서 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택은 뉴클레오티드 서열 상에서 코딩된 적어도 하나의 필수 단백질의 발현을 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택은 뉴클레오티드 서열 상에서 코딩된 제1 및 제2 2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다의 발현을 포함한다.
일부 실시양태에서, 필수 단백질은 DHFR 단백질이다. 일부 실시양태에서, 필수 단백질은 DHFR과 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일성을 갖는 단백질이다. 일부 실시양태에서, 단백질은 포유동물 DHFR이다. 일부 실시양태에서, 단백질은 인간 DHFR이다. 일부 실시양태에서, 단백질은 DHFR 유사체이다.
일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 세포에 대해 외인성이다. 일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 2-부분 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 서열은 세포에 대해 외인성이다. 일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 2-부분 뉴클레오티드 서열의 제1-부분 뉴클레오티드 서열은 세포에 대해 외인성이다. 일부 실시양태에서, 제1 또는 제2 2-부분 뉴클레오티드 서열의 제2-부분 뉴클레오티드 서열은 세포에 대해 외인성이다. 일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 2-부분 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 서열은 TCR이다. 일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 2-부분 뉴클레오티드 서열의 제1-부분 뉴클레오티드 서열은 TCR이다. 일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 2-부분 뉴클레오티드 서열의 제2-부분 뉴클레오티드 서열은 TCR이다.
일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 결합 도메인 중 적어도 하나는 GCN4로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 결합 도메인은 GCN4와 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일성을 갖는 단백질로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 결합 도메인은 포유동물 GCN4인 단백질로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 결합 도메인은 인간 GCN4인 단백질로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 결합 도메인은 GCN4 유사체인 단백질로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 결합 도메인 중 적어도 하나는 FKBP12로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 결합 도메인은 FKBP12와 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일성을 갖는 단백질로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 결합 도메인은 포유동물 FKBP12인 단백질로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 결합 도메인은 인간 FKBP12인 단백질로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 결합 도메인은 FKBP12 유사체인 단백질로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, FKBP12는 F36V 돌연변이를 갖는다. 일부 실시양태에서, FKBP12 결합이 유도된다. (임의의 목적을 위해 그 전체가 본원에 명확히 참고로 포함되는, Straathof KC, 
MA, Yotnda P, Dotti G, Vanin EF, Brenner MK, Heslop HE, Spencer DM, Rooney CM. An inducible caspase 9 safety switch for T-cell therapy. Blood. 2005 Jun 1;105(11):4247-54.)
일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 결합 도메인 중 적어도 하나는 JUN으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 결합 도메인은 JUN과 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일성을 갖는 단백질로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 결합 도메인은 포유동물 JUN인 단백질로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 결합 도메인은 인간 JUN인 단백질로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 결합 도메인은 JUN 유사체인 단백질로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 결합 도메인 중 적어도 하나는 FOS로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 결합 도메인은 FOS와 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일성을 갖는 단백질로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 결합 도메인은 포유동물 FOS인 단백질로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 결합 도메인은 인간 FOS인 단백질로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 결합 도메인은 FOS 유사체인 단백질로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 JUN으로부터 유래되고 제2 결합 도메인은 FOS로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, JUN 및 FOS는 야생형 JUN 및 FOS에 대해 서로에 대한 결합을 촉진하는 상보성 변화를 갖는다. (Glover JN, Harrison SC. Crystal structure of the heterodimeric bZIP transcription factor c-Fos-c-Jun bound to DNA. Nature. 1995 Jan 19;373(6511):257-61, 및 Glover and Harrison, Nature 1995. Jerome and Muller, Gene Ther 2001, 및 
V, 
R. A synthetic leucine zipper-based dimerization system for combining multiple promoter specificities. Gene Ther. 2001 May;8(9):725-9, 이들 둘 다는 임의의 목적을 위해 그 전체가 본원에 명확히 참고로 포함됨)
일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인은 서로에 대한 결합을 보존하는 상보성 돌연변이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 천연 결합 파트너에 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 제2 결합 도메인은 천연 결합 파트너에 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인은 천연 결합 파트너에 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인 및/또는 제2 결합 도메인 중 적어도 하나는 3 내지 7 개 상보성 돌연변이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인 및/또는 제2 결합 도메인 중 적어도 하나는 3 이상의 상보성 돌연변이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인 및/또는 제2 결합 도메인 중 적어도 하나는 4 이상의 상보성 돌연변이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인 및/또는 제2 결합 도메인 중 적어도 하나는 5 이상의 상보성 돌연변이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인 및/또는 제2 결합 도메인 중 적어도 하나는 6 개 상보성 돌연변이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인 및/또는 제2 결합 도메인 중 적어도 하나는 7 개 상보성 돌연변이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 제2 결합 도메인과 상이한 수의 상보성 돌연변이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 상보성 돌연변이는 하나 이상의 전하 쌍(또는 전하 스위치) 돌연변이이어서, 페어링된 전하가 구조에서 유지되지만, 위치 전하는 잔기의 쌍 사이에 역전된다. 예를 들어, 전하 상호작용을 통해 제2 잔기와 연합된 제1 잔기가 있고, 제1 잔기가 양으로 하전된 잔기이고 제2 잔기가 음으로 하전된 잔기인 상황에서, 전하는 스위치되어, 제1 잔기는 음으로 하전된 잔기이고 제2 잔기는 양으로 하전된 잔기이다. 일부 실시양태에서, 제1 잔기 및 제2 잔기는 동일한 단백질 상에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 잔기 및 제2 잔기는 상이한 단백질 상에 있다.
일부 실시양태에서, 필수 단백질의 기능의 회복이 유도된다. 일부 실시양태에서, 필수 단백질의 기능의 회복은 다이머화제에 의해 유도된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "다이머화제"는 통상의 기술자에게 일반적으로 이해되는 바와 같은 이의 보통의 의미를 갖고, 2 이상의 도메인을 가교하는 임의의 소분자 또는 단백질을 포함한다. 다이머화제의 비-제한적인 예는 AP1903이다. 본 발명을 고려하여 통상의 기술자에게 이해되는 바와 같이, 필수 단백질의 기능의 회복이 다이머화제에 의해 유도될 때, 다이머화제 또는 유도제는 외인성 선택 압력으로 고려되지 않는다.
일부 실시양태에서, 배양 단계는 세포 주기 억제제, 성장 억제제, DNA 복제 억제제, 대사 억제제, 유전자 발현 억제제, 또는 스트레스 억제제 중 적어도 하나의 존재 하에 수행된다. 일부 실시양태에서, 배양 단계는 메토트렉세이트의 존재 하에 수행된다.
본원에 기재된 일부 실시양태는 유전적으로 조작된 세포의 풍부화를 위한 방법에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "풍부화"는 통상의 기술자에게 일반적으로 이해되는 바와 같은 이의 보통의 의미를 갖고, 세포의 집단 내에서 소망하는 세포 유형의 비를 향상시키는 것을 포함한다. 풍부화의 비제한적인 예는 집단 외부에서 소망하는 세포를 정제하는 것, 소망하는 세포 유형의 수를 증가시키는 것, 및 비소망하는 세포 유형의 수를 감소시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 세포가 정상 시험관내 증식 조건 하에 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 세포의 생존 및/또는 증식을 위해 필수적인 적어도 제1 단백질 또는 세포 과정의 활성을 감소시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, 메토트렉세이트에 의해 감소된 DHFR의 활성을 갖는 세포는 정상 시험관내 증식 조건 하에 생존하고/하거나 증식할 수 없으며, 이는 시험관내 증식 조건에 대한 추가 보충제(예를 들어, 하이포크산틴 및 티미딘(HT))가 요구될 수 있기 때문이다. 따라서, 본원 발명을 고려하여 통상의 기술자에게 이해되는 바와 같이, 이 맥락에서, 정상 조건(또는 유사 어구)은 구체적으로 나타낸 변경(들)을 보상하는 특정 구성요소를 제공하지 않는 조건을 나타낸다. 본원에 나타낸 바와 같이, 이는 주어진 세포에서 성장, 복제, 세포 주기, 유전자 조절(DNA 수선, 전사, 번역, 및 복제를 포함함), 스트레스 반응, 대사, 아폽토시스, 영양분 획득, 단백질 전환, 세포 표면 온전함, 필수 효소 활성, 또는 이의 임의의 조합에 영향을 주는 임의의 단백질 또는 세포 시스템일 수 있다. 또한, 용어 "억제"는 대조군과 비교하여 세포 사멸, 대사 중단, 세포 주기 중단, 스트레스 유도, 단백질 전환 중단, DNA 스트레스, 및/또는 성장 중단을 완료하기 위해 대조군과 비교하여 세포 사멸, 대사 중단, 세포 주기 중단, 스트레스 유도, 단백질 전환 중단, DNA 스트레스, 및/또는 성장 중단 중 하나 이상의 발생에서의 상당한 증가로부터의 임의의 표현형에 적용될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
일부 실시양태에서, 방법은 세포에서 발현을 위해 작동가능한 본원에 개시된 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 적어도 2 개 부분을 포함한다. 본원에 나타낸 바와 같이, 이들 부분은 함께 적어도 하나의 필수 단백질의 발현을 향해 기능한다. 적어도 하나의 필수 단백질의 발현을 위해 함께 작동할 임의의 수의 부분이 있을 수 있다는 것이 이해될 것이다.
일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 결합 도메인에 융합된 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 비-기능적 부분을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열의 제1 부분은 결합 도메인에 융합된 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 비-기능적 부분을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열의 제2 부분은 발현될 적어도 하나의 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 제2 결합 도메인에 융합된 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 제2 비-기능적 부분을 포함하는 제2 융합 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 서열 및 발현될 적어도 하나의 단백질을 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열의 제2 부분은 제2 결합 도메인에 융합된 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 제2 비-기능적 부분을 포함하는 제2 융합 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 서열 및 발현될 적어도 하나의 단백질을 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포에서 함께 발현되는 융합 단백질은 적어도 하나의 필수 단백질의 성공적 발현을 야기한다. 본원에 개시된 예 중 많은 것은 2 개 융합 단백질 조합에 관한 것인 한편, 본원에 개시된 동일한 방법은 적어도 하나의 필수 단백질로 성공적으로 조합할 수 있는 임의의 수의 융합 단백질 하에 사용될 수 있다는 것이 통상이 기술자에게 이해될 것이다.
일부 실시양태에서, 제1 및 제2 융합 단백질이 세포에서 함께 발현될 때, 생존 및/또는 증식을 위한 적어도 하나의 필수 단백질의 기능은 회복된다. 본원에 개시된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 융합 단백질이 세포에서 함께 발현될 때, 생존 및/또는 증식을 위한 적어도 하나의 필수 세포 과정의 기능은 회복된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 필수 단백질 또는 세포 과정은 억제된 단백질 또는 세포 과정과 동일한 필수 단백질 또는 세포 과정이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 필수 단백질은 억제된 단백질과 유사한 활성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 필수 단백질은 적어도 하나의 억제된 세포 경로 또는 과정에서 기능한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 필수 단백질은 적어도 2 개의 필수 세포 경로 또는 과정에서 기능한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 필수 단백질의 발현은 억제된 단백질 및/또는 세포 과정의 억제 표현형을 완화하거나, 활성화시키거나, 회복시키거나, 약화시킨다. 일부 실시양태에서, 세포의 생존 및/또는 증식은 적어도 하나의 필수 단백질의 발현시 증가된다. 일부 실시양태에서, 세포의 생존 및/또는 증식은 적어도 하나의 필수 단백질의 발현시 완전히 회복된다.
일부 실시양태에서, 방법은 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질 둘 다를 발현하는 세포의 풍부화를 야기하는 시험관내 증식 조건 하에 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 표 1-5 중 어느 하나 이상 내의 구축물, 서열, 또는 하위서열 중 하나 이상은 본원에 제공된 본 실시양태 및/또는 배열 및/또는 방법 및/또는 조성물에서 이용될 수 있다.
실시예 1
이 실시예는 DHFR의 동시 녹-아웃 및 뉴클레아제-저항성 DHFR 유전자를 함유하는 TCR 유전자 구축물의 녹-인이 성공적 TCR 녹-인을 갖는 T 세포의 5-배 풍부화를 야기한다는 것을 나타낸다.
도 3-도 7에 대한 물질 및 방법
인간 일차 T 세포를 상이한 공여체 BC23 및 BC26으로부터 단리된 2 개 버피 코트로부터 항-CD3/CD28 비드(ThermoFisher, Cat. #: 111.32D, 3:1 비드:T 세포 비)에 의해 단리시키고 활성화시켰다. 활성화 후 2 일에, 세포를 수집하고, 전기천공을 다음 구성요소와 함께 세포로 수행하였다: (1) DHFR sgRNA-1/Cas9 RNP, (2) DHFR sgRNA-2/Cas9 RNP, (3) TRAC sgRNA/Cas9 RNP + NY-ESO-1 1G4 TCR을 코딩하는 녹인 주형, (4) TRAC sgRNA/Cas9 RNP + NY-ESO-1 1G4 TCR 및 DHFR을 코딩하는 녹인 주형, (5) TRAC sgRNA/Cas9 RNP + NY-ESO-1 1G4 TCR 및 DHFR을 코딩하는 녹인 주형 + DHFR sgRNA-1/Cas9 RNP. 5 분 동안 95℃에서 crRNA(32 pmol)를 TracrRNA(32 pmol)와 1 차 아닐링함으로써 RNP 복합체를 제조하고, 10 분 동안 실온에서 항온처리 후, Cas9 뉴클레아제 16 pmol을 첨가하고 실온에서 15 분 동안 항온처리하였다. RNP 복합체를 사용할 때까지 얼음 상에서 또는 장기 저장을 위해 -80℃에서 방치하였다. 100만 활성화된 T 세포(20 μL P3 버퍼 중)를 16 pmol RNP 복합체 및 1 ㎍ 수선 주형과 혼합함으로써 전기천공을 수행하고, 그 후에 전기천공을 펄스 코드 EH-115를 갖는 Lonza 4D-Nucleofector 장치로 개시하였다. 조건 (1) 및 (2)에서 전기천공된 세포에 대해, 이들을 전기천공 후 5 일차에 수집하고, 게놈 DNA를 단리시키고, DHFR 유전자좌를 PCR에 의해 증폭시키고 TIDE 분석을 수행하였다(도 3 및 도 4). 조건 (3), (4) 및 (5)에서 전기천공된 세포에 대해, 세포를 전기천공 후 6 일차(도 5) 및 10 일차(도 6 및 도 7 좌측)에 TCR 발현의 FACS 분석을 위해 수집하였다. 전기천공 후 12 일차에서, 총 세포 수를 또한 계수하고 TCR 녹인 세포를 계산하고 플롯팅하였다(도 7 우측).
도 3은 내인성 DHFR 유전자가 인간 일차 T 세포 내에서 유전적으로 비활성화될 수 있다는 증거를 제시하는 2 개 공여체로부터의 인간 T 세포에서 sgRNA sgDHFR-1의 녹아웃 효율을 결정하기 위한 TIDE 분석의 결과를 도시한다(각각 BC23 및 BC26에 대해 75% 및 18%). TIDE는 "분해에 의한 인델의 추적"을 의미하며, 이는 CRISPR/Cas9와 같은 게놈 편집 도구에 의한 세포의 풀에서 생성된 삽입 및 결실(인델)을 측정하기 위한 방법이다.
도 4는 내인성 DHFR 유전자가 인간 일차 T 세포 내에서 유전적으로 비활성화될 수 있다는 증거를 제시하는 2 개 공여체로부터의 인간 T 세포에서 sgRNA sgDHFR-2의 녹아웃 효율을 결정하기 위한 TIDE 분석의 결과를 도시한다(각각 BC23 및 BC26에 대해 34% 및 75%).
도 5는 1G4 TCR의 β-쇄에 결합하는 항-Vβ13.1(Biolegend, cat # 362406) 항체로 염색함으로써 2 개 공여체(BC23 및 BC 26)로부터의 T 세포에서 NY-ESO-1 1G4 TCR 녹인 효율을 확인하기 위한 FACS 분석의 결과를 도시한다. T 세포를 TRAC RNP(TRAC 유전자좌에서 DNA 이중 가닥 파괴를 생성하기 위한 것) 및 이중 가닥 DNA 파괴를 수선하며, 따라서 이 부위에 포함되는 다양한 수선 주형(전부 NY-ESO-1 1G4 TCR 서열을 함유함)으로 전기천공하였다.
좌측 칼럼은 NY-ESO-1 1G4 TCR만을 코딩하는 수선 주형의 녹인을 나타내고, 중간 칼럼은 뉴클레아제-저항성 DHFR 유전자와 연결된 1G4 TCR(IG4 TCR-DHFR KI)을 코딩하는 수선 주형의 녹인을 나타내고, 우측 칼럼은 DHFR 특이적 sgRNA를 사용한 내인성 DHFR의 동시 녹아웃과 조합된 1G4 TCR-DHFR 수선 주형의 녹인을 나타낸다. 내인성 DHFR의 동시 녹아웃은 전기천공 후 6 일차에 1G4-DHFR 수선 주형의 전달로 T 세포의 효율적 선택을 야기하며, 이는 녹인을 갖는 T 세포의 빈도가 각각 BC23 및 BC26에 대해 9%에서 51%(5.7 배 풍부화) 및 23%에서 70%(3 배 풍부화)로 증가하였기 때문이다. 데이터는 발명에 기재된 방법이 물리적 또는 약물-매개된 선택을 요구하지 않으면서 선택을 가능하게 하기 위한 외인성 유전자를 코딩하는 유전자 서열의 도입 없이 유전적으로-변형된 세포를 풍부화시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
도 6은 뉴클레아제 저항성 DHFR 트랜스유전자가 내인성 DHFR의 녹아웃과 조합된 TCRα/β-코딩 DNA 수선 주형에 포함될 때, 2 개 공여체(BC23 및 BC26)로부터의 T 세포에서 NY-ESO-1 1G4 TCR 녹인 효율을 확인하기 위한 FACS 분석의 결과를 도시한다. 좌측 칼럼은 NY-ESO-1 1G4 TCR 만의 녹인을 나타내고, 중간 칼럼은 1G4 TCR-DHFR의 녹인을 나타내고, 우측 칼럼은 내인성 DHFR의 동시 녹아웃을 갖는 1G4 TCR-DHFR의 녹인을 나타낸다. 데이터는 내인성 DHFR의 동시 녹아웃이 전기천공 후 10 일차에 1G4-DHFR KI를 갖는 T 세포의 효율적 선택을 야기한다는 것을 나타내며, 이는 녹인을 갖는 T 세포의 빈도가 각각 BC23 및 BC26에 대해 10%에서 61%(6.1 배 풍부화) 및 30%에서 85%(2.8 배 풍부화)로 증가했기 때문이다. 데이터는 발명에 기재된 방법이 물리적 또는 약물-매개된 선택을 요구하지 않으면서 선택을 허용하기 위한 외인성 유전자를 코딩하는 유전자 서열의 도입 없이 유전적으로-변형된 세포를 풍부화시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
상기 데이터는 방법이 물리적 또는 약물-매개된 선택을 요구하지 않으면서 선택을 가능하게 하기 위한 외인성 유전자를 코딩하는 유전자 서열의 도입 없이 유전적으로-조작된 세포를 풍부화시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
관심 치료 유전자(들)(예를 들어, TCRα 및 TCRβ) 및 siRNA- 또는 억제제-저항성 DHFR 유전자를 코딩하는 DNA 수선 주형의 녹인 및 siRNA 또는 억제제(메토트렉세이트)를 사용하여, 이를 녹아웃 시키기 보다는 내인성 DHFR 기능을 억제하는 것에 의해 유전자-편집된 T 세포의 풍부화를 달성하기 위한 다양한 전략이 있다.
도 7은 TCR 발현 수준이 2 개 공여체(BC23 및 BC26)로부터의 인간 T 세포에서의 TCRVβ13.1 항체 형광 강도의 FACS 분석을 기초로 하여 1G4-TCR KI(녹인) T 세포와 1G4-TCR-DHFR KI + DHFR KO T 세포 사이에 유사하다는 것을 나타내는 좌측 패널을 제공한다. 항-Vβ13.1 항체는 1G4 TCR의 β-쇄에 결합한다. 이 데이터는 발명으로 달성된 TCR 발현이 비변형된 TCR 트랜스유전자의 부위-특이적 통합과 유사하다는 것을 나타낸다.
우측 패널은 TCR 녹인 세포의 총 수가 전기천공 후 12 일차에 양측 공여체 T 세포에서 1G4-TCR 녹인과 1G4-TCR-DHFR KI + DHFR KO T 세포 사이에 유사하다는 것을 나타내며, 방법을 사용하여 변형된 T 세포가 유전자 조작 후 증식한다는 것을 나타낸다.
도 8-도 10에 대한 물질 및 방법
인간 일차 T 세포를 상이한 공여체 BC29, BC30, BC31 및 BC32로부터 단리된 4 개 버피 코트로부터 항-CD3/CD28 비드에 의해 단리시키고 활성화시켰다. 활성화 후 2 일에, 세포를 수집하고, 전기천공을 다음 구성요소와 함께 세포로 수행하였다: (1) TRAC sgRNA/Cas9 RNP + NY-ESO-1 1G4 TCR을 코딩하는 녹인 주형, (2) TRAC sgRNA/Cas9 RNP + NY-ESO-1 1G4 TCR 및 DHFR을 코딩하는 녹인 주형, (3) TRAC sgRNA/Cas9 RNP + NY-ESO-1 1G4 TCR 및 DHFR을 코딩하는 녹인 주형 + DHFR sgRNA-1/Cas9 RNP. 전기천공 및 형질도입 파라미터는 상기와 동일하였다. 세포를 5 일차에 TCR 발현의 FACS 분석을 위해 수집하였다(도 8, 도 9 및 도 10 좌측). 전기천공 후 12 일차에, 총 세포 수를 또한 계수하고 TCR 녹인 세포를 계산하고 플롯팅하였다(도 10 우측).
도 8은 뉴클레아제 저항성 DHFR 트랜스유전자가 내인성 DHFR의 녹아웃과 조합된 TCRα/β-코딩 DNA 수선 주형에 포함될 때, 전기천공 후 5 일차에 4 개 공여체(BC29, BC30, BC31, 및 BC32)로부터의 T 세포에서 NY-ESO-1 1G4 TCR 녹인 효율을 확인하기 위한 FACS 분석의 결과를 도시한다. 좌측 칼럼은 NY-ESO-1 1G4 TCR의 녹인을 나타내고, 중간 칼럼은 1G4 TCR-DHFR의 녹인을 나타내고, 우측 칼럼은 내인성 DHFR의 동시 녹아웃을 갖는 1G4 TCR-DHFR의 녹인을 나타내고; 항-Vβ13.1 항체는 1G4 TCR의 β-쇄에 결합한다. 데이터는 전기천공 후 5 일차에 BC23에 대해 녹인 효율이 25%에서 73%로; BC30에 대해 24%에서 50%로; BC31에 대해 17%에서 60%로 및 BC32에 대해 17%에서 41%로 증가하였다는 것을 나타낸다. 이는 발명에 기재된 방법이 물리적 또는 약물-매개된 선택을 요구하지 않으면서 선택을 가능하게 하기 위한 외인성 유전자를 코딩하는 유전자 서열의 도입 없이 유전적으로-변형된 세포를 풍부화시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
도 9는 방법이 물리적 또는 약물-매개된 선택을 요구하지 않으면서 선택을 가능하게 하기 위한 외인성 유전자를 코딩하는 유전자 서열의 도입 없이 유전적으로-변형된 세포를 풍부화시킬 수 있다는 것을 나타내는 도 8의 정량화 데이터를 제공한다.
도 10은 TCR 발현 수준이 4 개 공여체(BC29, BC30, BC31, 및 BC32)로부터의 인간 T 세포에서 TCRVβ13.1 형광 강도의 FACS 분석을 기초로 하여 1G4-TCR KI와 1G4-TCR-DHFR KI + DHFR KO 세포 사이에 유사하다는 것을 나타내는 좌측 패널을 제공하고, 항-Vβ13.1 항체는 1G4 TCR의 β-쇄에 결합한다. 우측 패널은 1G4-TCR 녹인 조건에 대한 TCR 녹인 세포의 총 수가 4 개 공여체 T 세포에서 1G4-DHFR-KI T 세포 또는 1G4-TCR-DHFR KI + DHFR KO T 세포와 비교하여 높다는 것을 나타낸다.
도 11-도 12에 대한 물질 및 방법
인간 일차 T 세포를 버피 코트 BC33 및 BC35로부터 항-CD3/CD28 비드에 의해 단리시키고 활성화시켰다. 활성화 후 2 일에, 세포를 수집하고, 전기천공을 다음 구성요소와 함께 세포로 수행하였다: (1) DHFR 유전자좌에서 10 개의 상이한 부위를 표적화하는 DHFR sgRNA/Cas9 RNP, (2) DHFR mRNA에서 6 개의 상이한 부위를 표적화하는 DHFR siRNA. 전기천공 후 3일에, 세포를 밤새 MTX-플루오레세인과 항온처리한 다음에, 플루오레세인 발현의 FACS 분석을 위해 수집하였다(도 12).
도 11은 DHFR 발현을 결정하기 위해 MTX-플루오레세인 표지를 사용한 결과를 제공하고, 좌측 패널은 표지가 없는 세포가 플루오레세인 염색에 대해 크게 음성이라는 것을 나타내고; 중간 및 우측 도면은 MTX-플루오레세인으로 표지된 세포이고; 중간 도면은 대조군 세포(야생형)가 플루오레세인 염색에 대해 크게 양성이라는 것을 나타내고; 우측 패널은 DHFR sgRNA로 전기천공된 세포가 MTX-플루오레세인 염색에 대해 대부분 음성이라는 것을 나타낸다. 이 데이터는 플루오레세인-표지된 MTX가 사용되어, DHFR-녹아웃 세포를 확인할 수 있다는 것을 제시한다.
도 12, 좌측 패널은 DHFR을 표적화하는 효율적 안내 RNA를 스크리닝하기 위한 도 11에 기재된 방법을 나타내고; 우측 패널은 DHFR을 표적화하는 효율적 siRNA를 스크리닝하기 위한 도 11에 기재된 방법의 사용을 나타낸다.
상기 결과는 1) DHFR 선택 전략이 TCR 녹인 세포를 강하게 풍부화시킬 수 있고, 2) MTX 표지가 DHFR 발현을 정량화할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 2
이 실시예는 일부 실시양태에 따른 방법이 돌연변이체 DHFR 유전자를 도입한 후, 임상적으로 승인된 약물 메토트렉세이트(MTX)로 선택함으로써 유전적으로-변형된 T 세포를 효율적으로 풍부화시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
3 개 공여체(BC37, BC38, 및 BC39)로부터의 T 세포를 NY-ESO-1 1G4 TCR을 코딩하는 대조군 수선 주형(1G4 KI) 또는 메토트렉세이트 (MTX)-저항성 DHFR 돌연변이체 유전자와 연결된 1G4 TCR을 코딩하는 수선 주형(1G4-DHFRm KI)을 갖는 CRISPR/Cas9을 사용하여 녹인시켰다. 그 다음에, T 세포를 1G4 TCR의 β-쇄에 결합하는 항-Vβ13.1(Biolegend, cat # 362406) 항체로 염색하였다. 1G4-DHFRm KI 주형으로 수선된 세포에 대해, 이들을 4 일 동안 전기천공 후 3 일차에 0.1 μM MTX로 처치하였다. 1G4 KI 주형으로 수선된 세포에 대해, 이들을 FACS 분석을 수행할 때까지 미처치된 채로 방치하였다. FACS 분석을 전기천공 후 11 일차에 수행하였다.
도 13a는 대조군 수선 주형 1G4 KI의 녹인을 갖는 T 세포를 나타내는 FACS 플롯이고, 도 13b는 수선 주형 1G4-DHFRm KI의 녹인을 갖는 T 세포를 나타내는 FACS 플롯이고, 도 13c는 2 개 기술적 복제물을 이용한 도 13a 및 도 13b의 정량화를 나타내는 막대 차트이다.
도 13a-c에서의 데이터는 MTX-저항성 DHFRm의 도입 및 MTX를 이용한 세포의 후속 처치가 각각 BC37, BC38, 및 BC39에 대해 26%에서 85%(3.3 배 풍부화), 15%에서 73%(4.9 배 풍부화) 및 26%에서 83%(3.2 배 풍부화)로 증가된 성공적 녹인을 갖는 T 세포의 빈도로서 녹인 T 세포의 효율적 선택을 야기한다는 것을 나타낸다. 데이터는 발명에 기재된 방법이 돌연변이체 DHFR 유전자를 도입한 후, 임상적으로 승인된 약물 MTX로 선택함으로써 유전적으로-변형된 세포를 효율적으로 풍부화시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
도 14는 도 13에 기재된 2 개 녹인 조건의 T 세포 증식을 나타내는 막대 플롯이다. 총 세포 수를 전기천공 후 10 일차에 계수하고 TCR 녹인 세포 수를 녹인 효율의 FACS 분석을 기초로 하여 계산하였다. 데이터는 MTX 선택 전략을 적용함으로써, 3 개 공여체에서 TCR 녹인 세포의 수율이 종래의 비-선택된 방법과 비교하여 2-3 배 높다는 것을 나타내었다.
실시예 3
이 실시예는 효율적으로 풍부화된 유전적으로-변형된 T 세포가 CD4+ 세포의 비율을 상당히 변경하지 않은 일부 실시양태에 따른 방법을 나타낸다. CD4+ 세포는 인간 T 세포의 2 개 주요 서브세트 중 하나이다(나머지는 CD8+ T 세포임). CD4+ 세포의 비정상적 비율은 손상된 면역 기능을 나타낼 것이다.
도 15는 항-CD4 항체(BD Bioscience, cat #: 345768)를 이용한 염색에 의한 도 13에 기재된 2 개 녹인 조건에서의 CD4+ 세포의 비율의 FACS 분석을 나타낸다. 데이터는 CD4+ 세포의 비율이 2 개 조건 사이에 유사하였으며, 따라서 MTX-선택 전략이 CD4+ 세포의 비율을 상당히 변경하지 않았다는 것을 나타내었다.
실시예 4
이 실시예는 일부 실시양태에 따른 방법이 풍부화된 유전적으로-변형된 T 세포의 표현형을 상당히 변경하지 않았다는 것을 나타낸다.
도 16은 항-CD45RA(BD Biosciences, cat #: 563963) 및 항-CD62L 항체(BD Biosciences, cat #: 562330)를 이용한 염색에 의한 도 13에 기재된 2 개 녹인 조건 하의 TCR 녹인 세포의 표현형의 FACS 분석을 나타낸다. CD45RA+CD62L+ 집단은 나이브 줄기 세포-유사 표현형을 반영하며, 이는 고도로 기능적이다. 데이터는 CD45RA+CD62L+ 세포의 집단이 2 개 녹인 조건 사이에 유사하였으며, 따라서 MTX-선택 전략이 세포의 표현형을 상당히 변경하지 않았다는 것을 나타내었다.
도 17은 항-CD27(BD Biosciences, cat #: 740972) 및 항-CD28 항체(BD Biosciences, cat #: 559770)를 이용한 염색에 의한 도 13에 기재된 2 개 녹인 조건 하의 TCR 녹인 세포의 표현형의 FACS 분석을 나타낸다. 공동-수용체 CD27 및 CD28은 T 세포 공동자극 분자이며, 따라서 이중-양성 세포는 고도로 기능적인 T 세포로 고려된다. 데이터는 CD27+CD28+ 세포의 집단이 2 개 녹인 조건 사이에서 유사하였으며, 따라서 MTX-선택 전략이 세포의 표현형을 상당히 변경하지 않았다는 것을 나타내었다.
실시예 5
이 실시예는 일부 실시양태에 따른 방법에 의해 생성된, 풍부화된 유전적으로-변형된 T 세포가 선택 없이 생성된 T 세포와 유사한 세포용해 용량을 갖는다는 것을 나타낸다.
인간 흑색종 A375 세포(HLA-A*02:01+ NY-ESO-1+)를 6-웰 플레이트에 플레이팅하고 실시예 2에서 생성된 바와 같은 상이한 수의 NY-ESO-1 1G4 TCR 녹인 T 세포(공여체 BC37로부터의 것)를 첨가하였다(0:1에서 2:1의 E:T 비). 5 일 후, 나머지 종양 세포를 포름알데하이드로 고정하고 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색하였다. 도 18에 나타낸 바와 같이, 좌측 플레이트를 비편집된 T 세포와 함께 공동-배양하고, 중간 플레이트를 1G4-녹인 T 세포(1G4 KI)와 함께 공동-배양하고 우측 플레이트를 MTX-선택된 1G4-DHFRm-녹인 T 세포(1G4-DHFRm KI + MTX)와 함께 하였다. 결과는 이 공동-배양 분석이 TCR-특이적 종양 세포 사멸을 나타낼 수 있다는 것을 나타내었으며, 이는 NY-ESO-1 1G4 TCR 발현을 갖지 않는 비편집된 T 세포가 종양 세포를 사멸시킬 수 없는 한편, 1G4 TCR 녹인 T 세포(중간 및 우측 플레이트)는 중간 내지 높은 E:T 비에서 종양 세포를 효율적으로 제거할 수 있기 때문이다. 결과는 또한 MTX-선택 방법에 의해 생성된 T 세포(우측 플레이트)가 선택 없이 생성된 T 세포(중간 플레이트)와 유사한 세포용해 용량을 갖는다는 것을 나타내었다.
도 19는 2 개 추가 공여체(BC38 및 BC39)로부터 유래된 T 세포를 이용한 종양-T 세포 공동-배양 분석을 나타낸다. 결과는 MTX-선택 방법에 의해 생성된 T 세포(우측 칼럼)가 선택 없이 생성된 T 세포(좌측 칼럼)와 유사한 세포용해 용량을 갖는다는 것을 확인하였다.
실시예 6
이 실시예는 일부 실시양태에 따른 방법에 의해 생성된, 풍부화된 유전적으로-변형된 T 세포가 선택 없이 생성된 T 세포와 유사한 IFNγ 및 IL2 생산 용량을 갖는다는 것을 나타낸다.
IFNγ는 면역 반응에서 중심 역할을 수행하는 사이토카인이고, 이는 활성화된 T 세포의 핵심 특징 중 하나로 고려된다. 풍부화된 유전적으로-변형된 T 세포(실시예 2에서 생산된 바와 같음)의 IFNγ 생산 용량을 연구하기 위해, 인간 흑색종 A375(HLA-A*02:01+ NY-ESO-1+) 세포를 96-웰 플레이트에 플레이팅하고 상이한 수의 NY-ESO-1 1G4 TCR 녹인 T 세포(2 개 공여체로부터의 것, 도 20, 제1 열: 공여체 BC37, 제2 열: 공여체 BC39)를 첨가하였다(1:2 내지 1:8의 E:T 비, 첫번째 3 개 칼럼). 자극을 위한 양성 대조군으로서, PMA 및 이오노마이신(PMA + ION, 우측 칼럼)을 첨가하였다. T 세포를 브레펠딘 A(Golgi-plug BD Biosciences, cat #: 554724)의 존재 하에 밤새 자극하여, 사이토카인 분비를 예방하고 항-IFNγ 항체(BD Biosciences, cat #: 340452) 및 항-IL2 항체(BD Biosciences, cat #: 340448)를 이용한 세포내 염색에 의한 IFNγ 생산의 FACS 분석을 위해 수집하였다. IFNγ-생산 T 세포의 비율을 도 20에 나타낸 바와 같이 플롯팅하였다. 데이터는 MTX-선택 방법에 의해 생성된 T 세포(1G4-DHFRm KI + MTX)가 선택 없이 생성된 T 세포(1G4 KI)와 유사한 IFNγ 생산 용량을 갖는다는 것을 나타내었다.
도 21은 종양 세포로 자극될 때, T 세포의 IFNγ 생산 용량을 나타내는 막대 플롯이다. 도 20에서와 같이, T 세포를 상이한 E:T 비에서 A375 세포로 자극하고, IFNγ 발현 수준(평균 형광 강도, MFI에 의해 결정됨)을 본원에 플롯팅하였다. 데이터는 MTX-선택 방법에 의해 생성된 T 세포(1G4-DHFRm KI + MTX)가 선택 없이 생성된 T 세포(1G4 KI)와 비교하여 유사한 양의 IFNγ를 생산한다는 것을 나타내었다.
도 22는 종양 세포로 자극될 때, T 세포의 IL2 생산 용량을 나타내는 막대 플롯이다. 도 20 및 도 21에 나타낸 바와 같이, T 세포를 상이한 E:T 비에서 A375 세포로 자극하였다. IL2-생산 세포의 비율(좌측 패널) 및 이의 발현 수준(MFI, 우측 패널)을 본원에 플롯팅하였다. 좌측 패널은 MTX-선택 방법에 의해 생성된 T 세포(1G4-DHFRm KI + MTX)가 선택 없이 생성된 T 세포(1G4 KI)와 같이 높은 비율의 IL2-생산 세포를 갖는다는 것을 나타낸 한편, 우측 패널은 MTX-선택 방법에 의해 생성된 T 세포(1G4-DHFRm KI + MTX)가 선택 없이 생성된 T 세포(1G4 KI)와 비교하여 유사한 양의 IL2를 생산한다는 것을 나타내었다.
실시예 7
이 실시예는 일부 실시양태에 따른 방법에 의해 생성된, 풍부화된 유전적으로-변형된 T 세포가 선택 없이 생성된 T 세포와 유사한 증식 용량을 갖는다는 것을 나타낸다.
도 23은 종양 세포로 자극될 때, T 세포 증식 용량을 나타내는 히스토그램이다. A375 세포를 24 웰 플레이트 상에 플레이팅하고, 상이한 비의 CFSE-표지된 T 세포(1:2 및 1:4의 E:T)를 플레이트에 첨가하였다. T 세포를 CFSE 희석액의 FACS 분석을 위해 3 일 후에 수집하였다. 데이터는 종양 세포로 자극시 MTX-선택 방법에 의해 생성된 T 세포(1G4-DHFRm KI + MTX)의 증식 용량이 선택 없이 생성된 T 세포(1G4 KI)와 유사하였다는 것을 나타내었다.
실시예 8
이 실시예는 분열-DHFR 전략이 이중 조작된 T 세포를 효율적으로 풍부화시킬 수 있고, 이 풍부화가 MTX 용량-의존적 방식으로 작동한다는 것을 나타낸다.
도 28은 BC45 및 BC46 이중 형질도입의 FACS 결과를 나타낸다. 2 개 버피 코트로부터 단리된 활성화된 인간 일차 T 세포, BC45 및 BC46을, 호모다이머화(GCN4) 또는 헤테로다이머화(JUN-FOS) 류신 지퍼에 융합된 N-말단 및 C-말단 단백질 절반으로 분열되는 MTX-저항성 뮤린 DHFRFS 돌연변이체(mDHFRmt)를 코딩하는 BEAV 레트로바이러스 벡터(벡터 A 및 B)로 이중-감염시켰다. 벡터 A 및 B는 또한 각각 Ly6G 또는 CD90.2 형질도입 마커를 코딩하였다. 형질도입 효율의 FACS 분석을 바이러스 감염 후 3 일차에 수행하였다. 데이터는 세포가 벡터 쌍17-18(GCN4-mDHFRmt_A 및 GCN4-mDHFRmt_B) 및 벡터 쌍 30-31(JUN-mDHFRmt_A-2A 및 FOS-mDHFRmt_B-2A)로 효율적으로 형질도입되었다는 것을 나타내었다. 이들 벡터 쌍에 대한 이중 형질도입 효율은 34.4%에서 72.4%로 달랐다. 반대로, 벡터 쌍 21-22(JUN-mDHFRmt_A 및 FOS-mDHFRmt_B) 및 벡터 쌍 23-24(GCN4-mDHFRmt_A-2A 및 GCN4-mDHFRmt_B-2A)에 대한 이중 형질도입 효율은 상대적으로 낮았다(0.058%에서 0.12%). 이중 형질도입된 세포가 풍부화될 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 쌍 17-18 및 쌍 30-31의 세포를 대량의 비형질도입된 세포와 혼합하여, 낮은 형질도입 효율 설정을 모방하였다.
도 29는 BC 45 세포의 MTX 선택의 결과를 나타낸다. 도 28로부터의 BC45 세포를 미처치된 채 방치하거나(열 1), 4 일 동안(형질도입 효율의 결정 후) 25 nM(열 2) 또는 50 nM(열 3) MTX로 처치하고, 그 후에 이중 형질도입된 세포의 풍부화를 FACS 분석에 의해 측정하였다. 데이터는 벡터 쌍 17-18로 감염된 세포가 11%에서 41%(25 nM MTX; 3.7 배) 및 67%(50 nM MTX; 6.1 배)로 풍부화되었고, 벡터 쌍 21-22로 감염된 세포가 0.12%에서 0.53%(50 nM MTX; 4.4 배)로 풍부화되었고, 벡터 쌍 23-24로 감염된 세포가 0.18%에서 2.18%(50 nM MTX; 12 배)로 풍부화되었고, 벡터 쌍 30-31로 감염된 세포가 6%에서 32%(25 nM MTX; 5.3 배) 및 63%(50 nM MTX; 10.5 배)로 풍부화되었다는 것을 나타내었다. 이와 함께, 이들 데이터는 분열-DHFR 전략이 이중 조작된 T 세포를 효율적으로 풍부화시킬 수 있고, 이 풍부화가 MTX 용량-의존적 방식으로 작동한다는 것을 나타내었다.
도 30은 BC 46 세포의 MTX 선택의 결과를 나타낸다. 도 28로부터의 BC46 세포를 미처치된 채 방치하거나(열 1), 4 일 동안(형질도입 효율의 결정 후) 25 nM(열 2) 또는 50 nM(열 3) MTX로 처치하고, 그 후에 이중 형질도입된 세포의 풍부화를 FACS 분석에 의해 측정하였다. 데이터는 벡터 쌍 17-18로 감염된 세포가 13%에서 38%(25 nM MTX; 2.9 배) 및 68%(50 nM MTX; 5.2 배)로 풍부화되었고, 벡터 쌍 21-22로 감염된 세포가 0.05%에서 0.31%(50 nM MTX; 6.2 배)로 풍부화되었고, 벡터 쌍 23-24로 감염된 세포가 0.14%에서 0.82%(50 nM MTX; 5.9 배)로 풍부화되었고, 벡터 쌍 30-31로 감염된 세포가 7%에서 25%(25 nM MTX; 3.6 배) 및 58%(50 nM MTX; 8.3 배)로 풍부화되었다는 것을 나타내었다. 이와 함께, 이들 데이터는 분열-DHFR 전략이 이중 조작된 T 세포를 효율적으로 풍부화시킬 수 있고, 이 풍부화가 MTX 용량-의존적 방식으로 작동한다는 것을 나타내었다.
도 31은 높은 MTX 농도에서 BC 45 세포 선택의 결과를 나타낸다. 도 29로부터의 BC45 세포를 다른 3 일 동안 100 nM MTX로 연속으로 처치하고, 그 후에 이중 형질도입된 세포의 풍부화를 FACS 분석에 의해 측정하였다. 데이터는 벡터 쌍 17-18로 감염된 세포가 7.85%에서 65.9%(열 2; 8.4 배) 및 75.8%(열 3; 9.7 배)로 풍부화되었고, 벡터 쌍 21-22로 감염된 세포가 0.03%에서 0.34%(열 2; 11.3 배) 및 2.82%(열 3; 94 배)로 풍부화되었고, 벡터 쌍 23-24로 감염된 세포가 0.08%에서 2.33%(열 2; 29 배) 및 11%(열 3; 138 배)로 풍부화되었고, 벡터 쌍 30-31로 감염된 세포가 4.4%에서 68%(열 2; 15.5 배) 및 83%(열 3; 18.9 배)로 풍부화되었다는 것을 나타내었다. 이와 함께, 이들 데이터는 분열-DHFR 전략이 이중 조작된 T 세포를 효율적으로 풍부화시킬 수 있고, 이 풍부화가 MTX 용량-의존적 방식으로 작동한다는 것을 나타내었다.
도 32는 높은 MTX 농도에서 BC 46 세포 선택의 결과를 나타낸다. 도 30으로부터의 BC46 세포를 다른 3 일 동안 100 nM MTX로 연속으로 처치하고, 그 후에 이중 형질도입된 세포의 풍부화를 FACS 분석에 의해 측정하였다. 데이터는 벡터 쌍 17-18로 감염된 세포가 9.86%에서 59%(열 2; 6 배) 및 80%(열 3; 8.1 배)로 풍부화되었고, 벡터 쌍 21-22로 감염된 세포가 0.05%에서 0.2%(열 2; 4 배) 및 1.16%(열 3; 23.2 배)로 풍부화되었고, 벡터 쌍 23-24로 감염된 세포가 0.07%에서 0.4%(열 2; 5.7 배) 및 1.83%(열 3; 26.1 배)로 풍부화되었고, 벡터 쌍 30-31로 감염된 세포가 4.5%에서 47%(열 2; 10.4 배) 및 76%(열 3; 16.9 배)로 풍부화되었다는 것을 나타내었다. 이와 함께, 이들 데이터는 분열-DHFR 전략이 이중 조작된 T 세포를 효율적으로 풍부화시킬 수 있고, 이 풍부화가 MTX 용량-의존적 방식으로 작동한다는 것을 나타내었다.
실시예 9
이 실시예는 돌연변이체 JUN-FOS 류신 지퍼를 사용하는 분열-DHFR 시스템이 야생형 JUN-FOS 류신 지퍼를 사용한 것과 유사한 효율로 이중 조작된 T 세포를 풍부화시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
도 43a 및 43b는 이중 조작된 BC54 T 세포의 MTX 선택의 결과를 나타낸다. 버피 코트로부터 단리된 활성화된 인간 일차 T 세포, BC54를 헤테로다이머화 JUN-FOS 류신 지퍼에 융합된 N-말단 및 C-말단 단백질 절반으로 분열되는 MTX-저항성 뮤린 DHFRFS 돌연변이체(mDHFR)를 코딩하는 BEAV 레트로바이러스 벡터(벡터 A 및 B)로 이중-감염시켰다. JUNWT은 야생형 JUN 류신 지퍼를 도시하고, FOSWT는 야생형 FOS 류신 지퍼를 도시하고, JUNMUT3AA은 FOS로부터의 3 개 산성 아미노산을 함유하는 돌연변이체 JUN 류신 지퍼를 도시하고, FOSMUT3AA는 JUN으로부터의 3 개 염기성 아미노산을 함유하는 돌연변이체 FOS 류신 지퍼를 도시한다. 벡터 A 및 B는 또한 각각 Ly6G 및 CD90.2 형질도입 마커를 코딩하였다. 형질도입 후 4 일에 출발하여, 세포를 미처치된 채 방치하거나(열 1), 2 일 동안 100 nM MTX로 처치하고(열 2), 그 후에 이중 형질도입된 세포의 풍부화를 FACS 분석에 의해 측정하였다. 데이터는 벡터 쌍 JUNWT-mDHFR_A + FOSWT-mDHFR_B로 감염된 세포가 7.97%에서 54.1%(6.8 배)로 풍부화되었고, 벡터 쌍 JUNMUT3AA-mDHFR_A + FOSMUT3AA-mDHFR_B로 감염된 세포가 10.3%에서 57.9%(5.6 배)로 풍부화되었고, 벡터 쌍 JUNWT-mDHFR_A + FOSMUT3AA-mDHFR_B로 감염된 세포가 6.26%에서 12.0%(1.9 배)로 풍부화되었고, 벡터 쌍 JUNMUT3AA-mDHFR_A + FOSWT-mDHFR_B로 감염된 세포가 7.73%에서 30.5%(3.9 배)로 풍부화되었다는 것을 나타내었다. 이와 함께, 이들 데이터는 3 개 전하-쌍 돌연변이를 갖는 돌연변이체 JUN-FOS 류신 지퍼를 사용하는 분열-DHFR 시스템이 이중 조작된 T 세포를 효율적으로 풍부화시킬 수 있지만, 3 개 전하-쌍 돌연변이가 야생형 JUN 및 FOS 류신 지퍼와의 상호작용을 폐지하기에 불충분하다는 것을 나타내었다.
도 44a-44d는 이중 조작된 BC76 T 세포의 MTX 선택의 결과를 나타낸다. 버피 코트로부터 단리된 활성화된 인간 일차 T 세포, BC76을 헤테로다이머화 JUN-FOS 류신 지퍼에 융합된 N-말단 및 C-말단 단백질 절반으로 분열되는 MTX-저항성 뮤린 DHFRFS 돌연변이체(mDHFR)를 코딩하는 레트로바이러스 벡터(벡터 A 및 B)로 이중-감염시켰다. JUNWT은 야생형 JUN 류신 지퍼를 도시하고, FOSWT는 야생형 FOS 류신 지퍼를 도시하고, JUNMUT3AA은 FOS로부터의 3 개 산성 아미노산을 함유하는 돌연변이체 JUN 류신 지퍼를 도시하고, FOSMUT3AA는 JUN으로부터의 3 개 염기성 아미노산을 함유하는 돌연변이체 FOS 류신 지퍼를 도시하고, JUNMUT4AA은 FOS로부터의 4 개 산성 아미노산을 함유하는 돌연변이체 JUN 류신 지퍼를 도시하고, FOSMUT4AA는 JUN으로부터의 4 개 염기성 아미노산을 함유하는 돌연변이체 FOS 류신 지퍼를 도시한다. 벡터 A 및 B는 또한 각각 Ly6G 및 CD90.2 형질도입 마커를 코딩하였다. 형질도입 후 4 일에 출발하여, 세포를 미처치된 채 방치하거나(열 1), 10 일 동안 100 nM MTX로 처치하고(열 2), 그 후에 이중 형질도입된 세포의 풍부화를 FACS 분석에 의해 측정하였다. 데이터는 벡터 쌍 JUNWT-mDHFR_A + FOSWT-mDHFR_B로 감염된 세포가 0.61%에서 80.4%(132 배)로 풍부화되었고, 벡터 쌍 JUNMUT3AA-mDHFR_A + FOSMUT3AA-mDHFR_B로 감염된 세포가 0.98%에서 70.9%(72 배)로 풍부화되었고, 벡터 쌍 JUNWT-mDHFR_A + FOSMUT3AA-mDHFR_B로 감염된 세포가 0.97%에서 3.01%(3.1 배)로 풍부화되었고, 벡터 쌍 JUNMUT3AA-mDHFR_A + FOSWT-mDHFR_B로 감염된 세포가 1.09%에서 20.9%(19 배)로 풍부화되었고, 벡터 쌍 JUNMUT4AA-mDHFR_A + FOSMUT4AA-mDHFR_B로 감염된 세포가 1.04%에서 72.6%(70 배)로 풍부화되었고, 벡터 쌍 JUNWT-mDHFR_A + FOSMUT4AA-mDHFR_B로 감염된 세포가 1.00%에서 1.42%(1.4 배)로 풍부화되었고, 벡터 쌍 JUNMUT4AA-mDHFR_A + FOSWT-mDHFR_B로 감염된 세포가 0.86%에서 2.23%(2.6 배)로 풍부화되었다는 것을 나타내었다. 이와 함께, 이들 데이터는 4 개 전하-쌍 돌연변이를 갖는 돌연변이체 JUN-FOS 류신 지퍼를 사용하는 분열-DHFR 시스템이 이중 조작된 T 세포를 효율적으로 풍부화시킬 수 있고, 4 개 전하-쌍 돌연변이가 야생형 JUN 및 FOS 류신 지퍼와의 상호작용을 크게 폐지하기에 충분하다는 것을 나타내었다.
실시예 10
이 실시예는 돌연변이체 FKBP12 다이머화 도메인을 사용하는 분열-DHFR 시스템이 화학적 다이머화 유도제 AP1903의 존재 하에 이중 조작된 T 세포를 풍부화시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
도 45a-45b는 이중 조작된 BC81 T 세포의 MTX 선택의 결과를 나타낸다. 버피 코트로부터 단리된 활성화된 인간 일차 T 세포, BC81을 호모다이머화 돌연변이체 FKBP12 도메인에 융합된 N-말단 및 C-말단 단백질 절반으로 분열되는 MTX-저항성 뮤린 DHFRFS 돌연변이체(mDHFR)를 코딩하는 레트로바이러스 벡터(벡터 A 및 B)로 이중-감염시켰다. 비형질도입됨은 비-형질도입된 세포를 도시하고, FKBP12F36V는 F36V 돌연변이를 함유하는 FKBP12 단백질을 도시하고, 이는 AP1903 다이머화제 약물에 대한 결합을 향상시킨다. 벡터 A 및 B는 또한 각각 Ly6G 및 CD90.2 형질도입 마커를 코딩하였다. 형질도입 후 4 일에 출발하여, 세포를 미처치된 채 방치하거나(칼럼 1 및 2) 4 시간 동안 10 nM AP1903로 처치하였다(칼럼 3). 그 후에, 세포를 미처치된 채 방치하거나(열 1), 8 일 동안 100 nM MTX로 처치하고(열 2), 그 후에 이중 형질도입된 세포의 풍부화를 FACS 분석에 의해 측정하였다. 데이터는 AP1903 처치 없이 벡터 쌍 FKBP12F36V-mDHFR_A + FKBP12F36V-mDHFR_B로 감염된 세포가 0.051%에서 0.042%(0.82 배)로 풍부화되었고, AP1903 처치와 함께 벡터 쌍 FKBP12F36V-mDHFR_A + FKBP12F36V-mDHFR_B로 감염된 세포가 0.061%에서 18.1%(297 배)로 풍부화되었다는 것을 나타내었다. 이와 함께, 이들 데이터는 돌연변이체 FKBP12 다이머화 도메인을 사용하는 분열-DHFR 시스템이 이중 조작된 T 세포를 효율적으로 풍부화시킬 수 있고, 이 풍부화가 AP1903-의존적 방식으로 작동한다는 것을 나타내었다.
실시예 11
이 실시예는 돌연변이체 FKBP12 다이머화 도메인 또는 돌연변이체 JUN-FOS 류신 지퍼를 사용하는 분열-DHFR 시스템이 제1 유전자좌 내로의 제1 외인성 단백질 및 제2 유전자좌 내로의 제2 외인성 단백질의 녹-인을 갖는 이중 조작된 T 세포를 풍부화시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
도 46은 이중 조작된 BC78 T 세포의 MTX 선택의 결과를 나타낸다. 버피 코트로부터 단리된 활성화된 인간 일차 T 세포, BC78을 호모다이머화 돌연변이체 FKBP12 도메인, 또는 헤테로다이머화 돌연변이체 JUN-FOS 류신 지퍼에 융합된 N-말단 및 C-말단 단백질 절반으로 분열되는 MTX-저항성 뮤린 DHFRFS 돌연변이체(mDHFR)를 코딩하는 Cas9 RNP 및 수선 주형(수선 주형 A 및 B)으로 전기천공하였다. 비편집됨은 비전기천공된 세포를 도시하고, FKBP12F36V-mDHFR_A는 NY-ESO-1 1G4 TCR을 코딩하는 수선 주형 및 F36V 돌연변이를 함유하는 FKBP12 단백질의 TRAC 유전자좌 녹-인을 도시하고, FKBP12F36V-mDHFR_B는 우성-음성 TGFBR2를 코딩하는 수선 주형, Ly6G 및 F36V 돌연변이를 함유하는 FKBP12 단백질의 B2M 유전자좌 녹-인을 도시하고, JUNMUT4AA-mDHFR_A는 NY-ESO-1 1G4 TCR을 코딩하는 수선 주형 및 FOS로부터의 4 개 산성 아미노산을 함유하는 돌연변이체 JUN 류신 지퍼의 TRAC 유전자좌 녹-인을 도시하고, FOSMUT4AA-mDHFR_B는 우성-음성 TGFBR2를 코딩하는 수선 주형, Ly6G 및 JUN으로부터의 4 개 염기성 아미노산을 함유하는 돌연변이체 FOS 류신 지퍼의 B2M 유전자좌 녹-인을 도시한다. 전기천공 후 4 일에 출발하여, 세포를 미처치된 채 방치하거나(칼럼 1 및 3) 1 시간 동안 10 nM AP1903으로 처치하였다(칼럼 2). 그 후에, 세포를 미처치된 채 방치하거나(열 1), 6 일 동안 100 nM MTX로 처치하고(열 2), 그 후에 이중 조작된 세포의 풍부화를 FACS 분석에 의해 측정하였다. 데이터는 수선 주형 쌍 FKBP12F36V-mDHFR_A + FKBP12F36V-mDHFR_B로 편집된 세포가 0.21%에서 22.1%(105 배)로 풍부화되었고, 수선 주형 쌍 JUNMUT4AA-mDHFR_A + FOSMUT4AA-mDHFR_B로 편집된 세포가 0.22%에서 11.8%(54 배)로 풍부화되었다는 것을 나타내었다. 이와 함께, 이들 데이터는 4 개 전하-쌍 돌연변이를 갖는 돌연변이체 FKBP12 다이머화 도메인 또는 돌연변이체 JUN-FOS 류신 지퍼를 사용하는 분열-DHFR 시스템이 2 개 상이한 유전자좌 내로의 다중 외인성 단백질의 녹-인을 갖는 이중 조작된 T 세포를 효율적으로 풍부화시킬 수 있다는 것을 나타내었다.
실시예 12
이 실시예는 돌연변이체 JUN-FOS 류신 지퍼를 사용하는 분열-DHFR 시스템이 야생형 JUN-FOS 류신 지퍼를 사용하는 것과 유사한 효율로 이중 조작된 T 세포를 풍부화시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
도 47a, 47b 및 48은 공여체 A 및 B로부터의 이중 조작된 T 세포의 MTX 선택의 결과를 나타낸다. 2 개 버피 코트 A 및 B로부터 단리된 활성화된 인간 일차 T 세포를 헤테로다이머화 JUN-FOS 류신 지퍼에 융합된 N-말단 및 C-말단 단백질 절반으로 분열되는 MTX-저항성 뮤린 DHFRFS 돌연변이체(mDHFR)를 코딩하는 레트로바이러스 벡터(벡터 A 및 B)로 이중-감염시켰다. JUNWT은 야생형 JUN 류신 지퍼를 도시하고, FOSWT는 야생형 FOS 류신 지퍼를 도시하고, JUNMUT3AA은 FOS로부터의 3 개 산성 아미노산을 함유하는 돌연변이체 JUN 류신 지퍼를 도시하고, FOSMUT3AA는 JUN으로부터의 3 개 염기성 아미노산을 함유하는 돌연변이체 FOS 류신 지퍼를 도시한다. 벡터 A 및 B는 또한 각각 Ly6G 및 CD90.2 형질도입 마커를 코딩하였다. 형질도입 후 4 일에 출발하여, 세포(공여체 B로부터의 것)를 미처치된 채 방치하거나(도 47a 및 47b, 열 1), 4 일 동안 100 nM MTX로 처치하고(도 47a 및 47b, 열 2), 그 후에 이중 형질도입된 세포의 풍부화를 FACS 분석에 의해 측정하였다. 데이터는 벡터 쌍 JUNWT-mDHFR_A + FOSWT-mDHFR_B로 감염된 세포(공여체 B로부터의 것)가 5.18%에서 80.5%(15.5 배)로 풍부화되었고, 벡터 쌍 JUNMUT3AA-mDHFR_A + FOSMUT3AA-mDHFR_B로 감염된 세포가 8.37%에서 88.1%(10.5 배)로 풍부화되었고, 벡터 쌍 JUNWT-mDHFR_A + FOSMUT3AA-mDHFR_B로 감염된 세포가 5.24%에서 20.8%(4 배)로 풍부화되었고, 벡터 쌍 JUNMUT3AA-mDHFR_A + FOSWT-mDHFR_B로 감염된 세포가 6.28%에서 70.5%(11.2 배)로 풍부화되었다는 것을 나타내었다. 이와 함께, 이들 데이터는 3 개 전하-쌍 돌연변이를 갖는 돌연변이체 JUN-FOS 류신 지퍼를 사용하는 분열-DHFR 시스템이 이중 조작된 T 세포를 효율적으로 풍부화시킬 수 있지만, 3 개 전하-쌍 돌연변이가 야생형 JUN 및 FOS 류신 지퍼와의 상호작용을 폐지시키기에 불충분하다는 것을 나타내었다. 도 48은 공여체 A 및 공여체 B 둘 다로부터의 세포의 FACS 정량화 데이터를 나타낸다.
도 49 및 50은 2 개 공여체로부터의 이중 조작된 T 세포의 MTX 선택의 결과를 나타낸다. 2 개 공여체(A 및 B)로부터의 버피 코트로부터 단리된 활성화된 인간 일차 T 세포를 짧은 길이의 헤테로다이머화 JUN-FOS 류신 지퍼(이 슬라이드에 기재된 모든 FOS JUN 류신 지퍼는 짧은 길이의 것임)에 융합된 N-말단 및 C-말단 단백질 절반으로 분열되는 MTX-저항성 뮤린 DHFRFS 돌연변이체(mDHFR)를 코딩하는 레트로바이러스 벡터(벡터 A 및 B)로 이중-감염시켰다. JUNWT은 야생형 JUN 류신 지퍼를 도시하고, FOSWT는 야생형 FOS 류신 지퍼를 도시하고, JUNMUT3AA은 FOS로부터의 3 개 산성 아미노산을 함유하는 돌연변이체 JUN 류신 지퍼를 도시하고, FOSMUT3AA는 JUN으로부터의 3 개 염기성 아미노산을 함유하는 돌연변이체 FOS 류신 지퍼를 도시하고, JUNMUT4AA은 FOS로부터의 4 개 산성 아미노산을 함유하는 돌연변이체 JUN 류신 지퍼를 도시하고, FOSMUT4AA는 JUN으로부터의 4 개 염기성 아미노산을 함유하는 돌연변이체 FOS 류신 지퍼를 도시한다. 벡터 A 및 B는 또한 각각 Ly6G 및 CD90.2 형질도입 마커를 코딩하였다. 형질도입 후 4 일에 출발하여, 세포를 미처치된 채 방치하거나, 6 일 동안 100 nM MTX로 처치하고, 그 후에 이중 형질도입된 세포의 풍부화를 FACS 분석에 의해 측정하였다. 데이터(도 49)는 벡터 쌍 JUNWT-mDHFR_A + FOSWT-mDHFR_B로 감염된 세포가 66 ± 6.6(공여체 A) 및 7.6 ± 1.1(공여체 B) 배 풍부화되었고, 벡터 쌍 JUNMUT3AA-mDHFR_A + FOSMUT3AA-mDHFR_B로 감염된 세포가 49 ± 1.5(공여체 A), 6.6 ± 0.9(공여체 B) 배 풍부화되었고, 벡터 쌍 JUNWT-mDHFR_A + FOSMUT3AA-mDHFR_B로 감염된 세포가 1.7 ± 0.1(공여체 A) 및 1.4 ± 0.17(공여체 B) 배 풍부화되었고, 벡터 쌍 JUNMUT3AA-mDHFR_A + FOSWT-mDHFR_B로 감염된 세포가 3.2 ± 0.66(공여체 A) 및 1.5 ± 0.38(공여체 B) 배 풍부화되었다는 것을 나타내었다. 데이터(도 50)는 벡터 쌍 JUNMUT4AA-mDHFR_A + FOSMUT4AA-mDHFR_B로 감염된 세포가 39 ± 13(공여체 A) 및 4.7 ± 0.32(공여체 B) 배 풍부화되었고, 벡터 쌍 JUNWT-mDHFR_A + FOSMUT4AA-mDHFR_B로 감염된 세포가 1.5 ± 0.13(공여체 A) 및 1.2 ± 0.043(공여체 B)로 풍부화되었고, 벡터 쌍 JUNMUT4AA-mDHFR_A + FOSWT-mDHFR_B로 감염된 세포가 2.2 ± 0.43(공여체 A) 및 1.5 ± 0.21(공여체 B)로 풍부화되었다는 것을 나타내었다. 이와 함께, 이들 데이터는 3 또는 4 개 전하-쌍 돌연변이를 갖는 돌연변이체 짧은 JUN-FOS 류신 지퍼를 사용하는 분열-DHFR 시스템이 이중 조작된 T 세포를 효율적으로 풍부화시킬 수 있고, 3 또는 4 개 전하-쌍 돌연변이가 야생형 JUN 및 FOS 류신 지퍼와의 상호작용을 크게 폐지시키기에 충분하다는 것을 나타내었다.
실시예 13
이 실시예는 8 개 전하-쌍 돌연변이 JUN-FOS 류신 지퍼를 사용하는 분열-DHFR 시스템이 이중 조작된 T 세포를 풍부화시킬 수 없다는 것을 나타낸다.
도 51a, 51b, 및 52는 공여체 A 및 B로부터의 이중 조작된 T 세포의 MTX 선택의 결과를 나타낸다. 2 개 버피 코트 A 및 B로부터 단리된 활성화된 인간 일차 T 세포를 헤테로다이머화 JUN-FOS 류신 지퍼에 융합된 N-말단 및 C-말단 단백질 절반으로 분열되는 MTX-저항성 뮤린 DHFRFS 돌연변이체(mDHFR)를 코딩하는 레트로바이러스 벡터(벡터 A 및 B)로 이중-감염시켰다. sJUN은 짧은 야생형 JUN 류신 지퍼를 도시하고, sFOS는 야생형 FOS 류신 지퍼를 도시하고, sJUNMUT8AA는 FOS로부터의 8 개 산성 아미노산을 함유하는 짧은 돌연변이체 JUN 류신 지퍼를 도시하고, sFOSMUT8AA는 JUN으로부터의 8 개 염기성 아미노산을 함유하는 돌연변이체 FOS 류신 지퍼를 도시한다. 벡터 A 및 B는 또한 각각 Ly6G 및 CD90.2 형질도입 마커를 코딩하였다. 형질도입 후 4 일에 출발하여, 세포(공여체 B로부터의 것)를 미처치된 채 방치하거나(도 51a 및 51b, 열 1), 6 일 동안 100 nM MTX로 처치하고(도 51a 및 51b, 열 2), 그 후에 이중 형질도입된 세포의 풍부화를 FACS 분석에 의해 측정하였다. 데이터(도 51a 및 51b)는 벡터 쌍 sJUN-mDHFR_A + sFOS-mDHFR_B로 감염된 세포(공여체 A로부터의 것)가 6.52%에서 80.4%(12.3 배)로 풍부화되었고, 벡터 쌍 sJUNMUT8AA-mDHFR_A + sFOSMUT8AA-mDHFR_B로 감염된 세포가 0.48%에서 1.07%(2.2 배)로 풍부화되었고, 벡터 쌍 sJUN-mDHFR_A + sFOSMUT8AA-mDHFR_B로 감염된 세포가 3.91%에서 6%(1.5 배)로 풍부화되었고, 벡터 쌍 sJUNMUT8AA-mDHFR_A + sFOS-mDHFR_B로 감염된 세포가 0.82%에서 0.73%(0.9 배)로 풍부화되었다는 것을 나타내었다. 도 52로부터의 데이터는 공여체 A 및 B 둘 다로부터의 FACS 플롯의 정량화를 나타낸다. 결론적으로, 이들 데이터는 8 개 전하-쌍 돌연변이를 갖는 돌연변이체 JUN-FOS 류신 지퍼를 사용하는 분열-DHFR 시스템이 이중 조작된 T 세포를 풍부화시킬 수 없다는 것을 나타내었다.
실시예 14
이 실시예는 돌연변이체 FKBP12 다이머화 도메인을 사용하는 분열-DHFR 시스템이 화학적 다이머화 유도제 AP1903의 존재 하에 이중 조작된 T 세포를 풍부화시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
도 53은 공여체 A 및 B로부터의 이중 조작된 T 세포의 MTX 선택의 결과를 나타낸다. 2 개 버피 코트 공여체 A 및 B로부터 단리된 활성화된 인간 일차 T 세포를 호모다이머화 돌연변이체 FKBP12 도메인에 융합된 N-말단 및 C-말단 단백질 절반으로 분열되는 MTX-저항성 뮤린 DHFRFS 돌연변이체(mDHFR)를 코딩하는 레트로바이러스 벡터(벡터 A 및 B)로 이중-감염시켰다. 비형질도입됨은 비-형질도입된 세포를 도시하고, FKBP12F36V는 F36V 돌연변이를 함유하는 FKBP12 단백질을 도시하고, 이는 AP1903 다이머화제 약물에 대한 결합을 향상시킨다. 벡터 A 및 B는 또한 각각 Ly6G 및 CD90.2 형질도입 마커를 코딩하였다. 형질도입 후 4 일에 출발하여, 세포를 미처치된 채 방치하거나 4 시간 동안 10 nM AP1903으로 처치하였다. 그 후에, 세포를 미처치된 채 방치하거나, 6 일 동안 100 nM MTX로 처치하고, 그 후에 이중 형질도입된 세포의 풍부화를 FACS 분석에 의해 측정하였다. 데이터는 AP1903 처치와 함께 벡터 쌍 FKBP12F36V-mDHFR_A + FKBP12F36V-mDHFR_B로 감염된 세포가 각각 188 ± 53(공여체 A) 및 39 ± 18(공여체 B)로 풍부화되었다는 것을 나타내었다. 이와 함께, 이들 데이터는 돌연변이체 FKBP12 다이머화 도메인을 사용하는 분열-DHFR 시스템이 이중 조작된 T 세포를 효율적으로 풍부화시킬 수 있다는 것을 나타내었다.
실시예 15
이 실시예는 B2M 가이드가 B2M 유전자좌에서 효율적인 절단을 매개할 수 있다는 것을 나타낸다.
도 54는 B2M 유전자좌를 표적화하는 효율적 가이드의 스크리닝의 결과를 나타낸다. 버피 코트로부터 단리된 활성화된 인간 일차 T 세포를 별개 B2M 유전자좌를 표적화하는 5 개 Cas9 RNP로 전기천공하였다. 전기천공 후 2 일에, HLA-ABC 발현을 측정함으로서 세포를 FACS 분석하였다. 데이터는 crB2M-4 및 crB2M-5가 80% 초과의 녹아웃 효율로 B2M 유전자좌를 표적화할 수 있다는 것을 나타내었다. 이 데이터를 기초로 하여, crB2M-4 및 crB2M-5를 후속 녹인 실험을 위해 선택하였다.
예시적 배열 (a):
1.
i) 세포에서 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현할 수 있는 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열을 세포 내로 도입하되,
세포는, 세포가 정상 세포 배양 배지에서 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 감소되는 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질을 갖고,
적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열이 세포에서 발현을 위해 작동가능하거나 표적 게놈에서 사전-결정된 부위 내로 삽입될 때 발현을 위해 작동가능해지고,
적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열이 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 또는 이의 변이체, 및 발현될 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제2-부분 뉴클레오티드 서열이 관심 단백질을 코딩하는 것인,
단계; 및
ii) 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현하는 세포의 선택 또는 풍부화를 위한 약리학적 외인성 선택 압력 없이 정상 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계
를 포함하는,
유전적으로 조작된 세포의 선택 또는 풍부화를 위한 방법.
2.
i) 세포가 정상 시험관내 증식 조건 하에 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 세포의 생존 및/또는 증식을 위해 필수적인 적어도 제1 단백질의 수준을 감소시키는 단계;
ii) 세포에서 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현할 수 있고 제1 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 또는 이의 변이체, 및 발현될 제2 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 2-부분 뉴클레오티드 서열을 세포 내로 도입하되,
적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열이 세포에서 발현을 위해 작동가능하거나 표적 게놈에서 사전-결정된 부위 내로 삽입될 때 발현을 위해 작동가능해지고,
제2-부분 단백질이 관심 단백질인,
단계; 및
iii) 제1 단백질 및 제2 단백질 둘 다를 발현하는 세포의 풍부화를 위한 약리학적 외인성 선택 압력 없이 정상 시험관내 증식 조건 하에 세포를 배양하는 단계
를 포함하는,
유전적으로 조작된 세포의 선택 또는 풍부화를 위한 방법.
3.
배열 1 또는 2 중 어느 하나에 있어서, 필수 단백질의 수준에서의 감소가 영구적 또는 일시적일 수 있는 것인, 방법.
4.
배열 2-3 중 어느 하나에 있어서, 필수 단백질의 수준에서의 감소가 필수 단백질을 코딩하는 유전자의 녹-아웃을 포함하는 것인, 방법.
5.
배열 4에 있어서, 녹-아웃이 CRISPR 리보핵단백질(RNP), TALEN, MegaTAL 또는 임의의 다른 뉴클레아제에 의해 매개되는 것인, 방법.
6.
배열 2-3 중 어느 하나에 있어서, 필수 단백질의 수준에서의 감소가 RNA 수준에서 필수 단백질의 수준에서의 일시적 감소를 포함하는 것인, 방법.
7.
배열 6에 있어서, 일시적 억제가 siRNA, miRNA 또는 CRISPR 간섭(CRISPRi)을 통하는 것인, 방법.
8.
배열 1-7 중 어느 하나에 있어서, 세포가 T 세포, NK 세포, NKT 세포, iNKT 세포, 조혈 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, iPSC, 신경 전구 세포, 망막 유전자 요법에서의 세포 유형 또는 임의의 다른 세포인, 방법.
9.
배열 1-8 중 어느 하나에 있어서, 제1-부분 뉴클레오티드 서열이 뉴클레오티드 서열에서 변경되어, 뉴클레아제, siRNA, miRNA 또는 CRISPRi 저항성을 달성하는 것인, 방법.
10.
배열 9에 있어서, 제1 부분 뉴클레오티드 서열이 필수 제1 단백질과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 것인, 방법.
11.
배열 1-10 중 어느 하나에 있어서, 제1-부분 뉴클레오티드 서열이 변경되어, 제1 단백질과 동일한 아미노산 서열을 갖지 않는 변경된 단백질을 코딩하는 것인, 방법.
12.
배열 11에 있어서, 변경된 단백질은 제1 단백질이 갖지 않는 특이적 특징을 갖는 것인, 방법.
13.
배열 12에 있어서, 특이적 특징이, 비제한적으로, 감소된 활성, 증가된 활성 및 변경된 반감기 중 하나 이상을 포함하는 것인, 방법.
14.
배열 1-13 중 어느 하나에 있어서, 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다가 동일한 프로모터 또는 상이한 프로모터에 의해 구동될 수 있는 것인, 방법.
15.
배열 1-14 중 어느 하나에 있어서, 제2-부분 뉴클레오티드 서열이 적어도 치료 유전자를 포함하는 것인, 방법.
16.
배열 1-15 중 어느 하나에 있어서, 제2-부분 뉴클레오티드 서열이 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 함유하는 신생항원 T-세포 수용체 복합체(TCR)를 코딩하는 것인, 방법.
17.
배열 1-16 중 어느 하나에 있어서, 필수 또는 제1 단백질이 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 이노신 모노포스페이트 탈수소효소 2(IMPDH2), O-6-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라아제(MGMT), 데옥시시티딘 키나아제(DCK), 하이포크산틴 포스포리보실트랜스퍼라아제 1(HPRT1), 인터류킨 2 수용체 서브유닛 감마(IL2RG), 액틴 베타(ACTB), 진핵생물 번역 신장 인자 1 알파 1(EEF1A1), 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH), 포스포글리세레이트 키나아제 1(PGK1) 또는 트랜스페린 수용체(TFRC)인, 방법.
18.
배열 1-17 중 어느 하나에 있어서, 제1-부분 뉴클레오티드 서열이 뉴클레아제-저항성 또는 siRNA-저항성 DHFR 유전자를 포함하고, 제2-부분 뉴클레오티드 서열이 TRA 유전자 및 TRB 유전자를 포함하는 것인, 방법.
19.
배열 18에 있어서, TRA, TRB 및 DHFR 유전자가 단일 개방 판독 프레임으로부터 발현되도록 작동가능하게 구성되는 것인, 방법.
20.
배열 19에 있어서, TRA, TRB 및 DHFR 유전자가 적어도 하나의 링커에 의해 분리되는 것인, 방법.
21.
배열 20에 있어서, 적어도 하나의 링커, TRA, TRB 및 DHFR 유전자의 순서가
TRA - 링커 - TRB - 링커 - DHFR,
TRA - 링커 - DHFR- 링커 - TRB,
TRB - 링커 - TRA - 링커 - DHFR,
TRB - 링커 - DHFR- 링커 - TRA,
DHFR - 링커 - TRA - 링커 - TRB, 또는
DHFR - 링커 - TRB - 링커 - TRA
인,
방법.
22.
배열 20 또는 21에 있어서, 적어도 하나의 링커가 적어도 하나의 자가-절단 2A 펩티드 및/또는 적어도 하나의 IRES 요소인, 방법.
23.
배열 18-22 중 어느 하나에 있어서, DHFR, TRA 및 TRB 유전자가 내인성 TCR 프로모터 또는, 비제한적으로, TRAC, TRBC1/2, DHFR, EEF1A1, ACTB, B2M, CD52, CD2, CD3G, CD3D, CD3E, LCK, LAT, PTPRC, IL2RG, ITGB2, TGFBR2, PDCD1, CTLA4, FAS, TNFRSF1A(TNFR1), TNFRSF10B(TRAILR2), ADORA2A, BTLA, CD200R1, LAG3, TIGIT, HAVCR2(TIM3), VSIR(VISTA), IL10RA, IL4RA, EIF4A1, FTH1, FTL, HSPA5, 및 PGK1의 프로모터를 포함하는 임의의 다른 적합한 프로모터에 의해 구동되는 것인, 방법.
24.
배열 1-23 중 어느 하나에 있어서, 2-부분 뉴클레오티드 서열이 세포의 게놈 내로 통합되는 것인, 방법.
25.
배열 1-24 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 2 부분 뉴클레오티드 서열이 표적 게놈에서 사전-결정된 부위 내로 삽입될 때 발현을 위해 작동가능해지고 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다가 표적 게놈에서 프로모터에 의해 구동되는 것인, 방법.
26.
배열 24 또는 25에 있어서, 통합이 뉴클레아제-매개된 부위-특이적 통합, 전이인자-매개된 유전자 전달 또는 바이러스-매개 유전자 전달을 통하는 것인, 방법.
27.
배열 26에 있어서, 뉴클레아제-매개된 부위-특이적 통합이 CRISPR RNP, 선택적으로 CRISPR/Cas9 RNP를 통하는 것인, 방법.
28.
배열 27에 있어서, 스플릿 인테인 시스템을 사용하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
29.
배열 1-23 중 어느 하나에 있어서, 도입된 2-부분 뉴클레오티드 서열이 세포의 게놈 내로 통합되지 않는 것인, 방법.
30.
배열 1-27 중 어느 하나에 있어서, 내인성 TCR 불변 유전자좌를 표적화하는 CRISPR RNP, 뉴클레아제-저항성 DHFR 유전자를 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 신생항원 TCR을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열이 세포에 전달되는 것인, 방법.
31.
배열 30에 있어서, 내인성 TCR 불변 유전자좌가 TCR 알파 불변(TRAC) 유전자좌 또는 TCR 베타 불변(TRBC) 유전자좌일 수 있는 것인, 방법.
32.
배열 30 또는 31에 있어서, 전달이 전기천공, 또는 기계적 또는 화학적 막 투과화를 기초로 하는 방법에 의한 것인, 방법.
33.
배열 1-5, 8-28 또는 30-32 중 어느 하나에 있어서, 제1 CRISPR RNP가 사용되어, 내인성 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 유전자를 녹-아웃시키고, 제2 CRISPR RNP가 사용되어, CRISPR 뉴클레아제-저항성 DHFR 유전자를 포함하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 치료 TCR 유전자를 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 내인성 TCR 불변 유전자좌 내로 녹-인시키는 것인, 방법.
34.
배열 33에 있어서, 제2 CRISPR RNP가 녹-인을 위해 TRAC 유전자좌를 절단하는 TRAC RNP인, 방법.
35.
배열 5, 27, 30, 33 또는 34 중 어느 하나에 있어서, CRISPR RNP가 CRISPR/Cas9 RNP인, 방법.
36.
배열 1-35 중 어느 하나에 있어서, 정상 세포 배양 배지가 비-매개된 세포의 성장 및/또는 증식에 적합한 것인, 방법.
37.
배열 1-36 중 어느 하나에 있어서, 정상 세포 배양 배지는 임의의 외인성 선택 압력이 없는 것인, 방법.
38.
배열 5-37 중 어느 하나에 있어서, CRISPR RNP가 사용되어, 제2 2-부분 뉴클레오티드를 표적 게놈에서 사전-결정된 부위 내로 녹-인시키고, 선택적으로 표적 게놈에서 사전-결정된 부위가 B2M 유전자인, 방법.
39.
i) 세포에서 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현할 수 있는 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열을 세포 내로 도입하되,
세포는, 세포가 정상 세포 배양 배지에서 생존하고/하거나 증식할 수 없도록 감소되는 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 기능적 활성을 갖고,
적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열이 세포에서 발현을 위해 작동가능하거나 표적 게놈에서 사전-결정된 부위 내로 삽입될 때 발현을 위해 작동가능해지고,
적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열이 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질과 실질적으로 동등한 기능을 제공하는 제1 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 제2 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제2 단백질이 관심 단백질인,
단계; 및
ii) 제1 단백질 및 제2 단백질 둘 다를 발현하는 세포의 풍부화 또는 선택을 야기하는 적어도 하나의 보충제를 함유하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계
를 포함하는,
유전적으로 조작된 세포의 선택 또는 풍부화를 위한 방법.
40.
i) 세포가 정상 시험관내 증식 조건 하에 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 세포의 생존 및/또는 증식을 위해 필수적인 적어도 제1 단백질의 기능적 활성을 감소시키는 단계;
ii) 세포에서 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현할 수 있고 실질적으로 동등한 기능을 제공하는 제1 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 제2 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 2-부분 뉴클레오티드 서열을 세포 내로 도입하되,
적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열이 세포에서 발현을 위해 작동가능하거나 표적 게놈에서 사전-결정된 부위 내로 삽입될 때 발현을 위해 작동가능해지고,
제2 단백질이 관심 단백질인,
단계; 및
iii) 제1 단백질 및 제2 단백질 둘 다를 발현하는 세포의 선택 또는 풍부화를 야기하는 적어도 하나의 보충제를 함유하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계
를 포함하는,
유전적으로 조작된 세포의 선택 또는 풍부화를 위한 방법.
41.
배열 39 또는 40에 있어서, 세포가 T 세포, NK 세포, NKT 세포, iNKT 세포, 조혈 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, iPSC, 신경 전구 세포, 망막 유전자 요법에서의 세포 유형 또는 임의의 다른 세포인, 방법.
42.
배열 39-41 중 어느 하나에 있어서, 제1-부분 뉴클레오티드 서열이 뉴클레오티드 서열에서 변경되어, 뉴클레아제, siRNA, miRNA 또는 CRISPRi 저항성을 달성하고, a) 제1 단백질과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하거나 b) 제1 단백질에 대해 조정된 기능성을 갖는 단백질을 코딩하는 것인, 방법.
43.
배열 39-42 중 어느 하나에 있어서, 제1-부분 뉴클레오티드 서열이 변경되어, 제1 단백질과 동일한 아미노산 서열을 갖지 않는 변경된 단백질을 코딩하는 것인, 방법.
44.
배열 43에 있어서, 변경된 단백질은 제1 단백질이 갖지 않는 특이적 특징을 갖는 것인, 방법.
45.
배열 44에 있어서, 특이적 특징이, 비제한적으로, 감소된 활성, 증가된 활성, 변경된 반감기, 소분자 억제에 대한 저항성 및 소분자 결합 후 증가된 활성 중 하나 이상을 포함하는 것인, 방법.
46.
배열 39-45 중 어느 하나에 있어서, 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다가 동일한 프로모터 또는 상이한 프로모터에 의해 구동될 수 있는 것인, 방법.
47.
배열 39-46 중 어느 하나에 있어서, 제2-부분 뉴클레오티드 서열이 적어도 치료 유전자를 포함하는 것인, 방법.
48.
배열 39-47 중 어느 하나에 있어서, 제2-부분 뉴클레오티드 서열이 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 함유하는 신생항원 T-세포 수용체 복합체(TCR)를 코딩하는 것인, 방법.
49.
배열 39-48 중 어느 하나에 있어서, 필수 또는 제1 단백질이 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 이노신 모노포스페이트 탈수소효소 2(IMPDH2), O-6-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라아제(MGMT), 데옥시시티딘 키나아제(DCK), 하이포크산틴 포스포리보실트랜스퍼라아제 1(HPRT1), 인터류킨 2 수용체 서브유닛 감마(IL2RG), 액틴 베타(ACTB), 진핵생물 번역 신장 인자 1 알파 1(EEF1A1), 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH), 포스포글리세레이트 키나아제 1(PGK1) 또는 트랜스페린 수용체(TFRC)인, 방법.
50.
배열 39-49 중 어느 하나에 있어서, 제1-부분 뉴클레오티드 서열이 단백질 억제제-저항성 DHFR 유전자를 포함하고, 제2-부분 뉴클레오티드 서열이 TRA 유전자 및 TRB 유전자를 포함하는 것인, 방법.
51.
배열 50에 있어서, TRA, TRB 및 DHFR 유전자가 단일 개방 판독 프레임으로부터 발현되도록 작동가능하게 구성되는 것인, 방법.
52.
배열 51에 있어서, TRA, TRB 및 DHFR 유전자가 적어도 하나의 링커에 의해 분리되는 것인, 방법.
53.
배열 52에 있어서, 적어도 하나의 링커, TRA, TRB 및 DHFR 유전자의 순서가
TRA - 링커 - TRB - 링커 - DHFR,
TRA - 링커 - DHFR- 링커 - TRB,
TRB - 링커 - TRA - 링커 - DHFR,
TRB - 링커 - DHFR- 링커 - TRA,
DHFR - 링커 - TRA - 링커 - TRB, 또는
DHFR - 링커 - TRB - 링커 - TRA
인,
방법.
54.
배열 53에 있어서, 적어도 하나의 링커가 적어도 하나의 자가-절단 2A 펩티드 및/또는 적어도 하나의 IRES 요소인, 방법.
55.
배열 50-54 중 어느 하나에 있어서, DHFR, TRA 및 TRB 유전자가 내인성 TCR 프로모터 또는, 비제한적으로, TRAC, TRBC1/2, DHFR, EEF1A1, ACTB, B2M, CD52, CD2, CD3G, CD3D, CD3E, LCK, LAT, PTPRC, IL2RG, ITGB2, TGFBR2, PDCD1, CTLA4, FAS, TNFRSF1A(TNFR1), TNFRSF10B(TRAILR2), ADORA2A, BTLA, CD200R1, LAG3, TIGIT, HAVCR2(TIM3), VSIR(VISTA), IL10RA, IL4RA, EIF4A1, FTH1, FTL, HSPA5 및 PGK1의 프로모터를 포함하는 임의의 다른 적합한 프로모터에 의해 구동되는 것인, 방법.
56.
배열 39-55 중 어느 하나에 있어서, 2-부분 뉴클레오티드 서열이 세포의 게놈 내로 통합되는 것인, 방법.
57.
배열 39-56 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 2 부분 뉴클레오티드 서열이 표적 게놈에서 사전-결정된 부위 내로 삽입될 때 발현을 위해 작동가능해지고 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다가 표적 게놈에서 프로모터에 의해 구동되는 것인, 방법.
58.
배열 57에 있어서, 통합이 뉴클레아제-매개된 부위-특이적 통합, 전이인자-매개된 유전자 전달 또는 바이러스-매개 유전자 전달을 통하는 것인, 방법.
59.
배열 58에 있어서, 뉴클레아제-매개된 부위-특이적 통합이 CRISPR RNP, 선택적으로 CRISPR/Cas9 RNP를 통하는 것인, 방법.
60.
배열 59에 있어서, 스플릿 인테인 시스템을 사용하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
61.
배열 39-55 중 어느 하나에 있어서, 도입된 2-부분 뉴클레오티드 서열이 세포의 게놈 내로 통합되지 않는 것인, 방법.
62.
배열 39-60 중 어느 하나에 있어서, 내인성 TCR 불변 유전자좌를 표적화하는 CRISPR RNP, 단백질 억제제-저항성 DHFR 유전자를 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 신생항원 TCR을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열이 세포에 전달되는 것인, 방법.
63.
배열 62에 있어서, 내인성 TCR 불변 유전자좌가 TCR 알파 불변(TRAC) 유전자좌 또는 TCR 베타 불변(TRBC) 유전자좌일 수 있는 것인, 방법.
64.
배열 62 또는 63에 있어서, 전달이 전기천공, 또는 기계적 또는 화학적 막 투과화를 기초로 하는 방법에 의한 것인, 방법.
65.
배열 62-64 중 어느 하나에 있어서, CRISPR RNP가 녹-인을 위해 TRAC 유전자좌를 절단하는 TRAC RNP인, 방법.
66.
배열 59, 62 또는 65 중 어느 하나에 있어서, CRISPR RNP가 CRISPR/Cas9 RNP인, 방법.
67.
배열 39-66 중 어느 하나에 있어서, 세포의 풍부화 또는 선택을 야기하는 보충제가 유세포분석 또는 자성 비드 풍부화에 의한 세포의 풍부화를 허용하는 항체인, 방법.
68.
배열 39-67 중 어느 하나에 있어서, 보충제가 제1 단백질 및 제2 단백질 둘 다를 발현하지 않으면서 세포의 생존 및/또는 증식을 손상시키는 것인, 방법.
69.
배열 68에 있어서, 제1 단백질이 세포의 생존 및/또는 증식의 보충제 매개된 손상에 대한 세포의 저항성을 매개하는 것인, 방법.
70.
배열 39-69 중 어느 하나에 있어서, 보충제가 메토트렉세이트인, 방법.
71.
배열 69 또는 70에 있어서, 제1 단백질이 메토트렉세이트-저항성 DHFR 돌연변이체 단백질인, 방법.
72.
i) 세포에서 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현할 수 있는 적어도 2 개의 2-부분 뉴클레오티드 서열을 세포 내로 도입하되,
세포는, 세포가 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 억제되는 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질을 갖고,
제1 2-부분 뉴클레오티드 서열이 제1 결합 도메인에 융합된 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 비-기능적 부분을 포함하는 제1 융합 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 관심 제1 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
제2 2-부분 뉴클레오티드 서열이 제2 결합 도메인에 융합된 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 비-기능적 부분을 포함하는 제2 융합 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 관심 제2 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
제1 및 제2 융합 단백질 둘 다가 세포에서 함께 발현될 때, 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 기능이 회복되는 것인,
단계; 및
ii) 제1 및 제2 2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현하는 세포의 선택을 야기하는 조건 하에 세포를 배양하는 단계
를 포함하는,
유전적으로 조작된 세포의 선택 또는 풍부화를 위한 방법.
73.
i) 세포가 정상 시험관내 증식 조건 하에 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 세포의 생존 및/또는 증식을 위해 필수적인 적어도 제1 단백질을 억제하는 단계;
ii) 세포에서 발현될 수 있는 적어도 2 개의 2-부분 뉴클레오티드 서열을 도입하되,
제1 2-부분 뉴클레오티드 서열이 제1 결합 도메인에 융합된 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 비-기능적 부분을 포함하는 제1 융합 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 관심 제1 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
제2 2-부분 뉴클레오티드 서열이 제2 결합 도메인에 융합된 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 비-기능적 부분을 포함하는 제2 융합 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 관심 제2 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
제1 및 제2 융합 단백질 둘 다가 세포에서 함께 발현될 때, 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 기능이 회복되는 것인,
단계; 및
iii) 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질 둘 다를 발현하는 세포의 풍부화를 야기하는 시험관내 증식 조건 하에 세포를 배양하는 단계
를 포함하는,
유전적으로 조작된 세포의 선택 또는 풍부화를 위한 방법.
74.
배열 72 또는 73에 있어서, 필수 단백질이 DHFR 단백질인, 방법.
75.
배열 74에 있어서, 제1 융합 단백질이 DHFR의 N-말단 부분을 포함하고 제2 융합 단백질이 DHFR의 C-말단 부분을 포함하는 것인, 방법.
76.
배열 74에 있어서, 제1 융합 단백질이 DHFR의 C-말단 부분을 포함하고 제2 융합 단백질이 DHFR의 N-말단 부분을 포함하는 것인, 방법.
77.
배열 74 또는 75에 있어서, DHFR의 N-말단 부분이 서열번호 22를 포함하는 것인, 방법.
78.
배열 74-77 중 어느 하나에 있어서, DHFR의 C-말단 부분이 서열번호 23을 포함하는 것인, 방법.
79.
배열 72-78 중 어느 하나에 있어서, 제1 또는 제2 2-부분 뉴클레오티드 서열의 제2-부분 뉴클레오티드 서열이 세포에 대해 외인성인 것인, 방법.
80.
배열 72-79 중 어느 하나에 있어서, 제1 또는 제2 2-부분 뉴클레오티드 서열의 제2-부분 뉴클레오티드 서열이 TCR인, 방법.
81.
배열 72-80 중 어느 하나에 있어서, 제1 및 제2 결합 도메인이 GCN4로부터 유래되는 것인, 방법.
82.
배열 72-81 중 어느 하나에 있어서, 제1 및/또는 제2 결합 도메인이 서열번호 24를 포함하는 것인, 방법.
83.
배열 72-82 중 어느 하나에 있어서, 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질이 서열번호 39 또는 서열번호 40을 포함하는 것인, 방법.
84.
배열 72-80 중 어느 하나에 있어서, 제1 및 제2 결합 도메인이 FKBP12로부터 유래되는 것인, 방법.
85.
배열 84에 있어서, FKBP12가 F36V 돌연변이를 갖는 것인, 방법.
86.
배열 72-80, 84 또는 85 중 어느 하나에 있어서, 제1 및/또는 제2 결합 도메인이 서열번호 31을 포함하는 것인, 방법.
87.
배열 72-80 또는 84-86 중 어느 하나에 있어서, 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질이 서열번호 62 또는 서열번호 63을 포함하는 것인, 방법.
88.
배열 72-80 중 어느 하나에 있어서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인이 JUN 및 FOS로부터 유래되는 것인, 방법.
89.
배열 88에 있어서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인이 서로에 대한 결합을 보존하는 상보성 돌연변이를 갖는 것인, 방법.
90.
배열 89에 있어서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인이 천연 결합 파트너에 결합하지 않는 것인, 방법.
91.
배열 72-80 또는 88-90 중 어느 하나에 있어서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인 각각이 3 내지 7 개 상보성 돌연변이를 갖는 것인, 방법.
92.
배열 91에 있어서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인이 각각 3 개 상보성 돌연변이를 갖는 것인, 방법.
93.
배열 72-80 또는 88-92 중 어느 하나에 있어서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인이 서열번호 26 또는 서열번호 29를 포함하는 것인, 방법.
94.
배열 72-80 또는 88-93 중 어느 하나에 있어서, 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질이 서열번호 35 또는 서열번호 36을 포함하는 것인, 방법.
95.
배열 91에 있어서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인이 각각 4 개 상보성 돌연변이를 갖는 것인, 방법.
96.
배열 72-80, 88-91 또는 95 중 어느 하나에 있어서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인이 서열번호 27 및 서열번호 30을 포함하는 것인, 방법.
97.
배열 72-80, 88-91, 95 또는 96 중 어느 하나에 있어서, 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질이 서열번호 37 및 서열번호 38을 포함하는 것인, 방법.
98.
배열 72-97 중 어느 하나에 있어서, 적어도 2 개의 2-부분 뉴클레오티드 서열이 세포의 게놈 내로 통합되는 것인, 방법.
99.
배열 72-98 중 어느 하나에 있어서, 적어도 2 개의 2-부분 뉴클레오티드 서열이 표적 게놈에서 사전-결정된 부위 내로 삽입될 때 발현을 위해 작동가능해지고 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다가 표적 게놈에서 프로모터에 의해 구동되는 것인, 방법.
100.
배열 98 또는 99에 있어서, 통합이 뉴클레아제-매개된 부위-특이적 통합, 전이인자-매개된 유전자 전달 또는 바이러스-매개 유전자 전달을 통하는 것인, 방법.
101.
배열 100에 있어서, 뉴클레아제-매개된 부위-특이적 통합이 CRISPR RNP를 통하는 것인, 방법.
102.
배열 72-101 중 어느 하나에 있어서, 제1 2-부분 뉴클레오티드 서열이 내인성 TCR 불변 유전자좌를 표적화하는 CRISPR RNP에 의해 세포에 전달되고, 제1 제1-부분 뉴클레오티드 서열이 DHFR 단백질의 비-기능적 부분을 코딩하고, 제1 제2-부분 뉴클레오티드 서열이 신생항원 TCR을 코딩하는 것인, 방법.
103.
배열 72-102 중 어느 하나에 있어서, 제2 2-부분 뉴클레오티드 서열이 TCR 불변 유전자좌 이외의 내인성 유전자좌를 표적화하는 CRISPR RNP에 의해 세포에 전달되고, 제2 제1-부분 뉴클레오티드 서열이 DHFR 단백질의 비-기능적 부분을 코딩하고, 제2 제2-부분 뉴클레오티드 서열이 관심 단백질을 코딩하는 것인, 방법.
104.
배열 103에 있어서, 제1 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 제2 제1-부분 뉴클레오티드 서열은, 융합 단백질이 공동-발현될 때, DHFR 활성을 갖는 DHFR 단백질의 비-기능적 부분을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 것인, 방법.
105.
배열 102-104 중 어느 하나에 있어서, 내인성 TCR 불변 유전자좌가 TCR 알파 불변(TRAC) 유전자좌 또는 TCR 베타 불변(TRBC) 유전자좌일 수 있는 것인, 방법.
106.
배열 103-105 중 어느 하나에 있어서, TCR 불변 유전자좌 이외의 내인성 유전자좌가 B2M 유전자좌인, 방법.
107.
배열 102-106 중 어느 하나에 있어서, 전달이 전기천공, 또는 기계적 또는 화학적 막 투과화를 기초로 하는 방법에 의한 것인, 방법.
108.
배열 101-107 중 어느 하나에 있어서, CRISPR RNP가 CRISPR/Cas9 RNP인, 방법.
109.
배열 26-28, 30-38, 58-60, 62-71 또는 100-108 중 어느 하나에 있어서, 뉴클레아제가 유전자좌 내로의 인-프레임 엑손 통합을 허용하여, 내인성 프로모터, 내인성 스플라이스 부위 및 내인성 종결 신호로부터의 2-부분 뉴클레오티드 중 하나의 적어도 하나의 부분을 발현하는 것인, 방법.
110.
배열 26-28, 30-38, 58-60, 62-71 또는 100-108 중 어느 하나에 있어서, 뉴클레아제가 유전자좌 내로의 인-프레임 엑손 통합을 허용하여, 내인성 프로모터, 내인성 스플라이스 부위 및 외인성 종결 신호로부터의 2-부분 뉴클레오티드 중 하나의 적어도 하나의 부분을 발현하는 것인, 방법.
111.
배열 26-28, 30-38, 58-60, 62-71 또는 100-108 중 어느 하나에 있어서, 뉴클레아제가 유전자좌 내로의 인트론 통합을 허용하여, 내인성 프로모터, 외인성 스플라이스 수용체 부위 및 외인성 종결 신호로부터의 2-부분 뉴클레오티드 중 하나의 적어도 하나의 부분을 발현하는 것인, 방법.
112.
배열 1-80 중 어느 하나에 있어서, 필수 또는 제1 단백질이 적어도 2 개의 개별적 기능장애 단백질 부분으로 분열되고, 적어도 2 개 부분 각각이 다량체화 도메인에 융합되고 적어도 2 개 부분 각각이 별개의 2-부분 뉴클레오티드 서열 내로 통합되어, 별개의 2-부분 뉴클레오티드 서열 전부가 발현되는 세포의 선택을 허용하고, 선택적으로 필수 또는 제1 단백질의 기능이 회복되는 것인, 방법.
113.
배열 1-80 중 어느 하나에 있어서, 필수 또는 제1 단백질이 기능장애 N-말단 및 C-말단 단백질 절반으로 분열되고, 각각의 절반이 호모- 또는 헤테로다이머화 단백질 파트너 또는 스플릿 인테인에 융합되는 것인, 방법.
114.
배열 112 또는 113에 있어서, 필수 또는 제1 단백질이 DHFR 단백질인, 방법.
115.
배열 114에 있어서, 제1 기능장애 단백질 부분이 DHFR의 N-말단 부분을 포함하고 제2 기능장애 단백질 부분이 DHFR의 C-말단 부분을 포함하는 것인, 방법.
116.
배열 115에 있어서, DHFR의 N-말단 부분이 서열번호 22를 포함하는 것인, 방법.
117.
배열 116에 있어서, DHFR의 C-말단 부분이 서열번호 23을 포함하는 것인, 방법.
118.
배열 108-110 중 어느 하나에 있어서, 호모다이머화 단백질이 GCN4, FKBP12 또는 이의 변이체인, 방법.
119.
배열 108-110 중 어느 하나에 있어서, 헤테로다이머화 단백질이 Jun/Fos 또는 이의 변이체인, 방법.
120.
배열 72-76, 80-83 또는 108-111 중 어느 하나에 있어서, 필수 단백질의 기능의 회복이 선택적으로 AP1903에 의해 유도되는 것인, 방법.
121.
배열 72-108 중 어느 하나에 있어서, 배양 단계가 메토트렉세이트의 존재 하에 수행되는 것인, 방법.
122.
배열 1-121 중 어느 하나에 있어서, 관심 단백질이 T 세포 수용체인, 방법.
123.
배열 122에 있어서, T 세포 수용체가 바이러스 또는 종양 항원에 대해 특이적인 것인, 방법.
124.
배열 123에 있어서, 종양 항원이 종양 신생항원인, 방법.
125.
배열 1 내지 124 중 어느 하나에 있어서, 유전적으로 조작된 세포가 일차 인간 T 세포인, 방법.
126.
i) 메토트렉세이트-저항성 DHFR 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 TRA 또는 TRB 프로모터의 후속의 2-부분 뉴클레오티드 서열의 통합에 의해 T 세포에서 T-세포 수용체 복합체 또는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 2-부분 뉴클레오티드 서열을 도입하는 단계, 및
ii) 제1 단백질 및 제2 단백질 둘 다를 발현하는 세포의 풍부화를 야기하는 메토트렉세이트를 함유하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계
를 포함하는, 유전적으로 조작된 T 세포의 풍부화를 위한 방법.
127.
i) 제1 CRISPR/Cas9 RNP를 사용하여 내인성 TRBC 유전자를 이의 유전자좌로부터 녹-아웃시키는 단계;
ii) 제2 CRISPR/Cas9 RNP를 사용하여, 메토트렉세이트-저항성 DHFR 유전자를 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 치료 TCR 유전자를 포함하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 내인성 TRBC 유전자좌 내로 녹-인시키되, 양측 뉴클레오티드 서열이 작동가능하게 연결되어, 내인성 TRBC 프로모터로부터의 발현을 허용하는 것인, 단계; 및
iii) 치료 TCR 및 메토트렉세이트-저항성 DHFR 유전자 둘 다를 발현하는 T 세포의 풍부화를 야기하는 메토트렉세이트를 함유하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계
를 포함하는, 외인성 T 세포 수용체 유전자를 발현하도록 조작된 T 세포의 풍부화를 위한 방법.
128.
i) 세포에서 발현을 위해 작동가능한 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열을 도입하되,
세포는, 세포가 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 억제되는 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질을 갖고,
적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열이 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제2-부분 뉴클레오티드 서열이 세포에 대해 외인성인 단백질을 코딩하는 것인,
단계; 및
ii) 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현하는 세포의 선택을 야기하는 조건 하에 세포를 배양하는 단계
를 포함하는,
유전적으로 조작된 세포의 선택을 위한 방법.
129.
i) 세포가 정상 시험관내 증식 조건 하에 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 세포의 생존 및/또는 증식을 위해 필수적인 적어도 제1 단백질의 활성을 감소시키는 단계;
ii) 세포에서 발현을 위해 작동가능하고 제1 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 제2 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 2-부분 뉴클레오티드 서열을 도입하되, 제2-부분 단백질이 세포에 대해 외인성인 것인, 단계; 및
iii) 제1 단백질 및 제2 단백질 둘 다를 발현하는 세포의 풍부화를 야기하는 시험관내 증식 조건 하에 세포를 배양하는 단계
를 포함하는, 유전적으로 조작된 세포의 풍부화를 위한 방법.
130.
상기 배열된 방법 중 어느 하나에 따라 제조되는 세포.
131.
세포가 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 메토트렉세이트의 존재에 의해 억제되는 내인성 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 및
메토트렉세이트-저항성 DHFR 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 내인성 TRA 또는 TRB 프로모터로부터 작동가능하게 발현되는 T-세포 수용체를 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 2-부분 뉴클레오티드 서열
을 포함하는, T 세포.
132.
내인성 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)의 녹-아웃, 및
DHFR 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 또는 이의 변이체; 및
내인성 TRA 또는 TRB 프로모터로부터 작동가능하게 발현되는 T-세포 수용체를 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열
을 포함하는 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열
을 포함하는, T 세포.
133.
세포가 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 메토트렉세이트의 존재에 의해 억제되도록 구성된 내인성 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 및
적어도 2 개의 2-부분 뉴클레오티드 서열
을 포함하고,
제1 2-부분 뉴클레오티드 서열이
i) DHFR 단백질의 비-기능적 또는 기능장애 부분을 코딩하는 제1 제1-부분 뉴클레오티드 서열 또는 이의 변이체; 및
ii) 내인성 TRA 또는 TRB 프로모터로부터 작동가능하게 발현되는 T-세포 수용체를 코딩하는 제1 제2-부분 뉴클레오티드 서열
을 포함하고,
제2 2-부분 뉴클레오티드 서열이
iii) DHFR 단백질의 비-기능적 또는 기능장애 부분을 코딩하는 제2 제1-부분 뉴클레오티드 서열 또는 이의 변이체; 및
iv) 내인성 B2M 프로모터로부터 작동가능하게 발현되는 관심 단백질을 코딩하는 제2 제2-부분 뉴클레오티드 서열
을 포함하고,
세포가 DHFR 활성을 갖도록 구성되는,
T 세포.
예시적 배열 (b):
1.
i) 세포에서 발현을 위해 작동가능한 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열을 도입하되,
세포는, 세포가 정상 세포 배양 배지에서 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 억제되는 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질을 갖고,
적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열이 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제2-부분 뉴클레오티드 서열이 세포에 대해 외인성인 단백질을 코딩하는 것인,
단계; 및
ii) 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현하는 세포의 선택을 위해 정상 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계
를 포함하는,
유전적으로 조작된 세포의 선택을 위한 방법.
2.
i) 세포가 정상 시험관내 증식 조건 하에 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 세포의 생존 및/또는 증식을 위해 필수적인 적어도 제1 단백질의 활성을 감소시키는 단계;
ii) 세포에서 발현을 위해 작동가능하고 제1 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 제2 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 2-부분 뉴클레오티드 서열을 도입하되, 제2-부분 단백질이 세포에 대해 외인성인 것인, 단계; 및
iii) 제1 단백질 및 제2 단백질 둘 다를 발현하는 세포의 풍부화를 위한 정상 시험관내 증식 조건 하에 세포를 배양하는 단계
를 포함하는, 유전적으로 조작된 세포의 풍부화를 위한 방법.
3.
배열 2에 있어서, 활성을 감소시키는 단계가 영구적 또는 일시적일 수 있는 것인, 방법.
4.
배열 2에 있어서, 활성을 감소시키는 단계가 필수 단백질을 코딩하는 유전자의 녹-아웃을 포함하는 것인, 방법.
5.
배열 4에 있어서, 녹-아웃이 CRISPR/Cas9 리보핵단백질(RNP), TALEN, MegaTAL 또는 임의의 다른 뉴클레아제에 의해 매개되는 것인, 방법.
6.
배열 2에 있어서, 활성을 감소시키는 단계가 필수 단백질의 활성의 일시적 억제를 포함하는 것인, 방법.
7.
배열 6에 있어서, 일시적 억제가 siRNA, miRNA, CRISPR 간섭(CRISPRi) 또는 단백질 억제제를 통하는 것인, 방법.
8.
배열 1 또는 2에 있어서, 세포가 T 세포, 조혈 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, iPSC, 신경 전구 세포, 망막 유전자 요법에서의 세포 유형 또는 임의의 다른 세포인, 방법.
9.
배열 1 또는 2에 있어서, 제1-부분 뉴클레오티드 서열이 뉴클레오티드 서열에서 변경되어, 뉴클레아제, siRNA, miRNA 또는 CRISPRi 저항성을 달성하지만, a) 제1 단백질과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하거나 b) 제1 단백질에 대해 조정된 기능성을 갖는 단백질을 코딩하는 것인, 방법.
10.
배열 1 또는 2에 있어서, 제1-부분 뉴클레오티드 서열이 변경되어, 제1 단백질과 동일한 아미노산 서열을 갖지 않는 변경된 단백질을 코딩하는 것인, 방법.
11.
배열 10에 있어서, 변경된 단백질은 제1 단백질이 갖지 않는 특이적 특징을 갖는 것인, 방법.
12.
배열 11에 있어서, 특이적 특징이, 비제한적으로, 감소된 활성, 증가된 활성, 변경된 반감기, 소분자 억제에 대한 저항성 및 소분자 결합 후 증가된 활성 중 하나 이상을 포함하는 것인, 방법.
13.
배열 1 또는 2에 있어서, 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열이 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현하기 위해 작동가능한 것인, 방법.
14.
배열 1 또는 2에 있어서, 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다가 동일한 프로모터 또는 상이한 프로모터에 의해 구동될 수 있는 것인, 방법.
15.
배열 1 또는 2에 있어서, 제2-부분 뉴클레오티드 서열이 적어도 치료 유전자를 포함하는 것인, 방법.
16.
배열 1 또는 2에 있어서, 제2-부분 뉴클레오티드 서열이 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 함유하는 신생항원 T-세포 수용체 복합체(TCR)를 코딩하는 것인, 방법.
17.
배열 1 또는 2에 있어서, 필수 또는 제1 단백질이 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 이노신 모노포스페이트 탈수소효소 2(IMPDH2), O-6-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라아제(MGMT), 데옥시시티딘 키나아제(DCK), 하이포크산틴 포스포리보실트랜스퍼라아제 1(HPRT1), 인터류킨 2 수용체 서브유닛 감마(IL2RG), 액틴 베타(ACTB), 진핵생물 번역 신장 인자 1 알파 1(EEF1A1), 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH), 포스포글리세레이트 키나아제 1(PGK1) 또는 트랜스페린 수용체(TFRC)인, 방법.
18.
배열 1 또는 2에 있어서, 제1-부분 뉴클레오티드 서열이 뉴클레아제-저항성, siRNA-저항성 또는 단백질 억제제-저항성 DHFR 유전자를 포함하고, 제2-부분 뉴클레오티드 서열이 TRA 유전자 및 TRB 유전자를 포함하는 것인, 방법.
19.
배열 18에 있어서, 단백질 억제제-저항성 DHFR 유전자가 메토트렉세이트-저항성 DHFR 유전자인, 방법.
20.
배열 18에 있어서, TRA, TRB 및 DHFR 유전자가 단일 개방 판독 프레임으로부터 발현되도록 작동가능하게 구성되는 것인, 방법.
21.
배열 20에 있어서, TRA, TRB 및 DHFR 유전자가 링커에 의해 분리되는 것인, 방법.
22.
배열 21에 있어서, 링커, TRA, TRB 및 DHFR 유전자의 순서가
TRA - 링커 - TRB - 링커 - DHFR,
TRA - 링커 - DHFR- 링커 - TRB,
TRB - 링커 - TRA - 링커 - DHFR,
TRB - 링커 - DHFR- 링커 - TRA,
DHFR - 링커 - TRA - 링커 - TRB, 또는
DHFR - 링커 - TRB - 링커 - TRA
인,
방법.
23.
배열 22에 있어서, 링커가 자가-절단 2A 펩티드 또는 IRES 요소인, 방법.
24.
배열 18에 있어서, DHFR, TRA 및 TRB 유전자가 내인성 TCR 프로모터 또는, 비제한적으로, TRAC, TRBC1/2, DHFR, EEF1A1, ACTB, B2M, CD52, CD2, CD3G, CD3D, CD3E, LCK, LAT, PTPRC, IL2RG, ITGB2, TGFBR2, PDCD1, CTLA4, FAS, TNFRSF1A(TNFR1), TNFRSF10B(TRAILR2), ADORA2A, BTLA, CD200R1, LAG3, TIGIT, HAVCR2(TIM3), VSIR(VISTA), IL10RA, IL4RA, EIF4A1, FTH1, FTL, HSPA5, 및 PGK1의 프로모터를 포함하는 임의의 다른 적합한 프로모터에 의해 구동되는 것인, 방법.
25.
배열 1 또는 2에 있어서, 2-부분 뉴클레오티드 서열이 세포의 게놈 내로 통합되는 것인, 방법.
26.
배열 25에 있어서, 통합이 뉴클레아제-매개된 부위-특이적 통합, 전이인자-매개된 유전자 전달 또는 바이러스-매개 유전자 전달을 통하는 것인, 방법.
27.
배열 26에 있어서, 뉴클레아제-매개된 부위-특이적 통합이 CRISPR/Cas9 RNP를 통하는 것인, 방법.
28.
배열 27에 있어서, 스플릿 인테인 시스템을 사용하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
29.
배열 1 또는 2에 있어서, 도입된 2-부분 뉴클레오티드 서열이 세포의 게놈 내로 통합되지 않는 것인, 방법.
30.
배열 1 또는 2에 있어서, 내인성 TCR 불변 유전자좌를 표적화하는 CRISPR/Cas9 RNP, 뉴클레아제-저항성 DHFR 유전자를 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 신생항원 TCR을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열이 세포에 전달되는 것인, 방법.
31.
배열 30에 있어서, 내인성 TCR 불변 유전자좌가 TCR 알파 불변(TRAC) 유전자좌 또는 TCR 베타 불변(TRBC) 유전자좌일 수 있는 것인, 방법.
32.
배열 30에 있어서, 전달이 전기천공, 또는 기계적 또는 화학적 막 투과화를 기초로 하는 방법에 의한 것인, 방법.
33.
배열 2에 있어서, 제1 CRISPR/Cas9 RNP가 사용되어, 내인성 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 유전자를 녹-아웃시키고, 제2 CRISPR/Cas9 RNP가 사용되어, CRISPR/Cas9 뉴클레아제-저항성 DHFR 유전자를 포함하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 치료 TCR 유전자를 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 내인성 TCR 불변 유전자좌 내로 녹-인시키는 것인, 방법.
34.
배열 33에 있어서, 메토트렉세이트가 사용되어, 제1 단백질을 억제하고, CRISPR/Cas9 RNP가 사용되어, 메토트렉세이트-저항성 DHFR 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 치료 TCR 유전자를 포함하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 내인성 TCR 불변 유전자좌 내로 녹-인시키는 것인, 방법.
35.
배열 33에 있어서, 제2 CRISPR/Cas9 RNP가 녹-인을 위해 TRAC 유전자좌를 절단하는 TRAC RNP인, 방법.
36.
배열 1 또는 2에 있어서, 정상 세포 배양 배지가 비-매개된 세포의 성장 및/또는 증식에 적합한 것인, 방법.
37.
배열 1 또는 2에 있어서, 정상 세포 배양 배지는 유세포분석 또는 자성 비드 풍부화에 의한 세포의 풍부화를 허용하는 약물 분자 또는 항체와 같은 외인성 선택 압력이 없는 것인, 방법.
38.
상기 방법 중 임의의 것에 따라 제조되는 세포.
39.
세포가 정상 세포 배양 배지에서 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 억제되는 내인성 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 및
DHFR을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 신생항원 T-세포 수용체 복합체를 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 2-부분 뉴클레오티드 서열
을 포함하는, 세포.
40.
i) 세포에서 발현을 위해 작동가능하고 제1 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 제2 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 2-부분 뉴클레오티드 서열을 도입하되, 제2-부분 단백질이 세포에 대해 외인성인 것인, 단계; 및
ii) 제1 단백질 및 제2 단백질 둘 다를 발현하는 세포의 풍부화를 야기하는 적어도 하나의 보충제를 함유하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계
를 포함하는, 유전적으로 조작된 세포의 풍부화를 위한 방법.
41.
배열 40에 있어서, 유전적으로 조작된 세포가 일차 인간 T 세포인, 방법.
42.
배열 40에 있어서, 보충제가 제1 단백질 및 제2 단백질 둘 다를 발현하지 않으면서 세포의 생존 및/또는 증식을 손상시키는 것인, 방법.
43.
배열 40에 있어서, 적어도 하나의 단백질이 세포의 생존 및/또는 증식의 보충제 매개된 손상에 대한 세포의 저항성을 매개하는 것인, 방법.
44.
배열 42에 있어서, 보충제가 메토트렉세이트인, 방법.
45.
배열 40에 있어서, 제1 단백질이 메토트렉세이트-저항성 DHFR 돌연변이체 단백질인, 방법.
46.
배열 40에 있어서, 제2 단백질이 T 세포 수용체인, 방법.
47.
배열 46에 있어서, T 세포 수용체가 바이러스 또는 종양 항원에 대해 특이적인 것인, 방법.
48.
배열 40에 있어서, 제1-부분 뉴클레오티드 서열이 뉴클레오티드 서열에서 변경되어, 뉴클레아제, siRNA, miRNA 또는 CRISPRi 저항성을 달성하는 것인, 방법.
49.
배열 40에 있어서, 적어도 2-부분 뉴클레오티드 서열의 발현이 세포의 내인성 유전자좌 내로의 부위-특이적 통합에 의해 달성되는 것인, 방법.
50.
배열 49에 있어서, 세포의 내인성 유전자좌 내로의 부위-특이적 통합이 CRISPR/Cas9, TALEN, MegaTAL 또는 유전자좌 내로의 무흔적 통합을 허용하여, 유전자좌의 내인성 프로모터로부터의 발현을 가능하게 하는 임의의 다른 뉴클레아제를 사용함으로써 달성되는 것인, 방법.
51.
배열 50에 있어서, 뉴클레아제가 유전자좌 내로의 인-프레임 엑손 통합을 허용하여, 내인성 프로모터, 내인성 스플라이스 부위, 및 내인성 종결 신호로부터의 발현을 가능하기 하는 것인, 방법.
52.
배열 50에 있어서, 뉴클레아제가 유전자좌 내로의 인-프레임 엑손 통합을 허용하여, 내인성 프로모터, 내인성 스플라이스 부위 및 외인성 종결 신호로부터의 발현을 가능하게 하는 것인, 방법.
53.
배열 50에 있어서, 뉴클레아제가 유전자좌 내로의 인트론 통합을 허용하여, 내인성 프로모터, 외인성 스플라이스 수용체 부위 및 외인성 종결 신호로부터의 발현을 가능하게 하는 것인, 방법.
54.
배열 40에 있어서, CRISPR/Cas9 RNP가 사용되어, 메토트렉세이트-저항성 DHFR 돌연변이체 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 치료 TCR 유전자를 포함하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 내인성 TCR 불변 유전자좌 내로 녹-인시키는 것인, 방법.
55.
배열 50 및 54 중 어느 하나에 있어서, 내인성 TRAC 또는 TRBC 유전자를 녹-아웃시키기 위해 사용되는 제2 CRISPR/Cas9 RNP를 추가로 포함하는 것인, 방법.
56.
i) 메토트렉세이트-저항성 DHFR 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 TRA 또는 TRB 프로모터의 후속의 2-부분 뉴클레오티드 서열의 통합에 의해 T 세포에서 T-세포 수용체 복합체 또는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 2-부분 뉴클레오티드 서열을 도입하는 단계, 및
ii) 제1 단백질 및 제2 단백질 둘 다를 발현하는 세포의 풍부화를 야기하는 메토트렉세이트를 함유하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계
를 포함하는, 유전적으로 조작된 T 세포의 풍부화를 위한 방법.
57.
i) 제1 CRISPR/Cas9 RNP를 사용하여 내인성 TRBC 유전자를 이의 유전자좌로부터 녹-아웃시키는 단계;
ii) 제2 CRISPR/Cas9 RNP를 사용하여, 메토트렉세이트-저항성 DHFR 유전자를 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 치료 TCR 유전자를 포함하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 내인성 TRBC 유전자좌 내로 녹-인시키되, 양측 뉴클레오티드 서열이 작동가능하게 연결되어, 내인성 TRBC 프로모터로부터의 발현을 허용하는 것인, 단계; 및
iii) 치료 TCR 및 메토트렉세이트-저항성 DHFR 유전자 둘 다를 발현하는 T 세포의 풍부화를 야기하는 메토트렉세이트를 함유하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계
를 포함하는, 외인성 T 세포 수용체 유전자를 발현하도록 조작된 T 세포의 풍부화를 위한 방법.
58.
세포가 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 메토트렉세이트의 존재에 의해 억제되는 내인성 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 및
메토트렉세이트-저항성 DHFR 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 내인성 TRA 또는 TRB 프로모터로부터 작동가능하게 발현되는 T-세포 수용체를 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 2-부분 뉴클레오티드 서열
을 포함하는, T 세포.
59.
배열 1, 2 또는 40 중 어느 하나에 있어서, 필수 또는 제1 단백질이 적어도 2 개의 개별적 기능장애 단백질 부분으로 분열되고, 적어도 2 개 부분 각각이 다량체화 도메인에 융합되고 적어도 2 개 부분 각각이 별개의 2-부분 뉴클레오티드 서열 내로 통합되어, 별개의 2-부분 뉴클레오티드 서열 전부가 발현되는 세포의 선택을 허용하는 것인, 방법.
60.
배열 59에 있어서, 필수 또는 제1 단백질이 기능장애 N-말단 및 C-말단 단백질 절반으로 분열되고, 각각의 절반이 호모- 또는 헤테로다이머화 단백질 파트너 또는 스플릿 인테인에 융합되는 것인, 방법.
61.
배열 59에 있어서, 필수 또는 제1 단백질이 DHFR 단백질인, 방법.
62.
i) 세포에서 발현을 위해 작동가능한 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열을 도입하되,
세포는, 세포가 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 억제되는 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질을 갖고,
적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열이 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제2-부분 뉴클레오티드 서열이 세포에 대해 외인성인 단백질을 코딩하는 것인,
단계; 및
ii) 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현하는 세포의 선택을 야기하는 조건 하에 세포를 배양하는 단계
를 포함하는,
유전적으로 조작된 세포의 선택을 위한 방법.
63.
i) 세포가 정상 시험관내 증식 조건 하에 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 세포의 생존 및/또는 증식을 위해 필수적인 적어도 제1 단백질의 활성을 감소시키는 단계;
ii) 세포에서 발현을 위해 작동가능하고 제1 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 제2 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 2-부분 뉴클레오티드 서열을 도입하되, 제2-부분 단백질이 세포에 대해 외인성인 것인, 단계; 및
iii) 제1 단백질 및 제2 단백질 둘 다를 발현하는 세포의 풍부화를 야기하는 시험관내 증식 조건 하에 세포를 배양하는 단계
를 포함하는, 유전적으로 조작된 세포의 풍부화를 위한 방법.
64.
i) 세포에서 발현을 위해 작동가능한 적어도 2 개의 2-부분 뉴클레오티드 서열을 도입하되,
세포는, 세포가 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 억제되는 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질을 갖고,
제1 2-부분 뉴클레오티드 서열이 제1 결합 도메인에 융합된 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 비-기능적 부분을 포함하는 제1 융합 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
제2 2-부분 뉴클레오티드 서열이 제2 결합 도메인에 융합된 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 비-기능적 부분을 포함하는 제2 융합 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
제1 및 제2 융합 단백질 둘 다가 세포에서 함께 발현될 때, 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 기능이 회복되는 것인,
단계; 및
ii) 제1 및 제2 2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현하는 세포의 선택을 야기하는 조건 하에 세포를 배양하는 단계
를 포함하는,
유전적으로 조작된 세포의 선택을 위한 방법.
65.
i) 세포가 정상 시험관내 증식 조건 하에 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 세포의 생존 및/또는 증식을 위해 필수적인 적어도 제1 단백질의 활성을 감소시키는 단계;
ii) 세포에서 발현을 위해 작동가능한 적어도 2 개의 2-부분 뉴클레오티드 서열을 도입하되,
제1 2-부분 뉴클레오티드 서열이 제1 결합 도메인에 융합된 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 비-기능적 부분을 포함하는 제1 융합 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
제2 2-부분 뉴클레오티드 서열이 제2 결합 도메인에 융합된 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 비-기능적 부분을 포함하는 제2 융합 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
제1 및 제2 융합 단백질 둘 다가 세포에서 함께 발현될 때, 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 기능이 회복되는 것인,
단계; 및
iii) 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질 둘 다를 발현하는 세포의 풍부화를 야기하는 시험관내 증식 조건 하에 세포를 배양하는 단계
를 포함하는,
유전적으로 조작된 세포의 풍부화를 위한 방법.
66.
배열 64 또는 65에 있어서, 필수 단백질이 DHFR 단백질인, 방법.
67.
배열 64-66 중 어느 하나에 있어서, 제1 또는 제2 2-부분 뉴클레오티드 서열의 제2-부분 뉴클레오티드 서열이 세포에 대해 외인성인 것인, 방법.
68.
배열 64-67 중 어느 하나에 있어서, 제1 또는 제2 2-부분 뉴클레오티드 서열의 제2-부분 뉴클레오티드 서열이 TCR인, 방법.
69.
배열 64-68 중 어느 하나에 있어서, 제1 및 제2 결합 도메인이 GCN4로부터 유래되는 것인, 방법.
70.
배열 64-68 중 어느 하나에 있어서, 제1 및 제2 결합 도메인이 FKBP12로부터 유래되는 것인, 방법.
71.
배열 70에 있어서, FKBP12가 F36V 돌연변이를 갖는 것인, 방법.
72.
배열 64-68 중 어느 하나에 있어서, 제1 결합 도메인이 JUN으로부터 유래되고 제2 결합 도메인이 FOS로부터 유래되는 것인, 방법.
73.
배열 72에 있어서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인이 서로에 대한 결합을 보존하는 상보성 돌연변이를 갖는 것인, 방법.
74.
배열 73에 있어서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인이 천연 결합 파트너에 결합하지 않는 것인, 방법.
75.
배열 72-74 중 어느 하나에 있어서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인 각각이 3 내지 7 개 상보성 돌연변이를 갖는 것인, 방법.
76.
배열 75에 있어서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인이 각각 3 개 상보성 돌연변이를 갖는 것인, 방법.
77.
배열 75에 있어서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인이 각각 4 개 상보성 돌연변이를 갖는 것인, 방법.
78.
배열 64-68, 70 또는 71 중 어느 하나에 있어서, 필수 단백질의 기능의 회복이 선택적으로 AP1903에 의해 유도되는 것인, 방법.
79.
배열 64-78 중 어느 하나에 있어서, 배양 단계가 메토트렉세이트의 존재 하에 수행되는 것인, 방법.
SEQUENCE LISTING
<110> Neogene Therapeutics B.V.
<120> METHODS TO ENRICH GENETICALLY ENGINEERED
T CELLS
<130> NTBV.024WO
<150> US 63/221808
<151> 2021-07-14
<150> US 63/170269
<151> 2021-04-02
<150> US 63/135460
<151> 2021-01-08
<150> US 63/062854
<151> 2020-08-07
<160> 63
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 187
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Val Gly Ser Leu Asn Cys Ile Val Ala Val Ser Gln Asn Met Gly
1 5 10 15
Ile Gly Lys Asn Gly Asp Leu Pro Trp Pro Pro Leu Arg Asn Glu Phe
20 25 30
Arg Tyr Phe Gln Arg Met Thr Thr Thr Ser Ser Val Glu Gly Lys Gln
35 40 45
Asn Leu Val Ile Met Gly Lys Lys Thr Trp Phe Ser Ile Pro Glu Lys
50 55 60
Asn Arg Pro Leu Lys Gly Arg Ile Asn Leu Val Leu Ser Arg Glu Leu
65 70 75 80
Lys Glu Pro Pro Gln Gly Ala His Phe Leu Ser Arg Ser Leu Asp Asp
85 90 95
Ala Leu Lys Leu Thr Glu Gln Pro Glu Leu Ala Asn Lys Val Asp Met
100 105 110
Val Trp Ile Val Gly Gly Ser Ser Val Tyr Lys Glu Ala Met Asn His
115 120 125
Pro Gly His Leu Lys Leu Phe Val Thr Arg Ile Met Gln Asp Phe Glu
130 135 140
Ser Asp Thr Phe Phe Pro Glu Ile Asp Leu Glu Lys Tyr Lys Leu Leu
145 150 155 160
Pro Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser Asp Val Gln Glu Glu Lys Gly Ile
165 170 175
Lys Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu Lys Asn Asp
180 185
<210> 2
<211> 187
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Val Gly Ser Leu Asn Cys Ile Val Ala Val Ser Gln Asn Met Gly
1 5 10 15
Ile Gly Lys Asn Gly Asp Phe Pro Trp Pro Pro Leu Arg Asn Glu Ser
20 25 30
Arg Tyr Phe Gln Arg Met Thr Thr Thr Ser Ser Val Glu Gly Lys Gln
35 40 45
Asn Leu Val Ile Met Gly Lys Lys Thr Trp Phe Ser Ile Pro Glu Lys
50 55 60
Asn Arg Pro Leu Lys Gly Arg Ile Asn Leu Val Leu Ser Arg Glu Leu
65 70 75 80
Lys Glu Pro Pro Gln Gly Ala His Phe Leu Ser Arg Ser Leu Asp Asp
85 90 95
Ala Leu Lys Leu Thr Glu Gln Pro Glu Leu Ala Asn Lys Val Asp Met
100 105 110
Val Trp Ile Val Gly Gly Ser Ser Val Tyr Lys Glu Ala Met Asn His
115 120 125
Pro Gly His Leu Lys Leu Phe Val Thr Arg Ile Met Gln Asp Phe Glu
130 135 140
Ser Asp Thr Phe Phe Pro Glu Ile Asp Leu Glu Lys Tyr Lys Leu Leu
145 150 155 160
Pro Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser Asp Val Gln Glu Glu Lys Gly Ile
165 170 175
Lys Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu Lys Asn Asp
180 185
<210> 3
<211> 561
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
atggttggtt cgctaaactg catcgtcgct gtgtcccaga acatgggcat cggcaagaac 60
ggggacctgc cctggccacc gctcaggaat gaattcagat atttccagag aatgaccaca 120
acctcttcag tagaaggtaa acagaatctg gtgattatgg gtaagaagac ctggttctcc 180
attcctgaga agaatcgacc tttaaagggt agaattaatt tagttctcag cagagaactc 240
aaggaacctc cacaaggagc tcattttctt tccagaagtc tagatgatgc cttaaaactt 300
actgaacaac cagaattagc aaataaagta gacatggtct ggatagttgg tggcagttct 360
gtttataagg aagccatgaa tcacccaggc catcttaaac tatttgtgac aaggatcatg 420
caagactttg aaagtgacac gttttttcca gaaattgatt tggagaaata taaacttctg 480
ccagaatacc caggtgttct ctctgatgtc caggaggaga aaggcattaa gtacaaattt 540
gaagtatatg agaagaatga t 561
<210> 4
<211> 561
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
atggtaggct ccctgaactg tatagttgcg gtatcccaaa atatggggat tggaaagaac 60
ggagaccttc cgtggccgcc cctccgaaat gaatttcgat actttcagag aatgacaact 120
acctcatctg tagagggaaa gcaaaatctg gttatcatgg gaaagaaaac gtggttctct 180
atccctgaaa aaaacagacc tctcaaaggc aggataaatt tggtattgtc aagagaattg 240
aaggaaccgc cacaaggagc tcattttctc agcagatctc tggacgatgc actcaaactc 300
accgaacaac cagaacttgc taataaggtt gatatggtct ggatagttgg gggcagcagt 360
gtatataagg aagccatgaa ccatcctggc catctgaagc tgtttgttac gaggataatg 420
caggacttcg agtccgacac ttttttccca gagattgact tggaaaagta taaactcttg 480
cctgagtatc ctggggttct ctccgatgtc caagaggaga aaggtattaa atataagttt 540
gaagtttatg aaaaaaacga t 561
<210> 5
<211> 561
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
atggtaggct ccctgaactg tatagttgcg gtatcccaaa atatggggat tggaaagaac 60
ggagactttc cgtggccgcc cctccgaaat gaatcccgat actttcagag aatgacaact 120
acctcatctg tagagggaaa gcaaaatctg gttatcatgg gaaagaaaac gtggttctct 180
atccctgaaa aaaacagacc tctcaaaggc aggataaatt tggtattgtc aagagaattg 240
aaggaaccgc cacaaggagc tcattttctc agcagatctc tggacgatgc actcaaactc 300
accgaacaac cagaacttgc taataaggtt gatatggtct ggatagttgg gggcagcagt 360
gtatataagg aagccatgaa ccatcctggc catctgaagc tgtttgttac gaggataatg 420
caggacttcg agtccgacac ttttttccca gagattgact tggaaaagta taaactcttg 480
cctgagtatc ctggggttct ctccgatgtc caagaggaga aaggtattaa atataagttt 540
gaagtttatg aaaaaaacga t 561
<210> 6
<211> 37
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 6
Thr Ile Ala Arg Leu Glu Glu Glu Val Lys Thr Leu Glu Ala Lys Glu
1 5 10 15
Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Glu Glu Lys Val Ala Gln
20 25 30
Leu Glu Gln Lys Val
35
<210> 7
<211> 37
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 7
Leu Arg Asp Thr Leu Gln Ala Lys Thr Asp Gln Leu Lys Asp Asn Gln
1 5 10 15
Ser Ala Leu Gln Thr Arg Ile Ala Asn Leu Leu Lys Lys Gln Glu Lys
20 25 30
Leu Glu Phe Ile Leu
35
<210> 8
<211> 153
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 8
Thr Ile Ala Arg Leu Glu Glu Glu Val Lys Thr Leu Glu Ala Lys Glu
1 5 10 15
Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Glu Glu Lys Val Ala Gln
20 25 30
Leu Glu Gln Lys Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met
35 40 45
Val Arg Pro Leu Asn Cys Ile Val Ala Val Ser Gln Asn Met Gly Ile
50 55 60
Gly Lys Asn Gly Asp Phe Pro Trp Pro Pro Leu Arg Asn Glu Ser Lys
65 70 75 80
Tyr Phe Gln Arg Met Thr Thr Thr Ser Ser Val Glu Gly Lys Gln Asn
85 90 95
Leu Val Ile Met Gly Arg Lys Thr Trp Phe Ser Ile Pro Glu Lys Asn
100 105 110
Arg Pro Leu Lys Asp Arg Ile Asn Ile Val Leu Ser Arg Glu Leu Lys
115 120 125
Glu Pro Pro Arg Gly Ala His Phe Leu Ala Lys Ser Leu Asp Asp Ala
130 135 140
Leu Arg Leu Ile Glu Gln Pro Glu Leu
145 150
<210> 9
<211> 128
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 9
Leu Arg Asp Thr Leu Gln Ala Lys Thr Asp Gln Leu Lys Asp Asn Gln
1 5 10 15
Ser Ala Leu Gln Thr Arg Ile Ala Asn Leu Leu Lys Lys Gln Glu Lys
20 25 30
Leu Glu Phe Ile Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala
35 40 45
Ser Lys Val Asp Met Val Trp Ile Val Gly Gly Ser Ser Val Tyr Gln
50 55 60
Glu Ala Met Asn Gln Pro Gly His Leu Arg Leu Phe Val Thr Arg Ile
65 70 75 80
Met Gln Glu Phe Glu Ser Asp Thr Phe Phe Pro Glu Ile Asp Leu Gly
85 90 95
Lys Tyr Lys Leu Leu Pro Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser Glu Val Gln
100 105 110
Glu Glu Lys Gly Ile Lys Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu Lys Lys Asp
115 120 125
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 10
tgattatggg taagaagacc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 11
aaccttaggg aacctccaca 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 12
cggcccggca gatacctgag 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 13
gacatggtct ggatagttgg 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 14
gtcgctgtgt cccagaacat 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 15
cagatacctg agcggtggcc 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 16
cacattacct tctactgaag 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 17
cgtcgctgtg tcccagaaca 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 18
accacaacct cttcagtaga 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 19
aaattaattc taccctttaa 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 20
gagaatcaaa atcggtgaat 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 21
gagtagcgcg agcacagcta 20
<210> 22
<211> 106
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 22
Met Val Arg Pro Leu Asn Cys Ile Val Ala Val Ser Gln Asn Met Gly
1 5 10 15
Ile Gly Lys Asn Gly Asp Phe Pro Trp Pro Pro Leu Arg Asn Glu Ser
20 25 30
Lys Tyr Phe Gln Arg Met Thr Thr Thr Ser Ser Val Glu Gly Lys Gln
35 40 45
Asn Leu Val Ile Met Gly Arg Lys Thr Trp Phe Ser Ile Pro Glu Lys
50 55 60
Asn Arg Pro Leu Lys Asp Arg Ile Asn Ile Val Leu Ser Arg Glu Leu
65 70 75 80
Lys Glu Pro Pro Arg Gly Ala His Phe Leu Ala Lys Ser Leu Asp Asp
85 90 95
Ala Leu Arg Leu Ile Glu Gln Pro Glu Leu
100 105
<210> 23
<211> 81
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 23
Ala Ser Lys Val Asp Met Val Trp Ile Val Gly Gly Ser Ser Val Tyr
1 5 10 15
Gln Glu Ala Met Asn Gln Pro Gly His Leu Arg Leu Phe Val Thr Arg
20 25 30
Ile Met Gln Glu Phe Glu Ser Asp Thr Phe Phe Pro Glu Ile Asp Leu
35 40 45
Gly Lys Tyr Lys Leu Leu Pro Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser Glu Val
50 55 60
Gln Glu Glu Lys Gly Ile Lys Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu Lys Lys
65 70 75 80
Asp
<210> 24
<211> 47
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 24
Asn Thr Glu Ala Ala Arg Arg Ser Arg Ala Arg Lys Leu Gln Arg Met
1 5 10 15
Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His
20 25 30
Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Glu Arg
35 40 45
<210> 25
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 25
Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn
1 5 10 15
Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln
20 25 30
Leu Lys Gln Lys Val Met Asn His
35 40
<210> 26
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 26
Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Glu Val Lys Thr Leu Glu Ala Gln Asn
1 5 10 15
Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Glu Glu Gln Val Ala Gln
20 25 30
Leu Lys Gln Lys Val Met Asn His
35 40
<210> 27
<211> 37
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 27
Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Glu Val Lys Thr Leu Glu Ala Gln Asn
1 5 10 15
Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Glu Glu Gln Val Ala Gln
20 25 30
Leu Glu Gln Lys Val
35
<210> 28
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 28
Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr Asp Gln Leu Glu Asp Glu Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys
20 25 30
Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala His
35 40
<210> 29
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 29
Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Lys Thr Asp Gln Leu Lys Asp Glu Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Gln Thr Arg Ile Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys
20 25 30
Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala His
35 40
<210> 30
<211> 37
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 30
Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Lys Thr Asp Gln Leu Lys Asp Glu Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Gln Thr Arg Ile Ala Asn Leu Leu Lys Lys Lys Glu Lys
20 25 30
Leu Glu Phe Ile Leu
35
<210> 31
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 31
Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro
1 5 10 15
Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp
20 25 30
Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe
35 40 45
Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala
50 55 60
Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr
65 70 75 80
Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr
85 90 95
Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu
100 105
<210> 32
<211> 191
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 32
Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu
1 5 10 15
Trp Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val
20 25 30
Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro
35 40 45
Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln
50 55 60
Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro
65 70 75 80
Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr
85 90 95
Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile
100 105 110
Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys
115 120 125
Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn
130 135 140
Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu
145 150 155 160
Leu Leu Val Ile Phe Gln Val Thr Gly Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu
165 170 175
Gly Val Ala Ile Ser Val Ile Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr Arg Val
180 185 190
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 33
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 34
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 34
Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 35
<211> 153
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 35
Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Glu Val Lys Thr Leu Glu Ala Gln Asn
1 5 10 15
Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Glu Glu Gln Val Ala Gln
20 25 30
Leu Lys Gln Lys Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met
35 40 45
Val Arg Pro Leu Asn Cys Ile Val Ala Val Ser Gln Asn Met Gly Ile
50 55 60
Gly Lys Asn Gly Asp Phe Pro Trp Pro Pro Leu Arg Asn Glu Ser Lys
65 70 75 80
Tyr Phe Gln Arg Met Thr Thr Thr Ser Ser Val Glu Gly Lys Gln Asn
85 90 95
Leu Val Ile Met Gly Arg Lys Thr Trp Phe Ser Ile Pro Glu Lys Asn
100 105 110
Arg Pro Leu Lys Asp Arg Ile Asn Ile Val Leu Ser Arg Glu Leu Lys
115 120 125
Glu Pro Pro Arg Gly Ala His Phe Leu Ala Lys Ser Leu Asp Asp Ala
130 135 140
Leu Arg Leu Ile Glu Gln Pro Glu Leu
145 150
<210> 36
<211> 128
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 36
Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Lys Thr Asp Gln Leu Lys Asp Glu Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Gln Thr Arg Ile Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys
20 25 30
Leu Glu Phe Ile Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala
35 40 45
Ser Lys Val Asp Met Val Trp Ile Val Gly Gly Ser Ser Val Tyr Gln
50 55 60
Glu Ala Met Asn Gln Pro Gly His Leu Arg Leu Phe Val Thr Arg Ile
65 70 75 80
Met Gln Glu Phe Glu Ser Asp Thr Phe Phe Pro Glu Ile Asp Leu Gly
85 90 95
Lys Tyr Lys Leu Leu Pro Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser Glu Val Gln
100 105 110
Glu Glu Lys Gly Ile Lys Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu Lys Lys Asp
115 120 125
<210> 37
<211> 153
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 37
Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Glu Val Lys Thr Leu Glu Ala Gln Asn
1 5 10 15
Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Glu Glu Gln Val Ala Gln
20 25 30
Leu Glu Gln Lys Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met
35 40 45
Val Arg Pro Leu Asn Cys Ile Val Ala Val Ser Gln Asn Met Gly Ile
50 55 60
Gly Lys Asn Gly Asp Phe Pro Trp Pro Pro Leu Arg Asn Glu Ser Lys
65 70 75 80
Tyr Phe Gln Arg Met Thr Thr Thr Ser Ser Val Glu Gly Lys Gln Asn
85 90 95
Leu Val Ile Met Gly Arg Lys Thr Trp Phe Ser Ile Pro Glu Lys Asn
100 105 110
Arg Pro Leu Lys Asp Arg Ile Asn Ile Val Leu Ser Arg Glu Leu Lys
115 120 125
Glu Pro Pro Arg Gly Ala His Phe Leu Ala Lys Ser Leu Asp Asp Ala
130 135 140
Leu Arg Leu Ile Glu Gln Pro Glu Leu
145 150
<210> 38
<211> 128
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 38
Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Lys Thr Asp Gln Leu Lys Asp Glu Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Gln Thr Arg Ile Ala Asn Leu Leu Lys Lys Lys Glu Lys
20 25 30
Leu Glu Phe Ile Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala
35 40 45
Ser Lys Val Asp Met Val Trp Ile Val Gly Gly Ser Ser Val Tyr Gln
50 55 60
Glu Ala Met Asn Gln Pro Gly His Leu Arg Leu Phe Val Thr Arg Ile
65 70 75 80
Met Gln Glu Phe Glu Ser Asp Thr Phe Phe Pro Glu Ile Asp Leu Gly
85 90 95
Lys Tyr Lys Leu Leu Pro Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser Glu Val Gln
100 105 110
Glu Glu Lys Gly Ile Lys Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu Lys Lys Asp
115 120 125
<210> 39
<211> 163
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 39
Asn Thr Glu Ala Ala Arg Arg Ser Arg Ala Arg Lys Leu Gln Arg Met
1 5 10 15
Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His
20 25 30
Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Glu Arg Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Val Arg Pro Leu Asn Cys
50 55 60
Ile Val Ala Val Ser Gln Asn Met Gly Ile Gly Lys Asn Gly Asp Phe
65 70 75 80
Pro Trp Pro Pro Leu Arg Asn Glu Ser Lys Tyr Phe Gln Arg Met Thr
85 90 95
Thr Thr Ser Ser Val Glu Gly Lys Gln Asn Leu Val Ile Met Gly Arg
100 105 110
Lys Thr Trp Phe Ser Ile Pro Glu Lys Asn Arg Pro Leu Lys Asp Arg
115 120 125
Ile Asn Ile Val Leu Ser Arg Glu Leu Lys Glu Pro Pro Arg Gly Ala
130 135 140
His Phe Leu Ala Lys Ser Leu Asp Asp Ala Leu Arg Leu Ile Glu Gln
145 150 155 160
Pro Glu Leu
<210> 40
<211> 138
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 40
Asn Thr Glu Ala Ala Arg Arg Ser Arg Ala Arg Lys Leu Gln Arg Met
1 5 10 15
Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His
20 25 30
Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Glu Arg Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Lys Val Asp Met Val
50 55 60
Trp Ile Val Gly Gly Ser Ser Val Tyr Gln Glu Ala Met Asn Gln Pro
65 70 75 80
Gly His Leu Arg Leu Phe Val Thr Arg Ile Met Gln Glu Phe Glu Ser
85 90 95
Asp Thr Phe Phe Pro Glu Ile Asp Leu Gly Lys Tyr Lys Leu Leu Pro
100 105 110
Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser Glu Val Gln Glu Glu Lys Gly Ile Lys
115 120 125
Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu Lys Lys Asp
130 135
<210> 41
<211> 178
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 41
Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn
1 5 10 15
Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln
20 25 30
Leu Lys Gln Lys Val Met Asn His Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Met Val Arg Pro Leu Asn Cys Ile Val Ala Val Ser Gln Asn
50 55 60
Met Gly Ile Gly Lys Asn Gly Asp Phe Pro Trp Pro Pro Leu Arg Asn
65 70 75 80
Glu Ser Lys Tyr Phe Gln Arg Met Thr Thr Thr Ser Ser Val Glu Gly
85 90 95
Lys Gln Asn Leu Val Ile Met Gly Arg Lys Thr Trp Phe Ser Ile Pro
100 105 110
Glu Lys Asn Arg Pro Leu Lys Asp Arg Ile Asn Ile Val Leu Ser Arg
115 120 125
Glu Leu Lys Glu Pro Pro Arg Gly Ala His Phe Leu Ala Lys Ser Leu
130 135 140
Asp Asp Ala Leu Arg Leu Ile Glu Gln Pro Glu Leu Gly Ser Gly Ala
145 150 155 160
Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
165 170 175
Gly Pro
<210> 42
<211> 153
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 42
Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr Asp Gln Leu Glu Asp Glu Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys
20 25 30
Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala His Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Ala Ser Lys Val Asp Met Val Trp Ile Val Gly Gly Ser Ser
50 55 60
Val Tyr Gln Glu Ala Met Asn Gln Pro Gly His Leu Arg Leu Phe Val
65 70 75 80
Thr Arg Ile Met Gln Glu Phe Glu Ser Asp Thr Phe Phe Pro Glu Ile
85 90 95
Asp Leu Gly Lys Tyr Lys Leu Leu Pro Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser
100 105 110
Glu Val Gln Glu Glu Lys Gly Ile Lys Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu
115 120 125
Lys Lys Asp Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala
130 135 140
Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
145 150
<210> 43
<211> 156
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 43
Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn
1 5 10 15
Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln
20 25 30
Leu Lys Gln Lys Val Met Asn His Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Met Val Arg Pro Leu Asn Cys Ile Val Ala Val Ser Gln Asn
50 55 60
Met Gly Ile Gly Lys Asn Gly Asp Phe Pro Trp Pro Pro Leu Arg Asn
65 70 75 80
Glu Ser Lys Tyr Phe Gln Arg Met Thr Thr Thr Ser Ser Val Glu Gly
85 90 95
Lys Gln Asn Leu Val Ile Met Gly Arg Lys Thr Trp Phe Ser Ile Pro
100 105 110
Glu Lys Asn Arg Pro Leu Lys Asp Arg Ile Asn Ile Val Leu Ser Arg
115 120 125
Glu Leu Lys Glu Pro Pro Arg Gly Ala His Phe Leu Ala Lys Ser Leu
130 135 140
Asp Asp Ala Leu Arg Leu Ile Glu Gln Pro Glu Leu
145 150 155
<210> 44
<211> 131
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 44
Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr Asp Gln Leu Glu Asp Glu Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys
20 25 30
Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala His Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Ala Ser Lys Val Asp Met Val Trp Ile Val Gly Gly Ser Ser
50 55 60
Val Tyr Gln Glu Ala Met Asn Gln Pro Gly His Leu Arg Leu Phe Val
65 70 75 80
Thr Arg Ile Met Gln Glu Phe Glu Ser Asp Thr Phe Phe Pro Glu Ile
85 90 95
Asp Leu Gly Lys Tyr Lys Leu Leu Pro Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser
100 105 110
Glu Val Gln Glu Glu Lys Gly Ile Lys Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu
115 120 125
Lys Lys Asp
130
<210> 45
<211> 185
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 45
Asn Thr Glu Ala Ala Arg Arg Ser Arg Ala Arg Lys Leu Gln Arg Met
1 5 10 15
Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His
20 25 30
Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Glu Arg Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Val Arg Pro Leu Asn Cys
50 55 60
Ile Val Ala Val Ser Gln Asn Met Gly Ile Gly Lys Asn Gly Asp Phe
65 70 75 80
Pro Trp Pro Pro Leu Arg Asn Glu Ser Lys Tyr Phe Gln Arg Met Thr
85 90 95
Thr Thr Ser Ser Val Glu Gly Lys Gln Asn Leu Val Ile Met Gly Arg
100 105 110
Lys Thr Trp Phe Ser Ile Pro Glu Lys Asn Arg Pro Leu Lys Asp Arg
115 120 125
Ile Asn Ile Val Leu Ser Arg Glu Leu Lys Glu Pro Pro Arg Gly Ala
130 135 140
His Phe Leu Ala Lys Ser Leu Asp Asp Ala Leu Arg Leu Ile Glu Gln
145 150 155 160
Pro Glu Leu Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala
165 170 175
Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
180 185
<210> 46
<211> 160
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 46
Asn Thr Glu Ala Ala Arg Arg Ser Arg Ala Arg Lys Leu Gln Arg Met
1 5 10 15
Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His
20 25 30
Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Glu Arg Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Lys Val Asp Met Val
50 55 60
Trp Ile Val Gly Gly Ser Ser Val Tyr Gln Glu Ala Met Asn Gln Pro
65 70 75 80
Gly His Leu Arg Leu Phe Val Thr Arg Ile Met Gln Glu Phe Glu Ser
85 90 95
Asp Thr Phe Phe Pro Glu Ile Asp Leu Gly Lys Tyr Lys Leu Leu Pro
100 105 110
Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser Glu Val Gln Glu Glu Lys Gly Ile Lys
115 120 125
Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu Lys Lys Asp Gly Ser Gly Ala Thr Asn
130 135 140
Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
145 150 155 160
<210> 47
<211> 2284
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 47
gccagagtta tattgctggg gttttgaaga agatcctatt aaataaaaga ataagcagta 60
ttattaagta gccctgcatt tcaggtttcc ttgagtggca ggccaggcct ggccgtgaac 120
gttcactgaa atcatggcct cttggccaag attgatagct tgtgcctgtc cctgagtccc 180
agtccatcac gagcagctgg tttctaagat gctatttccc gtataaagca tgagaccgtg 240
acttgccagc cccacagagc cccgcccttg tccatcactg gcatctggac tccagcctgg 300
gttggggcaa agagggaaat gagatcatgt cctaaccctg atcctcttgt cccacagata 360
tccagaaccc tgaccctgcc gtgtaccagc tgagagactc taaatccagt gacaagtctg 420
tctgcctatt cggatctggc gccaccaatt tcagcctgct gaaacaggct ggcgacgtgg 480
aagagaaccc cggacctatg tctatcggcc tgctgtgttg tgccgctctg tctctgcttt 540
gggccggacc tgttaatgcc ggcgtgaccc agacacctaa gttccaggtg ctgaaaaccg 600
gccagagcat gaccctgcag tgcgcccagg atatgaacca cgagtacatg agctggtaca 660
gacaggaccc tggcatgggc ctgagactga tccactattc tgtcggagcc ggcatcaccg 720
accagggcga agttcctaat ggctacaacg tgtccagaag caccaccgag gacttcccac 780
tgagactgct gtctgccgct cctagccaga ccagcgtgta cttttgtgcc agcagctacg 840
tgggcaacac cggcgagctg ttttttggcg agggcagcag actgaccgtg ctggaggacc 900
tgaagaacgt gttccctcca aaggtggccg tgttcgagcc ttctgaggcc gagatcagcc 960
acacacagaa agccacactc gtgtgtctgg ccaccggctt ctaccccgat cacgtggaac 1020
tgtcttggtg ggtcaacggc aaagaggtgc acagcggcgt cagcacagat ccccagcctc 1080
tgaaagaaca gcccgctctg aacgacagcc ggtactgtct gagcagcaga ctgagagtgt 1140
ccgccacctt ctggcagaac cccagaaacc acttcagatg ccaggtgcag ttctacggcc 1200
tgagcgaaaa cgacgagtgg acccaggaca gggccaagcc tgtgacacag atcgtgtctg 1260
ccgaagcctg gggcagagcc gattgtggct ttaccagcga gagctaccag cagggcgtgc 1320
tgtctgccac aatcctgtac gagatcctgc tgggcaaagc cactctgtac gccgtgctgg 1380
tgtctgccct ggtgctgatg gccatggtca agcggaagga tagcagaggc ggcagcggcg 1440
aaggcagagg ctctcttctt acatgcggcg acgtcgaaga aaatcctggg cctatgaagt 1500
ccctgcgggt gctgctggtt atcctgtggc tgcagctgag ctgggtctgg tcccagaaac 1560
aagaagtgac tcagatccca gccgctctga gtgtgcctga gggcgaaaac ctggtcctga 1620
actgcagctt caccgacagc gccatctaca acctgcagtg gttcaggcag gatcccggca 1680
agggactgac aagcctgctg ctgattcaga gcagccagag agagcagacc tccggcagac 1740
tgaatgccag cctggataag agcagcggcc gcagcacact gtatatcgcc gcttctcagc 1800
ctggcgatag cgccacatat ctgtgtgccg tgcgacctct gtacggcggc agctacatcc 1860
ctacatttgg cagaggcacc agcctgatcg tgcaccccta cattcagaac cccgatcctg 1920
ccgtgtatca gctgagagac agcaagtcca gcgacaagag cgtgtgtttg ttcaccgatt 1980
ttgattctca aacaaatgtg tcacaaagta aggattctga tgtgtatatc acagacaaaa 2040
ctgtgctaga catgaggtct atggacttca agagcaacag tgctgtggcc tggagcaaca 2100
aatctgactt tgcatgtgca aacgccttca acaacagcat tattccagaa gacaccttct 2160
tccccagccc aggtaagggc agctttggtg ccttcgcagg ctgtttcctt gcttcaggaa 2220
tggccaggtt ctgcccagag ctctggtcaa tgatgtctaa aactcctctg attggtggtc 2280
tcgg 2284
<210> 48
<211> 2905
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 48
gccagagtta tattgctggg gttttgaaga agatcctatt aaataaaaga ataagcagta 60
ttattaagta gccctgcatt tcaggtttcc ttgagtggca ggccaggcct ggccgtgaac 120
gttcactgaa atcatggcct cttggccaag attgatagct tgtgcctgtc cctgagtccc 180
agtccatcac gagcagctgg tttctaagat gctatttccc gtataaagca tgagaccgtg 240
acttgccagc cccacagagc cccgcccttg tccatcactg gcatctggac tccagcctgg 300
gttggggcaa agagggaaat gagatcatgt cctaaccctg atcctcttgt cccacagata 360
tccagaaccc tgaccctgcc gtgtaccagc tgagagactc taaatccagt gacaagtctg 420
tctgcctatt cggatctggc gccaccaatt tcagcctgct gaaacaggct ggcgacgtgg 480
aagagaaccc cggacctatg tctatcggcc tgctgtgttg tgccgctctg tctctgcttt 540
gggccggacc tgttaatgcc ggcgtgaccc agacacctaa gttccaggtg ctgaaaaccg 600
gccagagcat gaccctgcag tgcgcccagg atatgaacca cgagtacatg agctggtaca 660
gacaggaccc tggcatgggc ctgagactga tccactattc tgtcggagcc ggcatcaccg 720
accagggcga agttcctaat ggctacaacg tgtccagaag caccaccgag gacttcccac 780
tgagactgct gtctgccgct cctagccaga ccagcgtgta cttttgtgcc agcagctacg 840
tgggcaacac cggcgagctg ttttttggcg agggcagcag actgaccgtg ctggaagatc 900
tgaacaaggt gttccctcca gaggtggccg tgttcgagcc ttctgaggcc gagatcagcc 960
acacacagaa agccacactc gtgtgcctgg ccaccggctt ttttcccgat cacgtggaac 1020
tgtcttggtg ggtcaacggc aaagaggtgc acagcggcgt cagcacagat ccccagcctc 1080
tgaaagaaca gcccgctctg aacgacagcc ggtactgtct gtcctccaga ctgagagtgt 1140
ccgccacctt ctggcagaac cccagaaacc acttcagatg ccaggtgcag ttctacggcc 1200
tgagcgagaa cgatgagtgg acccaggata gagccaagcc tgtgacacag atcgtgtctg 1260
ccgaagcctg gggcagagcc gattgtggct ttacctccgt gtcctatcag cagggcgtgc 1320
tgagcgccac aatcctgtat gagatcctgc tgggcaaagc cactctgtac gccgtgctgg 1380
tgtctgccct ggtgctgatg gccatggtca agagaaagga cttcggcagc ggcgaaggca 1440
gaggctctct tcttacatgc ggcgacgtcg aagaaaatcc tgggcctatg gtaggctccc 1500
tgaactgtat agttgcggta tcccaaaata tggggattgg aaagaacgga gaccttccgt 1560
ggccgcccct ccgaaatgaa tttcgatact ttcagagaat gacaactacc tcatctgtag 1620
agggaaagca aaatctggtt atcatgggaa agaaaacgtg gttctctatc cctgaaaaaa 1680
acagacctct caaaggcagg ataaatttgg tattgtcaag agaattgaag gaaccgccac 1740
aaggagctca ttttctcagc agatctctgg acgatgcact caaactcacc gaacaaccag 1800
aacttgctaa taaggttgat atggtctgga tagttggggg cagcagtgta tataaggaag 1860
ccatgaacca tcctggccat ctgaagctgt ttgttacgag gataatgcag gacttcgagt 1920
ccgacacttt tttcccagag attgacttgg aaaagtataa actcttgcct gagtatcctg 1980
gggttctctc cgatgtccaa gaggagaaag gtattaaata taagtttgaa gtttatgaaa 2040
aaaacgatgg atctggcgcc accaatttca gcctgctgaa acaggctggc gacgtggaag 2100
agaaccccgg acctatgaag tccctgcggg tgctgctggt tatcctgtgg ctgcagctga 2160
gctgggtctg gtcccagaaa caagaagtga ctcagatccc agccgctctg agtgtgcctg 2220
agggcgaaaa cctggtcctg aactgcagct tcaccgacag cgccatctac aacctgcagt 2280
ggttcaggca ggatcccggc aagggactga caagcctgct gctgattcag agcagccaga 2340
gagagcagac ctccggcaga ctgaatgcca gcctggataa gagcagcggc cgcagcacac 2400
tgtatatcgc cgcttctcag cctggcgata gcgccacata tctgtgtgcc gtgcgacctc 2460
tgtacggcgg cagctacatc cctacatttg gcagaggcac cagcctgatc gtgcacccct 2520
acattcagaa ccccgatcct gccgtgtatc agctgagaga cagcaagtcc agcgacaaga 2580
gcgtgtgttt gttcaccgat tttgattctc aaacaaatgt gtcacaaagt aaggattctg 2640
atgtgtatat cacagacaaa actgtgctag acatgaggtc tatggacttc aagagcaaca 2700
gtgctgtggc ctggagcaac aaatctgact ttgcatgtgc aaacgccttc aacaacagca 2760
ttattccaga agacaccttc ttccccagcc caggtaaggg cagctttggt gccttcgcag 2820
gctgtttcct tgcttcagga atggccaggt tctgcccaga gctctggtca atgatgtcta 2880
aaactcctct gattggtggt ctcgg 2905
<210> 49
<211> 2905
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 49
gccagagtta tattgctggg gttttgaaga agatcctatt aaataaaaga ataagcagta 60
ttattaagta gccctgcatt tcaggtttcc ttgagtggca ggccaggcct ggccgtgaac 120
gttcactgaa atcatggcct cttggccaag attgatagct tgtgcctgtc cctgagtccc 180
agtccatcac gagcagctgg tttctaagat gctatttccc gtataaagca tgagaccgtg 240
acttgccagc cccacagagc cccgcccttg tccatcactg gcatctggac tccagcctgg 300
gttggggcaa agagggaaat gagatcatgt cctaaccctg atcctcttgt cccacagata 360
tccagaaccc tgaccctgcc gtgtaccagc tgagagactc taaatccagt gacaagtctg 420
tctgcctatt cggatctggc gccaccaatt tcagcctgct gaaacaggct ggcgacgtgg 480
aagagaaccc cggacctatg tctatcggcc tgctgtgttg tgccgctctg tctctgcttt 540
gggccggacc tgttaatgcc ggcgtgaccc agacacctaa gttccaggtg ctgaaaaccg 600
gccagagcat gaccctgcag tgcgcccagg atatgaacca cgagtacatg agctggtaca 660
gacaggaccc tggcatgggc ctgagactga tccactattc tgtcggagcc ggcatcaccg 720
accagggcga agttcctaat ggctacaacg tgtccagaag caccaccgag gacttcccac 780
tgagactgct gtctgccgct cctagccaga ccagcgtgta cttttgtgcc agcagctacg 840
tgggcaacac cggcgagctg ttttttggcg agggcagcag actgaccgtg ctggaagatc 900
tgaacaaggt gttccctcca gaggtggccg tgttcgagcc ttctgaggcc gagatcagcc 960
acacacagaa agccacactc gtgtgcctgg ccaccggctt ttttcccgat cacgtggaac 1020
tgtcttggtg ggtcaacggc aaagaggtgc acagcggcgt cagcacagat ccccagcctc 1080
tgaaagaaca gcccgctctg aacgacagcc ggtactgtct gtcctccaga ctgagagtgt 1140
ccgccacctt ctggcagaac cccagaaacc acttcagatg ccaggtgcag ttctacggcc 1200
tgagcgagaa cgatgagtgg acccaggata gagccaagcc tgtgacacag atcgtgtctg 1260
ccgaagcctg gggcagagcc gattgtggct ttacctccgt gtcctatcag cagggcgtgc 1320
tgagcgccac aatcctgtat gagatcctgc tgggcaaagc cactctgtac gccgtgctgg 1380
tgtctgccct ggtgctgatg gccatggtca agagaaagga cttcggcagc ggcgaaggca 1440
gaggctctct tcttacatgc ggcgacgtcg aagaaaatcc tgggcctatg gtaggctccc 1500
tgaactgtat agttgcggta tcccaaaata tggggattgg aaagaacgga gactttccgt 1560
ggccgcccct ccgaaatgaa tcccgatact ttcagagaat gacaactacc tcatctgtag 1620
agggaaagca aaatctggtt atcatgggaa agaaaacgtg gttctctatc cctgaaaaaa 1680
acagacctct caaaggcagg ataaatttgg tattgtcaag agaattgaag gaaccgccac 1740
aaggagctca ttttctcagc agatctctgg acgatgcact caaactcacc gaacaaccag 1800
aacttgctaa taaggttgat atggtctgga tagttggggg cagcagtgta tataaggaag 1860
ccatgaacca tcctggccat ctgaagctgt ttgttacgag gataatgcag gacttcgagt 1920
ccgacacttt tttcccagag attgacttgg aaaagtataa actcttgcct gagtatcctg 1980
gggttctctc cgatgtccaa gaggagaaag gtattaaata taagtttgaa gtttatgaaa 2040
aaaacgatgg atctggcgcc accaatttca gcctgctgaa acaggctggc gacgtggaag 2100
agaaccccgg acctatgaag tccctgcggg tgctgctggt tatcctgtgg ctgcagctga 2160
gctgggtctg gtcccagaaa caagaagtga ctcagatccc agccgctctg agtgtgcctg 2220
agggcgaaaa cctggtcctg aactgcagct tcaccgacag cgccatctac aacctgcagt 2280
ggttcaggca ggatcccggc aagggactga caagcctgct gctgattcag agcagccaga 2340
gagagcagac ctccggcaga ctgaatgcca gcctggataa gagcagcggc cgcagcacac 2400
tgtatatcgc cgcttctcag cctggcgata gcgccacata tctgtgtgcc gtgcgacctc 2460
tgtacggcgg cagctacatc cctacatttg gcagaggcac cagcctgatc gtgcacccct 2520
acattcagaa ccccgatcct gccgtgtatc agctgagaga cagcaagtcc agcgacaaga 2580
gcgtgtgttt gttcaccgat tttgattctc aaacaaatgt gtcacaaagt aaggattctg 2640
atgtgtatat cacagacaaa actgtgctag acatgaggtc tatggacttc aagagcaaca 2700
gtgctgtggc ctggagcaac aaatctgact ttgcatgtgc aaacgccttc aacaacagca 2760
ttattccaga agacaccttc ttccccagcc caggtaaggg cagctttggt gccttcgcag 2820
gctgtttcct tgcttcagga atggccaggt tctgcccaga gctctggtca atgatgtcta 2880
aaactcctct gattggtggt ctcgg 2905
<210> 50
<211> 2809
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 50
gccagagtta tattgctggg gttttgaaga agatcctatt aaataaaaga ataagcagta 60
ttattaagta gccctgcatt tcaggtttcc ttgagtggca ggccaggcct ggccgtgaac 120
gttcactgaa atcatggcct cttggccaag attgatagct tgtgcctgtc cctgagtccc 180
agtccatcac gagcagctgg tttctaagat gctatttccc gtataaagca tgagaccgtg 240
acttgccagc cccacagagc cccgcccttg tccatcactg gcatctggac tccagcctgg 300
gttggggcaa agagggaaat gagatcatgt cctaaccctg atcctcttgt cccacagata 360
tccagaaccc tgaccctgcc gtgtaccagc tgagagactc taaatccagt gacaagtctg 420
tctgcctatt cggatctggc gccaccaatt tcagcctgct gaaacaggct ggcgacgtgg 480
aagagaaccc cggacctatg tctatcggcc tgctgtgttg tgccgctctg tctctgcttt 540
gggccggacc tgttaatgcc ggcgtgaccc agacacctaa gttccaggtg ctgaaaaccg 600
gccagagcat gaccctgcag tgcgcccagg atatgaacca cgagtacatg agctggtaca 660
gacaggaccc tggcatgggc ctgagactga tccactattc tgtcggagcc ggcatcaccg 720
accagggcga agttcctaat ggctacaacg tgtccagaag caccaccgag gacttcccac 780
tgagactgct gtctgccgct cctagccaga ccagcgtgta cttttgtgcc agcagctacg 840
tgggcaacac cggcgagctg ttttttggcg agggcagcag actgaccgtg ctggaagatc 900
tgcggaacgt gttccctcca aaggtggccg tgtttgagcc tagcgaggcc gagatcagcc 960
acacacagaa agccacactc gtgtgtctgg ccaccggctt ctatcccgat cacgtggaac 1020
tgtcttggtg ggtcaacggc aaagaggtgc acagcggcgt cagcacagat ccccagcctc 1080
tgaaagaaca gcccgctctg aacgacagcc ggtactgtct gtcctccaga ctgagagtgt 1140
ccgccacctt ctggcagaac cccagaaacc acttcagatg ccaggtgcag ttctacggcc 1200
tgagcgagaa cgacaagtgg cctgagggat ctgccaagcc tgtgacacag atcgtgtctg 1260
ccgaagcttg gggcagagcc gattgtggct ttaccagcga gagctaccag cagggcgttc 1320
tgtctgccac catcctgtac gagatcctgc tgggcaaagc cactctgtac gccgtgctgg 1380
tgtctgccct ggtgctgatg gccatggtca agcggaagga tagcagaggc ggaagcggag 1440
aaggcagagg ctctctgctt acatgcggag atgtggaaga aaatcctgga ccaagaatcg 1500
cccgcctgga agaagaggtc aagaccctgg aggcccagaa cagcgagctg gcctctaccg 1560
ccaacatgct ggaagaacag gtcgcccagc tggagcagaa agtcggcggc ggaggatctg 1620
gcggaggcgg atctatggtt cgacccctga attgcatcgt ggccgtgtct cagaacatgg 1680
gcatcggcaa gaacggcgac ttcccttggc ctcctctgcg gaacgagagc aagtacttcc 1740
agagaatgac caccaccagc agcgtggaag gcaagcagaa cctggtcatc atgggcagaa 1800
agacctggtt cagcatcccc gagaagaaca ggcccctgaa ggaccggatc aacatcgtgc 1860
tgagcagaga gctgaaagag cctcctagag gcgcccactt tctggccaag tctctggacg 1920
atgccctgcg gctgattgag cagcctgaac ttggcagcgg cgccacaaac ttttcactgc 1980
tgaagcaagc cggggatgtc gaagagaatc cagggcctat gaagtccctg cgggtgctgc 2040
tggttatcct gtggctgcag ctgagctggg tctggtccca gaaacaagaa gtgactcaga 2100
tcccagccgc tctgagtgtg cctgagggcg aaaacctggt cctgaactgc agcttcaccg 2160
acagcgccat ctacaacctg cagtggttca ggcaggatcc cggcaaggga ctgacaagcc 2220
tgctgctgat tcagagcagc cagagagagc agacctccgg cagactgaat gccagcctgg 2280
ataagagcag cggccgcagc acactgtata tcgccgcttc tcagcctggc gatagcgcca 2340
catatctgtg tgccgtgcga cctctgtacg gcggcagcta catccctaca tttggcagag 2400
gcaccagcct gatcgtgcac ccctacattc agaaccccga tcctgccgtg tatcagctga 2460
gagacagcaa gtccagcgac aagagcgtgt gtttgttcac cgattttgat tctcaaacaa 2520
atgtgtcaca aagtaaggat tctgatgtgt atatcacaga caaaactgtg ctagacatga 2580
ggtctatgga cttcaagagc aacagtgctg tggcctggag caacaaatct gactttgcat 2640
gtgcaaacgc cttcaacaac agcattattc cagaagacac cttcttcccc agcccaggta 2700
agggcagctt tggtgccttc gcaggctgtt tccttgcttc aggaatggcc aggttctgcc 2760
cagagctctg gtcaatgatg tctaaaactc ctctgattgg tggtctcgg 2809
<210> 51
<211> 2617
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 51
gaagttctcc ttctgctagg tagcattcaa agatcttaat cttctgggtt tccgttttct 60
cgaatgaaaa atgcaggtcc gagcagttaa ctggctgggg caccattagc aagtcactta 120
gcatctctgg ggccagtctg caaagcgagg gggcagcctt aatgtgcctc cagcctgaag 180
tcctagaatg agcgcccggt gtcccaagct ggggcgcgca ccccagatcg gagggcgccg 240
atgtacagac agcaaactca cccagtctag tgcatgcctt cttaaacatc acgagactct 300
aagaaaagga aactgaaaac gggaaagtcc ctctctctaa cctggcactg cgtcgctggc 360
ttggagacag gtgacggtcc ctgcgggcct tgtcctgatt ggctgggcac gcgtttaata 420
taagtggagg cgtcgcgctg gcgggcattc ctgaagctga cagcattcgg gccgagatgt 480
ctcgctccgt ggccttagct ggatctggag aaggcagagg cagcctgctt acatgcggag 540
atgtggaaga aaatcctgga ccaatgggaa gaggcctgct gagaggactg tggcctctgc 600
acattgtgct gtggaccaga atcgccagca caatccctcc acacgtgcag aaaagcgtga 660
acaacgacat gatcgtgacc gacaacaatg gcgccgtgaa gttccctcag ctgtgcaagt 720
tctgcgacgt gcggttcagc acctgtgaca accagaaaag ctgcatgagc aactgcagca 780
tcaccagcat ctgcgagaag ccccaagaag tgtgcgtcgc cgtctggcgg aagaacgacg 840
agaacatcac cctggaaacc gtgtgtcacg accccaagct gccctaccac gacttcatcc 900
tggaagatgc cgcctctcct aagtgcatca tgaaggaaaa gaagaagccc ggcgagacat 960
tcttcatgtg cagctgctcc agcgacgagt gcaacgacaa catcatcttc agcgaagagt 1020
acaacaccag caatcccgac ctgctgctgg tcatcttcca ggtgaccggc atcagcctgc 1080
tgcctccact gggagttgcc atcagcgtga tcatcatctt ttactgctac cgcgtgggat 1140
ctggcgccac caatttcagc ctgctgaaac aggctggcga cgtggaagag aaccccggac 1200
ctctgaccga cacactgcag gccaagacag accaactgaa agatgagaag tctgccctgc 1260
agaccaggat cgctaacctg ctgaaaaaga aagagaagct cgagttcatc ctgggtggcg 1320
gaggatctgg cggaggcgga tctgccagca aggtggacat ggtctggatc gtcggcggct 1380
cctctgtgta ccaagaggcc atgaatcagc ccggacacct gaggctgttc gtgaccagaa 1440
tcatgcaaga gttcgagagc gacacattct tcccagagat cgacctgggc aagtacaagc 1500
tgctgcctga gtatcccggc gtgctgtctg aggtgcaaga ggaaaagggc atcaagtata 1560
agttcgaggt gtacgagaaa aaggatggat ccggcgaagg cagaggatct ctgctgacat 1620
gtggcgacgt ggaagagaac cctggaccta tggatacctg ccacattgcc aagagctgcg 1680
tgctgatcct gctggtcgtt ctgctgtgtg ccgagcgagc acagggcctc gagtgctaca 1740
attgcattgg cgtgccacct gagacaagct gcaacaccac cacctgtcct ttcagcgacg 1800
gcttctgtgt ggccctggaa atcgaagtga tcgtggacag ccaccggtcc aaagtgaagt 1860
ccaacctgtg cctgcctatc tgccccacca cactggacaa caccgagatc acaggcaacg 1920
ccgtgaacgt gaaaacctac tgctgcaaag aggacctctg caacgccgct gttccaacag 1980
gtggaagctc ttggactatg gccggcgtgc tgctgtttag cctggtgtct gttctgctgc 2040
agaccttcct gggatcaggc gccacgaatt ttagcctgct caaacaggcg ggcgacgtag 2100
aagagaaccc aggacctgtg ctcgcgctac tctctctttc tggcctggag gctatccagc 2160
gtgagtctct cctaccctcc cgctctggtc cttcctctcc cgctctgcac cctctgtggc 2220
cctcgctgtg ctctctcgct ccgtgacttc ccttctccaa gttctccttg gtggcccgcc 2280
gtggggctag tccagggctg gatctcgggg aagcggcggg gtggcctggg agtggggaag 2340
ggggtgcgca cccgggacgc gcgctacttg cccctttcgg cggggagcag gggagacctt 2400
tggcctacgg cgacgggagg gtcgggacaa agtttagggc gtcgataagc gtcagagcgc 2460
cgaggttggg ggagggtttc tcttccgctc tttcgcgggg cctctggctc ccccagcgca 2520
gctggagtgg gggacgggta ggctcgtccc aaaggcgcgg cgctgaggtt tgtgaacgcg 2580
tggaggggcg cttggggtct gggggaggcg tcgcccg 2617
<210> 52
<211> 2617
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 52
agtatcttgg ggccaaatca tgtagactct tgagtgatgt gttaaggaat gctatgagtg 60
ctgagagggc atcagaagtc cttgagagcc tccagagaaa ggctcttaaa aatgcagcgc 120
aatctccagt gacagaagat actgctagaa atctgctaga aaaaaaacaa aaaaggcatg 180
tatagaggaa ttatgaggga aagataccaa gtcacggttt attcttcaaa atggaggtgg 240
cttgttggga aggtggaagc tcatttggcc agagtggaaa tggaattggg agaaatcgat 300
gaccaaatgt aaacacttgg tgcctgatat agcttgacac caagttagcc ccaagtgaaa 360
taccctggca atattaatgt gtcttttccc gatattcctc aggtactcca aagattcagg 420
tttactcacg tcatccagca gagaatggaa agtcaaattt cctgaattgc tatgtgtctg 480
ggtttcatcc atccgacatt ggatctggag aaggcagagg cagcctgctt acatgcggag 540
atgtggaaga aaatcctgga ccaatgggaa gaggcctgct gagaggactg tggcctctgc 600
acattgtgct gtggaccaga atcgccagca caatccctcc acacgtgcag aaaagcgtga 660
acaacgacat gatcgtgacc gacaacaatg gcgccgtgaa gttccctcag ctgtgcaagt 720
tctgcgacgt gcggttcagc acctgtgaca accagaaaag ctgcatgagc aactgcagca 780
tcaccagcat ctgcgagaag ccccaagaag tgtgcgtcgc cgtctggcgg aagaacgacg 840
agaacatcac cctggaaacc gtgtgtcacg accccaagct gccctaccac gacttcatcc 900
tggaagatgc cgcctctcct aagtgcatca tgaaggaaaa gaagaagccc ggcgagacat 960
tcttcatgtg cagctgctcc agcgacgagt gcaacgacaa catcatcttc agcgaagagt 1020
acaacaccag caatcccgac ctgctgctgg tcatcttcca ggtgaccggc atcagcctgc 1080
tgcctccact gggagttgcc atcagcgtga tcatcatctt ttactgctac cgcgtgggat 1140
ctggcgccac caatttcagc ctgctgaaac aggctggcga cgtggaagag aaccccggac 1200
ctctgaccga cacactgcag gccaagacag accaactgaa agatgagaag tctgccctgc 1260
agaccaggat cgctaacctg ctgaaaaaga aagagaagct cgagttcatc ctgggtggcg 1320
gaggatctgg cggaggcgga tctgccagca aggtggacat ggtctggatc gtcggcggct 1380
cctctgtgta ccaagaggcc atgaatcagc ccggacacct gaggctgttc gtgaccagaa 1440
tcatgcaaga gttcgagagc gacacattct tcccagagat cgacctgggc aagtacaagc 1500
tgctgcctga gtatcccggc gtgctgtctg aggtgcaaga ggaaaagggc atcaagtata 1560
agttcgaggt gtacgagaaa aaggatggat ccggcgaagg cagaggatct ctgctgacat 1620
gtggcgacgt ggaagagaac cctggaccta tggatacctg ccacattgcc aagagctgcg 1680
tgctgatcct gctggtcgtt ctgctgtgtg ccgagcgagc acagggcctc gagtgctaca 1740
attgcattgg cgtgccacct gagacaagct gcaacaccac cacctgtcct ttcagcgacg 1800
gcttctgtgt ggccctggaa atcgaagtga tcgtggacag ccaccggtcc aaagtgaagt 1860
ccaacctgtg cctgcctatc tgccccacca cactggacaa caccgagatc acaggcaacg 1920
ccgtgaacgt gaaaacctac tgctgcaaag aggacctctg caacgccgct gttccaacag 1980
gtggaagctc ttggactatg gccggcgtgc tgctgtttag cctggtgtct gttctgctgc 2040
agaccttcct gggatcaggc gccacgaatt ttagcctgct caaacaggcg ggcgacgtag 2100
aagagaaccc aggacctgaa gttgacttac tgaagaatgg agagagaatt gaaaaagtgg 2160
agcattcaga cttgtctttc agcaaggact ggtctttcta tctcttgtac tacactgaat 2220
tcacccccac tgaaaaagat gagtatgcct gccgtgtgaa ccatgtgact ttgtcacagc 2280
ccaagatagt taagtggggt aagtcttaca ttcttttgta agctgctgaa agttgtgtat 2340
gagtagtcat atcataaagc tgctttgata taaaaaaggt ctatggccat actaccctga 2400
atgagtccca tcccatctga tataaacaat ctgcatattg ggattgtcag ggaatgttct 2460
taaagatcag attagtggca cctgctgaga tactgatgca cagcatggtt tctgaaccag 2520
tagtttccct gcagttgagc agggagcagc agcagcactt gcacaaatac atatacactc 2580
ttaacacttc ttacctactg gcttcctcta gcttttg 2617
<210> 53
<211> 3007
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 53
gccagagtta tattgctggg gttttgaaga agatcctatt aaataaaaga ataagcagta 60
ttattaagta gccctgcatt tcaggtttcc ttgagtggca ggccaggcct ggccgtgaac 120
gttcactgaa atcatggcct cttggccaag attgatagct tgtgcctgtc cctgagtccc 180
agtccatcac gagcagctgg tttctaagat gctatttccc gtataaagca tgagaccgtg 240
acttgccagc cccacagagc cccgcccttg tccatcactg gcatctggac tccagcctgg 300
gttggggcaa agagggaaat gagatcatgt cctaaccctg atcctcttgt cccacagata 360
tccagaaccc tgaccctgcc gtgtaccagc tgagagactc taaatccagt gacaagtctg 420
tctgcctatt cggatctggc gccaccaatt tcagcctgct gaaacaggct ggcgacgtgg 480
aagagaaccc cggacctatg tctatcggcc tgctgtgttg tgccgctctg tctctgcttt 540
gggccggacc tgttaatgcc ggcgtgaccc agacacctaa gttccaggtg ctgaaaaccg 600
gccagagcat gaccctgcag tgcgcccagg atatgaacca cgagtacatg agctggtaca 660
gacaggaccc tggcatgggc ctgagactga tccactattc tgtcggagcc ggcatcaccg 720
accagggcga agttcctaat ggctacaacg tgtccagaag caccaccgag gacttcccac 780
tgagactgct gtctgccgct cctagccaga ccagcgtgta cttttgtgcc agcagctacg 840
tgggcaacac cggcgagctg ttttttggcg agggcagcag actgaccgtg ctggaagatc 900
tgcggaacgt gttccctcca aaggtggccg tgtttgagcc tagcgaggcc gagatcagcc 960
acacacagaa agccacactc gtgtgtctgg ccaccggctt ctatcccgat cacgtggaac 1020
tgtcttggtg ggtcaacggc aaagaggtgc acagcggcgt cagcacagat ccccagcctc 1080
tgaaagaaca gcccgctctg aacgacagcc ggtactgtct gtcctccaga ctgagagtgt 1140
ccgccacctt ctggcagaac cccagaaacc acttcagatg ccaggtgcag ttctacggcc 1200
tgagcgagaa cgacaagtgg cctgagggat ctgccaagcc tgtgacacag atcgtgtctg 1260
ccgaagcttg gggcagagcc gattgtggct ttaccagcga gagctaccag cagggcgttc 1320
tgtctgccac catcctgtac gagatcctgc tgggcaaagc cactctgtac gccgtgctgg 1380
tgtctgccct ggtgctgatg gccatggtca agcggaagga tagcagaggc ggaagcggag 1440
aaggcagagg ctctctgctt acatgcggag atgtggaaga aaatcctgga ccaatgggag 1500
ttcaagtgga gacaatatca ccaggcgatg gaaggacatt ccccaagcga gggcaaacgt 1560
gtgtggtaca ctacactggc atgttggagg acggaaagaa agtcgacagt tcccgcgacc 1620
ggaataagcc tttcaaattc atgctcggca agcaggaggt cattcggggt tgggaggaag 1680
gggtcgcgca aatgagtgtc ggacaacgcg caaaacttac tatttcccca gattacgcct 1740
acggagccac aggtcaccct ggtatcatac caccccacgc gactctggtt tttgatgtcg 1800
aattgctgaa attggaatct ggcggaggct ctatggttcg acccctgaat tgcatcgtgg 1860
ccgtgtctca gaacatgggc atcggcaaga acggcgactt cccttggcct cctctgcgga 1920
acgagagcaa gtacttccag agaatgacca ccaccagcag cgtggaaggc aagcagaacc 1980
tggtcatcat gggcagaaag acctggttca gcatccccga gaagaacagg cccctgaagg 2040
accggatcaa catcgtgctg agcagagagc tgaaagagcc tcctagaggc gcccactttc 2100
tggccaagtc tctggacgat gccctgcggc tgattgagca gcctgaactt ggcagcggcg 2160
ccacaaactt ttcactgctg aagcaagccg gggatgtcga agagaatcca gggcctatga 2220
agtccctgcg ggtgctgctg gttatcctgt ggctgcagct gagctgggtc tggtcccaga 2280
aacaagaagt gactcagatc ccagccgctc tgagtgtgcc tgagggcgaa aacctggtcc 2340
tgaactgcag cttcaccgac agcgccatct acaacctgca gtggttcagg caggatcccg 2400
gcaagggact gacaagcctg ctgctgattc agagcagcca gagagagcag acctccggca 2460
gactgaatgc cagcctggat aagagcagcg gccgcagcac actgtatatc gccgcttctc 2520
agcctggcga tagcgccaca tatctgtgtg ccgtgcgacc tctgtacggc ggcagctaca 2580
tccctacatt tggcagaggc accagcctga tcgtgcaccc ctacattcag aaccccgatc 2640
ctgccgtgta tcagctgaga gacagcaagt ccagcgacaa gagcgtgtgt ttgttcaccg 2700
attttgattc tcaaacaaat gtgtcacaaa gtaaggattc tgatgtgtat atcacagaca 2760
aaactgtgct agacatgagg tctatggact tcaagagcaa cagtgctgtg gcctggagca 2820
acaaatctga ctttgcatgt gcaaacgcct tcaacaacag cattattcca gaagacacct 2880
tcttccccag cccaggtaag ggcagctttg gtgccttcgc aggctgtttc cttgcttcag 2940
gaatggccag gttctgccca gagctctggt caatgatgtc taaaactcct ctgattggtg 3000
gtctcgg 3007
<210> 54
<211> 2815
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 54
gaagttctcc ttctgctagg tagcattcaa agatcttaat cttctgggtt tccgttttct 60
cgaatgaaaa atgcaggtcc gagcagttaa ctggctgggg caccattagc aagtcactta 120
gcatctctgg ggccagtctg caaagcgagg gggcagcctt aatgtgcctc cagcctgaag 180
tcctagaatg agcgcccggt gtcccaagct ggggcgcgca ccccagatcg gagggcgccg 240
atgtacagac agcaaactca cccagtctag tgcatgcctt cttaaacatc acgagactct 300
aagaaaagga aactgaaaac gggaaagtcc ctctctctaa cctggcactg cgtcgctggc 360
ttggagacag gtgacggtcc ctgcgggcct tgtcctgatt ggctgggcac gcgtttaata 420
taagtggagg cgtcgcgctg gcgggcattc ctgaagctga cagcattcgg gccgagatgt 480
ctcgctccgt ggccttagct ggatctggag aaggcagagg cagcctgctt acatgcggag 540
atgtggaaga aaatcctgga ccaatgggaa gaggcctgct gagaggactg tggcctctgc 600
acattgtgct gtggaccaga atcgccagca caatccctcc acacgtgcag aaaagcgtga 660
acaacgacat gatcgtgacc gacaacaatg gcgccgtgaa gttccctcag ctgtgcaagt 720
tctgcgacgt gcggttcagc acctgtgaca accagaaaag ctgcatgagc aactgcagca 780
tcaccagcat ctgcgagaag ccccaagaag tgtgcgtcgc cgtctggcgg aagaacgacg 840
agaacatcac cctggaaacc gtgtgtcacg accccaagct gccctaccac gacttcatcc 900
tggaagatgc cgcctctcct aagtgcatca tgaaggaaaa gaagaagccc ggcgagacat 960
tcttcatgtg cagctgctcc agcgacgagt gcaacgacaa catcatcttc agcgaagagt 1020
acaacaccag caatcccgac ctgctgctgg tcatcttcca ggtgaccggc atcagcctgc 1080
tgcctccact gggagttgcc atcagcgtga tcatcatctt ttactgctac cgcgtgggat 1140
ctggcgccac caatttcagc ctgctgaaac aggctggcga cgtggaagag aaccccggac 1200
ctatgggtgt gcaggtggaa acaatctctc cgggagacgg tcgcactttc ccgaagcgcg 1260
ggcaaacctg tgtcgtacat tacactggca tgttggaaga tggaaaaaag gtcgatagtt 1320
ctcgcgaccg caataagcca ttcaaattca tgctggggaa gcaggaggtt attcgcggat 1380
gggaggaagg agttgcccaa atgtctgtgg gacaaagggc caagttgact attagtcccg 1440
actacgcata cggggcgacc ggacaccccg gtataatacc ccctcacgcc actctggtct 1500
tcgacgtaga gcttttgaaa ctcgagtcag ggggcggatc tgccagcaag gtggacatgg 1560
tctggatcgt cggcggctcc tctgtgtacc aagaggccat gaatcagccc ggacacctga 1620
ggctgttcgt gaccagaatc atgcaagagt tcgagagcga cacattcttc ccagagatcg 1680
acctgggcaa gtacaagctg ctgcctgagt atcccggcgt gctgtctgag gtgcaagagg 1740
aaaagggcat caagtataag ttcgaggtgt acgagaaaaa ggatggatcc ggcgaaggca 1800
gaggatctct gctgacatgt ggcgacgtgg aagagaaccc tggacctatg gatacctgcc 1860
acattgccaa gagctgcgtg ctgatcctgc tggtcgttct gctgtgtgcc gagcgagcac 1920
agggcctcga gtgctacaat tgcattggcg tgccacctga gacaagctgc aacaccacca 1980
cctgtccttt cagcgacggc ttctgtgtgg ccctggaaat cgaagtgatc gtggacagcc 2040
accggtccaa agtgaagtcc aacctgtgcc tgcctatctg ccccaccaca ctggacaaca 2100
ccgagatcac aggcaacgcc gtgaacgtga aaacctactg ctgcaaagag gacctctgca 2160
acgccgctgt tccaacaggt ggaagctctt ggactatggc cggcgtgctg ctgtttagcc 2220
tggtgtctgt tctgctgcag accttcctgg gatcaggcgc cacgaatttt agcctgctca 2280
aacaggcggg cgacgtagaa gagaacccag gacctgtgct cgcgctactc tctctttctg 2340
gcctggaggc tatccagcgt gagtctctcc taccctcccg ctctggtcct tcctctcccg 2400
ctctgcaccc tctgtggccc tcgctgtgct ctctcgctcc gtgacttccc ttctccaagt 2460
tctccttggt ggcccgccgt ggggctagtc cagggctgga tctcggggaa gcggcggggt 2520
ggcctgggag tggggaaggg ggtgcgcacc cgggacgcgc gctacttgcc cctttcggcg 2580
gggagcaggg gagacctttg gcctacggcg acgggagggt cgggacaaag tttagggcgt 2640
cgataagcgt cagagcgccg aggttggggg agggtttctc ttccgctctt tcgcggggcc 2700
tctggctccc ccagcgcagc tggagtgggg gacgggtagg ctcgtcccaa aggcgcggcg 2760
ctgaggtttg tgaacgcgtg gaggggcgct tggggtctgg gggaggcgtc gcccg 2815
<210> 55
<211> 2815
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 55
agtatcttgg ggccaaatca tgtagactct tgagtgatgt gttaaggaat gctatgagtg 60
ctgagagggc atcagaagtc cttgagagcc tccagagaaa ggctcttaaa aatgcagcgc 120
aatctccagt gacagaagat actgctagaa atctgctaga aaaaaaacaa aaaaggcatg 180
tatagaggaa ttatgaggga aagataccaa gtcacggttt attcttcaaa atggaggtgg 240
cttgttggga aggtggaagc tcatttggcc agagtggaaa tggaattggg agaaatcgat 300
gaccaaatgt aaacacttgg tgcctgatat agcttgacac caagttagcc ccaagtgaaa 360
taccctggca atattaatgt gtcttttccc gatattcctc aggtactcca aagattcagg 420
tttactcacg tcatccagca gagaatggaa agtcaaattt cctgaattgc tatgtgtctg 480
ggtttcatcc atccgacatt ggatctggag aaggcagagg cagcctgctt acatgcggag 540
atgtggaaga aaatcctgga ccaatgggaa gaggcctgct gagaggactg tggcctctgc 600
acattgtgct gtggaccaga atcgccagca caatccctcc acacgtgcag aaaagcgtga 660
acaacgacat gatcgtgacc gacaacaatg gcgccgtgaa gttccctcag ctgtgcaagt 720
tctgcgacgt gcggttcagc acctgtgaca accagaaaag ctgcatgagc aactgcagca 780
tcaccagcat ctgcgagaag ccccaagaag tgtgcgtcgc cgtctggcgg aagaacgacg 840
agaacatcac cctggaaacc gtgtgtcacg accccaagct gccctaccac gacttcatcc 900
tggaagatgc cgcctctcct aagtgcatca tgaaggaaaa gaagaagccc ggcgagacat 960
tcttcatgtg cagctgctcc agcgacgagt gcaacgacaa catcatcttc agcgaagagt 1020
acaacaccag caatcccgac ctgctgctgg tcatcttcca ggtgaccggc atcagcctgc 1080
tgcctccact gggagttgcc atcagcgtga tcatcatctt ttactgctac cgcgtgggat 1140
ctggcgccac caatttcagc ctgctgaaac aggctggcga cgtggaagag aaccccggac 1200
ctatgggtgt gcaggtggaa acaatctctc cgggagacgg tcgcactttc ccgaagcgcg 1260
ggcaaacctg tgtcgtacat tacactggca tgttggaaga tggaaaaaag gtcgatagtt 1320
ctcgcgaccg caataagcca ttcaaattca tgctggggaa gcaggaggtt attcgcggat 1380
gggaggaagg agttgcccaa atgtctgtgg gacaaagggc caagttgact attagtcccg 1440
actacgcata cggggcgacc ggacaccccg gtataatacc ccctcacgcc actctggtct 1500
tcgacgtaga gcttttgaaa ctcgagtcag ggggcggatc tgccagcaag gtggacatgg 1560
tctggatcgt cggcggctcc tctgtgtacc aagaggccat gaatcagccc ggacacctga 1620
ggctgttcgt gaccagaatc atgcaagagt tcgagagcga cacattcttc ccagagatcg 1680
acctgggcaa gtacaagctg ctgcctgagt atcccggcgt gctgtctgag gtgcaagagg 1740
aaaagggcat caagtataag ttcgaggtgt acgagaaaaa ggatggatcc ggcgaaggca 1800
gaggatctct gctgacatgt ggcgacgtgg aagagaaccc tggacctatg gatacctgcc 1860
acattgccaa gagctgcgtg ctgatcctgc tggtcgttct gctgtgtgcc gagcgagcac 1920
agggcctcga gtgctacaat tgcattggcg tgccacctga gacaagctgc aacaccacca 1980
cctgtccttt cagcgacggc ttctgtgtgg ccctggaaat cgaagtgatc gtggacagcc 2040
accggtccaa agtgaagtcc aacctgtgcc tgcctatctg ccccaccaca ctggacaaca 2100
ccgagatcac aggcaacgcc gtgaacgtga aaacctactg ctgcaaagag gacctctgca 2160
acgccgctgt tccaacaggt ggaagctctt ggactatggc cggcgtgctg ctgtttagcc 2220
tggtgtctgt tctgctgcag accttcctgg gatcaggcgc cacgaatttt agcctgctca 2280
aacaggcggg cgacgtagaa gagaacccag gacctgaagt tgacttactg aagaatggag 2340
agagaattga aaaagtggag cattcagact tgtctttcag caaggactgg tctttctatc 2400
tcttgtacta cactgaattc acccccactg aaaaagatga gtatgcctgc cgtgtgaacc 2460
atgtgacttt gtcacagccc aagatagtta agtggggtaa gtcttacatt cttttgtaag 2520
ctgctgaaag ttgtgtatga gtagtcatat cataaagctg ctttgatata aaaaaggtct 2580
atggccatac taccctgaat gagtcccatc ccatctgata taaacaatct gcatattggg 2640
attgtcaggg aatgttctta aagatcagat tagtggcacc tgctgagata ctgatgcaca 2700
gcatggtttc tgaaccagta gtttccctgc agttgagcag ggagcagcag cagcacttgc 2760
acaaatacat atacactctt aacacttctt acctactggc ttcctctagc ttttg 2815
<210> 56
<211> 25
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 56
gagcaggttc tcattgataa caagc 25
<210> 57
<211> 25
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 57
atcaattgag gtacggagaa actga 25
<210> 58
<211> 25
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 58
gtcatggttg gttcgctaaa ctgca 25
<210> 59
<211> 25
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 59
gcaggttctc attgataaca agctc 25
<210> 60
<211> 25
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 60
gttgacttta gatctataat tattt 25
<210> 61
<211> 25
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 61
aaatcatcaa ttgaggtacg gagaa 25
<210> 62
<211> 218
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 62
Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro
1 5 10 15
Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp
20 25 30
Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe
35 40 45
Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala
50 55 60
Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr
65 70 75 80
Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr
85 90 95
Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu Ser Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Met Val Arg Pro Leu Asn Cys Ile Val Ala Val Ser Gln Asn Met Gly
115 120 125
Ile Gly Lys Asn Gly Asp Phe Pro Trp Pro Pro Leu Arg Asn Glu Ser
130 135 140
Lys Tyr Phe Gln Arg Met Thr Thr Thr Ser Ser Val Glu Gly Lys Gln
145 150 155 160
Asn Leu Val Ile Met Gly Arg Lys Thr Trp Phe Ser Ile Pro Glu Lys
165 170 175
Asn Arg Pro Leu Lys Asp Arg Ile Asn Ile Val Leu Ser Arg Glu Leu
180 185 190
Lys Glu Pro Pro Arg Gly Ala His Phe Leu Ala Lys Ser Leu Asp Asp
195 200 205
Ala Leu Arg Leu Ile Glu Gln Pro Glu Leu
210 215
<210> 63
<211> 193
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 63
Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro
1 5 10 15
Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp
20 25 30
Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe
35 40 45
Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala
50 55 60
Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr
65 70 75 80
Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr
85 90 95
Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu Ser Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Ala Ser Lys Val Asp Met Val Trp Ile Val Gly Gly Ser Ser Val Tyr
115 120 125
Gln Glu Ala Met Asn Gln Pro Gly His Leu Arg Leu Phe Val Thr Arg
130 135 140
Ile Met Gln Glu Phe Glu Ser Asp Thr Phe Phe Pro Glu Ile Asp Leu
145 150 155 160
Gly Lys Tyr Lys Leu Leu Pro Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser Glu Val
165 170 175
Gln Glu Glu Lys Gly Ile Lys Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu Lys Lys
180 185 190
Asp
Claims (133)
- i) 세포에서 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현할 수 있는 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열을 세포 내로 도입하되,
세포는, 세포가 정상 세포 배양 배지에서 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 감소되는 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질을 갖고,
적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열이 세포에서 발현을 위해 작동가능하거나 표적 게놈에서 사전-결정된 부위 내로 삽입될 때 발현을 위해 작동가능해지고,
적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열이 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 또는 이의 변이체, 및 발현될 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제2-부분 뉴클레오티드 서열이 관심 단백질을 코딩하는 것인,
단계; 및
ii) 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현하는 세포의 선택 또는 풍부화를 위한 약리학적 외인성 선택 압력 없이 정상 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계
를 포함하는,
유전적으로 조작된 세포의 선택 또는 풍부화를 위한 방법. - i) 세포가 정상 시험관내(in vitro) 증식 조건 하에 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 세포의 생존 및/또는 증식을 위해 필수적인 적어도 제1 단백질의 수준을 감소시키는 단계;
ii) 세포에서 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현할 수 있고 제1 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 또는 이의 변이체, 및 발현될 제2 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 2-부분 뉴클레오티드 서열을 세포 내로 도입하되,
적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열이 세포에서 발현을 위해 작동가능하거나 표적 게놈에서 사전-결정된 부위 내로 삽입될 때 발현을 위해 작동가능해지고,
제2-부분 단백질이 관심 단백질인,
단계; 및
iii) 제1 단백질 및 제2 단백질 둘 다를 발현하는 세포의 풍부화를 위한 약리학적 외인성 선택 압력 없이 정상 시험관내 증식 조건 하에 세포를 배양하는 단계
를 포함하는,
유전적으로 조작된 세포의 선택 또는 풍부화를 위한 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
필수 단백질의 수준에서의 감소가 영구적 또는 일시적일 수 있는 것인, 방법. - 제2항 또는 제3항에 있어서,
필수 단백질의 수준에서의 감소가 필수 단백질을 코딩하는 유전자의 녹-아웃(knock-out)을 포함하는 것인, 방법. - 제4항에 있어서,
녹-아웃이 CRISPR 리보핵단백질(RNP), TALEN, MegaTAL 또는 임의의 다른 뉴클레아제에 의해 매개되는 것인, 방법. - 제2항 또는 제3항에 있어서,
필수 단백질의 수준에서의 감소가 RNA 수준에서 필수 단백질의 수준에서의 일시적 감소를 포함하는 것인, 방법. - 제6항에 있어서,
일시적 억제가 siRNA, miRNA 또는 CRISPR 간섭(CRISPRi)을 통하는 것인, 방법. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
세포가 T 세포, NK 세포, NKT 세포, iNKT 세포, 조혈 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, iPSC, 신경 전구 세포, 망막 유전자 요법에서의 세포 유형 또는 임의의 다른 세포인, 방법. - 제1항 내지 제8항 중 어느 하나 한 항에 있어서,
제1-부분 뉴클레오티드 서열이 뉴클레오티드 서열에서 변경되어, 뉴클레아제, siRNA, miRNA 또는 CRISPRi 저항성을 달성하는 것인, 방법. - 제9항에 있어서,
제1 부분 뉴클레오티드 서열이 필수 제1 단백질과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 것인, 방법. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
제1-부분 뉴클레오티드 서열이 변경되어, 제1 단백질과 동일한 아미노산 서열을 갖지 않는 변경된 단백질을 코딩하는 것인, 방법. - 제11항에 있어서,
변경된 단백질은 제1 단백질이 갖지 않는 특이적 특징을 갖는 것인, 방법. - 제12항에 있어서,
특이적 특징이, 비제한적으로, 감소된 활성, 증가된 활성 및 변경된 반감기 중 하나 이상을 포함하는 것인, 방법. - 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다가 동일한 프로모터 또는 상이한 프로모터에 의해 구동될 수 있는 것인, 방법. - 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
제2-부분 뉴클레오티드 서열이 적어도 치료 유전자를 포함하는 것인, 방법. - 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
제2-부분 뉴클레오티드 서열이 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 함유하는 신생항원 T-세포 수용체 복합체(TCR)를 코딩하는 것인, 방법. - 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
필수 또는 제1 단백질이 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 이노신 모노포스페이트 탈수소효소 2(IMPDH2), O-6-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라아제(MGMT), 데옥시시티딘 키나아제(DCK), 하이포크산틴 포스포리보실트랜스퍼라아제 1(HPRT1), 인터류킨 2 수용체 서브유닛 감마(IL2RG), 액틴 베타(ACTB), 진핵생물 번역 신장 인자 1 알파 1(EEF1A1), 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH), 포스포글리세레이트 키나아제 1(PGK1) 또는 트랜스페린 수용체(TFRC)인, 방법. - 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
제1-부분 뉴클레오티드 서열이 뉴클레아제-저항성 또는 siRNA-저항성 DHFR 유전자를 포함하고, 제2-부분 뉴클레오티드 서열이 TRA 유전자 및 TRB 유전자를 포함하는 것인, 방법. - 제18항에 있어서,
TRA, TRB 및 DHFR 유전자가 단일 개방 판독 프레임으로부터 발현되도록 작동가능하게 구성되는 것인, 방법. - 제19항에 있어서,
TRA, TRB 및 DHFR 유전자가 적어도 하나의 링커에 의해 분리되는 것인, 방법. - 제20항에 있어서,
적어도 하나의 링커, TRA, TRB 및 DHFR 유전자의 순서가
TRA - 링커 - TRB - 링커 - DHFR,
TRA - 링커 - DHFR- 링커 - TRB,
TRB - 링커 - TRA - 링커 - DHFR,
TRB - 링커 - DHFR- 링커 - TRA,
DHFR - 링커 - TRA - 링커 - TRB, 또는
DHFR - 링커 - TRB - 링커 - TRA
인,
방법. - 제20항 또는 제21항에 있어서,
적어도 하나의 링커가 적어도 하나의 자가-절단 2A 펩티드 및/또는 적어도 하나의 IRES 요소인, 방법. - 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
DHFR, TRA 및 TRB 유전자가 내인성 TCR 프로모터 또는, 비제한적으로, TRAC, TRBC1/2, DHFR, EEF1A1, ACTB, B2M, CD52, CD2, CD3G, CD3D, CD3E, LCK, LAT, PTPRC, IL2RG, ITGB2, TGFBR2, PDCD1, CTLA4, FAS, TNFRSF1A(TNFR1), TNFRSF10B(TRAILR2), ADORA2A, BTLA, CD200R1, LAG3, TIGIT, HAVCR2(TIM3), VSIR(VISTA), IL10RA, IL4RA, EIF4A1, FTH1, FTL, HSPA5 및 PGK1의 프로모터를 포함하는 임의의 다른 적합한 프로모터에 의해 구동되는 것인, 방법. - 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
2-부분 뉴클레오티드 서열이 세포의 게놈 내로 통합되는 것인, 방법. - 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
적어도 하나의 2 부분 뉴클레오티드 서열이 표적 게놈에서 사전-결정된 부위 내로 삽입될 때 발현을 위해 작동가능해지고 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다가 표적 게놈에서 프로모터에 의해 구동되는 것인, 방법. - 제24항 또는 제25항에 있어서,
통합이 뉴클레아제-매개된 부위-특이적 통합, 전이인자-매개된 유전자 전달 또는 바이러스-매개 유전자 전달을 통하는 것인, 방법. - 제26항에 있어서,
뉴클레아제-매개된 부위-특이적 통합이 CRISPR RNP, 선택적으로 CRISPR/Cas9 RNP를 통하는 것인, 방법. - 제27항에 있어서,
스플릿 인테인(split intein) 시스템을 사용하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
도입된 2-부분 뉴클레오티드 서열이 세포의 게놈 내로 통합되지 않는 것인, 방법. - 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
내인성 TCR 불변 유전자좌를 표적화하는 CRISPR RNP, 뉴클레아제-저항성 DHFR 유전자를 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 신생항원 TCR을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열이 세포에 전달되는 것인, 방법. - 제30항에 있어서,
내인성 TCR 불변 유전자좌가 TCR 알파 불변(TRAC) 유전자좌 또는 TCR 베타 불변(TRBC) 유전자좌일 수 있는 것인, 방법. - 제30항 또는 제31항에 있어서,
전달이 전기천공, 또는 기계적 또는 화학적 막 투과화를 기초로 하는 방법에 의한 것인, 방법. - 제1항 내지 제5항, 제8항 내지 제28항 또는 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 CRISPR RNP가 사용되어, 내인성 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 유전자를 녹-아웃시키고, 제2 CRISPR RNP가 사용되어, CRISPR 뉴클레아제-저항성 DHFR 유전자를 포함하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 치료 TCR 유전자를 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 내인성 TCR 불변 유전자좌 내로 녹-인(knock-in)시키는, 방법. - 제33항에 있어서,
제2 CRISPR RNP가 녹-인을 위해 TRAC 유전자좌를 절단하는 TRAC RNP인, 방법. - 제5항, 제27항, 제30항, 제33항 또는 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
CRISPR RNP가 CRISPR/Cas9 RNP인, 방법. - 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
정상 세포 배양 배지가 비-매개된 세포의 성장 및/또는 증식에 적합한 것인, 방법. - 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
정상 세포 배양 배지는 임의의 외인성 선택 압력이 없는 것인, 방법. - 제5항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
CRISPR RNP가 사용되어, 제2 2-부분 뉴클레오티드를 표적 게놈에서 사전-결정된 부위 내로 녹-인시키고, 선택적으로 표적 게놈에서 사전-결정된 부위가 B2M 유전자인, 방법. - i) 세포에서 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현할 수 있는 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열을 세포 내로 도입하되,
세포는, 세포가 정상 세포 배양 배지에서 생존하고/하거나 증식할 수 없도록 감소되는 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 기능적 활성을 갖고,
적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열이 세포에서 발현을 위해 작동가능하거나 표적 게놈에서 사전-결정된 부위 내로 삽입될 때 발현을 위해 작동가능해지고,
적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열이 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질과 실질적으로 동등한 기능을 제공하는 제1 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 제2 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제2 단백질이 관심 단백질인,
단계; 및
ii) 제1 단백질 및 제2 단백질 둘 다를 발현하는 세포의 풍부화 또는 선택을 야기하는 적어도 하나의 보충제를 함유하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계
를 포함하는,
유전적으로 조작된 세포의 선택 또는 풍부화를 위한 방법. - i) 세포가 정상 시험관내 증식 조건 하에 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 세포의 생존 및/또는 증식을 위해 필수적인 적어도 제1 단백질의 기능적 활성을 감소시키는 단계;
ii) 세포에서 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현할 수 있고 실질적으로 동등한 기능을 제공하는 제1 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 제2 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 2-부분 뉴클레오티드 서열을 세포 내로 도입하되,
적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열이 세포에서 발현을 위해 작동가능하거나 표적 게놈에서 사전-결정된 부위 내로 삽입될 때 발현을 위해 작동가능해지고,
제2 단백질이 관심 단백질인,
단계; 및
iii) 제1 단백질 및 제2 단백질 둘 다를 발현하는 세포의 선택 또는 풍부화를 야기하는 적어도 하나의 보충제를 함유하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계
를 포함하는,
유전적으로 조작된 세포의 선택 또는 풍부화를 위한 방법. - 제39항 또는 제40항에 있어서,
세포가 T 세포, NK 세포, NKT 세포, iNKT 세포, 조혈 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, iPSC, 신경 전구 세포, 망막 유전자 요법에서의 세포 유형 또는 임의의 다른 세포인, 방법. - 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
제1-부분 뉴클레오티드 서열이 뉴클레오티드 서열에서 변경되어, 뉴클레아제, siRNA, miRNA 또는 CRISPRi 저항성을 달성하고, a) 제1 단백질과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하거나 b) 제1 단백질에 대해 조정된 기능성을 갖는 단백질을 코딩하는 것인, 방법. - 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
제1-부분 뉴클레오티드 서열이 변경되어, 제1 단백질과 동일한 아미노산 서열을 갖지 않는 변경된 단백질을 코딩하는 것인, 방법. - 제43항에 있어서,
변경된 단백질은 제1 단백질이 갖지 않는 특이적 특징을 갖는 것인, 방법. - 제44항에 있어서,
특이적 특징이, 비제한적으로, 감소된 활성, 증가된 활성, 변경된 반감기, 소분자 억제에 대한 저항성 및 소분자 결합 후 증가된 활성 중 하나 이상을 포함하는 것인, 방법. - 제39항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다가 동일한 프로모터 또는 상이한 프로모터에 의해 구동될 수 있는 것인, 방법. - 제39항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
제2-부분 뉴클레오티드 서열이 적어도 치료 유전자를 포함하는 것인, 방법. - 제39항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
제2-부분 뉴클레오티드 서열이 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 함유하는 신생항원 T-세포 수용체 복합체(TCR)를 코딩하는 것인, 방법. - 제39항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
필수 또는 제1 단백질이 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 이노신 모노포스페이트 탈수소효소 2(IMPDH2), O-6-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라아제(MGMT), 데옥시시티딘 키나아제(DCK), 하이포크산틴 포스포리보실트랜스퍼라아제 1(HPRT1), 인터류킨 2 수용체 서브유닛 감마(IL2RG), 액틴 베타(ACTB), 진핵생물 번역 신장 인자 1 알파 1(EEF1A1), 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH), 포스포글리세레이트 키나아제 1(PGK1) 또는 트랜스페린 수용체(TFRC)인, 방법. - 제39항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
제1-부분 뉴클레오티드 서열이 단백질 억제제-저항성 DHFR 유전자를 포함하고, 제2-부분 뉴클레오티드 서열이 TRA 유전자 및 TRB 유전자를 포함하는 것인, 방법. - 제50항에 있어서,
TRA, TRB 및 DHFR 유전자가 단일 개방 판독 프레임으로부터 발현되도록 작동가능하게 구성되는 것인, 방법. - 제51항에 있어서,
TRA, TRB 및 DHFR 유전자가 적어도 하나의 링커에 의해 분리되는 것인, 방법. - 제52항에 있어서,
적어도 하나의 링커, TRA, TRB 및 DHFR 유전자의 순서가
TRA - 링커 - TRB - 링커 - DHFR,
TRA - 링커 - DHFR- 링커 - TRB,
TRB - 링커 - TRA - 링커 - DHFR,
TRB - 링커 - DHFR- 링커 - TRA,
DHFR - 링커 - TRA - 링커 - TRB, 또는
DHFR - 링커 - TRB - 링커 - TRA
인,
방법. - 제53항에 있어서,
적어도 하나의 링커가 적어도 하나의 자가-절단 2A 펩티드 및/또는 적어도 하나의 IRES 요소인, 방법. - 제50항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
DHFR, TRA 및 TRB 유전자가 내인성 TCR 프로모터 또는, 비제한적으로, TRAC, TRBC1/2, DHFR, EEF1A1, ACTB, B2M, CD52, CD2, CD3G, CD3D, CD3E, LCK, LAT, PTPRC, IL2RG, ITGB2, TGFBR2, PDCD1, CTLA4, FAS, TNFRSF1A(TNFR1), TNFRSF10B(TRAILR2), ADORA2A, BTLA, CD200R1, LAG3, TIGIT, HAVCR2(TIM3), VSIR(VISTA), IL10RA, IL4RA, EIF4A1, FTH1, FTL, HSPA5 및 PGK1의 프로모터를 포함하는 임의의 다른 적합한 프로모터에 의해 구동되는 것인, 방법. - 제39항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서,
2-부분 뉴클레오티드 서열이 세포의 게놈 내로 통합되는 것인, 방법. - 제39항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
적어도 하나의 2 부분 뉴클레오티드 서열이 표적 게놈에서 사전-결정된 부위 내로 삽입될 때 발현을 위해 작동가능해지고 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다가 표적 게놈에서 프로모터에 의해 구동되는 것인, 방법. - 제57항에 있어서,
통합이 뉴클레아제-매개된 부위-특이적 통합, 전이인자-매개된 유전자 전달 또는 바이러스-매개 유전자 전달을 통하는 것인, 방법. - 제58항에 있어서,
뉴클레아제-매개된 부위-특이적 통합이 CRISPR RNP, 선택적으로 CRISPR/Cas9 RNP를 통하는 것인, 방법. - 제59항에 있어서,
스플릿 인테인 시스템을 사용하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제39항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서,
도입된 2-부분 뉴클레오티드 서열이 세포의 게놈 내로 통합되지 않는 것인, 방법. - 제39항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서,
내인성 TCR 불변 유전자좌를 표적화하는 CRISPR RNP, 단백질 억제제-저항성 DHFR 유전자를 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 신생항원 TCR을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열이 세포에 전달되는 것인, 방법. - 제62항에 있어서,
내인성 TCR 불변 유전자좌가 TCR 알파 불변(TRAC) 유전자좌 또는 TCR 베타 불변(TRBC) 유전자좌일 수 있는 것인, 방법. - 제62항 또는 제63항에 있어서,
전달이 전기천공, 또는 기계적 또는 화학적 막 투과화를 기초로 하는 방법에 의한 것인, 방법. - 제62항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서,
CRISPR RNP가 녹-인을 위해 TRAC 유전자좌를 절단하는 TRAC RNP인, 방법. - 제59항, 제62항 또는 제65항 중 어느 한 항에 있어서,
CRISPR RNP가 CRISPR/Cas9 RNP인, 방법. - 제39항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서,
세포의 풍부화 또는 선택을 야기하는 보충제가 유세포분석 또는 자성 비드 풍부화에 의한 세포의 풍부화를 허용하는 항체인, 방법. - 제39항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서,
보충제가 제1 단백질 및 제2 단백질 둘 다를 발현하지 않으면서 세포의 생존 및/또는 증식을 손상시키는 것인, 방법. - 제68항에 있어서,
제1 단백질이 세포의 생존 및/또는 증식의 보충제 매개된 손상에 대한 세포의 저항성을 매개하는 것인, 방법. - 제39항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서,
보충제가 메토트렉세이트인, 방법. - 제69항 또는 제70항에 있어서,
제1 단백질이 메토트렉세이트-저항성 DHFR 돌연변이체 단백질인, 방법. - i) 세포에서 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현할 수 있는 적어도 2 개의 2-부분 뉴클레오티드 서열을 세포 내로 도입하되,
세포는, 세포가 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 억제되는 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질을 갖고,
제1 2-부분 뉴클레오티드 서열이 제1 결합 도메인에 융합된 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 비-기능적 부분을 포함하는 제1 융합 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 관심 제1 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
제2 2-부분 뉴클레오티드 서열이 제2 결합 도메인에 융합된 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 비-기능적 부분을 포함하는 제2 융합 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 관심 제2 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
제1 및 제2 융합 단백질 둘 다가 세포에서 함께 발현될 때, 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 기능이 회복되는 것인,
단계; 및
ii) 제1 및 제2 2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현하는 세포의 선택을 야기하는 조건 하에 세포를 배양하는 단계
를 포함하는,
유전적으로 조작된 세포의 선택 또는 풍부화를 위한 방법. - i) 세포가 정상 시험관내 증식 조건 하에 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 세포의 생존 및/또는 증식을 위해 필수적인 적어도 제1 단백질을 억제하는 단계;
ii) 세포에서 발현될 수 있는 적어도 2 개의 2-부분 뉴클레오티드 서열을 도입하되,
제1 2-부분 뉴클레오티드 서열이 제1 결합 도메인에 융합된 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 비-기능적 부분을 포함하는 제1 융합 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 관심 제1 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
제2 2-부분 뉴클레오티드 서열이 제2 결합 도메인에 융합된 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 비-기능적 부분을 포함하는 제2 융합 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 관심 제2 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
제1 및 제2 융합 단백질 둘 다가 세포에서 함께 발현될 때, 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질의 기능이 회복되는 것인,
단계; 및
iii) 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질 둘 다를 발현하는 세포의 풍부화를 야기하는 시험관내 증식 조건 하에 세포를 배양하는 단계
를 포함하는,
유전적으로 조작된 세포의 선택 또는 풍부화를 위한 방법. - 제72항 또는 제73항에 있어서,
필수 단백질이 DHFR 단백질인, 방법. - 제74항에 있어서,
제1 융합 단백질이 DHFR의 N-말단 부분을 포함하고 제2 융합 단백질이 DHFR의 C-말단 부분을 포함하는 것인, 방법. - 제74항에 있어서,
제1 융합 단백질이 DHFR의 C-말단 부분을 포함하고 제2 융합 단백질이 DHFR의 N-말단 부분을 포함하는 것인, 방법. - 제74항 또는 제75항에 있어서,
DHFR의 N-말단 부분이 서열번호 22를 포함하는 것인, 방법. - 제74항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서,
DHFR의 C-말단 부분이 서열번호 23을 포함하는 것인, 방법. - 제72항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 또는 제2 2-부분 뉴클레오티드 서열의 제2-부분 뉴클레오티드 서열이 세포에 대해 외인성인 것인, 방법. - 제72항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 또는 제2 2-부분 뉴클레오티드 서열의 제2-부분 뉴클레오티드 서열이 TCR인, 방법. - 제72항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 및 제2 결합 도메인이 GCN4로부터 유래되는 것인, 방법. - 제72항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 및/또는 제2 결합 도메인이 서열번호 24를 포함하는 것인, 방법. - 제72항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질이 서열번호 39 또는 서열번호 40을 포함하는 것인, 방법. - 제72항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 및 제2 결합 도메인이 FKBP12로부터 유래되는 것인, 방법. - 제84항에 있어서,
FKBP12가 F36V 돌연변이를 갖는 것인, 방법. - 제72항 내지 제80항, 제84항 또는 제85항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 및/또는 제2 결합 도메인이 서열번호 31을 포함하는 것인, 방법. - 제72항 내지 제80항 또는 제84항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질이 서열번호 62 또는 서열번호 63을 포함하는 것인, 방법. - 제72항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인이 JUN 및 FOS로부터 유래되는 것인, 방법. - 제88항에 있어서,
제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인이 서로에 대한 결합을 보존하는 상보성 돌연변이를 갖는 것인, 방법. - 제89항에 있어서,
제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인이 천연 결합 파트너에 결합하지 않는 것인, 방법. - 제72항 내지 제80항 또는 제88항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인 각각이 3 내지 7 개 상보성 돌연변이를 갖는 것인, 방법. - 제91항에 있어서,
제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인이 각각 3 개 상보성 돌연변이를 갖는 것인, 방법. - 제72항 내지 제80항 또는 제88항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인이 서열번호 26 또는 서열번호 29를 포함하는 것인, 방법. - 제72항 내지 제80항 또는 제88항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질이 서열번호 35 또는 서열번호 36을 포함하는 것인, 방법. - 제91항에 있어서,
제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인이 각각 4 개 상보성 돌연변이를 갖는 것인, 방법. - 제72항 내지 제80항, 제88항 내지 제91항 또는 제95항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인이 서열번호 27 및 서열번호 30을 포함하는 것인, 방법. - 제72항 내지 제80항, 제88항 내지 제91항, 제95항 또는 제96항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질이 서열번호 37 및 서열번호 38을 포함하는 것인, 방법. - 제72항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서,
적어도 2 개의 2-부분 뉴클레오티드 서열이 세포의 게놈 내로 통합되는 것인, 방법. - 제72항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서,
적어도 2 개의 2-부분 뉴클레오티드 서열이 표적 게놈에서 사전-결정된 부위 내로 삽입될 때 발현을 위해 작동가능해지고 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다가 표적 게놈에서 프로모터에 의해 구동되는 것인, 방법. - 제98항 또는 제99항에 있어서,
통합이 뉴클레아제-매개된 부위-특이적 통합, 전이인자-매개된 유전자 전달 또는 바이러스-매개 유전자 전달을 통하는 것인, 방법. - 제100항에 있어서,
뉴클레아제-매개된 부위-특이적 통합이 CRISPR RNP를 통하는 것인, 방법. - 제72항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 2-부분 뉴클레오티드 서열이 내인성 TCR 불변 유전자좌를 표적화하는 CRISPR RNP에 의해 세포에 전달되고, 제1 제1-부분 뉴클레오티드 서열이 DHFR 단백질의 비-기능적 부분을 코딩하고, 제1 제2-부분 뉴클레오티드 서열이 신생항원 TCR을 코딩하는 것인, 방법. - 제72항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서,
제2 2-부분 뉴클레오티드 서열이 TCR 불변 유전자좌 이외의 내인성 유전자좌를 표적화하는 CRISPR RNP에 의해 세포에 전달되고, 제2 제1-부분 뉴클레오티드 서열이 DHFR 단백질의 비-기능적 부분을 코딩하고, 제2 제2-부분 뉴클레오티드 서열이 관심 단백질을 코딩하는 것인, 방법. - 제103항에 있어서,
제1 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 제2 제1-부분 뉴클레오티드 서열은, 융합 단백질이 공동-발현될 때, DHFR 활성을 갖는 DHFR 단백질의 비-기능적 부분을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 것인, 방법. - 제102항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서,
내인성 TCR 불변 유전자좌가 TCR 알파 불변(TRAC) 유전자좌 또는 TCR 베타 불변(TRBC) 유전자좌일 수 있는 것인, 방법. - 제103항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서,
TCR 불변 유전자좌 이외의 내인성 유전자좌가 B2M 유전자좌인, 방법. - 제102항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서,
전달이 전기천공, 또는 기계적 또는 화학적 막 투과화를 기초로 하는 방법에 의한 것인, 방법. - 제101항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서,
CRISPR RNP가 CRISPR/Cas9 RNP인, 방법. - 제26항 내지 제28항, 제30항 내지 제38항, 제58항 내지 제60항, 제62항 내지 제71항 또는 제100항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서,
뉴클레아제가 유전자좌 내로의 인-프레임 엑손 통합을 허용하여, 내인성 프로모터, 내인성 스플라이스 부위 및 내인성 종결 신호로부터의 2-부분 뉴클레오티드 중 하나의 적어도 하나의 부분을 발현하는 것인, 방법. - 제26항 내지 제28항, 제30항 내지 제38항, 제58항 내지 제60항, 제62항 내지 제71항 또는 제100항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서,
뉴클레아제가 유전자좌 내로의 인-프레임 엑손 통합을 허용하여, 내인성 프로모터, 내인성 스플라이스 부위 및 외인성 종결 신호로부터의 2-부분 뉴클레오티드 중 하나의 적어도 하나의 부분을 발현하는 것인, 방법. - 제26항 내지 제28항, 제30항 내지 제38항, 제58항 내지 제60항, 제62항 내지 제71항 또는 제100항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서,
뉴클레아제가 유전자좌 내로의 인트론 통합을 허용하여, 내인성 프로모터, 외인성 스플라이스 수용체 부위 및 외인성 종결 신호로부터의 2-부분 뉴클레오티드 중 하나의 적어도 하나의 부분을 발현하는 것인, 방법. - 제1항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서,
필수 또는 제1 단백질이 적어도 2 개의 개별적 기능장애 단백질 부분으로 분열되고, 적어도 2 개 부분 각각이 다량체화 도메인에 융합되고 적어도 2 개 부분 각각이 별개의 2-부분 뉴클레오티드 서열 내로 통합되어, 별개의 2-부분 뉴클레오티드 서열 전부가 발현되는 세포의 선택을 허용하고, 선택적으로 필수 또는 제1 단백질의 기능이 회복되는 것인, 방법. - 제1항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서,
필수 또는 제1 단백질이 기능장애 N-말단 및 C-말단 단백질 절반으로 분열되고, 각각의 절반이 호모- 또는 헤테로다이머화 단백질 파트너 또는 스플릿 인테인에 융합되는 것인, 방법. - 제112항 또는 제113항에 있어서,
필수 또는 제1 단백질이 DHFR 단백질인, 방법. - 제114항에 있어서,
제1 기능장애 단백질 부분이 DHFR의 N-말단 부분을 포함하고 제2 기능장애 단백질 부분이 DHFR의 C-말단 부분을 포함하는 것인, 방법. - 제115항에 있어서,
DHFR의 N-말단 부분이 서열번호 22를 포함하는 것인, 방법. - 제116항에 있어서,
DHFR의 C-말단 부분이 서열번호 23을 포함하는 것인, 방법. - 제108항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서,
호모다이머화 단백질이 GCN4, FKBP12 또는 이의 변이체인, 방법. - 제108항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서,
헤테로다이머화 단백질이 Jun/Fos 또는 이의 변이체인, 방법. - 제72항 내지 제76항, 제80항 내지 제83항 또는 제108항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서,
필수 단백질의 기능의 회복이 선택적으로 AP1903에 의해 유도되는 것인, 방법. - 제72항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서,
배양 단계가 메토트렉세이트의 존재 하에 수행되는 것인, 방법. - 제1항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서,
관심 단백질이 T 세포 수용체인, 방법. - 제122항에 있어서,
T 세포 수용체가 바이러스 또는 종양 항원에 대해 특이적인 것인, 방법. - 제123항에 있어서,
종양 항원이 종양 신생항원인, 방법. - 제1항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서,
유전적으로 조작된 세포가 일차 인간 T 세포인, 방법. - i) 메토트렉세이트-저항성 DHFR 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 TRA 또는 TRB 프로모터의 후속의 2-부분 뉴클레오티드 서열의 통합에 의해 T 세포에서 T-세포 수용체 복합체 또는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 2-부분 뉴클레오티드 서열을 도입하는 단계, 및
ii) 제1 단백질 및 제2 단백질 둘 다를 발현하는 세포의 풍부화를 야기하는 메토트렉세이트를 함유하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계
를 포함하는, 유전적으로 조작된 T 세포의 풍부화를 위한 방법. - i) 제1 CRISPR/Cas9 RNP를 사용하여 내인성 TRBC 유전자를 이의 유전자좌로부터 녹-아웃시키는 단계;
ii) 제2 CRISPR/Cas9 RNP를 사용하여, 메토트렉세이트-저항성 DHFR 유전자를 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 치료 TCR 유전자를 포함하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 내인성 TRBC 유전자좌 내로 녹-인시키되, 양측 뉴클레오티드 서열이 작동가능하게 연결되어, 내인성 TRBC 프로모터로부터의 발현을 허용하는 것인, 단계; 및
iii) 치료 TCR 및 메토트렉세이트-저항성 DHFR 유전자 둘 다를 발현하는 T 세포의 풍부화를 야기하는 메토트렉세이트를 함유하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계
를 포함하는, 외인성 T 세포 수용체 유전자를 발현하도록 조작된 T 세포의 풍부화를 위한 방법. - i) 세포에서 발현을 위해 작동가능한 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열을 도입하되,
세포는, 세포가 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 억제되는 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질을 갖고,
적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열이 생존 및/또는 증식을 위한 필수 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제2-부분 뉴클레오티드 서열이 세포에 대해 외인성인 단백질을 코딩하는 것인,
단계; 및
ii) 제1-부분 및 제2-부분 뉴클레오티드 서열 둘 다를 발현하는 세포의 선택을 야기하는 조건 하에 세포를 배양하는 단계
를 포함하는,
유전적으로 조작된 세포의 선택을 위한 방법. - i) 세포가 정상 시험관내 증식 조건 하에 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 세포의 생존 및/또는 증식을 위해 필수적인 적어도 제1 단백질의 활성을 감소시키는 단계;
ii) 세포에서 발현을 위해 작동가능하고 제1 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 발현될 제2 단백질을 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 2-부분 뉴클레오티드 서열을 도입하되, 제2-부분 단백질이 세포에 대해 외인성인 것인, 단계; 및
iii) 제1 단백질 및 제2 단백질 둘 다를 발현하는 세포의 풍부화를 야기하는 시험관내 증식 조건 하에 세포를 배양하는 단계
를 포함하는, 유전적으로 조작된 세포의 풍부화를 위한 방법. - 제1항 내지 제129항 중 어느 하나에 따라 제조되는 세포.
- 세포가 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 메토트렉세이트의 존재에 의해 억제되는 내인성 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 및
메토트렉세이트-저항성 DHFR 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 및 내인성 TRA 또는 TRB 프로모터로부터 작동가능하게 발현되는 T-세포 수용체를 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 2-부분 뉴클레오티드 서열
을 포함하는, T 세포. - 내인성 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)의 녹-아웃, 및
DHFR 단백질을 코딩하는 제1-부분 뉴클레오티드 서열 또는 이의 변이체; 및
내인성 TRA 또는 TRB 프로모터로부터 작동가능하게 발현되는 T-세포 수용체를 코딩하는 제2-부분 뉴클레오티드 서열
을 포함하는 적어도 하나의 2-부분 뉴클레오티드 서열
을 포함하는, T 세포. - 세포가 생존하고/하거나 증식할 수 없는 수준까지 메토트렉세이트의 존재에 의해 억제되도록 구성된 내인성 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 및
적어도 2 개의 2-부분 뉴클레오티드 서열
을 포함하고,
제1 2-부분 뉴클레오티드 서열이
i) DHFR 단백질의 비-기능적 또는 기능장애 부분을 코딩하는 제1 제1-부분 뉴클레오티드 서열 또는 이의 변이체; 및
ii) 내인성 TRA 또는 TRB 프로모터로부터 작동가능하게 발현되는 T-세포 수용체를 코딩하는 제1 제2-부분 뉴클레오티드 서열
을 포함하고,
제2 2-부분 뉴클레오티드 서열이
iii) DHFR 단백질의 비-기능적 또는 기능장애 부분을 코딩하는 제2 제1-부분 뉴클레오티드 서열 또는 이의 변이체; 및
iv) 내인성 B2M 프로모터로부터 작동가능하게 발현되는 관심 단백질을 코딩하는 제2 제2-부분 뉴클레오티드 서열
을 포함하고,
세포가 DHFR 활성을 갖도록 구성되는,
T 세포.
Applications Claiming Priority (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US202063062854P | 2020-08-07 | 2020-08-07 | |
| US63/062,854 | 2020-08-07 | ||
| US202163135460P | 2021-01-08 | 2021-01-08 | |
| US63/135,460 | 2021-01-08 | ||
| US202163170269P | 2021-04-02 | 2021-04-02 | |
| US63/170,269 | 2021-04-02 | ||
| US202163221808P | 2021-07-14 | 2021-07-14 | |
| US63/221,808 | 2021-07-14 | ||
| PCT/US2021/071122 WO2022032299A1 (en) | 2020-08-07 | 2021-08-05 | Methods to enrich genetically engineered t cells |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230065251A true KR20230065251A (ko) | 2023-05-11 |
Family
ID=77543729
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020237007441A KR20230065251A (ko) | 2020-08-07 | 2021-08-05 | 유전적으로 조작된 t 세포를 풍부화시키기 위한 방법 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20220041999A1 (ko) |
| EP (1) | EP4192941A1 (ko) |
| JP (1) | JP2023537048A (ko) |
| KR (1) | KR20230065251A (ko) |
| CN (1) | CN116323920A (ko) |
| AU (1) | AU2021320556A1 (ko) |
| CA (1) | CA3188431A1 (ko) |
| MX (1) | MX2023001596A (ko) |
| TW (1) | TW202212352A (ko) |
| WO (1) | WO2022032299A1 (ko) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022183076A1 (en) * | 2021-02-25 | 2022-09-01 | Lyell Immunopharma, Inc. | Enhanced immune cell therapy targeting ny-eso-1 |
| WO2023084073A1 (en) | 2021-11-15 | 2023-05-19 | Neogene Therapeutics B.V. | Engineered t cells with reduced tgf-beta receptor signaling |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2018504143A (ja) * | 2015-01-26 | 2018-02-15 | セレクティスＣｅｌｌｅｃｔｉｓ | がん免疫治療のための抗ｈｓｐ７０特異的キメラ抗原受容体（ｃａｒ） |
| AU2018367896B2 (en) * | 2017-05-12 | 2023-06-01 | Crispr Therapeutics Ag | Materials and methods for engineering cells and uses thereof in immuno-oncology |
| CN107201365B (zh) * | 2017-05-19 | 2018-04-20 | 四川丰讯科技发展有限公司 | 一种特异性敲除二氢叶酸还原酶基因的sgRNA序列及其应用 |
-
2021
- 2021-08-05 MX MX2023001596A patent/MX2023001596A/es unknown
- 2021-08-05 AU AU2021320556A patent/AU2021320556A1/en active Pending
- 2021-08-05 US US17/395,132 patent/US20220041999A1/en active Pending
- 2021-08-05 KR KR1020237007441A patent/KR20230065251A/ko unknown
- 2021-08-05 JP JP2023508119A patent/JP2023537048A/ja active Pending
- 2021-08-05 WO PCT/US2021/071122 patent/WO2022032299A1/en unknown
- 2021-08-05 CA CA3188431A patent/CA3188431A1/en active Pending
- 2021-08-05 CN CN202180069138.5A patent/CN116323920A/zh active Pending
- 2021-08-05 EP EP21762978.1A patent/EP4192941A1/en active Pending
- 2021-08-06 TW TW110129192A patent/TW202212352A/zh unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP4192941A1 (en) | 2023-06-14 |
| JP2023537048A (ja) | 2023-08-30 |
| CN116323920A (zh) | 2023-06-23 |
| US20220041999A1 (en) | 2022-02-10 |
| TW202212352A (zh) | 2022-04-01 |
| WO2022032299A1 (en) | 2022-02-10 |
| MX2023001596A (es) | 2023-04-20 |
| AU2021320556A1 (en) | 2023-03-09 |
| CA3188431A1 (en) | 2022-02-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2015243922B2 (en) | Production of engineered T-cells by sleeping beauty transposon coupled with methotrexate selection | |
| US20230061455A1 (en) | Methods, compositions and components for crispr-cas9 editing of tgfbr2 in t cells for immunotherapy | |
| WO2019051424A9 (en) | Compositions and methods for chimeric ligand receptor (clr)-mediated conditional gene expression | |
| CN110462040A (zh) | 通过新基因开关表达系统调节多肽的表达 | |
| CN111655719A (zh) | 内源性t细胞受体的靶向置换 | |
| US20240033300A1 (en) | Method for treating autoimmune disease using cd4 t-cells with engineered stabilization of expression of endogenous foxp3 gene | |
| CA3086187A1 (en) | Vcar compositions and methods for use | |
| CN110914431B (zh) | 经人工操纵的免疫细胞 | |
| US20210002609A1 (en) | Modified lymphocytes | |
| US20220041999A1 (en) | Methods to enrich genetically engineered t cells | |
| US20230137729A1 (en) | Methods, compositions and components for crispr-cas9 editing of cblb in t cells for immunotherapy | |
| EP2670848B1 (en) | Affinity maturated t cell receptors and use thereof | |
| WO2021170089A1 (en) | Engineering immune cells via simultaneous knock-in and gene disruption | |
| EP4039808A1 (en) | Guide rnas and uses thereof | |
| Weissberg et al. | Endowing human CD8 T cells with a veto-like recognition capacity via the electroporation of MHC-I/CD3ζ mRNA | |
| WO2023016514A1 (zh) | 经修饰的细胞、其制备方法及应用 | |
| RU2798380C2 (ru) | Способы, композиции и компоненты для редактирования tgfbr2 посредством crispr-cas9 в t-клетках для иммунотерапии | |
| WO2022266538A2 (en) | Compositions and methods for targeting, editing or modifying human genes | |
| WO2023235813A2 (en) | Modified regulatory t cells and methods of using the same | |
| CN117940465A (en) | Modified cells, methods of making and uses thereof |