JP2023537048A - 遺伝子改変したｔ細胞の濃縮方法 - Google Patents
遺伝子改変したｔ細胞の濃縮方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2023537048A JP2023537048A JP2023508119A JP2023508119A JP2023537048A JP 2023537048 A JP2023537048 A JP 2023537048A JP 2023508119 A JP2023508119 A JP 2023508119A JP 2023508119 A JP2023508119 A JP 2023508119A JP 2023537048 A JP2023537048 A JP 2023537048A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- cells
- nucleotide sequence
- cell
- dhfr
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 330
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 title claims description 214
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 690
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 656
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 545
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 460
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 459
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 claims description 248
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 235
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 claims description 233
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 184
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 claims description 165
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 claims description 165
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 147
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 claims description 132
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 115
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 96
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 93
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 93
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 92
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 claims description 91
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 claims description 91
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 81
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 76
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 claims description 72
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 58
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 51
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 46
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims description 44
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 claims description 43
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 41
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 39
- 102100029454 T cell receptor alpha chain MC.7.G5 Human genes 0.000 claims description 38
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 36
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 36
- 102100026967 T cell receptor beta chain MC.7.G5 Human genes 0.000 claims description 33
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 claims description 33
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 claims description 30
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 30
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims description 28
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 claims description 28
- 102100027913 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP1A Human genes 0.000 claims description 24
- 108010006877 Tacrolimus Binding Protein 1A Proteins 0.000 claims description 24
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 24
- 238000010446 CRISPR interference Methods 0.000 claims description 22
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims description 20
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 18
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 claims description 18
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims description 18
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 claims description 17
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 claims description 17
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 17
- 102100022900 Actin, cytoplasmic 1 Human genes 0.000 claims description 15
- 101100107610 Arabidopsis thaliana ABCF4 gene Proteins 0.000 claims description 15
- 102100026234 Cytokine receptor common subunit gamma Human genes 0.000 claims description 15
- 101710189311 Cytokine receptor common subunit gamma Proteins 0.000 claims description 15
- 102100030801 Elongation factor 1-alpha 1 Human genes 0.000 claims description 15
- 101000756632 Homo sapiens Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 claims description 15
- 101000920078 Homo sapiens Elongation factor 1-alpha 1 Proteins 0.000 claims description 15
- 102100028251 Phosphoglycerate kinase 1 Human genes 0.000 claims description 15
- 101710139464 Phosphoglycerate kinase 1 Proteins 0.000 claims description 15
- 101100068078 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) GCN4 gene Proteins 0.000 claims description 15
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 15
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 15
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 15
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 15
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 15
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 15
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 15
- 230000017730 intein-mediated protein splicing Effects 0.000 claims description 14
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 14
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 12
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 12
- 229940121649 protein inhibitor Drugs 0.000 claims description 12
- 239000012268 protein inhibitor Substances 0.000 claims description 12
- 102100027314 Beta-2-microglobulin Human genes 0.000 claims description 11
- 101000937544 Homo sapiens Beta-2-microglobulin Proteins 0.000 claims description 11
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 11
- 102200015453 rs121912293 Human genes 0.000 claims description 11
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 claims description 11
- 102100029588 Deoxycytidine kinase Human genes 0.000 claims description 10
- 108010033174 Deoxycytidine kinase Proteins 0.000 claims description 10
- 102100034458 Hepatitis A virus cellular receptor 2 Human genes 0.000 claims description 10
- 101001076642 Homo sapiens Inosine-5'-monophosphate dehydrogenase 2 Proteins 0.000 claims description 10
- 101000610604 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10B Proteins 0.000 claims description 10
- 101000801228 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Proteins 0.000 claims description 10
- 101000666896 Homo sapiens V-type immunoglobulin domain-containing suppressor of T-cell activation Proteins 0.000 claims description 10
- 102100029098 Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 claims description 10
- 102100025891 Inosine-5'-monophosphate dehydrogenase 2 Human genes 0.000 claims description 10
- 102100025825 Methylated-DNA-protein-cysteine methyltransferase Human genes 0.000 claims description 10
- 108010033576 Transferrin Receptors Proteins 0.000 claims description 10
- 102100026144 Transferrin receptor protein 1 Human genes 0.000 claims description 10
- 102100040112 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10B Human genes 0.000 claims description 10
- 102100033732 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Human genes 0.000 claims description 10
- 102100038282 V-type immunoglobulin domain-containing suppressor of T-cell activation Human genes 0.000 claims description 10
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 10
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 claims description 10
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 9
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims description 9
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims description 9
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 claims description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 9
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims description 8
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 7
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 claims description 7
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 claims description 7
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 claims description 7
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 claims description 7
- -1 IL4RA Proteins 0.000 claims description 6
- 101150012617 TRB gene Proteins 0.000 claims description 6
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000005155 neural progenitor cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 claims description 6
- 101150069263 tra gene Proteins 0.000 claims description 6
- 102100022089 Acyl-[acyl-carrier-protein] hydrolase Human genes 0.000 claims description 5
- 102100035990 Adenosine receptor A2a Human genes 0.000 claims description 5
- 102100029822 B- and T-lymphocyte attenuator Human genes 0.000 claims description 5
- 101000796998 Bacillus subtilis (strain 168) Methylated-DNA-protein-cysteine methyltransferase, inducible Proteins 0.000 claims description 5
- 101000964894 Bos taurus 14-3-3 protein zeta/delta Proteins 0.000 claims description 5
- 102100024217 CAMPATH-1 antigen Human genes 0.000 claims description 5
- 108010065524 CD52 Antigen Proteins 0.000 claims description 5
- 102100021396 Cell surface glycoprotein CD200 receptor 1 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 claims description 5
- 108700041152 Endoplasmic Reticulum Chaperone BiP Proteins 0.000 claims description 5
- 102100021451 Endoplasmic reticulum chaperone BiP Human genes 0.000 claims description 5
- 102100039950 Eukaryotic initiation factor 4A-I Human genes 0.000 claims description 5
- 102100020760 Ferritin heavy chain Human genes 0.000 claims description 5
- 102100021062 Ferritin light chain Human genes 0.000 claims description 5
- 101150112743 HSPA5 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 108010007707 Hepatitis A Virus Cellular Receptor 2 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000824278 Homo sapiens Acyl-[acyl-carrier-protein] hydrolase Proteins 0.000 claims description 5
- 101000783751 Homo sapiens Adenosine receptor A2a Proteins 0.000 claims description 5
- 101000864344 Homo sapiens B- and T-lymphocyte attenuator Proteins 0.000 claims description 5
- 101000969553 Homo sapiens Cell surface glycoprotein CD200 receptor 1 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000889276 Homo sapiens Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000959666 Homo sapiens Eukaryotic initiation factor 4A-I Proteins 0.000 claims description 5
- 101001002987 Homo sapiens Ferritin heavy chain Proteins 0.000 claims description 5
- 101000818390 Homo sapiens Ferritin light chain Proteins 0.000 claims description 5
- 101001068133 Homo sapiens Hepatitis A virus cellular receptor 2 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000935040 Homo sapiens Integrin beta-2 Proteins 0.000 claims description 5
- 101001083151 Homo sapiens Interleukin-10 receptor subunit alpha Proteins 0.000 claims description 5
- 101001047640 Homo sapiens Linker for activation of T-cells family member 1 Proteins 0.000 claims description 5
- 101001137987 Homo sapiens Lymphocyte activation gene 3 protein Proteins 0.000 claims description 5
- 101000611936 Homo sapiens Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000702132 Homo sapiens Protein spinster homolog 1 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 claims description 5
- 101000662909 Homo sapiens T cell receptor beta constant 1 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000831007 Homo sapiens T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains Proteins 0.000 claims description 5
- 101000934346 Homo sapiens T-cell surface antigen CD2 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000946863 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD3 delta chain Proteins 0.000 claims description 5
- 101000946860 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD3 epsilon chain Proteins 0.000 claims description 5
- 101000738413 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD3 gamma chain Proteins 0.000 claims description 5
- 101000611023 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6 Proteins 0.000 claims description 5
- 101001047681 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase Lck Proteins 0.000 claims description 5
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 claims description 5
- 102100025390 Integrin beta-2 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100030236 Interleukin-10 receptor subunit alpha Human genes 0.000 claims description 5
- 102100039078 Interleukin-4 receptor subunit alpha Human genes 0.000 claims description 5
- 102000017578 LAG3 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100024032 Linker for activation of T-cells family member 1 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 claims description 5
- 102100037272 T cell receptor beta constant 1 Human genes 0.000 claims description 5
- 108700042075 T-Cell Receptor Genes Proteins 0.000 claims description 5
- 102100024834 T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains Human genes 0.000 claims description 5
- 102100025237 T-cell surface antigen CD2 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100035891 T-cell surface glycoprotein CD3 delta chain Human genes 0.000 claims description 5
- 102100035794 T-cell surface glycoprotein CD3 epsilon chain Human genes 0.000 claims description 5
- 102100037911 T-cell surface glycoprotein CD3 gamma chain Human genes 0.000 claims description 5
- 108010082684 Transforming Growth Factor-beta Type II Receptor Proteins 0.000 claims description 5
- 102000004060 Transforming Growth Factor-beta Type II Receptor Human genes 0.000 claims description 5
- 102100024036 Tyrosine-protein kinase Lck Human genes 0.000 claims description 5
- 101001038499 Yarrowia lipolytica (strain CLIB 122 / E 150) Lysine acetyltransferase Proteins 0.000 claims description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims description 5
- IJJVMEJXYNJXOJ-UHFFFAOYSA-N fluquinconazole Chemical compound C=1C=C(Cl)C=C(Cl)C=1N1C(=O)C2=CC(F)=CC=C2N=C1N1C=NC=N1 IJJVMEJXYNJXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000005734 heterodimerization reaction Methods 0.000 claims description 5
- 108040008770 methylated-DNA-[protein]-cysteine S-methyltransferase activity proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 5
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 4
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 claims description 4
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L (R)-2-Hydroxy-3-(phosphonooxy)-propanal Natural products O=C[C@H](O)COP([O-])([O-])=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L 0.000 claims description 3
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N D-glyceraldehyde 3-phosphate Chemical compound O=C[C@H](O)COP(O)(O)=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 3
- 101150076800 B2M gene Proteins 0.000 claims description 2
- 230000009149 molecular binding Effects 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 4
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 claims 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 claims 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 abstract description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 457
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 43
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 39
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 33
- 230000006870 function Effects 0.000 description 32
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 29
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 28
- 101000861454 Homo sapiens Protein c-Fos Proteins 0.000 description 24
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 24
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 description 20
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 description 20
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 19
- 239000002924 silencing RNA Substances 0.000 description 19
- 230000006525 intracellular process Effects 0.000 description 18
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 18
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 17
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 13
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 12
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 12
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 12
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 12
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 11
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 11
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 10
- 230000003946 protein process Effects 0.000 description 10
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 9
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 9
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 9
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 9
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 8
- 101000908713 Homo sapiens Dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 8
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 8
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 8
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 8
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 8
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 8
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 7
- 210000004986 primary T-cell Anatomy 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 230000004844 protein turnover Effects 0.000 description 7
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 6
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 6
- 230000034431 double-strand break repair via homologous recombination Effects 0.000 description 6
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 6
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 6
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 5
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 5
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 5
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 5
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 102100025137 Early activation antigen CD69 Human genes 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 4
- 101000934374 Homo sapiens Early activation antigen CD69 Proteins 0.000 description 4
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 4
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 4
- 102100027268 Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Human genes 0.000 description 4
- 101001065556 Mus musculus Lymphocyte antigen 6G Proteins 0.000 description 4
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 4
- 230000025084 cell cycle arrest Effects 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 4
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 4
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 4
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 230000006662 intracellular pathway Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- MSTNYGQPCMXVAQ-RYUDHWBXSA-N (6S)-5,6,7,8-tetrahydrofolic acid Chemical compound C([C@H]1CNC=2N=C(NC(=O)C=2N1)N)NC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 MSTNYGQPCMXVAQ-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 3
- 108010073062 Transcription Activator-Like Effectors Proteins 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000011198 co-culture assay Methods 0.000 description 3
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 230000000447 dimerizing effect Effects 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000003198 gene knock in Methods 0.000 description 3
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 3
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 3
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 230000003938 response to stress Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 3
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000005460 tetrahydrofolate Substances 0.000 description 3
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 3
- 230000009258 tissue cross reactivity Effects 0.000 description 3
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 3
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 description 2
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 description 2
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100028972 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Human genes 0.000 description 2
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 2
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 description 2
- 101001018097 Homo sapiens L-selectin Proteins 0.000 description 2
- 102100033467 L-selectin Human genes 0.000 description 2
- 101100278853 Mus musculus Dhfr gene Proteins 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 2
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 2
- 108010087408 alpha-beta T-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 125000001314 canonical amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 2
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940014144 folate Drugs 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 2
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 2
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 2
- 102000054767 gene variant Human genes 0.000 description 2
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 2
- 230000008826 genomic mutation Effects 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 2
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 201000005943 Barth syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108010001572 Basic-Leucine Zipper Transcription Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000000806 Basic-Leucine Zipper Transcription Factors Human genes 0.000 description 1
- 101100180402 Caenorhabditis elegans jun-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100026550 Caspase-9 Human genes 0.000 description 1
- 108090000566 Caspase-9 Proteins 0.000 description 1
- 229940123587 Cell cycle inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108091007741 Chimeric antigen receptor T cells Proteins 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 101150097493 D gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 206010013801 Duchenne Muscular Dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000010337 G2 phase Effects 0.000 description 1
- 229940122498 Gene expression inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 1
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000588067 Homo sapiens Metaxin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101001060744 Homo sapiens Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP1A Proteins 0.000 description 1
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 description 1
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 101001050288 Homo sapiens Transcription factor Jun Proteins 0.000 description 1
- 101150008942 J gene Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- 102000044126 RNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700020471 RNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 210000000662 T-lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- 108091005735 TGF-beta receptors Proteins 0.000 description 1
- 108091028113 Trans-activating crRNA Proteins 0.000 description 1
- 102000016715 Transforming Growth Factor beta Receptors Human genes 0.000 description 1
- 101150117115 V gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 102000006707 alpha-beta T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 208000005980 beta thalassemia Diseases 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 229930189065 blasticidin Natural products 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- KQNZDYYTLMIZCT-KQPMLPITSA-N brefeldin A Chemical compound O[C@@H]1\C=C\C(=O)O[C@@H](C)CCC\C=C\[C@@H]2C[C@H](O)C[C@H]21 KQNZDYYTLMIZCT-KQPMLPITSA-N 0.000 description 1
- JUMGSHROWPPKFX-UHFFFAOYSA-N brefeldin-A Natural products CC1CCCC=CC2(C)CC(O)CC2(C)C(O)C=CC(=O)O1 JUMGSHROWPPKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 238000010293 colony formation assay Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 210000001608 connective tissue cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 1
- GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N dTMP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- OZRNSSUDZOLUSN-LBPRGKRZSA-N dihydrofolic acid Chemical compound N=1C=2C(=O)NC(N)=NC=2NCC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OZRNSSUDZOLUSN-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000005868 electrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000003966 growth inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000002768 hair cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002064 heart cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 102000055209 human FKBP1A Human genes 0.000 description 1
- 102000047278 human FOS Human genes 0.000 description 1
- 102000047546 human JUN Human genes 0.000 description 1
- 102000051868 human MTX1 Human genes 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000004073 interleukin-2 production Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N ionomycin Natural products O1C(CC(O)C(C)C(O)C(C)C=CCC(C)CC(C)C(O)=CC(=O)C(C)CC(C)CC(CCC(O)=O)C)CCC1(C)C1OC(C)(C(C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N ionomycin Chemical compound O1[C@H](C[C@H](O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)/C=C/C[C@@H](C)C[C@@H](C)C(/O)=C/C(=O)[C@@H](C)C[C@@H](C)C[C@@H](CCC(O)=O)C)CC[C@@]1(C)[C@@H]1O[C@](C)([C@@H](C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000007524 negative regulation of DNA replication Effects 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 230000005868 ontogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000004789 organ system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000007859 posttranscriptional regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 108020001775 protein parts Proteins 0.000 description 1
- 230000016434 protein splicing Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000002213 purine nucleotide Substances 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 description 1
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 101150074703 sun gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0026—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5)
- C12N9/0028—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with NAD or NADP as acceptor (1.5.1)
- C12N9/003—Dihydrofolate reductase [DHFR] (1.5.1.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
- C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y105/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH group of donors (1.5)
- C12Y105/01—Oxidoreductases acting on the CH-NH group of donors (1.5) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.5.1)
- C12Y105/01003—Dihydrofolate reductase (1.5.1.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
本明細書では、遺伝子改変した細胞を選抜するための方法に関するさまざまな態様を開示する。いくつかの態様は、本明細書で開示の方法によって産生された細胞に関するものである。【選択図】 図１
Description
関連出願の相互参照
国外または国内の優先権を主張する全ての出願が、本出願とともに提出される出願データシートで特定されており、３７ＣＦＲ１．５７に基づいて、それらは参照することにより本明細書に組み入れられる。本出願は、２０２０年８月７日に出願の米国仮出願第６３／０６２８５４号、２０２１年１月８日に出願の同第６３／１３５４６０号、２０２１年４月２日に出願の同第６３／１７０２６９号、および２０２１年７月１４日に出願の同第６３／２２１８０８号の優先権を主張し、これらの全体は、参照することで本明細書に組み込まれる。
国外または国内の優先権を主張する全ての出願が、本出願とともに提出される出願データシートで特定されており、３７ＣＦＲ１．５７に基づいて、それらは参照することにより本明細書に組み入れられる。本出願は、２０２０年８月７日に出願の米国仮出願第６３／０６２８５４号、２０２１年１月８日に出願の同第６３／１３５４６０号、２０２１年４月２日に出願の同第６３／１７０２６９号、および２０２１年７月１４日に出願の同第６３／２２１８０８号の優先権を主張し、これらの全体は、参照することで本明細書に組み込まれる。
配列表の参照
本出願は、電子形式の配列表とともに出願される。配列表は、２０２３年２月６日に作成され、サイズが１００，９３４バイトの「ＮＴＢＶ．０２４ＷＯ．ｘｍｌ」と題するファイルとして提供される。電子形式の配列表に含まれる情報は、その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる。
本出願は、電子形式の配列表とともに出願される。配列表は、２０２３年２月６日に作成され、サイズが１００，９３４バイトの「ＮＴＢＶ．０２４ＷＯ．ｘｍｌ」と題するファイルとして提供される。電子形式の配列表に含まれる情報は、その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる。
技術分野
本発明は、細胞治療および／または遺伝子治療の分野に属する。いくつかの態様はさらに、細胞または遺伝子改変の分野に属する。
本発明は、細胞治療および／または遺伝子治療の分野に属する。いくつかの態様はさらに、細胞または遺伝子改変の分野に属する。
細胞治療とは、患者に生細胞を注入、移植、または埋め込むことで、例えば、免疫療法では細胞媒介免疫によってがん細胞と闘うＴ細胞を移植することで、あるいは病気組織を再生するために幹細胞を移植することで、薬効を得る治療法である。
本明細書に記載のいくつかの態様は、遺伝子改変した細胞を選抜するための方法に関する。この方法は、ｉ）細胞中で発現するよう操作可能な少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を細胞に導入すること；ならびにｉｉ）第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現する細胞を選抜するための一般的な細胞培養用の培地中で、細胞を培養すること；を含み、ここで細胞は、生存および／または増殖に必須のタンパク質を有しているが、そのレベルは、一般的な細胞培養用の培地中では細胞が生存もおよび／または増殖もできない程度まで抑制されており、ここで少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖のための必須のタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含み、ここで第二部分ヌクレオチド配列は目的のタンパク質（例えば細胞にとって外因性のタンパク質）をコードしている。
本明細書に記載のいくつかの態様は、遺伝子改変した細胞を選抜するための方法に関する。この方法は、ｉ）細胞中で発現するように操作可能な少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を導入すること；ならびに、ｉｉ）第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現する細胞の濃縮を可能にするインビトロの繁殖条件下で細胞を培養すること；を含み、ここで細胞は、生存および／または増殖に必須のタンパク質を有しているが、そのレベルは選択された培養条件下では細胞が生存もおよび／または増殖もできない程度まで抑制されており、ここで少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖を可能にするタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含み、ここで第二部分ヌクレオチド配列は細胞にとって外因性のタンパク質をコードしている。
本明細書に記載のいくつかの態様は、遺伝子改変した細胞を濃縮するための方法に関する。この方法は、ｉ）細胞の生存および／または増殖のために必須の少なくとも１つの第一のタンパク質のレベルを、インビトロの通常の繁殖条件下では細胞が生存もおよび／または増殖もできないレベルに低下させること；ｉｉ）細胞中で発現するように操作可能で、かつ、第一のタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、第二の発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含む少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を導入すること、ここで第二部分タンパク質は細胞にとって外因性であり；ならびに、ｉｉｉ）第一のタンパク質および第二のタンパク質の両方を発現する細胞を濃縮するために、細胞をインビトロの通常の繁殖条件下で培養すること；を含む。
本明細書に記載のいくつかの態様は細胞に関し、この細胞は、ｉ）一般的な細胞培養用の培地中では細胞が生存もおよび／または増殖もできないレベルにまで抑制された内在性のジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、および、ｉｉ）ＤＨＦＲをコードしている第一部分ヌクレオチド配列と新生抗原Ｔ細胞受容体複合体をコードしている第二部分ヌクレオチド配列を含有している少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列、を含む。
本明細書に記載のいくつかの態様は、遺伝子改変した細胞を濃縮するための方法に関する。この方法は、ｉ）細胞中で発現するように操作可能で、かつ、選択圧への耐性を細胞に付与する第一のタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と第二の発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含む少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を導入すること、ここで第二部分タンパク質は細胞にとって外因性であり；および、ｉｉ）第一のタンパク質と第二のタンパク質の両方を発現する細胞を濃縮するために、少なくとも１つの添加剤を含有している細胞培養用の培地中で細胞を培養すること、を含む。
本明細書に記載のいくつかの態様は、遺伝子改変したＴ細胞を濃縮するための方法に関する。この方法は、ｉ）メトトレキサート耐性ＤＨＦＲタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列とＴ細胞受容体複合体またはキメラ抗体受容体をコードしている第二部分ヌクレオチド配列を含有している２要素ヌクレオチド配列を、ＴＲＡまたはＴＲＢプロモーターの下流に組み込むことによってＴ細胞内に導入すること；およびｉｉ）第一のタンパク質と第二のタンパク質の両方を発現している細胞を濃縮するために、メトトレキサートを含有している細胞培養用の培地中で細胞を培養すること、を含む。
本明細書に記載のいくつかの態様は、外因性のＴ細胞受容体遺伝子を発現するように改変したＴ細胞を濃縮するための方法に関する。この方法は、ｉ）第一のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰを利用して内在性のＴＲＢＣ遺伝子をその遺伝子座からノックアウトすること；ｉｉ）第二のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰを利用して、メトトレキサート耐性ＤＨＦＲ遺伝子をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と治療用ＴＣＲ遺伝子を含有している第二部分ヌクレオチド配列を、内在性のＴＲＢＣ遺伝子座にノックインすること、ここでヌクレオチド配列は両方とも内在性のＴＲＢＣプロモーターから発現できるように操作可能に結合され；ならびに、ｉｉｉ）治療用ＴＣＲとメトトレキサート耐性ＤＨＦＲ遺伝子の両方を発現しているＴ細胞を濃縮するために、メトトレキサートを含有している細胞培養用の培地中で、細胞を培養すること；を含む。
本明細書に記載のいくつかの態様はＴ細胞に関し、このＴ細胞は、ｉ）メトトレキサート存在下では、細胞が生存もおよび／または増殖もできないレベルまで抑制された内在性のジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）；および、ｉｉ）メトトレキサート耐性ＤＨＦＲタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、内在性のＴＲＡまたはＴＲＢプロモーターから操作可能に発現するＴ細胞受容体をコードしている第二部分ヌクレオチドを含有している、少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列；を含む。
本明細書に記載のいくつかの態様は、Ｔ細胞に関するか、または外因性の遺伝子を発現するように改変したＴ細胞を濃縮するための方法に関し、それらは、ｉ）メトトレキサート存在下では、細胞が生存もおよび／または増殖もできないレベルまで抑制された内在性のＤＨＦＲ；および、ｉｉ）少なくとも２つのヌクレオチド配列であって、第一の結合ドメインに融合したメトトレキサート耐性ＤＨＦＲタンパク質の非機能性部分をコードしているヌクレオチド配列を含有している第一のヌクレオチドと、第二の結合ドメインに融合したメトトレキサート耐性ＤＨＦＲタンパク質の非機能性部分をコードしているヌクレオチド配列を含有している第二のヌクレオチドを含んでおり、両方のヌクレオチドが発現した時に、機能性メトトレキサート耐性ＤＨＦＲが発現して、第一および第二のヌクレオチドの両方を含有している細胞の選抜を促進することが可能になる、少なくとも２つのヌクレオチド配列；を含む。ヌクレオチド配列はいずれも、結合ドメインに融合しているメトトレキサート耐性ＤＨＦＲタンパク質の非機能性部分をコードしているヌクレオチド配列を含む第一部分と、外因性の遺伝子をコードしているヌクレオチド配列を含む第二部分を含んでいれば、２つ以上の部分を含んでいてもよい。これらの態様による特定の選抜方法では、ついで、少なくとも２つのヌクレオチド配列を含む細胞を濃縮するために、メトトレキサートを含有している細胞培養用の培地中で、このＴ細胞を培養する。
本明細書に記載のいくつかの態様は、複数の非機能性部分に分割されたＤＨＦＲタンパク質の機能を回復するための結合ドメインに関する。これらの結合ドメインは、相補的なＤＨＦＲタンパク質の非機能性部分に融合させると、ＤＨＦＲタンパク質の機能を回復することができる。結合ドメインは、天然の結合ドメインであっても、天然のタンパク質とは相互作用しない改変された結合ドメインであっても、または誘導可能な結合ドメインであってもよい。
本明細書ではさらに、遺伝子改変した細胞を選抜するための方法も開示する。いくつかの態様において、この方法は、細胞中で発現するように操作可能な少なくとも２つの２要素ヌクレオチド配列を導入することを含む。いくつかの態様において、細胞は、生存および／または増殖のための必須のタンパク質を有するが、そのタンパク質のレベルは、細胞が生存もおよび／または増殖もできない程度まで抑制されている。いくつかの態様において、第一の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖に必須のタンパク質の非機能性部分を第一の結合ドメインに融合させた第一の融合タンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含む。いくつかの態様において、第二の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖に必須のタンパク質の非機能性部分を第二の結合ドメインに融合させた第二の融合タンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含む。いくつかの態様では、第一および第二の融合タンパク質の両方が細胞中で一緒に発現する時に、生存および／または増殖に必須のタンパク質の機能が回復する。いくつかの態様において、この方法はさらに、第一および第二の２要素ヌクレオチド配列の両方を発現する細胞を選抜するための条件下で細胞を培養することを含む。
いくつかの態様において、必須のタンパク質とは、ＤＨＦＲタンパク質である。いくつかの態様では、第一または第二の２要素ヌクレオチド配列いずれかの第二部分ヌクレオチド配列が、細胞にとって外因性である。いくつかの態様では、第一または第二の２要素ヌクレオチド配列いずれかの第二部分ヌクレオチド配列がＴＣＲである。いくつかの態様では、第一および第二の結合ドメインがＧＣＮ４に由来する。いくつかの態様では、第一および第二の結合ドメインがＦＫＢＰ１２に由来する。いくつかの態様では、ＦＫＢＰ１２がＦ３６Ｖ変異を有する。いくつかの態様では、第一の結合ドメインがＪＵＮに由来し、第二の結合ドメインがＦＯＳに由来する。いくつかの態様では、第一の結合ドメインおよび第二の結合ドメインが、互いへの結合を保持する相補的な変異を有する。いくつかの態様では、第一の結合ドメインまたは第二の結合ドメインのいずれもが天然の結合パートナーとは結合しない。いくつかの態様では、第一の結合ドメインと第二の結合ドメインのそれぞれが、３～７つの相補的な変異を有する。いくつかの態様では、第一の結合ドメインと第二の結合ドメインのそれぞれが、３つの相補的な変異を有する。いくつかの態様では、第一の結合ドメインと第二の結合ドメインのそれぞれが、４つの相補的な変異を有する。いくつかの態様では、必須のタンパク質の機能の回復が、必要に応じてＡＰ１９０３によって、誘導される。いくつかの態様では、培養するステップがメトトレキサート存在下で実施される。
本明細書ではさらに、遺伝子改変した細胞を濃縮するための方法も開示する。いくつかの態様において、この方法は、細胞の生存および／または増殖のために必須の少なくとも１つの第一のタンパク質の活性を、この細胞がインビトロの通常の繁殖条件下では生存もおよび／または増殖もできないレベルに低下させることを含む。いくつかの態様において、この方法はさらに、細胞中で発現するよう操作可能な少なくとも２つの２要素ヌクレオチド配列を導入することを含む。いくつかの態様において、第一の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖に必須のタンパク質の非機能性部分を第一の結合ドメインに融合させた第一の融合タンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含む。いくつかの態様において、第二の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖に必須のタンパク質の非機能性部分を第二の結合ドメインに融合させた第二の融合タンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、第一および第二の融合タンパク質の両方が細胞中で一緒に発現する時に、生存および／または増殖に必須のタンパク質の機能が回復する。いくつかの態様において、この方法はさらに、第一の融合タンパク質と第二の融合タンパク質の両方を発現する細胞を濃縮するためのインビトロの繁殖条件下で、細胞を培養することを含む。
いくつかの態様において、必須のタンパク質は、ＤＨＦＲタンパク質である。いくつかの態様では、第一または第二の２要素ヌクレオチド配列いずれかの第二部分ヌクレオチド配列は、細胞にとって外因性である。いくつかの態様では、第一または第二の２要素ヌクレオチド配列いずれかの第二部分ヌクレオチド配列はＴＣＲである。いくつかの態様では、第一および第二の結合ドメインはＧＣＮ４に由来する。いくつかの態様では、第一および第二の結合ドメインはＦＫＢＰ１２に由来する。いくつかの態様では、ＦＫＢＰ１２はＦ３６Ｖ変異を有する。いくつかの態様では、第一の結合ドメインはＪＵＮに由来し、第二の結合ドメインはＦＯＳに由来する。いくつかの態様では、第一の結合ドメインおよび第二の結合ドメインは、互いへの結合を保持する相補的な変異を有する。いくつかの態様では、第一の結合ドメインまたは第二の結合ドメインのいずれもが、天然の結合パートナーとは結合しない。いくつかの態様では、第一の結合ドメインと第二の結合ドメインのそれぞれが、３～７つの相補的な変異を有する。いくつかの態様では、第一の結合ドメインと第二の結合ドメインのそれぞれが、３つの相補的な変異を有する。いくつかの態様では、第一の結合ドメインと第二の結合ドメインのそれぞれが、４つの相補的な変異を有する。いくつかの態様では、必須のタンパク質の機能の回復が、必要に応じてＡＰ１９０３によって、誘導される。いくつかの態様では、培養するステップがメトトレキサート存在下で実施される。
本明細書で提供するいくつかの態様は、遺伝子改変した細胞を選抜または濃縮するための方法を伴う。いくつかの態様において、この方法は、細胞中で第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現可能な少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を細胞に導入することを含む。細胞は、生存および／または増殖に必須のタンパク質を有しているが、そのタンパク質のレベルは、一般的な細胞培養用の培地中では細胞が生存もおよび／または増殖もできない程度まで低減している。少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、標的ゲノム中の予め決められた部位に挿入された時に、細胞中で発現するように操作可能であるかまたは発現するように操作可能な状態になり、かつ、少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖に必須のタンパク質またはそのバリアントをコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含む。第二部分ヌクレオチド配列は目的のタンパク質をコードしている。この方法はさらに、第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現する細胞を選抜または濃縮するための外因性の薬理学的選択圧を用いずに、一般的な細胞培養用の培地中で細胞を培養することを含む。
いくつかの態様において、この方法は、細胞の生存および／または増殖のために必須の少なくとも１つの第一のタンパク質のレベルを、インビトロの通常の繁殖条件下では細胞が生存もおよび／または増殖もできないレベルに低減すること、および、細胞中で第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現することが可能で、かつ、第一のタンパク質またはそのバリアントをコードしている第一部分ヌクレオチド配列と第二の発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含む少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を細胞に導入すること、を含む。少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、標的ゲノム中の予め決められた部位に挿入されたときに、細胞中で発現するように操作可能であるかまたは発現するように操作可能な状態になる。第二部分タンパク質は目的のタンパク質である。この方法はさらに、第一のタンパク質および第二のタンパク質の両方を発現する細胞を濃縮するための外因性の薬理学的選択圧を用いずに、インビトロの通常の繁殖条件下で細胞を培養することを含む。
いくつかの態様において、この方法は、細胞中で第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現可能な少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を細胞に導入することを含む。細胞は、生存および／または増殖に必須のタンパク質の機能活性を有しているが、その活性は、一般的な細胞培養用の培地中では細胞が生存もおよび／または増殖もできない程度に低減している。少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、標的ゲノム中の予め決められた部位に挿入された時に、細胞中で発現するように操作可能であるかまたは発現するように操作可能な状態になる。少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖に必須のタンパク質と実質的に等価な機能を付与する第一のタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、第二の発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列を含む。第二のタンパク質は目的のタンパク質である。この方法はさらに、第一のタンパク質と第二のタンパク質の両方を発現する細胞を濃縮または選抜するための少なくとも１つの添加剤を含有している細胞培養用の培地中で、細胞を培養することを含む。
いくつかの態様において、この方法は、細胞の生存および／または増殖のために必須の少なくとも１つの第一のタンパク質の機能活性を、インビトロの通常の繁殖条件下では細胞が生存もおよび／または増殖もできないレベルまで低減させること；細胞中で第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現することが可能で、かつ、実質的に等価な機能を付与する第一のタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、第二の発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含む、少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を細胞に導入すること、を含む。少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、標的ゲノム中の予め決められた部位に挿入された時に、細胞中で発現するように操作可能であるかまたは発現するように操作可能な状態になり、および第二のタンパク質は目的のタンパク質である。この方法はさらに、第一のタンパク質と第二のタンパク質の両方を発現する細胞を選抜または濃縮するための少なくとも１つの添加剤を含有している細胞培養用の培地中で細胞を培養することを含む。
いくつかの態様において、この方法は、細胞中で第一部分および第二部分ヌクレオチド配列の両方を発現可能な少なくとも２つの２要素ヌクレオチド配列を、細胞に導入することを含む。細胞は、生存および／または増殖に必須のタンパク質を有しているが、そのレベルは、細胞が生存もおよび／または増殖もできない程度に抑制されている。第一の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖に必須のタンパク質の非機能性部分を第一の結合ドメインに融合させた第一の融合タンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、第一の目的のタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含む。第二の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖に必須のタンパク質の非機能性部分を第二の結合ドメインに融合させた第二の融合タンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、第二の目的のタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列を含む。第一および第二の融合タンパク質の両方が細胞中で一緒に発現する時に、生存および／または増殖に必須のタンパク質の機能が回復する。この方法はさらに、第一および第二の２要素ヌクレオチド配列の両方を発現する細胞を選抜するための条件下で、細胞を培養することを含む。
いくつかの態様において、この方法は、細胞の生存および／または増殖に必須の少なくとも１つの第一のタンパク質のレベルを、インビトロの通常の繁殖条件下では細胞が生存もおよび／または増殖もできないレベルに抑制すること；および、細胞中で発現させることが可能な少なくとも２つの２要素ヌクレオチド配列を導入すること；を含む。第一の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖に必須のタンパク質の非機能性部分を第一の結合ドメインに融合させた第一の融合タンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、第一の目的のタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含む。第二の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖に必須のタンパク質の非機能性部分を第二の結合ドメインに融合させた第二の融合タンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、第二の目的のタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含む。第一および第二の融合タンパク質の両方が細胞中で一緒に発現する時に、生存および／または増殖に必須のタンパク質の機能が回復する。この方法はさらに、第一の融合タンパク質と第二の融合タンパク質の両方を発現する細胞を濃縮するために、インビトロの繁殖条件下で細胞を培養することを含む。
いくつかの態様において、この方法は、細胞中で発現するように操作可能な少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を導入することを含む。細胞は、生存および／または増殖に必須のタンパク質を有しているが、そのレベルは、細胞が生存もおよび／または増殖もできない程度に抑制されており、少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖に必須のタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含む。第二部分ヌクレオチド配列は、細胞にとって外因性のタンパク質をコードしている。この方法はさらに、第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現する細胞を選抜するための条件下で、細胞を培養することを含む。
いくつかの態様において、この方法は、細胞の生存および／または増殖に必須の少なくとも１つの第一のタンパク質の活性を、インビトロの通常の繁殖条件下では、細胞が生存もおよび／または増殖もできないレベルに低下させること；および、細胞中で発現するように操作可能で、かつ、第一のタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と第二の発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を導入すること、ここで第二部分タンパク質は細胞にとって外因性であり；および、第一のタンパク質および第二のタンパク質の両方を発現する細胞を濃縮するために、インビトロの繁殖条件下で細胞を培養すること；を含む。
本明細書ではさらに、本開示のいずれかの方法によって作製される細胞も開示する。
本明細書ではさらに、遺伝子改変したＴ細胞を濃縮するための方法も開示する。いくつかの態様において、この方法は、メトトレキサート耐性ＤＨＦＲタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、Ｔ細胞受容体複合体またはキメラ抗体受容体をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含有している２要素ヌクレオチド配列を、２要素ヌクレオチド配列をＴＲＡまたはＴＲＢプロモーターの下流に組み込むことによって、Ｔ細胞に導入すること；および、第一のタンパク質と第二のタンパク質の両方を発現している細胞を濃縮するために、メトトレキサートを含有している細胞培養用の培地中で、細胞を培養すること；を含む。
本明細書ではさらに、外因性のＴ細胞受容体遺伝子を発現するように改変したＴ細胞を濃縮するための方法も開示する。いくつかの態様において、この方法は、第一のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰを利用して内在性のＴＲＢＣ遺伝子をその遺伝子座からノックアウトすること；第二のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰを利用して、メトトレキサート耐性ＤＨＦＲ遺伝子をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と治療用ＴＣＲ遺伝子を含有している第二部分ヌクレオチド配列とを、内在性のＴＲＢＣ遺伝子座にノックインすること、ここでヌクレオチド配列は両方とも内在性のＴＲＢＣプロモーターから発現できるように操作可能に結合され；および、治療用ＴＣＲとメトトレキサート耐性ＤＨＦＲ遺伝子の両方を発現するＴ細胞を濃縮するために、メトトレキサートを含有している細胞培養用の培地中で細胞を培養すること；を含む。
本明細書ではさらに、Ｔ細胞を開示する。いくつかの態様において、このＴ細胞は、メトトレキサートの存在下では、細胞が生存もおよび／または増殖もできないレベルまで抑制される内在性のジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）；および、メトトレキサート耐性ＤＨＦＲタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と内在性のＴＲＡまたはＴＲＢプロモーターから操作可能に発現するＴ細胞受容体をコードしている第二部分ヌクレオチド配列を含有している、少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列；を含む。
いくつかの態様において、このＴ細胞は、内在性のジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）のノックアウト；および、ＤＨＦＲタンパク質またはそのバリアントをコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、内在性のＴＲＡまたはＴＲＢプロモーターから操作可能に発現するＴ細胞受容体をコードしている第二部分ヌクレオチド配列を含有している少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列；を含む。
いくつかの態様において、このＴ細胞は、メトトレキサートの存在下では、細胞が生存もおよび／または増殖もできないレベルまで抑制される内在性のジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）；および、少なくとも２つの２要素ヌクレオチド配列；を含む。第一の２要素ヌクレオチド配列は、ＤＨＦＲタンパク質の非機能性もしくは機能不全部分またはそのバリアントをコードしている第一の第一部分ヌクレオチド配列と、Ｔ細胞受容体コードし、内在性のＴＲＡまたはＴＲＢプロモーターから操作可能に発現する第一の第二部分ヌクレオチド配列を含む。第二の２要素ヌクレオチド配列は、ＤＨＦＲタンパク質の非機能性もしくは機能不全部分またはそのバリアントをコードしている第二の第一部分ヌクレオチド配列と、目的のタンパク質コードし、内在性のＢ２Ｍプロモーターから操作可能に発現する第二の第二部分ヌクレオチド配列を含み、かつ、細胞はＤＨＦＲを有する。
本発明のこれらのおよび他の特徴、側面、および利点は、以下の説明および添付の特許請求の範囲を参照することにより、より深く理解されるであろう。
上述した発明の概要、および発明を実施するための形態、ならびに後述する特許請求の範囲において、本発明の特定の特徴に言及した。本明細書における本発明の開示は、そのような特定の特徴のすべての可能な組み合わせを含むと理解される。例えば、特定の特徴が本発明の特定の側面もしくは態様、または特定の請求項の文脈において開示される場合、その特徴はまた、可能な範囲で、本発明の他の特定の側面および態様と組み合わせて、および／または本発明一般において使用することが可能である。
遺伝子ノックインとしても知られる、特定のゲノム部位への外来性ＤＮＡ配列の正確な導入は一般的に、（１）ヌクレアーゼによって特定のゲノム部位にＤＮＡ二本鎖切断を導入すること、および（２）相同修復鋳型を用い、相同指示修復（ＨＤＲ）経路によって、そのＤＮＡ切断を修復すること、の２つのステップを必要とする。ＨＤＲに必要とされる酵素が細胞周期のＳ期とＧ２期にのみ活性化するため、この過程は基本的に効率が悪い。つまり遺伝子ノックインは、主に分裂中の細胞に限定されている。遺伝子ノックインプロセスの全体的な効率の低さを考慮すると、遺伝子編集がうまくいった細胞を選抜し、濃縮することができるアプローチが有用であると考えられる。
治療用遺伝子構築物のノックインに成功した細胞の濃縮を可能にするためには、ノックインが起こった細胞が主に生き残り、ノックインが起こらなかった細胞が死ぬように選択的圧力をかけることが有効である。
本明細書に記載の様々な態様は、遺伝子改変した細胞を選抜するための方法に関する。それらの方法では、細胞にとって外因性の（そして例えば治療用途で導入される）少なくとも１つのタンパク質と、細胞の生存および／または増殖に必要とされ、かつ、抑制されていた必須のタンパク質の機能を回復する別のタンパク質をコードしている少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を導入することによって、遺伝子改変した細胞が選抜される。
細胞の生存および／または増殖に必要とされる必須タンパク質の機能は、ヌクレアーゼまたはタンパク質阻害剤によって抑制されうる。抑制は持続性であってもまたは一過性であってもよく、さらに抑制はヌクレオチドレベルであっても、またはタンパク質レベルであってもよい。
細胞の生存および／または増殖に必要とされる必須のタンパク質の機能は、外因性の選択圧（例えば、低分子媒介性阻害によって誘導されるもの）によって抑制される場合がある。
必須のタンパク質を２要素ヌクレオチド配列中にコードすることにより、必須のタンパク質を回復させることができる。コードされた必須のタンパク質は、そのヌクレオチド配列がヌクレアーゼ耐性をもつように、あるいはそのタンパク質がタンパク質阻害剤耐性をもつように、遺伝子改変したものであってもよい。そのため、必須のタンパク質がうまく再導入された細胞は野生型細胞よりも高い生存優位性を獲得し、経時的に濃縮されるようになる。
必須のタンパク質は、連続した１つの配列として導入しても、複数の外因性タンパク質を用いた細胞の遺伝子改変を可能にするために、異なるドメインに分割して導入してもよい。
加えて、本明細書に記載の様々な態様は、遺伝子改変した細胞を選抜するための本明細書に記載の方法を用いる過程で生成される細胞に関する。
本明細書に記載のいくつかの態様は、遺伝子改変した細胞を選抜するための方法に関する。この方法は、ｉ）細胞中で発現するように操作可能な少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を導入すること、ここで細胞は、生存および／または増殖に必須のタンパク質を有しているが、そのレベルは、選択された培養条件下では細胞が生存もおよび／または増殖もできない程度に抑制されており、かつ、少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、生存およびまたは増殖を可能にするタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含み、ここで第二部分ヌクレオチド配列は細胞にとって外因性のタンパク質をコードしていること；および、ｉｉ）第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現する細胞の濃縮を可能にするインビトロの繁殖条件下で、細胞を培養すること；を含む。
本明細書に記載のいくつかの態様は、遺伝子改変した細胞を選抜するための方法に関する。この方法は、ｉ）細胞中の必須のタンパク質を、細胞が一般的な培地中では生存もおよび／または増殖もできないレベルまで抑制すること；ｉｉ）細胞中で発現するように操作可能な少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を導入すること、ここで少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖を可能にするタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含み；ならびに、ｉｉｉ）第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現する細胞の濃縮を可能にする一般的な培地中で、細胞を培養すること；を含む。
本明細書に記載のいくつかの態様は、遺伝子改変した細胞を選抜するための方法に関する。この方法は、ｉ）少なくとも１つの化合物を細胞培養用の培地中に添加することによって、細胞中の必須のタンパク質のレベルを、細胞が生存もおよび／または増殖もできない程度に抑制すること；ｉｉ）少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を、ゲノム遺伝子座への標的組み込みによって、細胞中で細胞内在性プロモーターから発現するよう操作可能になるように細胞に導入すること、ここで少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、添加剤を含む培地中での細胞の生存および／または増殖を可能にするタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含み；ならびに、ｉｉｉ）第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現する細胞を濃縮することが可能な、少なくとも１つの化合物を含む培地中で、細胞を培養すること；を含む。
本明細書に記載のいくつかの態様は、遺伝子改変した細胞を選抜するための方法に関する。この方法は、
ｉ）細胞中で発現するように操作可能な少なくとも２つの２要素ヌクレオチド配列を導入すること、
ここで細胞は、生存および／または増殖に必須のタンパク質を有しているが、そのレベルは、細胞が選択された培養条件下では生存もおよび／または増殖もできない程度に抑制されており、
ここで第一の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖を可能にするタンパク質の第一の部分をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列を含み、
ここで第二の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖を可能にするタンパク質の第二の部分をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含み、
ここでタンパク質のこれらの部分は、細胞中で共発現させると機能性タンパク質を形成することができ；ならびに
ｉｉ）少なくとも２つの２要素ヌクレオチド配列の第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現する細胞の濃縮を可能にするインビトロの繁殖条件下で、細胞を培養すること；
を含む。
ｉ）細胞中で発現するように操作可能な少なくとも２つの２要素ヌクレオチド配列を導入すること、
ここで細胞は、生存および／または増殖に必須のタンパク質を有しているが、そのレベルは、細胞が選択された培養条件下では生存もおよび／または増殖もできない程度に抑制されており、
ここで第一の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖を可能にするタンパク質の第一の部分をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列を含み、
ここで第二の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖を可能にするタンパク質の第二の部分をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含み、
ここでタンパク質のこれらの部分は、細胞中で共発現させると機能性タンパク質を形成することができ；ならびに
ｉｉ）少なくとも２つの２要素ヌクレオチド配列の第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現する細胞の濃縮を可能にするインビトロの繁殖条件下で、細胞を培養すること；
を含む。
いくつかの態様を図３３に示す。これらの態様における新規の側面としては、
ＴＣＲおよびＣＡＲへの適用
Ｔ細胞での利用
ＴＣＲ遺伝子座への部位特異的組み込みの利用
ガン治療への利用
が含まれる。
ＴＣＲおよびＣＡＲへの適用
Ｔ細胞での利用
ＴＣＲ遺伝子座への部位特異的組み込みの利用
ガン治療への利用
が含まれる。
本明細書に記載のいくつかの態様はＴ細胞に関し、このＴ細胞は、ｉ）メトトレキサート存在下では、細胞が生存もおよび／または増殖もできないレベルまで抑制される内在性のＤＨＦＲ；および、ｉｉ）少なくとも２つのヌクレオチド配列であって、第一の結合ドメインに融合したメトトレキサート耐性ＤＨＦＲタンパク質の非機能性部分をコードしているヌクレオチド配列を含有している第一のヌクレオチドと第二の結合ドメインに融合したメトトレキサート耐性ＤＨＦＲタンパク質の非機能性部分をコードしているヌクレオチド配列を含有している第二のヌクレオチドとを含んでおり、両方のヌクレオチドが発現した時に、機能性メトトレキサート耐性ＤＨＦＲが発現して、第一および第二のヌクレオチドの両方を含有している細胞の選抜を促進することが可能になる、少なくとも２つのヌクレオチド配列；を含む。
本明細書に記載のいくつかの態様は、遺伝子改変した細胞を選抜するための方法に関する。この方法は、
ｉ）細胞中で発現するように操作可能な少なくとも２つの２要素ヌクレオチド配列を導入すること、
ここで細胞は、生存および／または増殖に必須のタンパク質を有しているが、そのレベルは、細胞が選択された培養条件下では生存もおよび／または増殖もできない程度に抑制されており、
ここで第一の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖を可能にするタンパク質の第一の非機能性部分を第一の結合ドメインに融合させた融合タンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列を含み、
ここで第二の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖を可能にするタンパク質の第二の非機能性部分を第二の結合ドメインに融合させた融合タンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含み、
ここで第一および第二の結合ドメインは、細胞中で互いに結合することが可能であり、
ここでタンパク質の第一および第二の非機能性部分は、細胞中で共発現させた時に、機能性タンパク質を形成することができ；ならびに
ｉｉ）少なくとも２つの２要素ヌクレオチド配列の第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現する細胞の濃縮を可能にするインビトロの繁殖条件下で、細胞を培養すること；
を含む。
ｉ）細胞中で発現するように操作可能な少なくとも２つの２要素ヌクレオチド配列を導入すること、
ここで細胞は、生存および／または増殖に必須のタンパク質を有しているが、そのレベルは、細胞が選択された培養条件下では生存もおよび／または増殖もできない程度に抑制されており、
ここで第一の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖を可能にするタンパク質の第一の非機能性部分を第一の結合ドメインに融合させた融合タンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列を含み、
ここで第二の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖を可能にするタンパク質の第二の非機能性部分を第二の結合ドメインに融合させた融合タンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含み、
ここで第一および第二の結合ドメインは、細胞中で互いに結合することが可能であり、
ここでタンパク質の第一および第二の非機能性部分は、細胞中で共発現させた時に、機能性タンパク質を形成することができ；ならびに
ｉｉ）少なくとも２つの２要素ヌクレオチド配列の第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現する細胞の濃縮を可能にするインビトロの繁殖条件下で、細胞を培養すること；
を含む。
本明細書に記載のいくつかの態様は、複数の非機能性部分に分割されたＤＨＦＲタンパク質の機能を回復するための結合ドメインに関する。これらの結合ドメインは、相補的なＤＨＦＲタンパク質の非機能性部分に融合させると、ＤＨＦＲタンパク質の機能を回復することができる。結合ドメインは、天然の結合ドメインであっても、天然のタンパク質とは相互作用しない改変された結合ドメインであっても、または誘導可能な結合ドメインであってもよい。
本明細書に記載のいくつかの態様は、遺伝子改変した細胞を選抜または濃縮するための方法に関する。「選抜」および「濃縮」という用語は、細胞集団中において、所望される遺伝子改変した細胞の割合が全体的に増加したことを指すと理解される。そのためこのことは、例えば、遺伝子改変した細胞の全体的な数を増加させること、集団に含まれるその他の細胞の数を低下させること、遺伝子改変した細胞を精製すること、これら手法の任意の組み合わせ、および他の類似した手法を含む場合がある。
いくつかの態様において、この方法は、細胞中で第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現可能な少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を細胞に導入することを含む。いくつかの態様において、この細胞は、生存および／または増殖に必須のタンパク質を有しているが、そのタンパク質のレベルは、一般的な細胞培養用の培地中では細胞が生存もおよび／または増殖もできない程度まで低減している。少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、標的ゲノム中の予め決められた部位に挿入された時に、細胞中で発現するように操作可能であるかまたは発現するように操作可能な状態になり、および少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖に必須のタンパク質またはそのバリアントをコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列を含む。第二部分ヌクレオチド配列は目的のタンパク質をコードしている。この方法はさらに、第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現する細胞を選抜または濃縮するための外因性の薬理学的選択圧を用いずに、一般的な細胞培養用の培地中で細胞を培養することを含む。
いくつかの態様において、この方法は、細胞の生存および／または増殖に機能するおよび／または必須の少なくとも１つの第一のタンパク質のレベルを、インビトロの通常の繁殖条件下では細胞が生存もおよび／または増殖もできない程度に低減させること；および、細胞中で第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現することが可能で、かつ、第一のタンパク質またはそのバリアントをコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、第二の発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を細胞に導入すること；を含む。
当業者には、「必須の」タンパク質が、所与の細胞の、成長、複製、細胞周期、遺伝子制御（ＤＮＡ修復、転写、翻訳、および複製を含む）、ストレス応答、代謝、アポトーシス、栄養素の獲得、タンパク質のターンオーバー、細胞表面の完全性、必須の酵素活性、生存、またはこれらの任意の組み合わせに影響を及ぼす任意のタンパク質であり得ることが理解される。
いくつかの態様では、必須のタンパク質のレベルの低減は持続性である。いくつかの態様では、必須のタンパク質のレベルの低減は一過性であるか、または非持続性である。いくつかの態様では、必須のタンパク質のレベルの低減は誘導可能である。いくつかの態様では、必須のタンパク質のレベルの低下は、ある１つの細胞周期の期間全体にわたって細胞の生存および／または増殖に影響を及ぼす。いくつかの態様では、必須のタンパク質のレベルの低減は、少なくともおよそ１分、少なくともおよそ１０分、少なくともおよそ３０分、少なくともおよそ６０分、少なくともおよそ２時間、少なくともおよそ５時間、少なくともおよそ１０時間、少なくともおよそ２０時間、少なくともおよそ１日、少なくともおよそ２日、少なくともおよそ４日、少なくともおよそ１週間、少なくともおよそ２週間、少なくともおよそ１ヶ月、または少なくともおよそ２ヶ月の間、細胞の生存および／または増殖に影響を及ぼす。いくつかの態様において、必須のタンパク質のレベルの低減は、増殖の完全な停止をもたらす。いくつかの態様において、必須のタンパク質のレベルの低減は、増殖の部分的な停止をもたらす。いくつかの態様において、増殖は、少なくともおよそ５％、少なくともおよそ１０％、少なくともおよそ２０％、少なくともおよそ３０％、少なくともおよそ５０％、少なくともおよそ７５％、少なくともおよそ８０％、少なくともおよそ９０％、少なくともおよそ９５％、少なくともおよそ９９％、または少なくともおよそ１００％、停止する。いくつかの態様において、必須のタンパク質のレベルの低減は、完全な細胞死をもたらす。いくつかの態様において、必須のタンパク質のレベルの低減は、集団中の全ての細胞の細胞死を惹起する。いくつかの態様において、必須のタンパク質のレベルの低減は、集団中の一部の細胞で細胞死を惹起する。いくつかの態様では、細胞集団中において細胞死（または生存率の低減）が、少なくともおよそ５％、少なくともおよそ１０％、少なくともおよそ２０％、少なくともおよそ３０％、少なくともおよそ５０％、少なくともおよそ７５％、少なくともおよそ８０％、少なくともおよそ９０％、少なくともおよそ９５％、少なくともおよそ９９％、または少なくともおよそ１００％、増加する。いくつかの態様において、必須のタンパク質のレベルの低減は、必須のタンパク質をコードしている遺伝子のノックアウトを含む。いくつかの態様において、必須のタンパク質のレベルの低減は、必須のタンパク質をコードしている遺伝子のノックダウンを含む。いくつかの態様において、必須のタンパク質のレベルの低減は、必須のタンパク質を阻害することが可能な遺伝子のノックインを含む。いくつかの態様において、ノックアウトおよび／またはノックダウンは、ＣＲＩＳＰＲリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）、ＴＡＬＥＮ、ＭｅｇａＴＡＬ、または任意の他のヌクレアーゼによって媒介される。いくつかの態様において、一過性の抑制は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）を介する。当業者には、ノックアウト、ノックダウン、およびタンパク質レベルを低減させる他の方法が、制限酵素と選択カセット、選択的転写阻害、選択的翻訳阻害、およびタンパク質標的を促進して分解させることなどの、任意の一般的な方法を用いて行われ得ることが理解されるであろう。いくつかの態様において、必須のタンパク質のレベルの低減は、必須のタンパク質のレベルの、ＲＮＡレベルでの一過性の低減を含む。いくつかの態様では、必須のタンパク質のＲＮＡが、少なくともおよそ５％、少なくともおよそ１０％、少なくともおよそ２０％、少なくともおよそ３０％、少なくともおよそ５０％、少なくともおよそ７５％、少なくともおよそ８０％、少なくともおよそ９０％、少なくともおよそ９５％、少なくともおよそ９９％、または少なくともおよそ１００％、低減する。いくつかの態様において、細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ｉＮＫＴ細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、ｉＰＳＣ、神経系前駆細胞、網膜の遺伝子治療に関わる細胞型、または他の任意の細胞である。
いくつかの態様において、少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、標的ゲノム中の予め決められた部位に挿入された時に、細胞中で発現するように操作可能であるかまたは発現するように操作可能な状態になり、および第二部分タンパク質は目的のタンパク質である。いくつかの態様では、第一部分ヌクレオチド配列のヌクレオチド配列が、ヌクレアーゼ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはＣＲＩＳＰＲｉ耐性を獲得するように変更されている。いくつかの態様では、第一部分ヌクレオチド配列のヌクレオチド配列が、少なくともおよそ５％、少なくともおよそ１０％、少なくともおよそ２０％、少なくともおよそ３０％、少なくともおよそ５０％、少なくともおよそ７５％、少なくともおよそ８０％、少なくともおよそ９０％、少なくともおよそ９５％、少なくともおよそ９９％、または少なくともおよそ１００％のヌクレアーゼ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはＣＲＩＳＰＲｉ耐性を獲得するように変更されている。いくつかの態様において、第一部分ヌクレオチド配列は、必須の第一のタンパク質と同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしている。いくつかの態様において、第一部分ヌクレオチド配列は、必須の第一のタンパク質と少なくともおよそ５％、少なくともおよそ１０％、少なくともおよそ２０％、少なくともおよそ３０％、少なくともおよそ５０％、少なくともおよそ７５％、少なくともおよそ８０％、少なくともおよそ９０％、少なくともおよそ９５％、少なくともおよそ９９％、または少なくともおよそ１００％同一なアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしている。いくつかの態様において、第一部分ヌクレオチド配列は、第一のタンパク質のアミノ酸配列とは同一でない変異タンパク質をコードするように変更される。いくつかの態様において、変異タンパク質は、第一のタンパク質にはない特性を有する。いくつかの態様において、特性には、これらに限定されるものではないが、活性の低下、活性の増強、および半減期の違いのうちの１つ以上が含まれる。いくつかの態様において、変異タンパク質の活性は、第一のタンパク質と比較して、少なくともおよそ５％、少なくともおよそ１０％、少なくともおよそ２０％、少なくともおよそ３０％、少なくともおよそ５０％、少なくともおよそ７５％、少なくともおよそ８０％、少なくともおよそ９０％、少なくともおよそ９５％、少なくともおよそ９９％、または少なくともおよそ１００％変更される。いくつかの態様では、変異タンパク質の半減期が、第一のタンパク質よりも短縮される。いくつかの態様では、変異タンパク質の半減期が、第一のタンパク質よりも延長される。いくつかの態様では、変異タンパク質の半減期が、第一のタンパク質と比較して、少なくともおよそ１．５倍、少なくともおよそ２倍、少なくともおよそ５倍、少なくともおよそ１０倍、少なくともおよそ２０倍、少なくともおよそ５０倍、または少なくともおよそ１００倍、延長または短縮される。いくつかの態様では、第一部分および第二部分のヌクレオチド配列は両方とも、同じプロモーターによって駆動される。いくつかの態様では、第一部分および第二部分のヌクレオチド配列が、異なるプロモーターによって駆動される。いくつかの態様では、第二部分ヌクレオチド配列は少なくとも１つの治療用遺伝子を含む。
当業者には、「治療用」の遺伝子またはタンパク質が、任意の疾患または障害の治療、防止、予防、緩和、改善、または治癒に有用な任意の遺伝子またはタンパク質であり得ることが理解される。
いくつかの態様では、第二部分ヌクレオチド配列が、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖を含有している新生抗原Ｔ細胞受容体複合体（ＴＣＲ）をコードしている。いくつかの態様では、必須のまたは第一のタンパク質は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ２（ＩＭＰＤＨ２）、Ｏ－６－メチルグアニン－ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）、デオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ）、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシル基転移酵素１（ＨＰＲＴ１）、インターロイキン２受容体サブユニットガンマ（ＩＬ２ＲＧ）、アクチンベータ（ＡＣＴＢ）、真核生物翻訳伸長因子１アルファ１（ＥＥＦ１Ａ１）、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ１）、またはトランスフェリン受容体（ＴＦＲＣ）である。いくつかの態様では、第一部分ヌクレオチド配列がヌクレアーゼ耐性またはｓｉＲＮＡ耐性ＤＨＦＲ遺伝子を含み、第二部分ヌクレオチド配列がＴＲＡ遺伝子およびＴＲＢ遺伝子を含む。いくつかの態様では、第一部分ヌクレオチド配列がヌクレアーゼ耐性またはｓｉＲＮＡ耐性ＤＨＦＲ遺伝子を含み、第二部分ヌクレオチド配列がＴＲＡ遺伝子およびＴＲＢ遺伝子を含む。いくつかの態様では、ＴＲＡ、ＴＲＢ、およびＤＨＦＲの遺伝子は少なくとも１つのリンカーによって隔てられている。いくつかの態様では、少なくとも１つのリンカーは少なくとも１つの自己切断２Ａペプチドおよび／または少なくとも１つのＩＲＥＳエレメントである。いくつかの態様では、ＤＨＦＲ、ＴＲＡ、およびＴＲＢの遺伝子は内在性のＴＣＲプロモーターから、または、これらに限定されるものではないが、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１／２、ＤＨＦＲ、ＥＥＦ１Ａ１、ＡＣＴＢ、Ｂ２Ｍ、ＣＤ５２、ＣＤ２、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＬＣＫ、ＬＡＴ、ＰＴＰＲＣ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＴＧＢ２、ＴＧＦＢＲ２、ＰＤＣＤ１、ＣＴＬＡ４、ＦＡＳ、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ（ＴＮＦＲ１）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＴＲＡＩＬＲ２）、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＢＴＬＡ、ＣＤ２００Ｒ１、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＨＡＶＣＲ２（ＴＩＭ３）、ＶＳＩＲ（ＶＩＳＴＡ）、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ４ＲＡ、ＥＩＦ４Ａ１、ＦＴＨ１、ＦＴＬ、ＨＳＰＡ５、およびＰＧＫ１などの任意の他の好適なプロモーターから駆動される。いくつかの態様では、２要素ヌクレオチド配列は細胞のゲノムに組み込まれる。いくつかの態様において、少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、標的ゲノムの予め決められた部位に挿入された時に、発現するように操作可能な状態になり、かつ、第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方が標的ゲノム中のプロモーターから駆動される。いくつかの態様において、組み込みは、ヌクレアーゼ媒介性部位特異的組み込み、トランスポゾン媒介性遺伝子送達、またはウイルス媒介性遺伝子送達を介する。いくつかの態様において、ヌクレアーゼ媒介性部位特異的組み込みは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰ、必要に応じてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ、を介するものである。いくつかの態様において、この方法はさらに、第一のタンパク質と第二のタンパク質の両方を発現する細胞を濃縮するための外因性の薬理学的選択圧を用いずに、インビトロの通常の繁殖条件下で細胞を培養することを含む。
当業者には、「通常のインビトロの繁殖条件」が、細胞、細胞株、または組織試料を維持することができる典型的な条件を包含するが、本明細書で提供されるような方法を実施するために意図的に除外または追加される変数（例えば、工程または成分）を含まないことが理解される。
いくつかの態様において、この方法はさらに、スプリットインテインシステムを利用することを含む。いくつかの態様では、導入される２要素ヌクレオチド配列は、細胞のゲノムに組み込まれない。いくつかの態様では、内在性のＴＣＲ定常部位、ヌクレアーゼ耐性ＤＨＦＲ遺伝子をコードしている第一部分ヌクレオチド配列、および新生抗原ＴＣＲをコードしている第二部分ヌクレオチド配列を標的とするＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰが細胞に送達される。いくつかの態様において、内在性のＴＣＲ定常部位は、ＴＣＲα定常（ＴＲＡＣ）部位であってもまたはＴＣＲβ定常（ＴＲＢＣ）部位であってもよい。いくつかの態様において、第二のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰは、ノックインするためにＴＲＡＣ遺伝子座を切断するＴＲＡＣ ＲＮＰである。いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰである。いくつかの態様において、一般的な細胞培養用の培地とは、改変されていない細胞の成長および／または増殖に好適な培地である。いくつかの態様において、一般的な細胞培養用の培地とは、いかなる外因性の選択圧も含まない培地である。いくつかの態様では、第二の２要素ヌクレオチドを標的ゲノム中の予め決められた部位にノックインするためにＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰが利用され、必要に応じて、ここで標的ゲノム中の予め決められた部位はＢ２Ｍ遺伝子である。
いくつかの態様において、この方法は、細胞中で第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現可能な少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を細胞に導入することを含む。細胞は、生存および／または増殖に必須のタンパク質の機能活性を有しているが、その活性は、一般的な細胞培養用の培地中では細胞が生存もおよび／または増殖もできない程度に低減している。少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、標的ゲノム中の予め決められた部位に挿入された時に、細胞中で発現するように操作可能であるかまたは発現するように操作可能な状態になり、および少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖に必須のタンパク質と実質的に等価な機能を付与する第一のタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、第二の発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含む。第二のタンパク質は目的のタンパク質である。この方法はさらに、第一のタンパク質と第二のタンパク質の両方を発現する細胞を濃縮または選抜するための少なくとも１つの添加剤を含有している細胞培養用の培地中で、細胞を培養することを含む。
いくつかの態様において、この方法は、細胞の生存および／または増殖のために必須の少なくとも１つの第一のタンパク質の機能活性を、インビトロの通常の繁殖条件下では細胞が生存もおよび／または増殖もできないレベルまで低減させること；および、細胞中で第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現することが可能で、かつ、実質的に等価な機能を付与する第一のタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、第二の発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含む、少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を細胞に導入すること；を含む。少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、標的ゲノム中の予め決められた部位に挿入された時に、細胞中で発現するように操作可能であるかまたは発現するように操作可能な状態になり、および第二のタンパク質は目的のタンパク質である。この方法はさらに、第一のタンパク質と第二のタンパク質の両方を発現する細胞を選抜または濃縮するための少なくとも１つの添加剤を含有している細胞培養用の培地中で細胞を培養することを含む。
いくつかの態様において、細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ｉＮＫＴ細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、ｉＰＳＣ、神経系前駆細胞、網膜の遺伝子治療に関わる細胞型、または他の任意の細胞である。いくつかの態様において、細胞は、哺乳類の細胞である。いくつかの態様において、細胞は、ラットまたはマウスの細胞である。いくつかの態様において、細胞は、ヒトの細胞である。いくつかの態様において、細胞は、確立されているまたは標準的な細胞株に由来する。いくつかの態様において、細胞は、一次組織に由来するかまたは初代細胞である。いくつかの態様では、第一部分ヌクレオチド配列のヌクレオチド配列は、ヌクレアーゼ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはＣＲＩＳＰＲｉ耐性を獲得するように変更されており、かつ、ａ）第一のタンパク質と同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしているか、またはｂ）第一のタンパク質に対して調整された機能を有するタンパク質をコードしている。いくつかの態様において、第一部分ヌクレオチド配列は、第一のタンパク質のアミノ酸配列とは同一でない変異タンパク質をコードするように変更されている。いくつかの態様において、第一部分ヌクレオチド配列は、第一のタンパク質と少なくともおよそ５％、少なくともおよそ１０％、少なくともおよそ２０％、少なくともおよそ３０％、少なくともおよそ５０％、少なくともおよそ７５％、少なくともおよそ８０％、少なくともおよそ９０％、少なくともおよそ９５％、少なくともおよそ９９％、または少なくともおよそ１００％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしている。いくつかの態様において、変異タンパク質は、第一のタンパク質にはない特性を有する。そのような特性としては、これらに限定されるものではないが、活性の低下、活性の増強、低分子阻害に対する耐性、半減期の違い、および低分子が結合した後の活性の増強のうちの１つ以上が含まれる。いくつかの態様では、変異タンパク質の活性が、第一のタンパク質と比較して、少なくともおよそ５％、少なくともおよそ１０％、少なくともおよそ２０％、少なくともおよそ３０％、少なくともおよそ５０％、少なくともおよそ７５％、少なくともおよそ８０％、少なくともおよそ９０％、少なくともおよそ９５％、少なくともおよそ９９％、または少なくともおよそ１００％変更される。いくつかの態様では、変異タンパク質の半減期が、第一のタンパク質よりも短縮される。いくつかの態様では、変異タンパク質の半減期が、第一のタンパク質よりも延長される。いくつかの態様では、変異タンパク質の半減期が、第一のタンパク質と比較して、少なくともおよそ１．５倍、少なくともおよそ２倍、少なくともおよそ５倍、少なくともおよそ１０倍、少なくともおよそ２０倍、少なくともおよそ５０倍、または少なくともおよそ１００倍、延長または短縮される。いくつかの態様では、第一部分および第二部分のヌクレオチド配列は両方とも、同じプロモーターによって駆動される。いくつかの態様では、第一部分および第二部分のヌクレオチド配列が、異なるプロモーターによって駆動される。いくつかの態様では、第二部分ヌクレオチド配列は少なくとも１つの治療用遺伝子を含む。いくつかの態様では、第二部分ヌクレオチド配列が、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖を含有している新生抗原Ｔ細胞受容体複合体（ＴＣＲ）をコードしている。いくつかの態様では、必須のまたは第一のタンパク質は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ２（ＩＭＰＤＨ２）、Ｏ－６－メチルグアニン－ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）、デオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ）、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシル基転移酵素１（ＨＰＲＴ１）、インターロイキン２受容体サブユニットガンマ（ＩＬ２ＲＧ）、アクチンベータ（ＡＣＴＢ）、真核生物翻訳伸長因子１アルファ１（ＥＥＦ１Ａ１）、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ１）、またはトランスフェリン受容体（ＴＦＲＣ）である。いくつかの態様では、第一部分ヌクレオチド配列がタンパク質阻害剤耐性ＤＨＦＲ遺伝子を含み、第二部分ヌクレオチド配列がＴＲＡ遺伝子およびＴＲＢ遺伝子を含む。いくつかの態様では、ＴＲＡ、ＴＲＢ、およびＤＨＦＲの遺伝子が、単一の読み取り枠から発現するように操作可能に構成されている。いくつかの態様では、ＴＲＡ、ＴＲＢ、およびＤＨＦＲの遺伝子が、２つまたは３つの読み取り枠から発現される。いくつかの態様では、ＴＲＡ、ＴＲＢ、およびＤＨＦＲの遺伝子は少なくとも１つのリンカーによって隔てられている。いくつかの態様では、ＴＲＡ、ＴＲＢ、およびＤＨＦＲの遺伝子は２つのリンカーによって隔てられている。いくつかの態様では、少なくとも１つのリンカー、ＴＲＡ、ＴＲＢ、およびＤＨＦＲの遺伝子の順番は以下のとおりである：ＴＲＡ－リンカー－ＴＲＢ－リンカー－ＤＨＦＲ、ＴＲＡ－リンカー－ＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＢ、ＴＲＢ－リンカー－ＴＲＡ－リンカー－ＤＨＦＲ、ＴＲＢ－リンカー－ＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＡ、ＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＡ－リンカー－ＴＲＢ、またはＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＢ－リンカー－ＴＲＡ。いくつかの態様では、少なくとも１つのリンカーは少なくとも１つの自己切断２Ａペプチドおよび／または少なくとも１つのＩＲＥＳエレメントである。いくつかの態様では、ＤＨＦＲ、ＴＲＡ、およびＴＲＢの遺伝子は内在性のＴＣＲプロモーターから、または、これらに限定されるものではないが、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１／２、ＤＨＦＲ、ＥＥＦ１Ａ１、ＡＣＴＢ、Ｂ２Ｍ、ＣＤ５２、ＣＤ２、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＬＣＫ、ＬＡＴ、ＰＴＰＲＣ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＴＧＢ２、ＴＧＦＢＲ２、ＰＤＣＤ１、ＣＴＬＡ４、ＦＡＳ、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ（ＴＮＦＲ１）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＴＲＡＩＬＲ２）、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＢＴＬＡ、ＣＤ２００Ｒ１、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＨＡＶＣＲ２（ＴＩＭ３）、ＶＳＩＲ（ＶＩＳＴＡ）、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ４ＲＡ、ＥＩＦ４Ａ１、ＦＴＨ１、ＦＴＬ、ＨＳＰＡ５、およびＰＧＫ１などの任意の他の好適なプロモーターから駆動される。いくつかの態様では、２要素ヌクレオチド配列は細胞のゲノムに組み込まれる。いくつかの態様では、２要素ヌクレオチド配列は細胞のゲノムに組み込まれない。いくつかの態様において、２要素ヌクレオチド配列は、細胞のゲノムには組み込まれないが、少なくとも１つのプラスミドを介して、細胞によって発現される。いくつかの態様では、２要素ヌクレオチド配列は細胞の核ゲノムに組み込まれる。いくつかの態様では、２要素ヌクレオチド配列は細胞のミトコンドリアゲノムに組み込まれる。いくつかの態様において、少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、標的ゲノムの予め決められた部位に挿入された時に、発現するように操作可能な状態になり、かつ、第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方が標的ゲノム中のプロモーターから駆動される。いくつかの態様において、組み込みは、ヌクレアーゼ媒介性部位特異的組み込み、トランスポゾン媒介性遺伝子送達、またはウイルス媒介性遺伝子送達を介する。いくつかの態様において、ヌクレアーゼ媒介性部位特異的組み込みは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰ、必要に応じてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ、を介するものである。いくつかの態様において、この方法はさらに、スプリットインテインシステムを利用することを含む。いくつかの態様では、内在性のＴＣＲ定常部位、タンパク質阻害剤耐性ＤＨＦＲ遺伝子をコードしている第一部分ヌクレオチド配列、および新生抗原ＴＣＲをコードしている第二部分ヌクレオチド配列を標的とするＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰが細胞に送達される。いくつかの態様において、内在性のＴＣＲ定常部位は、ＴＣＲα定常（ＴＲＡＣ）部位であってもまたはＴＣＲβ定常（ＴＲＢＣ）部位であってもよい。いくつかの態様において、送達は、エレクトロポレーション、または機械的もしくは化学的な膜透過処理に基づく方法によって行われる。いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰは、ノックインするためにＴＲＡＣ遺伝子座を切断するＴＲＡＣ ＲＮＰである。いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰである。いくつかの態様では、細胞の濃縮または選抜を導く添加剤は、フローサイトメトリーまたは磁気ビーズ濃縮による細胞の濃縮を可能にする抗体である。いくつかの態様では、第一のタンパク質が、添加剤を介した細胞の生存および／または増殖の損傷に対する細胞の耐性を媒介する。いくつかの態様では、添加剤はメトトレキサートである。いくつかの態様では、第一のタンパク質はメトトレキサート耐性ＤＨＦＲ変異型タンパク質である。
いくつかの態様において、この方法は、細胞中で第一部分および第二部分ヌクレオチド配列の両方を発現することが可能な少なくとも２つの２要素ヌクレオチド配列を、細胞に導入することを含む。細胞は、生存および／または増殖に必須のタンパク質を有しているが、そのレベルは、細胞が生存もおよび／または増殖もできない程度に抑制されており、かつ、第一の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖に必須のタンパク質の非機能性部分を第一の結合ドメインに融合させた第一の融合タンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、第一の目的のタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列を含む。第二の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖に必須のタンパク質の非機能性部分を第二の結合ドメインに融合させた第二の融合タンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、第二の目的のタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列を含む。第一および第二の融合タンパク質の両方が細胞中で一緒に発現する時に、生存および／または増殖に必須のタンパク質の機能が回復する。この方法はさらに、第一および第二の２要素ヌクレオチド配列の両方を発現する細胞を選抜するための条件下で、細胞を培養することを含む。
いくつかの態様において、この方法は、細胞の生存および／または増殖に必須の少なくとも１つの第一のタンパク質のレベルを、インビトロの通常の繁殖条件下では細胞が生存もおよび／または増殖もできないレベルに抑制すること；および、細胞中で発現させることが可能な少なくとも２つの２要素ヌクレオチド配列を導入すること；を含む。第一の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖に必須のタンパク質の非機能性部分を第一の結合ドメインに融合させた第一の融合タンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、第一の目的のタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含む。第二の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖に必須のタンパク質の非機能性部分を第二の結合ドメインに融合させた第二の融合タンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、第二の目的のタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含み、第一および第二の融合タンパク質の両方が細胞中で一緒に発現する時に、生存および／または増殖に必須のタンパク質の機能が回復する。この方法はさらに、第一の融合タンパク質と第二の融合タンパク質の両方を発現する細胞を濃縮するために、インビトロの繁殖条件下で細胞を培養することを含む。
いくつかの態様において、この方法は、細胞中で発現するように操作可能な少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を導入することを含む。細胞は、生存および／または増殖に必須のタンパク質を有しているが、そのレベルは、細胞が生存もおよび／または増殖もできない程度に抑制されており、かつ、少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖に必須のタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含む。第二部分ヌクレオチド配列は細胞にとって外因性のタンパク質をコードしている。この方法はさらに、第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現する細胞を選抜するための条件下で細胞を培養することを含む。
いくつかの態様において、この方法は、細胞の生存および／または増殖のために必須の少なくとも１つの第一のタンパク質の活性を、細胞がインビトロの通常の繁殖条件下では生存もおよび／または増殖もできないレベルまで低下させること；細胞中で発現するように操作可能で、かつ、第一のタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、第二の発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を導入すること；を含む。第二部分タンパク質は細胞にとって外因性である。この方法はさらに、第一のタンパク質および第二のタンパク質の両方を発現する細胞の濃縮を導くインビトロの繁殖条件下で細胞を培養することを含む。
いくつかの態様では、細胞の生存および／または増殖は、少なくともおよそ１分後、少なくともおよそ１０分後、少なくともおよそ３０分後、少なくともおよそ６０分後、少なくともおよそ２時間後、少なくともおよそ５時間後、少なくともおよそ１０時間後、少なくともおよそ２０時間後、少なくともおよそ１日後、少なくともおよそ２日後、少なくともおよそ３日後、少なくともおよそ４日後、少なくともおよそ５日後、少なくともおよそ６日後、少なくともおよそ１週間後、少なくともおよそ２週間後、少なくともおよそ１ヶ月後、または少なくともおよそ２ヶ月後に測定される。いくつかの態様では、生存および／または増殖に必須の少なくとも１つの第一のタンパク質の活性の低下は、少なくともおよそ１分、少なくともおよそ１０分、少なくともおよそ３０分、少なくともおよそ６０分、少なくともおよそ２時間、少なくともおよそ５時間、少なくともおよそ１０時間、少なくともおよそ２０時間、少なくともおよそ１日、少なくともおよそ２日、少なくともおよそ３日、少なくともおよそ４日、少なくともおよそ５日、少なくともおよそ６日、少なくともおよそ１週間、少なくともおよそ２週間、少なくともおよそ１ヶ月、または少なくともおよそ２ヶ月の間、継続する。いくつかの態様では、生存および／または増殖に必須の少なくとも１つの第一のタンパク質の活性の低下は持続性である。
本明細書に記載のいくつかの態様は、本明細書に開示する方法のいずれかによって作製される細胞に関する。
本明細書に記載のいくつかの態様は、遺伝子改変したＴ細胞を濃縮するための方法に関する。いくつかの態様において、この方法は、メトトレキサート耐性ＤＨＦＲタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、Ｔ細胞受容体複合体またはキメラ抗体受容体をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含有している２要素ヌクレオチド配列を、２要素ヌクレオチド配列をＴＲＡまたはＴＲＢプロモーターの下流に組み込むことによって、Ｔ細胞に導入すること；および、第一のタンパク質と第二のタンパク質の両方を発現している細胞を濃縮するために、メトトレキサートを含有している細胞培養用の培地中で、細胞を培養すること；を含む。
本明細書に記載のいくつかの態様は、外因性のＴ細胞受容体遺伝子を発現するように改変したＴ細胞を濃縮するための方法に関する。いくつかの態様において、この方法は、第一のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰを利用して内在性のＴＲＢＣ遺伝子をその遺伝子座からノックアウトすること；第二のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰを利用して、メトトレキサート耐性ＤＨＦＲ遺伝子をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と治療用ＴＣＲ遺伝子を含有している第二部分ヌクレオチド配列を、内在性のＴＲＢＣ遺伝子座にノックインすること、ここでヌクレオチド配列は両方とも内在性のＴＲＢＣプロモーターから発現できるように操作可能に結合され；および、治療用ＴＣＲとメトトレキサート耐性ＤＨＦＲ遺伝子の両方を発現するＴ細胞を濃縮するために、メトトレキサートを含有している細胞培養用の培地中で細胞を培養すること；を含む。
いくつかの態様において、必須のタンパク質はＤＨＦＲタンパク質である。いくつかの態様において必須のタンパク質は、ＤＨＦＲの模倣物または類似体である。いくつかの態様において、必須のタンパク質は、ＤＨＦＲタンパク質またはその一部と少なくともおよそ５０％、少なくともおよそ７５％、少なくともおよそ８０％、少なくともおよそ９０％、少なくともおよそ９５％、少なくともおよそ９９％、または少なくともおよそ１００％、同一である。いくつかの態様では、第一または第二の２要素ヌクレオチド配列いずれかの第二部分ヌクレオチド配列は、細胞にとって外因性である。いくつかの態様では、第一または第二の２要素ヌクレオチド配列いずれかの第二部分ヌクレオチド配列はＴＣＲである。いくつかの態様では、第一および／または第二の結合ドメインはＧＣＮ４に由来する。いくつかの態様では、第一および／または第二の結合ドメインは、ＧＣＮ４の模倣物または類似体に由来する。いくつかの態様において、第一および／または第二の結合ドメインは、ＧＣＮ４と少なくともおよそ５０％、少なくともおよそ７５％、少なくともおよそ８０％、少なくともおよそ９０％、少なくともおよそ９５％、少なくともおよそ９９％、または少なくともおよそ１００％同一の配列に由来する。いくつかの態様では、第一および／または第二の結合ドメインは配列番号２４を含む。いくつかの態様において、第一および／または第二の結合ドメインは、配列番号２４と少なくともおよそ５０％、少なくともおよそ７５％、少なくともおよそ８０％、少なくともおよそ９０％、少なくともおよそ９５％、少なくともおよそ９９％、または少なくともおよそ１００％同一の配列を含む。いくつかの態様では、第一の融合タンパク質および／または第二の融合タンパク質は配列番号３９および／または配列番号４０を含む。いくつかの態様において、第一の融合タンパク質および／または第二の融合タンパク質は、配列番号３９および／または配列番号４０と少なくともおよそ５０％、少なくともおよそ７５％、少なくともおよそ８０％、少なくともおよそ９０％、少なくともおよそ９５％、少なくともおよそ９９％、または少なくともおよそ１００％同一の配列を含む。いくつかの態様では、第一の融合タンパク質および／または第二の融合タンパク質は配列番号３５および／または配列番号３６を含む。いくつかの態様において、第一の融合タンパク質および／または第二の融合タンパク質は、配列番号３５および／または配列番号３６と少なくともおよそ５０％、少なくともおよそ７５％、少なくともおよそ８０％、少なくともおよそ９０％、少なくともおよそ９５％、少なくともおよそ９９％、または少なくともおよそ１００％同一の配列を含む。いくつかの態様では、第一の融合タンパク質および／または第二の融合タンパク質は配列番号３７および／または配列番号３８を含む。いくつかの態様において、第一の融合タンパク質および／または第二の融合タンパク質は、配列番号３７および／または配列番号３８と少なくともおよそ５０％、少なくともおよそ７５％、少なくともおよそ８０％、少なくともおよそ９０％、少なくともおよそ９５％、少なくともおよそ９９％、または少なくともおよそ１００％同一の配列を含む。いくつかの態様では、第一の融合タンパク質および／または第二の融合タンパク質は配列番号６２および／または配列番号６３を含む。いくつかの態様において、第一の融合タンパク質および／または第二の融合タンパク質は、配列番号６２および／または配列番号６３と少なくともおよそ５０％、少なくともおよそ７５％、少なくともおよそ８０％、少なくともおよそ９０％、少なくともおよそ９５％、少なくともおよそ９９％、または少なくともおよそ１００％同一の配列を含む。いくつかの態様では、第一および第二の結合ドメインはＦＫＢＰ１２に由来する。いくつかの態様では、第一および第二の結合ドメインはＦＫＢＰ１２の類似体または模倣物に由来する。いくつかの態様では、ＦＫＢＰ１２はＦ３６Ｖ変異を有する。いくつかの態様において、第一および第二の結合ドメインは、ＦＫＢＰ１２と少なくともおよそ５０％、少なくともおよそ７５％、少なくともおよそ８０％、少なくともおよそ９０％、少なくともおよそ９５％、少なくともおよそ９９％、または少なくともおよそ１００％同一の配列に由来する。いくつかの態様では、第一および／または第二の結合ドメインは配列番号３１を含む。いくつかの態様において、第一および／または第二の結合ドメインは、配列番号３１少なくともおよそ５０％、少なくともおよそ７５％、少なくともおよそ８０％、少なくともおよそ９０％、少なくともおよそ９５％、少なくともおよそ９９％、または少なくともおよそ１００％同一の配列を含む。いくつかの態様では、第一および／または第二の結合ドメインはＪＵＮおよび／またはＦＯＳに由来する。いくつかの態様では、第一および／または第二の結合ドメインはＪＵＮおよび／またはＦＯＳの類似体または模倣物に由来する。いくつかの態様において、第一および／または第二の結合ドメインは、ＪＵＮおよび／またはＦＯＳと少なくともおよそ５０％、少なくともおよそ７５％、少なくともおよそ８０％、少なくともおよそ９０％、少なくともおよそ９５％、少なくともおよそ９９％、または少なくともおよそ１００％同一の配列に由来する。いくつかの態様では、第一および／または第二の結合ドメインは配列番号２６および／または配列番号２９に由来する。いくつかの態様において、第一および／または第二の結合ドメインは、配列番号２６および／または配列番号２９と少なくともおよそ５０％、少なくともおよそ７５％、少なくともおよそ８０％、少なくともおよそ９０％、少なくともおよそ９５％、少なくともおよそ９９％、または少なくともおよそ１００％同一な配列に由来する。いくつかの態様では、第一および／または第二の結合ドメインは配列番号２７および／または配列番号３０に由来する。いくつかの態様において、第一および／または第二の結合ドメインは、配列番号２７および／または配列番号３０と少なくともおよそ５０％、少なくともおよそ７５％、少なくともおよそ８０％、少なくともおよそ９０％、少なくともおよそ９５％、少なくともおよそ９９％、または少なくともおよそ１００％同一な配列に由来する。いくつかの態様では、第一の結合ドメインおよび第二の結合ドメインは、互いへの結合を保持する相補的な変異を有する。いくつかの態様では、第一の結合ドメインまたは第二の結合ドメインのいずれもが、天然の結合パートナーとは結合しない。いくつかの態様では、第一の結合ドメインと第二の結合ドメインのそれぞれが、３～７つの相補的な変異を有する。いくつかの態様では、第一の結合ドメインと第二の結合ドメインのそれぞれが、３つの相補的な変異を有する。いくつかの態様では、第一の結合ドメインと第二の結合ドメインのそれぞれが、４つの相補的な変異を有する。いくつかの態様では、少なくとも２つの２要素ヌクレオチド配列は細胞のゲノムに組み込まれる。いくつかの態様では、少なくとも２つの２要素ヌクレオチド配列は細胞のゲノムに組み込まれない。いくつかの態様では、少なくとも２つの２要素ヌクレオチド配列は細胞の核ゲノムに組み込まれる。いくつかの態様では、少なくとも２つの２要素ヌクレオチド配列は細胞のミトコンドリアゲノムに組み込まれる。いくつかの態様において、少なくとも２つの２要素ヌクレオチド配列は、細胞のゲノムには組み込まれないが、少なくとも１つのプラスミドを介して、細胞によって発現される。いくつかの態様において、少なくとも２つの２要素ヌクレオチド配列は、標的ゲノムの予め決められた部位に挿入された時に、発現するように操作可能な状態になり、かつ、第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方が標的ゲノム中のプロモーターから駆動される。いくつかの態様において、組み込みは、ヌクレアーゼ媒介性部位特異的組み込み、トランスポゾン媒介性遺伝子送達、またはウイルス媒介性遺伝子送達を介する。いくつかの態様では、ヌクレアーゼ媒介性部位特異的組み込みはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰを介する。いくつかの態様では、内在性のＴＣＲ定常部位、ＤＨＦＲタンパク質の非機能性部分をコードしている第一の第一部分ヌクレオチド配列、および新生抗原ＴＣＲをコードしている第二部分ヌクレオチド配列を標的とするＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰによって、第一の２要素ヌクレオチド配列が細胞に送達される。いくつかの態様では、内在性のＴＣＲ定常部位、ＤＨＦＲタンパク質の非機能性部分をコードしている第一の第一部分ヌクレオチド配列、および新生抗原ＴＣＲをコードしている第一の第二部分ヌクレオチド配列を標的とするＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰによって、第一の２要素ヌクレオチド配列が細胞に送達される。いくつかの態様において、第一の第一部分ヌクレオチド配列および第二の第一部分ヌクレオチド配列は、ＤＨＦＲタンパク質の非機能性部分を含有している融合タンパク質をコードしていて、融合タンパク質を共発現させた時にＤＨＦＲ活性をもつ。いくつかの態様では、内在性のＴＣＲ定常部位ＴＣＲα定常（ＴＲＡＣ）部位であってもまたはＴＣＲβ定常（ＴＲＢＣ）部位であってもよい。いくつかの態様において、ＴＣＲ定常部位以外の内在性の遺伝子座は、Ｂ２Ｍ遺伝子座である。いくつかの態様において、送達は、エレクトロポレーション、または機械的もしくは化学的な膜透過処理に基づく方法によって行われる。いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰである。
いくつかの態様ではヌクレアーゼによって、内在性プロモーター、内在性スプライス部位、および内在性終結シグナルから発現するようにインフレームで遺伝子座のエキソンに組み込むことが可能になる。いくつかの態様ではヌクレアーゼによって、内在性プロモーター、内在性スプライス部位、および外因性終結シグナルから発現するようにインフレームで遺伝子座のエキソンに組み込むことが可能になる。いくつかの態様において、これらの態様は、本明細書で提供するいずれかの態様の一部であり得る。
いくつかの態様では、ヌクレアーゼによって、内在性のプロモーター、外因性のスプライス受容部位、および外因性の終結シグナルから発現するように遺伝子座のイントロンに組み込むことが可能になる。いくつかの態様では、必須のまたは第一のタンパク質は少なくとも２つの個別の機能不全タンパク質部分に分割され、ここで少なくとも２つのはそれぞれ多量体化ドメインに融合され、ここで少なくとも２つの部分は細胞の選抜を可能にする異なる２要素ヌクレオチド配列に組み込まれ、細胞内では異なる２要素ヌクレオチド配列の全てが発現され、必要に応じて、ここで必須のまたは第一のタンパク質の機能が回復する。いくつかの態様では、必須のまたは第一のタンパク質は少なくとも２つの個別の機能不全タンパク質部分に分割され、ここで少なくとも２つの部分はそれぞれ多量体化ドメインに融合され、ここで少なくとも２つの部分は細胞の選抜を可能にする異なる２要素ヌクレオチド配列に組み込まれ、細胞内では異なる２要素ヌクレオチド配列の全てが発現され、必要に応じて、ここで必須のまたは第一のタンパク質の機能が部分的に回復する。いくつかの態様では、必須のまたは第一のタンパク質は少なくとも２つの個別の機能不全タンパク質部分に分割され、ここで少なくとも２つの部分はそれぞれ多量体化ドメインに融合され、ここで少なくとも２つの部分は細胞の選抜を可能にする異なる２要素ヌクレオチド配列に組み込まれ、細胞内では異なる２要素ヌクレオチド配列の全てが発現され、必要に応じて、ここで必須のまたは第一のタンパク質の機能が、その通常のレベルの少なくともおよそ１０％、少なくともおよそ２０％、少なくともおよそ５０％、少なくともおよそ７５％、少なくともおよそ８０％、少なくともおよそ９５％、少なくともおよそ９９％、または少なくともおよそ１００％回復する。いくつかの態様では、必須のまたは第一のタンパク質が機能不全のＮ末端およびＣ末端タンパク質部分に分割され、それぞれの部分はホモもしくはヘテロ二量体化タンパク質パートナーまたはスプリットインテインに融合される。いくつかの態様では、必須のまたは第一のタンパク質はＤＨＦＲタンパク質である。いくつかの態様では、必須のまたは第一のタンパク質はＤＨＦＲタンパク質の類似体または模倣物である。いくつかの態様において、必須のまたは第一のタンパク質は、ＤＨＦＲタンパク質と少なくともおよそ５０％、少なくともおよそ７５％、少なくともおよそ８０％、少なくともおよそ９５％、少なくともおよそ９９％、または少なくともおよそ１００％同一である。いくつかの態様において、ホモ二量体化タンパク質は、ＧＣＮ４、ＦＫＢＰ１２、またはそのバリアントである。いくつかの態様において、ヘテロ二量体化タンパク質は、Ｊｕｎ／Ｆｏｓ、またはそのバリアントである。いくつかの態様では、必須のタンパク質の機能の回復は誘導性である。いくつかの態様では、必須のタンパク質のきいのうの回復がＡＰ１９０３によって誘導される。いくつかの態様において、必須のタンパク質の機能の回復は、少なくともおよそ５％、少なくともおよそ１０％、少なくともおよそ２０％、少なくともおよそ５０％、少なくともおよそ７５％、少なくともおよそ８０％、少なくともおよそ９５％、少なくともおよそ９９％、または少なくともおよそ１００％誘導される。いくつかの態様では、培養するステップがメトトレキサート存在下で実施される。いくつかの態様では、目的のタンパク質はＴ細胞受容体である。いくつかの態様において、Ｔ細胞受容体は、ウイルス性抗原または腫瘍抗原に特異的である。いくつかの態様では、腫瘍抗原は腫瘍新生抗原である。いくつかの態様では、遺伝子改変した細胞は初代ヒトＴ細胞である。
本明細書に記載のいくつかの態様は、Ｔ細胞に関する。いくつかの態様において、このＴ細胞は、メトトレキサートの存在下では、細胞が生存もおよび／または増殖もできないレベルまで抑制される内在性のジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）；およびメトトレキサート耐性ＤＨＦＲタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と内在性のＴＲＡまたはＴＲＢプロモーターから操作可能に発現するＴ細胞受容体をコードしている第二部分ヌクレオチド配列を含有している、少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列：を含む。
いくつかの態様において、このＴ細胞は、内在性のジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）のノックアウト；およびＤＨＦＲタンパク質またはそのバリアントをコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、内在性のＴＲＡまたはＴＲＢプロモーターから操作可能に発現するＴ細胞受容体をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含有している少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列；を含む。
いくつかの態様において、このＴ細胞は、メトトレキサート存在下では、細胞が生存もおよび／または増殖もできないレベルまで抑制される内在性のジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）；および少なくとも２つの２要素ヌクレオチド配列；を含む。第一の２要素ヌクレオチド配列は、ＤＨＦＲタンパク質の非機能性もしくは機能不全部分またはそのバリアントをコードしている第一の第一部分ヌクレオチド配列と、Ｔ細胞受容体コードし、内在性のＴＲＡまたはＴＲＢプロモーターから操作可能に発現する第一の第二部分ヌクレオチド配列とを含む。第二の２要素ヌクレオチド配列は、ＤＨＦＲタンパク質の非機能性もしくは機能不全部分またはそのバリアントをコードしている第二の第一部分ヌクレオチド配列と、目的のタンパク質コードし、内在性のＢ２Ｍプロモーターから操作可能に発現する第二の第二部分ヌクレオチド配列とを含み、ここで細胞はＤＨＦＲを有する。
定義
定義
本明細書全体を通じて「含む」という用語、または「含まれる」もしくは「含んでいる」などの変形は、言及している要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群を含むことを意味し、他の要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群を除外しないものと理解される。
以下の用語および方法の説明は、本開示をより良く説明するため、および当業者が本開示を実施する際の指針とするために提供される。単数形の「１つ」、「１種」、および「この」は、文脈から明らかにそうでないと判断されない限り、１つまたは２つ以上を指す。例えば、「核酸分子を含んでいる」という用語は、単一のまたは複数の核酸分子を含むもので、「少なくとも１つの核酸分子を含んでいる」という句と同等であるとみなされる。「または」という用語は、文脈からそうではないことが明らかでない限り、記載された代替要素の単一の要素または２つ以上の要素の組合せを指す。本明細書で使用する場合、「含む」は「包含する」を意味する。したがって、「ＡまたはＢを含んでいる」とは、追加の要素を排除することなく、「Ａ、Ｂ、またはＡおよびＢを包含する」ことを意味する。特段の指定のない限り、本定義が他に存在し得る定義と異なる可能性がある場合には、本明細書で提供される定義が優先される。
特段の記載のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及される全てのヒト遺伝子解析機構（ＨＵＧＯ Ｇｅｎｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＨＧＮＣ）の識別子（ＩＤ）は、その全体が参照により組み込まれる。本開示の実施または試験には、本明細書に記載の方法および材料と類似または同等のものを使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。材料、方法、および実施例は、例示に過ぎず、限定することを意図していない。
「Ｔ細胞受容体」または「ＴＣＲ」とは、Ｔ細胞すなわちＴリンパ球の表面に存在し、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子にペプチドとして結合した抗原を認識する分子を意味する。ＴＣＲは２種類のタンパク質鎖から構成されている（つまり、ヘテロ二量体である）。ヒトの場合、９５％のＴ細胞においてＴＣＲはアルファ（α）鎖とベータ（β）鎖（それぞれＴＲＡとＴＲＢによってコードされている）から構成されているが、５％のＴ細胞ではＴＣＲはガンマとデルタ（γ／δ）鎖（それぞれＴＲＧとＴＲＤによってコードされている）から構成されている。この比率は、個体発生時や疾患状態（白血病など）において変化し、また、生物種によっても異なる。それぞれのＴＣＲ鎖は２つの細胞外ドメイン、可変（Ｖ）領域と定常（Ｃ）領域、から構成されている。定常領域は細胞膜に近接していて、膜貫通領域と短い細胞質尾部が続くもので、一方、可変領域はペプチド／ＭＨＣ複合体に結合する。ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の両方の可変領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と呼ばれる、３つの超可変相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する。いくつかの態様では、ＣＤＲ３が主な抗原認識領域である。いくつかの態様では、ＴＣＲα鎖遺伝子はＶおよびＪを含み、ＴＣＲβ鎖遺伝子は、ＴＣＲの多様性に寄与するＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントを含む。ＴＣＲの定常ドメインは、システイン残基がジスルフィド結合を形成して２本の鎖の間のリンクを形成している短い連結配列から構成される。
他の特徴に加えて、Ｔ細胞は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、およびＣＤ６９を含むがこれらに限定されない、機能性または活性状態を示すマーカーの発現によって特徴付けることができる。いくつかの態様において、細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞などの、Ｔ細胞の特定のサブセットである。いくつかの態様において、この方法は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞などのＴ細胞の特定のサブセットに使用される。いくつかの態様において、この方法は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞などのＴ細胞の特定のサブセットを生成する過程で使用される。いくつかの態様において、細胞は活性化されており、例えば、ＣＤ２５またはＣＤ６９を発現している。いくつかの態様において、この方法は、例えばＣＤ２５またはＣＤ６９を発現している、活性化された細胞に使用される。いくつかの態様において、この方法は、活性化された細胞、例えばＣＤ２５またはＣＤ６９を発現している細胞、を生成する過程で使用される。
「治療用ＴＣＲ」または「治療用ＴＣＲ遺伝子」という用語は、所望の機能、例えば、宿主の免疫系が病気と闘うことを促進できることなどの機能を仲介する、ＴＣＲαとＴＣＲβ鎖の特定の組合せを指す場合がある。治療用ＴＣＲ遺伝子は、ファージ、酵母、またはＴ細胞提示系によって組換えＴＣＲライブラリーとして発現されるインビトロの変異型ＴＣＲ鎖から選択することができる。治療用ＴＣＲ遺伝子は、自己由来であっても同種異系であってもよい。
「目的のタンパク質」という用語は、本明細書に記載のいくつかの態様による細胞の生存および／または増殖に必須のタンパク質に加えて発現される任意のタンパク質を指すことができる。目的のタンパク質は、細胞にとって外因性であってもよい。目的のタンパク質は、細胞によって天然にも発現されるが、過剰発現されるタンパク質であってよい。タンパク質は、治療、診断、研究、または他の任意の意図において目的のものであってよい。目的のタンパク質の例としては、ＴＣＲ、キメラ抗原受容体、スイッチレセプター、サイトカイン、酵素、成長因子、抗体、およびそれらの改変型が挙げられる。
「遺伝子改変した細胞」とは、バイオテクノロジーを用いてその遺伝子構造を変化させた細胞のことである。このような変化には、種の中でのおよび種を越えた遺伝子の移動、新しい天然または合成遺伝子の導入、または天然に存在する遺伝子の除去などがあり、それによって、改良されたもしくは新規の生物を生み出したり、または生物中に改良されたまたは新規の機能を創出することができる。新しいＤＮＡは、組換えＤＮＡ法を用いて目的の遺伝物質を単離し、コピーするか、またはＤＮＡを人工的に合成することによって得られる。遺伝子改変した細胞に導入する前に、単離または合成されたＤＮＡを修飾することもできる。
「遺伝子改変したＴ細胞」とは、バイオテクノロジーを用いてその遺伝子構造を変化させたＴ細胞のことである。
タンパク質またはポリペプチドの文脈で用いられる場合、「リンカー」とは、２つのタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ドメイン、領域、またはモチーフを接続し、得られるポリペプチドが特定の機能または活性を保持するように、２つのサブ結合ドメインの相互作用に適合するスペーサー機能を提供し得る、アミノ酸配列を指す。特定の態様においてリンカーは、約２～約３５アミノ酸または２～３５アミノ酸、例えば、約４～約２０アミノ酸または４～２０アミノ酸、約８～約１５アミノ酸または８～１５アミノ酸、約１５～約２５アミノ酸または１５～２５アミノ酸で構成されている。いくつかの態様において、リンカーは、グリシンおよび／またはセリンアミノ酸に富む場合がある。
「インテイン」は「タンパク質イントロン」としても知られ、隣接する残基を結合することができるタンパク質セグメントまたはセグメントである。いくつかの態様において、インテインは、タンパク質スプライシングの間に、インテイン自体を切除したり、および／または前駆体ポリペプチドの残りの部分を結合することができる。いくつかの態様において、インテインは、ペプチド結合を介して他の残基と結合する。「スプリットインテイン」は、前駆体タンパク質のインテインが少なくとも２つの遺伝子に由来する場合を指す。
「非機能性」とは、活性が全くないか活性が著しく低下している、分子、単一のもしくは複数のアミノ酸、単一のもしくは複数のヌクレオチド、ドメイン、タンパク質セグメント、タンパク質、ＲＮＡ、ＲＮＡセグメント、ＤＮＡ、またはＤＮＡセグメントを指す。
「機能不全」という用語は、予想されるまたは完全な様式で機能することができず、異常な活性を有していてもまたは有していなくてもよい、分子、単一のもしくは複数のアミノ酸、単一のもしくは複数のヌクレオチド、ドメイン、タンパク質セグメント、タンパク質、ＲＮＡ、ＲＮＡセグメント、ＤＮＡ、またはＤＮＡセグメントを指す。
本明細書で使用する場合、「新生抗原」という用語は、腫瘍特異的なゲノム変異に由来する抗原を指す。例えば新生抗原は、腫瘍試料中で非同義一塩基変異に起因する変異型タンパク質が発現することによって、または変異誘発性のフレームシフトに起因する別の読み取り枠が発現することによって生じる場合がある。このため、新生抗原は病的状態に関連し得る。いくつかの態様において、「変異型タンパク質」は、正規のアミノ酸配列の同じ位置にあるアミノ酸とは異なるアミノ酸を少なくとも１つの含むタンパク質を指す。いくつかの態様において、変異型タンパク質は、正規のアミノ酸配列に対して、挿入、欠失、置換、読み取り枠シフトによって生じるアミノ酸の包含、またはそれらの任意の組合せを含む。「ＰＴＭ新生抗原」とは、腫瘍特異的であるが、ゲノム変異に基づかない抗原を指す。ＰＴＭ新生抗原の例としては、リン酸化新生抗原や糖鎖新生抗原が挙げられる。
「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９」は、ＤＮＡ配列の一部分を除去、追加、または変更することにより、遺伝学者や医学研究者がゲノムの一部を編集することを可能にする技術である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、ＤＮＡに変化を導入する２つの鍵となる分子から構成される。１つはＣａｓ９と呼ばれる酵素で、これは１対の「分子ハサミ」として機能し、ＤＮＡの２本の鎖をゲノム中の特定の位置で切断することができ、次いで、ＤＮＡの破片を追加または除去することができる；もう１つがガイドＲＮＡと呼ばれる一編のＲＮＡで、これは、より長いＲＮＡ足場中に位置する予め設計された短いＲＮＡ配列（約２０塩基対）から構成されている。足場部分はＤＮＡに結合し、予め設計された配列がＣａｓ９をゲノムの適切な部分に「先導」する。このことにより、Ｃａｓ９酵素が確実にゲノムの適切な箇所を切断することができるようになる。リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）は、リボ核酸とＲＮＡ結合タンパク質の複合体である。当業者であれば、本明細書に記載の様々な態様において、Ｃａｓ９以外のＣＲＩＳＰＲ系を同じように用いることができること、および「ＣＲＩＳＰＲ」という用語が、技術、系（システム）、または方法を指すために使用される場合、かかる系の属を意味することを認識するであろう。
ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）は、原核生物および真核生物の細胞において、配列特異的に遺伝子発現を抑制することができる遺伝子擾乱技術である。
「ＴＡＬＥＮ」すなわち転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼは、ＤＮＡの特定の配列を切断するように操作された制限酵素である。ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターのＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡ開裂ドメイン（ＤＮＡ鎖を切断するヌクレアーゼ）を融合することによって作られる。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、実質的に、所望されるＤＮＡ配列のいずれにも結合するように操作できるため、ヌクレアーゼと併用することで、ＤＮＡを特定の位置で切断することができる。
「ＭｅｇａＴＡＬ」は、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターのＤＮＡ結合領域を用いて、所望される単一のゲノム標的部位の近くに、部位特異的メガヌクレアーゼを誘導する、一本鎖の希少開裂型ヌクレアーゼシステムである。このシステムにより、極めて活性が高く、かつ、超特異的な小型のヌクレアーゼを生成することができる。
「ｓｉＲＮＡ」すなわち低分子干渉ＲＮＡ（短鎖干渉ＲＮＡまたはサイレンシングＲＮＡと呼ばれることもある）は、二本鎖の非コードＲＮＡ分子の一種で、一般的にｍｉＲＮＡと同様に２０～２７塩基対の長さで、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路内で作動する。ｓｉＲＮＡは転写後のｍＲＮＡを分解し、翻訳を妨げることで、相補的なヌクレオチド配列を持つ特定の遺伝子の発現を干渉する。
「ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）」は、植物、動物、一部のウイルスに見られる小さな非コードＲＮＡ分子（約２２のヌクレオチドを含む）で、ＲＮＡサイレンシングおよび遺伝子発現の転写後調節に機能する。ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ分子内の相補配列と塩基対を形成することによって機能し、その結果、これらｍＲＮＡ分子の発現が抑制される。
様々な態様
様々な態様
いくつかの態様では、本明細書で提供する方法は、遺伝子改変した細胞を濃縮するための選抜方法である。この方法は、ゲノムに、少なくとも、細胞の生存および／または増殖に必須のタンパク質をコードしている１つの遺伝子座に、ノックアウトを導入することを含む場合がある。必須の遺伝子のノックアウトについては図２７Ａを参照されたい。この方法はまた、細胞中で発現するように操作可能で、かつ、少なくとも、細胞の生存および／または増殖に必須のタンパク質をコードしている少なくとも１つのヌクレオチド配列を導入することを含む場合もある。
いくつかの態様において、選抜は、外因性の選択圧を用いずに達せられる。「外因性の選択圧」とは、通常の培地に加えられ、細胞の選抜を可能にする添加剤である。外因性の選択圧は、タンパク質または細胞内プロセスを阻害または活性化する分子（例えばメトトレキサートなどの薬剤分子）；細胞の構成要素に結合し、その構成要素を有する細胞を、構成要素を持たない細胞から、物理的に、光学的にまたは磁力を使ってソートすることを可能にする分子（例えば、フローサイトメトリーまたは磁気ビーズ濃縮による濃縮を可能にする抗体）；または、改変していない細胞よりも、改変した細胞の増殖を特異的に早めるために、細胞培地に追加することが可能な分子；であってよい。いくつかの好ましい態様では、外因性の選択圧は薬理学的な外因性の選択圧（例えばメトトレキサート）である。いくつかの態様において、再導入される遺伝子は、遺伝的にノックアウトされる内在性の遺伝子とアミノ酸配列が同一であるが、ヌクレアーゼ耐性を獲得するためにヌクレオチド配列が変更されており、それによって、ＤＨＦＲタンパク質などの変異型タンパク質の使用を回避することが可能である。いくつかの態様において、導入されるヌクレオチド配列は、細胞ゲノムに組み込まれる必要がある（つまり、導入遺伝子の安定した発現のために必要である）。必須のタンパク質をコードする遺伝子を、目的の遺伝子座に組み込むことができる。「改変した必須の遺伝子の目的の遺伝子座へのノックイン」については図２７Ｂを参照されたい。
いくつかの態様では、この方法は、遺伝子改変したＴ細胞を濃縮するための方法である。この方法は、Ｔ細胞の内在性ＤＨＦＲ遺伝子にヌクレアーゼ媒介性ノックアウトを導入すること；ならびに、Ｔ細胞受容体α鎖、Ｔ細胞受容体β鎖およびＤＨＦＲをコードしているヌクレオチド配列をＴ細胞のゲノムに導入すること；を含み、ここで、Ｔ細胞受容体α鎖、β鎖およびＤＨＦＲは全て、同時に発現するよう操作可能に連結される。（図２参照）。
いくつかの態様では、本明細書で提供する選抜方法のいずれかを、遺伝子改変したＴ細胞であって、その抗原特異性を細胞治療用に再指向化した遺伝子改変Ｔ細胞の濃縮に用いることができる。いくつかの態様では、固形癌を治療するための完全に個別化されたＴＣＲ治療に、この方法を利用することができる。これを可能にするためには、この方法を、個々の患者ベースで腫瘍生検から新生抗原特異的ＴＣＲ遺伝子を同定することを可能にする、より大きな方法に含めてもよい。その同定後、それら新生抗原ＴＣＲ遺伝子を、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ媒介性遺伝子ノックインを含むがこれに限定されない任意の技術を用いて患者のＴ細胞に導入し、それによって、Ｔ細胞の抗原特異性を腫瘍新生抗原に向けて再指向化することができる。最後に、静脈内注入によって、遺伝子改変したＴ細胞を患者に戻すことができる。
治療効果を最大にするためには、患者に戻す遺伝子改変したＴ細胞の大部分が、目的の新生抗原特異的ＴＣＲ遺伝子を発現していることが有用である。ＴＣＲ遺伝子のノックイン効率は一般に１０～３０％の範囲であるため、細胞注入の前に、うまく改変された細胞を濃縮できる選抜方法が有用である。いくつかの態様では、このような選抜方法は、ＴＣＲノックインに必要とされるのと同じ分子成分を利用することができ、このことは、Ｔ細胞の製造工程に追加の実験手順が必要でないことを意味する。これは、本明細書で提供する様々な態様のいくつかによって達成することができる。
いくつかの態様では、選択マーカーとして使用される内在性遺伝子（例えば、ＤＨＦＲ）をノックインとして導入することを条件として、この戦略を、特定の遺伝子に対する遺伝子ノックアウトを有する細胞を濃縮するためにも適用可能である。いくつかの態様では、必須の内在性のジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子をノックアウトするために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）（または、他のＣＲＩＳＰＲ系を含む任意のヌクレアーゼ）を用いることが可能である（図２上段を参照）。のこと。第二のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰを利用して、治療用ＴＣＲ遺伝子とＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ耐性ＤＨＦＲ遺伝子とを含有する構築物を内在性のＴＣＲ遺伝子座にノックインすることができる（図２下段を参照）。このように、ＴＣＲ遺伝子構築物のノックインに成功した細胞は、他のＤＨＦＲノックアウト細胞よりも強い生存優位性を獲得し、経時的に濃縮されるようになる。本明細書で提供するいくつかの態様を利用して、（１）遺伝子送達方法、（２）導入遺伝子の性質、および（３）標的とする細胞型とは無関係に、遺伝子改変した細胞を濃縮することができる。ＤＦＨＲが関与する経路を図１に示す。ＤＨＦＲ／メトトレキサート（ＭＴＸ）選抜は、組み替えタンパク質を高生産するクローンを単離するための多重増幅に利用される。ＤＨＦＲは、葉酸をテトラヒドロ葉酸に変換する還元酵素であり、細胞増殖のためのデノボのヌクレオチド合成経路に必須の前駆体である。ＤＨＦＲが抑制されると、添加剤（ヒポキサンチンやチミジン（ＨＴ））の補充がなければ、細胞は増殖できなくなる。したがって、ＤＨＦＲ選抜システムによって、ノックイン細胞を選抜することができるポイントが提供される。遺伝子構築物の一態様を図２に示す。いくつかの実施形態では、この濃縮戦略のために、内因性ＤＨＦＲをノックアウトし、ＤＨＦＲを治療用導入遺伝子（ＴＣＲβおよびＴＣＲα）と共に再導入することができる。ＤＨＦＲがノックアウトされた細胞は増殖を停止するかおよび／または死亡し、そしてＤＨＦＲを（導入遺伝子ＴＣＲβおよびＴＣＲαと共に）再導入した細胞のみが増殖および／または生存を続けることができるため、濃縮される；再導入されるＤＨＦＲはヌクレアーゼ耐性であるが、野生型ＤＨＦＲと同じアミノ酸配列を有する。図２に示す態様では、エレクトロポレーションの間に、
１．ノックインのためにＴＲＡＣを切断するＴＲＡＣ ＲＮＰ
２．内在性のＤＨＦＲをノックアウトするＤＨＦＲ ＲＮＰ
３．１Ｇ４－ＴＣＲとｓｇＲＮＡ耐性ＤＨＦＲとを含有している直鎖ｄｓＤＮＡ鋳型
の３つの構成要素を一緒に送達することが可能である。ＤＨＦＲノックアウト細胞では、ｓｇＲＮＡ耐性ＤＨＦＲノックインを併用した細胞のみが通常の培地で増殖することができる。
１．ノックインのためにＴＲＡＣを切断するＴＲＡＣ ＲＮＰ
２．内在性のＤＨＦＲをノックアウトするＤＨＦＲ ＲＮＰ
３．１Ｇ４－ＴＣＲとｓｇＲＮＡ耐性ＤＨＦＲとを含有している直鎖ｄｓＤＮＡ鋳型
の３つの構成要素を一緒に送達することが可能である。ＤＨＦＲノックアウト細胞では、ｓｇＲＮＡ耐性ＤＨＦＲノックインを併用した細胞のみが通常の培地で増殖することができる。
前述したように、ＤＨＦＲはプリンヌクレオチドの合成過程でジヒドロ葉酸をテトラヒドロ葉酸に変換する必須の酵素である（例えば図１を参照）。そのため、ＤＨＦＲをノックアウトするとＤＮＡの合成や修復が阻害され、Ｔ細胞のような増殖性の高い細胞の増殖が優先的に損なわれる。これに基づいて本発明の遺伝子編集濃縮戦略は提供されており、この戦略においては例えば、内在性のＤＨＦＲ遺伝子をノックアウト／抑制するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体（または、替わりに任意の他の関連システム）を、細胞にエレクトロポレーションすることができる。同時に、内在性のＴＣＲα定常（ＴＲＡＣ）遺伝子を標的とするＲＮＰ複合体と新生抗原ＴＣＲをコードしているＤＮＡ修復鋳型、およびＲＮＰ複合体が結合できないサイレント変異を含むヌクレアーゼ耐性ＤＨＦＲ遺伝子を、細胞にエレクトロポレーションする。ヌクレアーゼ耐性ＤＨＦＲ遺伝子が常に導入されたＴＣＲと共発現するように、ＤＮＡ修復鋳型を、ＴＣＲβ－２Ａ－ヌクレアーゼ耐性ＤＨＦＲ－２Ａ－ＴＣＲαの順序で設計することができ、その結果、３つのタンパク質を、自己切断２Ａペプチドを用いて単一の読み取り枠から発現させることができる。
いくつかの態様では、ＴＲＡＣ ＲＮＰとＤＮＡ修復鋳型をエレクトロポレーションした１０日後に、２０％±１０％のＴ細胞で、導入したＴＣＲ遺伝子がうまくノックインされたことを提示し得る。注目すべきは、この導入効率が、例えば、ＤＨＦＲ ＲＮＰを同時にエレクトロポレーションした場合にはＴ細胞の７３％±１２％まで増加し得ることである。この結果は、機能性ＤＨＦＲがＴ細胞の生存に有用であること、そしてヌクレアーゼ耐性ＤＨＦＲ遺伝子をノックインすることによって、ＴＣＲのノックインに成功したＴ細胞の頻度を１０日間の培養期間中に、例えばおよそ５倍に濃縮できることを示している。
本明細書の実施例に示すように、ＤＨＦＲ選抜戦略によってノックイン細胞を効率的に濃縮することができる。しかしながら、ｓｇＲＮＡでＤＨＦＲをノックアウトすると、内在性のＤＨＦＲ遺伝子座を持続的に変化させることができる。さらに、この方法では非特異的なオフターゲット編集を導入することができる。いくつかの態様では、ｓｇＲＮＡを、内在性のＤＨＦＲの発現を一過性に抑制するためのｓｉＲＮＡ、または、臨床試験済みのＴ細胞増殖中のＤＨＦＲ阻害剤であるメトトレキサートで置き換えることができる。
遺伝子改変細胞の濃縮には、現行の技術に基づくいくつかの選択システムが使用可能である。多くのシステムは、導入された導入遺伝子または導入されたマーカー（例えば、ＥＧＦＲやＬＮＧＦＲなどの表面分子の切断型変異体）への抗体の結合に基づく、改変細胞の選抜に依存している。このようなシステムは、遺伝子改変細胞を濃縮するために専用のプロセスステップ、試薬、および／または装置を必要とするため、本発明で提示する選択肢とは根本的に異なるものである。
現行の技術に基づく遺伝子改変細胞の選抜システムと比較して、本態様のいくつかは、以下に挙げるもののうちの１つ以上を含む、重要な利点をもたらす。
１．選抜を可能にするための外因性遺伝子配列の導入を必要としないこと：表面マーカー（例えば、切断型ＥＧＦＲ）、薬剤耐性（例えば、メトトレキサート）または抗生物質耐性（例えば、ピューロマイシンもしくはブラストサイジン）が介在する選抜に基づく別のシステムとは異なり、導入遺伝子以外の外因性遺伝子配列が細胞内に導入されない。いくつかの態様において、選抜は、アミノ酸配列が変更されていて、導入遺伝子とともに再導入される、必須の内在性遺伝子の遺伝的ノックアウトのみに基づくものである。
２．遺伝子改変した細胞の物理的な選抜を必要としないこと：当該技術分野の他の方法とは異なり、本発明は、抗体を介した濃縮（例えば、フローサイトメトリーソーティングや磁気ビーズによる濃縮）を必要としない。選抜は、導入遺伝子のカセットを発現していない細胞では必須の遺伝子の発現が消失するかまたは機能の抑制が起こる一方、遺伝子改変した細胞では導入遺伝子のカセットによって機能が回復することで、達成される。
３．細胞内在性タンパク質の変異体を必要としないこと：これまでに記載のＤＨＦＲを使用する選抜システムは、メトトレキサート耐性ＤＨＦＲ変異体の生成と導入に基づくものである。ＤＨＦＲ変異体が有する改変されたアミノ酸配列は潜在的に免疫原性であり、養子移入後の細胞拒絶を促進する可能性がある。さらに、Ｔ細胞の文脈では、遺伝子改変したＴ細胞はメトトレキサートに対して耐性を持つようになる。メトトレキサートは自己免疫疾患の治療によく使われるため、これは望ましくない。変異型タンパク質バージョンに関する要件がないことによって、ＤＨＦＲ以外の他の必須の遺伝子を用いたこのシステムの使用が大いに促進される。原則として、本明細書で提供する関連の様々な態様は、遺伝子改変細胞の生存に必須である任意の遺伝子に適用することができる。
４．導入遺伝子の消失リスクが低減すること：必須のタンパク質または耐性タンパク質を発現させるには導入遺伝子の発現が必要であるため、選択圧をかけて細胞生存のために導入遺伝子の発現を維持する結果、例えばプロモーターサイレンシングによる導入遺伝子の発現消失が低減すると考えられる。
５．複雑な遺伝的搭載物に対応可能であること：本開示の発明は、単一の遺伝子座から３つの外因性導入タンパク質（ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＤＨＦＲ）を発現する細胞を濃縮することを可能にする。注目すべきは、さらに２Ａペプチド配列またはＩＲＥＳ要素を使用することにより、さらに多くのタンパク質の発現を共濃縮することができると理解されることである。さらに本発明は、共起する遺伝子工学的事象、例えば２つの２要素ヌクレオチド配列の発現（それぞれが複数の外因性導入タンパク質をコードしていてもよい）で改変された、遺伝子改変した細胞の選抜を可能にする。
１．選抜を可能にするための外因性遺伝子配列の導入を必要としないこと：表面マーカー（例えば、切断型ＥＧＦＲ）、薬剤耐性（例えば、メトトレキサート）または抗生物質耐性（例えば、ピューロマイシンもしくはブラストサイジン）が介在する選抜に基づく別のシステムとは異なり、導入遺伝子以外の外因性遺伝子配列が細胞内に導入されない。いくつかの態様において、選抜は、アミノ酸配列が変更されていて、導入遺伝子とともに再導入される、必須の内在性遺伝子の遺伝的ノックアウトのみに基づくものである。
２．遺伝子改変した細胞の物理的な選抜を必要としないこと：当該技術分野の他の方法とは異なり、本発明は、抗体を介した濃縮（例えば、フローサイトメトリーソーティングや磁気ビーズによる濃縮）を必要としない。選抜は、導入遺伝子のカセットを発現していない細胞では必須の遺伝子の発現が消失するかまたは機能の抑制が起こる一方、遺伝子改変した細胞では導入遺伝子のカセットによって機能が回復することで、達成される。
３．細胞内在性タンパク質の変異体を必要としないこと：これまでに記載のＤＨＦＲを使用する選抜システムは、メトトレキサート耐性ＤＨＦＲ変異体の生成と導入に基づくものである。ＤＨＦＲ変異体が有する改変されたアミノ酸配列は潜在的に免疫原性であり、養子移入後の細胞拒絶を促進する可能性がある。さらに、Ｔ細胞の文脈では、遺伝子改変したＴ細胞はメトトレキサートに対して耐性を持つようになる。メトトレキサートは自己免疫疾患の治療によく使われるため、これは望ましくない。変異型タンパク質バージョンに関する要件がないことによって、ＤＨＦＲ以外の他の必須の遺伝子を用いたこのシステムの使用が大いに促進される。原則として、本明細書で提供する関連の様々な態様は、遺伝子改変細胞の生存に必須である任意の遺伝子に適用することができる。
４．導入遺伝子の消失リスクが低減すること：必須のタンパク質または耐性タンパク質を発現させるには導入遺伝子の発現が必要であるため、選択圧をかけて細胞生存のために導入遺伝子の発現を維持する結果、例えばプロモーターサイレンシングによる導入遺伝子の発現消失が低減すると考えられる。
５．複雑な遺伝的搭載物に対応可能であること：本開示の発明は、単一の遺伝子座から３つの外因性導入タンパク質（ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＤＨＦＲ）を発現する細胞を濃縮することを可能にする。注目すべきは、さらに２Ａペプチド配列またはＩＲＥＳ要素を使用することにより、さらに多くのタンパク質の発現を共濃縮することができると理解されることである。さらに本発明は、共起する遺伝子工学的事象、例えば２つの２要素ヌクレオチド配列の発現（それぞれが複数の外因性導入タンパク質をコードしていてもよい）で改変された、遺伝子改変した細胞の選抜を可能にする。
本明細書に記載するように、いくつかの態様は、これら記載した全５つの利点のうちのいくつか（例えば、これら利点のうちの１つ、２つ、３つ、または４つ）を有する場合がある。例えば、（１）内在性のＤＨＦＲがノックアウトされる態様では、ノックインＤＨＦＲは野生型ＤＨＦＲであってもよい（２）内在性のＤＨＦＲがメトトレキサートによって抑制される態様では、メトトレキサート耐性ＤＨＦＲまたはスプリット－ＤＨＦＲを用い、同時に、同じ遺伝子座から外因性に発現される要素によって選択圧を維持することができる。これらの態様および種々の利点のそれぞれは、本開示の様々な態様に一致し、また、それらに反映される。当業者であれば、本開示が複数のかつ多様な発明を提供しており、ある発明の要素のすべてが他の発明に必要とされるわけではないことを理解されよう。したがって、本明細書に開示した発明の全て（または必ずしも全て）が、前述した態様のうちの１つ以上を必ず有するとは限らない。当業者であれば、本開示、知識、および／または発明自体に関して提供される特定の要素とを考慮して、どの発明が前述した利点を有するかを判断することができるだろう。
いくつかの態様では、内在性のゲノム遺伝子座を持続的に遺伝子ノックアウトする代わりに、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）技術を用いた内在性ＤＨＦＲのノックダウンと、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはＣＲＩＳＰＲｉ耐性ＤＨＦＲ遺伝子バリアントを含有しているＴＣＲ遺伝子構築物を発現させることを組み合わせて利用することができる。
いくつかの態様では、メトトレキサート（ＭＴＸ）を用いた内在性ＤＨＦＲの阻害と、ＭＴＸ耐性ＤＨＦＲ遺伝子を含有し、かつ、内在性のプロモーター、内在性のスプライス部位、および内在性の終結シグナルから発現できるように遺伝子座のエクソンにインフレームで組み込んだ導入遺伝子のカセットを発現させることを組み合わせて利用することができる。
いくつかの態様では、メトトレキサート（ＭＴＸ）を用いた内在性ＤＨＦＲの阻害と、ＭＴＸ耐性ＤＨＦＲ遺伝子バリアントを含有しているＴＣＲ遺伝子構築物を発現させることを組み合わせて利用することができる。
いくつかの態様において、この選抜原理は、その遺伝子が細胞の生存および／または増殖に必須であることを条件として、ＤＨＦＲ以外の遺伝子にも適用可能である。
いくつかの態様では、内在性のＤＨＦＲはヌクレアーゼによってノックアウトまたはノックダウンされる；この選抜原理は、治療用遺伝子を、ヌクレアーゼ耐性ＤＨＦＲバリアントの再導入と関連づけることを条件として、他の任意の治療用遺伝子にも適用可能である。
いくつかの態様において、この選抜原理は、他の細胞型、例えば、造血幹細胞、間葉系幹細胞、ｉＰＳＣ、神経系前駆細胞、線維芽細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、および網膜の遺伝子治療に関わる細胞型等にも適用可能である。
いくつかの態様において、導入遺伝子は、ＨＤＲによるヌクレアーゼ媒介性部位特異的組み込み以外の方法、すなわち、トランスポゾン媒介性遺伝子送達、マイクロインジェクション、リポソーム／ナノ粒子媒介性遺伝子導入、ウイルス媒介性遺伝子送達、エレクトロポレーション、または機械的もしくは化学的な膜透過処理に基づく方法によって送達することができる。
いくつかの態様では、抑制された機能を回復するまたは選択圧に対する耐性をもたらすタンパク質を、ｉ）細胞内で操作可能に組み合わせることができる２つ以上の部分に分割しても、およびｉｉ）導入遺伝子カセットの全てによって同時にうまく改変できた細胞の選抜を可能にするために、導入遺伝子のカセットを各部分に連結させてもよい。いくつかの態様では、抑制された機能を回復するタンパク質を、二量体化ドメインに融合させてもよい。いくつかの態様において、二量体化ドメインは、ＧＣＮ４、Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、またはＦＫＢＰ１２タンパク質に由来するものであってよい。いくつかの態様では、二量体化は、ロイシンジッパーモチーフを利用して達成され得る。いくつかの態様では、二量体化は、スプリットインテインタンパク質を利用して達成され得る。いくつかの態様では、二量体化ドメインを、内在性タンパク質との二量体かを低減するまたは防止するように、外因性タンパク質との二量体化および／または結合を促進するように、改変する（例えば、アミノ酸配列を変化させる）ことができる。いくつかの態様では、二量体化ドメインとしての特徴（例えば誘導可能な二量体化）を追加、除去、および／または変更するために、二量体化ドメインを改変する（例えば、アミノ酸配列を変化させる）ことができる。
いくつかの態様では、異なる設計の導入遺伝子カセットを用いることができる。例として、６種類の配向を挙げる。
外因性タンパク質１－２Ａ－外因性タンパク質２－２Ａ－選抜に有利なタンパク質
外因性タンパク質１－２Ａ－選抜に有利なタンパク質－２Ａ－外因性タンパク質２
外因性タンパク質２－２Ａ－外因性タンパク質１－２Ａ－選抜に有利なタンパク質
外因性タンパク質２－２Ａ－選抜に有利なタンパク質－２Ａ－外因性タンパク質１
選抜に有利なタンパク質－２Ａ－外因性タンパク質１－２Ａ－外因性タンパク質２
選抜に有利なタンパク質－２Ａ－外因性タンパク質２－２Ａ－外因性タンパク質１
（任意の２Ａエレメントを使用する）
外因性タンパク質１－２Ａ－外因性タンパク質２－２Ａ－選抜に有利なタンパク質
外因性タンパク質１－２Ａ－選抜に有利なタンパク質－２Ａ－外因性タンパク質２
外因性タンパク質２－２Ａ－外因性タンパク質１－２Ａ－選抜に有利なタンパク質
外因性タンパク質２－２Ａ－選抜に有利なタンパク質－２Ａ－外因性タンパク質１
選抜に有利なタンパク質－２Ａ－外因性タンパク質１－２Ａ－外因性タンパク質２
選抜に有利なタンパク質－２Ａ－外因性タンパク質２－２Ａ－外因性タンパク質１
（任意の２Ａエレメントを使用する）
いくつかの態様では、異なる設計の導入遺伝子カセットを用いることができる。例として、ＴＣＲａ、ＴＣＲｂおよびＤＨＦＲの６種類の配向を挙げる。
ＴＣＲａ－２Ａ－ＴＣＲｂ－２Ａ－ＤＨＦＲ
ＴＣＲａ－２Ａ－ＤＨＦＲ－２Ａ－ＴＣＲｂ
ＴＣＲｂ－２Ａ－ＴＣＲａ－２Ａ－ＤＨＦＲ
ＴＣＲｂ－２Ａ－ＤＨＦＲ－２Ａ－ＴＣＲａ
ＤＨＦＲ－２Ａ－ＴＣＲａ－２Ａ－ＴＣＲｂ
ＤＨＦＲ－２Ａ－ＴＣＲｂ－２Ａ－ＴＣＲａ
（任意の２Ａエレメントを使用する）
ＴＣＲａ－２Ａ－ＴＣＲｂ－２Ａ－ＤＨＦＲ
ＴＣＲａ－２Ａ－ＤＨＦＲ－２Ａ－ＴＣＲｂ
ＴＣＲｂ－２Ａ－ＴＣＲａ－２Ａ－ＤＨＦＲ
ＴＣＲｂ－２Ａ－ＤＨＦＲ－２Ａ－ＴＣＲａ
ＤＨＦＲ－２Ａ－ＴＣＲａ－２Ａ－ＴＣＲｂ
ＤＨＦＲ－２Ａ－ＴＣＲｂ－２Ａ－ＴＣＲａ
（任意の２Ａエレメントを使用する）
いくつかの態様において、２要素ヌクレオチド配列は、内在性のプロモーター、内在性のスプライス部位、および内在性の終結シグナルからの発現を可能にするために、遺伝子座のエクソンにインフレームで組み込まれる。
いくつかの態様において、２要素ヌクレオチド配列は、第一のタンパク質、第二のタンパク質またはその両方の発現を可能にする、２要素ヌクレオチド配列自体の外因性のプロモーターと共に組み込まれる。
いくつかの態様では、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖は内在性のＴＣＲプロモーターから駆動され、ＤＨＦＲタンパク質は外因性の誘導プロモーターから駆動される。この導入遺伝子のカセットは、以下の設計のうちの１種類を有する。
ＴＣＲα－２Ａ－ＴＣＲβ－ｐＡ－プロモーター－ＤＨＦＲ－ｐＡ
ＴＣＲβ－２Ａ－ＴＣＲα－ｐＡ－プロモーター－ＤＨＦＲ－ｐＡ
ＴＣＲα－２Ａ－ＴＣＲβ－ｐＡ－プロモーター－ＤＨＦＲ－２Ａ（内在性のＴＲＡＣ ｐＡを使用する）
ＴＣＲβ－２Ａ－ＴＣＲα－ｐＡ－プロモーター－ＤＨＦＲ－２Ａ（内在性のＴＲＡＣ ｐＡを使用する）
ＴＣＲα－２Ａ－ＴＣＲβ－ｐＡ－プロモーター－ＤＨＦＲ－ｐＡ
ＴＣＲβ－２Ａ－ＴＣＲα－ｐＡ－プロモーター－ＤＨＦＲ－ｐＡ
ＴＣＲα－２Ａ－ＴＣＲβ－ｐＡ－プロモーター－ＤＨＦＲ－２Ａ（内在性のＴＲＡＣ ｐＡを使用する）
ＴＣＲβ－２Ａ－ＴＣＲα－ｐＡ－プロモーター－ＤＨＦＲ－２Ａ（内在性のＴＲＡＣ ｐＡを使用する）
少なくとも２要素ヌクレオチド配列の要素は、同じまたは異なるプロモーターから発現させることができる。いくつかの態様では、要素は、同じプロモーターから発現され、遺伝的リンカー（各要素が別個のタンパク質として発現される）またはタンパク質リンカー（連結した要素が単一のタンパク質として発現され、翻訳後に切断されてもされなくてもよい）のいずれかによって連結されている。遺伝子リンカーの例としては、ＩＲＥＳエレメントが挙げられる。タンパク質リンカーの例としては、２Ａまたはグリシン－セリンリンカーが挙げられる。タンパク質はまた、エレメント間のリンカーを含まない融合タンパク質として発現させることもできる。
いくつかの態様では、本明細書で提供する方法のいずれかは、遺伝子改変したＴ細胞を濃縮することへの使用を含む場合がある。それらのＴ細胞において必須のタンパク質は、同じ必須のタンパク質またはそのバリアントをコードする遺伝子改変されたヌクレオチドがそれらの細胞に再導入されない限り、細胞が生存または増殖できないように抑制される。必須のタンパク質の再導入に成功したＴ細胞は、他のノックアウト細胞よりも強い生存優位性を獲得し、経時的に濃縮されるようになる。このことには、（１）任意の導入遺伝子、例えばＴ細胞受容体やキメラ抗原受容体、ならびにＴ細胞の表現型および／または機能を改変するための外因性の遺伝子（例えば、ドミナントネガティブＴＧＦβ受容体、スイッチレセプターなど）のような導入遺伝子の導入、および／または（２）任意のＴ細胞サブセット（ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）など）の使用、が含まれる。
いくつかの態様において、この方法は、広範囲の導入遺伝子を種々の細胞型に送達するために広く適用可能である。この方法は、選抜マーカーとして用いる内在性の遺伝子が細胞に再導入されることを条件として、広範囲の遺伝子改変（遺伝子のノックアウト、ノックインなど）を濃縮するために用いることができる。
いくつかの態様では、本明細書で提供する方法は、以下のうちの１つ以上を提供する。
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ遺伝子を利用して編集し、治療用ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子を発現しているＴ細胞を濃縮するための溶液、
遺伝子改変したＴ細胞を濃縮するための溶液、
抗体を利用しない選抜を可能にする方法、
複雑かつ複数の導入遺伝子の送達を可能にする方法。
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ遺伝子を利用して編集し、治療用ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子を発現しているＴ細胞を濃縮するための溶液、
遺伝子改変したＴ細胞を濃縮するための溶液、
抗体を利用しない選抜を可能にする方法、
複雑かつ複数の導入遺伝子の送達を可能にする方法。
いくつかの態様では、本明細書で提供する方法はいずれも、腫瘍学に加えて全ての治療分野で、例えば、バース症候群、β－サラセミア、嚢胞性線維症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、血友病、鎌状赤血球症、自己免疫疾患および感染症などの分野において、遺伝子改変した細胞の濃縮に適用可能である。
いくつかの態様において、本方法は、ヌクレアーゼやｓｇＲＮＡを発現させるためのベクターの使用を必要としない。いくつかの態様では、ＤＮＡベクターの代わりに、リボヌクレオタンパク質複合体（ヌクレアーゼタンパク質とガイドＲＮＡ）を利用することができる。
いくつかの態様において、この手法は、ヌクレアーゼおよびｓｇＲＮＡの一過的な発現しかもたらさない場合がある。これによって、ゲノムへの持続的な組み込みを回避することができ、そのため、１）遺伝子破壊をもたらし得る無作為な組み込み、および２）細胞に免疫原性または毒性をもたらし得るヌクレアーゼの連続した発現、を回避することが可能になる。
いくつかの態様において、２要素ヌクレオチド配列は、プラスミド、トランスポゾンまたはウイルス媒介性無作為ゲノム組み込みを介したゲノムへの組み込みによって、細胞中で発現される。いくつかの態様において、２要素ヌクレオチド配列は、細胞ゲノムへの標的部位特異的組み込みによって発現される。いくつかの態様において、標的部位特異的組み込みは、ＤＮＡ切断の相同指向性修復によって達成される。このことは、プラスミドまたはウイルスが標的細胞のゲノムにランダムに組み込むことができるため、望ましい場合がある。いくつかの態様において、２要素ヌクレオチド配列は、相同指向性修復に好適な、直鎖二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ナノプラスミド、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）もしくは他の任意のウイルスの、環状、直鎖状の鋳型である。直鎖二本鎖ＤＮＡは、オープンエンドになっていてもクローズドエンドでもよい。
いくつかの態様では、本発明の修復鋳型がゲノムの特定の位置に組み込まれ、それによって、内在性のプロモーターがそれらの発現を駆動するため、この方法は、導入遺伝子と搭載物の発現を駆動するための別個のプロモーターを使用しない。
いくつかの態様において、この方法は、ヌクレアーゼまたは塩基の編集を必ずしも必要としない。その代わりに、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはＣＲＩＳＰＲｉが機能する。
いくつかの態様において、この方法では、ヌクレアーゼの持続的な組み込みを回避する、２本のベクターを用いる系が使用される。ヌクレアーゼを継続して発現させることは害になる可能性があるため、このことは有用となりうる。
いくつかの態様では、２つのプロモーターを利用する必要はなく、導入遺伝子とレスキュー遺伝子の発現を関連づけることができる。いくつかの態様では、導入遺伝子が失われる可能性が低下するため、このことが有益となる場合がある。
いくつかの態様では、本明細書に記載の様々な態様によって、以下のうちの１つ以上を克服することができる。遺伝子のノックイン効率が低い（例えば２０％未満）Ｔ細胞提供者に対処し、ノックイン細胞の選抜を可能にすること；ｃＧＭＰ－生産要件に、より適している手法；細胞に抗生物質選抜マーカーを追加すること；または細胞を追加の抗体選抜方法に暴露することを回避すること。
本明細書に記載のいくつかの態様は、遺伝子改変した細胞を濃縮するための方法に関する。この方法は、ｉ）細胞の生存および／または増殖のために必須の少なくとも１つの第一のタンパク質の活性を、インビトロの通常の繁殖条件下では細胞が生存もおよび／または増殖もできないレベルに低下させることを含む場合がある。この方法はさらに、ｉｉ）細胞中で発現するように操作可能で、第一のタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と第二の発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を導入すること、ここで第二部分のタンパク質は細胞にとって外因性であり、および、ｉｉｉ）第一のタンパク質と第二のタンパク質の両方を発現する細胞を濃縮するために、インビトロの通常の繁殖条件下で細胞を培養すること、を含む場合がある。いくつかの態様において、ステップｉｉｉ）は、第一のタンパク質と第二のタンパク質の両方を発現する細胞の濃縮をもたらすインビトロの繁殖条件下で細胞を培養すること、とすることもできる。
これらの態様において第一のタンパク質は、細胞の生存および／または増殖に必須のタンパク質である。必須のまたは第一のタンパク質は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ２（ＩＭＰＤＨ２）、Ｏ－６－メチルグアニン－ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）、デオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ）、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシル基転移酵素１（ＨＰＲＴ１）、インターロイキン２受容体サブユニットガンマ（ＩＬ２ＲＧ）、アクチンベータ（ＡＣＴＢ）、真核生物翻訳伸長因子１アルファ１（ＥＥＦ１Ａ１）、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ１）、またはトランスフェリン受容体（ＴＦＲＣ）であってよい。必須のタンパク質の活性は、ヌクレオチドまたはタンパク質レベルで抑制することが可能である。必須のタンパク質の活性が抑制されると、培地に何らかの物質が追加されるかまたは、同じ必須のタンパク質をコードしている遺伝子改変されたヌクレオチドがそれらの細胞に再導入されない限り、細胞は、インビトロの通常の繁殖条件下では生存することもまたは増殖することもできない。例えば、ＤＨＦＲが抑制されると、添加剤（ヒポキサンチンやチミジン（ＨＴ））の補充またはこれらの細胞への機能性ＤＨＦＲの再導入がなければ、細胞は増殖できない。
２要素ヌクレオチド配列の第一部分は必須のタンパク質をコードしており、この必須のタンパク質は、変更されたヌクレオチドまたはタンパク質配列を有し、内在性の必須タンパク質の活性を抑制するために用いられた物質に対する耐性を獲得することができるだけでなく、選択されたインビトロの繁殖条件下で細胞が生存または増殖する細胞の能力を回復する能力を有する。２要素ヌクレオチド配列の第二部分は第二のタンパク質をコードしており、第二のタンパク質は、細胞にとって外因性で、そして治療作用を有する場合がある。例えば第二のタンパク質は、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖を含有しているＴＣＲ複合体であってよい。２要素ヌクレオチド配列の一例を図２７Ｂに示す。
２要素ヌクレオチド配列の再導入がうまくいった細胞は必須のタンパク質を発現し、選択されたインビトロの繁殖条件下で生存または増殖する細胞の能力が回復し、それによって他の細胞よりも強い生存優位性を獲得し、経時的に濃縮される。いくつかの態様では、ヌクレオチドの第一部分と第二部分は、細胞中で共発現するように、単一の読み取り枠から発現されるように構成される。従って、濃縮した細胞を、Ｔ細胞治療などの下流の用途に用いることができる。
本明細書に記載のいくつかの態様は、細胞中の生存および／または増殖に必須のタンパク質が抑制されている場合に、遺伝子改変した細胞を選抜するための方法に関する。この方法は、ｉ）細胞中で発現するように操作可能な少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を導入することを含む場合があり、ここで細胞は、生存および／または増殖に必須のタンパク質を有しているが、そのレベルは、選択された培養条件下では細胞が生存もおよび／または増殖もできない程度に抑制されており、ならびに、ここで少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は生存および／または増殖に必須のタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列を含み、第二部分ヌクレオチド配列は細胞にとって外因性のタンパク質をコードしている。この方法はさらに、ｉｉ）第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現する細胞の選抜を導く細胞培養条件下で細胞を培養することを含む場合がある。
これらの態様では、２要素ヌクレオチド配列の再導入が成功した細胞は他の細胞よりも強い生存優位性を獲得し、経時的に濃縮される。いくつかの態様では、改変した細胞の選抜は、一般的な細胞培養用の培地中でも可能である。いくつかの態様において、一般的な細胞培養用の培地とは、改変されていない細胞の成長および／または増殖に好適な培地である。例えば、Ｔ細胞に適した一般的な培地には、サーモフィッシャーサイエンティフィックから入手可能なＲＰＭＩ １６４０がある。
いくつかの態様において、一般的な細胞培養用の培地は、フローサイトメトリーまたは磁気ビーズ濃縮による細胞の濃縮を可能にする薬剤分子、抗体、または任意の特定の添加剤のような外因性の選択圧を含まない。いくつかの態様において、改変した細胞の選抜は、外因性の選択圧をもたらす成分を細胞培養用の培地に追加することに基づいて可能になる。いくつかの態様では、外因性の選択圧によって、細胞の生存および／または増殖必須のタンパク質が抑制される。いくつかの態様において、外因性の選択圧は、細胞培養用の培地にメトトレキサートを追加することに基づく。
いくつかの態様では、活性の低下は持続的であっても一過的であってもよい。いくつかの態様において、活性の低下または抑制は、細胞中の必須のタンパク質の量またはレベルを持続的にまたは一過的に低減することによって達成される。いくつかの態様では、タンパク質レベルは同等に保たれるが、タンパク質の機能性が低下または抑制される。いくつかの態様において、活性の低下または抑制は、細胞中のタンパク質レベルの低減を伴うまたは伴わずに、細胞の機能活性を持続的にまたは一過的に低減することによって達成される。いくつかの態様において、活性の低下または抑制は、細胞中のタンパク質レベルを別個に変化させることを伴うまたは伴わずに、細胞の機能活性を持続的にまたは一過的に低減することによって達成される。持続性の態様では、必須のタンパク質をコードしている遺伝子をノックアウトし、細胞ゲノムから必須の遺伝子を永久に除去することもできる。いくつかの態様において、ノックアウトは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）、ＴＡＬＥＮ、ＭｅｇａＴＡＬ、または他の任意のヌクレアーゼによって媒介される。
一過性の態様では、必須のタンパク質の活性を一過的に抑制することができる。いくつかの態様では、一過性の抑制はｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）を介するものであり、必須のタンパク質の活性はＲＮＡレベルで抑制される。いくつかの態様では、一過性の抑制はタンパク質阻害剤を介するものであり、必須のタンパク質の活性はタンパク質レベルで抑制される。必須のタンパク質の活性は、細胞の成長／培養環境から、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）、またはタンパク質阻害剤が除去されると回復する。
いくつかの態様では、必須のタンパク質はＤＨＦＲであり、一過性の抑制はメトトレキサートによって引き起こされる。メトトレキサートはＤＨＦＲを競合的に阻害するタンパク質阻害剤で、ＤＨＦＲは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、チミジル酸、およびタンパク質の合成に必要だと考えられているテトラヒドロ葉酸の合成に関与する酵素である。従って、ＤＨＦＲが抑制された細胞は、生存もまたは増殖もできなくなる。
いくつかの態様において、細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ｉＮＫＴ細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、ｉＰＳＣ、神経系前駆細胞、網膜の遺伝子治療に関わる細胞型、または他の任意の細胞である。
いくつかの態様では、第一部分のヌクレオチド配列は、ヌクレアーゼ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはＣＲＩＳＰＲｉ耐性を獲得するように、そのヌクレオチド配列が変更されているが、第一のタンパク質と同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしている。例えば配列番号１（図３４）は、内在性ＤＨＦＲ遺伝子のヌクレオチド配列に変更が加えられた、第一部分ヌクレオチド配列である。配列番号１は、内在性ＤＨＦＲ遺伝子の特定のヌクレオチドを点突然変異させることによって作製される。変更されたヌクレオチド配列によって、配列番号１にヌクレアーゼ耐性が付与される。しかしながら、配列番号１によってコードされるＤＨＦＲタンパク質は内在性のＤＨＦＲタンパク質と同一のアミノ酸配列を有するため、同一の機能をもつ。
いくつかの態様において、第一部分ヌクレオチド配列は、第一のタンパク質と同一のアミノ酸配列をもたない変異タンパク質をコードするように、そのヌクレオチド配列が変更される。変異タンパク質は、第一のタンパク質に対して調整される機能を有する場合がある。いくつかの態様において、変異タンパク質は、第一のタンパク質がもたない特性を有する。いくつかの態様において、特性には、これらに限定されるものではないが、活性の低下、活性の増強、半減期の違い、低分子阻害に対する耐性、および低分子が結合した後の活性の増強のうちの１つ以上が含まれる。例えば、配列番号２（図３５）は、内在性ＤＨＦＲ遺伝子の特定のヌクレオチドを点突然変異させることによって作製され、その結果配列番号２は、内在性のＤＨＦＲとは異なるアミノ酸配列を有する変更されたＤＨＦＲタンパク質をコードしている。変更されたＤＨＦＲタンパク質は内在性のＤＨＦＲと同様の活性を有するが、タンパク質阻害剤であるＭＴＸに対する耐性をもつ。
いくつかの態様では、少なくとも１つのヌクレオチド配列は、第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現するように操作可能である。ヌクレオチド配列は、遺伝子を転写するための全要素を有する時に、発現するよう操作可能である。これらの要素には、これらに限定されるものではないが、プロモーター、エンハンサー、ＴＡＴＡボックス、およびポリ（Ａ）終結シグナルなどが含まれる。いくつかの態様では、これらのうちの１つ以上が任意で選択される。いくつかの態様では、第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を、同じプロモーターによってもまたは異なるプロモーターによっても駆動することができる。
いくつかの態様では、２要素ヌクレオチド配列は、第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を細胞中で発現させることができる。ヌクレオチド配列は、標的ゲノム中の予め決められた部位に挿入された時に、（ｉ）細胞中で発現するよう操作可能であるか、または（ｉｉ）発現するように操作可能な状態になり、これは、ヌクレオチド配列が遺伝子を転写するための全要素を有するようになるか、またはそれらと操作可能に結合されるためである。これらの要素としては、これらに限定されるものではないが、プロモーター、エンハンサー、ＴＡＴＡボックス、およびポリ（Ａ）終結シグナルなどが含まれる。発現に関する全ての状況で、全ての要素が必ずしも必要とされるものではない。いくつかの態様では、第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を、同じプロモーターおよび／もしくは上流配列（例えばエンハンサー）から、または異なるプロモーターおよび／もしくは上流配列（例えばエンハンサー）から駆動することができる。
いくつかの態様では、第二部分ヌクレオチド配列は少なくとも１つの治療用遺伝子を含む。治療用遺伝子とは、疾患の治療に薬剤として用いられる遺伝子である。例えば、特定の腫瘍抗原を標的とするＴ細胞受容体をコードしている遺伝子を治療用遺伝子として用いることができる。いくつかの態様において、第二部分ヌクレオチド配列は、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖を含有している新生抗原Ｔ細胞受容体複合体（ＴＣＲ）をコードしている。
いくつかの態様では、第一部分ヌクレオチド配列はヌクレアーゼ耐性、ｓｉＲＮＡ耐性、またはタンパク質阻害剤耐性ＤＨＦＲ遺伝子を含み、第二部分ヌクレオチド配列はＴＲＡ遺伝子とＴＲＢ遺伝子を含む。例えば、配列番号３（図３６）は野生型ヒトＤＨＦＲをコードするＤＮＡ配列であり；配列番号４（図３７）は、野生型のヒトＤＨＦＲコードしている、コドン最適化された、ヌクレアーゼ耐性のＤＮＡ配列であり；配列番号５（図３８）は、ＭＴＸ耐性ヒトＤＨＦＲ変異体をコードしている、コドン最適化されたＤＮＡ配列である。いくつかの態様では、タンパク質阻害剤耐性ＤＨＦＲ遺伝子はメトトレキサート耐性ＤＨＦＲ遺伝子である。
いくつかの態様では、ＴＲＡ、ＴＲＢ、およびＤＨＦＲの遺伝子は単一の読み取り枠から発現するように操作可能に構成されている。この構成の利点の１つとしては、細胞がＤＨＦＲを発現して一般的な細胞培養用の培地中で生存する場合、この細胞はＴＲＡおよびＴＲＢ遺伝子も発現しているため、下流の用途、例えばＴＣＲ治療に用いることができるということが挙げられる。
いくつかの態様では、ＴＲＡ、ＴＲＢ、およびＤＨＦＲの遺伝子はリンカーによって隔てられている。これらのリンカーによって、単一の読み取り枠の制御下にある複数の遺伝子を発現させることができる。いくつかの態様では、リンカー、ＴＲＡ、ＴＲＢ、およびＤＨＦＲの遺伝子順番は以下の通りである。
ＴＲＡ－リンカー－ＴＲＢ－リンカー－ＤＨＦＲ、
ＴＲＡ－リンカー－ＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＢ、
ＴＲＢ－リンカー－ＴＲＡ－リンカー－ＤＨＦＲ、
ＴＲＢ－リンカー－ＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＡ、
ＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＡ－リンカー－ＴＲＢ、または
ＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＢ－リンカー－ＴＲＡ。
ＴＲＡ－リンカー－ＴＲＢ－リンカー－ＤＨＦＲ、
ＴＲＡ－リンカー－ＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＢ、
ＴＲＢ－リンカー－ＴＲＡ－リンカー－ＤＨＦＲ、
ＴＲＢ－リンカー－ＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＡ、
ＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＡ－リンカー－ＴＲＢ、または
ＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＢ－リンカー－ＴＲＡ。
いくつかの態様において、リンカーは、自己切断２ＡペプチドまたはＩＲＥＳエレメントである。自己切断２ＡペプチドとＩＲＥＳエレメントはいずれも、単一の読み取り枠の制御下にある複数の遺伝子を発現させることができる。
いくつかの態様において、ＤＨＦＲ、ＴＲＡ、およびＴＲＢの遺伝子は、内在性のＴＣＲプロモーターまたは他の任意の好適なプロモーターによって駆動される。他の任意の好適なプロモーターとしては、これらに限定されるものではないが、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１／２、ＤＨＦＲ、ＥＥＦ１Ａ１、ＡＣＴＢ、Ｂ２Ｍ、ＣＤ５２、ＣＤ２、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＬＣＫ、ＬＡＴ、ＰＴＰＲＣ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＴＧＢ２、ＴＧＦＢＲ２、ＰＤＣＤ１、ＣＴＬＡ４、ＦＡＳ、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ（ＴＮＦＲ１）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＴＲＡＩＬＲ２）、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＢＴＬＡ、ＣＤ２００Ｒ１、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＨＡＶＣＲ２（ＴＩＭ３）、ＶＳＩＲ（ＶＩＳＴＡ）、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ４ＲＡ、ＥＩＦ４Ａ１、ＦＴＨ１、ＦＴＬ、ＨＳＰＡ５、およびＰＧＫ１などが挙げられる。
いくつかの態様では、２要素ヌクレオチド配列は細胞ゲノムに組み込まれる。いくつかの態様において、組み込みは、ヌクレアーゼ媒介性部位特異的組み込み、トランスポゾン媒介性遺伝子送達、またはウイルス媒介性遺伝子送達を介する。いくつかの態様では、ヌクレアーゼ媒介性部位特異的組み込みはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ＲＮＰ を介する。いくつかの態様はさらに、スプリットインテインシステムを利用することを含み、ここで必須のタンパク質または第一のタンパク質は機能不全なＮ末端およびＣ末端タンパク質部分に分割され、それぞれの部分はホモもしくはヘテロ二量体化タンパク質パートナーまたはスプリットインテインに融合される。それによって、同じ細胞中で両方のタンパク質部分が共発現している時にのみ、必須のタンパク質または第一のタンパク質の機能的再構築が可能になる。いくつかの態様では、必須のまたは第一のタンパク質はＤＨＦＲタンパク質である。（ペルティエＪＮ、キャンベル－ベロワＦＸ、ミクニックＳＷ 合理的に設計した断片からの活性型ジヒドロ葉酸還元酵素のオリゴマー化ドメイン指向型再構築（Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｆｒｏｍ ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．）米国科学アカデミー紀要、１９９８年１０月１３；９５（２１）：１２１４１－６；およびレミーＩ、ミクニックＳＷ タンパク質－フラグメントアッセイを用いた、タンパク質相互作用のクローン選抜およびインビボでの定量化（Ｃｌｏｎａｌ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙｓ．）米国科学アカデミー紀要、１９９９年５月１１；９６（１０）：５３９４－９、これらはいずれも、いかなる目的においても、参照することによりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。）
いくつかの態様では、導入される２要素ヌクレオチド配列は細胞ゲノムに組み込まれない。
いくつかの態様では、内在性のＴＣＲ定常部位、ヌクレアーゼ耐性ＤＨＦＲ遺伝子をコードしている第一部分ヌクレオチド配列、および新生抗原ＴＣＲをコードしている第二部分ヌクレオチド配列を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰが細胞に送達される。いくつかの態様において、内在性のＴＣＲ定常部位は、ＴＣＲα定常（ＴＲＡＣ）部位であってもまたはＴＣＲβ定常（ＴＲＢＣ）部位であってもよい。いくつかの態様において、送達は、エレクトロポレーション、または機械的もしくは化学的な膜透過処理に基づく方法によって行われる、
いくつかの態様では、第一のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰは内在性のジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子をノックアウトするために用いられ、第二のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ耐性ＤＨＦＲ遺伝子を含有している第一部分ヌクレオチド配列と治療用ＴＣＲ遺伝子をコードしている第二部分ヌクレオチド配列を、内在性のＴＣＲ定常部位にノックインするために用いられる。これらの態様では、内在性のジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）は発現せず、導入されたヌクレアーゼ耐性ＤＨＦＲ遺伝子はそのヌクレオチド配列に変更を有しているが、対応するタンパク質配列は変更されない。いくつかの態様において、第二のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰは、ノックインのためにＴＲＡＣ遺伝子座を切断するＴＲＡＣ ＲＮＰである。
いくつかの態様では、第一のタンパク質を阻害するためにメトトレキサートが用いられ、メトトレキサート耐性ＤＨＦＲタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と治療用ＴＣＲ遺伝子とを含有している第二部分ヌクレオチド配列を、内在性のＴＣＲ定常部位にノックインするためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰが用いられる。これらの態様では、内在性の第一のタンパク質はまだ発現しているが、その活性はメトトレキサートによって阻害され；また、導入されるヌクレオチド配列は、メトトレキサート耐性ＤＨＦＲタンパク質をコードしている。
本明細書に記載のいくつかの態様は、本明細書で開示のいずれかの方法によって作製される細胞に関する。
いくつかの態様において、細胞は、ｉ）一般的な細胞培養用の培地中では細胞が生存もおよび／または増殖もできないレベルまで抑制された内在性のジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、およびｉｉ）ＤＨＦＲをコードしている第一部分ヌクレオチド配列と新生抗原Ｔ細胞受容体複合体をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含有している少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列、を含む。
本明細書に記載のいくつかの態様は、遺伝子改変した細胞を濃縮するための方法に関する。この方法は、ｉ）細胞中で発現するように操作可能で、かつ、第一のタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と第二の発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を導入すること、ここで第二部分タンパク質は細胞にとって外因性であり；ならびに、ｉｉ）第一のタンパク質と第二のタンパク質の両方を発現している細胞を濃縮するために、少なくとも１つの添加剤を含有している細胞培養用の培地中で細胞を培養すること；を含む場合がある。
いくつかの態様では、遺伝子改変した細胞は初代ヒトＴ細胞である。いくつかの態様では、添加剤が、第一のタンパク質と第二のタンパク質の両方を発現していない細胞の生存および／または増殖を損傷する。いくつかの態様では、少なくとも１つのタンパク質が、添加剤を介した細胞の生存および／または増殖の損傷に対する細胞の耐性を媒介する。いくつかの態様では、添加剤はメトトレキサートである。いくつかの態様では、第一のタンパク質はメトトレキサート耐性ＤＨＦＲ変異型タンパク質である。
いくつかの態様では、第二のタンパク質はＴ細胞受容体である。いくつかの態様において、Ｔ細胞受容体はウイルス性抗原または腫瘍抗原に特異的である。いくつかの態様では、ヌクレアーゼ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはＣＲＩＳＰＲｉ耐性を獲得するように、第一部分ヌクレオチド配列のヌクレオチド配列が変更される。
いくつかの態様では、少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、細胞の内在性遺伝子座に部位特異的に組み込まれることによって発現される。いくつかの態様において、細胞の内在性遺伝子座への部位特異的組み込みは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、ＭｅｇａＴＡＬまたは、遺伝子座に痕跡を残さずに組み込むことができ、遺伝子座の内在性プロモーターからの発現を可能にする他の任意のヌクレアーゼによって達成される。
いくつかの態様では、ヌクレアーゼによって、内在性のプロモーター、内在性のスプライス部位、および内在性の転写終結シグナルからの発現が可能になるように、２要素ヌクレオチド配列を遺伝子座のエクソンにインフレームで組み込むことができる。この配置では、２要素ヌクレオチド配列の発現を制御している要素は、全て内在性の要素である。エクソンへの組み込みとは、２要素ヌクレオチド配列が遺伝子座のエクソン内に組み込まれる状況を指す。これらの態様のいくつかに関する模式図を図２４に示す。
いくつかの態様では、ヌクレアーゼによって、内在性のプロモーター、内在性のスプライス部位、および外因性の転写終結シグナルからの発現が可能になるように、２要素ヌクレオチド配列を遺伝子座のエクソンにインフレームで組み込むことができる。この配置では、２要素ヌクレオチド配列の発現を制御している要素は、内在性の要素と外因性の要素の混合である。これらの態様のいくつかに関する模式図を図２５に示す。
いくつかの態様では、ヌクレアーゼによって、内在性のプロモーター、外因性のスプライス受容部位、および外因性の転写終結シグナルからの発現が可能になるように、２要素ヌクレオチド配列を遺伝子座のイントロンに組み込むことができる。この配置では、２要素ヌクレオチド配列の発現を制御している要素は、内在性の要素と外因性の要素の混合である。イントロンへの組み込みとは、２要素ヌクレオチド配列が遺伝子座のイントロン内に組み込まれる状況を指す。これらの態様に関する模式図を図２６に示す。
いくつかの態様では、メトトレキサート耐性ＤＨＦＲ変異型タンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と治療用ＴＣＲ遺伝子を含有している第二部分ヌクレオチド配列を内在性のＴＣＲ定常部位にノックインするために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰが用いられる。
いくつかの態様はさらに、内在性のＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子をノックアウトするための用いられる第二のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰを含む。
本明細書に記載のいくつかの態様は、遺伝子改変したＴ細胞を濃縮するための方法に関する。この方法は、ｉ）メトトレキサート耐性ＤＨＦＲタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列とＴ細胞受容体複合体またはキメラ抗体受容体をコードしている第二部分ヌクレオチド配列を含有している２要素ヌクレオチド配列を、２要素ヌクレオチド配列をＴＲＡまたはＴＲＢプロモーターの下流に組み込むことによって、Ｔ細胞に導入すること；ならびに、ｉｉ）第一のタンパク質と第二のタンパク質の両方を発現している細胞を濃縮するために、メトトレキサート（２５ｎＭ～１００ｎＭ）を含有している細胞培養用の培地中で細胞を培養すること；を含む。
本明細書に記載のいくつかの態様は、外因性のＴ細胞受容体遺伝子を発現するよう改変したＴ細胞を濃縮するための方法に関する。この方法は、ｉ）第一のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰを利用して、内在性のＴＲＢＣ遺伝子をその遺伝子座からノックアウトすること；ｉｉ）第二のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰを利用して、メトトレキサート耐性ＤＨＦＲ遺伝子をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と治療用ＴＣＲ遺伝子とを含有している第二部分ヌクレオチド配列を、内在性のＴＲＡＣ遺伝子座にノックインすること、ここで、両方のヌクレオチド配列は、内在性のＴＲＡＣプロモーターから発現させることができるように操作可能に連結され；ならびに、ｉｉｉ）治療用ＴＣＲとメトトレキサート耐性ＤＨＦＲ遺伝子の両方を発現するＴ細胞を濃縮するために、メトトレキサートを含有している細胞培養用の培地中で細胞を培養すること；を含む。
本明細書に記載のいくつかの態様はＴ細胞に関し、このＴ細胞は、ｉ）メトトレキサート存在下では、細胞が生存もおよび／または増殖もできないレベルまで抑制される内在性のジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、およびｉｉ）メトトレキサート耐性ＤＨＦＲタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、内在性のＴＲＡまたはＴＲＢプロモーターから操作可能に発現するＴ細胞受容体をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含有している少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列、を含む。
いくつかの態様において、遺伝子改変した細胞を選抜するための方法は、ｉ）細胞中で発現するように操作可能な少なくとも２つの２要素ヌクレオチド配列を導入すること、を含む。細胞は、生存および／または増殖に必須のタンパク質を有しているが、そのレベルは、細胞が生存もおよび／または増殖もできない程度に抑制されている。第一の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖に必須のタンパク質の非機能性部分を第一の結合ドメインに融合させた第一の融合タンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含む。第二の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖に必須のタンパク質の非機能性部分を第二の結合ドメインに融合させた第二の融合タンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含む。第一および第二の融合タンパク質の両方を細胞内で一緒に発現させることができ、その共発現によって、生存および／または増殖に必須のタンパク質の機能が回復する。この方法はさらに、ｉｉ）第一および第二の２要素ヌクレオチド配列の両方を発現する細胞を選抜するための条件下で、細胞を培養することを含む。いくつかの態様では、前述した過程の１つ以上を、繰り返すおよび／または省略するおよび／または本明細書で提供する他の態様のいずれかで改変することができる。
いくつかの態様において、遺伝子改変した細胞を濃縮するための方法は、ｉ）細胞の生存および／または増殖に必須の少なくとも１つの第一のタンパク質の活性を、インビトロの通常の繁殖条件下では細胞が生存もおよび／または増殖もできないレベルに低減させること；ならびに、ｉｉ）細胞中で発現するように操作可能な少なくとも２つの２要素ヌクレオチド配列を導入すること；を含む。第一の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖に必須のタンパク質の非機能性部分を第一の結合ドメインに融合させた第一の融合タンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含む。第二の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖に必須のタンパク質の非機能性部分を第二の結合ドメインに融合させた第二の融合タンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含む。第一および第二の融合タンパク質の両方を細胞内で一緒に発現させることができ、その共発現によって、生存および／または増殖に必須のタンパク質の機能が回復する。この方法はさらに、ｉｉｉ）第一の融合タンパク質と第二の融合タンパク質の両方を発現する細胞を濃縮するために、インビトロの繁殖条件下で細胞を培養することを含む場合がある。いくつかの態様では、前述した過程の１つ以上を、繰り返すおよび／または省略するおよび／または本明細書で提供する他の態様のいずれかで改変することができる。
本明細書に記載のいくつかの態様は、遺伝子改変した細胞を選抜するための方法に関する。本明細書で使用する場合、「細胞」という用語は、任意の単一細胞、複数の細胞、または任意の生物に由来の細胞型を指し得る。いくつかの態様では、細胞は真核細胞である。いくつかの態様では、細胞は哺乳類の細胞である。いくつかの態様において、細胞は、初代細胞であるかまたは一次組織に由来する。いくつかの態様において、細胞は、確立された細胞株に由来する。いくつかの態様において、細胞は、マウス、ラット、非ヒト霊長類、またはヒトの細胞である。細胞が、任意の細胞、組織、器官、または臓器系のいずれに由来してもよいと理解される。細胞の非限定的な例としては、Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＡＲ Ｔ細胞、Ｂ細胞、免疫細胞、神経細胞、筋細胞、上皮細胞、結合組織細胞、幹細胞、骨細胞、血液細胞、内皮細胞、脂肪細胞、性細胞、腎細胞、肺細胞、脳細胞、心細胞、根毛細胞、膵臓細胞、およびガン細胞が挙げられる。
いくつかの態様において、この方法は、細胞中で発現するように操作可能な少なくとも１つのヌクレオチド配列を導入することを含む。いくつかの態様において、この方法は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも１０の配列、または少なくとも２０のヌクレオチド配列を導入することを含む。
いくつかの態様では、少なくとも１つのヌクレオチド配列は１つの部分を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのヌクレオチド配列は、少なくとも２つの部分を含む。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列は、少なくとも３つの部分を含む。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列は、少なくとも４つの部分を含む。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列は、少なくとも５つの部分を含む。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列は、１０の部分を含む。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列は、２０の部分を含む。
いくつかの態様では、細胞の生存および／または増殖に必須の少なくとも１つのタンパク質および／または細胞内プロセスは、細胞内で、その細胞が独力では生存もおよび／または増殖もできないレベルに抑制される。当業者であれば、「必須の」タンパク質または細胞内プロセスが、所与の細胞の、成長、複製、細胞周期、遺伝子制御（ＤＮＡ修復、転写、翻訳、および複製を含む）、ストレス応答、代謝、アポトーシス、栄養素の獲得、タンパク質のターンオーバー、細胞表面の完全性、必須の酵素活性、生存、またはこれらの任意の組み合わせに影響を及ぼす任意のタンパク質または細胞内プロセスであってよいことを理解されよう。また「抑制」という用語は、細胞死、代謝の停止、細胞周期の停止、ストレス誘導、タンパク質のターンオーバーの停止、ＤＮＡストレス、および／または成長の停止の１つ以上が対照と比較して優位に高まることから、対照と比較して完全な細胞死、代謝の停止、細胞周期の停止、ストレス誘導、タンパク質のターンオーバーの停止、ＤＮＡストレス、および／または成長の停止が生じることに起因するいずれの表現型に対しても適用され得ると理解される。いくつかの態様において、抑制は、部分的であってもまたは完全であってもよい（例えばタンパク質のレベルまたはその機能活性は、少なくともおよそ検出できる量で、例えば、これらには限定されないが、５０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％低減され得る）。いくつかの態様において、抑制は、細胞内のタンパク質のレベルまたは量を低減させること（例えば、ノックアウト、遺伝子サイレンシング、ｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲｉ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）で達成される。いくつかの態様において、抑制は、細胞中のタンパク質レベルの低減を伴うまたは伴わずに、タンパク質の機能活性を低減すること（例えば、タンパク質機能の低分子阻害剤、結合を阻止する抗体、タンパク質の機能を低減する変異）で達成される。
いくつかの態様において、ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖に必須のタンパク質の非機能性部分を結合ドメインに融合させた融合タンパク質をコードしている少なくとも１つの配列を含む。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列の第一部分は、生存および／または増殖に必須のタンパク質の非機能性部分を結合ドメインに融合させた融合タンパク質をコードしている少なくとも１つの配列を含む。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列の第二部分は、少なくとも１つの発現させたいタンパク質をコードしている少なくとも１つの配列を含む。
いくつかの態様において、ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖に必須のタンパク質の第二の非機能性部分を第二の結合ドメインに融合させた第二の融合タンパク質をコードしている少なくとも１つの配列と、少なくとも１つの発現させたいタンパク質をコードしている第二のヌクレオチド配列とを含む。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列の第二部分は、生存および／または増殖に必須のタンパク質の第二の非機能性部分を第二の結合ドメインに融合させた第二の融合タンパク質をコードしている少なくとも１つの配列と、少なくとも１つの発現させたいタンパク質をコードしている第二のヌクレオチド配列とを含む。いくつかの態様において、融合タンパク質は、細胞内で一緒に発現した時に、少なくとも１つの必須のタンパク質の発現を成功させる。これによって、細胞は必須のタンパク質の機能を取り戻し、細胞が生存することが可能になる。本明細書で開示する多くの実施例は、２つの融合タンパク質の組み合わせに関するが、当業者は、本明細書で開示するのと同じ方法を、少なくとも１つの必須のタンパク質とうまく組み合わせることのできる多数の様々な融合タンパク質のもとで用いることが可能であることを理解できる。
本明細書で開示するように、いくつかの態様では、細胞内で第一および第二の融合タンパク質が一緒に発現すると、少なくとも１つの生存および／または増殖に必須のタンパク質の機能が回復する。いくつかの態様では、細胞内で第一および第二の融合タンパク質が一緒に発現すると、少なくとも１つの生存および／または増殖に必須の細胞内プロセスが回復する。いくつかの態様において、この少なくとも１つの必須のタンパク質または細胞内プロセスは、抑制されたタンパク質または細胞内プロセスと同じ必須のタンパク質または細胞内プロセスである。いくつかの態様において、少なくとも１つの必須のタンパク質は、抑制されたタンパク質と同様の活性を有する。いくつかの態様では、少なくとも１つの必須のタンパク質は、少なくとも１つの抑制された細胞内経路またはプロセスにおいて機能する。いくつかの態様では、少なくとも１つの必須のタンパク質は、少なくとも２つの必須の細胞内経路またはプロセスにおいて機能する。いくつかの態様では、少なくとも１つの必須のタンパク質が発現することによって、抑制されたタンパク質および／または細胞内プロセスの抑制型の表現型が、緩和、活性化、回復または軽減される。いくつかの態様では、少なくとも１つの必須のタンパク質の発現に際して、細胞の生存および／または増殖が増強される。いくつかの態様では、少なくとも１つの必須のタンパク質の発現に際して、細胞の生存および／または増殖が完全に回復する。
いくつかの態様において、この方法はさらに、細胞の選抜を導く条件下で細胞を培養することを含む。いくつかの態様において、選抜は、ヌクレオチド配列上にコードされた少なくとも１つの必須のタンパク質が発現することを含む。いくつかの態様において、選抜は、ヌクレオチド配列上にコードされた第一および第二の２要素ヌクレオチド配列の両方が発現することを含む。
いくつかの態様では、必須のタンパク質はＤＨＦＲタンパク質である。いくつかの態様において、必須のタンパク質は、ＤＨＦＲと少なくともおよそ７５％、少なくともおよそ８０％、少なくともおよそ８５％、少なくともおよそ９０％、少なくともおよそ９５％、少なくともおよそ９９％、またはおよそ１００％同一なタンパク質である。いくつかの態様では、タンパク質は哺乳類のＤＨＦＲである。いくつかの態様では、タンパク質はヒトＤＨＦＲである。いくつかの態様では、タンパク質はＤＨＦＲ類似体である。
いくつかの態様では、ヌクレオチド配列は細胞にとって外因性である。いくつかの態様では、第一および／または第二の２要素ヌクレオチド配列いずれかのヌクレオチド配列が、細胞にとって外因性である。いくつかの態様では、第一および／または第二の２要素ヌクレオチド配列いずれかの第一部分ヌクレオチド配列が、細胞にとって外因性である。いくつかの態様では、第一または第二の２要素ヌクレオチド配列いずれかの第二部分ヌクレオチド配列が、細胞にとって外因性である。いくつかの態様では、第一および／または第二の２要素ヌクレオチド配列のヌクレオチド配列はＴＣＲである。いくつかの態様では、第一および／または第二の２要素ヌクレオチド配列の第一部分ヌクレオチド配列がＴＣＲである。いくつかの態様では、第一および／または第二の２要素ヌクレオチド配列の第二部分ヌクレオチド配列が、ＴＣＲである。
いくつかの態様では、第一および／または第二の結合ドメインのうちの少なくとも１つは、ＧＣＮ４に由来する。いくつかの態様において、結合ドメインは、ＧＣＮ４と少なくともおよそ７５％、少なくともおよそ８０％、少なくともおよそ８５％、少なくともおよそ９０％、少なくともおよそ９５％、少なくともおよそ９９％、またはおよそ１００％同一なタンパク質に由来する。いくつかの態様において、結合ドメインは、哺乳類ＧＣＮ４のタンパク質に由来する。いくつかの態様において、結合ドメインは、ヒトＧＣＮ４のタンパク質に由来する。いくつかの態様において、結合ドメインは、ＧＣＮ４類似体のタンパク質に由来する。
いくつかの態様では、第一および／または第二の結合ドメインのうちの少なくとも１つはＦＫＢＰ１２に由来する。いくつかの態様において、結合ドメインは、ＦＫＢＰ１２と少なくともおよそ７５％、少なくともおよそ８０％、少なくともおよそ８５％、少なくともおよそ９０％、少なくともおよそ９５％、少なくともおよそ９９％、またはおよそ１００％同一なタンパク質に由来する。いくつかの態様において、結合ドメインは、哺乳類ＦＫＢＰ１２のタンパク質に由来する。いくつかの態様において、結合ドメインは、ヒトＦＫＢＰ１２のタンパク質に由来する。いくつかの態様において、結合ドメインは、ＦＫＢＰ１２類似体のタンパク質に由来する。いくつかの態様では、ＦＫＢＰ１２はＦ３６Ｖ変異を有する。いくつかの態様では、ＦＫＢＰ１２の結合が誘導される。（ストラートフＫＣ、ピュールＭＡ、ヨトンダＰ、ドティＧ、バニンＥＦ、ブレナーＭＫ、ヘスロプＨＥ、スペンサーＤＭ、ルーニーＣＭ Ｔ細胞治療のための誘導性カスパーゼ９安全スイッチ（Ａｎ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｃａｓｐａｓｅ ９ ｓａｆｅｔｙ ｓｗｉｔｃｈ ｆｏｒ Ｔ－ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ．）血液（Ｂｌｏｏｄ、米国血液学学会誌）２００５年６月１；１０５（１１）：４２４７－５４、これらは、いかなる目的においても、参照することによりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。）
いくつかの態様では、第一および／または第二の結合ドメインのうちの少なくとも１つはＪＵＮに由来する。いくつかの態様において、結合ドメインは、ＪＵＮと少なくともおよそ７５％、少なくともおよそ８０％、少なくともおよそ８５％、少なくともおよそ９０％、少なくともおよそ９５％、少なくともおよそ９９％、またはおよそ１００％同一なタンパク質に由来する。いくつかの態様において、結合ドメインは、哺乳類ＪＵＮのタンパク質に由来する。いくつかの態様において、結合ドメインは、ヒトＪＵＮのタンパク質に由来する。いくつかの態様において、結合ドメインは、ＪＵＮ類似体のタンパク質に由来する。
いくつかの態様では、第一および／または第二の結合ドメインのうちの少なくとも１つはＦＯＳに由来する。いくつかの態様において、結合ドメインは、ＦＯＳと少なくともおよそ７５％、少なくともおよそ８０％、少なくともおよそ８５％、少なくともおよそ９０％、少なくともおよそ９５％、少なくともおよそ９９％、またはおよそ１００％同一なタンパク質に由来する。いくつかの態様において、結合ドメインは、哺乳類ＦＯＳのタンパク質に由来する。いくつかの態様において、結合ドメインは、ヒトＦＯＳのタンパク質に由来する。いくつかの態様において、結合ドメインは、ＦＯＳ類似体のタンパク質に由来する。いくつかの態様では、第一の結合ドメインはＪＵＮに由来し、および第二の結合ドメインはＦＯＳに由来する。いくつかの態様では、ＪＵＮおよびＦＯＳは相補的な変異を有し、それによって、野生型のＪＵＮおよびＦＯＳに対するよりも、相補的な変異を有するもの同士の結合が促進される。（グローバーＪＮ、ハリソンＳＣ ＤＮＡに結合したヘテロ二量体化ｂＺＩＰ転写因子ｃ－Ｆｏｓ－ｃ－Ｊｕｎの結晶構造（Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ ｂＺＩＰ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｃ－Ｆｏｓ－ｃ－Ｊｕｎ ｂｏｕｎｄ ｔｏ ＤＮＡ）ネイチャー１９９５年１月１９；３７３（６５１１）：２５７－６１；グローバーおよびハリソン、ネイチャー、１９９５；ジェロームおよびミュラー、遺伝子治療（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ）２００１；ジェロームＶ、ミュラーＲ 複数のプロモーター特性を結合させるための、人工ロイシンジッパーを用いた二量体化システム（Ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｌｅｕｃｉｎｅ ｚｉｐｐｅｒ－ｂａｓｅｄ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ．）遺伝子治療。２００１年５月８（９）：７２５－９；これらはいずれも、いかなる目的においても、参照することによりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。）
いくつかの態様では、第一の結合ドメインおよび第二の結合ドメインは、互いへの結合を保持する相補的な変異を有する。いくつかの態様では、第一の結合はドメイン天然の結合パートナーとは結合しない。いくつかの態様では、第二の結合ドメインは天然の結合パートナーとは結合しない。いくつかの態様では、第一の結合ドメインまたは第二の結合ドメインのいずれもが、天然の結合パートナーとは結合しない。いくつかの態様では、第一の結合ドメインおよび／または第二の結合ドメインのうちの少なくとも１つは３～７つの相補的な変異を有する。いくつかの態様では、第一の結合ドメインおよび／または第二の結合ドメインのうちの少なくとも１つは３つ以上の相補的な変異を有する。いくつかの態様では、第一の結合ドメインおよび／または第二の結合ドメインのうちの少なくとも１つは４つ以上の相補的な変異を有する。いくつかの態様では、第一の結合ドメインおよび／または第二の結合ドメインのうちの少なくとも１つは５つ以上の相補的な変異を有する。いくつかの態様では、第一の結合ドメインおよび／または第二の結合ドメインのうちの少なくとも１つは６つの相補的な変異を有する。いくつかの態様では、第一の結合ドメインおよび／または第二の結合ドメインのうちの少なくとも１つは７つの相補的な変異を有する。いくつかの態様では、第一の結合ドメインは第二の結合ドメインとは異なる数の相補的な変異を有する。いくつかの態様では、相補的な変異は、対となる電荷は構造中で維持されるが、残基間で電荷の位置が入れ替わる、１つ以上の電荷対（または電荷転換）変異である。例えば、第一の残基が電荷による相互作用を通して第二の残基と関連している状況で、かつ、第一の残基が正電荷を帯びた残基で、第二の残基が負の電荷を帯びた残基である場合、第一の残基を負の電荷を帯びた残基とし、第二の残基を正電荷を帯びた残基とするように、電荷を入れ替えることができる。いくつかの態様では、第一の残基と第二の残基は同じタンパク質上に存在する。いくつかの態様では、第一の残基と第二の残基は別のタンパク質上に存在する。
いくつかの態様では、必須のタンパク質の機能の回復が誘導される。いくつかの態様において、必須のタンパク質の機能の回復は、二量体化剤によって誘導される。本明細書で使用する場合、「二量体化剤」という用語は、当業者が通常理解するものと同じ一般的な意味を有し、２つ以上のドメインを架橋する低分子またはタンパク質を含む。二量体化剤の非限定的な例としてはＡＰ１９０３が挙げられる。本開示を前提とすると、当業者に理解されるように、必須のタンパク質の機能の回復が二量体化剤によって誘導される場合、その二量体化剤または誘導剤は外因性の選択圧とはみなされない。
いくつかの態様において、培養するステップは、細胞周期阻害剤、成長阻害剤、ＤＮＡ複製阻害剤、代謝阻害剤、遺伝子発現阻害剤、またはストレス阻害剤のうちの少なくとも１つの存在下で実施される。いくつかの態様では、培養するステップはメトトレキサート存在下で実施される。
本明細書に記載のいくつかの態様は、遺伝子改変した細胞を濃縮するための方法に関する。本明細書で使用する場合、「濃縮」という用語は、当業者が通常理解するものと同じ一般的な意味を有し、細胞集団中における所望の細胞型の割合を高めることを含む。濃縮の非限定的な例としては、集団から所望の細胞型を精製すること、所望の細胞型の数を増やすこと、および所望されない細胞型の数を減らすことが挙げられる。いくつかの態様において、この方法は、細胞の生存および／または増殖のために必須の少なくとも第一のタンパク質または細胞内プロセスの活性を、この細胞がインビトロの通常の繁殖条件下では生存もおよび／または増殖もできないレベルに低下させることを含む。例えば、メトトレキサートによってＤＨＦＲが抑制された細胞はインビトロの通常の繁殖条件下では細胞は生存もおよび／または増殖もできず、インビトロの繁殖条件への添加剤（ヒポキサンチンやチミジン（ＨＴ））の補充が必要とされる場合がある。したがって、本開示を前提として、当業者であれば理解できるように、この文脈において一般的な条件（または同様の表現）とは、示した特定の変化を補償する特定の成分を提供しない条件を表す。本明細書に記載の通り、これは、所与の細胞の成長、複製、細胞周期、遺伝子制御（ＤＮＡ修復、転写、翻訳、および複製を含む）、ストレス応答、代謝、アポトーシス、栄養素の獲得、タンパク質のターンオーバー、細胞表面の完全性、必須の酵素活性、生存、またはこれらの任意の組み合わせに影響を及ぼす任意のタンパク質または細胞内システムであり得る。また「抑制」という用語は、細胞死、代謝の停止、細胞周期の停止、ストレス誘導、タンパク質のターンオーバーの停止、ＤＮＡストレス、および／または成長の停止の１つ以上が対照と比較して優位に高まることから、対照と比較して完全な細胞死、代謝の停止、細胞周期の停止、ストレス誘導、タンパク質のターンオーバーの停止、ＤＮＡストレス、および／または成長の停止が生じることに起因するいずれの表現型に対しても適用され得ると理解される。
いくつかの態様において、この方法はさらに、細胞中で発現するように操作可能な本明細書で開示の少なくとも１つのヌクレオチド配列を導入することを含む。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列は、少なくとも２つの部分を含む。本明細書で記載するように、これら部分は一緒になって、少なくとも１つの必須のタンパク質の発現に機能する。これらの部分の数は、少なくとも１つの必須のタンパク質の発現に一緒に機能する限り、いくつであってもよい。
いくつかの態様において、ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖に必須のタンパク質の非機能性部分を結合ドメインに融合させた融合タンパク質をコードしている、少なくとも１つの配列を含む。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列の第一部分は、生存および／または増殖に必須のタンパク質の非機能性部分を結合ドメインに融合させた融合タンパク質をコードしている、少なくとも１つの配列を含む。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列の第二部分は、少なくとも１つの発現させたいタンパク質をコードしている少なくとも１つの配列を含む。
いくつかの態様において、ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖に必須のタンパク質の第二の非機能性部分を第二の結合ドメインに融合させた第二の融合タンパク質をコードしている少なくとも１つの配列と、少なくとも１つの発現させたいタンパク質をコードしている第二のヌクレオチド配列とを含む。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列の第二部分は、生存および／または増殖に必須のタンパク質の第二の非機能性部分を第二の結合ドメインに融合させた第二の融合タンパク質をコードしている少なくとも１つの配列と、少なくとも１つの発現させたいタンパク質をコードしている第二のヌクレオチド配列とを含む。いくつかの態様では、細胞内で融合タンパク質が一緒に発現する結果、少なくとも１つの必須のタンパク質の発現が成功する。本明細書で開示する多くの実施例は、２つの融合タンパク質の組み合わせに関するが、当業者は、本明細書で開示するのと同じ方法を、少なくとも１つの必須のタンパク質とうまく組み合わせることのできる任意の数の融合タンパク質のもとで用いることが可能であることを理解できる。
いくつかの態様では、細胞内で第一および第二の融合タンパク質が一緒に発現すると、少なくとも１つの生存および／または増殖に必須のタンパク質の機能が回復する。本明細書で開示するように、いくつかの態様では、細胞内で第一および第二の融合タンパク質が一緒に発現すると、少なくとも１つの生存および／または増殖に必須の細胞内プロセスが回復する。いくつかの態様において、この少なくとも１つの必須のタンパク質または細胞内プロセスは、抑制されたタンパク質または細胞内プロセスと同じ必須のタンパク質または細胞内プロセスである。いくつかの態様において、少なくとも１つの必須のタンパク質は、抑制されたタンパク質と同様の活性を有する。いくつかの態様では、少なくとも１つの必須のタンパク質は、少なくとも１つの抑制された細胞内経路またはプロセスにおいて機能する。いくつかの態様では、少なくとも１つの必須のタンパク質は、少なくとも２つの必須の細胞内経路またはプロセスにおいて機能する。いくつかの態様では、少なくとも１つの必須のタンパク質が発現することによって、抑制されたタンパク質および／または細胞内プロセスの抑制型の表現型が、緩和、活性化、回復または軽減される。いくつかの態様では、少なくとも１つの必須のタンパク質の発現に際して、細胞の生存および／または増殖が増強される。いくつかの態様では、少なくとも１つの必須のタンパク質の発現に際して、細胞の生存および／または増殖が完全に回復する。
いくつかの態様において、この方法はさらに、第一の融合タンパク質と第二の融合タンパク質の両方を発現する細胞を濃縮するために、インビトロの繁殖条件下で細胞を培養することを含む。
いくつかの態様では、表１～５のいずれか１つ以上において示す構築物、配列、またはサブ配列のうちの１つ以上を、本明細書で提供する本態様および／またはアレンジメントおよび／または方法および／または組成物中で利用することができる。
実施例１
本実施例は、ＤＨＦＲのノックアウトと、ヌクレアーゼ耐性ＤＨＦＲ遺伝子を含有しているＴＣＲ遺伝子構築物のノックインを同時に行うと、ＴＣＲのノックインに成功したＴ細胞が５倍濃縮されることを実証するものである。
本実施例は、ＤＨＦＲのノックアウトと、ヌクレアーゼ耐性ＤＨＦＲ遺伝子を含有しているＴＣＲ遺伝子構築物のノックインを同時に行うと、ＴＣＲのノックインに成功したＴ細胞が５倍濃縮されることを実証するものである。
図３～７の材料と方法
二人の提供者ＢＣ２３およびＢＣ２６から分離した２つのバフィーコートからヒト初代Ｔ細胞を単離し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（サーモフィッシャー、カタログ番号１１１．３２Ｄ、ビーズとＴ細胞の比は３：１）で活性化した。活性化の２日後に細胞を回収し、細胞に以下の成分をエレクトロポレーションした：（１）ＤＨＦＲ ｓｇＲＮＡ－１／Ｃａｓ９ ＲＮＰ、（２）ＤＨＦＲ ｓｇＲＮＡ－２／Ｃａｓ９ ＲＮＰ、（３）ＴＲＡＣ ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ＋ＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ＴＣＲをコードしているノックイン鋳型、（４）ＴＲＡＣ ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ＋ＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲとＤＨＦＲをコードしているノックイン鋳型、（５）ＴＲＡＣ ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ＋ＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲとＤＨＦＲをコードしているノックイン鋳型＋ＤＨＦＲ ｓｇＲＮＡ－１／Ｃａｓ９ ＲＮＰ。まずｃｒＲＮＡ（３２ｐｍｏｌ）とＴｒａｃｒＲＮＡ（３２ｐｍｏｌ）を９５℃で５分間アニーリングし、室温で１０分間インキュベートした後、１６ｐｍｏｌのＣａｓ９ヌクレアーゼを加え、室温で１５分間インキュベートすることで、ＲＮＰ複合体を準備した。ＲＮＰ複合体は使用するまで氷上に、長期保存の場合は－８０℃に置いた。１００万個の活性化Ｔ細胞（２０μｌのＰ３緩衝液溶液）と１６ｐｍｏｌのＲＮＰ複合体および１μｇの修復テンプレートを混合し、ついで、ロンザ（Ｌｏｎｚａ）４Ｄ－ヌクレオフェクター（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ）装置を用い、パルスコードＥＨ－１１５でエレクトロポレーションを開始することにより、エレクトロポレーションを実施した。条件（１）および（２）でエレクトロポレーションした細胞は、エレクトロポレーション後５日目に回収し、ゲノムＤＮＡを単離し、ＰＣＲでＤＨＦＲ遺伝子座を増幅し、そしてＴＩＤＥ分析を行った（図３および図４）。条件（３）、（４）および（５）でエレクトロポレーションした細胞は、エレクトロポレーション後６日目（図５）および１０日目（図６および図７左図）に回収し、ＴＣＲ発現のＦＡＣＳ分析を行った。また、エレクトロポレーション後１２日目には細胞総数を計数してＴＣＲノックイン細胞を算出し、プロットした（図７右図）。
二人の提供者ＢＣ２３およびＢＣ２６から分離した２つのバフィーコートからヒト初代Ｔ細胞を単離し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（サーモフィッシャー、カタログ番号１１１．３２Ｄ、ビーズとＴ細胞の比は３：１）で活性化した。活性化の２日後に細胞を回収し、細胞に以下の成分をエレクトロポレーションした：（１）ＤＨＦＲ ｓｇＲＮＡ－１／Ｃａｓ９ ＲＮＰ、（２）ＤＨＦＲ ｓｇＲＮＡ－２／Ｃａｓ９ ＲＮＰ、（３）ＴＲＡＣ ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ＋ＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ＴＣＲをコードしているノックイン鋳型、（４）ＴＲＡＣ ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ＋ＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲとＤＨＦＲをコードしているノックイン鋳型、（５）ＴＲＡＣ ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ＋ＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲとＤＨＦＲをコードしているノックイン鋳型＋ＤＨＦＲ ｓｇＲＮＡ－１／Ｃａｓ９ ＲＮＰ。まずｃｒＲＮＡ（３２ｐｍｏｌ）とＴｒａｃｒＲＮＡ（３２ｐｍｏｌ）を９５℃で５分間アニーリングし、室温で１０分間インキュベートした後、１６ｐｍｏｌのＣａｓ９ヌクレアーゼを加え、室温で１５分間インキュベートすることで、ＲＮＰ複合体を準備した。ＲＮＰ複合体は使用するまで氷上に、長期保存の場合は－８０℃に置いた。１００万個の活性化Ｔ細胞（２０μｌのＰ３緩衝液溶液）と１６ｐｍｏｌのＲＮＰ複合体および１μｇの修復テンプレートを混合し、ついで、ロンザ（Ｌｏｎｚａ）４Ｄ－ヌクレオフェクター（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ）装置を用い、パルスコードＥＨ－１１５でエレクトロポレーションを開始することにより、エレクトロポレーションを実施した。条件（１）および（２）でエレクトロポレーションした細胞は、エレクトロポレーション後５日目に回収し、ゲノムＤＮＡを単離し、ＰＣＲでＤＨＦＲ遺伝子座を増幅し、そしてＴＩＤＥ分析を行った（図３および図４）。条件（３）、（４）および（５）でエレクトロポレーションした細胞は、エレクトロポレーション後６日目（図５）および１０日目（図６および図７左図）に回収し、ＴＣＲ発現のＦＡＣＳ分析を行った。また、エレクトロポレーション後１２日目には細胞総数を計数してＴＣＲノックイン細胞を算出し、プロットした（図７右図）。
図３は、二人の提供者に由来するヒトＴ細胞へのｓｇＲＮＡ ｓｇＤＨＦＲ－１のノックアウト効率（ＢＣ２３およびＢＣ２６についてそれぞれ７５％および１８％）を決定するＴＩＤＥ分析の結果を示し、ヒト初代Ｔ細胞内において内在性ＤＨＦＲ遺伝子を遺伝的に不活性化できることの証拠を示している。ＴＩＤＥとは「トラッキングオブインデルズバイデコンポジション（分解による挿入や欠失の追跡）、Ｔｒａｃｋｉｎｇ ｏｆ Ｉｎｄｅｌｓ ｂｙ Ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ」の略で、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などのゲノム編集ツールによって細胞プール内に生じた挿入や欠失（インデル）を測定するための方法である。
図４は、二人の提供者に由来するヒトＴ細胞へのｓｇＲＮＡ ｓｇＤＨＦＲ－２のノックアウト効率（ＢＣ２３およびＢＣ２６についてそれぞれ３４％および７５％）を決定するＴＩＤＥ分析の結果を示し、ヒト初代Ｔ細胞内において内在性ＤＨＦＲ遺伝子を遺伝的に不活性化できることの証拠を示している。
図５では、二人の提供者（ＢＣ２３およびＢＣ２６）に由来するヒトＴ細胞へのＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲのノックアウト効率を確認するために行った、ＦＡＣＳ分析の結果を示す。染色には、１Ｇ４ ＴＣＲのβ鎖に結合する抗Ｖβ１３．１（バイオレジェンド、カタログ番号３６２４０６）抗体を用いた。Ｔ細胞には、ＴＲＡＣ ＲＮＰ（ＴＲＡＣ遺伝子座にＤＮＡ二本鎖切断を生成する）と、二本鎖ＤＮＡ切断を修復する様々な修復鋳型（すべてＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲ配列を含む）がエレクトロポレーションされ、この部位に取り込まれた状態になっている。
左列はＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲをコードしている修復鋳型のみのノックイン、中列はヌクレアーゼ耐性ＤＨＦＲ遺伝子に連結させた１Ｇ４ ＴＣＲをコードしている修復鋳型（ＩＧ４ ＴＣＲ－ＤＨＦＲ ＫＩ）のノックイン、右列はＤＨＦＲ特異的ｓｇＲＮＡを使って、１Ｇ４ ＴＣＲ－ＤＨＦＲ修復鋳型のノックインと内在性ＤＨＦＲのノックアウトを同時に行った場合の結果を示している。１Ｇ４－ＤＨＦＲ修復鋳型の送達に内在性ＤＨＦＲのノックアウトを同時に行うと、エレクトロポレーション６日後のＴ細胞の頻度はそれぞれ、ＢＣ２３では９％から５１％（５．７倍濃縮）に、ＢＣ２６では２３％から７０％（３倍濃縮）にと、Ｔ細胞の効率的な選抜がもたらされた。このデータは、本発明に記載の方法によって、物理的なまたは薬剤を介した選抜を必要とせず、また選抜を可能にするための外因性遺伝子をコードする遺伝子配列の導入もなしに、遺伝子改変した細胞を濃縮できることを示している。
図６は、ヌクレアーゼ耐性ＤＨＦＲ導入遺伝子がＴＣＲα／βをコードしているＤＮＡ修復鋳型に含まれていて、かつ、内在性ＤＨＦＲのノックアウトと組み合わせた時の、二人の提供者（ＢＣ２３およびＢＣ２６）由来のＴ細胞へのＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲのノックイン効率を確認するために行ったＦＡＣＳ分析の結果を示している。左列はＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲのみのノックイン、中央列は１Ｇ４ ＴＣＲ－ＤＨＦＲのノックイン、右列は１Ｇ４ ＴＣＲ－ＤＨＦＲのノックインと同時に内在性ＤＨＦＲのノックアウトを行った場合の結果を示す。このデータは、１Ｇ４－ＤＨＦＲのノックインと同時に内在性ＤＨＦＲをノックアウトすると、エレクトロポレーションの１０日後には１Ｇ４－ＤＨＦＲ ＫＩ Ｔ細胞の頻度がそれぞれ、ＢＣ２３では１０％から６１％（６．１倍濃縮）に、ＢＣ２６では３０％から８５％（２．８倍濃縮）にと、Ｔ細胞が効率的に選抜されることを示している。このデータは、本発明に記載の方法によって、物理的なまたは薬剤を介した選抜を必要とせず、また選抜を可能にするための外因性遺伝子をコードする遺伝子配列の導入もなしに、遺伝子改変した細胞を濃縮できることを示している。
以上のデータから、物理的なまたは薬剤を介した選抜を必要とせず、また選抜を可能にするための外因性遺伝子をコードする遺伝子配列の導入もなしに、遺伝子改変した細胞を濃縮できることが示された。
遺伝子編集されたＴ細胞の濃縮を達成するには、目的の治療用遺伝子（例えばＴＣＲαおよびＴＣＲβ）やｓｉＲＮＡ－または阻害剤耐性ＤＨＦＲ遺伝子をコードしているＤＮＡ修復鋳型をノックインすることによって、またはノックインするのではなくてｓｉＲＮＡまたは阻害剤（メトトレキサート）を用いて内在性ＤＨＦＲの機能を抑制することによってなど、様々な戦略がある。
図７左図は、二人の提供者（ＢＣ２３およびＢＣ２６）由来のヒトＴ細胞におけるＴＣＲＶβ１３．１抗体の蛍光強度のＦＡＣＳ分析に基づき、１Ｇ４－ＴＣＲ ＫＩ（ノックイン）Ｔ細胞と１Ｇ４－ＴＣＲ－ＤＨＦＲ ＫＩ＋ＤＨＦＲ ＫＯ Ｔ細胞ではＴＣＲの発現レベルが同等であることを示している。抗Ｖβ１３．１抗体は、１Ｇ４ ＴＣＲのβ鎖に結合する。このデータは、本発明によって達成されたＴＣＲの発現が、改変していないＴＣＲ導入遺伝子の部位特異的組み込みと同等であることを示している。
右図は、エレクトロポレーション１２日後の両提供者由来のＴ細胞におけるＴＣＲノックイン細胞の総数が、１Ｇ４－ＴＣＲノックインおよび１Ｇ４－ＴＣＲ－ＤＨＦＲ ＫＩ＋ＤＨＦＲ ＫＯ Ｔ細胞の両者で同等であり、本方法で改変したＴ細胞が遺伝子改変の後に増殖することを示している。
図８～１０の材料と方法
四人の提供者ＢＣ２９、ＢＣ３０、ＢＣ３１およびＢＣ３２由来の４つのバフィーコートからヒト初代Ｔ細胞を単離し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化した。活性化の２日後に細胞を回収し、細胞に以下の成分をエレクトロポレーションした：（１）ＴＲＡＣ ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ＋ＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲをコードしているノックイン鋳型、（２）ＴＲＡＣ ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ＋ＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲとＤＨＦＲをコードしているノックイン鋳型、（３）ＴＲＡＣ ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ＋ＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲとＤＨＦＲをコードしているノックイン鋳型＋ＤＨＦＲ ｓｇＲＮＡ－１／Ｃａｓ９ ＲＮＰ。エレクトロポレーションおよび導入の条件は前述したものと同様である。５日後に、ＴＣＲ発現に関するＦＡＣＳ分析（図８、図９および図１０左図）用に、細胞を回収した。また、エレクトロポレーション後１２日目には細胞総数を計数してＴＣＲノックイン細胞を算出し、プロットした（図１０右図）。
四人の提供者ＢＣ２９、ＢＣ３０、ＢＣ３１およびＢＣ３２由来の４つのバフィーコートからヒト初代Ｔ細胞を単離し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化した。活性化の２日後に細胞を回収し、細胞に以下の成分をエレクトロポレーションした：（１）ＴＲＡＣ ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ＋ＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲをコードしているノックイン鋳型、（２）ＴＲＡＣ ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ＋ＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲとＤＨＦＲをコードしているノックイン鋳型、（３）ＴＲＡＣ ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ＋ＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲとＤＨＦＲをコードしているノックイン鋳型＋ＤＨＦＲ ｓｇＲＮＡ－１／Ｃａｓ９ ＲＮＰ。エレクトロポレーションおよび導入の条件は前述したものと同様である。５日後に、ＴＣＲ発現に関するＦＡＣＳ分析（図８、図９および図１０左図）用に、細胞を回収した。また、エレクトロポレーション後１２日目には細胞総数を計数してＴＣＲノックイン細胞を算出し、プロットした（図１０右図）。
図８は、エレクトロポレーション５日後に、ヌクレアーゼ耐性ＤＨＦＲ導入遺伝子がＴＣＲα／βをコードしているＤＮＡ修復鋳型に含まれていて、かつ、内在性ＤＨＦＲのノックアウトと組み合わせた時の、四人の提供者（ＢＣ２９、ＢＣ３０、ＢＣ３１、およびＢＣ３２）由来のＴ細胞へのＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲのノックイン効率を確認するために行ったＦＡＣＳ分析の結果を示している。左列はＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲのノックイン、中央列は１Ｇ４ ＴＣＲ－ＤＨＦＲのノックイン、右列は１Ｇ４ ＴＣＲ－ＤＨＦＲのノックインと同時に内在性ＤＨＦＲのノックアウトを行った場合の結果を示す。抗Ｖβ１３．１抗体は、１Ｇ４ ＴＣＲのβ鎖に結合する。このデータは、エレクトロポレーション５日後のノックイン効率が、ＢＣ２３では２５％から７３％に、ＢＣ３０では２４％から５０％に、ＢＣ３１では１７％から６０％に、そしてＢＣ３２では１７％から４１％に増加したことを示している。このことは、本発明に記載の方法によって、物理的なまたは薬剤を介した選抜を必要とせず、また選抜を可能にするための外因性遺伝子をコードする遺伝子配列の導入もなしに、遺伝子改変した細胞を濃縮できることを示している。
図９は、図８を数値化したデータを提供し、この方法によって、物理的なまたは薬剤を介した選抜を必要とせず、また選抜を可能にするための外因性遺伝子をコードする遺伝子配列の導入もなしに、遺伝子改変した細胞を濃縮できることを示している。
図１０左図は、四人の提供者（ＢＣ２９、ＢＣ３０、ＢＣ３１、およびＢＣ３２）由来のヒトＴ細胞におけるＴＣＲＶβ１３．１（抗Ｖβ１３．１抗体は、１Ｇ４ ＴＣＲのβ鎖に結合する）の蛍光強度のＦＡＣＳ分析に基づき、１Ｇ４－ＴＣＲ ＫＩと１Ｇ４－ＴＣＲ－ＤＨＦＲ ＫＩ＋ＤＨＦＲ ＫＯ Ｔ細胞ではＴＣＲの発現レベルが同等であることを示している。右図は、四人の提供者由来のＴ細胞におけるＴＣＲノックイン細胞の総数が、１Ｇ４－ＤＨＦＲ－ＫＩ Ｔ細胞または１Ｇ４－ＴＣＲ－ＤＨＦＲ ＫＩ＋ＤＨＦＲ ＫＯ Ｔ細胞よりも１Ｇ４－ＴＣＲノックイン条件において多かったことを示している。
図１１～１２の材料と方法
ＢＣ３３およびＢＣ３５のバフィーコートからヒト初代Ｔ細胞を単離し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化した。活性化の２日後に細胞を回収し、細胞に以下の成分をエレクトロポレーションした：（１）ＤＨＦＲ遺伝子座の１０の異なる部位を標的とするＤＨＦＲ ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ、（２）ＤＨＦＲ ｍＲＮＡ内の６つの異なる部位を標的とするＤＨＦＲ ｓｉＲＮＡ。エレクトロポレーションの３日後、細胞をＭＴＸ－フルオレセインと共に一晩インキュベートし、回収して、フルオレセイン発現のＦＡＣＳ分析にかけた（図１２）。
ＢＣ３３およびＢＣ３５のバフィーコートからヒト初代Ｔ細胞を単離し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化した。活性化の２日後に細胞を回収し、細胞に以下の成分をエレクトロポレーションした：（１）ＤＨＦＲ遺伝子座の１０の異なる部位を標的とするＤＨＦＲ ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ、（２）ＤＨＦＲ ｍＲＮＡ内の６つの異なる部位を標的とするＤＨＦＲ ｓｉＲＮＡ。エレクトロポレーションの３日後、細胞をＭＴＸ－フルオレセインと共に一晩インキュベートし、回収して、フルオレセイン発現のＦＡＣＳ分析にかけた（図１２）。
図１１は、ＤＨＦＲの発現を決定するためにＭＴＸ－フルオレセイン標識を用いた場合の結果を示している。左図は、標識していない細胞の大部分がフルオレセイン染色陰性であることを示し；中央および右の図はＭＴＸ－フルオレセインで標識した細胞の図であり；中央図は、対照の細胞（野生型）の大部分がフルオレセイン染色陽性であることを示し；右図は、ＤＨＦＲ ｓｇＲＮＡをエレクトロポレーションで導入してある細胞ではＭＴＸ－フルオレセイン染色陰性が多いことを示している。このデータは、ＤＨＦＲノックアウト細胞を同定するのに、フルオレセイン標識ＭＴＸを利用できることを示唆している。
図１２左図は、図１１に示したＤＨＦＲを標的とする有効なガイドＲＮＡをスクリーニングするための方法を示す図であり、右図は、図１１に示したＤＨＦＲを標的とする有効なｓｉＲＮＡをスクリーニングするための方法の使用を示す。
以上の結果から、１）ＤＨＦＲ選抜戦略によって、ＴＣＲノックイン細胞を確実に濃縮できること、および２）ＭＴＸ標識によって、ＤＨＦＲの発現を定量化できることが実証された。
実施例２
本実施例は、変異型ＤＨＦＲ遺伝子を導入し、次いで、臨床試験済みの薬剤であるメトトレキサート（ＭＴＸ）で選抜することにより、いくつかの態様に夜方法によって、遺伝子改変したＴ細胞を効率的に濃縮できることを示すものである。
本実施例は、変異型ＤＨＦＲ遺伝子を導入し、次いで、臨床試験済みの薬剤であるメトトレキサート（ＭＴＸ）で選抜することにより、いくつかの態様に夜方法によって、遺伝子改変したＴ細胞を効率的に濃縮できることを示すものである。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して、三人（ＢＣ３７、ＢＣ３８、およびＢＣ３９）の提供者由来のＴ細胞に、対照であるＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲ（１Ｇ４ＫＩ）をコードしている修復鋳型またはメトトレキサート（ＭＴＸ）耐性ＤＨＦＲ変異型遺伝子（１Ｇ４－ＤＨＦＲｍ ＫＩ）に結合した１Ｇ４ ＴＣＲをコードする修復鋳型のいずれかをノックインした。次いでＴ細胞を、１Ｇ４ ＴＣＲのβ鎖に結合する抗Ｖβ１３．１（バイオレジェンド、カタログ番号３６２４０６）抗体で染色した。１Ｇ４－ＤＨＦＲｍ ＫＩ鋳型で修復した細胞を、エレクトロポレーションの３日後から４日間、０．１μＭのＭＴＸで処理した。１Ｇ４ ＫＩ鋳型で修復した細胞は、ＦＡＣＳ分析を行うまで未処理のままとした。ＦＡＣＳ分析をエレクトロポレーションの１１日後に実施した。
図１３Ａは、対照の修復鋳型である１Ｇ４ ＫＩをノックインしたＴ細胞のＦＡＣＳプロットを、図１３Ｂは修復鋳型１Ｇ４－ＤＨＦＲｍ ＫＩをノックインしたＴ細胞を示しており、図１３Ｃは、２回の技術的反復試験を行った図１３Ａおよび図１３Ｂを数量化した棒グラフである。
図１３Ａ～Ｃのデータは、ＭＴＸ耐性 ＤＨＦＲｍを導入し、次いで、細胞をＭＴＸで処理することによって、ノックインされたＴ細胞が効率的に選抜されることを示しており、ここで、ノックインが成功したＴ細胞の頻度はそれぞれ、ＢＣ３７では２６％から８５％（３．３倍濃縮）に、ＢＣ３８では１５％から７３％（４．９倍濃縮）に、そしてＢＣ３９では２６％から８３％（３．２倍濃縮）へと増加した。このデータは、変異型ＤＨＦＲ遺伝子を導入し、次いで臨床試験済みの薬剤であるＭＴＸを使って選抜する本発明に記載の方法によって、遺伝子改変した細胞を効率的に濃縮できることを示している。
図１４は、図１３に記載の２種類の条件でノックインしたＴ細胞の増殖を示す棒グラフである。エレクトロポレーションの１０日後に細胞総数を計数し、ノックイン効率のＦＡＣＳ分析に基づいてＴＣＲノックイン細胞の数を算出した。このデータは、三人の提供者由来のＴ細胞にＭＴＸ選抜戦略を適用すると、ＴＣＲノックイン細胞の収量が、従来の選抜を行わない方法よりも２～３倍増加することを示している。
実施例３
本実施例は、いくつかの態様による遺伝子改変したＴ細胞を効率的に濃縮する方法が、ＣＤ４＋細胞の割合を有意に変化させなかったことを示すものである。ＣＤ４＋細胞は、ヒトＴ細胞の２つの主要なサブセットの１つである（他方はＣＤ８＋Ｔ細胞）。ＣＤ４＋細胞の割合が正常でないことは、免疫機能の損傷を示す可能性がある。
本実施例は、いくつかの態様による遺伝子改変したＴ細胞を効率的に濃縮する方法が、ＣＤ４＋細胞の割合を有意に変化させなかったことを示すものである。ＣＤ４＋細胞は、ヒトＴ細胞の２つの主要なサブセットの１つである（他方はＣＤ８＋Ｔ細胞）。ＣＤ４＋細胞の割合が正常でないことは、免疫機能の損傷を示す可能性がある。
図１５は、図１３で記載した２種類のノックイン条件におけるＣＤ４＋細胞の割合を、抗ＣＤ４抗体（ＢＤバイオサイエンス、カタログ番号３４５７６８）による染色を用いてＦＡＣＳで分析した結果を示している。このデータは、この２種類の条件ではＣＤ４＋細胞の割合は同等であり、したがって、ＭＴＸ選抜戦略はＣＤ４＋細胞の割合を著しく変化させないことを示している。
実施例４
本実施例は、いくつかの態様による方法が、遺伝的に改変され、濃縮されたＴ細胞の表現型を有意に変化させないことを示すものである。
本実施例は、いくつかの態様による方法が、遺伝的に改変され、濃縮されたＴ細胞の表現型を有意に変化させないことを示すものである。
図１６は、図１３で記載した２種類のノックイン条件におけるＴＣＲノックイン細胞の表現型を、抗ＣＤ４５ＲＡ（ＢＤバイオサイエンス、カタログ番号５６３９６３）および抗ＣＤ６２Ｌ抗体（ＢＤバイオサイエンス、カタログ番号５６２３３０）による染色を用いてＦＡＣＳで分析した結果を示している。ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋の割合は、高度に機能的なナイーブ幹細胞様表現型を反映している。このデータは、この２種類のノックイン条件ではＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋細胞の割合は同等であり、したがって、ＭＴＸ選抜戦略は細胞の表現型を著しく変化させないことを示している。
図１７は、図１３で記載した２種類のノックイン条件におけるＴＣＲノックイン細胞の表現型を、抗ＣＤ２７（ＢＤバイオサイエンス、カタログ番号７４０９７２）および抗ＣＤ２８抗体（ＢＤバイオサイエンス、カタログ番号５５９７７０）による染色を用いてＦＡＣＳで分析した結果を示している。共受容体であるＣＤ２７とＣＤ２８は、Ｔ細胞を同時に刺激する分子であり、そのため、これらの二重陽性細胞は、高度に機能的なＴ細胞であると考えられる。このデータは、この２種類のノックイン条件ではＣＤ２７＋ＣＤ２８＋細胞の割合は同等であり、したがって、ＭＴＸ選抜戦略は細胞の表現型を著しく変化させないことを示している。
実施例５
本実施例は、いくつかの態様による方法によって生成された、遺伝的に改変され、濃縮されたＴ細胞が、選抜なしで生成されたＴ細胞と同様の細胞溶解能をもつことを示すものである。
本実施例は、いくつかの態様による方法によって生成された、遺伝的に改変され、濃縮されたＴ細胞が、選抜なしで生成されたＴ細胞と同様の細胞溶解能をもつことを示すものである。
ヒトメラノーマＡ３７５細胞（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１＋ＮＹ－ＥＳＯ－１＋）を６穴プレートに播種し、異なる数の、実施例２と同じように生成したＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲノックインＴ細胞（提供者ＢＣ３７由来）を加えた（Ｅ：Ｔ比は０：１から２：１）。５日後、残った腫瘍細胞をホルムアルデヒドで固定し、クリスタルバイオレット溶液で染色した。図１８に示すように、左のプレートは編集していないＴ細胞との共培養、中央のプレートは１Ｇ４－ノックインＴ細胞（１Ｇ４ ＫＩ）との競売様、そして右のプレートはＭＴＸ選抜した１Ｇ４－ＤＨＦＲｍ－ノックインＴ細胞（１Ｇ４－ＤＨＦＲｍ ＫＩ＋ＭＴＸ）である。この結果は、ＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲを発現していない未編集のＴ細胞は腫瘍細胞を死滅させることができないが、１Ｇ４ ＴＣＲノックインＴ細胞（中央および右のプレート）は、中程度から高いＥ：Ｔ非において、効率的に腫瘍最上を排除できたことから、この共培養アッセイによってＴＣＲ特異的な腫瘍細胞の死滅を示すことが可能であることを示している。この結果はまた、ＭＴＸ選抜法によって生成されたＴ細胞（右のプレート）が、選抜なしで生成されたＴ細胞（中央のプレート）と同等の細胞溶解能を有することも示している。
図１９は、腫瘍Ｔ細胞と、二人のさらなる提供者（ＢＣ３８およびＢＣ３９）由来のＴ細胞との共培養アッセイを示している。この結果から、ＭＴＸ選抜法によって生成されたＴ細胞（右カラム）が、選抜なしで生成されたＴ細胞（左カラム）と同等の細胞溶解能を有することが確認された。
実施例６
本実施例は、いくつかの態様による方法によって生成された、遺伝的に改変され、濃縮されたＴ細胞が、選抜なしで生成されたＴ細胞と同様のＩＦＮγおよびＩＬ２産生能をもつことを示すものである。
本実施例は、いくつかの態様による方法によって生成された、遺伝的に改変され、濃縮されたＴ細胞が、選抜なしで生成されたＴ細胞と同様のＩＦＮγおよびＩＬ２産生能をもつことを示すものである。
ＩＦＮγは、免疫応答において中心的な役割を果たすサイトカインであり、また活性化されたＴ細胞において鍵となる特徴の１つだと考えられている。遺伝的に改変され、濃縮されたＴ細胞（実施例２で生成したものと同様）のＩＦＮγ産生能を試験するために、ヒトメラノーマＡ３７５（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１＋ＮＹ－ＥＳＯ－１＋）細胞を９６穴プレートに播種し、異なる数のＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲノックインＴ細胞（二人の提供者由来、図２０、上段：提供者ＢＣ３７、下段：提供者ＢＣ３９）を加えた（Ｅ：Ｔ非は１：２～１：８、上段下段ともに左側３つの図）。刺激の陽性対照としては、ＰＭＡおよびイオノマイシン（ＰＭＡ＋ＩＯＮ、右側の図）を加えた。Ｔ細胞を、サイトカインの分泌を防止するためのブレフェルジンＡ（ＢＤゴルジプラグ（ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ）、ＢＤバイオサイエンス、カタログ番号５５４７２４）存在下で一晩刺激し、回収して、抗ＩＦＮγ抗体（ＢＤバイオサイエンス、カタログ番号３４０４５２）および抗ＩＬ２抗体（ＢＤバイオサイエンス、カタログ番号３４０４４８）での細胞間染色を用いたＩＦＮγ産生のＦＡＣＳ分析に用いた。ＩＦＮγを産生しているＴ細胞の割合を、図２０に示す様にプロットした。このデータは、ＭＴＸ選抜法によって生成されたＴ細胞（１Ｇ４－ＤＨＦＲｍ ＫＩ＋ＭＴＸ）が、選抜なしで生成されたＴ細胞（１Ｇ４ ＫＩ）と同等のＩＦＮγ産生能をもつことを示している。
図２１は、腫瘍細胞で刺激したＴ細胞のＩＦＮγ産生能を示す棒グラフである。図２０に示す様に、Ｔ細胞を異なるＥ：Ｔ非のＡ３７５細胞で刺激し、ＩＦＮγの発現レベル（平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって決定した）をここにプロットした。このデータは、ＭＴＸ選抜法によって生成されたＴ細胞（１Ｇ４－ＤＨＦＲｍ ＫＩ＋ＭＴＸ）が、選抜なしで生成されたＴ細胞（１Ｇ４ ＫＩ）と同等の量のＩＦＮγを産生したことを示している。
図２２は、腫瘍細胞で刺激したＴ細胞のＩＬ２産生能を示す棒グラフである。図２０および図２１に示す様に、Ｔ細胞を異なるＥ：Ｔ非のＡ３７５細胞で刺激した。ＩＬ２を産生しているＴ細胞の割合（左図）およびＩＬ２の発現レベル（ＭＦＩ、右図）をここにプロットした。左図は、ＭＴＸ選抜法によって生成されたＴ細胞（１Ｇ４－ＤＨＦＲｍ ＫＩ＋ＭＴＸ）では、選抜なしで生成されたＴ細胞（１Ｇ４ ＫＩ）よりも、ＩＬ２を産生しているＴ細胞の割合が高かったことを示しており、右図は、ＭＴＸ選抜法によって生成されたＴ細胞（１Ｇ４－ＤＨＦＲｍ ＫＩ＋ＭＴＸ）は選抜なしで生成されたＴ細胞（１Ｇ４ ＫＩ）と同等の量のＩＬ２を産生したことを示している。
実施例７
本実施例は、いくつかの態様による方法によって生成された、遺伝的に改変され、濃縮されたＴ細胞が、選抜なしで生成されたＴ細胞と同様の増殖能をもつことを示すものである。
本実施例は、いくつかの態様による方法によって生成された、遺伝的に改変され、濃縮されたＴ細胞が、選抜なしで生成されたＴ細胞と同様の増殖能をもつことを示すものである。
図２３は、腫瘍細胞で刺激したＴ細胞の増殖能を示すヒストグラムである。Ａ３７５細胞を２４穴プレートに播種し、異なる比率のＣＦＳＥ標識Ｔ細胞（Ｅ：Ｔ比は１：２および１：４）をプレートに加えた。３日後にＴ細胞を回収し、ＣＦＳＥ希釈によるＦＡＣＳ分析にかけた。このデータは、ＭＴＸ選抜法によって生成されたＴ細胞（１Ｇ４－ＤＨＦＲｍ ＫＩ＋ＭＴＸ）の腫瘍細胞で刺激された際の増殖能が、選抜なしで生成されたＴ細胞（１Ｇ４ ＫＩ）と同等であることを示している。
実施例８
本実施例は、スプリット－ＤＨＦＲ戦略によって、二重改変したＴ細胞を効率的に濃縮できること、またこの濃縮がＭＴＸ用量依存的な様式で機能することを示すものである。
本実施例は、スプリット－ＤＨＦＲ戦略によって、二重改変したＴ細胞を効率的に濃縮できること、またこの濃縮がＭＴＸ用量依存的な様式で機能することを示すものである。
図２８は、ＢＣ４５およびＢＣ４６に二重導入を行ったＦＡＣＳの結果を示している。２つのバフィーコート（ＢＣ４５およびＢＣ４６）から単離し、活性化したヒト初代Ｔ細胞に、ＭＴＸ耐性マウスＤＨＦＲＦＳ変異体（ｍＤＨＦＲｍｔ）をＮ末端およびＣ末端タンパク質部分（ベクターＡおよびＢ）に分割し、ホモ二量体化（ＧＣＮ４）またはヘテロ二量体化（ＪＵＮ－ＦＯＳ）ロイシンジッパーに融合させたものをコードしているＢＥＡＶレトロウイルスベクターを二重感染させた。また、ベクターＡとＢはそれぞれ、形質導入マーカーであるＬｙ６ＧまたはＣＤ９０．２をコードしている。ウイルス感染させた３日後に、導入効率のＦＡＣＳ分析を実施した。このデータは、ベクター対１７－１８（ＧＣＮ４－ｍＤＨＦＲｍｔ＿ＡおよびＧＣＮ４－ｍＤＨＦＲｍｔ＿Ｂ）およびベクター対３０－３１（ＪＵＮ－ｍＤＨＦＲｍｔ＿Ａ－２ＡおよびＦＯＳ－ｍＤＨＦＲｍｔ＿Ｂ－２Ａ）を用いたときに、細胞が効率的に形質転換されたことを示している。これらベクター対の二重導入効率は、３４．４％から７２．４％と様々であった。対照的に、ベクター対２１－２２（ＪＵＮ－ｍＤＨＦＲｍｔ＿ＡおよびＦＯＳ－ｍＤＨＦＲｍｔ＿Ｂ）およびベクター対２３－２４（ＧＣＮ４－ｍＤＨＦＲｍｔ＿Ａ－２ＡおよびＧＣＮ４－ｍＤＨＦＲｍｔ＿Ｂ－２Ａ）の二重導入効率は相対的に低かった（０．０５８％から０．１２％）。二重に形質導入した細胞を濃縮できるのか否かを確認するために、ベクター対１７－１８および対３０－３１の細胞に大量の未導入細胞を混合し、導入効率が低かった状況を模擬的に作り出した。
図２９は、ＢＣ４５細胞をＭＴＸ選抜した結果を示している。図２８のＢＣ４５細胞を、未処理のまま置くか（上段）、または２５ｎＭ（中段）もしくは５０ｎＭ（下段）のＭＴＸで４日間処理し（形質導入効率を決定した後）、その後、二重導入細胞の濃縮をＦＡＣＳ分析によって測定した。このデータは、ベクター対１７－１８を感染させた細胞は１１％から４１％（２５ｎＭのＭＴＸで３．７倍）および６７％（５０ｎＭのＭＴＸで６．１倍）に濃縮され、ベクター対２１－２２を感染させた細胞は０．１２％から０．５３％（５０ｎＭのＭＴＸで４．４倍）に濃縮され、ベクター対２３－２４を感染させた細胞は０．１８％から２．１８％（５０ｎＭのＭＴＸで１２倍）に濃縮され、そしてベクター対３０－３１を感染させた細胞は６％から３２％（２５ｎＭのＭＴＸで５．３倍）および６３％（５０ｎＭのＭＴＸで１０．５倍）に濃縮されたことを示している。合わせてこれらのデータは、スプリット－ＤＨＦＲ戦略によって、二重改変したＴ細胞を効率的に濃縮できること、またこの濃縮がＭＴＸ用量依存的な様式で機能することを示している。
図３０は、ＢＣ４６細胞をＭＴＸ選抜した結果を示している。図２８のＢＣ４６細胞を、未処理のまま置くか（上段）、または２５ｎＭ（中段）もしくは５０ｎＭ（下段）のＭＴＸで４日間処理し（形質導入効率を決定した後）、その後、二重導入細胞の濃縮をＦＡＣＳ分析によって測定した。このデータは、ベクター対１７－１８を感染させた細胞は１３％から３８％（２５ｎＭのＭＴＸで２．９倍）および６８％（５０ｎＭのＭＴＸで５．２倍）に濃縮され、ベクター対２１－２２を感染させた細胞は０．０５％から０．３１％（５０ｎＭのＭＴＸで６．２倍）に濃縮され、ベクター対２３－２４を感染させた細胞は０．１４％から０．８２％（５０ｎＭのＭＴＸで５．９倍）に濃縮され、そしてベクター対３０－３１を感染させた細胞は７％から２５％（２５ｎＭのＭＴＸで３．６倍）および５８％（５０ｎＭのＭＴＸで８．３倍）に濃縮されたことを示している。合わせてこれらのデータは、スプリット－ＤＨＦＲ戦略によって、二重改変したＴ細胞を効率的に濃縮できること、またこの濃縮がＭＴＸ用量依存的な様式で機能することを示している。
図３１は、より高濃度のＭＴＸによってＢＣ４５細胞を選抜した結果を示している。図２９のＢＣ４５細胞を、さらに３日間、継続して１００ｎＭのＭＴＸで処理し、その後、二重導入細胞の濃縮をＦＡＣＳ分析によって測定した。このデータは、ベクター対１７－１８を感染させた細胞は７．８５％から６５．９％（中段；８．４倍）および７５．８％（下段；９．７倍）に濃縮され、ベクター対２１－２２を感染させた細胞は０．０３％から０．３４％（中段；１１．３倍）および２．８２％（下段；９４倍）に濃縮され、ベクター対２３－２４を感染させた細胞は０．０８％から２．３３％（中段；２９倍）および１１％（下段；１３８倍）に濃縮され、そしてベクター対３０－３１を感染させた細胞は４．４％から６８％（中段；１５．５倍）および８３％（下段；１８．９倍）に濃縮されたことを示している。合わせてこれらのデータは、スプリット－ＤＨＦＲ戦略によって、二重改変したＴ細胞を効率的に濃縮できること、またこの濃縮がＭＴＸ用量依存的な様式で機能することを示している。
図３２は、より高濃度のＭＴＸによってＢＣ４６細胞を選抜した結果を示している。図３０のＢＣ４６細胞を、さらに３日間、継続して１００ｎＭのＭＴＸで処理し、その後、二重導入細胞の濃縮をＦＡＣＳ分析によって測定した。このデータは、ベクター対１７－１８を感染させた細胞は９．８６％から５９％（中段；６倍）および８０％（下段；８．１倍）に濃縮され、ベクター対２１－２２を感染させた細胞は０．０５％から０．２％（中段；４倍）および１．１６％（下段；２３．２倍）に濃縮され、ベクター対２３－２４を感染させた細胞は０．０７％から０．４％（中段；５．７倍）および１．８３％（下段；２６．１倍）に濃縮され、そしてベクター対３０－３１を感染させた細胞は４．５％から４７％（中段；１０．４倍）および７６％（下段；１６．９倍）に濃縮されたことを示している。合わせてこれらのデータは、スプリット－ＤＨＦＲ戦略によって、二重改変したＴ細胞を効率的に濃縮できること、またこの濃縮がＭＴＸ用量依存的な様式で機能することを示している。
実施例９
本実施例は、変異型ＪＵＮ－ＦＯＳロイシンジッパーを利用したスプリット－ＤＨＦＲシステムを使うことで、野生型ＪＵＮ－ＦＯＳロイシンジッパーを利用したシステムと同様の効率で、二重改変したＴ細胞を濃縮できることを示すものである。
本実施例は、変異型ＪＵＮ－ＦＯＳロイシンジッパーを利用したスプリット－ＤＨＦＲシステムを使うことで、野生型ＪＵＮ－ＦＯＳロイシンジッパーを利用したシステムと同様の効率で、二重改変したＴ細胞を濃縮できることを示すものである。
図４３Ａおよび４３Ｂは、二重改変したＢＣ５４Ｔ細胞のＭＴＸ選抜の結果を示している。ＢＣ５４のバフィーコートから単離し、活性化したヒト初代Ｔ細胞に、ＭＴＸ耐性マウスＤＨＦＲＦＳ変異体（ｍＤＨＦＲｍｔ）をＮ末端およびＣ末端タンパク質部分（ベクターＡおよびＢ）に分割し、ヘテロ二量体化ＪＵＮ－ＦＯＳロイシンジッパーと融合させたものをコードしているＢＥＡＶレトロウイルスベクターを二重感染させた。ＪＵＮＷＴは野生型のＪＵＮロイシンジッパーを表し、ＦＯＳＷＴは野生型のＦＯＳロイシンジッパーを表し、ＪｕｎＭＵＴ３ＡＡは、ＦＯＳに由来する３つの酸性アミノ酸を含む変異型のＪＵＮロイシンジッパーを表し、ＦｏｓＭＵＴ３ＡＡは、ＪＵＮに由来する３つの塩基性アミノ酸を含む変異型ＦＯＳロイシンジッパーを表す。さらにベクターＡおよびＢはそれぞれ、形質導入マーカーであるＬｙ６ＧおよびＣＤ９０．２もコードしている。形質導入の４日後から処理を開始し、細胞を未処理のまま置くか（上段）または１００ｎＭのＭＴＸで２日間処理し（下段）、その後、二重導入された細胞の濃縮をＦＡＣＳ分析で測定した。このデータは、ベクター対ＪＵＮＷＴ－ｍＤＨＦＲ＿Ａ＋ＦＯＳＷＴ－ｍＤＨＦＲ＿Ｂを感染させた細胞は７．９７％から５４．１％（６．８倍）に濃縮され、ベクター対ＪｕｎＭＵＴ３ＡＡ－ｍＤＨＦＲ＿Ａ＋ＦｏｓＭＵＴ３ＡＡ－ｍＤＨＦＲ＿Ｂを感染させた細胞は１０．３％から５７．９％（５．６倍）に濃縮され、ベクター対ＪＵＮＷＴ－ｍＤＨＦＲ＿Ａ＋ＦｏｓＭＵＴ３ＡＡ－ｍＤＨＦＲ＿Ｂを感染させた細胞は６．２６％から１２．０％（１．９倍）に濃縮され、そしてベクター対ＪｕｎＭＵＴ３ＡＡ－ｍＤＨＦＲ＿Ａ＋ＦＯＳＷＴ－ｍＤＨＦＲ＿Ｂを感染させた細胞は７．７３％から３０．５％（３．９倍）に濃縮されたことを示している。合わせてこれらのデータは、３つの電荷対変異を有する変異型ＪＵＮ－ＦＯＳロイシンジッパーを利用するスプリット－ＤＨＦＲ戦略によって、二重改変したＴ細胞を効率的に濃縮できるが、この３つの電荷対変異が野生型ＪＵＮおよびＦＯＳロイシンジッパーとの相互作用を阻害にするには不十分であることを示している。
図４４Ａ～４４Ｄは、二重改変したＢＣ７６Ｔ細胞のＭＴＸ選抜の結果を示している。ＢＣ７６のバフィーコートから単離し、活性化したヒト初代Ｔ細胞に、ＭＴＸ耐性マウスＤＨＦＲＦＳ変異体（ｍＤＨＦＲｍｔ）をＮ末端およびＣ末端タンパク質部分（ベクターＡおよびＢ）に分割し、ヘテロ二量体化ＪＵＮ－ＦＯＳロイシンジッパーと融合させたものをコードしているレトロウイルスベクターを二重感染させた。ＪＵＮＷＴは野生型のＪＵＮロイシンジッパーを表し、ＦＯＳＷＴは野生型のＦＯＳロイシンジッパーを表し、ＪｕｎＭＵＴ３ＡＡは、ＦＯＳに由来する３つの酸性アミノ酸を含む変異型のＪＵＮロイシンジッパーを表し、ＦｏｓＭＵＴ３ＡＡは、ＪＵＮに由来する３つの塩基性アミノ酸を含む変異型ＦＯＳロイシンジッパーを表し、ＪｕｎＭＵＴ４ＡＡは、ＦＯＳに由来する４つの酸性アミノ酸を含む変異型のＪＵＮロイシンジッパーを表し、ＦｏｓＭＵＴ４ＡＡは、ＪＵＮに由来する４つの塩基性アミノ酸を含む変異型ＦＯＳロイシンジッパーを表す。さらにベクターＡおよびＢはそれぞれ、形質導入マーカーであるＬｙ６ＧおよびＣＤ９０．２もコードしている。形質導入の４日後から処理を開始し、細胞を未処理のまま置くか（上段）または１００ｎＭのＭＴＸで１０日間処理し（下段）、その後、二重導入された細胞の濃縮をＦＡＣＳ分析で測定した。このデータは、ベクター対ＪＵＮＷＴ－ｍＤＨＦＲ＿Ａ＋ＦＯＳＷＴ－ｍＤＨＦＲ＿Ｂを感染させた細胞は０．６１％から８０．４％（１３２倍）に濃縮され、ベクター対ＪｕｎＭＵＴ３ＡＡ－ｍＤＨＦＲ＿Ａ＋ＦｏｓＭＵＴ３ＡＡ－ｍＤＨＦＲ＿Ｂを感染させた細胞は０．９８％から７０．９％（７２倍）に濃縮され、ベクター対ＪＵＮＷＴ－ｍＤＨＦＲ＿Ａ＋ＦｏｓＭＵＴ３ＡＡ－ｍＤＨＦＲ＿Ｂを感染させた細胞は０．９７％から３．０１％（３．１倍）に濃縮され、ベクター対ＪｕｎＭＵＴ３ＡＡ－ｍＤＨＦＲ＿Ａ＋ＦＯＳＷＴ－ｍＤＨＦＲ＿Ｂを感染させた細胞は１．０９％から２０．９％（１９倍）に濃縮され、ベクター対ＪｕｎＭＵＴ４ＡＡ－ｍＤＨＦＲ＿Ａ＋ＦｏｓＭＵＴ４ＡＡ－ｍＤＨＦＲ＿Ｂを感染させた細胞は１．０４％から７２．６％（７０倍）に濃縮され、ベクター対ＪＵＮＷＴ－ｍＤＨＦＲ＿Ａ＋ＦｏｓＭＵＴ４ＡＡ－ｍＤＨＦＲ＿Ｂを感染させた細胞は１．００％から１．４２％（１．４倍）に濃縮され、そしてベクター対ＪｕｎＭＵＴ４ＡＡ－ｍＤＨＦＲ＿Ａ＋ＦＯＳＷＴ－ｍＤＨＦＲ＿Ｂを感染させた細胞は０．８６％から２．２３％（２．６倍）に濃縮されたことを示している。合わせてこれらのデータは、４つの電荷対変異を有する変異型ＪＵＮ－ＦＯＳロイシンジッパーを利用するスプリット－ＤＨＦＲ戦略によって、二重改変したＴ細胞を効率的に濃縮できること、またこの４つの電荷対変異が野生型ＪＵＮおよびＦＯＳロイシンジッパーとの相互作用の大部分を阻害するのに十分であることを示している。
実施例１０
本実施例は、変異型ＦＫＢＰ１２二量体化ドメインを利用したスプリット－ＤＨＦＲシステムを使うことで、化学的な二量体化誘導剤であるＡＰ１９０３存在下において、二重改変したＴ細胞を濃縮できることを示すものである。
本実施例は、変異型ＦＫＢＰ１２二量体化ドメインを利用したスプリット－ＤＨＦＲシステムを使うことで、化学的な二量体化誘導剤であるＡＰ１９０３存在下において、二重改変したＴ細胞を濃縮できることを示すものである。
図４５Ａ～４５Ｂは、二重改変したＢＣ８１Ｔ細胞のＭＴＸ選抜の結果を示している。ＢＣ８１のバフィーコートから単離し、活性化したヒト初代Ｔ細胞に、ＭＴＸ耐性マウスＤＨＦＲＦＳ変異体（ｍＤＨＦＲ）をＮ末端およびＣ末端タンパク質部分（ベクターＡおよびＢ）に分割し、ホモ量体化変異型ＦＫＢＰ１２ドメインと融合させたものをコードしているレトロウイルスベクターを二重感染させた。未導入は形質導入していない細胞を表し、ＦＫＢＰ１２Ｆ３６Ｖは、ＡＰ１９０３二量体化剤への結合を促進するＦ３６Ｖ変異をもつＦＫＢＰ１２タンパク質を表す。さらにベクターＡおよびＢはそれぞれ、形質導入マーカーであるＬｙ６ＧおよびＣＤ９０．２もコードしている。形質導入の４日後から処理を開始し、細胞を未処理のまま置くか（図４５Ａ）または１０ｎＭのＡＰ１９０３で４時間処理した（図４５Ｂ）。その後、さらに細胞を未処理のまま置くか（上段）、または１００ｎＭのＭＴＸで８日間処理し（下段）、その後、二重導入された細胞の濃縮をＦＡＣＳ分析で測定した。このデータは、ベクター対ＦＫＢＰ１２Ｆ３６Ｖ－ｍＤＨＦＲ＿Ａ＋ＦＫＢＰ１２Ｆ３６Ｖ－ｍＤＨＦＲ＿Ｂを感染させたがＡＰ１９０３処理を行わなかった細胞は０．０５１％から０．０４２％（０．８２倍）に濃縮され、ベクター対ＦＫＢＰ１２Ｆ３６Ｖ－ｍＤＨＦＲ＿Ａ＋ＦＫＢＰ１２Ｆ３６Ｖ－ｍＤＨＦＲ＿Ｂを感染させ、さらにＡＰ１９０３を処理した細胞は０．０６１％から１８．１％（２９７倍）に濃縮されたことを示している。合わせてこれらのデータは、変異型ＦＫＢＰ１２二量体化ドメインを利用したスプリット－ＤＨＦＲシステムによって、二重改変したＴ細胞を効率的に濃縮できること、またこの濃縮がＡＰ１９０３依存的な様式で機能することを示している。
実施例１１
本実施例は、変異型ＦＫＢＰ１２二量体化ドメインまたは変異型ＪＵＮ－ＦＯＳロイシンジッパーを利用したスプリット－ＤＨＦＲシステムを使うことで、第一の外因性タンパク質が第一の遺伝子座に、そして第二の外因性タンパク質が第二の遺伝子座にノックインされた二重改変Ｔ細胞を濃縮できることを示すものである。
本実施例は、変異型ＦＫＢＰ１２二量体化ドメインまたは変異型ＪＵＮ－ＦＯＳロイシンジッパーを利用したスプリット－ＤＨＦＲシステムを使うことで、第一の外因性タンパク質が第一の遺伝子座に、そして第二の外因性タンパク質が第二の遺伝子座にノックインされた二重改変Ｔ細胞を濃縮できることを示すものである。
図４６は、二重改変したＢＣ７８Ｔ細胞のＭＴＸ選抜の結果を示している。ＢＣ７８のバフィーコートから単離し、活性化したヒト初代Ｔ細胞に、Ｃａｓ９ ＲＮＰと、ＭＴＸ耐性マウスＤＨＦＲＦＳ変異体（ｍＤＨＦＲ）をＮ末端およびＣ末端タンパク質部分（修復鋳型ＡおよびＢ）に分割し、ホモ二量体化変異型ＦＫＢＰ１２ドメインまたはヘテロ二量体化変異型ＪＵＮ－ＦＯＳロイシンジッパーと融合させたものをコードしている修復鋳型をエレクトロポレーションした。未編集はエレクトロポレーションしていない細胞を表し、ＦＫＢＰ１２Ｆ３６Ｖ－ｍＤＨＦＲ＿Ａは、ＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲとＦ３６Ｖ変異を含むＦＫＢＰ１２タンパク質をコードしている修復鋳型をＴＲＡＣ遺伝子座にノックインした細胞を表し、ＦＫＢＰ１２Ｆ３６Ｖ－ｍＤＨＦＲ＿Ｂは、ドミナントネガティブＴＧＦＢＲ２、Ｌｙ６ＧおよびＦ３６Ｖ変異を含むＦＫＢＰ１２タンパク質をコードしている修復鋳型をＢ２Ｍ遺伝子座にノックインした細胞を表し、ＪｕｎＭＵＴ４ＡＡ－ｍＤＨＦＲ＿Ａは、ＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲとＦＯＳに由来する４つの酸性アミノ酸を含む変異型ＪＵＮロイシンジッパーをコードしている修復鋳型をＴＲＡＣ遺伝子座にノックインした細胞を表し、そしてＦｏｓＭＵＴ４ＡＡ－ｍＤＨＦＲ＿Ｂは、ドミナントネガティブＴＧＦＢＲ２、Ｌｙ６ＧおよびＪＵＮに由来する４つの塩基性アミノ酸を含む変異型ＦＯＳロイシンジッパーをコードしている修復鋳型をＢ２Ｍ遺伝子座にノックインした細胞を表す。エレクトロポレーションの４日後から処理を開始し、細胞を未処理のまま置くか（図４６Ａ左図、図４６Ｂ）または１０ｎＭのＡＰ１９０３で１時間処理した（図４６Ａ右図）。その後、さらに細胞を未処理のまま置くか（上段）、または１００ｎＭのＭＴＸで６日間処理し（下段）、その後、二重導入された細胞の濃縮をＦＡＣＳ分析で測定した。このデータは、修復鋳型対ＦＫＢＰ１２Ｆ３６Ｖ－ｍＤＨＦＲ＿Ａ＋ＦＫＢＰ１２Ｆ３６Ｖ－ｍＤＨＦＲ＿Ｂで編集した細胞は０．２１％から２２．１％（１０５倍）に濃縮され、修復鋳型対ＪｕｎＭＵＴ４ＡＡ－ｍＤＨＦＲ＿Ａ＋ＦｏｓＭＵＴ４ＡＡ－ｍＤＨＦＲ＿Ｂで編集した細胞は０．２２％から１１．８％（５４倍）に濃縮されたことを示している。合わせてこれらのデータは、変異型ＦＫＢＰ１２二量体化ドメインまたは４つの電荷対変異を含む変異型ＪＵＮ－ＦＯＳロイシンジッパーを利用したスプリット－ＤＨＦＲシステムを使うことで、複数の外因性タンパク質が２つの異なる遺伝子座にノックインされた二重改変Ｔ細胞を効率的に濃縮できることを示している。
実施例１２
本実施例は、変異型ＪＵＮ－ＦＯＳロイシンジッパーを利用するスプリット－ＤＨＦＲシステムを使うことで、野生型ＪＵＮ－ＦＯＳロイシンジッパーを利用したシステムと同様の効率で、二重改変したＴ細胞を濃縮できることを示すものである。
本実施例は、変異型ＪＵＮ－ＦＯＳロイシンジッパーを利用するスプリット－ＤＨＦＲシステムを使うことで、野生型ＪＵＮ－ＦＯＳロイシンジッパーを利用したシステムと同様の効率で、二重改変したＴ細胞を濃縮できることを示すものである。
図４７Ａ、４７Ｂおよび４８は、提供者ＡおよびＢ由来のＴ細胞を二重改変し、ＭＴＸで選抜した結果を示している。提供者ＡおよびＢのバフィーコートから単離し、活性化したヒト初代Ｔ細胞に、ＭＴＸ耐性マウスＤＨＦＲＦＳ変異体（ｍＤＨＦＲ）をＮ末端およびＣ末端タンパク質部分（ベクターＡおよびＢ）に分割し、ヘテロ二量体化ＪＵＮ－ＦＯＳロイシンジッパーと融合させたものをコードしているレトロウイルスベクターを二重感染させた。ＪＵＮＷＴは野生型のＪＵＮロイシンジッパーを表し、ＦＯＳＷＴは野生型のＦＯＳロイシンジッパーを表し、ＪｕｎＭＵＴ３ＡＡは、ＦＯＳに由来する３つの酸性アミノ酸を含む変異型のＪＵＮロイシンジッパーを表し、ＦｏｓＭＵＴ３ＡＡは、ＪＵＮに由来する３つの塩基性アミノ酸を含む変異型ＦＯＳロイシンジッパーを表す。さらにベクターＡおよびＢはそれぞれ、形質導入マーカーであるＬｙ６ＧおよびＣＤ９０．２もコードしている。形質導入の４日後から処理を開始し、細胞（提供者Ｂ由来）を未処理のまま置くか（図４７Ａおよび４７Ｂ上段）または１００ｎＭのＭＴＸで４日間処理し（図４７Ａおよび４７Ｂ２下段）、その後、二重導入された細胞の濃縮をＦＡＣＳ分析で測定した。このデータは、ベクター対ＪＵＮＷＴ－ｍＤＨＦＲ＿Ａ＋ＦＯＳＷＴ－ｍＤＨＦＲ＿Ｂを感染させた細胞（提供者Ｂ由来）は５．１８％から８０．５％（１５．５倍）に濃縮され、ベクター対ＪｕｎＭＵＴ３ＡＡ－ｍＤＨＦＲ＿Ａ＋ＦｏｓＭＵＴ３ＡＡ－ｍＤＨＦＲ＿Ｂを感染させた細胞は８．３７％から８８．１％（１０．５倍）に濃縮され、ベクター対ＪＵＮＷＴ－ｍＤＨＦＲ＿Ａ＋ＦｏｓＭＵＴ３ＡＡ－ｍＤＨＦＲ＿Ｂを感染させた細胞は５．２４％から２０．８％（４倍）に濃縮され、そしてベクター対ＪｕｎＭＵＴ３ＡＡ－ｍＤＨＦＲ＿Ａ＋ＦＯＳＷＴ－ｍＤＨＦＲ＿Ｂを感染させた細胞は６．２８％から７０．５％（１１．２倍）に濃縮されたことを示している。合わせてこれらのデータは、３つの電荷対変異を有する変異型ＪＵＮ－ＦＯＳロイシンジッパーを利用するスプリット－ＤＨＦＲ戦略によって、二重改変したＴ細胞を効率的に濃縮できるが、この３つの電荷対変異が野生型ＪＵＮおよびＦＯＳロイシンジッパーとの相互作用を阻害にするには不十分であることを示している。図４８は、提供者Ａと提供者Ｂの両者由来の細胞に関するＦＡＣＳの数値化したデータを示している。
図４９および５０は、二人の提供者に由来するＴ細胞を二重改変し、ＭＴＸで選抜した結果を示している。二人の提供者（ＡおよびＢ）由来のバフィーコートから単離し、活性化したヒト初代Ｔ細胞に、ＭＴＸ耐性マウスＤＨＦＲＦＳ変異体（ｍＤＨＦＲ）をＮ末端およびＣ末端タンパク質部分（ベクターＡおよびＢ）に分割し、より短い長さのヘテロ二量体化ＪＵＮ－ＦＯＳロイシンジッパー（この図に示す全てのＦＯＳ－ＪＵＮロイシンジッパーは長さが短いものである）と融合させたものをコードしているレトロウイルスベクターを二重感染させた。ＪＵＮＷＴは野生型のＪＵＮロイシンジッパーを表し、ＦＯＳＷＴは野生型のＦＯＳロイシンジッパーを表し、ＪｕｎＭＵＴ３ＡＡは、ＦＯＳに由来する３つの酸性アミノ酸を含む変異型のＪＵＮロイシンジッパーを表し、ＦｏｓＭＵＴ３ＡＡは、ＪＵＮに由来する３つの塩基性アミノ酸を含む変異型ＦＯＳロイシンジッパーを表し、ＪｕｎＭＵＴ４ＡＡは、ＦＯＳに由来する４つの酸性アミノ酸を含む変異型のＪＵＮロイシンジッパーを表し、ＦｏｓＭＵＴ４ＡＡは、ＪＵＮに由来する４つの塩基性アミノ酸を含む変異型ＦＯＳロイシンジッパーを表す。さらにベクターＡおよびＢはそれぞれ、形質導入マーカーであるＬｙ６ＧおよびＣＤ９０．２もコードしている。形質導入の４日後から処理を開始し、細胞を未処理のまま置くか（上段）または１００ｎＭのＭＴＸで６日間処理し（下段）、その後、二重導入された細胞の濃縮をＦＡＣＳ分析で測定した。図４９のデータは、ベクター対ＪＵＮＷＴ－ｍＤＨＦＲ＿Ａ＋ＦＯＳＷＴ－ｍＤＨＦＲ＿Ｂを感染させた細胞は６６±６．６（提供者Ａ）および７．６±１．１（提供者Ｂ）倍に濃縮され、ベクター対ＪｕｎＭＵＴ３ＡＡ－ｍＤＨＦＲ＿Ａ＋ＦｏｓＭＵＴ３ＡＡ－ｍＤＨＦＲ＿Ｂを感染させた細胞は４９±１．５（提供者Ａ）、６．６±０．９（提供者Ｂ）倍に濃縮され、ベクター対ＪＵＮＷＴ－ｍＤＨＦＲ＿Ａ＋ＦｏｓＭＵＴ３ＡＡ－ｍＤＨＦＲ＿Ｂを感染させた細胞は１．７±０．１（提供者Ａ）および１．４±０．１７（提供者Ｂ）倍に濃縮され、ベクター対ＪｕｎＭＵＴ３ＡＡ－ｍＤＨＦＲ＿Ａ＋ＦＯＳＷＴ－ｍＤＨＦＲ＿Ｂを感染させた細胞は３．２±０．６６（提供者Ａ）および１．５±０．３８（提供者Ｂ）倍に濃縮されたことを示している。図５０のデータは、ベクター対ＪｕｎＭＵＴ４ＡＡ－ｍＤＨＦＲ＿Ａ＋ＦｏｓＭＵＴ４ＡＡ－ｍＤＨＦＲ＿Ｂを感染させた細胞は３９±１３（提供者Ａ）および４．７±０．３２（提供者Ｂ）倍に濃縮され、ベクター対ＪＵＮＷＴ－ｍＤＨＦＲ＿Ａ＋ＦｏｓＭＵＴ４ＡＡ－ｍＤＨＦＲ＿Ｂを感染させた細胞は１．５±０．１３（提供者Ａ）および１．２±０．０４３（提供者Ｂ）に濃縮され、そしてベクター対ＪｕｎＭＵＴ４ＡＡ－ｍＤＨＦＲ＿Ａ＋ＦＯＳＷＴ－ｍＤＨＦＲ＿Ｂを感染させた細胞は２．２±０．４３（提供者Ａ）および１．５±０．２１（提供者Ｂ）に濃縮されたことを示している。合わせてこれらのデータは、より短く、３つもしくは４つの電荷対変異を有する変異型ＪＵＮ－ＦＯＳロイシンジッパーを利用するスプリット－ＤＨＦＲシステムによって、二重改変したＴ細胞を効率的に濃縮できること、またこの３つもしくは４つの電荷対変異が野生型ＪＵＮおよびＦＯＳロイシンジッパーとの相互作用の大部分を阻害するのに十分であることを示している。
実施例１３
本実施例は、８つの電荷対変異型ＪＵＮ－ＦＯＳロイシンジッパーを利用したスプリット－ＤＨＦＲシステムでは、二重改変したＴ細胞を濃縮できないことを示すものである。
本実施例は、８つの電荷対変異型ＪＵＮ－ＦＯＳロイシンジッパーを利用したスプリット－ＤＨＦＲシステムでは、二重改変したＴ細胞を濃縮できないことを示すものである。
図５１Ａ、５１Ｂ、および５２は、提供者ＡおよびＢ由来のＴ細胞を二重改変し、ＭＴＸで選抜した結果を示している。提供者ＡおよびＢのバフィーコートから単離し、活性化したヒト初代Ｔ細胞に、ＭＴＸ耐性マウスＤＨＦＲＦＳ変異体（ｍＤＨＦＲ）をＮ末端およびＣ末端タンパク質部分（ベクターＡおよびＢ）に分割し、ヘテロ二量体化ＪＵＮ－ＦＯＳロイシンジッパーと融合させたものをコードしているレトロウイルスベクターを二重感染させた。ｓＪＵＮはより短い野生型ＪＵＮロイシンジッパーを表し、ｓＦＯＳは野生型ＦＯＳロイシンジッパーを表し、ｓＪＵＮＭＵＴ８ＡＡは、より短く、ＦＯＳに由来する８つの酸性アミノ酸を含む変異型ＪＵＮロイシンジッパーを表し、ｓＦＯＳＭＵＴ８ＡＡはＪＵＮに由来する８つの塩基性アミノ酸を含む変異型ＦＯＳロイシンジッパーを表す。さらにベクターＡおよびＢはそれぞれ、形質導入マーカーであるＬｙ６ＧおよびＣＤ９０．２もコードしている。形質導入の４日後から処理を開始し、細胞（提供者Ｂ由来）を未処理のまま置くか（図５１Ａおよび５１Ｂ上段）または１００ｎＭのＭＴＸで６日間処理し（図５１Ａおよび５１Ｂ２下段）、その後、二重導入された細胞の濃縮をＦＡＣＳ分析で測定した。図５１Ａおよび５１Ｂのデータは、ベクター対ｓＪＵＮ－ｍＤＨＦＲ＿Ａ＋ｓＦＯＳ－ｍＤＨＦＲ＿Ｂを感染させた細胞（提供者Ａ由来）は６．５２％から８０．４％（１２．３倍）に濃縮され、ベクター対ｓＪＵＮＭＵＴ８ＡＡ－ｍＤＨＦＲ＿Ａ＋ｓＦＯＳＭＵＴ８ＡＡ－ｍＤＨＦＲ＿Ｂを感染させた細胞は０．４８％から１．０７％（２．２倍）に濃縮され、ベクター対ｓＪＵＮ－ｍＤＨＦＲ＿Ａ＋ｓＦＯＳＭＵＴ８ＡＡ－ｍＤＨＦＲ＿Ｂを感染させた細胞は３．９１％から６％（１．５倍）に濃縮され、ベクター対ｓＪＵＮＭＵＴ８ＡＡ－ｍＤＨＦＲ＿Ａ＋ｓＦＯＳ－ｍＤＨＦＲ＿Ｂを感染させた細胞は０．８２％から０．７３％（０．９倍）に濃縮されたことを示している。図５２は、提供者ＡとＢ両者のＦＡＣＳプロットを数値化したデータを示している。まとめるとこれらのデータは、８つの電荷対へにを含む変異型ＪＵＮ－ＦＯＳロイシンジッパーを利用したスプリット－ＤＨＦＲシステムでは二重改変したＴ細胞を濃縮できなかったことを示している。
実施例１４
本実施例は、変異型ＦＫＢＰ１２二量体化ドメインを利用したスプリット－ＤＨＦＲシステムを使うことで、化学的な二量体化誘導剤であるＡＰ１９０３存在下において、二重改変したＴ細胞を濃縮できることを示すものである。
本実施例は、変異型ＦＫＢＰ１２二量体化ドメインを利用したスプリット－ＤＨＦＲシステムを使うことで、化学的な二量体化誘導剤であるＡＰ１９０３存在下において、二重改変したＴ細胞を濃縮できることを示すものである。
図５３は、提供者ＡおよびＢ由来のＴ細胞を二重改変し、ＭＴＸで選抜した結果を示している。提供者ＡおよびＢに由来する２つのバフィーコートから単離し、活性化したヒト初代Ｔ細胞に、ＭＴＸ耐性マウスＤＨＦＲＦＳ変異体（ｍＤＨＦＲ）をＮ末端およびＣ末端タンパク質部分（ベクターＡおよびＢ）に分割し、ホモ量体化変異型ＦＫＢＰ１２ドメインと融合させたものをコードしているレトロウイルスベクターを二重感染させた。未導入は形質導入していない細胞を表し、ＦＫＢＰ１２Ｆ３６Ｖは、ＡＰ１９０３二量体化剤への結合を促進するＦ３６Ｖ変異をもつＦＫＢＰ１２タンパク質を表す。さらにベクターＡおよびＢはそれぞれ、形質導入マーカーであるＬｙ６ＧおよびＣＤ９０．２もコードしている。形質導入の４日後から処理を開始し、細胞を未処理のまま置くか、または１０ｎＭのＡＰ１９０３で４時間処理した。その後、さらに細胞を未処理のまま置くか、または１００ｎＭのＭＴＸで６日間処理し、その後、二重導入された細胞の濃縮をＦＡＣＳ分析で測定した。このデータは、ベクター対ＦＫＢＰ１２Ｆ３６Ｖ－ｍＤＨＦＲ＿Ａ＋ＦＫＢＰ１２Ｆ３６Ｖ－ｍＤＨＦＲ＿Ｂを感染させ、さらにＡＰ１９０３を処理した細胞はそれぞれ、１８８±５３（提供者Ａ）および３９±１８（提供者Ｂ）に濃縮されたことを示している。合わせてこれらのデータは、変異型ＦＫＢＰ１２二量体化ドメインを利用したスプリット－ＤＨＦＲシステムによって、二重改変したＴ細胞を効率的に濃縮できることを示している。
実施例１５
本実施例は、Ｂ２Ｍガイドは、Ｂ２Ｍ遺伝子座の効率的な切断を媒介可能であることを示すものである。
本実施例は、Ｂ２Ｍガイドは、Ｂ２Ｍ遺伝子座の効率的な切断を媒介可能であることを示すものである。
図５４は、Ｂ２Ｍ遺伝子座を標的とする効率的なガイドのスクリーニング結果を示している。バフィーコートから単離し、活性化したヒト初代Ｔ細胞に、別個のＢ２Ｍ遺伝子座を標的としている５つのＣａｓ９ ＲＮＰをエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの２日後、ＨＬＡ－ＡＢＣの発現を測定することによる細胞のＦＡＣＳ分析を実施した。このデータから、ｃｒＢ２Ｍ－４とｃｒＢ２Ｍ－５が、８０％を超えるノックアウト効率をもってＢ２Ｍ遺伝子座を標的可能であると示された。このデータに基づき、以降のノックイン実験にはｃｒＢ２Ｍ－４およびｃｒＢ２Ｍ－５を選択した。
〔アレンジメント（実施形態）の例示（ａ）：〕
１．遺伝子改変した細胞を選抜または濃縮するための方法であって、
ｉ）細胞に、該細胞中で第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現することが可能な、少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を導入すること、
ここで該細胞は、一般的な細胞培養用の培地中では該細胞が生存もおよび／または増殖もできない程度まで低減しているレベルの生存および／または増殖に必須のタンパク質を有しており、ここで該少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、標的ゲノム中の予め決められた部位に挿入された時に、該細胞中で発現するように操作可能（ｏｐｅｒａｂｌｅ）であるかまたは発現するように操作可能な状態になり、かつ、該少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、該生存および／または増殖のための該必須のタンパク質またはそのバリアントをコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含み、ここで該第二部分ヌクレオチド配列は目的のタンパク質をコードしており；ならびに
ｉｉ）該第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現する該細胞を選抜または濃縮するための外因性の薬理学的選択圧を含まない該一般的な細胞培養用の培地中で、該細胞を培養すること；
を含む、方法。
１．遺伝子改変した細胞を選抜または濃縮するための方法であって、
ｉ）細胞に、該細胞中で第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現することが可能な、少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を導入すること、
ここで該細胞は、一般的な細胞培養用の培地中では該細胞が生存もおよび／または増殖もできない程度まで低減しているレベルの生存および／または増殖に必須のタンパク質を有しており、ここで該少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、標的ゲノム中の予め決められた部位に挿入された時に、該細胞中で発現するように操作可能（ｏｐｅｒａｂｌｅ）であるかまたは発現するように操作可能な状態になり、かつ、該少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、該生存および／または増殖のための該必須のタンパク質またはそのバリアントをコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含み、ここで該第二部分ヌクレオチド配列は目的のタンパク質をコードしており；ならびに
ｉｉ）該第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現する該細胞を選抜または濃縮するための外因性の薬理学的選択圧を含まない該一般的な細胞培養用の培地中で、該細胞を培養すること；
を含む、方法。
２．遺伝子改変した細胞を選抜または濃縮するための方法であって、
ｉ）細胞の該生存および／または増殖のために必須の少なくとも１つの第一のタンパク質のレベルを、インビトロの通常の繁殖条件下では該細胞が生存もおよび／または増殖もできないレベルに低減すること；
ｉｉ）該細胞中で第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現することが可能で、かつ、該第一のタンパク質またはそのバリアントをコードしている第一部分ヌクレオチド配列と第二の発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列を含む、少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を該細胞に導入すること、
ここで該少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、標的ゲノム中の予め決められた部位に挿入された時に、該細胞中で発現するように操作可能であるかまたは発現するように操作可能な状態になり、かつ、該第二部分タンパク質は目的のタンパク質であり；ならびに
ｉｉｉ）該第一のタンパク質と第二のタンパク質の両方を発現する該細胞を濃縮するための外因性の薬理学的選択圧を用いずに、該細胞をインビトロの通常の繁殖条件下で培養すること；
を含む、方法。
ｉ）細胞の該生存および／または増殖のために必須の少なくとも１つの第一のタンパク質のレベルを、インビトロの通常の繁殖条件下では該細胞が生存もおよび／または増殖もできないレベルに低減すること；
ｉｉ）該細胞中で第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現することが可能で、かつ、該第一のタンパク質またはそのバリアントをコードしている第一部分ヌクレオチド配列と第二の発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列を含む、少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を該細胞に導入すること、
ここで該少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、標的ゲノム中の予め決められた部位に挿入された時に、該細胞中で発現するように操作可能であるかまたは発現するように操作可能な状態になり、かつ、該第二部分タンパク質は目的のタンパク質であり；ならびに
ｉｉｉ）該第一のタンパク質と第二のタンパク質の両方を発現する該細胞を濃縮するための外因性の薬理学的選択圧を用いずに、該細胞をインビトロの通常の繁殖条件下で培養すること；
を含む、方法。
３．該必須のタンパク質のレベルの該低減が、持続性または一過性の場合がある、アレンジメント１または２のいずれか１項に記載の方法。
４．該必須のタンパク質のレベルの該低減が、該必須のタンパク質をコードしている遺伝子のノックアウトを含む、アレンジメント２～３のいずれか１項に記載の方法。
５．該ノックアウトが、ＣＲＩＳＰＲリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）、ＴＡＬＥＮ、ＭｅｇａＴＡＬ、または他の任意のヌクレアーゼによって媒介される、アレンジメント４に記載の方法。
６．該必須のタンパク質のレベルの該低減が、該必須のタンパク質の該レベルのＲＮＡレベルでの一過性の低減を含む、アレンジメント２～３のいずれか１項に記載の方法。
７．該一過性の抑制が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）を介するものである、アレンジメント６に記載の方法。
８．該細胞が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ｉＮＫＴ細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、ｉＰＳＣ、神経系前駆細胞、網膜の遺伝子治療に関わる細胞型、または他の任意の細胞である、アレンジメント１～７のいずれか１項に記載の方法。
９．該第一部分ヌクレオチド配列のヌクレオチド配列が、ヌクレアーゼ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはＣＲＩＳＰＲｉ耐性を獲得するように変更されている、アレンジメント１～８のいずれか１項に記載の方法。
１０．該第一部分ヌクレオチド配列が、該必須の第一のタンパク質と同一のアミノ酸配列を有するタンパク質コードしている、アレンジメント９に記載の方法。
１１．該第一部分ヌクレオチド配列が、該第一のタンパク質のアミノ酸配列とは同一でない変異タンパク質をコードするように変更されている、アレンジメント１～１０のいずれか１項に記載の方法。
１２．該変異タンパク質が、該第一のタンパク質にはない特性を有する、アレンジメント１１に記載の方法。
１３．該特性に、これらに限定されるものではないが、活性の低下、活性の増強、および半減期の違いのうちの１つ以上が含まれる、アレンジメント１２に記載の方法。
１４．該第一部分および該第二部分のヌクレオチド配列の両方を、同じプロモーターによってもまたは異なるプロモーターによっても駆動することができる、アレンジメント１～１３のいずれか１項に記載の方法。
１５．該第二部分のヌクレオチド配列が、少なくとも１つの治療用遺伝子を含む、アレンジメント１～１４のいずれか１項に記載の方法。
１６．該第二部分のヌクレオチド配列が、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖を含有している新生抗原Ｔ細胞受容体複合体（ＴＣＲ）をコードしている、アレンジメント１～１５のいずれか１項に記載の方法。
１７．該必須のまたは第一のタンパク質が、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ２（ＩＭＰＤＨ２）、Ｏ－６－メチルグアニン－ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）、デオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ）、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシル基転移酵素１（ＨＰＲＴ１）、インターロイキン２受容体サブユニットガンマ（ＩＬ２ＲＧ）、アクチンベータ（ＡＣＴＢ）、真核生物翻訳伸長因子１アルファ１（ＥＥＦ１Ａ１）、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ１）、またはトランスフェリン受容体（ＴＦＲＣ）である、アレンジメント１～１６のいずれか１項に記載の方法。
１８．該第一部分のヌクレオチド配列がヌクレアーゼ耐性またはｓｉＲＮＡ耐性ＤＨＦＲ遺伝子を含み、該第二部分のヌクレオチド配列がＴＲＡ遺伝子およびＴＲＢ遺伝子を含む、アレンジメント１～１７のいずれか１項に記載の方法。
１９．該ＴＲＡ、ＴＲＢ、およびＤＨＦＲの遺伝子が単一の読み取り枠から発現するように操作可能に構成されている、アレンジメント１８に記載の方法。
２０．該ＴＲＡ、ＴＲＢ、およびＤＨＦＲの遺伝子が少なくとも１つのリンカーによって隔てられている、アレンジメント１９に記載の方法。
２１．該少なくとも１つのリンカー、ＴＲＡ、ＴＲＢ、およびＤＨＦＲの遺伝子の順番が、
ＴＲＡ－リンカー－ＴＲＢ－リンカー－ＤＨＦＲ、
ＴＲＡ－リンカー－ＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＢ、
ＴＲＢ－リンカー－ＴＲＡ－リンカー－ＤＨＦＲ、
ＴＲＢ－リンカー－ＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＡ、
ＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＡ－リンカー－ＴＲＢ、または
ＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＢ－リンカー－ＴＲＡ
である、アレンジメント２０に記載の方法。
ＴＲＡ－リンカー－ＴＲＢ－リンカー－ＤＨＦＲ、
ＴＲＡ－リンカー－ＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＢ、
ＴＲＢ－リンカー－ＴＲＡ－リンカー－ＤＨＦＲ、
ＴＲＢ－リンカー－ＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＡ、
ＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＡ－リンカー－ＴＲＢ、または
ＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＢ－リンカー－ＴＲＡ
である、アレンジメント２０に記載の方法。
２２．該少なくとも１つのリンカーが、少なくとも１つの自己切断２Ａペプチドおよび／または少なくとも１つのＩＲＥＳエレメントである、アレンジメント２０または２１に記載の方法。
２３．該ＤＨＦＲ、ＴＲＡ、およびＴＲＢの遺伝子が、内在性のＴＣＲプロモーターまたは他の任意の好適なプロモーターによって駆動され、該他の任意の好適なプロモーターとしては、これらに限定されるものではないが、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１／２、ＤＨＦＲ、ＥＥＦ１Ａ１、ＡＣＴＢ、Ｂ２Ｍ、ＣＤ５２、ＣＤ２、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＬＣＫ、ＬＡＴ、ＰＴＰＲＣ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＴＧＢ２、ＴＧＦＢＲ２、ＰＤＣＤ１、ＣＴＬＡ４、ＦＡＳ、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ（ＴＮＦＲ１）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＴＲＡＩＬＲ２）、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＢＴＬＡ、ＣＤ２００Ｒ１、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＨＡＶＣＲ２（ＴＩＭ３）、ＶＳＩＲ（ＶＩＳＴＡ）、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ４ＲＡ、ＥＩＦ４Ａ１、ＦＴＨ１、ＦＴＬ、ＨＳＰＡ５、およびＰＧＫ１などがある、アレンジメント１８～２２のいずれか１項に記載の方法。
２４．該２要素ヌクレオチド配列が該細胞の該ゲノム中に組み込まれる、アレンジメント１～２３のいずれか１項に記載の方法。
２５．該少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列が、該標的ゲノム中の該予め決められた部位に挿入された時に、発現するように操作可能な状態になり、該第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方が該標的ゲノム中のプロモーターによって駆動される、アレンジメント１～２４のいずれか１項に記載の方法。
２６．該組み込みが、ヌクレアーゼ媒介性部位特異的組み込み、トランスポゾン媒介性遺伝子送達、またはウイルス媒介性遺伝子送を介するものである、アレンジメント２４または２５に記載の方法。
２７．該ヌクレアーゼ媒介性部位特異的組み込みが、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰ、必要に応じてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰを介するものである、アレンジメント２６に記載の方法。
２８．スプリットインテインシステムを用いることをさらに含む、アレンジメント２７に記載の方法。
２９．該導入された２要素ヌクレオチド配列が、該細胞の該ゲノム中に組み込まれていない、アレンジメント１～２３のいずれか１項に記載の方法。
３０．内在性のＴＣＲ定常部位、ヌクレアーゼ耐性ＤＨＦＲ遺伝子をコードしている該第一部分のヌクレオチド配列、および新生抗原ＴＣＲをコードしている該第二部分のヌクレオチド配列を標的としているＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰが該細胞に送達される、アレンジメント１～２７のいずれか１項に記載の方法。
３１．該内在性のＴＣＲ定常部位が、ＴＣＲα定常（ＴＲＡＣ）部位であってもまたはＴＣＲβ定常（ＴＲＢＣ）部位であってもよい、アレンジメント３０に記載の方法。
３２．該送達が、エレクトロポレーション、または機械的もしくは化学的な膜透過処理に基づく方法によって行われる、アレンジメント３０または３１に記載の方法。
３３．第一のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰが内在性のジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子をノックアウトするために用いられ、第二のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰが内在性のＴＣＲ定常部位に、該ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ耐性ＤＨＦＲ遺伝子を含有している該第一部分のヌクレオチド配列と治療用ＴＣＲ遺伝子をコードしている該第二部分のヌクレオチド配列をノックインするために用いられる、アレンジメント１～５、８～２８、または３０～３２のいずれか１項に記載の方法。
３４．該第二のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰが、ノックインするために該ＴＲＡＣ部位を切断するＴＲＡＣ ＲＮＰである、アレンジメント３３に記載の方法。
３５．該ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰである、アレンジメント５、２７、３０、３３、または３４のいずれか１項に記載の方法。
３６．該一般的な細胞培養用の培地が、改変されていない細胞の成長および／または増殖に適したものである、アレンジメント１～３５のいずれか１項に記載の方法。
３７．該一般的な細胞培養用の培地が、いかなる外因性の選択圧も含まない、アレンジメント１～３６のいずれか１項に記載の方法。
３８．ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰが該標的ゲノム中の予め決められた部位に第二の２要素ヌクレオチドをノックインするために用いられ、必要に応じてここで該標的ゲノム中の該予め決められた部位がＢ２Ｍ遺伝子である、アレンジメント５～３７のいずれか１項に記載の方法。
３９．遺伝子改変した細胞を選抜または濃縮するための方法であって、
ｉ）細胞中で第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現することが可能な、少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を該細胞に導入すること、
ここで該細胞の該生存および／または増殖に必須のタンパク質の機能活性は、一般的な細胞培養用の培地中では該細胞が生存もおよび／または増殖もできない程度まで低減しており、
ここで該少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、標的ゲノム中の予め決められた部位に挿入された時に、該細胞中で発現するように操作可能であるかまたは発現するように操作可能な状態になり、かつ、該少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖のための該必須のタンパク質と実質的に等価な機能を付与する第一のタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、第二の発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含み、該第二のタンパク質は目的のタンパク質であり；ならびに
ｉｉ）該第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現する該細胞の選抜または濃縮を導く少なくとも１つの添加剤を含有している細胞培養用の培地中で該細胞を培養すること；
を含む、方法。
ｉ）細胞中で第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現することが可能な、少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を該細胞に導入すること、
ここで該細胞の該生存および／または増殖に必須のタンパク質の機能活性は、一般的な細胞培養用の培地中では該細胞が生存もおよび／または増殖もできない程度まで低減しており、
ここで該少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、標的ゲノム中の予め決められた部位に挿入された時に、該細胞中で発現するように操作可能であるかまたは発現するように操作可能な状態になり、かつ、該少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖のための該必須のタンパク質と実質的に等価な機能を付与する第一のタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、第二の発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含み、該第二のタンパク質は目的のタンパク質であり；ならびに
ｉｉ）該第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現する該細胞の選抜または濃縮を導く少なくとも１つの添加剤を含有している細胞培養用の培地中で該細胞を培養すること；
を含む、方法。
４０．遺伝子改変した細胞を選抜または濃縮するための方法であって、
ｉ）細胞の生存および／または増殖のために必須の少なくとも１つの第一のタンパク質の機能活性を、インビトロの通常の繁殖条件下では該細胞が生存もおよび／または増殖もできない該レベルまで低減すること；
ｉｉ）該細胞中で該第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現することが可能で、かつ、実質的に等価な機能を付与する第一のタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と第二の発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含む少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を該細胞に導入すること、
ここで該少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、該標的ゲノム中の予め決められた部位に挿入された時に、該細胞中で発現するように操作可能であるかまたは発現するように操作可能な状態になり、かつ、該第二のタンパク質は目的のタンパク質であり；ならびに
ｉｉｉ）該第一のタンパク質と第二のタンパク質の両方を発現する該細胞の選抜または濃縮を導く少なくとも１つの添加剤を含有している細胞培養用の培地中で該細胞を培養すること；
を含む、方法。
ｉ）細胞の生存および／または増殖のために必須の少なくとも１つの第一のタンパク質の機能活性を、インビトロの通常の繁殖条件下では該細胞が生存もおよび／または増殖もできない該レベルまで低減すること；
ｉｉ）該細胞中で該第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現することが可能で、かつ、実質的に等価な機能を付与する第一のタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と第二の発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含む少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を該細胞に導入すること、
ここで該少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、該標的ゲノム中の予め決められた部位に挿入された時に、該細胞中で発現するように操作可能であるかまたは発現するように操作可能な状態になり、かつ、該第二のタンパク質は目的のタンパク質であり；ならびに
ｉｉｉ）該第一のタンパク質と第二のタンパク質の両方を発現する該細胞の選抜または濃縮を導く少なくとも１つの添加剤を含有している細胞培養用の培地中で該細胞を培養すること；
を含む、方法。
４１．該細胞が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ｉＮＫＴ細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、ｉＰＳＣ、神経系前駆細胞、網膜の遺伝子治療に関わる細胞型、または他の任意の細胞である、アレンジメント３９または４０に記載の方法。
４２．該第一部分ヌクレオチド配列のヌクレオチド配列が、ヌクレアーゼ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはＣＲＩＳＰＲｉ耐性を獲得するように変更されており、かつ、ａ）該第一のタンパク質と同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしているか、またはｂ）該第一のタンパク質に対して調整された機能を有するタンパク質をコードしている、アレンジメント３９～４１のいずれか１項に記載の方法。
４３．該第一部分ヌクレオチド配列が、該第一のタンパク質のアミノ酸配列とは同一でない変異タンパク質をコードするように変更されている、アレンジメント３９～４２のいずれか１項に記載の方法。
４４．該変異タンパク質が、該第一のタンパク質にはない特性を有する、アレンジメント４３に記載の方法。
４５．該特性に、これらに限定されるものではないが、活性の低下、活性の増強、半減期の違い、低分子阻害に対する耐性、および低分子が結合した後の活性の増強のうちの１つ以上が含まれる、アレンジメント４４に記載の方法。
４６．該第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を、同じプロモーターによってもまたは異なるプロモーターによっても駆動することができる、アレンジメント３９～４５のいずれか１項に記載の方法。
４７．該第二部分ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの治療用遺伝子を含む、アレンジメント３９～４６のいずれか１項に記載の方法。
４８．該第二部分ヌクレオチド配列が、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖を含有している新生抗原Ｔ細胞受容体複合体（ＴＣＲ）をコードしている、アレンジメント３９～４７のいずれか１項に記載の方法。
４９．該必須のまたは第一のタンパク質が、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ２（ＩＭＰＤＨ２）、Ｏ－６－メチルグアニン－ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）、デオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ）、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシル基転移酵素１（ＨＰＲＴ１）、インターロイキン２受容体サブユニットガンマ（ＩＬ２ＲＧ）、アクチンベータ（ＡＣＴＢ）、真核生物翻訳伸長因子１アルファ１（ＥＥＦ１Ａ１）、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ１）、またはトランスフェリン受容体（ＴＦＲＣ）である、アレンジメント３９～４８のいずれか１項に記載の方法。
５０．該第一部分ヌクレオチド配列がタンパク質阻害剤耐性ＤＨＦＲ遺伝子を含み、該第二部分ヌクレオチド配列がＴＲＡ遺伝子およびＴＲＢ遺伝子を含む、アレンジメント３９～４９のいずれか１項に記載の方法。
５１．該ＴＲＡ、ＴＲＢ、およびＤＨＦＲの遺伝子が単一の読み取り枠から発現するように操作可能に構成されている、アレンジメント５０に記載の方法。
５２．該ＴＲＡ、ＴＲＢ、およびＤＨＦＲの遺伝子が少なくとも１つのリンカーによって隔てられている、アレンジメント５１に記載の方法。
５３．該少なくとも１つのリンカー、ＴＲＡ、ＴＲＢ、およびＤＨＦＲ遺伝子の順番が、
ＴＲＡ－リンカー－ＴＲＢ－リンカー－ＤＨＦＲ、
ＴＲＡ－リンカー－ＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＢ、
ＴＲＢ－リンカー－ＴＲＡ－リンカー－ＤＨＦＲ、
ＴＲＢ－リンカー－ＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＡ、
ＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＡ－リンカー－ＴＲＢ、または
ＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＢ－リンカー－ＴＲＡ
である、アレンジメント５２に記載の方法。
ＴＲＡ－リンカー－ＴＲＢ－リンカー－ＤＨＦＲ、
ＴＲＡ－リンカー－ＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＢ、
ＴＲＢ－リンカー－ＴＲＡ－リンカー－ＤＨＦＲ、
ＴＲＢ－リンカー－ＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＡ、
ＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＡ－リンカー－ＴＲＢ、または
ＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＢ－リンカー－ＴＲＡ
である、アレンジメント５２に記載の方法。
５４．該少なくとも１つのリンカーが、少なくとも１つの自己切断２Ａペプチドおよび／または少なくとも１つのＩＲＥＳエレメントである、アレンジメント５３に記載の方法。
５５．該ＤＨＦＲ、ＴＲＡ、およびＴＲＢの遺伝子が、内在性のＴＣＲプロモーターまたは他の任意の好適なプロモーターによって駆動され、該他の任意の好適なプロモーターとしては、これらに限定されるものではないが、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１／２、ＤＨＦＲ、ＥＥＦ１Ａ１、ＡＣＴＢ、Ｂ２Ｍ、ＣＤ５２、ＣＤ２、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＬＣＫ、ＬＡＴ、ＰＴＰＲＣ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＴＧＢ２、ＴＧＦＢＲ２、ＰＤＣＤ１、ＣＴＬＡ４、ＦＡＳ、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ（ＴＮＦＲ１）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＴＲＡＩＬＲ２）、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＢＴＬＡ、ＣＤ２００Ｒ１、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＨＡＶＣＲ２（ＴＩＭ３）、ＶＳＩＲ（ＶＩＳＴＡ）、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ４ＲＡ、ＥＩＦ４Ａ１、ＦＴＨ１、ＦＴＬ、ＨＳＰＡ５、およびＰＧＫ１などがある、アレンジメント５０～５４のいずれか１項に記載の方法。
５６．該２要素ヌクレオチド配列が該細胞の該ゲノム中に組み込まれる、アレンジメント３９～５５のいずれか１項に記載の方法。
５７．該少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列が、該標的ゲノム中の該予め決められた部位に挿入された時に、発現するように操作可能な状態になり、該第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方が該標的ゲノム中のプロモーターによって駆動される、アレンジメント３９～５６のいずれか１項に記載の方法。
５８．該組み込みが、ヌクレアーゼ媒介性部位特異的組み込み、トランスポゾン媒介性遺伝子送達、またはウイルス媒介性遺伝子送を介するものである、アレンジメント５７に記載の方法。
５９．該ヌクレアーゼ媒介性部位特異的組み込みが、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰ、必要に応じてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰを介するものである、アレンジメント５８に記載の方法。
６０．スプリットインテインシステムを用いることをさらに含む、アレンジメント５９に記載の方法。
６１．該導入された２要素ヌクレオチド配列が、該細胞の該ゲノム中に組み込まれていない、アレンジメント３９～５５のいずれか１項に記載の方法。
６２．内在性のＴＣＲ定常部位、タンパク質阻害剤耐性ＤＨＦＲ遺伝子をコードしている該第一部分ヌクレオチド配列、および新生抗原ＴＣＲをコードしている該第二部分ヌクレオチド配列を標的としているＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰが該細胞に送達される、アレンジメント３９～６０のいずれか１項に記載の方法。
６３．該内在性のＴＣＲ定常部位が、ＴＣＲα定常（ＴＲＡＣ）部位であってもまたはＴＣＲβ定常（ＴＲＢＣ）部位であってもよい、アレンジメント６２に記載の方法。
６４．該送達が、エレクトロポレーション、または機械的もしくは化学的な膜透過処理に基づく方法によって行われる、アレンジメント６２または６３に記載の方法。
６５．該ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰが、ノックインするために該ＴＲＡＣ部位を切断するＴＲＡＣ ＲＮＰである、アレンジメント６２～６４のいずれか１項に記載の方法。
６６．該ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰである、アレンジメント５９、６２、または６５のいずれか１項に記載の方法。
６７．該細胞の濃縮または選抜を導く該添加剤が、フローサイトメトリーまたは磁気ビーズ濃縮による該細胞の濃縮を可能にする抗体である、アレンジメント３９～６６のいずれか１項に記載の方法。
６８．該添加剤が、該第一のタンパク質および該第二のタンパク質の両方を発現していない細胞の生存および／または増殖を損傷する、アレンジメント３９～６７のいずれか１項に記載の方法。
６９．該第一のタンパク質が、該添加剤を介した細胞の生存および／または増殖の損傷に対する該細胞の耐性を媒介する、アレンジメント６８に記載の方法。
７０．該添加剤がメトトレキサートである、アレンジメント３９～６９のいずれか１項に記載の方法。
７１．該第一のタンパク質がメトトレキサート耐性ＤＨＦＲ変異型タンパク質である、アレンジメント６９または７０のいずれか１項に記載の方法。
７２．遺伝子改変した細胞を選抜または濃縮するための方法であって、
ｉ）細胞中で第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現することが可能な、少なくとも２つの２要素ヌクレオチド配列を該細胞に導入すること、
ここで該細胞は、該細胞が生存もおよび／または増殖もできない程度まで抑制されたレベルの生存および／または増殖に必須のタンパク質を有しており、
ここで該第一の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖のための該必須のタンパク質の非機能性部分を第一の結合ドメインに融合させた第一の融合タンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、第一の目的のタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列を含み、かつ、該第二の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖のための該必須のタンパク質の非機能性部分を第二の結合ドメインに融合させた第二の融合タンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と第二の目的のタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列を含み、
ここで、該第一および第二の融合タンパク質の両方が細胞中で一緒に発現する時には、生存および／または増殖のための該必須のタンパク質の該機能が回復；ならびに
ｉｉ）該第一および第二の２要素ヌクレオチド配列の両方を発現する該細胞の該選抜を導く条件下で該細胞を培養すること；
を含む、方法。
ｉ）細胞中で第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現することが可能な、少なくとも２つの２要素ヌクレオチド配列を該細胞に導入すること、
ここで該細胞は、該細胞が生存もおよび／または増殖もできない程度まで抑制されたレベルの生存および／または増殖に必須のタンパク質を有しており、
ここで該第一の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖のための該必須のタンパク質の非機能性部分を第一の結合ドメインに融合させた第一の融合タンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、第一の目的のタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列を含み、かつ、該第二の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖のための該必須のタンパク質の非機能性部分を第二の結合ドメインに融合させた第二の融合タンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と第二の目的のタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列を含み、
ここで、該第一および第二の融合タンパク質の両方が細胞中で一緒に発現する時には、生存および／または増殖のための該必須のタンパク質の該機能が回復；ならびに
ｉｉ）該第一および第二の２要素ヌクレオチド配列の両方を発現する該細胞の該選抜を導く条件下で該細胞を培養すること；
を含む、方法。
７３．遺伝子改変した細胞を選抜または濃縮するための方法であって、
ｉ）細胞の生存および／または増殖のために必須の少なくとも第一のタンパク質を、該細胞がインビトロの通常の繁殖条件下では生存もおよび／または増殖もできないレベルまで抑制すること；
ｉｉ）該細胞中で発現させることが可能な少なくとも２つの２要素ヌクレオチド配列を導入すること、
ここで該第一の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖のための該必須のタンパク質の非機能性部分を第一の結合ドメインに融合させた第一の融合タンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、第一の目的のタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列を含み、かつ、該第二の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖のための該必須のタンパク質の非機能性部分を第二の結合ドメインに融合させた第二の融合タンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と第二の目的のタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列を含み、
ここで、該第一および第二の融合タンパク質の両方が細胞中で一緒に発現する時に、生存および／または増殖のための該必須のタンパク質の該機能が回復し；ならびに
ｉｉｉ）該第一の融合タンパク質および第二の融合タンパク質の両方を発現する該細胞の該濃縮を導くインビトロ繁殖条件下で該細胞を培養すること；
を含む、方法。
ｉ）細胞の生存および／または増殖のために必須の少なくとも第一のタンパク質を、該細胞がインビトロの通常の繁殖条件下では生存もおよび／または増殖もできないレベルまで抑制すること；
ｉｉ）該細胞中で発現させることが可能な少なくとも２つの２要素ヌクレオチド配列を導入すること、
ここで該第一の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖のための該必須のタンパク質の非機能性部分を第一の結合ドメインに融合させた第一の融合タンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、第一の目的のタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列を含み、かつ、該第二の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖のための該必須のタンパク質の非機能性部分を第二の結合ドメインに融合させた第二の融合タンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と第二の目的のタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列を含み、
ここで、該第一および第二の融合タンパク質の両方が細胞中で一緒に発現する時に、生存および／または増殖のための該必須のタンパク質の該機能が回復し；ならびに
ｉｉｉ）該第一の融合タンパク質および第二の融合タンパク質の両方を発現する該細胞の該濃縮を導くインビトロ繁殖条件下で該細胞を培養すること；
を含む、方法。
７４．該必須のタンパク質がＤＨＦＲタンパク質である、アレンジメント７２または７３に記載の方法。
７５．該第一の融合タンパク質がＤＨＦＲのＮ末端部分を含み、該第二の融合タンパク質がＤＨＦＲのＣ末端部分を含む、アレンジメント７４に記載の方法。
７６．該第一の融合タンパク質がＤＨＦＲのＣ末端部分を含み、該第二の融合タンパク質がＤＨＦＲのＮ末端部分を含む、アレンジメント７４に記載の方法。
７７．該ＤＨＦＲのＮ末端部分が配列番号２２を含む、アレンジメント７４または７５に記載の方法。
７８．該ＤＨＦＲのＣ末端部分が配列番号２３を含む、アレンジメント７４～７７のいずれか１項に記載の方法。
７９．該第一または第二の２要素ヌクレオチド配列いずれかの該第二部分ヌクレオチド配列が、該細胞にとって外因性である、アレンジメント７２～７８のいずれか１項に記載の方法。
８０．該第一または第二の２要素ヌクレオチド配列いずれかの該第二部分ヌクレオチド配列がＴＣＲである、アレンジメント７２～７９のいずれか１項に記載の方法。
８１．該第一および第二の結合ドメインがＧＣＮ４に由来する、アレンジメント７２～８０のいずれか１項に記載の方法。
８２．該第一および／または第二の結合ドメインが配列番号２４を含む、アレンジメント７２～８１のいずれか１項に記載の方法。
８３．該第一の融合タンパク質および第二の融合タンパク質が配列番号３９または配列番号４０を含む、アレンジメント７２～８２のいずれか１項に記載の方法。
８４．該第一および第二の結合ドメインがＦＫＢＰ１２に由来する、アレンジメント７２～８０のいずれか１項に記載の方法。
８５．該ＦＫＢＰ１２がＦ３６Ｖ変異を有する、アレンジメント８４に記載の方法。
８６．該第一および／または第二の結合ドメインが配列番号３１を含む、アレンジメント７２～８０、８４、または８５のいずれか１項に記載の方法。
８７．該第一の融合タンパク質および第二の融合タンパク質が配列番号６２または配列番号６３を含む、アレンジメント７２～８０または８４～８６のいずれか１項に記載の方法。
８８．該第一の結合ドメインおよび該第二の結合ドメインがＪＵＮおよびＦＯＳに由来する、アレンジメント７２～８０のいずれか１項に記載の方法。
８９．該第一の結合ドメインおよび第二の結合ドメインが、互いへの結合を保持する相補的な変異を有する、アレンジメント８８に記載の方法。
９０．該第一の結合ドメインまたは該第二の結合ドメインのいずれもが天然の結合パートナーとは結合しない、アレンジメント８９に記載の方法。
９１．該第一の結合ドメインと第二の結合ドメインのそれぞれが、３～７つの相補的な変異を有する、アレンジメント７２～８０または８８－９０のいずれか１項に記載の方法。
９２．該第一の結合ドメインと第二の結合ドメインのそれぞれが、３つの相補的な変異を有する、アレンジメント９１に記載の方法。
９３．該第一の結合ドメインおよび第二の結合ドメインが配列番号２６または配列番号２９を含む、アレンジメント７２～８０または８８～９２のいずれか１項に記載の方法。
９４．該第一の融合タンパク質および第二の融合タンパク質が配列番号３５または配列番号３６を含む、アレンジメント７２～８０または８８～９３のいずれか１項に記載の方法。
９５．該第一の結合ドメインと第二の結合ドメインのそれぞれが、４つの相補的な変を有する、アレンジメント９１に記載の方法。
９６．該第一の結合ドメインおよび第二の結合ドメインが配列番号２７および配列番号３０を含む、アレンジメント７２～８０、８８～９１、または９５のいずれか１項に記載の方法。
９７．該第一の融合タンパク質および第二の融合タンパク質が配列番号３７および配列番号３８を含む、アレンジメント７２～８０、８８～９１、９５、または９６のいずれか１項に記載の方法。
９８．該少なくとも２つの２要素ヌクレオチド配列が該細胞の該ゲノム中に組み込まれる、アレンジメント７２～９７のいずれか１項に記載の方法。
９９．該少なくとも２つの２要素ヌクレオチド配列が、該標的ゲノム中の予め決められた部位に挿入された時に、発現するように操作可能な状態になり、該第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方が該標的ゲノム中のプロモーターによって駆動される、アレンジメント７２～９８のいずれか１項に記載の方法。
１００．該組み込みが、ヌクレアーゼ媒介性部位特異的組み込み、トランスポゾン媒介性遺伝子送達、またはウイルス媒介性遺伝子送を介するものである、アレンジメント９８または９９に記載の方法。
１０１．該ヌクレアーゼ媒介性部位特異的組み込みがＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰを介するものである、アレンジメント１００に記載の方法。
１０２．内在性のＴＣＲ定常部位、ＤＨＦＲタンパク質の非機能性部分をコードしている該第一の第一部分ヌクレオチド配列、および新生抗原ＴＣＲをコードしている該第一の第二部分ヌクレオチド配列を標的としているＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰによって該第一の２要素ヌクレオチド配列が該細胞に送達される、アレンジメント７２～１０１のいずれか１項に記載の方法。
１０３．ＴＣＲ定常遺伝子座以外の内在性の遺伝子座、ＤＨＦＲタンパク質の非機能性部分をコードしている該第二の第一部分ヌクレオチド配列、および目的のタンパク質をコードしている該第二の第二部分ヌクレオチド配列を標的としているＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰによって該第二の２要素ヌクレオチド配列が該細胞に送達される、アレンジメント７２～１０２のいずれか１項に記載の方法。
１０４．該第一の第一部分ヌクレオチド配列と該第二の第一部分ヌクレオチド配列がＤＨＦＲタンパク質の非機能性部分を含有している融合タンパク質をコードしていて、共発現させた時にＤＨＦＲ活性をもつ、アレンジメント１０３に記載の方法。
１０５．該内在性のＴＣＲ定常部位がＴＣＲα定常（ＴＲＡＣ）部位であってもまたはＴＣＲβ定常（ＴＲＢＣ）部位であってもよい、アレンジメント１０２～１０４のいずれか１項に記載の方法。
１０６．該ＴＣＲ定常部位以外の内在性の遺伝子座がＢ２Ｍ遺伝子座である、アレンジメント１０３～１０５のいずれか１項に記載の方法。
１０７．該送達が、エレクトロポレーション、または機械的もしくは化学的な膜透過処理に基づく方法によって行われる、アレンジメント１０２～１０６のいずれか１項に記載の方法。
１０８．該ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰである、アレンジメント１０１～１０７のいずれか１項に記載の方法。
１０９．該ヌクレアーゼが、該２要素ヌクレオチドのうちのいずれか１つの少なくとも一部分を、該内在性プロモーター、該内在性スプライス部位、および該内在性終結シグナルから発現するようにインフレームで遺伝子座のエキソンに組み込むことを可能にする、アレンジメント２６～２８、３０～３８、５８～６０、６２～７１、または１００～１０８のいずれか１項に記載の方法。
１１０．該ヌクレアーゼが、該２要素ヌクレオチドのうちのいずれか１つの少なくとも一部分を、該内在性プロモーター、該内在性スプライス部位、および外因性終結シグナルから発現するようにインフレームで遺伝子座のエキソンに組み込むことを可能にする、アレンジメント２６～２８、３０～３８、５８～６０、６２～７１、または１００～１０８のいずれか１項に記載の方法。
１１１．該ヌクレアーゼが、該２要素ヌクレオチドのうちのいずれか１つの少なくとも一部分を、該内在性プロモーター、外因性のスプライス受容部位、および外因性終結シグナルから発現するように遺伝子座のイントロンに組み込むことを可能にする、アレンジメント２６～２８、３０～３８、５８～６０、６２～７１、または１００～１０８のいずれか１項に記載の方法。
１１２．該必須のまたは第一のタンパク質が少なくとも２つの個別の機能不全タンパク質部分に分割され、該少なくとも２つの部分がそれぞれ多量体化ドメインに融合され、該少なくとも２つの部分がそれぞれ、異なる２要素ヌクレオチド配列の全てが発現されている細胞の選抜を可能にする、異なる２要素ヌクレオチド配列に組み込まれ、必要に応じて該必須のまたは第一のタンパク質の該機能が回復する、アレンジメント１～８０のいずれか１項に記載の方法。
１１３．ここで該必須のまたは第一のタンパク質が、機能不全のＮ末端およびＣ末端タンパク質部分に分割され、それぞれの部分がホモもしくはヘテロ二量体化タンパク質パートナーまたはスプリットインテインに融合される、アレンジメント１～８０のいずれか１項に記載の方法。
１１４．該必須のまたは第一のタンパク質がＤＨＦＲタンパク質である、アレンジメント１１２または１１３のいずれか１項に記載の方法。
１１５．第一の機能不全タンパク質部分がＤＨＦＲのＮ末端部分を含み、第二の機能不全タンパク質部分がＤＨＦＲのＣ末端部分を含む、アレンジメント１１４に記載の方法。
１１６．該ＤＨＦＲのＮ末端部分が配列番号２２を含む、アレンジメント１１５に記載の方法。
１１７．該ＤＨＦＲのＣ末端部分が配列番号２３を含む、アレンジメント１１６に記載の方法。
１１８．該ホモ二量体化タンパク質がＧＣＮ４、ＦＫＢＰ１２、またはそのバリアントである、アレンジメント１０８～１１０のいずれか１項に記載の方法。
１１９．該ヘテロ二量体化タンパク質がＪｕｎ／Ｆｏｓ、またはそのバリアントである、アレンジメント１０８～１１０のいずれか１項に記載の方法。
１２０．該必須のタンパク質の該機能の回復が誘導される、必要に応じてＡＰ１９０３によって誘導される、アレンジメント７２～７６、８０～８３、または１０８～１１１のいずれか１項に記載の方法。
１２１．該培養するステップが、メトトレキサート存在下で実施される、アレンジメント７２～１０８のいずれか１項に記載の方法。
１２２．該目的のタンパク質がＴ細胞受容体である、アレンジメント１～１２１のいずれか１項に記載の方法。
１２３．該Ｔ細胞受容体がウイルス性抗原または腫瘍抗原に特異的である、アレンジメント１２２に記載の方法。
１２４．該腫瘍抗原が腫瘍新生抗原である、アレンジメント１２３に記載の方法。
１２５．該遺伝子改変した細胞が初代ヒトＴ細胞である、アレンジメント１～１２４のいずれか１項に記載の方法。
１２６．遺伝子改変したＴ細胞を濃縮するための方法であって、
ｉ）メトトレキサート耐性ＤＨＦＲタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、Ｔ細胞受容体複合体またはキメラ抗体受容体をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含有している該２要素ヌクレオチド配列を、該ＴＲＡまたはＴＲＢプロモーターの下流に組み込むことによって該Ｔ細胞内に導入すること；および
ｉｉ）該第一のタンパク質と該第二のタンパク質の両方を発現している該細胞の濃縮を導くために、メトトレキサートを含有している細胞培養用の培地中で該細胞を培養すること；
を含む、方法。
ｉ）メトトレキサート耐性ＤＨＦＲタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、Ｔ細胞受容体複合体またはキメラ抗体受容体をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含有している該２要素ヌクレオチド配列を、該ＴＲＡまたはＴＲＢプロモーターの下流に組み込むことによって該Ｔ細胞内に導入すること；および
ｉｉ）該第一のタンパク質と該第二のタンパク質の両方を発現している該細胞の濃縮を導くために、メトトレキサートを含有している細胞培養用の培地中で該細胞を培養すること；
を含む、方法。
１２７．外因性のＴ細胞受容体遺伝子を発現するように改変したＴ細胞を濃縮するための方法であって、
ｉ）第一のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰを利用して内在性のＴＲＢＣ遺伝子をその遺伝子座からノックアウトすること；
ｉｉ）第二のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰを利用して、メトトレキサート耐性ＤＨＦＲ遺伝子をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と治療用ＴＣＲ遺伝子を含有している第二部分ヌクレオチド配列を、該内在性のＴＲＢＣ遺伝子座にノックインすること、ここでヌクレオチド配列は両方とも該内在性のＴＲＢＣプロモーターから発現できるように操作可能に結合され；ならびに
ｉｉｉ）該治療用ＴＣＲと該メトトレキサート耐性ＤＨＦＲ遺伝子の両方を発現しているＴ細胞を濃縮するために、メトトレキサートを含有している細胞培養用の培地中で、該細胞を培養すること；
を含む、方法。
ｉ）第一のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰを利用して内在性のＴＲＢＣ遺伝子をその遺伝子座からノックアウトすること；
ｉｉ）第二のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰを利用して、メトトレキサート耐性ＤＨＦＲ遺伝子をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と治療用ＴＣＲ遺伝子を含有している第二部分ヌクレオチド配列を、該内在性のＴＲＢＣ遺伝子座にノックインすること、ここでヌクレオチド配列は両方とも該内在性のＴＲＢＣプロモーターから発現できるように操作可能に結合され；ならびに
ｉｉｉ）該治療用ＴＣＲと該メトトレキサート耐性ＤＨＦＲ遺伝子の両方を発現しているＴ細胞を濃縮するために、メトトレキサートを含有している細胞培養用の培地中で、該細胞を培養すること；
を含む、方法。
１２８．遺伝子改変した細胞を選抜するための方法であって、
ｉ）細胞中で発現するよう操作可能な少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を導入すること、
ここで該細胞は、該細胞が生存もおよび／または増殖もできない程度まで抑制されたレベルの生存および／または増殖に必須のタンパク質を有しており、かつ、該少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖のための該必須のタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含み、該第二部分ヌクレオチド配列は、該細胞にとって外因性のタンパク質をコードしており；ならびに
ｉｉ）該第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現している該細胞の該選抜を導く条件下で該細胞を培養すること；
を含む、方法。
ｉ）細胞中で発現するよう操作可能な少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を導入すること、
ここで該細胞は、該細胞が生存もおよび／または増殖もできない程度まで抑制されたレベルの生存および／または増殖に必須のタンパク質を有しており、かつ、該少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖のための該必須のタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含み、該第二部分ヌクレオチド配列は、該細胞にとって外因性のタンパク質をコードしており；ならびに
ｉｉ）該第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現している該細胞の該選抜を導く条件下で該細胞を培養すること；
を含む、方法。
１２９．遺伝子改変した細胞を濃縮するための方法であって、
ｉ）細胞の生存および／または増殖のために必須の少なくとも第一のタンパク質の活性を、インビトロの通常の繁殖条件下では該細胞が生存もおよび／または増殖もできないレベルに低下させること；
ｉｉ）該細胞中で発現するよう操作可能で、かつ、該第一のタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と第二の発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含む少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を、導入すること、ここで該第二部分は該細胞にとって外因性のタンパク質であり；ならびに
ｉｉｉ）該第一のタンパク質と第二のタンパク質の両方を発現する該細胞の該濃縮を導くインビトロの繁殖条件下で該細胞を培養すること；
を含む、方法。
ｉ）細胞の生存および／または増殖のために必須の少なくとも第一のタンパク質の活性を、インビトロの通常の繁殖条件下では該細胞が生存もおよび／または増殖もできないレベルに低下させること；
ｉｉ）該細胞中で発現するよう操作可能で、かつ、該第一のタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と第二の発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含む少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を、導入すること、ここで該第二部分は該細胞にとって外因性のタンパク質であり；ならびに
ｉｉｉ）該第一のタンパク質と第二のタンパク質の両方を発現する該細胞の該濃縮を導くインビトロの繁殖条件下で該細胞を培養すること；
を含む、方法。
１３０．アレンジメント１～１２９のいずれか１項に記載の方法によって作製される細胞。
１３１．Ｔ細胞であって、
メトトレキサート存在下では、該細胞が生存もおよび／または増殖もできないレベルまで抑制された内在性のジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）；および
メトトレキサート耐性ＤＨＦＲタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と該内在性のＴＲＡまたはＴＲＢプロモーターから操作可能に発現するＴ細胞受容体をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含有している、少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列；
を含む、Ｔ細胞。
メトトレキサート存在下では、該細胞が生存もおよび／または増殖もできないレベルまで抑制された内在性のジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）；および
メトトレキサート耐性ＤＨＦＲタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と該内在性のＴＲＡまたはＴＲＢプロモーターから操作可能に発現するＴ細胞受容体をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含有している、少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列；
を含む、Ｔ細胞。
１３２．Ｔ細胞であって、
内在性のジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）のノックアウト；および
ＤＨＦＲタンパク質またはそのバリアントをコードしている第一部分ヌクレオチド配列と該内在性のＴＲＡまたはＴＲＢプロモーターから操作可能に発現するＴ細胞受容体をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含有している少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列；
を含む、Ｔ細胞。
内在性のジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）のノックアウト；および
ＤＨＦＲタンパク質またはそのバリアントをコードしている第一部分ヌクレオチド配列と該内在性のＴＲＡまたはＴＲＢプロモーターから操作可能に発現するＴ細胞受容体をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含有している少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列；
を含む、Ｔ細胞。
１３３．メトトレキサートの存在下では、該細胞が生存もおよび／または増殖もできないレベルまで抑制されるように構成された内在性のジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）；ならびに
少なくとも２つの２要素ヌクレオチド配列；
を含むＴ細胞であって、
ここで該第一の２要素ヌクレオチド配列が
ｉ）ＤＨＦＲタンパク質の非機能性もしくは機能不全部分またはそのバリアントをコードしている第一の第一部分ヌクレオチド配列と
ｉｉ）Ｔ細胞受容体コードし、該内在性のＴＲＡまたはＴＲＢプロモーターから操作可能に発現する第一の第二部分ヌクレオチド配列を含み、
ここで該第二の２要素ヌクレオチド配列が
ｉｉｉ）ＤＨＦＲタンパク質の非機能性もしくは機能不全部分またはそのバリアントをコードしている第二の第一部分ヌクレオチド配列と
ｉｖ）目的のタンパク質コードし、該内在性のＢ２Ｍプロモーターから操作可能に発現する第二の第二部分ヌクレオチド配列を含み、および
ここで該細胞がＤＨＦＲ活性を有するように構成されている、
Ｔ細胞。
少なくとも２つの２要素ヌクレオチド配列；
を含むＴ細胞であって、
ここで該第一の２要素ヌクレオチド配列が
ｉ）ＤＨＦＲタンパク質の非機能性もしくは機能不全部分またはそのバリアントをコードしている第一の第一部分ヌクレオチド配列と
ｉｉ）Ｔ細胞受容体コードし、該内在性のＴＲＡまたはＴＲＢプロモーターから操作可能に発現する第一の第二部分ヌクレオチド配列を含み、
ここで該第二の２要素ヌクレオチド配列が
ｉｉｉ）ＤＨＦＲタンパク質の非機能性もしくは機能不全部分またはそのバリアントをコードしている第二の第一部分ヌクレオチド配列と
ｉｖ）目的のタンパク質コードし、該内在性のＢ２Ｍプロモーターから操作可能に発現する第二の第二部分ヌクレオチド配列を含み、および
ここで該細胞がＤＨＦＲ活性を有するように構成されている、
Ｔ細胞。
〔アレンジメント（実施形態）の例示（ｂ）：〕
１．遺伝子改変した細胞を選抜するための方法であって、
ｉ）細胞中で発現するように操作可能な少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を導入すること、
ここで該細胞は、一般的な細胞培養用の培地中では該細胞が生存もおよび／または増殖もできない程度に抑制されたレベルの生存および／または増殖に必須のタンパク質を有しており、かつ、該少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖のための該必須のタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含み、該第二部分ヌクレオチド配列は細胞にとって外因性のタンパク質をコードしており；ならびに
ｉｉ）該第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現する該細胞を選抜するために、該一般的な細胞培養用の培地中で該細胞を培養すること；
を含む、方法。
１．遺伝子改変した細胞を選抜するための方法であって、
ｉ）細胞中で発現するように操作可能な少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を導入すること、
ここで該細胞は、一般的な細胞培養用の培地中では該細胞が生存もおよび／または増殖もできない程度に抑制されたレベルの生存および／または増殖に必須のタンパク質を有しており、かつ、該少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖のための該必須のタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含み、該第二部分ヌクレオチド配列は細胞にとって外因性のタンパク質をコードしており；ならびに
ｉｉ）該第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現する該細胞を選抜するために、該一般的な細胞培養用の培地中で該細胞を培養すること；
を含む、方法。
２．遺伝子改変した細胞を濃縮するための方法であって、
ｉ）細胞の生存および／または増殖のために必須の少なくとも１つの第一のタンパク質のレベルを、インビトロの通常の繁殖条件下では該細胞が生存もおよび／または増殖もできないレベルに低下させること；
ｉｉ）該細胞中で発現するように操作可能で、かつ、該第一のタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と第二の発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含む少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を導入すること、ここで該第二部分タンパク質は細胞にとって外因性であり；ならびに
ｉｉｉ）該第一のタンパク質および第二のタンパク質の両方を発現する該細胞を濃縮するために、インビトロの通常の繁殖条件下で該細胞を培養すること；
を含む、方法。
ｉ）細胞の生存および／または増殖のために必須の少なくとも１つの第一のタンパク質のレベルを、インビトロの通常の繁殖条件下では該細胞が生存もおよび／または増殖もできないレベルに低下させること；
ｉｉ）該細胞中で発現するように操作可能で、かつ、該第一のタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と第二の発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含む少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を導入すること、ここで該第二部分タンパク質は細胞にとって外因性であり；ならびに
ｉｉｉ）該第一のタンパク質および第二のタンパク質の両方を発現する該細胞を濃縮するために、インビトロの通常の繁殖条件下で該細胞を培養すること；
を含む、方法。
３．該活性の低下が、持続性または一過性であってよい、アレンジメント２の方法。
４．該活性の低下が、該必須のタンパク質をコードしている該遺伝子のノックアウトを含む、アレンジメント２の方法。
５．該ノックアウトが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）、ＴＡＬＥＮ、ＭｅｇａＴＡＬ、または他の任意のヌクレアーゼによって媒介される、アレンジメント４の方法。
６．該活性の低下が、該必須のタンパク質の該活性の一過性の抑制を含む、アレンジメント２の方法。
７．該一過性の抑制が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）、またはタンパク質阻害剤を介する、アレンジメント６の方法。
８．該細胞が、Ｔ細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、ｉＰＳＣ、神経系前駆細胞、網膜の遺伝子治療に関わる細胞型、または他の任意の細胞である、アレンジメント１または２の方法。
９．該第一部分ヌクレオチド配列のヌクレオチド配列が、ヌクレアーゼ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはＣＲＩＳＰＲｉ耐性を獲得するように変更されているが、ａ）該第一のタンパク質と同一のアミノ酸配列を有するタンパク質コードしているか、またはｂ）該第一のタンパク質に対して調整された機能を有するタンパク質をコードしている、アレンジメント１または２の方法。
１０．該第一部分ヌクレオチド配列が、該第一のタンパク質のアミノ酸配列とは同一でない変異タンパク質をコードするように変更されている、アレンジメント１または２の方法。
１１．該変異タンパク質が該第一のタンパク質にはない特性を有する、アレンジメント１０の方法。
１２．該特性に、これらに限定されるものではないが、活性の低下、活性の増強、半減期の違い、低分子阻害に対する耐性、および低分子が結合した後の活性の増強のうちの１つ以上が含まれる、アレンジメント１１の方法。
１３．該少なくとも１つのヌクレオチド配列が、該第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現するよう操作可能である、アレンジメント１または２の方法。
１４．該第一部分と第二部分のヌクレオチド配列を、同じプロモーターによってもまたは異なるプロモーターによっても駆動（ｄｒｉｖｅ）することができる、アレンジメント１または２の方法。
１５．該第二部分ヌクレオチド配列が少なくとも１つの治療用遺伝子を含む、アレンジメント１または２の方法。
１６．該第二部分ヌクレオチド配列が、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖を含有している新生抗原Ｔ細胞受容体複合体（ＴＣＲ）をコードしている、アレンジメント１または２の方法。
１７．該必須のまたは第一のタンパク質が、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ２（ＩＭＰＤＨ２）、Ｏ－６－メチルグアニン－ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）、デオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ）、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシル基転移酵素１（ＨＰＲＴ１）、インターロイキン２受容体サブユニットガンマ（ＩＬ２ＲＧ）、アクチンベータ（ＡＣＴＢ）、真核生物翻訳伸長因子１アルファ１（ＥＥＦ１Ａ１）、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ１）、またはトランスフェリン受容体（ＴＦＲＣ）である、アレンジメント１または２の方法。
１８．該第一部分ヌクレオチド配列がヌクレアーゼ耐性、ｓｉＲＮＡ耐性、またはタンパク質阻害剤耐性ＤＨＦＲ遺伝子を含み、かつ、該第二部分ヌクレオチド配列がＴＲＡ遺伝子およびＴＲＢ遺伝子を含む、アレンジメント１または２の方法。
１９．該タンパク質阻害剤耐性ＤＨＦＲ遺伝子がメトトレキサート耐性ＤＨＦＲ遺伝子である、アレンジメント１８の方法。
２０．該ＴＲＡ、ＴＲＢ、およびＤＨＦＲの遺伝子が、単一の読み取り枠から発現するように操作可能に構成されている、アレンジメント１８の方法。
２１．該ＴＲＡ、ＴＲＢ、およびＤＨＦＲの遺伝子が、リンカーによって隔てられている、アレンジメント２０の方法。
２２．該リンカー、ＴＲＡ、ＴＲＢ、およびＤＨＦＲの遺伝子の順序が、
ＴＲＡ－リンカー－ＴＲＢ－リンカー－ＤＨＦＲ、
ＴＲＡ－リンカー－ＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＢ、
ＴＲＢ－リンカー－ＴＲＡ－リンカー－ＤＨＦＲ、
ＴＲＢ－リンカー－ＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＡ、
ＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＡ－リンカー－ＴＲＢ、または
ＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＢ－リンカー－ＴＲＡ。
である、アレンジメント２１の方法。
ＴＲＡ－リンカー－ＴＲＢ－リンカー－ＤＨＦＲ、
ＴＲＡ－リンカー－ＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＢ、
ＴＲＢ－リンカー－ＴＲＡ－リンカー－ＤＨＦＲ、
ＴＲＢ－リンカー－ＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＡ、
ＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＡ－リンカー－ＴＲＢ、または
ＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＢ－リンカー－ＴＲＡ。
である、アレンジメント２１の方法。
２３．該リンカーが自己切断２ＡペプチドまたはＩＲＥＳエレメントである、アレンジメント２２の方法。
２４．該ＤＨＦＲ、ＴＲＡ、およびＴＲＢの遺伝子が、内在性のＴＣＲプロモーターから、または、これらに限定されるものではないが、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１／２、ＤＨＦＲ、ＥＥＦ１Ａ１、ＡＣＴＢ、Ｂ２Ｍ、ＣＤ５２、ＣＤ２、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＬＣＫ、ＬＡＴ、ＰＴＰＲＣ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＴＧＢ２、ＴＧＦＢＲ２、ＰＤＣＤ１、ＣＴＬＡ４、ＦＡＳ、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ（ＴＮＦＲ１）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＴＲＡＩＬＲ２）、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＢＴＬＡ、ＣＤ２００Ｒ１、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＨＡＶＣＲ２（ＴＩＭ３）、ＶＳＩＲ（ＶＩＳＴＡ）、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ４ＲＡ、ＥＩＦ４Ａ１、ＦＴＨ１、ＦＴＬ、ＨＳＰＡ５、およびＰＧＫ１などの任意の他の好適なプロモーターから駆動される、アレンジメント１８の方法。
２５．該２要素ヌクレオチド配列が該細胞の該ゲノムに組み込まれる、アレンジメント１または２の方法。
２６．該組み込みが、ヌクレアーゼ媒介性部位特異的組み込み、トランスポゾン媒介性遺伝子送達、またはウイルス媒介性遺伝子送達を介する、アレンジメント２５の方法。
２７．該ヌクレアーゼ媒介性部位特異的組み込みがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰを介する、アレンジメント２６の方法。
２８．スプリットインテインシステムの利用をさらに含む、アレンジメント２７の方法。
２９．該導入された２要素ヌクレオチド配列が、該細胞の該ゲノムに組み込まれない、アレンジメント１または２の方法。
３０．該内在性のＴＣＲ定常部位、ヌクレアーゼ耐性ＤＨＦＲ遺伝子をコードしている該第一部分ヌクレオチド配列、および新生抗原ＴＣＲをコードしている該第二部分ヌクレオチド配列を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰが該細胞に送達される、アレンジメント１または２の方法。
３１．該内在性のＴＣＲ定常部位が、ＴＣＲα定常（ＴＲＡＣ）部位であってもまたはＴＣＲβ定常（ＴＲＢＣ）部位であってもよい、アレンジメント３０の方法。
３２．該送達がエレクトロポレーション、または機械的もしくは化学的な膜透過処理に基づく方法によって行われる、アレンジメント３０の方法。
３３．第一のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰが内在性のジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子をノックアウトするために用いられ、第二のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ＲＮＰが該ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ耐性ＤＨＦＲ遺伝子を含有している該第一部分ヌクレオチド配列と治療用ＴＣＲ遺伝子をコードしている該第二部分ヌクレオチド配列とを内在性のＴＣＲ定常部位にノックインするために用いられる、アレンジメント２の方法。
３４．メトトレキサートが該第一のタンパク質を阻害するために用いられ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰがメトトレキサート耐性ＤＨＦＲタンパク質をコードしている該第一部分ヌクレオチド配列と治療用ＴＣＲ遺伝子を含有している該第二部分ヌクレオチド配列を内在性のＴＣＲ定常部位にノックインするために用いられる、アレンジメント３３の方法。
３５．該第二のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰが、ノックインのために該ＴＲＡＣ遺伝子座を切断するＴＲＡＣ ＲＮＰである、アレンジメント３３の方法。
３６．該一般的な細胞培養用の培地が、改変されていない細胞の成長および／または増殖に好適な培地である、アレンジメント１または２の方法。
３７．該一般的な細胞培養用の培地が、フローサイトメトリーもしくは磁気ビーズ濃縮による該細胞の濃縮を可能にする薬剤分子もしくは抗体などの外因性の選択圧を含まない、アレンジメント１または２の方法。
３８．アレンジメント１～３７のいずれか１項に記載の方法によって作製される細胞。
３９．細胞であって、
一般的な細胞培養用の培地中では該細胞が生存もおよび／または増殖もできないレベルまで抑制されている内在性のジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）；および
ＤＨＦＲをコードしている第一部分ヌクレオチド配列と新生抗原Ｔ細胞受容体複合体をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含有している少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列；
を含む、細胞。
一般的な細胞培養用の培地中では該細胞が生存もおよび／または増殖もできないレベルまで抑制されている内在性のジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）；および
ＤＨＦＲをコードしている第一部分ヌクレオチド配列と新生抗原Ｔ細胞受容体複合体をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含有している少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列；
を含む、細胞。
４０．遺伝子改変した細胞を濃縮するための方法であって、
ｉ）該細胞中で発現するように操作可能で、かつ、該第一のタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と第二の発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含む少なくとも１つの２要素を導入すること、ここで該第二部分タンパク質は該細胞にとって外因性であり；ならびに
ｉｉ）該第一のタンパク質と該第二のタンパク質の両方を発現している該細胞を濃縮するために、少なくとも１つの添加剤を含有している細胞培養用の培地中で該細胞を培養すること；
を含む、方法。
ｉ）該細胞中で発現するように操作可能で、かつ、該第一のタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と第二の発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含む少なくとも１つの２要素を導入すること、ここで該第二部分タンパク質は該細胞にとって外因性であり；ならびに
ｉｉ）該第一のタンパク質と該第二のタンパク質の両方を発現している該細胞を濃縮するために、少なくとも１つの添加剤を含有している細胞培養用の培地中で該細胞を培養すること；
を含む、方法。
４１．該遺伝子改変した細胞が初代ヒトＴ細胞である、アレンジメント４０の方法。
４２．該添加剤が該第一のタンパク質と該第二のタンパク質を発現していない細胞の生存および／または増殖を損傷するものである、アレンジメント４０の方法。
４３．少なくとも１つのタンパク質が、該添加剤を介した細胞の生存および／または増殖の損傷に対する該細胞の耐性を媒介する、アレンジメント４０の方法。
４４．該添加剤がメトトレキサートである、アレンジメント４２の方法。
４５．該第一のタンパク質がメトトレキサート耐性ＤＨＦＲ変異型タンパク質である、アレンジメント４０の方法。
４６．該第二のタンパク質がＴ細胞受容体である、アレンジメント４０の方法。
４７．該Ｔ細胞受容体がウイルス性抗原または腫瘍抗原に特異的である、アレンジメント４６の方法。
４８．該第一部分ヌクレオチド配列のヌクレオチド配列が、ヌクレアーゼ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはＣＲＩＳＰＲｉ耐性を獲得するよう変更されている、アレンジメント４０の方法。
４９．該少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列の発現が、該細胞の内在性遺伝子座への部位特異的組み込みによって達成される、アレンジメント４０の方法。
５０．該細胞の内在性遺伝子座への部位特異的組み込みが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、ＭｅｇａＴＡＬまたは、遺伝子座に痕跡を残さずに組み込むことができ、該遺伝子座の該内在性プロモーターからの発現を可能にする他の任意のヌクレアーゼによって達成される、アレンジメント４９の方法。
５１．該ヌクレアーゼによって、該内在性のプロモーター、該内在性のスプライス部位、および該内在性の終結シグナルからの発現が可能になるように、遺伝子座のエクソンにインフレームで組み込むことができる、アレンジメント５０の方法。
５２．該ヌクレアーゼによって、該内在性のプロモーター、該内在性のスプライス部位、および外因性の終結シグナルからの発現が可能になるように、遺伝子座のエクソンにインフレームで組み込むことができる、アレンジメント５０の方法。
５３．該ヌクレアーゼによって、該内在性のプロモーター、外因性のスプライス受容部位、および外因性の終結シグナルからの発現が可能になるように、遺伝子座のイントロンに組み込むことができる、アレンジメント５０の方法。
５４．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰが、メトトレキサート耐性ＤＨＦＲ変異型タンパク質をコードしている該第一部分ヌクレオチド配列と治療用ＴＣＲ遺伝子を含有している該第二部分ヌクレオチド配列とを内在性のＴＣＲ定常部位にノックインするために用いられる、アレンジメント４０の方法。
５５．該内在性のＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子をノックアウトするための第二のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰの使用をさらに含む、アレンジメント５０および５４の方法。
５６．遺伝子改変したＴ細胞を濃縮するための方法であって、
ｉ）メトトレキサート耐性ＤＨＦＲタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、Ｔ細胞受容体複合体またはキメラ抗体受容体をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含有している２要素ヌクレオチド配列を、該２要素ヌクレオチド配列を該ＴＲＡまたはＴＲＢプロモーターの下流に組み込むことによって、該Ｔ細胞に導入すること；および
ｉｉ）該第一のタンパク質と該第二のタンパク質の両方を発現している該細胞を濃縮するために、メトトレキサートを含有している細胞培養用の培地中で、該細胞を培養すること；
を含む、方法。
ｉ）メトトレキサート耐性ＤＨＦＲタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、Ｔ細胞受容体複合体またはキメラ抗体受容体をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含有している２要素ヌクレオチド配列を、該２要素ヌクレオチド配列を該ＴＲＡまたはＴＲＢプロモーターの下流に組み込むことによって、該Ｔ細胞に導入すること；および
ｉｉ）該第一のタンパク質と該第二のタンパク質の両方を発現している該細胞を濃縮するために、メトトレキサートを含有している細胞培養用の培地中で、該細胞を培養すること；
を含む、方法。
５７．外因性のＴ細胞受容体遺伝子を発現するよう改変したＴ細胞を濃縮するための方法であって、
ｉ）第一のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰを利用して、内在性のＴＲＢＣ遺伝子をその遺伝子座からノックアウトすること；
ｉｉ）第二のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰを利用して、メトトレキサート耐性ＤＨＦＲ遺伝子をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と治療用ＴＣＲ遺伝子を含有している第二部分ヌクレオチド配列を、該内在性のＴＲＢＣ遺伝子座にノックインすること、ここで、両方のヌクレオチド配列は、該内在性のＴＲＢＣプロモーターから発現させることができるように操作可能に連結され；ならびに、
ｉｉｉ）該治療用ＴＣＲと該メトトレキサート耐性ＤＨＦＲ遺伝子の両方を発現するＴ細胞を濃縮するために、メトトレキサートを含有している細胞培養用の培地中で該細胞を培養すること；
を含む、方法。
ｉ）第一のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰを利用して、内在性のＴＲＢＣ遺伝子をその遺伝子座からノックアウトすること；
ｉｉ）第二のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰを利用して、メトトレキサート耐性ＤＨＦＲ遺伝子をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と治療用ＴＣＲ遺伝子を含有している第二部分ヌクレオチド配列を、該内在性のＴＲＢＣ遺伝子座にノックインすること、ここで、両方のヌクレオチド配列は、該内在性のＴＲＢＣプロモーターから発現させることができるように操作可能に連結され；ならびに、
ｉｉｉ）該治療用ＴＣＲと該メトトレキサート耐性ＤＨＦＲ遺伝子の両方を発現するＴ細胞を濃縮するために、メトトレキサートを含有している細胞培養用の培地中で該細胞を培養すること；
を含む、方法。
５８．Ｔ細胞であって、
メトトレキサート存在下では、該細胞が生存もおよび／または増殖もできないレベルまで抑制されている内在性のジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）；ならびに
メトトレキサート耐性ＤＨＦＲタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、該内在性のＴＲＡまたはＴＲＢプロモーターから操作可能に発現するＴ細胞受容体をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含有している、少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列；
を含む、Ｔ細胞。
メトトレキサート存在下では、該細胞が生存もおよび／または増殖もできないレベルまで抑制されている内在性のジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）；ならびに
メトトレキサート耐性ＤＨＦＲタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、該内在性のＴＲＡまたはＴＲＢプロモーターから操作可能に発現するＴ細胞受容体をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含有している、少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列；
を含む、Ｔ細胞。
５９．該必須のまたは第一のタンパク質が少なくとも２つの個別の機能不全タンパク質部分に分割され、該少なくとも２つの部分のそれぞれが多量体化ドメインに融合され、および該少なくとも２つの部分のそれぞれが異なる２要素ヌクレオチド配列に組み込まれて、異なる２要素ヌクレオチド配列の全てが発現している細胞を選抜することが可能になる、アレンジメント１、２または４０の方法。
６０．該必須のまたは第一のタンパク質が機能不全Ｎ末端およびＣ末端タンパク質部分に分割され、それぞれの部分がホモまたはヘテロ二量体化タンパク質パートナーまたはスプリットインテインに結合される、アレンジメント５９の方法。
６１．該必須のまたは第一のタンパク質がＤＨＦＲタンパク質である、アレンジメント５９の方法。
６２．遺伝子改変した細胞を選抜するための方法であって、
ｉ）細胞中で発現するように操作可能な少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を導入すること、
ここで該細胞は、生存および／または増殖に必須のタンパク質を有しているが、そのレベルは、該細胞が生存もおよび／または増殖もできない程度に抑制されており、および、
ここで該少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、該生存および／または増殖のための該必須のタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列を含んでおり、ここで該第二部分ヌクレオチド配列は該細胞にとって外因性のタンパク質をコードしており；ならびに
ｉｉ）該第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現する該細胞の該選抜を導くために、通常の条件下で該細胞を培養すること；
を含む、方法。
ｉ）細胞中で発現するように操作可能な少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を導入すること、
ここで該細胞は、生存および／または増殖に必須のタンパク質を有しているが、そのレベルは、該細胞が生存もおよび／または増殖もできない程度に抑制されており、および、
ここで該少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、該生存および／または増殖のための該必須のタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列を含んでおり、ここで該第二部分ヌクレオチド配列は該細胞にとって外因性のタンパク質をコードしており；ならびに
ｉｉ）該第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現する該細胞の該選抜を導くために、通常の条件下で該細胞を培養すること；
を含む、方法。
６３．遺伝子改変した細胞を濃縮するための方法であって、
ｉ）細胞の生存および／または増殖に必須の少なくとも１つの第一のタンパク質の活性を、インビトロの通常の繁殖条件下では該細胞が生存もおよび／または増殖もできないレベルに低下させること；
ｉｉ）該細胞中で発現するように操作可能で、かつ、該第一のタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と第二の発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含む少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を導入すること、ここで該第二部分タンパク質は該細胞にとって外因性であり；ならびに
ｉｉｉ）該第一のタンパク質および第二のタンパク質の両方を発現する該細胞の該濃縮を導くインビトロの繁殖条件下で、該細胞を培養すること；
を含む、方法。
ｉ）細胞の生存および／または増殖に必須の少なくとも１つの第一のタンパク質の活性を、インビトロの通常の繁殖条件下では該細胞が生存もおよび／または増殖もできないレベルに低下させること；
ｉｉ）該細胞中で発現するように操作可能で、かつ、該第一のタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と第二の発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含む少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を導入すること、ここで該第二部分タンパク質は該細胞にとって外因性であり；ならびに
ｉｉｉ）該第一のタンパク質および第二のタンパク質の両方を発現する該細胞の該濃縮を導くインビトロの繁殖条件下で、該細胞を培養すること；
を含む、方法。
６４．遺伝子改変した細胞を選抜するための方法であって、
ｉ）細胞中で発現するように操作可能な少なくとも２つの２要素ヌクレオチド配列を導入すること、
ここで該細胞は、生存および／または増殖に必須のタンパク質を有しているが、そのレベルは、該細胞が生存もおよび／または増殖もできない程度に抑制されており、
ここで該第一の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖のための該必須のタンパク質の非機能性部分を第一の結合ドメインに融合させた第一の融合タンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含み、かつ、該第二の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖のための該必須のタンパク質の非機能性部分を第二の結合ドメインに融合させた第二の融合タンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含み、そして、該第一および第二の融合タンパク質の両方が細胞中で一緒に発現する時に、生存および／または増殖のための該必須のタンパク質の該機能が回復し；ならびに
ｉｉ）該第一および第二の２要素ヌクレオチド配列の両方を発現する該細胞の該選抜を導く条件下で、該細胞を培養すること；
を含む、方法。
ｉ）細胞中で発現するように操作可能な少なくとも２つの２要素ヌクレオチド配列を導入すること、
ここで該細胞は、生存および／または増殖に必須のタンパク質を有しているが、そのレベルは、該細胞が生存もおよび／または増殖もできない程度に抑制されており、
ここで該第一の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖のための該必須のタンパク質の非機能性部分を第一の結合ドメインに融合させた第一の融合タンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含み、かつ、該第二の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖のための該必須のタンパク質の非機能性部分を第二の結合ドメインに融合させた第二の融合タンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含み、そして、該第一および第二の融合タンパク質の両方が細胞中で一緒に発現する時に、生存および／または増殖のための該必須のタンパク質の該機能が回復し；ならびに
ｉｉ）該第一および第二の２要素ヌクレオチド配列の両方を発現する該細胞の該選抜を導く条件下で、該細胞を培養すること；
を含む、方法。
６５．遺伝子改変した細胞を濃縮するための方法であって、
ｉ）細胞の生存および／または増殖に必須の少なくとも１つの第一のタンパク質の活性を、インビトロの通常の繁殖条件下では該細胞が生存もおよび／または増殖もできないレベルに低下させること；
ｉｉ）細胞中で発現するように操作可能な少なくとも２つの２要素ヌクレオチド配列を導入すること、
ここで該第一の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖のための該必須のタンパク質の非機能性部分を第一の結合ドメインに融合させた第一の融合タンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含み、かつ、該第二の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖のための該必須のタンパク質の非機能性部分を第二の結合ドメインに融合させた第二の融合タンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含み、ここで該第一および第二の融合タンパク質の両方が細胞中で一緒に発現する時に、生存および／または増殖のための該必須のタンパク質の該機能が回復し；ならびに
ｉｉｉ）該第一の融合タンパク質と第二の融合タンパク質の両方を発現する該細胞の該濃縮を導くインビトロの繁殖条件下で、該細胞を培養すること；
を含む、方法。
ｉ）細胞の生存および／または増殖に必須の少なくとも１つの第一のタンパク質の活性を、インビトロの通常の繁殖条件下では該細胞が生存もおよび／または増殖もできないレベルに低下させること；
ｉｉ）細胞中で発現するように操作可能な少なくとも２つの２要素ヌクレオチド配列を導入すること、
ここで該第一の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖のための該必須のタンパク質の非機能性部分を第一の結合ドメインに融合させた第一の融合タンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含み、かつ、該第二の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖のための該必須のタンパク質の非機能性部分を第二の結合ドメインに融合させた第二の融合タンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含み、ここで該第一および第二の融合タンパク質の両方が細胞中で一緒に発現する時に、生存および／または増殖のための該必須のタンパク質の該機能が回復し；ならびに
ｉｉｉ）該第一の融合タンパク質と第二の融合タンパク質の両方を発現する該細胞の該濃縮を導くインビトロの繁殖条件下で、該細胞を培養すること；
を含む、方法。
６６．該必須のタンパク質がＤＨＦＲタンパク質である、アレンジメント６４または６５の方法。
６７．該第一または第二の２要素ヌクレオチド配列いずれかの該第二部分ヌクレオチド配列が細胞にとって外因性である、アレンジメント６４～６６のいずれか１項に記載の方法。
６８．該第一または第二の２要素ヌクレオチド配列いずれかの該第二部分ヌクレオチド配列がＴＣＲである、アレンジメント６４～６７のいずれか１項に記載の方法。
６９．該第一および第二の結合ドメインがＧＣＮ４に由来する、アレンジメント６４～６８のいずれか１項に記載の方法。
７０．該第一および第二の結合ドメインがＦＫＢＰ１２に由来する、アレンジメント６４～６８のいずれか１項に記載の方法。
７１．該ＦＫＢＰ１２がＦ３６Ｖ変異を有する、アレンジメント７０の方法。
７２．該第一の結合ドメインがＪＵＮに由来し、該第二の結合ドメインがＦＯＳに由来する、アレンジメント６４～６８のいずれか１項に記載の方法。
７３．該第一の結合ドメインおよび第二の結合ドメインが互いへの結合を保持する相補的な変異を有する、アレンジメント７２の方法。
７４．該第一の結合ドメインまたは該第二の結合ドメインのいずれもが天然の結合パートナーとは結合しない、アレンジメント７３の方法。
７５．該第一の結合ドメインと第二の結合ドメインのそれぞれが３～７つの相補的な変異を有する、アレンジメント７２～７４のいずれか１項に記載の方法。
７６．該第一の結合ドメインと第二の結合ドメインのそれぞれが３つの相補的な変異を有する、アレンジメント７５の方法。
７７．該第一の結合ドメインと第二の結合ドメインのそれぞれが４つの相補的な変異を有する、アレンジメント７５の方法。
７８．該必須のタンパク質の該機能の該回復が、必要に応じてＡＰ１９０３によって、誘導される、アレンジメント６４～６８、７０、または７１のいずれか１項に記載の方法。
７９．該培養するステップがメトトレキサート存在下で実施される、アレンジメント６４～７８のいずれか１項に記載の方法。
Claims (133)
- 遺伝子改変した細胞を選抜または濃縮するための方法であって、
ｉ）細胞に、前記細胞中で第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現することが可能な、少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を導入すること、
ここで前記細胞は、一般的な細胞培養用の培地中では前記細胞が生存もおよび／または増殖もできない程度まで低減しているレベルの生存および／または増殖に必須のタンパク質を有しており、前記少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、標的ゲノム中の予め決められた部位に挿入された時に、前記細胞中で発現するように操作可能であるかまたは発現するように操作可能な状態になるものであり、前記少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖のための前記必須のタンパク質またはそのバリアントをコードしている第一部分ヌクレオチド配列と発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含み、かつ前記第二部分ヌクレオチド配列は目的のタンパク質をコードしており；ならびに、
ｉｉ）前記第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現する前記細胞を選抜または濃縮するための外因性の薬理学的選択圧を含まない前記一般的な細胞培養用の培地中で、前記細胞を培養すること；
を含む、方法。 - 遺伝子改変した細胞を選抜または濃縮するための方法であって、
ｉ）細胞の生存および／または増殖のために必須の少なくとも１つの第一のタンパク質のレベルを、インビトロの通常の繁殖条件下では前記細胞が生存もおよび／または増殖もできないレベルに低減すること；
ｉｉ）前記細胞中で第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現することが可能で、かつ、前記第一のタンパク質またはそのバリアントをコードしている第一部分ヌクレオチド配列と第二の発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含む、少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を前記細胞に導入すること、
ここで前記少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、標的ゲノム中の予め決められた部位に挿入された時に、前記細胞中で発現するように操作可能であるかまたは発現するように操作可能な状態になり、かつ、前記第二部分タンパク質は目的のタンパク質であり；ならびに
ｉｉｉ）前記第一のタンパク質と第二のタンパク質の両方を発現する前記細胞を濃縮するための外因性の薬理学的選択圧を用いずに、前記細胞をインビトロの通常の繁殖条件下で培養すること；
を含む、方法。 - 前記必須のタンパク質のレベルの前記低減が、持続性または一過性である、請求項１または２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記必須のタンパク質のレベルの前記低減が、前記必須のタンパク質をコードしている遺伝子のノックアウトを含む、請求項２から３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ノックアウトが、ＣＲＩＳＰＲリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）、ＴＡＬＥＮ、ＭｅｇａＴＡＬ、または他の任意のヌクレアーゼによって媒介される、請求項４に記載の方法。
- 前記必須のタンパク質のレベルの前記低減が、前記必須のタンパク質の前記レベルのＲＮＡレベルでの一過性の低減を含む、請求項２から３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記一過性の抑制が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）を介するものである、請求項６に記載の方法。
- 前記細胞が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ｉＮＫＴ細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、ｉＰＳＣ、神経系前駆細胞、網膜の遺伝子治療に関わる細胞型、または他の任意の細胞である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第一部分ヌクレオチド配列のヌクレオチド配列が、ヌクレアーゼ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはＣＲＩＳＰＲｉ耐性を獲得するように変更されている、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第一部分ヌクレオチド配列が、前記必須の第一のタンパク質と同一のアミノ酸配列を有するタンパク質コードしている、請求項９に記載の方法。
- 前記第一部分ヌクレオチド配列が、前記第一のタンパク質のアミノ酸配列とは同一でない変異タンパク質をコードするように変更されている、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記変異タンパク質が、前記第一のタンパク質にはない特性を有する、請求項１１に記載の方法。
- 前記特性に、活性の低下、活性の増強、および半減期の違いのうちの１つ以上が含まれる、請求項１２に記載の方法。
- 前記第一部分および前記第二部分のヌクレオチド配列の両方を、同じプロモーターまたは異なるプロモーターによって駆動することができる、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第二部分のヌクレオチド配列が、少なくとも１つの治療用遺伝子を含む、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第二部分のヌクレオチド配列が、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖を含有している新生抗原Ｔ細胞受容体複合体（ＴＣＲ）をコードしている、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記必須のまたは第一のタンパク質が、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ２（ＩＭＰＤＨ２）、Ｏ－６－メチルグアニン－ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）、デオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ）、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシル基転移酵素１（ＨＰＲＴ１）、インターロイキン２受容体サブユニットガンマ（ＩＬ２ＲＧ）、アクチンベータ（ＡＣＴＢ）、真核生物翻訳伸長因子１アルファ１（ＥＥＦ１Ａ１）、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ１）、またはトランスフェリン受容体（ＴＦＲＣ）である、請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第一部分のヌクレオチド配列がヌクレアーゼ耐性またはｓｉＲＮＡ耐性ＤＨＦＲ遺伝子を含み、前記第二部分のヌクレオチド配列がＴＲＡ遺伝子およびＴＲＢ遺伝子を含む、請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ＴＲＡ、ＴＲＢ、およびＤＨＦＲの遺伝子が単一の読み取り枠から発現するように操作可能に構成されている、請求項１８に記載の方法。
- 前記ＴＲＡ、ＴＲＢ、およびＤＨＦＲの遺伝子が少なくとも１つのリンカーによって隔てられている、請求項１９に記載の方法。
- 前記少なくとも１つのリンカー、ＴＲＡ、ＴＲＢ、およびＤＨＦＲの遺伝子の順番が、
ＴＲＡ－リンカー－ＴＲＢ－リンカー－ＤＨＦＲ、
ＴＲＡ－リンカー－ＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＢ、
ＴＲＢ－リンカー－ＴＲＡ－リンカー－ＤＨＦＲ、
ＴＲＢ－リンカー－ＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＡ、
ＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＡ－リンカー－ＴＲＢ、または
ＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＢ－リンカー－ＴＲＡ
である、請求項２０に記載の方法。 - 前記少なくとも１つのリンカーが、少なくとも１つの自己切断２Ａペプチドおよび／または少なくとも１つのＩＲＥＳエレメントである、請求項２０または２１に記載の方法。
- 前記ＤＨＦＲ、ＴＲＡ、およびＴＲＢの遺伝子が、内在性のＴＣＲプロモーターまたは他の任意の好適なプロモーターによって駆動され、前記他の任意の好適なプロモーターとしては、これらに限定されるものではないが、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１／２、ＤＨＦＲ、ＥＥＦ１Ａ１、ＡＣＴＢ、Ｂ２Ｍ、ＣＤ５２、ＣＤ２、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＬＣＫ、ＬＡＴ、ＰＴＰＲＣ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＴＧＢ２、ＴＧＦＢＲ２、ＰＤＣＤ１、ＣＴＬＡ４、ＦＡＳ、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ（ＴＮＦＲ１）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＴＲＡＩＬＲ２）、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＢＴＬＡ、ＣＤ２００Ｒ１、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＨＡＶＣＲ２（ＴＩＭ３）、ＶＳＩＲ（ＶＩＳＴＡ）、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ４ＲＡ、ＥＩＦ４Ａ１、ＦＴＨ１、ＦＴＬ、ＨＳＰＡ５、およびＰＧＫ１などがある、請求項１８から２２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記２要素ヌクレオチド配列が前記細胞の前記ゲノム中に組み込まれる、請求項１から２３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列が、前記標的ゲノム中の前記予め決められた部位に挿入された時に、発現するように操作可能な状態になり、前記第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方が前記標的ゲノム中のプロモーターによって駆動される、請求項１から２４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記組み込みが、ヌクレアーゼ媒介性部位特異的組み込み、トランスポゾン媒介性遺伝子送達、またはウイルス媒介性遺伝子送を介するものである、請求項２４または２５に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼ媒介性部位特異的組み込みが、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰ、必要に応じてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰを介するものである、請求項２６に記載の方法。
- スプリットインテインシステムを用いることをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
- 前記導入された２要素ヌクレオチド配列が、前記細胞の前記ゲノム中に組み込まれていない、請求項１から２３のいずれか１項に記載の方法。
- 内在性のＴＣＲ定常部位、ヌクレアーゼ耐性ＤＨＦＲ遺伝子をコードしている前記第一部分のヌクレオチド配列、および新生抗原ＴＣＲをコードしている前記第二部分のヌクレオチド配列を標的としているＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰが前記細胞に送達される、請求項１から２７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記内在性のＴＣＲ定常部位が、ＴＣＲα定常（ＴＲＡＣ）部位であってもまたはＴＣＲβ定常（ＴＲＢＣ）部位であってもよい、請求項３０に記載の方法。
- 前記送達が、エレクトロポレーション、または機械的もしくは化学的な膜透過処理に基づく方法によって行われる、請求項３０または３１に記載の方法。
- 第一のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰが内在性のジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子をノックアウトするために用いられ、第二のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰが内在性のＴＣＲ定常部位に、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ耐性ＤＨＦＲ遺伝子を含有している前記第一部分のヌクレオチド配列と治療用ＴＣＲ遺伝子をコードしている前記第二部分のヌクレオチド配列をノックインするために用いられる、請求項１から５、８から２８、または３０から３２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第二のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰが、ノックインするために前記ＴＲＡＣ部位を切断するＴＲＡＣ ＲＮＰである、請求項３３に記載の方法。
- 前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰである、請求項５、２７、３０、３３、または３４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記一般的な細胞培養用の培地が、改変されていない細胞の成長および／または増殖に適したものである、請求項１から３５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記一般的な細胞培養用の培地が、いかなる外因性の選択圧も含まない、請求項１から３６のいずれか１項に記載の方法。
- ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰが前記標的ゲノム中の予め決められた部位に第二の２要素ヌクレオチドをノックインするために用いられ、必要に応じてここで前記標的ゲノム中の前記予め決められた部位がＢ２Ｍ遺伝子である、請求項５から３７のいずれか１項に記載の方法。
- 遺伝子改変した細胞を選抜または濃縮するための方法であって、
ｉ）細胞中で第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現することが可能な、少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を前記細胞に導入すること、
ここで前記細胞の生存および／または増殖に必須のタンパク質の機能活性は、一般的な細胞培養用の培地中では前記細胞が生存もおよび／または増殖もできない程度まで低減しており、前記少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、標的ゲノム中の予め決められた部位に挿入された時に、前記細胞中で発現するように操作可能であるかまたは発現するように操作可能な状態になり、かつ、前記少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖のための前記必須のタンパク質と実質的に等価な機能を付与する第一のタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、第二の発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含み、前記第二のタンパク質は目的のタンパク質であり；ならびに
ｉｉ）前記第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現する前記細胞の選抜または濃縮を導く少なくとも１つの添加剤を含有している細胞培養用の培地中で前記細胞を培養すること；
を含む、方法。 - 遺伝子改変した細胞を選抜または濃縮するための方法であって、
ｉ）細胞の生存および／または増殖のために必須の少なくとも１つの第一のタンパク質の機能活性を、インビトロの通常の繁殖条件下では前記細胞が生存もおよび／または増殖もできない前記レベルまで低減すること；
ｉｉ）前記細胞中で前記第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現することが可能で、かつ、実質的に等価な機能を付与する第一のタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と第二の発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含む少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を前記細胞に導入すること、
ここで前記少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、前記標的ゲノム中の予め決められた部位に挿入された時に、前記細胞中で発現するように操作可能であるかまたは発現するように操作可能な状態になり、そして前記第二のタンパク質は目的のタンパク質であり；ならびに
ｉｉｉ）前記第一のタンパク質と前記第二のタンパク質の両方を発現する前記細胞の選抜または濃縮を導く少なくとも１つの添加剤を含有している細胞培養用の培地中で前記細胞を培養すること；
を含む、方法。 - 前記細胞が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ｉＮＫＴ細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、ｉＰＳＣ、神経系前駆細胞、網膜の遺伝子治療に関わる細胞型、または他の任意の細胞である、請求項３９または４０に記載の方法。
- 前記第一部分ヌクレオチド配列のヌクレオチド配列が、ヌクレアーゼ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはＣＲＩＳＰＲｉ耐性を獲得するように変更されており、かつ、ａ）前記第一のタンパク質と同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしているか、またはｂ）前記第一のタンパク質と同様の機能を有するよう調整されたタンパク質をコードしている、請求項３９から４１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第一部分ヌクレオチド配列が、前記第一のタンパク質のアミノ酸配列とは同一でない変異タンパク質をコードするように変更されている、請求項３９から４２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記変異タンパク質が、前記第一のタンパク質にはない特性を有する、請求項４３に記載の方法。
- 前記特性に、活性の低下、活性の増強、半減期の違い、低分子阻害に対する耐性、および低分子が結合した後の活性の増強のうちの１つ以上が含まれる、請求項４４に記載の方法。
- 前記第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を、同じプロモーターによってもまたは異なるプロモーターによっても駆動することができる、請求項３９から４５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第二部分ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの治療用遺伝子を含む、請求項３９から４６のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第二部分ヌクレオチド配列が、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖を含有している新生抗原Ｔ細胞受容体複合体（ＴＣＲ）をコードしている、請求項３９から４７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記必須のまたは第一のタンパク質が、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ２（ＩＭＰＤＨ２）、Ｏ－６－メチルグアニン－ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）、デオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ）、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシル基転移酵素１（ＨＰＲＴ１）、インターロイキン２受容体サブユニットガンマ（ＩＬ２ＲＧ）、アクチンベータ（ＡＣＴＢ）、真核生物翻訳伸長因子１アルファ１（ＥＥＦ１Ａ１）、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ１）、またはトランスフェリン受容体（ＴＦＲＣ）である、請求項３９から４８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第一部分ヌクレオチド配列がタンパク質阻害剤耐性ＤＨＦＲ遺伝子を含み、前記第二部分ヌクレオチド配列がＴＲＡ遺伝子およびＴＲＢ遺伝子を含む、請求項３９から４９のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ＴＲＡ、ＴＲＢ、およびＤＨＦＲの遺伝子が単一の読み取り枠から発現するように操作可能に構成されている、請求項５０に記載の方法。
- 前記ＴＲＡ、ＴＲＢ、およびＤＨＦＲの遺伝子が少なくとも１つのリンカーによって隔てられている、請求項５１に記載の方法。
- 前記少なくとも１つのリンカー、ＴＲＡ、ＴＲＢ、およびＤＨＦＲ遺伝子の順番が、
ＴＲＡ－リンカー－ＴＲＢ－リンカー－ＤＨＦＲ、
ＴＲＡ－リンカー－ＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＢ、
ＴＲＢ－リンカー－ＴＲＡ－リンカー－ＤＨＦＲ、
ＴＲＢ－リンカー－ＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＡ、
ＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＡ－リンカー－ＴＲＢ、または
ＤＨＦＲ－リンカー－ＴＲＢ－リンカー－ＴＲＡ
である、請求項５２に記載の方法。 - 前記少なくとも１つのリンカーが、少なくとも１つの自己切断２Ａペプチドおよび／または少なくとも１つのＩＲＥＳエレメントである、請求項５３に記載の方法。
- 前記ＤＨＦＲ、ＴＲＡ、およびＴＲＢの遺伝子が、内在性のＴＣＲプロモーターまたは他の任意の好適なプロモーターによって駆動され、前記他の任意の好適なプロモーターとしては、これらに限定されるものではないが、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１／２、ＤＨＦＲ、ＥＥＦ１Ａ１、ＡＣＴＢ、Ｂ２Ｍ、ＣＤ５２、ＣＤ２、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＬＣＫ、ＬＡＴ、ＰＴＰＲＣ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＴＧＢ２、ＴＧＦＢＲ２、ＰＤＣＤ１、ＣＴＬＡ４、ＦＡＳ、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ（ＴＮＦＲ１）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＴＲＡＩＬＲ２）、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＢＴＬＡ、ＣＤ２００Ｒ１、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＨＡＶＣＲ２（ＴＩＭ３）、ＶＳＩＲ（ＶＩＳＴＡ）、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ４ＲＡ、ＥＩＦ４Ａ１、ＦＴＨ１、ＦＴＬ、ＨＳＰＡ５、およびＰＧＫ１などがある、請求項５０から５４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記２要素ヌクレオチド配列が前記細胞の前記ゲノム中に組み込まれる、請求項３９から５５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列が、前記標的ゲノム中の前記予め決められた部位に挿入された時に、発現するように操作可能な状態になり、前記第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方が前記標的ゲノム中のプロモーターによって駆動される、請求項３９から５６のいずれか１項に記載の方法。
- 前記組み込みが、ヌクレアーゼ媒介性部位特異的組み込み、トランスポゾン媒介性遺伝子送達、またはウイルス媒介性遺伝子送を介するものである、請求項５７に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼ媒介性部位特異的組み込みが、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰ、必要に応じてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰを介するものである、請求項５８に記載の方法。
- スプリットインテインシステムを用いることをさらに含む、請求項５９に記載の方法。
- 前記導入された２要素ヌクレオチド配列が、前記細胞の前記ゲノム中に組み込まれていない、請求項３９から５５のいずれか１項に記載の方法。
- 内在性のＴＣＲ定常部位、タンパク質阻害剤耐性ＤＨＦＲ遺伝子をコードしている前記第一部分ヌクレオチド配列、および新生抗原ＴＣＲをコードしている前記第二部分ヌクレオチド配列を標的としているＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰが前記細胞に送達される、請求項３９から６０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記内在性のＴＣＲ定常部位が、ＴＣＲα定常（ＴＲＡＣ）部位であってもまたはＴＣＲβ定常（ＴＲＢＣ）部位であってもよい、請求項６２に記載の方法。
- 前記送達が、エレクトロポレーション、または機械的もしくは化学的な膜透過処理に基づく方法によって行われる、請求項６２または６３に記載の方法。
- 前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰが、ノックインするために前記ＴＲＡＣ部位を切断するＴＲＡＣ ＲＮＰである、請求項６２から６４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰである、請求項５９、６２、または６５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記細胞の濃縮または選抜を導く前記添加剤が、フローサイトメトリーまたは磁気ビーズ濃縮による前記細胞の濃縮を可能にする抗体である、請求項３９から６６のいずれか１項に記載の方法。
- 前記添加剤が、前記第一のタンパク質および前記第二のタンパク質の両方を発現していない細胞の生存および／または増殖を損傷する、請求項３９から６７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第一のタンパク質が、前記添加剤を介した細胞の生存および／または増殖の損傷に対する前記細胞の耐性を媒介する、請求項６８に記載の方法。
- 前記添加剤がメトトレキサートである、請求項３９から６９のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第一のタンパク質がメトトレキサート耐性ＤＨＦＲ変異型タンパク質である、請求項６９または７０のいずれか１項に記載の方法。
- 遺伝子改変した細胞を選抜または濃縮するための方法であって、
ｉ）細胞中で第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現することが可能な、少なくとも２つの２要素ヌクレオチド配列を前記細胞に導入すること、
ここで前記細胞は、前記細胞が生存もおよび／または増殖もできない程度まで抑制されたレベルの生存および／または増殖に必須のタンパク質を有しており、
ここで前記第一の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖のための前記必須のタンパク質の非機能性部分を第一の結合ドメインに融合させた第一の融合タンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、第一の目的のタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列を含み、前記第二の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖のための前記必須のタンパク質の非機能性部分を第二の結合ドメインに融合させた第二の融合タンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、第二の目的のタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列を含み、かつ、前記第一および第二の融合タンパク質の両方が細胞中で一緒に発現する時に、生存および／または増殖のための前記必須のタンパク質の前記機能が回復するものであり；ならびに
ｉｉ）前記第一および第二の２要素ヌクレオチド配列の両方を発現する前記細胞の前記選抜を導く条件下で前記細胞を培養すること；
を含む、方法。 - 遺伝子改変した細胞を選抜または濃縮するための方法であって、
ｉ）細胞の生存および／または増殖のために必須の少なくとも第一のタンパク質を、前記細胞がインビトロの通常の繁殖条件下では生存もおよび／または増殖もできないレベルまで抑制すること；
ｉｉ）前記細胞中で発現させることが可能な少なくとも２つの２要素ヌクレオチド配列を導入すること、
ここで前記第一の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖のための前記必須のタンパク質の非機能性部分を第一の結合ドメインに融合させた第一の融合タンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、第一の目的のタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含み、前記第二の２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖のための前記必須のタンパク質の非機能性部分を第二の結合ドメインに融合させた第二の融合タンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、第二の目的のタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列を含み、かつ、前記第一および第二の融合タンパク質の両方が細胞中で一緒に発現する時には、生存および／または増殖のための前記必須のタンパク質の前記機能が回復するものであり；ならびに
ｉｉｉ）前記第一の融合タンパク質および第二の融合タンパク質の両方を発現する前記細胞の前記濃縮を導くインビトロ繁殖条件下で前記細胞を培養すること；
を含む、方法。 - 前記必須のタンパク質がＤＨＦＲタンパク質である、請求項７２または７３に記載の方法。
- 前記第一の融合タンパク質がＤＨＦＲのＮ末端部分を含み、前記第二の融合タンパク質がＤＨＦＲのＣ末端部分を含む、請求項７４に記載の方法。
- 前記第一の融合タンパク質がＤＨＦＲのＣ末端部分を含み、前記第二の融合タンパク質がＤＨＦＲのＮ末端部分を含む、請求項７４に記載の方法。
- 前記ＤＨＦＲのＮ末端部分が配列番号２２を含む、請求項７４または７５に記載の方法。
- 前記ＤＨＦＲのＣ末端部分が配列番号２３を含む、請求項７４から７７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第一または第二の２要素ヌクレオチド配列いずれかの前記第二部分ヌクレオチド配列が、前記細胞にとって外因性である、請求項７２から７８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第一または第二の２要素ヌクレオチド配列いずれかの前記第二部分ヌクレオチド配列がＴＣＲである、請求項７２から７９のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第一および第二の結合ドメインがＧＣＮ４に由来する、請求項７２から８０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第一および／または第二の結合ドメインが配列番号２４を含む、請求項７２から８１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第一の融合タンパク質および第二の融合タンパク質が配列番号３９または配列番号４０を含む、請求項７２から８２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第一および第二の結合ドメインがＦＫＢＰ１２に由来する、請求項７２から８０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ＦＫＢＰ１２がＦ３６Ｖ変異を有する、請求項８４に記載の方法。
- 前記第一および／または第二の結合ドメインが配列番号３１を含む、請求項７２から８０、８４、または８５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第一の融合タンパク質および第二の融合タンパク質が配列番号６２または配列番号６３を含む、請求項７２から８０または８４から８６のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第一の結合ドメインおよび前記第二の結合ドメインがＪＵＮおよびＦＯＳに由来する、請求項７２から８０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第一の結合ドメインおよび第二の結合ドメインが、互いへの結合を保持する相補的な変異を有する、請求項８８に記載の方法。
- 前記第一の結合ドメインまたは前記第二の結合ドメインのいずれもが天然の結合パートナーとは結合しない、請求項８９に記載の方法。
- 前記第一の結合ドメインと第二の結合ドメインのそれぞれが、３～７つの相補的な変異を有する、請求項７２から８０または８８から９０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第一の結合ドメインと第二の結合ドメインのそれぞれが、３つの相補的な変異を有する、請求項９１に記載の方法。
- 前記第一の結合ドメインおよび第二の結合ドメインが配列番号２６または配列番号２９を含む、請求項７２から８０または８８から９２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第一の融合タンパク質および第二の融合タンパク質が配列番号３５または配列番号３６を含む、請求項７２から８０または８８から９３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第一の結合ドメインと第二の結合ドメインのそれぞれが、４つの相補的な変異を有する、請求項９１に記載の方法。
- 前記第一の結合ドメインおよび第二の結合ドメインが配列番号２７および配列番号３０を含む、請求項７２から８０、８８から９１、または９５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第一の融合タンパク質および第二の融合タンパク質が配列番号３７および配列番号３８を含む、請求項７２から８０、８８から９１、９５、または９６のいずれか１項に記載の方法。
- 前記少なくとも２つの２要素ヌクレオチド配列が前記細胞の前記ゲノム中に組み込まれる、請求項７２から９７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記少なくとも２つの２要素ヌクレオチド配列が、前記標的ゲノム中の予め決められた部位に挿入された時に、発現するように操作可能な状態になり、前記第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方が前記標的ゲノム中のプロモーターによって駆動される、請求項７２から９８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記組み込みが、ヌクレアーゼ媒介性部位特異的組み込み、トランスポゾン媒介性遺伝子送達、またはウイルス媒介性遺伝子送を介するものである、請求項９８または９９に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼ媒介性部位特異的組み込みがＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰを介するものである、請求項１００に記載の方法。
- 内在性のＴＣＲ定常部位、ＤＨＦＲタンパク質の非機能性部分をコードしている前記第一の第一部分ヌクレオチド配列、および新生抗原ＴＣＲをコードしている前記第一の第二部分ヌクレオチド配列を標的としているＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰによって前記第一の２要素ヌクレオチド配列が前記細胞に送達される、請求項７２から１０１のいずれか１項に記載の方法。
- ＴＣＲ定常遺伝子座以外の内在性の遺伝子座、ＤＨＦＲタンパク質の非機能性部分をコードしている前記第二の第一部分ヌクレオチド配列、および目的のタンパク質をコードしている前記第二の第二部分ヌクレオチド配列を標的としているＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰによって前記第二の２要素ヌクレオチド配列が前記細胞に送達される、請求項７２から１０２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第一の第一部分ヌクレオチド配列と前記第二の第一部分ヌクレオチド配列がＤＨＦＲタンパク質の非機能性部分を含有している融合タンパク質をコードしていて、共発現させた時にＤＨＦＲ活性をもつ、請求項１０３に記載の方法。
- 前記内在性のＴＣＲ定常部位がＴＣＲα定常（ＴＲＡＣ）部位であってもまたはＴＣＲβ定常（ＴＲＢＣ）部位であってもよい、請求項１０２から１０４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ＴＣＲ定常部位以外の内在性の遺伝子座がＢ２Ｍ遺伝子座である、請求項１０３から１０５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記送達が、エレクトロポレーション、または機械的もしくは化学的な膜透過処理に基づく方法によって行われる、請求項１０２から１０６のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰである、請求項１０１から１０７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼが、前記２要素ヌクレオチドのうちのいずれか１つの少なくとも一部分を、前記内在性プロモーター、前記内在性スプライス部位、および前記内在性終結シグナルから発現するようにインフレームで遺伝子座のエキソンに組み込むことを可能にする、請求項２６から２８、３０から３８、５８から６０、６２から７１、または１００から１０８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼが、前記２要素ヌクレオチドのうちのいずれか１つの少なくとも一部分を、前記内在性プロモーター、前記内在性スプライス部位、および外因性終結シグナルから発現するようにインフレームで遺伝子座のエキソンに組み込むことを可能にする、請求項２６から２８、３０から３８、５８から６０、６２から７１、または１００から１０８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼが、前記２要素ヌクレオチドのうちのいずれか１つの少なくとも一部分を、前記内在性プロモーター、外因性のスプライス受容部位、および外因性終結シグナルから発現するように遺伝子座のイントロンに組み込むことを可能にする、請求項２６から２８、３０から３８、５８から６０、６２から７１、または１００から１０８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記必須のまたは第一のタンパク質が少なくとも２つの個別の機能不全タンパク質部分に分割され、前記少なくとも２つの部分がそれぞれ多量体化ドメインに融合され、前記少なくとも２つの部分がそれぞれ、異なる２要素ヌクレオチド配列の全てが発現されている細胞の選抜を可能にする、異なる２要素ヌクレオチド配列に組み込まれ、必要に応じて前記必須のまたは第一のタンパク質の前記機能が回復する、請求項１から８０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記必須のまたは第一のタンパク質が、機能不全のＮ末端およびＣ末端タンパク質部分に分割され、それぞれの部分がホモもしくはヘテロ二量体化タンパク質パートナーまたはスプリットインテインに融合される、請求項１から８０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記必須のまたは第一のタンパク質がＤＨＦＲタンパク質である、請求項１１２または１１３のいずれか１項に記載の方法。
- 第一の機能不全タンパク質部分がＤＨＦＲのＮ末端部分を含み、第二の機能不全タンパク質部分がＤＨＦＲのＣ末端部分を含む、請求項１１４に記載の方法。
- 前記ＤＨＦＲのＮ末端部分が配列番号２２を含む、請求項１１５に記載の方法。
- 前記ＤＨＦＲのＣ末端部分が配列番号２３を含む、請求項１１６に記載の方法。
- 前記ホモ二量体化タンパク質がＧＣＮ４、ＦＫＢＰ１２、またはそのバリアントである、請求項１０８から１１０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ヘテロ二量体化タンパク質がＪｕｎ／Ｆｏｓ、またはそのバリアントである、請求項１０８から１１０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記必須のタンパク質の前記機能の回復が誘導される、必要に応じてＡＰ１９０３によって誘導される、請求項７２から７６、８０から８３、または１０８から１１１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記培養するステップが、メトトレキサート存在下で実施される、請求項７２から１０８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記目的のタンパク質がＴ細胞受容体である、請求項１から１２１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記Ｔ細胞受容体がウイルス性抗原または腫瘍抗原に特異的である、請求項１２２に記載の方法。
- 前記腫瘍抗原が腫瘍新生抗原である、請求項１２３に記載の方法。
- 前記遺伝子改変した細胞が初代ヒトＴ細胞である、請求項１から１２４のいずれか１項に記載の方法。
- 遺伝子改変したＴ細胞を濃縮するための方法であって、
ｉ）メトトレキサート耐性ＤＨＦＲタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、Ｔ細胞受容体複合体またはキメラ抗体受容体をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含有している前記２要素ヌクレオチド配列を、前記ＴＲＡまたはＴＲＢプロモーターの下流に組み込むことによって前記Ｔ細胞内に導入すること；および
ｉｉ）前記第一のタンパク質と前記第二のタンパク質の両方を発現している前記細胞の濃縮を導くために、メトトレキサートを含有している細胞培養用の培地中で前記細胞を培養すること；
を含む、方法。 - 外因性のＴ細胞受容体遺伝子を発現するように改変したＴ細胞を濃縮するための方法であって、
ｉ）第一のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰを利用して内在性のＴＲＢＣ遺伝子をその遺伝子座からノックアウトすること；
ｉｉ）第二のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰを利用して、メトトレキサート耐性ＤＨＦＲ遺伝子をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と治療用ＴＣＲ遺伝子を含有している第二部分ヌクレオチド配列を、前記内在性のＴＲＢＣ遺伝子座にノックインすること、ここでヌクレオチド配列は両方とも前記内在性のＴＲＢＣプロモーターから発現できるように操作可能に結合され；ならびに
ｉｉｉ）前記治療用ＴＣＲと前記メトトレキサート耐性ＤＨＦＲ遺伝子の両方を発現しているＴ細胞を濃縮するために、メトトレキサートを含有している細胞培養用の培地中で、前記細胞を培養すること；
を含む、方法。 - 遺伝子改変した細胞を選抜するための方法であって、
ｉ）細胞中で発現するよう操作可能な少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列を導入すること、
ここで前記細胞は、前記細胞が生存もおよび／または増殖もできない程度まで抑制されたレベルの生存および／または増殖に必須のタンパク質を有しており、かつ、前記少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列は、生存および／または増殖のための前記必須のタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と、発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含み、前記第二部分ヌクレオチド配列は、前記細胞にとって外因性のタンパク質をコードしており；ならびに
ｉｉ）前記第一部分と第二部分のヌクレオチド配列の両方を発現している前記細胞の前記選抜を導く条件下で前記細胞を培養すること；
を含む、方法。 - 遺伝子改変した細胞を濃縮するための方法であって、
ｉ）細胞の生存および／または増殖のために必須の少なくとも第一のタンパク質の活性を、インビトロの通常の繁殖条件下では前記細胞が生存もおよび／または増殖もできないレベルに低下させること；
ｉｉ）前記細胞中で発現するよう操作可能で、かつ、前記第一のタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と第二の発現させたいタンパク質をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含み、前記第二部分は前記細胞にとって外因性のタンパク質である、少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列とを、導入すること、；ならびに
ｉｉｉ）前記第一のタンパク質と第二のタンパク質の両方を発現する前記細胞の前記濃縮を導くインビトロの繁殖条件下で前記細胞を培養すること；
を含む、方法。 - 請求項１から１２９のいずれか１項に記載の方法によって作製される細胞。
- Ｔ細胞であって、
メトトレキサート存在下では、前記細胞が生存もおよび／または増殖もできないレベルまで抑制された内在性のジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）；および
メトトレキサート耐性ＤＨＦＲタンパク質をコードしている第一部分ヌクレオチド配列と前記内在性のＴＲＡまたはＴＲＢプロモーターから操作可能に発現するＴ細胞受容体をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含有している、少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列；
を含む、Ｔ細胞。 - Ｔ細胞であって、
内在性のジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）のノックアウト；および
ＤＨＦＲタンパク質またはそのバリアントをコードしている第一部分ヌクレオチド配列と前記内在性のＴＲＡまたはＴＲＢプロモーターから操作可能に発現するＴ細胞受容体をコードしている第二部分ヌクレオチド配列とを含有している少なくとも１つの２要素ヌクレオチド配列；
を含む、Ｔ細胞。 - メトトレキサート存在下では、前記細胞が生存もおよび／または増殖もできないレベルまで抑制されるように構成された内在性のジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）；ならびに
少なくとも第一の２要素ヌクレオチド配列と第二の２要素ヌクレオチド配列とを含むＴ細胞であって;
ここで、前記第一の２要素ヌクレオチド配列が
ｉ）ＤＨＦＲタンパク質の非機能性もしくは機能不全部分またはそのバリアントをコードしている第一の第一部分ヌクレオチド配列と
ｉｉ）Ｔ細胞受容体コードし、前記内在性のＴＲＡまたはＴＲＢプロモーターから操作可能に発現する第一の第二部分ヌクレオチド配列と、を含み、
前記第二の２要素ヌクレオチド配列は、
ｉｉｉ）ＤＨＦＲタンパク質の非機能性もしくは機能不全部分またはそのバリアントをコードしている第二の第一部分ヌクレオチド配列と
ｉｖ）目的のタンパク質コードし、前記内在性のＢ２Ｍプロモーターから操作可能に発現する第二の第二部分ヌクレオチド配列とを含み、そして
前記細胞がＤＨＦＲ活性を有するように構成されている、
Ｔ細胞。
Applications Claiming Priority (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US202063062854P | 2020-08-07 | 2020-08-07 | |
| US63/062,854 | 2020-08-07 | ||
| US202163135460P | 2021-01-08 | 2021-01-08 | |
| US63/135,460 | 2021-01-08 | ||
| US202163170269P | 2021-04-02 | 2021-04-02 | |
| US63/170,269 | 2021-04-02 | ||
| US202163221808P | 2021-07-14 | 2021-07-14 | |
| US63/221,808 | 2021-07-14 | ||
| PCT/US2021/071122 WO2022032299A1 (en) | 2020-08-07 | 2021-08-05 | Methods to enrich genetically engineered t cells |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2023537048A true JP2023537048A (ja) | 2023-08-30 |
Family
ID=77543729
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2023508119A Pending JP2023537048A (ja) | 2020-08-07 | 2021-08-05 | 遺伝子改変したｔ細胞の濃縮方法 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20220041999A1 (ja) |
| EP (1) | EP4192941A1 (ja) |
| JP (1) | JP2023537048A (ja) |
| KR (1) | KR20230065251A (ja) |
| CN (1) | CN116323920A (ja) |
| AU (1) | AU2021320556A1 (ja) |
| CA (1) | CA3188431A1 (ja) |
| MX (1) | MX2023001596A (ja) |
| TW (1) | TW202212352A (ja) |
| WO (1) | WO2022032299A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022183076A1 (en) * | 2021-02-25 | 2022-09-01 | Lyell Immunopharma, Inc. | Enhanced immune cell therapy targeting ny-eso-1 |
| US20230372485A1 (en) | 2021-11-15 | 2023-11-23 | Neogene Therapeutics B.V. | Engineered t cells with reduced tgf-beta receptor signaling |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BR112017015453A2 (pt) * | 2015-01-26 | 2018-01-23 | Cellectis | células imunes modificadas knockout para receptor de células t, dotadas de receptores quiméricos de antígeno, de ligação a cd123 para o tratamento de linfoma mieloide agudo recorrente/refratário ou neoplasia blástica de células dendríticas plasmacitoides |
| EP3621981A2 (en) * | 2017-05-12 | 2020-03-18 | CRISPR Therapeutics AG | Materials and methods for engineering cells and uses thereof in immuno-oncology |
| CN107201365B (zh) * | 2017-05-19 | 2018-04-20 | 四川丰讯科技发展有限公司 | 一种特异性敲除二氢叶酸还原酶基因的sgRNA序列及其应用 |
-
2021
- 2021-08-05 CA CA3188431A patent/CA3188431A1/en active Pending
- 2021-08-05 WO PCT/US2021/071122 patent/WO2022032299A1/en unknown
- 2021-08-05 JP JP2023508119A patent/JP2023537048A/ja active Pending
- 2021-08-05 MX MX2023001596A patent/MX2023001596A/es unknown
- 2021-08-05 EP EP21762978.1A patent/EP4192941A1/en active Pending
- 2021-08-05 AU AU2021320556A patent/AU2021320556A1/en active Pending
- 2021-08-05 KR KR1020237007441A patent/KR20230065251A/ko unknown
- 2021-08-05 US US17/395,132 patent/US20220041999A1/en active Pending
- 2021-08-05 CN CN202180069138.5A patent/CN116323920A/zh active Pending
- 2021-08-06 TW TW110129192A patent/TW202212352A/zh unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2021320556A1 (en) | 2023-03-09 |
| EP4192941A1 (en) | 2023-06-14 |
| TW202212352A (zh) | 2022-04-01 |
| CN116323920A (zh) | 2023-06-23 |
| CA3188431A1 (en) | 2022-02-10 |
| KR20230065251A (ko) | 2023-05-11 |
| WO2022032299A1 (en) | 2022-02-10 |
| US20220041999A1 (en) | 2022-02-10 |
| MX2023001596A (es) | 2023-04-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20210139583A1 (en) | Production of engineered t-cells by sleeping beauty transposon coupled with methotrexate selection | |
| AU2018355587B2 (en) | Targeted replacement of endogenous T cell receptors | |
| JP2021500894A (ja) | キメラ抗原受容体発現細胞を作製する方法 | |
| JP2021502113A (ja) | 免疫療法のためのｔ細胞におけるｔｇｆｂｒ２のｃｒｉｓｐｒ−ｃａｓ９編集のための方法、組成物、および構成要素 | |
| CN112040986A (zh) | 用于改进的免疫疗法的基因调控组合物和方法 | |
| JP7412666B2 (ja) | ＨＰＫ１を標的とするｇＲＮＡ及びＨＰＫ１遺伝子の編集方法 | |
| CN110914431B (zh) | 经人工操纵的免疫细胞 | |
| TW201819628A (zh) | 使用具有工程化穩定表現內源性foxp3基因之cd4 t細胞治療自體免疫疾病的方法 | |
| JP2023537048A (ja) | 遺伝子改変したｔ細胞の濃縮方法 | |
| US20210002609A1 (en) | Modified lymphocytes | |
| KR20200079312A (ko) | 면역요법을 위한 t 세포 내 cblb의 crispr-cas9 편집 방법, 조성물 및 성분 | |
| WO2021095013A1 (en) | Manufacturing process for making t cells expressing chimeric antigen receptors | |
| WO2018068257A1 (zh) | 通用型car-t细胞及其制备方法和用途 | |
| WO2022240360A9 (en) | Chimeric antigen receptors and modified cells comprising the same | |
| WO2021147891A1 (zh) | 一种经修饰的免疫效应细胞及其用途 | |
| EP4039808A1 (en) | Guide rnas and uses thereof | |
| US20230250415A1 (en) | Method for introducing antigen-specific receptor gene into t cell genome using circular dna | |
| WO2022266538A2 (en) | Compositions and methods for targeting, editing or modifying human genes | |
| EP4320241A1 (en) | Compositions and methods for delivery of therapeutic agents to acceptor cells | |
| WO2024047561A1 (en) | Biomaterials and processes for immune synapse modulation of hypoimmunogenicity |