TWI609960B - 轉位子系統、套組及其用途 - Google Patents

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Abstract

本揭示內容是關於一種於活體外利用一轉位子系統將一外源性DNA序列整合至細胞基因體的方法。該轉位子系統包含一第一載體，其帶有反向重複序列及一外源性DNA；以及一可表現轉位酶的第二載體。本揭示內容亦提供一種包含該用以將一外源性DNA整合至細胞基因體之轉位子系統的套組；以及一種用以治療有需要之個體的方法，包含利用本發明方法及/或套組來改造一免疫細胞，使其攜帶外源性DNA序列後，再對該個體投予一有效量之經改造的免疫細胞。

Description

轉位子系統、套組及其用途
本揭示內容是關於用以改造細胞，使細胞攜帶特定基因的系統、套組及方法；以及利用該些經改造的細胞做為治療藥劑，以治療有需要之個體的用途。
PiggyBac (PB)轉位子(transposon)是一種可移動的遺傳元件(mobile genetic element)， 能藉由「剪貼」機制有效率地在載體及基因體(genome)之間移動。在移動過程中，PB轉位酶會辨識位於轉位子載體二端的轉位子特定反向末端重複序列(transposon-specific inverted terminal repeat sequences, ITRs)，進而將內含物由原始位置有效率地整合(integrate)至TTAA基因體位置。PB轉位子系統的活性可使位於PB載體之二個ITRs間的特定基因輕易地移動至標的基因體中。
PB轉位子的特點包含：(1)無攜帶基因的長度限制；已知PB轉位子可促使長達100 kbp (kilobase)的DNA片段移動至標的細胞中；(2)轉置具可逆性；將僅會表現PB轉位酶的載體暫時性地轉染至包含插入PB載體的基因體中，可將轉位子由基因體中移除；以及(3) PB轉位子可廣泛應用於不同物種；對TTAA具有專一性的PB轉位子可對各式物種進行基因改造，舉例來說，昆蟲細胞及哺乳動物細胞。此外，相較於病毒載體，PB轉位子的免疫原性(immunogenicity)較低，較不易引發過敏反應。
免疫系統對人類健康極為重要。免疫系統發生缺陷或無法正常作用會降低個體消滅異常體細胞及侵入性病原菌的能力，進而造成腫瘤或感染等疾病。另一方面，當免疫系統過度活化時，則會攻擊及傷害自體組織，引發自體免疫疾病及發炎反應。因此，調控免疫細胞的表現、功能或作用(例如轉入(introduce)外源性基因)，以(i)提升或降低免疫細胞的基因表現，或(ii)增加或抑制免疫細胞的功能，提供了一種用以預防及/或治療免疫相關疾病的方法。然而，免疫細胞無法穩定表現外源性基因的特性往往限制了其於細胞治療方面的應用。
因此，相關領域亟需一種經改良的表現系統及方法，藉以使免疫細胞有效且穩定地表現外源性DNA序列(例如基因)，進而應用於細胞治療以預防或治療免疫相關疾病。
發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。
本揭示內容是關於一種於活體外將一外源性DNA序列整合至一細胞之基因體的方法。該方法包含：(i) 得到一轉位子系統，其係包含：(a) 一第一載體，包含一由序列編號：1所組成之核酸序列的第一反向重複；位於該第一反向重複下游的外源性DNA序列；及一位於該外源性DNA序列下游且包含由序列編號：2所組成之核酸序列的第二反向重複；以及(b)一第二載體，包含一可操作式地連接至一核酸的啟動子，其中該核酸可編碼出一具有序列編號：4之胺基酸序列的轉位酶；以及(ii)將第一及第二載體轉入該細胞。待轉位酶於該細胞中被表現後，即可催化由第一載體將外源性DNA序列剪切下來的反應，並整合至該細胞的基因體，藉以將外源性DNA序列整合至細胞的基因體中。
本揭示內容揭示一用以將一外源性DNA序列整合至細胞基因體的套組。該套組包含(i)一容器；(ii)一轉位子系統，包含(a)一第一載體，包含一由序列編號：1所組成之核酸序列的第一反向重複，一位於該第一反向重複之下游且具有由序列編號：2所組成之核酸序列的第二反向重複，以及一位於該第一反向重複與該第二反向重複之間、可使外源性DNA序列轉入的轉殖位置；以及(b)一第二載體，包含一可操作式地連接至一核酸的啟動子，其中該核酸可編碼出一具有序列編號：4之胺基酸序列的轉位酶；以及(iii)一隨附之操作說明，藉以指示如何使用本發明轉位子系統。該轉位酶可催化由第一載體剪切下外源性DNA序列的反應，並將其整合至細胞的基因體中。
此外，本揭示內容亦揭示了一種用以治療一罹患或疑似罹患免疫相關疾病之個體的方法。該方法包含利用本發明活體外方法(較佳是利用本發明套組)，將一外源性DNA序列整合至一免疫細胞的基因體中，以改造該免疫細胞；再對個體投予一有效量之前述經改造的免疫細胞，藉以改善或減緩免疫相關疾病的病徴。
在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。
為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。
1. 定義
除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。
雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比（例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者）均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處，將數值範圍表示成由一端點至另一段點或介於二端點之間；除非另有說明，此處所述的數值範圍皆包含端點。
在本揭示內容中，「轉位子」(transposon或transposable element)一詞是指一多核苷酸，其可由一供體多核苷酸(例如，一載體)剪下後，整合至一標的位置(例如，細胞的基因體或額外染色體(extrachromosome))，藉以改變其於基因體中的位置。轉位子為包含一核酸序列的多核苷酸，其中該核酸序列的二端分別具有同側作用(cis-acting)核苷酸序列，其中至少一同側作用核苷酸序列是位於該核酸序列的5'端，且至少一同側作用核苷酸序列是位於該核酸序列的3'端。位於轉位子各端之同側作用核苷酸序列包含至少一反向重複(inverted repeat, IR)；轉位酶(較佳是哺乳動物piggyBac家族的轉位酶)可結合至該反向重複。在一較佳實施方式中，轉位子為源自蛾的micro-piggyBac轉位子。
在本揭示內容中，「轉位酶」(transposase)一詞是指一多肽，其可催化由一供體多核苷酸(例如一微環(minicircle)構建體)剪切出轉位子的反應，接著將該轉位子整合至一標的細胞的基因體或額外染色體DNA中。較佳地，轉位酶會結合至反向重複序列。
在本揭示內容中，「多肽」(polypeptide)一詞是指一具有任何長度的胺基酸聚合物。因此，多肽的定義包含胜肽(peptide)、寡胜肽(oligopeptide)、蛋白(protein)、抗體(antibody)及酵素(enzyme)。「多肽」(polypeptide)一詞亦包含多肽的轉譯後修飾，舉例來說，醣化(glycosylation，例如加入一醣類)、乙醯化(acetylation)及磷酸化(phosphorylation)等。
「載體」(vector)一詞在本說明書是指一核酸分子，其可傳送與其連結之另一核酸分子。例示性的載體包含，但不限於，細菌、質體、噬菌體、黏質體(cosmid)、額外遺傳單位(episome)、病毒及可插入的DNA片段，例如可藉由同源重組(homologous recombination)插入宿主細胞之基因體的片段。
在本說明書中，「質體」(plasmid)一詞是指環狀之雙股DNA，可接受一外來的DNA片段，且能於原核或真核細胞中進行複製。
「微環」(minicircle)、「微環DNA」(minicircle DNA)及「微環核酸序列」(minicircle nucleic acid sequence)在本說明書為可互換的詞彙，皆是指一不包含任何複製所需之質體/載體骨架的核酸序列，例如原核生物的抗生素抗性基因及原核生物的複製原點。可以細菌質體於活體內製備微環，其係利用質體中重組酶辨識位點間的分子內重組來產生一不具有細菌質體骨架DNA的微環DNA載體。依據本揭示內容一實施方式，是利用酵素剪切/連結法來製備本發明微環。依據本揭示內容另一實施方式，是利用商業化套組(微環DNA製備套組, System Biosciences, CA, USA)來製備本發明微環。
在本揭示內容中，「轉入」(introduce)一詞是指將一多核苷酸(例如本發明轉位子系統之微環核酸序列或輔助載體)轉入一細胞或生物體。多核苷酸的核酸可以是裸露的DNA或RNA、與不同蛋白連接的DNA或RNA，或插入一載體的DNA或RNA。「轉入」(introduce)一詞在本揭示內容涵蓋了最廣泛的範圍；舉例來說，轉入包含以下方法所達成的傳送功效：轉染法(transfection，利用物理及/或化學處理將一多核苷酸轉入一真核細胞)、轉形法(transformation method，利用物理及/或化學處理將一多核苷酸轉入一原核細胞)、病毒法/病毒轉殖法(viral method/viral transduction method，以病毒或病毒載體將一多核苷酸轉入一真核及/或原核細胞)、接合法(conjugation method，藉由細胞-細胞直接接觸或細胞間的細胞質橋 ，將一多核苷酸由一細胞轉入另一細胞)及融合法(fusion method，融合二細胞，包含同型細胞融合及異型細胞融合)。
「改造」(engineer)在本揭示內容是指處理一細胞，造成該細胞產生可偵測的變化，其中該處理包含，但不限於，插入一與細胞異源(heterologous)/同源(homologous)的多核苷酸及/或多肽，以及使一細胞原生的多核苷酸及/或多肽產生突變。
在本揭示內容中，「轉位」(transposition)一詞是指一複雜的基因重組過程，包含一多核苷酸(轉位子)由一位點移動或複製到另一位點，該移動/複製常發生於基因體內、基因體之間、DNA構建體(例如質體、桿狀病毒質體(bacmid)及黏質體)之間，或是基因體及DNA構建體之間。依據本揭示內容實施方式，轉位是發生於基因體及DNA構建體之間，其中多核苷酸(例如本發明轉位子系統的表現組)是由本發明轉位子系統的微環核酸序列轉移至宿主細胞(例如免疫細胞)的基因體。
「轉位功效」(transposition efficacy)在本揭示內容是指在一群宿主細胞中，包含轉入多核苷酸之宿主細胞的數量。一般來說，可將一用以編碼報導蛋白(例如β-gal)的多核苷酸轉染至標的細胞來決定轉位功效。據此，可藉由分析轉入多核苷酸的基因產物(例如檢測具有β-gal活性的細胞數量)來決定轉位功效。依據本揭示內容一實施方式，轉入的多核苷酸是一勻黴素抗性基因，因此可藉由檢測對勻黴素具有抗性的細胞數量來決定轉位功效。
在本揭示內容中，「免疫細胞」(immune cell)一詞是指會影響免疫反應的細胞。免疫細胞是源自造血來源的細胞，包含淋巴細胞(例如B細胞及T細胞)、自然殺手細胞及髓質性細胞(例如單核球(monocyte)、巨噬細胞(macrophage)、嗜酸性球(eosinophil)、肥胖細胞(mast cell)、嗜鹼性球(basophil)及顆粒性白血球(granulocyte))。
在本揭示內容中，「免疫相關疾病」(immune-related disease)是指一疾病及/或病狀，其中免疫系統涉及了該疾病的致病機制，或是適度的刺激或抑制可治療及/或預防該疾病。例示式之免疫相關疾病包含，但不限於，腫瘤、感染性疾病、過敏、自體免疫疾病、移植物抗宿主疾病(graft-versus-host disease)或發炎性疾病。
「個體」(subject)一詞是指包含人類的動物，其可接受本發明方法的治療。除非特定指出，否則「個體」(subject)一詞同時意指男性及女性。
2. 發明敍述
本揭示內容是關於用以改造細胞、使細胞攜帶特定基因(例如治療蛋白之基因)的系統、方法及/或套組。經改造後的細胞可作為一種治療藥劑，據以對可接受特定基因產物治療的疾病及/或病狀產生治療功效。
如上所述，本揭示內容提供了一種可於活體外將一外源性DNA片段整合至一細胞之基因體的方法。該DNA序列可編碼出一對抗生素具有抗性的蛋白(antibiotic resistance protein)、一siRNA、一報導蛋白(reporter protein)、一細胞激素(cytokine)、一激酶(kinase)、一抗原(antigen)、一具有抗原專一性的受體(antigen-specific receptor)、一細胞激素受體(cytokine receptor)或一自殺多肽(suicide polypeptide)。舉例來說，外源性DNA序列可編碼出一種對腫瘤相關抗原(tumor-associated antigen)具有專一性的受體。經由本發明方法改造後的T細胞，可辨識且具專一性地毒殺會表現該腫瘤相關抗原的腫瘤細胞。在另一實施例中，外源性DNA序列可編碼出一種對勻黴素具有抗性的蛋白，藉以建立對勻黴素具有抗性的細胞株。或者是，外源性DNA序列可不具任何生物功能，而是藉由將自身片段插入一必要基因中，以阻斷另一基因的功能。舉例來說，外源性DNA序列可編碼出一反義RNA (anti-sense RNA)，以緘默PD-1或T細胞專一受體(T cell specific receptor, TCR)的基因表現。
首先，取得一轉位子系統來執行本發明方法。
該轉位子系統包含一第一載體，其係包含一具有由序列編號：1所組成之核酸序列的第一反向重複，一位於該第一反向重複下游的外源性DNA片段，以及一位於該外源性DNA序列下游，且具有由序列編號：2所組成之核酸序列的第二反向重複。該第一載體可更包含一非原核生物啟動子，其係可操作式地連接至該外源性DNA序列。舉例來說，該非原核生物啟動子可以是巨細胞病毒(cytomegalovirus, CMV)啟動子、勞斯肉瘤病毒(rous sarcoma virus, RSV)啟動子、猿猴病毒(simian virus, SV40)啟動子、鼠乳腺癌病毒(mouse mammary tumor virus, MMTV)啟動子、磷酸甘油酯激酶(phosphoglycerate kinase, PGK)啟動子、雞第二型活性(chicken beta-active)啟動子、延長因子1-α (elongation factor 1-alpha, EF1-α)啟動子、人類H1啟動子(human H1 promoter)或U6啟動子(U6 promoter)。在一實施例中，該第一載體更包含一增強子(enhancer)、一緘默子(silencer)或一絕緣子(insulator)。
在一特定實施方式中，該第一載體是一不包含細菌於複製時所需之原核生物序列的微環DNA。在排除外源性DNA序列後，該微環DNA的序列長度為500-1,500 bp。舉例來說，在排除外源性DNA序列後，該微環DNA的序列長度可以是700-1,200 bp或800-1,000 bp。
一般來說，原核生物DNA常被視為一種免疫刺激性抗原，會引發宿主產生免疫反應而降低第一載體攜帶之外源性DNA的表現功效。因此，相較於其他包含原核生物DNA序列的轉位子/表現系統來說，缺少原核生物序列的微環DNA可使本發明轉位子系統更有效率地將外源性DNA轉入宿主細胞(例如一真核生物之細胞)進行表現。此外，相較於傳統的轉位子/表現系統，本發明轉位子系統由於微環DNA缺少原核生物DNA序列，具有較小的體積/長度。
本發明轉位子系統亦包含一第二載體(例如，一輔助質體)，其包含一可操作式地連接至一核酸的啟動子，其中該核酸可編碼出一轉位酶。該轉位酶可辨識並結合至第一載體的第一反向重複及第二反向重複。舉例來說，該轉位酶可以是ThyPLGMH、mycPBase、TPLGMH或HAhyPBase。在一特定實施方式中，該轉位酶具有序列編號：4的胺基酸序列，其係由序列編號：3編碼而得。可依據本發明所屬技術領域具有通常知識者所熟知的方法或依據Yaa-Jyuhn James Meir et. al. (A versatile, highly efficient, and potentially safer piggyBac transposon system for mammalian genome manipulations, FASEB, 2013: 27, 4429-4443)所述方法來製備輔助質體。
位於該第二載體之啟動子是選自由巨細胞病毒啟動子、勞斯肉瘤病毒啟動子、猿猴病毒啟動子、鼠乳腺癌病毒啟動子、磷酸甘油酯激酶啟動子、雞第二型活性啟動子、延長因子1-α啟動子、人類H1啟動子及U6啟動子所組成的群組。在一特定實施方式中，啟動子是巨細胞病毒啟動子。
在執行本發明方法時，是將第一載體及第二載體轉入一細胞中。例示性之轉入方法包含，但不限於，磷酸鈣共沉澱(calcium phosphate co-precipitation)、電穿孔(electroporation)、核轉染(nucleofection)、細胞擠壓(cell squeezing，輕壓細胞膜)、超音波穿孔(sonoporation，利用高強度超音波於細胞膜形成孔洞)、光轉染(optical transfection，利用高聚焦雷射於細胞膜製造一微小孔洞)、基因交付(impalefection，將DNA連接至一奈米纖維表面並注入細胞中)、基因槍(gene gun，將DNA連接至一惰性固體之奈米粒子後，注入標的細胞核內)、磁轉染(magnetofection，利用磁力將DNA送至標的細胞內)、病毒轉染(viral transduction，利用病毒作為載體，將DNA送至標的細胞內)或以樹枝狀聚合物(dendrimer)、脂質體(liposome)及陽離子聚合物(cationic polymer)進行轉染。在一實施例中，是利用非脂質體的化學方法(FuGENE® HD轉染)將轉位子系統轉入細胞中。在另一實施例中，是利用核轉染將轉位子系統轉入細胞中。在本發明一特定實施方式中，是先將轉位系統的第一載體進行線狀化處理(linearize，例如使用限制酶)後，再轉入細胞。
第一載體及第二載體在轉入細胞時的重量比約為2:1到1:1。依據一實施方式，在將外源性DNA轉入一上皮細胞時，第一載體(例如微環DNA)與第二載體的重量比約為2:1到1:1。依據另一實施方式，在將外源性DNA轉入一永生化T細胞時(immortal T cell)，微環核酸序列與輔助質體的重量比約為2:1到1:1。依據再另一實施方式，在將外源性DNA轉入一初代T細胞時，微環核酸序列與輔助質體的重量比約為2:1到1:1。
第二載體於細胞表現轉位酶後，該轉位酶可催化由第一載體剪切出外源性DNA序列的反應，並將剪切出來的外源性DNA整合至細胞的基因體中。
本發明方法所使用的細胞可以是一免疫細胞。更具體來說，該免疫細胞可是T細胞、B細胞、樹突細胞(dendritic cell)、巨噬細胞或肥胖細胞。
在另一態樣中，該細胞是一幹細胞。舉例來說，幹細胞可以源自骨髓(bone marrow)、脂肪組織(adipose tissue)、周邊血(peripheral blood)、臍帶血(umbilical cord blood)或牙髓(dental pulp)。在一特定方法中，該細胞是一人類細胞。
為執行上述方法，本揭示內容亦提供一可將外源性DNA序列整合至細胞之基因體的套組。該套組包含一容器，其係包含上述本發明轉位子系統；以及一隨附之操作說明，藉以指示如何使用本發明轉位子系統。如上所述，本發明轉位子系統包含一第一及一第二載體。
第一載體包含一具有由序列編號：1所組成之核酸序列的第一反向重複，一位於該第一反向重複下游且具有由序列編號：2所組成之核酸序列的第二反向重複，以及一位於該第一反向重複與該第二反向重複之間、可使外源性DNA序列轉入的轉殖位置。
本發明套組的第一載體可更包含一非原核生物的啟動子，其係位於第一反向重複的下游及轉殖位置的上游。在將外源性DNA插入轉殖位置後，非原核動物之啟動子即可操作式地連接至該外源性DNA序列。舉例來說，非原核生物的啟動子可以是巨細胞病毒啟動子、勞斯肉瘤病毒啟動子、猿猴病毒啟動子、鼠乳腺癌病毒啟動子、磷酸甘油酯激酶啟動子、雞第二型活性啟動子、延長因子1-α啟動子、人類H1啟動子或U6啟動子。在一實施例中，第一載體更包含一增強子、一緘默子或一絕緣子。
本發明套組亦包含一第二載體，即一輔助質體，其係包含一可操作式地連接至一核酸的啟動子，其中該核酸可編碼出一轉位酶。舉例來說，該轉位酶可以是ThyPLGMH、mycPBase、TPLGMH或HAhyPBase。在一特定實施方式中，該轉位酶具有序列編號：4的胺基酸序列。
如本發明方法所述，本發明套組之第二載體包含一啟動子，其係選自由巨細胞病毒啟動子、勞斯肉瘤病毒啟動子、猿猴病毒啟動子、鼠乳腺癌病毒啟動子、磷酸甘油酯激酶啟動子、雞第二型活性啟動子、延長因子1-α啟動子、人類H1啟動子及U6啟動子所組成的群組。在一特定實施方式中，該啟動子是巨細胞病毒啟動子。
在本揭示內容中，「使用操作說明」(instruction)一詞包含了書冊、錄製物、圖表或任何傳達媒介(例如磁帶、CD、VCD或DVD)，可用以告知或指示使用者如何使用本發明轉位子系統。使用操作說明可固定於容器上，或與包含本發明轉位子系統之容器分開包裝。
本發明套組可更包含一用以穩定轉位子系統及/或進行細胞轉染的緩衝溶液。舉例來說，緩衝溶液可以是磷酸鹽緩衝生理食鹽水(phosphate-buffered saline, PBS)、包含Tris的生理食鹽水(Tris-based saline)、Tris-EDTA緩衝液、4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸 (4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid) 緩衝液或N,N-雙(2-羥乙基)-2-胺基乙磺酸(N,N-bis(2-hydroxyethyl)-2-amino ethanesulfonic acid, BES) 緩衝液。
如上所述，本揭示內容提供了一種用以治療罹患或疑似罹患免疫相關疾病之個體的方法。該方法包含利用本發明套組來改造一細胞，使該細胞攜帶一適用於治療該免疫相關疾病的基因；以及對該個體投予一有效量之經改造的細胞，以治療該免疫相關疾病。在一實施例中，基因為可辨識CD19的嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor, CAR)，可藉由改造CAR T細胞來治療急性淋巴性白血病。
罹患或疑似罹患免疫相關疾病的個體為一哺乳類動物，包含人類、小鼠、大鼠、兔子、猴子及豬。在一特定態樣中，個體為人類。當治療的個體為人類時，本發明方法之經轉入/轉染的免疫細胞較佳是源自該個體本身。或者是，本發明方法之經轉入/轉染的免疫細胞是源自一供體。
依據本揭示內容某些實施方式，本發明方法可用以治療一免疫抑制疾病，例如腫瘤或感染性疾病。在該些實施方式中，本發明轉位系統可包含一免疫增強基因，藉以提升該個體的免疫反應。
依據本揭示內容某些實施方式，本發明方法可用以治療一因免疫反應過度活化所造成的疾病(例如自體免疫疾病)或因免疫反應異常所造成的疾病(例如過敏、移植物抗宿主疾病或發炎性疾病)。在該些實施方式中，本發明轉位系統可包含一免疫抑制基因，藉以抑制該個體的免疫反應。
下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。實施例
材料及方法
細胞培養
本研究是利用人類胚胎腎臟細胞株293 (HEK 293)、人類JK永生化T淋巴球(Jurkat T)及初代人類T細胞進行相關分析。將HEK293細胞培養於包含10%胎牛血清、 2 mM L-麩醯胺酸 (L-glutamine)、1倍非必要胺基酸(nonessential amino acid)、1倍青黴素/鏈黴素(penicillin/streptomycin)及1 mM丙酮酸鈉(sodium pyruvate)的MEM細胞培養液中。將Jurkat T細胞及初代人類T細胞培養於包含2 mM L-麩醯胺酸、10%胎牛血清、1mM丙酮酸鈉及0.1 mM非必要胺基酸的RPMI1640細胞培養液中。所有的細胞皆係培養於包含5% CO2 的37º C環境中。
製備條件培養液 (conditioned medium)
將Jurkat細胞以每毫升2 x 106 個細胞的密度於新鮮細胞培養液中培養24小時，之後收集並過濾細胞培養液，作為條件培養液。
製備質體及 / 或表現構建體
pBS-cassette
由pcDNA3.1_hygro_LacZ載體(Invitrogen)剪切出包含由SV40啟動子趨動之勻黴素抗性基因的DNA片段。以XmnI及SapI酵素剪切後，將DNA片段轉殖至pBlueScript SKII之SmaI位置，藉以建構pBS-hygro。為進一步插入對康黴素(kanamycin)具有抗性之基因及複製原點ColE1，將 pZErO-2.1 (Invitrogen)中的ApoI_AflIII片段轉殖至pBS-hygro的EcoRV位置，以建構pBS-cassette。
mini-piggyBac_long ( 長式 mini-piggyBac)
以限制酶SmaI及EcoRV剪切pBS-cassette後，將剪切片段插入源自pBSII-ITR1的pXLBacIIPUbnlsEGFP中。製得之構建體mini-piggyBac_long的5’及3’端分別具有308 bp及238 bp的末端重複(terminal repeat, TR)。
利用XmnI剪切構建體mini-piggyBac_long，以製備線狀之mini-piggyBac_long。
mini-piggyBac_short ( 短式 mini-piggyBac)
以PciI及AclI剪切mini-piggyBac_long構建體，以klenow酵素(NE Biolabs)處理後，利用 T4 DNA 連接酶(NE Biolabs)進行自我連接反應，據以製備不包含胺芐青黴素(ampicillin)抗性基因及f1複製原點的mini-piggyBac_short。
利用BglI剪切mini-piggyBac_short以製備線狀之mini-piggyBac_short。
micro-piggyBac_long ( 長式 micro-piggyBac)
利用以下四對引子所組成的PCR混合物來製得短式piggyBac末端重複區域(terminal repeat domain, TRD) (即pXL-BacII 中的746~808 3’LTR及1426~1460 5’LTR)：pB-11-KpnI (序列編號：5)、pB-5-正向(序列編號：6)、pB-6-反向(序列編號：7)及pB-12-SacI (序列編號：8)。將包含67 bp 5’、40 bp 3’ TRD及SwaI與XhoI限制酶位置的擴增子(amplicon)，以Kpn I及Sac I轉殖至pBS-SKII中，以製備pPBendAATT。以Xho I將由上述pBS-cassette得到的表現基因組插入pPBendAATT之短式piggyback TRD之間，以製備micro-piggyBac_long。
利用XmnI 剪切micro-piggyBac_long ，以製備線狀之micro-piggyBac_long。
micro-piggyBac_short ( 短式 micro-piggyBac)
以Acc65I及AflIII剪切 micro-piggyBac_long，以移除胺芐青黴素抗性基因及f1複製原點。使剩餘的DNA片段自我連接，以製備不含胺芐青黴素抗性基因及f1複製原點micro-piggyBac_short。該構建體亦稱為微環基因組(minicircle cassette)。
利用XmnI 剪切micro-piggyBac_short，以製備線狀之micro-piggyBac_short。
Minicircle-microPB-cassette
或者是，可利用MC-Easy環狀微環DNA製備套組來製備micro-piggyBac_short (即微環基因組)。此種方法是以KpnI、SacI及XmnI剪切micro-piggyBac_long後，將包含micro-piggyBac之左(microL)及右(microR)反向重複的KpnI-SacI片段(3993 bp)插入pMC.BESPX-MCS1的EcoRV限制酶位置，以製備pMC-microPB-cassette。依照使用操作說明，以MC-Easy circle 環狀微環DNA製備套組由pMC-microPB-cassette製備minicircle-microPB-cassette。製得的minicircle-microPB-cassette不包含胺芐青黴素抗性基因及f1複製原點。
輔助質體
依據Yaa-Jyuhn James Meir et. al. (A versatile, highly efficient, and potentially safer piggyBac transposon system for mammalian genome manipulations, FASEB, 2013: 27, 4429-4443)所述方法來建構輔助質體pCMV-ThyPLGMH、pCMV-mycPBase、pCMV-TPLGMH及pCMV-HAhyPBase。
轉位試驗
HEK293 細胞
將八成滿的細胞種植於24孔盤中，細胞密度為每孔洞1 x 105 個細胞。進行細胞轉染時，以Fugene 6 (Roche, Florence, SC)將300奈克的DNA混合物轉染至細胞中。各DNA混合物包含100奈克的輔助質體(即pCMV-ThyPLGMH、pCMV-mycPBase、pCMV-TPLGMH或pCMV-HAhyPBase)、不同量之DNA供體(即mini-piggyBac_long、mini-piggyBac_short、micro-piggyBac_long、micro-piggyBac_short、pMC-microPB-cassette或minicircle-microPB-cassette；最少的供體量為100奈克)，以及使最終DNA含量達300奈克的pcDNA3.1。轉染後，取十五分之一之經轉染的細胞至100毫米盤，再以勻黴素篩選14天。利用包含4%三聚甲醛(paraformaldehyde)的PBS固定10分鐘後，以0.2%亞甲藍(methylene blue)染色1小時，以計數細胞群。經勻黴素篩選14天後，僅計算直徑為0.5毫米的細胞群。
Jurkat T 細胞
將每毫升1 x 106 個細胞培養24小時後，進行核轉染。各核轉染反應皆係將6微克的DNA混合物轉染至1 x 106 個細胞中。各DNA混合物包含2.5微克之輔助質體(即pCMV-ThyPLGMH、pCMV-mycPBase、pCMV-TPLGMH或pCMV-HAhyPBase)、不同量之DNA供體(即mini-piggyBac_long、mini-piggyBac_short、micro-piggyBac_long、micro-piggyBac_short、pMC-microPB-cassette或minicircle-microPB-cassette；最少的供體量為2.0微克)，以及使最終DNA含量達6微克的pcDNA3.1。經核轉染24小時後，將30個懸浮於50微升上述條件培養液的活細胞，以1.2毫克的勻黴素於96孔盤進行篩選。每2到3天，緩慢加入等體積的條件培養液，避免影響細胞群。各反應皆是以勻黴素對10,200個活細胞進行篩選。經勻黴素篩選6或7天後，利用光學顯微鏡來計算各反應之細胞群的數量，以得到其轉位活性。
初代 T 細胞
在進行核轉染前一天，以RPMI全細胞培養液(RPMI complete medium)解凍人類初代細胞(human primary cell，CD8+ CD45RA+ )。培養至隔日後，對細胞進行核轉染。各核轉染反應皆係將2.2微克之DNA混合物轉染至懸浮於20微升之ALL-IN-ONE核轉染緩衝液(GF1001, GenomeFrontier, Biosciences)的1X105 個細胞中。各DNA混合物包含0.8微克之輔助質體(即pCMV-HAhyPBase或pCMV-ThyPLGMH)、不同量之供體質體(即mini-piggyBac_long、mini-piggyBac_short、micro-piggyBac_long或micro-piggyBac_short；最大的供體量為1.4微克)，以及使最終DNA含量達2.2微克之pcDNA3.1。核轉染24小時後，以500微升之包含刺激物(PHA及每毫升50微克之IL-2)及每毫升1.0毫克勻黴素的RPMI 1640全細胞培養液培養經轉染的細胞。經勻黴素篩選22天後，計算存活細胞數以得到轉位活性。
實施例 1 於 HEK293 細胞的轉位活性
本實施例將分析各DNA供體及輔助質體於HEK293細胞的轉位活性。結果分別闡述於第1A-1C圖。
如第1A圖所示，不論共轉染的DNA供體為何，相較於以pcDNA3.1、pCMV-TPLGMH或pCMV-mycPBase進行轉染的細胞，經pCMV-ThyPLGMH轉染的細胞會形成最多之對勻黴素具有抗性的細胞群。該結果指出，ThyPLGMH為測試轉位酶中，轉位活性最高的轉位酶。至於DNA供體，四種測試的DNA供體(即mini-piggyBac_long、mini-piggyBac_short、micro-piggyBac_long及micro-piggyBac_short)於HEK293細胞中具有相似的轉位活性(第1A圖)。令人訝異地，當DNA供體是以其線狀形式轉染至HEK293細胞時，micro-piggyBac (即micro-piggyBac_short或micro-piggyBac_long)的轉位活性會顯著地高於 mini-piggyBac (即mini-piggyBac_short或mini-piggyBac_long)的轉位活性(第1B圖)，其中micro-piggyBac_short具有最高的轉位活性。
進一步檢測以MC-Easy環狀微環DNA製備套組所製得之微環的轉位活性。第1C圖的結果指出，當與pCMV-ThyPLGMH共轉染時，minicircle-microPB-cassette的活性是pMC-microPB-cassette活性的2.7倍。
整體來看，該些結果指出轉位活性會隨著DNA供體全長或其TRD的長度增加而減少；相較於其他測試的轉位酶，ThyPLGMH具有最高的轉位活性。因此，相較於其他的DNA供體及輔助質體，pCMV-ThyPLGMH與micro-piggyBac 微環(即micro-piggyBac_short或minicircle-microPB-cassette)的組合於HEK293細胞中能產生最高的轉位功效。
實施例 2 於 Jurkat T 細胞的轉位活性
接著於Jurkat T細胞中檢測pCMV-ThyPLGMH及micro-piggyBac微環的轉位活性。結果分別闡述於第2A-2B圖。
如第2A所示，相較於以其他DNA供體及輔助質體共轉染之細胞，由pCMV-ThyPLGMH及micro-piggyBac_short共轉染的細胞可產生顯著較高量之勻黴素抗性細胞群。
與第1C圖呈現相似的結果，相較於其他DNA供體/輔助質體組合，pCMV-ThyPLGMH與minicircle-microPB-cassette的組合可產生最高的轉位功效(第2B圖)。
實施例 3 於初代人類 T 細胞的轉位活性
除了上述細胞株(即HEK293細胞及Jurkat T細胞)外，亦利用初代人類T細胞來分析特定DNA供體及輔助質體的轉位活性。
如第3圖所示，於經pCMV-ThyPLGMH及短式或長式micro-piggyBac (即micro-piggyBac_short或micro-piggyBac_long)轉染的細胞可觀察到最佳的轉位活性。
總結上述，本揭示內容提供了一種轉位子系統及方法，可用以將一外源性基因整合至一細胞(特別是一免疫細胞)的基因體中。相較於他DNA及輔助質體的組合，pCMV-ThyPLGMH及micro-piggyBac 微環(不論是由酵素剪切/連接法製備之micro-piggyBac_short，或是由MC-Easy環狀微環DNA製備套組製得之minicircle-microPB-cassette)或micro-piggyBac_long的組合可產生最高的轉位功效。因此，本揭示內容亦提供了一種用以治療不同疾病(例如免疫相關疾病)的方法，其係藉由將一治療基因有效轉入有需要之個體體內，來達到治療的目的。
雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。
無
為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下： 第1A圖為一柱狀圖，其係關於將以酵素剪切/連接法製備的輔助質體及DNA供體(環狀形式)共轉染至HEK293細胞後，對勻黴素(hygromycin)具有抗性之HEK293細胞群(colony)的數量； 第1B圖是一柱狀圖，其係關於將以酵素剪切/連接法製備的輔助質體及DNA供體(線狀形式)共轉染至HEK293細胞後，對勻黴素具有抗性之HEK293細胞群的數量； 第1C圖為依據本揭示內容實施例1所闡述之柱狀圖，其係關於將以商業化套組製備的輔助質體及DNA供體共轉染至HEK293細胞後，對勻黴素具有抗性之HEK293細胞群的數量； 第2A圖是一柱狀圖，其係關於將以酵素剪切/連接法製備的輔助質體及DNA供體共轉染至Jurkat T細胞後，對勻黴素具有抗性之Jurkat T細胞群的數量； 第2B圖為依據本揭示內容實施例2所闡述之柱狀圖，其係關於將以商業化套組製備的輔助質體及DNA供體共轉染至Jurkat T細胞後，對勻黴素具有抗性之Jurkat T細胞群的數量；以及 第3圖為依據本揭示內容實施例3所闡述之柱狀圖，其係關於特定DNA供體及輔助質體於初代人類T細胞所產生的轉位功效。
＜110＞ 吳瓊媛 ＜120＞ 轉位子系統、套組及其用途 ＜130＞ P2904-TW ＜150＞ US62/267,270 ＜151＞ 2015-12-14 ＜160＞ 8 ＜170＞ BiSSAP 1.3 ＜210＞ 1 ＜211＞ 67 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 合成序列-5-IR ＜400＞ 1 ttaaccctag aaagataatc atattgtgac gtacgttaaa gataatcatg cgtaaaattg 60 acgcatg 67 ＜210＞ 2 ＜211＞ 40 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 合成序列-3-IR ＜400＞ 2 gcatgcgtca attttacgca gactatcttt ctagggttaa 40 ＜210＞ 3 ＜211＞ 2697 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 合成序列-ThyPLGMH ＜400＞ 3 atgggtcgca agaaacgtcg ccaacgtcgc cgtccgccta tcatgactcg agccatgggc 60 agcagcctgg acgacgagca catcctgagc gccctgctgc agagcgacga cgagctggtc 120 ggcgaggaca gcgacagcga ggtgagcgac cacgtgagcg aggacgacgt gcagtccgac 180 accgaggagg ccttcatcga cgaggtgcac gaggtgcagc ctaccagcag cggctccgag 240 atcctggacg agcagaacgt gatcgagcag cccggcagct ccctggccag caacaggatc 300 ctgaccctgc cccagaggac catcaggggc aagaacaagc actgctggtc cacctccaag 360 cccaccaggc ggagcagggt gtccgccctg aacatcgtga gaagccagag gggccccacc 420 aggatgtgca ggaacatcta cgaccccctg ctgtgcttca agctgttctt caccgacgag 480 atcatcagcg agatcgtgaa gtggaccaac gccgagatca gcctgaagag gcgggagagc 540 atgacctccg ccaccttcag ggacaccaac gaggacgaga tctacgcctt cttcggcatc 600 ctggtgatga ccgccgtgag gaaggacaac cacatgagca ccgacgacct gttcgacaga 660 tccctgagca tggtgtacgt gagcgtgatg agcagggaca gattcgactt cctgatcaga 720 tgcctgagga tggacgacaa gagcatcagg cccaccctgc gggagaacga cgtgttcacc 780 cccgtgagaa agatctggga cctgttcatc caccagtgca tccagaacta cacccctggc 840 gcccacctga ccatcgacga gcagctgctg ggcttcaggg gcaggtgccc cttcagggtc 900 tatatcccca acaagcccag caagtacggc atcaagatcc tgatgatgtg cgacagcggc 960 accaagtaca tgatcaacgg catgccctac ctgggcaggg gcacccagac caacggcgtg 1020 cccctgggcg agtactacgt gaaggagctg tccaagcccg tccacggcag ctgcagaaac 1080 atcacctgcg acaactggtt caccagcatc cccctggcca agaacctgct gcaggagccc 1140 tacaagctga ccatcgtggg caccgtgaga agcaacaaga gagagatccc cgaggtcctg 1200 aagaacagca ggtccaggcc cgtgggcacc agcatgttct gcttcgacgg ccccctgacc 1260 ctggtgtcct acaagcccaa gcccgccaag atggtgtacc tgctgtccag ctgcgacgag 1320 gacgccagca tcaacgagag caccggcaag ccccagatgg tgatgtacta caaccagacc 1380 aagggcggcg tggacaccct ggaccagatg tgcagcgtga tgacctgcag cagaaagacc 1440 aacaggtggc ccatggccct gctgtacggc atgatcaaca tcgcctgcat caacagcttc 1500 atcatctaca gccacaacgt gagcagcaag ggcgagaagg tgcagagccg gaaaaagttc 1560 atgcggaacc tgtacatggg cctgacctcc agcttcatga ggaagaggct ggaggccccc 1620 accctgaaga gatacctgag ggacaacatc agcaacatcc tgcccaaaga ggtgcccggc 1680 accagcgacg acagcaccga ggagcccgtg atgaagaaga ggacctactg cacctactgt 1740 cccagcaaga tcagaagaaa ggccagcgcc agctgcaaga agtgtaagaa ggtcatctgc 1800 cgggagcaca acatcgacat gtgccagagc tgtttcaagc ttaagttggg cggcggcgcc 1860 cccgccgtgg gcggcggccc caaggccgcg gataaaccgg tcgccaccat ggtgagcaag 1920 ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac 1980 ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc gagggcgatg ccacctacgg caagctgacc 2040 ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc 2100 ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc taccccgacc acatgaagca gcacgacttc 2160 ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc caggagcgca ccatcttctt caaggacgac 2220 ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag ttcgagggcg acaccctggt gaaccgcatc 2280 gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac 2340 aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg gccgacaagc agaagaacgg catcaaggtg 2400 aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag 2460 cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg ctgctgcccg acaaccacta cctgagcacc 2520 cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc 2580 gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg gacgagctgt acaagcttgg gcccgaacaa 2640 aaactcatct cagaagagga tctgaatagc gccgtcgacc atcatcatca tcatcat 2697 ＜210＞ 4 ＜211＞ 899 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 合成序列-ThyPLGMH ＜400＞ 4 Met Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Ile Met Thr 1 5 10 15 Arg Ala Met Gly Ser Ser Leu Asp Asp Glu His Ile Leu Ser Ala Leu 20 25 30 Leu Gln Ser Asp Asp Glu Leu Val Gly Glu Asp Ser Asp Ser Glu Val 35 40 45 Ser Asp His Val Ser Glu Asp Asp Val Gln Ser Asp Thr Glu Glu Ala 50 55 60 Phe Ile Asp Glu Val His Glu Val Gln Pro Thr Ser Ser Gly Ser Glu 65 70 75 80 Ile Leu Asp Glu Gln Asn Val Ile Glu Gln Pro Gly Ser Ser Leu Ala 85 90 95 Ser Asn Arg Ile Leu Thr Leu Pro Gln Arg Thr Ile Arg Gly Lys Asn 100 105 110 Lys His Cys Trp Ser Thr Ser Lys Pro Thr Arg Arg Ser Arg Val Ser 115 120 125 Ala Leu Asn Ile Val Arg Ser Gln Arg Gly Pro Thr Arg Met Cys Arg 130 135 140 Asn Ile Tyr Asp Pro Leu Leu Cys Phe Lys Leu Phe Phe Thr Asp Glu 145 150 155 160 Ile Ile Ser Glu Ile Val Lys Trp Thr Asn Ala Glu Ile Ser Leu Lys 165 170 175 Arg Arg Glu Ser Met Thr Ser Ala Thr Phe Arg Asp Thr Asn Glu Asp 180 185 190 Glu Ile Tyr Ala Phe Phe Gly Ile Leu Val Met Thr Ala Val Arg Lys 195 200 205 Asp Asn His Met Ser Thr Asp Asp Leu Phe Asp Arg Ser Leu Ser Met 210 215 220 Val Tyr Val Ser Val Met Ser Arg Asp Arg Phe Asp Phe Leu Ile Arg 225 230 235 240 Cys Leu Arg Met Asp Asp Lys Ser Ile Arg Pro Thr Leu Arg Glu Asn 245 250 255 Asp Val Phe Thr Pro Val Arg Lys Ile Trp Asp Leu Phe Ile His Gln 260 265 270 Cys Ile Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Ala His Leu Thr Ile Asp Glu Gln 275 280 285 Leu Leu Gly Phe Arg Gly Arg Cys Pro Phe Arg Val Tyr Ile Pro Asn 290 295 300 Lys Pro Ser Lys Tyr Gly Ile Lys Ile Leu Met Met Cys Asp Ser Gly 305 310 315 320 Thr Lys Tyr Met Ile Asn Gly Met Pro Tyr Leu Gly Arg Gly Thr Gln 325 330 335 Thr Asn Gly Val Pro Leu Gly Glu Tyr Tyr Val Lys Glu Leu Ser Lys 340 345 350 Pro Val His Gly Ser Cys Arg Asn Ile Thr Cys Asp Asn Trp Phe Thr 355 360 365 Ser Ile Pro Leu Ala Lys Asn Leu Leu Gln Glu Pro Tyr Lys Leu Thr 370 375 380 Ile Val Gly Thr Val Arg Ser Asn Lys Arg Glu Ile Pro Glu Val Leu 385 390 395 400 Lys Asn Ser Arg Ser Arg Pro Val Gly Thr Ser Met Phe Cys Phe Asp 405 410 415 Gly Pro Leu Thr Leu Val Ser Tyr Lys Pro Lys Pro Ala Lys Met Val 420 425 430 Tyr Leu Leu Ser Ser Cys Asp Glu Asp Ala Ser Ile Asn Glu Ser Thr 435 440 445 Gly Lys Pro Gln Met Val Met Tyr Tyr Asn Gln Thr Lys Gly Gly Val 450 455 460 Asp Thr Leu Asp Gln Met Cys Ser Val Met Thr Cys Ser Arg Lys Thr 465 470 475 480 Asn Arg Trp Pro Met Ala Leu Leu Tyr Gly Met Ile Asn Ile Ala Cys 485 490 495 Ile Asn Ser Phe Ile Ile Tyr Ser His Asn Val Ser Ser Lys Gly Glu 500 505 510 Lys Val Gln Ser Arg Lys Lys Phe Met Arg Asn Leu Tyr Met Gly Leu 515 520 525 Thr Ser Ser Phe Met Arg Lys Arg Leu Glu Ala Pro Thr Leu Lys Arg 530 535 540 Tyr Leu Arg Asp Asn Ile Ser Asn Ile Leu Pro Lys Glu Val Pro Gly 545 550 555 560 Thr Ser Asp Asp Ser Thr Glu Glu Pro Val Met Lys Lys Arg Thr Tyr 565 570 575 Cys Thr Tyr Cys Pro Ser Lys Ile Arg Arg Lys Ala Ser Ala Ser Cys 580 585 590 Lys Lys Cys Lys Lys Val Ile Cys Arg Glu His Asn Ile Asp Met Cys 595 600 605 Gln Ser Cys Phe Lys Leu Lys Leu Gly Gly Gly Ala Pro Ala Val Gly 610 615 620 Gly Gly Pro Lys Ala Ala Asp Lys Pro Val Ala Thr Met Val Ser Lys 625 630 635 640 Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp 645 650 655 Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly 660 665 670 Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly 675 680 685 Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly 690 695 700 Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe 705 710 715 720 Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe 725 730 735 Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu 740 745 750 Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys 755 760 765 Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser 770 775 780 His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val 785 790 795 800 Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala 805 810 815 Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu 820 825 830 Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro 835 840 845 Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala 850 855 860 Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Leu Gly Pro Glu Gln 865 870 875 880 Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His 885 890 895 His His His ＜210＞ 5 ＜211＞ 36 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 合成序列-pB-11-KpnI ＜400＞ 5 atcgggtacc ttaaccctag aaagataatc atattg 36 ＜210＞ 6 ＜211＞ 75 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 合成序列-pB-5-正向 ＜400＞ 6 ggtaccccct agaaagataa tcatattgtg acgtacgtta aagataatca tgcgtaaaat 60 tgacgcatgc tcgag 75 ＜210＞ 7 ＜211＞ 76 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 合成序列-pB-6-反向 ＜400＞ 7 gagctcccct agaaagatag tctgcgtaaa attgacgcat gccaccgcgg tggatttaaa 60 tctcgagcat gcgtca 76 ＜210＞ 8 ＜211＞ 34 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 合成序列-pB-12-SacI ＜400＞ 8 cgatgagctc ttaaccctag aaagatagtc tgcg 34

Claims (25)

  1. 一種於活體外將一外源性DNA序列整合至一細胞之基因體的方法，包含：(i)提供一轉位子系統，其係包含：一第一載體，其係一不包含細菌複製時所需之原核生物序列的微環DNA，包含：一第一反向重複，具有由序列編號：1所組成的核酸序列，該外源性DNA序列，其係位於該第一反向重複的下游，以及一第二反向重複，其係位於該外源性DNA序列的下游，且具有由序列編號：2所組成的核酸序列；其中，在排除該外源性DNA序列後，該第一載體的長度為500-1,500bp；以及一第二載體，包含一可操作式地連接至一核酸的啟動子，其中該核酸可用以編碼一具有序列編號：4之胺基酸序列的轉位酶；以及(ii)將該轉位子系統之第一載體及該第二載體轉入該細胞中，藉以使該外源性DNA序列整合至該細胞的基因體中，其中該轉位酶會於該細胞進行表現後，催化由該第一載體中剪切出該外源性DNA序列的反應，以及使該經剪切的外源性DNA序列被整合至該細胞的基因體中。
  2. 如請求項1所述之方法，其中該外源性 DNA序列可編碼出一對抗生素具有抗性的蛋白、一siRNA、一報導蛋白、一細胞激素、一激酶、一抗原、一具有抗原專一性的受體、一細胞激素受體或一自殺多肽。
  3. 如請求項2所述方法，其中該第一載體更包含一非原核生物啟動子，其係可操作式地連接至該外源性DNA序列。
  4. 如請求項3所述方法，其中該非原核生物啟動子是選自由巨細胞病毒啟動子、勞斯肉瘤病毒啟動子、猿猴病毒啟動子、鼠乳腺癌病毒啟動子、磷酸甘油酯激酶啟動子、雞第二型活性啟動子、延長因子1-α啟動子、人類H1啟動子及U6啟動子所組成的群組。
  5. 如請求項3所述方法，其中該第一載體更包含一增強子、一緘默子或一絕緣子。
  6. 如請求項1所述方法，其中位於該第二載體之該啟動子是選自由巨細胞病毒啟動子、勞斯肉瘤病毒啟動子、猿猴病毒啟動子、鼠乳腺癌病毒啟動子、磷酸甘油酯激酶啟動子、雞第二型活性啟動子、延長因子1-α啟動子、人類H1啟動子及U6啟動子所組成的群組。
  7. 如請求項1所述之方法，其中在排除該外源性DNA序列後，該微環DNA的長度為700-1,200bp。
  8. 如請求項7所述之方法，其中在排除該外源性DNA序列後，該微環DNA的長度為800-1,000bp。
  9. 如請求項1所述之方法，其中該細胞是一免疫細胞，其係選自由T細胞、B細胞、樹突細胞、巨噬細胞或肥胖細胞所組成的群組。
  10. 如請求項1所述之方法，其中該細胞是一幹細胞，其係選自由骨髓、脂肪組織、周邊血、臍帶血及牙髓所組成的群組。
  11. 如請求項1所述之方法，更包含在該轉入步驟前線狀化處理該第一載體。
  12. 如請求項1所述之方法，其中該第一載體及該第二載體是利用以下任一方法轉入該細胞中，該方法為磷酸鈣共沉澱、電穿孔、核轉染、細胞擠壓、超音波穿孔、光轉染、基因交付、基因槍、磁轉染、病毒轉染或以樹枝狀聚合物、脂質體及陽離子聚合物進行轉染。
  13. 如請求項9到12所述之任一方法，其中在排除該外源性DNA序列後，該微環DNA的長度為700-1,200bp。
  14. 如請求項13所述之方法，其中在排除該外源性DNA序列後，該微環DNA的長度為800-1,000bp。
  15. 如請求項9或10所述之方法，其中該細胞為人類細胞。
  16. 一種用以將一外源性DNA序列整合至一細胞之基因體的套組，包含：一容器；一轉位子系統，包含： 一第一載體，其係一長度介於500-1,500bp且不包含細菌複製所需之原核生物序列的微環DNA，包含：一第一反向重複，具有由序列編號：1所組成的核酸序列，一第二反向重複，具有由序列編號：2所組成的核酸序列，且係位於該第一反向重複的下游，以及一轉殖位置，其係位於該第一反向重複及該第二反向重複之間，可用以轉入該外源性DNA序列，以及一第二載體，包含一可操作式地連接至一核酸的啟動子，其中該核酸可用以編碼一具有序列編號：4之胺基酸序列的轉位酶；以及一使用操作說明，其係隨附於該容器中，且用以指示如何使用該轉位子系統；其中該轉位酶會於該細胞進行表現後，催化由該第一載體中剪切出該外源性DNA序列的反應，以及使該經剪切的外源性DNA序列被整合至該細胞的基因體中。
  17. 如請求項16所述之套組，其中位於該第二載體之該啟動子是選自由巨細胞病毒啟動子、勞斯肉瘤病毒啟動子、猿猴病毒啟動子、鼠乳腺癌病毒啟動子、磷酸甘油酯激酶啟動子、雞第二型活性啟動子、延長因子1-α啟動子、人類H1啟動子及U6啟動子所組成的群組。
  18. 如請求項16所述之套組，其中該第一載體更包含一非原核生物啟動子，其係位於該第一反向重複的下游，以及該轉殖位置的上游，其中該非原核生物啟動 子可選自由巨細胞病毒啟動子、勞斯肉瘤病毒啟動子、猿猴病毒啟動子、鼠乳腺癌病毒啟動子、磷酸甘油酯激酶啟動子、雞第二型活性啟動子、延長因子1-α啟動子、人類H1啟動子及U6啟動子所組成的群組。
  19. 一種如請求項16所述之轉位子系統於製備一治療一個體之免疫相關疾病之藥物的用途，其係利用該轉位子系統來改造一免疫細胞，使該免疫細胞帶有一外源性基因後，再對該個體投予一有效量之經改造的免疫細胞，以改善或減少該免疫相關疾病的病徵。
  20. 如請求項19所述之用途，其中該個體為人類。
  21. 如請求項19所述之用途，其中該免疫細胞是源自該個體或一供體。
  22. 如請求項19所述之用途，其中該外源性基因可增加該個體的免疫反應，且該免疫相關疾病為一腫瘤或一感染性疾病。
  23. 如請求項19所述之用途，其中該外源性基因可抑制該個體的免疫反應，且該免疫相關疾病為一過敏、一自體免疫疾病、一移植物抗宿主疾病或一發炎性疾病。
  24. 如請求項19所述之用途，其中該細胞是一免疫細胞，其係選自由T細胞、B細胞、樹突細胞、巨噬細胞或肥胖細胞所組成的群組。
  25. 如請求項19所述之用途，其中該外源性DNA序列可編碼出一對抗生素具有抗性的蛋白、一報導 蛋白、一細胞激素、一激酶、一抗原、一具有抗原專一性的受體、一細胞激素受體、一自殺多肽或一調控性元件。
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