JP2022521486A - トランスポゾンに基づく免疫細胞の改変 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2019年2月8日出願の第62/803,142号からの優先権を主張し、その全体はすべての目的のために参照により組み込まれる。
本出願は、参照により組み込まれる2020年1月28日作成の889,000バイトのST25_20200128という名称のtxtファイルに開示されている配列を指す。
「a」、「an」、および「the」という単数形の使用は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「ポリヌクレオチド」に対する指示対象は複数のポリヌクレオチドを含み、「基質」に対する指示対象は複数のこのような基質を含み、「変異体」に対する指示対象は複数の変異体を含むなどである。
5.2.1 トランスポゾン要素
異種ポリヌクレオチドが宿主細胞のゲノム内へと組み込まれる場合、免疫細胞における異種ポリヌクレオチド由来の遺伝子の発現の一貫性を改善することができる。ポリヌクレオチドの宿主細胞のゲノム内への組込みはまた、ゲノムDNAの複製および分裂を確実にするのと同じ機序に供することによって、一般に、該ポリヌクレオチドを安定して遺伝可能にする。このような安定した遺伝力は、長い成長期間にわたって良好かつ一貫した発現を達成するために望ましい。免疫細胞の安定した改変のために、特に治療用途のために、該改変の安定性および発現レベルの一貫性が重要である。
遺伝子移入系は、宿主細胞に導入予定のポリヌクレオチドを含む。遺伝子移入系は、本明細書に説明するトランスポゾンもしくはトランスポザーゼのいずれかを含むことができるか、またはトランスポザーゼもしくはトランスポゾンを必要とせずに効率的な遺伝子移入を容易にする他の特徴を有する1つ以上のポリヌクレオチドを含むことができる。
免疫細胞においてポリペプチドを発現するための遺伝子移入系は、宿主細胞に移入予定のポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドは、免疫細胞において活性のあるプロモーターを含む。例としては、哺乳動物グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素(GAPDH)遺伝子(例えば、配列番号97~107によって与えられる配列)、哺乳動物ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)遺伝子(例えば、配列番号115~118によって与えられる配列)、哺乳動物伸長因子1a(EF1a)遺伝子(例えば、配列番号94、96および128~146によって与えられる配列)、哺乳動物伸長因子2(EEF2)遺伝子(例えば、配列番号1108、109、114および147~154によって与えられる配列)およびユビキチン遺伝子(例えば、配列番号95または125~127によって与えられる配列)をはじめとする構成的に発現する遺伝子由来のプロモーターがある。これらの遺伝子は、それらの天然のイントロン配列をはじめとするイントロン配列とともに、またはそれなしで、使用することができる。例示的なイントロン配列は、配列番号155~159として与えられている。
遺伝子移入系は、発現のための遺伝子を真核細胞内へと導入するのに有用である。動物細胞および高等植物細胞をはじめとする多くの真核細胞は、遺伝子発現の間に転写されたmRNAをプロセシングする。タンパク質をコードする遺伝子は、しばしばポリアデニル化され、細胞内のmRNAを安定化する。ポリアデニル化シグナルはまた、転写を終結させるのにも役立つことができる。このことは、2つのプロモーター間の干渉を低減させるのに役立つので、2つ以上のオープンリーディングフレームがポリヌクレオチドから発現予定であるときに特に有用である可能性がある。1つのプロモーターからの転写を終結させ、それによって第1のプロモーターの3’に位置する第2のプロモーターとの干渉を低減させるのに有効であるポリアデニル化配列は、合成で設計することができる。配列番号160~配列番号217の配列はすべて、転写された配列のポリアデニル化を開始するために、および転写を終結させる上で有用である。配列番号160~配列番号217のポリアデニル化配列は、脊椎動物または無脊椎動物の細胞をはじめとする動物細胞における遺伝子の発現のための遺伝子移入系のポリヌクレオチドに含まれることができる。配列番号160~配列番号217のポリアデニル化配列は、ラット、マウス、およびハムスターなどの齧歯類、ウシ、ヤギまたはヒツジなどの有蹄動物、ブタをはじめとする哺乳動物に由来の細胞、ヒト組織およびヒト幹細胞に由来の細胞をはじめとする脊椎動物細胞において遺伝子を発現させるのに有用である。配列番号160~配列番号217のポリアデニル化配列は、免疫細胞、リンパ球、肝細胞、神経細胞、筋肉細胞、血液細胞、胚性幹細胞、体性幹細胞、造血細胞、胚、接合体および精子細胞(これらのいくつかは、インビトロ設定において操作されるために開放されている)をはじめとする種々の細胞型において有用である。配列番号160~配列番号217のポリアデニル化配列は、多能性細胞(その子孫が造血幹細胞または他の幹細胞などのいくつかの制限された細胞型へと分化することができる細胞)または全能性細胞(すなわち、その子孫が生物においていかなる細胞型にもなることができる細胞、例えば、胚性幹細胞)において遺伝子を発現させるのに有用である。配列番号160~配列番号217のポリアデニル化配列は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞またはヒト胎児由来腎(HEK293)細胞などの培養細胞において遺伝子を発現させるのに有用である。
異種ポリヌクレオチドが免疫細胞のゲノム内へと組み込まれるとき、異種ポリヌクレオチド内の遺伝要素が内在性免疫細胞遺伝子の発現に影響を及ぼすのを防止することがしばしば望ましい。同様に、異種ポリヌクレオチド内の遺伝子が免疫細胞ゲノム内の要素によって影響を及ぼされること、例えばヘテロクロマチン内への組み込みによってサイレンシングされること、を防止することはしばしば望ましい。インスレーター要素は、エンハンサー遮断活性(異種ポリヌクレオチド内の遺伝子が内在性免疫細胞遺伝子の発現に影響を及ぼすのを防止するのに役立つ)およびバリア活性(異種ポリヌクレオチド内の遺伝子がヘテロクロマチンへの組み込みによってサイレンシングされるのを防止するのに役立つ)を有することが公知である。エンハンサー遮断活性は、転写抑制体CTCFタンパク質の結合からもたらすことができる。バリア活性は、USF1およびVEZF1などの脊椎動物バリアタンパク質の結合からもたらすことができる。有用なインスレーター配列は、CTCF、USF1またはVEZF1に対する結合部位を含む。有利な遺伝子移入系は、CTCF、USF1またはVEZF1に対する結合部位を含むインスレーター配列を含むポリヌクレオチドを含む。より好ましくは、遺伝子移入系は、各々がCTCF、USF1またはVEZF1に対する結合部位を含む2つのインスレーター配列を含むポリヌクレオチドを含み、該2つのインスレーター配列は、異種ポリヌクレオチド内の何らかのプロモーターまたはエンハンサーに隣接する。インスレーター配列の有利な例は、配列番号87~配列番号93として与えられている。
免疫細胞が身体に対する脅威に適切に応答するためには、免疫細胞は、それらの標的を攻撃するのに十分長く生存することができなければならない。免疫細胞のエクスビボ操作を必要とする療法および研究には、免疫細胞が増殖することが有利である。しかしながら、エクスビボ培養条件も、ある特定のインビボ環境(例えば、固形腫瘍内の環境)も、免疫細胞の成長にとって最適ではない。例えば、かなり前処置されたリンパ腫患者に由来のT細胞は、抗CD19キメラ抗原受容体で操作されたとき、未処置患者に由来のT細胞よりも低いエクスビボ拡大速度および臨床応答を示す。それゆえ、特に免疫細胞に対して自然に敵対的である条件下では、ヒト免疫細胞の機能、持続性および増殖を増強する方法が必要とされている。
ヒト免疫細胞の持続性および増殖を増強するための1つのアプローチは、成長および/または生存を高めるための遺伝要素を免疫細胞のゲノム内へと組み込むことである。免疫細胞の生存を増強するための候補遺伝要素には、免疫細胞癌において突然変異することがわかっている遺伝子がある。しかしながら、細胞から癌細胞への形質転換は、典型的には、一連の突然変異を必要とすると考えられており、各突然変異の役割は、細胞の生存または成長に直接関連していないことがある。例えば、多くの突然変異は、追加の突然変異が起こる可能性を単に高めることが公知である。したがって、ある特定の遺伝子における突然変異が免疫細胞癌においてしばしば生じる相関が存在する可能性があるとしても、一般に、その同じ突然変異した遺伝子を免疫細胞内へと導入することがその細胞の成長または生存を増強するということにはならない。それゆえ、天然に存在する突然変異を含む遺伝子を含む異種ポリヌクレオチドの、免疫細胞のゲノム内への組み込みがその細胞の生存および増殖を高めるかどうかを判定するために試験を行うことができる。
STAT3(転写のシグナル伝達因子および活性化因子3)をコードする遺伝子は、大顆粒リンパ球性白血病において突然変異していることがしばしば認められる。これらの活性化突然変異は、STAT3のSH2ドメインに頻繁に存在し、S614R、E616K、G618R、Y640F、N647I、E652K、K658Y、K658R、K658N、K658M、K658R、K658H、K658N、D661YおよびD661Vを含む。STAT3における活性化突然変異はまた、SH2ドメインの外側でも認められており、例えば、F174SおよびH410Rである。第6.2.1.1節および第6.2.1.5節において説明するように、本発明者らは、STAT3タンパク質の活性化突然変異体をコードする異種ポリヌクレオチドが、免疫細胞の生存または免疫細胞の増殖を増強するために免疫細胞内へと導入されることができることを実証しており、STAT3の活性化突然変異体をコードする遺伝子は、第6.2節において説明するような免疫細胞生存増強遺伝子および免疫細胞増殖増強遺伝子である。その配列がF174S、H410R、S614R、E616K、G618R、Y640F、N647I、E652K、K658Y、K658R、K658N、K658M、K658R、K658H、K658N、D661YおよびD661Vから選択される1つ以上の突然変異を含む、STAT3の修飾版を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド、例えば、配列番号232)は、本発明の一実施形態である。突然変異した例示的なSTAT3タンパク質としては、配列番号246~配列番号250がある。好ましい実施形態は、活性化突然変異を含むSTAT3タンパク質をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含み、該核酸は異種プロモーターに作動可能に連結されている。STAT3の活性化突然変異体をコードする核酸に作動可能に連結されることができる例示的な異種プロモーターとしては、EF1プロモーター、PGKプロモーター、GAPDHプロモーター、EEF2プロモーター、ユビキチンプロモーター、SV40プロモーターまたはHSVTKプロモーター、例えば配列番号94~配列番号154から選択される配列がある。好ましい実施形態は、STAT3の活性化突然変異体をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含み、該核酸は、異種ポリアデニル化シグナル、例えば哺乳動物細胞を感染させるウイルスに由来のポリアデニル化シグナル、哺乳動物EF1ポリアデニル化シグナル、哺乳動物成長ホルモンポリアデニル化シグナルまたは哺乳動物グロビンポリアデニル化シグナル、例えば配列番号160~配列番号217から選択される配列に作動可能に連結されている。好ましい実施形態は、STAT3の活性化突然変異体をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号6および配列番号7を有する配列、または配列番号14および配列番号15を有する配列、または配列番号18および配列番号19を有する配列、または配列番号20および配列番号21を有する配列をさらに含む、piggyBac様トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態は、STAT3の活性化突然変異体をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号24と90%同一である配列と、配列番号25と90%同一である配列とをさらに含む、Sleeping BeautyトランスポゾンなどのMariner型トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態は、STAT3の活性化突然変異体をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号397と90%同一である配列と、配列番号398と90%同一である配列とをさらに含む、TcBusterトランスポゾンなどのhAT型トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。STAT3の活性化突然変異体をコードするポリヌクレオチドを含むトランスポゾンは、対応するトランスポザーゼまたは対応するトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドと共に免疫細胞内へと導入することができる。好ましい実施形態は、STAT3の活性化突然変異体をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、レンチウイルスベクターの一部であるポリヌクレオチドを含む。突然変異したSTAT3タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターは、パッケージングされ、免疫細胞を感染させるために使用することができる。免疫細胞は、好ましくはT細胞である。
CD28(分化クラスター28)遺伝子はしばしば、末梢T細胞リンパ腫において突然変異していることが認められる。最も一般的な活性化突然変異は、D124E、D124V、T195IおよびT195Pである。第6.2.1.2節および第6.2.1.3節において説明するように、本発明者らは、CD28タンパク質の活性化突然変異体をコードする異種ポリヌクレオチドが、免疫細胞の生存または免疫細胞の増殖を増強するために、および再刺激誘導性細胞死を低減させるために免疫細胞内へと導入されることができることを実証しており、CD28の活性化突然変異体をコードする遺伝子は、第6.2節において説明するような免疫細胞生存増強遺伝子および免疫細胞増殖増強遺伝子である。その配列がD124E、D124V、T195IおよびT195Pから選択される1つ以上の突然変異を含む、CD28の修飾版を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド(例えば、配列番号233)は、本発明の一実施形態である。突然変異した例示的なCD28タンパク質は、配列番号251として与えられている。突然変異したCD28は、配列番号233の最初の18アミノ酸における分泌シグナルを別の機能活性のある分泌シグナルで置き換えることをさらに含むことができる。好ましい実施形態は、CD28の活性化突然変異体をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含み、該核酸は異種プロモーターに作動可能に連結されている。突然変異したCD28をコードする核酸に作動可能に連結されることができる例示的な異種プロモーターとしては、EF1プロモーター、PGKプロモーター、GAPDHプロモーター、EEF2プロモーター、ユビキチンプロモーター、SV40プロモーターまたはHSVTKプロモーター、例えば配列番号94~配列番号154から選択される配列がある。好ましい実施形態は、CD28の活性化突然変異体をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含み、該核酸は、異種ポリアデニル化シグナル、例えば哺乳動物細胞を感染させるウイルスに由来のポリアデニル化シグナル、哺乳動物EF1ポリアデニル化シグナル、哺乳動物成長ホルモンポリアデニル化シグナルまたは哺乳動物グロビンポリアデニル化シグナル、例えば配列番号160~配列番号217から選択される配列に作動可能に連結されている。好ましい実施形態は、CD28の活性化突然変異体をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号6および配列番号7を有する配列、または配列番号14および配列番号15を有する配列、または配列番号18および配列番号19を有する配列、または配列番号20および配列番号21を有する配列をさらに含む、piggyBac様トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態は、CD28の活性化突然変異体をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号24と90%同一である配列と、配列番号25と90%同一である配列とをさらに含む、Sleeping BeautyトランスポゾンなどのMariner型トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態は、CD28の活性化突然変異体をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号397と90%同一である配列と、配列番号398と90%同一である配列とをさらに含む、TcBusterトランスポゾンなどのhAT型トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。CD28の活性化突然変異体をコードするポリヌクレオチドを含むトランスポゾンは、対応するトランスポザーゼまたは対応するトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドと共に免疫細胞内へと導入されることができる。好ましい実施形態は、CD28の活性化突然変異体をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、レンチウイルスベクターの一部であるポリヌクレオチドを含む。CD28の活性化突然変異体をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターは、パッケージングされ、免疫細胞を感染させるために使用することができる。免疫細胞は、好ましくはT細胞である。
RhoA小型GTPアーゼは、末梢T細胞リンパ腫において頻繁に突然変異している。リンパ腫と関係する最も一般的な突然変異は、G17VおよびK18Nである。RhoAタンパク質の活性化突然変異体は、免疫細胞の生存または免疫細胞の増殖を増強するために免疫細胞内へと導入されることができ、RhoAの活性化突然変異体をコードする遺伝子は、第6.2節において説明するような免疫細胞生存増強遺伝子および免疫細胞増殖増強遺伝子である。その配列がG17VおよびK18Nまたはこれらの組み合わせから選択される突然変異を含む、RhoAの修飾版を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド、例えば、配列番号234は、本発明の一実施形態である。突然変異した例示的なRhoAタンパク質は、配列番号252および配列番号253として与えられている。好ましい実施形態は、突然変異したRhoAタンパク質をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含み、該核酸は異種プロモーターに作動可能に連結されている。突然変異したRhoAをコードする遺伝子に作動可能に連結されることができる例示的な異種プロモーターとしては、EF1プロモーター、PGKプロモーター、GAPDHプロモーター、EEF2プロモーター、ユビキチンプロモーター、SV40プロモーターまたはHSVTKプロモーター、例えば配列番号94~配列番号154から選択される配列がある。好ましい実施形態は、突然変異したRhoAタンパク質をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含み、該核酸は、異種ポリアデニル化シグナル、例えば哺乳動物細胞を感染させるウイルスに由来のポリアデニル化シグナル、哺乳動物EF1ポリアデニル化シグナル、哺乳動物成長ホルモンポリアデニル化シグナルまたは哺乳動物グロビンポリアデニル化シグナル、例えば配列番号160~配列番号217から選択される配列に作動可能に連結されている。好ましい実施形態は、突然変異したRhoAタンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号6および配列番号7を有する配列、または配列番号14および配列番号15を有する配列、または配列番号18および配列番号19を有する配列、または配列番号20および配列番号21を有する配列をさらに含む、piggyBac様トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態は、突然変異したRhoAタンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号24と90%同一である配列と、配列番号25と90%同一である配列とをさらに含む、Sleeping BeautyトランスポゾンなどのMariner型トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態は、突然変異したRhoAタンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号397と90%同一である配列と、配列番号398と90%同一である配列とをさらに含む、TcBusterトランスポゾンなどのhAT型トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。突然変異したRhoAタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むトランスポゾンは、対応するトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドと共に免疫細胞内へと導入することができる。好ましい実施形態は、突然変異したRhoAタンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、レンチウイルスベクターの一部であるポリヌクレオチドを含む。突然変異したRhoAタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターは、パッケージングされ、免疫細胞を感染させるために使用することができる。免疫細胞は、好ましくはT細胞である。
活性化ホスホリパーゼCγ(PLCG)突然変異は、皮膚T細胞リンパ腫と関係している。リンパ腫と関係する最も一般的な活性化突然変異は、S345F、S520FおよびR707Qである。第6.2.1.5節において説明するように、本発明者らは、PLCGタンパク質の活性化突然変異体をコードする異種ポリヌクレオチドが、免疫細胞の生存または免疫細胞の増殖を増強するために免疫細胞内へと導入されることができることを実証しており、PLCGの活性化突然変異体をコードする遺伝子は、第6.2節において説明するような免疫細胞生存増強遺伝子および免疫細胞増殖増強遺伝子である。その配列がS345F、S520FおよびR707Qから選択される1つ以上の突然変異を含む、PLCGの修飾版を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド、例えば、配列番号235は、本発明の一実施形態である。突然変異した例示的なPLCGタンパク質は、配列番号254として与えられている。好ましい実施形態は、PLCGの活性化突然変異体をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含み、該核酸は異種プロモーターに作動可能に連結されている。突然変異したPLCGをコードする遺伝子に作動可能に連結されることができる例示的な異種プロモーターとしては、EF1プロモーター、PGKプロモーター、GAPDHプロモーター、EEF2プロモーター、ユビキチンプロモーター、SV40プロモーターまたはHSVTKプロモーター、例えば配列番号94~配列番号154から選択される配列がある。好ましい実施形態は、PLCGの活性化突然変異体をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含み、該核酸は、異種ポリアデニル化シグナル、例えば哺乳動物細胞を感染させるウイルスに由来のポリアデニル化シグナル、哺乳動物EF1ポリアデニル化シグナル、哺乳動物成長ホルモンポリアデニル化シグナルまたは哺乳動物グロビンポリアデニル化シグナル、例えば配列番号160~配列番号217から選択される配列に作動可能に連結されている。好ましい実施形態は、PLCGの活性化突然変異体をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号6および配列番号7を有する配列、または配列番号14および配列番号15を有する配列、または配列番号18および配列番号19を有する配列、または配列番号20および配列番号21を有する配列をさらに含む、piggyBac様トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態は、PLCGの活性化突然変異体をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号24と90%同一である配列と、配列番号25と90%同一である配列とをさらに含む、Sleeping BeautyトランスポゾンなどのMariner型トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態は、突然変異したPLCGタンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号397と90%同一である配列と、配列番号398と90%同一である配列とをさらに含む、TcBusterトランスポゾンなどのhAT型トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。突然変異したPLCGタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むトランスポゾンは、対応するトランスポザーゼまたは対応するトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドと共に免疫細胞内へと導入することができる。好ましい実施形態は、突然変異したPLCGタンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、レンチウイルスベクターの一部であるポリヌクレオチドを含む。突然変異したPLCGタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターは、パッケージングされ、免疫細胞を感染させるために使用することができる。免疫細胞は、好ましくはT細胞である。
STAT5B(転写のシグナル伝達因子および活性化因子5B)をコードする遺伝子は、T細胞白血病において突然変異していることが時折認められる。白血病と関係する最も一般的な活性化突然変異は、SH2ドメイン内のN642Hである。T細胞癌と関係する他のSTAT5B活性化突然変異には、SH2ドメイン突然変異T648S、S652YおよびY665F、ならびにSH2ドメイン外のP267Aがある。STAT5Bタンパク質の活性化突然変異体をコードする異種ポリヌクレオチドは、免疫細胞の生存または免疫細胞の増殖を増強するために免疫細胞内へと導入されることができ、STAT5Bの活性化突然変異体をコードする遺伝子は、第6.2節において説明するような免疫細胞生存増強遺伝子および免疫細胞増殖増強遺伝子である。その配列がN642H、T648S、S652Y、Y665FおよびP267Aから選択される1つ以上の突然変異を含む、STAT5Bの修飾版を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド(例えば、配列番号236)は、本発明の一実施形態である。突然変異した例示的なSTAT5Bタンパク質は、配列番号255として与えられている。好ましい実施形態は、突然変異したSTAT5Bタンパク質をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含み、該核酸は異種プロモーターに作動可能に連結されている。突然変異したSTAT5Bをコードする遺伝子に作動可能に連結されることができる例示的な異種プロモーターとしては、EF1プロモーター、PGKプロモーター、GAPDHプロモーター、EEF2プロモーター、ユビキチンプロモーター、SV40プロモーターまたはHSVTKプロモーター、例えば配列番号94~配列番号154から選択される配列がある。好ましい実施形態は、突然変異したSTAT5Bタンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドを含み、該遺伝子は、異種ポリアデニル化シグナル、例えば哺乳動物細胞を感染させるウイルスに由来のポリアデニル化シグナル、哺乳動物EF1ポリアデニル化シグナル、哺乳動物成長ホルモンポリアデニル化シグナルまたは哺乳動物グロビンポリアデニル化シグナル、例えば配列番号160~配列番号217から選択される配列に作動可能に連結されている。好ましい実施形態は、突然変異したSTAT5Bタンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号6および配列番号7を有する配列、または配列番号14および配列番号15を有する配列、または配列番号18および配列番号19を有する配列、または配列番号20および配列番号21を有する配列をさらに含む、piggyBac様トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態は、STAT5Bの活性化突然変異体をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号24と90%同一である配列と、配列番号25と90%同一である配列とをさらに含む、Sleeping BeautyトランスポゾンなどのMariner型トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態は、突然変異したSTAT5Bタンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号397と90%同一である配列と、配列番号398と90%同一である配列とをさらに含む、TcBusterトランスポゾンなどのhAT型トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。突然変異したSTAT5Bタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むトランスポゾンは、対応するトランスポザーゼまたは対応するトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドと共に免疫細胞内へと導入することができる。好ましい実施形態は、突然変異したSTAT5Bタンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、レンチウイルスベクターの一部であるポリヌクレオチドを含む。突然変異したSTAT5Bタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターは、パッケージングされ、免疫細胞を感染させるために使用することができる。免疫細胞は、好ましくはT細胞である。
サバイビン(タンパク質のアポトーシス阻害剤ファミリーのメンバー)をコードする遺伝子は、T細胞白血病において上方調節されることが時折認められる。第6.2.1.3節において説明するように、本発明者らは、異種プロモーターに作動可能に連結されたサバイビン遺伝子をコードする異種ポリヌクレオチドが、免疫細胞の生存または免疫細胞の増殖を増強するために、および再刺激誘導性細胞死を低減させるために免疫細胞内へと導入されることができることを実証しており、異種プロモーターに作動可能に連結されたサバイビン遺伝子は、第6.2節において説明するような免疫細胞生存増強遺伝子および免疫細胞増殖増強遺伝子である。異種プロモーターに作動可能に連結された、配列番号237を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明の一実施形態である。サバイビンをコードする遺伝子に作動可能に連結されることができる例示的な異種プロモーターとしては、EF1プロモーター、PGKプロモーター、GAPDHプロモーター、EEF2プロモーター、ユビキチンプロモーター、SV40プロモーターまたはHSVTKプロモーター、例えば配列番号94~配列番号154から選択される配列がある。好ましい実施形態は、サバイビンをコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドを含み、該遺伝子は、異種ポリアデニル化シグナル、例えば哺乳動物細胞を感染させるウイルスに由来のポリアデニル化シグナル、哺乳動物EF1ポリアデニル化シグナル、哺乳動物成長ホルモンポリアデニル化シグナルまたは哺乳動物グロビンポリアデニル化シグナル、例えば配列番号160~配列番号217から選択される配列に作動可能に連結されている。好ましい実施形態は、サバイビンをコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号6および配列番号7を有する配列、または配列番号14および配列番号15を有する配列、または配列番号18および配列番号19を有する配列、または配列番号20および配列番号21を有する配列をさらに含む、piggyBac様トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態は、サバイビンをコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号24と90%同一である配列と、配列番号25と90%同一である配列とをさらに含む、Sleeping BeautyトランスポゾンなどのMariner型トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態は、サバイビンをコードする遺伝子をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号397と90%同一である配列と、配列番号398と90%同一である配列とをさらに含む、TcBusterトランスポゾンなどのhAT型トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。サバイビンをコードするポリヌクレオチドを含むトランスポゾンは、対応するトランスポザーゼまたは対応するトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドと共に免疫細胞内へと導入することができる。好ましい実施形態は、サバイビンをコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、レンチウイルスベクターの一部であるポリヌクレオチドを含む。サバイビンをコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターは、パッケージングされ、免疫細胞を感染させるために使用することができる。免疫細胞は、好ましくはT細胞またはB細胞である。
Bcl-XL(抗アポトーシスタンパク質)をコードする遺伝子は、B細胞リンパ腫において上方調節されることが時折認められる。第6.2.1.5節および第6.2.1.6節において説明するように、本発明者らは、異種プロモーターに作動可能に連結されたBcl-XL遺伝子をコードする異種ポリヌクレオチドが、免疫細胞の生存または免疫細胞の増殖を増強するために、および再刺激誘導性細胞死を低減させるために免疫細胞内へと導入されることができることを実証しており、異種プロモーターに作動可能に連結されたBcl-XL遺伝子は、第6.2節において説明するような免疫細胞生存増強遺伝子および免疫細胞増殖増強遺伝子である。異種プロモーターに作動可能に連結された、配列番号238を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明の一実施形態である。Bcl-XLをコードする核酸に作動可能に連結されることができる例示的な異種プロモーターとしては、EF1プロモーター、PGKプロモーター、GAPDHプロモーター、EEF2プロモーター、ユビキチンプロモーター、SV40プロモーターまたはHSVTKプロモーター、例えば配列番号94~配列番号154から選択される配列がある。好ましい実施形態は、Bcl-XLをコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含み、該核酸は、異種ポリアデニル化シグナル、例えば哺乳動物細胞を感染させるウイルスに由来のポリアデニル化シグナル、哺乳動物EF1ポリアデニル化シグナル、哺乳動物成長ホルモンポリアデニル化シグナルまたは哺乳動物グロビンポリアデニル化シグナル、例えば配列番号160~配列番号217から選択される配列に作動可能に連結されている。好ましい実施形態は、Bcl-XLをコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号6および配列番号7を有する配列、または配列番号14および配列番号15を有する配列、または配列番号18および配列番号19を有する配列、または配列番号20および配列番号21を有する配列をさらに含む、piggyBac様トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態は、Bcl-XLをコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号24と90%同一である配列と、配列番号25と90%同一である配列とをさらに含む、Sleeping BeautyトランスポゾンなどのMariner型トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態は、Bcl-XLをコードする遺伝子をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号397と90%同一である配列と、配列番号398と90%同一である配列とをさらに含む、TcBusterトランスポゾンなどのhAT型トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。Bcl-XLをコードするポリヌクレオチドを含むトランスポゾンは、対応するトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドと共に免疫細胞内へと導入することができる。好ましい実施形態は、Bcl-XLをコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、レンチウイルスベクターの一部であるポリヌクレオチドを含む。Bcl-XLをコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターは、パッケージングされ、免疫細胞を感染させるために使用することができる。免疫細胞は、好ましくはT細胞またはB細胞である。
CCND1(サイクリンD1)をコードする遺伝子は、白血病において突然変異していることが時折認められる。癌と関係するCCND1突然変異には、E36G、E36Q、E36K、A39S、S41L、S41P、S41T、V42E、V42A、V42L、V42M、Y44S、Y44D、Y44C、Y44H、K46T、K46R、K46N、K46E、C47G、C47R、C47S、C47W、P199R、P199S、P199L、S201F、T285I、T285A、P286L、P286H、P286S、P286TおよびP286Aがある。CCND1タンパク質の活性化突然変異体をコードする異種ポリヌクレオチドは、免疫細胞の生存または免疫細胞の増殖を増強するために免疫細胞内へと導入されることができ、CCND1の活性化突然変異体をコードする遺伝子は、第6.2節において説明するような免疫細胞生存増強遺伝子および免疫細胞増殖増強遺伝子である。その配列がE36G、E36Q、E36K、A39S、S41L、S41P、S41T、V42E、V42A、V42L、V42M、Y44S、Y44D、Y44C、Y44H、K46T、K46R、K46N、K46E、C47G、C47R、C47S、C47W、P199R、P199S、P199L、S201F、T285I、T285A、P286L、P286H、P286S、P286TおよびP286Aから選択される1つ以上の突然変異を含む、CCND1の修飾版を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド(例えば、配列番号239)は、本発明の一実施形態である。突然変異した例示的なCCND1タンパク質は、配列番号256として与えられている。好ましい実施形態は、突然変異したCCND1タンパク質をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含み、該核酸は異種プロモーターに作動可能に連結されている。突然変異したCCND1をコードする核酸に作動可能に連結されることができる例示的な異種プロモーターとしては、EF1プロモーター、PGKプロモーター、GAPDHプロモーター、EEF2プロモーター、ユビキチンプロモーター、SV40プロモーターまたはHSVTKプロモーター、例えば配列番号94~配列番号154から選択される配列がある。好ましい実施形態は、突然変異したCCND1タンパク質をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含み、該核酸は、異種ポリアデニル化シグナル、例えば哺乳動物細胞を感染させるウイルスに由来のポリアデニル化シグナル、哺乳動物EF1ポリアデニル化シグナル、哺乳動物成長ホルモンポリアデニル化シグナルまたは哺乳動物グロビンポリアデニル化シグナル、例えば配列番号160~配列番号217から選択される配列に作動可能に連結されている。好ましい実施形態は、突然変異したCCND1タンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号6および配列番号7を有する配列、または配列番号14および配列番号15を有する配列、または配列番号18および配列番号19を有する配列、または配列番号20および配列番号21を有する配列をさらに含む、piggyBac様トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態は、CCND1の活性化突然変異体をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号24と90%同一である配列と、配列番号25と90%同一である配列とをさらに含む、Sleeping BeautyトランスポゾンなどのMariner型トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態は、CCND1の活性化突然変異体をコードする遺伝子をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号397と90%同一である配列と、配列番号398と90%同一である配列とをさらに含む、TcBusterトランスポゾンなどのhAT型トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。突然変異したCCND1タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むトランスポゾンは、対応するトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドと共に免疫細胞内へと導入することができる。好ましい実施形態は、突然変異したCCND1タンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、レンチウイルスベクターの一部であるポリヌクレオチドを含む。突然変異したCCND1タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターは、パッケージングされ、免疫細胞を感染させるために使用することができる。免疫細胞は、好ましくはT細胞またはB細胞である。
Bcl2(抗アポトーシスタンパク質)をコードする遺伝子は、B細胞リンパ腫において上方調節されることが時折認められる。第6.2.1.4節において説明するように、本発明者らは、異種プロモーターに作動可能に連結されたBcl2遺伝子をコードする異種ポリヌクレオチドが、免疫細胞の生存または免疫細胞の増殖を増強するために、免疫細胞内へと導入されることができることを実証しており、異種プロモーターに作動可能に連結されたBcl2遺伝子は、第6.2節において説明するような免疫細胞生存増強遺伝子および免疫細胞増殖増強遺伝子である。異種プロモーターに作動可能に連結された、配列番号v270または272を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明の一実施形態である。Bcl2をコードする核酸に作動可能に連結されることができる例示的な異種プロモーターとしては、EF1プロモーター、PGKプロモーター、GAPDHプロモーター、EEF2プロモーター、ユビキチンプロモーター、SV40プロモーターまたはHSVTKプロモーター、例えば配列番号94~配列番号154から選択される配列がある。好ましい実施形態は、Bcl2をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含み、該核酸は、異種ポリアデニル化シグナル、例えば哺乳動物細胞を感染させるウイルスに由来のポリアデニル化シグナル、哺乳動物EF1ポリアデニル化シグナル、哺乳動物成長ホルモンポリアデニル化シグナルまたは哺乳動物グロビンポリアデニル化シグナル、例えば配列番号160~配列番号217から選択される配列に作動可能に連結されている。好ましい実施形態は、Bcl2をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号6および配列番号7を有する配列、または配列番号14および配列番号15を有する配列、または配列番号18および配列番号19を有する配列、または配列番号20および配列番号21を有する配列をさらに含む、piggyBac様トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態は、Bcl2をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号24と90%同一である配列と、配列番号25と90%同一である配列とをさらに含む、Sleeping BeautyトランスポゾンなどのMariner型トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態は、Bcl2をコードする遺伝子をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号397と90%同一である配列と、配列番号398と90%同一である配列とをさらに含む、TcBusterトランスポゾンなどのhAT型トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。Bcl2をコードするポリヌクレオチドを含むトランスポゾンは、対応するトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドと共に免疫細胞内へと導入することができる。好ましい実施形態は、Bcl2をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、レンチウイルスベクターの一部であるポリヌクレオチドを含む。Bcl2をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターは、パッケージングされ、免疫細胞を感染させるために使用することができる。免疫細胞は、好ましくはT細胞またはB細胞である。
Bcl6(抗アポトーシスタンパク質)をコードする遺伝子は、B細胞リンパ腫において上方調節されることが時折認められる。第6.2.1.4節において説明するように、本発明者らは、異種プロモーターに作動可能に連結されたBcl6遺伝子をコードする異種ポリヌクレオチドが、免疫細胞の生存または免疫細胞の増殖を増強するために、免疫細胞内へと導入されることができることを実証しており、異種プロモーターに作動可能に連結されたBcl6遺伝子は、第6.2節において説明するような免疫細胞生存増強遺伝子および免疫細胞増殖増強遺伝子である。異種プロモーターに作動可能に連結された、配列番号271または配列番号272を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明の一実施形態である。Bcl6をコードする核酸に作動可能に連結されることができる例示的な異種プロモーターとしては、EF1プロモーター、PGKプロモーター、GAPDHプロモーター、EEF2プロモーター、ユビキチンプロモーター、SV40プロモーターまたはHSVTKプロモーター、例えば配列番号94~配列番号154から選択される配列がある。好ましい実施形態は、Bcl6をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含み、該核酸は、異種ポリアデニル化シグナル、例えば哺乳動物細胞を感染させるウイルスに由来のポリアデニル化シグナル、哺乳動物EF1ポリアデニル化シグナル、哺乳動物成長ホルモンポリアデニル化シグナルまたは哺乳動物グロビンポリアデニル化シグナル、例えば配列番号160~配列番号217から選択される配列に作動可能に連結されている。好ましい実施形態は、Bcl6をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号6および配列番号7を有する配列、または配列番号14および配列番号15を有する配列、または配列番号18および配列番号19を有する配列、または配列番号20および配列番号21を有する配列をさらに含む、piggyBac様トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態は、Bcl6をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号24と90%同一である配列と、配列番号25と90%同一である配列とをさらに含む、Sleeping BeautyトランスポゾンなどのMariner型トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態は、Bcl6をコードする遺伝子をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号397と90%同一である配列と、配列番号398と90%同一である配列とをさらに含む、TcBusterトランスポゾンなどのhAT型トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。Bcl6をコードするポリヌクレオチドを含むトランスポゾンは、対応するトランスポザーゼまたは対応するトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドと共に免疫細胞内へと導入することができる。好ましい実施形態は、Bcl6をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、レンチウイルスベクターの一部であるポリヌクレオチドを含む。Bcl6をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターは、パッケージングされ、免疫細胞を感染させるために使用することができる。免疫細胞は、好ましくはT細胞またはB細胞である。
T細胞などの免疫細胞は、天然リガンドおよび合成リガンドに結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達経路と相互作用する細胞内ドメインとを含む、膜タンパク質を発現する。本発明者らは、第1のタンパク質に由来する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、刺激シグナルまたは共刺激シグナルを免疫細胞に伝達する受容体に由来する細胞内ドメインとを含む、増強型シグナル伝達受容体(ESR)と呼ばれるキメラ受容体のセットを設計、合成および試験した。しかしながら、キメラ抗原受容体とは異なり、ESRは、CD3ゼータ鎖の細胞内部分を含む配列を含まない。ESRの1つの機能は、免疫細胞の生存を増強することである。ESRの別の機能は、例えば阻害性受容体に作用する腫瘍細胞によるT細胞阻害経路の関与を打ち消すことである(Tay et al,2017.Immunotherapy 9,1339-1349)。ESRが有効に機能するためには、腫瘍微小環境内に提示されている阻害性リガンドについて天然の阻害性受容体と競合するのに十分高いレベルで発現しなければならない。
阻害性受容体の細胞外ドメインが共刺激受容体の細胞内ドメインに融合した例示的なESRとして、本発明者らは、TNFRSF6(Fas)の細胞外ドメイン(配列番号323)を含み、さらにTNFRSF6(Fas)の膜貫通ドメイン(配列番号387)を含み、さらにTNFRSF9(4-1BB)の細胞内ドメイン(配列番号344)を含む、ESRを設計した。配列番号274を含むこのESR(Fas/4-1BB)は、第6.2節に説明するような免疫細胞生存増強遺伝子および免疫細胞増殖増強遺伝子である。
Fas/4-1BBの活性は、アポトーシス阻害剤Casp7:Casp7-DNのドミナントネガティブ版(配列番号262)によって増強される。免疫細胞の生存および免疫細胞の増殖を増強させる上でのFas/4-1BB+Casp7-DNの有効性は、第6.2.1.2節および第6.2.2.2節に示されている。
細胞外ドメインが、共刺激受容体の細胞内ドメインに融合した抗体由来の結合ドメインを含む例示的なESRとして、本発明者らは、その細胞外ドメインが、TNFRSF4(OX40)についての膜貫通ドメイン(配列番号373)とTNFRSF4(OX40)の細胞内ドメイン(配列番号341)とに融合したCD28アゴニスト抗体TGN1412(配列番号340)の結合ドメインを含むESRを設計した。抗CD28/OX40 ESRの配列は、(配列番号307)として与えられている。T細胞増殖を促進する上でのこのESRの有効性は、第6.2.2.1において説明されている。
本発明はまた、タンパク質としてのもしくは核酸によってコードされたトランスポザーゼ、および/またはトランスポゾンを含む、キット、あるいはタンパク質としてのまたは本明細書に説明するような核酸によってコードされたトランスポザーゼを、トランスポゾンと組み合わせて、場合により医薬として許容され得る担体、アジュバントまたはビヒクルと共に、場合により使用のための説明書と共に含む、本明細書に説明するような遺伝子移入系も特徴とする。本発明のキットの構成要素のいずれもが、立て続けにまたは併行して細胞内へと投与および/または移入することができ、例えば、トランスポザーゼタンパク質またはそのコード核酸は、トランスポゾンの投与および/もしくは移入の前に、該投与および/もしくは移入と同時に、または該投与および/もしくは移入の後に、先に定義した細胞内へと投与および/または移入することができる。あるいは、トランスポザーゼタンパク質またはそのコード核酸の移入の前に、該移入と同時に、または該移入の後に、トランスポゾンは、先に定義した細胞内へと移入することができる。併行して移入する場合、好ましくは、移入の前の転位を回避するために、いずれの構成要素も別個の製剤で提供され、および/または移入の直前に互いに混合される。加えて、キットの少なくとも1つの構成要素の投与および/または移入は、例えば、この構成要素の複数回用量を投与することによって、時間差モードで行うことができる。
以下の例は、本明細書に開示される方法、組成物およびキットを例示するものであり、いかなる方法においても限定するものと解釈されないものとする。様々な同等物が以下の例から明らかになるであろうが、このような同等物もまた、本明細書に開示される本発明の一部であるよう企図される。
6.1.1 ヒトT細胞株におけるトランスポゾン要素
Jurkat細胞は、ヒトT細胞の不死化株であり、該細胞は、ヒト免疫細胞、特にT細胞における該細胞の有効性について遺伝子移入系を試験するために有用である。本発明者らは、ゼノパス属(Xenopus)およびカイコガ属(Bombyx)のpiggyBac様トランスポザーゼがそれらの対応するトランスポゾンをJurkatヒトT細胞株のゲノム内へと転位させる能力を試験した。
6.1.2.1 Jurkat細胞におけるプロモーター試験
Jurkat細胞は、ヒトT細胞の不死化株であり、該細胞は、ヒト免疫細胞、特にT細胞における該細胞の有効性について遺伝子移入系を試験するために有用である。
配列番号220によって配列が与えられた第一のポリヌクレオチドと配列番号221によって配列が与えられた第二のポリヌクレオチドとの間に、プロモーター要素を導入することによって、ヒトCD19の発現のためのトランスポゾン内へと、該プロモーター要素をクローン化して、配列が配列番号88によって与えられたインスレーター配列と、配列が配列番号92によって与えられたインスレーター配列とを含み、一対のトランスポゾン末端が隣接しており、片方が標的部位5’-TTAA-3’、直後に続く配列番号8の配列、および直後に続く配列番号1を含み、もう片方が配列番号4、直後に続く配列番号9の配列、および直後に続く標的部位5’-TTAA-3’を含む、環状プラスミドを生成した。初代T細胞(1回の移入あたり200,000個の細胞)に、製造元の説明書により、Neonエレクトロポレーターを使用して、1μgのプラスミドDNAと、配列番号37のポリペプチド配列を有するゼノパス属(Xenopus)トランスポザーゼをコードする100ngのトランスポザーゼmRNAとを移入した。11日後、細胞を抗CD19抗体で標識し、平均蛍光強度をフローサイトメトリーによって測定した。
本発明の一態様は、免疫細胞の生存、増殖または拡大を増強するために使用することができる配列の開示である。
6.2.1.1 初代T細胞における突然変異したSTAT3の発現
STAT3:STAT3-Y640Fの突然変異型をコードする遺伝子を、配列番号115によって配列が与えられたPGKプロモーターと、配列番号182の配列を有するウサギグロビンポリアデニル化シグナルとに作動可能に連結し、遺伝子移入ポリヌクレオチドへとクローン化した。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素(GAPDH)プロモーターとウシ成長ホルモン(BGH)ポリアデニル化シグナル配列とに作動可能に連結されたDasherGFPをコードする遺伝子を含むGFPレポーター(配列番号222の配列を有する)をさらに含んでいだ。2つのオープンリーディングフレームを、多様に転写するように構成した(2つのプロモーターは互いに隣接し、反対方向に転写された)。2つのオープンリーディングフレームには、片方の側からHS4インスレーター(配列番号92の配列を有する)が、もう片方の側からD4Z4インスレーター(配列番号88の配列を有する)が隣接していた。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、1つのインスレーターの遠位側に、標的配列5’-TTAA-3’を、直後に続く配列番号10のpiggyBac様トランスポゾン逆方向末端反復配列(これは配列番号6の実施形態である)を、直後に続く配列番号3を有する追加のトランスポゾン末端配列(これは、配列番号1と>95%同一である)をさらに含んでいた。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、もう1つのインスレーターの遠位側に、配列番号5の追加のトランスポゾン末端配列(配列番号4と>95%同一である)を、直後に続く配列番号11のpiggyBac様トランスポゾン逆方向末端反復配列(これは配列番号7の実施形態である)を、直後に続く標的配列5’-TTAA-3’をさらに含んでいた。
T細胞形質転換要素と増強型シグナル伝達受容体とのセットをコードする遺伝子を、別々の遺伝子移入ポリヌクレオチド内へと個別にクローン化した。各場合では、該遺伝子を、配列が配列番号115によって与えられたPGKプロモーターと、配列番号182の配列を有するウサギグロビンポリアデニル化シグナルとに作動可能に連結し、遺伝子移入ポリヌクレオチド内へとクローン化した。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素(GAPDH)プロモーターとウシ成長ホルモン(BGH)ポリアデニル化シグナル配列とに作動可能に連結されたDasherGFPをコードする遺伝子を含むGFPレポーター(配列番号222の配列を有する)をさらに含んでいだ。2つのオープンリーディングフレームを、多様に転写するように構成した(2つのプロモーターは互いに隣接し、反対方向に転写された)。2つのオープンリーディングフレームには、片方の側からHS4インスレーター(配列番号92の配列を有する)が、もう片方の側からD4Z4インスレーター(配列番号88の配列を有する)が隣接していた。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、1つのインスレーターの遠位側に、標的配列5’-TTAA-3’を、直後に続く配列番号10のpiggyBac様トランスポゾン逆方向末端反復配列(これは配列番号6の実施形態である)を、直後に続く配列番号3を有する追加のトランスポゾン末端配列(これは、配列番号1と>95%同一である)をさらに含んでいた。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、もう1つのインスレーターの遠位側に、配列番号5の追加のトランスポゾン末端配列(配列番号4と>95%同一である)を、直後に続く配列番号11のpiggyBac様トランスポゾン逆方向末端反復配列(これは配列番号7の実施形態である)を、直後に続く標的配列5’-TTAA-3’をさらに含んでいた。
本発明者らは、第6.2.1.2節および表5に示されるように、T細胞の成長/生存および/または増殖を増強する、サバイビンまたはCD28のD124E/T195P活性化二重突然変異体の発現を発見した。これらの遺伝子がまたT細胞の挙動性能も増強することができるかどうかを試験するために、本発明者らは、該遺伝子を、B細胞上にのみ天然に認められるエピトープであるCD19を標的とするキメラ抗原受容体と共にT細胞のゲノム内へと組み込み、改変T細胞が形質転換B細胞株の細胞を死滅させる能力を試験した。
Stemcell Technologies製のEasySep Human CD8陽性選別キットを製造元の説明書により使用して、T細胞を、2つの異なる正常ドナー由来の末梢血単核細胞(PBMC)から調製した。T細胞を、放射線照射されたフィーダー細胞とのインキュベーションによって2~3日間刺激して、分泌されたCD3、CD28、IL-2、IL-7およびIL-15を提供した。おおよそ200,000個のT細胞に、製造元のプロトコルにより、Neonエレクトロポレーターを使用して、1μgのトランスポゾンDNAと、配列番号37のトランスポザーゼをコードする100ngのmRNAとを移入した。移入したT細胞をフィーダー細胞と混合し、37℃でインキュベートした。細胞を培養でおおよそ5週間成長させ、おおよそ5週間の時点で、各遺伝子移入ポリヌクレオチドを移入した細胞の約10%がGFPを発現していた。次いで、T細胞(200,000)の試料を同数のJY細胞と混合した。JYは、CD19を発現し、したがって抗CD19キメラ抗原受容体についての標的であるエプスタイン・バーウイルス不死化B細胞リンパ芽球様株である。細胞の試料を混合3日後および7日後に細胞混合物から採取し、抗CD8抗体および抗CD19抗体で染色した(それぞれT細胞およびJY細胞を標識するため)。結果を図3および表6に示す。混合3日後までに、キメラ抗原受容体のみを発現するT細胞は、JY腫瘍細胞に圧倒されてほとんど消失していた。検出可能な細胞の8%のみがCD8を発現していたのに対し、89%はCD19を発現していた(図3のパネルA、表6のA列、第3および第4の行)。混合7日後までに、細胞の2.3%のみがCD8発現T細胞であった(図3のパネルD、表6のA列、第5および第6の行)。対照的に、キメラ受容体+サバイビンまたはCD28-D124E-T195Pのいずれかを発現するT細胞は、JY腫瘍細胞の存在下で生存することができた。3日後、図3のパネルBおよびパネルCならびに表6のB列およびC列、第3および第4の行に示されるように、細胞の40~50%がCD8(T細胞マーカー)を発現しており、23~29%のみがCD19(腫瘍細胞マーカー)を発現していた。7日後までに、腫瘍細胞は有効に排除され、全細胞のおおよそ90%がCD8を発現していた(図3のパネルEおよびパネルF、ならびに表6のB列およびC列、第5および第6の行)。本発明者らは、サバイビンまたは、CD28のD124E/T195P活性化二重突然変異体の発現が、T細胞の成長/生存および/または増殖を増強するだけでなく、T細胞が腫瘍細胞の存在下で生存することができ、腫瘍細胞を死滅させるために活性があるままであることができることによってT細胞の挙動もまた増強することができると結論付ける。
移入したT細胞の第2の試料を、FACSを使用して選別して、GFP(トランスポゾンのT細胞ゲノムにおける存在の指標である)発現細胞を選択した。選択した細胞を培養でさらに1週間成長させ、インビボでJY腫瘍細胞を死滅させる能力について試験した。100万個のJY細胞をNSG免疫不全マウスに腹腔内注射によって投与した。7日後、100万個のGFP発現T細胞を、JY処理マウスへの腹腔内注射によって投与した。2匹のマウスに、T細胞の代わりにリン酸緩衝塩類溶液(PBS)の不活性対照処理を行った。表7に示すように、PBSを投与したマウスは、JY細胞注射後24日間または25日間生存した(表7の第1および第2の行)。キメラ抗原受容体を発現するT細胞の投与は、JY注射後5~6日間から30日間まで生存を延長した(表7の第3の行)。キメラ抗原受容体+サバイビンまたはCD28-D124E-T195Pを発現するT細胞の投与は、JY注射後さらに4日間から34日間まで生存を延長した(表7の第4および第5の行)。本発明者らは、サバイビンまたは、CD28のD124E/T195P活性化二重突然変異体の発現が、T細胞のエクスビボでの成長/生存および/または増殖を増強するだけでなく、T細胞が腫瘍細胞の存在下で生存することができ、腫瘍細胞を死滅させるために活性があるままであることができることによってT細胞のインビボでの挙動もまた増強することができると結論付ける。
本発明者らはまた、抗CD19キメラ抗原受容体のみ、またはサバイビンもしくはCD28-D124E-T195Pと共発現するキメラ抗原受容体、のいずれかを発現するT細胞に対する腫瘍再負荷試験も行った。標準的な単回負荷エクスビボ腫瘍溶解アッセイは、比較的短い共培養時間および高いT細胞対腫瘍比により、T細胞の真の抗腫瘍能をしばしば過大評価する。生存増強遺伝子(この場合、サバイビンおよびCD28-D124E-T195P)がT細胞機能も増強することができるかどうかを決定するために、本発明者らは、T細胞の生存を困難にする周囲の腫瘍微小環境をよりよく模倣するために再発性腫瘍細胞多量負荷を使用した。総量200μlのマイクロタイタープレートウェル内で、1、2、3、4または5連続用量の100,000個のNALM6(CD19+、CD20-、CD21-である)のいずれかをT細胞(100,000)に負荷した。各100,000個の細胞のNALM6用量は、48時間間隔とした。各再負荷について、100μlの上清を抜去し、100,000個のNALM6細胞を含有する100μlの新鮮な培地を添加した。試料に対する最後の負荷の24時間後、NALM6細胞死を生物発光の低減として、製造元の説明書によるD-ルシフェリンの添加およびBioTekシナジーNeo2ハイブリッドマイクロプレートリーダーを用いて発光を測定することによって測定した(例えば、Karimi et al.,(2014)Measuring Cytotoxicity by Bioluminescence Imaging Outperforms the Standard Chromium-51 Release Assay.PLoS ONE 9(2):e89357を参照されたい)。
ウイルスCHYSL(2A)配列(完全なオープンリーディングフレームBcl2-2A-Bcl6の配列は配列番号272として与えられる)によって分離されたBcl2およびBcl6をコードするオープンリーディングフレームを、配列番号115によって与えられた配列を有するPGKプロモーターと配列番号182の配列を有するウサギグロビンポリアデニル化シグナルとに作動可能に連結し、遺伝子移入ポリヌクレオチド内へとクローン化した。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素(GAPDH)プロモーターとウシ成長ホルモン(BGH)ポリアデニル化シグナル配列とに作動可能に連結されたDasherGFPをコードする遺伝子を含むGFPレポーター(配列番号222の配列)をさらに含んでいだ。2つのオープンリーディングフレームを、多様に転写するように構成した(すなわち、2つのプロモーターは互いに隣接し、反対方向に転写された)。2つのオープンリーディングフレームには、片方の側からHS4インスレーター(配列番号92の配列)が、もう片方の側からD4Z4インスレーター(配列番号88の配列)が隣接していた。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、1つのインスレーターの遠位側に、標的配列5’-TTAA-3’を、直後に続く配列番号10のpiggyBac様トランスポゾン逆方向末端反復配列(これは配列番号6の実施形態である)を、直後に続く配列番号3の追加のトランスポゾン末端配列(これは、配列番号1と>95%同一である)をさらに含んでいた。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、もう1つのインスレーターの遠位側に、配列番号5の追加のトランスポゾン末端配列(配列番号4と>95%同一である)を、直後に続く配列番号11のpiggyBac様トランスポゾン逆方向末端反復配列(これは配列番号7の実施形態である)を、直後に続く標的配列5’-TTAA-3’をさらに含んでいた。
T細胞形質転換要素と増強型シグナル伝達受容体とのセットをコードする遺伝子を、別々の遺伝子移入ポリヌクレオチド内へと個別にクローン化した。各場合では、該遺伝子を、配列が配列番号115によって与えられたPGKプロモーターと、配列番号182の配列を有するウサギグロビンポリアデニル化シグナルとに作動可能に連結した。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素(GAPDH)プロモーターとウシ成長ホルモン(BGH)ポリアデニル化シグナル配列とに作動可能に連結されたDasherGFPをコードする遺伝子を含むGFPレポーター(配列番号222の配列)をさらに含んでいだ。2つのオープンリーディングフレームを、多様に転写するように構成した(すなわち、2つのプロモーターは互いに隣接し、反対方向に転写された)。2つのオープンリーディングフレームには、片方の側からHS4インスレーター(配列番号92の配列)が、もう片方の側からD4Z4インスレーター(配列番号88の配列)が隣接していた。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、1つのインスレーターの遠位側に、標的配列5’-TTAA-3’を、直後に続く配列番号10のpiggyBac様トランスポゾン逆方向末端反復配列(これは配列番号6の実施形態である)を、直後に続く配列番号3を有する追加のトランスポゾン末端配列(これは、配列番号1と>95%同一である)をさらに含んでいた。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、もう1つのインスレーターの遠位側に、配列番号5の追加のトランスポゾン末端配列(配列番号4と>95%同一である)を、直後に続く配列番号11のpiggyBac様トランスポゾン逆方向末端反復配列(これは配列番号7の実施形態である)を、直後に続く標的配列5’-TTAA-3’をさらに含んでいた。
6.2.1.6a Bcl-XL増強型エクスビボBiTE細胞死滅試験
Bcl-XL(ポリペプチド配列は配列番号238によって付与)をコードする遺伝子を遺伝子移入ポリヌクレオチド内へとクローン化した。該遺伝子を、配列が配列番号115によって与えられたPGKプロモーターと、配列番号182の配列を有するウサギグロビンポリアデニル化シグナルとに作動可能に連結した。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素(GAPDH)プロモーターとウシ成長ホルモン(BGH)ポリアデニル化シグナル配列とに作動可能に連結されたDasherGFPをコードする遺伝子を含むGFPレポーター(配列番号222の配列)をさらに含んでいだ。2つのオープンリーディングフレームを、多様に転写するように構成した(すなわち、2つのプロモーターは互いに隣接し、反対方向に転写された)。2つのオープンリーディングフレームには、片方の側からHS4インスレーター(配列番号92の配列を有する)が、もう片方の側からD4Z4インスレーター(配列番号88の配列を有する)が隣接していた。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、1つのインスレーターの遠位側に、標的配列5’-TTAA-3’を、直後に続く配列番号10のpiggyBac様トランスポゾン逆方向末端反復配列(これは配列番号6の実施形態である)を、直後に続く配列番号3を有する追加のトランスポゾン末端配列(これは、配列番号1と>95%同一である)をさらに含んでいた。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、もう1つのインスレーターの遠位側に、配列番号5の追加のトランスポゾン末端配列(配列番号4と>95%同一である)を、直後に続く配列番号11のpiggyBac様トランスポゾン逆方向末端反復配列(これは配列番号7の実施形態である)を、直後に続く標的配列5’-TTAA-3’をさらに含んでいた。
本発明者らは、第6.2.1.3c節に説明されているような抗CD19キメラ抗原受容体を発現するT細胞に対して腫瘍再負荷試験を行った。サバイビンまたはCD28-D124E-T195Pと共発現したキメラ抗原受容体を含んでいるトランスポゾンは、第6.2.1.3節において説明されるとおりであり、Bcl-XLと共発現したキメラ抗原受容体を含む追加のトランスポゾンを生成した。生存増強遺伝子(この場合、サバイビン、CD28-D124E-T195PおよびBcl-XL)がT細胞機能も増強することができるかどうかを決定するために、本発明者らは、T細胞の生存を困難にする周囲の腫瘍微小環境をよりよく模倣するために再発性腫瘍細胞多量負荷を使用した。総量200μlのマイクロタイタープレートウェル内で、1、2、3、4、5または6連続用量の100,000個のNALM6(CD19+、CD20-、CD21-である)のいずれかをT細胞(100,000)に負荷した。各100,000個の細胞のNALM6用量は、48時間間隔とした。各再負荷について、100μlの上清を抜去し、100,000個のNALM6細胞を含有する100μlの新鮮な培地を添加した。試料に対する最後の負荷の24時間後、D-ルシフェリンを添加し、BioTekシナジーNeo2ハイブリッドマイクロプレートリーダーを製造元の説明書により使用して発光を測定することによって、生物発光の低減としてNALM6細胞死を測定した(例えば、Karimi et.al.,(2014)Measuring Cytotoxicity by Bioluminescence Imaging Outperforms the Standard Chromium-51 Release Assay.PLoS ONE 9(2):e89357を参照されたい)。
6.2.2.1 抗CD28/OX40は増殖増強活性を有するESRである
TNFRSF4についての膜貫通ドメイン(OX40)(配列は配列番号373によって付与)とTNFRSF4についての細胞内ドメイン(OX40)(配列は配列番号341によって付与)とに融合した抗CD28抗体TGN1412(配列は配列番号340によって付与)を含む抗CD28/OX40 ESR(配列は配列番号307によって付与)をコードするよう遺伝子を設計した。該遺伝子を、配列が配列番号115によって与えられたPGKプロモーターと、配列番号182を有するウサギグロビンポリアデニル化シグナル配列とに作動可能に連結した。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素(GAPDH)プロモーターとウシ成長ホルモン(BGH)ポリアデニル化シグナル配列とに作動可能に連結されたDasherGFPをコードする遺伝子を含むGFPレポーター(配列番号222の配列を有する)をさらに含んでいだ。2つのオープンリーディングフレームを、多様に転写するように構成した(2つのプロモーターは互いに隣接し、反対方向に転写された)。2つのオープンリーディングフレームには、片方の側からHS4インスレーター(配列番号92の配列を有する)が、もう片方の側からD4Z4インスレーター(配列番号88の配列を有する)が隣接していた。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、1つのインスレーターの遠位側に、標的配列5’-TTAA-3’を、直後に続く配列番号10のpiggyBac様トランスポゾン逆方向末端反復配列(これは配列番号6の実施形態である)を、直後に続く配列番号3を有する追加のトランスポゾン末端配列(これは、配列番号1と>95%同一である)をさらに含んでいた。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、もう1つのインスレーターの遠位側に、配列番号5の追加のトランスポゾン末端配列(配列番号4と>95%同一である)を、直後に続く配列番号11のpiggyBac様トランスポゾン逆方向末端反復配列(これは配列番号7の実施形態である)を、直後に続く標的配列5’-TTAA-3’をさらに含んでいた。
TNFRSF6(Fas)の細胞外ドメイン(配列は配列番号323によって付与)を含み、さらにTNFRSF6(Fas)の膜貫通ドメイン(配列は配列番号387によって付与)をさらに含み、TNFRSF9(4-1BB)の細胞内ドメイン(配列が配列番号344によって付与)をさらに含むESRをコードするように遺伝子を設計した。このESR(Fas/4-1BB)は、配列番号274の配列を含んでいた。アポトーシス阻害剤であるCasp7:Casp7-DNのドミナントネガティブ版(配列は配列番号262によって付与)をコードする第2の遺伝子も設計した。
表1.ヒトJurkat T細胞株におけるゼノパス属(Xenopus)およびカイコガ属(Bombyx)のpiggyBac様トランスポゾン
表
本発明は、以下の番号が付けられた実施形態を含む。
1. 免疫細胞内でのタンパク質の発現に有効な異種調節配列に作動可能に連結されたタンパク質をコードする核酸を含み、それにより前記免疫細胞の生存を増強する、免疫細胞生存増強遺伝子を含む、ポリヌクレオチド。
2. 前記免疫細胞生存増強遺伝子が、活性化突然変異を含む天然に存在するタンパク質をコードする、実施形態1に記載のポリヌクレオチド。
3. 前記免疫細胞生存増強遺伝子が、活性化突然変異を含むSTAT3、CD28、RhoA、PLCG、STAT5BまたはCCND1から選択されるタンパク質をコードする、実施形態1または2に記載のポリヌクレオチド。
4. 前記免疫細胞生存増強遺伝子がSTAT3をコードし、前記STAT3が以下の活性化突然変異、すなわち、F174S、H410R、S614R、E616K、G618R、Y640F、N647I、E652K、K658Y、K658R、K658N、K658M、K658R、K658H、K658N、D661YまたはD661Vのうちの1つ以上を含む、実施形態3に記載のポリヌクレオチド。
5. 前記免疫細胞生存増強遺伝子がCD28をコードし、前記CD28が以下の活性化突然変異、すなわち、D124E、D124V、T195IまたはT195Pのうちの1つ以上を含む、実施形態3に記載のポリヌクレオチド。
6. 前記免疫細胞生存増強遺伝子がRhoAをコードし、前記RhoAが以下の活性化突然変異、すなわち、G17VまたはK18Nのうちの1つ以上を含む、実施形態3に記載のポリヌクレオチド。
7. 前記免疫細胞生存増強遺伝子がPLCGをコードし、前記PLGCが以下の活性化突然変異、すなわち、S345F、S520FまたはR707Qのうちの1つを含む、実施形態3に記載のポリヌクレオチド。
8. 前記免疫細胞生存増強遺伝子がSTAT5Bをコードし、前記STAT5Bが以下の活性化突然変異、すなわち、N642H、T648S、S652Y、Y665FまたはP267Aのうちの1つ以上を含む、実施形態3に記載のポリヌクレオチド。
9. 前記免疫細胞生存増強遺伝子がCCND1をコードし、前記CCND1が以下の活性化突然変異、すなわち、E36G、E36Q、E36K、A39S、S41L、S41P、S41T、V42E、V42A、V42L、V42M、Y44S、Y44D、Y44C、Y44H、K46T、K46R、K46N、K46E、C47G、C47R、C47S、C47W、P199R、P199S、P199L、S201F、T285I、T285A、P286L、P286H、P286S、P286TまたはP286Aのうちの1つ以上を含む、実施形態3に記載のポリヌクレオチド。
10. 前記免疫細胞生存増強遺伝子が、天然に存在するヒトタンパク質をコードする、実施形態1に記載のポリヌクレオチド。
11. 前記免疫細胞生存増強遺伝子が、サバイビン、Bcl2、Bcl6またはBcl-XLから選択されるタンパク質をコードする、実施形態10に記載のポリヌクレオチド。
12. 前記免疫細胞生存増強遺伝子がアポトーシス阻害剤をコードする、実施形態1に記載のポリヌクレオチド。
13. 前記異種プロモーターが、EF1プロモーター、PGKプロモーター、GAPDHプロモーター、EEF2プロモーター、ユビキチンプロモーター、SV40プロモーターまたはHSVTKプロモーターから選択される、実施形態1~12のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
14. 前記異種プロモーターが配列番号94~154から選択される、実施形態1~12のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド。
15. 配列番号6および配列番号7、または配列番号14および配列暗号15、または配列番号18および配列番号19、または配列番号20および配列番号21、または配列番号26および配列番号27、または配列番号399および配列番号400から選択される1対の配列をさらに含む、実施形態1~14のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
16. そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含む免疫細胞の半減期が、そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含まない免疫細胞の半減期と比較して少なくとも25%長くなっている、実施形態1~15のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
17. そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含む免疫細胞の最長寿命が、そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含まない免疫細胞の最長寿命と比較して少なくとも25%長くなっている、実施形態1~16のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
18. そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含まない免疫細胞の倍加時間が、そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含む免疫細胞の倍加時間と比較して少なくとも25%長い、実施形態1~17のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
19. そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含む免疫細胞の増殖速度が、そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含まない免疫細胞の増殖速度と比較して少なくとも25%高くなっている、実施形態1~18のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
20. そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含むT細胞の抗原チャレンジの反復の際の生存が、そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含まない免疫細胞の生存と比較して少なくとも25%高くなっている、実施形態1~19のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
21. 実施形態1~20のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む、トランスポゾン。
22. 実施形態1~20のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを含む、レンチウイルスベクター。
23. 異種プロモーターに作動可能に連結された、アポトーシス阻害剤をコードするポリヌクレオチドを、免疫細胞内へと導入することを含む、改変された免疫細胞を作製するための方法。
24. 前記ポリヌクレオチドがトランスポゾン末端をさらに含み、かつ前記方法が、前記アポトーシス阻害剤をコードする前記ポリヌクレオチドが前記免疫細胞のゲノム内へと転位するように、対応するトランスポザーゼを前記免疫細胞内へと導入することをさらに含む、実施形態23に記載の方法。
25. 前記トランスポザーゼが、前記トランスポザーゼをコードする核酸として導入される、実施形態23または24に記載の方法。
26. 前記核酸がmRNAである、実施形態25に記載の方法。
27. 前記トランスポザーゼをコードする前記核酸が、前記免疫細胞において活性のあるプロモーターに作動可能に連結されている、実施形態24または25に記載の方法。
28. 前記トランスポゾンおよび前記トランスポザーゼが同じ時点で前記免疫細胞内へと導入される、実施形態24に記載の方法。
29. 前記トランスポゾンおよび前記トランスポザーゼが異なる時点で前記免疫細胞内へと導入される、実施形態24に記載の方法。
30. 前記免疫細胞がT細胞であり、前記方法が、抗原に結合することができる受容体をコードする遺伝子を前記免疫細胞内へと導入することをさらに含み、前記抗原をその表面に提示する標的細胞への前記受容体の結合が、前記T細胞に前記標的細胞を死滅させる、実施形態23~29のいずれ一つに記載の方法。
31. 前記アポトーシス阻害剤が、サバイビン、Bcl2、Bcl6、Bcl-XLまたはCasp3、Casp7、Casp8、Casp9もしくはCasp10のドミナントネガティブ突然変異体から選択される、実施形態23~29のいずれか一つに記載の方法。
32. 改変された免疫細胞を作製するための方法であって、前記方法が、STAT3、CD28、RhoA、PLCG、STAT5BまたはCCND1から選択されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを免疫細胞内へと導入することを含み、前記タンパク質が、異種プロモーターに作動可能に連結された活性化突然変異を含む、方法。
33. 改変された免疫細胞を作製するための方法であって、
a.阻害シグナルを免疫細胞に正常に伝達する受容体の細胞外ドメインに由来する配列
b.刺激シグナルを免疫細胞に伝達する受容体の細胞内ドメインの細胞内ドメインに由来する配列
c.膜貫通ドメイン
を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを免疫細胞内へと導入することを含み、
前記ポリペプチドがCD3ゼータ細胞内ドメインを含まない、方法。
34. 前記細胞外ドメインが、配列番号322~配列番号340から選択される配列を含む、実施形態33に記載の方法。
35. 前記細胞内ドメインが、配列番号341~配列番号364から選択される配列を含む、実施形態33または34に記載の方法。
36. 前記ポリペプチドが、配列番号274~配列番号318から選択される配列を含む、実施形態33に記載の方法。
37. そのゲノムが実施形態1~22いずれか一つに記載のポリヌクレオチドを含む、免疫細胞。
38. 前記免疫細胞の半減期が、そのゲノムが実施形態1に記載のポリヌクレオチドを含まない免疫細胞の半減期と比較して少なくとも25%長くなっている、実施形態37に記載の免疫細胞。
39. 前記免疫細胞の最長寿命が、そのゲノムが実施形態1に記載のポリヌクレオチドを含まない免疫細胞の最長寿命と比較して少なくとも25%長くなっている、実施形態37または38に記載の免疫細胞。
40. そのゲノムが実施形態1に記載のポリヌクレオチドを含まない免疫細胞の倍加時間が、そのゲノムが実施形態1に記載のポリヌクレオチドを含む免疫細胞の半減期と比較して少なくとも25%長くなっている、実施形態37~39のいずれか一つに記載の免疫細胞。
41. 前記免疫細胞の増殖速度が、そのゲノムが実施形態1に記載のポリヌクレオチドを含まない免疫細胞の増殖速度と比較して少なくとも25%高くなっている、実施形態37~40のいずれか一つに記載の免疫細胞。
42. そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含むT細胞の、抗原チャレンジの反復の際の生存が、そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含まない免疫細胞の生存と比較して少なくとも25%高くなっている、実施形態37~41のいずれか一つに記載の免疫細胞。
43. 前記免疫細胞がT細胞である、実施形態37~42のいずれか一つに記載の免疫細胞。
44. 前記免疫細胞がB細胞である、実施形態37~42のいずれか一つに記載の免疫細胞。
45. 前記免疫細胞がヒト細胞である、実施形態37~42のいずれか一つに記載の免疫細胞。
46. 前記免疫細胞が霊長類細胞、齧歯類細胞、ネコ細胞、イヌ細胞またはウマ細胞である、実施形態37~42のいずれか一つに記載の免疫細胞。
47. 前記免疫細胞生存増強遺伝子がシグナル伝達増強受容体(ESR)をコードし、前記ESRが
a.阻害シグナルを免疫細胞に正常に伝達する受容体の細胞外ドメインに由来する配列
b.刺激シグナルを免疫細胞に伝達する受容体の細胞内ドメインの細胞内ドメインに由来する配列
c.膜貫通ドメイン
を含み、かつ前記ESRがCD3ゼータ細胞内ドメインを含まない、実施形態1に記載のポリヌクレオチド。
48. 前記細胞外ドメイン(a)が、TNFRSF3(LTRβ)、TNFRSF6(Fas)、TNFRSF8(CD30)、TNFRSF10A(DR4)、TNFRSF10B(DR5)、TNFRSF19(TROY)、TNFRSF21(DR6)およびCTLA4から選択されるヒトタンパク質に由来する、実施形態47に記載のポリヌクレオチド。
49. 前記ESRが、配列番号322~340から選択される配列と少なくとも90%同一である配列を含む、実施形態47に記載のポリヌクレオチド。
50. 前記細胞内ドメイン(b)が、TNFRSF4(OX40)、TNFRSF5(CD40)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF9(4-1BB)、TNFRSF11A(RANK)、TNFRSF13B(TACI)、TNFRSF13C(BAFF-R)、TNFRSF14(HVEM)、TNFRSF17(CD269)、TNFRSF18(GITR)、CD28、CD28H(TMIGD2)、誘導性T細胞共刺激因子(ICOS/CD278)、DNAXアクセサリー分子1(DNAM-1/CD226)、シグナル伝達リンパ球活性化分子(SLAM/CD150)、T細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン(TIM-1/HAVcr-1)、インターフェロン受容体α鎖(IFNAR1)、インターフェロン受容体β鎖IFNAR2)、インターロイキン2受容体βサブユニット(IL2RB)、インターロイキン2受容体γサブユニット(IL2RG)、腫瘍壊死因子スーパーファミリー14(TNFSF14/LIGHT)、ナチュラルキラーグループ2メンバーD(NKG2D/CD314)およびCD40リガンド(CD40L)から選択されるヒトタンパク質に由来する、実施形態47~49のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド。
51. 前記ESRが、その配列が配列番号341~配列番号364から選択される配列と少なくとも90%同一であるポリペプチドを含む、実施形態47~50のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド。
52. 前記ESRが、その配列が配列番号365~配列番号396から選択される配列と少なくとも90%同一であるポリペプチドを含む、実施形態47~51のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド。
53. 前記ESRが、その配列が配列番号274~配列番号318から選択される配列と少なくとも90%同一であるポリペプチドを含む、実施形態45~52のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド。
54. 前記ポリヌクレオチドが異種プロモーターに作動可能に連結された、アポトーシス阻害剤をコードするセグメントをさらに含む、実施形態47~53のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド。
55. そのゲノムが実施形態47~54のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを含む、免疫細胞。
56. 前記免疫細胞ゲノムが、異種プロモーターに作動可能に連結された、アポトーシス阻害剤をコードするセグメントをさらに含む、実施形態55に記載の免疫細胞。
57. 改変された免疫細胞を作製するための方法であって、
a.実施形態47に記載のポリヌクレオチドを前記免疫細胞内へと導入すること
b.異種プロモーターに作動可能に連結された、アポトーシス阻害剤をコードするポリヌクレオチドを、前記免疫細胞内へと導入することを含む、方法。
58. 前記2つのポリヌクレオチドが同じ時点で前記免疫細胞内へと導入される、実施形態57に記載の方法。
59. 免疫細胞の生存を増強するタンパク質を同定する方法であって、
癌性免疫細胞由来のタンパク質をコードする核酸を配列決定して、突然変異を有するタンパク質をコードする核酸を同定することと、
前記突然変異を有するタンパク質をコードする核酸を用いて免疫細胞を形質転換することと、前記免疫細胞が生存を増強したかどうかを判定することとを含む、方法。
本明細書に引用された参考文献はすべて、あたかも各個々の公表物または特許もしくは特許出願がすべての目的のためにその全体が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているのと同程度に、その全体がすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。異なる内容が異なる時点での引用と関係している場合、本発明の優先日における引用と関係している内容を意味する。
Claims (59)
- 免疫細胞内でのタンパク質の発現に有効な異種調節配列に作動可能に連結されたタンパク質をコードする核酸を含み、それにより前記免疫細胞の生存を増強する、免疫細胞生存増強遺伝子を含む、ポリヌクレオチド。
- 前記免疫細胞生存増強遺伝子が、活性化突然変異を含む天然に存在するタンパク質をコードする、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 前記免疫細胞生存増強遺伝子が、活性化突然変異を含むSTAT3、CD28、RhoA、PLCG、STAT5BまたはCCND1から選択されるタンパク質をコードする、請求項2に記載のポリヌクレオチド。
- 前記免疫細胞生存増強遺伝子がSTAT3をコードし、前記STAT3が以下の活性化突然変異、すなわち、F174S、H410R、S614R、E616K、G618R、Y640F、N647I、E652K、K658Y、K658R、K658N、K658M、K658R、K658H、K658N、D661YまたはD661Vのうちの1つ以上を含む、請求項3に記載のポリヌクレオチド。
- 前記免疫細胞生存増強遺伝子がCD28をコードし、前記CD28が以下の活性化突然変異、すなわち、D124E、D124V、T195IまたはT195Pのうちの1つ以上を含む、請求項3に記載のポリヌクレオチド。
- 前記免疫細胞生存増強遺伝子がRhoAをコードし、前記RhoAが以下の活性化突然変異、すなわち、G17VまたはK18Nのうちの1つ以上を含む、請求項3に記載のポリヌクレオチド。
- 前記免疫細胞生存増強遺伝子がPLCGをコードし、前記PLGCが以下の活性化突然変異、すなわち、S345F、S520FまたはR707Qのうちの1つを含む、請求項3に記載のポリヌクレオチド。
- 前記免疫細胞生存増強遺伝子がSTAT5Bをコードし、前記STAT5Bが以下の活性化突然変異、すなわち、N642H、T648S、S652Y、Y665FまたはP267Aのうちの1つ以上を含む、請求項3に記載のポリヌクレオチド。
- 前記免疫細胞生存増強遺伝子がCCND1をコードし、前記CCND1が以下の活性化突然変異、すなわち、E36G、E36Q、E36K、A39S、S41L、S41P、S41T、V42E、V42A、V42L、V42M、Y44S、Y44D、Y44C、Y44H、K46T、K46R、K46N、K46E、C47G、C47R、C47S、C47W、P199R、P199S、P199L、S201F、T285I、T285A、P286L、P286H、P286S、P286TまたはP286Aのうちの1つ以上を含む、請求項3に記載のポリヌクレオチド。
- 前記免疫細胞生存増強遺伝子が、天然に存在するヒトタンパク質をコードする、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 前記免疫細胞生存増強遺伝子が、サバイビン、Bcl2、Bcl6またはBcl-XLから選択されるタンパク質をコードする、請求項10に記載のポリヌクレオチド。
- 前記免疫細胞生存増強遺伝子がアポトーシス阻害剤をコードする、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 前記異種プロモーターが、EF1プロモーター、PGKプロモーター、GAPDHプロモーター、EEF2プロモーター、ユビキチンプロモーター、SV40プロモーターまたはHSVTKプロモーターから選択される、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 前記異種プロモーターが配列番号94~154から選択される、請求項12に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号6および配列番号7、または配列番号14および配列暗号15、または配列番号18および配列番号19、または配列番号20および配列番号21、または配列番号26および配列番号27、または配列番号399および配列番号400から選択される1対の配列をさらに含む、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含む免疫細胞の半減期が、そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含まない免疫細胞の半減期と比較して少なくとも25%長くなっている、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含む免疫細胞の最長寿命が、そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含まない免疫細胞の最長寿命と比較して少なくとも25%長くなっている、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含まない免疫細胞の倍加時間が、そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含む免疫細胞の倍加時間と比較して少なくとも25%長い、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含む免疫細胞の増殖速度が、そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含まない免疫細胞の増殖速度と比較して少なくとも25%高くなっている、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含むT細胞の抗原チャレンジの反復の際の生存が、そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含まない免疫細胞の生存と比較して少なくとも25%高くなっている、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項1~20のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む、トランスポゾン。
- 請求項1~20のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、レンチウイルスベクター。
- 異種プロモーターに作動可能に連結された、アポトーシス阻害剤をコードするポリヌクレオチドを、免疫細胞内へと導入することを含む、改変された免疫細胞を作製するための方法。
- 前記ポリヌクレオチドがトランスポゾン末端をさらに含み、かつ前記方法が、前記アポトーシス阻害剤をコードする前記ポリヌクレオチドが前記免疫細胞のゲノム内へと転位するように、対応するトランスポザーゼを前記免疫細胞内へと導入することをさらに含む、請求項23に記載の方法。
- 前記トランスポザーゼが、前記トランスポザーゼをコードする核酸として導入される、請求項24に記載の方法。
- 前記核酸がmRNAである、請求項25に記載の方法。
- 前記トランスポザーゼをコードする前記核酸が、前記免疫細胞において活性のあるプロモーターに作動可能に連結されている、請求項25に記載の方法。
- 前記トランスポゾンおよび前記トランスポザーゼが同じ時点で前記免疫細胞内へと導入される、請求項24に記載の方法。
- 前記トランスポゾンおよび前記トランスポザーゼが異なる時点で前記免疫細胞内へと導入される、請求項24に記載の方法。
- 前記免疫細胞がT細胞であり、前記方法が、抗原に結合することができる受容体をコードする遺伝子を前記免疫細胞内へと導入することをさらに含み、前記抗原をその表面に提示する標的細胞への前記受容体の結合が、前記T細胞に前記標的細胞を死滅させる、請求項23に記載の方法。
- 前記アポトーシス阻害剤が、サバイビン、Bcl2、Bcl6、Bcl-XLまたはCasp3、Casp7、Casp8、Casp9もしくはCasp10のドミナントネガティブ突然変異体から選択される、請求項23に記載の方法。
- 改変された免疫細胞を作製するための方法であって、前記方法が、STAT3、CD28、RhoA、PLCG、STAT5BまたはCCND1から選択されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを免疫細胞内へと導入することを含み、前記タンパク質が、異種プロモーターに作動可能に連結された活性化突然変異を含む、方法。
- 改変された免疫細胞を作製するための方法であって、
a.阻害シグナルを免疫細胞に正常に伝達する受容体の細胞外ドメインに由来する配列
b.刺激シグナルを免疫細胞に伝達する受容体の細胞内ドメインの細胞内ドメインに由来する配列
c.膜貫通ドメイン
を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを免疫細胞内へと導入することを含み、
前記ポリペプチドがCD3ゼータ細胞内ドメインを含まない、方法。 - 前記細胞外ドメインが、配列番号322~配列番号340から選択される配列を含む、請求項33に記載の方法。
- 前記細胞内ドメインが、配列番号341~配列番号364から選択される配列を含む、請求項33に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、配列番号274~配列番号318から選択される配列を含む、請求項33に記載の方法。
- そのゲノムが請求項1に記載のポリヌクレオチドを含む、免疫細胞。
- 前記免疫細胞の半減期が、そのゲノムが請求項1に記載のポリヌクレオチドを含まない免疫細胞の半減期と比較して少なくとも25%長くなっている、請求項37に記載の免疫細胞。
- 前記免疫細胞の最長寿命が、そのゲノムが請求項1に記載のポリヌクレオチドを含まない免疫細胞の最長寿命と比較して少なくとも25%長くなっている、請求項37に記載の免疫細胞。
- そのゲノムが請求項1に記載のポリヌクレオチドを含まない免疫細胞の倍加時間が、そのゲノムが請求項1に記載のポリヌクレオチドを含む免疫細胞の半減期と比較して少なくとも25%長くなっている、請求項37に記載の免疫細胞。
- 前記免疫細胞の増殖速度が、そのゲノムが請求項1に記載のポリヌクレオチドを含まない免疫細胞の増殖速度と比較して少なくとも25%高くなっている、請求項37に記載の免疫細胞。
- そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含むT細胞の、抗原チャレンジの反復の際の生存が、そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含まない免疫細胞の生存と比較して少なくとも25%高くなっている、請求項37に記載の免疫細胞。
- 前記免疫細胞がT細胞である、請求項37に記載の免疫細胞。
- 前記免疫細胞がB細胞である、請求項37に記載の免疫細胞。
- 前記免疫細胞がヒト細胞である、請求項37に記載の免疫細胞。
- 前記免疫細胞が霊長類細胞、齧歯類細胞、ネコ細胞、イヌ細胞またはウマ細胞である、請求項37に記載の免疫細胞。
- 前記免疫細胞生存増強遺伝子がシグナル伝達増強受容体(ESR)をコードし、前記ESRが
a.阻害シグナルを免疫細胞に正常に伝達する受容体の細胞外ドメインに由来する配列
b.刺激シグナルを免疫細胞に伝達する受容体の細胞内ドメインの細胞内ドメインに由来する配列
c.膜貫通ドメイン
を含み、かつ前記ESRがCD3ゼータ細胞内ドメインを含まない、請求項1に記載のポリヌクレオチド。 - 前記細胞外ドメイン(a)が、TNFRSF3(LTRβ)、TNFRSF6(Fas)、TNFRSF8(CD30)、TNFRSF10A(DR4)、TNFRSF10B(DR5)、TNFRSF19(TROY)、TNFRSF21(DR6)およびCTLA4から選択されるヒトタンパク質に由来する、請求項47に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ESRが、配列番号322~340から選択される配列と少なくとも90%同一である配列を含む、請求項47に記載のポリヌクレオチド。
- 前記細胞内ドメイン(b)が、TNFRSF4(OX40)、TNFRSF5(CD40)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF9(4-1BB)、TNFRSF11A(RANK)、TNFRSF13B(TACI)、TNFRSF13C(BAFF-R)、TNFRSF14(HVEM)、TNFRSF17(CD269)、TNFRSF18(GITR)、CD28、CD28H(TMIGD2)、誘導性T細胞共刺激因子(ICOS/CD278)、DNAXアクセサリー分子1(DNAM-1/CD226)、シグナル伝達リンパ球活性化分子(SLAM/CD150)、T細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン(TIM-1/HAVcr-1)、インターフェロン受容体α鎖(IFNAR1)、インターフェロン受容体β鎖IFNAR2)、インターロイキン2受容体βサブユニット(IL2RB)、インターロイキン2受容体γサブユニット(IL2RG)、腫瘍壊死因子スーパーファミリー14(TNFSF14/LIGHT)、ナチュラルキラーグループ2メンバーD(NKG2D/CD314)およびCD40リガンド(CD40L)から選択されるヒトタンパク質に由来する、請求項47に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ESRが、その配列が配列番号341~配列番号364から選択される配列と少なくとも90%同一であるポリペプチドを含む、請求項47に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ESRが、その配列が配列番号365~配列番号396から選択される配列と少なくとも90%同一であるポリペプチドを含む、請求項47に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ESRが、その配列が配列番号274~配列番号318から選択される配列と少なくとも90%同一であるポリペプチドを含む、請求項45に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドが異種プロモーターに作動可能に連結された、アポトーシス阻害剤をコードするセグメントをさらに含む、請求項47に記載のポリヌクレオチド。
- そのゲノムが請求項47に記載のポリヌクレオチドを含む、免疫細胞。
- 前記免疫細胞ゲノムが、異種プロモーターに作動可能に連結された、アポトーシス阻害剤をコードするセグメントをさらに含む、請求項55に記載の免疫細胞。
- 改変された免疫細胞を作製するための方法であって、
a.請求項47に記載のポリヌクレオチドを前記免疫細胞内へと導入すること
b.異種プロモーターに作動可能に連結された、アポトーシス阻害剤をコードするポリヌクレオチドを、前記免疫細胞内へと導入することを含む、方法。 - 前記2つのポリヌクレオチドが同じ時点で前記免疫細胞内へと導入される、請求項57に記載の方法。
- 免疫細胞の生存を増強するタンパク質を同定する方法であって、
癌性免疫細胞由来のタンパク質をコードする核酸を配列決定して、突然変異を有するタンパク質をコードする核酸を同定することと、
前記突然変異を有するタンパク質をコードする核酸を用いて免疫細胞を形質転換することと、前記免疫細胞が生存を増強したかどうかを判定することとを含む、方法。
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