JP2023529443A - 抗ｃｄ１７１キメラ抗原受容体 - Google Patents

Abstract

本明細書で提供する方法および組成物の実施形態は、抗CD171キメラ抗原受容体（CAR）に関する。いくつかの実施形態は、長い細胞外ポリペプチドスペーサーを有する抗CD171 CARに関する。いくつかの実施形態は、このような抗CD171 CARを含む細胞であって、短いポリペプチドスペーサーを含む抗CD171 CARを含む細胞と比べて低用量で対象における持続性と活性が増強された細胞に関する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2020年6月8日に出願された「抗CD171キメラ抗原受容体」という名称の米国仮出願第63/036,021号の優先権を主張するものであり、この出願は引用によりその全体が本明細書に明示的に援用される。

配列表の参照
本願は電子形式の配列表とともに出願されたものである。この配列表は、SCRI283WOSEQLIST.TXTのファイル名で2021年6月4日に作成された約16kbのファイルとして提供されたものである。この電子形式の配列表に記載の情報は、引用によりその全体が本明細書に援用される。

本明細書で提供する方法および組成物の実施形態は、抗CD171キメラ抗原受容体（CAR）に関する。いくつかの実施形態は、長い細胞外ポリペプチドスペーサーを有する抗CD171 CARに関する。いくつかの実施形態は、このような抗CD171 CARを含む細胞であって、短いポリペプチドスペーサーを含む抗CD171 CARを含む細胞と比べて低用量で対象における持続性と活性が増強された細胞に関する。

神経芽腫は、小児期に最もよく見られる頭蓋外固形腫瘍であり、多様な臨床経過を呈する。神経芽腫は、治療的介入を行わなくても自然に退縮したり、分化したりするという有利な生物学的特徴を有する一方で、集学的な集中治療を行ったとしても進行して致命的となることも多いという不利な生物学特徴も有する。最大忍容量での集中的な一次化学療法、放射線療法、および自家造血幹細胞移植による地固め療法を行った後に、レチノイドと抗GD2抗体を投与することによって、ハイリスク患者の最大50%を治癒することができる。このような状況から、神経芽腫患者集団に忍容される新たな治療方法の開発が必要とされている。

本明細書で提供される方法および組成物の実施形態のいくつかは、キメラ抗原受容体（CAR）をコードするポリヌクレオチドを含む核酸であって、該CARが、
CD171に特異的に結合することができるか、CD171に特異的に結合するように構成されたリガンド結合ドメイン；
連続した120～230アミノ酸残基の長さを有するポリペプチドスペーサー；
膜貫通ドメイン；および
細胞内シグナル伝達ドメイン
を含むことを特徴とする核酸を含む。

いくつかの実施形態において、前記リガンド結合ドメインは、CE7モノクローナル抗体に由来するものである。

いくつかの実施形態において、前記リガンド結合ドメインは、配列番号1に示すヌクレオチド配列と少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むscFvを含む。

いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドスペーサーは、L235D置換を含むIgG4ヒンジ-CH2-CH3ドメインを含む。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドスペーサーは、配列番号2に示すアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、前記膜貫通ドメインは、CD28の膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、前記CD28の膜貫通ドメインは、配列番号4に示すアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2CおよびB7-H3からなる群から選択される共刺激ドメインと、CD3ζドメインまたはその機能性部分とを含む。いくつかの実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、CD28の細胞質内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、前記CD28の細胞質内ドメインは、配列番号18に示すアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、CD28の細胞質内ドメインを有していない。いくつかの実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、4-1BBの共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態において、前記4-1BBの共刺激ドメインは、配列番号7に示すヌクレオチド配列と少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記CD3ζドメインまたはその機能性部分は、配列番号8に示すヌクレオチド配列と少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。

いくつかの実施形態は、前記キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された構成的プロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記構成的プロモーターはEF1αプロモーターを含む。

いくつかの実施形態は、前記キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された誘導型プロモーターをさらに含む。

いくつかの実施形態は、細胞表面選択マーカーをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞表面選択マーカーは、切断型EGFRポリペプチド（EGFRt）および切断型Her2ポリペプチド（Her2t）から選択される。

いくつかの実施形態は、前記細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドと前記細胞表面選択マーカーをコードするポリヌクレオチドの間にリボソームスキップ配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記リボソームスキップ配列は、P2A配列、T2A配列、E2A配列およびF2A配列からなる群から選択される。

いくつかの実施形態は、自殺遺伝子システムをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子システムは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ／ガンシクロビル（HSVTK/GCV）自殺遺伝子システムおよび誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムから選択される。

いくつかの実施形態において、前記リガンド結合ドメインは、配列番号1に示すヌクレオチド配列を含み；前記ポリペプチドスペーサーは、配列番号2に示すアミノ酸配列からなり；前記膜貫通ドメインは、配列番号4に示すアミノ酸配列を含み；前記細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号7に示すヌクレオチド配列によってコードされる4-1BBの共刺激ドメインと、配列番号8に示すヌクレオチド配列によってコードされるCD3ζドメインまたはその機能性部分とを含み；前記核酸は、前記リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたEF1プロモーターと、T2Aリボソームスキップ配列を含むポリヌクレオチドと、EGFRtポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとをさらに含む。

本明細書で提供される方法および組成物の実施形態のいくつかは、前記核酸のいずれか１つによってコードされるポリペプチドを含む。

本明細書で提供される方法および組成物のいくつかの実施形態は、前記核酸のいずれか１つを含むベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、ウイルスベクター、トランスポゾンベクター、インテグラーゼベクターおよびmRNAベクターからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、フォーミーウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびガンマレトロウイルスベクターからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。

本明細書で提供される方法および組成物の実施形態のいくつかは、前記核酸のいずれか１つを含む宿主細胞を含む。

いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、CD4+Ｔ細胞またはCD8+Ｔ細胞である。

いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、前駆Ｔ細胞または造血幹細胞である。

いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、CD8+ナイーブＴ細胞、CD8+メモリーＴ細胞、CD8+セントラルメモリーＴ細胞、CD8+制御性Ｔ細胞、iPS細胞由来のCD8+Ｔ細胞、CD8+エフェクターメモリーＴ細胞およびCD8+バルクＴ細胞からなる群から選択されるCD8+細胞傷害性Ｔ細胞である。

いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、CD4+ナイーブＴ細胞、CD4+メモリーＴ細胞、CD4+セントラルメモリーＴ細胞、CD4+制御性Ｔ細胞、iPS細胞由来のCD4+Ｔ細胞、CD4+エフェクターメモリーＴ細胞およびCD4+バルクＴ細胞からなる群から選択されるCD4+ヘルパーＴ細胞である。

いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、対象と同種の細胞、好ましくはヒトである対象と同種の細胞であるか、または対象から得られた自家細胞、好ましくはヒトである対象から得られた自家細胞である。

本明細書で提供される方法および組成物の実施形態のいくつかは、前記宿主細胞のいずれか１つと、薬学的に許容される添加剤とを含む医薬組成物を含む。

本明細書で提供される方法および組成物の実施形態のいくつかは、対象においてがんを治療、抑制または緩和する方法であって、前記宿主細胞のいずれか１つを対象に投与することを含む方法を含む。

いくつかの実施形態において、前記対象に投与される前記宿主細胞の用量は、がんの治療、抑制または緩和に十分な用量であり、該用量は、連続した120アミノ酸残基未満の長さを有するポリペプチドスペーサーを含むCARを含む細胞の、がんの治療、抑制または緩和に十分な用量よりも少ない。

いくつかの実施形態において、前記対象に投与される前記宿主細胞の用量は5×10⁶個/kg未満である。

いくつかの実施形態は、前記対象にセツキシマブを投与することをさらに含む。

いくつかの実施形態において、前記がんはCD171発現細胞を含む。いくつかの実施形態において、前記がんは、神経芽腫および神経節芽腫から選択される。

本明細書で提供される方法および組成物の実施形態のいくつかは、対象におけるがんの治療、抑制または緩和に使用するための、前記宿主細胞のいずれか１つを含む。

本明細書で提供される方法および組成物のいくつかの実施形態は、対象におけるがんの治療用、抑制用または緩和用の医薬品の製造における、前記宿主細胞のいずれか１つの使用を含む。

本明細書で提供される方法および組成物の実施形態のいくつかは、医薬品として使用するための、前記宿主細胞のいずれか１つを含む。

短いスペーサーを有する第２世代抗CD171 CARをコードする核酸と短いスペーサーを有する第３世代抗CD171 CARをコードする核酸の構造の一例を示した模式図を示す。これらの核酸には、構成要素として、EF1プロモーター、シグナルポリペプチドをコードするリーダー配列、抗CD171 scFvのリガンド結合ドメインをコードするVH-リンカー-VLドメイン、IgG4ヒンジスペーサー（短いスペーサー）、CD28の膜貫通ドメイン（CD28tm）、4-1BBドメイン、CD3ζドメイン、T2Aリボソームスキップ配列、細胞表面選択マーカーとして機能してもよい切断型EGFR（tEGFR）ポリペプチドがコードされている。長いスペーサーを有する抗CD171 CARは、IgG4ヒンジドメインの代わりにIgG4ヒンジ-CH2-CH3ドメインを含む。

抗CD171 CARを含むエフェクター細胞とCD171+標的細胞または対照標的細胞とを様々な比率で共培養した際の特異的溶解率を示した一連の線グラフを示す。CARとして、短いスペーサーを有する第２世代抗CD171 CAR（CE7 2G short）；短いスペーサーを有する第３世代抗CD171 CAR（CE7 3G short）；長いスペーサーを有する第２世代抗CD171 CAR（CE7 2G long）；および長いスペーサーを有する第３世代抗CD171 CAR（CE7 3G long）を使用した。

抗CD171 CARを含む様々なエフェクターCD4+Ｔ細胞とCD171+標的細胞または対照標的細胞とを共培養した際のサイトカインの産生（IL-2、IFN-γおよびTNF-α）を示した一連のグラフを示す。CARとして、短いスペーサーを有する第２世代抗CD171 CAR（CE7 2GS）；短いスペーサーを有する第３世代抗CD171 CAR（CE7 3GS）；長いスペーサーを有する第２世代抗CD171 CAR（CE7 2GL）；および長いスペーサーを有する第３世代抗CD171 CAR（CE7 3GL）を使用した。

CARを含むエフェクター細胞で処置した頭蓋内神経芽腫異種移植片モデルのインビボ腫瘍細胞におけるシグナル（流束）の経時変化を示した線グラフを示す。CARとして、短いスペーサーを有する第２世代抗CD171 CAR（CE7 2GS）；短いスペーサーを有する第３世代抗CD171 CAR（CE7 3GS）；２つの置換を含む長いスペーサーを有する第２世代抗CD171 CAR（CE7 2GL、2mut）；２つの置換を含む長いスペーサーを有する第３世代抗CD171 CAR（CE7 3GL、2 mut）を使用した。

CARを含むエフェクター細胞で処置した神経芽腫異種移植片モデルの生存率を示した線グラフを示す。CARとして、短いスペーサーを有する第２世代抗CD171 CAR（CE7 2GS）；短いスペーサーを有する第３世代抗CD171 CAR（CE7 3GS）；２つの置換を含む長いスペーサーを有する第２世代抗CD171 CAR（CE7 2GL、2mut）；および２つの置換を含む長いスペーサーを有する第３世代抗CD171 CAR（CE7 3GL、2mut）を使用した。

本明細書で提供する方法および組成物の実施形態は、抗CD171キメラ抗原受容体（CAR）に関する。いくつかの実施形態は、長い細胞外ポリペプチドスペーサーを有する抗CD171 CARに関する。いくつかの実施形態は、このような抗CD171 CARを含む細胞であって、短いポリペプチドスペーサーを含む抗CD171 CARを含む細胞と比べて低用量で対象における持続性と活性が増強された細胞に関する。

再発性または難治性の神経芽腫の患者は、従来の化学療法に抵抗性を示す。このことから、研究者の間では、患者から直接得られたＴ細胞の使用が試みられている。このようなＴ細胞は、遺伝子組換えによりCARを発現させることができる。Ｔ細胞にCARを発現させることによって、神経芽腫患者の神経芽腫細胞の表面に発現されるタンパク質であるCD171をＴ細胞が認識することが可能となり、これによってＴ細胞が神経芽腫細胞を認識し、これを殺傷することが可能となる。

免疫療法は、化学療法や放射線療法に抵抗性を示す腫瘍細胞が感受性を示す免疫学的エフェクター機構を誘導することができることから興味深いアプローチである。CARを発現するＴ細胞は、HLA分子の発現とは無関係に腫瘍細胞と会合し、共刺激とCD3ζのシグナル伝達とが協働することによって活性化される。CE7と命名されたモノクローナル抗体は、腫瘍に発現されたヒトL1CAM（CD171）上のエピトープに結合する。このCE7モノクローナル抗体に由来するCE7 scFvをCARに組み込むことによって、腫瘍標的に対する指向性をＴ細胞に付与することができる（Hoefnagel CA., et al., (2001) Eur J Nucl Med 28:359-68）。一方、腫瘍に発現されたL1CAM上のCE7エピトープの選択性を担う分子原理は完全には解明されていないが、過去に報告されたいくつかの証拠から、この結合はグリコシル化に依存していることが示唆されている。また、いくつかの種類の固形腫瘍におけるCD171の発現は、腫瘍の進行や転移との相関性が認められていることから、CD171は、腫瘍の形成に一定の役割を果たしており、腫瘍細胞の分化、増殖、遊走および浸潤の制御に関与している。第１世代CE7-CARを発現する自家クローンCD8+細胞傷害性Ｔ細胞を使用した過去のパイロット臨床試験の報告において、標的に対する安全性が初めて評価された（Park J. et al., (2007) Mol Ther 15:825-33）。最大用量を10⁹個/m²として6人の神経芽腫患者を処置したところ、明らかなoff-tumor毒性は認められなかった。その一方で、Ｔ細胞の持続期間と持続の程度は限定的であった。短いスペーサーを有する細胞外ドメインと１つの細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン（4-1BB）を含むCE7-CAR（第２世代CAR）と、短いスペーサーを有する細胞外ドメインと２つの細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン（CD28および4-1BB）を含むCE7-CAR（第３世代CAR）が作製された。難治性または再発性の神経芽腫患者において、第２世代または第３世代のCE7-CAR Ｔ細胞の安全性、実施可能性および至適用量を決定するための第１相臨床試験が開始されている（ClinicalTrials.govのID番号：NCT02311621）。

本明細書で提供される方法および組成物の実施形態に有用な特定の態様は、米国特許公開第2018/0009891号、米国特許公開第2017/0267742号、米国特許公開第2017/0015746号、Kunkele A. et al., (2015) Cancer Immunol Res 3:368-379およびKunkele A., et al., (2017) Clin Cancer Res 23:466-477に開示されている（これらの文献はいずれも引用によりその全体が本明細書に明示的に援用される）。

用語の定義
別段の記載がない限り、本明細書で使用されている技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。

本明細書において、「a」または「an」は、１つまたは１つ以上を意味してもよい。

本明細書において、「約」は、測定値について述べる場合、特定の数値から±20%または±10%の変動を含むことを意味し、より好ましくは±5%の変動、さらにより好ましくは±1%の変動、さらにより好ましくは±0.1%の変動を含むことを意味する。

本明細書において、「核酸」または「核酸分子」という用語は、本明細書全体を参照すれば、一般的な通常の意味を有し、例えば、ポリヌクレオチドを指してもよく、例えば、デオキシリボ核酸（DNA）、リボ核酸（RNA）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により得られる断片、ならびにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用またはエキソヌクレアーゼ作用により得られる断片などが挙げられる。核酸分子は、天然のヌクレオチドモノマー（DNAやRNAなど）、天然のヌクレオチドの類似体（例えば、天然のヌクレオチドのエナンチオマー）、またはこれらの組み合わせから構成されていてもよい。修飾ヌクレオチドは、糖部分および／またはピリミジン塩基部分もしくはプリン塩基部分に修飾を有していてもよい。糖部分の修飾としては、例えば、ハロゲン、アルキル基、アミンまたはアジド基による１つ以上のヒドロキシル基の置換が挙げられ、糖部分はエーテル化またはエステル化されていてもよい。さらに、糖部分全体が、立体構造的に類似の構造や電子的に類似の構造と置換されていてもよく、このような構造として、例えば、アザ糖または炭素環式糖類似体が挙げられる。修飾塩基部分としては、アルキル化プリン、アルキル化ピリミジン、アシル化プリン、アシル化ピリミジン、およびその他の公知の複素環置換基が挙げられる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合またはこれと似た結合により連結することができる。ホスホジエステル結合と似た結合としては、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホロセレノエート結合、ホスホロジセレノエート結合、ホスホロアニロチオエート（phosphoroanilothioate）結合、ホスホロアニリデート（phosphoranilidate）結合、ホスホロアミデート結合などが挙げられる。「核酸分子」は、いわゆる「ペプチド核酸」も包含し、これは、ポリアミド主鎖に付加された天然の核酸塩基または修飾核酸塩基を含む。核酸は、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。いくつかの実施形態において、融合タンパク質をコードする核酸配列を提供する。いくつかの実施形態において、CD171に特異的なCAR をコードする核酸は、RNAまたはDNAである。

本明細書において、「コードする」という用語は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、例えば、遺伝子、cDNA、mRNAなどのポリヌクレオチド中の特定のヌクレオチド配列が、所定のアミノ酸配列などの別の巨大分子を合成するための鋳型として機能するという特性を含む。したがって、特定の遺伝子に対応するmRNAが転写および翻訳されて、細胞またはその他の生物系においてタンパク質が産生される場合、その遺伝子はこのタンパク質をコードする。

本明細書において、「キメラ抗原受容体（CAR）」という用語は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、例えば、疾患または障害に関連する分子に結合する抗体配列またはその他のタンパク質配列のリガンド結合ドメインを含む合成設計受容体が挙げられ、好ましくは、このようなリガンド結合ドメインが、スペーサードメインを介して、特定の細胞（例えば、Ｔ細胞など）の１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインまたはその他の受容体の１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、１つ以上の共刺激ドメイン）に連結された合成設計受容体が挙げられるが、これらに限定されない。キメラ受容体は、人工細胞受容体、人工Ｔ細胞受容体、キメラ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、キメラ免疫受容体またはCARと呼ぶこともできる。レトロウイルスベクターやレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターを使用してキメラ受容体のコード配列を細胞（好ましくはＴ細胞）に移入することによって、モノクローナル抗体またはその結合断片の特異性を細胞（好ましくはＴ細胞）に移植することができる。いくつかの例において、CARは、特定の細胞表面抗原を発現する標的細胞へＴ細胞を指向させるために設計された遺伝子組換えＴ細胞受容体であってもよい。養子細胞移入と呼ばれる方法によって、まず対象からＴ細胞を得た後、抗原に対して特異性を発揮することができる受容体を発現できるようにＴ細胞を遺伝子操作する。次に、このＴ細胞を患者に再導入する。再導入されたＴ細胞は抗原を認識し標的とすることができる。CARは、免疫受容体を発現する細胞に任意の特異性を移植することができる遺伝子組換え受容体でもある。研究者によっては、CARは、抗体または抗体断片（好ましくは抗体の抗原結合断片）、スペーサー、シグナル伝達ドメインおよび膜貫通領域を含むものであると理解されている。本明細書に記載のCARは、様々な構成要素すなわちドメイン（例えば、エピトープ結合領域（例えば、抗体断片、scFvまたはそれらの一部）、スペーサー、膜貫通ドメインおよび／またはシグナル伝達ドメインなど）が遺伝子組換えされており、これよって驚くべき効果が得られたことから、本明細書の開示を通して、CARの各構成要素はそれぞれ独立したエレメントとして明確に区別できることが多い。CARに含まれる様々な構成要素は様々なバリエーションを有することから、例えば、所望の結合親和性を得ることができ、例えば、特定のエピトープまたは抗原に対する結合親和性が増強される。

ベクターを使用してCARのコード配列をＴ細胞に移入することによって、モノクローナル抗体もしくはその結合断片またはscFvの特異性をＴ細胞に移植することができる。治療が必要な対象を治療するためにCARを使用する場合、養子細胞移入と呼ばれる技術が使用される。この技術では、治療対象からＴ細胞を採取し、得られたＴ細胞を遺伝子操作して、抗原に特異的なCARを発現させる。CARの発現により抗原の認識とそのターゲティングが可能になったＴ細胞を患者に再導入する。

いくつかの実施形態において、「膜貫通ドメイン」は、細胞膜の二重層を貫通する疎水性タンパク質領域であり、生体膜に埋め込まれるタンパク質を繋ぎ止める役割を果たす。膜貫通ドメインのトポロジーは、膜貫通型のαヘリックスであってもよいが、これに限定されない。本発明のキメラ抗原受容体（CAR）の実施形態のいくつかにおいて、このCARは、膜貫通ドメインをコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、この膜貫通ドメインは、CD28の膜貫通配列またはその断片を含み、このCD28の膜貫通配列またはその断片の長さは、10アミノ酸長、11アミノ酸長、12アミノ酸長、13アミノ酸長、14アミノ酸長、15アミノ酸長、16アミノ酸長、17アミノ酸長、18アミノ酸長、19アミノ酸長、20アミノ酸長、21アミノ酸長、22アミノ酸長、23アミノ酸長、24アミノ酸長、25アミノ酸長、26アミノ酸長、27アミノ酸長もしくは28アミノ酸長、またはこれらの長さのいずれか２つを上下限とする範囲内の長さである。いくつかの実施形態において、前記CD28の膜貫通配列またはその断片は、28アミノ酸長である。

いくつかの実施形態において、主要なシグナル伝達ドメインや共刺激ドメインなどのシグナル伝達ドメインとして、細胞内成分と相互作用することによって、シグナルを中継することができたり、シグナルを中継するように構成することができたり、シグナルの中継に関与することができたり、シグナルの中継に関与するように構成することが可能な、タンパク質または受容体タンパク質の細胞内ドメインまたは細胞質内ドメインが挙げられる。いくつかの態様において、このような相互作用は、エフェクター分子またはエフェクタータンパク質との特異的なタンパク質－タンパク質相互作用またはタンパク質－リガンド相互作用を介した細胞内ドメインによる情報伝達によって起こり、次いでシグナル伝達の連鎖反応が起こることによって、その目的地へとシグナルを送ることができる。いくつかの実施形態において、前記シグナル伝達ドメインは、１つ以上の共刺激ドメインを含む。いくつかの態様において、前記１つ以上の共刺激ドメインとして、例えば、TCR/CD3複合体のCD3ζ鎖などによって誘導される主要なシグナルに加えて、例えば、免疫応答、活性化、増殖、分化、サイトカインの分泌、細胞溶解活性、パーフォリン活性もしくはグランザイム活性またはこれらの任意の組み合わせなどのＴ細胞エフェクター応答などの応答を増強するシグナルをＴ細胞に提供するシグナル伝達部分が挙げられる。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインまたは共刺激ドメインとして、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、リンパ球機能関連抗原１（LFA-1）、CD2、CD7、LIGHT、NKG2CもしくはB7-H3の全体もしくはその一部、またはCD83に特異的に結合するリガンドの全体もしくはその一部、またはこれらの任意の組み合わせを挙げることができる。

本明細書において、「抗体」という用語は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、例えば、免疫系において細菌やウイルスなどの異物を特定し、それらを中和するために、形質細胞によって産生されるＹ字型の大きなタンパク質が挙げられる。抗体タンパク質は、４つのポリペプチド鎖、すなわち、ジスルフィド結合により連結された２本の同一の重鎖と２本の同一の軽鎖を含んでいてもよい。それぞれの重鎖および軽鎖は、免疫グロブリンドメインと呼ばれる構造ドメインから構成されている。免疫グロブリンドメインに含まれるアミノ酸の数は、約70個、約80個、約90個、約100個、約110個、約120個、約130個、約140個もしくは約150個であってもよく、またはこれらの数値のいずれか２つを上下限とする範囲内のアミノ酸数であってもよい。免疫グロブリンドメインは、その大きさや機能によって様々に分類される。いくつかの実施形態において、前記リガンド結合ドメインは、抗体もしくはその結合断片またはscFv、受容体のリガンドもしくはその変異体、ペプチド、および／またはポリペプチド性親和性分子もしくはポリペプチド性結合パートナーを含む。いくつかの実施形態において、前記リガンド結合ドメインは抗体断片であり、その結合部分であることが望ましい。いくつかの実施形態において、前記CARに含まれる前記抗体断片またはその結合部分は、Ｂ細胞上のリガンドに特異的である。いくつかの実施形態において、前記CARまたはTcRに含まれる前記抗体断片またはその結合部分は、特定のリガンドに特異的である。いくつかの実施形態において、前記CARに含まれる前記抗体断片またはその結合部分はCD171に特異的である。いくつかの実施形態において、前記リガンド結合ドメインは、一本鎖可変領域断片（scFV）などの、抗体断片またはその結合部分である。いくつかの実施形態において、前記CARに含まれる前記抗体断片またはその結合部分は、ヒト化抗体に由来する１つ以上のドメインまたはその結合部分を含む。

本明細書において、「一本鎖可変領域断片」すなわち「scFv」という用語は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、例えば、10～25個または約10～25個のアミノ酸からなる短いリンカーペプチドで連結された免疫グロブリンの重鎖可変領域（VH）と軽鎖可変領域（VL）からなる融合タンパク質が挙げられる。いくつかの実施形態において、CD171に特異的なscFvを含むCARが提供される。

リガンドの結合強度は、結合親和性とも呼ばれ、直接的な相互作用および解離作用によって決まる。リガンドは、「リガンド結合ドメイン」の結合を受けてもよい。「リガンド結合ドメイン」は、例えば、タンパク質上の特定のリガンドまたは特定のエピトープと結合可能な構造に見られる保存配列を指してもよい。リガンド結合ドメインまたはリガンド結合部分は、抗体もしくはその結合断片もしくはscFv、受容体のリガンドもしくはその変異体、ペプチド、および／またはポリペプチド性親和性分子もしくはポリペプチド性結合パートナーを含んでいてもよい。リガンド結合ドメインは、１つまたは複数のリガンドに特異的な特定のタンパク質ドメインやタンパク質上のエピトープであってもよいが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態は、スペーサーを含む。いくつかの実施形態において、このペプチドスペーサーは、1アミノ酸長以上または2アミノ酸長以上から15アミノ酸長以下である。いくつかの実施形態において、前記スペーサーはポリペプチド鎖である。いくつかの態様において、このポリペプチド鎖の長さは、例えば、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、55個、56個、57個、58個、59個、60個、61個、62個、63個、64個、65個、66個、67個、68個、69個、70個、71個、72個、73個、74個、75個、76個、77個、78個、79個、80個、81個、82個、83個、84個、85個、86個、87個、88個、89個、90個、91個、92個、93個、94個、95個、96個、97個、98個、99個、100個、101個、102個、103個、104個、105個、106個、107個、108個、109個、110個、111個、112個、113個、114個、115個、116個、117個、118個、119個、120個、121個、122個、123個、124個、125個、126個、127個、128個、129個、130個、131個、132個、133個、134個、135個、136個、137個、138個、139個、140個、141個、142個、143個、144個、145個、146個、147個、148個、149個、150個、151個、152個、153個、154個、155個、156個、157個、158個、159個、160個、161個、162個、163個、164個、165個、166個、167個、168個、169個、170個、171個、172個、173個、174個、175個、176個、177個、178個、179個、180個、181個、182個、183個、184個、185個、186個、187個、188個、189個、190個、191個、192個、193個、194個、195個、196個、197個、198個、199個、200個、201個、202個、203個、204個、205個、206個、207個、208個、209個、210個、211個、212個、213個、214個、215個、216個、217個、218個、219個、220個、221個、222個、223個、224個、225個、226個、227個、228個、229個、230個、231個、232個、233個、234個、235個、236個、237個、238個、239個もしくは240個の連続したアミノ酸で構成された長さであってもよく、またはこれらの長さのいずれか２つを上下限とする範囲内の長さであってもよい。キメラ抗原受容体（CAR）において、スペーサーは、例えば、20種のアミノ酸のうち任意のものを任意の順序で含むことによって、所望の長さのポリペプチド鎖を構成していてもよく、この20種のアミノ酸は、アルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンであることが好ましい。スペーサー配列は、前記キメラ抗原受容体においてscFV（またはリガンド結合ドメイン）と膜貫通ドメインの間に位置するリンカーであってもよい。いくつかの実施形態において、前記CARは、スペーサーをコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、このスペーサーは、3アミノ酸長、4アミノ酸長、5アミノ酸長、6アミノ酸長、7アミノ酸長、8アミノ酸長、9アミノ酸長、10アミノ酸長、11アミノ酸長、12アミノ酸長、13アミノ酸長、14アミノ酸長、15アミノ酸長、16アミノ酸長、17アミノ酸長、18アミノ酸長、19アミノ酸長、20アミノ酸長、21アミノ酸長、22アミノ酸長、23アミノ酸長、24アミノ酸長、25アミノ酸長、26アミノ酸長、27アミノ酸長、28アミノ酸長、29アミノ酸長、30アミノ酸長、31アミノ酸長、32アミノ酸長、33アミノ酸長、34アミノ酸長、35アミノ酸長、36アミノ酸長、37アミノ酸長、38アミノ酸長、39アミノ酸長、40アミノ酸長、41アミノ酸長、42アミノ酸長、43アミノ酸長、44アミノ酸長、45アミノ酸長、46アミノ酸長、47アミノ酸長、48アミノ酸長、49アミノ酸長、50アミノ酸長、51アミノ酸長、52アミノ酸長、53アミノ酸長、54アミノ酸長、55アミノ酸長、56アミノ酸長、57アミノ酸長、58アミノ酸長、59アミノ酸長、60アミノ酸長、61アミノ酸長、62アミノ酸長、63アミノ酸長、64アミノ酸長、65アミノ酸長、66アミノ酸長、67アミノ酸長、68アミノ酸長、69アミノ酸長、70アミノ酸長、71アミノ酸長、72アミノ酸長、73アミノ酸長、74アミノ酸長、75アミノ酸長、76アミノ酸長、77アミノ酸長、78アミノ酸長、79アミノ酸長、80アミノ酸長、81アミノ酸長、82アミノ酸長、83アミノ酸長、84アミノ酸長、85アミノ酸長、86アミノ酸長、87アミノ酸長、88アミノ酸長、89アミノ酸長、90アミノ酸長、91アミノ酸長、92アミノ酸長、93アミノ酸長、94アミノ酸長、95アミノ酸長、96アミノ酸長、97アミノ酸長、98アミノ酸長、99アミノ酸長、100アミノ酸長、101アミノ酸長、102アミノ酸長、103アミノ酸長、104アミノ酸長、105アミノ酸長、106アミノ酸長、107アミノ酸長、108アミノ酸長、109アミノ酸長、110アミノ酸長、111アミノ酸長、112アミノ酸長、113アミノ酸長、114アミノ酸長、115アミノ酸長、116アミノ酸長、117アミノ酸長、118アミノ酸長、119アミノ酸長、120アミノ酸長、121アミノ酸長、122アミノ酸長、123アミノ酸長、124アミノ酸長、125アミノ酸長、126アミノ酸長、127アミノ酸長、128アミノ酸長、129アミノ酸長、130アミノ酸長、131アミノ酸長、132アミノ酸長、133アミノ酸長、134アミノ酸長、135アミノ酸長、136アミノ酸長、137アミノ酸長、138アミノ酸長、139アミノ酸長、140アミノ酸長、141アミノ酸長、142アミノ酸長、143アミノ酸長、144アミノ酸長、145アミノ酸長、146アミノ酸長、147アミノ酸長、148アミノ酸長、149アミノ酸長、150アミノ酸長、151アミノ酸長、152アミノ酸長、153アミノ酸長、154アミノ酸長、155アミノ酸長、156アミノ酸長、157アミノ酸長、158アミノ酸長、159アミノ酸長、160アミノ酸長、161アミノ酸長、162アミノ酸長、163アミノ酸長、164アミノ酸長、165アミノ酸長、166アミノ酸長、167アミノ酸長、168アミノ酸長、169アミノ酸長、170アミノ酸長、171アミノ酸長、172アミノ酸長、173アミノ酸長、174アミノ酸長、175アミノ酸長、176アミノ酸長、177アミノ酸長、178アミノ酸長、179アミノ酸長、180アミノ酸長、181アミノ酸長、182アミノ酸長、183アミノ酸長、184アミノ酸長、185アミノ酸長、186アミノ酸長、187アミノ酸長、188アミノ酸長、189アミノ酸長、190アミノ酸長、191アミノ酸長、192アミノ酸長、193アミノ酸長、194アミノ酸長、195アミノ酸長、196アミノ酸長、197アミノ酸長、198アミノ酸長、199アミノ酸長、200アミノ酸長、201アミノ酸長、202アミノ酸長、203アミノ酸長、204アミノ酸長、205アミノ酸長、206アミノ酸長、207アミノ酸長、208アミノ酸長、209アミノ酸長、210アミノ酸長、211アミノ酸長、212アミノ酸長、213アミノ酸長、214アミノ酸長、215アミノ酸長、216アミノ酸長、217アミノ酸長、218アミノ酸長、219アミノ酸長、220アミノ酸長、221アミノ酸長、222アミノ酸長、223アミノ酸長、224アミノ酸長、225アミノ酸長、226アミノ酸長、227アミノ酸長、228アミノ酸長、229アミノ酸長、230アミノ酸長、231アミノ酸長、232アミノ酸長、233アミノ酸長、234アミノ酸長、235アミノ酸長、236アミノ酸長、237アミノ酸長、238アミノ酸長、239アミノ酸長もしくは240アミノ酸長の配列を含むか、またはこれらの長さのいずれか２つを上下限とする範囲内の長さの配列を含む。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、前記CARにおいてscFVと膜貫通領域の間に位置する。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、前記CARにおいてリガンド結合ドメインと膜貫通領域の間に位置する。

スペーサーは、所望の長さとなるようにカスタマイズ、選択または最適化してもよく、それによって標的細胞に対するscFvドメインの結合性を向上させたり調節したりすることにより細胞傷害性を高めてもよく、所望のレベルの細胞傷害性を得てもよい。いくつかの実施形態において、scFvドメインまたはリガンド結合ドメインと膜貫通ドメインの間に位置するリンカーまたはスペーサーの長さは、25～55アミノ酸長であってもよい（例えば、少なくとも25アミノ酸長、少なくとも26アミノ酸長、少なくとも27アミノ酸長、少なくとも28アミノ酸長、少なくとも29アミノ酸長、少なくとも30アミノ酸長、少なくとも31アミノ酸長、少なくとも32アミノ酸長、少なくとも33アミノ酸長、少なくとも34アミノ酸長、少なくとも35アミノ酸長、少なくとも36アミノ酸長、少なくとも37アミノ酸長、少なくとも38アミノ酸長、少なくとも39アミノ酸長、少なくとも40アミノ酸長、少なくとも41アミノ酸長、少なくとも42アミノ酸長、少なくとも43アミノ酸長、少なくとも44アミノ酸長、少なくとも45アミノ酸長、少なくとも46アミノ酸長、少なくとも47アミノ酸長、少なくとも48アミノ酸長、少なくとも49アミノ酸長、少なくとも50アミノ酸長、少なくとも51アミノ酸長、少なくとも52アミノ酸長、少なくとも53アミノ酸長、少なくとも54アミノ酸長もしくは少なくとも55アミノ酸長；25アミノ酸長、26アミノ酸長、27アミノ酸長、28アミノ酸長、29アミノ酸長、30アミノ酸長、31アミノ酸長、32アミノ酸長、33アミノ酸長、34アミノ酸長、35アミノ酸長、36アミノ酸長、37アミノ酸長、38アミノ酸長、39アミノ酸長、40アミノ酸長、41アミノ酸長、42アミノ酸長、43アミノ酸長、44アミノ酸長、45アミノ酸長、46アミノ酸長、47アミノ酸長、48アミノ酸長、49アミノ酸長、50アミノ酸長、51アミノ酸長、52アミノ酸長、53アミノ酸長、54アミノ酸長もしくは55アミノ酸長；またはこれらの長さのいずれか２つを上下限とする範囲内の長さであってもよい）。

いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、ヒト抗体のヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態において、前記スペーサーはIgG4のヒンジを含む。いくつかの実施形態において、前記IgG4ヒンジ領域は改変されたIgG4ヒンジである。

本明細書において、「非免疫原性スペーサー」は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、例えば、患者の免疫応答をほとんど誘導しないか、患者の免疫応答を全く誘導しないか、患者の免疫応答を弱めるか、患者の免疫応答を抑制するスペーサーが挙げられる。いくつかの実施形態において、前記CARは、対象（ヒトなど）の免疫応答を誘導しないスペーサーを含む。CARに対する免疫系の攻撃力を阻止または抑制するには、対象（ヒトなど）において、免疫応答を誘導しないスペーサー、免疫応答を抑制するスペーサー、免疫応答を弱めるスペーサーまたは免疫応答を低下させるスペーサーを使用することが重要である。

本明細書において、「リボソームスキップ配列」は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、例えば、翻訳中のリボソームにリボソームスキップ配列を「スキップ」させてペプチド結合の形成を妨げ、リボソームスキップ配列の直後の領域から翻訳させるという機能を有する配列が挙げられる。例えば、いくつかのウイルスはリボソームスキップ配列を有することから、単一の核酸から複数のタンパク質を連続して翻訳することができ、翻訳されたタンパク質はペプチド結合によって連結されずに別個のタンパク質として得られる。本明細書において、リボソームスキップ配列は「リンカー」配列として使用される。本明細書で提供する核酸の実施形態のいくつかにおいて、本発明の核酸は、キメラ抗原受容体をコードする配列とマーカータンパク質をコードする配列との間にリボソームスキップ配列を含むことから、キメラ抗原受容体とマーカータンパク質が、ペプチド結合によって連結されずに共発現される。いくつかの実施形態において、前記リボソームスキップ配列は、P2A配列、T2A配列、E2A配列またはF2A配列である。

本明細書において、「マーカー配列」は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、例えば、目的のタンパク質またはこのタンパク質を有する細胞の選択または追跡に使用されるタンパク質が挙げられる。本明細書に記載の実施形態において、フローサイトメトリーなどの実験において選択可能なマーカー配列を含んでいてもよい融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、前記マーカーは、切断型Her2（Her2t）ポリペプチドまたは切断型EGFR（EGFRt）を含む。

本明細書において、タンパク質を分泌させるための「シグナル配列」は、「シグナルペプチド」と呼んでもよい。シグナルペプチドは、分泌効率の向上を目的として使用することができ、いくつかの系では、シグナルペプチドがシグナル認識粒子（SRP）によって認識されて翻訳が中断し、シグナル配列がSRPによってSRP受容体へと導かれて分泌が起こる。本明細書で提供されるCARの実施形態のいくつかにおいて、このCARはシグナル配列をさらに含む。前記CARをコードする核酸の実施形態のいくつかにおいて、この核酸は、シグナル配列をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、このシグナル配列は、翻訳されたタンパク質を細胞膜へと導く役割を果たす。

本明細書において、「自殺遺伝子療法」、「自殺遺伝子」および「自殺遺伝子システム」は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、例えば、アポトーシスにより細胞を破壊する方法が挙げられ、この方法では、細胞にアポトーシスを起こして自殺させる自殺遺伝子が必要とされる。腫瘍環境の治療または改変のために遺伝子組換え免疫細胞の使用を必要とする患者の安全性への懸念から、有害事象を予防または軽減するための様々な戦略が開発されつつある。前処置工程として遺伝子組換え免疫細胞を対象に移植する際に見られうる有害作用としては、移入されたＴ細胞が血流にサイトカインを放出することによって起こる「サイトカインストーム（サイトカイン放出症候群）」が挙げられ、この疾患では生命に危険が及ぶほどの高熱や血圧の急降下を招く恐れがある。発熱などのサイトカインストームの徴候がある場合、過去の報告に従って、タモキシフェンを用いて自殺遺伝子システムを制御してもよい。

本明細書において、「ベクター」または「コンストラクト」は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、例えば、細胞に異種核酸を導入するために使用される核酸であって、様々な調節エレメントを含むことから、細胞において異種核酸を発現させることができる核酸が挙げられる。ベクターとしては、プラスミド、ミニサークル、酵母、ウイルスゲノム、レンチウイルスベクター、フォーミーウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、DNAであってもよく、RNA（例えばmRNA）であってもよい。

本明細書において、「トランスポゾン遺伝子カセット」またはトランスポゾンは、リコンビナーゼ認識部位（例えば、Sleeping Beautyトランスポゼース認識部位やまたはPiggyBacなど）に挟まれた遺伝子（一次転写産物の発現を誘導するプロモーター）を含む遺伝子エレメントを指す。トランスポゾン遺伝子カセットは、統合されたゲノム配列に組み込まれていてもよく、環状DNAとして遊離した状態で存在していてもよい。いくつかの実施形態において、トランスポゾン遺伝子カセットは、プロモーターとCARとシグナル配列をコードすることによって、産生されるタンパク質を細胞表面から分泌させることができる。

本明細書において、「インテグラーゼベクターシステム」は、標的ゲノムに特異的な付着部位を有するウイルスドナー核酸を組み込むという機能を有する。インテグラーゼを利用することによって、ウイルスDNAを宿主DNAに挿入することができる。

本明細書において、「Ｔ細胞」すなわち「Ｔリンパ球」は、どのような哺乳動物から得られたものであってもよいが、サルやヒトなどの霊長類、イヌ、ネコ、ウマなどの愛玩動物、またはヒツジ、ヤギ、ウシなどの家畜から得られたものであることが好ましい。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、レシピエント対象と同種の細胞（同種であるが別のドナーに由来するもの）である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は自家細胞である（ドナーとレシピエントは同じである）。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は同系の細胞である（ドナーとレシピエントは異なるが、一卵性双生児である）。

本明細書において、「前駆Ｔ細胞」は、胸腺へと遊走して、前駆Ｔ細胞となることができるリンパ球系前駆細胞を指し、前駆Ｔ細胞はＴ細胞受容体を発現しない。すべてのＴ細胞は、骨髄中の造血幹細胞に由来する。造血幹細胞由来の造血前駆細胞（リンパ球系前駆細胞）は、胸腺に定着して細胞分裂により拡大増殖し、未熟な胸腺細胞の大集団を作り出す。ごく初期の胸腺細胞はCD4もCD8も発現しないことから、ダブルネガティブ（CD4-CD8-）細胞に分類される。これらはその発達が進むにつれて、ダブルポジティブ胸腺細胞（CD4+CD8+）となり、最終的にシングルポジティブ（CD4+CD8-またはCD4-CD8+）胸腺細胞に成熟して、その後、胸腺から末梢組織に放出される。

本明細書において、「造血幹細胞」すなわち「HSC」は、骨髄系細胞に分化することができる前駆細胞であり、該骨髄系細胞としては、例えば、マクロファージ、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞および／またはリンパ系細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、NK細胞など）が挙げられる。HSCは３種の幹細胞を含む異種細胞集団であり、これら３種の幹細胞は血液中のリンパ系子孫細胞と骨髄系子孫細胞の割合（L/M）によって区別される。

本明細書において、「CD4+発現Ｔ細胞」および「CD4+Ｔ細胞」という用語は、本明細書を通して同じ意味で使用され、ヘルパーＴ細胞としても知られており、免疫系および獲得免疫系において重要な役割を果たしている。CD4+Ｔ細胞は、Ｔ細胞サイトカインを放出することにより他の免疫細胞の活性を補助する役割も果たす。CD4+Ｔ細胞は、免疫応答を補助し、抑制し、または調節する。CD4+Ｔ細胞は、Ｂ細胞抗体のクラススイッチ、細胞傷害性Ｔ細胞の活性化および増殖、ならびにマクロファージなどの食細胞の殺菌活性の最大化において不可欠である。CD4+発現Ｔ細胞は、数種類のサイトカインを産生する能力を有するが、CD4+Ｔ細胞により産生されるサイトカインの量は、移植適合性を向上または改善したり、移植適合性に寄与したり、移植適合性を誘導するような濃度ではない。本明細書において、「CD4+Ｔ細胞」は、獲得免疫系において一定の役割を果たす、成熟したヘルパーＴ細胞である。

本明細書において、「CD8+発現Ｔ細胞」および「CD8+Ｔ細胞」という用語は、本明細書を通して同じ意味で使用され、TC、細胞傷害性Ｔリンパ球、CTL、Ｔキラー細胞、細胞溶解性Ｔ細胞またはキラーＴ細胞としても知られている。本明細書で述べるように、CD8+Ｔ細胞は、がん細胞、ウイルス感染細胞、または損傷した細胞を殺傷することができるＴリンパ球である。CD8+Ｔ細胞は、特定の抗原を認識できるＴ細胞受容体（TCR）を発現する。CD8+Ｔ細胞は、細胞表面にCD8を発現する。CD8+発現Ｔ細胞は、数種類のサイトカインを産生する能力を有するが、CD8+Ｔ細胞により産生されるサイトカインの量は、移植適合性を向上または改善したり、移植適合性に寄与したり、移植適合性を誘導するような濃度ではない。「CD8 Ｔ細胞」または「キラーＴ細胞」は、がん細胞、ウイルス感染細胞、または損傷した細胞を殺傷することができるＴリンパ球である。

成熟Ｔ細胞は、表面タンパク質としてCD4を発現し、CD4+Ｔ細胞と呼ばれる。CD4+Ｔ細胞は、一般に、免疫系においてヘルパーＴ細胞としての役割を果たすことが運命づけられているものとして扱われる。例えば、抗原提示細胞がクラスII MHC上に抗原を発現する場合、CD4+細胞は細胞間相互作用（例えばCD40とCD40L）の組み合わせおよびサイトカインを介して抗原提示細胞を補助する。しかしながら、稀に例外があり、例えば、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、および細胞傷害性Ｔ細胞のサブグループもCD4を発現する。これらのCD4+発現Ｔ細胞群は、いずれもヘルパーＴ細胞とは見なされない。

本明細書において、「セントラルメモリー」Ｔ細胞（または「TCM」）は、抗原を経験したCTLであり、ナイーブ細胞と比較して、その表面上にCD62LまたはCCR-7とCD45ROを発現するが、CD45RAを発現していないか、CD45RAの発現が低下しているCTLを指す。いくつかの実施形態において、セントラルメモリー細胞は、ナイーブ細胞と比較して、CD62L、CCR7、CD28、CD127、CD45ROおよび／またはCD95の発現が陽性であるが、CD54RAの発現が低下している。

本明細書において、「エフェクターメモリー」Ｔ細胞（または「TEM」）は、抗原を経験したＴ細胞であり、セントラルメモリー細胞と比較して、その表面上にCD62Lを発現していないか、CD62Lの発現が低下しており、ナイーブ細胞と比較して、CD45RAを発現していないか、CD45RAの発現が低下しているＴ細胞を指す。いくつかの実施形態において、エフェクターメモリー細胞は、ナイーブ細胞またはセントラルメモリー細胞と比較して、CD62Lおよび／またはCCR7の発現が陰性であり、CD28および／またはCD45RAの発現が陽性または陰性である。

本明細書において、「ナイーブ」Ｔ細胞は、抗原を経験していないＴリンパ球であり、セントラルメモリー細胞またはエフェクターメモリー細胞と比較して、CD62Lおよび／もしくはCD45RAを発現しており、かつ／またはCD45ROを発現していないＴリンパ球を指す。いくつかの実施形態において、ナイーブCD8+Ｔリンパ球は、ナイーブＴ細胞の表現型マーカーの発現によって特徴付けられ、ナイーブＴ細胞の表現型マーカーとしては、CD62L、CCR7、CD28、CD127またはCD45RAが挙げられる。

本明細書において、「エフェクター」Ｔ細胞または「TE」Ｔ細胞は、抗原を経験した細胞傷害性Ｔリンパ球であり、セントラルメモリー細胞またはナイーブＴ細胞と比較して、CD62L、CCR7および／もしくはCD28を発現していないか、CD62L、CCR7、および／もしくはCD28の発現が低下しており、かつ／またはグランザイムＢもしくはパーフォリンまたはその両方が陽性のＴリンパ球を指す。

本明細書において、「移植適合性」は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、例えば、細胞が養子細胞移入により体内（例えば血流）に入った後に該細胞が成長および増殖する能力を含む。細胞の定着は、通常、移入後２～４週間以内に起こりうる。細胞の定着は、特定の細胞について血中細胞数を定期的に確認することによってモニタリングすることができる。いくつかの実施形態において、対象における疾患を治療、抑制または緩和する方法であって、本明細書に記載の遺伝子組換えＴ細胞を含む組成物または組み合わせ製品を投与することを含んでいてもよい方法が提供される。いくつかの実施形態において、前記方法は、キメラ抗原受容体を発現する遺伝子組換えＴ細胞の血球算定、例えば、移入した前記Ｔ細胞に関連するマーカーの有無の同定によって、前記対象をモニタリングすることをさらに含んでいてもよい。

本明細書において、「タンパク質」は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、例えば、１つ以上のポリペプチド鎖を含む巨大分子が挙げられる。したがって、タンパク質は複数のペプチドから構成されていてもよい。ペプチドとは、モノマーとしての１つ以上のアミノ酸がペプチド（アミド）結合によって連結されたアミノ酸鎖である。タンパク質またはペプチドは２つ以上のアミノ酸を含んでいてもよく、タンパク質配列またはペプチド配列に含まれるアミノ酸の最大数に特に制限はない。前記アミノ酸としては、例えば、アルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、シスチン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、ヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、ピロリシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、オルニチン、Ｓ－アデノシルメチオニンまたはセレノシステインが挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質は、例えば、糖鎖基などの非ペプチド成分をさらに含んでいてもよい。タンパク質への糖鎖やその他の非ペプチド性置換基の付加は、該タンパク質を産生する細胞によって行われてもよく、付加される糖鎖やその他の非ペプチド性置換基の種類は細胞の種類によって異なる。本明細書において、タンパク質は、そのアミノ酸主鎖の構造によって定義され、糖鎖基などの置換基は特に規定されないが、このような置換基がタンパク質に含まれていてもよい。いくつかの実施形態において、CAR Ｔ細胞は、サイトカイン、キメラサイトカイン受容体、キメラ共刺激分子、ドミナントネガティブ受容体、免疫賦活分子、免疫調節性分子などのタンパク質をさらに発現するように組換えられている。

本明細書において、「サイトカイン」は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、例えば、細胞のシグナル伝達において重要な役割を果たす小さいタンパク質（5～25kDa）が挙げられる。サイトカインは、細胞により放出され、他の細胞の挙動や、時にはサイトカインを放出した細胞自体（例えばＴ細胞など）の挙動に影響を及ぼす。サイトカインとしては、例えば、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカインもしくは腫瘍壊死因子またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。サイトカインは様々な細胞によって産生され、このような細胞としては、例えば、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、マスト細胞などの免疫細胞、ならびに内皮細胞、線維芽細胞、および様々な間質細胞が挙げられる。

本明細書において、「インターロイキン」すなわちILは、免疫系を大きく左右するサイトカインである。本発明で使用することができるインターロイキンの例として、例えば、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8/CXCL8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35もしくはIL-36またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。Ｔ細胞をインターロイキンと接触させることによって、Ｔ細胞の移植適合性が促進、補助、誘導または向上されるという効果が得られることがある。IL-1は、例えば、Ｔ細胞の成熱および増殖においてその機能を発揮することができる。IL-2は、例えば、Ｔ細胞応答の増殖および分化を刺激することができる。IL-3は、例えば、骨髄系前駆細胞の分化および増殖を促進することができる。IL-4は、例えば、増殖および分化を促進することができる。IL-7は、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞およびNK細胞の生存、発達およびホメオスタシスに関与するリンパ系前駆細胞の分化および増殖を促進することができる。IL-15は、例えば、ナチュラルキラー細胞の発生を誘導することができる。IL-21は、例えば、CD8+Ｔ細胞の活性化および増殖を共刺激し、NK細胞の細胞傷害性を増強し、CD40の誘導によるＢ細胞の増殖、分化およびアイソタイプスイッチを増強し、Th17細胞の分化を促進する。

本明細書において、「細胞を増殖させること」または「増殖」は、細胞を増殖、拡大、成長かつ複製させる工程を指す。例えば、CD8+Ｔ細胞またはCD4+Ｔ細胞の培養は、通常、Ｔリンパ球の成長および増殖に適した条件下で、CD8+Ｔ細胞またはCD4+Ｔ細胞をインキュベートすることによって行うことができる。キメラ抗原受容体を有する遺伝子組換えＴ細胞を作製する方法の実施形態のいくつかにおいて、前記CD4+発現Ｔ細胞を少なくとも1日増殖させるが、20日間増殖させてもよく、例えば、1日、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、15日間、16日間、17日間、18日間、19日間もしくは20日間、またはこれらの時点のいずれか２つを上下限とする範囲内の期間増殖させてもよい。また、キメラ抗原受容体を有する遺伝子組換えＴ細胞を作製する方法の実施形態のいくつかにおいて、前記CD8+発現Ｔ細胞を少なくとも1日増殖させるが、20日間増殖させてもよく、例えば、1日、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、15日間、16日間、17日間、18日間、19日間もしくは20日間、またはこれらの時点のいずれか２つを上下限とする範囲内の期間増殖させてもよい。

本明細書において、「親和性選択」は、特定の分子または目的の細胞の選択が可能な結合親和性薬剤と、この特定の分子もしくは細胞表面マーカーまたはこれらのエピトープとを結合させることによって、この特定の分子またはこの細胞表面マーカーを有する細胞を選択することを指す。親和性選択は、例えば、抗体、標識抗体、レクチン、アプタマーもしくはペプチドまたはこれらの任意の組み合わせを用いて行うことができる。遺伝子組換えＴ細胞の作製方法の実施形態のいくつかにおいて、Ｔ細胞の混合集団からのCD8+Ｔ細胞集団および／またはCD4+Ｔ細胞集団の分離工程は、CD8上および／またはCD4上に存在するエピトープを有するＴ細胞を親和性選択することによって行われる。前記方法のいくつかの実施形態において、抗CD8抗体もしくは抗CD4抗体またはその結合部分を使用して、目的の細胞を選択する。前記方法のいくつかの実施形態において、Ｔ細胞の混合集団からのCD8+Ｔ細胞集団および／またはCD4+Ｔ細胞集団の分離工程は、フローサイトメトリーによって行われる。前記方法のいくつかの実施形態において、Ｔ細胞の混合集団からのCD8+Ｔ細胞集団および／またはCD4+Ｔ細胞集団の分離工程は、免疫磁気選択によって行われる。前記方法のいくつかの実施形態において、抗CD8抗体もしくは抗CD4抗体またはその結合部分は、例えば、不活性ビーズまたは不活性粒子などの固体支持体に結合されている。

別の一実施形態において、拡大培養方法または増殖方法は、（例えば、少なくとも0.5ng/mlの濃度で）抗CD3抗体および／または抗CD28抗体を培養培地に加えることをさらに含んでいてもよい。別の一実施形態において、キメラ抗原受容体を有する遺伝子組換えＴ細胞の作製方法は、IL-2、IL-15もしくはIL-21またはこれらの任意の組み合わせを培養培地に添加することをさらに含んでいてもよい（例えば、IL-2の濃度は、少なくとも10単位/mlである）。別の一実施形態において、キメラ抗原受容体を有する遺伝子組換えＴ細胞の作製方法は、IL-7、IL-15もしくはIL-21またはこれらの任意の組み合わせを培養培地に添加することをさらに含んでいてもよい（例えば、IL-2の濃度は、少なくとも10単位/mlである）。拡大培養を行う前または拡大培養を行った後に、単離された細胞傷害性Ｔリンパ球およびヘルパーＴリンパ球をそれぞれナイーブＴ細胞亜集団、メモリーＴ細胞亜集団、およびエフェクターＴ細胞亜集団にソートすることができる。

いくつかの実施形態は、ポリペプチド配列またはその保存的バリアント配列（例えば、ポリペプチド配列が保存的置換された配列）を含む。いくつかの実施形態において、「保存的アミノ酸置換」は、機能的に同等なアミノ酸同士が置換されるアミノ酸置換を指す。保存的アミノ酸変化によって、得られるペプチドのアミノ酸配列において同義変化が起こる。例えば、同等の極性を有する１つ以上のアミノ酸は同等の機能を有し、得られるペプチドのアミノ酸配列において同義変化が起こる。特定の残基をより小さい残基で置換した場合に電荷が変わらない置換も、たとえこれらの残基が別々のグループに属していたとしても、「保存的置換」であると考えてもよい（例えば、フェニルアラニンからより小さいイソロイシンへの置換）。類似した側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは当技術分野において定義されている。保存的アミノ酸置換に含まれるいくつかのファミリーを表１に示す。

特定の核酸
本明細書で提供される方法および組成物の実施形態のいくつかは、キメラ抗原受容体（CAR）をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む。表２に、本明細書で提供する特定の実施形態に有用な配列を挙げる。図１は、CARをコードする核酸の代表的な実施形態を示す。いくつかの実施形態において、このCARは、CD171に特異的に結合することができるか、CD171に特異的に結合するように構成されたリガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、このリガンド結合ドメインは、CD171に特異的に結合する抗体に由来する相補性決定領域（CDR）を含む。いくつかの実施形態において、前記リガンド結合ドメインは、CD171に特異的に結合する抗体に由来するVHドメインおよび／またはVLドメインを含む。いくつかの実施形態において、前記リガンド結合ドメインは、CE7モノクローナル抗体に由来するものである（例えば、Schonmann SM, et al., (1986) Int J Cancer 1986;37:255-62を参照されたい；この文献は引用によりその全体が本明細書に明示的に援用される）。いくつかの実施形態において、前記リガンド結合ドメインは、配列番号1に示すヌクレオチド配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性、またはこれらの割合のいずれか２つを上下限とする範囲内の割合の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるscFvを含む。いくつかの実施形態において、前記リガンド結合ドメインは、配列番号1に示すヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを含むscFvを含むか、配列番号1に示すヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドからなるscFvを含む。

いくつかの実施形態において、前記CARはポリペプチドスペーサーを含む。いくつかの実施形態において、このポリペプチドスペーサーは、連続した120～230アミノ酸残基の長さを有する。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドスペーサーは、連続した229個のアミノ酸残基からなる。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドスペーサーは、IgG4ヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドスペーサーは、IgG4ヒンジ-CH2-CH3ドメインを含む。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドスペーサーは、IgG4ヒンジ-CH2-CH3ドメインを含み、このCH2ドメインはL235D置換を含む。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドスペーサーは、配列番号2に示すアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性、またはこれらの割合のいずれか２つを上下限とする範囲内の割合の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドスペーサーは、配列番号2に示すアミノ酸配列を含むか、配列番号2に示すアミノ酸配列からなる。

いくつかの実施形態において、前記リガンド結合ドメインのＣ末端は、20個以下、19個以下、18個以下、17個以下、16個以下、15個以下、14個以下、13個以下、12個以下、11個以下、10個以下、9個以下、8個以下、7個以下、6個以下、5個以下、4個以下、3個以下、2個以下、1個以下または0個のアミノ酸残基を介して、前記ポリペプチドスペーサーのＮ末端に連結されている。いくつかの実施形態において、前記リガンド結合ドメインのＣ末端は、ペプチド結合を介して前記ポリペプチドスペーサーのＮ末端に連結されており、該リガンド結合ドメインのＣ末端と該ポリペプチドスペーサーのＮ末端の間にアミノ酸残基は存在しない。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドスペーサーのＣ末端は、配列番号1に示すヌクレオチド配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性、またはこれらの割合のいずれか２つを上下限とする範囲内の割合の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列のＣ末端である。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドスペーサーのＮ末端は、配列番号2に示すアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性、またはこれらの割合のいずれか２つを上下限とする範囲内の割合の配列同一性を有するアミノ酸配列のＮ末端である。

いくつかの実施形態において、前記CARは膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、この膜貫通ドメインは、CD28の膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、前記CD28の膜貫通ドメインは、配列番号4に示すアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性、またはこれらの割合のいずれか２つを上下限とする範囲内の割合の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記CD28の膜貫通ドメインは、配列番号4に示すアミノ酸配列を含むか、配列番号4に示すアミノ酸配列からなる。

いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドスペーサーのＣ末端は、20個以下、19個以下、18個以下、17個以下、16個以下、15個以下、14個以下、13個以下、12個以下、11個以下、10個以下、9個以下、8個以下、7個以下、6個以下、5個以下、4個以下、3個以下、2個以下、1個以下または0個のアミノ酸残基を介して、前記膜貫通ドメインのＮ末端に連結されている。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドスペーサーのＣ末端は、ペプチド結合を介して前記膜貫通ドメインのＮ末端に連結されており、該ポリペプチドスペーサーのＣ末端と該膜貫通ドメインのＮ末端の間にアミノ酸残基は存在しない。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドスペーサーのＣ末端は、配列番号2に示すアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性、またはこれらの割合のいずれか２つを上下限とする範囲内の割合の配列同一性を有するアミノ酸配列のＣ末端である。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドスペーサーのＮ末端は、配列番号4に示すアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性、またはこれらの割合のいずれか２つを上下限とする範囲内の割合の配列同一性を有するアミノ酸配列のＮ末端である。

いくつかの実施形態において、前記CARは細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、この細胞内シグナル伝達ドメインは、CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2CおよびB7-H3からなる群から選択される共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ζドメインまたはその機能性部分をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、4-1BBの共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態において、前記4-1BBの共刺激ドメインは、配列番号7に示すヌクレオチド配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性、またはこれらの割合のいずれか２つを上下限とする範囲内の割合の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記4-1BBの共刺激ドメインは、配列番号7に示すヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記CD3ζドメインまたはその機能性部分は、配列番号8に示すヌクレオチド配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性、またはこれらの割合のいずれか２つを上下限とする範囲内の割合の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記CD3ζドメインまたはその機能性部分は、配列番号8に示すヌクレオチド配列によってコードされる配列を含むか、配列番号8に示すヌクレオチド配列によってコードされる配列からなる。

第３世代CARを含んでいてもよい実施形態のいくつかにおいて、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、CD28の細胞質内ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態において、このCD28の細胞質内ドメインは、配列番号6に示すアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性、またはこれらの割合のいずれか２つを上下限とする範囲内の割合の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記CD28の細胞質内ドメインは、配列番号6に示すアミノ酸配列を含むか、配列番号6に示すアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態において、前記CD28の細胞質内ドメインは、LL→GG置換を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記CD28の細胞質内ドメインは、配列番号18に示すアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性、またはこれらの割合のいずれか２つを上下限とする範囲内の割合の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記CD28の細胞質内ドメインは、配列番号18に示すアミノ酸配列を含むか、配列番号18に示すアミノ酸配列からなる。第２世代CARを含んでいてもよい実施形態のいくつかにおいて、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、CD28の細胞質内ドメインを有していない。

いくつかの実施形態は、前記キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された構成的プロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記構成的プロモーターは、EF1αプロモーターを含む。いくつかの実施形態は、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された誘導型プロモーターをさらに含む。

いくつかの実施形態は、細胞表面選択マーカーをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞表面選択マーカーは、切断型EGFRポリペプチド（EGFRt）および切断型Her2ポリペプチド（Her2t）から選択される。

いくつかの実施形態は、前記細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドと前記細胞表面選択マーカーをコードするポリヌクレオチドの間にリボソームスキップ配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記リボソームスキップ配列は、P2A配列、T2A配列、E2A配列およびF2A配列からなる群から選択される。

いくつかの実施形態は、自殺遺伝子システムをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子システムは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ／ガンシクロビル（HSVTK/GCV）自殺遺伝子システムおよび誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムから選択される。

本明細書で提供される方法および組成物のいくつかの実施形態は、本明細書に開示された抗CD171 CARをコードする核酸のいずれか１つ（例えば、前記核酸のいずれか１つ）を含むベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、ウイルスベクター、トランスポゾンベクター、インテグラーゼベクターおよびmRNAベクターからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、フォーミーウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびガンマレトロウイルスベクターからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。

本明細書で提供される方法および組成物の実施形態のいくつかは、本明細書に開示された核酸のいずれか１つによってコードされるポリペプチドを含む。表２に、本明細書で提供する特定の実施形態に有用な配列の一例を挙げる。

特定の細胞
本明細書で提供される方法および組成物の実施形態のいくつかは、本明細書で提供される核酸のいずれか１つを含む宿主細胞を含む。いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、CD4+Ｔ細胞またはCD8+Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、前駆Ｔ細胞または造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、CD8+ナイーブＴ細胞、CD8+メモリーＴ細胞、CD8+セントラルメモリーＴ細胞、CD8+制御性Ｔ細胞、iPS細胞由来のCD8+Ｔ細胞、CD8+エフェクターメモリーＴ細胞およびCD8+バルクＴ細胞からなる群から選択されるCD8+細胞傷害性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、CD4+ナイーブＴ細胞、CD4+メモリーＴ細胞、CD4+セントラルメモリーＴ細胞、CD4+制御性Ｔ細胞、iPS細胞由来のCD4+Ｔ細胞、CD4+エフェクターメモリーＴ細胞およびCD4+バルクＴ細胞からなる群から選択されるCD4+ヘルパーＴ細胞である。いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、対象と同種の細胞であり、ヒトである対象と同種の細胞であることが好ましく、別の実施形態では、前記宿主細胞は、対象から得られた自家細胞であり、ヒトである対象から得られた自家細胞であることが好ましい。

本明細書で提供される方法および組成物の実施形態のいくつかは、本明細書で提供される宿主細胞のいずれか１つと、薬学的に許容される添加剤とを含む医薬組成物を含む。

特定の治療方法
本明細書で提供される方法および組成物の実施形態のいくつかは、代替治療方法に関する。このような方法のいくつかは、対象（好ましくはヒト）においてがんを治療、抑制または緩和することを含み、このがんの治療、抑制または緩和は、本明細書で提供される宿主細胞のいずれか１つを該対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、前記対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態において、前記対象（好ましくはヒト）は、該対象が経験しているがんに特異的なCARを投与するために選択または特定された対象である。このような治療に応答性を示す対象または対象集団の選択または特定は、臨床的評価および／または診断的評価、例えば、前記対象の体内に存在するがん細胞上のCD171の有無またはその量の診断的評価を利用して、臨床医または医師によって行うことができる。

いくつかの実施形態において、前記対象に投与される前記宿主細胞の用量は、がんの治療、抑制または緩和に十分な用量であり、該用量は、連続した120アミノ酸残基未満の長さを有するポリペプチドスペーサーを含むCARを含む細胞の、がんの治療、抑制または緩和に十分な用量よりも少ない。

いくつかの実施形態において、前記対象に投与される前記宿主細胞の用量は、0個/kg以上から1×10⁶個/kg未満、2×10⁶個/kg未満、3×10⁶個/kg未満、4×10⁶個/kg未満、5×10⁶個/kg未満、6×10⁶個/kg未満、7×10⁶個/kg未満、8×10⁶個/kg未満または9×10⁶個/kg未満である。

いくつかの実施形態は、本明細書に開示された１つ以上の治療に加えて、セツキシマブを前記対象に投与することを含む。

いくつかの実施形態において、前記がんは、CD171発現細胞を含む。いくつかの実施形態において、前記がんは脳腫瘍を含む。いくつかの実施形態において、前記がんは、神経芽腫および神経節芽腫から選択される。別の実施形態は、医薬品としての、本明細書に記載の宿主細胞のいずれか１つ以上の使用を含み、該医薬品は、神経芽腫や神経節芽腫などのがんの治療用、抑制用または緩和用の医薬品であることが好ましい。

実施例１（比較例）－インビトロにおける抗CD171 CARの活性および異種移植片に対する抗CD171 CARの活性
米国特許公開第2018/0009891号とKunkele A. et al., (2015) Cancer Immunol Res 3:368-379に記載されている方法と実質的に同様にして、様々な抗CD171 CARを作製した（これらの文献はいずれも引用によりその全体が本明細書に明示的に援用される）。これらの抗CD171 CARには、短いスペーサー（IgG4ヒンジドメイン）、中程度の長さのスペーサー（IgG4ヒンジ-CH2ドメイン）または長いスペーサー（IgG4-CH2-CH3ドメイン）を有する第２世代CARが含まれていた。図１は、短いスペーサーを有する第２世代CARをコードする核酸と、短いスペーサーを有する第３世代抗CD171 CARをコードする核酸の代表的な構造の模式図を示す。この第２世代CARの細胞内シグナル伝達ドメインには、CD28の細胞質内ドメインは含まれていない。また、この第３世代CARの細胞内シグナル伝達ドメインには、CD28の膜貫通ドメインと4-1BBドメインの間にCD28の細胞質内ドメインが含まれていた。

インビトロでの研究およびインビボでの異種移植片を用いた研究を実施して、各世代のCARを含む細胞の活性を測定した。Kunkele A. et al., (2015) Cancer Immunol Res 3:368-379を参照されたい。簡潔に述べると、各世代のCARを含む細胞とCD171+Be2神経芽腫細胞をＥ：Ｔ比＝１：１で共培養したところ、長いスペーサーを有するCARは、中程度の長さのスペーサーや短いスペーサーを有するCARと比べて、高レベルのリン酸化ERKを誘導することが示された。また、各世代のCARを含む細胞とCD171+Be2神経芽腫細胞のＥ：Ｔ比＝１：１での共培養によって、長いスペーサーを有するCARは、中程度の長さのスペーサーや短いスペーサーを有するCARと比べて、高レベルのCD137の細胞表面発現を誘導することが示された。また、各世代のCARを含む細胞とCD171+Be2神経芽腫細胞のＥ：Ｔ比＝１：１での共培養によって、長いスペーサーを有するCARは、中程度の長さのスペーサーや短いスペーサーを有するCARと比べて、高レベルの特異的溶解を誘導することが示された。さらに、各世代のCARを含む細胞と腫瘍細胞を混合培養したところ、長いスペーサーを有するCARは、中程度の長さのスペーサーや短いスペーサーを有するCARと比べて、高レベルのサイトカイン分泌（IL-2、TNF-αおよびIFN-γ）を刺激することが示された。

しかしながら、長いスペーサーを有する抗CD171 CARは、中程度の長さのスペーサーや短いスペーサーを有するCARよりも、インビトロでの活性が大幅に低かった。簡潔に述べると、０日目に脳定位固定法によりffLuc+Be2腫瘍を移植したマウス頭蓋内神経芽腫異種移植片治療モデルを使用し、７日目にCARを投与した。長いスペーサーを有するCARを接触させた腫瘍では、腫瘍からのシグナルが増加し、マウスの生存率は、腫瘍を対照細胞に接触させた場合とほぼ同程度であった。一方、短いスペーサーや中程度の長さのスペーサーを有するCARを腫瘍に接触させると、マウスの生存率は、腫瘍を対照細胞に接触させた場合と比べて大幅に延長した。したがって、予想外にも、長いスペーサーを有するCARコンストラクトは、インビトロでは最も高い活性を誘導するにもかかわらず、インビボでの抗腫瘍作用は弱いことが示された。

実施例２－インビトロにおける抗CD171 CARの活性および異種移植片に対する抗CD171 CARの活性
二重変異体を有する長いスペーサーを含む第２世代抗CD171 CARおよび第３世代抗CD171 CARを作製した。この二重変異体を有する長いスペーサーは、IgG4-CH2-CH3ドメインを含み、CH2ドメインにL235D置換とN257Q置換を含んでいた（配列番号18）。L235D置換は、ヒトFcγR1への結合を低減または消失させ、N257Q置換は、マウスFcγR1への結合を低減または消失させるものであった。

インビトロでの研究およびインビボでの異種移植片を用いた研究を実施して、短いスペーサーを有する第２世代CAR、短いスペーサーを有する第３世代CAR、二重変異体を含む長いスペーサーを有する第２世代CAR、および二重変異体を含む長いスペーサーを有する第３世代CARの活性を比較した。簡潔に述べると、インビトロにおいて、各CARを含む細胞と対照細胞またはCD171+標的細胞とを様々な比率で共培養し、標的細胞の特異的な溶解を測定した（図２）。各CARによるCD171+標的Be2細胞の特異的な溶解が観察され、長いスペーサーを有するCARは、短いスペーサーを有するCARよりもある程度高い活性を有することが示された。さらに、インビトロにおいて、各CARを含む細胞と対照細胞またはCD171+標的細胞とを共培養し、刺激されたサイトカインを測定した（図３）。CARによってサイトカイン刺激が誘導され、長いスペーサーを有するCARは、短いスペーサーを有するCARよりもある程度高い活性を有することが示された。

０日目に脳定位固定法によりffLuc+Be2腫瘍を移植したマウス頭蓋内神経芽腫異種移植片治療インビボモデルを使用し、７日目にCARを投与した。長いスペーサーを有する第３世代CARと短いスペーサーを有する第３世代CARのいずれでも、腫瘍の根絶が確認され（図４）、生存率の延長が認められた（図５）。短いスペーサーを有する第２世代CARと長いスペーサーを有する第２世代CARでも、腫瘍の根絶が確認されたが、より早い段階で死亡に至った（図４および図５）。

実施例３－注入用CARの作製
米国特許公開第2018/0009891号に記載されている方法と実質的に同様にして、様々な抗CD171 CARを作製した（この文献は引用によりその全体が本明細書に明示的に援用される）。作製したCARには、短いスペーサーを含む第２世代抗CD171 CAR；長いスペーサーを含む第２世代抗CD171 CAR；および短いスペーサーを含む第３世代抗CD171 CARが含まれていた。短いスペーサーには、IgG4ヒンジドメインが含まれていた。長いスペーサーには、IgG4ヒンジ-CH2-CH3ドメインが含まれ、このCH2ドメインにはL235D置換が含まれていた（配列番号2）。L235D置換は、FcγR1への結合を低減または消失させるものであった。

実施例４－注入用CAR Ｔ細胞の作製
Kunkele A., et al., (2017) Clin Cancer Res 23:466-477に記載されている方法と実質的に同様にして、対象からCAR Ｔ細胞を作製した（この文献は引用によりその全体が本明細書に明示的に援用される）。簡潔に述べると、標準的なアフェレーシスを実施して、対象から約5×10⁹個のPBMCを回収した。CD4磁気ビーズとCD8磁気ビーズを使用して、CD4+Ｔ細胞集団とCD8+Ｔ細胞集団を単離した後、抗CD3/CD28ビーズ（ライフテクノロジーズ）で刺激し、放射線照射・熱非働化処理済みの10% defined FBS（GE Hyclone）とIL15（0.5ng/mL）とIL2（50U/mL）（CD8+細胞用）またはIL7（5ng/mL）（CD4+細胞用）とを添加したX-Vivo培地（ロンザ）中で培養した。１日目に、1mg/mL硫酸プロタミン（APP Pharmaceuticals）を添加したレンチウイルス上清［感染多重度（MOI）＝約0.1］を加えて32℃、800×gで30分間遠心分離することによって、CE7 CARレンチウイルスベクターによる形質導入を行った。残っていた刺激ビーズを培養物から除去し、CTS磁気システム（ライフテクノロジーズ）を使用して処理を行い、凍結保存した。細胞を拡大培養し、注入予定日までCryoStor CS-5培地（シグマ）中で凍結保存した。

実施例５－第Ｉ相臨床試験
治験実施計画
レンチウイルスを用いた形質導入によりCD171に特異的なキメラ抗原受容体を発現させた自家Ｔ細胞を使用した再発性／難治性神経芽腫の細胞免疫療法の実施可能性と安全性を確認するため、第１相臨床試験を開始した。

対象者の選択基準：
組織学的検証および／または骨髄中の腫瘍細胞の検出と、カテコールアミン値の上昇から、神経芽腫または神経節芽腫であると過去に診断を受けている。26歳以下の男性または女性の対象者である。初回診断時に高リスクの神経芽腫であると診断を受けているか、初回診断時に高リスクであるという診断を受けていない場合は、18ヶ月齢を超えた時点で転移性進行の証拠が認められている必要がある。測定可能または評価可能な疾患を有する。ランスキーまたはカルノフスキーのパフォーマンスステータスが50以上である。平均余命が８週間以上である。本試験への登録前に、過去に行ったすべての化学療法、免疫療法または放射線療法の顕著な急性毒性から回復している。最後に行った化学療法または生物学的療法から７日間以上経過している。本試験への登録から７日間以内に、（生理学的置換投与以外の）副腎皮質ホルモンの全身投与を行っていない。抗腫瘍性抗体療法の最後の投与から３半減期以上または30日以上（登録時から短い方）経過している。骨髄破壊的治療および自家幹細胞移植から（幹細胞の注入時から数えて）６週間以上経過している。非骨髄破壊的治療を行った後に幹細胞の注入を受けており、その他の適合条件をすべて満たした患者であれば適格であり、過去に同種造血幹細胞の移植を受けたことのない患者でなければならない。過去に受けた遺伝子組換え細胞療法が検出されないか、過去にウイルス療法を受けていない。試験登録時に外照射療法を受けていない。過去に受けたI131 MIBG治療から12週間以上経過している。試験の参加に十分な臓器機能を有する。試験の参加に適切な臨床検査値を有する。登録前の３ヶ月以内に、HIV抗原、HIV抗体、Ｂ型肝炎表面抗原およびＣ型肝炎抗体が陰性であり、Ｃ型肝炎抗体が陽性の患者の場合は、PCR検査が陰性であること書面で証明することにより適格であることを示さなければならない。

対象者の除外基準：
関連する中枢神経系病変（抗てんかん薬の継続投与を必要とする非熱性痙攣障害、不全麻痺、失語症、脳血管虚血／出血、重症脳外傷、認知症、小脳疾患、器質脳症候群、精神病、協調運動障害または運動障害）の既往歴または現病歴があり、中枢神経系・頭蓋内腫瘍を有している可能性のある患者である。妊娠中または授乳中である。必要に応じてアフェレーシス用カテーテルの一時的な留置を含むアフェレーシス処置に対する忍容性がない。神経芽腫以外の活発な悪性腫瘍が存在する。既知の頭蓋内転移性神経芽腫が存在する。ただし、軟部組織浸潤を認める頭蓋骨疾患は適格とする。活発な重度感染症が存在する。研究実施責任者の見解において、患者が治験実施計画に基づいた治療を受けるのに際して妨げとなる何らかの合併症が存在する。原発性免疫不全症／骨髄不全症候群が存在する。試験への登録時にその他の抗がん剤または放射線療法を受けている。試験への参加およびその後の15年間のフォローアップに対する同意／賛同を得ることが難しいか、そのような同意／賛同が得られない。

使用した治験実施計画は、実質的に以下に記載のとおりであった。適合条件を満たした対象者を試験に登録する際に、アフェレーシスを実施してCD171 CAR+Ｔ細胞作製用にＴ細胞を採取した。得られたアフェレーシス製剤からＴ細胞を単離し、CD4 Ｔ細胞およびCD8 Ｔ細胞を選択して別々に増殖させた後、レンチウイルスによる形質導入を行い、シグナル伝達能を持たない切断型EGFR（EGFRt）とCD171 CARを発現させ、４～６週間拡大培養した。CAR+Ｔ細胞を作製した後、対象者の疾患の評価を行い、リンパ球除去療法が必要であるかどうかを判断した。リンパ球除去を行ってから少なくとも48時間経過後に、CD4 CAR+Ｔ細胞とCD8 CAR+Ｔ細胞の比率をほぼ１：１としたCAR+Ｔ細胞を対象者に注入した。対象者の一部には、この遺伝子組換えＴ細胞を除去するため、セツキシマブをさらに投与した。セツキシマブの投与基準は、生命に危険が及ぶ急性毒性が認められた場合、および注入した遺伝子組換えＴ細胞に起因するリンパ球増殖性疾患が認められた場合とした。主要アウトカム評価項目には用量制限毒性（DLT）が含まれ、28日目まで患者におけるDLTの発生を評価した。副次アウトカム評価項目には腫瘍応答が含まれ、改訂版国際神経芽細胞腫応答基準に従って42日間にわたり患者を評価した。

この臨床試験では、Ａ群、Ｂ群およびＣ群の３つの試験群を設定した。試験群Ａは、短いスペーサーを有する第２世代CE7R CAR Ｔ細胞を使用することを含んでいた。使用した治験実施計画は、実質的に以下に記載のとおりであった。CD4自家細胞およびCD8自家細胞をレンチウイルスで形質導入して、患者由来のCD171特異的CAR Ｔ細胞を作製した。このCAR Ｔ細胞は、EGFRtも発現するものであった。リンパ球除去化学療法を患者に行ってから、形質導入により4-1BB:ζを有するCD171 CARとEGFRtを発現させた自家Ｔ細胞を静脈内注入した。CD171特異的CAR Ｔ細胞の投与は、リンパ球除去化学療法の約２～３日後に行った。このCAR Ｔ細胞の投与は、CD4細胞とCD8細胞の比率を約１：１として行い、Ｔ細胞の総用量を、1×10⁶個/kg（用量１）、5×10⁶個/kg（用量２）、1×10⁷個/kg（用量３）、5×10⁷個/kg（用量４）または1×10⁸個/kg（用量５）として用量レベルの評価を行った。

試験群Ｂは、短いスペーサーを有する第３世代CE7R CAR Ｔ細胞を使用することを含んでいた。使用した治験実施計画は、実質的に以下に記載のとおりであった。CD4自家細胞およびCD8自家細胞をレンチウイルスで形質導入して、患者由来のCD171特異的CAR Ｔ細胞を作製した。このCAR Ｔ細胞は、EGFRtも発現するものであった。リンパ球除去化学療法を患者に行ってから、形質導入によりCD28:4-1BB:ζを有するCD171 CARとEGFRtを発現させた自家Ｔ細胞を静脈内注入した。CD171特異的CAR Ｔ細胞の投与は、リンパ球除去化学療法の約２～３日後に行った。このCAR Ｔ細胞の投与は、CD4細胞とCD8細胞の比率を約１：１として行い、Ｔ細胞の総用量を、1×10⁶個/kg（用量１）、5×10⁶個/kg（用量２）、1×10⁷個/kg（用量３）、5×10⁷個/kg（用量４）または1×10⁸個/kg（用量５）として用量レベルの評価を行った。

試験群Ｃは、長いスペーサーを有する第２世代CE7R CAR Ｔ細胞を使用することを含んでいた。使用した治験実施計画は、実質的に以下に記載のとおりであった。CD4自家細胞およびCD8自家細胞をレンチウイルスで形質導入して、患者由来のCD171特異的CAR Ｔ細胞を作製した。このCAR Ｔ細胞は、EGFRtも発現するものであった。リンパ球除去化学療法を患者に行ってから、形質導入により4-1BB:ζを有するCD171 CARとEGFRtを発現させた自家Ｔ細胞を静脈内注入した。CD171特異的CAR Ｔ細胞の投与は、リンパ球除去化学療法の約２～３日後に行った。このCAR Ｔ細胞の投与は、CD4細胞とCD8細胞の比率を約１：１として行い、Ｔ細胞の総用量を、1×10⁶個/kg（用量１）、5×10⁶個/kg（用量２）、1×10⁷個/kg（用量３）、5×10⁷個/kg（用量４）または1×10⁸個/kg（用量５）として用量レベルの評価を行った。

結果
本試験では28人の対象者を登録した。19人の対象者にCAR Ｔ細胞を注入し、そのうちの２人に２回目の注入を行った。また、家族の要望、疾患の進行、Ｔ細胞の注入に対する不適合性またはCAR Ｔ細胞作製不能という理由から、CAR Ｔ細胞の注入を行う前に、６人の対象者が治験実施計画に基づいた治療から離脱した。３人の対象者は臨床的に安定であり、Ｔ細胞の注入の継続に向けて、疾患の進行の徴候／症状を観察するために待機中である。

用量レベル３で処置したＢ群の対象者と、用量レベル５で処置したＡ群の対象者において、グレード２の斑状丘疹状発疹とグレード３～４の低ナトリウム血症が観察された。用量レベル５で処置したＡ群の対象者は、用量制限毒性の基準と、過去に報告されている「ｋ目並べ」に従った増減により用量を増量する統計的デザインの再開基準とに合致していた。そこで、治験実施計画を変更して、CAR Ｔ細胞の注入後に、血清電解質と尿中電解質の評価を追加した。次の用量の割り付けでは、治験実施計画の統計的デザインに従って、Ａ群に用量レベル４を割り付け、Ｂ群に用量レベル２を割り付けて試験を再開した。Ａ群とＢ群に対して「ｋ目並べ」に従った統計的デザインを再開するにあたり、11人の患者を登録し、Ａ群とＢ群で計６人の患者にＴ細胞を注入した。その内訳は、Ａ群への用量レベル４の投与（２人の対象者）、Ｂ群への用量レベル２の投与（３人の対象者）、Ｂ群への用量レベル３の投与（１人の対象者）とした。Ｃ群は、単一患者における用量増量デザインフェーズで対象者を募集し、１人の対象者を用量レベル１で処置したところ、DLTは認められなかった。Ｂ群において３人の患者を用量レベル２で処置したところ、Ｂ群の用量レベル３に再度増量させる基準が満たされたため、さらに１人の患者を追加して処置したところ、DLTは認められなかったことには注目されたい。

Ｔ細胞に関連する毒性には、サイトカイン放出症候群、発疹および低ナトリウム血症が含まれる。19人の対象者のうち10人が、Ｔ細胞の注入後にグレード１～２の発疹を発症し、その内訳は、Ｂ群の用量レベル２では４人の対象者全員（対象者：S14、S18、S20およびS21）；Ｂ群の用量レベル３では２人の対象者全員（対象者：S15、S23）；Ａ群の用量レベル４では４人のうち３人の対象者（対象者：S11、S22、S25）；および対象者１人からなるＡ群の用量レベル５では当該対象者（対象者：S16）であった。また、10人のうち８人の対象者において、血液中でのＴ細胞の持続性が証明され、それとともに発疹が認められた。対象者S15と対象者S22に対して皮膚生検を行ったところ、いずれの対象者でも、表皮真皮接合部にEGFRt+Ｔ細胞の浸潤とCD171陽性細胞の局在が示され、この結果は、CAR Ｔ細胞のon-target off-tumor反応であると見られた。低ナトリウム血症の発症は、Ｂ群の用量レベル３（対象者：S15）とＡ群の用量レベル５（対象者：S16）の２人の対象者において認められ、いずれも発症と同時にＴ細胞の持続性が確認された。

用量レベル１を投与したＡ群およびＢ群の対象者では、84日目に骨髄中にCAR Ｔ細胞が検出された対象者S06を除いては、血液中のCAR Ｔ細胞は検出されなかった。用量レベル１を投与したＣ群の対象者S27は、28日目までCAR Ｔ細胞が検出可能であったことには注目されたい。これに対して、用量レベル２以上を投与した14人のうち11人の対象者と、用量レベル３以上で処置した８人のうち７人の対象者において、７日目にＴ細胞の持続性が観察された。治療反応性が評価可能であった18人の対象者における最良総合効果として、Ｃ群の用量レベル１の１人の対象者（S27）において部分奏効が得られた。進行性疾患に罹患していた１人の患者（S06：Ｂ群の用量レベル１）は、CAR Ｔ細胞を注入した後に特に治療を行わなくても、３年以上にわたって安定な病状を維持している。既知の転移性病巣が大きくなった後に退縮するという偽増悪（pseudo-progression）が、19人のうち７人の対象者で認められ、これらの患者では、少なくとも７日目の時点でＴ細胞が持続していたことが実証された。さらに、13日目に対象者S15において頭蓋内転移性病巣の生検を行ったところ、CD3+細胞の浸潤が認められ、そのうちの約30%がEGFRt陽性であったことから、CAR Ｔ細胞が浸潤していることが示された。

毒性と偽増悪は、Ｔ細胞の持続性に関連していると見られ、用量と各群の関係性も示唆された。Ｂ群の用量レベル２を投与した対象者（S20）とＣ群の用量レベル１を投与した対象者（S27）の計２人の対象者にCAR Ｔ細胞を再注入した。S20は、１回目の注入後、約210日間にわたって安定した病状を示し、無症候性に疾患が進行したことから、保存していたCAR Ｔ細胞を用いて２回目の注入を行った。２回目の注入は忍容性が高く、CAR Ｔ細胞に起因する有害事象は認められなかった。この患者は、２回目の注入から42日目に無症候性に疾患が進行したことから紹介元の施設に戻された。対象者S27は、42日目に、MIBGシンチグラフィーにより既知の転移性病巣のうちの１つが退縮したことが確認されたことから、１回目のCAR Ｔ細胞の注入による部分奏効が認められた。これらの知見を元に、この対象者に２回目のCAR Ｔ細胞を注入したところ、高い忍容性が示され、この２回目の注入の128日後に進行性疾患を発症した。

驚くべきことに、長いスペーサーを有する第２世代CARを含むCAR Ｔ細胞（Ｃ群）は、低用量（用量レベル１）で投与した場合でも、この処置を受けた対象者S27において少なくとも28日目までCAR Ｔ細胞が持続していたことが示された。これに対して、短いスペーサーを有する第２世代または第３世代CARを含むCAR Ｔ細胞（Ａ群およびＢ群）を高用量（用量レベル２以上）で投与して処置した対象者では、概してわずか７日目までしかCAR Ｔ細胞の持続性は認められなかった。治療反応性が評価可能であった18人の対象者における最良総合効果として、Ｃ群の用量レベル１の１人の対象者（S27）において部分奏効が得られた。

本明細書で使用されている「含む（comprising）」という用語は、「含む（including）」、「含む（containing）」または「特徴とする（characterized by）」という用語と同義であるとともに、オープンエンドで包括的な意味であり、本明細書には記載されていないさらなる要素や工程を除外するものではない。

前述の説明は、本発明のいくつかの方法および材料を開示するものである。本発明の方法および材料は、変更することができ、製造方法および器具も変更することができる。このような変更は、本開示または本明細書に開示された本発明の実施を考慮に入れて、当業者であれば容易に理解することができる。したがって、本発明は、本明細書に開示された特定の実施形態に限定されず、本発明の真の範囲および要旨において可能なあらゆる変更およびその他の態様を包含する。

本明細書において引用された公開特許出願、非公開特許出願、特許および学術文献を含む（ただしこれらに限定されない）すべての参考文献は、引用によりその全体が本明細書に援用され、本明細書の一部を構成する。引用により援用された文献、特許または特許出願が本明細書の開示内容と矛盾する場合、このような矛盾事項よりも本明細書の記載が採用および／または優先される。

Claims (45)

1. キメラ抗原受容体（CAR）をコードするポリヌクレオチドを含む核酸であって、該CARが、
   CD171に特異的に結合することができるか、CD171に特異的に結合するように構成されたリガンド結合ドメイン；
   連続した120～230アミノ酸残基の長さを有するポリペプチドスペーサー；
   膜貫通ドメイン；および
   細胞内シグナル伝達ドメイン
   を含む、核酸。
2. 前記ポリペプチドスペーサーが、L235D置換を含むIgG4ヒンジ-CH2-CH3ドメインを含む、請求項１に記載の核酸。
3. 前記ポリペプチドスペーサーが、配列番号2に示すアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の核酸。
4. 前記リガンド結合ドメインが、CE7モノクローナル抗体に由来するものである、請求項１～３のいずれか１項に記載の核酸。
5. 前記リガンド結合ドメインが、配列番号1に示すヌクレオチド配列と少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるscFvを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の核酸。
6. 前記膜貫通ドメインが、CD28の膜貫通ドメインを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の核酸。
7. 前記CD28の膜貫通ドメインが、配列番号4に示すアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の核酸。
8. 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2CおよびB7-H3からなる群から選択される共刺激ドメインと、CD3ζドメインまたはその機能性部分とを含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の核酸。
9. 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、CD28の細胞質内ドメインを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の核酸。
10. 前記CD28の細胞質内ドメインが、配列番号18に示すアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の核酸。
11. 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、CD28の細胞質内ドメインを有していない、請求項１～８のいずれか１項に記載の核酸。
12. 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、4-1BBの共刺激ドメインを含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の核酸。
13. 前記4-1BBの共刺激ドメインが、配列番号7に示すヌクレオチド配列と少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１２に記載の核酸。
14. 前記CD3ζドメインまたはその機能性部分が、配列番号8に示すヌクレオチド配列と少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１～１３のいずれか１項に記載の核酸。
15. 前記キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された構成的プロモーターをさらに含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の核酸。
16. 前記構成的プロモーターがEF1αプロモーターを含む、請求項１５に記載の核酸。
17. 前記キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された誘導型プロモーターをさらに含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の核酸。
18. 細胞表面選択マーカーをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載の核酸。
19. 前記細胞表面選択マーカーが、切断型EGFRポリペプチド（EGFRt）および切断型Her2ポリペプチド（Her2t）から選択される、請求項１８に記載の核酸。
20. 前記細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドと前記細胞表面選択マーカーをコードするポリヌクレオチドの間にリボソームスキップ配列をさらに含む、請求項１８または１９に記載の核酸。
21. 前記リボソームスキップ配列が、P2A配列、T2A配列、E2A配列およびF2A配列からなる群から選択される、請求項２０に記載の核酸。
22. 自殺遺伝子システムをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載の核酸。
23. 前記自殺遺伝子システムが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ／ガンシクロビル（HSVTK/GCV）自殺遺伝子システムおよび誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムから選択される、請求項２２に記載の核酸。
24. 前記リガンド結合ドメインが、配列番号1に示すヌクレオチド配列によってコードされること；前記ポリペプチドスペーサーが、配列番号2に示すアミノ酸配列からなること；前記膜貫通ドメインが、配列番号4に示すアミノ酸配列を含むこと；前記細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号7に示すヌクレオチド配列によってコードされる4-1BBの共刺激ドメインと、配列番号8に示すヌクレオチド配列によってコードされるCD3ζドメインまたはその機能性部分とを含むこと；および前記核酸が、前記リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたEF1プロモーターと、T2Aリボソームスキップ配列を含むポリヌクレオチドと、EGFRtポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとをさらに含むことを特徴とする、請求項１～２３のいずれか１項に記載の核酸。
25. 請求項１～２４のいずれか１項に記載の核酸によってコードされるポリペプチド。
26. 請求項１～２４のいずれか１項に記載の核酸を含むベクター。
27. ウイルスベクター、トランスポゾンベクター、インテグラーゼベクターおよびmRNAベクターからなる群から選択される、請求項２６に記載のベクター。
28. 前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクター、フォーミーウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびガンマレトロウイルスベクターからなる群から選択される、請求項２７に記載のベクター。
29. 前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項２８に記載のベクター。
30. 請求項１～２４のいずれか１項に記載の核酸を含む宿主細胞。
31. CD4+Ｔ細胞またはCD8+Ｔ細胞である、請求項３０に記載の宿主細胞。
32. 前駆Ｔ細胞または造血幹細胞である、請求項３０に記載の宿主細胞。
33. CD8+ナイーブＴ細胞、CD8+メモリーＴ細胞、CD8+セントラルメモリーＴ細胞、CD8+制御性Ｔ細胞、iPS細胞由来のCD8+Ｔ細胞、CD8+エフェクターメモリーＴ細胞およびCD8+バルクＴ細胞からなる群から選択されるCD8+細胞傷害性Ｔ細胞である、請求項３０に記載の宿主細胞。
34. CD4+ナイーブＴ細胞、CD4+メモリーＴ細胞、CD4+セントラルメモリーＴ細胞、CD4+制御性Ｔ細胞、iPS細胞由来のCD4+Ｔ細胞、CD4+エフェクターメモリーＴ細胞およびCD4+バルクＴ細胞からなる群から選択されるCD4+ヘルパーＴ細胞である、請求項３０に記載の宿主細胞。
35. 対象と同種の細胞、好ましくはヒトである対象と同種の細胞であるか、または対象から得られた自家細胞、好ましくはヒトである対象から得られた自家細胞である、請求項３０～３４のいずれか１項に記載の宿主細胞。
36. 請求項３０～３５のいずれか１項に記載の宿主細胞と、薬学的に許容される添加剤とを含む医薬組成物。
37. 対象においてがんを治療、抑制または緩和する方法であって、請求項３０～３５のいずれか１項に記載の宿主細胞を対象に投与することを含む方法。
38. 前記対象に投与される前記宿主細胞の用量が、がんの治療、抑制または緩和に十分な用量であり、該用量が、連続した120アミノ酸残基未満の長さを有するポリペプチドスペーサーを含むCARを含む細胞の、がんの治療、抑制または緩和に十分な用量よりも少ない、請求項３７に記載の方法。
39. 前記対象に投与される前記宿主細胞の用量が5×10⁶個/kg未満である、請求項３７または３８に記載の方法。
40. 前記対象にセツキシマブを投与することをさらに含む、請求項３７～３９のいずれか１項に記載の方法。
41. 前記がんが、CD171発現細胞を含む、請求項３７～４０のいずれか１項に記載の方法。
42. 前記がんが、神経芽腫および神経節芽腫から選択される、請求項３７～４１のいずれか１項に記載の方法。
43. 対象におけるがんの治療、抑制または緩和に使用するための、請求項３０～３５のいずれか１項に記載の宿主細胞。
44. 対象におけるがんの治療用、抑制用または緩和用の医薬品の製造における、請求項３０～３５のいずれか１項に記載の宿主細胞の使用。
45. 医薬品として使用するための、請求項３０～３５のいずれか１項に記載の宿主細胞。

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