KR20230021022A - 항-cd171 키메라 항원 수용체 - Google Patents

항-cd171 키메라 항원 수용체 Download PDF

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KR20230021022A
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마이클 씨. 젠슨
아담 존슨
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시애틀 칠드런즈 호스피탈 디/비/에이 시애틀 칠드런즈 리서치 인스티튜트
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Abstract

본원에 제공된 방법 및 조성물의 실시양태는 항-CD171 키메라 항원 수용체 (CAR)에 관한 것이다. 일부 실시양태는 긴 세포외 폴리펩티드 스페이서를 갖는 항-CD171 CAR에 관한 것이다. 일부 실시양태는 더 짧은 폴리펩티드 스페이서를 포함하는 항-CD171 CAR을 함유하는 세포와 비교하여 대상체에서 더 낮은 용량에서 증가된 지속성 및 활성을 갖는 이러한 항-CD171 CAR을 함유하는 세포에 관한 것이다.

Description

항-CD171 키메라 항원 수용체
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 "항-CD171 키메라 항원 수용체"라는 제목의 2020년 6월 8일에 출원된 미국 가출원 번호 63/036,021에 대한 우선권을 주장하며, 이는 전체가 참조로 본원에 명확히 포함된다.
서열 목록에 대한 참조
본 출원은 전자 형식의 서열 목록과 함께 제출되고 있다. 서열 목록은 SCRI283WOSEQLIST.TXT라는 제목의 파일로 제공되며, 2021년 6월 4일에 생성되었고, 크기는 대략 16 Kb이다. 서열 목록의 전자 형식의 정보는 전체가 참조로 본원에 포함된다.
발명의 분야
본원에 제공된 방법 및 조성물의 실시양태는 항-CD171 키메라 항원 수용체 (CAR)에 관한 것이다. 일부 실시양태는 긴 세포외 폴리펩티드 스페이서를 갖는 항-CD171 CAR에 관한 것이다. 일부 실시양태는 더 짧은 폴리펩티드 스페이서를 포함하는 항-CD171 CAR을 함유하는 세포와 비교하여 대상체에서 더 낮은 용량에서 증가된 지속성 및 활성을 갖는 이러한 항-CD171 CAR을 함유하는 세포에 관한 것이다.
신경모세포종은 이질적인 임상 경과를 갖는 소아기의 가장 흔한 두개외 고형 종양이다. 유리한 생물학을 갖는 신경모세포종은 치료적 개입 없이 자발적으로 퇴행하거나 분화하는 반면, 불리한 생물학을 갖는 신경모세포종은 종종 집중적인 다면 요법에도 불구하고 치명적으로 진행한다. 최대 내약성 최전선 집중 화학요법, 방사선, 통합 자가 조혈 줄기 세포 이식에 이어 레티노이드 및 항-GD2 항체는 고위험 환자의 최대 50%를 치료할 수 있다. 따라서, 이러한 환자 집단에서 허용가능한 새로운 치료 방식의 개발이 필요하다.
본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시양태는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 포함하며, 여기서 CAR은 CD171에 특이적으로 결합할 수 있거나 특이적으로 결합하도록 구성된 리간드 결합 도메인; 120개 이상 및 230개 이하의 연속 아미노산 잔기 길이를 갖는 폴리펩티드 스페이서; 막횡단 도메인; 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 리간드 결합 도메인은 CE7 모노클로날 항체로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, 리간드 결합 도메인은 서열식별번호 (SEQ ID NO): 01의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 scFv를 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드 스페이서는 L235D 치환을 포함하는 IgG4 힌지-CH2-CH3 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 스페이서는 서열식별번호: 02의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CD28 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD28 막횡단 도메인은 서열식별번호: 04의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은, CD3-제타 도메인 또는 이의 기능적 부분과 조합된, CD27, CD28, 4-1BB, OX-40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, LFA-1, CD2, CD7, NKG2C, 및 B7-H3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD28 세포질 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD28 세포질 도메인은 서열식별번호: 18의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD28 세포질 도메인이 결여되어 있다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 4-1BB 공동자극 도메인은 서열식별번호: 07의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, CD3-제타 도메인 또는 이의 기능적 부분은 서열식별번호: 08의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다.
일부 실시양태는 또한 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 구성적 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 구성적 프로모터는 EF1α 프로모터를 포함한다.
일부 실시양태는 또한 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 유도성 프로모터를 포함한다.
일부 실시양태는 또한 세포 표면 선별가능한 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 표면 선별가능한 마커는 말단절단된 EGFR 폴리펩티드 (EGFRt) 또는 말단절단된 Her2 폴리펩티드 (Her2t)로부터 선택된다.
일부 실시양태는 또한 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 세포 표면 선별가능한 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 사이에 위치한 리보솜 스킵 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리보솜 스킵 서열은 P2A 서열, T2A 서열, E2A 서열 및 F2A 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태는 또한 자살 유전자 시스템을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 자살 유전자 시스템은 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제/간시클로비르 (HSVTK/GCV) 자살 유전자 시스템, 또는 유도성 카스파제 자살 유전자 시스템으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 리간드 결합 도메인은 서열식별번호: 01의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 폴리펩티드 스페이서는 서열식별번호: 02의 아미노산 서열로 이루어지고; 막횡단 도메인은 서열식별번호: 04의 아미노산 서열을 포함하고; 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 07의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 4-1BB 공동자극 도메인, 및 서열식별번호: 08의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 CD3-제타 도메인 또는 이의 기능적 부분을 포함하고; 리간드 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, T2A 리보솜 스킵 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 EGFRt 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 EF1 프로모터를 추가로 포함한다.
본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시양태는 전술된 핵산 중 어느 하나에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함한다.
본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시양태는 전술된 핵산 중 어느 하나를 포함하는 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터, 트랜스포존 벡터, 인테그라제 벡터, 및 mRNA 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터, 포미 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 및 감마 레트로바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시양태는 전술된 핵산 중 어느 하나를 포함하는 숙주 세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포는 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포이다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포는 전구체 T 세포 또는 조혈 줄기 세포이다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포는 나이브 CD8+ T 세포, CD8+ 메모리 T 세포, 중심 메모리 CD8+ T 세포, 조절 CD8+ T 세포, IPS 유래된 CD8+ T 세포, 이펙터 메모리 CD8+ T 세포, 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 CD8+ 세포독성 T 세포이다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포는 나이브 CD4+ T 세포, CD4+ 메모리 T 세포, 중심 메모리 CD4+ T 세포, 조절 CD4+ T 세포, IPS 유래된 CD4+ T 세포, 이펙터 메모리 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 CD4+ T 헬퍼 세포이다.
일부 실시양태에서, 세포는 대상체, 바람직하게는 인간에 대해 동종이계이거나 대상체, 바람직하게는 인간에 대해 자가이다.
본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시양태는 전술된 숙주 세포 중 어느 하나 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 포함한다.
본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시양태는 대상체에게 전술된 숙주 세포 중 어느 하나를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료, 억제 또는 개선하는 방법을 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체에게 120개 미만의 연속 아미노산 잔기 길이를 갖는 폴리펩티드 스페이서를 포함하는 CAR을 포함하는 복수의 세포의 암을 치료, 억제 또는 개선하기에 충분한 용량 미만인, 암을 치료, 억제 또는 개선하기에 충분한 복수의 숙주 세포를 포함하는 용량이 투여된다.
일부 실시양태에서, 5 x 106개 세포/kg 미만의 복수의 숙주 세포를 포함하는 용량이 대상체에게 투여된다.
일부 실시양태는 또한 대상체에게 세툭시맙을 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 암은 CD171 발현 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 암은 신경모세포종 또는 신경절신경모세포종으로부터 선택된다.
본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시양태는 대상체에서 암을 치료, 억제 또는 개선하는데 사용하기 위한 전술된 숙주 세포 중 어느 하나를 포함한다.
본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시양태는 대상체에서 암을 치료, 억제 또는 개선하기 위한 의약의 제조에서 전술된 숙주 세포 중 어느 하나의 용도를 포함한다.
본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시양태는 약제로 사용하기 위한 전술된 숙주 세포 중 어느 하나를 포함한다.
도 1은 짧은 스페이서를 갖는 2세대 및 3세대 항-CD171 CAR을 코딩하는 핵산의 예시적 구조의 개략도를 도시한다. 코딩된 요소는 EF1 프로모터, 신호 폴리펩티드를 코딩하는 리더 서열, 항-CD171 scFv 리간드 결합 도메인을 코딩하는 VH-링커-VL 도메인, IgG4-힌지 스페이서 (짧은 스페이서), CD28 막횡단 (CD28tm) 도메인, 4-1BB 도메인, CD3제타 도메인, T2A 리보솜 스킵 서열, 세포 표면 선별가능한 마커일 수 있는 말단절단된 EGFR (tEGFR) 폴리펩티드를 포함한다. 긴 스페이서를 갖는 항-CD171 CAR은 IgG4 힌지 도메인 대신에 IgG4 힌지-CH2-CH3 도메인을 포함한다.
도 2는 CD171+ 표적 세포 또는 대조군 표적 세포와 공동-배양된 항-CD171 CAR을 포함하는 이펙터 세포의 다양한 비율에 대한 특이적 용해 백분율의 일련의 선 그래프를 도시한다. CAR은 짧은 스페이서를 갖는 2세대 항-CD171 CAR (CE7 2G 짧은); 짧은 스페이서를 갖는 3세대 항-CD171 CAR (CE7 3G 짧은); 긴 스페이서를 갖는 2세대 항-CD171 CAR (CE7 2G 긴); 긴 스페이서를 갖는 3세대 항-CD171 CAR (CE7 3G 긴)을 포함하였다.
도 3은 CD171+ 표적 세포 또는 대조군 표적 세포와 공동-배양된 항-CD171 CAR을 포함하는 다양한 이펙터 CD4+ T 세포에 대한 시토카인 생성 (IL-2, IFN-감마 및 TNF-알파)의 일련의 그래프를 도시한다. CAR은 짧은 스페이서를 갖는 2세대 항-CD171 CAR (CE7 2GS); 짧은 스페이서를 갖는 3세대 항-CD171 CAR (CE7 3GS); 긴 스페이서를 갖는 2세대 항-CD171 CAR (CE7 2GL); 및 긴 스페이서를 갖는 3세대 항-CD171 CAR (CE7 3GL)을 포함하였다.
도 4는 CAR을 포함하는 이펙터 세포로 처리된 두개내 신경모세포종 이종이식 모델에서 시간 경과에 따른 생체내 종양 세포로부터의 신호 (플럭스)에 대한 선 그래프를 도시한다. CAR은 짧은 스페이서를 갖는 2세대 항-CD171 CAR (CE7 2GS); 짧은 스페이서를 갖는 3세대 항-CD171 CAR (CE7 3GS); 스페이서에 2개의 치환을 갖는 긴 스페이서를 갖는 2세대 항-CD171 CAR (CE7 2GL, 2 mut); 및 스페이서에 2개의 치환을 갖는 긴 스페이서를 갖는 3세대 항-CD171 CAR (CE7 3GL, 2 mut)을 포함하였다.
도 5는 CAR을 포함하는 이펙터 세포로 처리된 이종이식 신경모세포종 모델에서 생존 백분율에 대한 선 그래프를 도시한다. CAR은 짧은 스페이서를 갖는 2세대 항-CD171 CAR (CE7 2GS); 짧은 스페이서를 갖는 3세대 항-CD171 CAR (CE7 3GS); 스페이서에 2개의 치환을 갖는 긴 스페이서를 갖는 2세대 항-CD171 CAR (CE7 2GL, 2 mut); 및 스페이서에 2개의 치환을 갖는 긴 스페이서를 갖는 3세대 항-CD171 CAR (CE7 3GL, 2 mut)을 포함하였다.
본원에 제공된 방법 및 조성물의 실시양태는 항-CD171 키메라 항원 수용체 (CAR)에 관한 것이다. 일부 실시양태는 긴 세포외 폴리펩티드 스페이서를 갖는 항-CD171 CAR에 관한 것이다. 일부 실시양태는 더 짧은 폴리펩티드 스페이서를 포함하는 항-CD171 CAR을 함유하는 세포와 비교하여 대상체에서 더 낮은 용량에서 증가된 지속성 및 활성을 갖는 이러한 항-CD171 CAR을 함유하는 세포에 관한 것이다.
재발성 또는 불응성 신경모세포종을 갖는 환자는 통상적인 화학요법에 내성이 있다. 이러한 이유로 연구자들은 CAR을 발현하도록 유전자조작으로 변형될 수 있는 환자로부터 직접적으로 수득되는 T 세포를 사용하려고 시도하고 있다. CAR은 T 세포가 신경모세포종을 갖는 환자의 신경모세포종 세포 표면에서 발현되는 단백질인 CD171의 인식을 통해 신경모세포종 세포를 인식하고 사멸시킬 수 있게 한다.
면역요법은 화학요법/방사선-내성 종양 세포가 민감한 면역학적 이펙터 메커니즘을 불러오기 때문에 매력적인 접근법이다. CAR을 발현하는 T 세포는 HLA 분자의 발현과 독립적으로 종양 세포와 관계를 맺고 협조된 공동자극 및 CD3제타 신호전달을 통해 활성화된다. CE7으로 명명된 모노클로날 항체는 종양 발현과 관련하여 인간 L1CAM (CD171)의 에피토프에 결합하며, CE7 scFv는 T 세포-재지시된 종양 표적화를 위해 유도되어 CAR로 조립되었다 (Hoefnagel CA., et al., (2001) Eur J Nucl Med 28:359-68). L1CAM 상의 종양 선택적 CE7 에피토프에 책임이 있는 분자 기초가 완전히 밝혀지지 않은 반면, 몇몇 라인의 증거는 결합이 글리코실화에 의존한다는 것을 시사한다. CD171은 이의 발현이 몇몇 고형 종양에서 종양 진행 및 전이와 서로 관련이 있고 종양 세포 분화, 증식, 이동 및 침습의 조절에 참여하기 때문에 발암에서 역할을 한다. 표적 안전성의 초기 평가는 1세대 CE7-CAR을 발현하는 자가 클로닝된 CD8+ 세포용해 T 림프구를 사용하여 이전에 보고된 파일롯 임상 시험에서 이루어졌다 (Park J. et al., (2007) Mol Ther 15:825-33). 6명의 신경모세포종 환자가 명백한 오프-종양 독성 없이 최대 109개 세포/m2의 용량으로 처리되었다. 그러나, 지속 기간 및 크기는 제한적이었다. 짧은 스페이서 세포외 도메인 및 1개 (4-1BB; 2세대 CAR) 또는 2개 (CD28 및 4-1BB; 3세대 CAR)의 세포내 공동자극 신호전달 도메인을 함유하는 CE7-CAR이 생성되었다. 불응성 또는 재발성 신경모세포종을 갖는 환자에서 2G 및 3G CE7-CAR T 세포의 안전성, 실행가능성 및 최적 용량을 결정하기 위한 I상 임상 시험이 시작되었다 (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT02311621).
본원에 제공된 방법 및 조성물의 실시양태에 유용한 특정 측면은 문헌 (U.S. 2018/0009891, U.S. 2017/0267742, U.S. 2017/0015746, Kunkele A. et al., (2015) Cancer Immunol Res 3:368-379, and Kunkele A., et al., (2017) Clin Cancer Res 23:466-477, 각각은 전체가 참조로 명백히 포함됨)에 개시되어 있다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "하나"는 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다.
측정가능한 값을 언급할 때 본원에 사용된 "약"은 특정된 값으로부터 ±20% 또는 ±10%, 더 바람직하게는 ±5%, 더욱 더 바람직하게는 ±l%, 더더욱 바람직하게는 ±0.1 %의 변동을 포괄하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "핵산" 또는 "핵산 분자"는 전체 명세서의 관점에서 평이하고 통상적인 의미를 가지며, 예컨대 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA)과 같은 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 생성된 단편, 또는 라이게이션, 절단, 엔도뉴클레아제 작용 또는 엑소뉴클레아제 작용 중 임의의 것에 의해 생성된 단편을 지칭할 수 있다. 핵산 분자는 자연 발생 뉴클레오티드 (예컨대, DNA 또는 RNA), 또는 자연 발생 뉴클레오티드의 유사체 (예컨대, 자연 발생 뉴클레오티드의 에난티오머 형태) 또는 이 둘의 조합인 단량체로 구성될 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 슈가 모이어티 및/또는 피리미딘 또는 퓨린 염기 모이이티에서 변경을 가질 수 있다. 슈가 변형은, 예컨대 하나 이상의 히드록실 기의 할로겐, 알킬 기, 아민 또는 아지도 기로의 대체를 포함하거나, 슈가는 에테르 또는 에스테르로 기능화될 수 있다. 또한, 전체 슈가 모이어티는 아자-슈가 또는 카르복실 슈가 유사체와 같은 입체적 및 전자적으로 유사한 구조로 대체될 수 있다. 염기 모이어티에서의 변형의 예는 알킬화된 퓨린 또는 피리미딘, 아실화된 퓨린 또는 피리미딘, 또는 다른 널리 공지된 헤테로사이클릭 치환체를 포함한다. 핵산 단량체는 포스포디에스테르 결합 또는 이러한 연결의 유사체에 의해 연결될 수 있다. 포스포디에스테르 연결의 유사체는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포라닐리데이트, 또는 포스포라미데이트 등을 포함한다. 용어 "핵산 분자"는 또한 소위 "펩티드 핵산"을 포함하며, 이는 폴리아미드 백본에 부착된 자연 발생 또는 변형된 핵산 염기를 포함한다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 제공된다. 일부 실시양태에서, CD171에 특이적인 CAR을 코딩하는 핵산은 RNA 또는 DNA이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "을 코딩하는" 또는 "코딩하는"은 본 명세서에 비추어 읽을 때 이의 평이하고 통상적인 의미를 가지며, 정의된 아미노산 서열과 같은 다른 거대분자의 합성을 위한 템플레이트로 작용하기 위해, 예컨대 유전자, cDNA, 또는 mRNA와 같은 폴리뉴클레오티드 내의 특정 뉴클레오티드 서열의 특성을 포함한다. 따라서, 유전자는 이 유전자의 전사 및 이에 상응하는 mRNA의 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생성하는 경우 단백질을 코딩한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "키메라 항원 수용체" (CAR)는 본 명세서에 비추어 읽을 때 이의 평이하고 통상적인 의미를 가지며, 예컨대 항체 또는 질환 또는 장애와 연관된 분자에 결합하는 다른 단백질 서열의 리간드 결합 도메인을 포함하는 합성적으로 설계된 수용체를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 스페이서 도메인을 통해 T 세포와 같은 세포의 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인, 또는 하나 이상의 공동자극 도메인과 같은 다른 수용체에 연결된다. 키메라 수용체는 또한 인공 세포 수용체 또는 T 세포 수용체, 키메라 세포 수용체 또는 T 세포 수용체, 키메라 면역수용체 또는 CAR로 지칭될 수 있다. 이들 수용체는 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터에 의해 촉진되는 코딩 서열의 전달로 세포, 바람직하게는 T 세포 상으로 모노클로날 항체 또는 이의 결합 단편의 특이성을 접목하는데 사용될 수 있다. CAR은 일부 경우에서 T 세포를 특정 세포 표면 항원을 발현하는 표적 세포로 재지시하도록 설계된 유전자 조작된 T 세포 수용체일 수 있다. T 세포는 대상체로부터 제거되고 변형되어 입양 세포 전달로 불리는 과정에 의해 항원에 특이적일 수 있는 수용체를 발현할 수 있다. T 세포는 이들이 항원을 인식하고 표적화할 수 있는 환자에게 재도입된다. CAR은 또한 임의의 특이성을 면역 수용체 세포에 접목할 수 있는 조작된 수용체이다. CAR은 일부 연구자에 의해 항체 또는 항체 단편, 바람직하게는 항체의 항원 결합 단편, 스페이서, 신호전달 도메인 및 막횡단 영역을 포함하는 것으로 간주된다. CAR의 성분은, 에피토프 결합 영역 (예컨대, 항체 단편, scFv 또는 이의 일부), 스페이서, 막횡단 도메인 및/또는 신호전달 도메인)과 같은 본원에 기재된 CAR의 상이한 성분 또는 도메인을 변형시키는 놀라운 효과로 인해, 독립적인 요소의 측면에서 본 개시내용 전반에 걸쳐 자주 구별된다. CAR의 상이한 요소의 변동은, 예컨대 특정 에피토프 또는 항원에 대한 더 강한 결합 친화성과 같은 원하는 결합 친화성을 야기할 수 있다.
CAR은 벡터에 의해 촉진되는 코딩 서열의 전달로 모노클로날 항체 또는 이의 결합 단편 또는 scFv의 특이성을 T 세포에 접목한다. CAR을 이를 필요로 하는 대상체에게 요법으로 이용하기 위해서는, T 세포를 대상체로부터 제거하고 항원에 특이적인 CAR을 발현할 수 있도록 변형시키는 입양 세포 전달로 불리는 기술이 이용된다. 이어서, 항원을 인식하고 표적화할 수 있는 T 세포가 환자에게 재도입된다.
일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 생물학적 막에 삽입되는 단백질을 고정시키기 위해 세포의 이중층에 존재할 수 있는 소수성인 막에 걸친 단백질의 영역이다. 제한 없이, 막횡단 도메인의 토폴로지는 막횡단 알파 나선일 수 있다. 키메라 항원 수용체의 일부 대안에서, CAR은 막횡단 도메인을 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 막횡단 도메인은 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28개 아미노산의 길이 또는 전술된 길이의 임의의 2개에 의해 정의되는 범위 내의 길이인 CD28 막횡단 서열 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 대안에서, CD28 막횡단 서열 또는 이의 단편은 28개 아미노산의 길이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 1차 신호전달 도메인 또는 공동자극 도메인과 같은 신호전달 도메인은 세포 내부 내의 성분과 상호작용하고 신호 릴레이에서 릴레이 또는 참여할 수 있는 또는 릴레이 또는 참여하도록 구성되는 단백질 또는 수용체 단백질의 세포내 또는 세포질 도메인을 포함한다. 일부 측면에서, 이러한 상호작용은 이펙터 분자 또는 이펙터 단백질과의 특정 단백질-단백질 또는 단백질-리간드 상호작용을 통해 소통하는 세포내 도메인을 통해 발생할 수 있으며, 이는 차례로 신호를 신호 쇄를 따라 목적지로 보낼 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호전달 도메인은 하나 이상의 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 측면에서, 하나 이상의 공동자극 도메인은, 예컨대 TCR/CD3 복합체의 CD3 제타 쇄에 의해 제공되는 1차 신호에 더하여 T 세포 이펙터 반응과 같은 반응, 예컨대 면역 반응, 활성화, 증식, 분화, 시토카인 분비, 세포용해 활성, 퍼포린 또는 그랜자임 활성 또는 이들의 임의의 조합을 향상시키는 신호를 T 세포에 제공하는 신호전달 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인 또는 공동자극 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, ICOS, 림프구 기능-연관된 항원-l (LFA-l), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, 또는 B7-H3, 또는 CD83에 특이적으로 결합하는 리간드 또는 이들의 임의의 조합의 모두 또는 일부를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "항체"는 본 명세서에 비추어 읽을 때 이의 평이하고 통상적인 의미를 가지며, 예컨대 박테리아 및 바이러스와 같은 외래 물체를 확인 및 중화시키기 위해 면역계에 의해 사용되는 형질 세포에 의해 생성되는 큰 Y-형 단백질을 포함한다. 항체 단백질은 4개의 폴리펩티드 쇄; 디술파이드 결합에 의해 연결된 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄를 포함할 수 있다. 각각의 쇄는 면역글로불린 도메인으로 불리는 구조 도메인으로 구성된다. 이들 도메인은 약 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150개의 아미노산 또는 이들 값 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위 내의 중간에 있는 임의의 수의 아미노산을 함유할 수 있으며 이들의 크기 및 기능에 따라 상이한 범주로 분류된다. 일부 실시양태에서, 리간드 결합 도메인은 항체 또는 이의 결합 단편 또는 scFv, 수용체 리간드 또는 이의 돌연변이체, 펩티드, 및/또는 폴리펩티드 친화성 분자 또는 결합 파트너를 포함한다. 일부 실시양태에서, 리간드 결합 도메인은 항체 단편, 바람직하게는 이의 결합 부분이다. 일부 실시양태에서, CAR 상에 존재하는 항체 단편 또는 이의 결합 부분은 B 세포 상의 리간드에 대해 특이적이다. 일부 실시양태에서, CAR 또는 TcR 상에 존재하는 항체 단편 또는 이의 결합 부분은 리간드에 대해 특이적이다. 일부 실시양태에서, CAR 상에 존재하는 항체 단편 또는 이의 결합 부분은 CD171에 대해 특이적이다. 일부 실시양태에서, 리간드 결합 도메인은 단일 쇄 가변 단편 (scFv)과 같은 항체 단편 또는 이의 결합 부분이다. 일부 실시양태에서, CAR 상에 존재하는 항체 단편 또는 이의 결합 부분은 인간화 항체 또는 이의 결합 부분으로부터의 하나 이상의 도메인을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "단일 쇄 가변 단편" 또는 "scFv"는 본 명세서에 비추어 읽을 때 이의 평이하고 통상적인 의미를 가지며, 예컨대 10개 또는 약 10개의 아미노산 내지 25개 또는 약 25개의 아미노산의 짧은 링커 펩티드와 연결된 면역글로불린의 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL) 가변 영역의 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD171에 특이적인 ScFv를 포함하는 CAR이 제공된다.
리간드의 결합 강도는 결합 친화도로 지칭되며, 직접적인 상호작용 및 용매 효과에 의해 결정될 수 있다. 리간드는 "리간드 결합 도메인"에 의해 결합될 수 있다. 예컨대, 리간드 결합 도메인은 단백질 상의 특정 리간드 또는 특정 에피토프에 결합할 수 있는 구조에서 보존된 서열을 지칭할 수 있다. 리간드 결합 도메인 또는 리간드 결합 부분은 항체 또는 이의 결합 단편 또는 scFv, 수용체 리간드 또는 이의 돌연변이체, 펩티드 및/또는 폴리펩티드 친화성 분자 또는 결합 파트너를 포함할 수 있다. 제한 없이, 리간드 결합 도메인은 특정 단백질 도메인 또는 리간드 또는 리간드들에 특이적인 단백질 상의 에피토프일 수 있다.
일부 실시양태는 스페이서를 포함한다. 일부 대안에서, 펩티드 스페이서는 15개 이하의 아미노산이지만 1개 또는 2개 이상의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 폴리펩티드 쇄이다. 일부 측면에서, 폴리펩티드 쇄는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78,. 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239 또는 240개의 연속 아미노산과 같은 길이 범위일 수 있거나 상술된 길이 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위 내의 길이를 가질 수 있다. 스페이서는 임의의 20개의 아미노산을, 예컨대 키메라 항원 수용체에서 바람직한 길이의 폴리펩티드 쇄를 생성하기 위해 임의의 순서로, 바람직하게는 아미노산 아르기닌, 히스티딘, 리신, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 글리신, 프롤린, 알라닌, 발린, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판을 포함할 수 있다. 스페이서 서열은 scFv (또는 리간드 결합 도메인)와 키메라 항원 수용체의 막횡단 도메인 사이의 링커일 수 있다. 일부 대안에서, CAR은 스페이서를 코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 스페이서는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78,. 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239 또는 240개의 아미노산 길이 또는 상술된 길이 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위 내의 길이를 갖는 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 스페이서는 scFv와 CAR의 막횡단 영역 사이에 존재한다. 일부 대안에서, 스페이서는 CAR의 리간드 결합 도메인과 CAR의 막횡단 영역 사이에 존재한다.
스페이서는 또한 표적 세포에 대한 scFv 도메인의 결합을 개선하거나 조정하기 위해 원하는 길이로 맞춤화, 선택 또는 최적화될 수 있으며, 이는 원하는 양의 세포독성 효능을 증가시키거나 제공할 수 있다. 일부 대안에서, scFv 도메인 또는 리간드 결합 도메인과 막횡단 사이의 링커 또는 스페이서는 25 내지 55개의 아미노산 길이 (예컨대, 적어도 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 또는 55개의 아미노산 또는 전술된 길이 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위 내의 길이)일 수 있다 .
일부 대안에서, 스페이서는 인간 항체의 힌지 영역을 포함한다. 일부 대안에서, 스페이서는 IgG4 힌지를 포함한다. 일부 대안에서, IgG4 힌지 영역은 변형된 IgG4 힌지이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "탈-면역화된 스페이서"는 본 명세서에 비추어 읽을 때 이의 평이하고 통상적인 의미를 가지며, 예컨대 면역 반응을 거의 내지 전혀 유발하지 않거나 환자로부터 약화되거나 감소된 면역 반응을 유발하는 스페이서를 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR은 인간과 같은 대상체에서 면역 반응을 유발하지 않는 스페이서를 포함한다. 스페이서는 CAR을 공격하는 면역계의 능력을 방지하거나 감소시키기 위해 인간과 같은 대상체에서 면역 반응을 유발하지 않거나 감소되거나 약화되거나 낮은 면역 반응을 유발하는 것이 중요하다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "리보솜 스킵 서열"은 본 명세서에 비추어 읽을 때 이의 평이하고 통상적인 의미를 가지며, 예컨대 번역 동안 리보솜이 리보솜 스킵 서열을 "스킵"하고 펩티드 결합 형성 없이 리보솜 스킵 서열 뒤의 영역을 번역하도록 하는 서열을 포함한다. 예컨대, 몇몇 바이러스는 펩티드 결합을 통해 연결된 단백질 없이 단일 핵산에서 몇몇 단백질의 순차적 번역을 허용하는 리보솜 스킵 서열을 갖는다. 본원에 기재된 바와 같이, 이는 "링커" 서열이다. 본원에 제공된 핵산의 일부 대안에서, 핵산은 키메라 항원 수용체에 대한 서열과 마커 단백질의 서열 사이에 리보솜 스킵 서열을 포함하여, 단백질이 공동-발현되고 펩티드 결합에 의해 연결되지 않도록 한다. 일부 실시양태에서, 리보솜 스킵 서열은 P2A, T2A, E2A 또는 F2A 서열이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "마커 서열"은 본 명세서에 비추어 읽을 때 이의 평이하고 통상적인 의미를 가지며, 예컨대 관심 단백질을 갖는 단백질 또는 세포를 선별하거나 추적하는데 사용되는 단백질을 포함한다. 본원에 기재된 대안에서, 제공된 융합 단백질은 유동 세포측정과 같은 실험에서 선별될 수 있는 마커 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 마커는 말단절단된 Her2 (Her2t) 폴리펩티드, 또는 말단절단된 EGFR (EGFRt)을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 분비를 위한 "신호 서열"은 또한 "신호 펩티드"로 지칭될 수 있다. 신호 펩티드는 분비 효율을 위해 사용될 수 있으며, 일부 시스템에서 번역을 중단하고 분비를 위해 신호 서열을 SRP 수용체로 향하게 하는 신호 인식 입자에 의해 인식된다. 본원에 제공된 CAR의 일부 대안에서, CAR은 신호 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR을 코딩하는 핵산 중, 핵산은 신호 서열을 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 신호 서열은 단백질의 번역 후 단백질을 세포막으로 표적화하기 위한 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "자살 유전자 요법", "자살 유전자" 및 "자살 유전자 시스템"은 본 명세서에 비추어 읽을 때 평이하고 통상적인 의미를 가지며, 예컨대 아폽토시스에 의해 세포가 스스로를 사멸시킬 자살 유전자를 필요로 하는 아폽토시스를 통해 세포를 파괴하는 방법을 포함한다. 종양 환경의 치료 또는 변형을 위해 유전자조작으로 변형된 면역 세포를 사용할 필요가 있는 환자에 대한 안전성 문제로 인해, 부작용을 방지하거나 완화하기 위한 전략이 개발되고 있다. 전처리 단계를 위해 유전자조작으로 변형된 면역 세포를 대상체에게 통합하는 것의 부작용은 시토카인 방출 증후군인 "시토카인 폭풍"을 포함할 수 있으며, 여기서 주입된 T 세포는 시토카인을 혈류로 방출하여 위험하게 높은 열 뿐만 아니라 급격한 혈압 강하를 유발할 수 있다. 전술된 바와 같이, 타목시펜에 의한 시스템의 제어는 또한 열과 같은 시토카인 폭풍의 징후가 있을 때 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "벡터" 또는 "구축물"은 본 명세서에 비추어 읽을 때 이의 평이하고 통상적인 의미를 가지며, 예컨대 세포에서 이종 핵산의 발현을 제공하기 위한 조절 요소를 갖는 세포에 이종 핵산을 도입하는데 사용되는 핵산을 포함한다. 벡터는 플라스미드, 미니서클, 효모, 바이러스 게놈, 렌티바이러스 벡터, 포미 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 벡터는 DNA 또는 mRNA와 같은 RNA일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "트랜스포존 유전자 카세트" 또는 트랜스포존은 리컴비나제 인식 부위 (예컨대, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제 인식 부위 또는 PiggyBac)가 측면에 있는 유전자 (1차 전사체의 발현을 유도하는 프로모터)를 함유하는 유전 요소를 지칭한다. 트랜스포존 유전자 카세트는 통합된 게놈 서열에 편입되거나 원형 DNA로 자유롭게 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 트랜스포존 유전자 카세트는 프로모터, CAR, 및 단백질을 세포 표면으로 향하게 하는 신호 서열을 코딩한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "인테그라제 벡터 시스템"은 바이러스 공여자 핵산을 표적 게놈에 대한 특정 부착 부위와 통합함으로써 작용한다. 인테그라제의 사용을 통해 바이러스 DNA는 숙주 DNA에 삽입된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "T 세포" 또는 "T 림프구"는 임의의 포유동물, 바람직하게는 원숭이 또는 인간을 포함하는 영장류, 개, 고양이 또는 말과 같은 반려 동물, 또는 양, 염소 또는 소와 같은 가축으로부터 유래될 수 있다. 일부 대안에서, T 세포는 수용자 대상체와 동종이계 (동일한 종이지만 상이한 공여자)이고; 일부 대안에서, T 세포는 자가이다 (공여자와 수용자가 동일함). 일부 대안에서, T 세포는 동계이다 (공여자 및 수용자는 상이하지만 일란성 쌍둥이임).
본원에서 사용되는 바와 같이, "T 세포 전구체"는 흉선으로 이동하여 T 세포 수용체를 발현하지 않는 T 세포 전구체가 될 수 있는 림프구 전구체 세포를 지칭한다. 모든 T 세포는 골수에 있는 조혈 줄기 세포에서 유래한다. 조혈 줄기 세포로부터의 조혈 선조 (림프구 전구 세포)는 흉선에 존재하고 세포 분열에 의해 확장되어 대형 미성숙 흉선구 집단을 생성한다. 최초기 흉선구는 CD4 뿐만 아니라 CD8도 발현하지 않으므로 이중-음성 (CD4-CD8-) 세포로 분류된다. 발달 과정을 거치면서 이중-양성 (CD4+CD8+) 흉선구가 되고 최종적으로 단일-양성 (CD4+CD8- 또는 CD4-CD8+) 흉선구로 성숙하여 흉선으로부터 말초 조직으로 방출된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "조혈 줄기 세포" 또는 "HSC"는, 예컨대 대식구, 단핵구, 대식구, 호중구, 호염구, 호산구, 적혈구, 거핵구/혈소판, 수지상 세포 및 /또는 림프구 계통 (예컨대, T 세포, B 세포 또는 NK 세포)과 같은 골수 세포를 발생시킬 수 있는 전구체 세포이다. HSC는 3가지 부류의 줄기 세포가 존재하는 이질적인 집단을 가지며, 이는 혈액 내 림프성 대 골수성 자손의 비율 (L/M)로 구별된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "CD4+ 발현 T 세포" 또는 "CD4+ T 세포"는 면역계 및 적응 면역계에서 중요한 역할을 하는 T 헬퍼 세포로도 공지되어 있다. CD4+ T 세포는 또한 T 세포 시토카인을 방출하여 다른 면역 세포의 활성을 돕는다. 이들 세포는 면역 반응을 돕거나 억제하거나 조절한다. 이들은 B 세포 항체 부류 스의칭, 세포독성 T 세포의 활성화 및 성장, 대식구와 같은 식세포의 살박테리아 활성 최대화에 필수적이다. CD4+ 발현 T 세포는 일부 시토카인을 생성하는 능력이 있지만, CD4+ T 세포에 의해 생성되는 시토카인의 양은 생착 적합성을 촉진, 개선, 기여 또는 유발하는 농도가 아니다. 본원에 기재된 바와 같이, "CD4+ T 세포"는 적응 면역계에서 역할을 하는 성숙한 T 헬퍼 세포이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "CD8+ 발현 T 세포" 또는 "CD8+ T 세포"는 TC, 세포독성 T 림프구, CTL, T-킬러 세포, 세포용해 T 세포 또는 킬러 T 세포로도 공지되어 있다. 본원에 기재된 바와 같이, CD8+ T 세포는 암 세포, 바이러스 감염 세포 또는 손상된 세포를 사멸시킬 수 있는 T-림프구이다. CD8+ T 세포는 특정 항원을 인식할 수 있는 T 세포 수용체 (TCR)를 발현한다. CD8+ T 세포는 표면에서 CD8을 발현한다. CD8+ 발현 T 세포는 일부 시토카인을 생성하는 능력이 있지만 CD8+ T 세포에 의해 생성되는 시토카인의 양은 생착 적합성을 촉진, 개선, 기여 또는 유도하는 농도가 아니다. "CD8 T 세포" 또는 "킬러 T 세포"는 암 세포, 바이러스로 감염된 세포 또는 손상된 세포를 사멸시킬 수 있는 T-림프구이다.
성숙한 T 세포는 표면 단백질 CD4를 발현하며 CD4+ T 세포로 지칭된다. CD4+ T 세포는 일반적으로 면역계 내에서 헬퍼 T 세포로 미리 정의된 역할을 하는 것으로 취급된다. 예컨대, 항원-제시 세포가 MHC 부류 II에서 항원을 발현할 때 CD4+ 세포는 세포 대 세포 상호작용 (예컨대, CD40 및 CD40L)의 조합을 통해 및 시토카인을 통해 이러한 세포를 도울 것이다. 그럼에도 불구하고, 드문 예외가 있다; 예컨대, 조절 T 세포, 천연 킬러 세포 및 세포독성 T 세포의 서브-그룹은 CD4를 발현한다. 후자의 CD4+ 발현 T 세포 그룹 모두는 T 헬퍼 세포로 간주되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "중심 메모리" T 세포 (또는 "TCM")는 나이브 세포와 비교하여 이의 표면에 CD62L 또는 CCR-7 및 CD45RO를 발현하고 CD45RA를 발현하지 않거나 감소된 발현을 갖는 항원 경험된 CTL을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 중심 메모리 세포는 나이브 세포와 비교하여 CD62L, CCR7, CD28, CD127, CD45RO, 및/또는 CD95의 발현에 대해 양성이고, CD54RA의 감소된 발현을 갖는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "이펙터 메모리" T 세포 (또는 "TEM")는 중심 메모리 세포와 비교하여 이의 표면에서 CD62L을 발현하지 않거나 감소된 발현을 갖고 나이브 세포와 비교하여 CD45RA를 발현하지 않거나 감소된 발현을 갖는 항원 경험된 T 세포를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이펙터 메모리 세포는 나이브 세포 또는 중심 메모리 세포와 비교하여 CD62L 및/또는 CCR7의 발현에 대해 음성이고, CD28 및/또는 CD45RA의 가변적 발현을 갖는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "나이브" T 세포는 중심 또는 이펙터 메모리 세포와 비교하여 CD62L 및/또는 CD45RA를 발현하고/하거나 CD45RO-를 발현하지 않는 비-항원 경험된 T 림프구를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 나이브 CD8+ T 림프구는 CD62L, CCR7, CD28, CD127, 또는 CD45RA를 포함하는 나이브 T 세포의 표현형 마커의 발현을 특징으로 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "이펙터" "TE" T 세포는 중심 메모리 또는 나이브 T 세포와 비교하여 CD62L, CCR7, CD28을 발현하지 않거나 감소된 발현을 갖고, 그랜자임 B 또는 퍼포린 또는 둘 다에 대해 양성인 항원 경험된 세포독성 T 림프구 세포를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "생착 적합성"은 본 명세서에 비추어 읽을 때 평이하고 통상적인 의미를 가지며, 예컨대 세포가 신체, 예컨대 혈류에 입양 전달을 통해 들어간 후에 세포가 성장하고 증식하는 능력을 포함한다. 생착은 일반적으로 전달 후 2 내지 4주 이내에 발생할 수 있다. 생착은 특정 세포에 대한 혈구 수를 자주 점검하여 모니터링될 수 있다. 일부 대안에서, 대상체에서 질환을 치료, 억제 또는 개선하는 방법이 제공되며, 방법은 본원에 기재된 바와 같이 유전자조작으로 변형된 T 세포를 포함하는 조성물 또는 산물 조합을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 키메라 항원 수용체를 발현하는 유전자조작으로 변형된 T 세포에 대한 혈구 수를 점검함으로써, 예컨대 전달된 T 세포와 연관된 마커의 존재 또는 부재를 확인함으로써 대상체를 모니터링하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "단백질"은 본 명세서에 비추어 읽을 때 이의 평이하고 통상적인 의미를 가지며, 예컨대 하나 이상의 폴리펩티드 쇄를 포함하는 거대분자를 포함한다. 따라서, 단백질은 임의의 하나 이상의 아미노산에 의해 형성되는 펩티드 (아미드) 결합에 의해 연결된 아미노산 단량체의 쇄인 펩티드를 포함할 수 있다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 함유할 수 있으며, 단백질 또는 펩티드 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 수에는 제한이 없다. 비제한적으로, 아미노산은, 예컨대 아르기닌, 히스티딘, 리신, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 시스틴, 글리신, 프롤린, 알라닌, 발린, 히드록시프롤린, 이소류신, 류신, 피롤리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 오르니틴, S-아데노실메티오닌, 또는 셀레노시스테인이다. 단백질은 또한, 예컨대 탄수화물 기와 같은 비-펩티드 성분을 포함할 수 있다. 탄수화물 및 다른 비-펩티드 치환체는 단백질이 생성되는 세포에 의해 단백질에 첨가될 수 있으며 세포 유형에 따라 달라질 것이다. 단백질은 아미노산 백본 구조의 관점에서 본원에서 정의되고; 탄수화물 기와 같은 치환체는 일반적으로 특정되지 않지만, 그럼에도 불구하고 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, CAR T 세포는 또한 시토카인, 키메라 시토카인 수용체, 키메라 공동자극 분자, 우성 음성 수용체, 면역자극 분자, 또는 면역조절 분자와 같은 단백질을 추가로 발현하도록 조작된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "시토카인"은 본 명세서에 비추어 읽을 때 이의 평이하고 통상적인 의미를 가지며, 예컨대 세포 신호전달에 중요한 작은 단백질 (5-25 kDa)을 포함한다. 시토카인은 세포에 의해 방출되고, 다른 세포, 및 때로는 방출 세포 자체, 예컨대 T 세포의 거동에 영향을 미친다. 시토카인은, 예컨대 케모카인, 인터페론, 인터류킨, 림포카인, 또는 종양 괴사 인자 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 시토카인은, 예컨대 대식구, B 림프구, T 림프구 및 비만 세포와 같은 면역 세포 뿐만 아니라 내피 세포, 섬유모세포, 및 다양한 간질 세포를 포함할 수 있는 광범위한 세포에 의해 생성될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "인터류킨" 또는 IL은 면역계가 주로 의존하는 시토카인이다. 본원에서 활용될 수 있는 인터류킨의 예는, 예컨대 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, Il-7, IL-8/CXCL8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-34, IL-35, 또는 IL-36 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. T 세포와 인터류킨의 접촉은 세포의 생착 적합성을 촉진, 지원, 유도 또는 개선하는 효과를 가질 수 있다. 예컨대, IL-1은 T 세포의 성숙 & 증식에서 기능할 수 있다. 예컨대, IL-2는 T 세포 반응의 성장 및 분화를 자극할 수 있다. 예컨대, IL-3는 골수 전구 세포의 분화 및 증식을 촉진할 수 있다. 예컨대, IL-4는 증식 및 분화를 촉진할 수 있다. 예컨대, IL-7은 B, T 및 NK 세포의 생존, 발달 및 항상성에 관여하는 림프구 전구 세포의 분화 및 증식을 촉진할 수 있다. 예컨대, IL-15는 천연 킬러 세포의 생성을 유도할 수 있다. 예컨대, IL-21은 CD8+ T 세포의 활성화 및 증식을 공동자극하고, NK 세포독성을 증가시키며, CD40-유도된 B 세포 증식, 분화 및 이소형 스위칭을 증가시키고, Th17 세포의 분화를 촉진한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "세포를 번식시키는" 또는 번식은 세포의 증식, 확장, 성장 및 재생성을 허용하는 단계를 지칭한다. 예컨대, CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포의 배양은 전형적으로 T 림프구의 성장 및 증식에 적합한 조건 하에서 인큐베이션될 수 있다. 키메라 항원 수용체를 갖는 유전자조작으로 변형된 T 세포를 생성하는 방법의 일부 대안에서, CD4+ 발현 T 세포는 적어도 1일 동안 번식되고, 20일, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일 동안 또는 전술된 기간 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위 내의 기간 동안 번식될 수 있다. 키메라 항원 수용체를 갖는 유전자조작으로 변형된 T 세포를 생성하는 방법의 일부 대안에서, CD8+ 발현 T 세포는 적어도 1일 동안 번식되고, 20일, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일 동안 또는 전술된 기간 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위 내의 기간 동안 번식될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "친화성 선별"은 결합 친화성 작용제로 분자 또는 마커 또는 이에 존재하는 에피토프에 결합함으로써 선별가능한 세포 표면 마커를 갖는 특정 분자 또는 세포를 선별하는 것을 지칭하며, 이는 관심의 특정 분자 또는 세포를 선별하는 것을 허용한다. 친화성 선별은, 예컨대 항체, 접합된 항체, 렉틴, 압타머 또는 펩티드 또는 이들의 임의의 조합에 의해 수행될 수 있다. 유전자조작으로 변형된 T 세포를 생성하는 방법의 일부 실시양태에서, T 세포의 CD8+ 집단 및/또는 T 세포의 CD4+ 집단을 T 세포의 혼합 집단으로부터 분리하는 것은 CD8 및/또는 CD4에 존재하는 에피토프를 갖는 T 세포에 대한 친화성 선별에 의해 수행된다. 방법의 일부 대안에서, 항-CD8 또는 항-CD4 항체 또는 이의 결합 부분이 관심 세포의 선별에 사용된다. 방법의 일부 대안에서, T 세포의 혼합 집단으로부터 T 세포의 CD8+ 집단 및/또는 T 세포의 CD4+ 집단의 분리는 유동 세포측정에 의해 수행된다. 방법의 일부 대안에서, T 세포의 혼합 집단으로부터 T 세포의 CD8+ 집단 및/또는 T 세포의 CD4+ 집단의 분리는 면역-자기 선별에 의해 수행된다. 방법의 일부 대안에서, 항-CD8 또는 항-CD4 항체 또는 이의 결합 단편은, 예컨대 불활성 비드 또는 불활성 입자와 같은 고체 지지체에 접합된다.
또 다른 대안에서, 확장 방법 또는 번식은 배양 배지에 항-CD3 및/또는 항 CD28 항체를 (예컨대, 적어도 0.5 ng/ml의 농도로) 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 대안에서, 키메라 항원 수용체 방법을 갖는 유전자조작으로 변형된 T 세포를 생성하는 방법은 배양 배지에 IL-2, IL-15, 또는 IL-21 또는 이들의 임의의 조합을 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다 (예컨대, IL-2의 농도는 적어도 10 단위/m1임). 또 다른 대안에서, 키메라 항원 수용체 방법을 갖는 유전자조작으로 변형된 T 세포를 생성하는 방법은 배양 배지에 IL-7, IL-15, 또는 IL-21 또는 이들의 임의의 조합을 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다 (예컨대, IL-2의 농도는 적어도 10 단위/ml임). T 림프구를 단리한 후, 세포독성 및 헬퍼 T 림프구 모두 확장 전 또는 후에 나이브, 메모리 및 이펙터 T 세포 서브집단으로 분류될 수 있다.
일부 실시양태는 폴리펩티드 서열 또는 폴리펩티드 서열의 보존적 치환과 같은 이의 보존적 변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, "보존적 아미노산 치환"은 기능적으로 등가인 아미노산을 치환하는 아미노산 치환을 지칭한다. 보존적 아미노산 변화는 생성된 펩티드의 아미노산 서열에 침묵 변화를 초래한다. 예컨대, 유사한 극성의 하나 이상의 아미노산은 기능적 등가물로 작용하여 펩티드의 아미노산 서열 내에 침묵 변이를 초래한다. 전하 중성이고 잔기를 더 작은 잔기로 대체하는 치환은 잔기가 상이한 그룹에 있더라도 "보존적 치환"으로 간주될 수 있다 (예컨대, 페닐알라닌을 더 작은 이소류신으로 대체). 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 계열은 관련 기술분야에 정의되어 있다. 몇몇 계열의 보존적 아미노산 치환이 표 1에 나타나 있다.
<표 1>
Figure pct00001
특정 핵산
본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 대안은 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 포함한다. 표 2는 본원에 제공된 특정 실시양태에서 유용한 서열을 나열한다. 도 1은 CAR을 코딩하는 핵산의 예시적인 실시양태를 도시한다. 일부 실시양태에서, CAR은 CD171에 특이적으로 결합할 수 있거나 특이적으로 결합하도록 구성된 리간드 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리간드 결합 도메인은 CD171에 특이적으로 결합하는 항체로부터 유래되는 상보성-결정 영역 (CDR)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리간드 결합 도메인은 CD171에 특이적으로 결합하는 항체로부터 유래되는 VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리간드 결합 도메인은 CE7 모노클로날 항체로부터 유래된다 (예컨대, 문헌 (Schonmann SM, et al., (1986) Int J Cancer 1986;37:255-62, 전체가 참조로 명백히 포함됨) 참조). 일부 실시양태에서, 리간드 결합 도메인은 서열식별번호: 01의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 또는 상술된 백분율 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위 내의 서열 동일성 백분율을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 scFv를 포함한다. 일부 실시양태에서, 리간드 결합 도메인은 서열식별번호: 01의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함하거나 이로 이루어진 scFv를 포함한다.
일부 실시양태에서, CAR은 폴리펩티드 스페이서를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 스페이서는 120개 이상 및 230개 이하의 연속 아미노산 잔기 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 스페이서는 229개의 연속 아미노산 잔기로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 스페이서는 IgG4 힌지 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 스페이서는 IgG4 힌지-CH2-CH3 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 스페이서는 CH2 도메인이 L235D 치환을 포함하는 IgG4 힌지-CH2-CH3 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 스페이서는 서열식별번호: 02의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 또는 상술된 백분율 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위 내의 서열 동일성 백분율을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 스페이서는 서열식별번호: 02의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 리간드 결합 도메인의 C-말단은 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 또는 0개 이하의 개재 아미노산 잔기로 폴리펩티드 스페이서의 N-말단에 연결된다. 일부 실시양태에서, 리간드 결합 도메인의 C-말단은 개재 아미노산 잔기 없이 폴리펩티드 스페이서의 N-말단에 펩티드 결합을 통해 연결된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 스페이서의 C-말단은 서열식별번호: 01의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 또는 상술된 백분율 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위 내의 서열 동일성 백분율을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열의 C-말단이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 스페이서의 N-말단은 서열식별번호: 02의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 또는 상술된 백분율 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위 내의 서열 동일성 백분율을 갖는 아미노산 서열의 N-말단이다.
일부 실시양태에서, CAR은 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CD28 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD28 막횡단 도메인은 서열식별번호: 04의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 또는 상술된 백분율 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위 내의 서열 동일성 백분율을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD28 막횡단 도메인은 서열식별번호: 04의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드 스페이서의 C-말단은 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 또는 0개 이하의 개재 아미노산 잔기로 막횡단 도메인의 N-말단에 연결된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 스페이서의 C-말단은 개재 아미노산 잔기 없이 막횡단 도메인의 N-말단에 펩티드 결합을 통해 연결된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 스페이서의 C-말단은 서열식별번호: 02의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 또는 상술된 백분율 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위 내의 서열 동일성 백분율을 갖는 아미노산 서열의 C-말단이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 스페이서의 N-말단은 서열식별번호: 04의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 또는 상술된 백분율 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위 내의 서열 동일성 백분율을 갖는 아미노산 서열의 N-말단이다.
일부 실시양태에서, CAR은 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX-40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, LFA-1, CD2, CD7, NKG2C, 및 B7-H3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 또한 CD3-제타 도메인 또는 이의 기능적 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 4-1BB 공동자극 도메인은 서열식별번호: 07의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 또는 상술된 백분율 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위 내의 서열 동일성 백분율을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 4-1BB 공동자극 도메인은 서열식별번호: 07의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, CD3-제타 도메인 또는 이의 기능적 부분은 서열식별번호: 08의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 또는 상술된 백분율 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위 내의 서열 동일성 백분율을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, CD3-제타 도메인 또는 이의 기능적 부분은 서열식별번호: 08의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
3세대 CAR을 포함할 수 있는 일부 대안에서, 세포내 신호전달 도메인은 또한 CD28 세포질 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서 CD28 세포질 도메인은 서열식별번호: 06의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 또는 상술된 백분율 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위 내의 서열 동일성 백분율을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD28 세포질 도메인은 서열식별번호: 06의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서 CD28 세포질 도메인은 LL>GG 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서 CD28 세포질 도메인은 서열식별번호: 18의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 또는 상술된 백분율 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위 내의 서열 동일성 백분율을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD28 세포질 도메인은 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 2세대 CAR을 포함할 수 있는 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD28 세포질 도메인이 결여되어 있다.
일부 실시양태는 또한 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 구성적 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 구성적 프로모터는 EF1α 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태는 또한 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 유도성 프로모터를 포함한다.
일부 실시양태는 또한 세포 표면 선별가능한 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 표면 선별가능한 마커는 말단절단된 EGFR 폴리펩티드 (EGFRt) 또는 말단절단된 Her2 폴리펩티드 (Her2t)로부터 선택된다.
일부 실시양태는 또한 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 세포 표면 선별가능한 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 사이에 위치한 리보솜 스킵 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리보솜 스킵 서열은 P2A 서열, T2A 서열, E2A 서열, 및 F2A 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태는 또한 자살 유전자 시스템을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 자살 유전자 시스템은 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제/간시클로비르 (HSVTK/GCV) 자살 유전자 시스템, 또는 유도성 카스파제 자살 유전자 시스템으로부터 선택된다.
본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시양태는 전술된 핵산 중 어느 하나와 같이 항-CD171 CAR을 코딩하는 본원에 개시된 핵산 중 어느 하나를 포함하는 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터, 트랜스포존 벡터, 인테그라제 벡터, 및 mRNA 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터, 포미 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 및 감마 레트로바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시양태는 본원에 개시된 핵산 중 어느 하나에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함한다. 표 2는 본원에 제공된 특정 실시양태에 유용한 예시적인 서열을 나열한다.
<표 2>
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
특정 세포
본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시양태는 본원에 제공된 핵산 중 어느 하나를 포함하는 숙주 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 전구체 T 세포, 또는 조혈 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 나이브 CD8+ T 세포, CD8+ 메모리 T 세포, 중심 메모리 CD8+ T 세포, 조절 CD8+ T 세포, IPS 유래된 CD8+ T 세포, 이펙터 메모리 CD8+ T 세포, 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 CD8+ 세포독성 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 나이브 CD4+ T 세포, CD4+ 메모리 T 세포, 중심 메모리 CD4+ T 세포, 조절 CD4+ T 세포, IPS 유래된 CD4+ T 세포, 이펙터 메모리 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 CD4+ T 헬퍼 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 대상체, 바람직하게는 인간에 대해 동종이계이고, 다른 실시양태에서 세포는 대상체, 바람직하게는 인간에 대해 자가이다.
본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시양태는 본원에 제공된 숙주 세포 중 어느 하나 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 포함한다.
특정 치료 방법
본원에 제공된 방법 및 조성물 중 일부는 치료적 대안에 관한 것이다. 일부 이러한 방법은 대상체에게 본원에 제공된 숙주 세포 중 어느 하나를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체, 바람직하게는 인간에서 암을 치료, 억제 또는 개선하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 대상체, 바람직하게는 인간은 상기 대상체가 겪고 있는 암에 특이적인 CAR을 수용하도록 선택되거나 확인된다. 이러한 요법에 반응하는 대상체 또는 대상체 집단의 이러한 선택 또는 확인은 임상 및/또는 진단 평가, 예컨대 상기 대상체에 존재하는 암 세포 상의 CD171의 존재 또는 양의 진단 평가를 이용하여 임상의 또는 의사에 의해 이루어질 수 있다.
일부 실시양태에서, 대상체에게 120개 미만의 연속 아미노산 잔기 길이를 갖는 폴리펩티드 스페이서를 포함하는 CAR을 포함하는 복수의 세포의 암을 치료, 억제 또는 개선하기에 충분한 용량 미만인, 암을 치료, 억제 또는 개선하기에 충분한 복수의 숙주 세포를 포함하는 용량이 투여된다.
일부 실시양태에서, 대상체에게 1 x 106개 세포/kg, 2 x 106개 세포/kg, 3 x 106개 세포/kg, 4 x 106개 세포/kg, 5 x 106개 세포/kg, 6 x 106개 세포/kg, 7 x 106개 세포/kg, 8 x 106개 세포/kg, 9 x 106개 세포/kg 미만 (단 0개 이상)의 복수의 숙주 세포를 포함하는 용량이 투여된다.
일부 실시양태는 또한 본원에 개시된 요법 중 하나 이상에 더하여 대상체에게 세툭시맙을 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 암은 CD171 발현 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 암은 뇌암을 포함한다. 일부 실시양태에서, 암은 신경모세포종 또는 신경절신경모세포종으로부터 선택된다. 추가의 실시양태는 약제, 바람직하게는 신경모세포종 또는 신경절신경모세포종과 같은 암의 치료, 억제 또는 개선을 위한 약제로서 본원에 기재된 어느 하나 이상의 숙주 세포의 용도를 포함한다.
실시예
실시예 1 (비교 실시예) - 항-CD171 CAR의 시험관내 및 이종이식 활성
항-CD171 CAR은 문헌 (U.S. 2018/0009891 및 Kunkele A. et al., (2015) Cancer Immunol Res 3:368-379, 각각은 전체가 참조로 명백히 포함됨)에 기재된 것과 실질적으로 유사한 방법에 의해 제조되었다. 항-CD171 CAR은 짧은 스페이서 (IgG4 힌지 도메인), 중간 스페이서 (IgG4 힌지-CH2 도메인), 또는 긴 스페이서 (IgG4-CH2-CH3 도메인)를 갖는 2세대 CAR을 포함하였다. 도 1은 짧은 스페이서를 갖는 2세대 CAR 및 3세대 항-CD171 CAR을 코딩하는 핵산의 예시적인 구조의 개략도를 도시한다. 2세대 CAR은 CD28 세포질 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인이 결여되어 있다. 3세대 CAR은 CD28 막횡단 도메인과 4-1BB 도메인 사이에 위치한 CD28 세포질 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하였다.
각각의 세대의 CAR을 함유하는 세포의 활성을 결정하기 위해 시험관내 연구 및 생체내 이종이식 연구를 수행하였다 (문헌 (Kunkele A. et al., (2015) Cancer Immunol Res 3:368-379) 참조). 간략하게, 더 긴 스페이서를 갖는 CAR은 중간 또는 짧은 스페이서를 갖는 CAR보다 1:1 E:T 비율로 CD171+ Be2 신경모세포종 세포와의 공동-배양 시 더 높은 수준의 포스포-ERK를 유도하였다. 더 긴 스페이서를 갖는 CAR은 중간 또는 짧은 스페이서를 갖는 CAR보다 1:1 E:T 비율로 CD171+ Be2 세포와의 공동-배양 시 더 높은 수준의 CD137 표면 발현을 유도하였다. 더 긴 스페이서를 갖는 CAR은 중간 또는 짧은 스페이서를 갖는 CAR보다 CD171+ Be2 세포와의 공동-배양 시 더 높은 수준의 특이적 용해를 유도하였다. 더 긴 스페이서를 갖는 CAR은 중간 또는 짧은 스페이서를 갖는 CAR보다 혼합된 종양 배양에서 높은 수준의 시토카인 분비, IL-2, TNF알파 및 IFN 감마를 자극하였다.
그러나, 더 긴 스페이서를 갖는 항-CD171 CAR은 중간 또는 더 짧은 스페이서를 갖는 CAR보다 실질적으로 더 낮은 시험관내 활성을 가졌다. 간략하게, 제0일에 ffLuc+Be2 종양을 정위적으로 이식하고 제7일에 CAR을 투여한 두개내 마우스 신경모세포종 이종이식 요법 모델을 사용하였다. 긴 스페이서를 갖는 CAR과 접촉된 종양에서, 종양 및 마우스 생존으로부터의 신호 증가는 대조군 세포와 접촉된 종양과 실질적으로 유사하였다. 대조적으로, 종양이 짧은 또는 중간 스페이서를 갖는 CAR과 접촉되었을 때, 마우스 생존은 대조군 세포와 접촉된 종양과 비교하여 실질적으로 증가되었다. 따라서, 예상외로, 긴 스페이서를 갖는 CAR 구축물은 가장 높은 시험관내 활성을 발생시켰지만 생체내에서 약화된 항종양 효능을 나타내었다.
실시예 2 - 항-CD171 CAR의 시험관내 및 이종이식 활성
CH2 도메인이 L235D 치환 및 N257Q 치환 (서열식별번호: 18)을 포함하는 IgG4-CH2-CH3 도메인을 포함하는 이중 돌연변이의 긴 스페이서를 함유하는 2세대 및 3세대 항-CD171 CAR이 생성되었다. L235D 치환은 인간 FcγR1에 대한 결합을 감소시키거나 제거시키고, N257Q 치환은 뮤린 FcγR1에 대한 결합을 감소시키거나 제거시켰다.
하기 CAR의 활성을 비교하기 위해 시험관내 연구 및 생체내 이종이식 연구를 수행하였다: 짧은 스페이서를 갖는 2세대 CAR; 짧은 스페이서를 갖는 3세대 CAR; 이중 돌연변이의 긴 스페이서를 갖는 2세대 CAR; 및 이중 돌연변이의 긴 스페이서를 갖는 3세대 CAR. 간략하게, CAR을 함유하는 세포를 대조군 세포 또는 CD171+ 표적 세포와 다양한 비율로 시험관내에서 공동-배양하고, 표적 세포의 특이적 용해를 측정하였다 (도 2). 각각의 CAR을 갖는 CD171+ 표적 Be2 세포에 대해 특이적 용해가 관찰되었으며, 긴 스페이서를 갖는 CAR이 짧은 스페이서를 갖는 CAR보다 다소 더 큰 활성을 가졌다. CAR을 함유하는 세포를 대조군 세포 또는 CD171+ 표적 세포와 함께 시험관내에서 공동-배양하고, 자극된 시토카인을 측정하였다 (도 3). CAR은 시토카인 자극을 유도하였으며, 긴 스페이서를 갖는 CAR은 짧은 스페이서를 갖는 CAR보다 다소 더 큰 활성을 가졌다.
제0일에 ffLuc+Be2 종양을 정위적으로 이식하고 제7일에 CAR을 투여한 생체내 두개내 마우스 신경모세포종 이종이식 요법 모델을 사용하였다. 긴 또는 짧은 스페이서를 갖는 3세대 CAR은 종양을 근절하고 (도 4), 생존 기간을 연장시켰다 (도 5). 짧은 또는 긴 스페이서를 갖는 2세대 CAR도 종양을 근절하였지만 조기 사망을 초래하였다 (도 4 및 도 5).
실시예 3 - 주입을 위한 CAR의 제조
항-CD171 CAR은 문헌 (U.S. 2018/0009891, 전체가 참조로 명백히 포함됨)에 기재된 것과 실질적으로 유사한 방법에 의해 제조되었다. CAR은 짧은 스페이서를 포함하는 2세대 항-CD171 CAR; 긴 스페이서를 포함하는 2세대 항-CD171 CAR; 및 짧은 스페이서를 포함하는 3세대 항-CD171 CAR을 포함하였다. 짧은 스페이서는 IgG4 힌지 도메인을 포함하였다. 긴 스페이서는 CH2 도메인이 L235D 치환 (서열식별번호: 02)을 포함하는 IgG4 힌지-CH2-CH3 도메인을 포함하였다. L235D 치환은 FcγR1에 대한 결합을 감소시키거나 제거시켰다.
실시예 4 - 주입을 위한 CAR T 세포의 제조
대상체로부터의 CAR T 세포는 문헌 (Kunkele A., et al., (2017) Clin Cancer Res 23:466-477, 전체가 참조로 명백히 포함됨)에 기재된 것과 실질적으로 유사한 방법에 의해 제조되었다. 간략하게, 대상체는 대략 5 X 109개 PBMC 수집을 위해 표준 성분채집술을 받았다. CD4 및 CD8 자성 비드를 사용하여 CD4+ 및 CD8+ T 세포 집단을 단리한 후, 세포를 항-CD3/CD28 비드 (라이프 테크놀로지즈 (Life Technologies))로 자극하고, 10% 정의되고 방사선조사되고 열-불활성화된 FBS (GE 하이클론 (GE Hyclone)), IL15 (0.5 ng/mL), 및 CD8+ 세포에 대해 IL2 (50 U/mL), CD4+ 세포에 대해 IL7 (5 ng/mL)로 보충된 X-비보 (X-Vivo) 배지 (론자 (Lonza))에서 배양하였다. CE7 CAR 렌티바이러스 벡터로의 형질도입은 1 mg/mL 프로타민 술페이트 (APP 파마슈티칼스 (APP Pharmaceuticals))로 보충된 렌티바이러스 상청액 [대략적인 감염 다중도 (MOI) = 0.1]을 사용하여 32℃에서 30분 동안 800 X g에서 원심분리에 의해 제1일에 수행되었다. 잔류 자극 비드는 CTS 자석 시스템 (라이프 테크놀로지즈)을 사용하여 냉동 보존하기 전에 배양물로부터 제거되었다. 계획된 주입일까지 세포를 확장하고 크리오스터 CS-5 (CryoStor CS-5) (시그마 (Sigma))에서 냉동 보존하였다.
실시예 5 - I상 임상 시험
시험 프로토콜
CD171-특이적 키메라 항원 수용체를 발현하도록 렌티바이러스로 형질도입된 자가 T 세포를 사용하여 재발성/불응성 신경모세포종에 대한 세포 면역요법의 실행가능성 및 안전성을 결정하기 위한 1상 임상 시험이 시작되었다.
대상체 포함 기준은 하기를 포함하였다: 조직학적 검증 및/또는 증가된 카테콜아민 수준을 갖는 골수 내 종양 세포의 입증에 의한 신경모세포종 또는 신경절신경모세포종의 사전 진단; ≤ 26세의 남성 또는 여성 대상체; 초기 진단 시 고위험 신경모세포종 진단 또는 초기 진단 시 고위험이 아닌 경우 생후 > 18개월 때 전이 진행의 증거를 반드시 가짐; 측정가능하거나 평가가능한 질환; ≥ 50의 란스키 (Lansky) 또는 카르노프스키 (Karnofsky) 수행 상태 점수; ≥ 8주의 기대 수명; 본 연구에 등록하기 전에 이전의 모든 화학요법, 면역요법 또는 방사선요법의 유의한 급성 독성 효과로부터 회복됨; 마지막 화학요법 또는 생물학적 요법 투여 후 ≥ 7일; 등록 7일 이내에 (생리학적 대체 투여가 아닌 한) 전신 코르티코스테로이드 없음; ≥ 3 반감기 또는 항-종양 지시된 항체 요법의 마지막 투여 시점으로부터 30일, 등록 시점보다 더 짧은 시점; 골수절제 요법 및 자가 줄기 세포 이식 (줄기 세포 주입 시간 기준)으로부터 ≥ 6주, 비-골수절제 요법 후 줄기 세포 주입을 받은 환자는 다른 모든 적격성 요건을 충족하면 자격이 있으며, 환자는 이전에 동종이계 조혈 줄기 세포 이식을 받은 바 없어야 함; 여전히 검출가능한 이전의 유전자조작으로 변형된 세포 요법 또는 이전의 바이러스요법이 없음; 연구 등록 시 외부 빔 방사선 요법을 받고 있지 않아야 함. 이전 I131 MIBG 요법으로부터 ≥ 12주; 적절한 기관 기능; 적절한 실험실 값; 등록 전 3개월 이내에 음성 HIV 항원 및 항체, B형 간염 표면 항원 및 C형 간염 항체, 양성 C형 간염 항체를 갖는 환자의 경우, 자격을 갖추려면 음성 PCR 검사가 문서화되어야 함.
대상체 제외 기준은 하기를 포함하였다: 관련 CNS 병리 또는 현재 관련 CNS 병리 (지속적인 항-간질 약물이 필요한 비-열성 발작 장애, 부전 마비, 실어증, 뇌혈관 허혈/출혈, 중증 뇌 손상, 치매, 소뇌 질환, 기질성 뇌 증후군, 정신병, 협동 또는 운동 장애)의 병력, 환자는 CNS 두개내 종양을 가질 수 있음; 임신 또는 모유-수유; 필요한 경우 임시 성분채집술 카테터 배치를 포함하는 성분채집술 절차를 견딜 수 없음; 신경모세포종 이외의 활성 악성종양의 존재; 공지된 두개내 전이성 신경모세포종, 및 연조직 확장을 동반한 두개골 기반 질환의 존재; 활성 중증 감염의 존재; 프로토콜 주임 연구자의 의견에 따라 환자가 프로토콜-기반 요법을 받는 것을 방해할 임의의 동시 의학적 병태의 존재; 원발성 면역결핍/골수부전 증후군의 존재; 연구 시작 시점에 임의의 다른 항-암제 또는 방사선요법을 받음; 연구 참여 및 15년 후속 조치에 대한 동의/찬성을 제공할 의사가 없거나 제공할 수 없음.
이용된 프로토콜은 하기와 실질적으로 동일하였다. 적격성 요건을 충족하고 연구에 등록할 때, 대상체는 CD171 CAR+ T 세포 생성을 위한 T 세포를 얻기 위해 성분채집술을 받았다. T 세포를 성분채집술 산물로부터 단리한 다음, CD4 및 CD8 T 세포를 선별하여 별도로 성장시키고, CD171 CAR 뿐만 아니라 신호전달 능력이 없는 말단절단된 EGFR (EGFRt)를 발현하도록 렌티바이러스로 형질도입하고, 4-6주 기간 동안 배양물에서 확장하였다. CAR+ T 세포가 생성된 후, 대상체는 질환 평가 및 필요한 림프구고갈 요법의 결정을 받았다. 림프구고갈이 완료된지 적어도 48시간 후, 대상체는 CD4 대 CD8 CAR+ T 세포의 대략 1:1 비율로 CAR+ T 세포의 주입을 받았다. 일부 대상체는 유전자조작으로 변형된 T 세포의 제거를 위해 세툭시맙을 추가로 받았다. 세툭시맙을 받는 기준은 생명을 위협하는 급성 독성 뿐만 아니라 주입된 유전자조작으로 변형된 T 세포로부터 발생하는 림프증식성 장애를 나타내는 연구를 포함하였다. 1차 결과 측정은 환자가 용량 제한 독성 (DLT) 발생에 대해 제28일까지 평가된 DLT를 포함하였다. 2차 결과 측정은 환자가 42일 기간으로 수정된 국제 신경모세포종 반응 기준에 따라 평가된 종양 반응을 포함하였다.
임상 시험은 A, B 및 C의 3가지 실험 아암을 포함하였다. 실험 아암 A는 짧은 스페이서 2세대 CE7R CAR T 세포의 사용을 포함하였다. 이용된 프로토콜은 하기와 실질적으로 동일하였다. 자가 CD4 및 CD8 세포는 또한 EGFRt를 발현하는 환자 유래된 CD171 특이적 CAR T 세포를 생성하기 위해 렌티바이러스로 형질도입되었다. 환자는 4-1BB:제타 CD171CAR 및 EGFRt를 발현하도록 형질도입된 자가 T 세포를 정맥내 주입하기 전에 림프구고갈 화학요법을 받았다. CD171 특이적 CAR T 세포는 림프구고갈 화학요법 후 대략 2-3일에 투여되었다. 세포를 대략 1:1 CD4 및 CD8 세포로 투여하고, 용량 수준을 1x106개 세포/kg (용량 1), 5x106개 세포/kg (용량 2), 1x107개 세포/kg (용량 3), 5x107개 세포/kg (용량 4), 또는 1x108개 세포/kg (용량 5)의 총 T 세포 용량에 대해 평가하였다.
실험 아암 B는 짧은 스페이서 3세대 CE7R CAR T 세포의 사용을 포함하였다. 이용된 프로토콜은 하기와 실질적으로 동일하였다. 자가 CD4 및 CD8 세포는 또한 EGFRt를 발현하는 환자 유래된 CD171 특이적 CAR T 세포를 생성하기 위해 렌티바이러스로 형질도입되었다. 환자는 CD28:4-1BB:제타 CD171CAR 및 EGFRt를 발현하도록 형질도입된 자가 T 세포를 정맥내 주입하기 전에 림프구고갈 화학요법을 받았다. CD171 특이적 CAR T 세포는 림프구고갈 화학요법 후 대략 2-3일에 투여되었다. 세포를 대략 1:1 CD4 및 CD8 세포로 투여하고, 용량 수준을 1x106개 세포/kg (용량 1), 5x106개 세포/kg (용량 2), 1x107개 세포/kg (용량 3), 5x107개 세포/kg (용량 4), 또는 1x108개 세포/kg (용량 5)의 총 T 세포 용량에 대해 평가하였다.
실험 아암 C는 긴 스페이서 2세대 CE7R CAR T 세포의 사용을 포함하였다. 이용된 프로토콜은 하기와 실질적으로 동일하였다. 자가 CD4 및 CD8 세포는 또한 EGFRt를 발현하는 환자 유래된 CD171 특이적 CAR T 세포를 생성하기 위해 렌티바이러스로 형질도입되었다. 환자는 4-1BB:제타 CD171CAR 및 EGFRt를 발현하도록 형질도입된 자가 T 세포를 정맥내 주입하기 전에 림프구고갈 화학요법을 받았다. CD171 특이적 CAR T 세포는 림프구고갈 화학요법 후 대략 2-3일에 투여되었다. 세포를 대략 1:1 CD4 및 CD8 세포로 투여하고, 용량 수준을 1x106개 세포/kg (용량 1), 5x106개 세포/kg (용량 2), 1x107개 세포/kg (용량 3), 5x107개 세포/kg (용량 4), 또는 1x108개 세포/kg (용량 5)의 총 T 세포 용량에 대해 평가하였다.
결과
28명의 대상체가 연구에 등록되었다. 19명의 대상체가 CAR T 세포 주입을 받았고, 이 중 2명은 2차 주입을 받았다. 6명의 대상체는 가족 선호, 질환 진행 및 T 세포 주입에 대한 부적격, 또는 CAR T 세포 제조 불능을 포함한 이유로 CAR T 세포 주입을 받기 전에 프로토콜 요법을 중단하였다. 3명의 대상체는 임상적으로 안정적이며 대상체는 T 세포 주입을 진행하기 전에 질환 진행의 징후/증상을 기다리고 있다.
등급 2 반구진성 피부 발진 및 등급 3-4 저나트륨혈증이 용량 수준 3 아암 B, 및 용량 수준 5 아암 A에서 처리된 대상체에서 관찰되었다. 용량 수준 5 아암 A의 대상체의 용량 제한 독성에 대한 충족 기준 및 이전 "케이-인-로우 (k-in-row)" 업-앤드-다운 (up-and-down) 용량 증량 통계 설계를 재개하기 위한 기준. 프로토콜은 CAR T 세포 주입 후 혈청 및 소변 전해질의 추가 평가를 포함하도록 수정되었다. 후속 용량 할당은 프로토콜 통계 설계에 따라 용량 수준 4 아암 A, 및 용량 수준 2 아암 B에서 재시작되었다. 아암 A 및 B에 대한 "케이-인-로우" 통계 설계를 재개한 이후, 11명의 환자가 등록되었고 6명의 환자가 아암 A 및 B에서 T 세포 주입을 받았다: 아암 A 용량 수준 4 (2명의 대상체), 아암 B 용량 수준 2 (3명의 대상체), 아암 B 용량 수준 3 (1명의 대상체). 아암 C는 단일 환자 증량 설계 단계에서 발생 (accrual)을 시작하였고, 1명의 대상체는 DLT를 경험하지 않고 용량 수준 1에서 처리되었다. 참고로, 3명의 환자는 아암 B 용량 수준 2에서 처리되었고, 아암 B 용량 수준 3으로 다시 증량하는 기준을 충족하였으며, 이 중 1명의 추가 환자는 DLT 없이 처리되었다.
T 세포와 관련된 독성은 시토카인 방출 증후군, 피부 발진 및 저나트륨혈증을 포함한다. 19명의 대상체 중 10명은 T 세포 주입 후 등급 1-2 피부 발진이 발생하였다: 아암 B 용량 수준 2에서 4/4 대상체 (대상체 S14, S18, S20 및 S21); 아암 B 용량 수준 3에서 2/2 대상체 (대상체 S15, S23); 아암 A 용량 수준 4에서 3/4 대상체 (대상체 S11, S22, S25); 및 아암 A 용량 수준 5에서 1/1 대상체 (대상체 S16). 10명의 대상체 중 8명은 피부 발진과 동시에 혈액 내 T 세포 지속의 증거를 가졌다. S15 및 S22 대상체에 대해 피부 생검을 수행하였으며, 둘 다 진피-표피 접합부에서 EGFRt+ T 세포 침윤 및 CD171 양성 세포의 공동-국소화를 입증하였으며, 이는 CAR T 세포의 온-표적, 오프-종양 효과와 일치한다. 아암 B 용량 수준 3 (대상체 S15), 및 아암 A 용량 수준 5 (대상체 S16)에서의 2명의 대상체에서 저나트륨혈증이 발생하였으며, 둘 다 동시에 T 세포 지속성을 나타내었다.
T 세포는 제84일에 골수에서 검출가능한 CAR T 세포를 갖는 대상체 S06을 제외하고는 용량 수준 1에서 아암 A 또는 B를 받은 대상체의 혈액에서 검출되지 않았다. 특히, 아암 C 용량 수준 1에서 대상체 S27은 제28일까지 검출가능한 CAR T 세포를 가졌다. 대조적으로, 제7일에 T 세포 지속성은 용량 수준 2 이상을 받는 11/14 대상체 및 용량 수준 3 이상에서 처리된 7/8 대상체에서 관찰되었다. 반응에 대해 평가할 수 있는 18명의 대상체에 대한 최상의 전체 반응은 아암 C 용량 수준 1에서 1명의 대상체 (S27)의 부분 반응이었다. 진행성 질환이 발생한 1명의 환자 (S06 - 아암 B 용량 수준 1)는 어떠한 후속 요법도 없이 CAR T 세포 주입 이후 3+년 동안 장기간 안정된 질환을 가지고 있다. 공지된 전이성 병변의 크기 증가에 이어 이 병변의 퇴행으로 정의되는 거짓-진행이 7/19 대상체에서 관찰되었으며, 이들 모두는 최소 제7일에 문서화된 T 세포 지속성을 가졌다. 제13일에 대상체 S15에서 수행된 두개골 전이성 병변의 생검은 CAR T 세포 침윤과 일치하는 EGFRt에 대해 대략 30% +로 CD3+ 침윤을 나타내었다.
독성 및 거짓-진행은 T 세포 지속성과 연관된 것으로 나타났으며, 용량 및 아암 연관성이 일부 제시되었다. 2명의 대상체에게 CAR T 세포가 재주입되었으며, 1명은 아암 B 용량 수준 2 (S20) 및 아암 C 용량 수준 1 (S27)이었다. S20은 1차 주입 후 ~210일 동안 안정한 질환을 가졌고, 무증상 진행성 질환으로 인해 저장된 CAR T 세포의 2차 주입이 수행되었다. 주입 #2는 CAR T 세포로 인한 어떠한 부작용도 없이 내약성이 우수하였다. 환자는 제+42일에 무증상 진행성 질환을 경험하고 추천 기관으로 돌아갔다. 대상체 S27은 MIBG에서 대상체의 공지된 전이성 병변 중 하나의 퇴행에 의해 입증된 바와 같이 제42일에 1차 CAR T 세포 주입에 대해 부분 반응을 가졌다. 이러한 발견에 기초하여, 대상체는 2차 CAR T 세포 주입을 받았고, 이는 내약성이 우수하였고, 2차 주입 후 128일에 진행성 질환이 발생하였다.
놀랍게도, 긴 스페이서 2세대 CAR을 포함하는 CAR T 세포 (아암 C)의 매우 낮은 용량 (용량 수준 1)으로 처리된 대상체 S27은 적어도 제28일까지 CAR T 세포 지속성을 입증하였다. 대조적으로, 짧은 스페이서 2세대 또는 3세대 CAR을 포함하는 CAR T 세포 (아암 A 및 B)의 더 높은 용량 (용량 수준 2 이상)으로 처리된 대상체는 일반적으로 단지 제7일에 CAR T 세포 지속성을 입증하였다. 반응에 대해 평가할 수 있는 18명의 대상체에 대한 최상의 전체 반응은 아암 C 용량 수준 1에서 1명의 대상체 (S27)의 부분 반응이었다.
본원에 사용된 용어 "포함하는"은 "함유하는" 또는 "을 특징으로 하는"과 동의어이며, 포괄적이거나 개방적이며, 추가의 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.
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SEQUENCE LISTING <110> Jensen, Michael C. <120> ANTI-CD171 CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS <130> SCRI.283WO <150> 63/036021 <151> 2020-06-08 <160> 20 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 787 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CE7 scFV <400> 1 atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60 atcccccagg tgcagctgca gcagcctggc gccgagctgg tgaagccagg cgccagcgtg 120 aagctgtcct gcaaggccag cggctacacc ttcaccggct actggatgca ctgggtgaag 180 cagagacccg gccacggcct ggaatggatc ggcgagatca accccagcaa cggccggacc 240 aactacaacg agcggttcaa gagcaaggcc accctgaccg tggacaagag cagcaccacc 300 gccttcatgc agctgtccgg cctgaccagc gaggacagcg ccgtgtactt ctgcgccagg 360 gactactacg gcaccagcta caacttcgac tactggggcc agggcaccac actgaccgtg 420 agcagcggcg gagggggctc tggcggcgga ggatctgggg gagggggcag cgacatccag 480 atgacccaga gcagcagcag cttcagcgtg agcctgggcg accgggtgac catcacctgt 540 aaggccaacg aggacatcaa caaccggctg gcctggtatc agcagacccc cggcaacagc 600 cccaggctgc tgatcagcgg cgccaccaac ctggtgaccg gcgtgcccag ccggtttagc 660 ggcagcggct ccggcaagga ctacaccctg accatcacaa gcctgcaggc cgaggacttc 720 gccacctact actgccagca gtactggtcc acccccttca ccttcggcag cggcaccgag 780 ctggaaa 787 <210> 2 <211> 229 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L (long) spacer L235D substitution <400> 2 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Asp Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly Lys 225 <210> 3 <211> 673 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L (long) spacer L235D substitution <400> 3 gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccga gttcgacggc ggacccagcg tgttcctgtt 60 cccccccaag cccaaggaca ccctgatgat cagccggacc cccgaggtga cctgcgtggt 120 ggtggacgtg agccaggaag atcccgaggt ccagttcaat tggtacgtgg acggcgtgga 180 agtgcacaac gccaagacca agcccagaga ggaacagttc aacagcacct accgggtggt 240 gtctgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc aaagaataca agtgcaaggt 300 gtccaacaag ggcctgccca gcagcatcga aaagaccatc agcaaggcca agggccagcc 360 tcgcgagccc caggtgtaca ccctgcctcc ctcccaggaa gagatgacca agaaccaggt 420 gtccctgacc tgcctggtga agggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag 480 caacggccag cctgagaaca actacaagac cacccctccc gtgctggaca gcgacggcag 540 cttcttcctg tacagccggc tgaccgtgga caagagccgg tggcaggaag gcaacgtctt 600 tagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac acccagaaga gcctgagcct 660 gtccctgggc aag 673 <210> 4 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28tm <400> 4 Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser 1 5 10 15 Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val 20 25 <210> 5 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28tm <400> 5 atgttctggg tgctggtggt ggtcggaggc gtgctggcct gctacagcct gctggtcacc 60 gtggccttca tcatcttttg ggtg 84 <210> 6 <211> 41 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CD28 cytoplasmic <400> 6 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 35 40 <210> 7 <211> 126 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 41-BB <400> 7 aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60 actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120 gaactg 126 <210> 8 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3zeta <400> 8 cgggtgaagt tcagcagaag cgccgacgcc cctgcctacc agcagggcca gaatcagctg 60 tacaacgagc tgaacctggg cagaagggaa gagtacgacg tcctggataa gcggagaggc 120 cgggaccctg agatgggcgg caagcctcgg cggaagaacc cccaggaagg cctgtataac 180 gaactgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgg 240 aggcggggca agggccacga cggcctgtat cagggcctgt ccaccgccac caaggatacc 300 tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc ccaagg 336 <210> 9 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T2A <400> 9 ctcgagggcg gcggagaggg cagaggaagt cttctaacat gcggtgacgt ggaggagaat 60 cccggcccta gg 72 <210> 10 <211> 1005 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFRt <400> 10 cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 60 acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc tccatcagtg gcgatctcca catcctgccg 120 gtggcattta ggggtgactc cttcacacat actcctcctc tggatccaca ggaactggat 180 attctgaaaa ccgtaaagga aatcacaggg tttttgctga ttcaggcttg gcctgaaaac 240 aggacggacc tccatgcctt tgagaaccta gaaatcatac gcggcaggac caagcaacat 300 ggtcagtttt ctcttgcagt cgtcagcctg aacataacat ccttgggatt acgctccctc 360 aaggagataa gtgatggaga tgtgataatt tcaggaaaca aaaatttgtg ctatgcaaat 420 acaataaact ggaaaaaact gtttgggacc tccggtcaga aaaccaaaat tataagcaac 480 agaggtgaaa acagctgcaa ggccacaggc caggtctgcc atgccttgtg ctcccccgag 540 ggctgctggg gcccggagcc cagggactgc gtctcttgcc ggaatgtcag ccgaggcagg 600 gaatgcgtgg acaagtgcaa ccttctggag ggtgagccaa gggagtttgt ggagaactct 660 gagtgcatac agtgccaccc agagtgcctg cctcaggcca tgaacatcac ctgcacagga 720 cggggaccag acaactgtat ccagtgtgcc cactacattg acggccccca ctgcgtcaag 780 acctgcccgg caggagtcat gggagaaaac aacaccctgg tctggaagta cgcagacgcc 840 ggccatgtgt gccacctgtg ccatccaaac tgcacctacg gatgcactgg gccaggtctt 900 gaaggctgtc caacgaatgg gcctaagatc ccgtccatcg ccactgggat ggtgggggcc 960 ctcctcttgc tgctggtggt ggccctgggg atcggcctct tcatg 1005 <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S (small) spacer <400> 11 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S (small) spacer <400> 12 gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct 36 <210> 13 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M (medium) spacer <400> 13 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg 1 5 10 15 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 20 25 30 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 35 40 45 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 50 55 60 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 65 70 75 80 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 85 90 95 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 100 105 110 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 115 <210> 14 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M (medium) spacer <400> 14 gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccctggcc agcctagaga accccaggtg 60 tacaccctgc ctcccagcca ggaagagatg accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg 120 gtcaaaggct tctaccccag cgatatcgcc gtggaatggg agagcaacgg ccagcccgag 180 aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg gacagcgacg gcagcttctt cctgtactcc 240 cggctgaccg tggacaagag ccggtggcag gaaggcaacg tcttcagctg cagcgtgatg 300 cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag aagtccctga gcctgagcct gggcaag 357 <210> 15 <211> 229 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L (long) spacer <400> 15 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly Lys 225 <210> 16 <211> 687 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L (long) spacer <400> 16 gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccctgccc ccgagttcga cggcggaccc 60 agcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagccg gacccccgag 120 gtgacctgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagatcccg aggtccagtt caattggtac 180 gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccca gagaggaaca gttccagagc 240 acctaccggg tggtgtctgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaagaa 300 tacaagtgca aggtgtccaa caagggcctg cccagcagca tcgaaaagac catcagcaag 360 gccaagggcc agcctcgcga gccccaggtg tacaccctgc ctccctccca ggaagagatg 420 accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg gtgaagggct tctaccccag cgacatcgcc 480 gtggagtggg agagcaacgg ccagcctgag aacaactaca agaccacccc tcccgtgctg 540 gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc cggctgaccg tggacaagag ccggtggcag 600 gaaggcaacg tctttagctg cagcgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 660 aagagcctga gcctgtccct gggcaag 687 <210> 17 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28 cytoplasmic (LL->GG, at 7th and 8th amino acid residues) <400> 17 cggagcaagc ggagcagagg cggccacagc gactacatga acatgacccc cagacggcct 60 ggccccaccc ggaagcacta ccagccctac gccccaccca gggactttgc cgcctacaga 120 agc 123 <210> 18 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28 cytoplasmic (LL->GG, at 7th and 8th residues) <400> 18 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 35 40 <210> 19 <211> 229 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L (long) spacer L235D and N257Q substitutions (underlined) <400> 19 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Asp Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly Lys 225 <210> 20 <211> 673 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L (long) spacer L235D and N257Q codon substitutions <400> 20 gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccga gttcgacggc ggacccagcg tgttcctgtt 60 cccccccaag cccaaggaca ccctgatgat cagccggacc cccgaggtga cctgcgtggt 120 ggtggacgtg agccaggaag atcccgaggt ccagttcaat tggtacgtgg acggcgtgga 180 agtgcacaac gccaagacca agcccagaga ggaacagttc cagagcacct accgggtggt 240 gtctgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc aaagaataca agtgcaaggt 300 gtccaacaag ggcctgccca gcagcatcga aaagaccatc agcaaggcca agggccagcc 360 tcgcgagccc caggtgtaca ccctgcctcc ctcccaggaa gagatgacca agaaccaggt 420 gtccctgacc tgcctggtga agggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag 480 caacggccag cctgagaaca actacaagac cacccctccc gtgctggaca gcgacggcag 540 cttcttcctg tacagccggc tgaccgtgga caagagccgg tggcaggaag gcaacgtctt 600 tagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac acccagaaga gcctgagcct 660 gtccctgggc aag 673

Claims (45)

  1. 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산으로서, CAR은
    CD171에 특이적으로 결합할 수 있거나 특이적으로 결합하도록 구성된 리간드 결합 도메인;
    120개 이상 및 230개 이하의 연속 아미노산 잔기 길이를 갖는 폴리펩티드 스페이서;
    막횡단 도메인; 및
    세포내 신호전달 도메인
    을 포함하는 것인 핵산.
  2. 제1항에 있어서, 폴리펩티드 스페이서가 L235D 치환을 포함하는 IgG4 힌지-CH2-CH3 도메인을 포함하는 것인 핵산.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 폴리펩티드 스페이서가 서열식별번호: 02의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 리간드 결합 도메인이 CE7 모노클로날 항체로부터 유래되는 것인 핵산.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 리간드 결합 도메인이 서열식별번호: 01의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 scFv를 포함하는 것인 핵산.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 막횡단 도메인이 CD28 막횡단 도메인을 포함하는 것인 핵산.
  7. 제6항에 있어서, CD28 막횡단 도메인이 서열식별번호: 04의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인이 CD3-제타 도메인 또는 이의 기능적 부분과 조합하여 CD27, CD28, 4-1BB, OX-40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, LFA-1, CD2, CD7, NKG2C, 및 B7-H3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 공동자극 도메인을 포함하는 것인 핵산.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인이 CD28 세포질 도메인을 포함하는 것인 핵산.
  10. 제9항에 있어서, CD28 세포질 도메인이 서열식별번호: 18의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인이 CD28 세포질 도메인이 결여되어 있는 것인 핵산.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인이 4-1BB 공동자극 도메인을 포함하는 것인 핵산.
  13. 제12항에 있어서, 4-1BB 공동자극 도메인이 서열식별번호: 07의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 것인 핵산.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, CD3-제타 도메인 또는 이의 기능적 부분이 서열식별번호: 08의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 것인 핵산.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 구성적 프로모터를 추가로 포함하는 것인 핵산.
  16. 제15항에 있어서, 구성적 프로모터가 EF1α 프로모터를 포함하는 것인 핵산.
  17. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 유도성 프로모터를 추가로 포함하는 것인 핵산.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 표면 선별가능한 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것인 핵산.
  19. 제18항에 있어서, 세포 표면 선별가능한 마커가 말단절단된 EGFR 폴리펩티드 (EGFRt) 또는 말단절단된 Her2 폴리펩티드 (Her2t)로부터 선택되는 것인 핵산.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 세포 표면 선별가능한 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 사이에 위치한 리보솜 스킵 서열을 추가로 포함하는 것인 핵산.
  21. 제20항에 있어서, 리보솜 스킵 서열이 P2A 서열, T2A 서열, E2A 서열, 및 F2A 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 핵산.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 자살 유전자 시스템을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것인 핵산.
  23. 제22항에 있어서, 자살 유전자 시스템이 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제/간시클로비르 (HSVTK/GCV) 자살 유전자 시스템, 또는 유도성 카스파제 자살 유전자 시스템으로부터 선택되는 것인 핵산.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    리간드 결합 도메인이 서열식별번호: 01의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되며; 폴리펩티드 스페이서가 서열식별번호: 02의 아미노산 서열로 이루어지고; 막횡단 도메인이 서열식별번호: 04의 아미노산 서열을 포함하고; 세포내 신호전달 도메인이 서열식별번호: 07의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 4-1BB 공동자극 도메인, 및 서열식별번호: 08의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 CD3-제타 도메인 또는 이의 기능적 부분을 포함하고;
    리간드 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 EF1 프로모터, T2A 리보솜 스킵 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 EGFRt 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것인 핵산.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드.
  26. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 벡터.
  27. 제26항에 있어서, 벡터가 바이러스 벡터, 트랜스포존 벡터, 인테그라제 벡터, 및 mRNA 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 벡터.
  28. 제27항에 있어서, 바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터, 포미 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 및 감마 레트로바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 벡터.
  29. 제28항에 있어서, 바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터인 벡터.
  30. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  31. 제30항에 있어서, 숙주 세포가 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포인 숙주 세포.
  32. 제30항에 있어서, 숙주 세포가 전구체 T 세포 또는 조혈 줄기 세포인 숙주 세포.
  33. 제30항에 있어서, 숙주 세포가 나이브 CD8+ T 세포, CD8+ 메모리 T 세포, 중심 메모리 CD8+ T 세포, 조절 CD8+ T 세포, IPS 유래된 CD8+ T 세포, 이펙터 메모리 CD8+ T 세포, 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 CD8+ 세포독성 T 세포인 숙주 세포.
  34. 제30항에 있어서, 숙주 세포가 나이브 CD4+ T 세포, CD4+ 메모리 T 세포, 중심 메모리 CD4+ T 세포, 조절 CD4+ T 세포, IPS 유래된 CD4+ T 세포, 이펙터 메모리 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 CD4+ T 헬퍼 세포인 숙주 세포.
  35. 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 대상체, 바람직하게는 인간에 대해 동종이계이거나 대상체, 바람직하게는 인간에 대해 자가인 숙주 세포.
  36. 제30항 내지 제35항 중 어느 한 항의 숙주 세포 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  37. 제30항 내지 제35항 중 어느 한 항의 숙주 세포를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료, 억제 또는 개선하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 대상체에게 120개 미만의 연속 아미노산 잔기 길이를 갖는 폴리펩티드 스페이서를 포함하는 CAR을 포함하는 복수의 세포의 암을 치료, 억제 또는 개선하기에 충분한 용량 미만인, 암을 치료, 억제 또는 개선하기에 충분한 복수의 숙주 세포를 포함하는 용량이 투여되는 것인 방법.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 5 x 106개 세포/kg 미만의 복수의 숙주 세포를 포함하는 용량이 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  40. 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 세툭시맙을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  41. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 CD171 발현 세포를 포함하는 것인 방법.
  42. 제37항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 신경모세포종 또는 신경절신경모세포종으로부터 선택되는 것인 방법.
  43. 제30항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 암을 치료, 억제 또는 개선하는데 사용하기 위한 숙주 세포.
  44. 대상체의 암을 치료, 억제 또는 개선하기 위한 약제의 제조에서 제30항 내지 제35항 중 어느 한 항의 숙주 세포의 용도.
  45. 제30항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 약제로서 사용하기 위한 숙주 세포.
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