JP7379654B2 - 抗ｂｃｍａキメラ抗原受容体 - Google Patents

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Description

背景
Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）は、Ｂ細胞系統の細胞上に発現される腫瘍壊死ファミリー受容体（ＴＮＦＲ）メンバーである。ＢＣＭＡの発現は、最終分化したＢ細胞で最も高い。ＢＣＭＡは形質細胞生存の媒介に関与して、長期の体液性免疫を維持する。ＢＣＭＡの発現は最近、多くのがん、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、および感染症に関連付けられている。ＢＣＭＡの発現が増加するがんには、いくつかの血液がん、例えば多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫、様々な白血病、膠芽腫などが含まれる。ＢＣＭＡに関連する自己免疫疾患には、限定はされないが、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、水疱形成性皮膚疾患、例えば天痘瘡、乾癬、炎症性腸疾患、セリアック病、悪性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、強皮症、グレーブス病、シェーグレン症候群、グッドパスチャー症候群、および１型糖尿病が含まれる。多くの自己抗体介在性自己免疫疾患は、全身性ステロイドまたは免疫抑制剤による長期間の処置を必要とし、これには重大な毒性が伴う。ＢＣＭＡに関連するアレルギー性疾患には、アナフィラキシー、喘息、食物アレルギー、刺咬昆虫アレルギー、薬物アレルギー、アレルギー性鼻炎、蕁麻疹、血管浮腫、湿疹、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、および好酸球性食道炎が含まれる。多くのアレルギー性疾患は、全身性または局所ステロイドによる長期間の処置、免疫調節療法、または免疫療法を必要とする。環境、食品、薬物、および昆虫によるアレルギーに冒された患者は、多くの場合、不快なアレルゲンを避けるためにそのライフスタイルを変更しなければならない。
ＢＣＭＡ関連状態を処置するための有望な新しいアプローチは、悪性腫瘍関連抗原を認識するように遺伝子改変されたＴ細胞の、養子免疫伝達である。例えばKochenderferの米国特許第9,765,342号を参照されたい。Ｔ細胞は、核酸構築物を導入することにより遺伝子改変されて、細胞外抗原認識部分および細胞内シグナル伝達ドメインを含む融合タンパク質である、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現することができる。例えば、Eshhar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993;90:720-724、およびSadelain et al., Curr. Opin. Immunol, 2009;21:215-223を参照。ＢＣＭＡを認識するように改変されたものなどのＣＡＲ Ｔ細胞は、多発性骨髄腫などの状態の処置に有益であることが示されている。例えばAli et al., Blood, 2016;128:1688-1700；Brudno et al., J. Clin. Oncol., 2018;36:2267-2280を参照。
ＢＣＭＡに対するＣＡＲタンパク質およびＣＡＲ Ｔ細胞は、以前に記載されている。例えば、Kochenderferの米国特許第9,765,342号、Brogdon et al.の米国特許第10,174,095号、およびMorgan et al.の米国特許出願2017/0226216 A1を参照されたい；これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
以前に開示された形態の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞療法は、製造上の困難、次善の発現、次善の標的関与および腫瘍死滅、炎症性副作用、および免疫原性を含むいくつかの欠点に悩まされている。
したがって、ＢＣＭＡ関連状態の処置のための改善されたＣＡＲ組成物および方法が必要とされる。
発明の概要
本開示のいくつかの側面は、改変されたキメラ抗原受容体を発現する新規構築物が、ＢＣＭＡへの結合の増加ならびにin vitroおよびin vivoでの多発性骨髄腫細胞の死滅を含む改善された特性を示すという驚くべき発見に、少なくとも部分的に基づいている。例示的な改善には、以下が含まれる：ＣＡＲ Ｔ細胞をＢＣＭＡにさらに効果的に結合させ、がん細胞をより効率的に死滅させるＣＤＲ配列の改変；ＣＡＲ発現を改善する５’および３’非翻訳配列（ＵＴＲ）；ＣＡＲ発現を改善する細胞質ドメイン；その他の改善、例えば発現も改善するポリアデニン（ポリＡ）テールの改善など。
いくつかの側面において、本開示は、ＢＣＭＡに特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。いくつかの態様において、ＣＡＲは、配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１３、１４、１５、１７、または１８のいずれか１つからの少なくとも１つの新規ＣＤＲ配列を含む。特定の態様において、ＣＡＲは、配列番号２、６、９、１１、１４、および１７のＣＤＲ配列（すなわち、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３）を含む。
いくつかの態様において、ＣＡＲはさらに、膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様において、膜貫通ドメインはＣＤ８膜貫通ドメインである。しかしながら、他の膜貫通ドメインを本発明に従って使用することができる。いくつかの態様において、ＣＡＲはさらに、共刺激ドメインおよび／またはシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、共刺激ドメインは、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、および／またはＯＸ４０共刺激ドメインである。いくつかの態様において、ＣＡＲは、シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインである。いくつかの態様において、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインは、１つ以上の共刺激ドメイン（例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２８、および／またはＯＸ４０共刺激ドメイン）を有するＣＤＲに含まれる。
本開示の他の側面は、上記の態様のいずれかに記載のまたは本明細書に別に記載のような、ＣＡＲをコードする配列を含む核酸に関する。いくつかの態様において、本明細書で提供される核酸配列のいずれかは、ＣＡＲの発現を改善するのに有用な１つ以上の特徴を含む。例えば、核酸は、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、ポリアデニンテール（ポリＡ）、７－メチルグアノシンキャップ（ｍ７Ｇ）、および／またはオープンリーディングフレームを含み得る。核酸はさらに、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含み得る。
さらに他の側面は、例えば、上記態様のいずれか１つに記載のまたは本明細書に別に記載のエレクトロポレーションによる、細胞への導入に適したｍＲＮＡ構築物に関する。本開示のさらに他の側面は、上記態様のいずれか１つに記載のまたは本明細書に別に記載の核酸を含む、ベクターに関する。いくつかの態様において、ベクターはレンチウイルスベクターである。
本開示の他の側面は、上記態様のいずれか１つに記載のまたは本明細書に別に記載のＣＡＲおよび／またはＣＡＲをコードする核酸を含む、細胞に関する。いくつかの態様において、細胞は、幹細胞、ＮＫ細胞、またはＴ細胞である。いくつかの態様において、細胞はＴ細胞である。
本開示の他の側面は、上記態様のいずれか１つに記載のまたは本明細書に別に記載のＣＡＲを含む複数の細胞（例えば、Ｔ細胞）を含む、組成物に関する。いくつかの態様において、組成物はさらに、薬学的に許容し得る担体を含む。
本開示のさらに他の側面は、複数のＣＡＲ改変細胞を生成する方法に関し、この方法は、上記態様のいずれか１つに記載のまたは本明細書に別に記載のＣＡＲをコードする核酸を、エレクトロポレーション、細胞の物理的破壊例えば細胞の圧搾、または核酸を含むナノ粒子の使用により、複数の免疫細胞に導入することを含む。いくつかの態様において、免疫細胞はＴ細胞である。いくつかの態様において、ｍＲＮＡ構築物は、ＣＡＲをコードする核酸を含む。
本開示のさらに他の側面は、複数のＣＡＲ改変細胞を生成する方法に関し、この方法は、上記態様のいずれか１つに記載のまたは本明細書に別に記載の核酸を含むレンチウイルスベクターを、複数の免疫細胞に導入することを含む。いくつかの態様において、上記態様のいずれか１つにおけるかまたは本明細書に別に記載の、１つ以上の核酸を含む１つ以上のレンチウイルスベクターが提供される。いくつかの態様において、免疫細胞はＴ細胞である。
本開示の他の側面は、がんを有するかまたはがんを有するリスクのある対象を処置する方法に関し、この方法は、上記態様のいずれか１つに記載のまたは本明細書に別に記載のＣＡＲを含むＴ細胞、上記態様のいずれか１つに記載のまたは本明細書に別に記載の組成物、または上記態様のいずれか１つに記載のまたは本明細書に別に記載の方法によって生成される複数の細胞を、がんを有するかまたはがんを有するリスクのある対象に、投与することを含む。いくつかの態様において、がんは多発性骨髄腫である。
自己免疫疾患またはアレルギー性障害を有する対象を処置する方法も提供される。がん、自己免疫疾患、またはアレルギー性障害の処置のための、本明細書に開示のＣＡＲを含む１つ以上のＴ細胞の使用もまた、提供される。
図１は、配列番号３１のＣＡＲまたは対照（ｍＲＮＡなし）で生成されたＣＡＲ Ｔ細胞による、トランスフェクションの２４時間後の、細胞生存率、ＣＡＲ発現、およびＢＣＭＡ結合の評価を示す。
図２は、配列番号２０、２１または２５のＣＡＲで生成されたヒト化抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞による処置後の、in vivoでの多発性骨髄腫ＭＭ．１Ｓ細胞腫瘍の測定を示す。ＣＡＲ Ｔ細胞または対照（ＣＡＲ陰性）細胞を、６日目に単回投与した。腫瘍量（tumor burden）は、蛍光性腫瘍細胞からの平均生物発光強度（フラックス、フォトン／秒）として示される。
図３は、Sleeping Beautyトランスポゾンシステムにより配列番号３１のＣＡＲを発現するように改変されたＴ細胞による、ＣＡＲ発現、抗ＢＣＭＡ細胞毒性、およびインターフェロン－γ分泌の測定値を示す。定義
本明細書および特許請求の範囲で使用する場合、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈が明らかに別を示さない限り、単数形および複数形の参照を含む。したがって例えば「剤」への言及は、単一の剤および複数のかかる剤を含む。
本明細書で使用する「活性化」という用語は、検出可能な細胞増殖を誘導するのに十分に刺激された、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、幹細胞または他の細胞の状態を指す。活性化はまた、誘導されたサイトカイン産生、および検出可能なエフェクター機能と関連する可能性がある。「活性化Ｔ細胞」という用語は、とりわけ、細胞分裂しているＴ細胞を指す。
本明細書で使用する「アレルギー」および「アレルギー性」という用語は、通常は無害な物質、すなわちアレルゲンに対する異常な過敏反応を伴う病状を指す。例示的なアレルギー状態には、アナフィラキシー、喘息、食物アレルギー、刺咬昆虫アレルギー、薬物アレルギー、アレルギー性鼻炎、蕁麻疹、血管浮腫、湿疹、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、および好酸球性食道炎が含まれる。
本明細書で使用する「抗体」という用語は広く、４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖からなる任意の免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、またはその任意の機能的フラグメント、変異体、バリアントまたは誘導であって、Ｉｇ分子の本質的なエピトープ結合機能を保持するものを指す。かかる変異体、バリアント、または誘導体の抗体フォーマットは、当技術分野で知られている。その非限定的態様を以下に論じる。
全長抗体において、各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと略される）と重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン：ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと略される）および軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬで構成される。ＶＨおよびＶＬ領域はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ぶ超可変性の領域に細分化でき、これらの間にはフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ぶより保存された領域が存在する。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端に向かってＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置されている。免疫グロブリン分子は、任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＡ２）またはサブクラスであることができる。
本明細書で使用する、抗体の「抗原結合部分」という用語（または簡単に「抗体部分」）は、抗原（例えば、ＢＣＭＡ）に特異的に結合する能力を保持している、抗体の１つ以上のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体のフラグメントによって実行できることが示されている。かかる抗体の態様はまた、二重特異性（bispecific）、二重特異性（dual specific）、または多重特異性フォーマットであり得て、２つ以上の異なる抗原に特異的に結合する。多重特異性、二重特異性、および二重特異性抗体構築物は当技術分野で周知であり、Kontermann (ed.), Bispecific Antibodies, Springer, NY (2011)、およびSpiess et al., Mol. Immunol. 67(2):96-106 (2015)に記載され特徴付けられている。
抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合フラグメントの例には、以下が含まれる：（ｉ）Ｆａｂフラグメント：ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント：ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインで構成されるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単鎖のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）単一の可変ドメインを含む、ｄＡｂフラグメント（Ward et al., (1989) Nature 341:544-546、Winter et al., ＰＣＴ公開WO 90/05144 A1；参照により本明細書に組み込まれる）；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコードされているが、これらは、組換え法を使用して、これらをＶＬとＶＨ領域が対になって一価分子を形成する単一のタンパク質鎖とすることができる合成リンカーにより、結合することができる（これは単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426；およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照）。かかる一本鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることが意図される。ダイアボディなどの一本鎖抗体の他の形態も包含される。ダイアボディは、ＶＨとＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖で発現される二価の二重特異性抗体であるが、同じ鎖上の２つのドメイン間のペアリングを可能にするには短すぎるリンカーを使用しているため、ドメインは別の鎖の相補的なドメインと強制的にペアリングされて、２つの抗原結合部位が作られる（例えば、Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123を参照）。かかる抗体結合部分は当技術分野で知られている（Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5)。
本明細書で使用する「抗体重鎖」は、それらの天然に存在する立体配座において、すべての抗体分子に存在する２種類のポリペプチド鎖のうちの大きい方を指す。
本明細書で使用する「抗体軽鎖」は、それらの天然に存在する立体配座において、すべての抗体分子に存在する２種類のポリペプチド鎖のうちの小さい方を指し、カッパおよびラムダ軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
本明細書で使用する「合成抗体」という用語は、組換えＤＮＡ技術を使用して生成される抗体を指し、例えば、ウイルスベクターによって発現される抗体である。この用語はまた、抗体であって、該抗体をコードするＤＮＡ分子の合成によって生成され、かつそのＤＮＡ分子が、抗体タンパク質またはその抗体を特定するアミノ酸配列を発現するところの、前記抗体を意味すると解釈されるべきであり、ここでＤＮＡまたはアミノ酸配列は、当技術分野で周知の利用可能な合成ＤＮＡまたはアミノ酸配列技術を使用して得られたものである。
いくつかの態様において、本明細書で使用する「抗原」または「Ａｇ」という用語は、免疫応答を誘発する分子として定義される。この免疫応答には、抗体産生、または特定の免疫学的コンピテントセルの活性化、あるいはその両方が含まれ得る。当業者は、事実上すべてのタンパク質またはペプチドを含む任意の高分子が、抗原として役立ち得ることを理解するであろう。さらに、抗原は、組換えまたはゲノムＤＮＡに由来することができる。当業者は、したがって、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡが、本明細書で使用される「抗原」をコードすることを理解するであろう。さらに当業者は、抗原が、遺伝子の完全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要はないことを理解するであろう。本発明が複数の遺伝子の部分ヌクレオチド配列の使用を含み、これらに限定されないこと、およびこれらのヌクレオチド配列が様々な組み合わせで配置されて、所望の免疫応答を誘発することは、容易に明らかである。さらに当業者は、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要はまったくないことを理解するであろう。抗原が合成されて生成され得るか、または生物学的試料から誘導され得ることは、容易に明らかである。かかる生物学的試料には、組織試料、腫瘍試料、細胞、または生体液が含まれ得るが、これらに限定されない。
本明細書で使用する「腫瘍抗原」という用語は、多発性骨髄腫細胞などのがん細胞に関連する抗原を指す。腫瘍抗原の例にはＢＣＭＡが含まれるが、これに限定されない。
本明細書で使用する「抗腫瘍効果」という用語は、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移の数の減少、期待寿命の増加、またはがん性状態に関連する様々な生理学的症状の改善によって明示され得る、生物学的効果を指す。「抗腫瘍効果」はまた、そもそも腫瘍の発生の予防における、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞および抗体の能力によっても明示することができる。
「自己免疫」という用語は、個体の免疫系またはその構成要素がその個体の正常な体組織を攻撃する、疾患または病気を指す。自己免疫疾患は、自己抗体、すなわち、個人が自分自身の組織の抗原を認識することによって生成される抗体によって、媒介され得る。例示的な自己免疫疾患には、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、水疱形成性皮膚疾患、例えば天痘瘡、乾癬、炎症性腸疾患、セリアック病、悪性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、強皮症、グレーブス病、シェーグレン症候群、グッドパスチャー症候群、および１型糖尿病が含まれる。
本明細書で使用する「自家」という用語は、後に個体に再導入されるその同じ個体に由来する任意の材料を指すことを意味する。
「同種異系」という用語は、同じ種の異なる動物に由来する移植片を指す。「異種」とは、異なる種の動物に由来する移植片を指す。
本明細書で使用する「がん」という用語は、異常な細胞の急速かつ制御されない増殖を特徴とする疾患として定義される。がん細胞は、局所的に、または血流やリンパ系を介して、体の他の部分に広がり得る。様々ながんの例には、限定はされないが、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵臓がん、結腸直腸がん、腎がん、肝臓がん、脳がん、リンパ腫、白血病、肺がんなどが含まれる。いくつかの態様において、がんは、ＢＣＭＡを発現するがんである。ＢＣＭＡを発現する例示的ながんには、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、および膠芽腫が含まれる。いくつかの態様において、がんは多発性骨髄腫を指す。多発性骨髄腫は形質細胞のがんである。多発性骨髄腫は、血液検査（血清タンパク質電気泳動、無血清カッパ／ラムダ軽鎖アッセイ）、骨髄検査、尿タンパク質電気泳動、および／または一般的に関与する骨のＸ線で診断することができる。いくつかの態様において、がんはホジキンリンパ腫（ＨＬ）を指す。ＨＬはＢ細胞のがんである。
「有効量」は、障害またはその１つ以上の症状の重症度および／または期間を低減または改善し、障害の進行を防ぎ、障害の退行を引き起こし、障害に関連する１つ以上の症状の再発、発生、発症または進行を防止し、障害を検出し、または別の治療法（例えば、予防薬または治療薬）の予防もしくは治療効果を増強または改善するのに十分な、治療の量を指す。
本明細書で使用する「外因性」という用語は、生物、細胞、組織、または器官系から導入された、またはその外部で生成された、任意の材料を指す。
「発現ベクター」は、発現されるヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現に十分なシス作用要素を含む；発現のための他の要素は、宿主細胞によって、またはin vitro発現系において供給され得る。発現ベクターには当技術分野で知られているすべてのものが含まれ、例えばコスミド、プラスミド（例えば、裸のまたはリポソームに含まれた）、および組換えポリヌクレオチドを組み込んだウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）などである。発現ベクターは、例えばＲＮＡウイルスベクターによって、自己増幅ＲＮＡを提供することができる。例えば、U.S.S.N. 12/831,252を参照。
本明細書で使用する「免疫グロブリン」または「Ｉｇ」という用語は、抗体として機能するタンパク質のクラスとして定義される。Ｂ細胞によって発現される抗体は、ＢＣＲ（Ｂ細胞受容体）または抗原受容体と呼ばれることもある。このタンパク質のクラスに含まれる５つのメンバーは、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥである。ＩｇＡは、唾液、涙、母乳、胃腸分泌物、ならびに呼吸器および泌尿生殖器の粘液分泌物などの身体分泌液に存在する、一次抗体である。ＩｇＧは、最も一般的な循環抗体である。ＩｇＭは、ほとんどの対象の一次免疫応答で生成される主要な免疫グロブリンである。これは、凝集、補体結合、およびその他の抗体反応において最も効率的な免疫グロブリンであり、細菌およびウイルスに対する防御に重要である。ＩｇＤは、既知の抗体機能を持たない免疫グロブリンであるが、抗原受容体として機能する可能性がある。ＩｇＥは、アレルゲンへの曝露時に、肥満細胞および好塩基球からのメディエーターの放出を引き起こすことにより、即時型過敏症を媒介する免疫グロブリンである。
「単離された」とは、自然状態から変更または除去されたことを意味する。例えば、生きている動物に自然に存在する核酸またはペプチドは「単離されて」いないが、同じ核酸またはペプチドであって、その自然状態の共存物質から部分的または完全に分離されたものは「単離されている」。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することができ、または、例えば宿主細胞などの非天然環境に存在することができる。
特に明記しない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列または核酸」は、互いに変質した（degenerate）バージョンでありかつ同じアミノ酸配列をコードする、すべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という句は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列がいくつかのバージョンでイントロンを含み得る程度まで、イントロンも含み得る。
本明細書で使用する「レンチウイルス」は、レトロウイルス科の属を指す。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染できるという点でレトロウイルスの中でも独特である；それらは、大量の遺伝情報を宿主細胞のＤＮＡに送達できるため、遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶ、およびＦＩＶは、すべてレンチウイルスの例である。レンチウイルスに由来するベクターは、有意なレベルのin vivo、ex vivo、またはin vitroの遺伝子導入を達成する手段を提供する。
本明細書で使用する「調節する」という用語は、処置または化合物の非存在下での対象における応答のレベルと比較して、および／または他の点では同一であるが未処置の対象における応答のレベルと比較して、対象における応答のレベルの検出可能な増加または減少を媒介することを意味する。この用語は、天然のシグナルまたは応答を混乱させ、および／または影響を及ぼし、それにより、対象、好ましくはヒトにおいて有益な治療応答を媒介することを包含する。
「コドン最適化」は、特定のアミノ酸に関連するコドンが、目的の遺伝子の翻訳効率のために最適化されることを意味する。コドン最適化は典型的には、目的の遺伝子または配列を評価し、特定の細胞または種の同じアミノ酸に使用されるより優勢なまたは一般のコドンで、コドンを置換することを含む。コドン最適化を評価するために当業者によって使用されるプログラムには、Integrated DNA Technologies、EnCor Biotechnology, Inc.、JCat、OptimumGene TM (GenScript USA, Inc., Pisataway, NJ 08854)などによって提供されるプログラムが含まれる。本明細書に記載のＣＡＲの態様をコードする配列はコドン最適化され得て、それらの翻訳効率を高めることができる。
本明細書で使用する「リンカー」という用語は、結合（例えば、共有結合）、化学基、または分子であって、２つの分子または部分、例えば、融合タンパク質の２つのドメイン、例えばヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９ドメインと核酸編集ドメイン（例えば、アデノシンデアミナーゼ）を連結するものを指す。いくつかの態様において、リンカーは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインを含む、ＲＮＡプログラム可能なヌクレアーゼのｇＲＮＡ結合ドメインと、核酸編集タンパク質の触媒ドメインを結合する。いくつかの態様において、リンカーは、ｄＣａｓ９tと核酸編集タンパク質を結合する。典型的には、リンカーは、２つの基、分子、または他の部分の間に配置されるか、またはそれらに隣接し、共有結合を介してそれぞれに接続され、したがって２つを接続する。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸または複数のアミノ酸（例えば、ペプチドまたはタンパク質）である。いくつかの態様において、リンカーは、有機分子、基、ポリマー、または化学部分である。いくつかの態様において、リンカーは、長さが５～１００アミノ酸、例えば、長さが５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、４５～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１５０、または１５０～２００のアミノ酸である。より長いかまたはより短いリンカーも企図される。
「作動可能に連結された」という用語は、調節配列と異種核酸配列との間の機能的連結であって、後者の発現をもたらすものを指す。例えば、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係に置かれる場合、第１の核酸配列は、第２の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を与える場合、プロモーターは、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は隣接しており、２つのタンパク質コード領域を結合する必要がある場合には、同じリーディングフレーム内にある。
「過剰発現された」または「過剰発現」という用語は、疾患領域（例えば、患者の特定の組織または器官内の固形腫瘍）からの細胞における、その組織または器官からの正常細胞での発現のレベルと比較した、異常なレベルの発現（例えば、腫瘍抗原の）を示すことを意図している。腫瘍抗原の過剰発現を特徴とする固形腫瘍または血液悪性腫瘍を有する患者は、当技術分野で知られている標準的なアッセイによって決定することができる。
免疫原性組成物の「非経口」投与には、例えば、皮下（ｓ．ｃ）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、または胸骨内注射、または注入技術が含まれる。
「患者」、「対象」、「個体」などの用語は、本明細書で交換可能に使用され、in vitroまたはin situを問わず、本明細書に記載の方法に適した任意の動物またはその細胞を指す。いくつかの態様において、患者、対象または個人はヒトである。
本明細書で使用する「プロモーター」という用語は、ポリヌクレオチド配列の特定の転写を開始するために必要な、細胞の合成機構によってまたは導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列として定義される。
本明細書で使用する「プロモーター／調節配列」という用語は、プロモーター／調節配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現に必要とされる核酸配列を意味する。いくつかの例において、この配列はコアプロモーター配列であり得、他の例では、この配列は遺伝子産物の発現に必要とされるエンハンサー配列および他の調節要素も含み得る。プロモーター／調節配列は、例えば、組織特異的な様式で遺伝子産物を発現するものであり得る。「構成的」プロモーターは、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結された場合に、細胞のほとんどまたはすべての生理学的条件下で、遺伝子産物を細胞内で産生させるヌクレオチド配列である。
「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結された場合に、プロモーターに対応するインデューサーが細胞内に存在する場合にのみ、遺伝子産物を実質的に細胞内で産生させるヌクレオチド配列である。
「組織特異的」プロモーターは、遺伝子によってコードまたは特定されるポリヌクレオチドと作動可能に連結された場合に、細胞がプロモーターに対応する組織タイプの細胞である場合にのみ、遺伝子産物を実質的に細胞内で産生させるヌクレオチド配列である。
抗体（ｓｃＦｖなど）に関して本明細書で使用する「特異的に結合する」または「特異的」という用語は、特定の抗原を認識するが、試料中の他の分子を実質的に認識または結合しない抗体を意味する。例えば、１つの種からのある抗原に特異的に結合する抗体は、１つ以上の種からのその抗原にも結合し得る。しかし、かかる異種間反応性（cross-species reactivity）は、それ自体が、抗体が特異的であるとの分類を変えることはない。別の例において、抗原に特異的に結合する抗体は、抗原の異なる対立遺伝子型にも結合し得る。しかし、かかる交差反応性はそれ自体が、抗体が特異的であるとの分類を変えることはない。いくつかの例において、「特異的結合」または「特異的に結合すること」という用語は、抗体、タンパク質、またはペプチドと第２の化学種との相互作用に関して使用され得、相互作用が、化学種における特定の構造（例えば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存することを意味する；例えば、抗体は一般的なタンパク質ではなく、特定のタンパク質構造を認識して結合する。もしも抗体がエピトープ「Ａ」に特異的であれば、標識「Ａ」および抗体を含む反応における、エピトープＡ（または遊離の非標識Ａ）を含む分子の存在は、抗体に結合する標識Ａの量を減少させるであろう。
「対象」という用語は、その中で免疫応答を誘発することができる生物（例えば、哺乳動物）を含むことを意図する。対象の例には、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそれらのトランスジェニック種が含まれる。いくつかの態様において、対象は非ヒト哺乳動物である。いくつかの態様において、対象は非ヒト霊長類である。いくつかの態様において、対象は齧歯動物である。いくつかの態様において、対象は、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ネコ、またはイヌである。いくつかの態様において、対象は、脊椎動物、両生類、爬虫類、魚、昆虫、ハエ、または線虫である。いくつかの態様において、対象は研究動物である。いくつかの態様において、対象は遺伝子操作され、例えば遺伝子操作された非ヒト対象である。対象は、いずれかの性および発達の任意の段階であり得る。いくつかの態様において、対象は、がん（例えば、多発性骨髄腫）を有する。他の態様において、対象は健康なボランティアである。
本明細書で使用する「治療的」という用語は、処置および／または予防を意味する。治療効果は、病状の抑制、寛解、または根絶によって得られる。
本明細書で使用する「治療有効量」という用語は、研究者、獣医、医師または他の臨床医によって求められている、組織、器官系、または対象の生物学的または医学的応答を誘発する、主題化合物の量を指す。「治療有効量」という用語は、投与された場合に、処置されている障害または疾患の１つ以上の徴候または症状の発症を予防するか、またはある程度緩和するのに十分な化合物の量を含む。治療有効量は、化合物、疾患およびその重症度、ならびに処置される対象の年齢、体重などに応じて変化するであろう。
本明細書で使用する場合、「処置」、「処置する」、および「処置すること」という用語は、本明細書に記載の疾患または障害またはそれらの1つ以上の症状を逆転する、緩和する、発症を遅延する、または進行を阻害することを目的とした、臨床的介入を指す。いくつかの態様において、処置は、１つ以上の症状が発生した後、および／または疾患が診断された後に、施され得る。他の態様において、処置は症状の非存在下で、例えば、症状の発症を予防または遅延させるために、または疾患の発症または進行を阻害するために、施され得る。例えば、処置は、症状の発症前に感受性の高い個体に施され得る（例えば、症状の病歴に照らして、および／または遺伝的または他の感受性因子に照らして）。処置は、症状が解消した後、例えば再発を予防または遅延させるために、継続してもよい。
本明細書で使用する「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、外因性核酸が宿主細胞に移入または導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外因性核酸でトランスフェクトされた、形質転換された、または形質導入された細胞である。細胞は、主要な対象細胞およびその子孫を含む。
「ベクター」は、単離された核酸を含み、かつ単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用することができる物質の組成物である。多数のベクターが当技術分野で知られており、限定はされないが、線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスを含む。したがって「ベクター」という用語は、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスを含む。この用語はまた、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなどの、核酸の細胞への移動を容易にする非プラスミドおよび非ウイルス化合物を含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが含まれるが、これらに限定されない。
特定の態様の詳細な説明
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）技術は、特定の腫瘍抗原を標的とするエフェクターＴ細胞の生成を目的とした、抗がん免疫療法アプローチである。ＣＡＲは、抗原結合機能とＴ細胞活性化機能の両方を提供する組換え受容体である。ＣＡＲは当技術分野で知られており、例えば以前にSadelain M., et al., "The basic principles of chimeric antigen receptor (CAR) design" Cancer Discov. 2013 Apr; 3(4): 388-398において記載されている；その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。一般にＣＡＲ Ｔ細胞（本明細書ではＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲＴとも呼ばれる）は、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体部分に基づいて操作されたＴ細胞である。いくつかの態様において、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）部分は、Ｔ細胞の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）およびシグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ鎖を含む）を組み合わせた受容体複合体を含む。
本明細書で提供されるように、抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）ＣＡＲ、およびそれらの対応する核酸発現構築物は、改善された発現、改善されたＣＡＲ Ｔ細胞のＢＣＭＡへの結合、改善された半減期、改善されたＢＣＭＡ発現細胞（骨髄腫細胞など）の死滅、および低下したヒトの免疫原性を含む、改善された特性を与えるように操作された。改善された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲを発現する核酸構築物を生成するために、１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）に変異を作り、変異をオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に導入し、変異をフレームワーク領域に導入し、代替の５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を使用し、代替の共刺激ドメインを使用し、および代替のポリアデニンテールを設計した。かかる改善された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲおよびそれらの発現構築物は、Ali et al. (2016)の臨床試験で使用された、すなわち配列番号１９のＣＡＲなどの、以前に記載された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲと比較して、改善された特性を実証する。
本明細書に記載されるように、ＣＡＲは、多発性骨髄腫（ＭＭ）抗原であるＢＣＭＡに結合するｓｃＦｖに基づいて操作された。例示的なＣＡＲは、以下からなることができる：ＣＤ８シグナルペプチド、抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ（例えば、配列番号６０のもの）、ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン。ＣＡＲ Ｔ細胞を生成するために、ＣＡＲを発現するｍＲＮＡ構築物を、健康なヒトドナーからアフェレーシスによって得たＣＤ８＋リンパ球にトランスフェクトした。試験したＣＡＲタンパク質の１つを発現するＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、配列番号２１のＣＡＲを発現するＣＡＲ Ｔ細胞）は、ＢＣＭＡへの結合の増加、in vitroでのＢＣＭＡ発現骨髄腫細胞の死滅の増加、および動物モデルにおけるヒト骨髄腫腫瘍増加の顕著な阻害を実証した。したがって、本発明の側面は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲおよびその使用方法に関する。いくつかの態様において、ＣＡＲは、Ｔ細胞により発現されて、がんの処置、例えば多発性骨髄腫の処置に有用である。
いくつかの態様において、ＣＡＲはＢＣＭＡに特異的である。Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ；ＢＣＭ、ＣＤ２６９、ＴＮＦＲＳＦ１７、またはＴＮＦＲＳＦ１３Ａとしても知られている）は、Ｂ細胞で発現するＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーである。例示的な非限定的ヒトＢＣＭＡ配列が、以下に提供される。
＞gi|23238192|ref|NP_001183.2|腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１７、ＢＣＭＡ［ホモサピエンス］
MLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYCNASVTNSVKGTNAILWTCLGLSLIISLAV
FVLMFLLRKINSEPLKDEFKNTGSGLLGMANIDLEKSRTGDEIILPRGLEYTVEECTCEDCIKSKPKVDS
DHCFPLPAMEEGATILVTTKTNDYCKSLPAALSATEIEKSISAR（配列番号１２１）
いくつかの態様において、本明細書で提供されるＣＡＲのいずれかは、ＢＣＭＡに特異的に結合する一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含み、これは、単一のポリペプチド（例えば、リンカーによって接続された）または２つのポリペプチド（例えば、１つは第１のＣＡＲポリペプチド上、および1つは第２のＣＡＲポリペプチド上で、これらは細胞に一度導入されると二量体を形成し得る）であり得る。
組成物
ＣＡＲ
いくつかの側面において、本発明は、ＢＣＭＡに特異的な（例えば、ＢＣＭＡに特異的に結合する）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。いくつかの態様において、ＣＡＲは、ＢＣＭＡに特異的な抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを含む。いくつかの態様において、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、ヒト化抗ＢＣＭＡ結合ドメインである。いくつかの態様において、細胞質ドメイン、またはそうでなければ細胞内ドメインは、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲがＢＣＭＡタンパク質（例えば、がん細胞の表面に発現するＢＣＭＡタンパク質）に結合すると、細胞内で例えばＴ細胞活性化シグナルなどのシグナルを伝達することができる、Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞増殖シグナル、記憶シグナル、細胞毒性エフェクター機能シグナル、またはサイトカイン産生シグナルを伝達することができる。いくつかの態様において、Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは、共刺激分子を含む。いくつかの態様において、細胞質ドメインはさらに、ゼータ鎖部分を含む。例示的なＴ細胞シグナル伝達ドメインには、限定されないが、ＣＤ８－アルファタンパク質、ＣＤ２８タンパク質、ＣＤ３ゼータタンパク質、ＦｃＲガンマタンパク質、ＣＤ２７タンパク質、ＯＸ４０タンパク質、４１ＢＢタンパク質、およびそれらの任意の組み合わせが含まれる。しかしながら、本明細書で提供されるＴ細胞シグナル伝達ドメインは例示的であり、本開示は、本発明に従って使用することができる既知のまたはそうでなければまだ開示されていない追加のＴ細胞シグナル伝達ドメインも企図することを理解されたい。
いくつかの態様において、ＣＡＲの細胞外ドメインと膜貫通ドメインの間、またはＣＡＲの細胞質ドメインと膜貫通ドメインの間、またはＢＣＭＡ結合ドメインの間に、スペーサーおよび／またはヒンジドメインを組み込むことができる。本明細書で使用する「スペーサードメイン」という用語は、一般に、膜貫通ドメインをポリペプチド鎖の細胞外ドメインまたは細胞質ドメインのいずれかに連結するように機能する、任意のオリゴまたはポリペプチドを指す。いくつかの態様において、スペーサードメインは、最大３００アミノ酸、例えば、１～５アミノ酸、１～１０アミノ酸、１～２０アミノ酸、１～４０アミノ酸、１～６０アミノ酸、１～１００アミノ酸、１～１５０アミノ酸、１～２００アミノ酸、１～２５０アミノ酸、１～３００アミノ酸、５～１０アミノ酸、５～２０アミノ酸、５～４０アミノ酸、５～６０アミノ酸、５～１００アミノ酸、１０～２０アミノ酸、１０～４０アミノ酸、１０～６０アミノ酸、１０～１００アミノ酸、２０～４０アミノ酸、２０～６０アミノ酸、２０～１００アミノ酸、４０～６０アミノ酸、４０～１００アミノ酸、または６０～１００アミノ酸を含み得る。いくつかの態様において、スペーサードメインは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸を含み得る。本開示の側面はこの点に関して限定されないので、１つ以上のスペーサードメインがＣＡＲの他の領域に含まれ得ることもまた、理解されるべきである。例示的なスペーサー配列には、限定することなく、以下の1つ以上が含まれる：ＧＧＧＧＳ（配列番号１２４）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１２５）；（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号１２６）；ＧＳＴＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳ（配列番号１２７）；ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＳＥＧＳＴＫＧ（配列番号１２８）；ＧＧＧＧＳＧＧＧ（配列番号１２９）；およびＧＧＧＳ（配列番号１３０）。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるＣＡＲのいずれかはヒンジ領域を含み、これは典型的には、ＣＡＲの細胞外ドメインを細胞内ドメインに接続する。いくつかの態様において、ヒンジ領域は、ＣＡＲのＢＣＭＡ結合ドメインと膜貫通ドメインとの間、またはＣＡＲのスペーサードメインと膜貫通ドメインとの間にある。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、ヒンジ、例えばヒトタンパク質からのヒンジを介して、ＣＡＲの細胞外ドメイン、例えばＣＡＲの抗ＢＣＭＡ結合ドメインに付着させることができる。例えば一態様において、ヒンジは、ヒトＩｇ（免疫グロブリン）ヒンジから、例えば、ＩｇＧ４ヒンジ、ＣＤ８αヒンジ、またはＣＤ２８ヒンジからであり得る。いくつかの態様において、ヒンジは、天然に存在するＩｇ分子のヒンジ、例えばＩｇＧ４ヒンジ、ＣＤ８αヒンジ、またはＣＤ２８ヒンジのアミノ酸配列を、またはそれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ヒンジは、ＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号１１７）と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ヒンジは、配列番号１１７のアミノ酸配列を含む。しかしながら、ヒンジのこれらの例は限定することを意味するものではなく、他のヒンジが企図されることを理解されたい。例えば、ヒンジはまた、細胞表面タンパク質の１つ以上の細胞外ドメインを含み得る。例えば、Watanabe et al., "Fine-tuning the CAR spacer improves T-cell potency," Oncoimmunology. 2016; 5(12): e1253656を参照；その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるＣＡＲのいずれかは、構造：ＮＨ２－［ＢＣＭＡ結合ドメイン］－［膜貫通ドメイン］－［細胞質ドメイン］－ＣＯＯＨを含む。いくつかの態様において、ＣＡＲは、構造：ＮＨ２－［ＢＣＭＡ結合ドメイン］－［ヒンジ領域］－［膜貫通ドメイン］－［細胞質ドメイン］－ＣＯＯＨを含む。いくつかの態様において、ＣＡＲは、１つ以上のスペーサー配列を含む。いくつかの態様において、「］－［」の各例は、任意のスペーサー配列の存在を示す。いくつかの態様において、細胞質ドメインは、ＣＤ８－アルファタンパク質、ＣＤ２８タンパク質、ＣＤ３ゼータタンパク質、ＦｃＲガンマタンパク質、ＣＤ２７タンパク質、ＯＸ４０タンパク質、４１ＢＢタンパク質、およびそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、本明細書で提供されるＣＡＲのいずれかは、以下の構造を含む：
［ＢＣＭＡ結合ドメイン］－［膜貫通ドメイン］－［細胞質ドメイン］；
［ＢＣＭＡ結合ドメイン］－［ヒンジ領域］－［膜貫通ドメイン］－［細胞質ドメイン］；
［シグナルペプチド］－［ＢＣＭＡ結合ドメイン］－［膜貫通ドメイン］－［細胞質ドメイン］；または
［シグナルペプチド］－［ＢＣＭＡ結合ドメイン］－［ヒンジ領域］－［膜貫通ドメイン］－［細胞質ドメイン］。
いくつかの態様において、ＣＡＲは、以下の例示的な非限定的配置のうちの１つから選択される配置を有する細胞質ドメインを含む：
［ＣＤ３ゼータ］；
［ＣＤ２８］－［ＣＤ３ゼータ］；
［４１ＢＢ］－［ＣＤ３ゼータ］；
［ＯＸ４０］－［ＣＤ３ゼータ］；または
［４１ＢＢ］－［ＯＸ４０］－［ＣＤ３ゼータ］。
いくつかの態様において、上記の例示的な非限定的配置は、ＣＡＲの左から右、Ｎ末端からＣ末端である。いくつかの態様において、「］－［」の各例は、任意のスペーサー配列の存在を示す。
一側面において、本発明のＣＡＲの抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、例えば、ヒトまたはヒト化ｓｃＦｖ部分は、その配列が哺乳動物細胞での発現のためにコドン最適化されている導入遺伝子によってコードされる。一側面において、本発明のＣＡＲ構築物全体は、その配列全体が哺乳動物細胞での発現のためにコドン最適化されている導入遺伝子によってコードされる。コドン最適化とは、ＤＮＡをコードする際の同義コドン（すなわち、同じアミノ酸をコードするコドン）の出現頻度が、異なる種で偏っているという発見を指す。かかるコドンの縮退は、同一のポリペプチドが様々なヌクレオチド配列によってコードされることを可能にする。様々なコドン最適化方法が当技術分野で知られており、例えば、少なくとも米国特許第5,786,464号および第6,114,148号に開示されている方法が含まれる。
本開示は、本明細書で提供される分子（例えば、抗ＢＣＭＡ結合タンパク質、ｓｃＦｖ、ＣＡＲＳ、およびＲＮＡ構築物）のいずれかをコードする核酸配列を提供し、これは、以下のような当技術分野で知られている組換え方法を使用して得ることができる；例えば、遺伝子を発現する細胞からライブラリーをスクリーニングすることにより、それを含むことが知られているベクターから遺伝子を誘導することにより、または標準的な技術を使用してそれを含む細胞および組織から直接単離することにより。代替的に、目的の核酸は、クローン化されるのではなく、合成的に生成され得る。
本発明はさらに、細胞に直接形質導入することができるＣＡＲを発現するレトロウイルスおよびレンチウイルスベクター構築物を含む。
本発明はまた、細胞に直接トランスフェクトすることができるＲＮＡ構築物を含む。トランスフェクションで使用するｍＲＮＡを生成する１つの方法は、特別に設計されたプライマーを用いる、テンプレートのin vitro転写（ＩＶＴ）と、その後の任意のポリＡ添加により、３’および５’非翻訳配列（「ＵＴＲ」）、５’キャップおよび／または内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、発現される核酸、およびポリＡテール（通常は長さが５０～２０００塩基であるが、以下でより詳細に説明される）、を含む構築物を生成することを含む。こうして生成されたＲＮＡは、様々な種類の細胞を効率的にトランスフェクトすることができる。一態様において、テンプレートは、ＣＡＲの配列を含む。一態様において、ＲＮＡ ＣＡＲベクターは、細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞に、エレクトロポレーションにより形質導入される。
抗ＢＣＭＡ結合ドメイン
いくつかの態様において、本明細書で提供されるＣＡＲは、抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）結合ドメインを含む。いくつかの態様において、本明細書で提供されるＣＡＲは、他の既知の抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、例えば、Ali et al. (2016)の臨床試験で使用されるすなわち配列番号１９のＣＡＲからの抗ＢＣＭＡ結合ドメインよりも高い親和性でＢＣＭＡに結合することができる、ＢＣＭＡ結合ドメインを含む。いくつかの態様において、本発明のＣＡＲのいずれかは、腫瘍細胞上のＢＣＭＡ抗原に特異的に結合する所望のＢＣＭＡ結合部分を操作することによって、目的の腫瘍抗原を標的とするように操作することができる。いくつかの態様において、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、本明細書に記載の任意のＣＡＲの膜貫通ドメインおよび／または細胞内ドメインのＮ末端である。
ＢＣＭＡ結合ドメインは、ＢＣＭＡに結合する任意のドメインであり得、これには限定することなく、モノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、ポリクローナル抗体、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、およびそれらの抗原結合（例えば、ＢＣＭＡ結合）フラグメントを含む。いくつかの態様において、ＢＣＭＡ結合ドメインはヒト化される（例えば、部分的にヒト化されるか、または完全にヒト化される）ことが有益である。いくつかの例において、ＢＣＭＡ結合ドメインは、そこでＣＡＲが最終的に使用されるのと同じ種に由来することが有益である。例えば、ヒトでの使用については、ＣＡＲのＢＣＭＡ結合ドメインは、ヒト抗体またはそのフラグメントを含むことが有益であり得る。したがって、いくつかの態様において、ＢＣＭＡ結合ドメイン部分は、ヒト抗体またはそのフラグメントを含む。ヒトにおける抗体のin vivo使用については、ヒト抗体を使用することが好ましい場合がある。完全なヒト抗体は、ヒト対象の治療的処置に特に望ましい。ヒト抗体は当技術分野で知られている様々な方法によって作製することができ、これには、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用するファージディスプレイ法、およびこれらの技術の改善を含む。また、米国特許第4,444,887号および第4,716,111号；およびＰＣＴ公開WO98/46645、WO98/50433、WO98/24893、W098/16654、WO 96/34096、WO 96/33735、およびWO91/10741を参照；それぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ヒト抗体はまた、重鎖および軽鎖が、ヒトＤＮＡの１つ以上の供給源に由来するヌクレオチド配列によってコードされる抗体であり得る。ヒト抗体またはヒト化抗体はまた、機能的な内因性免疫グロブリンを発現することはできないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを使用して生成することもできる。例えば、ヒトの重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体は、ランダムに、または相同組換えによって、マウス胚性幹細胞に導入され得る。代替的に、ヒトの可変領域、定常領域、および多様性領域を、ヒトの重鎖および軽鎖遺伝子に加えて、マウス胚性幹細胞に導入することができる。マウスの重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入とは別に、または同時に、機能しなくなる可能性がある。例えば、キメラおよび生殖系列変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。改変された胚性幹細胞は、増大され、胚盤胞にマイクロインジェクションされて、キメラマウスを生成する。次にキメラマウスを繁殖させて、ヒト抗体を発現するホモ接合性の子孫を生成する。トランスジェニックマウスは、選択された抗原、例えば本発明のポリペプチドの全部または一部を用いて、通常の様式で免疫化される。
一側面において、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、フラグメント、例えば単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）または抗ＢＣＭＡ抗体からのフラグメントである。一側面において、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、または二機能性（例えば、二重特異性）ハイブリッド抗体（例えば、Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)）である。一側面において、本発明の抗体およびそのフラグメントは、野生型のまたは増強された親和性で、ＢＣＭＡタンパク質に結合する。
いくつかの例において、ｓｃＦｖは、当技術分野で知られている方法に従って調製することができる（例えば、Bird et al., (1988) Science 242:423-426およびHuston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照）。ＳｃＦｖ分子は、柔軟なポリペプチドリンカーを使用してＶＨ領域とＶＬ領域を結合することにより、生成することができる。ｓｃＦｖ分子は、最適化された長さおよび／またはアミノ酸組成を有するリンカー（例えば、Ｓｅｒ－Ｇｌｙリンカー）を含む。リンカーの長さは、ｓｃＦｖの可変領域がどのように折り畳まれて相互作用するかに大きく影響する可能性がある。実際、短いポリペプチドリンカーが使用される場合（例えば、５～１０アミノ酸の間）、鎖内折り畳みが防止される。２つの可変領域をまとめて機能的なエピトープ結合部位を形成するには、鎖間折り畳みも必要である。リンカーの配向とサイズの例については、例えば、Hollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448、米国特許出願公開第2005/0100543号、2005/0175606号、2007/0014794号、およびＰＣＴ公開WO2006/020258およびWO2007/024715を参照、それぞれの全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
ｓｃＦｖは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれ以上のアミノ酸残基のリンカーをそのＶＬ領域とＶＨ領域の間に含むことができる。リンカー配列は、任意の天然に存在するアミノ酸を含み得る。いくつかの態様において、リンカー配列は、アミノ酸グリシンおよびセリンを含む。別の態様において、リンカー配列は、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎなどのグリシンおよびセリンリピートのセットを含み、ここでｎは、１以上の正の整数である（配列番号１３１）。一態様において、リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号１３２）または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号１３３）であり得る。いくつかの態様において、ｓｃＦｖは、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号１０８）、またはＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧＳＧＧＧＳＧＧＧ（配列番号１０９）のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるリンカーを含む。いくつかの態様において、ｓｃＦｖは、配列番号１０８または１０９のアミノ酸配列を含むリンカーを含む。
抗原（例えば、ＢＣＭＡ）に対する抗体は、免疫化されたトランスジェニックマウスから、従来のハイブリドーマ技術を使用して得ることができる。トランスジェニックマウスが保有するヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞の分化中に再配列し、その後、クラススイッチおよび体細胞変異を起こす。したがってかかる技術を使用して、ＩｇＧ１（ガンマ１）およびＩｇＧ３を含むがこれらに限定されない、治療上有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体を生成することが可能である。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を生成するためのこの技術およびかかる抗体を生成するためのプロトコルの詳細な議論については、例えば、以下を参照されたい：ＰＣＴ公開WO2014/055771、WO 98/24893、WO 96/34096、およびWO96/33735；および米国特許第5,413,923号；5,625,126号；5,633,425号；5,569,825号；5,661,016号；5,545,806号；5,814,318号；および5,939,598号；それぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。「ヒト化」抗体は、元の抗体と同様の抗原特異性を、すなわち、本発明においては例えばＢＣＭＡに結合する能力を保持している。
いくつかの態様において、抗体（例えば、ＢＣＭＡ結合ドメインを作製するために使用される抗体）は、それぞれ約２５ｋＤａの２つの軽（Ｌ）鎖およびそれぞれ約５０ｋＤａの２つの重鎖（Ｈ）から構成される四量体グリコシル化タンパク質である。ラムダとカッパと呼ばれる２種類の軽鎖が、抗体に見出され得る。重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、およびＭの５つの主要なクラスに割り当てることができ、これらのいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２に分類できる。各軽鎖は典型的には、Ｎ末端可変（Ｖ）ドメイン（ＶＬ）および定常（Ｃ）ドメイン（ＣＬ）を含む。各重鎖は典型的には、Ｎ末端Ｖドメイン（ＶＨ）、３つまたは４つのＣドメイン（ＣＨ１～３）、およびヒンジ領域を含む。ＶＨに最も近いＣＨドメインは、ＣＨ１と呼ばれる。ＶＨおよびＶＬドメインは、フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）と呼ばれる比較的保存された配列の４つの領域からなり、超可変配列の３つの領域（相補性決定領域、ＣＤＲ）の足場を形成する。ＣＤＲには、抗体と抗原の特定の相互作用に関与する残基のほとんどが含まれている。ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と呼ばれる。したがって、重鎖上のＣＤＲ構成要素はＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３と呼ばれ、軽鎖上のＣＤＲ構成要素はＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３と呼ばれる。ＣＤＲは典型的には、Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services (1991), eds. Kabat et al.に記載されているように、KabatＣＤＲを指す。抗原結合部位を特徴づけるための別の標準は、Chothiaにより記載されているように、超可変ループを参照することである。例えば、Chothia, D. et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:799-817；およびTomlinson et al. (1995) EMBO J. 14:4628-4638を参照されたい。さらに別の標準は、Oxford MolecularのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアで使用されるＡｂＭ定義である。一般に例えば、Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S, and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg)にある、抗体可変ドメインのタンパク質配列および構造分析を参照されたい。KabatＣＤＲに関して記載された態様は、代替的に、Chothia超可変ループまたはＡｂＭ定義ループ、あるいはこれらの方法のいずれかの組み合わせに関して同様に記載された関係を使用して、実装することができる。
本明細書で提供されるＣＡＲ Ｔ細胞は、当技術分野で知られている他のＣＡＲ Ｔ細胞、例えばAli et al. (2016)の臨床試験で使用されるＣＡＲ Ｔ細胞、すなわち、配列番号１９のＣＡＲのものよりも高い親和性でＢＣＭＡに結合することができ、および／またはより効率的にＢＣＭＡ発現細胞（例えば、骨髄腫細胞）を死滅させることができる。いくつかの態様において、本明細書で提供される抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、ＢＣＭＡに対する別の抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、例えばAli et al. (2016)の臨床試験で使用される、すなわち配列番号１９のＣＡＲのＢＣＭＡ結合ドメインの親和性よりも、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１４０％、１６０％、１８０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、または１，０００％高い親和性で、ＢＣＭＡに結合することができる。いくつかの態様において、本明細書で提供される抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、Ｔ細胞上に発現されるＣＡＲに含まれる場合、別の抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、例えばAli et al. (2016)の臨床試験で使用される、すなわち配列番号１９のＣＡＲよりも、がん細胞（例えば、ＢＣＭＡ発現骨髄腫細胞）をより効率的に死滅させることができる（例：少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１４０％、１６０％、１８０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、または１，０００％効率的）。抗ＢＣＭＡ結合ドメインで使用される例示的なＣＤＲ配列を以下に提供する。参照ＣＤＲ配列（すなわち、配列番号１、４、７、１０、１２、および１６）に関して異なるアミノ酸残基は、太字および下線で示されている。
いくつかの態様において、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１３、１４、１５、１７、および１８のいずれか１つから選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列（例えば、少なくとも２、３、４、５、または６つのＣＤＲ配列）を含む。いくつかの態様において、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、配列番号１～３のいずれか１つのＣＤＲＨ１アミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの態様において、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、配列番号４～６のいずれか１つのＣＤＲＨ２アミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの態様において、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、配列番号７～９のいずれか１つのＣＤＲＨ３アミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの態様において、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、配列番号１０～１１のいずれか１つのＣＤＲＬ１アミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの態様において、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、配列番号１２～１５のいずれか１つのＣＤＲＬ２アミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの態様において、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、配列番号１６～１８のいずれか１つのＣＤＲＬ３アミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの態様において、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、配列番号８または９のＣＤＲＨ３を含む。いくつかの態様において、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、配列番号１７または１８のＣＤＲＬ３を含む。
いくつかの態様において、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、表１に示されるｓｃＦｖクローンのいずれか１つに提供されるように、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、またはＣＤＲＬ３、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様において、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、表１に示されるｓｃＦｖクローンのいずれか１つのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。本開示はまた、表１に示されるｓｃＦｖクローンのいずれか１つに提供されるようなＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、またはＣＤＲＬ３を含む分子をコードする、任意の核酸配列を含む。抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３ドメインは、抗体の抗原に対する結合特異性／親和性において、特に重要な役割を果たし得る。したがって本開示の抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、表１に示されるように、少なくとも抗体の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３を含み得る。本開示の側面は、ＢＣＭＡタンパク質（例えば、腫瘍細胞上のＢＣＭＡタンパク質）に結合し、かつ６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む、抗ＢＣＭＡ結合ドメインに関する。

表１－本明細書に提供されるＣＡＲにおいて使用される、各ｓｃＦｖのＣＤＲ配列（ＣＤＲＨ１～３およびＣＤＲＬ１～３）の組み合わせ。各ｓｃＦｖに用いる親フレームワーク領域は、示された配列番号の親フレームワークによっても表される。各ＣＤＲは、それらの配列番号によって表される。「＊」でマークした配列番号は、配列番号１、４、７、１０、１２、および１６の参照ＣＤＲ配列とは異なる。
いくつかの態様において、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。いくつかの態様において、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３の順序でリストされている次のＣＤＲの群のいずれか１つを含む：
配列番号３、４、７、１０、１２、および１６；
配列番号１、４、８、１０、１２、および１６；
配列番号１、４、７、１１、１４、および１７；
配列番号１、４、７、１１、１４、および１８；
配列番号２、６、９、１０、１２、および１６；
配列番号３、５、８、１０、１２、および１６；
配列番号３、４、９、１０、１２、および１８；
配列番号２、６、９、１１、１３、および１７；
配列番号１、４、７、１０、１５、および１６；
配列番号２、６、９、１１、１４、および１７；
配列番号２、６、９、１１、１４、および１８；
配列番号１、４、８、１０、１５、および１７；ならびに
配列番号１、４、７、１０、１２、および１６。
本開示は、１、２、または３個であって３個を超えない保存的変異を有する、本明細書で提供されるＣＤＲ配列（例えば、配列番号１～１８）のいずれかを企図することを理解されたい。したがって、いくつかの態様において、本明細書で提供されるＣＤＲ配列のいずれか、すなわち、本明細書で提供されるＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＤＨ３、ＣＤＬ１、ＣＤＬ２、またはＣＤＬ３のいずれかのＣＤＲ配列は、１、２または３個の保存的変異を含み得る。本明細書で使用する「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸置換が行われるタンパク質の相対的な電荷またはサイズ特性を変化させない、アミノ酸置換を指す。バリアントは、かかる方法を編集する以下の参考文献に見られるような、当業者に知られているポリペプチド配列を変更するための方法に従って、調製することができる：例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York。アミノ酸の保存的置換には、以下の群内のアミノ酸間で行われる置換が含まれる：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；および（ｇ）Ｅ、Ｄ。
いくつかの態様において、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの態様において、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、配列番号４８～７２のいずれか１つのｓｃＦｖからの重鎖可変ドメインフレームワーク配列、または配列番号４８～７２のいずれか１つのｓｃＦｖからの軽鎖可変ドメインフレームワーク配列と、少なくとも７５％（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％）同一である重鎖可変ドメインフレームワーク配列を含む。いくつかの態様において、相同な重鎖可変ドメインフレームワーク配列および／または軽鎖可変ドメインフレームワーク配列は、本明細書で提供されるＣＤＲ配列のいずれにおいても変化しない。例えば、いくつかの態様において、配列変化の程度（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％）は、本明細書で提供されるＣＤＲ配列のいずれかを除く、重鎖可変および／または軽鎖可変配列で起こり得る。以下に提供されるｓｃＦｖアミノ酸配列（配列番号４８～７２）において、重鎖可変配列は太字で示され、軽鎖可変配列はイタリック体で示され、リンカー配列は下線で示される。いくつかの態様において、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）から構成される単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。いくつかの態様において、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、配列番号４８～７２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
２つのアミノ酸配列の「パーセント同一性」は、Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990のアルゴリズムを、Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993のように修正して使用して決定される。かかるアルゴリズムは、Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990のNBLASTおよびXBLASTプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。BLASTタンパク質検索は、XBLASTプログラム、スコア＝５０、単語長＝３を用いて実行して、目的のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を取得することができる。２つの配列間にギャップが存在する場合、Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997に記載されているように、ギャップ付きBLASTを利用することができる。BLASTおよびギャップ付きBLASTプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、XBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメータを使用することができる。









リーダードメイン
いくつかの態様において、ＣＡＲは、翻訳されたキメラタンパク質を膜に向けるためのリーダードメイン（「シグナルペプチド」とも呼ばれる）を有して設計される。いくつかの態様において、ＣＡＲは、ＣＡＲタンパク質のアミノ末端（Ｎ－ｔｅｒ）にリーダー配列を含む。一側面において、ＣＡＲはさらに、細胞外ＢＣＭＡ結合ドメインのＮ末端にリーダー配列を含み、ここでリーダー配列は、細胞プロセシングおよびＣＡＲの細胞膜への局在化中に、ＢＣＭＡ結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）から任意に切断される。リーダードメインは、一般に１５～３０アミノ酸の範囲にある。リーダードメインの例には、ＣＤ８ａリーダー（２１アミノ酸）、ＣＤ３３リーダー（１７アミノ酸）、ＣＤ４リーダー（２５アミノ酸）、ＩＬ－２Ｒ（ＣＤ２５）リーダー（２１アミノ酸）、トリプシノーゲン２リーダー（１５アミノ酸）、ＶＥＧＦＲ１リーダー（２６アミノ酸）、ＥＧＦＲリーダー（２４アミノ酸）、ＧＭＣＳＦＲリーダー（２２アミノ酸）、ＩｇＶＬリーダー、ＩｇＶＫリーダー、またはＩｇＶＨリーダーが含まれる。いくつかの態様において、リーダー配列は、本明細書で提供されるリーダードメインのいずれかと少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。いくつかの態様において、リーダー配列は、ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号１１０）のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。いくつかの態様において、リーダー配列は、配列番号１１０のアミノ酸配列を含む。
膜貫通ドメインおよびヒンジドメイン
膜貫通ドメインに関し、様々な態様において、ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに付着した膜貫通ドメインを含むように設計することができる。膜貫通ドメインは、膜貫通領域に隣接する１つ以上の追加のアミノ酸、例えば、膜貫通が由来するタンパク質の細胞外領域に関連する１つ以上のアミノ酸（例えば、細胞外領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から１５までのアミノ酸）、および／または膜貫通タンパク質が由来するタンパク質の細胞内領域に関連する１つ以上の追加のアミノ酸（例えば、細胞内領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から１５までのアミノ酸）を含み得る。一側面において、膜貫通ドメインは、使用されるＣＡＲの他のドメインの１つに関連するものである。いくつかの例において、膜貫通ドメインは、アミノ酸置換によって選択または改変され得て、かかるドメインの同じかまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへの結合を回避すること、例えば、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限にすることができる。一側面において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞の表面上の別のＣＡＲとのホモ二量体化が可能である。別の側面において、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、同じＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞に存在する天然の結合パートナーの結合ドメインとの相互作用を最小化するように、改変または置換され得る。
膜貫通ドメインは、天然または組換えの供給源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。一側面において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲが標的に結合した場合は必ず、細胞内ドメインにシグナル伝達することができる。本発明で特に使用される膜貫通ドメインは、少なくとも以下の膜貫通領域を含み得る：例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ、またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８（例えば、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ）、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、少なくとも以下の共刺激分子の膜貫通領域を含み得る：例えば、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、トールリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（触覚（Tactile））、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンド。膜貫通ドメインは、当技術分野で知られている、または本明細書に記載されている任意の方法を使用して、例えばUniProtデータベースを使用することによって、同定することができる。
いくつかの態様において、膜貫通ドメインは合成であってよく、その場合、これは、ロイシンおよびバリンなどの主に疎水性残基を含むであろう。いくつかの態様において、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットは、合成膜貫通ドメインの各末端に見出されるであろう。任意に、例えば長さが２から１０アミノ酸の間の短いオリゴまたはポリペプチドリンカーが、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間の連結を形成し得る。グリシン－セリンダブレットは、例示的な適切なリンカーを提供する。
いくつかの態様において、本発明のＣＡＲにおける膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインである。この目的のためのＣＤ８の配列はＰＣＴ公開WO2014/055771に教示されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの態様において、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８ａ膜貫通である。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴ（配列番号１１８）、ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮ（配列番号１２０）のアミノ酸配列、またはこれらと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む。膜貫通ドメインの一部は、細胞外または細胞質ゾルであり得ることを理解されたい；例えばいくつかの態様において、膜貫通ドメインは、ＬＹＣＮＨＲＮ（配列番号１１９）のアミノ酸配列を含む細胞質ゾル部分を含む。
いくつかの態様において、本発明のＣＡＲにおける膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインである。当業者は、完全な膜貫通ドメインまたはその一部が、細胞質ドメインまたはその一部とともに実装されることを理解するであろう。典型的には、使用される膜貫通ドメインと細胞質ドメインは、ＣＤ２８配列の連続部分である。いくつかの態様において、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列を含むＣＡＲを細胞膜に固定することができるそのフラグメントまたはバリアントを含む。
いくつかの例において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲの細胞外領域、例えばＣＡＲの抗原結合ドメインに、ヒンジ、例えばヒトタンパク質からのヒンジを介して、付着している。例えば一態様において、ヒンジは、ヒトＩｇ（免疫グロブリン）ヒンジ、例えばＩｇＧ４ヒンジ、またはＣＤ８ａヒンジであり得る。一態様において、ヒンジまたはスペーサーは、ＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号１１７）のアミノ酸配列、またはこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む（例えば、それからなる）。一側面において、膜貫通ドメインおよびヒンジドメインは、ＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮ（配列番号１１１）のアミノ酸配列を含む（例えば、それからなる）。
細胞質ドメイン
本開示のいくつかの側面は、細胞質ドメイン（細胞内ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインとも呼ばれる）を有するＣＡＲを提供する。本発明のＣＡＲの細胞質ドメインまたは領域は、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは一般に、ＣＡＲが導入された免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化に関与する。いくつかの態様において、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＡＲが導入された免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化に関与する。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊な機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性、またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特殊な機能を実行するように指示する、タンパク質の部分を指す。通常は細胞内シグナル伝達ドメイン全体を使用できるが、多くの場合にドメイン全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮部分が使用される限りにおいて、かかる短縮部分は、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、無傷のドメインの代わりに使用され得る。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な、細胞内シグナル伝達ドメインの任意の短縮部分を含むことを意味する。
本発明のＣＡＲで使用するための細胞内シグナル伝達ドメインの例には、協調して作用して、抗原受容体エンゲージメントに続いてシグナル伝達を開始する、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および抗原受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体またはバリアント、および同じ機能的能力を有する任意の組換え配列が含まれる。
ＴＣＲのみを介して生成されたシグナルは、Ｔ細胞の完全な活性化には不十分であり、二次および／または共刺激シグナルも必要であることが知られている。したがって、Ｔ細胞の活性化は、細胞質シグナル伝達配列の次の２つの異なるクラスによって媒介されると言える：ＴＣＲ（一次細胞内シグナル伝達ドメイン）を介して抗原依存性の一次活性化を開始するもの、および抗原非依存的に作用して二次または共刺激シグナルを提供するもの（二次細胞質ドメイン、例えば、共刺激ドメイン）。
一次シグナル伝達ドメインは、刺激的な方法または抑制的な方法のいずれかで、ＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する。刺激的に作用する一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。
本発明において特に有用である一次細胞内シグナル伝達ドメインを含むＩＴＡＭの例には、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８（「ＩＣＯＳ」としても知られている）、Ｆｃ．イプシロン．ＲＩ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、およびＣＤ６６ｄが含まれる。一態様において、本発明のＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達ドメインを含む。例示的なＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを以下に提供する。
一態様において、一次シグナル伝達ドメインは、改変されたＩＴＡＭドメイン、例えば天然のＩＴＡＭドメインと比較して変化した（例えば、増加または減少した）活性を有する、変異ＩＴＡＭドメインを含む。一態様において、一次シグナル伝達ドメインは、改変されたＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、最適化および／または短縮されたＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一態様において、一次シグナル伝達ドメインは、１、２、３、４、またはそれ以上のＩＴＡＭモチーフを含む。一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む分子のさらなる例には、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、およびＣＤ３２のそれらが含まれる。
ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインそれ自体を含むことができ、または、本発明のＣＡＲの文脈において有用な、他の任意の所望の細胞内シグナル伝達ドメインと組み合わせることができる。例えば、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ゼータ鎖部分、および１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含むことができる。共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部を指す。共刺激分子は、リンパ球の抗原に対する効率的な応答に必要な、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。かかる分子の例には、以下が含まれる：ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、トールリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（触覚）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなど。例えば、ＣＤ２７共刺激は、in vitroでのヒトＣＡＲ Ｔ細胞の増大、エフェクター機能、および生存を増強し、in vivoでのヒトＴ細胞の持続性と抗腫瘍活性を増強することが実証されている（Song et al. Blood. 2012; 119(3):696-706）。本発明のＣＡＲの細胞質部分内の細胞内シグナル伝達配列は、ランダムなまたは特定の順序で互いに連結され得る。任意に、例えば、長さが２から１０アミノ酸（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸）の間の短いオリゴまたはポリペプチドリンカーは、細胞内シグナル伝達配列間の結合を形成し得る。一態様において、グリシン－セリンダブレット（doublet）を適切なリンカーとして使用することができる。一態様において、単一のアミノ酸、例えば、アラニン、グリシンを適切なリンカーとして使用することができる。
一側面において、細胞内シグナル伝達ドメインは、２つ以上、例えば、２、３、４、５、またはそれ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含むように設計される。例示的な共刺激ドメインを以下に提供する。一態様において、２つ以上、例えば、２、３、４、５、またはそれ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、リンカー分子、例えば、本明細書に記載のリンカー分子によって分離されている。一態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、２つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、リンカー分子は、グリシン残基である。いくつかの態様において、リンカーはアラニン残基である。
例示的ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン：
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR（配列番号１０７）
例示的共刺激ドメイン：
ＣＤ２８
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS（配列番号１００）
４１ＢＢ
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL（配列番号１０１）
ＯＸ４０
RRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI（配列番号１０２）
シグナル伝達ドメインと共刺激ドメインの例示的組合せ：
ＣＤ２８－ＣＤ３ゼータａ
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR（配列番号１０３）
４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR（配列番号１０４）
ＯＸ４０－ＣＤ３ゼータ
RRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR（配列番号１０５）
４１ＢＢ－ＯＸ４０－ＣＤ３ゼータ
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR（配列番号１０６）
ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインそれ自体を含むように設計することができ、または、本発明のＣＡＲの文脈で有用な他の任意の所望の細胞質ドメイン、例えば４－１ＢＢドメイン、ＣＤ２８ドメイン、および／またはＯＸ４０ドメインなどと組み合わせることができる。例えば、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖部分および共刺激シグナル伝達領域を含むことができる。共刺激シグナル伝達領域は、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部を指す。したがって本発明は、主に４－１ＢＢ、ＣＤ２８、およびＯＸ４０を、共刺激要素またはシグナル伝達要素として例示しているが、他の追加の共刺激要素またはシグナル伝達要素は、本発明の範囲内である。共刺激ドメインおよび細胞内ドメインの例示的な配列が、本明細書に提供される。他の例示的な４－１ＢＢ共刺激ドメインは、米国特許公開US20050113564に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるＣＡＲのいずれかは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、ＣＤ３ゼータドメインは、ヒトに由来する。いくつかの態様において、ＣＤ３ゼータドメインは、配列番号１０７のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＣＤ３ゼータドメインは、配列番号１０７のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるＣＡＲのいずれかは、１つ以上（例えば、２、３、４、または５個）の共刺激ドメインを含む。いくつかの態様において、本明細書で提供されるＣＡＲのいずれかは、ＣＤ２８、４１ＢＢ、および／またはＯＸ４０共刺激ドメインを含む。いくつかの態様において、共刺激ドメインはヒトに由来する。いくつかの態様において、ＣＡＲは、配列番号１００～１０２のいずれかのアミノ酸配列の１つ以上、またはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるその任意のバリアントを含む。ＣＡＲの細胞質ドメインは、シグナル伝達および／または細胞質ドメインの任意の組み合わせを含み得ることを理解されたい。例えば細胞質ドメインは、以下のドメインの例示的な組み合わせのいずれかを含み得る：ＣＤ２８－ＣＤ３ゼータ；４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ；ＯＸ４０－ＣＤ３ゼータ；または４１ＢＢ－ＯＸ４０－ＣＤ３ゼータ。いくつかの態様において、ＣＡＲの細胞質ドメインは、配列番号１０３～１０６のいずれかのアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるその任意のバリアントを含む。
例示的な全長ＣＡＲ
本明細書で提供されるように、本開示は、抗ＢＣＭＡ結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のヒトまたはヒト化ＢＣＭＡ結合ドメイン）、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを含む、ＣＡＲｘを企図する。本明細書で提供されるＣＡＲのいずれも、本明細書に記載のドメインまたはペプチドの任意の組み合わせを使用して生成することができ、例えば、ＣＡＲは、本明細書で提供される任意の抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、膜貫通、細胞質ドメイン、シグナルペプチド、またはヒンジ領域を含むことができることを理解されたい。例示的なＣＡＲおよびそのバリアントが、以下に提供される。
ＣＡＲ－Ｒ１
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVLTQSPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIHWYQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEEDDVAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAFSLETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSSFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR（配列番号１９）
ＣＡＲ－Ｋ′
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSFLGINLIHWYQQKPGQPPKLLIYSASNLQSGVPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDTANYYCLQSRTLPRTFGQGTKVEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGGSVKISCKASGYTFTSYSINWVRQAPGKGLEWVGWINTETREPAYAQGFTGRFTFSADTSKSMAYLQINSLRAEDTAVYYCALDYLYSLDFWGQGTLVTVSSFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR（配列番号２０）
ＣＡＲ－Ｒ′
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSFLGINLIHWYQQKPGQPPKLLIYSASNLQSGVPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDTANYYCLQSRTLPRTFGQGTKVEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGGSVKISCKASGYTFTSYSINWVRQAPGKGLEWVGWINTETREPAYAQGFTGRFTFSADTSKSMAYLQINSLRAEDTAVYYCALDYLYSLDFWGQGTLVTVSSFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR（配列番号２１）
ＣＡＲ－Ｊ′
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSFLGINLIHWYQQKPGQPPKLLIYSASNLQSGVPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDTANYYCLQSKNFPRTFGQGTKVEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGGSVKISCKASGYTFTSYSINWVRQAPGKGLEWVGWINTETREPAYAQGFTGRFTFSADTSKSMAYLQINSLRAEDTAVYYCALDYLYSLDFWGQGTLVTVSSFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR（配列番号２２）
ＣＡＲ－Ｌ′
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSFLGINLIHWYQQKPGQPPKLLIYSASNLQSGVPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDTANYYCLQSKNFPRTFGQGTKVEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGGSVKISCKASGYTFTSYSINWVRQAPGKGLEWVGWINTETREPAYAQGFTGRFTFSADTSKSMAYLQINSLRAEDTAVYYCALDYLYSLDFWGQGTLVTVSSFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR（配列番号２３）
ＣＡＲ－Ｏ′
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVTILGSHLIHWYQQKPGQPPKLLINLASNVNTGVPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDTANYYCLQSRTLPRTFGQGTKVEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGGSVKISCKASGYTFTDYSINWVRQAPGKGLEWVGWINTETREPAYAYDFTGRFTFSADTSKSMAYLQINSLRAEDTAVYYCALDYTYGMDYWGQGTLVTVSSFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR（配列番号２４）
ＣＡＲ－Ｓ′
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVTILGSHLIHWYQQKPGQPPKLLINLASNVNTGVPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDTANYYCLQSRTLPRTFGQGTKVEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGGSVKISCKASGYTFTDYSINWVRQAPGKGLEWVGWINTETREPAYAYDFTGRFTFSADTSKSMAYLQINSLRAEDTAVYYCALDYTYGMDYWGQGTLVTVSSFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR（配列番号２５）
ＣＡＲ－ＩＩ
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVLTQSPSSLSASVGDRATISCRASESVTILGSHLIHWYQQKPGQAPKLLIQLASNVQTGVPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDVAVYYCLQSRTIPRTFGQGTKVEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGGSVKISCAASGYTFTDYSINWVRQAPGKGLEWVGWINTETREPAYAYDFRGRFTFSADTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCALDYSYAMDYWGQGTLVTVSSFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR（配列番号２６）
ＣＡＲ－１０ｄＵ
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVLTQSPSSLSASVGDRATISCRASESVTILGSHLIHWYQQKPGQAPKLLIQLASNVQTGVPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDVAVYYCLQSRTIPRTFGQGTKVEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGGSVKISCAASGYTFTDYSINWVRQAPGKGLEWVGWINTETREPAYAYDFRGRFTFSADTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCALDYSYAMDYWGQGTLVTVSSFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR（配列番号２７）
ＣＡＲ－１７′
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVTILGSHLIHWYQQKPGQPPKLLIQLASNVQTGVPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDTANYYCLQSRTIPRTFGQGTKVEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGGSVKISCKASGYTFTDYSINWVRQAPGKGLEWVGWINTETREPAYAYDFTGRFTFSADTSKSMAYLQINSLRAEDTAVYYCALDYSYAMDYWGQGTLVTVSSFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR（配列番号２８）
いくつかの態様において、ＣＡＲの全長アミノ酸配列は、配列番号１９～２８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列のいずれか１つと、または本明細書で提供されるＣＡＲのいずれかと、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一である。いくつかの態様において、ＣＡＲは、配列番号１９～２８のいずれか１つに記載の、または本明細書で提供される融合タンパク質のいずれかに記載のアミノ酸配列のいずれか１つと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、またはそれ以上の変異を含む。いくつかの態様において、ＣＡＲは、配列番号１９～２８のいずれか１つに記載の、または本明細書で提供される融合タンパク質のいずれかに記載のアミノ酸配列のいずれか１つと比較して、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、または少なくとも５００の同一の連続するアミノ酸残基を含む。
核酸およびベクター
いくつかの態様において、本発明は、ＣＡＲ（例えば、本明細書で提供されるＣＡＲのいずれか）をコードする核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を包含する。いくつかの態様において、核酸分子はＤＮＡである。いくつかの態様において、核酸分子はＲＮＡである。いくつかの態様において、核酸分子はＣＡＲの配列を含み、その配列は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインの１つ以上をコードする核酸配列に作動可能に連結された抗原結合ドメイン（例えば、抗ＢＣＭＡ結合ドメイン）をコードする核酸配列を含む。いくつかの態様において、核酸分子は、以下の例示的かつ非限定的な配置の１つから選択される配置を有するＣＡＲをコードする：
［抗原結合ドメイン］－［膜貫通ドメイン］－［細胞質ドメイン］；
［抗原結合ドメイン］－［ヒンジ領域］－［膜貫通ドメイン］－［細胞質ドメイン］；
［シグナルペプチド］－［抗原結合ドメイン］－［膜貫通ドメイン］－［細胞質ドメイン］；または
［シグナルペプチド］－［抗原結合ドメイン］－［ヒンジ領域］－［膜貫通ドメイン］－［細胞質ドメイン］。
いくつかの態様において、ＣＡＲの核酸配列は、以下の例示的かつ非限定的な配置の１つから選択される配置を有する細胞質ドメインを含む：
［ＣＤ３ゼータ］；
［ＣＤ２８］－［ＣＤ３ゼータ］；
［４１ＢＢ］－［ＣＤ３ゼータ］；
［ＯＸ４０］－［ＣＤ３ゼータ］；または
［４１ＢＢ］－［ＯＸ４０］－［ＣＤ３ゼータ］。
いくつかの態様において、上記の例示的かつ非限定的な配置は、ＣＡＲの左から右、Ｎ末端からＣ末端である。いくつかの態様において、「］－［」の各例は、任意のスペーサー配列の存在を示す。
本明細書で提供される核酸分子のいずれかが、他の特徴、例えば５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、ポリアデニンテール（ポリＡ）、７－メチルグアノシンキャップ（ｍ７Ｇ）、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、および／またはオープンリーディングフレームを、コードするかまたは含み得ることを理解されたい。いくつかの態様において、本開示は、以下の特徴の配置を有するＲＮＡ、またはそれをコードするＤＮＡを提供する：
５’－［５’ＵＴＲ］－［ＣＡＲ］－３’
５’－［ｍ７Ｇキャップ］－［５’ＵＴＲ］－［ＣＡＲ］－３’
５’－［ｍ７Ｇキャップ］－［５’ＵＴＲ］－［ＣＡＲ］－［ポリＡ］－３’
５’－［ＣＡＲ］－［３’ＵＴＲ］－［ポリＡ］－３’
５’－［５’ＵＴＲ］－［ＣＡＲ］－［３’ＵＴＲ］－３’
５’－［５’ＵＴＲ］－［ＣＡＲ］－［３’ＵＴＲ］－［ポリＡ］－３’
５’－［ｍ７Ｇキャップ］－［５’ＵＴＲ］－［ＣＡＲ］－［３’ＵＴＲ］－［ポリＡ］－３’
いくつかの態様において、提供される核酸は、安定性および／または翻訳効率を促進する能力を有する化学構造を含む。いくつかの態様において、ＲＮＡは、好ましくは５’および３’ＵＴＲを有する。一態様において、５’ＵＴＲは、１から３０００ヌクレオチドの長さである。コード領域に付加される５’および３’ＵＴＲ配列の長さは、異なる方法によって変更することができ、これには、限定はされないが、ＵＴＲの異なる領域にアニーリングするＰＣＲ用のプライマーの設計を含む。このアプローチを使用して、当業者は、転写されたＲＮＡのトランスフェクション後に最適な翻訳効率を達成するために必要な５’および３’ＵＴＲの長さを、改変することができる。
いくつかの態様において、５’および３’ＵＴＲは、目的の核酸のための天然に存在する内因性５’および３’ＵＴＲであり得る。代替的に、目的の核酸に内因性ではないＵＴＲ配列を、ＵＴＲ配列をフォワードおよびリバースプライマーに組み込むことによって、またはテンプレートの他の任意の改変によって付加することができる。目的の核酸に内因性ではないＵＴＲ配列の使用は、ＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を改変するために有用であり得る。例えば、３’ＵＴＲ配列のＡＵに富む要素は、ｍＲＮＡの安定性を低下させ得ることが知られている。したがって３’ＵＴＲは、転写されたＲＮＡの安定性を高めるように、当技術分野で周知のＵＴＲの特性に基づき、選択または設計することができる。
一態様において、５’ＵＴＲは、内因性核酸のコザック配列を含むことができる。代替的に、目的の核酸に内因性ではない５’ＵＴＲが上記のようにＰＣＲによって付加されている場合、コンセンサスコザック配列は、５’ＵＴＲ配列を付加することによって再設計することができる。コザック配列は、一部のＲＮＡ転写産物の翻訳効率を高めることができるが、しかしすべてのＲＮＡに対して効率的な翻訳を可能にするために必要とされるわけではないようである。多くのｍＲＮＡに対するコザック配列の要件は、当技術分野で知られている。他の態様において、５’ＵＴＲは、ＲＮＡゲノムが細胞内で安定しているＲＮＡウイルスの５’ＵＴＲであり得る。他の態様において、様々なヌクレオチド類似体を３’または５’ＵＴＲで使用して、ｍＲＮＡのエキソヌクレアーゼ分解を妨げることができる。
いくつかの態様において、本開示は、細胞（例えば、Ｔ細胞）においてＣＡＲを発現するために特に有用な５’および／または３’ＵＴＲを提供する。いくつかの態様において、５’ＵＴＲは、Ｙｉ１、ＩｇＧ、ＣＤ８、Ｍｙｏ、ＣＤ３、ＡＦＰ、アクチン、ＩＦＮＧ、ＡＣＴＢＬ２、合成配列、またはそれらのバリアントからの５’ＵＴＲである。いくつかの態様において、５’ＵＴＲは、ヒトまたはマウスに由来する。例示的な５’ＵＴＲ配列を以下に提供する。いくつかの態様において、５’ＵＴＲは、配列番号７３～８２のいずれか１つに記載の核酸配列のいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一である核酸配列を含む。いくつかの態様において、５’ＵＴＲは、配列番号７１～８２に記載の核酸配列のいずれか１つと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、またはそれ以上の変異を有する核酸配列を含む。いくつかの態様において、５’ＵＴＲは、配列番号７１～８２に記載の核酸配列のいずれか１つと比較して、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、または少なくとも５０の同一の隣接ヌクレオチドを有する、核酸配列を含む。
５’ＵＴＲ－Ｙｉ１
GGGAGACCCAAGCTGGCTAGCCTCGCAGTTCGGCGGTCCCGCGGGTCTGTCTGTTGCTTCAACAGTGTTTGGACGGAACAGATCCGGGGACTCTCTTCCAGCC（配列番号７３）
５’ＵＴＲ－ＩｇＧ
AGACCCAAGCTGGCTAGCTCTAAAGAAGCCCCTGGGAGCACAGCTCATCACC（配列番号７４）
５’ＵＴＲ－ＣＤ８
AGACCCAAGCTGGCTAGCAGCTCCTCACCCACCCCAGCCGCGACTGTCTCCGCCGAGCCCCCGGGGCCAGGTGTCCCGGGCGCGCCCCG（配列番号７５）
５’ＵＴＲ－Ｍｙｏ
GTGGAACACTTCTGAACCTGCATTTTTATCTGGAACTCCAGAAGCAGAATCCTTTGCTAAATAAATCGCAGCC（配列番号７６）
５’ＵＴＲ－ＣＤ３
AGAGAAGCAGACATCTTCTAGTTCCTCCCCCACTCTCCTCTTTCCGGTACCTGTGAGTCAGCTAGGGGAGGGCAGCTCTCACCCAGGCTGATAGTTCGGTGACCTGGCTTTATCTACTGGATGAGTTCCGCTGGGAG（配列番号７７）
５’ＵＴＲ－ＡＦＰ
AGACCCAAGCTGGCTAGCATATTGTGCTTCCACCACTGCCAATAACAAAATAACTAGCAACC（配列番号７８）
５’ＵＴＲ－Ｒ１合成配列
AAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC（配列番号７９）
５’ＵＴＲ－アクチン
CGCGTCCGCCCCGCGAGCACAGAGCCTCGCCTTTGCCGATCCGCCGCCCGTCCACACCCGCCGCCAGCTCACC（配列番号８０）
５’ＵＴＲ－ＩＦＮＧ
CACATTGTTCTGATCATCTGAAGATCAGCTATTAGAAGAGAAAGATCAGTTAAGTCCTTTGGACCTGATCAGCTTGATACAAGAACTACTGATTTCAACTTCTTTGGCTTAATTCTCTCGGAAACG（配列番号８１）
５’ＵＴＲ－ＡＣＴＢＬ２
GTGTCTGAAAGCATTTCTGGAGTGTTTTAGGCCTGTTCACTTTCTCTTACTCACTGTCTATTCACTTGTCCTGTTCACTCGTCTGGAAGATCTCAGCCAGCACC（配列番号８２）
いくつかの態様において、本開示は、細胞（例えば、Ｔ細胞）においてＣＡＲを発現するために特に有用な、３’ＵＴＲを提供する。いくつかの態様において、３’ＵＴＲは、ヒトベータグロビン、ＩｇＧ、アクチン、ＡＦＰ、ＣＤ３、ＩＦＮＧ、Ｍｙｏ、ＦｏｘＰ３、ＧＡＰＤＨ、ＧＡＴＡ３、Ｈ２ＡＦＶ、ＲＯＲＣ、ＳＯＣ２、マウスアルファグロビン、ＧＡＴＡ３、またはそれらのバリアントからの３’ＵＴＲである。いくつかの態様において、３’ＵＴＲは、ヒトまたはマウスに由来する。例示的な３’ＵＴＲ配列を以下に提供する。いくつかの態様において、３’ＵＴＲは、配列番号８３～９９のいずれか１つに記載の核酸配列のいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一である、核酸配列を含む。いくつかの態様において、３’ＵＴＲは、配列番号８３～９９に記載の核酸配列のいずれか１つと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、またはそれ以上の変異を有する核酸配列を含む。いくつかの態様において、３’ＵＴＲは、配列番号８３～９９に記載の核酸配列のいずれか１つと比較して、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、または少なくとも５０の同一の隣接ヌクレオチドを有する核酸配列を含む。
３’ＵＴＲ－ヒトベータグロビン
GGGCCCGTTTAAACCCGCTGGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCGTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGC（配列番号８３）
３’ＵＴＲ－ＩｇＧ
TGAGTGCGACGGCCGGCAAGCCCCCGCTCCCCGGGCTCTCGCGGTCGCACGAGGATGCTTGGCACGTACCCCGTGTACATACTTCCCGGGCGCCCAGCATGGAAATAAAGCACCCAGCGCTGCCCTGGGCCCCTGCG（配列番号８４）
３’ＵＴＲ－アクチン
GCGGACTATGACTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTTGACAAAACCTAACTTGCGCAGAAAACAAGATGAGATTGGCATGGCTTTATTTGTTTTTTTTGTTTTGTTTTGGTTTTTTTTTTTTTTTGGCTTGACTCAGGATTTAAAAACTGGAACGGTGAAGGTGACAGCAGTCGGTTGGAGCGAGCATCCCCCAAAGTTCTCAATGTGGCCGAGGACTTTGATTGCACATTGTTGTTTTTTTAATAGTCATTCCAAATATGAGATGCGTTGTTACAGGAAGTCCCTTGCCATCCTAAAAGCCACCCCACTTCTCTCTAAGGAGAATGGCCCAGTCCTCTCCCAAGTCCACACAGGGGAGGTGATAGCATTGCTTTCGTGTAAATTATGTAATGCAAAATTTTTTTAATCTTCGCCTTAATACTTTTTTATTTTGTTTTATTTTGAATGATGAGCCTTCGTGCCCCCCCTTCCCCCTTTTTTGTCCCCCAACTTGAGATGTATGAAGGCTTTTGGTCTCCCTGGGAGTGGGTGGAGGCAGCCAGGGCTTACCTGTACACTGACTTGAGACCAGTTGAATAAAAGTGCACACCTT（配列番号８５）
３’ＵＴＲ－ＡＦＰ
ATTACTTCAGGGGAAGAGATGACAAAACGAGTCTTTCATTCGGTGTGAACTTTTCTCTTTAATTTTAACTGATTTAACACTTTTTGTGAATTAATGAAATGATAAAGACTTTTATGTGAGATTTCCTTATCACAGAAATAAAATATCTCCAAATGTTTCCTTTTC（配列番号８６）
３’ＵＴＲ－ＣＤ３
ACCTGAGACTGGTGGCTTCTAGAAGCAGCCATTACCAACTGTACCTTCCCTTCTTGCTCAGCCAATAAATATATCCTCTTTCACTCAG（配列番号８７）
３’ＵＴＲ－ＩＦＮＧ
TGGTTGTCCTGCCTGCAATATTTGAATTTTAAATCTAAATCTATTTATTAATATTTAACATTATTTATATGGGGAATATATTTTTAGACTCATCAATCAAATAAGTATTTATAATAGCAACTTTTGTGTAATGAAAATGAATATCTATTAATATATGTATTATTTATAATTCCTATATCCTGTGACTGTCTCACTTAATCCTTTGTTTTCTGACTAATTAGGCAAGGCTATGTGATTACAAGGCTTTATCTCAGGGGCCAACTAGGCAGCCAACCTAAGCAAGATCCCATGGGTTGTGTGTTTATTTCACTTGATGATACAATGAACACTTATAAGTGAAGTGATACTATCCAGTTACTGCCGGTTTGAAAATATGCCTGCAATCTGAGCCAGTGCTTTAATGGCATGTCAGACAGAACTTGAATGTGTCAGGTGACCCTGATGAAAACATAGCATCTCAGGAGATTTCATGCCTGGTGCTTCCAAATATTGTTGACAACTGTGACTGTACCCAAATGGAAAGTAACTCATTTGTTAAAATTATCAATATCTAATATATATGAATAAAGTGTAAGTTCACAAC（配列番号８８）
３’ＵＴＲ－Ｍｙｏ
ACACACCTGCCTGATGCTATCAAGAGGCTGAAGAAAGCGCCAAATGTGCTATTTTTTGGTCACTTGCTTTATGACGTTTATTTTCCTGTTAAAGCTGAATAAATAAAAACTACAGTAAATGTA（配列番号８９）
３’ＵＴＲ－ＦｏｘＰ３
CCTCAAGATCAAGGAAAGGAGGATGGACGAACAGGGGCCAAACTGGTGGGAGGCAGAGGTGGTGGGGGCAGGGATGATAGGCCCTGGATGTGCCCACAGGGACCAAGAAGTGAGGTTTCCACTGTCTTGCCTGCCAGGGCCCCTGTTCCCCCGCTGGCAGCCACCCCCTCCCCCATCATATCCTTTGCCCCAAGGCTGCTCAGAGGGGCCCCGGTCCTGGCCCCAGCCCCCACCTCCGCCCCAGACACACCCCCCAGTCGAGCCCTGCAGCCAAACAGAGCCTTCACAACCAGCCACACAGAGCCTGCCTCAGCTGCTCGCACAGATTACTTCAGGGCTGGAAAAGTCACACAGACACACAAAATGTCACAATCCTGTCCCTCACTCAACACAAACCCCAAAACACAGAGAGCCTGCCTCAGTACACTCAAACAACCTCAAAGCTGCATCATCACACAATCACACACAAGCACAGCCCTGACAACCCACACACCCCAAGGCACGCACCCACAGCCAGCCTCAGGGCCCACAGGGGCACTGTCAACACAGGGGTGTGCCCAGAGGCCTACACAGAAGCAGCGTCAGTACCCTCAGGATCTGAGGTCCCAACACGTGCTCGCTCACACACACGGCCTGTTAGAATTCACCTGTGTATCTCACGCATATGCACACGCACAGCCCCCCAGTGGGTCTCTTGAGTCCCGTGCAGACACACACAGCCACACACACTGCCTTGCCAAAAATACCCCGTGTCTCCCCTGCCACTCACCTCACTCCCATTCCCTGAGCCCTGATCCATGCCTCAGCTTAGACTGCAGAGGAACTACTCATTTATTTGGGATCCAAGGCCCCCAACCCACAGTACCGTCCCCAATAAACTGCAGCCGAGCTCCCCAC（配列番号９０）
３’ＵＴＲ－ＧＡＰＤＨ
GAAGTCTGTTCCTGTCCTCCCTGTGCAGGGTATCCTGTAGGGTGACCTGGAATTCGAATTCTGTTTCCCTTGTAAAATATTTGTCTGTCTCTTTTTT（配列番号９１）
３’ＵＴＲ－ＧＡＴＡ３（ＯＲＦ配列）
CTATGAAGAAGGAAGGCATCCAGACCAGAAACCGAAAAATGTCTAGCAAATCCAAAAAGTGCAAAAAAGTGCATGACTCACTGGAGGACTTCCCCAAGAACAGCTCGTTTAACCCGGCCGCCCTCTCCAGACACATGTCCTCCCTGAGCCACATCTCGCCCTTCAGCCACTCCAGCCACATGCTGACCACGCCCACGCCGATGCACCCGCCATCCAGC（配列番号９２）
３’ＵＴＲ－Ｈ２ＡＦＶ
AGGGATGCTTTAACCAACCCTCTTCCTCCCCGTCATTGTACTGTAACTGGGACAGAAGAAATAATGGGGATATGTGGAATTTTTAACAACAGTTAAATGGAAAAGCATAGACAATTACTGTAGACATGATAAAAGAAACATTTGTATGTTCTTAGACTCGAAGTTTGATAAAAGTACCTTTTCATGTGGTGACAGTTGTGTGTTGATTGGCTAGGTTTCTCCCGTGTGTTTTATACAAAAATGGAATTGATAAACCATTTTTTACAAAATTAATTTGTCTCAAAACTGTTCTGTTCATGATGTATTAGAAATATTTTACTCAGACTTTAAATATTTTAAATCTCAGATTGGTTATTCAGAGTAACCTTAGAACAGAAATTGGGAATATATCTTTACAATGATTGATACCATGGTATATTGACTCTTAGATGCTATTGATCTGTAGCACCATTTTTTACAAACGACTAAGGAAAAAACCTGCCAATTAAATCATGATATGCCATCAATTATGAGACATCCCAATTTGAGAGATGTTAGATTATAGAAAAGTATGCATTTATGACTGAAATGGTAGTGGAATTATTTGAATTCTACACCAAGCACTTACCATGTGCCAGGCCCTTTGCAGAGTGCTCTACTGACCAAGAAAGTTGTTGCTGCCACATTATAGATGTGGAGCCTAAGGGTCACAGAAATTGTGTGCTATGCCAAAAAACATTGAACTGGTAGATAGAAAATGACAGAGCTAGGATTCAAACCTAGATCTGGCTGACTCCAGAGCCTAGTTTTACCTGGAATTGATGTTCAGTTTATCAAAGGTTTCTCCTTTTGGTTTAAAATCCCAATTTTTGGCCTGGCATTGTGGTTTACGCCTGTAATCCCAACAC（配列番号９３）
３’ＵＴＲ－ＲＯＲＣ
CCTGGAAGAGGGACTCCTTGCCTCTCCCTATGGCCTGCTGGCCCACCTCCCTGGACCCCGTTCCACCCTCACCCTTTTCCTTTCCCATGAACCCTGGAGGGTGGTCCCCACCAGCTCTTTGGAAGTGAGCAGATGCTGCGGCTGGCTTTCTGTCAGCAGGCCGGCCTGGCAGTGGGACAATCGCCAGAGGGTGGGGCTGGCAGAACACCATCTCCAGCCTCAGCTTTGACCTGTCTCATTTCCCATATTCCTTCACACCCAGCTTCTGGAAGGCATGGGGTGGCTGGGATTTAAGGACTTCTGGGGGACCAAGACATCCTCAAGAAAACAGGGGCATCCAGGGCTCCCTGGATGAATAGAATGCAATTCATTCAGAAGCTCAGAAGCTAAGAATAAGCCTTTGAAATACCTCATTGCATTTCCCTTTGGGCTTCGGCTTGGGGAGATGGATCAAGCTCAGAGACTGGCAGTGAGAGCCCAGAAGGACCTGTATAAAATGAATCTGGAGCTTTACATTTTCTGCCTCTGCCTTCCTCCCAGCTCAGCAAGGAAGTATTTGGGCACCCTACCCTTTACCT（配列番号９４）
３’ＵＴＲ－ＳＯＤ２
ACCACGATCGTTATGCTGATCATACCCTAATGATCCCAGCAAGATAATGTCCTGTCCTCTAAGATGTGCATCAAGCCTGGTACATACTGAAAACCCTATAAGGTCCTGGATAATTTTTGTTTGATTATTCATTGAAGAAACATTTATTTTCCAATTGTGTGAAGTTTTTGACTGTTAATAAAAGAATCTGTCAACCATCAAAGAGGTCTGCATTATGCTTGCATGTCAAAAACTTTAAAAATCCTATAATCTTC（配列番号９５）
３’ＵＴＲ－マウスアルファグロビン
GCGGCCGCTTAATTAAGCTGCCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTCCCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAGTCTAG（配列番号９６）
３’ＵＴＲ－ＧＡＴＡ３（完全）
GCCCTGCTCGATGCTCACAGGGCCCCCAGCGAGAGTCCCTGCAGTCCCTTTCGACTTGCATTTTTGCAGGAGCAGTATCATGAAGCCTAAACGCGATGGATATATGTTTTTGAAGGCAGAAAGCAAAATTATGTTTGCCACTTTGCAAAGGAGCTCACTGTGGTGTCTGTGTTCCAACCACTGAATCTGGACCCCATCTGTGAATAAGCCATTCTGACTCATATCCCCTATTTAACAGGGTCTCTAGTGCTGTGAAAAAAAAAATGCTGAACATTGCATATAACTTATATTGTAAGAAATACTGTACAATGACTTTATTGCATCTGGGTAGCTGTAAGGCATGAAGGATGCCAAGAAGTTTAAGGAATATGGGAGAAATAGTGTGGAAATTAAGAAGAAACTAGGTCTGATATTCAAATGGACAAACTGCCAGTTTTGTTTCCTTTCACTGGCCACAGTTGTTTGATGCATTAAAAGAAAATAAAAAAAAGAAAAAAGAGAAAAGAAAAAAAAAGAAAAAAGTTGTAGGCGAATCATTTGTTCAAAGCTGTTGGCCTCTGCAAAGGAAATACCAGTTCTGGGCAATCAGTGTTACCGTTCACCAGTTGCCGTTGAGGGTTTCAGAGAGCCTTTTTCTAGGCCTACATGCTTTGTGAACAAGTCCCTGTAATTGTTGTTTGTATGTATAATTCAAAGCACCAAAATAAGAAAAGATGTAGATTTATTTCATCATATTATACAGACCGAACTGTTGTATAAATTTATTTACTGCTAGTCTTAAGAACTGCTTTCTTTCGTTTGTTTGTTTCAATATTTTCCTTCTCTCTCAATTTTTGGTTGAATAAACTAGATTACATTCAGTTGGCCTAAGGTGGTTGTGCTCGGAGGGTTTCTTGTTTCTTTTCCATTTTGTTTTTGGATGATATTTATTAAATAGCTTCTAAGAGTCCGGCGGCATCTGTCTTGTCCCTATTCCTGCAGCCTGTGCTGAGGGTAGCAGTGTATGAGCTACCAGCGTGCATGTCAGCGACCCTGGCCCGACAGGCCACGTCCTGCAATCGGCCCGGCTGCCTCTTCGCCCTGTCGTGTTCTGTGTTAGTGATCACTGCCTTTAATACAGTCTGTTGGAATAATATTATAAGCATAATAATAAAGTGAAAATATTTTAAAACTACAA（配列番号９７）
３’ＵＴＲ－ＧＡＴＡ３（前半）
GCCCTGCTCGATGCTCACAGGGCCCCCAGCGAGAGTCCCTGCAGTCCCTTTCGACTTGCATTTTTGCAGGAGCAGTATCATGAAGCCTAAACGCGATGGATATATGTTTTTGAAGGCAGAAAGCAAAATTATGTTTGCCACTTTGCAAAGGAGCTCACTGTGGTGTCTGTGTTCCAACCACTGAATCTGGACCCCATCTGTGAATAAGCCATTCTGACTCATATCCCCTATTTAACAGGGTCTCTAGTGCTGTGAAAAAAAAAATGCTGAACATTGCATATAACTTATATTGTAAGAAATACTGTACAATGACTTTATTGCATCTGGGTAGCTGTAAGGCATGAAGGATGCCAAGAAGTTTAAGGAATATGGGAGAAATAGTGTGGAAATTAAGAAGAAACTAGGTCTGATATTCAAATGGACAAACTGCCAGTTTTGTTTCCTTTCACTGGCCACAGTTGTTTGATGCATTAAAAGAAAATAAAAAAAAGAAAAAAGAGAAAAGAAAAAAAAAGAAAAAA（配列番号９８）
３’ＵＴＲ－ＧＡＴＡ３（後半）
GTTGTAGGCGAATCATTTGTTCAAAGCTGTTGGCCTCTGCAAAGGAAATACCAGTTCTGGGCAATCAGTGTTACCGTTCACCAGTTGCCGTTGAGGGTTTCAGAGAGCCTTTTTCTAGGCCTACATGCTTTGTGAACAAGTCCCTGTAATTGTTGTTTGTATGTATAATTCAAAGCACCAAAATAAGAAAAGATGTAGATTTATTTCATCATATTATACAGACCGAACTGTTGTATAAATTTATTTACTGCTAGTCTTAAGAACTGCTTTCTTTCGTTTGTTTGTTTCAATATTTTCCTTCTCTCTCAATTTTTGGTTGAATAAACTAGATTACATTCAGTTGGCCTAAGGTGGTTGTGCTCGGAGGGTTTCTTGTTTCTTTTCCATTTTGTTTTTGGATGATATTTATTAAATAGCTTCTAAGAGTCCGGCGGCATCTGTCTTGTCCCTATTCCTGCAGCCTGTGCTGAGGGTAGCAGTGTATGAGCTACCAGCGTGCATGTCAGCGACCCTGGCCCGACAGGCCACGTCCTGCAATCGGCCCGGCTGCCTCTTCGCCCTGTCGTGTTCTGTGTTAGTGATCACTGCCTTTAATACAGTCTGTTGGAATAATATTATAAGCATAATAATAAAGTGAAAATATTTTAAAACTACAA（配列番号９９）
いくつかの態様において、本開示は、それぞれが本明細書で提供されるＣＡＲの１つ以上をコードする核酸配列を提供する。かかるＣＡＲをコードする例示的な核酸配列は、配列番号２９～４７に提供されている。しかしながら、本明細書で提供される配列のバリアントもまた企図されることを理解されたい。いくつかの態様において、ＣＡＲは、配列番号２９～４７のいずれか１つに記載の核酸配列のいずれか１つと、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一である核酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、ＣＡＲは、配列番号２９～４７に記載の核酸配列のいずれか１つと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、またはそれ以上の変異（例えば、少なくとも５０、１００、２００、３００、４００、５００、または６００）を有する核酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号２９～４７に記載の核酸配列のいずれか１つと比較して、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１１００、少なくとも１２００、少なくとも１３００、少なくとも１４００、少なくとも１５００、少なくとも１６００、または少なくとも１７００の同一の連続したヌクレオチドを有する核酸配列を含む。
いくつかの態様において、本開示は、そのそれぞれが本明細書で提供される１つ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする、核酸配列を提供する。かかるＯＲＦをコードする例示的な核酸配列は、配列番号１１２～１１６、１２２、および１２３に提供される。しかしながら、本明細書に提供されるＯＲＦ配列のバリアントもまた企図されることを理解されたい。いくつかの態様において、ＯＲＦは、配列番号１１２～１１６、１２２、および１２３のいずれか１つに記載の核酸配列のいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一である核酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、ＯＲＦは、配列番号１１２～１１６、１２２、および１２３に記載の核酸配列のいずれか１つと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、またはそれ以上の変異（例えば、少なくとも５０、１００、２００、３００、４００、５００、または６００）を有する核酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、ＯＲＦをコードする核酸配列は、配列番号１１２～１１６、１２２、および１２３に記載の核酸配列のいずれか１つと比較して、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１１００、少なくとも１２００、少なくとも１３００、少なくとも１４００、少なくとも１５００、少なくとも１６００、または少なくとも１７００の同一の隣接ヌクレオチドを有する核酸配列を含む。
ＲＮＡのＤＮＡテンプレートからの合成を、遺伝子クローニングを必要とすることなく可能にするために、転写のプロモーターは、転写される配列の上流のＤＮＡテンプレートに付着されるべきである。ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターとして機能する配列がフォワードプライマーの５’末端に付加されると、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、転写されるオープンリーディングフレームの上流のＰＣＲ産物に組み込まれるようになる。１つの好ましい態様において、プロモーターは、本明細書の他の場所に記載されているように、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターには、限定はされないが、Ｔ３およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが含まれる。Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６プロモーターのコンセンサスヌクレオチド配列は、当技術分野で知られている。
好ましい態様において、ｍＲＮＡは、細胞内のリボソーム結合、翻訳の開始、および安定性ｍＲＮＡを決定する５’末端および３’ポリＡテールの両方に、キャップを有する。
ポリＡ／ＴストレッチをＤＮＡテンプレートに統合する従来の方法は、分子クローニングである。しかし、プラスミドＤＮＡに統合されたポリＡ／Ｔ配列はプラスミドの不安定性を引き起こす可能性があり、このことは、細菌細胞から得られたプラスミドＤＮＡテンプレートがしばしば、欠失およびその他の異常で高度に汚染される原因である。これにより、クローン作製手順は面倒で時間がかかるだけでなく、多くの場合に信頼性が低くなる。そのため、クローニングなしでポリＡ／Ｔ ３’ストレッチによりＤＮＡテンプレートを構築できる方法が非常に望ましいのである。
転写ＤＮＡテンプレートのポリＡ／Ｔセグメントは、ＰＣＲ中に、１００ＴテールなどのポリＴテールを含むリバースプライマーを使用することにより（サイズは５０～５０００Ｔであり得る）、またはＰＣＲ後に、酵素的付加、ＤＮＡライゲーション、またはin vitro組換えを含むがこれらに限定されない任意の他の方法により、生成され得る。ポリＡテールはまた、ＲＮＡに安定性を提供し、その分解を低減する。一般にポリＡテールの長さは、転写されたＲＮＡの安定性と正の相関がある。一態様において、ポリＡテールは、１００～５０００のアデノシンである。いくつかの態様において、ポリＡテールは、少なくとも１５０アデノシンである（例えば、少なくとも１５０、１８０、または２００アデノシン）。いくつかの態様において、ポリＡテールは、１００～２００、１００～３００、１００～４００、１００～５００、１００～６００、１００～７００、１００～８００、１００～９００、１００～１０００、２００～３００、２００～４００、２００～５００、２００～６００、２００～７００、２００～８００、２００～９００、２００～１０００、３００～４００、３００～５００、３００～６００、３００～７００、３００～８００、３００～９００、３００～１０００、４００～５００、４００～６００、４００～７００、４００～８００、４００～９００、４００～１０００、５００～６００、５００～７００、５００～８００、５００～９００、５００～１０００、６００～７００、６００～８００、６００～９００、６００～１０００、７００～８００、７００～９００、７００～１０００、８００～９００、８００～１０００、または９００～１０００のアデノシンである。
ＲＮＡのポリＡテールはさらに、in vitro転写に続いて、大腸菌ポリＡポリメラーゼ（Ｅ－ＰＡＰ）などのポリＡポリメラーゼを使用して伸長することができる。さらに、異なる化学基の３’末端への付着は、ｍＲＮＡの安定性を高めることができる。かかる付着物は、改変／人工のヌクレオチド、アプタマーおよび他の化合物を含有することができる。例えば、ＡＴＰ類似体は、ポリＡポリメラーゼを使用してポリＡテールに組み込むことができる。ＡＴＰ類似体は、ＲＮＡの安定性をさらに高めることができる。
５’キャップもまた、ＲＮＡ分子に安定性を提供する。好ましい態様において、本明細書に開示の方法によって生成されるＲＮＡは、５’キャップを含む。５’キャップは当技術分野で知られており、本明細書に記載されている技術を使用して提供される（Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001)；Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001)；Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)）。
本明細書で提供されるＲＮＡはまた、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列を含むことができる。ＩＲＥＳ配列は、ｍＲＮＡへのキャップ非依存性リボソーム結合を開始し、翻訳の開始を促進する、ウイルス、染色体、または人工的に設計された配列のいずれであってもよい。細胞エレクトロポレーションに適した任意の溶質であって、糖類、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化剤、界面活性剤など、細胞の透過性と生存率を促進する因子を含有することができるものを含めることができる。
所望の分子（例えば、ＣＡＲ）をコードする核酸配列は、当技術分野で知られている組換え方法を使用して、例えば、遺伝子を発現する細胞からライブラリーをスクリーニングすることにより、これを含むことが知られているベクターから遺伝子を誘導することにより、これを含む細胞および組織から直接単離することにより、標準的な手法を用いて得ることができる。代替的に、目的の遺伝子は、クローン化するのではなく、合成的に生成することができる。例示的なベクターには、限定はされないが、コスミド、プラスミド（例えば、裸のまたはリポソームに含まれた）、レトロトランスポゾン（例えば、piggyback、sleeping beauty）、および本明細書で提供される核酸のいずれかを組み込んだウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）が含まれる。
本発明はまた、本発明のＤＮＡが挿入されたベクターを提供する。レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターは、導入遺伝子の長期的で安定した組込みと娘細胞でのその増殖（propagation）を可能にするので、長期的な遺伝子導入を達成するための適切なツールである。レンチウイルスベクターは、マウス白血病ウイルスなどの腫瘍レトロウイルスに由来するベクターよりも、肝細胞などの非増殖細胞を形質導入できるという点で優れている。それらはまた、免疫原性が低いという追加の利点を有する。別の態様において、所望のＣＡＲは、トランスポゾンによって細胞内で発現され得る。別の態様において、所望のＣＡＲは、相同性指向組換えにより細胞内で発現され得る。
ベクターは、複製および真核生物への組み込みに適する可能性がある。典型的なクローニングベクターは、所望の核酸配列の発現の調節に有用な、転写および翻訳ターミネーター、開始配列、およびプロモーターを含む。本発明の発現構築物はまた、標準的な遺伝子送達プロトコルを使用して、核酸免疫化および遺伝子治療に使用され得る。遺伝子送達の方法は当技術分野で知られている。例えば、米国特許第5,399,346号、5,580,859号、5,589,466号を参照、これらの全体は参照により本明細書に組み込まれる。別の態様において、本発明は、遺伝子治療ベクターを提供する。核酸は、多くの種類のベクターにクローン化することができる。例えば核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、およびコスミドを含むがこれらに限定されないベクターに、クローン化することができる。特に関心のあるベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、および配列決定ベクターが含まれる。
さらに発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供され得る。ウイルスベクター技術は当技術分野で周知であり、例えば、Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)、ならびにその他のウイルス学および分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスには、限定されないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレンチウイルスが含まれる。一般に適切なベクターは、少なくとも１つの生物において機能的な複製起点、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位、および１つ以上の選択マーカーを含む（例えば、WO01/96584；WO 01/29058；および米国特許第6,326,193号）。
哺乳動物細胞への遺伝子導入のために、多くのウイルスベースのシステムが開発されてきた。例えば、レトロウイルスは遺伝子送達システムに便利なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子は、当技術分野で知られている技術を使用して、ベクターに挿入され、レトロウイルス粒子にパッケージングすることができる。次に、組換えウイルスを単離して、in vivoまたはex vivoのいずれかで対象の細胞に送達することができる。多くのレトロウイルスシステムが当技術分野で知られている。いくつかの態様において、レトロウイルスベクターが使用される。多くのレトロウイルスベクターが当技術分野で知られている。いくつかの態様において、レンチウイルスベクターが使用される。
追加のプロモーター要素、例えばエンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは開始部位の３０～１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、最近多くのプロモーターが、開始部位の下流にも機能要素を含むことが示されている。プロモーター要素間の間隔はしばしば柔軟であるため、要素が反転または互いに移動した場合に、プロモーター機能は維持される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、活性が低下し始める前に、プロモーター要素間の間隔を増加させて５０ｂｐ離すことができる。プロモーターに応じて、個々の要素は協調的または独立して機能し、転写を活性化できるようである。
適切なプロモーターの一例は、即時型初期（immedidate-early）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに作動可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することができる、強力な構成的プロモーター配列である。適切なプロモーターの別の例は、伸長因子－ｌａ（ＥＦ－ｌａ）である。しかしながら、他の構成的プロモーター配列も使用され得て、これには、限定はされないが以下を含む：シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、鳥類白血病ウイルスプロモーター、エプスタインバーウイルス即時型初期プロモーター、ルース肉腫ウイルスプロモーター、ならびにヒト遺伝子プロモーター、例えば限定することなく、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーター。さらに本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモーターも本発明の一部として企図されている。誘導性プロモーターの使用は分子スイッチを提供し、これは、発現が望まれる場合にそれが作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現をオンにすることができ、または発現が望まれない場合に発現をオフにすることができる。誘導性プロモーターの例には、メタロチオネインプロモーター、糖質コルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、プロモーターは、ＥＦ－１ａプロモーターである。
ＣＡＲポリペプチドまたはその一部の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターはまた、選択マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれかまたは両方を含み得て、ウイルスベクターを介してトランスフェクトまたは感染することが求められる細胞の集団からの細胞の発現の同定および選択を容易にすることができる。他の側面において、選択マーカーは、別個のＤＮＡ片上に運ばれ、同時トランスフェクション手順において使用され得る。選択マーカーおよびレポーター遺伝子の両方に、宿主細胞での発現を可能にする適切な調節配列を隣接させることができる。有用な選択マーカーには、例えば、ｎｅｏなどの抗生物質耐性遺伝子が含まれる。レポーター遺伝子は、トランスフェクトされた可能性のある細胞を同定し、調節配列の機能を評価するために使用される。一般にレポーター遺伝子は、レシピエントの生物または組織に存在しないか、またはそれによって発現されない遺伝子であり、その発現が、酵素活性、抗生物質耐性または蛍光などのいくつかの容易に検出可能な特性によって現れるポリペプチドをコードする。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後の適切な時期にアッセイされる。適切なレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼ、クロランフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ、または緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子が含まれ得る（例：Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82）。適切な発現系はよく知られており、既知の技術を使用して調製するか、または商業的に入手することができる。一般に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小の５’隣接領域を有する構築物が、プロモーターとして同定される。かかるプロモーター領域はレポーター遺伝子に連結され、プロモーター駆動型転写を調節する能力について薬剤を評価するために使用され得る。
遺伝子を細胞に導入および発現する方法は、当技術分野で知られている。発現ベクターの文脈において、ベクターは、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母、または昆虫細胞に、当技術分野の任意の方法によって容易に導入することができる。例えば発現ベクターは、物理的、化学的、または生物学的手段によって宿主細胞に移入することができる。いくつかの態様において、宿主細胞はＴ細胞である。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための物理的方法には、エレクトロポレーション、機械的膜破壊（例えば、細胞圧搾またはナノ粒子ベースの送達）、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝撃、マイクロインジェクションなどが含まれる。ベクターおよび／または外因性核酸を含む細胞を生成するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)を参照。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための好ましい方法は、エレクトロポレーションである。
目的のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法は、ＤＮＡおよびＲＮＡベクターの使用を含む。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、遺伝子を哺乳動物、例えばヒト細胞に挿入するために最も広く使用されている方法になっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどに由来することができる。例えば米国特許第5,350,674号および5,585,362号を参照されたい。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段には、コロイド分散系、例えば高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズなど、および脂質ベースのシステム、例えば水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームなどが含まれる。in vitroおよびin vivoでの送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。
非ウイルス送達システムが利用される場合、例示的な送達ビヒクルはリポソームである。脂質製剤の使用が、核酸を宿主細胞へ導入するために企図されている（in vitro、ex vivoまたはin vivo）。別の側面において、核酸は脂質と関連し得る。脂質に関連する核酸は、リポソームの水性内部にカプセル化され、リポソームの脂質二重層内に散在され、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方に関連する連結分子を介してリポソームに付着し、リポソームに捕捉され、リポソームと複合体を形成し、脂質を含む溶液に分散され、脂質と混合し、脂質と組み合わされ、脂質に懸濁液として含まれ、ミセルを含むか複合体を形成し、または他の方法で脂質と関連する。脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクターに関連する組成物は、溶液中の特定の構造に限定されない。例えば、それらは二層構造で、ミセルとして、または「崩壊した」構造を有して存在し得る。それらはまた、単に溶液中に散在し、サイズまたは形状が均一でない凝集体を形成する可能性がある。脂質は脂肪性物質であり、これは天然に存在する脂質または合成脂質であり得る。例えば脂質には、細胞質に自然に存在する脂肪滴および、長鎖脂肪族炭化水素とその誘導体を含む化合物のクラス、例えば脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、アルデヒドなどが含まれる。
使用に適した脂質は、商業的供給源から入手することができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Sigma, St. Louis, MOから入手することができる；リン酸ジセチル（「ＤＣＰ」）は、K & K Laboratories (Plainview, NY)から入手できる；コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）はCalbiochem-Behringから入手できる；ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）および他の脂質は、Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL)から入手することができる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質のストック溶液は、約－２０℃で保存できる。クロロホルムはメタノールよりも蒸発しやすいため、唯一の溶媒として使用される。「リポソーム」は、封入された脂質二重層または凝集体の生成によって形成される、様々な単層および多重膜脂質ビヒクルを包含する総称である。リポソームは、リン脂質二重膜と内部水性媒体を備えた小胞構造を有するものとして、特徴付けることができる。多重膜リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水溶液に懸濁されると自発的に形成される。脂質成分は、閉じた構造を形成する前に自己再配列し、脂質二重層の間に水および溶解した溶質を閉じ込める（Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10）。しかしながら、通常の小胞構造とは異なる構造を溶液中に有する組成物も包含される。例えば脂質は、ミセル構造をとるか、脂質分子の不均一な凝集体として単に存在する可能性がある。リポフェクタミン－核酸複合体も企図される。
外因性核酸を宿主細胞に導入するため、または別様に細胞を本発明の阻害剤に曝露するために用いる方法に関係なく、宿主細胞での組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、様々なアッセイを実施することができる。かかるアッセイには、例えば、当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ、例えばサザンブロッティングおよびノーザンブロッティング、ＲＴ－ＰＣＲおよびＰＣＲなど；「生化学的」アッセイ、例えば特定のペプチドの存在または不在の検出を、例えば免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット）によって、または、本発明の範囲内にある薬剤を同定するための本明細書に記載のアッセイによって行うこと、などが含まれる。
ＲＮＡトランスフェクション
いくつかの態様において、本発明の改変Ｔ細胞は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡは、本明細書に記載のＣＡＲをコードする配列を含む）の導入によって改変される。いくつかの態様において、in vitroで転写されたＲＮＡ ＣＡＲは、一過性トランスフェクションの一形態として細胞に導入することができる。ＲＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で生成されたテンプレートを使用したin vitro転写により、生成される。任意の供給源からの目的のＤＮＡは、ＰＣＲにより、適切なプライマーとＲＮＡポリメラーゼを使用して、in vitroのｍＲＮＡ合成用のテンプレートに直接変換できる。ＤＮＡの供給源は、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ配列、または任意の他の適切なＤＮＡの供給源であり得る。in vitro転写のための所望のテンプレートは、本発明のＣＡＲである。
ＲＮＡは、標的細胞に、いくつかの異なる方法のいずれかを使用して導入することができ、これは例えば商業的方法であって、限定することなく以下を含む：エレクトロポレーション（Amaxa（登録商標）Nucleofector-II（登録商標）（Amaxa Biosystems, Cologne, Germany)）、（ECM 830(BTX)（Harvard Instruments, Boston, Mass.）またはGene Pulser II（登録商標）（BioRad, Denver, Colo.）、Multiporator（登録商標）（Eppendort, Hamburg Germany）、機械的膜破壊（例えば細胞圧搾、米国特許公開第2014/287509A1を参照）、リポフェクションを使用したカチオン性リポソーム媒介トランスフェクション、ポリマーカプセル化、ペプチド媒介性トランスフェクション、または「遺伝子銃」などのバイオリスティック粒子送達システム（例えば、Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)。
本明細書に開示されるのは、in vitroで転写されたＲＮＡ ＣＡＲを生成するための方法である。本発明はまた、細胞に直接トランスフェクトすることができる、ＣＡＲをコードするＲＮＡ構築物を含む。トランスフェクションで使用するためのｍＲＮＡを生成する方法は、テンプレートの、特別に設計されたプライマーを使用したin vitro転写（ＩＶＴ）および、それに続くポリＡの付加を含み得て、これにより、以下を含む構築物：３’および５’非翻訳配列（「ＵＴＲ」）、５’キャップおよび／または内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、発現される核酸、およびポリＡテール（典型的には５０～４００、５０～２０００塩基、１５０～４００塩基、または１５０～２０００塩基の長さ）を生成する。こうして生成されたＲＮＡは、様々な種類の細胞を効率的にトランスフェクトすることができる。一側面において、テンプレートはＣＡＲの配列を含む。
一側面において、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）によってコードされる。一側面において、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするｍＲＮＡは、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞に、ＣＡＲ発現細胞（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞）の生成のために導入される。
一態様において、in vitroで転写されたＲＮＡ ＣＡＲは、一過性トランスフェクションの一形態として細胞に導入することができる。ＲＮＡは、in vitro転写により、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で生成されたテンプレートを使用して生成される。任意の供給源からの目的のＤＮＡは、適切なプライマーとＲＮＡポリメラーゼを使用して、in vitroのｍＲＮＡ合成用のテンプレートにＰＣＲによって直接変換できる。ＤＮＡの供給源は、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ配列、または任意の他の適切なＤＮＡの供給源であり得る。in vitro転写のための所望のテンプレートは、本発明のＣＡＲである。例えば、ＲＮＡ ＣＡＲ用のテンプレートは、以下を含む細胞外領域を含む：抗腫瘍抗体の一本鎖可変ドメイン；ヒンジ領域、膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８ａの膜貫通ドメイン）；および、例えばＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよび／またはＣＤ２８、４１ＢＢおよび／またはＯＸ４０のシグナル伝達ドメインを含む、細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞質領域。
一態様において、ＰＣＲで使用するＤＮＡは、オープンリーディングフレームを含む。ＤＮＡは、生物のゲノムに由来する天然のＤＮＡ配列に由来することができる。一態様において、核酸は、５’および／または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）のいくつかまたはすべて、例えば本明細書で提供される非翻訳領域のいずれかを含むことができる。核酸は、エキソンおよびイントロンを含み得る。一態様において、ＰＣＲで使用するＤＮＡは、ヒト核酸配列である。別の態様において、ＰＣＲで使用するＤＮＡは、５’および３’ＵＴＲを含むヒト核酸配列である。ＤＮＡは代替的に、天然に存在する生物では通常発現されない人工ＤＮＡ配列であり得る。例示的な人工ＤＮＡ配列は、一緒にライゲートされて融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを形成する、遺伝子の部分を含むものである。一緒にライゲートされるＤＮＡの部分は、単一の生物からでも、複数の生物からでもよい。
ＰＣＲは、トランスフェクションに使用するｍＲＮＡのin vitro転写用のテンプレートを生成するために使用される。ＰＣＲを実施するための方法は当技術分野でよく知られている。ＰＣＲで使用するプライマーは、ＰＣＲのテンプレートとして使用されるＤＮＡの領域に実質的に相補的な領域を有するように設計される。本明細書で使用する「実質的に相補的な」とは、プライマー配列中の塩基の大部分またはすべてが相補的であるか、または１つ以上の塩基が非相補的であるかもしくはミスマッチである、ヌクレオチドの配列を指す。実質的に相補的な配列は、ＰＣＲに使用するアニーリング条件下で、目的のＤＮＡ標的とアニーリングまたはハイブリダイズすることができる。プライマーは、ＤＮＡテンプレートの任意の部分に実質的に相補的であるように設計することができる。例えばプライマーは、５’および３’ＵＴＲを含む、細胞内で通常転写される核酸の部分（オープンリーディングフレーム）を増幅するように設計することができる。プライマーはまた、目的の特定のドメインをコードする核酸の一部を増幅するように設計することができる。一態様において、プライマーは、５’および３’ＵＴＲの全部または一部を含む、ヒトｃＤＮＡのコード領域を増幅するように設計される。ＰＣＲに有用なプライマーは、当技術分野でよく知られている合成方法によって生成することができる。「フォワードプライマー」は、増幅されるＤＮＡ配列の上流にあるＤＮＡテンプレート上のヌクレオチドに実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含むプライマーである。「上流」は、本明細書では、増幅されるＤＮＡ配列の、コード鎖に対して位置５を指すために使用される。「リバースプライマー」は、増幅されるＤＮＡ配列の下流にある二本鎖ＤＮＡテンプレートに実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含むプライマーである。「下流」は本明細書では、増幅されるＤＮＡ配列の、コード鎖に対して３’の位置を指すために使用される。
ＰＣＲに有用な任意の高フィデリティーＤＮＡポリメラーゼを、本明細書に開示の方法で使用することができる。試薬およびポリメラーゼは、多くの供給元から市販されている。
遺伝子改変免疫細胞
いくつかの態様において、ＣＡＲ配列（例えば、本明細書に記載のＣＡＲをコードする核酸配列）は、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを使用して、細胞（例えば、Ｔ細胞、肝細胞、またはＮＫ細胞）に送達される。ＣＡＲを発現するレトロウイルスおよびレンチウイルスベクターは、様々な種類の真核細胞に送達されることができ、また形質導入細胞を担体として使用するか、カプセル化、結合、または裸のベクターの無細胞局所もしくは全身送達を使用して、組織および生物全体に送達できる。使用する方法は、安定した発現が必要または十分である、任意の目的に使用することができる。
別の態様において、所望のＣＡＲは、トランスポゾンを介して細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）において発現され得る。
開示された方法は、基礎研究および治療における免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）活性の調節のために、がん、幹細胞、急性および慢性感染症、ならびに自己免疫疾患の分野において適用することができ、これは、遺伝子改変されたＴ細胞またはＮＫ細胞の、標的細胞、例えば標的がん細胞を死滅させる能力の評価を含む。発現レベルを個別に調節することを可能にする、ベクター。例えば、同じ細胞内の複数のキメラ受容体上の異なる細胞内エフェクター／共刺激ドメインを変化させることにより、複数抗原性標的に対する最高レベルの細胞毒性を評価すると同時に、正常細胞に対する最低の細胞毒性を評価する、受容体組み合わせの構造の決定が可能となる。
細胞のクローニングは不要であり、その理由は、リンパ球集団全体を安定かつ均一に改変することができる、レンチウイルスベクターまたはオンコレトロウイルスベクターによるＣＡＲの形質導入の効率のためである。
免疫細胞の供給源
本発明の免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の増大および遺伝子改変の前に、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の供給源を対象から得る。免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は多くの供給源から得ることができ、これには、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸膜滲出液、脾臓組織、および腫瘍が含まれる。免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）はまた、誘導された多能性幹細胞または造血幹細胞または前駆細胞から生成され得る。本発明のいくつかの態様において、当技術分野で利用可能な、Ｔ細胞およびＮＫ細胞株を含むがこれらに限定されない任意の数の免疫細胞株を使用することができる。本発明のいくつかの態様において、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は、Ficoll（商標）分離などの当業者に知られている任意の数の技術を使用して、対象から収集された血液単位から得ることができる。いくつかの態様において、個体の循環血液からの細胞は、アフェレーシスによって得る。アフェレーシス生成物は典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、その他の有核白血球、赤血球、および血小板などを含む、リンパ球を含む。いくつかの態様において、アフェレーシスにより収集された細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、その後の処理ステップのために細胞を適切な緩衝液または培地に入れることができる。本発明のいくつかの態様において、細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。代替の態様において、洗浄溶液はカルシウムを欠き、またマグネシウムを欠き得るか、またはすべてではないにしても多くの二価カチオンを欠き得る。再度、驚くべきことに、カルシウムの非存在下での最初の活性化ステップは、拡大された活性化につながる。当業者が容易に理解するように、洗浄ステップは、当業者に知られている方法、例えば半自動化された「フロースルー」遠心分離機（例えば、Cobe（登録商標）2991セルプロセッサ、Baxter（登録商標）CytoMate（登録商標）、またはHaemonetics（登録商標）Cell Saver 5（登録商標））を製造元の指示に従って使用することなどによって、達成され得る。洗浄後に細胞は、様々な生体適合性緩衝液、例えばＣａ２＋非含有、Ｍｇ２＋非含有ＰＢＳ、PlasmaLyte A、または緩衝液を含むかもしくは含まない他の生理食塩水などに、再懸濁することができる。代替的に、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、細胞を培養培地に直接再懸濁することができる。
別の態様において、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は、例えばPERCOLL（商標）勾配による遠心分離または対流遠心エラトリエーション（counterflow centrifugal elutriation）により、赤血球を溶解し単球を除去することによって、末梢血リンパ球から単離される。Ｔ細胞の特定の亜集団、例えばＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、およびＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞などは、正または負の選択技術によってさらに単離することができる。例えばいくつかの態様において、Ｔ細胞は、DYNABEADS（登録商標）M-450 CD3/CD28 Tなどの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（すなわち、３×２８）結合ビーズとの、所望のＴ細胞の正の選択に十分な期間のインキュベーションによって単離される。いくつかの態様において、時間は約３０分である。さらなる態様において、時間は３０分から３６時間以上の範囲およびその間のすべての整数値である。さらなる態様において、時間は、少なくとも１、２、３、４、５、または６時間である。さらに別の好ましい態様において、時間は１０から２４時間である。好ましい一態様において、インキュベーション時間は２４時間である。白血病患者からＴ細胞を単離する場合、２４時間などのより長いインキュベーション時間を使用すると、細胞の収量を増やすことができる。他の細胞型と比較してＴ細胞が少ない状況では、例えば腫瘍組織からまたは免疫不全の個体から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を分離する場合などでは、より長いインキュベーション時間を使用してＴ細胞を単離し得る。さらに、より長いインキュベーション時間を使用すると、ＣＤ８＋Ｔ細胞の捕捉効率を高めることができる。したがって、Ｔ細胞がＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに結合することを可能にする時間を単に短縮または延長することにより、および／またはビーズ対Ｔ細胞の比率を増加または減少することによって（本明細書でさらに説明するように）、Ｔ細胞の亜集団を、培養開始時またはプロセス中の他の時点で、正または負の方向に優先的に選択することができる。さらに、ビーズまたは他の表面上の抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体の比率を増加または減少することにより、Ｔ細胞の亜集団を、培養開始時または他の所望の時点で、正または負の方向に優先的に選択することができる。当業者は、本発明の文脈において、複数ラウンドの選択も使用できることを認識するであろう。ある態様において、選択手順を実行し、活性化および増大プロセスにおいて「非選択の」細胞を使用することが望ましい場合がある。「非選択の」細胞は、さらなる選択ラウンドに供することもできる。
負の選択によるＴ細胞集団の濃縮は、負選択された細胞に特有の表面マーカーに向けられた抗体の組み合わせで達成することができる。１つの方法は、負選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに向けられたモノクローナル抗体のカクテルを使用する、負の磁気免疫接着またはフローサイトメトリーによる、細胞選別および／または選択である。例えば、ＣＤ４＋細胞を負の選択によって濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルには典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ、およびＣＤ８に対する抗体が含まれる。ある態様において、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋、およびＦｏｘＰ３＋を典型的に発現する制御性Ｔ細胞を濃縮するか、または正の選択をすることが望ましい場合がある。
代替的に、ある態様において、Ｔ制御性細胞は、抗Ｃ２５結合ビーズまたは他の同様の選択方法によって除去される。
所望の細胞集団の正または負の選択による単離のために、細胞の濃度および表面（例えば、ビーズなどの粒子）を変えることができる。ある態様において、ビーズと細胞が一緒に混合される体積を著しく減少させて（すなわち、細胞の濃度を増加させて）、細胞とビーズの最大接触を確実にすることが望ましい場合がある。例えば、いくつかの態様において、２０億細胞／ｍｌの濃度が使用される。いくつかの態様において、１０億細胞／ｍｌの濃度が使用される。さらなる態様において、１億個を超える細胞／ｍｌが使用される。さらなる態様において、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、または５０００万細胞／ｍｌの細胞の濃度が使用される。さらに別の態様において、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または１億細胞／ｍｌからの細胞の濃度が使用される。さらなる態様において、１億２５００万または１億５０００万細胞／ｍｌの濃度を使用することができる。高濃度を使用すると、細胞収量、細胞活性化、および細胞増大が高まる可能性がある。さらに、高い細胞濃度を使用すると、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞などの目的の標的抗原を弱く発現する可能性のある細胞、または多くの腫瘍細胞が存在する試料（白血病血液、腫瘍組織など）からの細胞の、より効率的な捕捉が可能になる。かかる細胞の集団は、治療的価値を有する可能性があり、入手することが望ましいであろう。例えば、高濃度の細胞を使用すると、通常はＣＤ２８の発現が弱いＣＤ８＋Ｔ細胞の、より効率的な選択が可能となる。
関連する態様において、より低濃度の細胞を使用することが望ましい場合がある。Ｔ細胞と表面（ビーズなどの粒子）の混合物を大幅に希釈することにより、粒子と細胞の間の相互作用が最小限に抑えられる。これにより、粒子に結合する所望の抗原を大量に発現する細胞が選択される。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞は高レベルのＣＤ２８を発現し、希薄濃度のＣＤ８＋Ｔ細胞よりも効率的に捕捉される。いくつかの態様において、使用される細胞の濃度は５×１０６／ｍｌである。他の態様において、使用される濃度は、約１×１０５／ｍｌから１×１０６／ｍｌ、およびその間の任意の整数値であり得る。
他の態様において、細胞は、回転子上で、様々な長さの時間様々な速度で、２～１０℃または室温のいずれかでインキュベートされ得る。
刺激用のＴ細胞はまた、洗浄ステップの後に凍結することができる。理論に束縛されないことを望み、凍結およびその後の解凍ステップは、細胞集団中の顆粒球およびある程度の単球を除去することによって、より均一な生成物を提供する。血漿と血小板を除去する洗浄ステップの後、細胞を凍結溶液に懸濁してもよい。多くの凍結溶液およびパラメータが当技術分野で知られており、この文脈で有用であるが、１つの方法は、２０％のＤＭＳＯおよび８％のヒト血清アルブミンを含むＰＢＳ、または１０％のデキストラン４０および５％のデキストロース、２０％のヒト血清アルブミンおよび７．５％のＤＭＳＯ、または、３１．２５％のPlasmalyte-A、３１．２５％のデキストロース５％、０．４５％のＮａＣｌ、１０％のデキストラン４０および５％のデキストロース、２０％のヒト血清アルブミン、および７．５％ＤＭＳＯを含む培養培地、または他の適切な細胞凍結培地であって例えば、HespanとPlasmaLyte Aを含有するもの、を使用することを含み、次に細胞は、１分あたり１°の速度で－８０°Ｃに凍結され、液体窒素貯蔵タンクの気相に貯蔵される。制御された凍結の他の方法、ならびに、直ちに－２０℃または液体窒素中での制御されない凍結も、使用することができる。ある態様において、凍結保存された細胞は、本明細書に記載されるように解凍および洗浄され、本発明の方法を使用した活性化の前に、室温で１時間静止される。
また、本発明の文脈において企図されるのは、本明細書に記載の増大された細胞が必要とされる前の期間における、対象からの血液試料またはアフェレーシス生成物の収集である。したがって、増大される細胞の供給源は、必要な任意の時点で収集することができ、Ｔ細胞などの所望の細胞を単離および凍結して、明細書に記載されているようなＴ細胞療法から恩恵を受ける任意の数の疾患または状態に対するＴ細胞治療で、後に使用することができる。いくつかの態様において、血液試料またはアフェレーシスは、一般に健康な対象から採取される。ある態様において、血液試料またはアフェレーシスは、疾患を発症するリスクがあるがまだ疾患を発症していない、一般に健康な対象から採取され、目的の細胞は、後で使用するために単離および凍結される。ある態様において、Ｔ細胞は、増大され、凍結され、そして後に使用され得る。ある態様において、試料は、本明細書に記載の特定の疾患の診断直後であるが、任意の処置の前に、患者から収集される。さらなる態様において、細胞は、任意の数の関連する治療法の前に、対象からの血液試料またはアフェレーシスから単離され、ここで該治療法には、限定されないが以下が含まれる：薬剤による処置、例えばナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸、およびＦＫ５０６、抗体、または他の免疫抑制剤、例えばCAMPATH（登録商標）、抗ＣＤ３抗体、サイトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、および照射など。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリン（シクロスポリンおよびＦＫ５０６）を阻害するか、成長因子誘導性シグナル伝達に重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Liu et al., Cell 66:807-815, 1991；Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991；Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993）。さらなる態様において、細胞は、患者のために単離され、骨髄または幹細胞移植、または、フルダラビン、外部ビーム放射線療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミドなどの化学療法剤、またはOKT3およびCAMPATH（登録商標）等の抗体のいずれかを使用するＴ細胞切除療法と組み合わせて（例えば、その前に、同時にまたは後に）、後での使用のために凍結される。別の態様において、細胞は単離され、例えばRITUXAN（登録商標）などのＣＤ２０と反応する薬剤などのＢ細胞切除療法に続く処置に先立って、およびその後の使用のために、凍結することができる。
本発明のさらなる態様において、Ｔ細胞は、処置の直後に患者から得る。この点に関して、特定のがん処置、特に免疫系を損傷する薬物による処置の後、処置のすぐ後の通常は患者が処置から回復している期間中において、得られるＴ細胞の品質が最適であるか、またはex vivoで増大する能力について改善している可能性があることが観察されている。同様に、本明細書に記載の方法を使用したex vivo操作の後に、これらの細胞は、増強された生着およびin vivo増大のための好ましい状態にあり得る。したがって本発明の文脈内で、この回復期の間に、Ｔ細胞、樹状細胞、または造血系統の他の細胞を含む血液細胞を収集することが企図される。さらにある態様において、可動化（mobilization）（例えば、ＧＭ－ＣＳＦによる可動化）および順化レジメンを使用して、対象において、特定の細胞型の再増殖（repopulation）、再循環、再生、および／または増大が好まれる状態を、特に治療後の定義された時間枠の間に作り出すことができる。実例の細胞型には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、および免疫系の他の細胞が含まれる。
Ｔ細胞の活性化および増大
望ましいＣＡＲを発現するためのＴ細胞の遺伝子改変の前であっても後であっても、Ｔ細胞は、例えば、以下の文献に記載されている方法を一般的に使用して、活性化および増大することができる：米国特許6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；および米国特許出願公開第20060121005号。
一般に、本発明のＴ細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤とＴ細胞表面上の共刺激分子を刺激するリガンドとを付着させて有する表面との接触によって、増大される。特にＴ細胞集団は、本明細書に記載のように刺激され得る；例えば抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または表面に固定化された抗ＣＤ２抗体との接触によって、またはカルシウムイオノフォアと組み合わされたプロテインキナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）との接触によって、刺激され得る。Ｔ細胞表面のアクセサリー分子の共刺激には、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の集団は、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下で、接触させることができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体。抗ＣＤ２８抗体の例には、９．３、Ｂ－Ｔ３、ＸＲ－ＣＤ２８（Diaclone, Besancon, France）が含まれ、当技術分野で一般に知られている他の方法同様に使用することができる（Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998；Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9): 13191328, 1999；Garland et al., J. Immunol Meth. 227(l-2):53-63, 1999）。
ある態様において、Ｔ細胞の一次刺激シグナルおよび共刺激シグナルは、異なるプロトコルによって提供され得る。例えば、各シグナルを提供する薬剤は、溶液中にあるか、または表面に結合されていてもよい。表面に結合される場合、薬剤は、同じ表面に結合されても（すなわち、「シス」形成において）、または別個の表面に結合されてもよい（すなわち、「トランス」形成において）。代替的に、一方の薬剤を表面に結合させ、もう一方の薬剤は溶液中にあってもよい。いくつかの態様において、共刺激シグナルを提供する薬剤は細胞表面に結合され、一次活性化シグナルを提供する薬剤は、溶液中にあるか、または表面に結合されている。ある態様において、両方の薬剤が溶液中にあり得る。別の態様において、薬剤は可溶性形態であり得、次いで、例えばＦｃ受容体を発現する細胞、または薬剤に結合する抗体もしくは他の結合剤などの表面に架橋され得る。これに関して、例えば、本発明においてＴ細胞を活性化および増大する際に使用することが企図される人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）については、米国特許出願公開第20040101519号および20060034810号を参照されたい。
いくつかの態様において、２つの薬剤は、同じビーズ上、すなわち「シス」、または別のビーズ、すなわち「トランス」のいずれかで、ビーズ上に固定化される。例として、一次活性化シグナルを提供する薬剤は、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメントであり、共刺激シグナルを提供する薬剤は、抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合フラグメントである；そして両方の薬剤は、同等の分子量で同じビーズに共固定化される。いくつかの態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞増大およびＴ細胞増殖のためにビーズに結合した各抗体の１：１の比率が使用される。本発明のある側面において、ビーズに結合した抗ＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比率は、１：１の比率を使用して観察された増大と比較して、Ｔ細胞増大における増加が観察されるように使用される。１つの特定の態様において、１：１の比率を使用して観察された増大と比較して、約１倍から約３倍の増加が観察される。いくつかの態様において、ビーズに結合したＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比率は、１００：１から１：１００の範囲およびその間のすべての整数値である。本発明の一側面において、抗ＣＤ３抗体よりも多くの抗ＣＤ２８抗体が粒子に結合している、すなわち、ＣＤ３：ＣＤ２８の比率は１未満である。本発明のある態様において、ビーズに結合した抗ＣＤ２８抗体対抗ＣＤ３抗体の比率は、２：１よりも大きい。１つの特定の態様において、ビーズに結合した抗体の、１：１００のＣＤ３：ＣＤ２８比率が使用される。別の態様において、ビーズに結合した抗体の、１：７５のＣＤ３：ＣＤ２８比率が使用される。さらなる態様において、ビーズに結合した抗体の、１：５０のＣＤ３：ＣＤ２８比率が使用される。別の態様において、ビーズに結合した抗体の、１：３０のＣＤ３：ＣＤ２８比率が使用される。１つの好ましい態様において、ビーズに結合した抗体の、１：１０のＣＤ３：ＣＤ２８比率が使用される。別の態様において、ビーズに結合した抗体の、１：３のＣＤ３：ＣＤ２８比率が使用される。さらに別の態様において、ビーズに結合した抗体の、３：１のＣＤ３：ＣＤ２８比率が使用される。
粒子対細胞の比率として１：５００から５００：１までおよびその間の任意の整数値を使用して、Ｔ細胞または他の標的細胞を刺激することができる。当業者が容易に理解できるように、粒子の細胞に対する比率は、標的細胞に対する粒子サイズに依存し得る。例えば、小さいサイズのビーズは少数の細胞にしか結合できないが、大きいビーズは多くの細胞に結合できる。ある態様において、細胞対粒子の比率は、１：１００から１００：１の範囲およびその間の任意の整数値であり、さらなる態様において、比率は、１：９から９：１およびその間の任意の整数値を含み、Ｔ細胞を刺激するためにも使用することができる。Ｔ細胞刺激をもたらす抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８結合粒子とＴ細胞との比率は、上記のように変化し得るが、特定の好ましい値には、以下が含まれる：１：１００、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、および１５：１。１つの好ましい比率は、Ｔ細胞あたり少なくとも１：１の粒子である。いくつかの態様において、１：１以下の粒子対細胞の比率が使用される。１つの特定の態様において、好ましい粒子：細胞比率は１：５である。さらなる態様において、粒子の細胞に対する比率は、刺激の日に応じて変化させることができる。例えば、いくつかの態様において、粒子対細胞の比率は、初日に１：１から１０：１であり、追加の粒子が、細胞に、毎日または隔日で最大１０日間、最終的な比率で１：１から１：１０まで（追加日の細胞数に基づく）、添加される。１つの特定の態様において、粒子対細胞の比率は、刺激の初日で１：１であり、刺激の３日目および５日目で１：５に調整される。別の態様において、粒子は、毎日または隔日ベースで、刺激の１日目に１：１、および３日目および５日目に１：５の最終比率になるように添加される。別の態様において、粒子対細胞の比率は、刺激の初日で２：１であり、刺激の３日目および５日目で１：１０に調整される。別の態様において、粒子は、毎日または隔日ベースで、刺激の１日目に１：１、および３日目および５日目に１：１０の最終比率になるように添加される。当業者は、様々な他の比率が本発明での使用に適し得ることを理解するであろう。特に、比率は、粒子サイズならびに細胞のサイズおよび型によって異なるであろう。
本発明のさらなる態様において、Ｔ細胞などの細胞は、薬剤でコーティングされたビーズと組み合わされ、続いてビーズと細胞が分離され、次いで細胞が培養される。代替の態様において、培養の前に、薬剤でコーティングされたビーズと細胞は分離されず、一緒に培養される。さらなる態様において、ビーズと細胞は、最初に磁力などの力の適用により濃縮されて細胞表面マーカーのライゲーションが増加し、それによって細胞刺激が誘導される。
一例として、細胞表面タンパク質は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８が付着している常磁性ビーズ（３×２８ビーズ）をＴ細胞に接触させることによって、ライゲートすることができる。いくつかの態様において、細胞（例えば、１０４から１０９のＴ細胞）およびビーズ（例えば、１：１の比率のDYNABEADS（登録商標）M-450 CD3/CD28 T常磁性ビーズ）は、緩衝液、好ましくはＰＢＳ（カルシウムやマグネシウムなどの二価カチオンを含まないもの）中で組み合わされる。この場合も、当業者は、任意の細胞濃度を使用できることを容易に理解することができる。例えば、標的細胞は試料中で非常にまれであり試料の０．０１％のみを構成するか、または試料全体（すなわち、１００％）が目的の標的細胞を含み得る。したがって、任意の細胞数が本発明の文脈内にある。ある態様において、粒子と細胞が共に混合される体積を著しく減少させて（すなわち、細胞の濃度を増加させて）、細胞と粒子の最大の接触を確実にすることが望ましい場合がある。例えば、いくつかの態様において、約２０億細胞／ｍｌの濃度が使用される。別の態様において、１億個を超える細胞／ｍｌが使用される。さらなる態様において、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、または５０００万細胞／ｍｌの細胞の濃度が使用される。さらに別の態様において、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または１億細胞／ｍｌからの細胞の濃度が使用される。さらなる態様において、１億２５００万または１億５０００万細胞／ｍｌの濃度を使用することができる。高濃度を使用すると、細胞収量、細胞活性化、および細胞増大が高まる可能性がある。さらに、高い細胞濃度を使用すると、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞などの目的の標的抗原を弱く発現する可能性のある細胞の、より効率的な捕捉が可能になる。かかる細胞の集団は、治療的価値を有する可能性があり、ある態様においては入手することが望ましいであろう。例えば、高濃度の細胞を使用すると、通常はＣＤ２８の発現が弱いＣＤ８＋Ｔ細胞の、より効率的な選択が可能となる。
本発明のいくつかの態様において、混合物は、数時間（約３時間）から約１４日、またはその間の任意の時間整数値で培養することができる。別の態様において、混合物を２１日間培養することができる。本発明のいくつかの態様において、ビーズとＴ細胞は、約８日間一緒に培養される。別の態様において、ビーズとＴ細胞は、２～３日間一緒に培養される。Ｔ細胞の培養時間が６０日以上になるように、数サイクルの刺激が望ましい場合もある。Ｔ細胞培養に適した条件には、増殖および生存に必要な因子を含有し得る適切な培地（例えばMinimal Essential MediaまたはRPMI Media 1640またはX-vivo 15（Lonza））が含まれ、これは以下を含む：血清（例えばウシ胎児血清またはヒト血清）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インスリン、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＴＧＦ－β、およびＴＮＦ－α、または当業者に知られている細胞の増殖のための任意の他の添加剤。細胞増殖のための他の添加剤には、限定はされないが、界面活性剤、血漿プラスマネート（plasmanate）、およびＮ－アセチル－システインおよび２－メルカプトエタノールなどの還元剤が含まれる。培地には、RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 15、およびX-Vivo 20、Optimizerが含まれ、これにはアミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンと共に、無血清の、または適切な量の血清（または血漿）または規定のホルモンのセット、および／もしくはＴ細胞の増殖と増大に十分な量のサイトカインが補充される。ペニシリンおよびストレプトマイシンなどの抗生物質は、実験培養物にのみ含まれ、対象に注入する細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、増殖をサポートするために必要な条件下、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、空気プラス５％ＣＯ２）の下で維持される。
様々な刺激時間に曝露されたＴ細胞は、異なる特徴を示し得る。例えば、典型的な血液またはアフェレーシスされた末梢血単核細胞生成物は、細胞傷害性またはサプレッサーＴ細胞集団（Ｔｃ、ＣＤ８＋）よりも多くのヘルパーＴ細胞集団（３／４、ＣＤ４＋）を有する。ＣＤ３およびＣＤ２８受容体を刺激することによるＴ細胞のex vivo増大は、約８～９日前には主に３／４細胞からなるＴ細胞の集団を生成し、一方約８～９日後には、Ｔ細胞の集団はますます多くのＴｃ細胞の集団を含む。したがって、処置の目的に応じて、主にＴＨ細胞を含むＴ細胞集団を対象に注入することが有利であり得る。同様に、Ｔｃ細胞の抗原特異的サブセットが単離されている場合、このサブセットをさらに増大することが有益であり得る。
さらにまた、ＣＤ４およびＣＤ８マーカーに加えて、他の表現型マーカーも、大幅にしかし大部分は再現可能に、細胞増大プロセスの過程の間変化する。したがってかかる再現性は、活性化されたＴ細胞産物を特定の目的のために調整する能力を実現可能にする。
治療的用途
いくつかの態様において、本発明は、抗原認識ドメイン（例えば、ＢＣＭＡに特異的なｓｃＦｖ）、膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８膜貫通ドメイン）、および細胞質ドメイン（例えば、ＣＤ３－ゼータ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４－１ＢＢの細胞内ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせ）を組み合わせたＣＡＲを発現するように改変された細胞（例えば、Ｔ細胞）を包含する。したがって、いくつかの例においては、形質導入された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は、ＣＡＲ媒介性免疫（例えば、Ｔ細胞）応答を誘発することができる。いくつかの態様において、本発明は、一次Ｔ細胞の特異性を腫瘍抗原に向け直すための、ＣＡＲの使用を提供する。したがっていくつかの態様において、本発明はまた、ＣＡＲを発現するＴ細胞を哺乳動物に投与するステップを含む、哺乳動物における標的細胞集団または組織に対するＴ細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法を提供し、ここでＣＡＲは、所定の標的（例えば、ＢＣＭＡ）と特異的に相互作用する結合部分、例えばヒトＣＤ３ゼータの細胞内ドメインを含むゼータ鎖部分、および共刺激シグナル伝達領域を含む。いくつかの態様において、本発明は、Ｔ細胞がＣＡＲを発現するように遺伝子改変され、ＣＡＲ Ｔ細胞がそれを必要とするレシピエントに注入されるタイプの細胞療法を含む。注入された細胞は、レシピエントの腫瘍細胞を死滅させることができる。抗体療法とは異なり、ＣＡＲ Ｔ細胞はin vivoで複製することができ、持続的な腫瘍制御につながり得る長期的な持続性をもたらす。
特定の理論に束縛されることを望まないが、ＣＡＲ改変Ｔ細胞（CAR-modified T cells）によって誘発される抗腫瘍免疫応答は、能動的または受動的免疫応答であり得る。さらに、ＣＡＲ媒介性免疫応答は、ＣＡＲ改変Ｔ細胞がＣＡＲの抗原結合部分に特異的な免疫応答を誘導する、養子免疫療法アプローチの一部であり得る。例えば、ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＢＣＭＡを発現する細胞に対して特異的な免疫応答を誘発する。本明細書に開示されるデータは、抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ならびに４１ＢＢ、ＣＤ２８およびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むレンチウイルスベクターを具体的に開示するが、本発明は、本明細書の他の部分に記載されるように、構築物の各成分について任意の数のバリエーションを含むと解釈されるべきである。すなわち、本発明は、抗原結合部分に特異的なＣＡＲ媒介性Ｔ細胞応答を生成するための、ＣＡＲ内の任意の抗原結合部分の使用を含む。例えば、本発明のＣＡＲの抗原結合部分は、がんを処置する目的で腫瘍抗原を標的化することができる。いくつかの態様において、本発明のＣＡＲの抗原結合部分は、多発性骨髄腫などの特定のがんを処置するように設計される。
本発明のＣＡＲ改変Ｔ細胞はまた、哺乳動物におけるex vivo免疫化および／またはin vivo治療のための一種のワクチンとしても役立ち得る。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
ex vivo免疫化に関して、以下のうちの少なくとも１つが、細胞を哺乳動物に投与する前にin vitroで起こる：ｉ）細胞の増大、ｉｉ）ＣＡＲをコードする核酸を細胞に導入すること、および／またはｉｉｉ）細胞の凍結保存。ex vivo手順は当技術分野で周知であり、以下でより完全に議論される。簡単に言えば、細胞は哺乳動物（好ましくはヒト）から単離され、本明細書に開示のＣＡＲを発現するベクターで遺伝子改変される（例えば、in vitroで形質導入またはトランスフェクトされる）。ＣＡＲ改変細胞は、哺乳動物レシピエントに投与して、治療上の利益を提供することができる。哺乳動物レシピエントはヒトであってよく、ＣＡＲ改変細胞はレシピエントに関して自家であることができる。代替的に、細胞は、レシピエントに関して同種異系、同系または異種であることができる。
造血幹細胞および前駆細胞のex vivo増大のための手順は、米国特許第5,199,942号に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれ、本発明の細胞に適用することができる。他の適切な方法が当技術分野で知られており、したがって本発明は、細胞のex vivo増大の任意の特定の方法に限定されない。簡単に述べると、Ｔ細胞のex vivo培養および増大は、以下を含む：（１）哺乳動物からのＣＤ３４＋造血幹細胞および前駆細胞を、末梢血採取または骨髄外植片から収集すること；および（２）かかる細胞をex vivoで増大すること。米国特許第5,199,942号に記載されている細胞増殖因子に加えて、ｆｌｔ３－Ｌ、ＩＬ－１、ＩＬ－３およびｃ－ｋｉｔリガンドなどの他の因子を、細胞の培養および増大に使用することができる。細胞ベースのワクチンをex vivo免疫化に関して使用することに加えて、本発明はまた、患者において抗原に対する免疫応答を誘発するためのin vivo免疫化のための、組成物および方法も提供する。
一般に、本明細書に記載のように活性化および増大された細胞は、がんを有する個体などの免疫無防備状態の個体で生じる疾患の、処置および予防に利用することができる。特に、本発明のＣＡＲ改変Ｔ細胞は、多発性骨髄腫の処置に使用される。ある態様において、本発明の細胞は、多発性骨髄腫を発症するリスクのある患者の処置に使用される。
本発明のＣＡＲ改変免疫細胞（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞）、またはかかる細胞を含む組成物は、それを必要とする対象に使用されるか、または投与されて、抗腫瘍免疫を提供し；がんを処置または予防し；自己免疫状態を処置または予防し；またはアレルギー状態を処置または予防することができる。いくつかの態様において、がんは、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、白血病、または膠芽腫である。いくつかの態様において、自己免疫状態は、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、天痘瘡、乾癬、炎症性腸疾患、セリアック病、悪性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、強皮症、グレーブス病、シェーグレン症候群、グッドパスチャー症候群、または１型糖尿病である。いくつかの態様において、アレルギー状態は、アナフィラキシー、喘息、食物アレルギー、刺咬昆虫アレルギー、薬物アレルギー、アレルギー性鼻炎、蕁麻疹、血管浮腫、湿疹、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、および好酸球性食道炎である。
本発明のＣＡＲ改変免疫細胞（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞）は、単独で、または希釈剤および／またはＩＬ－２もしくは他のサイトカインもしくは細胞集団などの他の成分と組み合わせた組成物（例えば、医薬組成物）として、投与され得る。簡単に言えば、本発明の医薬組成物は、本明細書に記載の標的細胞集団を、１つ以上の薬学的または生理学的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含み得る。かかる組成物は、以下を含み得る：緩衝液、例えば中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水など；炭水化物、例えばグルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなど；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸；抗酸化剤；キレート剤、例えばＥＤＴＡまたはグルタチオン；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および防腐剤。
本発明の組成物は、好ましくは、静脈内投与用に製剤化される。
本発明の医薬組成物は、処置（または予防）される疾患に適切な様式で投与することができる。投与の量および頻度は、患者の状態、患者の疾患の種類および重症度などの要因によって決定されるが、ただし適切な投与量は臨床試験によって決定され得る。
「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍抑制有効量」または「治療量」が示される場合、投与される本発明の組成物の正確な量は、医師によって、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染症または転移の程度、および状態における個人差を考慮して決定され得る。本明細書に記載のＣＡＲ改変免疫細胞（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞）を含む医薬組成物は、１０４～１０９細胞／ｋｇ体重、好ましくは１０５～１０６細胞／ｋｇ体重、およびこれらの範囲内のすべての整数値を含む用量で投与し得ると、一般に述べることができる。Ｔ細胞組成物はまた、これらの投薬量で複数回投与され得る。細胞は、免疫療法で一般的に知られている注入技術を使用して投与することができる（例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988を参照）。特定の患者に最適な投与量および処置計画は、医学の当業者によって、疾患の兆候について患者をモニタリングし、それに応じて処置を調整することにより、容易に決定することができる。
ある態様において、活性化免疫（例えば、Ｔ細胞）を対象に投与し、その後血液を再採取し（またはアフェレーシスを実施し）、本発明に従ってそこからＴ細胞を活性化し、これらの活性化および増大したＴ細胞を患者に再注入することが望ましい場合がある。このプロセスは、数週間ごとに複数回実行できる。ある態様において、Ｔ細胞は、１０ｃｃから４００ｃｍの採血から活性化され得る。ある態様において、Ｔ細胞は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、または１００ｃｃの採血から活性化される。理論に束縛されることなく、この複数回の採血／複数回の再注入プロトコルを使用すると、Ｔ細胞の特定の集団を選択するのに役立ち得る。
対象組成物の投与は、任意の便利な様式で実施することができ、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、移植（implantation）または移植（transplantation）を含む。本明細書に記載の組成物は、患者に対して、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって、または腹腔内に投与することができる。いくつかの態様において、本発明の免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）組成物は、皮内注射または皮下注射によって患者に投与される。別の態様において、本発明の免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）組成物は、好ましくは、ｉ．ｖ．注射によって投与される。免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の組成物は、腫瘍、リンパ節、または疾患部位に直接注射してもよい。
本発明のある態様において、本明細書に記載の方法、またはＴ細胞が治療レベルに増大される当技術分野で知られている他の方法を使用して活性化および増大された細胞は、患者に対して、任意の数の関連処置法と組み合わせて（例えば、その前に、同時にまたはその後に）使用され得て、該関連処置法としては、限定はされないが以下を含む：抗ウイルス療法、シドフォビルおよびインターロイキン－２、シタラビン（ＡＲＡ－Ｃとしても知られる）などの薬剤による処置、またはＭＳ患者に対するナタリズマブ処置または乾癬患者に対するエファリズマブ処置またはＰＭＬ患者のための他の処置。さらなる態様において、本発明のＴ細胞は、以下と組み合わせて使用し得る：化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸、およびＦＫ５０６、抗体、または他の免疫抑制剤、例えばCAMPATH（アレムツズマブ）、抗ＣＤ３抗体、または他の抗体療法、サイトキシン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、および照射など。これらの薬剤は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリン（シクロスポリンおよびＦＫ５０６）を阻害するか、成長因子誘導シグナル伝達に重要なｐ７０Ｓ６キナーゼ（ラパマイシン）を阻害する。さらなる態様において、本発明の細胞組成物は、患者に対して、骨髄移植、フルダラビン、外部ビーム放射線治療（ＸＲＴ）、シクロホスファミドなどの化学療法剤、またはＯＫＴ３やCAMPATHなどの抗体のいずれかを使用するＴ細胞切除療法と併せて（例えば、その前に、それと同時に、またはその後に）投与される。別の態様において、本発明の細胞組成物は、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えば、リツキサンなどのＢ細胞切除療法の後に投与される。例えばいくつかの態様において、対象は、高用量化学療法による標準的な処置とそれに続く末梢血幹細胞移植を受けることができる。ある態様において、移植に続いて、対象は、本発明の増大された免疫細胞の注入を受ける。追加の態様において、増大された細胞は、手術の前または後に投与される。
ヒト投与のための投薬量のスケーリングは、当技術分野で認められている慣行に従って実施することができる。例えばCAMPATHの用量は、一般に、成人患者の場合１～約１００ｍｇの範囲であり、通常１～３０日間毎日投与される。好ましい１日用量は１日あたり１～１０ｍｇであるが、いくつかの例において、１日あたり最大４０ｍｇのより大きな用量が使用され得る（米国特許第6,120,766号に記載されている）。ＣＡＲ Ｔ細胞の投与とスケジューリングの戦略が議論されている（Ertl et al., 2011, Cancer Res, 71:3175-81; Junghans, 2010, Journal of Translational Medicine, 8:55）。
さらなる詳細なしに、当業者は、上記の説明に基づいて本開示を最大限に利用することができると考えられる。したがって以下の特定の態様は、単なる例示として解釈されるべきであり、いかなる方法においても本開示の残りの部分を限定するものではない。本明細書で引用されるすべての刊行物は、本明細書で参照されている目的または主題のために、参照により組み込まれる。
本明細書に記載の発明をより完全に理解するために、以下の実施例を示す。本出願に記載の合成例は、本明細書に提供される化合物および方法を例証するために提供されており、決してそれらの範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
他に定義されない限り、本明細書で使用するすべての技術的および科学的用語は、本発明が関係する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法および材料を、本発明の試験の実施に使用することができるが、好ましい材料および方法は本明細書に記載されている。本発明を説明および特許請求する際に、以下の用語が使用される。
例１：本発明のｍＲＮＡ構築物からの機能的ＣＡＲ Ｔ細胞の生成
ヒトＣＡＲ Ｔ細胞を、本発明のＣＡＲタンパク質をコードする本発明のｍＲＮＡ構築物を使用して生成した。ＣＡＲ Ｔ細胞は、生存可能であり、ＢＣＭＡに結合し、ＢＣＭＡ＋腫瘍細胞を死滅させることが観察された。
配列番号３１のヌクレオチド配列を含む本発明のｍＲＮＡ構築物を、ＤＮＡプラスミドからのin vitro転写によって生成した。in vitro転写は、線形化されたプラスミドテンプレートからのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによって実施し、約１５０アデニンヌクレオチドのポリアデニンテールを酵素的に付加した。７－メチルグアノシンキャップを、ｍＲＮＡの５’末端に、同時転写ｍＲＮＡ合成中に組み込んだ。
本発明のｍＲＮＡ構築物は、５’から３’まで、以下を含んでいた：５’キャップ、配列番号７４として記載の５’ＵＴＲ、配列番号１１２として記載のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、配列番号９２として記載の３’ＵＴＲ、および１５０アデニンユニット以上の３’ポリアデニンテール。ＯＲＦは、配列番号２１のアミノ酸配列を有する本発明のＣＡＲタンパク質をコードした。
ｍＲＮＡ構築物からＣＡＲ Ｔ細胞を調製するために、リンパ球を、健康なヒトドナーからのアフェレーシスによって得た。これらのリンパ球から、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ８抗体に結合した常磁性マイクロビーズで正に選択した。これにより、９５％ＣＤ８＋Ｔ細胞で９５％生存可能な細胞が得られた。これらの濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ３抗体（クローンＯＫＴ３）の存在下で５％ＣＯ２と共に３７oＣで約１４日間インキュベートすることにより、増大させた。細胞をＰ３トランスフェクションバッファー（Lonza）に再懸濁し、エレクトロポレーション（4D Nucleofector（登録商標）、Lonza）により製造元の指示に従って、ｍＲＮＡ構築物でトランスフェクトした。次に細胞を、ＩＬ－１５を含む標準培地での約８時間の培養に戻した。
上記プロセスから得たＣＡＲ Ｔ細胞を、生存率、ＣＡＲタンパク質発現、ＢＣＭＡ結合、および細胞毒性、すなわちＢＣＭＡ＋骨髄腫（腫瘍）細胞を死滅させる能力について試験した。生存率、ＣＡＲ発現、およびＢＣＭＡ結合は、GUAVA（登録商標）EASYCYTE（登録商標） 12HTフローサイトメーター（EMD Millipore）でのフローサイトメトリーにより決定した。生存率を試験するために、ＣＡＲ Ｔ細胞の試料をヨウ化プロピジウムと混合し、フローサイトメーターで近赤外チャネルの蛍光を電子ゲーティングして実施した。ＣＡＲタンパク質の発現とＢＣＭＡ結合を試験するために、ＣＡＲ Ｔ細胞の試料を、０．４ｕｇ／ｍＬのフィコエリスリン（ＰＥ）結合ＢＣＭＡ（組換えヒトTNFRSF17タンパク質、Ｆｃ／Ｈｉｓタグ付き、Ｒ－ＰＥ標識；Creative Biomart, Shirley, NY）と共にインキュベートした。ＣＡＲ発現は、フローサイトメーターで、黄色チャネルの蛍光を電子ゲーティングして評価し、ＣＡＲ陽性およびＣＡＲ陰性細胞上のＢＣＭＡ－ＰＥからの発光の有無を検出した。ＢＣＭＡ結合は、黄色チャネルの蛍光強度を測定して、標識されたＣＡＲ陽性細胞に結合したＢＣＭＡ－ＰＥの相対量を決定することにより、決定した。生存率、発現、およびＢＣＭＡ結合アッセイについては、ｍＲＮＡなしでエレクトロポレーションしたＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＡＲ陰性Ｔ細胞）を、並行対照として試験した。
ＣＡＲ Ｔ細胞の、ＢＣＭＡ＋骨髄腫細胞を死滅させる能力を試験するために、ＣＡＲ Ｔ細胞を、緑色蛍光タンパク質（ＭＭ．１Ｓ－ＧＦＰ）を発現するＢＣＭＡ＋骨髄腫細胞株と共インキュベートした。５０，０００個のＭＭ．１Ｓ－ＧＦＰ腫瘍細胞のアリコートを、９６ウェルプレートのウェルに配置した。約２５００～５０，０００個のＣＡＲ Ｔ細胞を各ウェルに添加して、約１：１～１：２０の間の様々なエフェクター：標的比（すなわち、ＣＡＲ Ｔ細胞のＢＣＭＡ＋骨髄腫細胞に対する比率）を得た。一晩のインキュベーション後、ヨウ化プロピジウムを使用して死細胞を染色した。生存可能な標的細胞を同定し、細胞密度をフローサイトメトリーによって決定した。ＣＡＲ Ｔ細胞による骨髄腫細胞の死滅の程度は、ＣＡＲ Ｔ細胞を含まない同時対照ウェルにおける骨髄腫細胞の数と比較することにより計算した。結果は図１と表２に反映されており、これはトランスフェクションの２４時間後の、配列番号３１のＣＡＲまたは対照（ｍＲＮＡなし）で生成されたＣＡＲ Ｔ細胞による、細胞生存率、ＣＡＲ発現、ＢＣＭＡ結合の評価、ならびにＢＣＭＡ＋骨髄腫（腫瘍）細胞の死滅パーセンテージを示す。

表２－配列番号３１のＣＡＲで生成されたＣＡＲ Ｔ細胞による細胞生存率、ＣＡＲ発現、ＢＣＭＡ結合の評価、およびＢＣＭＡ＋骨髄腫（腫瘍）細胞の死滅パーセンテージ。＊トランスフェクションの４時間後に測定。＊＊死滅アッセイで使用される１：１０のエフェクター：標的比（死滅アッセイは４日間のインキュベーション）。
結論として、ｍＲＮＡ構築物を使用してＣＡＲ Ｔ細胞を生成した。ｍＲＮＡ構築物は、本発明のＣＡＲタンパク質をコードした。ＣＡＲ Ｔ細胞は、高い生存率、ＣＡＲタンパク質発現、ＢＣＭＡ結合、およびＢＣＭＡ＋骨髄腫（腫瘍）細胞の死滅を示した。ｍＲＮＡ構築物なしでエレクトロポレーションしたＣＤ８＋Ｔ細胞は、本質的にＣＡＲ発現なし、本質的にＢＣＭＡ結合なし、および腫瘍細胞の死滅を示さなかった。
例２：ＣＡＲ相補性決定領域でのアミノ酸置換
改善された特性を有するＣＡＲを生成するために、様々なアミノ酸置換を抗ＢＣＭＡ ＣＡＲの相補性決定領域（ＣＤＲ）に導入した。偶然にもこれらの改変は、ＣＡＲ Ｔ細胞およびAli et al. (2016)の臨床試験で使用された、すなわち配列番号１９のそれぞれのＣＡＲと比較して、ＣＡＲ Ｔ細胞によるＢＣＭＡ結合および腫瘍死滅を実質的に改善した。
ＣＡＲをコードする多数のｍＲＮＡ構築物を、配列番号２９を参照配列として用いて調製した。新規構築物は、１つ以上のＣＤＲにおける１つ以上のアミノ酸残基に関して異なっていた。
以下の表３は、この実施例に記載のｍＲＮＡ構築物を提供する。表３は、３つの重鎖および３つの軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３）の各々に含まれるそれぞれの親配列および配列フラグメントを示す。ＣＡＲのｓｃＦｖ領域に対応するかまたは実質的に対応するＣＡＲの部分は、表３において「新規ｓｃＦｖ配列」と呼ばれる。

表３－「新規ｓｃＦｖ」配列の配列識別番号（配列番号）のリスト（それらの親配列および対応するＣＤＲ配列を含む）。アスタリスク（＊）は親配列に関するアミノ酸置換を示し、配列番号の一部ではない。
各ｍＲＮＡ構築物について、例１に記載のように、ＣＡＲ Ｔ細胞をヒトＣＤ８＋細胞へのトランスフェクションにより調製した。次に、各ｍＲＮＡ構築物から作製したＣＡＲ Ｔ細胞を、例１に記載のように、ＢＣＭＡ結合および腫瘍死滅についてエレクトロポレーションの３日後に試験した。結果を以下に示す表４に要約する。

表４－対応するｓｃＦｖ部分を発現するＣＡＲ Ｔ細胞を用いてのＢＣＭＡ結合結果および死滅されたヒト骨髄腫細胞％。＊エフェクター：標的比は１：２。
したがって、ＣＤＲを改変するいくつかの試みは、ＢＣＭＡ結合を減少させたため不成功であった。ただし特定のＣＡＲ、例えば配列番号５７、配列番号６０、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６９、および配列番号７０の配列を含むものは、配列番号１９の最初のＣＡＲと比較して、それらのＣＤＲ残基が実質的に改変されているのみでなく、劇的により良いＣＡＲ発現およびヒト骨髄腫細胞の死滅を提供した。
例３．ＣＡＲ ｓｃＦｖフレームワーク領域でのアミノ酸置換によるヒト化
ＣＡＲをヒト化するために、ＣＡＲのｓｃＦｖフレームワーク領域に様々なアミノ酸置換を導入した。偶然にもこれらの改変は、Ali et al (2016)の臨床試験で使用された、すなわち配列番号１９の非ヒト化ＣＡＲのＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、ＣＡＲ Ｔ細胞のＢＣＭＡ結合および腫瘍死滅を実質的に改善した。
ＣＡＲをコードする多数のｍＲＮＡ構築物を、配列番号２９のｍＲＮＡ構築物を出発点として使用して（これは、配列番号１９の配列のＣＡＲをコードし、配列番号４８の配列のｓｃＦｖを含む）調製した。これらの構築物は、ｓｃＦｖ相補性決定領域（ＣＤＲ）の同じかまたは実質的に同じアミノ酸残基をコードしたが、ｓｃＦｖフレームワーク領域のアミノ酸残基に関して異なっていた。これらのバリエーションを作成するにあたり、実験者の意図は、ＣＡＲを発現するＣＡＲ Ｔ細胞のＢＣＭＡ結合および腫瘍死滅特性を低下させることなく、ｓｃＦｖフレームワーク領域をヒト化することであった。各ｍＲＮＡ構築物について、ＣＡＲ Ｔ細胞を、ヒトＣＤ８＋細胞へのトランスフェクションにより、実質的に実施例１に記載のように調製した。次に、各ｍＲＮＡ構築物から作製されたＣＡＲ Ｔ細胞を、実質的に例１に記載のように、ＢＣＭＡ結合および／または腫瘍死滅についてエレクトロポレーションの３日後に試験した。
実験の最初の反復において、様々な改変をＣＡＲのｓｃＦｖフレームワーク残基に行い、結果を表５に示す。

表５－対応するｓｃＦｖ配列を発現しフレームワーク残基に改変を有するＣＡＲ Ｔ細胞を用いたＢＣＭＡ結合の結果。
したがって、ｓｃＦｖフレームワークをヒト化するためのいくつかの試みは、ＢＣＭＡ結合を減少させたため不成功であった。しかしながら、配列番号５４のｓｃＦｖを含むＣＡＲは、配列番号４８の参照ｓｃＦｖを含むがその他は同等のＣＡＲよりも、ＣＡＲ Ｔ細胞のＢＣＭＡ結合において４１％の改善を提供した。したがって、配列番号５４のｓｃＦｖをさらなる最適化のリードとして選択した。実験の２回目の反復では、ＣＡＲのｓｃＦｖフレームワーク残基にさらに様々な改変を行い、ＢＣＭＡ結合の結果は次の表６に示すものであった。

表６－対応するｓｃＦｖ配列を発現しフレームワーク残基にさらなる改変を有するＣＡＲ Ｔ細胞を用いたＢＣＭＡ結合の結果。
ｓｃＦｖフレームワークをヒト化するためのいくつかの試みは、ＢＣＭＡ結合を減少させたため不成功であった。しかしながら、配列番号５７のｓｃＦｖは、配列番号５４のｓｃＦｖよりも、ＣＡＲ Ｔ細胞ＢＣＭＡ結合においてさらに２４％の改善を提供した。したがって、配列番号５７のｓｃＦｖを含むＣＡＲをさらなる最適化のためのリードとして選択した。
実験の第３の反復において、配列番号５７のｓｃＦｖを含むＣＡＲを、以下と比較した：（１）配列番号４８の最初のｓｃＦｖを含むＣＡＲ；（２）配列番号５７のｓｃＦｖからさらに改変された、配列番号６０のｓｃＦｖ；および（３）配列番号４８のｓｃＦｖから独立した方法により開発された、配列番号６１のｓｃＦｖ（Antibody Humanization by a Single Cycle of CDR-Grafting, Hu et al. in Ricin Toxin; Bentham Science Publishers Eds. JW Cherwonwogrodzky）。表７に示す次の結果は、ＢＣＭＡの結合と腫瘍死滅について見られた。

表７－対応するｓｃＦｖ部分を発現するＣＡＲ Ｔ細胞を用いてのＢＣＭＡ結合結果および死滅されたヒト骨髄腫細胞％。＊＊エフェクター：標的比は１：１０。
最後に、達成されたヒト化の量を測定するために、上記配列それぞれのｓｃＦｖのフレームワーク領域のアミノ酸を、免疫遺伝学データベース（ＩＭＧＴ）の配列から同定されたその配列の最も近い生殖細胞系列隣接物（closest germline neighbor）のアミノ酸と比較した（IMGT（登録商標）, the international ImMunoGeneTics information system（登録商標） 25 years on. Lefranc M-P et al., Nucleic Acids Res. 2015 Jan;43:D413-22）。最も近い生殖細胞系列隣接物に対する平均アミノ酸同一性は、配列番号４８について７８％、配列番号５７について８４％、および配列番号６０について８８％であった。したがって、この一連の配列改変とアッセイの終わりに、配列番号５７および配列番号６０のｓｃＦｖを含むＣＡＲは、配列番号１９の最初のＣＡＲと比較してｓｃＦｖフレームワーク残基が実質的にヒト化されただけでなく、ＣＡＲ Ｔ細胞に、劇的に優れたＢＣＭＡ結合および腫瘍死滅を提供した。
例４．ヒト化フレームワークとＣＤＲ領域を組み合わせたＣＡＲ
実験を行って、例２および例３に記載のヒト化ｓｃＦｖフレームワークとＣＤＲ配列の様々な組み合わせを試験した。目的は、どの様々な組み合わせが、ＣＡＲ Ｔ細胞に優れたＢＣＭＡ結合と腫瘍死滅を提供するかを決定することであった。以下に、この例の配列の参照表を示す。表に示す各組み合わせについて、ＣＡＲ Ｔ細胞を、実質的に例１に記載のように調製および試験した。比較のために、ＣＡＲ Ｔ細胞は、Ali et al (2016)のもの、すなわち配列番号１９に対応するＣＡＲタンパク質を用いても調製した。
表８は、それぞれの親配列ならびに、３つの重鎖および３つの軽鎖ＣＤＲ：ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３の各々に含まれる配列フラグメントを示す。

表８－「全長ＣＡＲ」配列の配列識別番号（配列番号）のリスト；それらのｓｃＦｖフレームワークの親配列および対応するＣＤＲ配列を含む。アスタリスク（＊）は親配列に関するアミノ酸置換を示し、配列番号の一部ではない。ＣＡＲ配列の配列番号２１、２３、および２５は、それぞれ、配列番号２０、２２、および２４の変型であり、これらは４１ＢＢ細胞内共刺激ドメインをさらに含む。
各ｍＲＮＡ構築物から作製したＣＡＲ Ｔ細胞を、ＢＣＭＡ結合および腫瘍死滅について、エレクトロポレーションの約３日後に試験した。結果を表９に示す。

表９－対応するＣＡＲ部分を発現するＣＡＲ Ｔ細胞を用いてのＢＣＭＡ結合結果および死滅されたヒト骨髄腫細胞％。
したがって、配列番号２８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、および配列番号２５のヒト化構築物は、配列番号１９と比較して、ＣＡＲ Ｔ細胞に、より優れたＢＣＭＡ結合およびヒト骨髄腫細胞の死滅を提供した。
これらの構築物のｓｃＦｖにおける、組み合わされたフレームワークとＣＤＲ領域のヒト化の程度を、Lazarの方法を使用して測定し（A molecular immunology approach to antibody humanization and functional optimization, Lazar GA. et al. Molecular Immunology (2007) 44:1986）、ヒトのストリング含有量および完全９ｍｅｒスコアを決定した。結果を表１０にまとめる。

表１０－ヒトストリング含有量および完全９ｍｅｒスコアを含む、示された各ＣＡＲアミノ酸配列のヒト化の程度。
ヒトストリング含有量および完全９ｍｅｒスコアは、親配列のヒト化の成功を示した。結論として、ＣＡＲのｓｃＦｖ領域に対する広範な一連の反復的で経験的な残基改変の後、配列番号１９のＣＡＲに関してｓｃＦｖ領域でヒト化されているのみでなく、ＣＡＲ Ｔ細胞に劇的に優れたＢＣＭＡ結合と骨髄腫細胞の死滅も提供する、いくつかのＣＡＲが得られた。
例５：ＣＡＲ共刺激ドメインにおけるアミノ酸置換
対照実験を行って、ＣＡＲタンパク質における特定の細胞内共刺激ドメインの包含または改変が、ＣＡＲタンパク質の発現を改善し、対応するＣＡＲ Ｔ細胞によるＢＣＭＡ結合および腫瘍死滅を改善したかどうかを試験した。
複数のｍＲＮＡ構築物を調製した；それらがコードするＣＡＲタンパク質は、同じシグナルペプチド、ｓｃＦｖ、柄（stalk）、および膜貫通ドメインを含むが、それらの共刺激ドメインにおいて１つ以上のアミノ酸が異なっていた。各ｍＲＮＡ構築物について、ＣＡＲ Ｔ細胞を、ヒトＣＤ８＋細胞へのトランスフェクションにより、実質的に例１に記載のように調製した。次に、各ｍＲＮＡ構築物から作製したＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＡＲ発現および抗腫瘍細胞傷害性について、エレクトロポレーションの約２４時間後に実質的に例１に記載のように試験した。Ali et al (2016)の臨床試験で使用されたｍＲＮＡ構築物を、対照として試験した（配列番号２９）。ｍＲＮＡ構築物およびそれらの発現結果を以下の表１１に示す。各共刺激ドメインについて、配列番号と配列の天然供給源を示す。

表１１－対応するＣＡＲ共刺激ドメインを発現するＣＡＲ Ｔ細胞を用いての相対的発現および死滅されたヒト骨髄腫細胞％。＊エフェクター：標的比１：１０。
ＣＤ２８－ＣＤ３ｚドメインを含む構築物と比較して、ＣＤ３ｚのみ、４１ＢＢ－ＣＤ３ｚ、ＯＸ４０－ＣＤ３ｚ、または４１ＢＢ－ＯＸ４０－ＣＤ３ｚを含む構築物は、優れた発現を示した。これは予想外であり、なぜならば、天然に存在する共刺激ドメインの、別のドメインへの置換は、通常、タンパク質の発現に影響を与えると予想されないからである。
ＣＤ３ｚのみまたは４１ＢＢ－ＣＤ３ｚの共刺激ドメインを含む構築物はまた、ＢＣＭＡ＋腫瘍細胞のより良い死滅を提供した。ＯＸ４０－ＣＤ３ｚまたは４１ＢＢ－ＯＸ４０－ＣＤ３ｚを含む構築物は、それらの優れた発現にもかかわらず、ＣＤ２８－ＣＤ３ｚドメインを含む構築物と比較して劣った腫瘍死滅を示した。
したがって、共刺激領域の変化を試験した対照実験において、配列番号１０７および配列番号１０４の構築物は、優れた発現および腫瘍死滅の組み合わせを提供した。改善された発現は必ずしも改善された死滅と一致しなかった。
例６：ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ構築物における非翻訳領域の置換
実験を行って、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ構築物の５’および／または３’非翻訳領域の変化が、ヒトＴ細胞におけるＣＡＲ発現にどのように影響するかを試験した。
同じＣＡＲタンパク質（すなわち、配列番号５９のもの）をコードするが、それらの５’および／または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）のヌクレオチド配列が異なる、多数のｍＲＮＡ構築物を調製した。これらの構築物は、他の点では、例えば５’キャップおよびポリアデニンテールに関しては、同一であった。意図は、１つ以上のヒト遺伝子（ＣＤ３ＤおよびＣＤ８Ｂ２遺伝子など）で自然に発生した異なる５’および３’ＵＴＲ配列を組み込んだ、いくつかの構築物を比較することであった。
１つの構築物について、その３’ＵＴＲではなく、ＧＡＴＡ３遺伝子のＯＲＦ（すなわち、配列番号９２）に存在する２１８ヌクレオチド部分を３’ＵＴＲとして使用し、これは特に良好に機能した。
各ｍＲＮＡ構築物について、ＣＡＲ Ｔ細胞を、実質的に例１に記載のように調製した。トランスフェクションの約２４時間後、各ｍＲＮＡ構築物から作製したＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＡＲ発現のレベルについて実質的に例１に記載の方法により試験した。ｍＲＮＡ構築物とその発現結果を以下の表１２に示す。各構築物について、それぞれの配列番号および配列の天然供給源を示す。

表１２－５’および３’ＵＴＲ配列の示された組み合わせを使用した、配列番号５９（Ｙ３４）のＣＡＲの相対的発現。ＧＡＴＡ３のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）である配列番号９２の配列は特に良好に機能し、発現を改善した。＊平均蛍光強度、構築物Ａ＝１００に正規化。ＩｇＧ＝ＩｇＧ重鎖、１４番染色体。
５’ＵＴＲについて、配列番号７４は最良の発現を与えた（構築物Ａ、ＢおよびＥを比較）。３’ＵＴＲについて、配列番号９２が最良の発現を与えた（構築物ＥとＦを比較）。
結論として、実験は、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ構築物の５’および／または３’非翻訳領域の変化が、ヒトＴ細胞におけるＣＡＲ発現にどのように影響するかを試験した。先験的に同等に合理的であると思われたいくつかの選択肢の中で、構築物Ｆは、他の７つの構築物の平均発現より２．６倍以上優れた最良の発現を示した。構築物Ｆの優れた性能は、配列番号７４のヌクレオチドを含む５’ＵＴＲと配列番号９２のヌクレオチドを含む３’ＵＴＲが含まれていることによるものであった。
この結果は、部分的には、配列番号９２が天然に存在するＵＴＲではないため、驚くべきものであった。構築物Ｆに含まれる配列番号９２は、ＣＡＲ発現を増加させるのではなく、減少させることが期待された。
例７：ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ構築物のための改良されたポリアデニンテール
対照実験を実施して、特定の３’ポリアデニンテールの、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ構築物への付加を試験した。
同じ５’ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム、および抗ＢＣＭＡ ＣＡＲタンパク質をコードする３’ＵＴＲを含むが、７８以上のヌクレオチドの３’ポリアデニンテールを含むかまたは含まない、多数のｍＲＮＡ構築物を調製した。各構築物は、以下から選択される正確に１つのｍＲＮＡ配列を含んでいた：配列番号４６、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４または配列番号４５。各構築物において、ポリアデニンテールは３’ＵＴＲに対して３’に位置し、かかる３’ＵＴＲは例２に記載されている。追加のポリアデニル化を、配列番号３６のヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡ構築物に対し酵素的に実施して、他の点では同一の、ポリアデニンテールが１５０を超えるヌクレオチドを含むｍＲＮＡ構築物を得た。ｍＲＮＡ構築物のそれぞれについて、ＣＡＲ Ｔ細胞を、ヒトＣＤ８＋細胞へのトランスフェクションにより、実質的に例１に記載のように調製した。トランスフェクションの約２４時間後、ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＡＲ発現のレベルについて、実質的に例１に記載のように試験した。２つの実験からの結果を以下の表１３および１４に示す。

表１３－ポリＡテールなしのＣＡＲと比較した、７８ｍｅｒのポリＡテールを有する全長ＣＡＲの相対的発現。発現の改善倍数は、各ＣＡＲ構築物に対して提供される。＊平均蛍光強度、ポリＡなしの配列番号４６＝１００に対して正規化。

表１４－７８ｍｅｒのポリＡテールまたは１５０Ａを超える残基を有するポリＡテールを有する配列番号３６のＣＡＲの発現における改善倍数。発現の改善倍数は、配列番号３６のＣＡＲ構築物に対して提供される。＊平均蛍光強度、ポリＡなしの配列番号４６＝１００に対して正規化。＊平均蛍光強度、７８ｍｅｒポリＡの配列番号３６＝１００に対して正規化。
したがって、直接的な実験的比較は、ｍＲＮＡ構築物に７８ｍｅｒのポリアデニンテールを含めることにより、本発明のＣＡＲタンパク質の発現が４．３倍（ｐ＜０．００１）改善されることを示した。７８ｍｅｒと比較して、１５０ｍｅｒを超えるポリアデニンテールを含めると、ＣＡＲの発現がさらに２．４倍改善された。
例８：ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ構築物における同義ヌクレオチド置換
対照実験を実施して、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡのＯＲＦへの、特定の同義ヌクレオチド置換が、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の機能を構築するかどうか試験した。
ＯＲＦが配列番号２６の同じＣＡＲタンパク質をコードするが、これらのＯＲＦのヌクレオチド配列が異なるような、すなわち同義ヌクレオチド置換の導入により、複数のｍＲＮＡ構築物を調製した。配列番号１１６のＯＲＦヌクレオチド配列を含む構築物は、対照として機能した。各ｍＲＮＡ構築物について、ＣＡＲ Ｔ細胞を、ｍＲＮＡのヒトＣＤ８＋Ｔ細胞へのトランスフェクションにより例１に記載のように調製した。トランスフェクションの約２４時間後、ＣＡＲ Ｔ細胞を、例１に記載のようにＢＣＭＡ結合について試験した。
配列番号１１６の構築物と比較して、配列番号１２２（ＩＩの新しいコドン最適化）および配列番号１２３（ＩＩ ｄＵ）の構築物は、ＢＣＭＡ結合がそれぞれ１．６５および３．４３であるＣＡＲ Ｔ細胞を生じた。同義ヌクレオチド置換はＣＡＲタンパク質配列を変更しなかったので、これは驚くべきことであった。結論として、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ構築物のＯＲＦにおける特定の同義ヌクレオチド置換は、ＣＡＲ Ｔ細胞のＢＣＭＡ結合特性を改善した。
例９：ＣＡＲの特異性および交差反応性の試験
配列番号３１のヌクレオチド配列を含む本発明のｍＲＮＡ構築物から生成されたＣＡＲ Ｔ細胞を、５５２８のヒト原形質膜タンパク質および細胞表面につながれたヒト分泌タンパク質（Retrogenix, High Peak, UK）を含む細胞マイクロアレイライブラリーとのＣＡＲ相互作用について試験した。ｍＲＮＡ構築物が配列番号３５または配列番号４０のもので、それ以外は同等であるＣＡＲ Ｔ細胞を、タンパク質のより小さなサブセットにおいて確認目的で試験した。ＣＡＲを欠くがそれ以外は同等のＴ細胞を使用して、非ＣＡＲ特異的相互作用について試験した。配列番号３１、配列番号３５、および配列番号４０の各ＣＡＲは、ヒトＢＣＭＡと特異的に相互作用したが、ＣＡＲといかなる他のタンパク質との間の相互作用は観察されなかった。結論として、本発明の３つのＣＡＲはＢＣＭＡに特異的に結合したが、他の抗原と交差反応はしなかった。
例１０：ＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍活性のin vivo評価
配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３５のヌクレオチド配列を含む本発明のｍＲＮＡ構築物から生成されたＣＡＲ Ｔ細胞を、動物におけるヒト骨髄腫腫瘍細胞の増殖を測定する動物モデルで試験した。これらのｍＲＮＡ構築物は、それぞれ、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２５の配列を含むＣＡＲタンパク質をコードした。
ＣＡＲ Ｔ細胞は、ｍＲＮＡ ＣＡＲ構築物のヒトＣＤ８＋細胞へのトランスフェクションにより、例１に記載のように調製した。この試験で用いた陰性対照は、（１）非改変ＣＤ８＋Ｔ細胞および、（２）ビヒクルのみを含んでいた。NOD－scid－ガンマ（ＮＳＧ）マウスに、２００万個のMM.1S-flucヒト骨髄腫腫瘍細胞を接種した。腫瘍の成長は、連続生物発光イメージングによりモニタリングした。６日目にマウスをランダム化して、ビヒクル、非改変ＣＤ８＋Ｔ細胞、または、配列番号２０、配列番号２１もしくは配列番号２５のＣＡＲを発現するようにトランスフェクトされたＣＡＲ Ｔ細胞を与えた。図２に腫瘍測定の結果を示す。１１日目までに、ビヒクルまたは改変ＣＤ８＋細胞で処置されたマウスにおいて、腫瘍が広範囲に成長した。対照的に、配列番号２０（ｐ＝０．００６）、配列番号２１（ｐ＝０．０１）、または配列番号２５（ｐ＝０．００４）のＣＡＲを発現するようにトランスフェクトされたＣＡＲ Ｔ細胞は、腫瘍増殖を有意に阻害した。結論として、本発明の抗ＢＣＭＡのＣＡＲをコードするｍＲＮＡ構築物の３つの例から調製されたＣＡＲ Ｔ細胞は、動物モデルにおいてヒト骨髄腫腫瘍の成長を有意に阻害した。
例１１：ＣＡＲ Ｔ細胞の生存に対するｍＲＮＡの効果
対照実験を行って、２人の骨髄腫患者から提供された細胞から生成されたＣＡＲ Ｔ細胞の生存に対する、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡの効果を評価した。２人の骨髄腫患者からの細胞から、配列番号３１のヌクレオチド配列を含む本発明のｍＲＮＡ構築物を使用することにより生成した２ロットのＣＡＲ Ｔ細胞を、２つの対応するロットのＣＡＲ Ｔ細胞と比較した；ここで各ロットは、同じ２人の骨髄腫患者からの細胞からであるが、ただし配列番号２９のヌクレオチド配列を含む参照ｍＲＮＡ構築物を使用して生成した。ここに記載の場合を除き、ＣＡＲ Ｔ細胞の各ロットは、実質的に例１に記載の方法によって生成した。細胞は、ｍＲＮＡエレクトロポレーション後に２１時間、後培養し、その後細胞を回収し、生存率を評価した。結果は次のとおりである：

配列番号２９のＣＡＲ Ｔ細胞の生存率は、配列番号３１のＣＡＲ Ｔ細胞の生存率よりも実質的に低かった。結論として、配列番号３１の本発明のｍＲＮＡ構築物は、配列番号２９のコンパレーターｍＲＮＡ構築物よりも、ＣＡＲ Ｔ細胞に対してより良好な生存率を付与した。
例１２：本発明のキメラ抗原受容体を発現する恒久的改変ＣＡＲ Ｔ細胞を作製するためのSleeping Beautyトランスポゾンシステムの使用
Sleeping Beautyトランスポゾンシステムを使用して、本発明のキメラ抗原受容体を発現する恒久的に改変されたＣＡＲ Ｔ細胞を作製した。
第１のプラスミドを、次の要素：ＥＦ１ａプロモーター、ＩｇＧ ５’ＵＴＲ、配列番号２１のアミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレーム、およびポリＡテール、を含んで構築した；ここで前述の要素は集合的に、Sleeping Beautyトランスポゾンの逆方向末端反復に隣接している（「Seq－２１トランスポゾンプラスミド」）。第２のプラスミドを、ＥＦ１ａプロモーター、ＩｇＧ ５’ＵＴＲ、コザックコンセンサス配列、ＳＢ１１をコードするオープンリーディングフレーム、およびポリＡテールを含んで構築した（「ＳＢ１１プラスミド」）。
正常なヒトドナーからの末梢血単核細胞を洗浄し、Seq－２１トランスポゾンプラスミドのみの存在下、またはSeq－２１トランスポゾンプラスミドとＳＢ１１プラスミドの両方の存在下で、Ｐ３緩衝液（Lonza）に再懸濁した。細胞をエレクトロポレーションして（4D Nucleofector（登録商標）, Lonza）、プラスミドを細胞に導入した。次に、細胞を５時間の培養に移した。細胞をＣＤ３／ＣＤ２８Dynabeads（登録商標）（ThermoFisher）を含む刺激培養物に移した。増大中、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＢＣＭＡ－ＰＥ試薬で染色し、例１に記載のフローサイトメトリーによりＣＡＲの発現について分析した。１４日目までに、Ｔ細胞は３０倍増大した。ＳＢ１１とSeq－２１トランスポゾンプラスミドの両方で改変された細胞は、ＢＣＭＡ－ＰＥに反応する細胞の５～１０％を示した（図３Ａ）。Seq－２１トランスポゾンプラスミドのみでのトランスフェクション後に増大した細胞は、反応性を示さなかった。機能的ＣＡＲ Ｔ細胞活性は、多発性骨髄腫標的細胞株ＭＭ１Ｓ－ＧＦＰを用いた細胞毒性アッセイを例１に記載のように使用し、全生存細胞に基づく細胞数を用いた複数のエフェクター：標的比を使用して評価した。サイトカイン（インターフェロン－γ）産生は、共培養上清においても、ＥＬＩＳＡによる４：１のエフェクター：標的比から評価した。図３Ｂは、９日目の細胞からのデータを示し、これは、Seq－２１トランスポゾンプラスミドおよびＳＢ１１プラスミドで送達された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲによる恒久的改変によっては付与されたが、Seq－２１トランスポゾンプラスミドのみでは付与されなかった、特定の細胞毒性およびインターフェロン－γ産生を示す。
したがって、Sleeping Beautyトランスポゾンシステムは、本発明の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲを発現するＣＡＲ Ｔ細胞を生成するために成功して使用された。これらの細胞は、抗ＢＣＭＡ細胞毒性およびサイトカイン分泌を実証した。これらは、ＣＡＲを恒久的に発現することが期待される。
本明細書、例えば、背景、要約、詳細な説明、実施例、および／または参考文献のセクションで言及されるすべての刊行物、特許、特許出願、出版物、およびデータベースエントリ（例えば、配列データベースエントリ）は、個々の刊行物、特許、特許出願、出版物、およびデータベースエントリのそれぞれが、参照により具体的かつ個別に本明細書に組み込まれているかのように、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合は、本明細書の定義を含む本出願が優先する。
均等物および範囲
当業者は、本明細書に記載の態様の多くの均等物を認識し、またはルーチンの実験のみを使用して確認することができるであろう。本開示の範囲は、上記の説明に限定されることを意図するものではなく、添付の特許請求の範囲に記載されている通りである。
「a」、「an」、および「the」などの冠詞は、逆が示されない限りまたは文脈から明らかでない限り、１つまたは２つ以上を意味し得る。グループの２つ以上のメンバー間に「または」を含むクレームまたは説明は、逆の指示がない限りまたは文脈から明らかでない限り、グループメンバーの１つ、２つ以上、またはすべてが存在する場合に、満たされていると見なされる。２つ以上のグループメンバー間に「または」を含むグループの開示は、グループの正確に１つのメンバーが存在する態様、グループの２つ以上のメンバーが存在する態様、およびグループのすべてが存在する態様を提供する。簡潔にするために、これらの態様は本明細書で個別に説明されていないが、これらの態様のそれぞれが本明細書で提供され、具体的に特許請求または放棄され得ることが理解される。
本発明は、１つ以上のクレームからまたは説明の１つ以上の関連部分からの１つ以上の限定、要素、節、または説明用語が別のクレームに導入されている、すべての変形、組み合わせ、および順列を包含することを理解されたい。例えば、別のクレームに依存するクレームは、同じ基本クレームに依存する任意の他のクレームに見出される限定の１つ以上を含むように変更することができる。さらに、クレームが組成物を記載している場合には、別段の指示があるかまたは当業者に矛盾もしくは不一致が生じることが明らかでない限り、本明細書に開示される作製もしくは使用の方法のいずれかに従って、またはもしあれば当業者に知られている方法に従って、該組成物を製造または使用する方法が含まれることを、理解されたい。
要素がリストとして、例えば、マーカッシュ群形式で提示される場合、要素のすべての可能なサブグループも開示され、任意の要素または要素のサブグループをグループから削除できることが理解されるべきである。「含む」という用語はオープンであることを意図しており、追加の要素またはステップを含めることを可能にすることにも留意されたい。一般に、態様、製品、または方法が、特定の要素、特徴、またはステップを含むと言及される場合、かかる要素、特徴、もしくはステップからなるかまたは本質的にこれらからなる態様、製品、または方法もまた、提供される。簡潔にするために、これらの態様は本明細書で個別に説明されていないが、これらの態様のそれぞれが本明細書で提供され、具体的に特許請求または放棄され得ることが、理解されるであろう。
範囲が与えられる場合、エンドポイントが含まれる。さらに、別段の指示があるかまたは文脈および／もしくは当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表される値は、いくつかの態様において、記載された範囲内の任意の特定の値を、文脈で明確に別段の指示がない限り範囲の下限の単位の１０分の１までとることができることを理解されたい。簡潔にするために、各範囲の値は本明細書で個別に説明されないが、これらの値のそれぞれが本明細書に提供され、具体的に特許請求または放棄され得ることを理解されたい。別段の指示があるかまたは文脈および／もしくは当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表される値は、所与の範囲内の任意のサブ範囲を想定することができ、ここでサブ範囲のエンドポイントは、範囲の下限の単位の１０分の１と同じ精度で表される。
さらに、本発明の任意の特定の態様は、クレームのいずれか１つ以上から明示的に除外され得ることが理解されるべきである。範囲が与えられている場合、範囲内の任意の値は、１つ以上のクレームから明示的に除外され得る。本発明の組成物および／または方法の任意の態様、要素、特徴、用途、または側面は、任意の１つ以上のクレームから除外することができる。簡潔にするために、１つ以上の要素、特徴、目的、または側面が除外されるすべての態様が、本明細書に明示的に記載されているわけではない。

Claims (11)

  1. 抗原結合部分を含むタンパク質であって、ここで、前記抗原結合部分が、以下：
    （ｉ）配列番号３を含む、ＣＤＲＨ１；
    （ｉｉ）配列番号４を含む、ＣＤＲＨ２；
    （ｉｉｉ）配列番号７を含む、ＣＤＲＨ３；
    （ｉｖ）配列番号１０を含む、ＣＤＲＬ１；
    （ｖ）配列番号１２を含む、ＣＤＲＬ２；および
    （ｖｉ）配列番号１６を含む、ＣＤＲＬ３、
    を含む、抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）結合ドメインであって、
    ここで、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、配列番号５３、５７または６０のいずれか１つのｓｃＦｖからの重鎖および軽鎖可変ドメインフレームワーク配列を含む、前記タンパク質。
  2. 抗原結合部分を含むタンパク質であって、ここで、前記抗原結合部分が、以下：
    （ｉ）配列番号１を含む、ＣＤＲＨ１；
    （ｉｉ）配列番号４を含む、ＣＤＲＨ２；
    （ｉｉｉ）配列番号８を含む、ＣＤＲＨ３；
    （ｉｖ）配列番号１０を含む、ＣＤＲＬ１；
    （ｖ）配列番号１２を含む、ＣＤＲＬ２；および
    （ｖｉ）配列番号１６を含む、ＣＤＲＬ３、
    を含む、抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）結合ドメインであって、
    ここで、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、配列番号５３、５７または６０のいずれか１つのｓｃＦｖからの重鎖および軽鎖可変ドメインフレームワーク配列を含む、前記タンパク質。
  3. 抗原結合部分を含むタンパク質であって、ここで、前記抗原結合部分が、以下：
    （ｉ）配列番号１を含む、ＣＤＲＨ１；
    （ｉｉ）配列番号４を含む、ＣＤＲＨ２；
    （ｉｉｉ）配列番号７を含む、ＣＤＲＨ３；
    （ｉｖ）配列番号１１を含む、ＣＤＲＬ１；
    （ｖ）配列番号１４を含む、ＣＤＲＬ２；および
    （ｖｉ）配列番号１７を含む、ＣＤＲＬ３、
    を含む、抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）結合ドメインであって、
    ここで、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、配列番号５３、５７または６０のいずれか１つのｓｃＦｖからの重鎖および軽鎖可変ドメインフレームワーク配列を含む、前記タンパク質。
  4. 抗原結合部分を含むタンパク質であって、ここで、前記抗原結合部分が、以下：
    （ｉ）配列番号１を含む、ＣＤＲＨ１；
    （ｉｉ）配列番号４を含む、ＣＤＲＨ２；
    （ｉｉｉ）配列番号７を含む、ＣＤＲＨ３；
    （ｉｖ）配列番号１１を含む、ＣＤＲＬ１；
    （ｖ）配列番号１４を含む、ＣＤＲＬ２；および
    （ｖｉ）配列番号１８を含む、ＣＤＲＬ３、
    を含む、抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）結合ドメインであって、
    ここで、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、配列番号５３、５７または６０のいずれか１つのｓｃＦｖからの重鎖および軽鎖可変ドメインフレームワーク配列を含む、前記タンパク質。
  5. 抗原結合部分を含むタンパク質であって、ここで、前記抗原結合部分が、以下：
    （ｉ）配列番号２を含む、ＣＤＲＨ１；
    （ｉｉ）配列番号６を含む、ＣＤＲＨ２；
    （ｉｉｉ）配列番号９を含む、ＣＤＲＨ３；
    （ｉｖ）配列番号１０を含む、ＣＤＲＬ１；
    （ｖ）配列番号１２を含む、ＣＤＲＬ２；および
    （ｖｉ）配列番号１６を含む、ＣＤＲＬ３、
    を含む、抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）結合ドメインであって、
    ここで、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、配列番号５３、５７または６０のいずれか１つのｓｃＦｖからの重鎖および軽鎖可変ドメインフレームワーク配列を含む、前記タンパク質。
  6. 抗原結合部分を含むタンパク質であって、ここで、前記抗原結合部分が、以下：
    （ｉ）配列番号３を含む、ＣＤＲＨ１；
    （ｉｉ）配列番号５を含む、ＣＤＲＨ２；
    （ｉｉｉ）配列番号８を含む、ＣＤＲＨ３；
    （ｉｖ）配列番号１０を含む、ＣＤＲＬ１；
    （ｖ）配列番号１２を含む、ＣＤＲＬ２；および
    （ｖｉ）配列番号１６を含む、ＣＤＲＬ３、
    を含む、抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）結合ドメインであって、
    ここで、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、配列番号５３、５７または６０のいずれか１つのｓｃＦｖからの重鎖および軽鎖可変ドメインフレームワーク配列を含む、前記タンパク質。
  7. 抗原結合部分を含むタンパク質であって、ここで、前記抗原結合部分が、以下：
    （ｉ）配列番号３を含む、ＣＤＲＨ１；
    （ｉｉ）配列番号４を含む、ＣＤＲＨ２；
    （ｉｉｉ）配列番号９を含む、ＣＤＲＨ３；
    （ｉｖ）配列番号１０を含む、ＣＤＲＬ１；
    （ｖ）配列番号１２を含む、ＣＤＲＬ２；および
    （ｖｉ）配列番号１８を含む、ＣＤＲＬ３、
    を含む、抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）結合ドメインであって、
    ここで、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、配列番号５３、５７または６０のいずれか１つのｓｃＦｖからの重鎖および軽鎖可変ドメインフレームワーク配列を含む、前記タンパク質。
  8. 抗原結合部分を含むタンパク質であって、ここで、前記抗原結合部分が、以下：
    （ｉ）配列番号２を含む、ＣＤＲＨ１；
    （ｉｉ）配列番号６を含む、ＣＤＲＨ２；
    （ｉｉｉ）配列番号９を含む、ＣＤＲＨ３；
    （ｉｖ）配列番号１１を含む、ＣＤＲＬ１；
    （ｖ）配列番号１３を含む、ＣＤＲＬ２；および
    （ｖｉ）配列番号１７を含む、ＣＤＲＬ３、
    を含む、抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）結合ドメインであって、
    ここで、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、配列番号５３、５７または６０のいずれか１つのｓｃＦｖからの重鎖および軽鎖可変ドメインフレームワーク配列を含む、前記タンパク質。
  9. 抗原結合部分を含むタンパク質であって、ここで、前記抗原結合部分が、以下：
    （ｉ）配列番号１を含む、ＣＤＲＨ１；
    （ｉｉ）配列番号４を含む、ＣＤＲＨ２；
    （ｉｉｉ）配列番号７を含む、ＣＤＲＨ３；
    （ｉｖ）配列番号１０を含む、ＣＤＲＬ１；
    （ｖ）配列番号１５を含む、ＣＤＲＬ２；および
    （ｖｉ）配列番号１６を含む、ＣＤＲＬ３、
    を含む、抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）結合ドメインであって、
    ここで、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、配列番号５３、５７または６０のいずれか１つのｓｃＦｖからの重鎖および軽鎖可変ドメインフレームワーク配列を含む、前記タンパク質。
  10. 抗原結合部分を含むタンパク質であって、ここで、前記抗原結合部分が、以下：
    （ｉ）配列番号２を含む、ＣＤＲＨ１；
    （ｉｉ）配列番号６を含む、ＣＤＲＨ２；
    （ｉｉｉ）配列番号９を含む、ＣＤＲＨ３；
    （ｉｖ）配列番号１１を含む、ＣＤＲＬ１；
    （ｖ）配列番号１４を含む、ＣＤＲＬ２；および
    （ｖｉ）配列番号１７を含む、ＣＤＲＬ３、
    を含む、抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）結合ドメインであって、
    ここで、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、配列番号５３、５７または６０のいずれか１つのｓｃＦｖからの重鎖および軽鎖可変ドメインフレームワーク配列を含む、前記タンパク質。
  11. 抗原結合部分を含むタンパク質であって、ここで、前記抗原結合部分が、以下：
    （ｉ）配列番号２を含む、ＣＤＲＨ１；
    （ｉｉ）配列番号６を含む、ＣＤＲＨ２；
    （ｉｉｉ）配列番号９を含む、ＣＤＲＨ３；
    （ｉｖ）配列番号１１を含む、ＣＤＲＬ１；
    （ｖ）配列番号１４を含む、ＣＤＲＬ２；および
    （ｖｉ）配列番号１８を含む、ＣＤＲＬ３、
    を含む、抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）結合ドメインであって、
    ここで、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、配列番号５３、５７または６０のいずれか１つのｓｃＦｖからの重鎖および軽鎖可変ドメインフレームワーク配列を含む、前記タンパク質。
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