KR20240004680A

KR20240004680A - 키메라 수용체 및 이의 사용 방법

Info

Publication number: KR20240004680A
Application number: KR1020237040933A
Authority: KR
Inventors: 알바 곤살레스-훈카; 아센 보야노프 로그브; 니콜라스 프랑켈
Original assignee: 센티 바이오사이언시스, 인코포레이티드
Priority date: 2021-05-07
Filing date: 2022-05-06
Publication date: 2024-01-11
Also published as: CA3217614A1; JP2024516713A; WO2022236142A2; US20240173410A1; IL308148A; EP4334346A2; TW202309091A; AU2022270717A1; WO2022236142A3

Abstract

V-Set 및 면역글로불린 도메인 함유 2(VSIG2)에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함하는 키메라 단백질이 본원에 제공된다. 또한, VSIG2에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함하는 키메라 단백질에 관련한 세포, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 및 방법이 본원에 제공된다.

Description

키메라 수용체 및 이의 사용 방법

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2021년 5월 7일에 출원된 미국 가출원 제63/185,896 및 2021년 11월 24일에 출원된 미국 가출원 제63/283,147호의 이익 및 우선권을 주장하며, 이들 각각은 그 전체가 사실상 참조로서 본원에 통합된다.

서열 목록

본 출원은 EFS-Web을 통해 제출된 서열 목록을 함유하며 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 20XX년 XX월에 생성된 상기 ASCII 사본은 XXXXXUS_sequencelisting.txt으로 명명되며 X,XXX,XXX 바이트의 크기이다.

T 세포와 같은 면역반응성 세포의 특이성 및 기능을 재유도하는 데 사용되는 키메라 항원 수용체(CAR) 기반 입양 세포 요법은 림프 악성종양 환자에서 효능을 나타내었다(Pule 등의 문헌[Nat. Med. (14):1264-1270 (2008)]; Maude 등의 문헌[N Engl J Med. (371):1507-17 (2014)]; Brentjens 등의 문헌[Sci Transl Med. (5):177ra38 (2013)]). CAR T 세포는 화학요법이 약물 내성 및 종양 진행으로 이어진 CD19-발현 악성종양 환자에서 완전 관해를 유도하는 것으로 나타났다. CD19 CAR 요법의 성공은 고형 종양과 같은 다른 악성 종양을 치료하기 위한 낙관론을 제공한다.

고형 종양에 대한 CAR 요법을 개발하는 데 있어서 한 가지 문제점은 적합한 표적의 부족이다. 적절한 CAR 표적을 식별하는 능력은 동일한 표적 항원을 발현하는 정상 세포를 손상시키지 않으면서 종양을 효과적으로 표적화하고 치료하는 데 중요하다. 따라서, 정상 세포 또는 조직을 표적화하지 않으면서 종양 세포를 표적하는 CAR-기반 고형 종양 요법에 대한 필요성이 남아 있다.

전술한 요구를 충족하기 위해, 본 개시는 VSIG2(VSIG2)에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함하는 키메라 단백질에 관한 것이다.

일 양태에서, V-Set 및 면역글로불린 도메인 함유 2(V-Set And Immunoglobulin Domain Containing 2, VSIG2)에 특이적인 항원 결합 도메인 및 이종 분자 또는 모이어티를 포함하는 키메라 단백질이 본원에 제공되며,

항원 결합 도메인은 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하되,

(a) VH는

GFTFSNS(서열번호 2)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1),

SDGGLY(서열번호 3)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 및

QGVRPFFDY(서열번호 4)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3)을 포함하고, VL은

RASENIYSYLA(서열번호 11) 또는 RASENLYSYLA(서열번호 12)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1),

NAETLPE(서열번호 13)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2), 및

QHHYVIPWT(서열번호 14)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함하거나;

(b) VH는

서열번호 1의 VH 영역 아미노산 서열 내에 포함된 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), 서열번호 1의 VH 영역 아미노산 서열 내에 포함된 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 및 서열번호 1의 VH 영역 아미노산 서열 내에 포함된 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3)을 포함하고,

VL은

경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1)이 서열번호 9의 VL 영역 아미노산 서열 내에 포함되고, 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2)는 서열번호 9의 VL 영역 아미노산 서열 내에 포함되고, 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)은 서열번호 9의 VL 영역 아미노산 서열 내에 포함되는 것을 포함하거나,

(c) VH는

VL은

경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1)은 서열번호 10의 VL 영역 아미노산 서열 내에 포함되고, 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2)는 서열번호 10의 VL 영역 아미노산 서열 내에 포함되고, 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)은 서열번호 10의 VL 영역 아미노산 서열 내에 포함되는 것을 포함하고,

선택적으로, 기준 항체의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3의 아미노산 서열은 Kabat 또는 Chothia 넘버링 체계에 기초하여 정의된다.

일부 구현예에서, VH 영역은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 영역은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나, VL 영역은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함하고, 선택적으로 scFv의 VH 및 VL은 펩티드 링커에 의해 분리되고, 선택적으로 항원 결합 도메인은 구조 VH-L-VL 또는 VL-L-VH를 포함하되, VH는 중쇄 가변 도메인이고, L은 펩티드 링커이고, VL은 경쇄 가변 도메인이고/이거나 선택적으로 scFv는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다: 서열번호 19~35 및 69~74.

일부 구현예에서, 키메라 단백질은 키메라 항원 수용체(CAR)이며, 이종 분자 또는 모이어티는 막관통 도메인, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인, 힌지 도메인, 스페이서 영역, 하나 이상의 펩티드 링커, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 포함한다.

일부 구현예에서, CAR은 면역 반응을 억제하는 하나 이상의 세포내 억제 도메인을 포함하는 억제 CAR이고, 하나 이상의 세포내 억제 도메인 각각은 효소 억제 도메인 또는 세포내 억제 공동 신호전달 도메인을 포함한다.

또 다른 양태에서, 위의 양태 또는 구현예 중 어느 하나의 키메라 단백질을 암호화하는 조작된 폴리뉴클레오티드가 본원에 제공된다.

또 다른 양태에서, 위의 양태 또는 구현예 중 어느 하나의 조작된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터가 본원에 제공된다.

또 다른 양태에서, 위의 양태 또는 구현예 중 어느 하나의 키메라 단백질, 위의 양태 또는 구현예의 조작된 폴리뉴클레오티드, 또는 위의 양태 또는 구현예의 발현 벡터를 포함하는 단리된 세포가 본원에 제공된다.

또 다른 양태에서, 위의 양태 중 어느 하나의 키메라 단백질, 양태 또는 구현예의 조작된 폴리뉴클레오티드, 또는 위의 양태 또는 구현예의 발현 벡터를 발현하는 조작된 세포의 집단이 본원에 제공된다.

일부 구현예에서, 세포 또는 세포의 집단은 세표 표면에 발현된 하나 이상의 종양 표적화 키메라 수용체를 추가로 포함하되, 하나 이상의 종양 표적화 키메라 수용체 각각은 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 조작된 T 세포 수용체이다.

일부 구현예에서, 세포 또는 세포의 집단은 T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 감마-델타 T 세포, 세포독성 T 림프구(CTL), 조절 T 세포, 바이러스 특이적 T 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 자연 살해(NK) 세포, B 세포, 종양 침윤 림프구(TIL), 선천성 림프구 세포, 비만 세포, 호산구, 호염기구, 호중구, 골수 세포, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포, 적혈구, 혈소판 세포, 인간 배아 줄기 세포(ESC), ESC 유래 세포, 다능성 줄기 세포, 중간엽 기질 세포(MSC), 유도 만능 줄기 세포(iPSC), 및 iPSC-유래 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또 다른 양태에서, 위의 양태 또는 구현예 중 어느 하나의 세포 또는 조작된 세포의 집단의 유효량, 및 약학적으로 허용되는 담체, 약학적으로 허용되는 부형제, 또는 이들의 조합을 포함하는 약학적 조성물이 본원에 제공된다.

다른 양태에서, 대상체에서 종양 세포에 대한 세포 매개 면역 반응을 자극하는 방법이 본원에 제공되며, 방법은 위의 양태 또는 구현예 중 어느 하나의 키메라 단백질, 위의 양태 또는 구현예 중 어느 하나의 조작된 폴리뉴클레오티드, 위의 양태 또는 구현예 중 어느 하나의 발현 벡터, 위의 양태 또는 구현예 중 어느 하나의 세포 또는 조작된 세포의 집단, 또는 위의 양태 또는 구현예의 조성물의 치료적 유효 용량을 종양을 가진 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

다른 양태에서, 종양을 가진 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 방법은 위의 양태 또는 구현예 중 어느 하나의 키메라 단백질, 위의 양태 또는 구현예 중 어느 하나의 조작된 폴리뉴클레오티드, 위의 양태 또는 구현예 중 어느 하나의 발현 벡터, 위의 양태 또는 구현예 중 어느 하나의 세포 또는 조작된 세포의 집단, 또는 위의 양태 또는 구현예의 조성물의 치료적 유효 용량을 투여하는 단계를 포함한다.

일부 양태에서, 본 개시는 V-Set 및 면역글로불린 도메인 함유 2(VSIG2)에 특이적인 항원 결합 도메인 및 이종 분자 또는 모이어티를 포함하는 키메라 단백질을 제공하되, 항원 결합 도메인은 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하고, 여기서 VH는 QGVRPFFDY(서열번호 4)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3)을 포함한다. 일부 양태에서, VL은 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함하되, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3의 아미노산 서열은 서열번호 9 또는 서열번호 10의 VL 영역 아미노산 서열 내에 포함된다. 일부 양태에서, VL은 RASENIYSYLA(서열번호 11) 또는 RASENLYSYLA(서열번호 12)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), NAETLPE(서열번호 13)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2), 및 QHHYVIPWT(서열번호 14)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함한다.

일부 양태에서, 본 개시는 V-Set 및 면역글로불린 도메인 함유 2(VSIG2)에 특이적인 항원 결합 도메인 및 이종 분자 또는 모이어티를 포함하는 키메라 단백질을 제공하며, 항원 결합 도메인은 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하되, VH는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3)을 포함하고, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3의 아미노산 서열은 서열번호 1의 VH 영역 아미노산 서열 내에 포함된다. 일부 양태에서, VL은 RASENIYSYLA(서열번호 11) 또는 RASENLYSYLA(서열번호 12)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), NAETLPE(서열번호 13)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2), 및 QHHYVIPWT(서열번호 14)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함한다. 일부 양태에서, VL은 RASENIYSYLA(서열번호 11) 또는 RASENLYSYLA(서열번호 12)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), NAETLPE(서열번호 13)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2), 및 QHHYVIPWT(서열번호 14)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함한다.

일부 양태에서, 본 개시는 V-Set 및 면역글로불린 도메인 함유 2(VSIG2)에 특이적인 항원 결합 도메인 및 이종 분자 또는 모이어티를 포함하는 키메라 단백질을 제공하며, 여기서 항원 결합 도메인은 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하되,

VH은 GFTFSNS(서열번호 2)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), SDGGLY(서열번호 3)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 및 QGVRPFFDY(서열번호 4)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3)을 포함한다. 일부 양태에서, VL은 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함하되, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3의 아미노산 서열은 서열번호 9 또는 서열번호 10의 VL 영역 아미노산 서열 내에 포함된다. 일부 양태에서, VL은 RASENIYSYLA(서열번호 11) 또는 RASENLYSYLA(서열번호 12)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), NAETLPE(서열번호 13)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2), 및 QHHYVIPWT(서열번호 14)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함한다.

일부 양태에서, 본 개시는 V-Set 및 면역글로불린 도메인 함유 2(VSIG2)에 특이적인 항원 결합 도메인 및 이종 분자 또는 모이어티를 포함하는 키메라 단백질을 제공하며, 항원 결합 도메인은 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하되, VL은 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함하고, CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3의 아미노산 서열은 서열번호 9 또는 서열번호 10의 VL 영역 아미노산 서열 내에 포함된다. 일부 양태에서, VH는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3)을 포함하되, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3의 아미노산 서열은 서열번호 1의 VH 영역 아미노산 서열 내에 포함된다. 일부 양태에서, VH는 GFSLSRY(서열번호 2)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), SDGGLY(서열번호 3)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 및 QGVRPFFDY(서열번호 4)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3)을 포함한다.

일부 양태에서, 본 개시는 V-Set 및 면역글로불린 도메인 함유 2(VSIG2)에 특이적인 항원 결합 도메인 및 이종 분자 또는 모이어티를 포함하는 키메라 단백질을 제공하며, 항원 결합 도메인은 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하되, VL은 RASENIYSYLA(서열번호 11) 또는 RASENLYSYLA(서열번호 12)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), NAETLPE(서열번호 13)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2), 및 QHHYVIPWT(서열번호 14)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함한다. 일부 양태에서, VH는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3)을 포함하되, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3의 아미노산 서열은 서열번호 1의 VH 영역 아미노산 서열 내에 포함된다. 일부 양태에서, VH는 GFSLSRY(서열번호 2)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), SDGGLY(서열번호 3)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 및 QGVRPFFDY(서열번호 4)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3)을 포함한다.

일부 양태에서, 본 개시는 V-Set 및 면역글로불린 도메인 함유 2(VSIG2)에 특이적인 항원 결합 도메인 및 이종 분자 또는 모이어티를 포함하는 키메라 단백질을 제공하며, 항원 결합 도메인은 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하되, VH는 GFTFSNS(서열번호 2)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), SDGGLY(서열번호 3)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 및 QGVRPFFDY(서열번호 4)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3)을 포함하고, VL은 RASENIYSYLA(서열번호 11) 또는 RASENLYSYLA(서열번호 12)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), NAETLP(서열번호 13)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2), 및 QHHYVIPWT(서열번호 14)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함한다.

일부 양태에서, VH 영역은 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, VH 영역은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 양태에서, VL 영역은 서열번호 9의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, VL 영역은 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 양태에서, 본 개시는 V-Set 및 면역글로불린 도메인 함유 2(VSIG2)에 특이적인 항원 결합 도메인 및 이종 분자 또는 모이어티를 포함하는 키메라 단백질을 제공하되, 항원 결합 도메인은 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하고, VH는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, VH 영역은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, VL 영역은 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, VL 영역은 서열번호 9의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, VL 영역은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, VL 영역은 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, VL 영역은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 양태에서, 본 개시는 V-Set 및 면역글로불린 도메인 함유 2(VSIG2)에 특이적인 항원 결합 도메인 및 이종 분자 또는 모이어티를 포함하는 키메라 단백질을 제공하며, 항원 결합 도메인은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하되, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하고,

VL은 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, VL은 서열번호 9의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, VL 영역은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, VL은 서열번호 9의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, VL 영역은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, VH 영역은 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, VH 영역은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 양태에서, 본 개시는 V-Set 및 면역글로불린 도메인 함유 2(VSIG2)에 특이적인 항원 결합 도메인 및 이종 분자 또는 모이어티를 포함하는 키메라 단백질을 제공하며, 항원 결합 도메인은 기준 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 VSIG2에 대한 결합에 대해 경쟁하고,

기준 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하되, VH는 GFTFSNS(서열번호 2)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), SDGGLY(서열번호 3)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 및 QGVRPFFDY(서열번호 4)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3)을 포함하고, VL은 RASENIYSYLA(서열번호 11) 또는 RASENLYSYLA(서열번호 12)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), NAETLPE(서열번호 13)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2), 및 QHHYVIPWT(서열번호 14)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함한다. 일부 양태에서, 기준 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 VH 영역은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 기준 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 VL 영역은 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 양태에서, 본 개시는 V-Set 및 면역글로불린 도메인 함유 2(VSIG2)에 특이적인 항원 결합 도메인 및 이종 분자 또는 모이어티를 포함하는 키메라 단백질을 제공하며, 항원 결합 도메인은 기준 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 본질적으로 동일한 VSIG2 에피토프에 결합하고, 기준 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하되, VH는 GFTFSNS(서열번호 2)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), SDGGLY(서열번호 3)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 및 QGVRPFFDY(서열번호 4)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3)을 포함하고, VL은 RASENIYSYLA(서열번호 11) 또는 RASENLYSYLA(서열번호 12)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), NAETLPE(서열번호 13)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2), 및 QHHYVIPWT(서열번호 14)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함한다. 일부 양태에서, 기준 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 VH 영역은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 기준 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 VL 영역은 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 양태에서, 본 개시는 V-Set 및 면역글로불린 도메인 함유 2(VSIG2)에 특이적인 항원 결합 도메인 및 이종 분자 또는 모이어티를 포함하는 키메라 단백질을 제공하며, 항원 결합 도메인은 기준 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 결합하는 VSIG2 에피토프와 동일한 인간 VSIG2의 에피토프에 결합하고, 기준 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하되,

VH는 GFTFSNS(서열번호 2)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), SDGGLY(서열번호 3)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 및 QGVRPFFDY(서열번호 4)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3)을 포함하고, VL은 RASENIYSYLA(서열번호 11) 또는 RASENLYSYLA(서열번호 12)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), NAETLPE(서열번호 13)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2), 및 QHHYVIPWT(서열번호 14)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함한다. 일부 양태에서, 기준 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 VH 영역은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 기준 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 VL 영역은 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 양태에서, 키메라 단백질의 항원 결합 도메인은 F(ab) 단편, F(ab') 단편, 또는 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함한다. 일부 양태에서, 항원 결합 도메인은 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함한다. 일부 양태에서, scFv의 VH 및 VL은 펩티드 링커에 의해 분리된다. 일부 양태에서, 항원 결합 도메인은 구조 VH-L-VL 또는 VL-L-VH를 포함하되, 여기서 VH는 중쇄 가변 도메인이고, L은 펩티드 링커이며, VL은 경쇄 가변 도메인이다. 일부 양태에서, 펩티드 링커는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다: 서열번호 19 내지 35. 일부 양태에서, scFv는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다: 70~75.

일부 양태에서, 키메라 단백질은 항체-약물 접합체이며, 이종 분자 또는 모이어티는 치료제를 포함한다.

일부 양태에서, 키메라 단백질은 키메라 항원 수용체(CAR)이며, 이종 분자 또는 모이어티는 막관통 도메인, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인, 힌지 도메인, 스페이서 영역, 하나 이상의 펩티드 링커, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 포함한다. 일부 양태에서, CAR은 막관통 도메인을 포함한다. 일부 양태에서, CAR은 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 양태에서, CAR은 면역 반응을 자극하는 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 활성화 CAR이다. 일부 양태에서, CAR은 면역 반응을 억제하는 하나 이상의 세포내 억제 도메인을 포함하는 억제 CAR이다. 일부 양태에서, 세포내 억제 도메인은 효소 억제 도메인을 포함한다. 일부 양태에서, 세포내 억제 도메인은 세포내 억제 공동 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 양태에서, CAR은 항원 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 스페이서 영역을 포함한다. 일부 양태에서, 스페이서 영역은 서열번호 39 내지 51로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다.

일부 양태에서, 본 개시는 본원에 기술된 키메라 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 약학적으로 허용 가능한 부형제, 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물을 제공한다.

일부 양태에서, 본 개시는 본원에 기술된 키메라 단백질을 암호화하는 조작된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

일부 양태에서, 본 개시는 본원에 기술된 조작된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

일부 양태에서, 본 개시는 본원에 기술된 바와 같은 조작된 폴리뉴클레오티드 또는 본원에 기술된 바와 같은 발현 벡터, 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 약학적으로 허용 가능한 부형제, 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물을 제공한다.

일부 양태에서, 본 개시는 본원에 기술된 바와 같은 조작된 폴리뉴클레오티드 또는 본원에 기술된 바와 같은 발현 벡터로 단리된 세포를 형질도입하는 단계를 포함하는, 조작된 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시는 위의 방법에 의해 생산된 조작된 세포를 제공한다.

일부 양태에서, 본 개시는 본원에 기술된 바와 같은 조작된 폴리뉴클레오티드, 본원에 기술된 바와 같은 발현 벡터, 또는 본원에 기술된 바와 같은 조작된 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터와 약학적으로 허용 가능한 담체, 약학적으로 허용 가능한 부형제, 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물을 포함하는 단리된 세포를 제공한다.

일부 양태에서, 본 개시는 본원에 기술된 조작된 폴리뉴클레오티드 또는 본원에 기술된 발현 벡터를 발현하는 조작된 세포의 집단을 제공한다.

일부 양태에서, 본 개시는 본원에 기술된 키메라 단백질을 포함하는 단리된 세포를 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시는 본원에 기술된 키메라 단백질을 발현하는 조작된 세포의 집단을 제공한다. 일부 양태에서, 키메라 단백질은 단리된 세포 또는 세포 집단에서 재조합적으로 발현된다. 일부 양태에서, 단리된 세포 또는 세포의 집단은 세포 표면 상에 발현된 하나 이상의 종양 표적화 키메라 수용체를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 종양 표적화 키메라 수용체 각각은 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 조작된 T 세포 수용체이다. 일부 양태에서, 세포 또는 세포의 집단은 T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 감마-델타 T 세포, 세포독성 T 림프구(CTL), 조절 T 세포, 바이러스 특이적 T 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 자연 살해(NK) 세포, B 세포, 종양 침윤 림프구(TIL), 선천성 림프구 세포, 비만 세포, 호산구, 호염기구, 호중구, 골수 세포, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포, 적혈구, 혈소판 세포, 인간 배아 줄기 세포(ESC), ESC 유래 세포, 다능성 줄기 세포, 중간엽 기질 세포(MSC), 유도 만능 줄기 세포(iPSC), 및 iPSC-유래 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 세포 또는 세포 집단은 자가유래이다. 일부 양태에서, 세포 또는 세포 집단은 동종이계이다.

일부 양태에서, 본 개시는 본원에 기술된 바와 같은 세포 또는 조작된 세포의 집단의 유효량 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 약학적으로 허용 가능한 부형제, 또는 이들의 조합을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

일부 양태에서, 본 개시는 본원에 기술된 바와 같은 키메라 단백질을 발현하는 유전적으로 변형된 세포의 유효량 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 약학적으로 허용 가능한 부형제, 또는 이들의 조합을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, 약학적 조성물은 종양을 치료 및/또는 예방하기 위한 것이다.

일부 양태에서, 본 개시는 본원에 기술된 바와 같은 키메라 단백질, 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터, 본원에 기술된 바와 같은 세포 또는 세포 집단을 포함하는 조성물 또는 약학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.

일부 양태에서, 본 개시는 대상체에서 종양 세포에 대한 세포 매개 면역 반응을 자극하는 방법을 제공하며, 방법은 본원에 기술된 바와 같은 키메라 단백질, 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터, 본원에 기술된 바와 같은 세포 또는 세포 집단을 포함하는 조성물 또는 약학적 조성물의 치료적 유효 용량을 종양을 가진 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

일부 양태에서, 본 개시는 종양을 가진 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 방법은 본원에 기술된 바와 같은 키메라 단백질, 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터, 본원에 기술된 바와 같은 세포 또는 세포 집단을 포함하는 조성물 또는 약학적 조성물의 치료적 유효 용량을 투여하는 단계를 포함한다.

일부 양태에서, 본 개시는 본원에 기술된 바와 같은 키메라 단백질을 포함하는 종양을 치료 및/또는 예방하기 위한 키트를 제공한다. 일부 양태에서, 키트는 대상체에서 종양을 치료 및/또는 예방하기 위한 하나 이상의 항원-특이적 세포를 생산하는 키메라 단백질을 사용하기 위한 서면 지침을 추가로 포함한다.

일부 양태에서, 본 개시는 본원에 기술된 바와 같은 세포 또는 세포 집단을 포함하는 종양을 치료 및/또는 예방하기 위한 키트를 제공한다. 일부 양태에서, 키트는 대상체에서 종양을 치료 및/또는 예방하기 위해 세포를 사용하기 위한 서면 지침을 추가로 포함한다.

일부 양태에서, 본 개시는 본원에 기술된 바와 같은 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 종양을 치료 및/또는 예방하기 위한 키트를 제공한다. 일부 양태에서, 키트는 대상체에서 종양을 치료 및/또는 예방하기 위한 하나 이상의 항원-특이적 세포를 생산하는 벡터를 사용하기 위한 서면 지침을 추가로 포함한다.

일부 양태에서, 본 개시는 본원에 기술된 바와 같은 벡터를 포함하는, 종양을 치료 및/또는 예방하기 위한 키트를 제공한다. 일부 양태에서, 키트는 대상체에서 종양을 치료 및/또는 예방하기 위한 하나 이상의 항원-특이적 세포를 생산하는 벡터를 사용하기 위한 서면 지침을 추가로 포함한다.

일부 양태에서, 본 개시는 본원에 기술된 바와 같은 조성물을 포함하는, 종양을 치료 및/또는 예방하기 위한 키트를 제공한다. 일부 양태에서, 키트는 대상체에서 종양을 치료 및/또는 예방하기 위해 조성물을 사용하기 위한 서면 지침을 추가로 포함한다.

특허 또는 출원 파일은 컬러로 실행된 적어도 하나의 도면을 함유한다. 컬러 도면이 있는 이 특허 또는 특허 출원 간행물의 사본은 요청 및 필요한 비용 지불 시 사무소에 의해 제공될 것이다.
본 개시내용의 이들 및 다른 특징, 측면, 및 이점은 하기 설명, 및 첨부 도면과 관련하여 더 잘 이해될 것이다.
도 1. Chothia 명명 체계를 사용한 항-VSIG2 항체(Ab)의 경쇄 가변 영역에 대한 시퀀싱 결과.
도 2. Chothia 명명 체계를 사용한 항-VSIG2 항체(Ab)의 중쇄 가변 영역에 대한 시퀀싱 결과.
도 3. aCAR/iCAR 형질도입 NK 세포로부터 다양한 항-VSIG2 억제 CAR 및 항-CEA 활성화 CAR의 발현.
도 4. 항-VSIG2 억제 CAR 및 항-CEA 활성화 CAR을 발현하는 NK 세포에 의한, VSIG2를 발현하거나 VSIG2 발현이 결여된 CEA-양성 표적 세포의 사멸.
도 5. 항-VSIG2 활성화 CAR을 이용한 NK 세포에 의한 VSIG2-양성 표적 세포의 사멸.
도 6. 형질도입된 NK 세포에서 다양한 항-VSIG2 활성화 CAR의 발현.
도 7a. 항-VSIG2 활성화 CAR을 발현하는 NK 세포에 의한 표적 세포 Ls174t의 사멸.
도 7b. 항-VSIG2 활성화 CAR을 발현하는 NK 세포에 의한 표적 세포 DLD1의 사멸.
도 7c. 항-VSIG2 활성화 CAR을 발현하는 NK 세포에 의한 표적 세포 Ls174t의 사멸.
도 7d. 항-VSIG2 활성화 CAR을 발현하는 NK 세포에 의한 표적 세포 DLD1의 사멸.
도 8. FLT3-활성화 CAR 및 다양한 항-VSIG2 억제 CAR을 발현하는 NK 세포에 의한 FLT3-양성 표적 세포의 사멸
도 9. FLT3 활성화 CAR/VSIG2 억제 CAR NK 세포/표적 세포 공동 배양에서 TNFα 생성의 정량화.
도 10a. 형질도입된 NK 세포에서 다양한 항-VSIG2 억제 CAR 및 항-CEA 활성화 CAR의 발현.
도 10b. 대조군 NK 세포에서 다양한 항-VSIG2 억제 CAR 및 항-CEA 활성화 CAR의 발현.
도 11. CEA-활성화 CAR 및 다양한 항-VSIG2 억제 CAR을 발현하는 NK 세포에 의한 CEA-양성 표적 세포의 사멸.

본 개시내용의 실행은, 달리 표시되지 않는 한, 당 기술분야의 기술 내에서 분자 생물학, 화학, 생화학, 바이러스학, 및 면역학의 통상적인 방법을 이용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에서 완전히 설명된다. 예를 들어, 문헌[Hepatitis C Viruses: Genomes and Molecular Biology (S.L. Tan ed., Taylor & Francis, 2006); Fundamental Virology, 3^rd　Edition, vol. I & II (B.N. Fields and D.M. Knipe, eds.)]; 문헌[Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition)]; Sambrook등의 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3^rd　Edition, 2001); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.)]을 참조한다.

정의

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어, 표기법 및 다른 과학 용어는 당 기술분야의 숙련자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우에, 통상적으로 이해되는 의미의 용어는 명료성 및/또는 용이한 참조를 위해 본원에 정의되고, 본원에서 이러한 정의의 포함은 반드시 당 기술분야에서 일반적으로 이해되는 것에 대한 차이를 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본원에 기재되거나 또는 언급된 기술 및 절차는 일반적으로 널리 이해되고 예를 들어, Sambrook 등의 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4th ed. (2012) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]에 기재된 광범위하게 활용되는 분자 클로닝 방법론과 같이, 당 기술분야의 숙련자에 의한 관습적인 방법론을 사용하여 통상적으로 이용된다. 적절한 경우, 상업적으로 이용가능한 키트 및 시약의 사용을 수반하는 절차는 일반적으로 달리 언급되지 않는 한 제조업체에 의해 정의된 프로토콜 및 조건에 따라 수행된다.

본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태("a," "an," 및 "the")는 문맥상 달리 명백히 나타내지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 용어 "포함하다(include)", "예컨대(such as)" 등은 달리 구체적으로 표시되지 않는 한, 제한 없이 포함하도록 의도된다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는(comprising)"은 또한 달리 구체적으로 표시되지 않는 한, 언급된 요소로 "이루어진(consisting of)" 및 "본질적으로 이루어진(consisting essentially of)" 실시예를 구체적으로 포함한다.

용어 "약(about)"은 표시된 값 및 해당 값의 위 아래 범위를 나타내고 포함한다. 특정 실시예에서, 용어 "약"은 지정된 값　±　10%, ±　5%, 또는 ± 1%를 나타낸다. 특정 구현예에서, 적용가능한 경우, 용어 "약"은 지정된 값(들)± 해당 값(들)의 1 표준 편차를 나타낸다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "세포 매개 면역 반응 자극" 또는 "면역 반응 자극"은 하나 이상의 세포 유형 또는 세포 집단에 의한 면역 반응을 초래하는 신호를 생성하는 것을 지칭한다. 면역자극 활성은 전염증성 활성을 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 면역 반응은 면역 세포(예를 들어, T-세포 또는 NK 세포) 활성화 후에 일어나거나, 이에 제한되지는 않으나, CD28, CD137(4-1BB), OX40, CD40 및 ICOS, 및 B7-1, B7-2, OX-40L, 및 4-1BBL을 포함하는 이들의 상응하는 리간드를 통해 동시에 매개된다. 이러한 폴리펩티드는 종양 미세환경에 존재할 수 있고 신생물 세포에 대한 면역 반응을 활성화할 수 있다. 다양한 구현예에서, 전염증성 폴리펩티드 및/또는 이의 리간드의 촉진, 자극, 또는 달리 작용화는 면역반응성 세포의 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 특정 이론에 구속되지 않고, 다수의 자극 신호(예를 들어, 공동 자극)를 수신하는 것은, 공동 자극 신호의 부재 하에 T 세포가 억제되고 항원에 반응하지 않게 될 수 있는 T 세포 매개 면역 반응("T 세포 무력화"으로도 지칭됨)과 같은 강력하고 장기적인 세포 매개 면역 반응을 장착하는 데 중요하다. 다양한 공동 자극 신호의 효과는, 특히 서로 조합될 때, 변화하고 단지 부분적으로만 이해될 수 있지만, 공동 자극은 일반적으로, 예를 들어, 동족 항원을 발현하는 표적 세포의 완전한 및/또는 지속적인 제거를 매개하는 데 있어서 항원에 강력하게 반응하는, T 세포 또는 NK 세포와 같은, 오래 지속되는, 증식성 및 세포자멸 내성 세포를 생성하기 위해 유전자 발현을 증가시킨다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "키메라 항원 수용체" 또는 대안적으로 "CAR"은 적어도 세포 외 항원-결합 도메인, 막관통 도메인 및 기능성 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 신호전달 도메인(또한 본원에서 "세포 내 신호전달 도메인"으로 지칭됨)을 포함하는 재조합 폴리펩티드 작제물을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "활성화 CAR" 또는 "aCAR"은 동족체 aCAR 리간드에 결합할 때 면역 반응을 개시, 활성화, 자극 또는 증가시키는 활성화 CAR-발현 세포에서 신호 전달 또는 단백질 발현의 변화를 유도할 수 있는 CAR 작제물/구조물을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "억제 CAR" 또는 "iCAR"은 공동-자극 신호를 비롯하여, 하나 이상의 자극 신호를 수신하고 있거나 수신한 면역반응성 세포의 활성화 감소와 같이, 동족체 iCAR 리간드에 결합할 때 면역 반응을 예방, 약화, 억제, 감소(reduce), 감소(decrease), 억제(inhibit) 또는 저해(suppress)하는 억제 CAR-발현 세포에서 신호 전달 또는 단백질 발현의 변화를 유도할 수 있는 CAR 작제물/구조물을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 제2 메신저를 생성하여 정의된 신호전달 경로를 통해 세포 활성을 조절하기 위해 세포 내에서 정보를 전송하거나 이러한 메신저에 대해 반응하여 효과기로서 기능함으로써 작용하는 단백질의 기능적 부분을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "세포외 항원 결합 도메인" 또는 "항원 결합 도메인"(ABD)은 주어진 항원 또는 에피토프를 특이적으로 인식하거나 이에 결합하는 폴리펩티드 서열 또는 폴리펩티드 복합체, 예컨대 VSIG2 특이적 결합을 제공하는 본원에 기술된 키메라 단백질의 폴리펩티드 서열 또는 폴리펩티드 복합체 부분을 지칭한다. ABD(또는 항체, 항원-결합 단편, 및/또는 이를 포함하는 키메라 단백질)는 ABD가 특이적으로 결합하는 에피토프(또는 보다 일반적으로는 항원)를 "인식"하고, 에피토프는 ABD의 "인식 특이성" 또는 "결합 특이성"이라고 한다. ABD는 특정 친화도로 특이적인 항원 또는 에피토프에 결합하는 것으로 지칭된다. 본원에 기술된 바와 같이, "친화도"는 하나의 분자와 다른 분자 사이의 비공유 분자간 힘의 상호작용 강도를 지칭한다. 친화도, 즉,상호작용의 강도는 해리 평형 상수(KD)로서 표현될 수 있으며, 여기서 더 낮은 KD 값은 분자들 간의 더 강한 상호작용을 지칭한다. 항체 작제물의 KD 값은 바이오-층 간섭계(예를 들어, Octet/FORTEBIO®), 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술(예를 들어, Biacore®), 및 세포 결합 분석(예를 들어, 유세포 계측법)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 측정된다. 친화도에 의해 평가되는 바와 같이, 특이적 결합은, KD 값이 10^-6M, 10^-7M, 10^-8M, 10^-9M, 또는 10^-10M 미만인 ABD와 이의 동족 항원 또는 에피토프 사이의 친화도를 갖는 결합 분자를 지칭할 수 있다. 특이적 결합은 또한, 본 개시의 폴리펩티드를 자연적으로 포함하는, 샘플, 예를 들어 생물학적 샘플 내의 다른 분자를 특이적으로 인식하고 결합하지 않으면서, 관심 생물학적 분자(예를 들어 폴리펩티드)의 인식 및 결합을 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 특이적 결합은 결합이 동일하거나 유사한 에피토프, 항원 또는 항원 결정기의 제2 제제와 경쟁하거나 대체될 수 있는 방식으로 에피토프 또는 항원 또는 항원 결정기에 대한 ABD, 항체 또는 항원-결합 단편 간의 결합을 지칭한다.

ABD는 항체일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자로부터 유래된 단백질, 또는 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 항체는 다클론 또는 단클론, 다중 또는 단일 사슬, 또는 온전한 면역글로불린일 수 있고, 천연 공급원 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 항체는 면역글로불린 분자의 사량체일 수 있다.

ABD는 항체의 항원-결합 단편일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항원-결합 단편"은 항원 또는 에피토프와 같은 표적에 대한 항원-결합 단편의 인식 및 특이적 결합을 부여하기에 충분한, 온전한 항체, 또는 이의 재조합 변이체의 적어도 일부를 지칭한다. 항원-결합 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, scFv, 선형 항체, 단일 도메인 항체 예를 들어 sdAb(VL 또는 VH), 낙타류 V_HH 도메인, 및 힌지 영역에서 이황화 결합에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편, 및 항체의 단리된 CDR 또는 다른 에피토프 결합 단편과 같은 항원-결합 단편으로부터 형성된 다중-특이적 항체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 항원-결합 단편은 또한 단일 도메인 항체, 맥시바디(maxibody), 미니바디(minibody), 나노바디(nanobody), 인트라바디(intrabody), 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), v-NAR 및 비스-scFv로 혼입될 수 있다(예를 들어, Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23: 1126-1 136, 2005 참조). 항원 결합 단편은 또한 피브로넥틴 유형 III(Fn3)과 같은 폴리펩티드를 기반으로 하는 스캐폴드에 이식될 수 있다(피브로넥틴 폴리펩티드 미니바디를 기재하는 미국 특허 번호 제6,703,199호 참조).

본원에 기술된 키메라 단백질과 같은 결합 분자 내의 ABD의 수는 결합 분자의 "결합가(valency)"를 정의한다. 단일 ABD를 갖는 결합 분자는 "1가(monovalent)"이다. 복수의 ABD를 갖는 결합 분자는 "다가(multivalent)"인 것으로 지칭된다. 2개의 ABD를 갖는 다가 결합 분자는 "2가(bivalent.)"이다. 3개의 ABD를 갖는 다가 결합 분자는 "3가(trivalent)"이다. 4개의 ABD를 갖는 다가 결합 분자는 "4가(tetravalent)"이다. 다양한 다가 실시예에서, 복수의 ABD 모두는 동일한 인식 특이성을 가지며 "단일특이적 다가" 결합 분자로서 지칭될 수 있다. 다른 다가 실시예에서, 복수의 ABD 중 적어도 2개는 상이한 인식 특이성을 갖는다. 이러한 결합 분자는 다가이고 "다중특이적"이다. ABD가 집합적으로 2개의 인식 특이성을 갖는 다가 실시예에서, 결합 분자는 "이중특이적"이다. ABD가 집합적으로 3개의 인식 특이성을 갖는 다가 실시예에서, 결합 분자는 "삼중특이적"이다. ABD가 집합적으로 동일한 항원 상에 존재하는 상이한 에피토프에 대한 복수의 인식 특이성을 갖는 다가 실시예에서, 결합 분자는 "다중파라토프(multiparatopic)"이다. ABD가 동일한 항원 상의 2개의 에피토프를 집합적으로 인식하는 다가 실시예는 "이중파라토프(biparatopic)"이다.

다양한 다가 실시예에서, 결합 분자의 다가성은 특이적 표적에 대한 결합 분자의 결합활성(avidity)을 개선한다. 본원에 기술된 바와 같이, "결합력"은 2개 이상의 분자, 예를 들어, 특이적 표적에 대한 다가 결합 분자 사이의 전반적인 상호작용 강도를 지칭하며, 여기서 결합력은 다수의 ABD의 친화도에 의해 제공되는 누적 상호작용 강도이다. 결합력은 전술한 바와 같이 친화도를 결정하는 데 사용된 것과 동일한 방법에 의해 측정될 수 있다. 특정 구현예에서, 특이적 표적에 대한 결합 분자의 결합력은 상호작용이 특이적 결합 상호작용이 되도록 하는 것이며, 여기서 두 분자 간의 결합력은 10^-6M, 10^-7 M, 10^-8M, 10^-9 M, 또는 10^-10 M 미만의 KD 값을 갖는다. 특정 구현예에서, 특이적 표적에 대한 결합 분자의 결합력은, 상호작용이 특이적 결합 상호작용이 되도록 KD 값을 가지되, 개별 ABD의 하나 이상의 친화도는 그들 스스로 각각의 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 것에 적격인 KD 값을 갖지 않는다. 특정 구현예에서, 결합력은 공유하는 특이적 표적 또는 복합체 상의 별개의 항원, 예컨대, 개별 세포에서 발견되는 별개의 항원에 대한 다수의 ABD의 친화도에 의해 제공되는 누적 상호작용 강도이다. 특정 실시예에서, 결합활성은 공유된 개별 항원 상의 별도의 에피토프에 대한 다수의 ABD의 친화도에 의해 제공되는 누적 상호작용 강도이다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단일-사슬 가변 단편" 또는 "scFv"는 경쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 하나의 항원-결합 단편 및 중쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 한의 항원-결합 단편을 포함하는 융합 단백질을 지칭하며, 여기서 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 짧은 가요성 폴리펩티드 링커를 통해 인접하게 연결되고, 단일 사슬 폴리펩티드로서 발현될 수 있으며, 여기서 scFv는 유래된 것으로부터 온전한 항체의 특이성을 유지한다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같은 scFv는 VL 및 VH 가변 영역을 어느 순서로든 가질 수 있으며, 예를 들어, 폴리펩티드의 N-말단 및 C-말단 단부와 관련하여, scFv는 VL-링커-VH를 포함할 수 있거나 VH-링커-VL을 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "가변 영역"은 재조합 이벤트로부터 발생하는 가변 서열을 지칭하며, 예를 들어, B 세포 또는 T 세포 내의 T 세포 수용체(TCR) 유전자 내의 면역글로불린 유전자에서의 V, J, 및/또는 D 분절 재조합이 따른다. 면역글로불린 유전자에서, 가변 영역은 일반적으로 이들이 유래되는 항체 사슬로부터 정의되며, 예를 들어, VH는 항체 중쇄의 가변 영역을 지칭하고, VL은 항체 경쇄의 가변 영역을 지칭한다. 선택된 VH 및 선택된 VL은 함께 결합하여 항원 특이성 및 결합 친화도를 부여하는 항원-결합 도메인을 형성할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 항원 특이성 및 결합 친화도를 부여하는 항체 가변 영역인 VH 및 VL 내의 서열을 지칭한다. 예를 들어, 일반적으로, 각각의 중쇄 가변 영역에 3개의 CDR(예를 들어, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3)이 있고 각각의 경쇄 가변 영역에 3개의 CDR(LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3)이 있다. 주어진 CDR의 정확한 아미노산 서열 경계는 Kabat 등의 문헌 [(1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD ("Kabat" numbering scheme)], Al-Lazikani 등의 문헌[(1997) JMB 273,927-948 ("Chothia" numbering scheme)], 또는 이들의 조합에 기재된 것들을 포함한 다수의 널리 알려진 방식 중 임의의 것을 사용하여 결정될 수 있다. Kabat 넘버링 체계 하에, 일부 실시예에서, 중쇄 가변 도메인(VH)에서 CDR 아미노산 잔기는 31~35(HCDR1), 50~65(HCDR2), 및 95~102(HCDR3)로 넘버링되고; 경쇄 가변 도메인(VL)에서 CDR 아미노산 잔기는 24~34(LCDR1), 50~56(LCDR2), 및 89~97(LCDR3)로 넘버링된다. Chothia 넘버링 체계 하에, 일부 실시예에서, VH에서 CDR 아미노산은 26~32(HCDR1), 52~56(HCDR2), 및 95~102(HCDR3)로 넘버링되고; VL에서 CDR 아미노산 잔기는 26~32(LCDRl), 50~52(LCDR2), 및 91~96(LCDR3)으로 넘버링된다. 조합된 Kabat 및 Chothia 넘버링 체계에서, 일부 구현예에서, CDR은 Kabat CDR, Chothia CDR, 또는 둘 다의 일부인 아미노산 잔기에 상응한다. 예를 들면, 일부 구현예에서, CDR은 VH, 예를 들어, 포유류 VH, 예를 들어, 인간 VH에서 아미노산 잔기 26~35(HCDR1), 50~65(HCDR2), 및 95~102(HCDR3); 및 VL, 예를 들어, 포유류 VL, 예를 들어, 인간 VL에서 아미노산 잔기 24~34(LCDRl), 50~56(LCDR2), 및 89~97(LCDR3)에 상응한다. 다양한 구현예에서, CDR은 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼, 낙타, 당나귀, 염소 및 인간 서열을 포함하지만 이에 한정되지 않는 포유류 서열이다. 바람직한 실시예에서, CDR은 인간 서열이다. 다양한 실시예에서, CDR은 자연적으로 발생하는 서열이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "프레임워크 영역" 또는 "FR"은 일반적으로 (N-말단에서 C-말단까지) FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 배열로, 산재된 CDR에 대한 스캐폴드로서 작용하는 항체 가변 영역 VH 및 VL 내의 일반적으로 보존된 서열을 지칭한다. 다양한 구현예에서, FR은 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼, 낙타, 당나귀, 염소 및 인간 서열을 포함하지만 이에 한정되지 않는 포유류 서열이다. 특정 구현예에서, FR은 인간 서열이다. 다양한 구현예에서, FR은 자연적으로 발생하는 서열이다. 다양한 구현예에서, FR은 합리적으로 설계된 서열을 포함하지만 이에 한정되지 않는 합성 서열이다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체 중쇄"는 항체 분자에 자연 발생 입체형태로 존재하고, 항체가 속하는 부류를 일반적으로 결정하는 2 가지 유형의 폴리펩티드 사슬 중 더 큰 것을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체 경쇄"는 항체 분자에 자연 발생 입체형태로 존재하는 2 가지 유형의 폴리펩티드 사슬 중 더 작은 것을 지칭한다. 카파(κ) 및 람다(λ) 경쇄는 2 가지 주요 항체 경쇄 이소형을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "재조합 항체"는 예를 들어, 박테리오파지 또는 효모 발현 시스템에 의해 발현된 항체와 같이, 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성된 항체를 지칭한다. 위의 용어는 또한 항체를 암호화하는 DNA 분자의 합성에 의해 생성되고 DNA 분자가 항체 단백질, 또는 항체를 명시하는 아미노산 서열을 발현하는 항체를 의미하는 것으로 해석되어야 하며, 여기서 DNA 또는 아미노산 서열은 당 기술분야에서 이용가능하고 널리 알려진 재조합 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 사용하여 수득되었다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항원" 또는 "Ag"는 면역 반응을 일으키는 분자를 지칭한다. 이러한 면역 반응은 항체 생산, 또는 특이적 면역학적으로-적격 세포의 활성화, 또는 둘 다를 수반할 수 있다. 당 기술분야의 숙련자는 실질적으로 모든 단백질 또는 펩티드를 포함한 임의의 거대분자가 항원으로서 역할을 할 수 있음을 이해할 것이다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항-종양 효과" 또는 "항-종양 활성"은, 예를 들어, 종양 부피 감소, 종양 세포 수 감소, 전이 수 감소, 기대 수명 증가, 종양 세포 증식 감소, 종양 세포 생존 감소, 또는 암성 상태와 연관된 다양한 생리학적 증상의 개선을 포함하나 이에 제한되지 않는, 다양한 방식에 의해 나타낼 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다. 항-종양 효과"는 또한 우선 종양 발생의 예방 시, 예를 들어 예방적 요법 또는 치료 시 본 개시내용의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 세포 및 항체의 능력에 의해 나타낼 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "자가"는 나중에 대상체에게 재도입될 동일한 대상체로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "동종"은 물질이 도입되는 대상체와 동일한 종의 다른 동물로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다. 둘 이상의 대상체는 하나 이상의 유전자좌에 있는 유전자가 동일하지 않을 때 서로 동종이라고 한다. 일부 구현예에서, 동일한 종의 개체로부터의 동종 물질은 항원적으로 상호작용하도록, 예를 들어 MHC 대립유전자와 같은 특정 유전자에서 유전적으로 충분히 다를 수 있다. 일부 구현예에서, 동일한 종의 개체로부터의 동종 물질은 항원적으로 상호작용하지 않도록, 예를 들어, MHC 대립유전자와 같은 특정 유전자에서 충분히 유전적으로 유사할 수 있다.

본 개시의 단리된 폴리뉴클레오티드 분자는 본 개시내용의 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 암호화하는 임의의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 핵산 서열을 포함한다. 이러한 폴리뉴클레오티드 분자는 내인성 핵산 서열과 100% 상동성이거나 동일할 필요가 없지만, 통상적으로 실질적인 동일성을 나타낼 것이다. 내인성 서열에 대해 "실질적인 동일성" 또는 "실질적인 상동성"을 갖는 핵산 서열은 통상적으로 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 분자의 적어도 하나의 가닥과 혼성화된다. 본원에 사용된 바와 같이, "혼성화하다"는 다양한 엄격성 조건 하에, 상보적 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 본원에 기재된 유전자), 또는 이의 부분 사이에 이중-가닥 분자를 형성하기 위한 쌍형성을 지칭한다. 예를 들어, 엄격한 염 농도는 약 750 mM 미만 NaCl 및 75 mM 트리소듐 시트레이트, 약 500 mM 미만 NaCl 및 50 mM 트리소듐 시트레이트, 또는 약 250 mM 미만 NaCl 및 25 mM 트리소듐 시트레이트일 수 있다. 낮은 엄격성 혼성화는 유기 용매, 예를 들어, 포름아미드의 부재 하에 수득될 수 있는 반면, 높은 엄격성 혼성화는 적어도 약 35% 포름아미드 또는 적어도 약 50% 포름아미드의 존재 하에 수득될 수 있다. 엄격한 온도 조건은 보통 적어도 약 30℃ 적어도 약 37℃ 또는 적어도 약 42℃의 온도를 포함할 것이다. 혼성화 시간, 세제, 예를 들어, 나트륨 도데실 설페이트(SDS)의 농도, 및 담체 DNA의 포함 또는 배제와 같은 다양한 추가적인 매개변수는 당업자에게 잘 알려져 있다. 필요에 따라 이들 다양한 조건을 조합함으로써 다양한 수준의 엄격성이 달성될 수 있다.

"실질적으로 동일한" 또는 "실질적으로 상동"이란 참조 아미노산 서열(예를 들어, 본원에 기재된 아미노산 서열 중 임의의 하나) 또는 핵산 서열(예를 들어, 본원에 기재된 핵산 서열 중 임의의 하나)과 적어도 약 50% 상동이거나 동일한 것을 나타내는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 분자를 의미한다. 바람직하게는, 이러한 서열은 비교를 위해 사용되는 서열에 대해 아미노산 수준 또는 핵산 수준에서 적어도 약 60%, 약 80%,약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99%, 또는 약 100% 상동이거나 동일하다. 서열 동일성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어(예를 들어, Genetics Computer Group의 서열 분석 소프트웨어 패키지, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, BLAST, BESTFIT, GAP, 또는 PILEUP/PRETTYBOX 프로그램)를 사용하여 측정된다. 이러한 소프트웨어는 다양한 치환, 결실, 및/또는 다른 변형에 대한 상동성 정도를 할당함으로써 동일하거나 또는 유사한 서열을 일치시킨다. 보존적 치환은 전형적으로 다음 그룹 내에서의 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신. 동일성 정도를 결정하기 위한 예시적인 접근법에서, 밀접하게 관련된 서열을 나타내는 e-3와 e-100 사이의 확률 점수와 함께, BLAST 프로그램이 사용될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "암호화"는 생물학적 과정에서 뉴클레오티드(예를 들어, rRNA, tRNA 및 mRNA)의 정의된 서열 또는 아미노산의 정의된 서열을 갖는 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 역할을 하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 유전자, cDNA, 또는 mRNA에서 뉴클레오티드의 특이적 서열의 고유한 특성 및 이로부터 기인한 생물학적 특성을 지칭한다. 따라서, 유전자, cDNA, 또는 RNA는 해당 유전자에 상응하는 rnRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생성하는 경우 단백질을 암호화한다. mRNA 서열과 동일하고 일반적으로 서열 목록에 제공되는 뉴클레오티드 서열인 코딩 가닥, 및 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로 사용되는 비-코딩 가닥은 둘 다 해당 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 생성물을 암호화하는 것으로 지칭될 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 축퇴 버전이고 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. "단백질 또는 RNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열"이라는 어구는 또한 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 일부 버전에서 인트론(들)을 함유하는 정도로 인트론을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "리간드"는 수용체에 결합하는 분자를 지칭한다. 특히, 리간드는 또 다른 세포 상의 수용체에 결합하여, 세포 간 인식 및/또는 상호작용을 허용한다.

용어 "유효량" 및 "치료 유효량"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 특정 생물학적 결과를 달성하는 데 효과적인 본원에 기재된 바와 같은 화합물, 제형, 물질, 또는 조성물의 양을 지칭한다. 일부 구현예에서, "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 관심 질환 또는 장애, 예를 들어, 고형 종양의 지속적인 증식, 성장, 또는 전이를 저지하거나, 개선하거나, 또는 억제하기에 충분한 양이다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "면역반응성 세포"는 면역 반응(예를 들어, 면역 효과기 반응)에서 기능하는 세포 또는 이의 전구체, 또는 자손을 지칭한다. 면역 효과기 세포의 예는 알파/베타 T 세포, 감마/델타 T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 비만 세포, 및 골수-유래 식세포를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "면역 효과기 반응" 또는 "면역 효과기 기능"은 예를 들어, 표적 세포의 면역 공격을 향상시키거나 촉진하는 면역반응성 세포의 기능 또는 반응을 지칭한다. 예를 들어, 면역 효과기 기능 또는 반응은 표적 세포의 사멸 또는 성장 또는 증식의 억제를 촉진하는 T 세포 또는 NK 세포의 특성을 지칭할 수 있다. T 세포의 경우, 1차 자극 및 공동 자극은 면역 효과기기능 또는 반응의 예이다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "가요성 폴리펩티드 링커" 또는 "링커"는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 영역을 함께 연결하기 위해 단독으로 또는 조합하여 사용되는 글리신 및/또는 세린 잔기와 같은 아미노산으로 이루어진 펩티드 링커를 지칭한다. 일 구현예에서, 가요성 폴리펩티드 링커는 Gly/Ser 링커이고 아미노산 서열 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n 또는 (Gly-Gly-Gly-Ser)_n을 포함하며, 여기서 n은 1 이상의 양의 정수이다. 예를 들어, n=l, n=2, n=3, n=4, n=5, n=6, n=7, n=8, n=9, 또는 n=10. 일부 구현예에서, 가요성 폴리펩티드 링커는 Gly₄Ser[서열번호 27] 또는 (Gly₄Ser)₃[서열번호 29]를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 다른 구현예에서, 링커는 (Gly₂Ser), (GlySer) 또는 (Gly₃Ser)[서열번호 22]의 다중 반복을 포함한다. 일부 구현예에서, 가요성 폴리펩티드 링커는 Whitlow 링커(예를 들어, GSTSGSGKPGSGEGSTKG[서열번호 32])를 포함한다. 일부 구현예에서, 가요성 폴리펩티드 링커는 (EAAAK)₃[서열번호 33]) 링커를 포함한다. 또한, 예를 들어, 국제특허공개 WO2012/138475호에 기재된 링커가 본 개시의 범위 내에 포함된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 하나 이상의 요법(예를 들어, 하나 이상의 치료제, 예컨대 본 개시의 CAR)의 투여로 야기되는, 증식성 장애(예를 들어, 암)의 진행, 중증도 및/또는 지속기간의 감소 또는 개선, 또는 증식성 장애의 하나 이상의 증상(바람직하게는, 하나 이상의 인식가능한 증상)의 개선을 지칭한다. 일부 구현예에서, 감소 또는 개선은 환자에 의해 반드시 인식가능하지 않은 종양의 성장과 같은 증식성 장애의 적어도 하나의 측정가능한 물리적 매개변수의 개선을 지칭한다. 다른 구현예에서, 용어 "치료하다", "치료", 및 "치료하는"은 증식성 장애의 진행을, 예를 들어, 인식가능한 증상의 안정화에 의해 물리적으로, 예를 들어, 물리적 매개변수의 안정화에 의해 생리학적으로, 또는 둘 다에 의해 억제함을 지칭한다. 일부 구현예에서, 감소 또는 개선은 종양 크기 또는 암성 세포 수의 감소 또는 안정화를 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는 면역 반응이 도출될 수 있는 살아있는 유기체(예를 들어, 포유동물, 인간)를 포함하는 것으로 의도된다.

본 개시의 다른 양태는 하기 섹션에 기재되어 있고 청구된 발명의 범위 내에 있다.

다른 해석 규칙

본원에 인용된 범위는 인용된 종점을 포함하는, 범위 내의 모든 값에 대한 약칭으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 및 50의 임의의 수, 수의 조합, 또는 하위 범위를 포함하는 것으로 이해된다.

VSIG2-특이적 키메라 단백질 및 항원 결합 도메인

본 개시는 V-set 및 면역글로불린 도메인-함유 단백질 2(VSIG2)에 결합하는 키메라 단백질 및 이러한 키메라 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 구현예에서, VSIG2-특이적 키메라 단백질은 인간 VSIG2(예를 들어, 사실상 참조로서 본원에 통합된 Uniprot Q96IQ7) 또는 이의 에피토프 단편에 결합한다. VSIG2는 상피 세포에서 발현될 수 있다. VSIG2는 건강한 상피세포와 같이 일반적으로 건강한 것으로 간주되는 세포에서 발현될 수 있다. VSIG2-특이적 항체의 예는 OTI2D8("2D8"로도 알려지고 본원에서 Ab로도 지칭됨) 및 OTI5A10("5A10"으로도 알려짐)을 포함한다.

본 개시는 표 A에 열거된 아미노산 서열 중 하나 이상을 갖는 VSIG2-특이적 항원 결합 도메인을 포함하는 키메라 단백질, 및 이러한 키메라 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

일부 구현예에서, VSIG2-특이적 항원 결합 도메인은 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 가지며, VH는 QGVRPFFDY(서열번호 4)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3)을 포함한다. 일부 구현예에서, VH는 서열번호 1의 VH 영역 아미노산 서열 내 CDR-H1, 및 CDR-H2의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), 및 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2)를 포함한다. 일부 구현예에서, VSIG2-특이적 항원 결합 도메인은 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 추가로 포함하되, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3의 아미노산 서열은 서열번호 9 또는 서열번호 10의 VL 영역 아미노산 서열 내에 포함된다. 일부 구현예에서, VSIG2-특이적 항원 결합 도메인은 RASENIYSYLA(서열번호 11) 또는 RASENLYSYLA(서열번호 12)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), NAETLPE(서열번호 13)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2), 및 QHHYVIPWT(서열번호 14)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함한다.

일부 구현예에서, VSIG2-특이적 항원 결합 도메인은 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 가지며, VH는 서열번호 1의 VH 영역 아미노산 서열 내에 포함된 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3의 아미노산 서열을 갖는, 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3)을 포함한다. 일부 구현예에서, VSIG2-특이적 항원 결합 도메인은 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 추가로 포함하되, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3의 아미노산 서열은 서열번호 9 또는 서열번호 10의 VL 영역 아미노산 서열 내에 포함된다. 일부 구현예에서, VSIG2-특이적 항원 결합 도메인은 RASENIYSYLA(서열번호 11) 또는 RASENLYSYLA(서열번호 12)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), NAETLPE(서열번호 13)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2), 및 QHHYVIPWT(서열번호 14)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함한다.

일부 구현예에서, VSIG2-특이적 항원 결합 도메인은 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 가지며, VH는 GFTFSNS(서열번호 2)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), SDGGLY(서열번호 3)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 및 QGVRPFFDY(서열번호 4)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3)을 포함한다. 일부 구현예에서, VSIG2-특이적 항원 결합 도메인은 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 추가로 포함하되, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3의 아미노산 서열은 서열번호 9 또는 서열번호 10의 VL 영역 아미노산 서열 내에 포함된다. 일부 구현예에서, VSIG2-특이적 항원 결합 도메인은 RASENIYSYLA(서열번호 11) 또는 RASENLYSYLA(서열번호 12)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), NAETLPE(서열번호 13)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2), 및 QHHYVIPWT(서열번호 14)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함한다.

일부 구현예에서, VSIG2-특이적 항원 결합 도메인은 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 가지며, VL은 서열번호 9 또는 서열번호 10의 VL 영역 아미노산 서열 내에 포함된 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3의 아미노산 서열을 갖는, 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함한다.. 일부 구현예에서, VSIG2-특이적 항원 결합 도메인은 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR-H1), 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3)을 추가로 포함하되, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3의 아미노산 서열은 서열번호 1의 VH 영역 아미노산 서열 내에 포함된다. 일부 구현예에서, VSIG2-특이적 항원 결합 도메인은 GFTFSNS(서열번호 2)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), SDGGLY(서열번호 3)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), QGVRPFFDY(서열번호 4)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3)을 포함한다.

일부 구현예에서, VSIG2-특이적 항원 결합 도메인은 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 가지되, VL은 RASENIYSYLA(서열번호 11) 또는 RASENLYSYLA(서열번호 12)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), NAETLPE(서열번호13)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2), 및 QHHYVIPWT(서열번호 14) 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함한다. 일부 구현예에서, VSIG2-특이적 항원 결합 도메인은 서열번호 1의 VH 영역 아미노산 서열 내에 포함된 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3의 아미노산 서열을 갖는, 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3)을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, VSIG2-특이적 항원 결합 도메인은 GFTFSNS(서열번호 2)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), SDGGLY(서열번호 3)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 및 QGVRPFFDY(서열번호 4)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3)을 포함한다.

일부 구현예에서, VSIG2-특이적 항원 결합 도메인은 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 가지며, 여기서, (1) VH는 GFTFSNS(서열번호 2)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), SDGGLY(서열번호 3)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 및 QGVRPFFDY(서열번호 4)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3)을 포함하고, (2) VL은 RASENIYSYLA(서열번호 11) 또는 RASENLYSYLA(서열번호 12)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), NAETLPE(서열번호 13)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2), 및 QHHYVIPWT(서열번호 14)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함한다.

일부 구현예에서, VSIG2-특이적 항원 결합 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역을 갖는다. 일부 구현예에서, VSIG2-특이적 항원 결합 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역을 갖는다.

일부 구현예에서, VSIG2-특이적 항원 결합 도메인은 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 갖는다. 일부 구현예에서, VSIG2-특이적 항원 결합 도메인은 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 갖는다. 일부 구현예에서, VSIG2-특이적 항원 결합 도메인은 (1) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역, 및 (2) 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역 또는 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 갖는다.

일부 구현예에서, VSIG2-특이적 항원 결합 도메인은 (1) 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역, 및 (2) 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역 또는 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 갖는다.

일부 구현예에서, VSIG2-특이적 항원 결합 도메인은 (1) 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역, 및 (2) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 또는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역을 갖는다. 일부 구현예에서, VSIG2-특이적 항원 결합 도메인은 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역, 및 (2) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 또는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역을 갖는다.

일부 구현예에서, VSIG2-특이적 항원 결합 도메인은 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 가지는 기준 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 경쟁하되, (1) VH는 GFTFSNS(서열번호 2)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), SDGGLY(서열번호 3)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 및 QGVRPFFDY(서열번호 4)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3)을 포함하고, (2) VL은 RASENIYSYLA(서열번호 11) 또는 RASENLYSYLA(서열번호 12)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), NAETLPE(서열번호 13)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2), 및 QHHYVIPWT(서열번호 14)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함한다.

일부 구현예에서, VSIG2-특이적 항원 결합 도메인은 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 가지는 기준 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 동일하거나 본질적으로 동일한 에피토프(예를 들어, 구분되는 인간 VSIG2 에피토프)에 결합하되, (1) VH는 GFTFSNS(서열번호 2)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), SDGGLY(서열번호 3)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 및 QGVRPFFDY(서열번호 4)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3)을 포함하고, (2) VL은 RASENIYSYLA(서열번호 11) 또는 RASENLYSYLA(서열번호 12)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), NAETLPE(서열번호 13)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2), 및 QHHYVIPWT(서열번호 14)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함한다. 일부 구현예에서, VSIG2-특이적 항원 결합 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 갖는 기준 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 동일하거나 본질적으로 동일한 에피토프(예를 들어, 구별되는 인간 VSIG2 에피토프)에 결합한다. 일부 구현예에서, VSIG2-특이적 항원 결합 도메인은 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VL를 갖는 기준 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 동일하거나 본질적으로 동일한 에피토프(예를 들어, 구별되는 인간 VSIG2 에피토프)에 결합한다.

VSIG2-특이적 항원 결합 도메인은 본원에 기술된 임의의 포맷, 예컨대 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, scFv, 선형 항체, sdAb(VL 또는 VH)와 같은 단일 도메인 항체, 카멜화 VHH, 및 다중-특이적 포맷으로 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, VSIG2-특이적 항원 결합 도메인은 F(ab) 포맷이다. 일부 구현예에서, VSIG2-특이적 항원 결합 도메인은 F(ab') 포맷이다.

일부 구현예에서, VSIG2-특이적 항원 결합 도메인은 본원에 기술된 임의의 펩티드 링커를 갖는 scFv 포맷을 포함하는 단쇄 가변 단편(scFv) 포맷이다(예를 들어, 표 1 참조). 일부 구현예에서, VSIG2-특이적 항원 결합 도메인은 구조 VH-L-VL 또는 VL-L-VH를 가지며, 여기서 L은 펩티드 링커이다.

키메라 항원 수용체(CAR)

본 개시의 특정 양태는 본원에 기술된 VSIG2-특이적 항원 결합 도메인 중 어느 하나를 가지며, VSIG2 단백질, VSIG2 유래 항원, 또는 VSIG2 유래 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 키메라 수용체에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 일반적으로, CAR은 항원 결합 도메인 및 항원 결합 도메인에 이종인 폴리펩티드 분자, 예컨대 항원 결합 도메인이 유래될 수 있는 항체에 이종인 펩티드를 포함하는 키메라 단백질이다. 항원 결합 도메인에 이종인 폴리펩티드 분자는 막관통 도메인, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인, 힌지 도메인, 스페이서 영역, 하나 이상의 펩티드 링커, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.

일부 구현예에서, CAR은 면역 효과기 세포에 관심 특이성(예를 들어, VSIG2)을 이식하거나 또는 부여하는 조작된 수용체이다. 특정 구현예에서, CAR은 T 세포 또는 NK 세포와 같은 면역반응성 세포에 항체의 특이성을 이식하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 CAR은 하나 이상의 세포 내 신호전달 도메인에 융합된 막관통 도메인에 융합된 세포 외 항원-결합 도메인(예를 들어, scFv)을 포함한다.

일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 활성화 키메라 항원 수용체(aCAR 및 달리 명시되지 않는 한 일반적으로 CAR로도 지칭됨)이다. 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체와 이의 동족체 리간드의 결합은 면역반응성 세포의 활성화를 유도하기에 충분하다. 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체와 이의 동족체 리간드의 결합은 면역반응성 세포의 자극을 유도하기에 충분하다. 일부 구현예에서, 면역반응성 세포의 활성화는 표적 세포의 사멸을 초래한다. 일부 구현예에서, 면역반응성 세포의 활성화는 면역반응성 세포에 의한 사이토카인 또는 케모카인 발현 및/또는 분비를 초래한다. 일부 구현예에서, 면역반응성 세포의 자극은 면역반응성 세포에 의한 사이토카인 또는 케모카인 발현 및/또는 분비를 초래한다. 일부 구현예에서, 면역반응성 세포의 자극은 면역반응성 세포의 분화를 유도한다. 일부 구현예에서, 면역반응성 세포의 자극은 면역반응성 세포의 증식을 유도한다. 일부 구현예에서, 면역반응성 세포의 활성화 및/또는 자극은 위의 반응의 조합일 수 있다.

본 개시의 CAR은 1세대, 2세대, 또는 3세대 CAR일 수 있다. "1세대" CAR은 일반적으로 T 세포 수용체 사슬로부터 유래된 단일 세포 내 신호전달 도메인을 포함한다. "1세대" CAR은 일반적으로 내인성 TCR에서 신호의 주요 전달자인 CD3-제타(CD3z) 사슬로부터 세포 내 신호전달 도메인을 갖는다. "1세대" CAR은 새로운 항원 인식을 제공하고 HLA-매개 항원 제시와 관계없이, 단일 융합 분자에서 CD3z 사슬 신호전달 도메인을 통해 CD4⁺　및 CD8⁺　T 세포 둘 다의 활성화를 야기할 수 있다. "2세대" CAR은 T 세포에 추가적인 신호를 제공하기 위해 다양한 공동 자극 분자(예를 들어, CD28, 4-1BB, ICOS, OX40) 중 하나로부터의 제2 세포 내 신호전달 도메인을 CAR의 세포질 꼬리에 첨가한다. "2세대" CAR은 공동 자극(예를 들어, CD28 또는 4- 1BB) 및 활성화(CD3z) 둘 다를 제공한다. 전임상 연구는 "2세대" CAR이 T 세포와 같은 면역반응성 세포의 항-종양 활성을 개선시킬 수 있음을 나타낸다. "3세대" CAR은 다중 세포내 공동 자극 신호전달 도메인(예를 들어, CD28 및 4-1BB) 및 세포내 활성화 신호전달 도메인(CD3z)을 갖는다.

일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 키메라 억제 수용체(iCAR)이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 키메라 억제 수용체는 뇌, 뉴런 조직, 내분비, 뼈, 골수, 면역계, 내피 조직, 근육, 폐, 간, 담낭, 췌장, 위장관, 신장, 방광, 남성 생식기, 여성 생식기, 지방, 연조직, 및 피부로 이루어진 군으로부터 선택된 조직으로부터 유래된 비-종양 세포 상에서 발현되는 항원에 결합한다.

일부 구현예에서, 키메라 억제 수용체(예를 들어, VSIG2-특이적 키메라 억제 수용체)는, 예를 들어, NOT-로직 게이트로서 본 개시의 세포(예를 들어, 면역반응성 세포) 상에서 발현되는 하나 이상의 활성화 키메라 수용체(예를 들어, 활성화 키메라 TCR 또는 CAR)와 함께 사용되어 하나 이상의 활성화 키메라 수용체의 하나 이상의 활성을 조절하거나, 조정하거나, 또는 달리 억제할 수 있다. 예를 들면, 건강한 세포가 종양-표적화 키메라 수용체에 의해 인식되는 항원 및 억제 키메라 수용체에 의해 인식되는 항원을 둘 다 발현하는 경우, 종양 항원을 발현하는 면역반응성 세포는 건강한 세포에 결합할 수 있다. 이러한 경우, 억제 키메라 항원은 또한 건강한 세포의 동족 리간드에 결합할 것이고 억제 키메라 수용체의 억제 기능은 종양 표적화 키메라 수용체를 통한 면역반응성 세포의 활성화를 줄이거나, 감소시키거나, 예방하거나, 또는 억제할 것이다("NOT-로직 게이팅"). 일부 구현예에서, 본 개시의 키메라 억제 수용체는 본 개시의 세포(예를 들어, 면역반응성 세포)의 하나 이상의 활성을 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, 면역반응성 세포는 발현되지 않거나 일반적으로 종양에서 발현되는 것으로 간주되는 항원(예를 들어, VSIG2)을 표적으로 하는 하나 이상 이상의 종양 표적화 키메라 수용체 및 하나 이상의 억제 키메라 수용체를 포함할 수 있다. 동일한 면역반응성 세포에서 종양-표적화 키메라 수용체 및 억제 키메라 수용체의 조합을 사용하여 종양 표적외 독성을 감소시킬 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시의 CAR의 세포외 항원 결합 도메인은 약 2 x 10^-7 M 이하, 약 1 x 10^-7 M 이하, 약 9 x 10^-8 M 이하, 약 1 x 10^-8 M 이하, 약 9 x 10^-9 M 이하, 약 5 x 10^-9 M 이하, 약 4 x 10^-9 M 이하, 약 3 x 10^-9 M 이하, 약 2 x 10^-9 M 이하, 또는 약 1 x 10^-9 M 이하의 해리 상수(K_d)로, 하나 이상의 항원(예를 들어, VSIG2)에 결합한다. 일부 구현예에서, K_d는 약 2 x 10^-7 M 내지 약 1 x 10^-9 M 범위이다.

본 개시의 CAR의 세포외 항원 결합 도메인의 결합은 예를 들어, 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA), 방사성면역검정(RIA), FACS 분석, 생물검정(예를 들어, 성장 억제), 생물층 간섭법(예를 들어, Octet/FORTEBIO®), 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술(예를 들어, Biacore®) 또는 웨스턴 블롯 검정에 의해 결정될 수 있다. 이러한 검정 각각은 일반적으로 관심 복합체에 특이적인 표지된 시약(예를 들어, 항체 또는 scFv)을 이용함으로써 특정 관심 단백질-항체 복합체의 존재를 검출한다. 예를 들어, scFv는 방사성 표지되고 RIA 분석에 사용될 수 있다. 방사성 동위원소는 γ 계수기 또는 섬광 계수기의 사용과 같은 이러한 수단에 의해 또는 방사선촬영술에 의해 검출될 수 있다. 특정 실시예에서, CAR의 세포 외 항원-결합 도메인은 형광 마커로 표지된다. 형광 마커의 비제한적인 예는 녹색 형광 단백질(GFP), 청색 형광 단백질(예를 들어, EBFP, EBFP2, Azurite, 및 mKalamal), 청록색 형광 단백질(예를 들어, ECFP, Cerulean, 및 CyPet), 및 황색 형광 단백질(예를 들어, YFP, Citrine, Venus, 및 YPet)을 포함한다. 특정 구현예에서, CAR의 세포외 항원 결합 도메인은 세포외 항원 결합 도메인에 특이적인 이차 항체로 표지되고, 여기서 이차 항체는 (예를 들어, 방사성으로 또는 형광 마커로) 표지된다.

일부 구현예에서, 본 개시의 CAR은 VSIG2(예를 들어, VSIG2 단백질, VSIG2-유래 항원, 또는 VSIG2-유래 에피토프)에 결합하는 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 외 항원-결합 도메인은 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 외 항원-결합 도메인은 가교될 수 있는 Fab 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 외 결합 도메인은 F(ab)₂ 단편이다_.

세포 외 항원-결합 도메인

본 개시의 CAR의 세포외 항원 결합 도메인은 VSIG2(예를 들어, VSIG2 단백질, VSIG2-유래 항원, 또는 VSIG2-유래 에피토프)에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 세포외 항원 결합 도메인은 상피 세포 상에 발현된 VSIG2에 결합한다. 특정 구현예에서, 세포외 항원 결합 도메인은 건강한 상피 세포와 같이 일반적으로 건강한 것으로 간주되는 세포 상에 발현된 VSIG2에 결합한다. 일부 구현예에서, VSIG2는 인간 VSIG2이다.

본 개시의 항원-결합 도메인은, 제한 없이, 단클론 항체, 다클론 항체, 재조합 항체, 이중특이적 항체, 접합된 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 및 단일-도메인 항체(sdAb), 예컨대 낙타과 유래 나노바디의 중쇄 가변 도메인(VH), 경쇄 가변 도메인(VL) 및 가변 도메인(VHH)을 포함하나 이에 제한되지 않는 이의 기능적 단편을 포함하는 항원 및 항원-결합 도메인으로 기능하는 것으로 당업계에 공지된 대안적인 스캐폴드에 결합하는 임의의 도메인, 예컨대, 재조합 피브로넥틴 도메인, T 세포 수용체(TCR), 친화도 향상된 재조합 TCR, 또는 이의 단편, 예를 들어, 단일 사슬 TCR 등을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 항원 결합 도메인은 CAR이 궁극적으로 사용될 동일한 종으로부터 유래되는 것이 유리하다.

일부 구현예에서, 세포외 항원 결합 도메인은 항체를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 인간 항체이다. 특정 구현예에서, 항체는 키메라 항체이다. 일부 실시예에서, 세포 외 항원-결합 도메인은 항체의 항원-결합 단편을 포함한다.

일부 실시예에서, 세포 외 항원-결합 도메인은 F(ab) 단편을 포함한다. 특정 실시예에서, 세포 외 항원-결합 도메인은 F(ab') 단편을 포함한다.

일부 구현예에서, 세포외 항원 결합 도메인은 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 항원 결합 도메인은 2개의 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함한다. 일부 실시예에서, 2개의 scFv 각각은 동일한 항원 상에서 별개의 에피토프에 결합한다. 일부 실시예에서, 세포 외 항원-결합 도메인은 제1 scFv 및 제2 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 scFv 및 제2 scFv는 동일한 항원 상에서 별개의 에피토프에 결합한다. 특정 구현예에서, scFv는 포유류 scFv이다. 특정 구현예에서, scFv는 키메라 scFv이다. 특정 구현예에서, scFv는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다.

일부 구현예에서, scFv는 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 scFv를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 75의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 scFv를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 76의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 scFv를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 77의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 scFv를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 78의 핵산 서열을 포함한다 일부 구현예에서, 본 개시의 scFv를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 79의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 scFv를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 80의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 scFv를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 81의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 scFv를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 82의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 scFv를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 83의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 scFv를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 84의 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, VH 및 VL은 펩티드 링커에 의해 분리된다. 특정 구현예에서, 펩티드 링커는 표 1에 나타낸 임의의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, scFv는 구조 VH-L-VL 또는 VL-L-VH를 포함하며, 여기서 VH는 중쇄 가변 도메인이고, L은 펩티드 링커이며, VL은 경쇄 가변 도메인이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 scFv 각각은 구조 VH-L-VL 또는 VL-L-VH를 포함하며, 여기서 VH는 중쇄 가변 도메인이고, L은 펩티드 링커이며, VL은 경쇄 가변 도메인이다. 2개 이상의 scFv가 함께 연결되어 있는 경우, 각각의 scFv는 펩티드 결합으로 다음 scFv에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 scFv 각각은 펩티드 링커에 의해 분리된다.

펩티드 링커
링커	아미노산 서열	서열번호
(G2S)₁ 링커	GGS	19
(G2S)₂ 링커	GGSGGS	20
(G₂S)₃ 링커	GGSGGSGGS	21
(G₂S)₄ 링커	GGSGGSGGSGGS	22
(G₂S)₅ 링커	GGSGGSGGSGGSGGS	23
(G₃S)₁ 링커	GGGS	24
(G₃S)₂ 링커	GGGSGGGS	25
(G₃S)₃ 링커	GGGSGGGSGGGS	26
(G₃S)₄ 링커	GGGSGGGSGGGSGGGS	27
(G₃S)₅ 링커	GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS	28
(G₄S)₁ 링커	GGGGS	29
(G₄S)₂ 링커	GGGGSGGGGS	30
(G₄S)₃ 링커	GGGGSGGGGSGGGGS	31
(G₄S)₄ 링커	GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS	32
(G₄S)₅ 링커	GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS	33
Whitlow 링커	GSTSGSGKPGSGEGSTKG	34
(EAAAK)4 링커 2	EAAAKEAAAKEAAAKEAAAK	35

일부 구현예에서, 본 개시는 제1 CAR 및 제2 CAR을 제공한다. 제1 CAR의 항원 결합 도메인 및 제2 CAR의 항원 결합 도메인은 본원에 기재되거나 또는 당 기술분야에 알려진 적절한 항원 결합 도메인일 수 있다. 예를 들어, 제1 또는 제2 항원 결합 도메인은 하나 이상의 항체, 항체의 항원-결합 단편, F(ab) 단편, F(ab') 단편, 단쇄 가변 단편(scFv), 또는 단일-도메인 항체(sdAb)일 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 CAR 및/또는 제2 CAR의 항원-결합 도메인은 2개의 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함한다. 일부 구현예에서, 2개의 scFv 각각은 동일한 항원 상에서 별개의 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, 제1 CAR의 항원 결합 도메인은 VSIG2에 대해 특이적일 수 있고, 제2 CAR의 항원 결합 도메인은 구분되는 제2 항원, 예컨대, 암 항원(예를 들어, 결장암 세포와 같은 종양 세포에서 발현된 항원)에 대해 특이적일 수 있다.

일부 구현예에서, 세포 외 항원-결합 도메인은 단일-도메인 항체(sdAb)를 포함한다. 특정 구현예에서, sdAb는 인간화 sdAb이다. 특정 구현예에서, sdAb는 키메라 sdAb이다.

일부 구현예에서, 본 개시의 CAR은 2개 이상의 항원-결합 도메인, 3개 이상의 항원-결합 도메인, 4개 이상의 항원-결합 도메인, 5개 이상의 항원-결합 도메인, 6 개 이상의 항원-결합 도메인, 7 개 이상의 항원-결합 도메인, 8 개 이상의 항원-결합 도메인, 9 개 이상의 항원-결합 도메인, 또는 10 개 이상의 항원-결합 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 항원-결합 도메인 각각은 동일한 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 항원-결합 도메인 각각은 동일한 항원의 상이한 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 항원 결합 도메인 각각은 상이한 항원에 결합한다.

일부 구현예에서, CAR은 2개의 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, 2개의 항원-결합 도메인은 가요성 링커를 통해 또 다른 것에 부착된다. 일부 구현예에서, 2개의 항원-결합 도메인 각각은 항체, 항체의 항원-결합 단편, scFv, sdAb, 재조합 피브로넥틴 도메인, T 세포 수용체(TCR), 친화도 향상된 재조합 TCR, 및 단쇄 TCR로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 2개의 항원-결합 도메인을 포함하는 CAR은 이중특이적 CAR 또는 탠덤 CAR(tanCAR)이다.

특정 구현예에서, 이중특이적 CAR 또는 tanCAR은 이중특이적 항체 또는 항체 단편(예를 들어, scFv)을 포함하는 항원-결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체 분자의 각각의 항체 또는 항체 단편(예를 들어, scFv) 내에서, VH는 VL의 상류 또는 하류일 수 있다. 일부 구현예에서, 상류 항체 또는 항체 단편(예를 들어, scFv)은 이의 VL(VL₁)의 상류에 이의 VH(VH₁)와 함께 배열되고 하류 항체 또는 항체 단편(예를 들어, scFv)은 이의 VH(VH₂)의 상류에 이의 VL(VL₂)과 함께 배열되어, 전체 이중특이적 항체 분자가 VH₁-VL₁-VL₂-VH₂의 배열을 갖도록 한다. 다른 구현예에서, 상류 항체 또는 항체 단편(예를 들어, scFv)은 이의 VH(VH₁)의 상류에 이의 VL(VL₁)과 함께 배열되고 하류 항체 또는 항체 단편(예를 들어, scFv)은 이의 VL(VL₂)의 상류에 이의 VH(VH₂)와 함께 배열되어, 전체 이중특이적 항체 분자가 VL₁ VH₁-VH₂-VL₂의 배열을 갖도록 한다. 일부 구현예에서, 링커는 2개의 항체 또는 항체 단편(예를 들어, scFv) 사이, 예를 들어, 작제물이 VH₁-VL₁-VL₂-VH₂로 배열되는 경우 VL₁ 및 VL₂ 사이 또는 작제물이 VL₁-VH₁-VH₂-VL₂로 배열되는 경우 VH₁ 및 VH₂ 사이에 배치된다. 링커는 본원에 기재된 바와 같은 링커, 예를 들어, (Gly₄-Ser)n 링커일 수 있으며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이다. 일반적으로, 2개의 scFv 사이의 링커는 2개의 scFv의 도메인 사이에 쌍형성 오류를 피하기 위해 충분히 길어야 한다. 일부 구현예에서, 링커는 제1 scFv의 VL과 VH 사이에 배치된다. 일부 구현예에서, 링커는 제2 scFv의 VL과 VH 사이에 배치된다. 다중 링커를 갖는 작제물에서, 링커 중 임의의 2개 이상은 동일하거나 상이할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 이중특이적 CAR 또는 tanCAR은 VL, VH를 포함하고, 본원에 기재된 바와 같은 배열에 하나 이상의 링커를 추가로 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시의 키메라 수용체는 2가 CAR을 포함한다. 일부 구현예에서, 2가 CAR은 VSIG2 2가 CAR이다. 일부 구현예에서, 2가 VSIG2 CAR은 표 A에 나타낸 항-VSIG2 서열 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 2가 VSIG2 CAR의 ABD는 각각 동일한 ABD를 포함한다.

일부 구현예에서, 키메라 수용체는 이중시스트론 키메라 항원 수용체를 포함한다. 일부 구현예에서, 이중시스트론 키메라 항원 수용체는 VSIG2 CAR을 포함한다. 일부 구현예에서, 이중시스트론 VSIG2 CAR은 표 A에 나타낸 항-VSIG2 서열 중 하나 이상을 포함한다.

막관통 도메인

일부 구현예에서, 본 개시의 CAR(예를 들어, 본원에 기재된 VSIG2-특이적 CAR)의 막관통 도메인은 세포막의 적어도 일부에 걸친 소수성 알파 나선을 포함한다. 상이한 막관통 도메인은 상이한 수용체 안정성을 초래할 수 있는 것으로 나타났다. 항원 인식 후, 수용체는 클러스터링되고 신호는 세포로 전송된다. 일부 구현예에서, 본 개시의 CAR의 막관통 도메인은 CD8 폴리펩티드, CD28 폴리펩티드, CD3-제타 폴리펩티드, CD4 폴리펩티드, 4-1BB 폴리펩티드, OX40 폴리펩티드, ICOS 폴리펩티드, CTLA-4 폴리펩티드, PD-1 폴리펩티드, LAG-3 폴리펩티드, 2B4 폴리펩티드, BTLA 폴리펩티드, LIR-1(LILRB1) 폴리펩티드의 막관통 도메인을 포함할 수 있거나, 합성 펩티드, 또는 이의 임의의 조합일 수 있다.

일부 구현예에서, 막관통 도메인은 CD8 폴리펩티드로부터 유래된다. 임의의 적합한 CD8 폴리펩티드가 사용될 수 있다. 예시적인 CD8 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 NP_001139345 및 AAA92533.1을 포함하나 이에 제한되지 않는다. CD8 막관통 도메인의 예는 IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(서열번호 36), IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHR(서열번호 37), 및 IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN(서열번호 38)을 포함한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 서열 IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(서열번호 36)를 포함한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 서열 IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHR(서열번호 37)을 포함한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 서열 IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN(서열번호 38)을 포함한다.

일부 구현예에서, 막관통 도메인은 CD28 폴리펩티드로부터 유래된다. 임의의 적합한 CD28 폴리펩티드가 사용될 수 있다. 예시적인 CD28 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 NP_006130.1 및 NP_031668.3을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 CD3-제타 폴리펩티드로부터 유래된다. 임의의 적합한 CD3-제타 폴리펩티드가 사용될 수 있다. 예시적인 CD3-제타 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 NP_932170.1 및 NP_001106862.1을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 CD4 폴리펩티드로부터 유래된다. 임의의 적합한 CD4 폴리펩티드가 사용될 수 있다. 예시적인 CD4 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 NP_000607.1 및 NP_038516.1을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 4-1BB 폴리펩티드로부터 유래된다. 임의의 적합한 4-1BB 폴리펩티드가 사용될 수 있다. 예시적인 4-1BB 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 NP_001552.2 및 NP_001070977.1을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 OX40 폴리펩티드로부터 유래된다. 임의의 적합한 OX40 폴리펩티드가 사용될 수 있다. 예시적인 OX40 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 NP_003318.1 및 NP_035789.1을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 ICOS 폴리펩티드로부터 유래된다. 임의의 적합한 ICOS 폴리펩티드가 사용될 수 있다. 예시적인 ICOS 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 NP_036224 및 NP_059508을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 CTLA-4 폴리펩티드로부터 유래된다. 임의의 적합한 CTLA-4 폴리펩티드가 사용될 수 있다. 예시적인 CTLA-4 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 NP_005205.2 및 NP_033973.2를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 PD-1 폴리펩티드로부터 유래된다. 임의의 적합한 PD-1 폴리펩티드가 사용될 수 있다. 예시적인 PD-1 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 NP_005009 및 NP_032824를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 LAG-3 폴리펩티드로부터 유래된다. 임의의 적합한 LAG-3 폴리펩티드가 사용될 수 있다. 예시적인 LAG-3 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 NP_002277.4 및 NP_032505.1을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 2B4 폴리펩티드로부터 유래된다. 임의의 적합한 2B4 폴리펩티드가 사용될 수 있다. 예시적인 2B4 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 NP_057466.1 및 NP_061199.2를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 BTLA 폴리펩티드로부터 유래된다. 임의의 적합한 BTLA 폴리펩티드가 사용될 수 있다. 예시적인 BTLA 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 NP_861445.4 및 NP_001032808.2를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 임의의 적합한 LIR-1(LILRB1) 폴리펩티드가 사용될 수 있다. 예시적인 LIR-1(LILRB1) 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 NP_001075106.2 및 NP_001075107.2를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

일부 구현예에서, 막관통 도메인은 NCBI 참조 번호 NP_001139345, AAA92533.1, NP_006130.1, NP_031668.3, NP_932170.1, NP_001106862.1, NP_000607.1, NP_038516.1, NP_001552.2, NP_001070977.1, NP_003318.1, NP_035789.1, NP_036224, NP_059508, NP_005205.2, NP_033973.2, NP_005009, NP_032824, NP_002277.4, NP_032505.1, NP_057466.1, NP_061199.2, NP_861445.4, 또는 NP_001032808.2의 서열, 또는 이의 단편과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상동성은 BLAST 또는 FASTA와 같은 표준 소프트웨어를 사용하여 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 하나의 보존적 아미노산 치환, 최대 2개의 보존적 아미노산 치환, 또는 최대 3개의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 적어도 110개, 적어도 120개, 적어도 130개, 적어도 140개, 적어도 150개, 적어도 160개, 적어도 170, 적어도 180, 적어도 190개, 적어도 200개, 적어도 210개, 적어도 220개, 적어도 230개, 또는 적어도 240개 아미노산 길이인 NCBI 참조 번호 NP_001139345, AAA92533.1, NP_006130.1, NP_031668.3, NP_932170.1, NP_001106862.1, NP_000607.1, NP_038516.1, NP_001552.2, NP_001070977.1, NP_003318.1, NP_035789.1, NP_036224, NP_059508, NP_005205.2, NP_033973.2, NP_005009, NP_032824, NP_002277.4, NP_032505.1, NP_057466.1, NP_061199.2, NP_861445.4, 또는 NP_001032808.2의 연속 부분인 아미노산 서열을 가질 수 있다.

막관통 도메인이 유래될 수 있는 적합한 폴리펩티드의 추가의 예는 T-세포 수용체, CD27, CD3 엡실론, CD45, CD5, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, CD2, CD27, LFA-1(CD11a, CD18), GITR, CD40, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7Ra, ITGA1, VLA1 , CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKG2D, 및 NG2C의 알파, 베타 또는 제타 사슬의 막관통 영역을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

일부 구현예에서, 막관통 도메인은 CAR의 세포내 신호전달과 동일한 단백질로부터 유래된다.

스페이서 영역

일부 구현예에서, 본 개시의 CAR(예를 들어, 본원에 기재된 VSIG2-특이적 CAR)은 또한 세포외 항원 결합 도메인을 막관통 도메인에 연결하는 스페이서 영역을 포함할 수 있다. 스페이서 영역은 항원-결합 도메인이 항원 인식을 용이하게 하기 위해 상이한 방향으로 배향되게 하기에 충분히 가요성일 수 있다. 일부 구현예에서, 스페이서 영역은 인간 단백질로부터의 힌지일 수 있다. 예를 들어, 힌지는, 제한 없이, IgG4 힌지, IgG2 힌지, CD8a 힌지, 또는 IgD 힌지를 포함하는 인간 Ig(면역글로불린) 힌지일 수 있다. 일부 구현예에서, 스페이서 영역은 IgG4 힌지, IgG2 힌지, IgD 힌지, CD28 힌지, KIR2DS2 힌지, LNGFR 힌지, 또는 PDGFR-베타 세포외 링커를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 스페이서 영역은 항원 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 위치한다. 일부 구현예에서, 스페이서 영역은 표 2에 열거된 임의의 아미노산 서열 또는 표 2에 열거된 임의의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

스페이서 아미노산 서열
아미노산 서열	서열번호	설명
TTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD	39	CD8 힌지
AAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP	40	CD28 힌지
ESKYGPPCPSCP	41	IgG4 최소 힌지
ESKYGPPAPSAP	42	IgG4 최소 힌지, 이황화 없음
ESKYGPPCPPCP	43	IgG4 S228P 최소 힌지, 향상된 이황화 형성
EPKSCDKTHTCP	44	IgG1 최소 힌지
AAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN	45	연장된 CD8a 힌지
ACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEADAEC	46	LNGFR 힌지
ACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVC	47	절단된 LNGFR 힌지(TNFR-Cys1)
AVGQDTQEVIVVPHSLPFKV	48	PDGFR-베타 세포 외 링커

일부 구현예에서, 스페이서 영역은 서열번호 39에 나타낸 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서 영역은 서열번호 40에 나타낸 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서 영역은 서열번호 41에 나타낸 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서 영역은 서열번호 42에 나타낸 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서 영역은 서열번호 43에 나타낸 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서 영역은 서열번호 44에 나타낸 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서 영역은 서열번호 45에 나타낸 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서 영역은 서열번호 46에 나타낸 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서 영역은 서열번호 47에 나타낸 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서 영역은 서열번호 48에 나타낸 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 스페이서 영역은 서열 TTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(서열번호 49)를 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서 영역은 서열 ALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(서열번호 50)을 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서 영역은 서열 FVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(서열번호 51)를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 임의의 스페이서 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 표 3에 열거된 임의의 핵산 서열 또는 표 3에 열거된 임의의 핵산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 핵산 서열을 포함할 수 있다.

스페이서 핵산 서열
핵산 서열	서열번호	설명
ACCACAACTCCTGCTCCTAGACCTCCTACACCAGCTCCTACAATCGCCCTGCAGCCACTGTCTCTGAGGCCAGAAGCTTGTAGACCTGCTGCAGGCGGAGCCGTGCATACAAGAGGACTGGATTTCGCCTGCGAC	52	CD8 힌지
GCAGCAGCTATCGAGGTGATGTATCCTCCGCCCTACCTGGATAATGAAAAGAGTAATGGGACTATCATTCATGTAAAAGGGAAGCATCTTTGTCCTTCTCCCCTTTTCCCCGGTCCGTCTAAACCT	53	CD28 힌지
GAAAGCAAGTACGGTCCACCTTGCCCTAGCTGTCCG	54	IgG4 최소 힌지
GAATCCAAGTACGGCCCCCCAGCGCCTAGTGCCCCA	55	IgG4 최소 힌지, 이황화 없음
GAATCTAAATATGGCCCGCCATGCCCGCCTTGCCCA	56	IgG4 S228P 최소 힌지, 향상된 이황화 형성
GAACCGAAGTCTTGTGATAAAACTCATACGTGCCCG	57	IgG1 최소 힌지
GCTGCTGCTTTCGTACCCGTGTTCCTCCCTGCTAAGCCTACGACTACCCCCGCACCGAGACCACCCACGCCAGCACCCACGATTGCTAGCCAGCCCCTTAGTTTGCGACCAGAAGCTTGTCGGCCTGCTGCTGGTGGCGCGGTACATACCCGCGGCCTTGATTTTGCTTGCGATATATATATCTGGGCGCCTCTGGCCGGAACATGCGGGGTCCTCCTCCTTTCTCTGGTTATTACTCTCTACTGTAATCACAGGAAT	58	연장된 CD8a 힌지
GCCTGCCCGACCGGGCTCTACACTCATAGCGGGGAATGTTGTAAGGCATGTAACTTGGGTGAGGGCGTCGCACAGCCCTGCGGAGCTAACCAAACAGTGTGCGAACCCTGCCTCGATAGTGTGACGTTCTCTGATGTTGTATCAGCTACAGAGCCTTGCAAACCATGTACTGAGTGCGTTGGACTTCAGTCAATGAGCGCTCCATGTGTGGAGGCAGATGATGCGGTCTGTCGATGTGCTTACGGATACTACCAAGACGAGACAACAGGGCGGTGCGAGGCCTGTAGAGTTTGTGAGGCGGGCTCCGGGCTGGTGTTTTCATGTCAAGACAAGCAAAATACGGTCTGTGAAGAGTGCCCTGATGGCACCTACTCAGACGAAGCAGATGCAGAATGC	59	LNGFR 힌지
GCCTGCCCTACAGGACTCTACACGCATAGCGGTGAGTGTTGTAAAGCATGCAACCTCGGGGAAGGTGTAGCCCAGCCATGCGGGGCTAACCAAACCGTTTGC	60	절단된 LNGFR 힌지(TNFR-Cys1)
GCTGTGGGCCAGGACACGCAGGAGGTCATCGTGGTGCCACACTCCTTGCCCTTTAAGGTG	61	PDGFR-베타 세포 외 링커

일부 구현예에서, 본 개시의 CAR은 2개의 아미노산 잔기 내지 10개의 아미노산 잔기 길이이고, CAR의 막관통 도메인과 세포질 영역 사이에 연결을 형성할 수 있는 짧은 올리고펩티드 또는 폴리펩티드 링커를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 링커의 비제한적인 예는 글리신-세린 이중항이다. 일부 구현예에서, 링커는 GGCKJSGGCKJS(서열번호 62)의 아미노산 서열을 포함한다.

세포내 신호전달 도메인

일부 구현예에서, 본 개시의 CAR(예를 들어, 본원에 기재된 VSIG2-특이적 CAR)은 하나 이상의 세포질 도메인 또는 영역을 포함한다. CAR의 세포질 도메인 또는 영역은 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다.

본 개시의 CAR에 사용될 수 있는 적합한 세포내 신호전달 도메인의 예는, 제한 없이, 항원 수용체 결합 후 신호 전달을 조정하기 위해 협력하여 작용하는 T 세포 수용체(TCR) 및 공동 수용체의 세포질 서열, 뿐만 아니라 이러한 서열의 임의의 유도체 또는 변이체 및 동일한 기능적 능력을 갖는 임의의 재조합 서열을 포함한다.

이론에 얽매이지 않길 바라면서, TCR 단독을 통해 수득된 신호는 T 세포의 전체 활성화에 충분하지 않고, 따라서 2차 및/또는 공동 자극 신호도 전체 활성화에 필요한 것으로 통상적으로 여겨진다. 따라서, T 세포 활성화는 TCR(1차 세포내 신호전달 도메인)을 통해 항원-의존적 1차 활성화를 개시하고 2차 또는 공동 자극 신호(2차 세포질 도메인, 예를 들어, 공동 자극 도메인)를 제공하기 위해 항원-독립적 방식으로 작용하는, 2가지 별개 부류의 세포질 신호전달 서열에 의해 매개될 수 있다. 또한, T 세포 신호전달 및 기능(예를 들어, 활성화 신호 전달 캐스케이드)은 세포내 억제 공동 신호전달 도메인을 통해 T 세포에 존재하는 억제 수용체에 의해 음성으로 조절될 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시의 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 억제성 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 억제 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 세포내 억제 공동 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 세포내 억제 공동 신호전달 도메인은 펩티드 링커(예를 들어, 표 1) 또는 스페이서 또는 힌지 서열(예를 들어, 표 2 참조)을 통해 다른 도메인(예를 들어, 막관통 도메인)에 연결된다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 세포내 억제 공동 신호전달 도메인이 존재할 때, 2개 이상의 세포내 억제 공동 신호전달 도메인은 펩티드 링커(예를 들어, 표 1 참조) 또는 스페이서 또는 힌지 서열(예를 들어, 표 2 참조)을 통해 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포내 억제 공동 신호전달 도메인은 억제 도메인이다. 일부 구현예에서, 키메라 단백질의 하나 이상의 세포내 억제 공동 신호전달 도메인은 하나 이상의 ITIM-함유 단백질, 또는 이의 단편(들)을 포함한다. ITIM은 많은 억제 면역 수용체의 세포질 꼬리에서 발견되는 보존된 아미노산 서열이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 ITIM-함유 단백질, 또는 이의 단편은 PD-1, CTLA4, TIGIT, BTLA, LAIR1, KIR2DL1, KIR3DL1, LIR1, SIGLEC2, 및 SIRP알파(SIRPa)로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 세포내 억제 공동 신호전달 도메인은 하나 이상의 비-ITIM 스캐폴드 단백질, 또는 이의 단편(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 비-ITIM 스캐폴드 단백질, 또는 이의 단편은 GRB-2, Dok-1, Dok-2, SLAP, LAG3, HAVR, GITR, 및 PD-L1으로부터 선택된다. 억제 세포내 신호전달 도메인은 효소 억제 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 효소 억제 도메인은 효소 촉매 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 효소 촉매 도메인은 CSK, SHP-1, PTEN, CD45, CD148, PTP-MEG1, PTP-PEST, c-CBL, CBL-b, PTPN22, LAR, PTPH1, SHIP-1, 또는 RasGAP를 포함하나 이에 한정되지 않는 효소로부터 유래된다. 신호전달의 효소 조절의 예는 Pavel Otαhal 등의 문헌 [Biochim Biophys Acta. 2011 Feb;1813(2):367-76], Kosugi A. 등의 문헌 [Involvement of SHP-1 tyrosine phosphatase in TCR-mediated signaling pathways in lipid rafts, Immunity, 2001 Jun; 14(6): 669-80], 및 Stanford, 등의 문헌 [Regulation of TCR signaling by tyrosine phosphatases: from immune homeostasis to autoimmunity, Immunology, 2012 Sep; 137(1): 1-19]에 더욱 상세히 기술되어 있고, 이들 각각은 사실상 참조로서 본원에 통합된다.

일부 구현예에서, 본 개시의 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 자극 방식, 또는 억제 방식으로 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절하는 1차 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)로 알려져 있는 신호전달 모티프를 함유할 수 있다. 본 개시내용의 CAR에 사용될 수 있는 적합한 ITAM-함유 1차 세포 내 신호전달 도메인의 예는 CD3-제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278("ICOS"로도 알려져 있음), FceRI, DAP10, DAP12, 및 CD66d의 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

일부 구현예에서, 본 개시의 CAR(예를 들어, 본원에 기재된 VSIG2-특이적 CAR)은 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어, CD3-제타 폴리펩티드의 1차 신호전달 도메인을 포함한다. 본 개시내용의 CD3-제타 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 NP_932170 또는 NP_001106864.2의 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 상동성인 아미노산 서열, 또는 이의 단편을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, CD3-제타 폴리펩티드는 하나의 보존적 아미노산 치환, 최대 2개의 보존적 아미노산 치환, 또는 최대 3개의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 적어도 20 개, 적어도 30 개, 적어도 40 개, 적어도 50 개, 적어도 60 개, 적어도 70 개, 적어도 80 개, 적어도 90 개, 적어도 100 개, 적어도 110 개, 적어도 120 개, 적어도 130 개, 적어도 140 개, 적어도 150 개, 또는 적어도 160 개, 적어도 170 개, 또는 적어도 180 개 아미노산 길이인 NCBI 참조 번호 NP_932170 또는 NP_001106864.2의 연속 부분인 아미노산 서열을 가질 수 있다.

다른 구현예에서, 1차 신호전달 도메인은 변형된 ITAM 도메인, 예를 들어, 천연 ITAM 도메인과 비교하여 활성이 변경된(예를 들어, 증가된 또는 감소된) 돌연변이된 ITAM 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 1차 신호전달 도메인은 변형된 ITAM-함유 1차 세포 내 신호전달 도메인, 예를 들어, 최적화된 및/또는 절단된 ITAM-함유 1차 세포 내 신호전달 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 1차 신호전달 도메인은 1, 2, 3, 4개 또는 그 이상의 ITAM 모티프를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시내용의 CAR의 세포 내 신호전달 도메인은 그 자체로 CD3-제타 신호전달 도메인을 포함할 수 있거나 본 개시내용의 CAR의 맥락에서 유용한 임의의 다른 원하는 세포 내 신호전달 도메인과 조합될 수 있다. 예를 들어, CAR의 세포 내 신호전달 도메인은 CD3-제타 사슬 부분 및 공동-자극 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 공동-자극 신호전달 도메인은 공동-자극 분자의 세포 내 도메인을 포함하는 CAR의 일부를 지칭할 수 있다. 본 개시의 공동 자극 분자는 항원에 대한 림프구의 효율적인 반응에 필요할 수 있는 항원 수용체 또는 이의 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 적합한 공동 자극 분자의 예는, 제한 없이, CD97, CD2, ICOS, CD27, CD154, CD8, OX40, 4-1BB, CD28, ZAP40, CD30, GITR, HVEM, DAP10, DAP12, MyD88, 2B4, CD40, PD-1, 림프구 기능-연관 항원-1(LFA-1), CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, MHC 클래스 I 분자, TNF 수용체 단백질, 면역글로불린-유사 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, 신호 전달 림프구 활성화 분자(SLAM 단백질), 활성화 NK 세포 수용체, BTLA, Toll 리간드 수용체, CDS, ICAM-1, (CD11a/CD18), BAFFR, KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLAl, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, NKG2D, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(촉각), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a 등을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 CAR의 세포질 부분 내에서 세포내 신호전달 서열은 무작위 또는 명시된 순서로 서로 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 짧은 올리고펩티드 또는 폴리펩티드 링커, 예를 들어, 길이가 2개의 아미노산 내지 10개의 아미노산(예를 들어, 2개의 아미노산, 3개의 아미노산, 4개의 아미노산, 5개의 아미노산, 6개의 아미노산, 7개의 아미노산, 8개의 아미노산, 9개의 아미노산, 또는 10개의 아미노산)은 세포 내 신호전달 서열 사이에 연결을 형성할 수 있다. 일 구현예에서, 글리신-세린 이중항이 적합한 링커로 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 단일 아미노산, 예를 들어, 알라닌 또는 글리신이 적합한 링커로 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 2개 이상의 공동 자극 신호전달 도메인, 예를 들어, 2개의 공동 자극 신호전달 도메인, 3개의 공동 자극 신호전달 도메인, 4개의 공동 자극 신호전달 도메인, 5개의 공동 자극 신호전달 도메인, 6개의 공동 자극 신호전달 도메인, 7개의 공동 자극 신호전달 도메인, 8개의 공동 자극 신호전달 도메인, 9개의 공동 자극 신호전달 도메인, 10개의 공동 자극 신호전달 도메인, 또는 그 이상의 공동 자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 2개의 공동 자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 공동 자극 신호전달 도메인은 본 개시의 링커(예를 들어, 표 1에 기재된 임의의 링커)에 의해 분리된다. 일 구현예에서, 링커는 글리신 잔기이다. 또 다른 구현예에서, 링커는 알라닌 잔기이다.

일부 구현예에서, 본 개시의 세포는 본 개시의 VSIG2에 결합하는 항원 결합 도메인, 본 개시의 막관통 도메인, 1차 신호전달 도메인, 및 하나 이상의 공동 자극 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 발현한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 세포는 VSIG2에 결합하는 항원 결합 도메인(예를 들어, 표 A에 열거된 아미노산 서열 중 하나 이상을 갖는 VSIG2-특이적 항원 결합 도메인), 본 개시의 막관통 도메인, 및 하나 이상의 세포내 억제 공동 신호전달 도메인을 포함하는 iCAR을 발현한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 세포는 (1) VSIG2에 결합하는 항원 결합 도메인(예를 들어, 표 A에 열거된 아미노산 서열 중 하나 이상을 갖는 VSIG2-특이적 항원 결합 도메인), 본 개시의 막관통 도메인, 일차 신호전달 도메인, 및 하나 이상의 공동 자극 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 발현한다.

자연 살해 세포 수용체(NKR) CAR

일부 구현예에서, 본 개시의 CAR(예를 들어, 본원에 기재된 VSIG2-특이적 CAR)은 자연 살해 세포 수용체(NKR)의 하나 이상의 구성요소를 포함하여, NKR-CAR을 형성한다. NKR 구성요소는, 제한 없이, 살해 세포 면역글로불린-유사 수용체(KIR), 예컨대 KIR2DL1, KIR2DL2/L3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, DIR2DS5, KIR3DL1/S1, KIR3DL2, KIR3DL3, KIR2DP1, 및 KIRS DPI; 자연 세포독성 수용체(NCR), 예컨대 NKp30, NKp44, NKp46; 면역 세포 수용체의 신호전달 림프구 활성화 분자(SLAM) 패밀리, 예컨대 CD48, CD229, 2B4, CD84, NTB-A, CRACC, BLAME, 및 CD2F-10; Fc 수용체(FcR), 예컨대 CD16, 및 CD64; 및 Ly49 수용체, 예컨대 LY49A 및 LY49C를 포함하는 임의의 적합한 자연 살해 세포 수용체로부터의 막관통 도메인, 힌지 도메인, 또는 세포질 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, NKR-CAR은 어댑터 분자 또는 세포내 신호전달 도메인, 예컨대 DAP12와 상호작용할 수 있다. NKR 구성요소를 포함하는 CAR의 예시적인 구성 및 서열은 2014년 9월 18일 공개된 국제 특허 공개 WO2014/145252에 기재되어 있다.

추가적인 키메라 수용체 표적

본 개시의 특정 양태는 VSIG2에 더하여 관심 항원에 결합하는 키메라 수용체 및 이러한 키메라 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 개시의 특정 양태는 VSIG2에 더하여 관심 항원에 결합하는 키메라 수용체 및 세포, 예컨대 이러한 키메라 수용체 중 하나 이상을 발현하도록 유전적으로 변형된 면역반응성 세포, 및 악성 암종, 예컨대, 고형 종양, 및 항원-특이적 면역 반응이 요구되는 다른 병리를 치료 및/또는 예방하기 위한 이러한 수용체 및 세포의 사용 방법에 관한 것이다. 악성 세포는 면역 인식 및 제거로부터 스스로를 보호하는 일련의 메커니즘을 개발하였다. 본 개시내용은 이러한 악성 세포를 치료하기 위한 종양 미세환경 내에서 면역원성을 제공한다.

일부 구현예에서, 제1 키메라 수용체는 VSIG2에 결합하는 항원 결합 도메인(예를 들어, 표 A에 열거된 아미노산 서열 중 하나 이상을 갖는 VSIG2-특이적 항원 결합 도메인)을 포함하고, 제2 키메라 수용체는 종양 관련 항원(예를 들어, 결장암 관련 항원)과 같은 제2 항원에 결합하는 추가 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 VSIG2에 특이적인 제1 키메라 수용체(예를 들어, 표 A에 열거된 아미노산 서열 중 하나 이상을 갖는 VSIG2-특이적 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR) 및, 종양 관련 항원(예를 들어, 결장암 관련 항원)과 같은 제2 항원에 특이적인 제2 키메라 수용체를 발현할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 VSIG2에 특이적인 제1 억제 키메라 수용체(예를 들어, 표 A에 열거된 아미노산 서열 중 하나 이상을 갖는 VSIG2-특이적 항원 결합 도메인을 포함하는 억제 CAR) 및, 종양 관련 항원(예를 들어, 결장암 관련 항원)과 같은 제2 항원에 특이적인 제2 키메라 수용체를 발현할 수 있다. 예를 들어, 세포(예를 들어, 면역반응성 세포)는 VSIG2에 결합하는 항원 결합 도메인(예를 들어, 표 A에 열거된 아미노산 서열 중 하나 이상을 갖는 VSIG2-특이적 항원 결합 도메인)을 포함하는 iCAR 및 종양 관련 항원(예를 들어, 결장암 관련 항원)을 표적으로 하는 aCAR을 공동 발현하거나 공동 발현할 수 있도록 조작될 수 있다. VSIG2에 추가하여 항원에 결합하는 적절한 항체는, 천연 또는 합성, 전장 또는 이의 단편, 단클론 또는 다클론이든, 종양 관련 항원(예를 들어, 결장암 관련 항원)과 같은 제2 항원에 충분히 강력하게 특이적으로 결합하는 임의의 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 상업적으로 이용 가능한 항체는 제2 항원, 예컨대 종양 관련 항원(예를 들어, 결장암 관련 항원)에 결합하기 위해 사용될 수 있다. 상업적으로 이용가능한 항체의 CDR은 통상적인 서열분석 기술을 사용하여 당 기술분야의 숙련자에 의해 용이하게 접근가능하다. 또한, 당 기술분야의 숙련자는 이러한 상업적으로 이용가능한 항체의 CDR에 기초하여 scFv 및 키메라 수용체(예를 들어, CAR 및 TCR)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 구축할 수 있다.

T 세포 수용체(TCR)

본 개시의 특정 양태는 제2 항원, 예컨대 종양 관련 항원(예를 들어, 결장암 관련 항원)에 특이적으로 결합하는 키메라 수용체에 관한 것으로, 제2 항원에 대한 키메라 수용체는 조작된 T 세포 수용체(TCR)이다. 본 개시내용의 TCR은 비변이 CD3 사슬 분자와의 복합체의 일부로서 발현되는 2개의 가변 사슬을 함유하는 이황화-연결된 이종이량체 단백질이다. TCR은 T 세포의 표면 상에서 발견되고, 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자에 결합된 펩티드로서 항원을 인식하는 것을 담당한다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 TCR은 TRA에 의해 암호화된 알파 사슬 및 TRB에 의해 암호화된 베타 사슬을 포함한다. 특정 구현예에서, TCR은 감마 사슬 및 델타 사슬(각각 TRG 및 TRD에 의해 암호화됨)을 포함한다.

TCR의 각각의 사슬은 2개의 세포 외 도메인, 즉, 가변(V) 영역 및 불변(C) 영역으로 구성된다. 불변 영역은 세포 막에 근위에 있으며, 막횡단 영역 및 짧은 세포질 꼬리가 이어진다. 가변 영역은 펩티드/MHC 복합체에 결합한다. 가변 영역 각각은 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는다.

특정 구현예에서, TCR은 3개의 이량체성 신호전달 모듈 CD3d/e, CD3g/e, 및 CD247ζ/ζ 또는 CD247ζ/η와 함께 수용체 복합체를 형성할 수 있다. TCR 복합체가 이의 항원 및 MHC(펩티드/MHC)와 결합하는 경우, TCR 복합체를 발현하는 T 세포가 활성화된다.

일부 구현예에서, 본 개시내용의 TCR은 재조합 TCR이다. 특정 구현예에서, TCR은 비-천연 발생 TCR이다. 특정 구현예에서, TCR은 적어도 하나의 아미노산 잔기에 의해 천연 발생 TCR과 상이하다. 일부 구현예에서, TCR은 적어도 2 아미노산 잔기, 적어도 3 아미노산 잔기, 적어도 4 아미노산 잔기, 적어도 5 아미노산 잔기, 적어도 6 아미노산 잔기, 적어도 7 아미노산 잔기, 적어도 8 아미노산 잔기, 적어도 9 아미노산 잔기, 적어도 10 아미노산 잔기, 적어도 11 아미노산 잔기, 적어도 12 아미노산 잔기, 적어도 13 아미노산 잔기, 적어도 14 아미노산 잔기, 적어도 15 아미노산 잔기, 적어도 20 아미노산 잔기, 적어도 25 아미노산 잔기, 적어도 30 아미노산 잔기, 적어도 40 아미노산 잔기, 적어도 50 아미노산 잔기, 적어도 60 아미노산 잔기, 적어도 70 아미노산 잔기, 적어도 80 아미노산 잔기, 적어도 90 아미노산 잔기, 적어도 100 아미노산 잔기, 또는 그 이상의 아미노산 잔기에 의해 천연 발생 TCR과 상이하다. 특정 구현예에서, TCR은 적어도 하나의 아미노산 잔기에 의해 천연 발생 TCR로부터 변형된다. 일부 구현예에서, TCR은 적어도 2 아미노산 잔기, 적어도 3 아미노산 잔기, 적어도 4 아미노산 잔기, 적어도 5 아미노산 잔기, 적어도 6 아미노산 잔기, 적어도 7 아미노산 잔기, 적어도 8 아미노산 잔기, 적어도 9 아미노산 잔기, 적어도 10 아미노산 잔기, 적어도 11 아미노산 잔기, 적어도 12 아미노산 잔기, 적어도 13 아미노산 잔기, 적어도 14 아미노산 잔기, 적어도 15 아미노산 잔기, 적어도 20 아미노산 잔기, 적어도 25 아미노산 잔기, 적어도 30 아미노산 잔기, 적어도 40 아미노산 잔기, 적어도 50 아미노산 잔기, 적어도 60 아미노산 잔기, 적어도 70 아미노산 잔기, 적어도 80 아미노산 잔기, 적어도 90 아미노산 잔기, 적어도 100 아미노산 잔기, 또는 그 이상의 아미노산 잔기에 의해 천연 발생 TCR로부터 변형된다.

키메라 TCR

일부 구현예에서, 본 개시의 TCR은 TCR 사슬, 예를 들어 TCR 알파 사슬 또는 TCR 베타 사슬의 하나 이상의 불변 도메인에 이식되어, 제2 관심 항원, 예컨대, 종양 관련 항원(예를 들어, 결장암 관련 항원)에 특이적으로 결합하는 키메라 TCR을 생성할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함한다. 이론에 얽매이지 않고, 키메라 TCR은 항원 결합 시 TCR 복합체를 통해 신호를 전달할 수 있는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 항체 또는 항체 단편(예를 들어, scFv)은 TCR 사슬, 예컨대 TCR 알파 사슬 및/또는 TCR 베타 사슬의 불변 도메인, 예를 들어, 세포 외 불변 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 도메인의 적어도 일부에 이식될 수 있다. 또 다른 예로서, 항체 또는 항체 단편의 CDR은 TCR 알파 사슬 및/또는 베타 사슬에 이식되어 제2 항원, 예컨대, 종양 관련 항원(예를 들어, 결장암 관련 항원)에 특이적으로 결합하는 키메라 TCR을 생성할 수 있다. 이러한 키메라 TCR은 당업계에 알려진 방법에 의해 생성될 수 있다(예를 들어, Willemsen RA 등의 문헌[Gene Therapy 2000; 7:1369-1377]; Zhang T 등의 문헌[Cancer Gene Ther 2004 11: 487-496]; 및 Aggen 등의 문헌[Gene Ther. 2012 Apr; 19(4): 365-74]).

면역반응성 세포

본 개시의 특정 양태는 본 개시의 하나 이상의 키메라 수용체 또는 이러한 키메라 수용체를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 유전적으로 조작된 면역반응성 세포와 같은 세포, 및 고형 종양(예를 들어, 결장암)을 치료하기 위한 이러한 세포의 사용 방법에 관한 것이다.

일부 구현예에서, 세포는 포유류 세포이다. 일부 구현예에서, 포유류 세포는 1차 세포이다. 일부 구현예에서, 포유류 세포는 세포주이다. 일부 구현예에서, 포유류 세포 골수 세포, 혈액 세포, 피부 세포, 뼈 세포, 근육 세포, 신경 세포, 지방 세포, 간 세포, 또는 심장 세포. 일부 구현예에서, 세포는 줄기 세포이다. 예시적인 줄기 세포는 배아 줄기 세포(ESC), 유도성 다능성 줄기 세포(iPSC), 성체 줄기 세포, 및 조직-특이적 줄기 세포, 예컨대 조혈 줄기 세포(혈액 줄기 세포), 중간엽 줄기 세포(MSC), 신경 줄기 세포, 상피 줄기 세포, 또는 피부 줄기 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 세포는 본 개시내용의 줄기 세포로부터 유래되거나 또는 분화된 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 면역 세포이다. 본 개시내용의 면역 세포는 본 개시내용의 줄기 세포(예를 들어, ESC 또는 iPSC)로부터 단리되거나 또는 분화될 수 있다. 예시적인 면역 세포는 T 세포(예를 들어, 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, 기억 T 세포, 조절 T 세포, 자연 살해 T 세포, 알파 베타 T 세포, 및 감마 델타 T 세포), B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 수지상 세포, 골수 세포, 대식세포, 및 단핵구를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 세포는 신경 세포이다. 본 개시내용의 신경 세포는 본 개시내용의 줄기 세포(예를 들어, ESC 또는 iPSC)로부터 단리되거나 또는 분화될 수 있다. 예시적인 신경 세포는 신경 전구 세포, 뉴런(예를 들어, 감각 뉴런, 운동 뉴런, 콜린성 뉴런, GABA성 뉴런, 글루탐산성 뉴런, 도파민성 뉴런, 또는 세로토닌성 뉴런), 성상세포, 회소돌기아교세포, 및 소교세포를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

일부 구현예에서, 세포는 면역반응성 세포이다. 본 개시내용의 면역반응성 세포는 본 개시내용의 줄기 세포(예를 들어, ESC 또는 iPSC)로부터 단리되거나 또는 분화될 수 있다. 본 개시내용의 예시적인 면역반응성 세포는 림프성 계통의 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는다. B 세포, T 세포, 및 자연 살해(NK) 세포를 포함한 림프성 계통은, 항체 생산, 세포 면역계 조절, 혈액 내 외부 제제 검출, 숙주에 이질적인 세포 검출 등을 제공한다. 림프성 계통의 면역반응성 세포의 예는 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 배아 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 및 유도성 다능성 줄기 세포(예를 들어, 림프성 세포가 유래되거나 또는 분화될 수 있는 것들)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. T 세포는 흉선에서 성숙하고 주로 세포-매개 면역을 담당하는 림프구일 수 있다. T 세포는 적응 면역계에 수반된다. 일부 구현예에서, 본 개시의 T 세포는, 제한 없이, T 헬퍼 세포, 세포독성 T 세포, 기억 T 세포(중추 기억 T 세포, 줄기 세포-유사 기억 T 세포(또는 줄기-유사 기억 T 세포 포함), 및 2 가지 유형의 효과기 기억 T 세포, 예를 들어, T_EM　세포 및 T_EMRA 세포, 조절 T 세포(억제인자 T 세포로도 알려짐), 자연 살해 T 세포, 점막 관련 비변이 T 세포, 및 γδ T 세포를 포함하는 임의의 유형의 T 세포일 수 있다. 세포독성 T 세포(CTL 또는 살해 T 세포)는 감염된 체세포 또는 종양 세포의 사멸을 유도할 수 있는 T 림프구의 하위세트이다. 환자 자신의 T 세포는 하나 이상의 키메라 수용체, 예컨대 키메라 TCR 또는 CAR의 도입을 통해 특이적 항원을 표적하도록 유전적으로 변형될 수 있다.

자연 살해(NK) 세포는 세포-매개 면역의 일부이고 선천 면역 반응 동안 작용하는 림프구일 수 있다. NK 세포는 표적 세포에 대한 세포독성 효과를 수행하기 위해 사전 활성화를 필요로 하지 않는다.

일부 구현예에서, 본 개시내용의 면역반응성 세포는 T 세포이다. 본 개시내용의 T 세포는 자가, 동종이거나, 조작된 전구 또는 줄기 세포로부터 시험관 내에서 유래될 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시내용의 면역반응성 세포는 TCR-αβ가 결핍된 보편적인 T 세포이다. 범용 T 세포를 개발하는 방법은 당 기술분야, 예를 들어, Valton 등의 문헌[Molecular Therapy (2015); 23 9, 1507-1518], 및 Torikai 등의 문헌[Blood 2012 119:5697-5705]에 기재되어 있다.

일부 구현예에서, 본 개시내용의 면역반응성 세포는 본 개시내용의 하나 이상의 키메라 수용체를 포함하는 단리된 면역반응성 세포이다. 일부 구현예에서, 면역반응성 세포는 본 개시내용의 1 개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6 개 이상, 7 개 이상, 8 개 이상, 9 개 이상, 또는 10 개 이상의 키메라 수용체를 포함한다.

일부 구현예에서, 면역반응성 세포는 T 세포이다. 일부 구현예에서, 면역반응성 세포는 자연 살해(NK) 세포이다.

일부 구현예에서, 면역반응성 세포는 면역 수용체를 발현하거나 발현할 수 있다. 면역 수용체는 일반적으로 면역 수용체 발현 세포에서 신호 전달 또는 단백질 발현의 변화를 유도할 수 있고, 이는 동족 리간드에 결합 시 면역 반응의 조절을 초래한다(예를 들어, 면역 반응의 조절, 활성화, 개시, 자극, 증가, 예방, 약화, 억제, 감소, 경감, 억제 또는 저해). 예를 들어, TCR/CAR에 존재하는 CD3 사슬이 리간드 결합에 반응하여 클러스터링될 때, 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM) 매개 신호 전달 캐스케이드가 생성된다. 구체적으로, 특정 구현예에서, 내인성 TCR, 외인성 CAR, 키메라 TCR, 또는 CAR(구체적으로 활성화 CAR)이 이들 각각의 항원에 결합할 때, 결합된 수용체(예를 들어 CD4 또는 CD8, CD3g/d/e/z 등) 근처에 많은 분자의 클러스터링을 포함하는 면역학적 시냅스의 형성이 발생한다. 막 결합된 신호전달 분자의 이러한 클러스터링은 CD3 사슬 내에 함유된 ITAM 모티프가 인산화되게 할 수 있으며, 이는 차례로 T 세포 활성화 경로를 개시하고 궁극적으로 NF-κκ 및 AP-1과 같은 전사 인자를 활성화시킬 수 있다. 이들 전사 인자는 T 세포 매개 면역 반응, 예컨대, 사이토카인 생성 및/또는 T 세포 매개 사멸을 개시하기 위해 마스터 조절인자 T 세포 단백질의 증식 및 발현을 위한 IL-2 생산을 증가시키기 위해 T 세포의 전반적인 유전자 발현을 유도할 수 있다.

다중 키메라 수용체를 발현하는 세포

일부 구현예에서, 본 개시내용의 세포(예를 들어, 면역반응성 세포)는 본 개시내용의 2개 이상의 키메라 수용체를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 2개 이상의 키메라 수용체를 포함하며, 여기서 2개 이상의 키메라 수용체 중 하나는 키메라 억제 수용체이다. 일부 구현예에서, 세포는 3개 이상의 키메라 수용체를 포함하며, 여기서 3개 이상의 키메라 수용체 중 적어도 하나는 키메라 억제 수용체이다. 일부 구현예에서, 세포는 4개 이상의 키메라 수용체를 포함하며, 여기서 4개 이상의 키메라 수용체 중 적어도 하나는 키메라 억제 수용체이다. 일부 구현예에서, 세포는 5개 이상의 키메라 수용체를 포함하며, 여기서 5개 이상의 키메라 수용체 중 적어도 하나는 키메라 억제 수용체이다.

일부 구현예에서, 2개 이상의 키메라 수용체 각각은 예를 들어, 동일한 항원 또는 상이한 항원에 결합하는 상이한 항원-결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서 2개 이상의 키메라 수용체에 결합된 각각의 항원은 동일한 세포, 예컨대, 상피 세포 유형(예를 들어, 동일한 상피 세포 유형) 상에서 발현된다.

본 개시의 세포(예를 들어, 면역반응성 세포)가 2개 이상의 별개의 키메라 수용체를 발현하는 구현예에서, 상이한 키메라 수용체 각각의 항원-결합 도메인은 항원-결합 도메인이 서로 상호작용하지 않도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 제1 키메라 수용체(예를 들어, VSIG2-특이적 키메라 수용체) 및 제2 키메라 수용체를 발현하는 본 개시의 세포(예를 들어, 면역반응성 세포)는 제2 키메라 수용체의 항원 결합 도메인과 결합을 형성하지 않는 항원 결합 도메인을 포함하는 제1 키메라 수용체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 제1 키메라 수용체의 항원-결합 도메인은 scFv와 같은 항체 단편을 포함할 수 있는 반면, 제2 키메라 수용체의 항원-결합 도메인은 VHH를 포함할 수 있다.

이론에 얽매이지 않고, 각각이 항원-결합 도메인을 포함하는 복수의 키메라 막 포매된 수용체를 갖는 세포에서, 수용체 각각의 항원-결합 도메인 사이의 상호작용은 바람직하지 않을 수 있는데, 이러한 상호작용이 동족체 항원에 결합하는 항원-결합 도메인 중 하나 이상의 능력을 억제할 수 있기 때문인 것으로 여겨진다. 따라서, 본 개시의 세포(예를 들어, 면역반응성 세포)가 2개 이상의 키메라 수용체를 발현하는 구현예에서, 키메라 수용체는 이러한 억제 상호작용을 최소화하는 항원-결합 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 하나의 키메라 수용체의 항원-결합 도메인은 scFv를 포함하고 제2 키메라 수용체의 항원-결합 도메인은 단일 VH 도메인, 예를 들어, 낙타과, 상어, 또는 칠성장어 단일 VH 도메인, 또는 인간 또는 마우스 서열로부터 유래된 단일 VH 도메인을 포함한다.

일부 구현예에서, 세포 표면에 존재하는 경우, 제1 키메라 수용체의 항원 결합 도메인의 이의 동족 항원(예를 들어, VSIG2에 결합하는 VSIG2-특이적 키메라 수용체)에 대한 결합은 제2 키메라 수용체의 존재에 의해 실질적으로 감소되지 않는다. 일부 구현예에서, 제2 키메라 수용체의 존재 하에 제1 키메라 수용체의 항원-결합 도메인의 이의 동족체 항원에 대한 결합은 제2 키메라 수용체의 부재 하에 제1 키메라 수용체의 항원-결합 도메인의 이의 동족체 항원에 대한 결합의 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%이다. 일부 구횬예에서, 세포 표면에 존재하는 경우, 제1 키메라 수용체 및 제2 키메라 수용체의 항원-결합 도메인은 둘 다 scFv 항원-결합 도메인인 경우보다 더 적게 서로 회합한다. 일부 구현예에서, 제1 키메라 수용체 및 제2 키메라 수용체의 항원 결합 도메인은 둘 다 scFv 항원 결합 도메인인 경우보다 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 더 적게 서로 결합한다.

키메라 억제 수용체

일부 구현예에서, 본 개시의 세포(예를 들어, 면역반응성 세포)는 본 개시의 하나 이상의 키메라 억제 수용체를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 키메라 억제 수용체 각각은 정상 세포(예를 들어, 일반적으로 건강한 것으로 간주되는 세포)에서 발현되지만 결장암 세포와 같은 종양 세포에서는 발현되지 않는 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 억제 수용체는 VSIG2에 결합하는 항원 결합 도메인(예를 들어, 표 A에 열거된 아미노산 서열 중 하나 이상을 갖는 VSIG2-특이적 항원 결합 도메인)을 포함한다.

일부 구현예에서, 하나 이상의 키메라 억제 수용체는 뇌, 뉴런 조직, 내분비, 뼈, 골수, 면역계, 내피 조직, 근육, 폐, 간, 담낭, 췌장, 위장관, 신장, 방광, 남성 생식기, 여성 생식기, 지방, 연조직, 및 피부로 이루어진 군으로부터 선택된 조직으로부터 유래된 비-종양 세포 상에서 발현되는 항원에 결합한다.

일부 구현예에서, 키메라 억제 수용체(예를 들어, VSIG2-특이적 키메라 억제 수용체)는, 예를 들어, NOT-로직 게이트로서 본 개시의 세포(예를 들어, 면역반응성 세포) 상에서 발현되는 하나 이상의 활성화 키메라 수용체(예를 들어, 활성화 키메라 TCR 또는 CAR)와 함께 사용되어 하나 이상의 활성화 키메라 수용체의 하나 이상의 활성을 조절하거나, 조정하거나, 또는 달리 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 키메라 억제 수용체는 본 개시의 세포(예를 들어, 면역반응성 세포)의 하나 이상의 활성을 억제할 수 있다.

공동 자극 리간드

일부 구현예에서, 본 개시의 세포(예를 들어, 면역반응성 세포)는 하나 이상의 재조합 또는 외인성 공동 자극 리간드를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포는 하나 이상의 공동 자극 리간드로 추가로 형질도입될 수 있어서, 세포가 본 개시의 하나 이상의 키메라 수용체(예를 들어, 본원에 기재된 VSIG2-특이적 CAR) 및 하나 이상의 공동 자극 리간드를 공동 발현하거나 이를 공동 발현하도록 유도한다. 이론에 얽매이지 않기를 바라면서, 하나 이상의 키메라 수용체와 하나 이상의 공동 자극 리간드 사이의 상호작용은 세포의 완전 활성화에 중요한 비-항원-특이적 신호를 제공할 수 있는 것으로 여겨진다. 적합한 공동 자극 리간드의 예는, 제한 없이, 종양 괴사 인자(TNF) 슈퍼패밀리의 구성원, 및 면역글로불린(Ig) 슈퍼패밀리 리간드를 포함한다. TNF는 전신 염증에 수반되는 사이토카인이며 급성기 반응을 자극한다. 이의 주요 역할은 면역 세포의 조절에 있다. TNF 슈퍼패밀리의 구성원은 다수의 공통 특징을 공유한다. TNF 슈퍼패밀리 구성원의 대부분은 짧은 세포질 분절 및 비교적 긴 세포 외 영역을 함유하는 유형 II 막관통 단백질(세포 외 C-말단)로서 합성된다. 적합한 TNF 슈퍼패밀리 구성원의 예는 신경 성장 인자(NGF), CD40L(CD40L)/CD 154, CD137L/4-1BBL, TNF-a, CD134L/OX40L/CD252, CD27L/CD70, Fas 리간드(FasL), CD30L/CD153, 종양 괴사 인자 베타(TNFP)/림포톡신- 알파(LTa), 림포톡신-베타(LTP), CD257/B 세포-활성화 인자(B AFF)/Bly s/THANK/Tall- 1, 글루코코르티코이드-유도된 TNF 수용체 리간드(GITRL), 및 TNF-관련 세포자멸사-유도 리간드(TRAIL), LIGHT(TNFSF 14)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 면역글로불린(Ig) 슈퍼패밀리는 세포의 인식, 결합, 또는 접착 과정에 수반되는 세포 표면 및 가용성 단백질의 큰 그룹이다. 이들 단백질은 면역글로불린과 구조적 특징을 공유하고 면역글로불린 도메인(접힘)을 보유한다. 적합한 면역글로불린 슈퍼패밀리 리간드의 예는 CD80 및 CD86, CD28에 대한 두 리간드, PD-1에 대한 리간드인 PD-L1/(B7-H1)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 공동 자극 리간드는 4-1BBL, CD80, CD86, CD70, OX40L, CD48, TNFRSF14, PD-L1, 및 이의 조합으로부터 선택된다.

케모카인 수용체

일부 구현예에서, 본 개시의 세포(예를 들어, 면역반응성 세포)는 하나 이상의 키메라 수용체(예를 들어, 본원에 기재된 VSIG2-특이적 CAR)를 포함하고 하나 이상의 케모카인 수용체를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, T 세포와 같은 세포에서 케모카인 수용체 CCR2b 또는 CXCR2의 유전자 이식 발현은 CCL2-분비 또는 CXCL1-분비 고형 종양에 대한 수송을 향상시킨다(Craddock 등의 문헌[J Immunother. 2010 Oct; 33(8):780-8] 및 Kershaw 등의 문헌[Hum Gene Ther. 2002 Nov 1; 13(16): 1971 -80]). 이론에 얽매이지 않고, 본 개시내용의 키메라 수용체-발현 세포 상에서 발현되는 케모카인 수용체는 종양에 의해 분비된 케모카인을 인식하고 종양에 대한 세포의 표적화를 개선시킬 수 있으며, 이는 종양에 대한 세포의 침윤을 용이하게 하고 세포의 항종양 효능을 향상시킬 수 있는 것으로 여겨진다. 본 개시의 케모카인 수용체는 자연적으로 발생하는 케모카인 수용체, 재조합 케모카인 수용체, 또는 이의 케모카인-결합 단편을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 세포 상에서 발현될 수 있는 적합한 케모카인 수용체의 예는 CXC 케모카인 수용체, 예컨대 CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, 또는 CXCR7; CC 케모카인 수용체, 예컨대 CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, 또는 CCR11; CX3C 케모카인 수용체, 예컨대 CX3CR1; XC 케모카인 수용체, 예컨대 XCR1; 및 이의 케모카인-결합 단편을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 세포 상에서 발현될 케모카인 수용체는 종양에 의해 분비되는 케모카인에 기초하여 선택된다.

키메라 수용체 조절

본 개시의 일부 구현예는 본 개시의 키메라 수용체(예를 들어, 본원에 기재된 VSIG2-특이적 CAR) 발현 세포의 하나 이상의 키메라 수용체 활성을 조절하는 것에 관한 것이다. 키메라 수용체 활성이 조절될 수 있는 여러 방식이 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 키메라 수용체 활성이 제어될 수 있는 조절가능한 키메라 수용체는 키메라 수용체 요법의 안전성 및/또는 효능을 최적화하는 데 바람직할 수 있다. 예를 들어, 이량체화 도메인에 융합된 카스파제를 사용하여 세포자멸사를 유도하는 것(예를 들어, Di 등의 문헌[N Engl. J. Med. 2011 Nov. 3; 365(18): 1673-1683] 참조)은 키메라 수용체 요법에서 안전성 스위치로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 키메라 수용체-발현 세포는 또한 리미두시드(IUPAC 명칭: [(1R)-3-(3,4-디메톡시페닐)-1-[3-[2-[2-[[2-[3-[(1R)-3-(3,4-디메톡시페닐)-1-[(2S)-1-[(2S)-2-(3,4,5-트리메톡시페닐)부타노일]피페리딘-2-카르보닐]옥시프로필]페녹시]아세틸]아미노]에틸아미노]-2-옥소에톡시]페닐]프로필] (2S)-1-[(2S)-2-(3,4,5-트리메톡시페닐)부타노일]피페리딘-2-카르복실레이트)와 같은 이량체화 약물의 투여 시, 카스파제-9의 활성화를 유도하고 세포에서 세포자멸사를 초래하는 유도성 카스파제-9(i카스파제-9)를 발현할 수 있다. 일부 구현예에서, i카스파제-9는 이량체화의 화학적 유도인자(CID)의 존재 하에 이량체화를 매개하는 CID를 포함하는 결합 도메인을 함유하여, 키메라 수용체-발현 세포의 유도성 및 선택적 고갈을 초래한다.

대안적으로, 일부 구현예에서 본 개시내용의 키메라 수용체는 키메라 수용체 활성을 탈활성화하거나 또는 달리 억제하는 소분자 또는 항체를 활용함으로써 조절될 수 있다. 예를 들어, 항체는 항체 의존적 세포-매개의 세포독성(ADCC)을 유도함으로써 키메라 수용체-발현 세포를 결실시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 키메라 수용체-발현 세포는 ADCC에 의한 세포 사멸 또는 보체-유도된 세포 사멸을 유도할 수 있는 분자에 의해 인식된 항원을 추가로 발현할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 키메라 수용체-발현 세포는 항체 또는 항체 단편에 의해 표적화될 수 있는 수용체를 추가로 발현할 수 있다. 항체 또는 항체 단편에 의해 표적화될 수 있는 적합한 수용체의 예는 EpCAM, VEGFR, 인테그린(예를 들어, ανβ3, α4, αI¾β3, α4β7, α5β1, ανβ3, αν), TNF 수용체 슈퍼패밀리의 구성원(예를 들어, TRAIL-R1 및 TRAIL-R2), PDGF 수용체, 인터페론 수용체, 폴레이트 수용체, GPNMB, ICAM-1 , HLA-DR, CEA, CA-125, MUC1, TAG-72, IL-6 수용체, 5T4, GD2, GD3, CD2, CD3, CD4, CD5, CD11, CD11a/LFA-1, CD15, CD18/ITGB2, CD19, CD20, CD22, CD23/IgE 수용체, CD25, CD28, CD30, CD33, CD38, CD40, CD41 , CD44, CD51, CD52, CD62L, CD74, CD80, CD125, CD147/바시긴, CD152/CTLA-4, CD154/CD40L, CD195/CCR5, CD319/SLAMF7, 및 EGFR, 및 이들의 절단된 버전을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

일부 구현예에서, 본 개시의 키메라 수용체-발현 세포는 또한 신호전달 능력이 결여되어 있지만 ADCC를 유도할 수 있는 분자에 의해 인식되는 에피토프를 유지하는 절단된 표피 성장 인자 수용체(EGFR)를 발현할 수 있다(예를 들어, WO2011/056894).

일부 구현예에서, 본 개시의 키메라 수용체-발현 세포는 키메라 수용체-발현 세포에서 CD32 및 CD20 항원 둘 다로부터의 표적 에피토프를 조합하는 고도로 발현하는 작은 마커/자살 유전자를 추가로 포함하며, 이는 ADCC에 의한 키메라 수용체-발현 세포의 선택적 고갈을 초래하는 항-CD20 항체(예를 들어, 리툭시맙(rituximab))에 결합한다. 본 개시내용의 키메라 수용체-발현 세포를 고갈시키기 위한 다른 방법은 ADCC를 유도함으로써 파괴를 위한 키메라 수용체-발현 세포에 선택적으로 결합하고 표적하는 단클론 항-CD52 항체의 투여를 포함하나 이에 제한될 수 있다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체-발현 세포는 항-유전형 항체와 같은 키메라 수용체 리간드를 사용하여 선택적으로 표적화될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-유전형 항체는 ADCC 또는 ADC 활성과 같은 효과기 세포 활성을 유발할 수 있다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체 리간드는 독소와 같은 세포 사멸을 유도하는 제제에 추가로 커플링될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 키메라 수용체-발현 세포는 본 개시의 세포 고갈제에 의해 인식되는 표적 단백질을 추가로 발현할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 단백질은 CD20이고 세포 고갈제는 항-CD20 항체이다. 이러한 구현예에서, 키메라 수용체-발현 세포를 감소시키거나 또는 제거하는 것이 바람직하면 세포 고갈제가 투여된다. 일부 구현예에서, 세포 고갈제는 항-CD52 항체이다.

일부 구현예에서, 조절된 키메라 수용체는 폴리펩티드의 세트를 포함하며, 여기서 본 개시내용의 키메라 수용체의 구성요소는 별개의 폴리펩티드 또는 구성원 상에서 분할된다. 예를 들어, 폴리펩티드의 세트는 이량체화 분자의 존재 하에, 폴리펩티드를 서로 커플링하여 기능적 키메라 수용체를 형성할 수 있는 경우, 이량체화 스위치를 포함할 수 있다.

키메라 수용체 암호화 폴리뉴클레오티드 작제물

본 개시의 특정 양태는 본 개시의 하나 이상의 키메라 수용체(예를 들어, 본원에 기술된 VSIG2-특이적 CAR)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 단리된 폴리뉴클레오티드)에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 RNA 작제물, 예컨대 메신저 RNA(mRNA) 전사체 또는 변형된 RNA이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 DNA 작제물이다.

일부 구현예에서, 본 개시의 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 항원 결합 도메인(이때, 각각의 도메인은 표적 항원(예를 들어, VSIG2)에 결합함), 막관통 도메인, 및 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 암호화한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 항원-결합 도메인, 막관통 도메인, 1차 신호전달 도메인(예를 들어, CD3-제타 도메인), 및 하나 이상의 공동 자극 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 암호화한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 스페이서 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 스페이서 영역에 의해 막관통 도메인에 연결된다. 일부 구현예에서, 스페이서 영역은 표 3에 열거된 임의의 핵산 서열로부터 선택된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 리더 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.

본 개시의 폴리뉴클레오티드는 관심 유전자를 발현하는 세포로부터의 라이브러리를 스크리닝하거나, 유전자를 포함하는 것으로 알려진 벡터로부터 관심 유전자를 유도하거나, 또는 표준 기술을 사용하여 해당 유전자를 함유하는 세포 및 조직으로부터 직접 관심 유전자를 단리하는 것을 포함하나 이에 제한되지 않는 당 기술분야에 알려진 임의의 적합한 재조합 방법을 사용하여 수득될 수 있다. 대안적으로, 관심 유전자는 합성적으로 생성될 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시의 폴리뉴클레오티드는 벡터 내에 포함된다. 일부 구현예에서, 본 개시의 폴리뉴클레오티드는 트랜스포존, CRISPR/Cas9 시스템, TALEN, 또는 징크 핑거 뉴클레아제를 통해 세포에서 발현된다.

일부 구현예에서, 본 개시의 키메라 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 발현은 핵산을 프로모터에 작동가능하게 연결하고 작제물을 발현 벡터에 혼입함으로써 달성될 수 있다. 적합한 벡터는 진핵생물 세포에서 복제 및 통합될 수 있다. 전형적인 클로닝 벡터는 원하는 핵산을 발현을 조절하는 데 유용한 전사 및 번역 종결인자, 개시 서열, 및 프로모터를 함유한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 발현 작제물은 또한 표준 유전자 전달 프로토콜을 사용하여, 핵산 면역화 및 유전자 요법에 사용될 수 있다(예를 들어, US5399346, US5580859, 및 US5589466). 일부 구현예에서, 본 개시의 벡터는 유전자 요법 벡터이다.

본 개시의 폴리뉴클레오티드는 다수의 유형의 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 플라스미드, 파지미드, 파지 유도체, 동물 바이러스, 또는 코스미드를 포함하나 이에 제한되지 않는 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터, 또는 서열분석 벡터일 수 있다.

일부 구현예에서, 플라스미드 벡터는 본 개시의 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 게놈 내로 혼입하기 위한 트랜스포존/트랜스포사제 시스템을 포함한다. 트랜스포존 및 트랜스포사제 플라스미드 시스템을 사용하여 면역 세포에서 단백질을 발현하는 방법은 일반적으로 Chicaybam L의 문헌[Hum Gene Ther. 2019 Apr;30(4):511-522. doi: 10.1089/hum.2018.218]; 및 PtαckovαP의 문헌[Cytotherapy. 2018 Apr;20(4):507-520. doi: 10.1016/j.jcyt.2017.10.001]에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, 트랜스포존 시스템은 Sleeping Beauty 트랜스포존/트랜스포사제 또는 piggyBac 트랜스포존/트랜스포사제이다.

일부 구현예에서, 본 개시의 발현 벡터는 바이러스 벡터의 형태로 세포에 제공될 수 있다. 적합한 바이러스 벡터 시스템은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스, 및 렌티바이러스로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 렌티바이러스 벡터는 딸 세포에서 이식유전자의 장기간 안정한 통합 및 이의 증식을 허용하므로, 이러한 벡터가 장기간 유전자 전달에 적합하다. 렌티바이러스 벡터는 또한 렌티바이러스 벡터가 비-증식 세포에서도 형질도입할 수 있다는 점에서 종양-레트로바이러스(예를 들어, 쥣과 백혈병 바이러스)로부터 유래된 벡터보다 유리하다. 일부 구현예에서, 본 개시의 벡터는 아데노바이러스 벡터(A5/35)이다. 일부 구현예에서, 본 개시의 벡터는 적어도 하나의 유기체에서 기능적인 복제 원점, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클라제 부위, 및 하나 이상의 선택가능한 마커를 함유한다(예를 들어, WO01/96584; WO01/29058; 및 US6326193). 유전자를 포유류 세포 내로 전달하기 위해 다수의 바이러스 기반 시스템이 개발되었다. 선택된 유전자는 벡터 내로 삽입되고 당 기술분야에 알려진 기술을 사용하여 레트로바이러스 입자에 패키징될 수 있다. 그런 다음 재조합 바이러스가 단리되고 생체 내 또는 생체 외에서 포유류 세포에 전달될 수 있다. 다수의 레트로바이러스 시스템이 당 기술분야에 알려져 있다.

일부 구현예에서, 본 개시내용의 벡터는 추가적인 프로모터 요소, 예컨대 전사 개시 빈도를 조절하는 인핸서를 포함한다. 인핸서는 전형적으로 출발 부위의 30 bp 내지 110 bp 상류에 있는 영역에 위치하지만, 다수의 프로모터가 또한 출발 부위의 하류에 있는 기능적 요소를 함유하는 것으로 나타났다. 프로모터 요소 사이의 간격은 유연할 수 있으며, 요소가 서로에 대해 역전되거나 또는 이동할 때 프로모터 기능이 보존되도록 한다. 예를 들어, 티미딘 키나제(tk) 프로모터에서 프로모터 요소 사이의 간격은 활성의 감소가 시작되기 전에 50 bp 간격으로 증가될 수 있다. 프로모터에 따라, 개별 요소는 협력하여 또는 독립적으로 기능하여 전사를 활성화시킬 수 있다. 예시적인 프로모터는 SFFV 유전자 프로모터, EFS 유전자 프로모터, CMV IE 유전자 프로모터, EFla 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터, 및 포스포글리세로키나제(PGK) 프로모터를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

일부 구현예에서, 본 개시의 면역반응성 세포와 같은 포유류 세포에서 본 개시의 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 프로모터는 EF1a 프로모터이다. 천연 EF1a 프로모터는 아미노아실 tRNA를 리보솜으로 효소적으로 전달하는 것을 담당하는 신장 인자-1 복합체의 알파 서브유닛의 발현을 유도한다. EF1a 프로모터는 포유류 발현 플라스미드에서 광범위하게 사용되었고 렌티바이러스 벡터 내로 클로닝된 폴리뉴클레오티드로부터 키메라 수용체 발현을 유도하는 데 효과적인 것으로 나타났다.

일부 구현예에서, 본 개시의 면역반응성 세포와 같은 포유류 세포에서 본 개시의 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 프로모터는 구성적 프로모터이다. 예를 들어, 적합한 구성적 프로모터는 비장 초점 형성 바이러스(SFFV) 프로모터이다. 예를 들어, 적합한 구성적 프로모터는 극초기 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터이다. CMV 프로모터는 프로모터에 작동가능하게 연결된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 높은 수준으로 유도할 수 있는 강력한 구성적 프로모터이다. 다른 적합한 구성적 프로모터는 유비퀴틴 C(UbiC) 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV40) 초기 프로모터, 마우스 유선 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스 극초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 신장 인자-la 프로모터, 헤모글로빈 프로모터, 및 크레아틴 키나제 프로모터를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

일부 구현예에서, 본 개시의 면역반응성 세포와 같은 포유류 세포에서 본 개시의 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 프로모터는 유도성 프로모터이다. 유도성 프로모터의 사용은 프로모터가 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결될 때 본 개시의 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하거나 또는 억제할 수 있는 분자 스위치를 제공할 수 있다. 유도성 프로모터의 예는 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터, 및 테트라사이클린 프로모터를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

일부 구현예에서, 본 개시의 벡터는 분비를 용이하게 하는 신호 서열, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결인자, 에피솜 복제를 가능하게 하는 요소, 및/또는 선별을 가능하게 하는 요소를 추가로 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시의 벡터는 벡터로 형질도입된 세포 집단으로부터 키메라 수용체 발현 세포의 식별 및 선별을 용이하게 하기 위해 선별 마커 유전자 및/또는 리포터 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 선택가능한 마커는 벡터로부터 분리되고 공동 형질감염 절차에 사용되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다. 선택가능한 마커 또는 리포터 유전자는 숙주 세포에서 발현을 허용하기 위해 적절한 조절인자 서열과 플랭킹될 수 있다. 선택가능한 마커의 예는 네오 등과 같은 항생제-내성 유전자를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

일부 구현예에서, 리포터 유전자는 형질도입된 세포를 식별하고 조절 서열의 기능성을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 리포터 유전자는 수용 유기체 또는 조직에 존재하지 않거나 또는 이에 의해 발현되지 않고 발현이 효소적 활성과 같은 용이하게 검출가능한 특성을 초래하는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 폴리뉴클레오티드가 수용 세포에 도입된 후 적합한 시간에 검정될 수 있다. 리포터 유전자의 예는 루시퍼라제를 암호화하는 유전자, 베타-갈락토시다제를 암호화하는 유전자, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자, 분비된 알칼리성 포스파타제를 암호화하는 유전자, 및 녹색 형광 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현 시스템은 당 기술분야에 잘 알려져 있고 알려진 기술을 사용하여 제조되거나 또는 상업적으로 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 리포터 유전자의 가장 높은 발현 수준을 나타내는 최소 5' 플랭킹 영역을 갖는 작제물이 프로모터로 식별된다. 이러한 프로모터 영역은 리포터 유전자에 연결되고 프로모터-구동된 전사를 조절하는 능력에 대해 제제를 평가하는 데 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시의 키메라 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터는 키메라 수용체의 활성을 증가시키는 폴리펩티드를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다.

키메라 수용체-발현 세포가 2개 이상의 키메라 수용체를 포함하는 구현예에서, 단일 폴리뉴클레오티드는 단일 조절 제어 요소(예를 들어, 프로모터) 하에 또는 폴리뉴클레오티드에 포함된 각 키메라 수용체-암호화 뉴클레오티드 서열에 대한 별개의 조절 제어 요소 하에 2개 이상의 키메라 수용체를 암호화할 수 있다. 키메라 수용체-발현 세포가 2개 이상의 키메라 수용체를 포함하는 일부 구현예에서, 각각의 키메라 수용체는 별개의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 별개의 폴리뉴클레오티드는 자체 제어 요소(예를 들어, 프로모터)를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 폴리뉴클레오티드는 2개 이상의 키메라 수용체를 암호화하고 키메라 수용체-암호화 뉴클레오티드 서열은 동일한 해독 틀에 있고 단일 폴리펩티드 사슬로 발현된다. 이러한 구현예에서, 2개 이상의 키메라 수용체는 하나 이상의 펩티드 절단 부위, 예컨대 세포 내 프로테아제에 대한 자가-절단 부위 또는 기질에 의해 분리될 수 있다. 적합한 펩티드 절단 부위는 T2A 펩티드 절단 부위, P2A 펩티드 절단 부위, E2A 펩티드 절단 부위, 및 F2A 펩티드 절단 부위를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 키메라 수용체는 T2A 펩티드 절단 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 키메라 수용체는 E2A 펩티드 절단 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 키메라 수용체는 T2A 및 E2A 펩티드 절단 부위를 포함한다.

유전자를 세포에 도입하고 발현시키는 방법은 당 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 발현 벡터는 물리적, 화학적, 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하기 위한 물리적 수단의 예는 칼슘 포스페이트 침전, 리포펙틴, 입자 충격, 미세주입, 및 전기천공법을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 화학적 수단의 예는 콜로이드성 분산 시스템, 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구체, 비드, 및 수중유 에멀젼, 미셸(micelle), 혼합 미셸, 및 리포솜을 포함한 지질-기반 시스템을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 생물학적 수단의 예는 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

일부 구현예에서, 리포솜은 시험관 내, 생체 외, 또는 생체 내에서 본 개시의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 비-바이러스 전달 시스템으로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, 리포솜의 수성 내부에 포획되거나, 리포솜의 지질 이중층 내에 산재되거나, 리포솜 및 폴리뉴클레오티드 둘 다와 회합된 연결 분자를 통해 리포솜에 부착되거나, 리포솜에 포획되거나, 리포솜과 복합체화되거나, 지질을 함유하는 용액에 분산되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 조합되거나, 지질에 현탁액으로 함유되거나, 미셸에 함유되거나 또는 이와 복합체화되거나, 또는 달리 지질과 회합됨으로써 지질과 회합될 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 지질-회합된 폴리뉴클레오티드 또는 벡터 조성물은 용액 내 임의의 특정한 구조로 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 이러한 조성물은 미셸로서 또는 "붕괴된" 구조를 갖는 이중층 구조에 존재할 수 있다. 이러한 조성물은 또한 용액에 산재되어, 크기 또는 형상이 균일하지 않는 응집체를 형성할 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 지질은 천연 발생 또는 합성될 수 있는 지방 물질이다. 일부 실시예에서, 지질은 세포질에서 천연적으로 발생하는 지방 액적 또는 지방산, 알코올, 아민, 아미노 알코올, 및 알데하이드와 같은, 장쇄 지방족 탄화수소 및 이의 유도체를 함유하는 화합물의 부류를 포함할 수 있다. 적합한 지질은 상업적 공급처로부터 수득될 수 있고 디미리스틸 포스파티딜콜린("DMPC"), 디세틸포스페이트("DCP"), 콜레스테롤, 및 디미리스틸포스파티딜글리세롤("DMPG")을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 클로로포름 또는 클로로포름/메탄올에서 지질의 스톡 용액은 약 -20℃에서 저장될 수 있다. 클로로포름은 메탄올보다 더 용이하게 증발되므로, 용매로 사용된다. 본원에 사용된 바와 같이, "리포솜"은 봉입된 지질 이중층 또는 응집체의 생성에 의해 형성된 다양한 단일 및 다중층 지질 비히클을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 리포솜은 인지질 이중층 막 및 내부 수성 매질을 갖는 소포체 구조를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 일부 구현예에서, 다중층 리포솜은 수성 매질에 의해 분리된 다중 지질 층을 가질 수 있다. 다중층 리포솜은 인지질이 과량의 수용액에 현탁될 때 자발적으로 형성될 수 있다. 일부 구현예에서, 액체 구성요소는 닫힌 구조의 형성 전에 자기-재배열을 겪을 수 있고 지질 이중층 사이에 물 및 용해된 용질을 가둘 수 있다. 일부 구현예에서, 지질은 미셸 구조를 가정하거나 또는 단지 지질 분자의 불균일한 응집체로서 존재할 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 본 개시의 면역반응성 세포와 같은 포유류 숙주 세포 내로 도입된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포에서 본 개시의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터의 존재는 서던 블롯 검정, 노던 블롯 검정, RT-PCR, PCR, ELISA 검정, 및 웨스턴 블롯 검정을 포함하나 이에 제한되지 않는 당 기술분야에 알려진 임의의 적합한 검정에 의해 확인될 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 본 개시의 면역반응성 세포 내로 안정하게 형질도입된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터의 안정한 발현을 나타내는 세포는 형질도입 후 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 4주, 적어도 5주, 적어도 6주, 적어도 7주, 적어도 8주, 적어도 3개월, 적어도 6개월, 적어도 9개월, 또는 적어도 12개월 동안 암호화된 키메라 수용체를 발현한다.

본 개시의 키메라 수용체가 세포에서 일시적으로 발현되는 구현예에서, 본 개시의 키메라 수용체-암호화 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 본 개시의 면역반응성 세포 내로 형질감염된다. 일부 구현예에서 면역반응성 세포는 형질감염 후 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일, 또는 약 15일 동안 키메라 수용체를 발현한다.

일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 작제물은 이중스트론성 키메라 항원 수용체를 암호화한다. 일부 구현예에서, 암호화된 이중이스트론 키메라 항원 수용체는 VSIG2 CAR(예컨대, VSIG2 억제 CAR) 및 제2 항원(예컨대, 종양-표적화 키메라 수용체)에 특이적인 CAR을 포함한다.

일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 작제물은 2가 키메라 항원 수용체를 암호화한다. 일부 구현예에서, 암호화된 2가 키메라 항원 수용체는 VSIG2 항원 결합 도메인 및 제2 항원 결합 도메인을 포함한다.

약학적 조성물 및 투여

본 개시의 특정 양태는 본 개시의 하나 이상의 키메라 수용체 또는 이러한 하나 이상의 키메라 수용체를 발현하는 본 개시의 면역반응성 세포를 포함하는 조성물(예를 들어, 약학적 조성물)에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체 또는 이러한 키메라 수용체를 발현하는 유전적으로 변형된 면역반응성 세포를 포함하는 조성물은 골수 장애와 같은 증식성 장애의 치료를 위해 대상체에게 전신으로 또는 직접적으로 제공될 수 있다. 특정 구현예에서, 조성물은 관심 기관(예를 들어, 장애에 의해 영향을 받은 기관) 내로 직접적으로 주사된다. 대안적으로, 조성물은 예를 들어, 순환계(예를 들어, 종양 혈관계) 내로의 투여에 의해 관심 기관에 간접적으로 제공될 수 있다. 시험관 내 또는 생체 내에서 T 세포, NK 세포, 또는 CTL 세포의 생산을 증가시키기 위해 조성물의 투여 전, 중간, 또는 후에 확장제 및 분화제가 제공될 수 있다.

본 개시의 유전적으로 변형된 세포를 포함하는 조성물은 임의의 생리학적으로 허용가능한 비히클 내에서, 예를 들어 혈관내 투여될 수 있지만, 유전적으로 변형된 세포가 재생 및 분화에 적절한 부위(예를 들어, 흉선)를 찾을 수 있는 뼈 또는 다른 편리한 부위 내로도 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 1x10⁵개의 세포가 투여될 수 있으며, 결국 1x10¹⁰개 이상의 세포에 도달할 수 있다. 본 개시의 유전적으로 변형된 세포를 포함하는 조성물은 정제된 세포 집단을 포함할 수 있다. 세포 집단에서 유전적으로 변형된 세포의 백분율을 결정하는 방법은 당 기술분야에 잘 알려져 있고 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 세포 집단에서 유전적으로 변형된 세포의 순도는 세포 집단에서 세포의 약 50%, 약 55%, 약 60%, 또는 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 그 이상일 수 있다. 투여량은 당업자에 의해 용이하게 조정될 수 있다(예를 들어, 순도 감소는 투여량 증가를 필요로 할 수 있음). 세포는 주사, 카테터 등에 의해 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 인자, 예를 들어, L-2, IL-3, IL-6, IL-11, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, G-CSF, MCSF, GM-CSF, 감마-인터페론, 및 에리트로포이에틴이 또한 포함될 수 있다.

특정 구현예에서, 조성물은 유전적으로 변형된 세포, 예컨대 면역반응성 세포 또는 이의 전구체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이다. 투여는 자가유래 또는 이종유래일 수 있다. 예를 들어, 면역반응성 세포, 또는 전구체는 하나의 대상체로부터 수득될 수 있고, 동일한 대상체 또는 상이한 호환가능한 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 면역반응성 세포 또는 이의 자손은 말초 혈액 세포로부터 유래될 수 있고(예를 들어, 생체 내, 생체 외, 또는 시험관 내 유래) 카테터 투여, 전신 주사, 국소 주사, 정맥내 주사, 또는 비경구 투여를 포함하는 국소 주사를 통해 투여될 수 있다. 본 개시의 치료적 조성물(예를 들어, 본 개시의 유전적으로 변형된 세포를 함유하는 약학적 조성물)을 투여하는 경우, 일반적으로 단위 투여량 주사가능 형태(용액, 현탁액, 에멀젼)로 제형화될 것이다.

제형

본 개시의 특정 양태는 본 개시의 키메라 수용체 또는 이러한 키메라 수용체를 발현하는 유전적으로 변형된 세포(예를 들어, 본 개시의 면역반응성 세포)를 포함하는 조성물의 제형에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 세포를 포함하는 본 개시의 조성물은 선택된 pH로 완충될 수 있는, 등장성 수용액, 현탁액, 에멀젼, 분산액, 및 점성 조성물을 포함하나 이에 한정되지 않는 멸균 액체 제제로서 제공될 수 있다. 액체 제제는 통상적으로 겔, 다른 점성 조성물, 및 고체 조성물보다 제조하기가 더 용이하다. 추가적으로, 액체 조성물은 특히 주사로 투여하기에 더 편리할 수 있다. 일부 구현예에서, 점성 조성물은 특정 조직과의 더 긴 접촉 기간을 제공하기 위해 적절한 점도 범위 내에서 제형화될 수 있다. 액체 또는 점성 조성물은 담체를 포함할 수 있으며, 이는, 예를 들어, 물, 염수, 인산염 완충 염수, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이의 적합한 혼합물을 함유하는, 용매 또는 분산 매질일 수 있다.

일부 구현예에서, 멸균 주사용 용액은, 원하는 경우, 다양한 양의 임의의 다른 성분과 함께 충분한 양의 적절한 용매에 본 개시의 유전적으로 변형된 세포를 혼입함으로써 제조될 수 있다. 이러한 조성물은 멸균수, 생리 식염수, 글루코스, 또는 덱스트로스 등과 같은 적합한 담체, 희석제, 또는 부형제와 혼합될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 또한 동결건조될 수 있다. 조성물은 투여 경로 및 원하는 제제에 따라 습윤제, 분산제, pH 완충제, 및 항균제와 같은 보조 물질을 함유할 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시의 조성물은 조성물의 안정성 및 멸균성을 향상시킬 수 있는 다양한 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 첨가제의 예는, 제한 없이, 항미생물 보존제, 산화방지제, 킬레이트화제, 및 완충제를 포함한다. 일부 구현예에서, 미생물 오염은 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 임의의 항균제 및 항진균제를 포함하여 예방될 수 있다. 본 개시의 주사용 약학적 제형의 연장된 흡수는 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 적합한 제제의 사용에 의해 야기될 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시의 조성물은 등장성일 수 있는데, 즉, 혈액 및 누액과 동일한 삼투압을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 원하는 등장성은 예를 들어, 염화나트륨, 덱스트로스, 붕산, 타르타르산나트륨, 프로필렌 글리콜, 또는 다른 무기 또는 유기 용질을 사용하여 달성될 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시의 제형의 구성요소는 화학적으로 불활성이고 본 개시의 유전적으로 변형된 세포의 생존력 또는 효능에 영향을 미치지 않도록 선택된다.

본 개시의 유전적으로 변형된 세포의 치료적 용도에 관한 한 가지 고려사항은 최적의 효능을 달성하는 데 필요한 세포의 양이다. 일부 구현예에서, 투여될 세포의 양은 치료되는 대상체에 따라 달라질 것이다. 특정 구현예에서, 필요로 하는 대상체에게 투여된 유전적으로 변형된 세포의 양은 1 x 10⁴개의 세포 내지 1 x 10¹⁰개의 세포 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 유효량으로 간주될 세포의 정확한 양은 특정 대상체의 크기, 연령, 성별, 체중, 및 상태를 포함하는, 각각의 대상체에 대한 개별적인 인자에 기초할 수 있다. 투여량은 본 개시 및 당업계의 지식에 기초하여 당업자에 의해 용이하게 확인될 수 있다.

이종 모이어티 및 변형

추가의 일련의 구현예에서, 본원의 VSIG2-특이적 키메라 단백질(예를 들어, 표 A에 열거된 아미노산 서열 중 하나 이상을 갖는 항원 결합 도메인을 포함하는 VSIG2-특이적 키메라 단백질)은 추가적인 모이어티 및/또는 변형을 포함한다.

약물 접합체

다양한 구현예에서, VSIG2-특이적 키메라 단백질은 항체-약물 접합체를 형성하기 위해 치료제(즉, 약물)에 접합된 표 A에 열거된 아미노산 서열 중 하나 이상을 갖는 항원 결합 도메인을 포함한다. 치료제는, 이에 한정되지는 않으나, 화학요법제, 영상화제(예를 들어, 방사성 동위원소), 면역 조절제(예를 들어, 사이토카인, 케모카인, 또는 관문 억제제), 및 독소(예를 들어, 세포독성제)를 포함한다. 특정 구현예에서, 치료제는 본원에서 보다 상세히 논의된 바와 같이, 링커 펩티드를 통해 항원 결합 도메인에 부착된다.

본원에 개시된 항원 결합 도메인에 약물을 접합시키기에 적합할 수 있는 (예를 들어, 표 A에 열거된 아미노산 서열 중 하나 이상을 갖는) 항체-약물 접합체(ADC)의 제조 방법은, 예를 들어, 미국 특허 제8,624,003호(pot 방법), 미국 특허 제8,163,888호(일단계), 미국 특허 제5,208,020호(2단계 방법), 미국 특허 제8,337,856호, 미국 특허 제5,773,001호, 미국 특허 제7,829,531호, 미국 특허 제5,208,020호, 미국 특허 제7,745,394호, WO 2017/136623, WO 2017/015502, WO 2017/015496, WO 2017/015495, WO 2004/010957, WO 2005/077090, WO 2005/082023, WO 2006/065533, WO 2007/030642, WO 2007/103288, WO 2013/173337, WO 2015/057699, WO 2015/095755, WO 2015/123679, WO 2015/157286, WO 2017/165851, WO 2009/073445, WO 2010/068759, WO 2010/138719, WO 2012/171020, WO 2014/008375, WO 2014/093394, WO 2014/093640, WO 2014/160360, WO 2015/054659, WO 2015/195925, WO 2017/160754, Storz의 문헌[MAbs. 2015 November-December; 7(6): 989-1009], Lambert 등의 문헌 [Adv Ther, 2017 34: 1015]. Diamantis 등의 문헌 [British Journal of Cancer, 2016, 114, 362-367], Carrico 등의 문헌 [Nat Chem Biol, 2007. 3: 321-2], We 등의 문헌 [Proc Natl Acad Sci USA, 2009. 106: 3000-5], Rabuka 등의 문헌 [Curr Opin Chem Biol., 2011 14: 790-6], Hudak 등의 문헌 [Angew Chem Int Ed Engl., 2012: 4161-5], Rapuka 등의 문헌 [Nat Protoc., 2012 7:1052-67], Agarwal 등의 문헌 [Proc Natl Acad Sci USA., 2013, 110: 46-51], Agarwal 등의 문헌 [Bioconjugate Chem., 2013, 24: 846-851], Barfield 등의 문헌 [Drug Dev. and D., 2014, 14:34-41], Drake 등의 문헌 [Bioconjugate Chem., 2014, 25:1331-41], Liang 등의 문헌 [J Am Chem Soc., 2014, 136:10850-3], Drake 등의 문헌 [Curr Opin Chem Biol., 2015, 28:174-80], 및 York 등의 문헌 [BMC Biotechnology, 2016, 16(1):23]에 기술되어 있고, 이들 각각은 교시하는 모든 것에 대해 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.

추가 결합 모이어티

다양한 구현예에서, VSIG2-특이적 키메라 단백질은 표 A에 열거된 아미노산 서열 중 하나 이상 및 하나 이상의 추가 결합 모이어티를 갖는 항원 결합 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 결합 모이어티는 전장 항체, Fab 단편, Fvs, scFvs, 탠덤 scFvs, 디아바디, sc디아바디, DART, tandAbs, 미니바디, 카멜화 VHH, 및 당업자에게 공지된 다른 항체 단편 또는 포맷을 포함하지만 이에 한정되지 않는 항체 단편 또는 항체 포맷이다. 예시적인 항체 및 항체 단편 포맷은 Brinkmann 등의 문헌 (MABS,2017, Vol. 9, No. 2, 182-212)에 상세히 기재되어 있고, 교시하는 모든 것에 대해 참조로서 본원에 통합된다.

특정 구현예에서, 하나 이상의 추가 결합 모이어티는 VSIG2-특이적 항원 결합 도메인의 하나 이상의 펩티드, 예컨대 VH 및/또는 VL, Fab 중쇄 및/또는 경쇄 단편, 또는 scFv의 C-말단에 부착된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 추가 결합 모이어티는 VSIG2-특이적 항원 결합 도메인의 하나 이상의 펩티드, 예컨대 VH 및/또는 VL, Fab 중쇄 및/또는 경쇄 단편, 또는 scFv의 N-말단에 부착된다.

특정 구현예에서, 하나 이상의 추가 결합 모이어티는 VSIG2와 상이한 항원 또는 에피토프에 특이적이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 추가 결합 모이어티는 VSIG2-에 특이적이다.

특정 구현예에서, 하나 이상의 추가 결합 모이어티는 반응성 화학(예를 들어, 클릭 화학) 및 친화도 태그 부착 시스템을 포함하지만 이에 한정되지 않는 시험관 내 방법을 사용하여 본원에 기재된 항원 결합 도메인(예를 들어, 표 A에 열거된 아미노산 서열 중 하나 이상을 가짐)에 부착된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 추가 결합 모이어티는 Fc-매개 결합(예를 들어, 단백질 A/G)을 통해 본원에 기재된 항원 결합 도메인(예를 들어, 표 A에 열거된 아미노산 서열 중 하나 이상을 가짐)에 부착된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 추가 결합 모이어티는 본원에 기재된 항원 결합 도메인과 동일한 발현 벡터(예를 들어, 플라스미드) 상의 추가 결합 모이어티 사이의 융합 산물의 뉴클레오티드 서열을 암호화하는 것과 같은 재조합 DNA 기술을 사용하여 본원에 기재된 항원 결합 도메인(예를 들어, 표 A에 열거된 아미노산 서열 중 하나 이상을 가짐)에 부착된다.

작용/반응성 기

다양한 구현예에서, 본원에 기재된 (예를 들어, 표 A에 열거된 아미노산 서열 중 하나 이상을 갖는) 항원 결합 도메인은, 추가 모이어티(예를 들어, 약물 접합체 및 추가 결합 모이어티)에 연결하는 것과 같은 하류 과정 또는 하류 정제 과정에서 사용될 수 있는 작용기 또는 화학적 반응성기를 포함하는 변형을 갖는다.

특정 구현예에서, 변형은 반응성 티올(예를 들어, 말레이미드계 반응성 기), 반응성 아민(예를 들어, N-하이드록시숙신이미드계 반응성기), "클릭 화학"기(예를 들어, 반응성 알킨기), 및 알데하이드를 보유한 포르밀글리신(FGly)을 포함하지만 이에 한정되지 않는 화학적 반응성기이다. 특정 구현예에서, 변형은 친화도 펩티드 서열(예를 들어, HA, HIS, FLAG, GST, MBP, 및 Strep 시스템 등)을 포함하지만 이에 한정되지 않는 작용기이다. 특정 구현예에서, 작용기 또는 화학적 반응성기는 절단 가능한 펩티드 서열을 갖는다. 특정 구현예에서, 절단가능한 펩티드는 광절단, 화학적 절단, 프로테아제 절단, 환원 조건, 및 pH 조건을 포함하지만 이에 한정되지 않는 수단에 의해 절단된다. 특정 구현예에서, 프로테아제 절단은 세포내 프로테아제에 의해 수행된다. 특정 구현예에서, 프로테아제 절단은 세포외 또는 막 연결 프로테아제에 의해 수행된다. 프로테아제 절단을 채택하는 ADC 요법은 Choi 등의 문헌 [Theranostics, 2012; 2(2): 156-178.]에 더욱 상세히 기재되어 있고, 그 전체는 교시하는 모든 것에 대해 참조로서 본원에 통합된다.

치료 방법

본 개시의 특정 양태를 이를 필요로 하는 대상체를 치료하기 위해 키메라 수용체 및 이러한 키메라 수용체를 발현하는 본 개시의 유전적으로 변형된 세포(예를 들어, 면역반응성 세포)를 사용하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 개시의 방법은 대상체에서 고형 종양과 같은 암을 치료하는 데 유용하다. 일부 구현예에서, 고형 종양은 결장암, 췌장암, 폐암, 및/또는 위암으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 고형 종양은 결장암이다. 일부 구현예에서, 결장암은 결장 암종이다. 일부 실시예에서, 고형 종양은 폐암이다. 일부 구현예에서, 폐암은 폐 선암종이다. 본 개시의 다른 양태는, 대상체, 예컨대, 면역약화된 인간 대상체에서 병원체 감염 또는 다른 감염성 질환을 치료하기 위한 방법에서 키메라 수용체 및 이러한 키메라 수용체를 발현하는 본 개시의 유전적으로 변형된 세포(예를 들어, 면역반응성 세포)의 용도에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 개시의 방법은, 제한 없이, 기존 병태 경감, 병태 예방, 기존 병태 치료, 기존 병태 관리, 또는 병태의 재발 또는 악화의 예방을 포함하는, 원하는 효과를 달성하기에 유효한 양으로 본 개시의 유전적으로 변형된 세포를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 유효량은 본 개시의 유전적으로 변형된 세포(예를 들어, 면역반응성 세포)의 1회 또는 일련의 투여로 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 유효량은 볼루스 또는 연속 관류로 제공될 수 있다.

본원에 개시된 바와 같이, "유효량" 또는 "치료 유효량"은 치료 시 유리하거나 또는 원하는 임상 결과에 영향을 미치기에 충분한 양이다. 유효량은 하나 이상의 용량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 치료의 관점에서, 유효량은 질환의 진행을 완화, 개선, 안정화, 역전 또는 지연시키거나, 또는 달리 질환의 병리학적 결과를 감소시키기에 충분한 양이다. 유효량은 일반적으로 사례별로 의사에 의해 결정되고 당 기술분야의 숙련자의 기술 범위 내에 있다. 유효량을 달성하기 위한 적절한 투여량을 결정할 때 여러 요인이 전형적으로 고려된다. 이들 요인은 대상체의 연령, 성별 및 체중, 치료되는 병태, 병태의 중증도 및 투여되는 면역반응성 세포의 형태 및 유효 농도를 포함한다.

항원-특이적 세포(예를 들어, 면역반응성 세포, 예컨대, T 세포 또는 NK 세포)를 사용한 입양 면역요법의 경우, 약 1 x 10⁵ 내지 1 x10¹⁰개 세포/kg(예를 들어, 약 1 x 10⁹개의 세포) 범위의 세포 용량이 통상적으로 주입된다. 세포를 대상체 내로 투여하고 후속 분화 시, 특이적 항원에 대해 특이적으로 지시된 면역반응성 세포가 유도된다. 일부 구현예에서, 면역반응성 세포의 유도는, 제한 없이, 결실 또는 무력화와 같은 항원-특이적 세포의 불활성화를 포함할 수 있다. 불활성화는 자가면역 장애에서와 같이 관용성을 확립하거나 재확립하는 데 특히 유용하다. 유전적으로 변형된 세포는 정맥내, 피하, 결절내, 종양내, 척추강내, 흉강내, 복강내 및 직접적으로 흉선으로를 포함하나 이에 제한되지 않는 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 투여될 수 있다.

치료적 처치

일부 구현예에서, 본 개시의 방법은 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 본 개시의 방법은 대상체에서 골수성 장애를 치료 및/또는 예방하는 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다. 일부 구현예에서, 요법에 적합한 인간 대상체는 임상 기준에 의해 구별될 수 있는 2 가지 치료 그룹을 포함할 수 있다. "진행성 질환" 또는 "높은 종양 부담"을 갖는 대상체는 임상적으로 측정가능한 종양을 보유하는 대상체이다. 임상적으로 측정가능한 종양은 종양 질량을 기반으로 검출될 수 있는 것이다(예를 들어, 촉진, CAT 스캔, 초음파검사, 유방촬영상 또는 X-선에 의한 백혈병 세포의 백분율을 기반으로 함; 양성 생화학적 또는 조직병리학적 마커 자체는 이 집단을 식별하기에 불충분함). 일부 구현예에서, 본 개시의 약학적 조성물은 이러한 대상체의 병태를 완화시키려는 목적으로, 항-종양 반응을 도출하기 위해 이러한 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 종양 질량의 감소는 약학적 조성물의 투여 결과로 발생하지만, 임의의 임상적 개선이 이점을 구성할 것이다. 일부 구현예에서, 임상적 개선은 종양의 병리학적 결과에서 감소된 진행 위험 또는 속도 또는 감소를 포함한다. 일부 구현예에서, 적합한 인간 대상체의 두번째 그룹은 "애쥬번트(adjuvant) 그룹" 대상체이다. 이러한 대상체는 골수성 장애의 병력이 있지만, 또 다른 방식의 요법에 반응을 보인 개인이다. 이전 요법은, 제한 없이, 외과적 절제, 방사선요법, 및/또는 전통적인 화학요법을 포함할 수 있다. 결과적으로, 이러한 개인은 임상적으로 측정가능한 종양이 없다. 그러나, 이들은 원래 종양 부위 근처에, 또는 전이에 의해 질환의 진행 위험이 있는 것으로 의심된다. 일부 구현예에서, 이 그룹은 추가로 고위험 및 저위험 개인으로 세분될 수 있다. 초기 치료 전 또는 후에 관찰된 특징에 기초하여 세분화가 이루어질 수 있다. 이러한 특징은 임상 분야에서 알려져 있고, 각각의 상이한 골수성 장애에 대해 적합하게 정의된다. 고위험 하위그룹의 전형적인 특징은 종양이 이웃 조직을 침습하거나, 림프절의 침범을 보이는 것이다.

본원에 기재된 바와 같은 면역 반응을 증가시키는 임의의 및 모든 측면에서, 특징 또는 기능의 측면의 임의의 증가 또는 감소 또는 변경은 본원에 기재된 바와 같은 면역반응성 세포와 접촉되지 않은 세포와 비교된다.

면역 반응을 증가시키는 것은 면역 반응을 향상시키거나 또는 면역 반응을 유도하는 것 둘 다일 수 있다. 예를 들면, 면역 반응을 증가시키는 것은 면역 반응의 시작 또는 개시, 또는 진행중이거나 또는 기존 면역 반응을 상승 또는 증폭시키는 것을 모두 포함한다. 일부 구현예에서, 치료는 면역 반응을 유도한다. 일부 구현예에서, 유도된 면역 반응은 적응 면역 반응이다. 일부 구현예에서, 유도된 면역 반응은 선천적 면역 반응이다. 일부 구현예에서, 치료는 면역 반응을 향상시킨다. 일부 구현예에서, 향상된 면역 반응은 적응 면역 반응이다. 일부 구현예에서, 향상된 면역 반응은 선천적 면역 반응이다. 일부 구현예에서, 치료는 면역 반응을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 증가된 면역 반응은 적응 면역 반응이다. 일부 구현예에서, 증가된 면역 반응은 선천적 면역 반응이다.

일부 구현예에서, 대상체의 추가의 그룹은 골수성 장애에 대한 유전적 소인을 가지고 있지만, 골수성 장애의 임상 징후가 아직 입증되지 않은 대상체이다. 예를 들어, 악성 장애와 관련된 유전적 돌연변이에 양성으로 테스트되었지만, 여전히 가임기인 여성은 화학요법, 방사선 기반 요법, 및/또는 예방적 수술을 수행하기에 적합할 때까지 악성 장애의 발생을 예방하기 위한 예방적인 치료에서 본 개시의 세포(예를 들어, 면역반응성 세포) 중 하나 이상을 받는 것이 이익일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 진행된 형태의 질환을 가질 수 있고, 이 경우 치료 목적은 질환 진행 완화 또는 역전, 및/또는 부작용 개선을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 이미 치료된 병력을 가질 수 있으며, 이 경우 치료 목적은 통상적으로 재발 위험 감소 또는 지연을 포함할 수 있다.

병용 요법

일부 구현예에서, 본 개시의 하나 이상의 키메라 수용체를 발현하는 본 개시의 유전적으로 변형된 세포(예를 들어, 면역반응성 세포)는 다른 알려진 제제 및 요법과 조합하여 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 병용 요법은 하나 이상의 추가적인 치료제와 조합하여 투여될 수 있는 본 개시의 유전적으로 변형된 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 세포 및 하나 이상의 추가적인 치료제는 동일하거나 또는 별개의 조성물로 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 순차적 투여의 경우, 유전적으로 변형된 것이 먼저 투여될 수 있고, 하나 이상의 추가적인 제제가 두번째로 투여될 수 있거나, 투여 순서가 역전될 수 있다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 세포는 하나 이상의 추가적인 치료제를 발현하도록 추가로 변형된다.

일부 구현예에서, 본 개시의 유전적으로 변형된 세포는 수술, 화학요법, 방사선, 면역억제제(예를 들어, 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 마이코페놀레이트, 및 FK506), 항체, 또는 다른 면역제거제(예를 들어, CAMPATH 또는 항-CD3 항체), 사이톡신, 플루다라빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀산, 스테로이드, FR901228, 사이토카인, 방사선조사, 및 펩티드 백신과 조합하여 치료 계획에 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시의 유전적으로 변형된 세포는 림프고갈제와 조합하여 사용될 수 있다. 적합한 림프고갈제는 면역요법 전에, 림프구, 예를 들어, B 세포 림프구 및/또는 T 세포 림프구를 줄이거나 또는 감소시킨다. 적합한 림프고갈제의 예는, 제한 없이, 플루다라빈, 사이클로포스파미드, 코르티코스테로이드, 알렘투주맙, 전신 조사(TBI), 및 이의 임의의 조합을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 유전적으로 변형된 세포는 화학치료제와 조합하여 사용될 수 있다. 적합한 화학치료제는, 제한 없이, 안트라사이클린(예를 들어, 독소루비신), 빈카 알칼로이드(예를 들어, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈), 알킬화제(예를 들어, 사이클로포스파미드, 데카르바진, 멜팔란, 이포스파미드, 테모졸로미드), 면역 세포 항체(예를 들어, 알렘투주맙, 겜투주맙, 리툭시맙, 토시투모맙), 항대사물질(예를 들어, 엽산 길항제, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체 및 아데노신 데아미나제 억제제, 예컨대 플루다라빈), mTOR 억제제, TNFR 글루코코르티코이드 유도된 TNFR 관련 단백질(GITR) 작용제, 프로테오좀 억제제(예를 들어, 아클라시노마이신 A, 글리오톡신 또는 보르테조밉), 면역조절제, 예컨대 탈리도미드 또는 탈리도미드 유도체(예를 들어, 레날리도미드)를 포함한다.

병용 요법에 사용하기에 적합한 일반적인 화학치료제의 예는, 제한 없이, 아나스트로졸(Arimidex®), 비칼루타미드(Casodex®), 블레오마이신 술페이트(Blenoxane®), 부술판(Myleran®), 부술판 주사(Busulfex®), 카페시타빈(Xeloda®), N4-펜톡시카르보닐-5-데옥시-5-플루오로시티딘, 카르보플라틴(Paraplatin®), 카르무스틴(BiCNU®), 클로람부실(Leukeran®), 시스플라틴(Piatinol®), 클라드리빈(Leustatin®), 사이클로포스파미드(Cytoxan® 또는 Neosar®), 시타라빈, 시토신 아라비노시드(Cytosar-U®), 시타라빈 리포솜 주사(DepoCyt®), 다카르바진(DTIC-Dome®), 닥티노마이신(Actinomycin D, Cosmegan), 다우노루비신 하이드로클로라이드(Cerubidine®), 다우로루비신 시트레이트 리포솜 주사(DaunoXome®), 덱사메타손, 도세탁셀(Taxotere®), 독소루비신 하이드로클로라이드(Adriamycin®, Rubex®), 엡토포시드(Vepesid®), 플루다라빈 포스페이트(Fludara®), 5-플루오로우라실(Adrucil®, Efudex®), 플루타미드(Eulexin®), 테자시티빈, 겜시타빈(디플루오로데옥시시티딘), 하이드록시우레아(Hydrea®), 이다루비신(Idaniycin®), 이포스파미드(IFEX®), 이리노테칸(Camptosar®), L-아스파라기나제(ELSPAR®), 류코보린 칼슘, 멜팔란(Alkeran®), 6-머캅토퓨린(Purinethol®), 메토트렉세이트(Folex®), 미톡산트론(Novantrone®), 마일로타르그, 파클리탁셀(Taxol®), 포에닉스(Yttrium90/MX-DTPA), 펜토스타틴, 카르무스틴 이식물 함유 폴리펩로산 20(Gliadel®), 타목시펜 시트레이트(Nolvadex®), 테니포시드(Vumon®), 6-티오구아닌, 티오테파, 티라파자민(Tirazone®), 주사용 토포테칸 하이드로클로라이드(Hycamptin®), 빈블라스틴(Velban®), 빈크리스틴(Oncovin®), 및 비노렐빈(Navelbine®)을 포함한다.

적합한 알킬화제의 예는, 제한 없이, 질소 머스타드, 에틸렌이민 유도체, 알킬 술포네이트, 니트로소우레아 및 트리아젠): 우라실 머스타드(Aminouracil Mustard®, Chlorethaminacil®, Demethyldopan®, Desmethyldopan®, Haemanthamine®, Nordopan®, Uracil nitrogen mustard®. Uracilmostaza®, Uramustin®, Uramustine®), 클로르메틴(Mustargen®), 사이클로포스파미드(Cytoxan®, Neosar®, Clafen®, Endoxan®, Procytox®, Rev immune??), 이포스파미드(Mitoxana®), 멜팔란(Alkeran®), 클로람부실(Leukeran®), 피포브로만(Amedel®, Vercyte®), 트리에틸렌멜라민(Hemel®, Hexalen®, Hexastat®), 트리에틸렌티오포스포르아민, 테모졸로미드(Temodar®), 티오테파(Thioplex®), 부술판(Busilvex®, Myleran®), 카르무스틴(BiCNU®), 로무스틴(CeeNU®), 스트렙토조신(Zanosar®), 및 다카르바진(DTIC-Dome®)을 포함한다. 추가적인 예시적인 알킬화제는, 제한없이, 옥살리플라틴(Eloxatin®); 테모졸로미드(Temodar® 및 Temodal®); 닥티노마이신(또한 악티노마이신-D으로 알려져 있음, Cosmegen®); 멜팔란(또한 L-PAM, L-사르콜리신, 및 페닐알라닌 머스타드로 알려져 있음, Alkeran®); 알트레탐(또한 헥사메틸멜라민(HMM)으로 알려져 있음, Hexalen®); 카르무스틴(BiCNU®); 벤다무스틴(Treanda®); 부술판(Busulfex® 및 Myleran®); 카르보플라틴(Paraplatin®); 로무스틴(또한 CCNU로 알려져 있음, CeeNU®); 시스플라틴(또한 CDDP로 알려져 있음, Platinol® 및 Platinol®-AQ); 클로람부실(Leukeran®); 사이클로포스파미드(Cytoxan® 및 Neosar®); 다카르바진(또한 DTIC, DIC 및 이미다졸 카르복사미드로 알려져 있음, DTIC-Dome®); 아이트레타민(또한 헥사메틸멜라민(HMM)으로 알려져 있음, Hexalen®); 이포스파미드(Ifex®); 프레드누무스틴; 프로카바진(Matulane®); 메클로르에타민(또한 질소 머스타드, 무스틴 및 메클로로에타민 하이드로클로라이드로 알려져 있음, Mustargen®); 스트렙토조신(Zanosar®); 티오테파(또한 티오포스포아미드로 알려져 있음, TESPA 및 TSPA, Thioplex®); 사이클로포스파미드(Endoxan®, Cytoxan®, Neosar®, Procytox®, Revimmue®); 및 벤다무스틴 HC1(Treanda®)을 포함한다.

적합한 mTOR 억제제의 예는, 제한 없이, 템시롤리무스, 리다포롤리무스(데페롤리무스), AP23573, MK8669, 에베롤리무스(Afimtor® 또는 RADOOl), 라파마이신(AY22989, Sirolmius®), 및 XL765를 포함한다.

적합한 면역조절제의 예는, 제한 없이, 아푸투주맙, 페그필그라스팀(Neulasta®), 레날리도미드(CC-5013, Revlimid®), 탈리도미드(Thalomid®), 악티미드(CC4047), 및 IRX-2를 포함한다.

적합한 안트라사이클린의 예는, 제한 없이, 독소루비신(Adriamycin® 및 Rubex®); 블레오마이신(lenoxane®); 다우노루비신(다우르루비신 하이드로클로라이드, 다우노마이엠, 및 루비도마이신 하이드로클로라이드, Cerubidine®); 다우노루비신 리포소말(다우로루비신 시트레이트 리포솜, DaunoXome®); 미톡산트론(DHAD, Novantrone®); 에피루비신(Ellence??); 이다루비신(Idamycin®, Idamycin PES®); 미토마이신 C(Mutamycin®); 겔다나마이신; 헤르비마이신; 라비도마이신; 및 데사세트 이라비도마이신을 포함한다.

적합한 빈카 알칼로이드의 예는, 제한 없이, 비노렐빈 타르트레이트(Navelbine®), 빈크리스틴(Oncovin®), 및 빈데신(Eldisine®)); 빈블라스틴(또한 빈블라스틴 술페이트, 빈카류코블라스틴 및 VLB로 알려져 있음, Alkaban-AQ® 및 Velban®); 및 비노렐빈(Navelbme®)을 포함한다.

적합한 프로테오좀 억제제의 예는, 제한 없이, 보르테조밉(Velcade®); 카르필조밉; 마리조밉(NPI-0052); 익사조밉 시트레이트(MLN-9708); 델란조밉(CEP-18770); 및 ONX-0912를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 유전적으로 변형된 세포는 CD20 억제제, 예를 들어, 항-CD20 항체, 또는 이의 단편과 조합하여 투여된다. 예시적인 항-CD20 항체는, 제한 없이, 리툭시맙, 오파투무맙, 오크렐리주맙, 벨투주맙, 오비누투주맙, TRU- 015(Trubion Pharmaceuticals), 오카라투주맙, 및 Prol31921을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 유전적으로 변형된 세포는 종양분해성 바이러스와 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, 종양분해성 바이러스는 암 세포에서 선택적으로 복제하고 이의 사멸을 촉발하거나 또는 이의 성장을 늦출 수 있다. 일부 경우에, 종양분해성 바이러스는 비-암 세포에 영향을 미치지 않거나 또는 최소 영향을 미친다. 적합한 종양분해성 바이러스는, 제한 없이, 종양분해성 아데노바이러스, 종양분해성 단순 포진 바이러스, 종양분해성 레트로바이러스, 종양분해성 파보바이러스, 종양분해성 백시니아 바이러스, 종양분해성 신비스 바이러스, 종양분해성 인플루엔자 바이러스, 또는 종양분해성 RNA 바이러스(예를 들어, 종양분해성 레오바이러스, 종양분해성 뉴캐슬병 바이러스(NDV), 종양분해성 홍역 바이러스, 또는 종양분해성 수포성 구내염 바이러스(VSV))를 포함한다. 일부 구현예에서, 종양분해성 바이러스는 재조합 종양분해성 바이러스이다.

일부 구현예에서, 본 개시의 유전적으로 변형된 세포는 단백질 티로신 포스파타제 억제제, 예를 들어, SHP-I 억제제 또는 SHP-2 억제제와 조합하여 대상체에게 투여된다. 일 구현예에서, 본 개시의 유전적으로 변형된 세포는 키나제 억제제와 조합하여 사용될 수 있다. 적합한 키나제 억제제의 예는, 제한 없이, CDK4 억제제, CDK4/6 억제제, BTK 억제제, 포스파티딜이노시톨 3-키나제(PI3K) 억제제, mTOR 억제제, MNK 억제제, 및 역형성 림프종 키나제(ALK) 억제제를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 유전적으로 변형된 세포는 골수성-유래 억제인자 세포(MDSC)의 조절인자와 조합하여 대상체에게 투여된다. MDSC는 많은 고형 종양의 종양 부위 및 주변부에 축적된다. 이러한 세포는 T 세포 반응을 억제하여, 키메라 수용체 발현 세포 요법의 효능을 방해한다. 이론에 얽매이지 않기를 바라면서, MDSC 조절인자의 투여는 본 개시의 유전적으로 변형된 세포의 효능을 향상시키는 것으로 여겨진다. MDSC의 적합한 조절인자의 예는, 제한 없이, MCS110 및 BLZ945를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 유전적으로 변형된 세포는 면역억제성 형질 세포의 활성을 억제하거나 감소시키는 제제와 조합하여 대상체에게 투여된다. 면역억제성 형질 세포는 옥살리플라틴과 같은 T 세포-의존적 면역원성 화학요법을 방해하는 것으로 나타났다(Shalapour 등의 문헌[Nature 2015, 521 :94-101]). 일 구현예에서, 면역억제성 형질 세포는 IgA, 인터류킨 (IL)-10, 및 PD-L1 중 하나 이상을 발현할 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시의 유전적으로 변형된 세포는 인터류킨-15(IL-15) 폴리펩티드, 인터류킨-15 수용체 알파(IL-I5Ra) 폴리펩티드, 또는 IL-15 폴리펩티드 및 IL-15Ra 폴리펩티드 둘 다의 조합과 조합하여 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본 개시의 유전적으로 변형된 세포는 인터류킨-15(IL-15) 폴리펩티드, 인터류킨-15 수용체 알파(IL-I5Ra) 폴리펩티드, 또는 IL-15 폴리펩티드 및 IL-15Ra 폴리펩티드 둘 다의 조합을 발현하도록 추가로 변형된다.

일부 구현예에서 악성암종(예를 들어, 고형 종양)를 가진 대상체에게 제제, 예를 들어, 세포독성 또는 화학요법제, 생물학적 요법(예를 들어, 항체, 예를 들어, 단클론 항체, 또는 세포 요법), 또는 억제제(예를 들어, 키나제 억제제)와 조합하여 본 개시의 유전적으로 변형된 세포가 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체에게 세포독성제, 예를 들어, CPX-351(Celator Pharmaceuticals), 시타라빈, 다우노루비신, 보사록신(Sunesis Pharmaceuticals), 사파시타빈(Cyclacel Pharmaceuticals), 이다루비신, 또는 미톡산트론과 조합하여 본 개시의 유전적으로 변형된 세포가 투여된다. CPX-351은 시타라빈 및 다우노루비신을 5:1 몰비로 포함하는 리포솜 제형이다. 일부 구현예에서, 대상체에게 저메틸화제, 예를 들어, DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제, 예를 들어, 아자시티딘 또는 데시타빈과 조합하여 본원에 기재된 키메라 수용체 발현 세포가 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체에게 생물학적 요법, 예를 들어, 항체 또는 세포 요법, 예를 들어, 225Ac-린투주맙(Actimab-A; Actinium Pharmaceuticals), IPH2102(Innate Pharma/Bristol Myers Squibb), SGN-CD33A(Seattle Genetics), 또는 겜투주맙 오조가미신(Mylotarg; Pfizer)과 조합하여 본 개시의 유전적으로 변형된 세포가 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체에게 FLT3 억제제, 예를 들어, 소라페닙(Bayer), 미도스타우린(Novartis), 퀴자르티닙(Daiichi Sankyo), 크레노이아닙(Arog Pharmaceuticals), PLX3397(Daiichi Sankyo), AKN-028(Akinion Pharmaceuticals), 또는 ASP2215(Astelias)와 조합하여 본 개시의 유전적으로 변형된 세포가 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체에게 이소시트레이트 데하이드로게나제(IDH) 억제제, 예를 들어, AG-221(Celgene/ Agios) 또는 AG-120(Agios/Celgene)과 조합하여 본 개시의 유전적으로 변형된 세포가 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체에게 세포 주기 조절제, 예를 들어, 폴로-유사 키나제1(Plkl)의 억제제, 예를 들어, 볼라세르팁(Boehringer Ingelheim); 또는 사이클린-의존적 키나제 9(Cdk9)의 억제제, 예를 들어, 알보시딥(Tolero Pharmaceuticals/Sanofi Aventis)과 조합하여 본 개시의 유전적으로 변형된 세포가 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체에게 B 세포 수용체 신호전달 네트워크 억제제, 예를 들어, B-세포 림프종 2(Bcl-2)의 억제제, 예를 들어, 베네토클락스(Abbvie/Roche); 또는 버튼의 티로신 키나제(Btk)의 억제제, 예를 들어, 이브루티닙(Pharmacyclics/Johnson & Johnson Janssen Pharmaceutical)과 조합하여 본 개시의 유전적으로 변형된 세포가 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체에게 M1 아미노펩티다제의 억제제; 히스톤 데아세틸라제(HDAC)의 억제제, 예를 들어, 프라시노스타트(MEI Pharma); 다중-키나제 억제제, 예를 들어, 리고세르팁(Onconova Therapeutics/Baxter/SymBio); 또는 펩티드성 CXCR4 역 작용제, 예를 들어, BL-8040(BioLineRx)과 조합하여 본 개시의 유전적으로 변형된 세포가 투여된다.

일부 구현예에서, 대상체는 본 개시의 유전적으로 변형된 세포의 활성 또는 적합성을 향상시키는 제제를 투여받을 수 있다. 예를 들어, 제제는 면역 세포(예를 들어, T 세포 또는 NK 세포) 기능을 조정하거나 조절하는 분자를 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 세포 기능을 조정하거나 조절하는 분자는 억제 분자이다. 일부 구현예에서, 프로그램화 사멸 1(PD-1)과 같은 억제 분자는 면역 효과기 반응을 시작하는 유전적으로 변형된 세포의 능력을 감소시킬 수 있다. 적합한 억제 분자의 예는, 제한 없이, PD-1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM(예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD 160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3(CD276), B7-H4(VTCN1), HVEM(TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, GAL9, 아데노신, 및 TGF 베타를 포함한다. 예를 들어, DNA, RNA 또는 단백질 수준에서 억제에 의해 면역 세포 기능을 조정하거나 조절하는, 예를 들어, 억제하는 분자의 억제는 본 개시의 유전적으로 변형된 세포의 성능을 최적화할 수 있다. 일부 구현예에서, 제제, 예를 들어, 억제 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 억제 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 억제 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, dsRNA, 예를 들어, siRNA 또는 shRNA, 클러스터링된 규칙적인 간격을 갖는 짧은 회문구조 반복부(CRISPR), 전사-활성인자 유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), 또는 징크 핑거 엔도뉴클레아제(ZFN)는 유전적으로 변형된 세포에서 억제 분자의 발현을 억제하는 데 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 억제제는 shRNA이다. 일부 구현예에서, 본 개시의 유전적으로 변형된 세포는 억제 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 억제 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 억제 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, dsRNA, 예를 들어, siRNA 또는 shRNA, 클러스터링된 규칙적인 간격을 갖는 짧은 회문구조 반복부(CRISPR), 전사-활성인자 유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), 또는 징크 핑거 엔도뉴클레아제(ZFN)를 발현하도록 추가로 변형될 수 있으며, 유전적으로 변형된 세포에서 억제 분자의 발현을 억제하는 데 사용될 수 있다.

일 구현예에서, 면역 세포 기능을 조정하거나 조절하는, 예를 들어, 억제하는 제제는 본 개시의 유전적으로 변형된 세포 내에서 억제된다. 이러한 구현예에서, 면역 세포 기능을 조정하거나 조절하는, 예를 들어, 억제하는 분자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자는 본 개시의 키메라 수용체의 구성요소, 예를 들어, 모든 구성요소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 연결된다. 일 구현예에서, 면역 세포 기능을 조정하거나 조절하는, 예를 들어, 억제하는 분자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 분자는 면역 세포 기능을 조정하거나 조절하는, 예를 들어, 억제하는 분자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자가 발현되도록, 예를 들어, 유전적으로 변형된 세포 내에서 발현되도록 프로모터, 예를 들어, HI- 또는 U6-유래 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일 구현예에서, 면역 세포 기능을 조정하거나 조절하는, 예를 들어, 억제하는 분자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 분자는 키메라 수용체의 구성요소, 예를 들어, 모든 구성요소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 동일한 벡터, 예를 들어, 렌티바이러스 벡터 상에 존재한다. 이러한 구현예에서, 면역 세포 기능을 조정하거나 조절하는, 예를 들어, 억제하는 분자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 분자는 벡터, 예를 들어, 렌티바이러스 벡터 상에 키메라 수용체의 구성요소, 예를 들어, 모든 구성요소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대해 5'- 또는 3'-에 위치한다. 면역 세포 기능을 조정하거나 조절하는, 예를 들어, 억제하는 분자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 분자는 키메라 수용체의 구성요소, 예를 들어, 모든 구성요소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 동일하거나 상이한 방향으로 전사될 수 있다. 일 구현예에서, 면역 세포 기능을 조정하거나 조절하는, 예를 들어, 억제하는 분자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 분자는 키메라 수용체의 구성요소, 예를 들어, 모든 구성요소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 벡터가 아닌 벡터 상에 존재한다. 일 구현예에서, 면역 세포 기능을 조정하거나 조절하는, 예를 들어, 억제하는 분자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 분자는 유전적으로 변형된 세포 내에서 일시적으로 발현된다. 일 구현예에서, 면역 세포 기능을 조정하거나 조절하는, 예를 들어, 억제하는 분자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 분자는 본 개시의 유전적으로 변형된 세포의 게놈으로 안정하게 통합된다.

일 구현예에서, 면역 세포 기능을 조정하거나 조절하는, 예를 들어, 억제하는 제제는 억제 분자에 결합하는 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 예를 들어, 제제는 PD-l, PD-Ll, PD-L2 또는 CTLA4에 결합하는 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 일 구현예에서, 제제는 TIM3에 결합하는 항체 또는 항체 단편이다. 일 구현예에서, 제제는 LAG3에 결합하는 항체 또는 항체 단편이다.

일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 세포의 활성을 향상시키는 제제는 CEACAM 억제제(예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3, 및/또는 CEACAM-5 억제제)이다. 일 구현예에서, CEACAM의 억제제는 항-CEACAM 항체 분자이다. 일 구현예에서, 본 개시의 유전적으로 변형된 세포의 활성을 향상시키는 제제는 miR-17-92이다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 세포의 활성을 향상시키는 제제는 CD40L이다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 세포의 활성을 향상시키는 제제는 GM-CSF이다. 일부 구현예에서, 본 개시의 유전적으로 변형된 세포는 본 개시의 억제 분자에 결합하는 항체 또는 항체 단편을 발현하도록 추가로 변형된다.

일 구현예에서, 본 개시의 유전적으로 변형된 세포의 활성을 향상시키는 제제는 사이토카인이다. 사이토카인은 면역반응성 세포 확장, 분화, 생존, 및 항상성과 관련된 중요한 기능을 갖는다. 본 개시의 유전적으로 변형된 세포를 수용하는 대상체에게 투여될 수 있는 사이토카인은, 제한 없이, IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IIL-12, L-15, IL-18, 및 IL-21, 또는 이의 조합을 포함한다. 사이토카인은 1일 1회 또는 1일 1회 초과, 예를 들어, 1일 2회, 1일 3회, 또는 1일 4회 투여될 수 있다. 사이토카인은 1일을 초과하여 투여될 수 있으며, 예를 들어, 사이토카인은 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 또는 4주 동안 투여된다. 예를 들어, 사이토카인은 7일 동안 1일 1회 투여된다. 일부 구현예에서, 본 개시의 유전적으로 변형된 세포는 하나 이상의 사이토카인, 예컨대, IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-12, L-15, IL-18, 및 IL-21을 발현하도록 추가로 변형된다.

일부 구현예에서, 사이토카인은 유전적으로 변형된 세포와 동시에 또는 함께 투여될 수 있으며, 예를 들어, 동일한 날에 투여될 수 있다. 사이토카인은 유전적으로 변형된 세포와 동일한 약학적 조성물로 제조될 수 있거나, 별개의 약학적 조성물로 제조될 수 있다. 대안적으로, 사이토카인은 유전적으로 변형된 세포의 투여 직후, 예를 들어, 유전적으로 변형된 세포의 투여 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 7일 후에 투여될 수 있다. 사이토카인이 1일 초과에 걸쳐 발생하는 투약 계획으로 투여되는 일부 구현예에서, 사이토카인 투약 계획의 첫번째 날은 유전적으로 변형된 세포의 투여와 동일한 날일 수 있거나, 사이토카인 투약 계획의 첫번째 날은 유전적으로 변형된 세포의 투여 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 7일 후일 수 있다. 일 구현예에서, 첫번째 날에, 유전적으로 변형된 세포가 대상체에게 투여되고, 두번째 날에, 사이토카인이 다음 7일 동안 1일 1회 투여된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 유전적으로 변형된 세포의 투여 후 일정 기간 동안, 예를 들어, 유전적으로 변형된 세포의 투여 후 적어도 2주, 3주, 4주, 6주, 8주, 10주, 12주, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 또는 1년 이상 투여된다. 일 구현예에서, 사이토카인은 유전적으로 변형된 세포에 대한 대상체의 반응 평가 후에 투여된다.

키트

본 개시의 특정 양태는 암(예를 들어,고형 종양)의 치료 및/또는 예방을 위한 키트에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 키트는 유효량의 본 개시의 하나 이상의 키메라 수용체, 본 개시의 단리된 핵산, 본 개시의 벡터, 및/또는 본 개시의 세포(예를 들어, 면역반응성 세포)를 포함하는 치료적 또는 예방적 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 멸균 용기를 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 용기는 상자, 앰플, 병, 바이알, 튜브, 백, 파우치, 블리스터-팩, 또는 당 기술분야에 알려진 다른 적합한 용기 형태일 수 있다. 용기는 플라스틱, 유리, 적층된 종이, 금속 호일, 또는 약제를 보유하기에 적합한 다른 재료로 만들어질 수 있다.

일부 구현예에서, 치료적 또는 예방적 조성물은 암(예를 들어, 고형 종양)을 지니거나 암이 발생할 위험이 있는 대상체에게 치료적 또는 예방적 조성물을 투여하기 위한 지침과 함께 제공된다. 일부 구현예에서, 지침은 장애의 치료 및/또는 예방을 위한 조성물의 용도에 관한 정보를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 지침은 치료적 또는 예방적 조성물의 설명, 투여량 일정, 장애 또는 이의 증상의 치료 또는 예방을 위한 투여 일정, 예방 조치, 경고, 적응증, 금기증, 과다 투여량 정보, 이상 반응, 동물 약리학, 임상 연구, 및/또는 참고문헌을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 지침은 용기(존재하는 경우)에 직접적으로 인쇄되거나, 또는 용기에 적용된 라벨로서, 또는 용기 내에 또는 용기와 함께 공급된 별개의 시트, 팜플렛, 카드, 또는 폴더로서 인쇄될 수 있다.

열거된 구현예

1. V-Set 및 면역글로불린 도메인 함유 2(VSIG2)에 특이적인 항원 결합 도메인 및 이종 분자 또는 모이어티를 포함하는 키메라 단백질로서,

항원 결합 도메인이 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하고,

VH는 QGVRPFFDY(서열번호 4)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3)을 포함하는, 키메라 단백질.

2. V-Set 및 면역글로불린 도메인 함유 2(VSIG2)에 특이적인 항원 결합 도메인 및 이종 분자 또는 모이어티를 포함하는 키메라 단백질로서,

항원 결합 도메인은 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하고,

VH는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3)을 포함하고,

CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3의 아미노산 서열은 서열번호 1의 VH 영역 아미노산 서열 내에 포함되는, 키메라 단백질.

3. V-Set 및 면역글로불린 도메인 함유 2(VSIG2)에 특이적인 항원 결합 도메인 및 이종 분자 또는 모이어티를 포함하는 키메라 단백질로서,

VL은

GFTFSNS(서열번호 2)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), SDGGLY(서열번호 3)의 아미노산 서열을 갖는

중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 및 QGVRPFFDY(서열번호 4)의 아미노산 서열을 갖는

중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3)을 포함하는, 키메라 단백질.

4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, VL은 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함하되, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3의 아미노산 서열은 서열번호 9 또는 서열번호 10의 VL 영역 아미노산 서열 내에 포함된, 키메라 단백질.

5. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, VL은

RASENIYSYLA(서열번호 11) 또는 RASENIYSYLA(서열번호 12)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), NAETLPE(서열번호 13)의 아미노산 서열을 갖는

경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2), 및 QHHYVIPWT(서열번호 14)의 아미노산 서열을 갖는

경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함하는, 키메라 단백질.

6. V-Set 및 면역글로불린 도메인 함유 2(VSIG2)에 특이적인 항원 결합 도메인 및 이종 분자 또는 모이어티를 포함하는 키메라 단백질로서,

VL은 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함하고,

CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3의 아미노산 서열은 서열번호 9 또는 서열번호 10의 VL 영역 아미노산 서열 내에 포함되는, 키메라 단백질.

7. V-Set 및 면역글로불린 도메인 함유 2(VSIG2)에 특이적인 항원 결합 도메인 및 이종 분자 또는 모이어티를 포함하는 키메라 단백질로서,

VL은

RASENIYSYLA(서열번호 11) 또는 RASENLYSYLA(서열번호 12)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), NAETLPE(서열번호 13)의 아미노산 서열을 갖는

경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함하는, 키메라 단백질.

8. 구현예 6 또는 구현예 7에 있어서, VH는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3)을 포함하되, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3의 아미노산 서열은 서열번호 1의 VH 영역 아미노산 서열 내에 포함된, 키메라 단백질.

9. 구현예 6 내지 8 중 어느 하나에 있어서, VH은

중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3)을 포함하는, 키메라 단백질.

10. V-Set 및 면역글로불린 도메인 함유 2(VSIG2)에 특이적인 항원 결합 도메인 및 이종 분자 또는 모이어티를 포함하는 키메라 단백질로서,

VH는

QGVRPFFDY(서열번호 4)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3)을 포함하고,

VL은

QHHYVIPWT(서열번호 14)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함하는, 키메라 단백질.

11. 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, VH 영역은 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질

12. 구현예 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, VH 영역은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질.

13. 구현예 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, VL 영역은 서열번호 9의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질

14. 구현예 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, VL 영역은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질.

15. 구현예 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, VL 영역은 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질.

16. 구현예 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, VL 영역은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질.

17. V-Set 및 면역글로불린 도메인 함유 2(VSIG2)에 특이적인 항원 결합 도메인 및 이종 분자 또는 모이어티를 포함하는 키메라 단백질로서,

VH는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질.

18. 구현예 17에 있어서, VH 영역은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질.

19. 구현예 17 또는 구현예 18에 있어서, VL 영역은 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질.

20. 구현예 17 또는 구현예 18에 있어서, VL 영역은 서열번호 9의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질.

21. 구현예 17 또는 구현예 18에 있어서, VL 영역은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질.

22. 구현예 17 또는 구현예 18에 있어서, VL 영역은 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질.

23. 구현예 17 또는 구현예 18에 있어서, VL 영역은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질.

24. V-Set 및 면역글로불린 도메인 함유 2(VSIG2)에 특이적인 항원 결합 도메인 및 이종 분자 또는 모이어티를 포함하는 키메라 단백질로서,

항원 결합 도메인은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하되,

항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하고,

VL은 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질.

25. 구현예 24에 있어서, VL 영역은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질.

26. 구현예 24에 있어서, VL 영역은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질.

27. 구현예 24 내지 26 중 어느 하나에 있어서, VH 영역은 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질.

28. 구현예 24 내지 26 중 어느 하나에 있어서, VH 영역은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질.

29. V-Set 및 면역글로불린 도메인 함유 2(VSIG2)에 특이적인 항원 결합 도메인 및 이종 분자 또는 모이어티를 포함하는 키메라 단백질로서,

항원 결합 도메인은 VSIG2에 결합하기 위해 기준 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 경쟁하되,

기준 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하고,

VH는

VL은

30. V-Set 및 면역글로불린 도메인 함유 2(VSIG2)에 특이적인 항원 결합 도메인 및 이종 분자 또는 모이어티를 포함하는 키메라 단백질로서,

항원 결합 도메인은 기준 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 본질적으로 동일한 VSIG2 에피토프에 결합하되,

여기서 VH는

VL은

RASENIYSYLA의 아미노산 서열(서열번호 11) 또는 RASENLYSYLA의 아미노산 서열(서열번호 12)을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1),

31. V-Set 및 면역글로불린 도메인 함유 2(VSIG2)에 특이적인 항원 결합 도메인 및 이종 분자 또는 모이어티를 포함하는 키메라 단백질로서,

항원 결합 도메인은 기준 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 결합하는 VSIG2 에피토프와 동일한 인간 VSIG2의 에피토프에 결합하되,

VH는

VL은

32. 구현예 29 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 기준 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 VH 영역은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질.

33. 구현예 29 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 기준 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 VL 영역은 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질.

34. 구현예 1 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 항원 결합 도메인은 F(ab) 단편, F(ab') 단편, 또는 단쇄 가변 단편(scFV)을 포함하는, 키메라 단백질.

35. 구현예 34에 있어서, 항원 결합 도메인은 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함하는, 키메라 단백질.

36. 구현예 1 내지 35 중 어느 하나에 있어서, VH 및 VL은 펩티드 링커에 의해 분리되는, 키메라 단백질.

37. 구현예 36에 있어서, 항원 결합 도메인은 구조 VH-L-VL 또는 VL-L-VH를 포함하되, VH는 중쇄 가변 도메인이고, L은 펩티드 링커이며, VL은 경쇄 가변 도메인인, 키메라 단백질.

38. 구현예 36 또는 구현예 37에 있어서, 펩티드 링커는 서열번호 19 내지 35로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질.

39. 구현예 35 또는 구현예 36에 있어서, scFv는 서열번호 69 내지 74로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질.

40. 구현예 1 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 키메라 단백질은 항체-약물 접합체이고, 이종 분자 또는 모이어티는 치료제를 포함하는, 키메라 단백질.

41. 구현예 1 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 키메라 단백질은 키메라 항원 수용체(CAR)이고, 이종 분자 또는 모이어티는 막관통 도메인, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인, 힌지 도메인, 스페이서 영역, 하나 이상의 펩티드 링커, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 포함하는, 키메라 단백질.

42. 구현예 41에 있어서, CAR은 막관통 도메인을 포함하는, 키메라 단백질.

43. 구현예 41 또는 구현예 42에 있어서, CAR은 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 키메라 단백질.

44. 구현예 41 내지 43 중 어느 하나에 있어서, CAR은 면역 반응을 자극하는 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 활성화 CAR인, 키메라 단백질.

45. 구현예 41 내지 43 중 어느 하나에 있어서, CAR은 면역 반응을 억제하는 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 억제 CAR인, 키메라 단백질.

46. 구현예 45에 있어서, 세포내 억제 도메인은 효소 억제 도메인을 포함하는, 키메라 단백질.

47. 구현예 45에 있어서, 세포내 억제 도메인은 세포내 억제 공동 신호전달 도메인을 포함하는, 키메라 단백질.

48. 구현예 41 내지 47 중 어느 하나에 있어서, CAR은 항원-결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 스페이서 영역을 포함하는, 키메라 단백질.

49. 구현예 48에 있어서, 스페이서 영역은 서열번호 39~51로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는, 키메라 단백질.

50. 구현예 1 내지 49 중 어느 하나의 키메라 단백질 및 약학적으로 허용가능한 담체, 약학적으로 허용가능한 부형제, 또는 이의 조합을 포함하는 조성물.

51. 구현예 1 내지 49 중 어느 하나의 키메라 단백질을 암호화하는 조작된 폴리뉴클레오티드.

52. 구현예 51의 조작된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.

53. 구현예 51의 조작된 폴리뉴클레오티드 또는 구현예 52의 발현 벡터, 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 약학적으로 허용 가능한 부형제, 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물.

54. 구현예 51의 조작된 폴리뉴클레오티드 또는 구현예 52의 발현 벡터로 단리된 세포 또는 세포를 형질도입하는 단계를 포함하는, 조작된 세포를 제조하는 방법.

55. 구현예 54의 방법에 의해 생산된 조작된 세포.

56. 구현예 51의 조작된 폴리뉴클레오티드, 구현예 52의 발현 벡터, 또는 구현예 53의 조성물을 포함하는 단리된 세포.

57. 구현예 51의 조작된 폴리뉴클레오티드, 구현예 52의 발현 벡터를 발현하는 조작된 세포의 집단.

58. 구현예 1 내지 49 중 어느 하나의 키메라 단백질을 포함하는 단리된 세포.

59. 구현예 1 내지 49 중 어느 하나의 키메라 단백질을 발현하는 조작된 세포의 집단.

60. 구현예 56 내지 59 중 어느 하나에 있어서, 키메라 단백질은 재조합적으로 발현되는, 세포 또는 세포의 집단.

61. 구현예 56 내지 60 중 어느 하나에 있어서, 키메라 단백질은 벡터 또는 세포의 게놈의 선택된 유전자좌로부터 발현되는, 세포 또는 세포의 집단.

62. 구현예 56 내지 61 중 어느 하나에 있어서, 세포 또는 세포의 집단은 세포 표면 상에 발현된 하나 이상의 종양 표적화 키메라 수용체를 추가로 포함하는, 세포 또는 세포의 집단.

63. 구현예 62에 있어서, 하나 이상의 종양 표적화 키메라 수용체 각각은 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 조작된 T 세포 수용체인, 세포 또는 세포의 집단.

64. 구현예 56 내지 63 중 어느 하나에 있어서, 세포 또는 세포의 집단은 T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 감마-델타 T 세포, 세포독성 T 림프구(CTL), 조절 T 세포, 바이러스 특이적 T 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 자연 살해(NK) 세포, B 세포, 종양 침윤 림프구(TIL), 선천 림프구 세포, 비만 세포, 호산구, 호염기구, 호중구, 골수 세포, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포, 적혈구, 혈소판 세포, 인간 배아 줄기 세포(ESC), ESC 유래 세포, 다능성 줄기 세포, 중간엽 기질 세포(MSC), 유도 만능 줄기 세포(iPSC), 및 iPSC-유래 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포 또는 세포의 집단.

65. 구현예 56 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 세포는 자가유래인, 세포 또는 세포의 집단.

66. 구현예 56 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 세포는 동종이계인, 세포 또는 세포의 집단.

67. 구현예 56 내지 66 중 어느 하나의 세포 또는 조작된 세포의 집단의 유효량 및 약학적으로 허용가능한 담체, 약학적으로 허용가능한 부형제, 또는 이의 조합을 포함하는 약학적 조성물.

68. 구현예 1 내지 49 중 어느 하나의 키메라 단백질을 발현하는 유전적으로 변형된 세포의 유효량 및 약학적으로 허용가능한 담체, 약학적으로 허용가능한 부형제, 또는 이의 조합을 포함하는 약학적 조성물.

69. 구현예 67 또는 구현예 68에 있어서, 종양을 치료 및/또는 예방하기 위한 것인, 약학적 조성물.

70. 치료적 유효량의 구현예 53의 조성물 또는 구현예 55 내지 66 중 어느 하나의 임의의 세포 또는 구현예 67 내지 69 중 어느 하나의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법.

71. 종양을 가진 대상체에게 치료적 유효량의 구현예 53의 조성물, 또는 구현예 55 내지 66 중 어느 하나의 임의의 세포, 또는 구현예 67 내지 69 중 어느 하나의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양 세포에 대한 세포-매개 면역 반응을 자극하는 방법.

72. 치료 유효량의 구현예 53, 또는 구현예 55 내지 66 중 어느 하나의 임의의 세포 또는 구현예 67 내지 69 중 어느 하나의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 종양을 가진 대상체를 치료하는 방법.

73. 구현예 1 내지 49 중 어느 하나의 키메라 단백질을 포함하는, 종양을 치료 및/또는 예방하기 위한 키트.

74. 구현예 73에 있어서, 키트는 대상체에서 종양을 치료 및/또는 예방하기 위한 하나 이상의 항원 특이적 세포를 생산하는 키메라 단백질을 사용하기 위한 서면 지침을 추가로 포함하는, 키트.

75. 구현예 55 내지 66 중 어느 하나의 세포 또는 세포의 집단을 포함하는, 종양을 치료 및/또는 예방하기 위한 키트.

76. 구현예 75에 있어서, 키트는 대상체에서 종양을 치료 및/또는 예방하기 위해 세포를 사용하기 위한 서면 지침을 추가로 포함하는, 키트.

77. 구현예 51의 조작된 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 종양을 치료 및/또는 예방하기 위한 키트.

78. 구현예 77에 있어서, 키트는 대상체에서 종양을 치료 및/또는 예방하기 위한 하나 이상의 항원 특이적 세포를 생산하는 폴리뉴클레오티드를 사용하기 위한 서면 지침을 추가로 포함하는, 키트.

79. 구현예 52의 벡터를 포함하는, 종양을 치료 및/또는 예방하기 위한 키트.

80. 구현예 79에 있어서, 키트는 대상체에서 종양을 치료 및/또는 예방하기 위한 하나 이상의 항원 특이적 세포를 생산하는 벡터를 사용하기 위한 서면 지침을 추가로 포함하는, 키트.

81. 구현예 53, 또는 67 내지 69 중 어느 하나의 조성물을 포함하는, 종양을 치료 및/또는 예방하기 위한 키트.

82. 구현예 81에 있어서, 키트는 대상체에서 종양을 치료 및/또는 예방하기 위해 조성물을 사용하기 위한 서면 지침을 추가로 포함하는, 키트.

실시예

하기는 본 개시내용의 방법 및 조성물의 예이다. 일반적인 설명이 본원에 제공되면, 다양한 다른 구현예가 실행될 수 있음이 이해된다.

아래는 본 개시의 청구된 주제를 수행하기 위한 특정 구현예의 실시예이다. 실시예는 단지 예시 목적으로 제공되며, 어떠한 방식으로도 본 개시의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 사용된 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위한 노력이 이루어졌지만, 일부 실험적 오류 및 편차가 물론 허용되어야 한다.

실시예 1: 항-VSIG2 항체 서열 결정

방법

항체 시퀀싱

마우스 항-인간 VSIG2 단클론 항체 클론("Ab")을 시퀀싱하였다. 간략하게, 각각의 면역글로불린 사슬을 함유하는 샘플을 다양한 효소에 의해 소화시킨 다음 LC-MS/MS로 분석하였다. 드 노보 펩티드 시퀀싱을 사용하여 LC-MS/MS 데이터로부터 펩티드를 특성화한 다음 항체 서열로 조립하였다.

Ab 항-VSIG2 항체를 펩티드 시퀸싱하였다. 다수의 효소 분해의 LC-MS/MS 데이터를 조립된 항체 서열에 맵핑하였다. 중쇄 및 경쇄에서, 아미노산 잔기의 100%는 적어도 5번의 펩티드 스캔에 의해 커버되었으며, 유의한 지지 단편 이온을 가졌다(데이터 미도시).

경쇄 및 중쇄 가변 영역에 대한 시퀀싱 결과는도 1 및 도 2에 각각 도시되어 있다. 프레임워크 및 상보성 결정 영역(CDR)은 Chothia 주석 및 넘버링 체계뿐만 아니라 Kabat 주석 및 넘버링 체계에 따라 주석이 달린다. 서열은 표 A에 제시되어 있다. 류신(L) 및 이소류신(I)이 동일한 잔기 질량을 갖는 것을 고려하여, 추가 분석 기술을 사용하여 이들 잔기를 식별하였다. 도 1에 도시된 바와 같이 CDR-L1의 위치 21에서의 이소류신 잔기는 이소류신인 것으로 결정되었지만 100% 신뢰로 확인되지 않았다.

실시예 2: 항-VSIG2 활성화 CAR 생산 및 평가

CAR 작제물을 렌티바이러스 벡터에 클로닝하였다. Lenti-X 293T 시스템을 사용하여 렌티바이러스를 생산한다. 조사된 CAR 작제물에 대한 항원 특이성 및 도메인 구성은 아래 표 B에 기술되어 있고, scFv 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열은 각각 표 C 및 표 D에 제시되어 있다.

활성화 CAR NK 세포 검정

일차 NK 세포를 인간 공여자 PBMC로부터 단리하고 동결시킨다. 표 C에 기술된 바와 같이 선택된 활성화 CAR(aCAR)을 함유하는 CAR 렌티바이러스로 NK 세포를 형질도입한다.

사멸 검정을 수행하여 VSIG-2를 내인성으로 발현하는 인간 결장직장 선암종 세포주인 HT29 세포; 외인성으로 VSIG2를 발현하는 Ls174t 세포; 및 VSIG2를 외인성으로 발현하는 DLD1 세포를 포함하는 VSIG2 발현 세포의 사멸을 평가한다. 사멸 검정은 항-VSIG2 aCAR을 발현하는 NK 세포가 VSIG2-발현 세포를 사멸시킬 수 있음을 입증할 것이다.

실시예 3: 항-VSIG2 억제 CAR의 생성

항-VSIG2 억제 CAR(iCAR) 작제물을 각각 렌티바이러스 벡터 내로 클로닝하였다. 조사된 CAR 작제물에 대한 항원 특이성 및 도메인 구성은 아래 표 E에 기술되어 있다. iCAR 작제물의 각각의 항-VSIG2 scFv에 대한 아미노산 서열은 상기 표 C에 나타나 있다. 각각의 항-VSIG2 scFv에 대한 뉴클레오티드 서열은 아래 표 F에 나타나 있다.

NOT-게이트 항-VSIG2 iCAR의 억제 활성을 시험하기 위해, 개별 항-VSIG2 iCAR 및 항-CEA aCAR 작제물을 렌티바이러스 입자로 포장하고 일차 NK 세포를 형질도입하는 데 사용된다. 바이러스의 양은 p24 역가(형질도입 당 750,000 pg)로 설정하였다. iCAR 작제물은 puroR 카세트를 함유하였으므로, 형질도입 후 4일차부터 7일차까지 NK 세포 배양물에 퓨로마이신을 첨가하였고, 이때, 유세포 계측법으로 발현을 평가하고, 사멸 검정을 위해 NK 세포를 마이크로웰 플레이트로 옮겼다. NK 세포를 (1) aCAR 항원 CEA만을 발현하는 종양 세포, (2) aCAR 항원 CEA와 iCAR 항원 VSIG2 모두를 발현하는 종양 세포, 또는 (3) 두 유형 모두를 혼합한 종양 세포와 함께 배양하였다. 16~18시간 후, 유세포 계측법으로 배양물을 분석하고, 각 유형의 살아있는 표적 세포를 계수하였다. 주어진 NK 세포 유형의 aCAR 매개 사멸(기저 차감)을 먼저 총 사멸(표적 단독 조건과 비교하여 표적의 감소)을 계산한 다음, 대조군(iCAR 단독) NK 세포에 의한 총 사멸을 차감하여 정량화하였다. iCAR 항원이 있거나 없는 표적의 aCAR 매개 사멸 사이의 변화로서 iCAR 매개 보호를 정량화하였다. 사멸 검정 상청액을 TNFa 분비에 대해 분석하였고, aCAR 및 iCAR 성능 메트릭을 사멸과 유사하게 계산하였다. 발현 분석을 위해, 각각의 에피토프 태그에 대해 iCAR 및 aCAR을 염색한다. 결과는 NOT-게이트 항-VSIG2 iCAR의 억제 활성을 입증할 것이다.

실시예 4: NOT 게이트-기반 안전성 항원-양성 세포 보호

본 실시예에서, CEA 활성화 CAR과 병용된 NOT-게이트의 사용을 안전성 항원(VSIG2)을 발현하는 세포를 사용하여 평가하였다.

먼저, 안전성 항원(VSIG2)을 발현하는 세포주를 생성하였다. SEM 세포를 VSIG2 단백질을 발현하는 렌티바이러스 및 내성 선택 마커(블라스티딘)를 사용하여 형질도입하였다. 항생제 내성에 대해 세포를 선택하였고, 유세포 계측법을 통해 원하는 단백질의 발현을 평가하였다. SEM 세포도 CEACAM5-EGFP의 막-결합 형태를 암호화하는 렌티바이러스로 형질도입하였다. 세포를 EGFP 양성에 대해 분류하고 CEACAM5 및 VSIG2의 공동 발현을 유세포 계측을 통해 결정하였다.

다음으로, CEA 활성화 CAR 및 항-VSIG2 억제 CAR을 발현하는 NK 세포를 생성하였다. 다양한 억제 도메인을 갖는 다양한 항-VSIG2 억제 CAR(다수의 세포내 도메인을 갖는 것들은 막관통 도메인에 근접한 순서로 열거된다: LIR1-LIR1, KIR3DL1, KIR3DL1-KIR3DL1, LIR1-KIR3DL1, KIR3DL1-LIR1, KIR2DL1, LAIR1, SIGLEC2, 및 SIRPa). 단일 세포내 도메인만을 갖는 각각의 경우, 동일한 단백질의 막관통 도메인을 사용하였다. 2개의 세포내 도메인을 갖는 이들의 경우, 제1 세포내 도메인과 동일한 단백질로부터의 막관통 도메인을 사용하였다. 또한, 각각의 CAR은 CD8 힌지, 및 scFv와 힌지 사이에 V5 에피토프 태그를 포함하였다. 작제물 설명은 표 F에 제공되어 있다.

항-VSIG2 억제 CAR의 성분은 표 G에 제공된다.

일차, 공여자-유래 NK 세포를 먼저 확장시킨 다음, CAR을 암호화하는 레트로바이러스로 형질도입하였다. aCAR의 발현은 MyC 태그를 사용하여 유세포 계측을 통해 결정하였다. VSIG2 안전성 항원 시스템에 대한 발현은 도 3에 도시되어 있다.

CEA-aCAR 및 다양한 항--VSIG2 iCAR을 발현하는 NK 세포를 CEACAM5 단독 또는 CEACAM5/안전성 항원(VSIG2)을 발현하는 표적 세포와 공동 배양하였다. aCAR 단독, iCAR 단독 및 비-표적화 iCAR과 같은 적절한 대조군을 사용하였다.

도 4에 도시된 바와 같이 유세포 계측을 사용하여 NOT-게이팅된 CAR NK 세포와 밤새 공동 배양한 후 표적 세포 감소 백분율을 측정하였다. 도 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 다양한 억제 도메인을 함유하는 다양한 VSIG2-억제 CAR은 CEACAM5(적색 막대)만을 발현하는 표적 세포가 아니라 안전성 항원(VSIG2, 청색 막대)을 발현하는 표적 세포에서 CAR-매개된 세포 사멸의 유의한 감소를 보여준다. 이러한 결과는 VSIG2 억제 CAR의 발현이 안전성-항원 의존적 방식으로 활성화 CAR-매개된 신호전달을 감소시킨다는 것을 나타낸다.

실시예 5: VSIG2 결합제의 특성 분석 및 안전성 항원으로서의 용도

본 실시예에서, 전술한 실시예에 기술된 VSIG2 결합제를 포함하는 CAR을 활성화 CAR(aCAR) 및 억제 CAR(iCAR)로서의 활성에 대해 분석하였다.

본 실시예에 사용된 VSIG2 CAR의 요약은 아래 표 H에 제공되어 있다. 상응하는 서열이 위의 실시예 3에 제공되어 있다.

VSIG2 scFv 서열을 사용하여 상이한 링커 및 배향을 사용하여 CD28z aCAR을 구축하여 NK 세포에 의한 VSIG2-양성 표적 세포의 발현, 결합 및 사멸을 확인하였다. NK 세포를 상이한 VSIG2-aCARs 발현하는 레트로바이러스로 형질도입하였다(위의 표 H에 도시된 바와 같음). 상이한 VSIG2 결합제를 단클론 VSIG2 항체의 쥣과 서열에 기초하여 설계하고, CD28 ICD 및 CD3z 신호 전달 도메인을 갖는 CAR을 활성화하는 것으로 구축하였다. 형질도입된 NK 세포를 위의 실시예 4에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여, 인간 VSIG2를 과발현하도록 조작된 SEM 표적 세포와 1:8의 효과기 세포:표적 세포(E:T) 비율로 공동 배양하였다. 야생형(VSIG2 발현 없음) 표적 세포와 비교하여 표적 세포 사멸을 정량화하였다. 결과는 도 5에 도시된다.

형질도입 후 6일차에, 상이한 결합제를 갖는 VSIG2 aCAR의 발현을 결정하였다(도 6). VL/VH 배향은 scFv의 VH/VL 배향보다 더 높은 평균 형광 강도(MFI)를 생성하였음을 관찰하였다. 가장 높은 발현은 SB04750, SB04746, 및 SB04744에 대해 관찰되었다.

VSIG2-CAR NK 세포를 mKate 및 VSIG2를 발현하는 결장암(CRC) 표적 세포와 공동 배양하였다(Ls174t, 도 7a 및 DLD1, 도 7b). 표적 세포 성장은 적색 형광(mKATE)을 통해 Incucyte^® 상에서 측정하였다. 시험된 모든 VSIG2 aCAR은 미형질도입(NV) 및 대조군(SB04501, scFv가 없는 비표적화 aCAR)과 비교하여 사멸 증가를 나타냈다. 가장 높은 발현은 SB04750, SB04746, 및 SB04744에 대해 관찰되었다. 선택된 scFv에 의한 사멸은 도 7c(Ls174t 세포) 및 도 7d(DLD1 세포)에 추가로 도시된다.

FLT3 NOT 게이트로서 VSIG2

그런 다음, FLT3 NOT 게이트로서 VSIG2 iCAR의 사용을 시험하였다. NK 세포와 1:4 E:T 비율로 FLT3 및 VSIG2 둘 다를 발현하는 표적 세포와 비교하여 FLT3을 과발현하는 SEM 표적 세포(전술한 방법론을 사용하여 생성됨)를 공동 배양하였다. NK 세포를 상이한 결합제를 갖는 FLT3-aCAR 및 VSIG2-iCAR 발현하는 레트로바이러스로 형질도입하였다. 도 8은 두 표적 세포주에 걸쳐 증가된 사멸을 나타내는 VSIG2 CAR을 보여준다.

그런 다음, Luminex를 사용하여 NK 세포 및 FLT3-표적 세포와의 공동 배양 실험으로부터의 상청액을 분석하여 사이토카인 생성을 정량화하였다. NOT-게이트 CAR-NK 세포를 VSIG2-양성 표적 세포와 공동 배양하였을 때, 도 9에 나타낸 바와 같이, TNFα 생성이 감소하였다.

CEA NOT 게이트로서 VSIG2

CEA-aCAR 및 선택된 VSIG2 결합제를 사용하여 구축된 다양한 VSIG2-iCARs을 발현하는 레트로바이러스로 NK 세포를 형질도입하고, 유세포 계측법을 사용하여 NK 세포에서 CEA-aCAR 및 VSIG2-iCAR의 발현을 결정하였다(도 10a, 대조군 주는 도 10b에 도시됨).

그런 다음, 형질도입된 NK 세포를 인간 VSIG2를 1:2 E:T 비율로 과발현하도록 조작된 표적 세포와 공동 배양하였다. 표적 세포 감소를 VSIG2(좌측 열)를 발현하지 않는 표적 세포와 비교하였다. 중요하게는, 몇몇 VSIG2 iCARS는 VSIG2-의존성 방식으로 표적 세포의 NK 매개 사멸을 유의하게 감소시켰다(도 11).

이들 데이터는 시험된 VSIG2 scFv가, 예를 들어 활성화 CAR과 조합하여 NOT GATE 기술로서, 안전 항원으로서 사용될 수 있음을 입증한다.

참조에 의한 포함

본 출원에 인용된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및 다른 문서는 각각의 개별 간행물, 특허, 특허 출원 또는 다른 문서가 모든 목적을 위해 참조로 포함되도록 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

균등물

다양한 특정 구현예가 예시되고 기재되었지만, 상기 명세서는 제한적이지 않다. 다양한 변화가 본 개시내용의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 본 명세서를 검토할 때 많은 변경이 당업자에게 명백해질 것이다.

기타 서열

본 개시와 관련된 다른 서열이 아래에 제시된다:

SEQUENCE LISTING <110> SENTI BIOSCIENCES, INC. <120> CHIMERIC RECEPTORS AND METHODS OF USE THEREOF <130> STB-033WO <140> PCT/US2022/028202 <141> 2022-05-06 <150> 63/283,147 <151> 2021-11-24 <150> 63/185,896 <151> 2021-05-07 <160> 105 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Glu Val Gln Met Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ser 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Asp Gly Gly Leu Tyr Thr His Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Ser Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Gly Val Arg Pro Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 24 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 25 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 25 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 26 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 26 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 27 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 27 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 28 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 28 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 29 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 29 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 30 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 30 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 31 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 31 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 32 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 32 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 33 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 33 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 34 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 34 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr 1 5 10 15 Lys Gly <210> 35 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 35 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu 1 5 10 15 Ala Ala Ala Lys 20 <210> 36 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 36 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Val Ile Thr 20 <210> 37 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 37 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg 20 25 <210> 38 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 38 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 1 5 10 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Sequence: Synthetic peptide <400> 42 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Ala Pro Ser Ala Pro 1 5 10 <210> 43 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 43 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 44 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 44 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 1 5 10 <210> 45 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 45 Ala Ala Ala Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr 1 5 10 15 Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro 20 25 30 Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val 35 40 45 His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro 50 55 60 Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu 65 70 75 80 Tyr Cys Asn His Arg Asn 85 <210> 46 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 70 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Phe Asn Ala Glu Thr Leu Pro Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Thr Gly Ser Gly Thr His Phe Ser Leu Arg Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Val Ile Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Met Val Glu 115 120 125 Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys 130 135 140 Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ser Gly Met Ser Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Asp Gly 165 170 175 Gly Leu Tyr Thr His Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile 180 185 190 Ser Arg Asp Asn Gly Lys Ser Thr 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gtgcccagca gattttctgg aacaggcagc 600 ggcacccact tcagcctgag aatcaatagc ctgcagcctg aggacttcgg cagctactac 660 tgccagcacc actacgtgat cccttggacc tttggcggag gcaccaagct ggaaatcaag 720 <210> 76 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 76 gacatccaga tgacacagtc tccagccagc ctgtctgcct ctgtgggaga gacagtgacc 60 atgacctgtc gggccagcga gaacatctac agctacctgg cctggtatca gcagaagcag 120 ggcaagtctc ctcagctgct ggtgttcaac gccgagacac tgcctgaagg cgtgcccagc 180 agattttctg gaacaggcag cggcacccac ttcagcctga gaatcaatag cctgcagcct 240 gaggacttcg gcagctacta ctgccagcac cactacgtga tcccttggac ctttggcgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa gggcggaggc ggatcaggtg gcggaggaag tggcggcgga 360 ggatctgagg tgcagatggt tgagtctggc ggcgatctgg ttaagcctgg cggaagcctg 420 aagctgtctt gtgccgccag cggcttcacc ttcagcaata gcggcatgag ctgggtccga 480 cagacccctg acaagagact ggaatgggtc gccagcatct ctgacggcgg cctgtacaca 540 cactaccccg attctgtgaa gggcagattc accatcagca gagacaacgg caagagcacc 600 ctgtacctgc agatgagcag cctgagaagc gaggacaccg ccatctacta ctgcgccaga 660 cagggcgtca gacccttctt cgattattgg ggccagggca ccacactgac cgtgtcatct 720 <210> 77 <211> 729 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 77 gaggtgcaga tggttgagtc tggcggcgat ctggttaagc ctggcggaag cctgaagctg 60 tcttgtgccg ccagcggctt caccttcagc aatagcggca tgagctgggt ccgacagacc 120 cctgacaaga gactggaatg ggtcgccagc atctctgacg gcggcctgta cacacactac 180 cccgattctg tgaagggcag attcaccatc agcagagaca acggcaagag caccctgtac 240 ctgcagatga gcagcctgag aagcgaggac accgccatct actactgcgc cagacagggc 300 gtcagaccct tcttcgatta ttggggccag ggcaccacac tgaccgtgtc atctggcagc 360 acaagcggct ctggaaaacc tggatctggc gagggctcta ccaagggcga catccagatg 420 acacagtctc cagccagcct gtctgcctct gtgggagaga cagtgaccat gacctgtcgg 480 gccagcgaga acatctacag ctacctggcc tggtatcagc agaagcaggg caagtctcct 540 cagctgctgg tgttcaacgc cgagacactg cctgaaggcg tgcccagcag attttctgga 600 acaggcagcg gcacccactt cagcctgaga atcaatagcc tgcagcctga ggacttcggc 660 agctactact gccagcacca ctacgtgatc ccttggacct ttggcggagg caccaagctg 720 gaaatcaag 729 <210> 78 <211> 729 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 78 gacatccaga tgacacagtc tccagccagc ctgtctgcct ctgtgggaga gacagtgacc 60 atgacctgtc gggccagcga gaacatctac agctacctgg cctggtatca gcagaagcag 120 ggcaagtctc ctcagctgct ggtgttcaac gccgagacac tgcctgaagg cgtgcccagc 180 agattttctg gaacaggcag cggcacccac ttcagcctga gaatcaatag cctgcagcct 240 gaggacttcg gcagctacta ctgccagcac cactacgtga tcccttggac ctttggcgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa gggcagcaca agcggctctg gaaaacctgg atctggcgag 360 ggctctacca agggcgaggt gcagatggtt gagtctggcg gcgatctggt taagcctggc 420 ggaagcctga agctgtcttg tgccgccagc ggcttcacct tcagcaatag cggcatgagc 480 tgggtccgac agacccctga caagagactg gaatgggtcg ccagcatctc tgacggcggc 540 ctgtacacac actaccccga ttctgtgaag ggcagattca ccatcagcag agacaacggc 600 aagagcaccc tgtacctgca gatgagcagc ctgagaagcg aggacaccgc catctactac 660 tgcgccagac agggcgtcag acccttcttc gattattggg gccagggcac cacactgacc 720 gtgtcatct 729 <210> 79 <211> 690 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 79 gaggtgcaga tggttgagtc tggcggcgat ctggttaagc ctggcggaag cctgaagctg 60 tcttgtgccg ccagcggctt caccttcagc aatagcggca tgagctgggt ccgacagacc 120 cctgacaaga gactggaatg ggtcgccagc atctctgacg gcggcctgta cacacactac 180 cccgattctg tgaagggcag attcaccatc agcagagaca acggcaagag caccctgtac 240 ctgcagatga gcagcctgag aagcgaggac accgccatct actactgcgc cagacagggc 300 gtcagaccct tcttcgatta ttggggccag ggcaccacac tgaccgtgtc atctggtggc 360 ggaggcagcg acatccagat gacacagtct ccagccagcc tgtctgcctc tgtgggagag 420 acagtgacca tgacctgtcg ggccagcgag aacatctaca gctacctggc ctggtatcag 480 cagaagcagg gcaagtctcc tcagctgctg gtgttcaacg ccgagacact gcctgaaggc 540 gtgcccagca gattttctgg aacaggcagc ggcacccact tcagcctgag aatcaatagc 600 ctgcagcctg aggacttcgg cagctactac tgccagcacc actacgtgat cccttggacc 660 tttggcggag gcaccaagct ggaaatcaag 690 <210> 80 <211> 690 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 80 gacatccaga tgacacagtc tccagccagc ctgtctgcct ctgtgggaga gacagtgacc 60 atgacctgtc gggccagcga gaacatctac agctacctgg cctggtatca gcagaagcag 120 ggcaagtctc ctcagctgct ggtgttcaac gccgagacac tgcctgaagg cgtgcccagc 180 agattttctg gaacaggcag cggcacccac ttcagcctga gaatcaatag cctgcagcct 240 gaggacttcg gcagctacta ctgccagcac cactacgtga tcccttggac ctttggcgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa gggtggcgga ggcagcgagg tgcagatggt tgagtctggc 360 ggcgatctgg ttaagcctgg cggaagcctg aagctgtctt gtgccgccag cggcttcacc 420 ttcagcaata gcggcatgag ctgggtccga cagacccctg acaagagact ggaatgggtc 480 gccagcatct ctgacggcgg cctgtacaca cactaccccg attctgtgaa gggcagattc 540 accatcagca gagacaacgg caagagcacc ctgtacctgc agatgagcag cctgagaagc 600 gaggacaccg ccatctacta ctgcgccaga cagggcgtca gacccttctt cgattattgg 660 ggccagggca ccacactgac cgtgtcatct 690 <210> 81 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 81 gaggtgcaga tggtggaaag cggcggagat ctggtgaagc ctggcggcag cctgaagctg 60 tcttgtgccg cttctggctt taccttcagc aacagcggca tgagctgggt cagacagacc 120 cctgataagc ggctggaatg ggtggccagc atcagcgacg gcggactgta cacccactac 180 ccagacagcg tgaaaggcag attcacaatc agccgggaca acggcaagtc caccctgtat 240 ctgcagatgt ctagcctgag aagcgaggac accgccatct actactgcgc cagacaaggc 300 gtgcgcccct tcttcgacta ctggggccag ggaacaacac tcaccgtgtc ctccggcgga 360 ggcggatcag gtggcggagg aagtggcggc ggaggatctg atatccagat gacccagagc 420 cctgcttctc tgagcgccag cgtgggcgag acagtgacca tgacctgtag agcctccgag 480 aatatctaca gctacctggc ctggtaccag cagaaacagg gcaagagccc ccagctgctg 540 gtctttaacg ccgagacact gcctgaaggc gtgccatcta gattctccgg caccggcagc 600 ggcacacact tcagcctccg gatcaacagc ctgcaacctg aggacttcgg atcttattac 660 tgccagcacc actacgtgat cccctggacc ttcggcggag gcaccaagct ggaaatcaag 720 <210> 82 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 82 gatatccaga tgacccagag ccctgcttct ctgagcgcca gcgtgggcga gacagtgacc 60 atgacctgta gagcctccga gaatatctac agctacctgg cctggtacca gcagaaacag 120 ggcaagagcc cccagctgct ggtctttaac gccgagacac tgcctgaagg cgtgccatct 180 agattctccg gcaccggcag cggcacacac ttcagcctcc ggatcaacag cctgcaacct 240 gaggacttcg gatcttatta ctgccagcac cactacgtga tcccctggac cttcggcgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa gggcggaggc ggatcaggtg gcggaggaag tggcggcgga 360 ggatctgagg tgcagatggt ggaaagcggc ggagatctgg tgaagcctgg cggcagcctg 420 aagctgtctt gtgccgcttc tggctttacc ttcagcaaca gcggcatgag ctgggtcaga 480 cagacccctg ataagcggct ggaatgggtg gccagcatca gcgacggcgg actgtacacc 540 cactacccag acagcgtgaa aggcagattc acaatcagcc gggacaacgg caagtccacc 600 ctgtatctgc agatgtctag cctgagaagc gaggacaccg ccatctacta ctgcgccaga 660 caaggcgtgc gccccttctt cgactactgg ggccagggaa caacactcac cgtgtcctcc 720 <210> 83 <211> 729 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 83 gaggtgcaga tggtggaaag cggcggagat ctggtgaagc ctggcggcag cctgaagctg 60 tcttgtgccg cttctggctt taccttcagc aacagcggca tgagctgggt cagacagacc 120 cctgataagc ggctggaatg ggtggccagc atcagcgacg gcggactgta cacccactac 180 ccagacagcg tgaaaggcag attcacaatc agccgggaca acggcaagtc caccctgtat 240 ctgcagatgt ctagcctgag aagcgaggac accgccatct actactgcgc cagacaaggc 300 gtgcgcccct tcttcgacta ctggggccag ggaacaacac tcaccgtgtc ctccggcagc 360 acaagcggct ctggaaaacc tggatctggc gagggctcta ccaagggcga tatccagatg 420 acccagagcc ctgcttctct gagcgccagc gtgggcgaga cagtgaccat gacctgtaga 480 gcctccgaga atatctacag ctacctggcc tggtaccagc agaaacaggg caagagcccc 540 cagctgctgg tctttaacgc cgagacactg cctgaaggcg tgccatctag attctccggc 600 accggcagcg gcacacactt cagcctccgg atcaacagcc tgcaacctga ggacttcgga 660 tcttattact gccagcacca ctacgtgatc ccctggacct tcggcggagg caccaagctg 720 gaaatcaag 729 <210> 84 <211> 729 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 84 gatatccaga tgacccagag ccctgcttct ctgagcgcca gcgtgggcga gacagtgacc 60 atgacctgta gagcctccga gaatatctac agctacctgg cctggtacca gcagaaacag 120 ggcaagagcc cccagctgct ggtctttaac gccgagacac tgcctgaagg cgtgccatct 180 agattctccg gcaccggcag cggcacacac ttcagcctcc ggatcaacag cctgcaacct 240 gaggacttcg gatcttatta ctgccagcac cactacgtga tcccctggac cttcggcgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa gggcagcaca agcggctctg gaaaacctgg atctggcgag 360 ggctctacca agggcgaggt gcagatggtg gaaagcggcg gagatctggt gaagcctggc 420 ggcagcctga agctgtcttg tgccgcttct ggctttacct tcagcaacag cggcatgagc 480 tgggtcagac agacccctga taagcggctg gaatgggtgg ccagcatcag cgacggcgga 540 ctgtacaccc actacccaga cagcgtgaaa ggcagattca caatcagccg ggacaacggc 600 aagtccaccc tgtatctgca gatgtctagc ctgagaagcg aggacaccgc catctactac 660 tgcgccagac aaggcgtgcg ccccttcttc gactactggg gccagggaac aacactcacc 720 gtgtcctcc 729 <210> 85 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 85 ggaggcggag gatctggtgg cggaggaagt ggcggaggcg gttct 45 <210> 86 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 86 ggtggtggtg gcagtggtgg cggtggctca ggtggcggcg gatcaggcgg tggtggttct 60 ggcggcggtg gatct 75 <210> 87 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 87 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Phe Asn Ala Glu Thr Leu Pro Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Thr Gly Ser Gly Thr His Phe Ser Leu Arg Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Val Ile Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly 100 105 110 Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln 115 120 125 Met Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys 130 135 140 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ser Gly Met Ser 145 150 155 160 Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile 165 170 175 Ser Asp Gly Gly Leu Tyr Thr His Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg 180 185 190 Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Ser Thr Leu Tyr Leu Gln Met 195 200 205 Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln 210 215 220 Gly Val Arg Pro Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 88 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 88 Ile Leu Ile Gly Val Ser Val Val Phe Leu Phe Cys Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Val Leu Phe Cys Leu 20 <210> 89 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 89 His Arg Gln Asn Gln Ile Lys Gln Gly Pro Pro Arg Ser Lys Asp Glu 1 5 10 15 Glu Gln Lys Pro Gln Gln Arg Pro Asp Leu Ala Val Asp Val Leu Glu 20 25 30 Arg Thr Ala Asp Lys Ala Thr Val Asn Gly Leu Pro Glu Lys Asp Arg 35 40 45 Glu Thr Asp Thr Ser Ala Leu Ala Ala Gly Ser Ser Gln Glu Val Thr 50 55 60 Tyr Ala Gln Leu Asp His Trp Ala Leu Thr Gln Arg Thr Ala Arg Ala 65 70 75 80 Val Ser Pro Gln Ser Thr Lys Pro Met Ala Glu Ser Ile Thr Tyr Ala 85 90 95 Ala Val Ala Arg His 100 <210> 90 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 90 Val Ile Gly Ile Leu Val Ala Val Ile Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Phe Leu Ile 20 <210> 91 <211> 168 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 91 Leu Arg His Arg Arg Gln Gly Lys His Trp Thr Ser Thr Gln Arg Lys 1 5 10 15 Ala Asp Phe Gln His Pro Ala Gly Ala Val Gly Pro Glu Pro Thr Asp 20 25 30 Arg Gly Leu Gln Trp Arg Ser Ser Pro Ala Ala Asp Ala Gln Glu Glu 35 40 45 Asn Leu Tyr Ala Ala Val Lys His Thr Gln Pro Glu Asp Gly Val Glu 50 55 60 Met Asp Thr Arg Ser Pro His Asp Glu Asp Pro Gln Ala Val Thr Tyr 65 70 75 80 Ala Glu Val Lys His Ser Arg Pro Arg Arg Glu Met Ala Ser Pro Pro 85 90 95 Ser Pro Leu Ser Gly Glu Phe Leu Asp Thr Lys Asp Arg Gln Ala Glu 100 105 110 Glu Asp Arg Gln Met Asp Thr Glu Ala Ala Ala Ser Glu Ala Pro Gln 115 120 125 Asp Val Thr Tyr Ala Gln Leu His Ser Leu Thr Leu Arg Arg Glu Ala 130 135 140 Thr Glu Pro Pro Pro Ser Gln Glu Gly Pro Ser Pro Ala Val Pro Ser 145 150 155 160 Ile Tyr Ala Thr Leu Ala Ile His 165 <210> 92 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 92 Ile Leu Ile Gly Thr Ser Val Val Ile Ile Leu Phe Ile Leu Leu Phe 1 5 10 15 Phe Leu Leu <210> 93 <211> 84 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 93 His Arg Trp Cys Ser Asn Lys Lys Asn Ala Ala Val Met Asp Gln Glu 1 5 10 15 Ser Ala Gly Asn Arg Thr Ala Asn Ser Glu Asp Ser Asp Glu Gln Asp 20 25 30 Pro Gln Glu Val Thr Tyr Thr Gln Leu Asn His Cys Val Phe Thr Gln 35 40 45 Arg Lys Ile Thr Arg Pro Ser Gln Arg Pro Lys Thr Pro Pro Thr Asp 50 55 60 Ile Ile Val Tyr Thr Glu Leu Pro Asn Ala Glu Ser Arg Ser Lys Val 65 70 75 80 Val Ser Cys Pro <210> 94 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 94 Val Ala Val Gly Leu Gly Ser Cys Leu Ala Ile Leu Ile Leu Ala Ile 1 5 10 15 Cys Gly Leu <210> 95 <211> 141 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 95 Lys Leu Gln Arg Arg Trp Lys Arg Thr Gln Ser Gln Gln Gly Leu Gln 1 5 10 15 Glu Asn Ser Ser Gly Gln Ser Phe Phe Val Arg Asn Lys Lys Val Arg 20 25 30 Arg Ala Pro Leu Ser Glu Gly Pro His Ser Leu Gly Cys Tyr Asn Pro 35 40 45 Met Met Glu Asp Gly Ile Ser Tyr Thr Thr Leu Arg Phe Pro Glu Met 50 55 60 Asn Ile Pro Arg Thr Gly Asp Ala Glu Ser Ser Glu Met Gln Arg Pro 65 70 75 80 Pro Pro Asp Cys Asp Asp Thr Val Thr Tyr Ser Ala Leu His Lys Arg 85 90 95 Gln Val Gly Asp Tyr Glu Asn Val Ile Pro Asp Phe Pro Glu Asp Glu 100 105 110 Gly Ile His Tyr Ser Glu Leu Ile Gln Phe Gly Val Gly Glu Arg Pro 115 120 125 Gln Ala Gln Glu Asn Val Asp Tyr Val Ile Leu Lys His 130 135 140 <210> 96 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 96 Ile Val Val Gly Val Val Cys Thr Leu Leu Val Ala Leu Leu Met Ala 1 5 10 15 Ala Leu Tyr Leu 20 <210> 97 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 97 Val Arg Ile Arg Gln Lys Lys Ala Gln Gly Ser Thr Ser Ser Thr Arg 1 5 10 15 Leu His Glu Pro Glu Lys Asn Ala Arg Glu Ile Thr Gln Asp Thr Asn 20 25 30 Asp Ile Thr Tyr Ala Asp Leu Asn Leu Pro Lys Gly Lys Lys Pro Ala 35 40 45 Pro Gln Ala Ala Glu Pro Asn Asn His Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Gln 50 55 60 Thr Ser Pro Gln Pro Ala Ser Glu Asp Thr Leu Thr Tyr Ala Asp Leu 65 70 75 80 Asp Met Val His Leu Asn Arg Thr Pro Lys Gln Pro Ala Pro Lys Pro 85 90 95 Glu Pro Ser Phe Ser Glu Tyr Ala Ser Val Gln Val Pro Arg Lys 100 105 110 <210> 98 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 98 Ile Leu Ile Gly Thr Ser Val Val Ile Ile Leu Phe Ile Leu Leu Leu 1 5 10 15 Phe Phe Leu Leu 20 <210> 99 <211> 84 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 99 His Leu Trp Cys Ser Asn Lys Lys Asn Ala Ala Val Met Asp Gln Glu 1 5 10 15 Pro Ala Gly Asn Arg Thr Ala Asn Ser Glu Asp Ser Asp Glu Gln Asp 20 25 30 Pro Glu Glu Val Thr Tyr Ala Gln Leu Asp His Cys Val Phe Thr Gln 35 40 45 Arg Lys Ile Thr Arg Pro Ser Gln Arg Pro Lys Thr Pro Pro Thr Asp 50 55 60 Thr Ile Leu Tyr Thr Glu Leu Pro Asn Ala Lys Pro Arg Ser Lys Val 65 70 75 80 Val Ser Cys Pro <210> 100 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 100 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15 Leu Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 35 40 45 <210> 101 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> SITE <222> (1)..(30) <223> This sequence may encompass 1-6 'Gly Gly Gly Gly Ser' repeating units <400> 101 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 <210> 102 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 102 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 103 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 103 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Phe Asn Ala Glu Thr Leu Pro Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Thr Gly Ser Gly Thr His Phe Ser Leu Arg Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Val Ile Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 104 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 104 Glu Val Gln Met Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ser 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Asp Gly Gly Leu Tyr Thr His Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Ser Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Gly Val Arg Pro Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 105 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 105 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 10 15

Claims

V-Set 및 면역글로불린 함유 도메인 2 (VSIG2)에 특이적인 항원 결합 도메인 및 이종 분자 또는 모이어티를 포함하는 키메라 단백질로서,
상기 항원 결합 도메인은 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하고,
(a) 상기 VL은
GFTFSNS(서열번호 2)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1),
SDGGLY(서열번호 3)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 및
QGVRPFFDY(서열번호 4)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3)을 포함하고,
상기 VL은
RASENIYSYLA(서열번호 11) 또는 RASENLYSYLA(서열번호 12)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1),
NAETLPE(서열번호 13)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2), 및
QHHYVIPWT(서열번호 14)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함하거나,
(b) 상기 VH는
서열번호 1의 VH 영역 아미노산 서열 내에 포함된 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), 서열번호 1의 VH 영역 아미노산 서열 내에 포함된 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 및 서열번호 1의 VH 영역 아미노산 서열 내에 포함된 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3)을 포함하고,
상기 VL은
경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1)이 서열번호 9의 VL 영역 아미노산 서열 내에 포함되고, 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2)는 서열번호 9의 VL 영역 아미노산 서열 내에 포함되고, 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)은 서열번호 9의 VL 영역 아미노산 서열 내에 포함되는 것을 포함하거나,
(c) 상기 VH는
서열번호 1의 VH 영역 아미노산 서열 내에 포함된 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), 서열번호 1의 VH 영역 아미노산 서열 내에 포함된 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 및 서열번호 1의 VH 영역 아미노산 서열 내에 포함된 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3)을 포함하고,
상기 VL은
경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1)은 서열번호 10의 VL 영역 아미노산 서열 내에 포함되고, 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2)는 서열번호 10의 VL 영역 아미노산 서열 내에 포함되고, 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)은 서열번호 10의 VL 영역 아미노산 서열 내에 포함되는 것을 포함하고,
선택적으로, 상기 기준 항체의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3의 아미노산 서열은 Kabat 또는 Chothia 넘버링 체계에 기초하여 정의되는, 키메라 단백질.
제1항에 있어서, 상기 VH 영역은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 VL 영역은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 VL 영역은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인은 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함하고,
선택적으로, scFv의 VH 및 VL은 펩티드 링커에 의해 분리되고,
선택적으로, 상기 항원 결합 도메인은 구조 VH-L-VL 또는 VL-L-VH를 포함하되, VH는 중쇄 가변 도메인이고, L은 펩티드 링커이고, VL은 경쇄 가변 도메인이고/이거나,
선택적으로, 상기 scFv는 서열번호 19~35 및 69~74로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 단백질.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 단백질은 키메라 항원 수용체(CAR)이고, 상기 이종 분자 또는 모이어티는 막관통 도메인, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인, 힌지 도메인, 스페이서 영역, 하나 이상의 펩티드 링커, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 포함하는, 키메라 단백질.
제5항에 있어서, 상기 CAR은 면역 반응을 억제하는 하나 이상의 세포내 억제 도메인을 포함하는 억제 CAR이고, 상기 하나 이상의 세포내 억제 도메인 각각은 효소 억제 도메인 또는 세포내 억제 공동 신호전달 도메인을 포함하는, 키메라 단백질.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 키메라 단백질을 암호화하는 조작된 폴리뉴클레오티드.
제7항의 조작된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 키메라 단백질, 제7항의 조작된 폴리뉴클레오티드, 또는 제8항의 발현 벡터를 포함하는 단리된 세포.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 키메라 단백질, 제7항의 조작된 폴리뉴클레오티드, 또는 제8항의 발현 벡터를 발현하는 조작된 세포의 집단.
제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 세포 또는 세포의 집단은 세포 표면 상에서 발현된 하나 이상의 종양-표적화 키메라 수용체를 추가로 포함하고, 선택적으로 상기 하나 이상의 종양-표적화 키메라 수용체 각각은 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 조작된 T 세포 수용체인, 세포 또는 세포 집단.
제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 또는 세포의 집단은 T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 감마-델타 T 세포, 세포독성 T 림프구(CTL), 조절 T 세포, 바이러스 특이적 T 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 자연 살해(NK) 세포, B 세포, 종양 침윤 림프구(TIL), 선천 림프구 세포, 비만 세포, 호산구, 호염기구, 호중구, 골수 세포, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포, 적혈구, 혈소판 세포, 인간 배아 줄기 세포(ESC), ESC 유래 세포, 다능성 줄기 세포, 중간엽 기질 세포(MSC), 유도 만능 줄기 세포(iPSC), 및 iPSC-유래 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포 또는 세포의 집단.
제9항 내지 제12항 중 어느 한 항의 세포 또는 조작된 세포의 집단의 유효량 및 약학적으로 허용가능한 담체, 약학적으로 허용가능한 부형제, 또는 이의 조합을 포함하는 약학적 조성물.
대상체에서 종양 세포에 대한 세포 매개 면역 반응을 자극하는 방법으로서, 종양을 가진 대상체에게 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 키메라 단백질, 제7항의 조작된 폴리뉴클레오티드, 제8항의 발현 벡터, 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항의 세포 또는 조작된 세포의 군집 또는 제13항의 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
종양을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 키메라 단백질, 제7항의 조작된 폴리뉴클레오티드, 제8항의 발현 벡터, 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항의 세포 또는 조작된 세포의 집단, 또는 제13항의 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.