TWI753141B - 嵌合抗原受體 - Google Patents

Abstract

本發明是一種嵌合抗原受體，其包含目標抗原結合區域、跨膜區域、及T細胞活化訊息傳導區域，前述目標抗原是神經節苷脂GM2。

Description

嵌合抗原受體

本發明是關於一種嵌合抗原受體、表現嵌合抗原受體的細胞、及包含編碼有嵌合抗原受體之鹼基序列的載體等。 本發明基於2017年3月27日於日本提出申請的特願2017-061461號申請案而主張優先權，在此沿用其內容。

嵌合抗原受體（Chimeric Antigen Receptor，以下又稱為「CAR」），是一種人工嵌合蛋白質，由辨識癌細胞的細胞表面抗原的單鏈抗體、和誘導T細胞活化的訊息傳導區域所融合而成。例如，藉由將編碼有CAR的基因導入至不具有腫瘤反應性的一般末梢血液T細胞（末梢血液T淋巴球）中，而可以大量製作能表現CAR的CAR表現T細胞（以下又稱為「CAR-T細胞」）。該CAR-T細胞具有腫瘤反應性，無須依賴與主要組織相容性複合體（MHC）之間的相互作用，即能造成對癌細胞的傷害。

藉由投予CAR-T細胞所進行的癌症免疫療法，較具體而言，是從患者體內採集T細胞，將編碼有CAR的基因導入至該T細胞中並進行增幅，再移入至患者體內，這種療法目前在世界上正進行臨床試驗，並且獲得了在白血病和淋巴瘤等造血器官惡性腫瘤等方面顯示有效性的結果。

然而，目前在藉由CAR-T細胞進行的免疫療法中能獲得有效結果者，僅有針對造血器官惡性腫瘤的療法，對於固體腫瘤則無法獲得顯示有效性的結果。為了開發對於固體腫瘤有效的CAR，很重要的是目標抗原之選擇，正探求可應用於固體腫瘤的目標抗原。

另一方面，作為CAR-T細胞瘤法對於固體腫瘤無法獲得效果的主要原因，認為有：CAR-T細胞在生物體內的存活率低、往腫瘤局部的積聚性低、由腫瘤細胞分泌的免疫抑制因子等所造成的活性抑制等。作為解決此種問題的方法，已報告有一種方法，是將編碼有T細胞的免疫機能促進因子的核酸、和編碼有CAR的核酸，一起導入至T細胞中（專利文獻1）。 [先前技術文件] 　(專利文獻)

專利文獻1：國際公開第2016/056228號

在專利文獻1中，由於並未確認到以人類固體腫瘤所表現的抗原為目標的CAR-T細胞的功效，所以正尋求對於此種抗原顯示有效性的CAR-T細胞。

因此，本發明的目的在於提供一種將固體腫瘤抗原作為目標抗原的新穎的CAR、及一種對於固體腫瘤有效的CAR-T細胞。

本發明包含以下的態樣。

[1]一種嵌合抗原受體，其包含目標抗原結合區域、跨膜區域、及T細胞活化訊息傳導區域，前述目標抗原是神經節苷脂GM2。

[2]如[1]所述之嵌合抗原受體，其中，前述目標抗原結合區域包含抗神經節苷脂GM2抗體的重鏈可變區域和輕鏈可變區域。

[3]如[2]所述之嵌合抗原受體，其中，前述抗神經節苷脂GM2抗體，是選自由下述(a)~(c)所構成之群組的抗體：(a)包含重鏈可變區域和輕鏈可變區域且對於神經節苷脂GM2具有結合能力的抗體，該重鏈可變區域包含由序列編號2所述之胺基酸序列所構成的重鏈可變區域的CDR1、CDR2及CDR3，該輕鏈可變區域包含由序列編號4所述之胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域的CDR1、CDR2及CDR3； (b)包含重鏈可變區域和輕鏈可變區域且對於神經節苷脂GM2具有結合能力的抗體，該重鏈可變區域由序列編號2所述之胺基酸序列中的1個或複數個胺基酸經變異而成的胺基酸序列所構成，該輕鏈可變區域由序列編號4所述之胺基酸序列中的1個或複數個胺基酸經變異而成的胺基酸序列所構成；及，(c)包含重鏈可變區域和輕鏈可變區域且對於神經節苷脂GM2具有結合能力的抗體，該重鏈可變區域由與序列編號2所述之胺基酸序列具有70%以上的序列同一性的胺基酸序列所構成，該輕鏈可變區域由與序列編號4所述之胺基酸序列具有70%以上的序列同一性的胺基酸序列所構成。

[4]如[3]所述之嵌合抗原受體，其中，該重鏈可變區域包含序列編號2所述之胺基酸序列，該輕鏈可變區域包含序列編號4所述之胺基酸序列。

[5]如[2]~[4]中任一項所述之嵌合抗原受體，其中，前述抗神經節苷脂GM2抗體是單鏈抗體(scFv)。

[6]如[5]所述之嵌合抗原受體，其中，前述scFv是選自由下述(a)~(c)所構成之群組的多肽：(a)包含選自由序列編號10、12、14及16所構成之群組的胺基酸序列的多肽；(b)由一胺基酸序列所構成且具有對於神經節苷脂GM2抗體的結合能力的多肽，該胺基酸序列與選自由序 列編號10、12、14及16所構成之群組的胺基酸序列具有70%以上的序列同一性；及，(c)由一胺基酸序列所構成且對於神經節苷脂GM2具有結合能力的多肽，該胺基酸序列是選自由序列編號10、12、14及16所構成之群組的胺基酸序列中的1個或複數個胺基酸經變異而成的胺基酸序列。

[7]如[1]~[6]中任一項所述之嵌合抗原受體，其中，前述跨膜區域是CD8的跨膜區域。

[8]如[7]所述之嵌合抗原受體，其中，前述CD8的跨膜區域，包含選自由下述(a)~(c)所構成之群組中的多肽：(a)包含序列編號20所述之胺基酸序列的多肽；(b)由一胺基酸序列所構成且具有跨膜能力的多肽，該胺基酸序列與序列編號20所述之胺基酸序列具有70%以上的序列同一性；及，(c)由一胺基酸序列所構成且具有跨膜能力的多肽，該胺基酸序列是序列編號20所述之胺基酸序列中的1個或複數個胺基酸經變異而成的胺基酸序列。

[9]如[1]~[8]中任一項所述之嵌合抗原受體，其中，T細胞活化訊息傳導區域是CD3ζ的T細胞活化訊息傳導區域。

[10]如[9]所述之嵌合抗原受體，其中，前述CD3ζ的T細胞活化訊息傳導區域，包含選自由下述(a)~(c)所構成之群組中的多肽：(a)包含序列編號28所述之胺基酸序列的多肽；(b)由一胺基酸序列所構成且具有T細胞活化訊息傳導能力的多肽，該胺基酸序列與序列編號28所述之胺基酸序列具有70%以上的序列同一性（相同性）； (c)由一胺基酸序列所構成且具有T細胞活化訊息傳導能力的多肽，該胺基酸序列是序列編號28所述之胺基酸序列中的1個或複數個胺基酸經變異而成的胺基酸序列。 [11]如[9]或[10]所述之嵌合抗原受體，其中前述T細胞活化訊息傳導區域，進一步包含CD28的T細胞活化訊息傳導區域和4-1BB的T細胞活化訊息傳導區域中的至少一者。 [12]如[11]所述之嵌合抗原受體，其中前述CD28的T細胞活化訊息傳導區域，包含選自由下述(a)～(c)所構成之群組中的多肽： (a)包含序列編號24所述之胺基酸序列的多肽； (b)由一胺基酸序列所構成且具有T細胞活化訊息傳導能力的多肽，該胺基酸序列與序列編號24所述之胺基酸序列具有70%以上的序列同一性（相同性）； (c)由一胺基酸序列所構成且具有T細胞活化訊息傳導能力的多肽，該胺基酸序列是序列編號24所述之胺基酸序列中的1個或複數個胺基酸經變異而成的胺基酸序列。 [13]如[11]所述之嵌合抗原受體，其中前述4-1BB的T細胞活化訊息傳導區域，包含選自由下述(a)～(c)所構成之群組中的多肽： (a)包含序列編號26所述之胺基酸序列的多肽； (b)由一胺基酸序列所構成且具有T細胞活化訊息傳導能力的多肽，該胺基酸序列與序列編號26所述之胺基酸序列具有70%以上的序列同一性（相同性）； (c)由一胺基酸序列所構成且具有T細胞活化訊息傳導能力的多肽，該胺基酸序列是序列編號26所述之胺基酸序列中的1個或複數個胺基酸經變異而成的胺基酸序列。 [14]如[11]～[13]中任一項所述之嵌合抗原受體，其中前述T細胞活化訊息傳導區域，包含CD28、4-1BB、及CD3ζ的T細胞活化訊息傳導區域，並且從N端起依照CD28、4-1BB、及CD3ζ的順序配置。 [15]一種細胞，該細胞表現如[1]～[14]中任一項所述之嵌合抗原受體。 [16]如[15]所述之細胞，其中該細胞進一步表現IL-7和CCL19中的至少一者。 [17]如[16]所述之細胞，其中該細胞表現IL-7和CCL19中的兩者。 [18]如[16]或[17]所述之細胞，其中前述IL-7，包含選自由下述(a)～(c)所構成之群組中的多肽： (a)包含序列編號59所述之胺基酸序列的多肽； (b)由一胺基酸序列所構成且具有T細胞的免疫機能促進機能的多肽，該胺基酸序列與序列編號59所述之胺基酸序列具有70%以上的序列同一性； (c)由一胺基酸序列所構成且具有T細胞的免疫機能促進機能的多肽，該胺基酸序列是序列編號59所述之胺基酸序列中的1個或複數個胺基酸經變異而成的胺基酸序列。 [19]如[16]～[18]中任一項所述之細胞，其中前述CCL-19，包含選自由下述(a)～(c)所構成之群組中的多肽： (a)包含序列編號61所述之胺基酸序列的多肽； (b)由一胺基酸序列所構成且具有T細胞的免疫機能促進機能的多肽，該胺基酸序列與序列編號61所述之胺基酸序列具有70%以上的序列同一性；及， (c)由一胺基酸序列所構成且具有T細胞的免疫機能促進機能的多肽，該胺基酸序列是序列編號61所述之胺基酸序列中的1個或複數個胺基酸經變異而成的胺基酸序列。 [20]如[15]～[19]中任一項所述之細胞，其中，前述細胞是免疫細胞。 [21]如[20]所述之細胞，其中，前述免疫細胞是T細胞。 [22]一種多核苷酸，該多核苷酸包含一鹼基序列，該鹼基序列編碼有如[1]～[14]中任一項所述之嵌合抗原受體。 [23]如[22]所述之多核苷酸，其中，進一步包含編碼有IL-7之鹼基序列和編碼有CCL19之鹼基序列中的至少一者。 [24]如[23]所述之多核苷酸，其中，包含編碼有IL-7之鹼基序列和編碼有CCL19之鹼基序列中的兩者。 [25]一種載體，該載體包含一鹼基序列，該鹼基序列編碼有如[1]～[14]中任一項所述之嵌合抗原受體。 [26]如[25]所述之載體，其中，進一步包含編碼有IL-7之鹼基序列和編碼有CCL19之鹼基序列中的至少一者。 [27]如[26]所述之載體，其中，包含編碼有IL-7之鹼基序列和編碼有CCL19之鹼基序列中的兩者。 [28]一種表現嵌合抗原受體之細胞的製造方法，該製造方法包含將一多核苷酸或一載體導入至細胞中的步驟，該多核苷酸或該載體包含一鹼基序列，該鹼基序列編碼有如[1]～[14]中任一項所述之嵌合抗原受體。 [29]如[28]所述之表現嵌合抗原受體之細胞的製造方法，其中，包含將一多核苷酸或一載體進一步導入至細胞中的步驟，該多核苷酸或該載體包含編碼有IL-7之鹼基序列和編碼有CCL19之鹼基序列中的至少一者。 [30]如[29]所述之表現嵌合抗原受體之細胞的製造方法，其中，包含將一多核苷酸或一載體導入至細胞中的步驟，該多核苷酸或該載體包含編碼有IL-7之鹼基序列和編碼有CCL19之鹼基序列中的兩者。 [31]一種醫藥組成物，該醫藥組成物包含如[15]～[20]中任一項所述之細胞。 [32]如[31]所述之醫藥組成物，其中，該醫藥組成物用以治療或預防腫瘤。

根據本發明，可提供一種以固體腫瘤抗原作為目標抗原的新穎的CAR、及一種對於固體腫瘤有效的CAR-T細胞。

根據本發明所提供的多肽、多核苷酸、載體、及細胞，可以是經分離而成的狀態。亦即，本說明書中所記載的多肽、多核苷酸、載體、及細胞，可以是經分離而成的多肽、經分離而成的多核苷酸、經分離而成的載體、及經分離而成的細胞。

［嵌合抗原受體（抗GM2 CAR）］ 在一個實施形態中，本發明提供一種嵌合抗原受體，其包含目標抗原結合區域、跨膜區域、及T細胞活化訊息傳導區域，前述目標抗原是神經節苷脂GM2。

本說明書中，所謂的「嵌合抗原受體（CAR）」，意指包含目標抗原結合區域、跨膜區域、及T細胞活化訊息傳導區域的嵌合蛋白質。另外，所謂的嵌合蛋白質，意指包含源自2種以上的異種蛋白質的序列的蛋白質。CAR並非僅限定於包含上述3個區域的嵌合抗原受體，而是亦包括包含其他區域的嵌合抗原受體。

＜目標抗原結合區域＞ 本實施形態的CAR，包含一目標抗原結合區域，該目標抗原為神經節苷脂GM2（以下有時僅稱為「GM2」）。

所謂的目標抗原結合區域，意指當CAR在T細胞表現時，在細胞外結合於目標抗原的細胞外區域。在CAR-T細胞中表現的CAR，會移動至細胞膜，位於細胞外的目標抗原結合區域和位於細胞內的T細胞活化訊息傳導區域，會通過貫通細胞膜的跨膜區域而呈現連結狀態。CAR-T細胞如果接觸到具有目標抗原作為膜抗原的細胞，則目標抗原結合區域就會結合於該目標抗原，藉此將T細胞活化訊息從T細胞活化訊息傳導區域傳導至T細胞內，T細胞即被活化。

本實施形態的CAR中，目標抗原結合區域所結合的目標抗原是GM2。 GM2，是一種神經節苷脂，也就是具有唾液酸(sialic acid)之醣脂質。神經節苷脂構成動物的細胞膜，是由醣鏈也就是親水性側鏈、和神經鞘胺醇與脂肪酸也就是疏水性側鏈所構成的分子。神經節苷脂，是根據下述而分類：唾液酸的鍵結型態、鍵結數、以及在非還原端鍵結的N-乙醯半乳胺糖（GalNAc）和半乳糖（Gal）是否有鍵結。GM2，則是具有GalNacβ1-4（SAα2-3）Galβ1-4Glcβ1-1 Ceramide (神經醯胺)之醣鏈結構的神經節苷脂之一。

神經節苷脂的種類和表現量，會根據細胞種類、臟器種類、動物種類等而異，已知在細胞癌化過程中，神經節苷脂的表現會有量和質的變化（Cancer Res 45:2405-14(1985)）。已有報告指出，GM2在正常細胞中幾乎未辨認到其表現，但在肺癌、神經母細胞瘤、神經膠質瘤、黑色素瘤、惡性間皮瘤、骨髓瘤等腫瘤中則有表現（Cancer Res 45:2405-14(1985); Cancer Res 50:7444-9(1990); Cancer Sci vol.102 no.12:2157-2163; Cancer Sci vol.106 no.1:102-107(2015)）。

目標抗原結合區域，只要是能專一地結合於GM2者即可，並無特別限定，較佳是包含能專一地結合於GM2的單株抗體（以下又稱為「抗GM2抗體」）的抗原結合區域。抗體的所謂「抗原結合區域」，是指在抗體中有關其與抗原的結合的區域，具體而言，是指包含互補性決定區（Complementarity Determining Region：CDR）的區域。抗體的抗原結合區域，包含該抗體的至少一個CDR。較佳的態樣中，抗體的抗原結合區域，包含該抗體的全部的6個CDR。另外，CDR可以藉作為CDR之定義而為人所知的任意的定義來決定，例如可以採用根據Kabat、Chothia、AbM、cotact等之定義。較佳者可舉出根據Kabat之定義的CDR。

可以使用於目標抗原結合區域的抗GM2抗體，並無特別限定，可以是習知者，也可以是新製作而成者。新製作抗GM2抗體時，以習知的方法來進行抗GM2抗體的製作即可。例如，可以採用以GM2將動物免疫而獲得融合瘤的方法、噬菌體展示(phage display)法等。

抗GM2抗體所源自的生物，並無特別限定，較佳是人類抗體。作為人類抗GM2抗體的例子，可舉出具有序列編號2所述之胺基酸序列作為重鏈可變（VH）區域、具有序列編號4所述之胺基酸序列作為輕鏈可變（VL）區域的抗體等。由序列編號2所述之胺基酸序列所構成的VH區域，其根據Kabat之定義的CDR1～3的胺基酸序列，分別顯示於序列編號63～65。又，由序列編號4所述之胺基酸序列所構成的VL區域，其根據Kabat之定義的CDR1～3的胺基酸序列，分別顯示於序列編號66～68。

在較佳的態樣中，目標抗原結合區域可以包含抗GM2抗體的VH區域和VL區域。例如，包含單鏈抗體（scFv）的多肽，即為目標抗原結合區域的較佳例，該單鏈抗體包含抗GM2抗體的VH區域和VL區域。scFv是用連接胜肽(peptide linker)來連結抗體的VH區域和VL區域而成的多肽，一般被用作為CAR的目標抗原結合區域。

當採用scFv時，連結VH區域和VL區域的連接胜肽並無特別限定，使用一般被用作為scFv者即可。作為連接胜肽的例子，例如可以舉出連接子(linker)15（序列編號6）、連接子25（序列編號8）等，但並不限定於這些連接子。

用於scFv的VH區域和VL區域，只要是採用抗GM2抗體的VH區域和VL區域即可。抗GM2抗體的較佳例，是如同上述。又，用於scFv的VH區域和VL區域，只要能維持對於GM2的結合能力，則改變部分序列而成者亦可。例如，作為scFv，可以優先採用以下者。 [1a]包含VH區域和VL區域且具有對於GM2的結合能力的scFv，該VH區域包含由序列編號2所述之胺基酸序列所構成的VH區域的CDR1～3，該VL區域包含由序列編號4所述之胺基酸序列所構成的VL區域的CDR1～3。 [1b] 包含VH區域和VL區域且具有對於GM2的結合能力的scFv，該VH區域由序列編號2所述之胺基酸序列所構成，該VL區域由序列編號4所述之胺基酸序列所構成。 [1c] 包含VH區域和VL區域且具有對於GM2的結合能力的scFv，該VH區域由序列編號2所述之胺基酸序列中的1個或複數個胺基酸經變異而成的胺基酸序列所構成，該VL區域由序列編號4所述之胺基酸序列中的1個或複數個胺基酸經變異而成的胺基酸序列所構成。 [1d] 包含VH區域和VL區域，且具有對於GM2的結合能力的scFv，該VH區域由與序列編號2所述之胺基酸序列具有70%以上的序列同一性（相同性）的胺基酸序列所構成，該VL區域由與序列編號4所述之胺基酸序列具有70%以上的序列同一性（相同性）的胺基酸序列所構成。

上述[1a]中，CDR以外的序列（框架序列(framework sequence)），較佳是採用已知的人類抗體的框架序列。例如，可以從下述胺基酸序列等之中選擇，該些胺基酸序列是選自：登錄於GenBank等習知的序列資料庫的人類抗體的胺基酸序列的框架序列、源自人類抗體的各個次族群(subgroup)的共通序列(Human Most Homologous Consensus Sequence；Kabat, E. A.等人的Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services,1991)。

上述[1c]中，「複數個」例如可以是2~30個，較佳是2~20個，進一步較佳是2~10個，更佳是2~5個。又，「變異」可以是缺失、取代、增加(addition)、及插入中的任一者，亦可以是這些的組合。又，變異的位置較佳是CDR1~3以外的區域(亦即，框架區域)。

上述[1d]中，序列同一性，只要是70%以上即可，並無特別限定，較佳是80%以上，進一步較佳是85%以上，更佳是90%以上，進一步更佳是95%以上，特佳是96%以上、97%以上、98%以上、或99%以上。另外，胺基酸序列彼此的序列同一性(相同性)，是如下述般求出：以對應之胺基酸有最多一致者的方式，在相當於插入及缺失的部分放入間隙(gap)而將二個胺基酸序列並列，再求出除去所獲得的排列(alignment)中的間隙並且相對於全體胺基酸序列時的一致的胺基酸的比例。胺基酸序列彼此的序列同一性，可以採用所屬技術領域中習知的各種相同性檢索軟體來求得。例如，可以基於藉由習知的相同性檢索軟體BLASTP而獲得的排列來進行計算，藉此獲得胺基酸序列的序列同一性的值。

作為scFv的具體例，例如可以舉出：包含選自由序列編號10、12、14及16所構成之群組的胺基酸序列的多肽；選自由序列編號10、12、14及16所構成之群組的胺基酸序列所構成的多肽；由一胺基酸序列所構成且具有對於GM2的結合能力的多肽，該胺基酸序列是選自由序列編號10、12、14及16所構成之群組的胺基酸序列中的1個或複數個胺基酸經變異而成的胺基酸序列；及，由一胺基酸序列所構成且具有對於GM2的結合能力的多肽，該胺基酸序列與選自由序列編號10、12、14及16所構成之群組的胺基酸序列具有70%以上的序列同一性（相同性）。另外，關於「複數個」和「變異」，是與上述相同。又，關於「序列同一性」，亦與上述相同。

＜跨膜區域＞ 所謂的「跨膜區域」，意指當CAR在T細胞表現時，貫通細胞膜而存在，並連結細胞外區域和細胞內區域的區域。跨膜區域，只要是具有貫通細胞膜的功能的多肽即可，並無特別限定。跨膜區域，可以是源自天然蛋白質者，亦可以是人為設計而成者。源自天然蛋白質的跨膜區域，可以從任意的膜相關蛋白或跨膜蛋白中取得。較佳的態樣中，跨膜區域可以對應於目標抗原對於目標抗原結合區域的結合，而將活化訊息傳導至T細胞活化訊息傳導區域。

作為跨膜區域，例如可以舉出：T細胞受體的α鏈和β鏈、CD3ζ、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154、GITR等跨膜區域。作為較佳例，可以舉出CD8的跨膜區域。這些蛋白質所源自的生物，並無特別限定，較佳是人類。這些蛋白質的胺基酸序列，可以從GenBank等習知的序列資料庫取得。例如，作為人類CD8的胺基酸序列的例子，可以舉出登錄為GenBank編號：NM_001768.6者等，作為跨膜區域的胺基酸序列，可以舉出序列編號20所述之胺基酸序列。

又，跨膜區域，亦可以是源自上述天然蛋白質之跨膜區域的突變體。作為源自天然蛋白質之跨膜區域的突變體的例子，例如可以舉出以下者。 [2a]由一胺基酸序列所構成且具有跨膜能力的多肽，該胺基酸序列與源自天然蛋白質之跨膜區域的胺基酸序列（例如，序列編號20）具有70%以上的序列同一性（相同性）。 [2b]由一胺基酸序列所構成且具有跨膜能力的多肽，該胺基酸序列是源自天然蛋白質之跨膜區域的胺基酸序列（例如，序列編號20）中的1個或複數個胺基酸經變異而成的胺基酸序列。

上述[2a]中，序列同一性，只要是70%以上即可，並無特別限定，較佳是80%以上，進一步較佳是85%以上，更佳是90%以上，特佳是95%以上。

上述[2b]中，「複數個」例如可以是2～10個，較佳是2～5個，進一步較佳是2～4個，更佳是2或3個。又，「變異」可以是缺失、取代、增加、及插入中的任一者，亦可以是這些的組合。

＜T細胞活化訊息傳導區域＞ 所謂的「T細胞活化訊息傳導區域」，意指當CAR在T細胞表現時，位於細胞內並且將T細胞活化訊息傳導至T細胞內的區域。T細胞中，MHC．胜肽複合體若結合於T細胞受體（T cell Receptor：TCR），則T細胞活化訊息會通過TCR．CD3複合體而傳導至細胞內，引發各種磷酸化訊息（初級訊息傳導）。又，在T細胞的細胞表面上表現的共刺激分子，藉由其與對於抗原提示細胞的細胞表面上表現的各共刺激分子具有專一性的配位子(ligand)的結合，將共刺激訊息傳導至細胞內，而輔助T細胞的活化（次級訊息傳導）。 本說明書中，所謂的「T細胞活化訊息傳導」，包含前述初級訊息傳導和次級訊息傳導之兩者。又，所謂的「T細胞活化訊息傳導區域」，意指有關前述初級訊息傳導和次級訊息傳導的蛋白質的有關該訊息傳導的細胞內區域。

T細胞活化訊息傳導區域，只要是有關T細胞活化訊息傳導的蛋白質的T細胞活化訊息傳導區域即可，並無特別限定。例如，關於初級訊息傳導，已知免疫受體酪胺酸活化模體（immunoreceptor tyrosine-based activation motif：ITAM）有所關聯。因此，作為T細胞活化訊息傳導區域的例子，可以舉出具有ITAM的蛋白質的T細胞活化訊息傳導區域。作為具有ITAM的蛋白質的例子，可以舉出：CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d等。含有這些蛋白質的ITAM的T細胞活化訊息傳導區域，是用於CAR的T細胞活化訊息傳導區域的較佳例。作為進一步較佳的例子，可以舉出CD3ζ等的T細胞活化訊息傳導區域。

又，關於次級訊息傳導，如同上述，與共刺激分子有所關聯。因此，作為T細胞活化訊息傳導區域的例子，亦可以舉出共刺激分子的訊息傳導區域。作為共刺激分子的例子，例如可以舉出：CD2、CD4、CD5、CD8、CD27、CD28、OXO40(CD134)、4-1BB(CD137)、ICOS、CD154、HVEM、GITR、Fc Receptor-associated γ chain等。這些蛋白質的T細胞活化訊息傳導區域，也同樣是用於CAR的T細胞活化訊息傳導區域的較佳例。作為進一步較佳的例子，可以舉出CD28、4-1BB等的T細胞活化訊息傳導區域。

上述蛋白質所源自的生物，並無特別限定，較佳是人類。另外，這些蛋白質的胺基酸序列，可以從GenBank等習知的序列資料庫取得。例如，作為人類CD3ζ的胺基酸序列的例子，可以舉出登錄為GenBank編號：NM_000734.3者等，作為T細胞活化訊息傳導區域的胺基酸序列，可以舉出序列編號28所述之胺基酸序列。又，作為人類CD28的胺基酸序列的例子，可以舉出登錄為GenBank編號：NM_006139.2者等，作為T細胞活化訊息傳導區域的胺基酸序列，可以舉出序列編號24所述之胺基酸序列。又，作為人類4-1BB的胺基酸序列的例子，可以舉出登錄為GenBank編號：NM_001561.5者等，作為T細胞活化訊息傳導區域的胺基酸序列，可以舉出序列編號26所述之胺基酸序列。

又，T細胞活化訊息傳導區域，亦可以是源自上述天然蛋白質之T細胞活化訊息傳導區域的突變體。作為源自天然蛋白質之T細胞活化訊息傳導區域的突變體的例子，例如可以舉出以下者。 [3a]由一胺基酸序列所構成且具有T細胞活化訊息傳導能力的多肽，該胺基酸序列與源自天然蛋白質之T細胞活化訊息傳導區域的胺基酸序列（例如，序列編號24、26、28）具有70%以上的序列同一性（相同性）。 [3b]由一胺基酸序列所構成且具有T細胞活化訊息傳導能力的多肽，該胺基酸序列是源自天然蛋白質之T細胞活化訊息傳導區域的胺基酸序列（例如，序列編號24、26、28）中的1個或複數個胺基酸經變異而成的胺基酸序列。

上述[3a]中，序列同一性，只要是70%以上即可，並無特別限定，較佳是80%以上，進一步較佳是85%以上，更佳是90%以上，特佳是95%以上。

上述[3b]中，「複數個」，例如當採用有關初級訊息傳導的蛋白質時，可以是2～30個，較佳是2～20個，進一步較佳是2～10個，更佳是2～5個。又，例如當採用共刺激分子時，「複數個」可以是2～15個，較佳是2～10個，進一步較佳是2～5個，更佳是2或3個。又，「變異」可以是缺失、取代、增加、及插入中的任一者，亦可以是這些的組合。

本實施形態的CAR所包含的T細胞活化訊息傳導區域的數目，並不僅限定於1個，亦可以包含複數的T細胞活化訊息傳導區域。此時，複數的T細胞活化訊息傳導區域可以相同亦可以不同。較佳的態樣中，CAR包含2個以上的T細胞活化訊息傳導區域。此時，CAR所包含的T細胞活化訊息傳導區域，較佳是有關初級訊息傳導的T細胞活化訊息傳導區域和有關次級訊息傳導的T細胞活化訊息傳導區域的組合。作為具體例，可以舉出：CD3ζ和CD28的T細胞活化訊息傳導區域的組合、CD3ζ和4-1BB的T細胞活化訊息傳導區域的組合、CD3ζ和CD28和4-1BB的T細胞活化訊息傳導區域的組合等。

另外，當組合有關初級訊息傳導的T細胞活化訊息傳導區域和有關次級訊息傳導的T細胞活化訊息傳導區域時，較佳是將有關初級訊息傳導的T細胞活化訊息傳導區域配置於C端。上述的具體例中，較佳是將CD3ζ的T細胞活化訊息傳導區域配置在比CD28或4-1BB的T細胞活化訊息傳導區域更靠近C端處。當同時採用CD28和4-1BB時，任何配置順序均可，可以舉出從N端起依照CD28、4-1BB的順序來配置的例子。

當僅採用1個T細胞活化訊息傳導區域時，較佳是採用有關初級訊息傳導的T細胞活化訊息傳導區域，進一步較佳是採用CD3ζ的T細胞活化訊息傳導區域。

＜其他區域＞ 本實施形態的CAR，除了上述區域之外，亦可以包含其他區域。作為其他區域的例子，可以舉出：細胞外鉸鏈區(hinge region)、細胞質功能區(cytoplasmic domain)、間隔區(spacer region)、訊息胜肽(signal peptide)等。

（細胞外鉸鏈區） 所謂的「細胞外鉸鏈區」，意指連結細胞外的目標抗原結合區域和跨膜區域的區域。較佳的態樣中，本實施形態的CAR包含細胞外鉸鏈區。 細胞外鉸鏈區，只要是能連結目標抗原結合區域和跨膜區域者即可，並無特別限定。細胞外鉸鏈區可以是源自天然蛋白質者，亦可以是人為設計而成者。細胞外鉸鏈區，例如可以是1～100個左右的胺基酸，較佳是10～70個左右的胺基酸所構成。細胞外鉸鏈區，較佳是不妨礙目標抗原結合區域的GM2結合能力，並且也不妨礙藉由T細胞活化訊息傳導區域進行的訊息傳導。

作為細胞外鉸鏈區，例如可以舉出：CD8、CD28、CD4等細胞外鉸鏈區。又，亦可使用免疫球蛋白（例如，IgG4等）的細胞外鉸鏈區。作為較佳例，可以舉出CD8的細胞外鉸鏈區。

上述蛋白質所源自的生物，並無特別限定，較佳是人類。另外，這些蛋白質的胺基酸序列，可以從GenBank等習知的序列資料庫取得。作為人類CD8的胺基酸序列的例子，可以舉出上述的胺基酸序列，作為細胞外鉸鏈區的胺基酸序列，可以舉出序列編號18所述之胺基酸序列。

又，細胞外鉸鏈區，亦可以是源自上述天然蛋白質之細胞外鉸鏈區的突變體。作為源自天然蛋白質之細胞外鉸鏈區的突變體的例子，例如可以舉出以下者。 [4a]由一胺基酸序列所構成的多肽，該胺基酸序列與源自天然蛋白質之細胞外鉸鏈區的胺基酸序列（例如，序列編號18）具有70%以上的序列同一性（相同性）。 [4b]由一胺基酸序列所構成的多肽，該胺基酸序列是源自天然蛋白質之細胞外鉸鏈區的胺基酸序列（例如，序列編號18）中的1個或複數個胺基酸經變異而成的胺基酸序列。

上述[4a]中，序列同一性，只要是70%以上即可，並無特別限定，較佳是80%以上，進一步較佳是85%以上，更佳是90%以上，特佳是95%以上。

上述[4b]中，「複數個」例如可以是2～20個，較佳是2～15個，進一步較佳是2～10個，更佳是2～5個。又，「變異」可以是缺失、取代、增加、及插入中的任一者，亦可以是這些的組合。

（細胞質功能區） 所謂的「細胞質功能區」，是跨膜蛋白中鄰接跨膜區域之細胞質端的區域，由3～50個左右的胺基酸所構成。較佳的態樣中，本實施形態的CAR包含細胞質功能區。細胞質功能區，只要是跨膜蛋白的鄰接跨膜區域之細胞質端的區域者即可，並無特別限定。通過細胞質功能區，跨膜區域和T細胞活化訊息傳導區域會連結，藉此可以使跨膜區域的結構穩定。細胞質功能區，可以是源自天然蛋白質者，亦可以是人為設計而成者。細胞質功能區，例如可以是3～50個左右的胺基酸，較佳是4～20個左右的胺基酸，進一步較佳是5～10個左右的胺基酸所構成。細胞質功能區，較佳是源自與跨膜區域相同的蛋白質者。藉由採用源自與跨膜區域相同的蛋白質的細胞質功能區，可以進一步保持跨膜區域結構的穩定。

作為細胞質功能區，例如可以舉出在上述跨膜區域中所舉出的蛋白質的細胞質功能區。作為較佳例，可以舉出CD8的細胞質功能區。這些蛋白質所源自的生物，並無特別限定，較佳是人類。作為細胞質功能區的胺基酸序列，可以舉出序列編號22所述之胺基酸序列。

又，細胞質功能區，亦可以是源自上述天然蛋白質之細胞質功能區的突變體。作為源自天然蛋白質之細胞質功能區的突變體的例子，例如可以舉出以下者。 [5a]由一胺基酸序列所構成且具有跨膜區域穩定能力的多肽，該胺基酸序列與源自天然蛋白質之細胞質功能區的胺基酸序列（例如，序列編號22）具有70%以上的序列同一性（相同性）。 [5b]由一胺基酸序列所構成且具有跨膜區域穩定能力的多肽，該胺基酸序列是源自天然蛋白質之細胞質功能區的胺基酸序列（例如，序列編號22）中的1個或複數個胺基酸經變異而成的胺基酸序列。

上述[5a]中，序列同一性，只要是70%以上即可，並無特別限定，較佳是80%以上，進一步較佳是85%以上，更佳是90%以上，特佳是95%以上。

上述[5b]中，「複數個」例如可以是2～5個，較佳是2～4個，進一步較佳是2或3個。又，「變異」可以是缺失、取代、增加、及插入中的任一者，亦可以是這些的組合。

（間隔區） 所謂的「間隔區」，是指連結蛋白質的兩個功能區（domain）的短的胜肽。在一個態樣中，本實施形態的CAR，亦可以使上述目標抗原結合區域、跨膜區域、T細胞活化訊息傳導區域等各區域通過間隔區而連結。間隔區並無特別限定，使用一般用於嵌合蛋白質之製作者即可。作為間隔區的長度，可以舉出1～100個胺基酸，較佳是10～50個胺基酸。作為間隔區的例子，可以舉出甘胺酸-絲胺酸連續序列等。

（訊息胜肽） 「訊息胜肽」，是指示膜蛋白或分泌蛋白(secretory protein)之定位(localization)的胜肽。在一個態樣中，本實施形態的CAR可以包含訊息胜肽。訊息胜肽，一般而言是由存在於膜蛋白的N端的5～60個左右的胺基酸所構成的胜肽，其在定位完成的成熟蛋白質中已被去除。

本實施形態的CAR所採用的訊息胜肽，較佳是指示CAR往細胞膜之定位的訊息胜肽，較佳是膜蛋白的訊息胜肽。作為訊息胜肽的例子，可以舉出：T細胞受體的α鏈和β鏈、CD3ζ、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154、GITR、免疫球蛋白重鏈、免疫球蛋白輕鏈等的訊息胜肽。作為訊息胜肽的胺基酸序列的具體例，可以舉出序列編號57所述之胺基酸序列。

本實施形態的CAR中，上述各區域，可以從N端起依照目標抗原結合區域、跨膜區域、T細胞活化訊息傳導區域的順序來配置。這些各區域，可以互相直接連結，亦可以通過其他區域或間隔序列(spacer sequence)而連結。

當本實施形態的CAR包含細胞外鉸鏈區時，細胞外鉸鏈區是配置在目標抗原結合區域和跨膜區域之間。又，當本實施形態的CAR包含細胞質功能區時，細胞質功能區是配置在跨膜區域和T細胞活化訊息傳導區域之間。 又，當本實施形態的CAR包含訊息胜肽時，訊息胜肽是配置在CAR的N端。

作為本實施形態的CAR的具體例，可以舉出包含下述的CAR：包含抗GM2抗體之scFv的目標抗原結合區域、CD8的跨膜區域（或其突變體）、CD28的T細胞活化訊息傳導區域（或其突變體）、4-1BB的T細胞活化訊息傳導區域（或其突變體）、及CD3ζ的T細胞活化訊息傳導區域（或其突變體）。作為較佳例，可以舉出包含下述的CAR：包含抗GM2抗體之scFv的目標抗原結合區域、CD8的細胞外鉸鏈區（或其突變體）、CD8的跨膜區域（或其突變體）、CD8的細胞質功能區（或其突變體）、CD28的T細胞活化訊息傳導區域（或其突變體）、4-1BB的T細胞活化訊息傳導區域（或其突變體）、及CD3ζ的T細胞活化訊息傳導區域（或其突變體）。

作為這樣的CAR，例如可以舉出包含選自由序列編號40、42、44及46所構成之群組中的胺基酸序列的CAR。另外，序列編號40、42、44及46所述之胺基酸序列中，第1～19位的序列是相當於訊息胜肽。因此，上述例子中的成熟的CAR，分別包含:序列編號40所述之胺基酸序列的第20～874位的胺基酸序列、序列編號42所述之胺基酸序列的第20～884位的胺基酸序列、序列編號44所述之胺基酸序列的第20～874位的胺基酸序列、序列編號46所述之胺基酸序列的第20～884位的胺基酸序列。 較佳的態樣中，本實施形態的CAR，是由選自由序列編號40、42、44及46所構成之群組中的胺基酸序列所構成。又，成熟的CAR，是由選自由下述胺基酸所構成之群組中的胺基酸序列所構成：序列編號40所述之胺基酸序列的第20～874位的胺基酸序列、序列編號42所述之胺基酸序列的第20～884位的胺基酸序列、序列編號44所述之胺基酸序列的第20～874位的胺基酸序列、序列編號46所述之胺基酸序列的第20～884位的胺基酸序列。

［表現抗GM2 CAR的細胞（抗GM2 CAR表現細胞）］ 在一個實施形態中，本發明提供一種表現上述實施形態之CAR的細胞。

本實施形態的細胞，會表現上述實施形態的CAR（以下又稱為「抗GM2 CAR」），於細胞表面上具有該CAR。GM2表現細胞中，GM2大多存在於細胞表層。本實施形態的細胞若接觸GM2表現細胞，則會藉由抗GM2 CAR的目標抗原結合區域，而結合於GM2表現細胞的表層的GM2。藉此，本實施形態的細胞被活化，而發生細胞傷害性顆粒之釋放、和細胞激素(cytokine)之產生。藉由這些細胞傷害性顆粒和細胞激素，GM2表現細胞會受到破壞。

本實施形態的細胞，較佳是哺乳動物細胞，例如可以是人類細胞，或小鼠、大鼠、牛、綿羊、馬、犬、豬、猿猴等非人類哺乳動物細胞，進一步較佳是人類細胞。細胞的種類並無特別限定，可以舉出：採集自血液、骨髓液、脾臟、胸腺、淋巴結等的細胞；浸潤於原發性腫瘤、轉移性腫瘤、癌性腹水等的癌組織中的免疫細胞等。作為較佳例，可以舉出免疫細胞，可以優先採用從末梢血液分離而成的末梢血液單核球等。末梢血液單核球所包含的細胞中，又以效應細胞(effector cell)為佳，作為特佳的細胞，可以舉出T細胞及其前驅細胞。T細胞的種類並無特別限定，可以是下述中的任一種T細胞：αβT細胞、γδT細胞、CD8陽性T細胞、細胞傷害性T細胞、CD4陽性T細胞、輔助型T細胞、記憶型T細胞、初始T細胞、腫瘤浸潤T細胞、自然殺手T細胞等。這些之中，進一步較佳是CD8陽性T細胞或細胞傷害性T細胞。

本實施形態的細胞，除了抗GM2 CAR以外，較佳是進一步表現介白素（Interleukin：IL）-7和趨化激素（C-C模體）配位子19（Chemokine（C-C motif）Ligand 19：CCL19）中的至少一者。較佳的態樣中，本實施形態的細胞，是表現下述的細胞：（i）抗GM2 CAR、（ii）IL-7和CCL19中的至少一者。本實施形態的細胞，進一步較佳是表現抗GM2 CAR、IL-7、及CCL19的細胞。

IL-7是T細胞生存所必須的細胞激素，是藉由骨髓、胸腺、淋巴器官．組織的基質細胞(stromal cell)等非造血細胞所產生，但在T細胞則幾乎未辨認到其產生。

另一方面，CCL19主要是由淋巴結的樹狀細胞或巨噬細胞所產生，具有下述功能：通過其受體也就是CC趨化激素受體7（Chemokine（C-C motif）Receptor 7：CCR7）而引發T細胞或B細胞、成熟的樹狀細胞的移動。

IL-7和CCL19所源自的生物，並無特別限定，較佳是人類。另外，這些蛋白質的胺基酸序列，可以從GenBank等習知的序列資料庫取得。例如，作為人類IL-7的胺基酸序列的例子，可以舉出登錄為GenBank編號：NM_000880.3（序列編號59）者等。又，作為人類CCL19的胺基酸序列的例子，可以舉出登錄為GenBank編號：NM_006274.2（序列編號61）者等。另外，IL-7和CCL19具有訊息胜肽，在成熟蛋白質中則訊息胜肽已被去除。例如，在序列編號59所述之人類IL-7的胺基酸序列中，第1～25位的序列即相當於訊息胜肽。又，例如，在序列編號61所述之人類CCL19的胺基酸序列中，第1～21位的序列即相當於訊息胜肽。

又，IL-7和CCL19，亦可以是源自上述天然蛋白質的突變體。作為IL-7的突變體的例子，例如可以舉出以下者。 [6a]由一胺基酸序列所構成且具有T細胞的免疫機能促進機能的多肽，該胺基酸序列與天然IL-7的胺基酸序列（例如，序列編號59）具有70%以上的序列同一性（相同性）。 [6b]由一胺基酸序列所構成且具有T細胞的免疫機能促進機能的多肽，該胺基酸序列是天然IL-7的胺基酸序列（例如，序列編號59）中的1個或複數個胺基酸經變異而成的胺基酸序列。

又，作為CCL19的突變體的例子，例如可以舉出以下者。 [7a]由一胺基酸序列所構成且具有T細胞的免疫機能促進機能的多肽，該胺基酸序列與天然CCL19的胺基酸序列（例如，序列編號61）具有70%以上的序列同一性（相同性）。 [7b]由一胺基酸序列所構成且具有T細胞的免疫機能促進機能的多肽，該胺基酸序列是天然CCL19的胺基酸序列（例如，序列編號61）中的1個或複數個胺基酸經變異而成的胺基酸序列。

另外，所謂的「T細胞的免疫機能促進機能」，意指維持並促進T細胞的生存、增殖、細胞傷害活性、移動活性、往腫瘤組織之浸潤活性等的功能。 上述[6a]和[7a]中，序列同一性，只要是70%以上即可，並無特別限定，較佳是80%以上，進一步較佳是85%以上，更佳是90%以上，特佳是95%以上。 又，上述[6b]和[7b]中，「複數個」例如可以是2～30個，較佳是2～20個，進一步較佳是2～10個，更佳是2～5個。又，「變異」可以是缺失、取代、增加、及插入中的任一者，亦可以是這些的組合。

又，IL-7和CCL19的突變體，亦可以是將這些蛋白質的訊息胜肽變更為其他訊息胜肽而成者，亦可以是去除訊息胜肽而成者。較佳是IL-7和CCL19的突變體具有分泌蛋白的訊息胜肽而被分泌至細胞外。

當本實施形態的細胞是經分離而成的T細胞時，藉由表現抗GM2 CAR並且表現IL-7和CCL19中的至少一者，T細胞的免疫機能受到促進，而可成為對於GM2表現細胞的細胞傷害活性、往腫瘤組織之浸潤、在腫瘤微環境(tumor microenvironment)中的生存能力均優異的T細胞。

又，本實施形態的細胞，可以是除了抗GM2 CAR以外還表現自殺基因者。本實施形態的細胞，藉由表現自殺基因，而可以視需要而將本實施形態的細胞誘導至細胞凋亡。自殺基因並無特別限定，可以採用習知者。例如，作為自殺基因，可以舉出：單純疱疹病毒的胸苷激酶（HSV-TK）基因、誘導型凋亡蛋白酶9（inducible caspase 9）基因等。表現HSV-TK的細胞，可以藉由使其與更昔洛韋(Ganciclovir)共存，而誘導細胞死亡。又，表現誘導型凋亡蛋白酶9的細胞，可以藉由使其與AP1903等二聚體誘導化合物（chemical induction of dimerization：CID）共存，而誘導細胞死亡。自殺基因的胺基酸序列，可以從GenBank等習知的序列資料庫取得。又，亦可以利用市售的包含自殺基因的載體等的序列。

本實施形態的細胞，可以是包含抗GM2 CAR的細胞（較佳是T細胞）。本實施形態的細胞的較佳例，可以是包含抗GM2 CAR且包含IL-7和CCL19中的至少一者的細胞（較佳是T細胞）。本實施形態的細胞的進一步較佳例，可以是包含抗GM2 CAR、IL-7、及CCL19的細胞（較佳是T細胞）。本實施形態的細胞的更佳例，可以是包含抗GM2 CAR、IL-7、CCL19、及自殺基因的細胞（較佳是T細胞）。

本實施形態的細胞，可以藉由後述將包含編碼有抗GM2 CAR之鹼基序列的多核苷酸或載體導入至細胞中的方式而獲得。

［包含編碼有抗GM2 CAR之鹼基序列的多核苷酸］ 在一個實施形態中，本發明提供一種包含編碼有抗GM2 CAR之鹼基序列的多核苷酸。

本實施形態的多核苷酸，只要是包含編碼有抗GM2 CAR之鹼基序列者即可，並無特別限定。抗GM2 CAR，是如同上述［嵌合抗原受體（抗GM2 CAR）］的項目所述。本實施形態的多核苷酸，較佳是包含一鹼基序列，該鹼基序列編碼有如上述［嵌合抗原受體（抗GM2 CAR）］的項目所例示的抗GM2 CAR之胺基酸序列。

例如，作為編碼有目標抗原結合區域的鹼基序列，可以舉出編碼有抗GM2抗體的scFv的鹼基序列。較具體而言，可以例示包含下述鹼基序列者：編碼有序列編號2所述之胺基酸序列的鹼基序列、編碼有序列編號4所述之胺基酸序列的鹼基序列。作為編碼有序列編號2所述之胺基酸序列的鹼基序列，可以例示序列編號1、49、51、或53所述之鹼基序列。又，作為編碼有序列編號4所述之胺基酸序列的鹼基序列，可以例示序列編號3、50、52、或54所述之鹼基序列。 這些鹼基序列，較佳是以編碼有連接子的鹼基序列來連結者。關於連接子，是如同上述「嵌合抗原受體」的項目所述。例如，作為編碼有上述所例示的連接子15的鹼基序列，可以例示序列編號5或55所述之鹼基序列。又，作為編碼有連接子25的鹼基序列，可以例示序列編號7或56所述之鹼基序列。 作為編碼有抗GM2抗體的scFv的鹼基序列的具體例，可以舉出序列編號9、11、13、或15所述之鹼基序列等。 作為編碼有目標抗原結合區域的鹼基序列，較佳是視導入之細胞的生物種類而經密碼子最佳化(codon optimization)者，當導入至人類細胞中時，較佳是經人類密碼子最佳化。

又，編碼有跨膜區域和T細胞活化訊息傳導區域的鹼基序列，可以從GenBank等習知的序列資料庫取得。又，當GM2 CAR包含細胞外鉸鏈區等其他區域時，編碼有該些區域的鹼基序列，也可以從GenBank等習知的序列資料庫取得。 例如，當採用人類CD8的跨膜區域作為跨膜區域時，作為編碼有人類CD8的鹼基序列，可以舉出登錄為GenBank編號：NM_001768.6者等，作為編碼有跨膜區域之鹼基序列，可以例示序列編號19所述之鹼基序列。 又，例如，當採用人類CD3ζ、人類CD28、人類4-1BB的T細胞活化訊息傳導區域作為T細胞活化訊息傳導區域時，作為編碼有人類CD3ζ、人類CD28、人類4-1BB的鹼基序列，分別可以舉出登錄為GenBank編號：NM_000734.3、NM_006139.2、及NM_001561.5者等，作為編碼有人類CD3ζ、人類CD28、人類4-1BB的T細胞活化訊息傳導區域的鹼基序列，分別可以例示序列編號27、23、及25所述之鹼基序列。 又，例如，當採用人類CD8的細胞外鉸鏈區作為細胞外鉸鏈區時，作為編碼有細胞外鉸鏈區的鹼基序列，可以例示序列編號17所述之鹼基序列。 又，例如，當採用人類CD8的細胞質功能區作為細胞質功能區時，作為編碼有細胞質功能區的鹼基序列，可以例示序列編號21所述之鹼基序列。

編碼有上述各區域的鹼基序列，並不限定於習知者，如果是編碼有上述各區域的鹼基序列，則任何序列均可以。藉由基因編碼的簡併(degeneracy)，對應於1個胺基酸的密碼子會存在複數個。因此，編碼有同一胺基酸序列的鹼基序列，會存在多數種。編碼有上述各區域的鹼基序列，只要是編碼有該些區域即可，可以是藉由基因編碼的簡併而產生的複數種鹼基序列的任一者。 作為編碼有上述各區域的鹼基序列，較佳是視導入之細胞的生物種類而經密碼子最佳化者，當導入至人類細胞中時，較佳是經人類密碼子最佳化。 又，編碼有上述各區域的鹼基序列，亦可以是編碼有源自上述天然蛋白質之各區域的突變體的鹼基序列。關於各區域的突變體，是如同上述［嵌合抗原受體（抗GM2 CAR）］的項目所述。

編碼有抗GM2 CAR之各區域的鹼基序列，較佳是從5’端起，按照目標抗原結合區域、跨膜區域、T細胞活化訊息傳導區域的順序而依序配置。當採用訊息胜肽、細胞外鉸鏈區等區域時，較佳是將訊息胜肽配置於目標抗原結合區域的5’端，並且將細胞外鉸鏈區配置於目標抗原結合區域和跨膜區域之間。編碼有這些區域的鹼基序列，可以直接連結，亦可以通過編碼有間隔區的鹼基序列而連結。關於間隔區，是如同上述［嵌合抗原受體（抗GM2 CAR）］的項目所述。

作為編碼有抗GM2 CAR的鹼基序列的具體例，可以舉出選自由序列編號39、41、43、及45所構成之群組中的鹼基序列等。

本實施形態的多核苷酸，可以藉由下述而獲得：將由編碼有抗GM2 CAR之各區域的鹼基序列所構成的多核苷酸，直接連結、或通過間隔序列而連結。編碼有抗GM2 CAR之各區域的多核苷酸，亦可以基於各區域的鹼基序列，以習知方法進行化學合成，而藉此取得。又，亦可以用下述方法取得：以cDNA作為模板，藉由PCR法或恆溫增幅法(isothermal amplification)等方法，將編碼有各區域的多核苷酸增幅而取得，該cDNA是將萃取自T細胞等地方的DNA、或萃取自T細胞等地方的RNA，進行反轉錄而成。如此進行而獲得之編碼有各區域的多核苷酸，在轉譯後不失去各區域的功能的範圍內，亦可以進行取代、缺失、增加、插入等改變。

本實施形態的多核苷酸，亦可以除了編碼有抗GM2 CAR的鹼基序列以外，還包含：啟動子、強化子(enhancer)、多聚腺苷酸化信號序列(polyadenylation signal)、終止子(terminator)等控制序列；或編碼有其他蛋白質的鹼基序列等。

作為其他蛋白質，例如可以舉出IL-7和CCL19。編碼有這些蛋白質的鹼基序列，可以從GenBank等習知的序列資料庫取得。例如，當採用人類IL-7時，作為編碼有人類IL-7的鹼基序列，可以舉出登錄為GenBank編號：NM_002190.2（序列編號58）者等。又，當採用人類CCL19時，作為編碼有人類CCL19的鹼基序列的例子，可以舉出登錄為GenBank編號：NM_006274.2（序列編號60）者等。 又，編碼有這些蛋白質的鹼基序列，並不限定於習知者，只要是編碼有這些蛋白質的鹼基序列則任何序列均可，也可以是藉由基因編碼的簡併而產生的複數種鹼基序列的任一者。作為編碼有這些蛋白質的鹼基序列，較佳是視導入之細胞的生物種類而經密碼子最佳化者，當導入至人類細胞中時，較佳是經人類密碼子最佳化。 又，編碼有這些蛋白質的鹼基序列，亦可以是編碼有天然IL-7和天然CCL19的突變體的鹼基序列。關於這些突變體，是如同上述［表現抗GM2 CAR的細胞（抗GM2 CAR表現細胞）］的項目所述。

又，作為其他蛋白質，亦可以舉出自殺基因。關於自殺基因，是如同上述［表現抗GM2 CAR的細胞（抗GM2 CAR表現細胞）］的項目所述。編碼有自殺基因的鹼基序列，可以從GenBank等習知的序列資料庫取得。又，亦可以利用市售的包含自殺基因的載體等的序列。

本實施形態的多核苷酸，當包含編碼有其他蛋白質的鹼基序列時，在編碼有抗GM2 CAR的鹼基序列、和編碼有該其他蛋白質的鹼基序列之間，亦可以間隔有編碼有2A胜肽等自我截切型胜肽的鹼基序列、或IRES(internal ribozyme entry site，內部的核醣體進入位)序列等。又，當其他蛋白質有二個以上時，該些其他蛋白質之間，亦可以間隔有自我截切型胜肽或IRES等。藉由間隔有這些序列，可以由1個啟動子獨立表現複數種蛋白質。

作為2A胜肽，可以例示下述的2A胜肽：小RNA病毒(picornavirus)、輪狀病毒、昆蟲病毒、口蹄疫病毒、錐蟲(Trypanosoma)病毒等。作為具體例，小RNA病毒的2A胜肽（F2A）的胺基酸序列顯示於序列編號62。編碼有2A胜肽的鹼基序列，較佳是視導入之細胞的生物種類而經密碼子最佳化者，當導入至人類細胞中時，較佳是經人類密碼子最佳化。

又，本實施形態的多核苷酸，亦可以是在每一個編碼有抗GM2 CAR之鹼基序列和編碼有其他蛋白質之鹼基序列的蛋白質編碼序列中都具有啟動子、強化子、多聚腺苷酸化信號序列、終止子等控制序列的多核苷酸。又，也可以是下述的多核苷酸：部分的蛋白質編碼序列獨立具有控制序列，而其他的蛋白質編碼序列則通過2A胜肽或IRES等而連結並且具有共通的控制序列。

［包含編碼有抗GM2 CAR之鹼基序列的載體］ 在一個實施形態中，本發明提供一種載體，該載體包含一鹼基序列，該鹼基序列編碼有抗GM2 CAR。

上述實施形態的多核苷酸，也可以是載體的形態。載體的種類並無特別限定，可以使用一般常用的表現載體等。載體可以是直鏈狀或環狀，也可以是質體等非病毒載體、病毒載體、藉由轉位子(transposon)之載體。作為載體，例如可以舉出：病毒載體、質體載體、附著型載體(episomal vector)、人工染色體載體等。

作為病毒載體，可以舉出：仙台病毒載體、反轉錄病毒（包含慢病毒(lentivirus)）載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、疱疹病毒載體、痘瘡病毒載體、痘病毒載體、小兒麻痺病毒載體、Shirubisu病毒(Shirubisu virus)載體、棒狀病毒載體、副黏液病毒載體、正黏液病毒載體等。

作為質體載體，例如可以舉出：pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo等動物細胞表現用之質體載體。

附著型載體，是在染色體外可以自主複製的載體。作為附著型載體，例如可以舉出下述載體：源自EBV、SV40等，且包含自主複製所必須的序列作為載體要件的載體。作為自主複製所必須的載體要件，具體而言，可以舉出一基因，該基因編碼有：複製起點、和結合於複製起點而控制複製的蛋白質。例如，在EBV方面可以舉出複製起點oriP和EBNA-1基因，在SV40方面可以舉出複製起點ori和SV40LT基因。

作為人工染色體載體，例如可以舉出：YAC（Yeast artificial chromosome）載體、BAC（Bacterial artificial chromosome）載體、PAC（P1-derived artificial chromosome）載體等。

作為本實施形態的載體的較佳例，可以舉出病毒載體，作為進一步較佳例，可以舉出反轉錄病毒載體。作為反轉錄病毒載體，可以例示pMSGV1載體（Tamada k et al., Clin Cancer Res 18:6436-6445(2012)）或pMSCV載體（Takara Bio公司製造），藉由採用反轉錄病毒載體，載體中的基因會嵌入宿主細胞的基因體中，並且在宿主細胞中長期安定地表現。

本實施形態的載體，除了上述［包含編碼有抗GM2 CAR之鹼基序列的多核苷酸］的項目所述之鹼基序列以外，亦可以包含下述鹼基序列：編碼有複製起點和結合於複製起點而控制複製之蛋白質的鹼基序列；編碼有抗藥性基因、報導基因等標識基因的鹼基序列等。

編碼有抗GM2 CAR之鹼基序列，較佳是以在適當的啟動子之控制下表現的方式來配置於載體內。又，當包含編碼有其他蛋白質的鹼基序列時，這些鹼基序列同樣較佳是以在適當的啟動子之控制下表現的方式來配置於載體內。作為啟動子，例如可以舉出：SRα啟動子ー、SV40早期啟動子、反轉錄病毒之LTR、CMV（巨細胞病毒）啟動子、RSV（勞斯肉瘤病毒）啟動子、HSV-TK（單純疱疹病毒的胸苷激酶）啟動子、EF1α啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱休克啟動子等。又，亦可以將人類CMV之IE基因的強化子和啟動子一起使用。作為例子之一，可以舉出CAG啟動子（包含巨細胞病毒強化子、雞β-肌動蛋白啟動子和β-球蛋白基因的多聚腺苷酸化信號序列部位）等。又，如同上述［包含編碼有抗GM2 CAR之鹼基序列的多核苷酸］的項目所述，亦可以在各蛋白質編碼序列之間，配置編碼有自我截切型胜肽的鹼基序列或IRES，在共通的啟動子的控制下進行轉錄。

在較佳的態樣中，本實施形態的載體，除了編碼有抗GM2 CAR之鹼基序列以外，還進一步包含編碼有IL-7之鹼基序列和編碼有CCL19之鹼基序列中的至少一者。在進一步較佳的態樣中，本實施形態的載體，除了編碼有抗GM2 CAR之鹼基序列以外，還進一步包含編碼有IL-7之鹼基序列和編碼有CCL19之鹼基序列。 較佳的是，本實施形態的載體包含一編碼有抗GM2 CAR之鹼基序列，該編碼有抗GM2 CAR之鹼基序列是功能性地連結於適當的啟動子。進一步較佳的是，本實施形態的載體包含一鹼基序列，該鹼基序列是由編碼有抗GM2 CAR之鹼基序列、編碼有IL-7之鹼基序列、及編碼有CCL19之鹼基序列通過編碼有自我截切型胜肽之鹼基序列或IRES所連結而成，並且該鹼基序列是功能性地連結於適當的啟動子。另外，所謂的「功能性地連結於啟動子」，意指以在啟動子的控制下表現的方式，連結於啟動子的下游。在前述例子中，編碼有抗GM2 CAR之鹼基序列、編碼有IL-7之鹼基序列、及編碼有CCL19之鹼基序列的配置順序，並無特別限定，可以設為任意的配置順序。

［表現抗GM2 CAR細胞的製造方法］ 在一個實施形態中，本發明提供一種表現抗GM2 CAR之細胞的製造方法，該製造方法包含將多核苷酸或載體導入至細胞中的步驟，該多核苷酸或該載體包含一編碼有抗GM2 CAR之鹼基序列。

上述實施形態的表現抗GM2 CAR的細胞（以下又稱為「抗GM2 CAR表現細胞」），可以藉由將上述實施形態的包含編碼有抗GM2 CAR之鹼基序列的多核苷酸或載體導入至細胞中而獲得。經導入至細胞內的多核苷酸或載體，是在可以表現抗GM2 CAR的狀態下，維持於細胞內。所謂的「可以表現的狀態」，意指編碼有抗GM2 CAR之鹼基序列是處於可以轉錄、轉譯的狀態。

將多核苷酸或載體導入至細胞中的方法，並無特別限定，可以採用習知的方法。例如，可以舉出下述方法：病毒感染法、脂質體轉染法、顯微注射法、磷酸鈣法、二乙基胺基乙基-葡聚醣法、電穿孔法、採用轉位子之方法、粒子槍(particle gun)法等。

又，當載體是反轉錄病毒時，亦可以基於載體所具有的LTR序列和包裹用訊息(packaging signal)而選擇適當的包裹細胞，並用以製備反轉錄病毒粒子。作為包裹細胞，例如可以例示PG13、PA317、GP+E-86、GP+envAm-12、Psi-Crip等。又，亦可以採用轉染效率高的293細胞或293T細胞來作為包裹細胞。可以使用於各種反轉錄病毒載體和該載體之包裹的包裹細胞，已經廣泛地市售，因此亦可以採用該些市售品。例如，可以採用GP2-293細胞（Takara Bio公司製造）、Plat-GP細胞（COSMO BIO公司製造）、PG13細胞（ATCC CRL-10686）、PA317細胞（ATCC CRL-9078）等，亦可以採用Retrovirus Packaging kit Eco(Takara Bio公司製造)等市售套組。

當使IL-7、CCL19、自殺基因等其他外來蛋白質在抗GM2 CAR表現細胞中表現時，可以使編碼有這些其他蛋白質之鹼基序列包含於一包含編碼有抗GM2 CAR之鹼基序列的載體中，也可以使其包含於其他載體中。當使編碼有其他蛋白質之鹼基序列包含於其他載體中時，可以將該載體與編碼有抗GM2 CAR之鹼基序列的載體同時或分別導入至細胞中。

又，抗GM2 CAR表現細胞，亦可以藉由下述方式製造：採用習知的基因編輯技術等，以在適當的啟動子之控制下可以表現的方式，將包含編碼有抗GM2 CAR之鹼基序列的多核苷酸嵌入細胞的基因體，藉此製造抗GM2 CAR表現細胞。作為基因編輯技術，例如可以舉出採用下述核酸內切酶的技術：鋅指核酸酶、TALEN(似轉錄激活因子蛋白核酸酶(transcription activator-like effector nuclease))、CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat(群聚且有規律間隔的短回文重複序列))-Cas系統、PPR(pentatricopeptide repeat)等。當使其他外來蛋白質表現於抗GM2 CAR表現細胞時，亦同樣採用基因編輯技術等，以在適當的啟動子之控制下可以表現的方式，將包含編碼有其他外來蛋白質之鹼基序列的多核苷酸嵌入細胞的基因體。例如，可以舉出下述方法：將多核苷酸嵌入細胞基因體之非編碼區域等的方法，該多核苷酸包含一功能性地連結於適當的啟動子而成且編碼有抗GM2 CAR（或其他蛋白質）的鹼基序列；將多核苷酸嵌入細胞基因體之內源啟動子(endogenous promoter)的下游的方法等，該多核苷酸包含一編碼有抗GM2 CAR（或其他蛋白質）的鹼基序列。作為內源啟動子，例如可以舉出TCRα、TCRβ的啟動子等。

將包含編碼有抗GM2 CAR之鹼基序列的多核苷酸或載體導入至細胞中之後，該細胞中的抗GM2 CAR的表現，可以藉由流式細胞儀、RT-PCR、北方墨點法、西方墨點法、ELISA、螢光免疫染色等習知方法來確認。又，IL-7和CCL19等其他外來蛋白質的表現，同樣也可以藉由習知方法來確認。

［包含抗GM2 CAR表現細胞的醫藥組成物］ 在一個實施形態中，本發明提供一種包含抗GM2 CAR表現細胞的醫藥組成物。

抗GM2 CAR表現細胞，會對於GM2表現細胞顯示專一的細胞傷害活性。因此，抗GM2 CAR表現細胞，可以使用於治療或預防有關GM2表現細胞的疾病。GM2會表現於包括肺癌、神經母細胞瘤、神經膠質瘤、黑色素瘤、惡性間皮瘤、骨髓瘤等範圍廣泛的腫瘤細胞中，所以包含抗GM2 CAR表現細胞的醫藥組成物，可以利用作為用以治療或預防腫瘤的醫藥組成物。腫瘤，可以是發生於骨組織、軟骨組織、脂肪組織、肌肉組織、血管組織及造血組織的任一者。作為腫瘤，例如可以舉出下述，但並不限定於該些腫瘤：神經膠質瘤、黑色素瘤、惡性間皮瘤、肺癌、胰臟癌、頭頸部癌、肝癌、子宮癌、膀胱癌、膽管癌、食道癌、睪丸瘤、甲狀腺癌、腦瘤、前列腺癌、大腸癌、腎臟癌、卵巢癌、乳癌、腺癌、鱗狀細胞癌、腺樣鱗狀細胞癌、未分化癌、大細胞癌、小細胞癌、皮膚癌、陰道癌、頸癌、脾臟癌、氣管癌、支氣管癌、小腸癌、胃癌、膽囊癌、睪丸癌等癌症；骨肉瘤、軟骨肉瘤、Ewing氏肉瘤、惡性血管內皮瘤、惡性神經髓鞘瘤、軟組織肉瘤等肉瘤；神經母細胞瘤、肝母細胞瘤、神經管胚細胞瘤、腎胚細胞瘤、胰臟母細胞瘤、胸膜肺母細胞瘤、視網膜母細胞瘤等母細胞瘤；生殖細胞瘤；淋巴瘤、白血病、骨髓瘤等血液腫瘤等。本實施形態的醫藥組成物尤其適合作為用以治療或預防表現GM2之腫瘤的醫藥組成物。做為表現GM2之腫瘤，例如可以舉出肺癌、神經母細胞瘤、神經膠質瘤、黑色素瘤、惡性間皮瘤、骨髓瘤等，但並不限定於該些腫瘤。腫瘤是否表現GM2，例如可以藉由採用抗GM2抗體等的習知方法來確認。作為習知方法，可以例示流式細胞儀、ELISA、免疫染色、螢光免疫染色等。除了抗GM2 CAR以外還表現IL-7和CCL19的任一者或兩者的細胞（較佳是T細胞），只要是表現GM2的腫瘤，即便是對於固體腫瘤，亦會發揮強力的細胞傷害活性。因此，包含表現抗GM2 CAR以及IL-7和CCL19的任一者或兩者的細胞（較佳是T細胞）的本實施形態的醫藥組成物，能夠特別適合用於表現GM2之固體腫瘤。從而，包含表現抗GM2 CAR以及IL-7和CCL19的任一者或兩者的細胞（較佳是T細胞）並且用以治療或預防固體腫瘤的醫藥組成物，是本實施形態的醫藥組成物的合適例子。所謂的「固體腫瘤」，意指發生於造血系統組織之血液癌症以外的腫瘤，包括上皮細胞癌及非上皮細胞癌。

本實施形態的醫藥組成物，除了抗GM2 CAR表現細胞以外，亦可以包含藥學上所容許的攜帶體等其他成分。作為其他成分，除了藥學上所容許的攜帶體以外，例如可以舉出：細胞激素等T細胞活化因子、免疫刺激劑、免疫檢查點抑制劑、其他表現CAR的細胞、抗發炎藥等，但不限定於這些成分。作為藥學上所容許的攜帶體，可以舉出：細胞培養之培養基、生理食鹽水、磷酸緩衝液、檸檬酸緩衝液等。

本實施形態的醫藥組成物，可以藉由習知的方法來投予，較佳是藉由注射或輸注(infusion)而投予至患者。作為投予路徑，較佳是靜脈內投予，但並不限定於此，亦可以藉由注入腫瘤內等路徑而投予。

本實施形態的醫藥組成物，可以包含治療上有效量的抗GM2 CAR表現細胞。所謂的「治療上有效量」，意指用以治療或預防疾病的有效的藥劑的量。治療上有效量，可以根據投予對象的疾病狀態、年齡、性別、及體重等而變動。本實施形態的醫藥組成物中，上述抗GM2 CAR表現細胞的治療上有效量，例如可以是抗GM2 CAR表現細胞能夠抑制腫瘤增殖的量。

本實施形態的醫藥組成物的投予量和投予間隔，可以根據下述而適當地選擇：投予對象的年齡、性別及體重等；疾病的種類、嚴重度及症狀等；及，投予方法等。作為投予量，可以投予治療上有效量，例如可以舉出：在一次的投予中，投予細胞的個數為1×10⁴ ～1×10¹⁰ 個，較佳是1×10⁵ ～1×10⁹ 個，進一步較佳是5×10⁶ ～5×10⁸ 個。

作為本實施形態的醫藥組成物的投予間隔，例如可以設為：每1星期、每10～30日、每1個月、每3～6個月、每1年等。又，因為抗GM2 CAR表現細胞可以在投予對象的體內自行增殖，所以亦可以設為一次完成的投予。又，亦可以在投予後監測體內的抗GM2 CAR表現細胞的數目，再視其結果而決定投予時期。

又，本實施形態的醫藥組成物，可以和其他抗癌劑併用而使用。作為其他抗癌劑，可以舉出下述，但並不限定於該些抗癌劑：環磷醯胺等烷化劑、噴司他丁(pentostatin)等抗代謝物質、利妥昔(rituximab)等分子標靶藥物、基利克膜衣錠(imatinib)等激酶抑制劑、萬科注射劑(bortezomib)等蛋白酶體抑制劑、環孢靈素等鈣調神經磷酸酶抑制劑、艾達黴素(idarubicin)等抗癌性抗生物質、抗癌妥(irinotecan)等植物生物鹼、順鉑等白金製劑、泰莫西芬(tamoxifen)等荷爾蒙療法藥物、保疾伏(nivolumab)、吉舒達(pembrolizumab)等免疫抑制藥物等。

又，其他的態樣中，本發明提供下述：1）一種抗GM2 CAR表現細胞之用途，其用於製造治療或預防腫瘤的醫藥組成物；2）一種治療或預防表現GM2之腫瘤的方法，其包含將抗GM2 CAR表現細胞投予至對象（例如，罹患表現GM2之腫瘤的患者、已進行腫瘤之外科切除的患者等）的步驟；3）一種抗GM2 CAR表現細胞，其使用於腫瘤的治療或預防；4）一種抗GM2 CAR表現細胞之用途，其用於治療或預防腫瘤。 進一步，在別的態樣中，本發明提供一種用於製作抗GM2 CAR表現細胞的套組，其包含上述實施形態的載體。該套組，只要是包含上述實施形態的載體即可，並無特別限制，亦可以包含用以製作抗GM2 CAR表現細胞的說明書、或用於將載體導入至細胞中的試劑等。 [實施例]

以下，藉由實施例來說明本發明，但本發明並不受以下的實施例所限定。

［實施例1］表現IL-7和CCL19之抗GM2 CAR表現T細胞的製作（T細胞的免疫機能促進因子的選擇） 可以控制T細胞的機能的分子，至少在生物體內存在著數百種。本發明人在數量龐大的組合之中，選擇了IL-7和CCL19作為用以提高CAR-T細胞之抗腫瘤效果的免疫機能促進因子。

另外，前述IL-7是T細胞生存所必須的細胞激素，是藉由存在於骨髓、胸腺及淋巴器官．組織的基質細胞等非造血細胞所產生。另一方面，在T細胞則幾乎未辨認到產生IL-7的能力。

又，前述CCL19主要是由淋巴結中的樹狀細胞或巨噬細胞所產生，具有下述功能：通過其受體也就是CCR7而引發T細胞或B細胞、成熟的樹狀細胞的移動。

（抗GM2 CAR的scFv序列） 基於已知的GM2抗體的序列，來設計抗GM2 CAR的scFv序列。為了比較VL和VH的順序、連接子的種類，合成下述各DNA片段：VL-連接子15-VH（序列編號9：VL15VH）、VL-連接子25-VH（序列編號11：VL25VH）、VH-連接子15-VL（序列編號13：VH15VL）、及VH-連接子25-VL（序列編號15：VH25VL）。另外，後續的實施例中，除了特別記載的情形以外，均使用VL15VH作為抗GM2 scFv序列。

（表現IL-7和CCL19之抗GM2 CAR表現載體的製作） 化學合成一IL-7-F2A-CCL19 DNA片段（序列編號33：IL-7-F2A-CCL19），該片段的編碼初始為人類IL-7（無終止密碼子(stop codon)），其後是F2A和人類CCL19。繼而，採用既有的小鼠抗CD20 CAR-IL-7/CCL19載體，用前述所合成的人類IL-7-F2A-CCL19 DNA片段（序列編號33），藉由限制酶（NsiI和SalI）處理及連接(ligation)，來取代載體內的小鼠IL-7-F2A-CCL19區域，該小鼠抗CD20 CAR-IL-7/CCL19載體是在pMSGV1反轉錄病毒表現載體（Tamada k et al., Clin Cancer Res 18:6436-6445(2012)）中插入構築物(construct)而成，該構築物是由小鼠抗CD20 scFv、小鼠CD8跨膜區域、小鼠CD28-4-1BB-CD3ζ細胞內訊息模體、及小鼠IL-7-F2A-小鼠CCL19所構成。進一步，化學合成一人類抗CD20 CAR DNA片段（序列編號37：抗CD20 CAR），用該DNA片段並且藉由限制酶（NcoI和EcoI）處理及連接，來取代載體內的小鼠抗CD20 CAR區域，該DNA片段是由人類抗CD20 scFv、人類CD8跨膜區域、及人類CD28-4-1BB-CD3ζ細胞內訊息模體所構成。最後，化學合成一DNA片段（序列編號9、11、13、15），用該DNA片段並且藉由限制酶（NcoI和NotI）處理及連接，來取代載體內的抗CD20 scFv，該DNA片段編碼有人類抗GM2 scFv。另外，抗CD20 CAR DNA片段的構築體顯示於第1A圖，所獲得的載體的配置圖則顯示於第1B圖。

（表現IL-7/CCL19和HSV-tk的抗GM2 CAR表現載體的製作） CAR-T細胞療法中，會由於對於目標抗原的強烈免疫反應，而發生細胞激素釋放症候群等全身性副作用。為了處理此問題，製作一CAR構築體，該CAR構築體導入了源自疱疹病毒之胸苷激酶基因HSV-tk來作為自殺基因。將此構築體進行基因導入，並且使HSV-tk在CAR-T細胞中表現，則藉由添加更昔洛韋也就是巨細胞病毒治療藥物，CAR-T細胞會被誘導細胞凋亡而死滅，所以能夠藉由投予更昔洛韋而控制體內的CAR-T細胞。 首先，化學合成IL-7-F2A-CCL19-F2A-HSV-tk DNA片段（序列編號35：IL-7-F2A-CCL19- HSV-tk）。繼而，用所合成的IL-7-F2A-CCL19-HSV-tk DNA片段（序列編號35）並且藉由限制酶（NsiI和SalI）處理及連接，來將表現IL-7和CCL19之抗GM2 CAR表現載體（序列編號39）內的IL-7-F2A-CCL19區域予以取代，而製作成表現IL-7/CCL19和HSV-tk之抗GM2 CAR表現載體（序列編號47）。

（經導入IL-7/CCL19表現-抗GM2 CAR載體而成的反轉錄病毒的製作） 為了將基因導入至T細胞中而製作反轉錄病毒。採用Lipofectamine 3000（Life Technology公司製造），將上述IL-7/CCL19表現-抗GM2 CAR載體和p-Ampho質體（Takara Bio公司製造），轉染至GP2-293包裹細胞株（Takara Bio公司製造）中，藉此製作成經導入IL-7/CCL19表現-抗GM2 CAR載體而成的反轉錄病毒。於轉染起48小時之後，回收含有前述反轉錄病毒的上清液。

作為前述GP2-293細胞的培養液，採用添加有10%FCS、100U/ml的盤尼西林、100mg/ml的鏈黴素的DMEM。又，作為後述實施例所採用的T細胞的培養液，採用GT-T551，其包含2.0%人類AB型血清（Sigma公司製造）、1%盤尼西林-鏈黴素（和光純藥公司製造）、2.5μg/ml的雙性殺黴素B（Bristol-Myers Squibb公司製造）。

（T細胞的轉導(transduction)） 從健康供血者的血液中採集末梢血液單核球，為了使T細胞活化而在經固定化抗CD3單株抗體（5μg/ml）和RetroNectin（註冊商標：Takara Bio公司製造，25μg/ml）而成的培養皿上，與2×10⁶ 個IL-2（200IU/ml：Peprotech公司製造）一起在37℃且5%CO₂ 的恆溫箱中培養3日。於培養開始之後的第2日，在預先以25μg/ml之RetroNectin（Takara Bio公司製造）被覆(coat)而成的表面未處理24孔盤中，以每1孔為500μl的方式，添加上述所製作的含有經導入IL-7/CCL19表現-抗GM2 CAR載體而成之反轉錄病毒的上清液，藉由2000g、2小時的離心而製作成反轉錄病毒預充填培養皿(retrovirus preload plate)。培養皿共計製作2片，於離心結束後，以1.5%BSA/PBS清洗，以4℃保存至使用前。於培養第3日，從上述培養皿中回收已被活化的細胞，調整為細胞懸浮液（1×10⁵ cells/ml）。將該細胞懸浮液以每1孔為1ml的方式添加至反轉錄病毒預充填培養皿中，於IL-2（最終濃度200IU/ml）存在下在37℃且5%CO₂ 的恆溫箱中培養24小時，而進行第1次的反轉錄病毒感染。翌日（培養第4日），將各孔的細胞溶液移至經保存的第2片病毒預充填培養皿，以500g離心1分鐘後，於37℃培養4小時，而進行第2次的感染。於37℃培養4小時之後，將各孔的細胞懸浮液1ml移至新的12孔細胞培養盤中，以含有IL-2（200IU/ml）的新的培養液（GT-T551）稀釋成4倍，在37℃且5%CO₂ 的恆溫箱中進行培養。培養至末梢血液單核球之培養起始日起算的第7日為止，獲得經導入IL-7/CCL19表現-抗GM2 CAR載體而成的T細胞（抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞）（第1B圖）。又，同時製作非基因導入細胞來作為CAR陰性細胞對照組，該非基因導入細胞是將從同一位健康供血者的血液中獲得的末梢血液單核球以同樣方式活化，但並未進行反轉錄病毒感染。

［實施例2］藉由流式細胞儀進行的CAR表現測定（流式細胞儀分析） 辨識GM2作為抗原的CAR的表現程度分析，是藉由雙色流式細胞儀分析來進行。使所製作成的抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞，與生物素化protein L（GenScript公司製造）、異藻藍蛋白（APC）標記鏈黴親合素（Affymetrix公司製造）、及APC標記抗CD8單株抗體（Affymetrix公司製造）反應，而進行染色。流式細胞儀是採用EC800（Sony公司製造），數據分析是採用FlowJo software（Tree Star公司製造）。

結果顯示於第2圖。左圖是無CAR基因導入的細胞，右圖是抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞的結果。又，圖中的數值表示各自的族群的百分比。如同第2圖所示，抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞中，確認到約68%的CAR的表現。

［實施例3］IL-7、CCL19的產生 （抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞之培養上清液中的IL-7、CCL19濃度的測定） 將上述的培養第7日的抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞或非基因導入細胞的培養上清液回收，針對抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞所進行的IL-7和CCL19的生成，採用市售的ELISA套組（分別是Peprotech公司製造和R&D systems公司製造）來進行探討。

〔結果〕 結果顯示於第3圖。如同第3圖所示，抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞的培養上清液中（GM2 CAR），關於IL-7檢測到300pg/ml以上，關於CCL19檢測到2000pg/ml以上。由此結果確認到，抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞會表現IL-7和CCL19，並且所表現的IL-7和CCL19會被分泌至細胞外。另一方面，對照組的非基因導入T細胞的培養上清液中(non infection)，IL-7和CCL19均為檢測限值以下(Not detected)。

〔實施例4〕各腫瘤細胞的GM2表現

(流式細胞儀分析)

將惡性間皮瘤細胞株Y-meso8A、MSTO211H、骨髓瘤細胞株KMS-11、KMS-28PE、大腸癌細胞株SW480，用經Alexa488標記而成之抗GM2抗體和對照組的抗DNP抗體來染色，藉由流式細胞儀分析而測定各腫瘤細胞中的GM2的表現。Alexa488標記抗GM2抗體和Alexa488標記抗DNP抗體，均是以10μg/樣品來進行染色。

結果大腸癌細胞株SW480中並未辨認到GM2的表現，但惡性間皮瘤細胞株Y-meso8A、MSTO211H和骨髓瘤細胞株KMS-11、KMS-28PE則確認到GM2的表現。

〔實施例5〕細胞傷害性試驗

(藉由抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞所進行之⁵¹Cr釋放試驗1)

第4圖，顯示了抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞之製作、細胞傷害性試驗、共同培養試驗的試驗時程。如同第4圖所示，於第8日回收CAR-IL-7/CCL19表現T細胞，採用標準的4小時⁵¹ Cr釋放分析法，來評估CAR-IL-7/CCL19表現T細胞對於腫瘤細胞的細胞傷害活性。 採用表現人類GM2的各種腫瘤細胞來作為標靶細胞。將前述腫瘤細胞株，在100μCi Na₂ ⁵¹ CrO₄ 存在下，於37℃培養1小時之後，清洗3次，以每1孔5×10³ 個細胞的方式添加至96孔V底盤（Nunc公司製造）中。之後，作為效應T細胞，添加4種抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞、或非基因導入T細胞，與標靶細胞一起於37℃中共同培養4小時，該4種抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞是改變抗GM2 CAR之scFv的VH和VL、以及連接子的組合而成。另外，效應細胞/標靶細胞之比（E/T ratio），是調整於2.5、5、10、20、40的範圍內。標靶細胞的最大釋放和自然釋放，是藉由以含10%Triton-X（Sigma-Aldrich公司製造）之培養液來培養、或僅以培養液培養標靶細胞來測定。上清液的⁵¹ Cr釋放，是以TopCount閃爍計數器（PerkinElmer公司製造）來測定。細胞傷害活性的比例，是以下述算式來算出：細胞傷害活性（%）＝［（試驗釋放－自然釋放）／（最大釋放－自然釋放）］×100。

［結果］ 結果顯示於第5A圖和第5B圖。第5A圖是將惡性間皮瘤細胞株（Y-meso8A、MSTO211H）作為標靶細胞而成的結果，第5B圖是將骨髓瘤細胞株（KMS-11、KMS-28PE）作為標靶細胞而成的結果。圖中，「VL15VH」、「VL25VH」、「VH15VL」、及「VH25VL」分別是包含該序列作為抗GM2 CAR之scFv序列的抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞。如同第5A圖和第5B圖所示，抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞，無論是藉由VH、VL及連結子的任一種組合，均顯示對於腫瘤細胞株的細胞傷害性。另一方面，對照組的非基因導入T細胞（non infection）則幾乎未顯示對於腫瘤細胞株的細胞傷害活性。另外，第5A圖和第5B圖的圖表的橫軸，以E/T ratio來表示效應細胞（T細胞）與標靶細胞（腫瘤細胞）的比，縱軸則顯示細胞傷害活性（%）。

（藉由抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞所進行之⁵¹ Cr釋放試驗2） 為了探討藉由抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞所造成之細胞傷害活性的GM2專一性，採用抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞、作為CAR-T細胞之對照組的辨識FITC的抗FITC CAR-T細胞、及非基因導入T細胞，比較並探討各細胞對於GM2陽性腫瘤細胞株和GM2陰性腫瘤細胞株的細胞傷害活性。另外，抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞中，是採用包含VL15VH作為scFv序列者。

［結果］

結果顯示於第6A圖~第6C圖。第6A圖是將惡性間皮瘤細胞株(Y-MESO8A)作為標靶細胞而成的結果，第6B圖是將骨髓瘤細胞株(KMS11)作為標靶細胞而成的結果，第6C圖是將大腸癌細胞株(SW480)作為標靶細胞而成的結果。如同第6A圖~第6C圖所示，抗FITCCAR-T細胞(FITC CAR-T)對於任一種標靶細胞均無法辨認出明顯的細胞傷害活性，與非基因導入T細胞(non infection)幾乎為相同程度。另一方面，抗GM2CAR-IL-7/CCL19表現T細胞(GM2 CAR-T)雖然對於表現GM2的細胞(Y-MESO8A、KMS11)顯示了細胞傷害性，但對於未表現GM2的細胞(SW480)則未顯示細胞傷害性。由此可以確認到，抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞會誘導出對於GM2具專一性的細胞傷害活性。另外，第6A圖~第6C圖的圖表的橫軸，以E/T ratio來表示效應細胞(T細胞)與標靶細胞(腫瘤細胞)的比，縱軸則顯示細胞傷害活性(%)。

(共同培養試驗)

如同第4圖所示，於第7日回收抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞，與GM2陽性瘤細胞株或GM2陰性腫瘤細胞株一起，以效應細胞：腫瘤細胞之比成為1：1~1：3的方式調整之後，在24孔細胞培養皿上以37℃於細胞培養恆溫箱中進行共同培養。從共同培養開始起2~3日後，以顯微鏡觀察細胞傷害活性，並且採用市售的IFN-γELISA套組(BioLegend公司製造）來測定培養上清液中產生的IFN-γ。作為抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞的對照組，採用了抗FITC CAR表現T細胞和非基因導入T細胞。

［結果］ 結果顯示於第7圖～第9圖。第7圖、第8圖是將惡性間皮瘤細胞株（Y-meso8A、MSTO221H）作為標靶細胞而成的結果，第9圖是將大腸癌細胞株（SW480）作為標靶細胞而成的結果。如同第7圖～第9圖所示，對照組的抗FITC CAR-T表現細胞（FITC CAR-T）或非基因導入T細胞（non-infection）與標靶腫瘤細胞的共同培養中，任一種標靶腫瘤細胞均被觀察到與僅有腫瘤細胞的孔（tumor only）為相同程度的增殖。

另一方面，抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞（GM2 CAR-T）中，則根據標靶腫瘤細胞的種類而辨認到有腫瘤增殖的差異。與GM2陰性標靶細胞（SW480：第9圖）的共同培養中，標靶腫瘤細胞與僅有腫瘤細胞的孔為相同程度的增殖。另一方面，與GM2陽性標靶細胞（Y-meso8A：第7圖、MSTO221H：第8圖）的共同培養中，相較於僅有腫瘤細胞的孔、和與對照組細胞共同培養的孔，與GM2陽性標靶細胞共同培養的腫瘤細胞的數目可觀察到明顯的減少。

從這些結果可以確認到，與⁵¹ Cr釋放分析法同樣地，抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞會抗原專一性地傷害腫瘤細胞。又，如第10圖所示，在採用共同培養後之上清液而進行的IFN-γ的ELISA中，也只有抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞與GM2陽性標靶細胞（MSTO221H、Y-meso8A）的共同培養的上清液中才有確認到IFN-γ的產生。

［實施例6］腫瘤模式中的治療效果 （對於X光照射小鼠的抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞之投予） 朝NOD/SCID/IL2rgKO（NSG）小鼠也就是免疫缺陷小鼠照射2Gy的X光之後，於腹腔或胸腔接種1×10⁴ 個螢光素酶表現MSTO211H。對於此腹腔內腫瘤模式族群（n=2）或胸腔內腫瘤模式族群（n=3），於1日後朝靜脈內投予2.5×10⁷ 個抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞（確認有CAR表現的細胞為1×10⁷ 個）或作為對照組的相同數目的非基因導入T細胞。將細胞投予日設為day 0，採用IVIS imaging system(非侵入式活體分子影像系統)（PerkinElmer公司製造）經時性地評估腫瘤容量（=由螢光素酶所致之發光強度）。

［結果］ 小鼠的腫瘤容量的變遷結果顯示於第11A圖和第11B圖。第11A圖是胸腔內腫瘤模式中的結果，第11B圖是腹腔內腫瘤模式中的結果。如第11A圖所示，胸腔內腫瘤模式中，在投予非基因導入T細胞的族群（non infection）可以確認到腫瘤增殖，但在抗GM2CAR-IL-7/CCL19表現T細胞投予族群（GM2 CAR-T）則並未辨認到明顯的腫瘤增殖。又，如第11B圖所示，腹腔內腫瘤接種模式中，抗GM2CAR-IL-7/CCL19表現T細胞投予族群（GM2 CAR-T）至day 3為止曾辨認到腫瘤增殖，但之後腫瘤便逐漸縮小。由這些結果明顯可知，無論是在胸腔內腫瘤模式或腹腔內腫瘤模式中，抗GM2CAR-IL-7/CCL19表現T細胞均顯示優異的抗腫瘤活性，

（對於非X光照射小鼠的抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞之投予） 繼而，以對於NSG小鼠無X光照射的前處置且在胸腔內接種腫瘤而成的模式，來探討抗腫瘤效果。於胸腔接種1×10⁴ 個螢光素酶表現MSTO211H，翌日，朝靜脈內投予1.6×10⁷ 個抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞（CAR表現細胞為1×10⁷ 個）或作為對照組的相同數目的非基因導入T細胞（抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞投予族群n=6、非基因導入T細胞投予族群n=5）。將細胞投予日設為day 0，與前述同樣地採用IVIS imaging system經時性地評估腫瘤增殖。

［結果］ 小鼠的腫瘤容量的變遷結果顯示於第12圖。如第12圖所示，非基因導入T細胞投予族群（non infection）中，腫瘤逐漸增殖。另一方面，抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞投予族群（GM2 CAR-T）中，至day 9為止腫瘤曾顯示增殖趨勢，但之後除了其中1隻小鼠以外，其餘小鼠的腫瘤就不再增殖而消退。與前述的有X光照射之前處置的模式同樣地，抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞可以確認到會誘導出優異的抗腫瘤效果。

［實施例7］腫瘤模式中的治療效果 （抗GM2 CAR表現T細胞的製作） 除了不含IL-7-F2A-CCL19 DNA片段以外，製作與IL-7/CCL19表現-抗GM2 CAR載體具備同樣結構的抗GM2 CAR表現載體。以與實施例1同樣的方法，將此抗GM2 CAR表現載體轉導至T細胞中，而獲得抗GM2 CAR表現T細胞。

（對於小鼠的抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞或抗GM2 CAR表現T細胞之投予） 對於NOD/SCID/IL2rgKO（NSG）小鼠也就是免疫缺陷小鼠，於胸腔接種1×10⁴ 個螢光素酶表現MSTO211H。對於此胸腔內腫瘤模式族群，於1日後朝靜脈內投予2.2×10⁶ 個抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞（確認有CAR表現的細胞為1×10⁶ 個）、相同數目的抗GM2 CAR表現T細胞（確認有CAR表現的細胞為1×10⁶ 個）、或作為對照組的相同數目的非基因導入T細胞（各族群n=5）。將細胞投予日設為day 0，採用IVIS imaging system（PerkinElmer公司製造）經時性地評估腫瘤容量（=由螢光素酶所致之發光強度）。

［結果］ 小鼠的腫瘤容量的變遷結果顯示於第13圖。第13圖中，「×」表示小鼠死亡。如第13圖所示，胸腔內腫瘤模式中，在投予非基因導入T細胞的族群（non infection）可以確認到經時性的腫瘤增殖，在day 57的時間點已經無小鼠存活。在投予抗GM2 CAR表現T細胞的族群（GM2 CAR-T(-)IL-7/CCL19）雖然腫瘤亦經時性地增殖，但相較於非基因導入T細胞投予族群，則可見到腫瘤增殖之抑制。另一方面，在抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞投予族群（GM2 CAR-T(+)IL-7/CCL19）中，相較於其他族群，其腫瘤的增殖受到抑制，在day 70之後小鼠仍然存活。

第14圖，是將第13圖中的發光強度變遷加以圖表化而成者。第14圖的圖表的橫軸顯示從在小鼠胸腔內接種腫瘤細胞起的經過日數，縱軸顯示腫瘤細胞的發光強度（×10⁶ 光子/秒）。非基因導入T細胞投予族群（non infection）和抗GM2 CAR表現T細胞投予族群（GM2 CAR-T(-)IL-7/CCL19）中，由於在day 57的時間點已經無小鼠存活，所以沒有之後的圖。第14圖中，相較於非基因導入T細胞投予族群（non infection），抗GM2 CAR表現T細胞投予族群（GM2 CAR-T(-)IL-7/CCL19）中可以確認到腫瘤增殖稍微受到抑制。另一方面，抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞投予族群（GM2 CAR-T(+)IL-7/CCL19）中，腫瘤增殖被抑制在幾乎固定的範圍內。

又，第15圖是顯示小鼠存活率變遷的圖表。第15圖的圖表的橫軸顯示從在小鼠胸腔內接種腫瘤細胞起的經過日數，縱軸顯示小鼠的存活率（%）。如第15圖所示，相較於非基因導入T細胞投予族群（non infection），抗GM2 CAR表現T細胞投予族群（GM2 CAR-T(-)IL-7/CCL19）確認到存活期間有稍微延長的趨勢。另一方面，相較於非基因導入T細胞投予族群和抗GM2 CAR表現T細胞投予族群，抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞投予族群（GM2 CAR-T(+)IL-7/CCL19）確認到存活率的改善（存活期間的延長效果）。 由以上的結果明顯可知，抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞具有優異的抗腫瘤活性。 [產業利用性]

根據本發明，提供一種將固體腫瘤抗原作為目標抗原的新穎的CAR、和一種對於固體腫瘤有效的CAR-T細胞。本發明的CAR-T細胞，可以應用於肺癌、神經母細胞瘤、神經膠質瘤、黑色素瘤、惡性間皮瘤、骨髓瘤等表現GM2之固體腫瘤的治療和預防。

本申請案是基於已在日本申請的特願2017-61461（申請日為2017年3月27日）號案，其內容全部包含於本說明書中。

無

第1A圖是顯示抗GM2 CAR構築體的示意圖。 第1B圖是顯示表現IL-7/CCL19-抗GM2 CAR之載體、和經導入前述載體而成的抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞的示意圖。 第2圖是顯示以流式細胞儀確認抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞中的CAR表現程度的結果的圖。左圖是非基因導入T細胞的結果，右圖是抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞的結果。 第3圖是顯示藉由ELISA測定表現抗GM2 CAR之T細胞的培養上清液中的IL-7和CCL19之濃度的結果的圖。圖中，「GM2 CAR」是表示抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞，「non infection」表示非基因導入T細胞（後續的圖中亦相同）。 第4圖是顯示使用抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞而成的腫瘤細胞傷害性試驗和共同培養試驗的試驗時程的圖。 第5A圖是顯示使用4種抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞而成的鉻釋放試驗結果的圖。第5A圖是將惡性間皮瘤細胞株（Y-meso8A、MSTO211H）作為標靶細胞而成的試驗的結果。圖中，「VL15VH」、「VL25VH」、「VH15VL」、及「VH25VL」分別是包含該序列作為抗GM2 CAR之scFv序列的抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞中的結果（後續的圖中亦相同）。 第5B圖是顯示使用4種抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞而成的鉻釋放試驗結果的圖。第5B圖是將骨髓瘤細胞株（KMS-11、KMS-28PE）作為標靶細胞而成的試驗的結果。 第6A圖是顯示抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞和對照組CAR-T細胞的鉻釋放試驗結果比較的圖。第6A圖是將惡性間皮瘤細胞株（Y-meso8A）作為標靶細胞而成的試驗的結果。圖中，「FITC CAR-T」是表示使用作為陰性對照組的抗FITC CAR-T細胞（後續的圖中亦相同）。 第6B圖是顯示抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞和對照組CAR-T細胞的鉻釋放試驗結果比較的圖。第6B圖是將骨髓瘤細胞株（KMS-11）作為標靶細胞而成的試驗的結果。 第6C圖是顯示抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞和對照組CAR-T細胞的鉻釋放試驗結果比較的圖。第6C圖是將大腸癌細胞株（SW480）作為標靶細胞而成的試驗的結果。 第7圖是顯示GM2陽性的惡性間皮瘤細胞株（Y-meso8A）和抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞或對照組細胞的共同培養試驗結果的圖。圖中，「tumor only」是表示僅培養腫瘤細胞（後續的圖中亦相同）。 第8圖是顯示GM2陽性的惡性間皮瘤細胞株（MSTO211H）和抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞或對照組細胞的共同培養試驗結果的圖。 第9圖是顯示GM2陰性的大腸癌細胞株（SW480）和抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞或對照組細胞的共同培養試驗結果的圖。 第10圖是顯示以ELISA測定各腫瘤細胞株和抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞或對照組細胞的共同培養試驗的培養上清液中的IFN-γ的結果的圖。 第11A圖是顯示在已投予表現Luciferase(螢光素酶)之MSTO211H至胸腔內而成的免疫缺陷小鼠中投予抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞或非基因導入T細胞時的腫瘤增殖變遷的圖。 第11B圖是顯示在已投予表現螢光素酶之MSTO211H至腹腔內而成的免疫缺陷小鼠中投予抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞或非基因導入T細胞時的腫瘤增殖變遷的圖。 第12圖是顯示在已投予表現螢光素酶之MSTO211H至胸腔內而成的免疫缺陷小鼠中投予抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞或非基因導入T細胞時的腫瘤增殖變遷的分析結果的圖。 第13圖是顯示在已投予表現螢光素酶之MSTO211H至胸腔內而成的免疫缺陷小鼠中投予抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞、抗GM2 CAR表現T細胞、或非基因導入T細胞時的腫瘤增殖變遷的分析結果的圖。圖中，「×」表示小鼠死亡。 第14圖是顯示在已投予表現螢光素酶之MSTO211H至胸腔內而成的免疫缺陷小鼠中投予抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞、抗GM2 CAR表現T細胞、或非基因導入T細胞時對於腫瘤增殖變遷之效果的分析結果的圖。 第15圖是顯示在已投予表現螢光素酶之MSTO211H至胸腔內而成的免疫缺陷小鼠中投予抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞、表現抗GM2 CAR之T細胞、或非基因導入T細胞時對於小鼠存活率之效果的分析結果的圖。

國內寄存資訊 (請依寄存機構、日期、號碼順序註記) 無

國外寄存資訊 (請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記) 無

<110> 日商諾伊爾免疫生物科技股份有限公司(Noile-Immune Biotech,Inc.)

<120> 嵌合抗原受體

<150> JP2017-061461

<151> 2017-03-27

<160> 68

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於VL15VH的抗GM2抗體的VH區域

<400> 1

<210> 2

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗GM2抗體的VH區域

<400> 2

<210> 3

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於VL15VH的抗GM2抗體的VL區域

<400> 3

<210> 4

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗GM2抗體的VL區域

<400> 4

<210> 5

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於VL15VH的連接子15

<400> 5

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子15

<400> 6

<210> 7

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於VL25VH的連接子25

<400> 7

<210> 8

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子25

<400> 8

<210> 9

<211> 723

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗GM2scFv(VL15VH)

<400> 9

<210> 10

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗GM2scFv(VL15VH)

<400> 10

<210> 11

<211> 753

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗GM2scFv(VL25VH)

<400> 11

<210> 12

<211> 251

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗GM2scFv(VL25VH)

<400> 12

<210> 13

<211> 723

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗GM2scFv(VH15VL)

<400> 13

<210> 14

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗GM2scFv(VH15VL)

<400> 14

<210> 15

<211> 753

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗GM2scFv(VH25VL)

<400> 15

<210> 16

<211> 251

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗GM2scFv(VH25VL)

<400> 16

<210> 17

<211> 165

<212> DNA

<213> 人類(智人)

<400> 17

<210> 18

<211> 55

<212> PRT

<213> 人類(智人)

<400> 18

<210> 19

<211> 63

<212> DNA

<213> 人類(智人)

<400> 19

<210> 20

<211> 21

<212> PRT

<213> 人類(智人)

<400> 20

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人類(智人)

<400> 21

<210> 22

<211> 7

<212> PRT

<213> 人類(智人)

<400> 22

<210> 23

<211> 123

<212> DNA

<213> 人類(智人)

<400> 23

<210> 24

<211> 41

<212> PRT

<213> 人類(智人)

<400> 24

<210> 25

<211> 138

<212> DNA

<213> 人類(智人)

<400> 25

<210> 26

<211> 46

<212> PRT

<213> 人類(智人)

<400> 26

<210> 27

<211> 339

<212> DNA

<213> 人類(智人)

<400> 27

<210> 28

<211> 113

<212> PRT

<213> 人類(智人)

<400> 28

<210> 29

<211> 849

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD8(鉸鏈區)_CD8(跨膜區域)_CD28(訊息傳導區域)_4-1BB (訊息傳導區域)_CD3z(訊息傳導區域)

<400> 29

<210> 30

<211> 283

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD8(鉸鏈區)_CD8(跨膜區域)_CD28(訊息傳導區域)_4-1BB (訊息傳導區域)_CD3z(訊息傳導區域)

<400> 30

<210> 31

<211> 86

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EcoRI_F2A-NsiI

<400> 31

<210> 32

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> EcoRI_F2A-NsiI

<400> 32

<210> 33

<211> 909

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IL7_F2A_CCL19_SalI

<400> 33

<210> 34

<211> 300

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IL7_F2A_CCL19_SalI

<400> 34

<210> 35

<211> 2112

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IL7_F2A_CCL19_HSVtK_SalI

<400> 35

<210> 36

<211> 701

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IL7_F2A_CCL19_HSVtK_SalI

<400> 36

<210> 37

<211> 1641

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類抗CD20 CAR

<400> 37

<210> 38

<211> 547

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類抗CD20 CAR

<400> 38

<210> 39

<211> 2625

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗GM2 CAR(VL15VH)

<400> 39

<210> 40

<211> 874

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗GM2 CAR(VL15VH)

<400> 40

<210> 41

<211> 2655

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗GM2 CAR(VL25VH)

<400> 41

<210> 42

<211> 884

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗GM2 CAR(VL25VH)

<400> 42

<210> 43

<211> 2625

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗GM2 CAR(VH15VL)

<400> 43

<210> 44

<211> 874

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗GM2 CAR(VH15VL)

<400> 44

<210> 45

<211> 2655

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗GM2 CAR(VH25VL)

<400> 45

<210> 46

<211> 884

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗GM2 CAR(VH25VL)

<400> 46

<210> 47

<211> 3825

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗GM2 CAR(VL15VH)_HSV tk

<400> 47

<210> 48

<211> 1275

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗GM2 CAR(VL15VH)_HSV tk

<400> 48

<210> 49

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於VL25VH的抗GM2抗體的VH區域

<400> 49

<210> 50

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於VL25VH的抗GM2抗體的VL區域

<400> 50

<210> 51

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於VH15VL的抗GM2抗體的VH區域L

<400> 51

<210> 52

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於VH15VL的抗GM2抗體的VL區域

<400> 52

<210> 53

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於VH25VL的抗GM2抗體的VH區域

<400> 53

<210> 54

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於VH25VL的抗GM2抗體的VL區域

<400> 54

<210> 55

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於VH15VL的連接子15

<400> 55

<210> 56

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於VH25VL的連接子25

<400> 56

<210> 57

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 訊息胜肽

<400> 57

<210> 58

<211> 531

<212> DNA

<213> 人類(智人)

<400> 58

<210> 59

<211> 177

<212> PRT

<213> 人類(智人)

<400> 59

<210> 60

<211> 294

<212> DNA

<213> 人類(智人)

<400> 60

<210> 61

<211> 98

<212> PRT

<213> 人類(智人)

<400> 61

<210> 62

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F2A

<400> 62

<210> 63

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗GM2抗體的VH區域的CDR1

<400> 63

<210> 64

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗GM2抗體的VH區域的CDR2

<400> 64

<210> 65

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗GM2抗體的VH區域的CDR3

<400> 65

<210> 66

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗GM2抗體的VL區域的CDR1

<400> 66

<210> 67

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗GM2抗體的VL區域的CDR2

<400> 67

<210> 68

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗GM2抗體的VL區域的CDR3

<400> 68

Claims (16)

1. 一種細胞，其為表現嵌合抗原受體、以及IL-7和CCL19的細胞，其中，前述嵌合抗原受體包含目標抗原結合區域、跨膜區域、及T細胞活化訊息傳導區域，前述目標抗原結合區域包含抗神經節苷脂GM2抗體的重鏈可變區域和輕鏈可變區域，前述抗神經節苷脂GM2抗體是選自由下述(a)~(c)所構成之群組的抗體：(a)包含重鏈可變區域和輕鏈可變區域且對於神經節苷脂GM2具有結合能力的抗體，該重鏈可變區域包含由序列編號2所述之胺基酸序列所構成的重鏈可變區域的CDR1、CDR2及CDR3，該輕鏈可變區域包含由序列編號4所述之胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域的CDR1、CDR2及CDR3，並且前述重鏈可變區域和前述輕鏈可變區域的CDR1、CDR2及CDR3是根據Kabat、Chothia、AbM或contact之定義來決定；(b)包含重鏈可變區域和輕鏈可變區域且對於神經節苷脂GM2具有結合能力的抗體，該重鏈可變區域由序列編號2所述之胺基酸序列中的1個或2~10個胺基酸經變異而成的胺基酸序列所構成，該輕鏈可變區域由序列編號4所述之胺基酸序列中的1個或2~10個胺基酸經 變異而成的胺基酸序列所構成，並且前述重鏈可變區域和前述輕鏈可變區域中的變異的位置在根據Kabat、Chothia、AbM或contact之定義來決定的CDR1、CDR2及CDR3以外的區域；及(c)包含重鏈可變區域和輕鏈可變區域且對於神經節苷脂GM2具有結合能力的抗體，該重鏈可變區域由與序列編號2所述之胺基酸序列具有90%以上的序列同一性的胺基酸序列所構成，該輕鏈可變區域由與序列編號4所述之胺基酸序列具有90%以上的序列同一性的胺基酸序列所構成，並且前述重鏈可變區域和前述輕鏈可變區域中的變異的位置在根據Kabat、Chothia、AbM或contact之定義來決定的CDR1、CDR2及CDR3以外的區域。
2. 如請求項1所述之細胞，其中，前述重鏈可變區域的CDR1、CDR2及CDR3分別由序列編號63、64及65所述之胺基酸序列所構成，前述輕鏈可變區域的CDR1、CDR2及CDR3分別由序列編號66、67及68所述之胺基酸序列所構成。
3. 如請求項1所述之細胞，其中，該重鏈可變區域包含序列編號2所述之胺基酸序列，該輕鏈可變區域包含序列編號4所述之胺基酸序列。
4. 如請求項1~3中任一項所述之細胞，其中， 前述抗神經節苷脂GM2抗體是單鏈抗體scFv。
5. 如請求項4所述之細胞，其中，前述scFv是選自由下述(a)~(c)所構成之群組的多肽：(a)包含選自由序列編號10、12、14及16所構成之群組的胺基酸序列的多肽；(b)由一胺基酸序列所構成且對於神經節苷脂GM2具有結合能力的多肽，該胺基酸序列與選自由序列編號10、12、14及16所構成之群組的胺基酸序列具有90%以上的序列同一性，並且選自由前述序列編號10、12、14及16所構成之群組的胺基酸序列中的變異的位置在前述重鏈可變區域和前述輕鏈可變區域中的根據Kabat、Chothia、AbM或contact之定義來決定的CDR1、CDR2及CDR3以外的區域；及(c)由一胺基酸序列所構成且對於神經節苷脂GM2具有結合能力的多肽，該胺基酸序列是選自由序列編號10、12、14及16所構成之群組的胺基酸序列中的1個或2~20個胺基酸經變異而成的胺基酸序列，並且選自由前述序列編號10、12、14及16所構成之群組的胺基酸序列中的變異的位置在前述重鏈可變區域和前述輕鏈可變區域中的根據Kabat、Chothia、AbM或contact之定義來決定的CDR1、CDR2及CDR3以外的區域。
6. 如請求項1~3中任一項所述之細胞，其中，前述細胞是免疫細胞。
7. 如請求項5所述之細胞，其中，前述細胞是免疫細胞。
8. 一種多核苷酸，其為含有編碼嵌合抗原受體之鹼基序列、以及編碼IL-7之鹼基序列和編碼CCL19之鹼基序列的多核苷酸，其中，前述嵌合抗原受體包含目標抗原結合區域、跨膜區域、及T細胞活化訊息傳導區域，前述目標抗原結合區域包含抗神經節苷脂GM2抗體的重鏈可變區域和輕鏈可變區域，前述抗神經節苷脂GM2抗體是選自由下述(a)~(c)所構成之群組的抗體：(a)包含重鏈可變區域和輕鏈可變區域且對於神經節苷脂GM2具有結合能力的抗體，該重鏈可變區域包含由序列編號2所述之胺基酸序列所構成的重鏈可變區域的CDR1、CDR2及CDR3，該輕鏈可變區域包含由序列編號4所述之胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域的CDR1、CDR2及CDR3，並且前述重鏈可變區域和前述輕鏈可變區域的CDR1、CDR2及CDR3是根據Kabat、Chothia、AbM或contact之定義來決定；(b)包含重鏈可變區域和輕鏈可變區域且對於神經節苷脂GM2具有結合能力的抗體，該重鏈可變區域由序列編號2所述之胺基酸序列中的1個或2~10個胺基酸 經變異而成的胺基酸序列所構成，該輕鏈可變區域由序列編號4所述之胺基酸序列中的1個或2~10個胺基酸經變異而成的胺基酸序列所構成，並且前述重鏈可變區域和前述輕鏈可變區域中的變異的位置在根據Kabat、Chothia、AbM或contact之定義來決定的CDR1、CDR2及CDR3以外的區域；及(c)包含重鏈可變區域和輕鏈可變區域且對於神經節苷脂GM2具有結合能力的抗體，該重鏈可變區域由與序列編號2所述之胺基酸序列具有90%以上的序列同一性的胺基酸序列所構成，該輕鏈可變區域由與序列編號4所述之胺基酸序列具有90%以上的序列同一性的胺基酸序列所構成，並且前述重鏈可變區域和前述輕鏈可變區域中的變異的位置在根據Kabat、Chothia、AbM或contact之定義來決定的CDR1、CDR2及CDR3以外的區域。
9. 如請求項8所述之多核苷酸，其中，前述重鏈可變區域的CDR1、CDR2及CDR3分別由序列編號63、64及65所述之胺基酸序列所構成，前述輕鏈可變區域的CDR1、CDR2及CDR3分別由序列編號66、67及68所述之胺基酸序列所構成。
10. 如請求項9所述之多核苷酸，其中，前述重鏈可變區域包含序列編號2所述之胺基酸序列，前述輕 鏈可變區域包含序列編號4所述之胺基酸序列。
11. 如請求項8~10中任一項所述之多核苷酸，其中，前述抗神經節苷脂GM2抗體是單鏈抗體scFv。
12. 如請求項11所述之多核苷酸，其中，前述scFv是選自由下述(a)~(c)所構成之群組的多肽：(a)包含選自由序列編號10、12、14及16所構成之群組的胺基酸序列的多肽；(b)由一胺基酸序列所構成且對於神經節苷脂GM2具有結合能力的多肽，該胺基酸序列與選自由序列編號10、12、14及16所構成之群組的胺基酸序列具有90%以上的序列同一性，並且選自由前述序列編號10、12、14及16所構成之群組的胺基酸序列中的變異的位置在前述重鏈可變區域和前述輕鏈可變區域中的根據Kabat、Chothia、AbM或contact之定義來決定的CDR1、CDR2及CDR3以外的區域；及(c)由一胺基酸序列所構成且對於神經節苷脂GM2具有結合能力的多肽，該胺基酸序列是選自由序列編號10、12、14及16所構成之群組的胺基酸序列中的1個或複數2~20個胺基酸經變異而成的胺基酸序列，並且選自由前述序列編號10、12、14及16所構成之群組的胺基酸序列中的變異的位置在前述重鏈可變區域和前述輕鏈可變區域中的根據Kabat、Chothia、AbM或 contact之定義來決定的CDR1、CDR2及CDR3以外的區域。
13. 一種載體，其包含請求項8~12中任一項所述之多核苷酸。
14. 一種表現嵌合抗原受體之細胞的製造方法，其包含將請求項8~12中任一項所述之多核苷酸或請求項13所述之載體導入至細胞中的步驟。
15. 一種醫藥組成物，其包含請求項1~7中任一項所述之細胞。
16. 如請求項15所述之醫藥組成物，其中，該醫藥組成物用以治療或預防腫瘤。

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