KR20230019414A - 항-cd39 항체 및 입양 세포 요법을 포함하는 조합 요법 - Google Patents

항-cd39 항체 및 입양 세포 요법을 포함하는 조합 요법 Download PDF

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아킴 모에스타
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Abstract

항-CD39 항체와 입양 세포 요법의 항체 조합 요법이 제공된다.

Description

항-CD39 항체 및 입양 세포 요법을 포함하는 조합 요법
CD39에 특이적으로 결합하는 항체 및 입양 세포 요법을 포함하는 조합 요법이 본 명세서에서 제공된다.
인간 CD39는 7개의 잠재적인 N-연결된 글리코실화 부위 및 11개의 시스테인 잔기를 갖는 510-아미노산 단백질이다. CD39는 ATP를 인산화하여 ADP 및 AMP를 수득하는 내재성 막 단백질이다. 구조적으로, 이것은 두 개의 막관통 도메인, 작은 세포질 도메인 및 큰 세포외 소수성 도메인을 특징으로 한다. CD39는 세포 표면에의 국재화 시에 촉매적으로 활성화된다.
CD39는 비장, 흉선, 폐 및 태반에서 구성적으로 발현되고, 이들 조직에서 내피 세포 및 면역 세포 집단, 예컨대, B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 수지상 세포(DC), 랑게르한스 세포, 단핵구, 대식세포, 혈관사이 세포, 호중구 및 조절 T 세포(Treg)와 연관된다. CD8+ 및 CD4+ T 세포 상에서의 CD39의 발현은 또한 종양 미세환경 내에서 유도될 수 있다. CD39가 다른 효소와 함께 ATP, ADP 및 AMP를 아데노신으로 분해시킨다는 점을 고려하면, CD39는 ATP-유도된 전염증성 면역 세포 활성을 아데노신에 의해 매개되는 항-염증 상태로 바꾸는 면역학적 스위치인 관문(checkpoint)이다.
CD39의 발현은 많은 고형 종양에서 증가된다. 예를 들어, CD39 발현은 결장직장암, 두경부암, 췌장암, 방광암, 뇌암, 유방암, 위암, 간세포 암종, 폐암, 비소세포 폐암, 만성 림프구성 백혈병, 림프종, 흑색종, 난소암 및 전립선암에서 증가된다. 증가된 CD39 발현은 악성 종양의 발달 및 진행과 연루되는 것을 시사한다. 고형 종양에서의 CD39의 발현은 종양 상피에서, 침윤성 백혈구 집단에서 또는 혈관 내피에서 발견될 수 있다.
입양 세포 요법은, 예를 들어, 암 또는 바이러스 감염과 같은 질환을 치료하기 위해 대상체 자신의 면역 세포(또는 공여체의 면역 세포)를 사용하는 면역요법이다. 입양 세포 요법에서, T 세포는 종양에 반응하여 확장되는 능력에 기초하여 단리되거나 또는 세포 상의 소정의 분자, 예컨대, 암세포 상의 항원을 표적으로 하도록 유전자 변형된다. 이어서, 종양 반응성 T 세포는 확장되어 대상체로 도로 주입된다.
TIL 요법이라 불리는 입양 세포 요법의 한 형태는 종양 침윤 림프구와 연루된다. TIL 요법에서, 종양에 침투한 종양 침윤 림프구는 대상체로부터 채취한 종양 생검으로부터 수집되고 환자에게 재주입하기 위하여 시험관내에서 확장된다. 종양 침윤 림프구는 종양 파괴에 적극적으로 관여한다. 하나의 방법에서, 생검의 절제 후, 종양으로부터 단리된 DNA는 신생항원으로서 인식되는 암에서 발견되는 돌연변이를 식별하도록 시퀀싱된다.
이 방법에서, 돌연변이된 신생항원은 종양 침윤 림프구와 함께 공동 배양되는 자가 수지상 세포에 삽입된다. 이어서, 종양 침윤 림프구는 신생항원 인식에 대해 검정된다. 이어서, 신생항원을 인식하는 이러한 종양 침윤 림프구가 선택되고, 확장되고, 대상체로 도로 주입된다. 다른 방법에서, T 세포는 단리되어 환자에게 도로 주입되는 종양 생검을 인식하는 능력으로 인해 수가 확장된다.
TCR 요법이라 불리는 또 다른 접근법은 특이적 T-세포 수용체(T-cell receptor: "TCR")를 발현하도록 대상체의 또는 공여체의 T 세포를 조작하는 것을 포함한다. T 세포 수용체는 TCRα와 TCRβ의 두 소단위로 이루어진 이종이량체이다. 각각의 소단위는 수용체를 세포막에 고정시키는 불변 영역과 항원 인식에서 기능한 초가변 영역을 함유한다. TCR은 세포의 내부와 외부 상의 종양 특이적 단백질을 인식할 수 있다.
TCR 요법에서, T 세포는 대상체의 또는 공여체의 혈액으로부터 수거된다. T 세포는 T 세포 수용체를 발현하도록 실험실에서 유전자 변형된다. T 세포는 그 수가 확장되어 대상체에게 도로 주입된다. 새로운 T 세포 수용체를 갖는 T 세포는 환자의 암을 표적으로 할 수 있다.
키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor: "CAR") T 세포 요법("CAR-T 요법")에서, T 세포 수용체의 하나 이상의 부분은 항원 결합 모이어티, 예컨대, 항체 또는 항체 단편으로 변화된다. 암 연관 항원(종양 연관 항원(tumor associated antigen) 또는 "TAA")은 종종 종양에 의해 발현된다. 항체 또는 항체 단편은 TAA에 표적화된다. TAA를 표적으로 하는 T 세포는 암세포를 직접 공격할 수 있다.
CAR-T 요법에서, T 세포는 대상체의 또는 공여체의 혈액으로부터 수거되고 키메라 항원 수용체를 발현하도록 유전자 변형된다. T 세포는 수가 확장되어 대상체에게 도로 주입된다. CAR-T 변형은 대상체의 암에 특이적으로 T 세포를 표적으로 한다.
관문 저해제는 암과 같은 질환의 치료에서 상당한 가능성을 나타내었다. 입양 세포 요법은 마찬가지로 상당한 가능성을 나타내었다. CD39 항체와 같은 관문 저해제와, 조합하여 투여된 입양 세포 요법은 어느 하나의 요법 단독보다 훨씬 더 큰 가능성을 나타낼 수 있다.
암을 앓고 있는 대상체의 치료를 위한 방법 및 약제학적 조성물이 본 명세서에 제공되되, 해당 조성물은 CD39에 특이적으로 결합하는 항체 및 입양 세포 요법을 포함한다.
제1 양상은 CD39에 특이적으로 결합하는 항체 및 입양 세포 요법 조성물을 포함하는 치료용 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 입양 세포 요법은 TIL 요법, TCR 요법 및/또는 CAR 요법을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 입양 세포 요법 조성물은 면역 효과기 세포를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 NK 세포, T 세포, 수지상 세포, 대식세포, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), αβ T 세포, γδ T 세포, 조절 T 세포, NK T 세포 또는 이들의 조합을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 입양 세포 요법 조성물은 이종성 TCR 및/또는 CAR를 발현하는 조작된 세포를 포함하거나 또는 이로 이루어진 면역 효과기 세포를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포는 T 세포이다.
일부 실시형태에서, 조작된 세포는 종양-연관 항원(TAA)에 특이적으로 결합하는 세포외 결합 모이어티를 포함하는 CAR을 발현한다. 일부 실시형태에서, TAA는 B 세포 항원이다. 일부 실시형태에서, CAR은 항-CD19 결합 모이어티이다. 일부 실시형태에서, TAA는 흑색종 항원이다. 일부 실시형태에서, 흑색종 항원은 gp100이다.
일부 실시형태에서, CAR은 세포외 결합 모이어티, 막관통 도메인, 및 림프구의 활성화 및/또는 증식을 촉발시키는 세포내 도메인. 일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 적어도 하나의 공자극 도메인, 또는 공자극 도메인과 다른 공자극 도메인 및/또는 저해 도메인의 조합을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 CD28 또는 4-1BB 공자극 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 조작된 세포는 이종성 TCR을 발현한다. 일부 실시형태에서, 이종성 TCR은 TAA에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, TAA는 흑색종 항원이다. 일부 실시형태에서, TAA는 gp100으로부터 유래된 펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 이종성 TCR은 gp100을 인식하는 TCR이다.
일부 실시형태에서, CD39에 결합하는 항체는 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하되, VH 및/또는 VL은 함께 하기 중 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개를 포함한다:
(a) 서열번호 1 내지 21 또는 서열번호 259 내지 263 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VHCDR1,
(b) 서열번호 24 내지 42 또는 서열번호 265 내지 269 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VHCDR2,
(c) 서열번호 45 내지 72 또는 서열번호 271 내지 275 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VHCDR3,
(d) 서열번호 75 내지 89 또는 서열번호 277 내지 281 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VLCDR1,
(e) 서열번호 92 내지 107 또는 서열번호 283 내지 287 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VLCDR2 및
(f) 서열번호 110 내지 135 또는 서열번호 289 내지 293 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VLCDR3.
제2 양상은 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법을 제공하되, 해당 방법은,
(a) 대상체에게 입양 세포 요법 조성물을 투여하는 단계; 및
(b) 대상체에게 항-CD39 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편을 동시에 또는 순차적으로 투여하는 단계
를 포함하되, 방법은 (b) 전에 (a)를 수행하는 것, (a) 전에 (b)를 수행하는 것, (a)와 (b)를 동시에 수행하는 것, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 입양 세포 요법 조성물을 투여하는 단계 및 (b)를 수행하기 전에 조성물의 세포가 대상체의 표적 세포 또는 조직으로 이동하는 것을 기다리는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 단계 (b)는 항-CD39 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편을 투여 일정으로 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 투여 일정은 항-CD39 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편을 매주, 월 2회, 매월, 또는 2개월마다 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 입양 세포 요법 조성물을 투여하는 적어도 하나의 추가의 단계를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 입양 세포 요법은 TIL 요법, TCR 요법 및/또는 CAR 요법을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 입양 세포 요법 조성물은 NK 세포, T 세포, 수지상 세포, 대식세포, PBMC, αβT 세포, γδ T 세포, 조절 T 세포, NK T 세포 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 입양 세포 요법 조성물은 이종성 TCR 및/또는 CAR을 발현하는 조작된 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 조작된 세포는 TAA에 특이적으로 결합하는 세포외 결합 모이어티를 포함하는 CAR을 발현한다. 일부 실시형태에서, TAA는 B 세포 항원이다. 일부 실시형태에서, CAR은 항-CD19 결합 모이어티이다. 일부 실시형태에서, TAA는 흑색종 항원이다. 일부 실시형태에서, 흑색종 항원은 gp100이다.
일부 실시형태에서, CAR은 세포외 결합 모이어티, 막관통 도메인, 및 림프구의 활성화 및/또는 증식을 촉발시키는 세포내 도메인. 일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 적어도 하나의 공자극 도메인, 또는 공자극 도메인과 다른 공자극 도메인 및/또는 저해 도메인의 조합을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 CD28 또는 4-1BB 공자극 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 조작된 세포는 이종성 TCR을 발현한다. 일부 실시형태에서, 이종성 TCR은 TAA에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, TAA는 흑색종 항원이다. 일부 실시형태에서, TAA는 gp100이다. 일부 실시형태에서, 이종성 TCR은 pmel-1 TCR이다.
일부 실시형태에서, CD39에 결합하는 항체는 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하되, VH 및/또는 VL은 함께 하기 중 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개를 포함한다:
(a) 서열번호 1 내지 21 또는 서열번호 259 내지 263 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VHCDR1,
(b) 서열번호 24 내지 42 또는 서열번호 265 내지 269 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VHCDR2,
(c) 서열번호 45 내지 72 또는 서열번호 271 내지 275 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VHCDR3,
(d) 서열번호 75 내지 89 또는 서열번호 277 내지 281 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VLCDR1,
(e) 서열번호 92 내지 107 또는 서열번호 283 내지 287 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VLCDR2 및
(f) 서열번호 110 내지 135 또는 서열번호 289 내지 293 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VLCDR3.
제3 양상은 입양 세포 요법 조성물을 제조하는 방법을 제공하되, 해당 방법은,
(a) 제1 세포 집단을 제공하는 단계; 및
(b) 항-CD39 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편의 존재 하에 입양 세포 요법을 위하여 치료적 유효량의 세포를 생성하는 데 충분한 조건 하에 제1 세포 집단을 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 세포 집단은 입양 세포 요법 치료를 필요로 하는 대상체로부터 얻어진 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 세포 집단은 공여체 대상체 또는 세포주로부터 얻어진 세포를 포함하고, 입양 세포 요법 조성물은 수용체 대상체(recipient subject)의 치료를 위하여 생성된 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 입양 세포 요법은 TIL 요법, TCR 요법 및/또는 CAR 요법을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 방법은 제1 세포 집단 또는 이의 부분을 조작하는 단계 및/또는 제2 세포 집단 또는 이의 부분을 조작하는 단계를 더 포함하되, 여기서 제2 세포 집단은 단계 (b) 전에 또는 동안에 제1 세포 집단을 확장시킴으로써 생산되고, 제1 세포 집단을 조작하는 것 및/또는 제2 세포 집단을 조작하는 것은 CAR 또는 이종성 TCR을 발현하도록 세포를 유전자 변형시키는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-CD39 항체는 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하되, VH 및/또는 VL은 함께 하기 중 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개를 포함한다:
(a) 서열번호 1 내지 21 또는 서열번호 259 내지 263 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VHCDR1,
(b) 서열번호 24 내지 42 또는 서열번호 265 내지 269 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VHCDR2,
(c) 서열번호 45 내지 72 또는 서열번호 271 내지 275 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VHCDR3,
(d) 서열번호 75 내지 89 또는 서열번호 277 내지 281 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VLCDR1,
(e) 서열번호 92 내지 107 또는 서열번호 283 내지 287 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VLCDR2 및
(f) 서열번호 110 내지 135 또는 서열번호 289 내지 293 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VLCDR3.
일부 실시형태에서, 암은 고형 암이다. 일부 실시형태에서, 암은 혈액암이다. 일부 실시형태에서, 암은 전이성 비소세포 폐암(NSCLC), 전이성 두경부 편평세포암종(HNSCC), 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 다발성 골수종(MM), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL), 흑색종, 신장 세포 암종, 전이성 피부 편평세포암종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종(NHL), 및 DNA 불일치 복구 결함 또는 미소부수체 불안정성-높은 상태를 갖는 절제 불가능한 또는 전이성 고형 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간 대상체이다.
도 1은 CAR-T 요법과 같은 입양 세포 요법과 조합된 CD39에 결합하는 항체의 표현을 묘사한다.
도 2는 마우스 이종이식 모델에서 CAR-T 세포로의 치료 동안 항-CD39 항체의 투여가 CAR-T 세포 확장 단계 및 지속 단계를 포착하는 여러 연구 시점에서 유세포분석에 의해 측정된 바 혈액 중 CD4+, CD8+ 및 CD3+ T 세포의 백분율을 증가시키는 것을 묘사한다. 백분율은 개체로부터 표시되고, 평균 백분율은 ±SEM으로 나타낸다. 통계는 언페어드 t-검정(p* < 0.05, p** < 0.005, p*** < 0.001)에 의해 결정되었다.
도 3은 마우스 이종이식 모델에서 CAR-T 세포로의 치료 동안 항-CD39 항체의 투여가 유세포분석에 의해 측정된 바 제61일째 연구 종료 시 말초 기관에서 CD4+, CD8+ 및 CD3+ T 세포의 생착을 증가시키는 것을 묘사한다. 백분율은 개체로부터 표시되고, 평균 백분율은 ±SEM으로 나타낸다. 통계는 언페어드 t-검정 (p* < 0.05, p** < 0.005, p*** < 0.001)에 의해 결정되었다.
도 4는 생물발광 플럭스(p/s)로 정량된 바 항-CD39 항체와 조합하여 CAR-T로 치료된 군에서 루시페라제 발현 Raji 종양 세포를 사용한 마우스 이종이식 모델에서 감소된 종양 부담을 묘사한다. (A)는 플로팅된 개체 동물 플럭스 측정치를 나타내고, (B)는 기하학적 군 평균±SEM 플럭스 측정치를 나타낸다. 플럭스 > 5E7(p/s)로 결정된 바와 같은 종양 재발은 각 처리 집단에 대해서 하기와 같이 나타낸다(10/10의 비처리 마우스, 6/10의 CAR-T + 아이소타입 대조군 치료 마우스 및 3/10의 CAR-T + 항-CD39 항체가 종양 재발을 경험하였다).
도 5는 항-CD39 항체와 조합하여 CAR-T로 처리된 군에서 루시페라제 발현 Raji 종양 세포를 사용한 마우스 이종이식 모델의 IVIS 영상화를 통해 감소된 전체 종양 부담을 묘사한다. 비처리된 마우스는 제14일 후에 종양 부담으로 인해 연구에서 제거된 한편, 두 CAR-T 요법 처리된 군에서의 마우스는 완전한 연구 동안 영상화되었다.
도 6은 항-CD39 항체와 조합하여 흑색종 항원 특이적 Pmel-1 CD8+ T 세포를 사용하는 입양 세포 요법으로 처리 후 B1 6F10 흑색종 종양을 보유하는 7일째 면역 반응을 묘사한다. (A)는 림프절에서의 항원 제시 부위에서 입양 전달된(adoptively transferred) 항원 특이적 CD8+ T 세포(상부) 및 내인성 CD8+ T 세포(하부)의 증식이 Ki67 염색에 의해 측정된 바 항-CD39 항체에 의한 처리에 의해 증대되는 것을 나타낸다. (B)는 CD39 염색에 의해 측정된 바 항-CD39 항체에 의한 처리를 통해 림프절에서의 입양 전달된 항원 특이적 CD8+ T 세포(상부) 및 내인성 CD8+ T 세포(하부)의 개선된 조기 활성화를 나타낸다.
도 7은, 35일째 연구 종료 시, 입양 세포 요법과 흑색종 항원 특이적 Pmel-1 CD8+ T 세포의 조합과 함께 항-CD39 항체에 의한 처리를 받은 마우스가 (A) 림프절(LN) 및 (B) 비장(SP)에서 CD39 발현에 의해 측정된 바 항원 특이적 CD8+ T 세포 및 내인성 CD8+ T 세포의 감소된 탈진을 갖는 것을 묘사한다.
CD39에 특이적으로 결합하는 항체 및 입양 세포 요법을 포함하는 조합물이 본 명세서에서 제공된다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 용어, 표기법 및 다른 과학 용어는 당업자가 통상적으로 이해하는 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우에, 통상적으로 이해되는 의미를 갖는 용어는 명확성 및/또는 즉시 참조를 위해 본 명세서에 정의되며, 본 명세서에서의 이러한 정의의 포함이 반드시 당업계에서 일반적으로 이해되는 것에 대한 차이를 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 명세서에 기재되거나 언급된 기술 및 절차는 일반적으로 잘 이해되고, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4th ed. (2014) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]에 기재된 분자 클로닝 방법과 같은 당업자에 의해 통상적인 방법을 사용하여 통상적으로 이용된다. 적절한 경우, 상업적으로 이용 가능한 키트 및 시약의 사용을 포함한 절차는, 달리 언급되지 않는 한 일반적으로 제조업체 정의된 프로토콜 및/또는 파라미터에 따라서 수행된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 문맥이 달리 명백하게 나타내지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다.
용어 "약"은 나타낸 값 및 그 값보다 위 및 아래의 범위를 나타내고 포함한다. 소정의 실시형태에서, 용어 "약"은 명시된 값±10%, ±5% 또는 ±1%를 나타낸다. 소정의 실시형태에서, 용어 "약"은 명시된 값±그 값의 하나의 표준 편차를 나타낸다.
용어 "이의 조합"은 그 용어가 지칭하는 모든 가능한 요소의 조합을 포함한다.
용어 "CD39" 및 "분화 클러스터 39"는 본 명세서에서 호환 가능하게 사용된다. CD39는 또한 엑토뉴클레오사이드 트라이포스페이트 다이포스포하이드롤라제-1로도 알려져 있다(유전자: ENTPDJ; 단백질: NTPD as el, www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/953 참조). CD39는 ATPDase 및 SPG64로도 지칭되었다. 위에서 제시된 용어의 각각은 호환 가능하게 사용될 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 용어는 세포에 의해 자연적으로 발현되거나 CD39 유전자로 형질감염된 세포에 의해 발현되는 인간 CD39의 임의의 변이체, 아이소형 및 종 상동체를 포함한다. 일부 실시형태에서, CD39 단백질은 뮤린 CD39를 포함한다. 일부 실시형태에서, CD39 단백질은 시노몰구스 CD39를 포함한다.
용어 "면역글로불린"은 일반적으로 2쌍의 폴리펩타이드 쇄, 즉, 1쌍의 경쇄(L) 및 1쌍의 중쇄(H)를 포함하는 구조적으로 관련된 부류의 단백질을 지칭한다. 온전한 면역글로불린에서, 이들 4개의 쇄 모두는 다이설파이드 결합에 의해 상호연결된다. 면역글로불린의 구조는 잘 특성규명되어 있다. 예컨대, 문헌[Paul, Fundamental Immunology 7th ed., Ch. 5 (2013) Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA]을 참조한다. 간략하게, 각각의 중쇄는 전형적으로 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역(CH)을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 전형적으로 3개의 도메인, 즉, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 전형적으로 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 전형적으로 CL로도 약칭되는 하나의 도메인을 포함한다.
용어 "입양 세포 요법"은, 대상체가 암 또는 바이러스 감염과 같은 질환과 싸우는 것을 돕도록 면역 세포가 대상체에게 투여되는 면역요법을 지칭한다. 암 요법에서, 예를 들어, T 세포는 대상체의 자신의 혈액(또는 공여체의 혈액으로부터) 또는 종양 조직으로부터 채취되고, 다수개로 성장하고, 이어서 대상체게 암을 싸우는 것을 돕도록 대상체에게 도로 제공된다. 입양 세포 요법의 유형은 종양-침윤 림프구("TIL") 요법, T-세포 수용체("TCR") 요법, 및 키메라 항원 수용체 T-세포(CAR-T-세포) 요법을 포함한다.
"종양-침윤 림프구("TIL") 요법" 또는 "TIL 요법"은 종양에 또는 그 부근에 있고 종양을 인식하는 능력을 가진 림프구를 사용하는 입양 세포 요법인 면역요법을 지칭한다. TIL 요법에서, 종양에 또는 그 부근에 있는 T-세포와 같은 림프구는 단리되고, 이어서 이들을 다수개로 신속하게 성장하게 하는 물질로 처리된다. 이들 림프구는 이어서 대상체에게 도로 제공된다.
"T-세포 수용체 요법" 또는 "TCR 요법"은 특수한 또는 특이적 T-세포 수용체 또는 TCR을 발현하도록 대상체의 또는 공여체의 T 또는 면역 세포를 조작하는 것을 포함하는 입양 세포 요법의 유형을 지칭한다.
"키메라 항원 수용체 T 세포 요법" 또는 "CAR-T 요법"은 T 세포 수용체의 하나 이상의 부분이 항체 또는 항체 단편과 같은 세포외 결합 모이어티로 변화되는 입양 세포 요법을 지칭한다. 항체 또는 항체 단편과 같은 세포외 결합 모이어티는 종양 연관 항원(TAA) 또는 종양 특이적 항원(TSA)으로 표적화될 수 있다.
용어 "항체"는 면역글로불린 분자의 유형을 설명하며 본 명세서에서는 가장 넓은 의미로 사용된다. 항체는 구체적으로 온전한 항체(예컨대, 온전한 면역글로불린) 및 항체 단편을 포함한다. 항체는 적어도 하나의 항원-결합 도메인을 포함한다. 항원-결합 도메인의 한 가지 예는 VH-VL 이량체에 의해 형성된 항원 결합 도메인이다.
VH 및 VL 영역은 보다 보존된 영역에 산재된 초가변성의 영역("초가변 영역(HVR); "상보성 결정 영역"(CDR)으로도 불림)으로 더욱 세분될 수 있다. 보다 보존된 영역은 프레임워크 영역(FR)으로 불린다. 각각의 VH 및 VL은 일반적으로 다음의 순서로(N-말단에서 C-말단으로) 정렬된 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함한다: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. CDR은 항원 결합에 연루되고, 항체에 항원 특이성 및 결합 친화도를 부여한다. 전문이 참조에 의해 원용되는 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest 5th ed. (1991) Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD]을 참조한다.
임의의 척추동물 종으로부터의 경쇄는 불변 도메인의 서열에 기초하여 카파 및 람다라 불리는 2가지 유형 중 하나에 할당될 수 있다.
임의의 척추동물 종으로부터의 중쇄는 5가지 상이한 부류(또는 아이소타입), 즉, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 중 하나에 할당될 수 있다. 이들 부류는 또한 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 명시된다. IgG 및 IgA 부류는 서열 및 기능의 차이에 기초하여 하위부류로 더욱 세분된다. 인간은 다음의 하위부류, 즉, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl 및 IgA2를 발현한다.
CDR의 아미노산 서열 경계는 문헌[Kabat et al., 상기 참조("Kabat" 번호매김 체계); Al-Lazikani et al., 1997, J Mol. Biol., 273:927-948("Chothia" 번호매김 체계); MacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol. 262:732-745("Contact" 번호매김 체계); Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol., 2003, 27:55-77("IMGT" 번호매김 체계); 및 Honegge and
Figure pct00001
, J. Mol. Biol., 2001, 309:657-70("AHo" 번호매김 체계)(각각 전문이 참조에 의해 원용됨)에 기재된 것들을 포함한 다수의 공지된 번호매김 체계 중 임의의 것을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다.
표 1은 Kabat 및 Chothia 체계에 의해 식별된 바와 같은 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3의 위치를 제공한다. CDR-H1의 경우, 잔기 번호매김은 Kabat 및 Chothia 번호매김 체계 둘 다를 사용하여 제공된다.
달리 특정되지 않는 한, 본 명세서에서 특정 CDR의 식별에 사용되는 번호매김 체계는 Kabat 번호매김 체계이다. Chothia 번호매김 체계에 의한 변이체 및 동가의 항체는 본 발명의 범위 내인 것으로 의도된다.
Figure pct00002
"EU 번호매김 체계"는 항체 중쇄 불변 영역 내의 잔기를 지칭하는 경우 일반적으로 사용된다. 달리 기술되지 않는 한, EU 번호매김 체계는 본 명세서에 기재된 항체 중쇄 불변 영역 내의 잔기를 지칭하는 데 사용된다.
"항체 단편"은 온전한 항체의 항원 결합 또는 가변 영역과 같은 온전한 항체의 부분을 포함한다. 항체 단편은, 예를 들어, Fv 단편, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편, scFv(sFv) 단편 및 scFv-Fc 단편을 포함한다.
"Fv" 단편은 하나의 중쇄 가변 도메인 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 비-공유결합된 이량체를 포함한다.
"Fab" 단편은, 경쇄 및 경쇄 가변 도메인 이외에, 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 포함한다. Fab 단편은, 예를 들어, 전장 항체의 파파인 소화에 의해 생성될 수 있다.
"F(ab')2" 단편은, 다이설파이드 결합에 의해, 힌지 영역 근처에서 연결된 2개의 Fab' 단편을 함유한다. F(ab')2 단편은, 예를 들어, 온전한 항체의 펩신 소화에 의해 생성될 수 있다. F(ab') 단편은, 예를 들어, β-머캅토에탄올에 의한 처리에 의해 해리될 수 있다.
"단일-쇄 Fv" 또는 "sFv" 또는 "scFv" 항체 단편은 단일 폴리펩타이드 쇄 내의 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함한다. VH 및 VL은 일반적으로 펩타이드 링커에 의해 연결된다. 전문이 참조에 의해 원용되는 문헌[
Figure pct00003
A. (1994). Antibodies from Escherichia coli. Rosenberg M. & Moore G.P. (Eds.), The Pharmacology of Monoclonal Antibodies vol. 113 (pp. 269-315). Springer-Verlag, New York]을 참조한다. "scFv-Fc" 단편은 Fc 도메인에 부착된 scFv를 포함한다. 예를 들어, Fc 도메인은 scFv의 C-말단에 부착될 수 있다. Fc 도메인은 scFv 내의 가변 도메인의 배향(즉, VH-VL 또는 VL-VH)에 따라서 VH 또는 VL이 후속할 수 있다. 당업계에 공지되거나 또는 본 명세서에 기재된 임의의 적합한 Fc 도메인이 사용될 수 있다.
용어 "단클론성 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터의 항체를 지칭한다. 실질적으로 균질한 항체의 집단은, 단클론 항체의 생산 동안 정상적으로 발생할 수 있는 변이체를 제외하고는, 실질적으로 유사하고, 동일한 에피토프(들)에 결합하는 항체를 포함한다. 이러한 변이체는 일반적으로 소량만 존재한다. 단클론 항체는 전형적으로 복수의 항체로부터의 단일 항체의 선택을 포함하는 과정에 의해 얻어진다.
예를 들어, 선택 과정은 복수의 클론, 예컨대, 하이브리도마 클론, 파지 클론, 효모 클론, 박테리아 클론 또는 다른 재조합 DNA 클론의 혼주물(pool)로부터의 고유한 클론의 선택일 수 있다. 선택된 항체는, 예를 들어, 표적에 대한 친화도를 개선시키고("친화도 성숙"), 항체를 인간화하고, 세포 배양물에서의 이의 생산을 개선하고, 그리고/또는 대상체에서 이의 면역원성을 저감시키기 위해 추가로 변경될 수 있다.
용어 "키메라 항체"는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 공급원 또는 종으로부터 유래되는 반면 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래되는 항체를 지칭한다.
비-인간 항체의 "인간화된" 형태는, 비-인간 항체로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 인간화 항체는 일반적으로 하나 이상의 CDR로부터의 잔기가 비-인간 항체(공여체 항체)의 하나 이상의 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린(수용체(recipient) 항체)이다. 공여체 항체는 목적하는 특이성, 친화도 또는 생물학적 효과를 갖는 마우스, 래트, 토끼, 닭 또는 비-인간 영장류 항체와 같은 임의의 적합한 비-인간 항체일 수 있다. 몇몇 경우에, 수용자 항체의 선택된 프레임워크 영역 잔기는 공여체 항체로부터의 대응하는 프레임워크 영역 잔기로 대체된다. 인간화 항체는 수용체 항체 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 또한 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 기능을 추가로 개선하기 위해 이루어질 수 있다. 추가의 상세한 설명에 대해서는, 문헌[Jones et al., Nature, 1986, 321:522-525; Riechmann et al., Nature, 1988, 332:323-329; 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 1992, 2:593-596]을 참조하며, 이들의 각각은 전문이 참조에 의해 원용된다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산된 항체의 아미노산 서열에 대응하거나, 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 인간 항체-인코딩 서열을 이용하는 비-인간 공급원으로부터 유래된(예컨대, 인간 공급원으로부터 얻거나 또는 드 노보(de novo) 설계된) 아미노산 서열을 갖는 것이다. 인간 항체는 구체적으로 인간화 항체를 배제한다.
"단리된 항체"는 이의 자연 환경의 성분으로부터 분리 및/또는 회수된 것이다. 자연 환경의 성분은 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 물질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단리된 항체는, 예를 들면, 스피닝 컵 서열분석장치의 사용에 의해, N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 얻기에 충분한 정도로 정제된다. 일부 실시형태에서, 단리된 항체는 쿠마시 블루(Coomassie blue) 또는 은 염색에 의한 검출로 환원 또는 비환원 조건하에 겔 전기영동(예컨대, SDS-PAGE)에 의해 균질화되도록 정제된다. 단리된 항체는 재조합 세포 내의 원위치에 항체를 포함하는 데, 그 이유는 항체의 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않기 때문이다. 일부 실시형태에서, 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조된다.
"친화도"는 분자의 단일 결합 부위(예컨대, 항체)와 이의 결합 파트너(예컨대, 항원) 간의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 달리 지시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "결합 친화도"는 결합 쌍(예컨대, 항체 및 항원)의 구성원 간의 1:1 상호작용을 반영하는 내재성 결합 친화도를 지칭한다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화도는 일반적으로 해리 상수(KD)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본 명세서에 기재된 것들을 비롯하여 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다. 친화도는, 예를 들면, Biacore® 기기와 같은 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술을 사용하여 결정될 수 있다.
표적 분자에 대한 항체의 결합과 관련하여, 특정 항원(예컨대, 폴리펩타이드 표적) 또는 특정 항원상의 에피토프 "에 결합" 또는 "에 결합하는"이라는 용어는 비선택적 상호작용과는 측정 가능하게 상이한 결합을 의미한다. 결합은, 또한 과량의 비-표지 표적과 같은 표적과 유사한 대조 분자와의 경쟁에 의해 결정될 수 있다. 그 경우에, 프로브에의 표지된 표적의 결합이 과량의 비-표지된 표적에 의해 경쟁적으로 저해되는 경우 결합이 표시된다.
폴리펩타이드 서열과 참조 서열 간의 "동일성" 퍼센트는 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하기 위해 서열을 정렬하고 필요한 경우에 갭을 도입한 후 참조 서열의 아미노산 잔기와 동일한 폴리펩타이드 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN, MEGALIGN(DNASTAR), CLUSTALW 또는 CLUSTAL OMEGA 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당업계의 기량 내인 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 당업자라면 비교되는 서열의 전장에 걸쳐서 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
"보존적 치환" 또는 "보존적 아미노산 치환"은 하나 이상의 아미노산이 하나 이상의 화학적으로 또는 기능적으로 유사한 아미노산으로 치환됨을 지칭한다. 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 치환을 갖는 폴리펩타이드 서열은 "보존적으로 변형된 변이체"로 알려져 있다. 이러한 보존적으로 변형된 변이체는 다형성 변이체, 종간 상동체 및 대립유전자에 추가되고 이를 배제하지 않는다. 예로서, 하기 아미노산의 그룹은 서로에 대한 보존적 치환으로 간주된다.
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추가의 보존적 치환은, 예를 들어, 문헌[Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties 2nd ed. (1993) W. H. Freeman & Co., New York, NY]에서 찾을 수 있다. 모 항체에서 아미노산 잔기의 하나 이상의 보존적 치환을 수행함으로써 생성된 항체는 "보존적으로 변형된 변이체"라 지칭된다.
용어 "아미노산"은 20개의 통상적인 천연형 아미노산을 지칭한다. 천연형 아미노산은 알라닌(Ala; A), 아르기닌(Arg; R), 아스파라긴(Asn; N), 아스파르트산(Asp; D), 시스테인(Cys; C); 글루탐산(Glu; E), 글루타민(Gln; Q), 글리신(Gly; G); 히스티딘(His; H), 아이소류신(Ile; I), 류신(Leu; L), 라이신(Lys; K), 메티오닌 Met; M), 페닐알라닌(Phe; F), 프롤린(Pro; P), 세린(Ser; S), 트레오닌(Thr; T), 트립토판(Trp; W), 티로신(Tyr; Y) 및 발린(Val; V)을 포함한다.
"항원"은 항체 또는 항체 단편에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 구조를 지칭한다.
"TAA", "종양 연관 항원" 또는 "종양 항원"은 종양 세포에서 생산된 항원을 지칭한다. TAA는 암 요법에서 항원으로서 사용하기 위한 유용한 종양 마커 및 후보이다.
"TSA" 또는 "종양 특이적 항원"은 종양 세포에 고유한 항원을 지칭한다.
"단핵구"는 일종의 백혈구를 의미한다. 단핵구는 대식세포와 골수 계통 의존 수지상 세포로 분화될 수 있다.
"대식세포"는 표면에 소정의 인식 단백질이 없는 세포 파편, 미생물 및 암세포를 삼켜 소화시키는 일종의 백혈구를 지칭한다. 삼키는 과정은 식균 작용이라 불린다. 대식세포는 또한 선천성 면역에 중요한 역할을 하고 림프구와 같은 다른 면역 세포를 동원함으로써 적응 면역을 개시하는 데 도움을 준다. 대식세포는 T 세포에 대한 항원 제시자로서 중요하다. 대식세포는 염증을 증가 및 감소시키는 역할을 할 수 있으며, 염증을 증가시키는 것을 M1 대식세포라 부르고 염증을 감소시키는 것을 M2 대식세포라 부른다.
"수지상 세포"는 면역계의 항원 제시 세포를 지칭한다. 무엇보다도, 수지상 세포는 항원 물질을 처리하여 이를 표면 상에서 면역계의 T 세포에 제시한다. 수지상 세포는 선천 및 적응 면역 체계에서 역할을 한다. 일단 활성화되면, 수지상 세포는 림프절로 이동하여 T 세포 및 B 세포와 상호 작용하여 적응 면역 체계를 형성하는 데 도움이 된다.
"림프구"는 척추동물의 면역 체계에 있는 일종의 백혈구를 지칭한다. 림프구는 자연 살해 세포, T 세포 및 B 세포를 포함한다. 림프구는 림프에서 발견되는 주요 유형의 세포이다.
"NK 세포", "자연 살해 세포", "K 세포" 및 "살해 세포"는 선천 면역 체계의 성분인 림프구를 지칭한다. NK 세포는 종양과 바이러스에 감염된 세포의 숙주 거부에 중요한 역할을 한다. NK 세포는 세포독성이며 세포질의 작은 과립은 그랜자임으로 알려진 퍼포린 및 프로테아제와 같은 특수 단백질을 함유한다. NK 세포는 종종 인터페론 또는 대식세포-유래 사이토카인에 반응하여 활성이다.
"T 세포" 또는 "T 림프구"는 흉선에서 발달하고 면역 반응에서 중심적인 역할을 하는 림프구의 유형을 지칭한다. T 세포는 세포 표면에 T 세포 수용체의 존재에 의해 다른 림프구와 구별될 수 있다.
"TCR 복합체"는 TCR, ζ-쇄 및 CD3 분자를 함께 지칭한다.
"T 세포 수용체" 또는 "TCR"은 항원 단편을 주요 조직적합성(MHC) 복합 분자에 결합된 펩타이드로서 인식하는 역할을 하는 T 세포 표면에서 발견되는 분자를 지칭한다. T 세포 수용체는 TCRα 및 TCRβ 또는 TCRγ 및 TCRδ의 2개의 소단위로 이루어진 이종이량체이다. TCR이 항원 및 MHC와 관여하면, T 세포는 신호 전달을 통해 활성화된다.
CD3 T 세포 공동-수용체는 세포독성 T 세포(CD8+ 미경험 T 세포)와 또한 T 헬퍼 세포(CD4+ 미경험 T 세포) 둘 다를 활성화시키는 데 도움이 된다. CD3은 단백질 복합체로 이루어진다. 포유류에서, 복합체는 CD3γ쇄, CD3δ쇄 및 2개의 CD3ε 쇄를 함유한다. CD3 쇄는 T 세포 수용체 및 ζ-쇄(제타-쇄)와 회합하여 활성화 신호를 생성한다.
"ζ-쇄" 또는 "CD3ζ 신호전달 도메인" 또는 "CD3 ζ" 또는 "제타-쇄" 또는 "T-세포 표면 인식 당단백질 CD3 제타 쇄" 또는 "CD247"은 항원 인식을 세포내 신호 전달 경로에 결합하는 데 중요한 역할을 하는 단백질을 지칭한다.
"자연 살해 T 세포" 또는 "NK T 세포"는 T 세포와 자연 살해 세포 둘 다의 특성을 공유하는 이질적인 T 세포 군을 지칭한다.
"B 세포" 또는 "B 림프구"는 소림프구 하위유형의 백혈구 유형을 지칭한다. 이들은 항체를 분비함으로써 적응 면역 체계에서 활성이다. 이들은 또한 항원을 제시하고 사이토카인을 분비한다. T 세포 및 NK 세포와 달리, B 세포는 세포막에 B 세포 수용체를 발현한다.
"말초 혈액 단핵 세포" 또는 "PBMC"는 둥근 핵을 갖는 임의의 말초 혈액 세포를 지칭한다. 말초 혈액 세포는, 예를 들어, 림프구 및 단핵구를 포함한다.
"말초 혈액 세포"는 적혈구와 같은 적혈구 세포, 백혈구와 같은 백혈구 세포 및 혈소판으로 이루어진 혈액의 세포성분을 지칭한다. 말초 혈액 세포는 순환하는 혈액 폴(poll) 내에서 발견되며 림프계, 비장, 간 또는 골수 내에서 격리되지 않는다.
"자극" 또는 "자극성"은 분자(즉, 자극성 분자)의 결합이 신호 전달을 매개하는 사건을 지칭한다. 자극성 분자는, 항원 제시 세포 상에 존재하는 동족 자극성 리간드 또는 수용체에 결합하는 T 세포와 같은 면역 세포 상의 분자이다. 항원 제시 세포(예컨대, 수지상 세포, B-세포 등)에 존재하는 경우, 자극성 리간드 또는 수용체는 T 세포 상의 자극성 리간드 또는 수용체와 특이적으로 결합함으로써, 면역 반응의 활성화 및 개시를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, T 세포에 의한 1차 반응을 매개할 수 있다. 자극성 분자는 펩타이드가 로딩된 MHC 분자, 항-CD3 항체, 항-CD28 항체 또는 항-CD2 항체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
"공자극 신호"는, 자극성 신호와 조합하여, T 세포 또는 항원-제시 세포 반응, 예컨대, 증식, 및 면역 반응의 상향조절 또는 하향조절을 유도하는 신호를 지칭한다.
"공자극 분자"는 공자극 리간드 또는 수용체와 결합하고 증식과 같은 T 세포 또는 항원 제시 세포에 대한 공자극 반응을 매개하는 T 세포 또는 항원 제시 세포 상의 동족 결합 파트너를 지칭한다. 공자극 분자는 CD27, CD28, 4-1BB, GITR, OX40, CD30, CD40, CD83, ICOS, LFA-1, CD2, TNFSF14, NKG2C 및 CD83을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
"공자극 리간드"는 T 세포 또는 항원-제시 세포 상의 동족 공자극 수용체에 결합하는 T 세포 또는 항원 제시 세포 상의 분자와 같은 분자를 지칭한다. 공자극 리간드의 결합은, 증식, 활성화 또는 분화를 비롯한, T 세포 또는 항원 제시 세포 반응을 매개하는 신호를 제공한다. 공자극은 자극성 신호에 부가되는 신호를 도입한다. 공자극 리간드는 CD7, B7-1(CD80), B7-2(CD86), 4-1BB 리간드, OX40 리간드, 유도성 공자극 리간드(ICOS-L), 세포간 부착 분자(ICAM), CD30 리간드, CD40 리간드, CD70, CD83, 림프-독소 베타 수용체, 3/TR6, 면역글로불린-유사, ILT3, 및 톨 리간드 수용체에 결합하는 작용제 또는 항체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
임의의 암의 "치료하는" 또는 "치료"는, 소정의 실시형태에서, 대상체에 존재하는 암을 개선하는 것을 지칭한다. 다른 실시형태에서, "치료하는" 또는 "치료"는 대상체가 식별할 수 없는 적어도 하나의 신체적 파라미터를 개선시키는 것을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, "치료하는" 또는 "치료"는 질환 또는 장애를 신체적으로(예를 들면, 식별 가능한 증상의 안정화) 또는 생리학적으로(예를 들어, 신체적 파라미터의 안정화) 또는 둘 다로 조절하는 것을 포함한다.
용어 "컨디셔닝" 및 "사전-컨디셔닝"(pre-conditioning)은, 예를 들어 대상체에게 화학요법을 제공함으로써 입양 세포 요법을 위한 대상체를 준비하는 것을 지칭한다. 컨디셔닝은, T 세포 요법 이전에, 내인성 림프구 수를 저감시키는 것, 사이토카인 싱크를 제거하는 것, 하나 이상의 항상성 사이토카인 또는 전염증성 인자의 혈청 수준을 증가시키는 것, 컨디셔닝 후에 투여된 T 세포의 효과기 기능을 향상시키는 것, 항원 제시 세포 활성화 및/또는 이용가능성을 증강시키는 것, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는 포유동물 대상체를 의미한다. 예시적인 대상체는 인간, 원숭이, 개, 고양이, 마우스, 래트, 소, 말, 낙타, 조류, 염소 및 양을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 본 명세서에 제공되는 항체로 치료될 수 있는 암, 자가면역 질환 또는 병태, 면역 질환 또는 병태, 및/또는 감염을 갖는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 암, 자가면역 질환 또는 병태, 및/또는 급성 감염 및 만성 감염을 갖는 것으로 의심되는 인간이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료적 유효량" 또는 "유효량"은, 대상체에게 투여될 경우 암을 치료하는 데 효과적인 항체 및/또는 입양 세포 요법의 양을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효량은 각각의 항체 및/또는 입양 세포 요법의 예시적인 투여량을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효량은 임상 종말점에 따라서 반응을 달성하기 위하여 사용되는 양을 결정하는 것을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 임상 종말점은 객관적 반응률(Objective Response Rate: ORR), 무진행 생존율(Progression Free Survival: PFS) 및/또는 고형 종양 반응 평가 기준(Response Evaluation Criteria in Solid Tumor: "RECIST")을 포함한다.
조합
입양 세포 요법과 암의 치료용 항체의 조합이 본 명세서에서 제공된다.
제1 양상은 CD39에 특이적으로 결합하는 항체 및 입양 세포 요법 조성물을 포함하는 치료용 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 입양 세포 요법은 TIL 요법, TCR 요법 및/또는 CAR 요법을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 입양 세포 요법 조성물은 면역 효과기 세포를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 NK 세포, T 세포, NKT 세포, 수지상 세포, 대식세포, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), αβ T 세포, γδ T 세포, 조절 T 세포, NK T 세포, 또는 이들의 조합을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 입양 세포 요법 조성물은 이종성 TCR 및/또는 CAR를 발현하는 조작된 세포를 포함하거나 또는 이로 이루어진 면역 효과기 세포를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포는 T 세포이다. 일부 실시형태에서, T 세포는 CD8+ T 세포이다.
일부 실시형태에서, 조작된 세포는 종양-연관 항원(TAA)에 특이적으로 결합하는 세포외 결합 모이어티를 포함하는 CAR을 발현한다. 일부 실시형태에서, TAA는 B 세포 항원이다. 일부 실시형태에서, CAR은 항-CD19 결합 모이어티이다. 일부 실시형태에서, TAA는 흑색종 항원이다. 일부 실시형태에서, 흑색종 항원은 gp100이다.
일부 실시형태에서, CAR은 세포외 결합 모이어티, 막관통 도메인, 및 림프구의 활성화 및/또는 증식을 촉발시키는 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 적어도 하나의 공자극 도메인, 또는 공자극 도메인과 다른 공자극 도메인 및/또는 저해 도메인의 조합을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 CD28 또는 4-1BB 공자극 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 조작된 세포는 이종성 TCR을 발현한다. 일부 실시형태에서, 이종성 TCR은 TAA에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, TAA는 흑색종 항원이다. 일부 실시형태에서, TAA는 gp100이다. 일부 실시형태에서, 이종성 TCR은 pmel-1 TCR이다.
일부 실시형태에서, CD39에 결합하는 항체는 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하되, VH 및/또는 VL은 함께 하기 중 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개를 포함한다:
(a) 서열번호 1 내지 21 또는 서열번호 259 내지 263 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VHCDR1,
(b) 서열번호 24 내지 42 또는 서열번호 265 내지 269 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VHCDR2,
(c) 서열번호 45 내지 72 또는 서열번호 271 내지 275 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VHCDR3,
(d) 서열번호 75 내지 89 또는 서열번호 277 내지 281 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VLCDR1,
(e) 서열번호 92 내지 107 또는 서열번호 283 내지 287 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VLCDR2 및
(f) 서열번호 110 내지 135 또는 서열번호 289 내지 293 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VLCDR3.
제2 양상은 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법을 제공하되, 상기 방법은,
(a) 대상체에게 입양 세포 요법 조성물을 투여하는 단계; 및
(b) 대상체에게 항-CD39 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편을 동시에 또는 순차적으로 투여하는 단계
를 포함하되, 방법은 (b) 전에 (a)를 수행하는 것, (a) 전에 (b)를 수행하는 것, (a)와 (b)를 동시에 수행하는 것, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 입양 세포 요법 조성물을 투여하는 단계 및 (b)를 수행하기 전에 조성물의 세포가 대상체의 표적 세포 또는 조직으로 이동하는 것을 기다리는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단계 (b)는 항-CD39 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편을 투여 일정으로 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 투여 일정은 항-CD39 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편을 매주, 월 2회, 매월, 또는 2개월마다 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 입양 세포 요법 조성물을 투여하는 적어도 하나의 추가의 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 입양 세포 요법은 TIL 요법, TCR 요법 및/또는 CAR 요법을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 입양 세포 요법 조성물은 NK 세포, T 세포, 수지상 세포, 대식세포, PBMC, αβ T 세포, γδ T 세포, 조절 T 세포, NK T 세포, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 입양 세포 요법 조성물은 이종성 TCR 및/또는 CAR을 발현하는 조작된 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포는 T 세포이다. 일부 실시형태에서, T 세포는 CD8+ T 세포이다.
일부 실시형태에서, 조작된 세포는 TAA에 특이적으로 결합하는 세포외 결합 모이어티를 포함하는 CAR을 발현한다. 일부 실시형태에서, TAA는 B 세포 항원이다. 일부 실시형태에서, CAR은 항-CD19 결합 모이어티이다. 일부 실시형태에서, TAA는 흑색종 항원이다. 일부 실시형태에서, 흑색종 항원은 gp100이다.
일부 실시형태에서, CAR은 세포외 결합 모이어티, 막관통 도메인, 및 림프구의 활성화, 지속, 생존 및/또는 증식을 촉발시키는 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 CD3 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 적어도 하나의 공자극 도메인, 또는 공자극 도메인과 다른 공자극 도메인 및/또는 저해 도메인의 조합을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 CD28 또는 4-1BB 공자극 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 조작된 세포는 이종성 TCR을 발현한다. 일부 실시형태에서, 이종성 TCR은 TAA에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, TAA는 흑색종 항원이다. 일부 실시형태에서, TAA는 gp100이다. 일부 실시형태에서, 이종성 TCR은 pmel-1 TCR이다.
일부 실시형태에서, CD39에 특이적으로 결합하는 항체는 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하되, VH 및/또는 VL은 함께 하기 중 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개를 포함한다:
(a) 서열번호 1 내지 21 또는 서열번호 259 내지 263 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VHCDR1,
(b) 서열번호 24 내지 42 또는 서열번호 265 내지 269 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VHCDR2,
(c) 서열번호 45 내지 72 또는 서열번호 271 내지 275 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VHCDR3,
(d) 서열번호 75 내지 89 또는 서열번호 277 내지 281 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VLCDR1,
(e) 서열번호 92 내지 107 또는 서열번호 283 내지 287 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VLCDR2 및
(f) 서열번호 110 내지 135 또는 서열번호 289 내지 293 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VLCDR3.
제3 양상은 입양 세포 요법 조성물을 제조하는 방법을 제공하되, 해당 방법은,
(a) 제1 세포 집단을 제공하는 단계; 및
(b) 항-CD39 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편의 존재 하에 입양 세포 요법을 위하여 치료적 유효량의 세포를 생성하는 데 충분한 조건 하에 제1 세포 집단을 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 세포 집단은 입양 세포 요법 치료를 필요로 하는 대상체(또는 공여체)로부터 얻어진 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 세포 집단은 공여체 대상체로부터 얻어진 세포를 포함하고, 입양 세포 요법 조성물은 수용체 대상체의 치료를 위하여 생성된 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 입양 세포 요법은 TIL 요법, TCR 요법 및/또는 CAR 요법을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 방법은 제1 세포 집단 또는 이의 부분을 조작하는 단계 및/또는 제2 세포 집단 또는 이의 부분을 조작하는 단계를 더 포함하되, 여기서 제2 세포 집단은 단계 (b) 전에 또는 동안에 제1 세포 집단을 확장시킴으로써 생산되고, 제1 및/또는 제2 세포 집단을 조작하는 것은 CAR 또는 이종성 TCR을 발현하도록 세포를 유전자 변형시키는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-CD39 항체는 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하되, VH 및/또는 VL은 함께 하기 중 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개를 포함한다:
(a) 서열번호 1 내지 21 또는 서열번호 259 내지 263 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VHCDR1,
(b) 서열번호 24 내지 42 또는 서열번호 265 내지 269 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VHCDR2,
(c) 서열번호 45 내지 72 또는 서열번호 271 내지 275 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VHCDR3,
(d) 서열번호 75 내지 89 또는 서열번호 277 내지 281 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VLCDR1,
(e) 서열번호 92 내지 107 또는 서열번호 283 내지 287 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VLCDR2 및
(f) 서열번호 110 내지 135 또는 서열번호 289 내지 293 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VLCDR3.
CD39 항체의 CDR-H1 + CDR-H2 + CDR-H3 영역
일부 실시형태에서, CD39에 결합하는 항체는 서열번호 1 내지 21 또는 서열번호 259 내지 263으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어진 CDR-H1 서열, 서열번호 24 내지 42 또는 서열번호 265 내지 269로부터 선택된 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어진 CDR-H2 서열 및 서열번호 45 내지 72 또는 서열번호 271 내지 275로부터 선택된 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어진 CDR-H3 서열을 포함하는 VH 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR-H1 서열, CDR-H2 서열 및 CDR-H3 서열은 모두 본 개시내용에서 제공되는 단일의 예시적인 VH 서열로부터 유래된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3은 모두 서열번호 138 내지 177 또는 서열번호 295, 서열번호 299, 서열번호 303, 서열번호 307 또는 서열번호 311로부터 선택된 단일의 예시적인 VH 서열로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, CD39에 결합하는 항체는 서열번호 2를 포함하는 CDR-H1 서열, 서열번호 25를 포함하는 CDR-H2 서열 및 서열번호 46을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하는 VH 서열을 포함한다.
CD39 항체의 V H 서열
일부 실시형태에서, CD39에 결합하는 항체는 서열번호 138 내지 177 또는 서열번호　295, 서열번호 299, 서열번호 303, 서열번호 307, 또는 서열번호 311로부터 선택된 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어진 VH 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD39에 결합하는 항체는 서열번호 139를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어진 VH 서열을 포함한다.
CD39 항체의 CDR-L1 + CDR-L2 + CDR-L3 영역
일부 실시형태에서, CD39에 특이적으로 결합하는 항체는 서열번호 75 내지 89 또는 서열번호 277 내지 281로부터 선택된 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어진 CDR-L1 서열, 서열번호 92 내지 107 또는 서열번호 283 내지 287로부터 선택된 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어진 CDR-L2 서열 및 서열번호 110 내지 135 또는 서열번호 289 내지 293로부터 선택된 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어진 CDR-L3 서열을 포함하는 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR-L1 서열, CDR-L2 서열 및 CDR-L3 서열은 모두 본 개시내용에서 제공된 단일의 예시적인 VL 서열로부터 유래된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3은 모두 서열번호 180 내지 209 또는 서열번호 296, 서열번호 300, 서열번호 304, 서열번호 308, 또는 서열번호 312로부터 선택된 단일의 예시적인 VL 서열로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, CD39에 특이적으로 결합하는 항체는 서열번호 76 포함하는 CDR-L1 서열, 서열번호 93 포함하는 CDR-L2 서열 및 서열번호 111을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하는 VL 서열을 포함한다.
CD39 항체의 V L 서열
일부 실시형태에서, CD39에 결합하는 항체는 서열번호　180 내지 209 또는 서열번호 296, 서열번호 300, 서열번호 304, 서열번호 308, 또는 서열번호　312 중 어느 하나로부터 선택된 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어진 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD39에 결합하는 항체는 서열번호 181을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어진 VL 서열을 포함한다.
CD39 항체에 대한 V H - V L 쌍
일부 실시형태에서, CD39에 결합하는 항체는 VH 서열 및 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, VH 서열은 서열번호 138 내지 177 또는 서열번호 295, 서열번호 299, 서열번호 303, 서열번호 307, 또는 서열번호 311 중 어느 하나를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어진 VH 서열이고, VL 서열은 서열번호 180 내지 209 또는 서열번호 296, 서열번호 300, 서열번호 304, 서열번호 308, 또는 서열번호 312 중 어느 하나를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어진 VL 서열이다. 일부 실시형태에서, CD39에 특이적으로 결합하는 항체는 서열번호 139를 포함하는 VH 서열 및 서열번호 181을 포함하는 VL 서열을 포함한다.
CD39 항체의 CDR-H1 + CDR-H2 + CDR-H3 + CDR-L1 + CDR-L2 + CDR-L3
일부 실시형태에서, CD39에 특이적으로 결합하는 항체는 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하되, VH 및/또는 VL은 함께 하기 중 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개를 포함한다:
(a) 서열번호 1 내지 21 또는 서열번호 259 내지 263 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VHCDR1,
(b) 서열번호 24 내지 42 또는 서열번호 265 내지 269 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VHCDR2,
(c) 서열번호 45 내지 72 또는 서열번호 271 내지 275 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VHCDR3,
(d) 서열번호 75 내지 89 또는 서열번호 277 내지 281 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VLCDR1,
(e) 서열번호 92 내지 107 또는 서열번호 283 내지 287 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VLCDR2 및
(f) 서열번호 110 내지 135 또는 서열번호 289 내지 293 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VLCDR3.
일부 실시형태에서, CD39에 특이적으로 결합하는 항체는, 서열번호 2를 포함하는 CDR-H1 서열, 서열번호 25를 포함하는 CDR-H2 서열 및 서열번호 46을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하는 VH 서열 및 서열번호 76을 포함하는 CDR-L1 서열, 서열번호 93을 포함하는 CDR-L2 서열 및 서열번호 111을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하는 VL 서열을 포함한다.
HC + LC
일부 실시형태에서, CD39에 결합하는 항체는 HC 서열로 이루어진 1개 이상의 중쇄 및 LC 서열로 이루어진 1개 이상의 경쇄를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CD39에 결합하는 항체는 HC 서열로 이루어진 2개의 동일한 중쇄 및 LC 서열로 이루어진 2개의 동일한 경쇄를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, CD39에 결합하는 항체의 HC 서열은 서열번호 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 297, 301, 305, 309, 313 중 어느 하나를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어진 HC 서열이고, CD39에 결합하는 항체의 LC 서열은 서열번호 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 298, 302, 306, 310, 314 중 어느 하나를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어진 LC 서열이다. 일부 실시형태에서, CD39에 결합하는 항체의 HC 서열은 서열번호 212로 이루어진 HC 서열이고 LC 서열은 서열번호 213으로 이루어진 LC 서열이다.
CD39 항체의 글리코실화 변이체
소정의 실시형태에서, 본 발명의 항체는 글리코실화되는 정도를 증가, 감소 또는 제거하도록 변경될 수 있다. 폴리펩타이드의 글리코실화는 전형적으로 "N-연결"되거나 "O-연결"된다.
"N-연결된" 글리코실화는 아스파라긴 잔기의 측쇄에의 탄수화물 모이어티의 부착을 지칭한다. 트라이펩타이드 서열인 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 아스파라긴 측쇄에 대한 탄수화물 모이어티의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩타이드에서의 이들 트라이펩타이드 서열 중 하나의 존재는 잠재적 글리코실화 부위를 생성한다.
"O-연결된" 글리코실화는 하이드록시아미노산, 가장 통상적으로 세린 또는 트레오닌에 대한 당인 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 자일로스 중 하나의 부착을 지칭하지만, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시라이신이 또한 사용될 수 있다.
항체에 대한 N-연결된 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 하나 이상의 위에서 기재된 트라이펩타이드 서열이 생성 또는 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 달성될 수 있다. O-연결된 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 (경우에 따라) 항체의 서열 내에 또는 서열에 대한 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가, 결실 또는 치환에 의해 달성될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 항체는 글리코실화된다. 소정의 실시형태에서, 항체는 탈글리코실화된다(deglycosylated). 탄수화물은 표준 기술에 의해 제거될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 항체는, 예를 들어, 글리코실화하지 않는 시스템에서의 발현에 의해 비글리코실화된다(aglycosylated).
CD39 항체의 제조
항원 제조
항체의 생산에 사용되는 CD39 항원은 온전한 CD39 또는 CD39의 단편일 수 있다. 온전한 CD39 또는 CD39의 단편은, 단리된 단백질의 형태일 수 있거나 또는 세포에 의해 발현될 수 있다. 당업자라면 온전하거나 단편이거나 간에 CD39 항원을 제조하는 방법을 이해할 것이다. 항원은, 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 WO/2019/027935에 제시된 바와 같이 제조될 수 있다. 항체를 생성하는 데 유용한 CD39의 다른 형태는 당업자에게 명백할 것이다.
CD39 단클론성 항체
일부 실시형태에서, CD39에 결합하는 항체는 단클론성 항체이다. 단클론성 항체는, 예를 들어, 문헌[Kohler et al., Nature, 1975, 256:495-497]에 처음 기재된 하이브리도마 방법을 사용하여 그리고/또는 재조합 DNA 방법(예컨대, 미국 특허 제4,816,567호 참조)에 의해 얻어질 수 있다. 단클론성 항체는 또한 예를 들어 파지 또는 효모-기반 라이브러리를 사용하여 얻어질 수 있다. 예컨대, 미국 특허 제8,258,082호 및 제8,691,730호를 참조한다.
하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물은 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도하도록 면역화된다. 대안적으로, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다. 이어서, 림프구는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 융합체를 사용하여 골수종 세포와 융합되어, 하이브리도마 세포를 형성한다. 문헌[Goding J.W., Monoclonal Antibodies: Principles and Practice 3rd ed. (1986) Academic Press, San Diego, CA]을 참조한다.
하이브리도마 세포는 융합되지 않은 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 저해하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에 파종되고 성장된다. 예를 들어, 모 골수종 세포가 효소인 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HGPRT 또는 HPRT)를 결여하는 경우, 하이브리도마용 배양 배지는 전형적으로 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘(HAT 배지)을 포함할 것이고, 이러한 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다.
유용한 골수종 세포는, 효율적으로 융합하고 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정적인 고수준 생산을 지원하며 HAT 배지의 유무와 같은 민감한 배지 조건인 것들이다. 이들 중에서, 바람직한 골수종 세포주는 뮤린 골수종 세포주, 예컨대, MOP-21 및 MC-11 마우스 종양(Salk Institute Cell Distribution Center(캘리포니아주 샌디에고 소재)로부터 입수 가능), 및 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포(American Type Culture Collection(매릴랜드주 록빌 소재)으로부터 입수 가능)로부터 유래된 것들이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주는 또한 인간 단클론성 항체의 생산에 기재된 바 있다. 예컨대, 문헌[Kozbor, J. Immunol., 1984, 133:3001]을 참조한다.
목적하는 특이성, 친화도 및/또는 생물학적 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 식별 후, 선택된 클론은 제한 희석 절차에 의해 서브클로닝되고 표준 방법에 의해 성장될 수 있다. 문헌[Goding, 상기 참조]을 참조한다. 이 목적을 위한 적합한 배양 배지는, 예를 들어, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로서 생체내에서 성장될 수 있다.
단클론성 항체를 인코딩하는 DNA는 통상의 절차를 사용하여(예컨대, 단클론성 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리되고 시퀀싱될 수 있다. 따라서, 하이브리도마 세포는 목적하는 특성을 가진 항체를 인코딩하는 DNA의 유용한 공급원으로서 역할할 수 있다. 일단 단리되면, DNA는 발현 벡터에 배치될 수 있고, 이어서 달리 항체를 생산하지 않는 박테리아(예컨대, 이. 콜라이(E. coli)), 효모(예컨대, 사카로마이세테스(Saccharomyces) 또는 피치아(Pichia) 종), COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포에 형질감염되어, 단클론성 항체를 생산한다.
CD39 인간화 항체
인간화 항체는 단클론성 항체의 구조적 부분의 대부분 또는 전부를 대응하는 인간 항체 서열로 대체함으로써 생성될 수 있다. 결과적으로, 항원-특이적 가변 영역 또는 CDR만이 비-인간 서열로 구성된 하이브리드 분자가 생성된다. 인간화 항체를 얻는 방법은, 예를 들어, 문헌[Winter and Milstein, Nature, 1991, 349:293-299; Rader et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA., 1998, 95:8910-8915; Steinberger et al., J Biol. Chem., 2000, 275:36073-36078; Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1989, 86:10029-10033]; 및 미국 특허 제5,585,089호, 제5,693,761호, 제5,693,762호 및 6,180,370호에 기재된 것들을 포함한다.
일부 실시형태에서, CD39에 결합하는 항체는 B66이다. 일부 실시형태에서, CD39에 결합하는 항체는 B66을 포함하는 인간화 항-CD39이다(예를 들어, 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 WO/2019/027935 참조).
CD39 인간 항체
인간 항체는 당업계에 공지된 다양한 기술에 의해, 예를 들어, 유전자이식(transgenic) 동물(예컨대, 인간화 마우스)을 사용하여 생성될 수 있다. 예컨대, 문헌[Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1993, 90:2551; Jakobovits et al., Nature, 1993, 362:255-258; Bruggermann et al., Year in Immuno., 1993, 7:33]; 및 미국 특허 제5,591,669호, 제5,589,369호 및 제5,545,807호를 참조한다. 인간 항체는 또한 파지-디스플레이 라이브러리로부터 유도될 수 있다(예컨대, 문헌[Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 1991, 227:381-388; Marks et al., J Mol. Biol., 1991, 222:581-597]; 및 미국 특허 제5,565,332호 및 제5,573,905호 참조). 인간 항체는 또한 시험관내 활성화된 B 세포에 의해 생성될 수 있다(예컨대, 미국 특허 제5,567,610호 및 제5,229,275호 참조). 인간 항체는 또한 효모-기반 라이브러리로부터 유도될 수 있다(예컨대, 미국 특허 제8,691,730호 참조).
일부 실시형태에서, CD39에 결합하는 항체는 인간 항체이다(예를 들어, 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 WO/2019/027935 참조).
입양 세포 요법을 위한 추출
입양 세포 요법은 대상체의 면역 효과기 세포, 공여체의 면역 효과기 세포, 또는 대상체의 암을 공격하도록 본질적으로 또는 조작될 수 있는 면역 효과기 세포를 포함하는 세포주를 사용한다. 따라서, T 세포를 비롯한, 대상체의 또는 공여체의 백혈구는, 대상체 샘플의 나머지로부터 초기에 분리되어야 한다. 일부 실시형태에서, 추출은 T 세포를 단리시키는 것을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 단리된 T 세포는 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 당업자라면 환자 T 세포를 추출하는 방법을 이해할 것이다(예를 들어, 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 문헌[Molecular Therapy Oncolytics, Volume 3, 2016, 16015] 참조).
일부 실시형태에서, 대상체 또는 공여체 샘플은 전혈을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 대상체 또는 공여체 샘플은 원심분리된다. 일부 실시형태에서, 대상체 또는 공여체 샘플은 연막 샘플을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 대상체 또는 공여체 샘플은 PBMC 샘플을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 대상체 또는 공여체 샘플은 미분획된 T 세포 샘플을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 대상체 또는 공여체 샘플은 림프구 샘플을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 대상체 또는 공여체 샘플은 백혈구 샘플을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 대상체 또는 공여체 샘플은 성분채집 샘플을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 대상체 또는 공여체 샘플은 백혈구성분채집 샘플을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 입양 세포 요법 조성물은 NK 세포, T 세포, 수지상 세포, 대식세포, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), αβ T 세포, γδ T 세포, 조절 T 세포, NK T 세포, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 입양 세포 요법 조성물은 이종성 TCR 및/또는 CAR을 발현하는 조작된 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포는 T 세포이다. 일부 실시형태에서, T 세포는 CD8+ T 세포이다.
T 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막삼출액, 비장 조직, 및 종양을 비롯한 다수의 공급원으로부터 얻어질 수 있다. T 세포는, Ficoll™ 분리와 같은 당업자에게 공지된 임의의 수의 기술을 사용하여 대상체 또는 공여체로부터 수집된 혈액의 단위로부터 얻어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체 또는 공여체의 순환 혈액으로부터의 T 세포는 성분채집에 의해 얻어진다. 성분채집 산물은 전형적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 기타 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 포함하는 림프구를 함유한다.
일부 실시형태에서, 성분채집에 의해 수집된 T 세포는 혈장 분획을 제거하기 위하여 세척될 수 있다. 일부 실시형태에서, T 세포는 세척 용액으로 세척된다. 일부 실시형태에서, 세척 용액은 인산염 완충 식염수(PBS)를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 세척 용액은 칼슘, 마그네슘 및/또는 선택된 2가 양이온을 결여한다. 당업자라면 세척이 당업자에게 공지된 방법에 의해, 예컨대, 제조사의 지침에 따라서 반자동 "관류" 원심분리기(예를 들어, Cobe 2991 세포 처리기, Baxter CytoMate, 또는 Haemonetics Cell Saver 5)를 사용함으로써 달성될 수 있음을 이해할 것이다.
일부 실시형태에서, T 세포는 후속 처리 단계를 위해 적절한 완충액, 배양물 또는 배지에 놓인다. 예를 들어, 세포는, 예를 들어, Ca-무함유, Mg-무함유 PBS, PlasmaLyte A, 또는 완충액이 있거나 없는 다른 식염수와 같은 다양한 생체적합성 완충제에 재현탁될 수 있다. 일부 실시형태에서, 배양 조건은 5% 이하의 인간 AB 혈청을 포함하거나 또는 이로 이루어지고, 공지된 배양 배지 조건 및 조성물을 사용할 수 있다(문헌[Smith et al., Ex-vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement" Clinical & Translational Immunology (2015) 4, e31; doi:10.1038/cti.2014.31] 참조, 이는 이의 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용됨).
일부 실시형태에서, T 세포는 적혈구를 용해시키고 단핵구를 고갈시킴으로써, 예를 들어 PERCOLL™ 구배를 통한 원심분리에 의해 또는 역류 원심 분리에 의해 말초 혈액 림프구로부터 단리된다. CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및 CD45R0+T 세포와 같은 T 세포의 특정 하위집단은 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 추가로 단리될 수 있다. 일부 실시형태에서, T 세포는 목적하는 T 세포의 양성 선택에 충분한 시간 기간(time period) 동안 항-CD3/항-CD28(예컨대, 3x28)-접합된 비드, 예컨대, DYNABEADS® M450 CD3/CD28 T와 함께 인큐베이션에 의해 단리된다.
일부 실시형태에서, 시간 기간은 약 30분이다. 일부 실시형태에서, 시간 기간은 30분 내지 36시간 또는 그 이상의 범위이다. 일부 실시형태에서, 시간 기간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6시간이다. 일부 실시형태에서, 시간 기간은 10 내지 24시간이다. 일부 실시형태에서, 시간 기간은 24시간이다.
더 긴 인큐베이션 시간은, 종양 조직으로부터 또는 면역저하된 개체로부터, 다른 세포 유형에 비해서 T 세포가 거의 없는 임의의 상황에서, 예컨대, 종양 침윤 림프구(TIL)를 단리시킴에 있어서, T 세포를 단리시키는 데 사용될 수 있다. 또한, 더 긴 인큐베이션 시간의 사용은 CD8+ T 세포의 포획 효율을 증가시킬 수 있다. 따라서, T 세포가 CD3/CD28 비드와 같은 CD3/CD28 비드에 결합하도록 허용되는 시간을 단순히 단축 또는 연장시킴으로써, 그리/또는 비드 대 T 세포의 비율을 증가 또는 감소시킴으로써, T 세포의 부분집단의 부분집단이 배양 개시 시 또는 과정 중 다른 시점에서 우선적으로 긍정적으로 또는 부정적으로 선택된다. 부가적으로, 비드 또는 다른 표면 상의 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체의 비율을 증가 또는 감소시킴으로써, T 세포의 부분집단이 배양 개시 시 또는 다른 목적하는 시점에서 우선적으로 긍정적으로 또는 부정적으로 선택된다. 다회의 선택 라운드가 또한 사용될 수 있다.
음성 선택에 의한 T 세포 집단의 풍부화는 음성적으로 선택된 세포에 고유한 표면 마커에 지향된 항체의 조합으로 달성될 수 있다. 한 가지 방법은 음성적으로 선택된 세포에 존재하는 세포 표면 마커에 지향된 단클론성 항체의 칵테일을 사용하는 음성 자기 면역부착 또는 유세포분석을 통한 세포 분류 및/또는 선택이다. 예를 들어, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 풍부화하기 위하여, CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD8에 대한 단클론성 항체 칵테일이 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 전형적으로 CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+ 및 FoxP3+를 발현하는 조절 T 세포를 풍부화시키거나 또는 음성적으로 또는 양성적으로 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로, 일부 실시형태에서, T 조절 세포는 항-CD25 접합된 비드 또는 다른 유사한 선택 방법에 의해 고갈될 수 있다. 일부 실시형태에서, 풍부화된 T 세포 집단은 약 40%, 약 35%, 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1% 미만의 CD25+ 세포를 함유한다.
일부 실시형태에서, T 조절 세포, 예컨대, CD25+ T 세포는, 항-CD25 항체 또는 이의 단편, 또는 CD25-결합 리간드, 예를 들어, 제한 없이, IL-2를 사용하여 집단으로부터 제거된다. 일부 실시형태에서, 항-CD25 항체 또는 이의 단편, 또는 CD25-결합 리간드는 기질, 예컨대, 비드에 접합되거나, 또는 다르게는 기질, 예컨대, 비드 상에 코팅된다. 일부 실시형태에서, T 조절 세포, 예컨대, CD25+ T 세포는 Miltenyi™로부터의 CD25 고갈 시약을 사용하여 집단으로부터 제거된다.
일부 실시형태에서, 대상체는 T 세포의 수집 전에 조절 T 세포를 저감시키는 하나 이상의 요법으로 사전-치료된다. 대상을 사전 치료하면 재발 가능성을 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 사이클로포스파마이드, 항-GITR 항체, CD25-고갈, 또는 이들의 조합 중 하나 이상이 T 세포의 단리 전에 대상체에게 투여된다. 사이클로포스파마이드, 항-GITR 항체, CD25-고갈, 또는 이들의 조합 중 하나 이상의 투여는 궁극적으로 CAR-발현 세포 산물의 주입 전, 동안 또는 후에 발생할 수 있다.
일부 실시형태에서, 조절 T 세포 또는 종양 세포가 아니라 달리 세포의 확장 및/또는 기능에 부정적인 영향을 미치는 세포(예컨대, CD14, CD11b, CD33, CD15, CD52, 또는 잠재적으로 면역 억제 세포에 의해 발현되는 다른 마커)인 세포의 집단이 제거된다. 일부 실시형태에서, 이러한 세포는 조절 T 세포 및/또는 종양 세포와 동시에, 또는 상기 고갈 후에, 또는 다른 순서로 제거된다. 하나 또는 하나 초과의 선택 단계, 예컨대, 하나 초과의 고갈 단계가 포함될 수 있고, 이들 단계는 임의의 순서로 발생할 수 있다.
일부 실시형태에서, T 세포는 종양 항원, 예컨대, CD25, 예컨대, CD19, CD30, CD38, CD123, CD20, CD14 또는 CD11b를 포함하지 않는 종양 항원을 발현하는 세포를 집단으로부터 제거함으로써 풍부화될 수 있고, 이에 의해서 T 조절 고갈된, 예컨대, CD25+ 고갈된 세포 및 종양 항원 고갈된 세포의 집단을 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 종양 항원 발현 세포는 T 조절, 예컨대, CD25+ 세포와 동시에 제거된다. 예를 들어, 항-CD25 항체 또는 이의 단편, 및 항-종양 항원 항체 또는 이의 단편은, 세포 또는 항-CD25 항체 또는 이의 단편, 또는 항-종양 항원 항체 또는 이의 단편을 제거하는 데 사용될 수 있는 동일한 기질, 예컨대, 비드에 부착될 수 있고, 별도의 비드에 부착될 수 있는데, 이들의 혼합물은 세포를 제거하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, T 조절 세포, 예컨대, CD25+ 세포의 제거, 및 종양 항원 발현 세포의 제거는 순차적이고, 예컨대, 어느 한 순서로 발생할 수 있다.
T 세포는 또한 세척 후 냉동될 수 있다. 냉동 및 후속의 해동 단계는 세포 집단에서 과립구 및/또는 단핵구를 제거함으로써 보다 균일한 산물을 제공할 수 있다. 혈장과 혈소판을 제거하는 세척 단계 후, 세포는 냉동 용액에 현탁될 수 있다. 일부 실시형태에서, 동결보존된 세포는 해동되고 세척되고, 활성화 전에 실온에서 1시간 동안 휴지되도록 허용된다.
일부 실시형태에서, T 세포는 대상체를 기능적 T 세포로 남겨두는 치료 직후 대상체로부터 얻어진다. 소정의 암 치료, 특히 면역 체계를 손상시키는 약물에 의한 치료 후, 대상체가 치료로부터 정상적으로 회복되는 기간 동안 치료 직후에, 얻어진 T 세포의 품질은 생체외에서 확장되는 능력에 대해 최적이거나 개선될 수 있다.
입양 세포 요법용 재프로그래밍
일부 실시형태에서, 하나 이상의 TCR 및/또는 하나 이상의 CAR을 인코딩하는 하나 이상의 유전자가 단리된 면역 세포에 전달되어 조작된 세포를 생산한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 하나 이상의 TCR 및/또는 하나 이상의 CAR를 인코딩하는 유전자를 전달하는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, 벡터는 DNA, RNA, 플라스미드, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 레트로바이러스 벡터는 감마레트로바이러스 벡터를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 단리된 면역 세포는 조작된 세포의 효능 및/또는 안전성을 증대시키는 하나 이상의 유전자를 전달한다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포의 효능을 증대시키는 하나 이상의 유전자는 하나 이상의 사이토카인이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 사이토카인은 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15 및/또는 IL-18을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포의 효능을 증대시키는 하나 이상의 유전자는 수용체를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 수용체는 케모카인 수용체를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 케모카인 수용체는 CXCR2 및 또는 CCR2B를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 수용체는 우성 음성 수용체를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 우성 음성 수용체는 TGFBR2를 포함하거나 또는 이로 이루어진다(예컨대, 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용되는 문헌[Depil et al. 2020 Nature Reviews Drug Discovery 19: 185-199] 참조).
일부 실시형태에서, 단리된 면역 세포는 조작된 세포의 안전성을 증대시키는 하나 이상의 유전자를 전달한다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포의 안전성을 증대시키는 유전자는 안전성 스위치를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 안전성 스위치는 자살 스위치를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 자살 스위치는 HSV-TK, iCasp9, CD20 및/또는 EGFRt를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 안전성 스위치는 TCR 및/또는 CAR 유전자의 발현을 제어하는 시스템을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, TCR 및 또는 CAR 유전자의 발현을 제어하는 시스템은 synNotch 시스템 또는 유도성 CAR 시스템을 포함하거나 또는 이로 이루어진다(예컨대, 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용되는 문헌[Yu et al. 2019 Molecular Cancer 18: 125-138] 참조).
렌티바이러스와 같은 레트로바이러스로부터 유래된 벡터는 딸 세포에서 이식유전자(transgene)의 장기간 안정적인 통합 및 번식을 허용하기 때문에 장기간 유전자 전달을 달성하는 적합한 도구이다. 렌티바이러스 벡터는, 간세와 같은 비증식성 세포를 형질도입할 수 있다는 점에서 뮤린 백혈병 바이러스와 같은 온코-레트로바이러스로부터 유래된 벡터에 비해서 부가된 이점을 갖는다. 이들은 낮은 면역원성의 부가된 이점도 갖는다.
레트로바이러스 벡터는, 또한 예컨대, 감마레트로바이러스 벡터일 수 있다. 감마레트로바이러스 벡터는, 예컨대, 프로모터, 패키징 신호, 프라이머 결합 부위(PBS), 하나 이상의 (예컨대, 2개의) 긴 말단 반복부(LTR), 및 관심 이식유전자, 예컨대, TCR 또는 CAR를 포함할 수 있다. 감마레트로바이러스 벡터는 gag, pol 및 env와 같은 바이러스 구조 유전자가 부족할 수 있다. 예시적인 감마레트로바이러스 벡터는 뮤린 백혈병 바이러스(MLV), 비장-병소 형성 바이러스(Spleen-Focus Forming Virus: SFFV), 및 골수증식성 육종 바이러스(MPSV), 및 이들로부터 유래된 벡터를 포함한다. 기타 감마레트로바이러스 벡터는, 예컨대, 문헌[Tobias Maetzig et al. "Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application" Viruses. 2011 Jun; 3(6): 677-713]에 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 TCR 및/또는 CAR의 통합 및/또는 효능 및/또는 생존율을 증대시키는 하나 이상의 유전자의 전달은 유전자 편집을 통해 발생한다. 일부 실시형태에서, 유전자는 유전자 편집 모이어티와 함께 동시 전달되거나 순차적으로 전달된다. 일부 실시형태에서, 유전자 편집 모이어티는 잠자는 숲속의 미녀(sleeping beauty), CRISPR, CAS9, TALEN, megaTAL, 및 아연 집게 뉴클레아제를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. (예컨대, 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용되는 문헌[June et al. 2009 Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716] 참조).
TCR 및/또는 CAR의 발현은 전형적으로 TCR 및/또는 CAR 폴리펩타이드 또는 이의 부분을 인코딩하는 핵산을 프로모터에 작동 가능하게 연결하고 이 작제물을 발현 벡터에 통합함으로써 달성된다. 벡터는 진핵생물에서 복제 및 통합에 적합할 수 있다. 전형적인 클로닝 벡터는 목적하는 핵산 서열의 발현 조절에 유용한 전사 및 번역 종결자, 개시 서열 및 프로모터를 함유한다.
일부 실시형태에서, TCR 및/또는 CAR의 발현은 TCR 및/또는 CAR 작제물을 유전자 편집을 통해 특정 유전자좌(locus)에 통합함으로써 달성된다. 일부 실시형태에서, 이 유전자좌는 TRAC 또는 CD52 유전자좌이다(예를 들어, 문헌[Depil, et al., 2020, Cancer Cell Therapy, 19:185-199; Fisher, et al., 2018, Frontiers in Immunology, 9:1409; Wang, et al., 2020, Cancer Letters, 472:175-180]; W02017019848 참조, 이들은 이들의 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용됨).
포유동물 T 세포에서 CAR을 발현할 수 있는 프로모터의 예는 EFl알파 프로모터(EFla 또는 EF1a)이다. 천연 EFla 프로모터는 리보솜으로 아미노아실 tRNA의 효소적 전달을 담당하는 신장 인자-1 복합체의 알파 소단위의 발현을 유도한다. EFla 프로모터는 포유동물 발현 플라스미드에서 광범위하게 사용되었으며 렌티바이러스 벡터에 클로닝된 이식유전자로부터 CAR 발현을 유도하는 데 효과적인 것으로 나타났다. (예컨대, 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 문헌[Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 14531464 (2009)] 참조). 일부 실시형태에서, 벡터는 EFl알파 프로모터를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 프로모터는 작동 가능하게 연결된 임의의 폴리뉴클레오타이드 서열의 높은 수준의 발현을 유도할 수 있는 강한 구성적 프로모터 서열인 즉시 초기 거대세포바이러스(CMV) 프로모터를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 유인원 바이러스 40(SV40) 초기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인-바 바이러스 즉시 초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터뿐만 아니라, 제한되지 않지만, 액틴 프로모터, 미오손 프로모터, 신장 인자-1a 프로모터, 헤모글로빈 프로모터 및 크레아틴 키나제 프로모터와 같은 인간 유전자 프로모터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 기타 구성적 프로모터 서열이 또한 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 유도성 프로모터의 사용은, 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현이 바람직할 때 그러한 발현을 켜거나 또는 당해 발현이 바람직하지 않을 때 발현을 끌 수 있는 분자 스위치를 제공한다. 유도성 프로모터의 예는 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터 및 테트라사이클린 프로모터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 프로모터는 내인성 프로모터이다. 내인성 프로모터의 사용은 항원에 대한 자연적인 반응을 모방하고 탈진으로 연결될 수 있는 과도한 세포 자극을 방지하는 방식으로 발현이 조절되게 허용한다.
일부 실시형태에서, 벡터는 (예컨대, 소 성장 호르몬(BGH) 유전자로부터) 분비를 촉진시키는 신호 서열, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결자, 원핵생물(예컨대, SV40 기원 및 ColE1 또는 당업계에 공지된 기타의 것들)에서 에피솜 복제 및 복제를 허용하는 요소, 및/또는 선택을 허용하는 요소(예컨대, 암피실린 내성 유전자 및/또는 제오신 마커)를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
벡터는 물리적, 화학적 또는 생물학적 수단에 의해 T 세포에 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포에 도입하기 위한 물리적 방법은 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 충격, 미세주입, 전기천공 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생산하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY]을 참조한다. 벡터는 또한 리포펙션에 의해 T 세포에 도입될 수 있다. 관심 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포에 도입하기 위한 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다.
폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포에 도입하기 위한 화학적 수단은 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구체, 비드와 같은 콜로이드 분산 시스템, 및 수중유 에멀션, 마이셀, 혼합 마이셀 및 리포솜을 포함하는 지질-기반 시스템을 포함한다. 시험관내 및 생체내에서 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시적인 콜로이드 시스템은 리포솜(예컨대, 인공 막 소포)이다. 표적화된 나노입자 또는 다른 적합한 서브-마이크론 크기의 전달 시스템을 사용한 폴리뉴클레오타이드의 전달과 같은 핵산의 최신 표적화된 전달의 다른 방법이 이용 가능하다.
다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 포진 바이러스 I, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다(예를 들어, 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는, 미국 특허 제5,350,674호 및 제5,585,362호 참조).
입양 세포 요법에서 조작된 세포의 확장
입양 세포 요법용 세포는 확장 또는 증식될 수 있다. T 세포와 같은 면역 효과기 세포는 일반적으로, 예를 들어, 미국 특허 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; 및 미국 특허 출원 공개 제20060121005호(이들의 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨)에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 활성화되고 확장될 수 있다. 일반적으로, 면역 효과기 세포, 예컨대, T 세포의 집단은 CD3/TCR 복합체 연관 신호를 자극하는 제제 및 면역 효과기 세포, 예컨대, T 세포의 표면 상의 공자극 분자를 자극하는 리간드가 부착된 표면과의 접촉에 의해 확장될 수 있다. 특히, T 세포 집단은, 예컨대, 표면에 고정된 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 항-CD2 항체와의 접촉에 의해, 또는 칼슘 이오노포어(ionophore)와 함께 단백질 키나제 C 활성제(예컨대, 브리오스타틴)와의 접촉에 의해 본 명세서에 기재된 바와 같이 자극될 수 있다. T 세포의 표면 상의 보조 분자의 공-자극을 위해, 보조 분자에 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들어, T 세포의 집단은 T 세포의 증식을 자극하기에 적절한 조건 하에 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다.
CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 증식을 자극하기 위하여, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체는 당업계에 통상적으로 공지된 다른 방법도 사용될 수 있다(문헌[Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999] 참조, 이들의 각각은, 임의의 도면을 비롯하여, 본 명세서에 참조에 의해 원용됨). 항-CD28 항체의 예는, 제한 없이, 9.3, B-T3, XR-CD28(Diaclone, 프랑스 브장송 소재)을 포함한다.
일부 실시형태에서, T 세포를 위한 1차 자극성 신호 및 공자극 신호는 소정 시간의 기간 동안 제공될 수 있다. 일부 실시형태에서, T 세포는 수 시간(예컨대, 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24시간) 내지 약 14일(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14일)의 기간 동안 배양물에서 확장된다. 일부 실시형태에서, T 세포는 약 4일 내지 약 9일의 기간 동안 확장된다. 일부 실시형태에서, T 세포는 약 8일 이하의 기간 동안 확장된다. 일부 실시형태에서, T 세포는 약 7, 약 6, 또는 약 5일 동안 확장된다.
일부 실시형태에서, T 세포는 5일 동안 배양물에서 확장되고, 생성된 T 세포는 배양물에서 확장되지 않은 세포와 비교하여 더 높은 전염증성 사이토카인 생산을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 전염증성 사이토카인은 IFN-γ 및/또는 GM-CSF를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
T 세포 배양에 적절한 조건은, 혈청(예컨대, 소태아 또는 인간 혈청), 인터류킨-2(IL-2), 인슐린, IFN- γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFP 및 TNF-α 또는 당업자에게 공지된 세포의 성장을 위한 임의의 기타 첨가제를 비롯한, 증식 및 생존에 필요한 소정의 인자일 수 있는 적절한 배지(예컨대, 최소 필수 배지 또는 RPMI Media 1640 또는 X-vivo 15(Lonza))를 포함한다. 세포의 성장을 위한 기타 첨가제는, 계면활성제, 플라스마네이트(plasmanate), 및 환원제, 예컨대, N-아세틸-시스테인 및 2-머캅토에탄올을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 배지는, 적절한 양의 혈청(또는 혈장) 또는 정해진 세트의 호르몬 및/또는 T 세포의 성장 및 확장을 위해 충분한 양의 사이토카인(들)이 보충된 또는 혈청이 없는, 아미노산, 피루브산나트륨 및 비타민과 함께 RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 15 및/또는 X-Vivo 20, Optimizer를 포함할 수 있다. 표적 세포는 성장을 지원하는 데 필요한 조건, 예를 들어, 적절한 온도(예컨대, 37℃) 및 분위기(예컨대, 공기+5% CO2) 하에 유지될 수 있다.
일부 실시형태에서, T 세포는, 유세포분석과 같은 방법에 의해 측정된 바와 같이, 14일 확장 기간에 걸쳐서 세포의 적어도 200-배(예컨대, 200-배, 250-배, 300-배, 또는 350-배) 증가를 초래하는 하나 이상의 인터류킨을 포함하는 적절한 배지(예컨대, 본 명세서에 기재된 배지)에서 확장된다. 일부 실시형태에서, 세포는 IL-15 및/또는 IL-7(예컨대, IL-15 및 IL-7)의 존재 하에 확장된다.
일부 실시형태에서, T 조절 세포, 예컨대, CD25+ T 세포가 제거된다. 일부 실시형태에서, T 조절 세포는 항-CD25 항체 또는 이의 단편, 또는 CD25-결합 리간드를 사용하여 제거된다. 일부 실시형태는 세포 집단(예컨대, CD25+ T 세포와 같은 T 조절 세포가 고갈된 세포 집단; 또는 항-CD25 항체, 이의 단편, 또는 CD25-결합 리간드와 이미 접촉한 세포 집단)을 IL-15 및/또는 IL-7과 접촉시키는 것을 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포는 혈청을 포함하는 배지에서 배양(예컨대, 확장, 시뮬레이션 및/또는 형질도입)된다. 혈청은, 예컨대, 인간 AB 혈청(hAB)일 수 있다. 일부 실시형태에서, hAB 혈청은 약 2%, 약 5%, 약 2 내지 3%, 약 3 내지 4%, 약 4 내지 5% 또는 약 2 내지 5%로 존재한다. (전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는, 문헌[Smith et al., "Ex-vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement" Clinical & Translational Immunology (2015) 4, e31; doi:10.1038/cti.2014.31] 참조).
일부 실시형태에서, 조작된 세포는 생물반응기에서 확장 또는 증식된다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포는 항-CD39 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편의 존재 하에 확장, 증식 또는 배양된다.
입양 세포 요법을 위한 컨디셔닝
일부 실시형태에서, 대상체는 입양 세포 요법을 받기 전에 컨디셔닝될 수 있다. 일례로서, 대상체는 CAR-T 세포와 같은 조작된 세포를 위한 공간을 만들기 위하여 백혈구 수를 낮추는 화학요법을 받을 수 있다. 다른 예로서, 대상체는 종양 세포사를 유도하고/하거나 ATP의 방출 및 종양 부위에의 CD39 세포의 귀소를 촉진하기 위하여 화학요법을 받을 수 있다. 임의의 요법이 당업자에 따라서 대상체에게 투여될 수 있다.
특히, 벤다무스틴(bendamustine), 이브루티닙(ibrutinib), 사이클로포스파마이드, 알렘투주맙(alemtuzumab) 및/또는 플루다라빈(fludarabine)은 일부 실시형태에서 입양 세포 요법을 위한 컨디셔닝으로서 대상체에게 투여될 수 있다(예를 들어, 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 미국 특허 9,855,298 참조). 일부 실시형태에서, 컨디셔닝은 입양 세포 요법의 투여 전에 벤다무스틴, 이브루티닙, 사이클로포스파마이드, 알렘투주맙 및/또는 플루다라빈을 투여하는 것을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 컨디셔닝은 입양 세포 요법의 투여 전 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일에 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 컨디셔닝은 약 100 ㎎/㎏, 약 125 ㎎/㎏, 약 150 ㎎/㎏, 약 175 ㎎/㎏, 약 200 ㎎/㎏, 약 225 ㎎/㎏, 약 250 ㎎/㎏, 약 275 ㎎/㎏, 약 300 ㎎/㎏, 약 325 ㎎/㎏, 약 350 ㎎/㎏, 약 375 ㎎/㎏, 약 400 ㎎/㎏, 약 425 ㎎/㎏, 약 450 ㎎/㎏, 약 475 ㎎/㎏, 또는 약 500 ㎎/㎏의 투여량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 컨디셔닝은 입양 세포 요법의 투여 전에 사이클로포스파마이드를 투여하는 것을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 컨디셔닝은 본 명세서에서 제공되는 투여량 및 시간에 입양 세포 요법의 투여 전에 사이클로포스파마이드를 투여하는 것을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 컨디셔닝은 하나 이상의 사이토카인, 예컨대, 인터류킨 7(IL-7), 인터류킨 15(IL-15), 인터류킨 10(IL-10), 인터류킨 5(IL-5), 감마-유도 단백질 10(IP-10), 인터류킨 8(IL-8), 단핵구 화학주성 단백질 1(MCP-1), 태반 성장 인자(PLGF), C-반응성 단백질(CRP), 가용성 세포간 부착 분자 1(sICAM-1), 가용성 혈관 부착 분자 1(sVCAM-1), 또는 이들의 임의의 조합의 혈정 수준을 증가시키는 것을 포함하거나 또는 이로 이루어진다 일부 실시형태에서, 컨디셔닝은 IL-7, IL-15, IP-10, MCP-1, PLGF, CRP, 또는 이들의 임의의 조합의 혈청 수준을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-7, IL-15, IP-10, MCP-1, PLGF, CRP, 또는 이들의 임의의 조합의 혈청 수준은, TIL, TCR, 및 또는 CAR 요법을 포함하는 조작된 세포에 의한 하나 이상의 사이토카인의 발현을 통해서 증가된다.
요법의 투여
본 명세서에 기재된 조성물의 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 이식(implantation) 또는 이식(transplantation)을 비롯한 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본 명세서에 기재된 조성물은 대상체에게 경동맥, 피하, 피부내, 종양내, 결절내, 골수내, 근육내, 정맥내(i.v.) 주사에 의해, 또는 복강내로 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 조성물의 투여는 피부내 또는 피하 주사를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 조성물의 투여는 주사를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 조성물의 투여는 종양, 림프절, 및/또는 감염 부위에의 직접 주사를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
의 CD39에 결합하는 항체의 치료적 유효량과 입양 세포 요법의 치료적 유효량은 대상체의 연령, 체중, 종양 크기, 감염 정도, 암 또는 전이의 정도, 및 병태의 개인차를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다. 대상체에게 투여될 투여량은 치료 중인 병태 및 대상체의 정확한 속성에 따라 달라질 것이다. 당업자라면 인간 투여를 위한 투여량의 규모를 결정할 수 있을 것이다. 유효 용량은 시험관내 또는 동물 모델에서 유도된 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다.
예를 들어, CD39에 특이적으로 결합하는 항체의 치료적 유효량은 대상체 또는 샘플 중량 킬로그램당 항체의 밀리그램 또는 마이크로그램량을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 항체의 투여량은 0.1 ㎎/㎏, 1 ㎎/㎏, 2 ㎎/㎏, 3 ㎎/㎏, 4 ㎎/㎏, 5 ㎎/㎏, 6 ㎎/㎏, 7 ㎎/㎏, 8 ㎎/㎏, 9 ㎎/㎏, 10 ㎎/㎏, 또는 15 ㎎/㎏(대상체의 체중) 이상이다. 일부 실시형태에서, 항체의 투여량은 0.1㎎ 내지 200㎎, 0.1㎎ 내지 100㎎, 0.1㎎ 내지 50㎎, 0.1㎎ 내지 25㎎, 0.1㎎ 내지 20㎎, 0.1㎎ 내지 15㎎, 0.1㎎ 내지 10㎎, 0.1㎎ 내지 7.5㎎, 0.1㎎ 내지 5㎎, 0.1 내지 2.5㎎, 0.25㎎ 내지 20㎎, 0.25 내지 15㎎, 0.25 내지 12㎎, 0.25 내지 10㎎, 0.25㎎ 내지 7.5㎎, 0.25㎎ 내지 5㎎, 0.25㎎ 내지 2.5㎎, 0.5㎎ 내지 20㎎, 0.5 내지 15㎎, 0.5 내지 12㎎, 0.5 내지 10㎎, 0.5㎎ 내지 7.5㎎, 0.5㎎ 내지 5㎎, 0.5㎎ 내지 2.5㎎, 1㎎ 내지 20㎎, 1㎎ 내지 15㎎, 1㎎ 내지 12㎎, 1㎎ 내지 10㎎, 1㎎ 내지 7.5㎎, 1㎎ 내지 5㎎, 또는 1㎎ 내지 2.5㎎이다. 일부 실시형태에서, 항체의 투여량은 0.1㎎ 내지 0.2㎎, 0.2㎎ 내지 0.3㎎, 0.3㎎ 내지 0.4㎎, 0.4㎎ 내지 0.5, 0.5㎎ 내지 0.6㎎, 0.6㎎ 내지 0.7, 0.7㎎ 내지 0.8㎎, 또는 0.8㎎ 내지 0.9㎎이다.
입양 세포 요법의 치료량은 또한 당업자에 따라서 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 입양 세포 요법은 약 104개 세포/kg 체중 내지 약 109개 세포/kg 체중의 투여량을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 입양 세포 요법은 약 105개 세포/kg 체중 내지 약 106개 세포/kg 체중의 투여량을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 입양 세포 요법은 약 104개 세포/kg 체중 내지 약 109개 세포/kg 체중의 정수값의 투여량을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 입양 세포 요법은 CAR 요법 또는 CAR-T 요법을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CAR 요법 또는 CAR-T 요법은 약 1×106, 약 2×106, 약 3×106, 약 4×106, 약 5×106, 약 6×106, 약 7×106, 약 8×106, 약 9×106, 약 1×107, 약 2×107, 약 3×107, 약 4×107, 약 5×107, 약 6×107, 약 7×107, 약 8×107, 약 9×107, 약 1×108, 약 2×108, 약 3×108, 약 4×108, 또는 약 5×108개 세포/kg의 투여량을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CAR 요법 또는 CAR-T 요법은 최대 약 1×106, 최대 약 2×106, 최대 약 3×106, 최대 약 4×106, 최대 약 5×106, 최대 약 6×106, 최대 약 7×106, 최대 약 8×106, 최대 약 9×106, 최대 약 1×107, 최대 약 2×107, 최대 약 3×107, 최대 약 4×107, 최대 약 5×107, 최대 약 6×107, 최대 약 7×107, 최대 약 8×107, 최대 약 9×107, 최대 약 1×108, 최대 약 2×108, 최대 약 3×108, 최대 약 4×108, 또는 최대 약 5×108개 세포/kg의 투여량을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, CAR 요법 또는 CAR-T 요법은 약 1×105개 세포, 약 2×105개 세포, 약 3×105개 세포, 약 4×105개 세포, 약 5×105개 세포, 약 6×105개 세포, 약 7×105개 세포, 약 8×105개 세포, 약 9×105개 세포, 약 1×106개 세포, 약 2×106개 세포, 약 3×106개 세포, 약 4×106개 세포, 약 5×106개 세포, 약 6×106개 세포, 약 7×106개 세포, 약 8×106개 세포, 약 9×106개 세포, 약 1×107개 세포, 약 2×107개 세포, 약 3×107개 세포, 약 4×107개 세포, 약 5×107개 세포, 약 6×107개 세포, 약 7×107개 세포, 약 8×107개 세포, 약 9×107개 세포, 약 1×108개 세포, 약 2×108개 세포, 약 3×108개 세포, 약 4×108개 세포, 약 5×108개 세포, 약 6×108개 세포, 약 7×108개 세포, 약 8×108개 세포, 약 9×108개 세포, 약 1×109개 세포, 약 2×109개 세포, 약 3×109개 세포, 약 4×109개 세포, 또는 약 5×109개 세포의 투여량을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CAR 요법 또는 CAR-T 요법은 적어도 약 1×105개 세포, 적어도 약 2×105개 세포, 적어도 약 3×105개 세포, 적어도 약 4×105개 세포, 적어도 약 5×105개 세포, 적어도 약 6×105개 세포, 적어도 약 7×105개 세포, 적어도 약 8×105개 세포, 적어도 약 9×105개 세포, 적어도 약 1×106개 세포, 적어도 약 2×106개 세포, 적어도 약 3×106개 세포, 적어도 약 4×106개 세포, 적어도 약 5×106개 세포, 적어도 약 6×106개 세포, 적어도 약 7×106개 세포, 적어도 약 8×106개 세포, 적어도 약 9×106개 세포, 적어도 약 1×107개 세포, 적어도 약 2×107개 세포, 적어도 약 3×107개 세포, 적어도 약 4×107개 세포, 적어도 약 5×107개 세포, 적어도 약 6×107개 세포, 적어도 약 7×107개 세포, 적어도 약 8×107개 세포, 적어도 약 9×107개 세포, 적어도 약 1×108개 세포, 적어도 약 2×108개 세포, 적어도 약 3×108개 세포, 적어도 약 4×108개 세포, 적어도 약 5×108개 세포, 적어도 약 6×108개 세포, 적어도 약 7×108개 세포, 적어도 약 8×108개 세포, 적어도 약 9×108개 세포, 적어도 약 1×109개 세포, 적어도 약 2×109개 세포, 적어도 약 3×109개 세포, 적어도 약 4×109개 세포, 또는 적어도 약 5×109개 세포의 투여량을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, CAR 요법 또는 CAR-T 요법은 최대 약 1×105개 세포, 최대 약 2×105개 세포, 최대 약 3×105개 세포, 최대 약 4×105개 세포, 최대 약 5×105개 세포, 최대 약 6×105개 세포, 최대 약 7×105개 세포, 최대 약 8×105개 세포, 최대 약 9×105개 세포, 최대 약 1×106개 세포, 최대 약 2×106개 세포, 최대 약 3×106개 세포, 최대 약 4×106개 세포, 최대 약 5×106개 세포, 최대 약 6×106개 세포, 최대 약 7×106개 세포, 최대 약 8×106개 세포, 최대 약 9×106개 세포, 최대 약 1×107개 세포, 최대 약 2×107개 세포, 최대 약 3×107개 세포, 최대 약 4×107개 세포, 최대 약 5×107개 세포, 최대 약 6×107개 세포, 최대 약 7×107개 세포, 최대 약 8×107개 세포, 최대 약 9×107개 세포, 최대 약 1×108개 세포, 최대 약 2×108개 세포, 최대 약 3×108개 세포, 최대 약 4×108개 세포, 최대 약 5×108개 세포, 최대 약 6×108개 세포, 최대 약 7×108개 세포, 최대 약 8×108개 세포, 최대 약 9×108개 세포, 최대 약 1×109개 세포, 최대 약 2×109개 세포, 최대 약 3×109개 세포, 최대 약 4×109개 세포, 또는 최대 약 5×109개 세포의 투여량을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 치료적으로 유효한은 각각의 항체 및/또는 입양 세포 요법의 예시적인 투여량을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효량은 임상 종말점에 따라서 반응을 달성하기 위하여 사용되는 양을 결정하는 것을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 임상 종말점은 객관적 반응률(ORR), 무진행 생존율(PFS) 및/또는 고형 종양 반응 평가 기준("RECIST")을 포함한다.
투여 빈도는 투여량과 관련될 것이고, 또한 투여된 특정 요법, 장애, 질환 또는 병태의 중증도, 투여 경로뿐만 아니라, 대상체의 연령, 체중, 반응 및 과거 병력에 따라서 각 대상체에 특이적인 인자에 따라서 달라질 것이다. 빈도는 또한 시험관내 또는 동물 모델로부터 유도된 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다.
CD39에 결합하는 항체는 적합한 일정에 따라서, 예를 들어, 매주 1회, 2회, 3회 또는 3회 투여될 수 있다. 임상의 또는 치료 중인 의사는 대상체 반응과 함께 요법을 중단, 조절 또는 종료하는 방법 및 시기를 알 것이다. 일부 실시형태에서, CD39에 결합하는 항체가 투여될 수 있고, 투여는 반복될 수 있고, 한 회 이상의 투여는 적어도 1 day, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 30일, 45일, 2개월, 75일, 3개월 또는 6개월만큼 분리될 수 있다.
입양 세포 요법은 또한 적합한 일정에 따라서 투여될 수 있다. CD39에 특이적으로 결합하는 항체 및/또는 입양 세포 요법 조성물은 다회 그리고 동일 또는 상이한 투여량으로 투여될 수 있다. CD39에 특이적으로 결합하는 항체 및/또는 치료적 유효량의 입양 세포 요법 조성물은 임의의 순서로 그리고 임의의 투여량으로 투여될 수 있다. 일부 실시형태는 대상체에게 입양 세포 요법 조성물을 투여하는 단계 및 항-CD39 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편을 동시에 또는 순차적으로 투여하는 단계를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CD39에 특이적으로 결합하는 항체는 입양 세포 요법 전에 투여된다. 일부 실시형태에서, CD39에 특이적으로 결합하는 항체는 입양 세포 요법 후에 투여된다. 일부 실시형태에서, CD39에 결합하는 항체 및/또는 입양 세포 요법은 다회 그리고 동일 또는 상이한 투여량, 또는 이들의 조합으로 투여된다.
대상체는 입양 세포 요법의 초기 투여 및 입양 세포 요법의 후속 투여를 받을 수 있다(예를 들어, 도 1 참조). 일부 실시형태에서, 대상체는 입양 세포 요법의 초기 투여 및 하나 이상의 후속 투여를 받는다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 투여는 이전의 투여 후 약 15일 미만, 약 14일 미만, 약 13일 미만, 약 12일 미만, 약 11일 미만, 약 10일 미만, 약 9일 미만, 약 8일 미만, 약 7일 미만, 약 6일 미만, 약 5일 미만, 약 4일 미만, 약 3일 미만, 약 2일 미만, 또는 약 1일 미만에 투여된다. 일부 실시형태에서, 입양 세포 요법의 1회 초과의 투여가 매주 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 주당 입양 세포 요법의 1회 초과의 투여를 받은 후에 입양 세포 요법의 투여가 없는 한 주를 갖는다. 일부 실시형태에서, 입양 세포 요법의 투여가 없이 입양 세포 요법의 1회 이상의 추가의 투여가 이어진다. 일부 실시형태에서, 대상체는 1 주기 초과의 입양 세포 요법을 받고, 각 주기 사이의 시간은 약 10, 약 9, 약 8, 약 7, 약 6, 약 5, 약 4, 약 3, 약 2, 또는 약 1일 미만이다.
일부 실시형태에서, 대상체는 CD39에 결합하는 항체 및/또는 입양 세포 요법을 받기 전에 컨디셔닝될 수 있다. 일례로서, 대상체는 그들의 백혈구 수를 낮추고 CAR-T 세포를 위한 공간을 만들기 위하여 화학 요법을 받을 수 있다. 다른 예로서, 대상체는 종양 세포사를 유도하고/하거나 ATP의 방출 및 종양 부위에의 CD39 세포의 귀소를 촉진하기 위하여 화학요법을 받을 수 있다. 임의의 요법이 당업자에 따라서 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 컨디셔닝은 입양 세포 전달의 투여 전에 또는 CD39에 결합하는 항체의 투여 전에 사이클로포스파마이드를 투여하는 것을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 입양 세포 요법이 대상체에게 투여되고, 이어서 후속적으로 혈액을 뽑아낸다. 일부 실시형태에서, 입양 세포 요법이 대상체에게 투여되고, 이어서 후속적으로 성분채집이 수행된다. 이 과정은 몇 주마다 다수회 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 백혈구 성분채집을 겪을 수 있는데, 여기서 백혈구는 생체외에서 수집, 풍부화 또는 고갈되어, 관심 세포, 예컨대, T 세포를 선택 및/또는 단리시킨다.
입양 세포의 집단
일부 실시형태에서, 입양 세포 요법은 하나 이상의 입양 세포 요법을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 입양 세포 요법은 TIL 요법, TCR 요법, 및/또는 CAR 요법 중 하나 이상을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 αβ T 세포, γδ T 세포, 조절 T 세포, NK T 세포, NK 세포, 대식세포 및 또는 수지상 세포를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 입양 세포 요법은 환자 유래 자가 면역 세포 및 또는 공여체 유래 동종이계 면역 세포를 포함하거나 또는 이로 이루어진다(예를 들어, 문헌[Depil, et al., 2020, Cancer Cell Therapy, 19:185-199; Fisher, et al., 2018, Frontiers in Immunology, 9:1409; Wang, et al., 2020, Cancer Letters, 472:175-180]; W02017019848 참조, 이는 이의 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용됨). 당업자라면 입양 세포 요법의 임의의 조합을 상정할 수 있을 것이다.
일부 실시형태에서, 조작된 세포는 하나 이상의 TAA 및/또는 또는 하나 이상의 TSA에 결합하는 더 많은 세포외 결합 모이어티를 포함하거나 또는 이로 이루어진 하나 이상의 조작된 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 TAA 및/또는 TSA는 MART-1, gp100, CEA, CD-19, NY-ESO-1, MAGE-A3, hTERT, EGFR, 메소텔린, HPV, EBV, MCC, Mum-1, β-카테닌(β-Catenin), CDK4, 및/또는 ERBB2IP 중 하나 이상을 포함한다(예를 들어, 문헌[Landscape of Tumor Antigens in T Cell Immunotherapy, J Immunol December 1, 2015, 195 (11) 5117-5122; DOI: doi.org/10.4049/jimmuno1.1501657] 참조, 이는 이의 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용됨).
일부 실시형태에서, TAA는 B 세포 항원이다. 일부 실시형태에서, TAA는 흑색종 항원이다. 일부 실시형태에서, 흑색종 항원은 gp100이다.
TIL 요법
일부 실시형태에서, 입양 세포 요법은 TIL 요법을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. TIL 요법에서, 종양을 침투한 림프구는 대상체로부터 채취한 종양 생검으로부터 수확된다. 이들 림프구는 단리된 종양으로부터 직접 확장될 수 있다. 또 다른 방법에서, 림프구의 절제 후에, 종양으로부터 단리된 DNA는 신생항원을 나타내는 암에서 발견되는 돌연변이를 식별하도록 시퀀싱된다. 이어서, 돌연변이된 신생항원은 자가 수지상 세포에 삽입되어, 종양 침윤 림프구와 공-배양된다. 종양 침윤 림프구는 신생항원 인식에 대해서 검정된다. 이어서, 신생항원을 인식하는 이러한 종양 침윤 림프구가 확장되어, 대상체에게 다시 주입된다.
TCR 요법
일부 실시형태에서, 입양 세포 요법은 TCR 요법을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 입양 세포 요법은 TCR을 발현하는 조작된 세포를 포함하거나 또는 이로 이루어진 면역 효과기 세포를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
TCR 요법은 특정 TCR을 발현하도록 대상체의 또는 공여체의 면역 세포를 조작하는 것을 포함한다. TCR 요법에서, 면역 세포는 대상체의 또는 공여체의 혈액으로부터 수거된다. T 세포는 대상체의 암에 표적화된 새로운 T 세포 수용체를 발현하도록 유전자 변형된다, 예를 들어. T 세포는 수가 확장되어 대상체에게 다시 주입된다. TCR은 세포의 내부 또는 외부 상의 종양 특이적 단백질을 인식할 수 있다.
CAR 요법
일부 실시형태에서, 입양 세포 요법 조성물은 CAR을 발현하는 조작된 세포를 포함하거나 또는 이로 이루어진 면역 효과기 세포를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CAR은 세포외 결합 모이어티, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CAR은 세포외 결합 모이어티 및 세포내 도메인을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 세포외 결합 모이어티는 세포내 도메인에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된다.
CAR-T 요법에서, T 세포는 대상체의 또는 공여체의 혈액으로부터 수거되고, 키메라 항원 수용체를 발현하도록 유전자 변형된다. 이어서, 유전자 변형된 T 세포는 그 수가 확장되어 대상체에게 도로 주입된다. CAR 변형은 유전자 변형된 T 세포를 대상체의 암에 대해 표적화하고, 이러한 세포가 암에 제공되었을 때 공격하도록 당해 T 세포를 촉발시킨다. CAR, 및 CAR을 조작하고 세포에 도입하기 위한 방법은, 예를 들어, WO 200014257; WO 2013126726; WO 2012129514; WO 2014031687; WO 2013166321; WO 2013071154; WO 2013123061; WO 2014055668; WO 2014031687; WO2017112741; WO 2019213184; US 2002131960; US 2013287748; US 20130149337; 미국 특허 제6,410,319호; 제6,451,995; 7,070,995호; 제7,265,209호; 제7,354,762호; 제7,446,179호; 제7,446,190호; 제7,446,191호; 제8,252,592호; 제8,324,353호; 제8,339,645호; 제8,398,282호; 및 제8,479,118호; EP2537416; 문헌[Sadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75, Al; Kochenderfer et al., 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; 및 Brentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5(177)]에서 찾을 수 있고, 이들의 각각은 이들의 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다
일부 실시형태에서, CAR-T 요법은 T 세포 활성을 조절할 수 있다. 일부 실시형태에서, CAR-T 요법은 T 세포 분화 및/또는 항상성을 조절할 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포외 결합 모이어티 및 또는 모이어티는 항원에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원은 TAA 또는 TSA이다. 일부 실시형태에서, 항원은 폴리펩타이드를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 항원은 탄수화물 또는 기타 분자를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, TAA 또는 TSA는 B 세포 항원을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 항원은 CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Ig카파, Ig람다, CD79a, CD79b 또는 CD30을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 항원은 CD19를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, TAA 또는 TSA는 하나 이상의 TAA 및/또는 TSA를 포함한다. 일부 실시형태에서, TAA 및/또는 TSA는 MART-1, gp100, CEA, CD-19, NY-ES0-1, MAGE-A3, hTERT, EGFR, 메소텔린, HPV, EBV, MCC, Mum-1, β-카테닌, CDK4 및/또는 ERBB2IP를 포함하거나 또는 이로 이루어진다(예를 들어, 문헌[Landscape of Tumor Antigens in T Cell Immunotherapy, J Immunol December 1, 2015, 195 (11) 5117-5122; DOI: doi.org/10.4049/jimmuno1.1501657] 참조, 이는 이의 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용됨).
일부 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 하나 이상의 항체 또는 항체 단편이다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 서열번호 258에 제시된 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 항체 또는 항체 단편을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항체 단편은 항원에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원은 CD19이다.
일부 이러한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 Ig 분자의 부분을 함유하는 스페이서를 더 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, Ig 분자의 부분은 인간 Ig 분자를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, Ig 분자의 부분은 Ig 힌지를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, Ig 힌지는 IgG4 힌지를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
하나 이상의 세포외 결합 모이어티가 항원에 결합할 경우, 세포외 결합 모이어티 또는 모이어티들은 면역자극 또는 면역억제 신호, 예컨대, ITAM 또는 ITIM-전달 신호를, 세포에 전달함으로써, 질환 또는 병태에 표적화된 면역 반응을 촉진 또는 제한한다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 ITAM 또는 ITIM을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
막관통 도메인은 세포막에 걸쳐 있는 α-나선을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 수용체의 하나 이상의 도메인과 자연적으로 회합된다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD4, CD8α, CD28 및 CD3ζ로부터 유래된 막관통 도메인을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 T-세포 수용체, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CDS, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137(4-1BB), 또는 CD154의 알파, 베타 또는 제타 쇄를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
CAR은 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 CD3을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 인간 CD3 쇄를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 CD3ζ 신호전달 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 포함하거나 또는 이로 이루어진다(예를 들어, www.uniprot.org/uniprot/P20963.2 및 미국 특허 제7,446,190호 및 제8,911,993호 참조, 임의의 도면을 비롯하여 이들의 각각은 참조에 의해 본 명세서에 원용됨).
T 세포 활성화는 종종 또한 하나 이상의 공자극 도메인에 의해 매개된다. 일부 실시형태에서, CAR은 적어도 하나의 공자극 도메인을 더 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CAR은 CD28 또는 4-1BB 공자극 도메인을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CAR은 OX40(CD134), CD27, DAP10, DAP12 및/또는 ICOS의 막관통 도메인, 세포내 도메인 및/또는 공자극 도메인을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 막관통 도메인과 세포내 도메인 및/또는 공자극 도메인은 연결된다. 일부 실시형태에서, 세포내 도메인 및/또는 공자극 도메인은 올리고 또는 펩타이드 링커와 연결된다. 일부 실시형태에서, 링커는 2 내지 10개의 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 글리신 및/또는 세린을 포함한다. 일부 양상에서, 추가의 CAR은 동일한 조작된 세포에서 발현된다. 일부 실시형태에서, 추가의 CAR은 2차 또는 공자극 신호를 제공한다.
암
암의 경우, 본 발명의 항체는 일반적으로 약제학적으로 허용 가능한 투여 형태로 인간 또는 포유류 인간에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 암은 혈액암이다. 임의의 적합한 암은 본 명세서에서 제공되는 항체로 치료될 수 있다. 일부 실시형태에서, 암은 고형 암이다. 일부 실시형태에서, 암은 전이성 비소세포 폐암 (NSCLC), 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 다발성 골수종(MM), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 전이성 두경부 편평세포암종(HNSCC), 흑색종, 신장 세포 암종, 전이성 피부 편평세포암종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종(NHL), 및 DNA 불일치 복구 결함 또는 미소부수체 불안정성-높은 상태를 갖는 절제 불가능한 또는 전이성 고형 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 백금 요법 후 재발성 또는 진행성이다.
실시예
실시예 1: CAR 작제물
마우스 FMC63 항-CD19 scFv(JN Kochenderfer, SA Feldman, Y Zhao, H Xu, MA Black, RA Morgan, WH Wilson, SA Rosenberg. Construction and preclinical evaluation of an anti-CD19 chimeric antigen receptor. J Immunother 32, 689702 (2009), 이는 이의 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용됨)를 GM-CSF로부터의 신호전달 펩타이드, 힌지 영역, 막관통 도메인, CD28로부터의 공자극 도메인, 및 CD3ζ 활성화 도메인(CD19 CAR)을 함유하는 제2 세대 CAR 카세트에 삽입하였다. FLAG 태그(DYKDDDDK)를 scFv와 힌지 영역 사이의 CD19 CAR에 삽입하였다(CD19-FLAG CAR).
실시예 2: CAR-인코딩 렌티바이러스의 생성
CAR를 인코딩하는 DNA를 합성하고, Syno Biological(중국 베이징 소재)에 의해 제3세대 렌티바이러스 벡터인 Lenti CMV-MCS-EFla-puro로 서브클로닝하였다. 모든 CAR 렌티바이러스 작제물을 양방향으로 시퀀싱하여 CAR 서열을 확인하고, 렌티바이러스 생산에 사용하였다. 천만개의 성장-정지된 HEK293FT 세포(Thermo Fisher)를 T75 플라스크에 파종하고, 하룻밤 배양하고, 이어서 CalPhos Transfection 키트(Takara, 캘리포니아주 마운틴뷰 소재)를 사용하여 pPACKH1 렌티벡터 패키징 믹스(System Biosciences, 캘리포니아주 팰로앨토 소재) 및 10㎎의 각각의 렌티바이러스 벡터로 형질감염시켰다. 다음 날 배지를 신선한 배지로 교체하고, 48시간 후에 렌티바이러스 함유 배지를 수집하였다. 배지에서 2100g에서 30분 동안 원심분리에 의해 세포 파편을 제거하였다. 바이러스 입자를 112,000g에서 100분 동안 원심분리에 의해 수집하고, AIM V-AlbuMAX 배지(Thermo Fisher)에 현탁시키고, 분취하여, -80℃에서 냉동시켰다.
바이러스 제제의 역가는 Lenti-X qRT-PCR 키트(Takara) 및 7900HT 서멀 사이클러(thermal cycler)(Thermo Fisher)를 사용하여 정량적 RT-PCR에 의해 결정하였다. 렌티바이러스 역가는 1×108 pfu/㎖ 초과였다. 렌티바이러스는 승인된 생물안전성 수준-2 조절에 따라서 생성되고 사용되었다.
실시예 3: CAR-T 세포의 생성 및 확장
10% FBS 및 300 U/㎖ IL-2(Thermo Fisher)를 함유하는 AIM V 배지에서 1×106개 세포/㎖로 현탁된 인간 말초 혈액 연막(승인된 IRB 프로토콜에 따라서 Stanford University Blood Center에 의해 제공됨)으로부터 PBMC를 단리시키고, 동등한 수(1:1 비)의 CD3/CD28 Dynabeads(Thermo Fisher)와 혼합하고, 비처리된 24-웰 플레이트(웰당 0.5㎖)에서 배양하였다. 24 및 48시간에, 렌티바이러스를 1 tl의 TransPlus 형질도입 인핸서(AlStem)와 함께 5의 감염 다중도(MOI)로 배양물에 첨가하였다. 그 다음 2주에 걸쳐서 T 세포가 증식됨에 따라서, 세포를 2 내지 3일마다 계수하고, 300 U/ml IL-2가 포함된 신선한 배지를 배양물에 첨가하여 세포 밀도를 1 내지 3×106개 세포/㎖로 유지시켰다.
실시예 4: CAR-T 요법과 조합한 항-CD39 항체의 평가를 위한 이종이식 모델
6주령의 수컷 NSG 마우스(Jackson Laboratories, 메인주 바 하버 소재)를 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에 따라서 엄격하게 수용하고 조작하였다. 0일째에 (n=10 마우스/군, 총 3개군) 마우스에게 5×105개의 루시페라제 발현 Raji 세포를 이식하였다. 이식 2일 후, 비처리 마우스는 I.V. 볼루스의 PBS를 공급받은 반면, CAR-T 세포를 받은 군은 꼬리 정맥 주사에 의해 5×106개의 항-CD19 CD28-CD3ζ CAR-T 세포를 공급받았다.
CAR-T 세포의 투여 후 2일째에, 비처리 마우스에게 PBS를 복강내 투여하였다. CAR-T 처리된 마우스의 하나의 군은 huIgG4 아이소타입 대조군의 250㎍ 복강내 용량을 공급받았고, CAR-T 처리된 마우스의 시험군은 항-CD39 항체(TTX-030)의 250㎍ 복강내 용량을 공급받았다. PBS 또는 250㎍의 항체의 복강내 용량을 나머지 연구 동안 7일마다 투여하였다.
종양-이식 후 종양 진행은, D-루시페린 기질의 복강내 주사 후, IVIS 스펙트럼(Xenogen) 영상기를 사용한 종양 발광성의 총 플럭스 측정에 의해 정량화하였다. 유세포분석은 표시된 시간에 연구 동안 수행되었다. 61일째 연구 종료 시에, 혈액, 조직 및 골수를 수집하였다. 간, 비장, 림프절 및 신장 샘플로부터 메시 스트레이너(mesh strainer)를 통과시킴으로써 단일 세포 현탁액을 제조하였다. 골수를 2 ㎎/㎖ 콜라게나제 D 용액으로 37℃에서 30분 동안 처리하였다.
세포를 염색하기 전에 PBS로 세척하였다. 혈액을 FAC 튜브로 옮기고 적혈구를 실온에서 10분 동안 신선한 염화암모늄 RBC 용해 완충액에 용해시켰다. 세포를 원심분리에 의해 펠렛화하고, FACS 완충액(PBS + 2% FBS + 2mM EDTA)으로 1회 세척하였다. 샘플을 정상 마우스 혈청 또는 래트 항-마우스 FcBlock(BD) 및 인간 혈청을 사용하여 5분 동안 차단하고, 이어서 항-CD4(Biolegend RPA-T4), 항-CD8a(Biolegend RPA-T8), 7AAD(Biolegend) 및 항-CD3(Biolegend OKT3)로 30분 동안 염색하고, 2회 세척하고 FACSCalibur(BD) 상에 획득하였다.
결과는 도 2, 도 3, 도 4 및 도 5에서 볼 수 있다. 도 2는, 마우스 이종이식 모델에서 CAR-T 세포로의 치료 동안 항-CD39 항체의 투여가 CAR-T 세포 확장 단계 및 지속 단계를 포착하는 여러 연구 시점에서 유세포분석에 의해 측정된 바 혈액 중 CD4+, CD8+ 및 CD3+ T 세포의 백분율을 증가시키는 것을 나타낸다. 백분율은 개체로부터 표시되고, 평균 백분율은 ±SEM으로 나타낸다. 통계는 언페어드 t-검정(p* < 0.05, p** < 0.005, p*** < 0.001)에 의해 결정되었다. 도 3은, 마우스 이종이식 모델에서 CAR-T 세포로의 치료 동안 항-CD39 항체의 투여가 유세포분석에 의해 측정된 바 제61일째 연구 종료 시 말초 기관에서 CD4+, CD8+ 및 CD3+ T 세포의 생착을 증가시키는 것을 나타낸다. 백분율은 개체로부터 표시되고, 평균 백분율은 ±SEM으로 나타낸다. 통계는 언페어드 t-검정(p* < 0.05, p** < 0.005, p*** < 0.001)에 의해 결정되었다. 도 4는 생물발광 플럭스(p/s)로 정량된 바 항-CD39 항체와 조합하여 CAR-T로 치료된 군에서 루시페라제 발현 Raji 종양 세포를 사용한 마우스 이종이식 모델에서 감소된 종양 부담을 나타낸다. (A)는 플로팅된 개체 동물 플럭스 측정치를 나타내고, (B)는 기하학적 군 평균±SEM 플럭스 측정치를 나타낸다. 플럭스 > 5E7(p/s)로 결정된 바와 같은 종양 재발은 각 치료 집단에 대해서 하기와 같이 나타낸다(10/10의 비처리 마우스, 6/10의 CAR-T + 아이소타입 대조군 치료 마우스 및 3/10의 CAR-T + 항-CD39 항체가 종양 재발을 경험하였다). 도 5는 항-CD39 항체와 조합하여 CAR-T로 처리된 군에서 루시페라제 발현 Raji 종양 세포를 사용한 마우스 이종이식 모델의 IVIS 영상화를 통해 감소된 전체 종양 부담을 묘사한다. 비처리된 마우스는 제14일 후에 종양 부담으로 인해 연구에서 제거된 한편, 두 CAR-T 요법 처리된 군에서의 마우스는 완전한 연구 동안 영상화되었다.
실시예 5: 항-CD39 항체와 조합한 종양 항원 특이적 CD8+ T 세포 입양 세포 전달의 동계 B16F10 모델
6주령 내지 8주령의 암컷 C57BL6(Charles River Laboratories) 마우스를 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 따라서 엄격하게 수용하고 조작하였다. -8일째에, (n=15 마우스/군, 총 3개 군) 마우스에게 1.5×105 B16F10 세포를 피부내에 이식하였다. -1일(이식 후 7일)째에, 실험군은 입양 전달 전에 컨디셔닝 양생으로서 250 ㎎/㎏ 용량의 사이클로포스파마이드를 공급받았다. 다음 날, 0일째에, 실험군은 꼬리 정맥 주사에 의해 1×106개의 Pmel-1 CD8+ T 세포의 입양 전달을 받았다.
입양 전달을 위한 항원 특이적 CD8+ T 세포를 생성하기 위하여, 비장세포를 Pmel-1 마우스(Jackson Laboratories)로부터 단리시키고, 1μM의 hgp10025-33 펩타이드로 16시간 동안 자극하였다. 이어서, Pmel-1 CD8+ T 세포를 MACS CD8a+ T 세포 분리 키트(Miltenyi)를 사용하여 정제하고, PBS로 세척하였다. 0일째에 시작하여, 비처리 마우스에게 PBS를 복강내 투여한 반면, 입양 세포 요법 처리된 마우스의 대조군은 mIgG1 아이소타입 대조군의 250㎍의 복강내 용량을 받았고, 입양 세포 요법 처리된 마우스의 시험군은 항-CD39 항체(B66)의 250㎍의 복강내 용량을 받았다.
PBS 또는 250㎍의 항체의 복강내 용량은 나머지 연구 동안 주당 2회 투여하였다. 종양-이식 후 종양 진행은 캘리퍼스 측정에 의해 정량화하였다. 유세포분석은 7일째 연구 동안 또는 입양 전달 후 35일째 연구 종료 시에 코호트(n=5 마우스/군)에서 수행하였다. 마우스를 인도적으로 안락사시키고, 혈액, 조직 및 종양을 수집하였다. 비장, 림프절 및 종양 샘플로부터 메시 스트레이너를 통과시킴으로써 단일 세포를 준비하였다. 세포를 염색 전에 PBS로 세척하였다. 혈액을 FAC 튜브로 옮기고, 적혈구를 실온에서 10분 동안 신선한 염화암모늄 RBC 용해 완충액에 용해시켰다. 세포를 원심분리에 의해 펠릿화하고, FACS 완충액(PBS + 2% FBS + 2mM EDTA)으로 2회 세척하였다. 샘플을 래트 항-마우스 FcBlock(BD) 및 인간 혈청으로 20분 동안 차단하고, 이어서 항-CD4(Biolegend GK1.5), 항-CD8a(Biolegend 53-6.7), 항-CD45(Biolegend 30-F11), 넌-크로스 블로킹(non-cross blocking) 항-CD39(Biolegend Duha59), 항-Thy1.1(Biolegend OX-7), 항-Vβ13(Invitrogen MR12-3), 항-Ki67(BD B56) 및 항-CD3(BD 17A2)로 30분 동안 염색하고, 2회 세척하고, FACSCalibur(BD) 상에서 획득하였다.
결과는 도 6 및 도 7에서 볼 수 있다. 도 6(A)는 림프절에서의 항원 제시 부위에서 입양 전달된 항원 특이적 CD8+ T 세포(상부) 및 내인성 CD8+ T 세포(하부)의 증식이 Ki67 염색에 의해 측정된 바 항-CD39 항체에 의한 처리에 의해 증대되는 것을 나타낸다. 도 6(B)는 CD39 염색에 의해 측정된 바 항-CD39 항체에 의한 처리를 통해 림프절에서의 입양 전달된 항원 특이적 CD8+ T 세포(상부) 및 내인성 CD8+ T 세포(하부)의 개선된 조기 활성화를 입증한다.
실시예 6: B66 항체 생성
뮤린 CD39에 대한 B66 항체는 WT 스프라그 돌리(Sprague Dawley) 래트의 면역화에 이어서 하이브리도마의 스크리닝을 통해 발견되었다. 적중(hit)은 마우스 IgG1로부터 유래된 Fc 영역을 갖는 항체로서 생성되었고, 재조합 mCD39 세포외 도메인(R&D Systems, cat. #4398-EN)에 대한 또는 CD39를 내인성으로 발현하는 마우스 세포에 대한 결합에 대해 확인되었다. D265A 변이체는 QuikChange 부위-지정 돌연변이유발(Agilent)을 사용하여 생성되었다. 항-인간 CD39(TTX-030)는 인간 Fab 라이브러리를 사용한 효모 디스플레이를 통해 사전에 생성되었고 표준 기술에 의해 발현되었다(예를 들어, WO/2019/027935 참조, 이는 이의 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용됨).
유의성은 언페어드 t-검정에 의해 GraphPad Prism 8.0.1 소프트웨어를 사용하여 결정하였다.
실시예 7: CD39에 결합하는 항체의 선택
CD39 항체는, 예컨대, W02009036379; W02010105256; W02012009568; 및 문헌[Xu et al., Protein Eng. Des. Sel., 2013, 26:663-670](각각 전문이 참조에 의해 원용됨)에 일반적으로 기재된 바와 같이 그리고 보다 구체적으로 아래에 제공된 바와 같이 IgG 포맷으로 효모 세포의 표면에 제시된 인간 항체의 합성 라이브러리로부터 선택하였다. 재조합 라이브러리로부터 단리된 ABP의 서열 및 특성은 표 S에 제공되어 있다.
-10E+09 다양성의 8가지 미경험 인간 합성 효소 라이브러리를 W02009036379; W02010105256; W02012009568; 및 문헌[Xu et al., Protein Eng. Des. Sel., 2013, 26:663-670]에 기재된 바와 같이 번식시켰으며; 이들 각각은 전문이 참조에 의해 원용된다. 처음 두 라운드의 선택을 위하여, 문헌[Siegel et al., J. Inununol. Meth., 2004, 286:141-153]에 기재된 바와 같이 Miltenyi MACS® 시스템을 이용한 자기 비드 분류 기술을 수행하였다. 다음 라운드의 선택은 유세포분석 기반 분류를 사용하여 수행하였다. 모든 라운드의 선택을 위하여, 항원은 바이오티닐화된 인간 CD39 세포외 도메인(이하 "ECD")이었고, 감소하는 농도의 항원을 각각의 후속 라운드의 선택에 사용하였다. 항원에 대한 선택에 부가하여, 일부 라운드의 선택은 CHO 세포로부터의 가용성 막 단백질을 이용하는 비특이적 결합제의 수를 저감시키기 위하여 사용되었다(W02014179363 및 문헌[Xu et al., Protein Eng. Des. Sel., 2013, 26:663-670] 참조, 각각 전문이 참조에 의해 원용됨). 최종 라운드의 분류 후, 효모를 플레이팅하고, 특성규명을 위하여 그리고 친화도 성숙을 위한 클론의 지명을 위하여 개별 콜로니를 선택하였다.
숙주 세포에서 일시적 발현을 최대화하기 위한 코돈 최적화를 갖는 관심 항체 가변 도메인을 합성하였다. 가변 영역을 인간 면역글로불린 불변 도메인을 함유하는 발현 벡터에 클로닝하고 이들의 서열을 확인하였다. 항체 중쇄 및 경쇄 벡터 쌍을 Expifectamine 시스템(Invitrogen)을 사용하여 Expi293 세포로 형질감염시켰다. 일시적 배양물을 4일째에 수거하고, 청징화된 세포 배양 상청액 IgG 역가를 표준품과 함께 Octet(ForteBio)를 사용한 생물층 간섭계(Bio Layer Interferometry: BLI)를 사용하여 추정하였다. 후속하여, 항체를 Protein A 칼럼 상에서 정제하고 저 pH 글리신을 사용하여 용리시켰다. 이어서, 정제된 항체 샘플을 완충액-교환하거나 다운스트림 검정-상용성 완충액으로 투석하였다.
항체 순도는 SDS-PAGE 및 분석용 크기 배제 크로마토그래피 칼럼에서 샘플을 실행함으로써 평가하였다.
경쇄 셔플링: 중쇄 플라스미드를 (본 명세서에 기재된) 미경험 산출물로부터 추출하고 10E+06의 다양성을 갖는 사전-제작된 미경험 경쇄 라이브러리로 형질전환시켰다. 각각의 라운드에 대해 감소하는 양의 바이오티닐화된 ECD 항원을 사용하여 한 라운드의 MACS 분류 및 세 라운드의 FACS 분류로 위에서 기재된 기술한 바와 같이 선택을 수행하였다. 일차 발견 과정으로부터의 선택된 개별 중쇄를 또한 10E+06의 다양성을 갖는 별도의 사전-제작된 경쇄 라이브러리에 독립적으로 형질전환시켰으며, 각 라운드에 대해 감소하는 양의 바이오티닐화된 ECD 항원을 사용하여 한 라운드의 MACS 분류 및 세 라운드의 FACS 분류로 위에서 기재된 바와 같이 선택을 수행하였다.
실시예 8: 친화도 성숙
미경험 클론의 최적화는 3가지 성숙 전략, 즉, CDR-H1 및 CDR-H2의 다양화; CDR-H3의 다양화; CDR-L1, L2 및 L3의 다양화; 다양화된 중쇄 및 경쇄의 셔플링을 이용하여 수행하였다.
CDR-H1 및 CDR-H2 선택: 각각의 경쇄 배취 다양화, 경쇄 다양화 및 미경험 발견 노력으로부터 선택된 클론으로부터의 CDR-H3을 10E+8 초과의 다양성의 CDR-H1 및 CDR-H2 변이체를 갖는 사전 제작된 라이브러리로 독립적으로 재조합하였으며 선택은 ECD 항원을 사용하여 수행하였다. 친화도 압력은 감소하는 농도의 항원을 사용함으로써 적용하였다.
CDR-H3 선택: CDR-H1 및 CDR-H2 선택 절차로부터 얻어진 클론을 중쇄의 워킹 이량체(walking dimer) 돌연변이유발을 통해 추가 라운드의 친화도 성숙에 적용하였다. 선택은 일반적으로 위에서 기재된 바와 같이 ECD를 항원으로 사용하지만 모든 선택 라운드에 대해 FACS 분류를 사용하는 것을 추가하여 수행하였다.
CDR-L1, L2, L3 선택: CDR-H1 및 CDR-H2 선택 절차로부터 얻어진 클론을 경쇄의 돌연변이유발을 통해 추가 라운드의 친화도 성숙에 적용하였다. CDR-L1 및 CDR-L2 다양성은 사전-제작된 라이브러리로부터 유래된 반면 CDR-L3 다양성은 워킹 이량체 돌연변이유발로부터 유래되었다. 선택은 일반적으로 위에서 기재된 바와 같이 ECD를 항원으로서 사용하지만 모든 선택 라운드에 대해 FACS 분류를 사용하고, 본 명세서에 기재된 CDR-L1, L2, L3 공정에서 한 라운드의 MACS에 이어 세 라운드의 FACS를 사용하는 것을 추가하여 수행하였다.
다양화된 중쇄 및 경쇄 셔플링: 위에서 기재된 중쇄 다양화 및 경쇄 다양화로부터의 산출물을 재조합하였으며, 선택은 일반적으로 위에서 기재된 바와 같이 ECD를 항원으로서 사용하지만 모든 선택 라운드에 대해 FACS 분류를 사용하는 것을 추가하여 수행하였다.
실시예 S: 서열
표 S는 본 명세서에서 언급된 서열들을 제공한다.
표 S 서열.
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Figure pct00033
Figure pct00034
등가물
위에서 제시된 개시내용은 독립적인 유용성을 갖는 다수의 별개의 발명을 포괄할 수 있다. 이들 각각의 본 발명이 이의 바람직한 형태(들)로 개시되었지만, 본 명세서에 개시되고 예시된 바와 같은 이의 구체적인 실시형태는 많은 변형이 가능하기 때문에 제한적인 의미로 간주되지 않아야 한다. 본 발명의 주제는 본 명세서에 개시된 다양한 요소, 특징, 기능 및/또는 특성의 모든 신규하고 뻔하지 않은 조합 및 하위조합을 포함한다. 하기 청구범위는 특히 신규하고 뻔하지 않은 것으로 간주되는 특정 조합 및 하위조합을 가리킨다. 특징, 기능, 요소 및/또는 특성의 다른 조합 및 하위조합으로 구현된 발명은 본 출원에서, 본 출원의 우선권을 주장하는 출원에서 또는 관련 출원에서 특허청구될 수 있다. 이러한 청구범위는, 상이한 발명에 또는 동일한 발명에 관한 것이든, 그리고 원래의 청구범위와 비교하여 범위가 더 넓거나, 좁거나, 동등하거나, 상이하거나 간에, 본 개시내용의 발명의 주제 내에 포함되는 것으로 또한 간주된다.
SEQUENCE LISTING <110> TRISHULA THERAPEUTICS, INC. <120> COMBINATION THERAPY INVOLVING ANTI-CD39 ANTIBODIES AND ADOPTIVE CELL THERAPY <130> 1107385-00043 <140> PCT/US2021/025661 <141> 2021-04-02 <150> US 63/005,099 <151> 2020-04-03 <160> 314 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1 Ser Tyr Tyr Met His 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Ser Tyr Glu Met His 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Ser Tyr Gln Met His 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Ser Tyr Tyr Met Tyr 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 5 Ser 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 164 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Phe Thr Asp Tyr Ser Ser Gly Tyr Ser Ser Gly Trp Thr 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 165 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 165 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 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Sequence: Synthetic polypeptide <400> 171 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Thr Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Gly Gly Tyr Gln His His Tyr Phe Asp Leu Trp Gly 100 105 110 Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 172 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 172 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ser Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala 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<400> 180 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Tyr Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 181 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 181 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ala Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg His Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 188 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Phe Ser 20 25 30 Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Leu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 189 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 189 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Arg Ser Val Leu Phe Ser 20 25 30 Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 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Synthetic polypeptide <400> 191 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Lys Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Asn Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Leu Leu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 192 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 192 Gly Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Phe Ser 20 25 30 Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe 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Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 314 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 314 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Ala Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Tyr His Leu Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Trp Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210

Claims (49)

  1. 치료용 조성물로서, CD39에 결합하는 항체 및 입양 세포 요법 조성물을 포함하는, 치료용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 입양 세포 요법 조성물은 NK 세포, T 세포, NKT 세포, 수지상 세포, 대식세포, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 또는 이들의 조합을 포함하는, 치료용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 입양 세포 요법 조성물은 이종성 T 세포 수용체(T cell receptor: TCR) 및/또는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor: CAR)를 발현하는 조작된 세포를 포함하는, 치료용 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 조작된 세포는 T 세포인, 치료용 조성물.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 조작된 세포는 종양-연관 항원(tumor-associated antigen: TAA)에 특이적으로 결합하는 세포외 결합 모이어티를 포함하는 CAR를 발현하는, 치료용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 TAA는 B 세포 항원인, 치료용 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 CAR은 항-CD19 결합 모이어티를 포함하는, 치료용 조성물.
  8. 제5항에 있어서, 상기 TAA는 흑색종 항원인, 치료용 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 흑색종 항원은 gp100인, 치료용 조성물.
  10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAR은 세포외 결합 모이어티, 막관통 도메인, 및 림프구의 활성화 및/또는 증식을 촉발시키는 세포내 도메인을 포함하는, 치료용 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 세포내 도메인은 CD3 신호전달 도메인을 포함하는, 치료용 조성물.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 CAR은 적어도 하나의 공자극 도메인을 더 포함하는, 치료용 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 CAR은 CD28 또는 4-1BB 공자극 도메인을 포함하는, 치료용 조성물.
  14. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 조작된 세포는 상기 이종성 TCR을 발현하는, 치료용 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 이종성 TCR은 TAA에 특이적으로 결합하는, 치료용 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 TAA는 흑색종 항원인, 치료용 조성물.
  17. 제16항에 있어서, TAA는 gp100인, 치료용 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 이종성 TCR은 pmel-1 TCR인, 치료용 조성물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 입양 세포 요법 조성물은 CD8+ T 세포를 포함하는, 치료용 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD39에 결합하는 항체는 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하되, 상기 VH 및/또는 VL은 함께 하기 중 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개를 포함하는, 치료용 조성물:
    (a) 서열번호 1 내지 21 또는 서열번호 259 내지 263 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VHCDR1,
    (b) 서열번호 24 내지 42 또는 서열번호 265 내지 269 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VHCDR2,
    (c) 서열번호 45 내지 72 또는 서열번호 271 내지 275 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VHCDR3,
    (d) 서열번호 75 내지 89 또는 서열번호 277 내지 281 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VLCDR1,
    (e) 서열번호 92 내지 107 또는 서열번호 283 내지 287 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VLCDR2 및
    (f) 서열번호 110 내지 135 또는 서열번호 289 내지 293 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VLCDR3.
  21. 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서,
    (a) 상기 대상체에게 입양 세포 요법 조성물을 투여하는 단계; 및
    (b) 항-CD39 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편을 동시에 또는 순차적으로 투여하는 단계
    를 포함하되, 상기 방법은 (b) 전에 (a)를 수행하는 것, (a) 전에 (b)를 수행하는 것, (a)와 (b)를 동시에 수행하는 것, 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 방법은 상기 입양 세포 요법 조성물을 투여하는 단계 및 (b)를 수행하기 전에 상기 조성물의 세포가 상기 대상체의 표적 세포 또는 조직으로 이동하는 것을 기다리는 단계를 포함하는, 방법.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 단계 (b)는 치료적 유효량의 상기 항-CD39 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편을 투여 일정으로 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 투여 일정은 상기 치료적 유효량의 상기 항-CD39 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편을 매주, 월 2회, 매월, 또는 2개월마다 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 치료적 유효량의 상기 입양 세포 요법 조성물을 투여하는 적어도 하나의 추가의 단계를 더 포함하는, 방법.
  26. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 입양 세포 요법 조성물은 NK 세포, T 세포, NKT 세포, PBMC, 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  27. 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 입양 세포 요법 조성물은 이종성 TCR 및/또는 CAR을 발현하는 조작된 세포를 포함하는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 조작된 세포는 T 세포인, 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 조작된 세포는 TAA에 특이적으로 결합하는 세포외 결합 모이어티를 포함하는 CAR을 발현하는, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 TAA는 B 세포 항원인, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 CAR은 항-CD19 결합 모이어티를 포함하는, 방법.
  32. 제29항에 있어서, 상기 TAA는 흑색종 항원인, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 흑색종 항원은 gp100인, 방법.
  34. 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAR은 상기 세포외 결합 모이어티, 막관통 도메인, 및 림프구의 활성화 및/또는 증식을 촉발시키는 세포내 도메인을 포함하는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 세포내 도메인은 CD3 신호전달 도메인을 포함하는, 방법.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 CAR은 적어도 하나의 공자극 도메인을 더 포함하는, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 CAR은 CD28 또는 4-1BB 공자극 도메인을 포함하는, 방법.
  38. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 조작된 세포는 상기 이종성 TCR을 발현하는, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 이종성 TCR은 TAA에 특이적으로 결합하는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 TAA는 흑색종 항원인, 방법.
  41. 제39항에 있어서, 상기 TAA는 gp100인, 방법.
  42. 제40항에 있어서, 상기 이종성 TCR은 pmel-1 TCR인, 방법.
  43. 제21항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 입양 세포 요법 조성물은 CD8+ T 세포를 포함하는, 방법.
  44. 제21항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD39에 결합하는 항체는 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하되, 상기 VH 및/또는 VL은 함께 하기 중 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개를 포함하는, 방법:
    (a) 서열번호 1 내지 21 또는 서열번호 259 내지 263 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VHCDR1,
    (b) 서열번호 24 내지 42 또는 서열번호 265 내지 269 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VHCDR2,
    (c) 서열번호 45 내지 72 또는 서열번호 271 내지 275 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VHCDR3,
    (d) 서열번호 75 내지 89 또는 서열번호 277 내지 281 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VLCDR1,
    (e) 서열번호 92 내지 107 또는 서열번호 92 내지 107 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VLCDR2 및
    (f) 서열번호 110 내지 135 또는 서열번호 289 내지 293 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VLCDR3.
  45. 입양 세포 요법 조성물을 제조하는 방법으로서,
    (a) 제1 세포 집단을 제공하는 단계; 및
    (b) 항-CD39 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편의 존재 하에 입양 세포 요법을 위하여 치료적 유효량의 세포를 생성하는 데 충분한 조건 하에 상기 제1 세포 집단을 배양하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 제1 세포 집단은 입양 세포 요법 치료를 필요로 하는 대상체 또는 공여체로부터 얻어진 세포를 포함하는, 방법.
  47. 제45항에 있어서, 상기 제1 세포 집단은 공여체 대상체로부터 얻어진 세포를 포함하고, 상기 입양 세포 요법 조성물은 수용체 대상체(recipient subject)의 치료를 위하여 생성된 세포를 포함하는, 방법.
  48. 제45항에 있어서, 상기 방법은 상기 제1 세포 집단 또는 이의 부분을 조작하는 단계 및/또는 제2 세포 집단 또는 이의 부분을 조작하는 단계를 더 포함하되, 상기 제2 세포 집단은 단계 (b) 전에 또는 동안에 상기 제1 세포 집단을 확장시킴으로써 생산되고, 상기 조작하는 단계 중 어느 하나는 CAR 또는 이종성 TCR을 발현하도록 상기 세포를 유전자 변형시키는 것을 포함하는, 방법.
  49. 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-CD39 항체는 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하되, 상기 VH 및/또는 VL은 함께 하기 중 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개를 포함하는, 방법:
    (a) 서열번호 1 내지 21 또는 서열번호 259 내지 263 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VHCDR1,
    (b) 서열번호 24 내지 42 또는 서열번호 265 내지 269 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VHCDR2,
    (c) 서열번호 45 내지 72 또는 서열번호 271 내지 275 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VHCDR3,
    (d) 서열번호 75 내지 89 또는 서열번호 277 내지 281 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VLCDR1,
    (e) 서열번호 92 내지 107 또는 서열번호 283 내지 287 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VLCDR2 및
    (f) 서열번호 110 내지 135 또는 서열번호 289 내지 293 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 VLCDR3.
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