WO1998047914A2 - Us6 gen aus dem humanen cytomegalovirus (hcmv) - Google Patents

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WO1998047914A2
WO1998047914A2 PCT/EP1998/002225 EP9802225W WO9847914A2 WO 1998047914 A2 WO1998047914 A2 WO 1998047914A2 EP 9802225 W EP9802225 W EP 9802225W WO 9847914 A2 WO9847914 A2 WO 9847914A2
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Hartmut Hengel
Ulrich Koszinowski
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Roche Diagnostics Gmbh
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    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C12N2710/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the invention relates to a gene from the human cytomegalovirus (HCMV), a polypeptide encoded thereby, an antibody directed against the polypeptide and the pharmaceutical application of the nucleic acid, the polypeptide and the antibody.
  • HCMV human cytomegalovirus
  • T cells that express oiss receptors specialize in the detection of peptides presented by MHC-encoded molecules. Proteins that are synthesized during viral gene expression are degraded in the cytosol by the proteasome. Then peptides are assembled using transporter molecules (TAP) with the heavy MHC class I chain and 32 microglobulin to form a trimeric complex (MJ Androlewicz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 ( 1993) 9130; JJ Neefjes et al. Science 261 (1993) 769; T.
  • TAP transporter molecules
  • This complex is then transported from the endoplasmic reticulum (ER) through the ER-Golgi-Intermediate Compartment (ERGIC) / cis-Golgi network, the middle Golgi and the Trans-Golgi (TGN) network to the plasma membrane, where the MHC complex presents the peptide for cytotoxic CD8 T cells.
  • ER endoplasmic reticulum
  • ERGIC ER-Golgi-Intermediate Compartment
  • TGN Trans-Golgi
  • DNA viruses such as smallpox viruses, herpes viruses and adenoviruses, contain genes which inhibit the development of an inflammatory reaction by influencing the complement cascade and by interaction with cytokines and interferons (Smith, Trends in Microbiol. 2 (1994), 81-88). These genes seem to lary genes of the respective host, and their potential function can be predicted by sequence homology.
  • viruses can also influence the antigen presentation via the MHC class I mechanism by acting on proteins which are involved in the antigen presentation. No cellular homologs have yet been found for these viral genes. There is therefore a particular interest in them because they can point to previously unknown functions in cell biology.
  • CMV Cyotmegaloviruses
  • IE very early
  • E early
  • L late
  • Cytomegaloviruses have developed specific functions to escape the cellular immune response.
  • HCMV human CMV
  • MCMV mouse CMV
  • the protein ICP47 (McGeoch et al., J. Mol. Biol. 181 (1985), 1-13) is known from the herpes simplex virus type I and also inhibits the antigen presentation by MHC class I molecules (York et al ., Cell. 77 (1994), 525-535; Frueh et al. Nature 375 (1995), 415-418).
  • the protein ICP47 acts as an inhibitor of peptide transport proteins (TAP).
  • TAA peptide transport proteins
  • E3 / 19K is known from adenoviruses, which binds the heavy chains of MHC class I transplantation antigens from humans and mice (cf. e.g.
  • the protein E3 / 19K shows a direct association with MHC class I molecules from humans, mice and rats, whereby the intracellular transport and the expression on the cell surface are strongly inhibited.
  • the object of the present invention was to identify new genes which influence the antigen presentation by MHC I molecules and thus act as immunomodulators.
  • the invention describes the identification, cloning and characterization of a gene from human cytomegalovirus, which is designated as US6 and which codes for a new polypeptide.
  • This gene was identified by transfection in mammalian cells as an inhibitor of MHC expression.
  • the gene product of the US6 gene significantly inhibits the surface expression of MHC I molecules.
  • the US6 gene, the polypeptide encoded therefrom and antibodies directed against the polypeptide are suitable as diagnostic, therapeutic or preventive agents for diseases which are directly or indirectly associated with disorders of the MHC class I antigen presentation on the cell surface.
  • the gene and the polypeptide are suitable as immunomodulators for gene therapy.
  • the present invention relates to a nucleic acid which codes for a polypeptide which influences the MHC class I antigen presentation, comprising:
  • the in SEQ ID No. The nucleotide sequence shown in Figure 1 contains an open reading frame of 549 bp which corresponds to a polypeptide with a length of 183 amino acids.
  • the amino acid sequence of this polypeptide is shown in SEQ ID No. 2 shown.
  • the polypeptide is a type I transmembrane glycoprotein with a calculated molecular mass of 21 kDa.
  • the invention also comprises a nucleotide sequence which hybridizes with one of the aforementioned sequences.
  • hybridization according to the present invention is used as in Sambrook et al.
  • the nucleic acid according to the invention is preferably not associated with other protein-coding nucleic acid sections from HCMV. Furthermore, the nucleic acid according to the invention is preferably operatively linked to an expression control sequence which is active in eukaryotic cells, in particular in mammalian cells.
  • the nucleotide sequence according to the invention is preferably a DNA. However, it can also comprise an RNA or a nucleic acid analog, such as a peptide nucleic acid.
  • the nucleic acid according to the invention particularly preferably comprises a sequence which corresponds to the sequence shown in SEQ ID No. 1 nucleotide sequence shown and preferably the luminal portion thereof has a homology of more than 80%, preferably as 90% and particularly preferably more than 95%.
  • a modified nucleic acid according to the invention or a nucleic acid analogue according to the invention contains at least one 12 base, preferably at least 15 base long section of the nucleic acid sequence as previously indicated.
  • Such substances are suitable as hybridization probes, antisense molecules or catalytically active ribozymes.
  • Another object of the present invention is a polypeptide encoded by a nucleic acid as indicated above.
  • This polypeptide preferably has
  • Nucleic acids according to the invention are obtainable from cytomegaloviruses, in particular from human cytomegaloviruses. You can use known techniques using short sections of the procedure described in SEQ ID No. 1 nucleotide sequence shown as hybridization probes and / or primers can be isolated by known methods. Furthermore, nucleic acids according to the invention can be produced by mutagenesis from naturally occurring nucleic acids or by chemical synthesis. In chemical synthesis, modified nucleotide building blocks can optionally be used instead of the usual nucleotide building blocks. Nucleic acids which consist partially or completely of modified nucleotide building blocks or nucleic acid analogs such as peptide nucleic acids whose base sequence corresponds to a nucleic acid according to the invention can be used, for example, as therapeutic agents.
  • Another object of the present invention is a recombinant vector which contains at least one copy of a nucleic acid according to the invention.
  • This vector can be any prokaryotic or eukaryotic vector on which the nucleic acid according to the invention is under the control of an expression signal (promoter, operator, enhancer etc.).
  • prokaryotic vectors are chromosomal vectors such as bacteriophages and extrachomosomal vectors such as plasmids, circular plasmid vectors being particularly preferred.
  • Suitable prokaryotic vectors are e.g. B. Sambrook et al. , Supra, chap. 1-4.
  • the vector according to the invention is particularly preferably a eukaryotic vector, in particular a vector for mammalian cells.
  • Particularly preferred vectors are vectors suitable for gene therapy, such as retroviruses, modified adenoviruses or adeno-associated viruses.
  • retroviruses such as retroviruses, modified adenoviruses or adeno-associated viruses.
  • retroviruses such as retroviruses, modified adenoviruses or adeno-associated viruses.
  • Such vectors are Expert in the field of molecular biology and gene therapy. In particular, Sambrook et al. , supra, chap. 16 on Kriegler, M.; Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual; Freeman and Company (NY) 1990 and on Vos, IMH; Viruses in human gene therapy; Caroline Academic Press, referenced in 1995.
  • the invention also relates to muteins, variants and fragments thereof. These are to be understood as sequences which differ from the one shown in SEQ ID no. By substitution, deletion and / or insertion of individual amino acids or short amino acid segments. 2 differentiate amino acid sequence shown.
  • variant includes both naturally occurring variations in individual virus strains and proteins generated by recombinant DNA technology (in particular in vitro mutagenesis with the aid of chemically synthesized oligonucleotides) which are capable of presenting the antigen of MHC class I molecules to affect the surface of cells.
  • This term also includes chemically modified polypeptides which are attached to the termini and / or reactive amino acid side groups by acylation, e.g. B. acety- lation, or amidation are modified.
  • Another object of the present invention is a cell which is transformed or transfected with a nucleic acid according to the invention or a vector according to the invention.
  • the cell can be both a eukaryotic and a prokaryotic cell. Methods for transforming cells with nucleic acids are state of the art and therefore need not be explained in more detail. Examples of particularly preferred cells are eukaryotic cells, in particular animal cells and particularly preferably mammalian cells.
  • the present invention also relates to the use of the polypeptide according to the invention or fragments of this polypeptide as an immunogen for the production of antibodies. Antibodies can be produced in a customary manner by immunizing experimental animals with the complete polypeptide or fragments thereof and then obtaining the resulting polyclonal antisera.
  • monoclonal antibodies can be obtained from the antibody-producing cells of the test animals in a known manner by cell fusion. Human monoclonal antibodies can also be produced by known methods. Recombinant US6 protein or peptide fragments thereof are preferred as the immunogen.
  • Another object of the present invention is thus an antibody against the US6 protein or a variant thereof, preferably an antibody that shows no cross-reaction with other CMV-encoded proteins.
  • the antibody is particularly preferably directed against the entire polypeptide or against a peptide sequence which corresponds to amino acids 20 to 29 of the sequence shown in SEQ ID No. 2 corresponds to the amino acid sequence shown.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition which contains, as active components, nucleic acids, modified nucleic acids or nucleic acid analogs, vectors, cells, polypeptides or antibodies as stated above.
  • the pharmaceutical composition according to the invention can furthermore contain pharmaceutically customary excipients, auxiliaries and / or additives and optionally further active components.
  • the pharmaceutical composition can be used in particular for diagnostic purposes or for the production of a therapeutic agent.
  • Use as a therapeutic agent for modulating the immune system is particularly preferred. This modulation of the immune system can be done by Influencing, in particular by inhibition, the antigen presentation of MHC class I molecules on the surface of cells can be achieved.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is particularly suitable for applications in gene therapy, e.g. B. to reduce the immunogenicity of transfected cells.
  • a nucleic acid according to the invention is operatively linked to an expression signal active in the intended host cell in a transfection vector suitable for gene therapy purposes. Expression of the US6 gene product in the cell transfected with the vector prevents or at least reduces recognition of the transfected cell by the immune system.
  • the nucleic acid according to the invention can be introduced both in the body and extracorporeally in cells.
  • the nucleic acid according to the invention can be used together with other known immunomodulatory agents which can be selected, for example, from viral MHC I inhibitors and nucleic acids coding therefor.
  • viral MHC I inhibitors and nucleic acids coding therefor.
  • Specific examples are the viral genes US2, US3, US11, ICP47 and E3 / 19K mentioned at the beginning and their gene products.
  • the inhibitor according to the invention is distinguished from known inhibitors by the fact that it intervenes at a very late stage in the mechanism for the presentation of antigens by the MHC class I complex on the surface of cells. This late blocking can be combined in a particularly advantageous manner with the early blocking by the inhibitors of the prior art.
  • SEQ ID No. 1. a nucleotide sequence which contains genetic information coding for the US6 gene and SEQ ID No. 2 the amino acid sequence of the US6 gene product.
  • Figure 1 shows that US6 expression prevents CD8 + T cell recognition, MHC class I surface expression, and MHC class I complex formation due to inhibition of TAP-mediated peptide transport.
  • Peptides # 67 (RYWANATRSF), # 600 (TNKTRIDGQY) and # 802 (RRYQNSTEL) radiolabeled with 12S I by chloramine-T-catalyzed iodination.
  • the cells were permeabilized with streptolysin 0 (2.5 U / ml). 1.25 x 10 6 cells per sample were incubated with the peptide (1 uM) and 10 mM ATP in 0.1 ml incubation buffer (130 mM KC1, 5 mM Hepes pH 7.3, 10 mM NaCl, 1 mM CaCl 2, 2 mM EGTA, 2 mM MgCl 2 ) for 20 minutes at 37 ° C.
  • the glycosylated peptide fraction was isolated with 30 ⁇ l concanavalin A (ConA) Sepharose slurry and quantified by ⁇ -counting.
  • ConA concanavalin A
  • the pulses per minute (cpm) obtained after Con A treatment were given as a percentage of the cpm used.
  • HeLa cells were infected overnight with a US6 recombinant vaccinia virus or a control vaccinia virus with an infection multiplicity of 3.
  • the black bars represent the transport speed in the presence of ATP, the white bars in the absence of ATP as a control.
  • the mean of two experiments is given in each case.
  • HCMV strain AD 169 (ATCC-VR538) was grown according to standard methods in tissue culture. The open reading frame of the US6 gene was cloned after PCR amplification of HCMV AD169 DNA.
  • the primers were as follows: forward primer 5'-CGC GGG GGA TCC GCC GCC ATG GAT CTC TTG ATT CGT CTC-3 '; Reverse primer 5'-CGC GGG TCT AGA GAA TTC GCA TCA GGA GCC ACA ACG TCG-3 '.
  • the PCR product was cloned into plasmid p7.5K131 (H.J. Schlicht et al., J. Virol.
  • a US6 construct which contained the 24 bp FLAG sequence (Eastman Kodak, New Heaven, CT) on the 3 'side using the back primer 5'-CGC CCC TCT AGA TTA CTA CTT GTC ATC GTC GTC CTT GTA GTC CTC GAG GAT ATC GGA GCC ACA ACG TCG AAT GGG ACG-3 '.
  • the PCR product was cloned into the 5'BamHI and 3'XbaI restriction sites of pcDNAIneo.
  • hydrophilic FLAG sequence N-AspTyrLysAspAspAsp-AspLys-C
  • sequence coding for US6 using a short oligopeptide spacer (Asp, Ile, Leu, Glu).
  • the transfectants were screened for antigen presentation on HLA-A2 allospecific CD8 + CTL clones, MHC class I surface expression and TAP-mediated peptide transport.
  • the isolated genes US2 (data not shown) and US6 reduced both the surface expression of MHC class I molecules and the recognition by CD 8+ CTL (Fig. 1A and B).
  • the amino acid sequence of US6 corresponds to a type Ia transmembrane protein with a mass of 21 KD and a possible N-linked glycosylation site.
  • confocal laser scanning microscopy was carried out on transfected HeLa cells using an affinity-purified polyclonal rabbit antiserum which recognizes the luminal domain of the US6 protein.
  • HeLa-US6 transfectants were pretreated with 500 U / ml IFN ⁇ for 48 hours before undergoing paraformaldehyde fixation and solubilization with 0.1% NP40 have undergone.
  • the cells were labeled with (A), a polyclonal rabbit anti US6 antiserum, which was generated by immunizing rabbits with KLH-coupled synthetic peptides of amino acids 20-29 of the US6 sequence and antibodies against the cellular proteins TAPl, BiP, p53 or against the ice and medial cisterns of the Golgi and then stained with goat anti-rabbit IgG-FITC and goat anti-mouse IgG-TRITC.
  • a typical ER staining pattern was observed in HeLa-US6 cells, while HeLa control cells were negative.
  • the localization of the polypeptide US6 in the ER was due to the almost perfect colocalization with the ER marker protein BiP (G.
  • the immune precipitate obtained from a digitonin lysate from HeLa-US6 cells was in an NP40 lysis buffer containing 1.5% SDS warmed, which resulted in the release of the proteins (see FIG. 2B, lane 1).
  • HeLa-US6 and control cells were metabolically labeled overnight and lysed in a 1% digitonin-lysine buffer before immunoprecipitation with anti-US6 antibodies.
  • the precipitated proteins were dissolved in a 1% NP40 lysis buffer containing 1.5% SDS and heated to 65 ° C for 35 min.
  • the anti-US6 antibodies were removed by incubation twice with Protein A-Sepharose before re-immunoprecipitation of the supernatant with rabbit polyclonal antibodies against calreticulin and BiP (StressGen, Victoria, BC, Canada), free MHC I heavy chain (HC) (obtained from Dr. HL Ploegh, Cambridge, MA) and against calnexin (obtained from Dr. M. Brenner, Boston, MA).
  • US6 binds to calnexin, which is involved as a molecular chaperone in steps before the folding of the heavy MHC I chain (E. Degen et al., J. Cell. Biol. 112 (1991), 1099; S. Rajagopalan et al., Science 263 (1994), 387).
  • the cytosol TAP inhibitor ICP47 has been shown to compete with ATP-independent binding of peptides to the transporter (K. Ahn et al., EMBO J. 15 (1996), 3247; R. Tomazin et al., EMBO J. 15 (1996), 3256).
  • Using the photoactivatable radioiodinated peptide [125 I] TYDNKTRA [4-trifluoromethyl-diazirinyl) phenylalanine] it was investigated whether binding of peptides to TAP can occur in the presence of US6. For this purpose, the method of Nijenhuis et al. , J. Immunol.
  • US6 mRNA produced by in vitro transcription of pcDNAIneo-US6 with T + RNA polymerase, Promega, Heidelberg, Germany
  • HCMV expresses a cascade of successive US gene functions that disrupt the mechanism of antigen presentation 5 by MHC class I molecules.
  • the (IE) protein gpUS3 which is expressed at the beginning of an infection, hinders the transport of MHC class I complexes (K. Ahn et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA 93 (1996), 10990; TR Jones et al ., Proc. Natl. Acad. Be USA 93 (1996), 11327).
  • the glycoproteins encoded by 0 US2 and USII guide formed MHC class I HC into the cytosol, where it is rapidly broken down (E. Wiertz et al., Cell 84 (1996), 769).

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Abstract

Die Erfindung betrifft das US6 Gen aus dem humanen Cytomegalovirus (HCMV), das davon kodierten Polypeptid, einen gegen das Polypetid gerichteten Antikörper sowie dessen pharmazeutische Anwendungen, insbesondere in der Modulation des Immunsystems und in der Verringung der Immunogenität von transfizierten Zellen.

Description

US6 GEN AUS DEM HUMANEN CYTOMEGALOVIRUS (HCMV)
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Gen aus dem humanen Cytomegalovirus (HCMV) , ein davon codiertes Polypeptid, einen gegen das Poly- peptid gerichteten Antikörper sowie die pharmazeutische Anwendung der Nucleinsäure, des Polypeptids und des Antikörpers.
Die T-Zell vermittelte Immunantwort spielt eine zentrale Rolle bei der Abwehr intrazellulärer Pathogene . T-Zellen, die oiß- Rezeptoren exprimieren, sind auf die Erkennung von Peptiden spezialisiert, die durch MHC-codierte Moleküle präsentiert werden. Proteine, die während der viralen Genexpression synthetisiert worden sind, werden im Cytosol durch das Proteasom abgebaut. Dann werden Peptide mit Hilfe von Transportermolekülen (TAP) mit der schweren MHC-Klasse I Kette und 32-Mikroglo- bulin assembliert, um einen trimeren Komplex zu bilden (M. J. Androlewicz et al . , Proc . Natl . Acad. Sei. USA 90 (1993) 9130; J. J. Neefjes et al . Science 261 (1993) 769; T. Spies et al . , Nature 355 (1992) 644; J. C. Shepard et al . , Cell 74, (1993) 577) . Dieser Komplex wird dann aus dem endoplasmatischen Reti- culum (ER) durch das ER-Golgi-Intermediat Compartment (ERGIC) /cis-Golgi Netzwerk, das mittlere Golgi- und das Trans- Golgi (TGN) Netzwerk) zur Plasmamembran transportiert, wo der MHC Komplex das Peptid für cytotoxische CD8 T-Zellen präsentiert .
Während der Coevolution mit ihren Wirten haben Viren Mechanismen der Anpassung an das Immunsystem entwickelt . Einige Viren können trotz einer starken Immunreaktion persistieren. DNA-Viren, wie Pockenviren, Herpesviren und Adenoviren, enthalten Gene, welche das Entstehen einer Entzündungsreaktion durch Beeinflussung der Komplementkaskade und durch Wechselwirkung mit Cytokinen und Interferonen hemmen (Smith, Trends in Microbiol. 2 (1994) , 81-88) . Diese Gene scheinen von zellu- lären Genen des jeweiligen Wirts abzustammen, und durch Sequenzhomologie kann ihre potentielle Funktion vorhergesagt werden.
Viren können jedoch auch die Antigenpräsentation über den MHC- Klasse I Mechanismus beeinflussen, indem sie auf Proteine, die bei der Antigenpräsentation beteiligt sind, einwirken. Für diese viralen Gene sind bisher noch keine zellulären Homologe gefunden worden. Somit besteht an ihnen ein besonderes Inter- esse, weil sie auf bislang noch unbekannte Funktionen in der Zellbiologie hinweisen können.
Herpesviren sind in der Lage, trotz des Vorhandenseins eines aktiven Immunsystems im Wirt eine lebenslange Infektion auf- rechtzuerhalten. Cyotmegaloviren (CMV) stellen die . -Unterfamilie der Herpesviren dar und verursachen sowohl akute als auch chronische Infektionen. CMV Gene werden kaskadenartig exprimiert, wie es für Herpesviren während der sehr frühen (IE) , der frühen (E) , und der späten (L) Phase der Infektion kennzeichnend ist. Cytomegaloviren haben spezifische Funktionen entwickelt, um der zellulären Immunantwort zu entgehen. Sowohl humaner CMV (HCMV) als auch Maus CMV (MCMV) beeinflussen die Oberflächenexpression von MHC-Klasse I Molekülen und die Antigenpräsentation an CD8+ T-Lymphozyten (P. D. Barnes und J. G. Grundy, J. Gen Virol. 73 (1992) 2395; M. Del Val et al., Cell 58 (1989) 305; H. Hengel et al., J. Gen. Virol. 76
(1995) 2987) . Der Befund, daß die Präsentation eines viralen
Antigens von Maus Cytomegalovirus (MCMV) , einem ß-Herpesvirus, während der Phasen der Replikationskaskade stark reguliert ist (Reddehase et al . , J. Virol. 60 (1986), 1125-1129; Del Val et al., Cell 58 (1989), 505-315), führte zu der Erkenntnis, daß die frühen MCMV-Gene die Expression von MHC-Klasse I Molekülen regulieren (Del Val et. al . , J. Exp. Med. 176 (1992), 729-738; Campbell _ Slater, J. Virol. 68 (1994) 1805-1811). Auch beim humanen Cytomegalovirus (Beersma et al . J. Immunol . 151 (1993), 4455-4464; Yamashita et al . , Virology 193 (1993), 727- 736; Warren et al . , J. Virol. 68 (1994), 2822-2829) und beim Herpes Simplex Virus Typ I (York et al . , Cell 77 (1994), 525- 535) konnte eine Hemmung der Antigenrepräsentation durch MHC- Klasse I Moleküle gezeigt werden.
Aus dem humanen Cytomegalovirus sind mehrere Genprodukte bekannt, welche als Inhibitoren von MHC-Klasse I Molekülen wirken. Beispiele sind die Genprodukte US3, US11 und US2 (siehe z. B. Jones et al . , Proc . Natl . Acad. Sei. USA 93 (1996) 11327-11333; Jones et al . , J. Virol. 69 (1995), 4830-4841; Wiertz et al . Cell 84 (1996), 769-779).
Die internationale Patentanmeldung WO 96/04383 offenbart HCMV- Deletions-Mutanten. Die Infektion von humanen Zellen mit drei dieser Mutanten, in denen jeweils die offenen Leserahmen IRS1- US11, US2-US11 bzw. IRS1-US9 + US11 entfernt wurden, führte zum Verlust der Kontrolle über die Oberflächenexpression von MHC-Klasse I Molekülen. Außerdem werden als für die virale MHC-Klasse I Kontrolle relevante Subregionen die offenen Leserahmen US11 sowie US2-US5 genannt. Die internationale Pa- tentanmeldung WO 96/31241 offenbart Zellen, in denen verschiedene virale Proteine mit MHC-Klasse-I-inhibitorischer Wirkung exprimiert wurden. Zu diesen gehören die HCMV US5 und US11 Genprodukte. Die Veröffentlichung von Greaves et al . (J. Gen. Virol. 76, 2151-2160 (1995)) beschreibt die gezielte Deletion der HCMV-Gene IRSl sowie US3 bis US5 und die Infektion humaner Zellen mit den Deletionsmutanten.
Aus dem Herpes-Simplex Virus Typ I ist das Protein ICP47 (McGeoch et al . , J. Mol. Biol . 181 (1985), 1-13) bekannt, welches ebenfalls die Antigenpräsentation durch MHC-Klasse I Moleküle inhibiert (York et al . , Cell. 77 (1994), 525-535; Früh et al . Nature 375 (1995), 415-418). Das Protein ICP47 wirkt als Inhibitor von Peptidtransportproteinen (TAP) . Aus Adenoviren ist schließlich das Protein E3/19K bekannt, welches die schweren Ketten von MHC-Klasse I Transplantationsantigenen aus Mensch und Maus bindet (vgl. z. B. Signas et al . , Nature 299 (1982), 175-178; Burgert et al . , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987), 1356-1360; Tanaka & Tevrethia, Virology 165 (1988), 357-366; Jefferies & Burgert , J. Exp . Med. 172 (1990), 1653-1664; Hermiston et al . , J. Virol. 67 (1993), 5289-5298). Das Protein E3/19K zeigt eine direkte Assoziation mit MHC- Klasse I Molekülen von Mensch, Maus und Ratte, wodurch der intrazelluläre Transport und die Expression an der Zelloberfläche stark inhibiert werden.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, neue Gene zu identifizieren, welche die Antigenpräsentation durch MHC I Moleküle beeinflussen und somit als Immunmodulatoren wirken.
Die Erfindung beschreibt die Identifizierung, Klonierung und Charakterisierung eines Gens aus humanem Cytomegalovirus, das als US6 bezeichnet wird und für ein neues Polypeptid codiert. Identifiziert wurde dieses Gen durch Transfektion in Säugerzellen als Inhibitor der MHC-Expression. Das Genprodukt des US6 Gens bewirkt eine signifikante Inhibierung der Oberflä- chenexpression von MHC I Molekülen. Das US6 Gen, das davon codierte Polypeptid sowie gegen das Polypeptid gerichtete Antikörper sind als diagnostische, therapeutische oder präventive Mittel für Erkrankungen geeignet, die mit Störungen der MHC-Klasse I Antigenpräsentation an der Zelloberfläche direkt oder indirekt assoziert sind. Insbesondere sind das Gen und das Polypeptid als Immunmodulatoren für die Gentherapie geeignet. Die Veröffentlichung von Hengel et al . (IMMUNITIY, 6, 623-632, Mai, 1997) wurde nach dem Anmeldetag der vorliegenden Anmeldung veröffentlicht und offenbart den Gegenstand der vorliegenden Patentanmeldung. Die Veröffentlichungen von Ahn et al. (IMMUNITIY, 6, 613-621, Mai, 1997) und Lehner (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 94, 6904-6909, Juni, 1997) wurden ebenfalls nach dem Anmeldetag der vorliegenden Patentanmeldung veröffentlicht und offenbaren ebenfalls biologische Funktionen des US6 HCMV-Gens. Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Nucleinsäu- re, welche für ein die MHC-Klasse I Antigenpräsentation beeinflussendes Polypeptid codiert, umfassend:
(a) die in SEQ ID No. 1 dargestellte Nucleotidsequenz mindestens im Bereich zwischen den Nucleotiden 58 und 88,
(b) eine der Sequenz aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nucleotidsequenz oder
(c) eine mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) unter strin- genten Bedingungen hybridisierende Nucleotidsequenz.
Die in SEQ ID No. 1 dargestellte Nucleotidsequenz enthält einen offenen Leserahmen von 549 bp, der einem Polypeptid mit einer Länge von 183 Aminosäuren entspricht. Die Aminosäuresequenz dieses Polypeptids ist in SEQ ID No. 2 dargestellt. Das Polypeptid ist ein Typ I Transmembranglykoprotein mit einer berechneten Molekularmasse von 21 kDa.
Neben der in SEQ ID No. 1 gezeigten Nucleotidsequenz und einer dieser Sequenz im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Nucleotidsequenz umfasst die Erfindung auch noch eine Nucleotidsequenz, die mit einer der zuvor ge- nannten Sequenzen hybridisiert. Der Begriff "Hybridisierung" gemäß vorliegender Erfindung wird wie bei Sambrook et al .
(Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press (1989), 1.101-1.104) verwendet. Vorzugsweise spricht man von einer stringenten Hybridisierung, wenn nach Waschen für eine Stunde mit 1 x SSC und 0,1% SDS bei 50°C, vorzugsweise bei 55°C, besonders bevorzugt bei 62°C und am meisten bevorzugt bei 68°C, insbesondere für eine Stunde in 0,2 x SSC und 0,1% SDS bei 50°C, vorzugsweise bei 55°C, besonders bevorzugt bei 62 °C und am meisten bevorzugt bei 68 °C noch ein positives Hybridisierungssignal beobachtet wird. Eine unter derartigen Waschbedingungen mit der für SEQ ID No. 1 gezeigten Nucleotidsequenz oder einer damit im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Nucleotidsequenz hybridisierende Nucleotidsequenz ist eine erfindungsgemäße Nucleotidsequenz.
Die erfindungsgemäße Nucleinsäure ist vorzugsweise nicht assoziiert mit anderen Protein-codierenden Nucleinsäureabschnitten aus HCMV. Weiterhin ist die erfindungsgemäße Nucleinsäure vorzugsweise in operativer Verknüpfung mit einer Expressionskontrollsequenz, die in eukaryontisehen Zellen, insbesondere in Säugerzellen wirksam ist.
Vorzugsweise ist die erfindungsgemäße Nucleotidsequenz eine DNA. Sie kann jedoch auch eine RNA oder ein Nucleinsäureanalo- gon wie etwa eine peptidische Nucleinsäure umfassen. Besonders bevorzugt umfasst die erfindungsgemäße Nucleinsäure eine Sequenz, die zu der in SEQ ID No . 1 dargestellten Nucleotidsequenz und bevorzugt dem luminalen Abschnitt davon eine Homologie von mehr als 80%, vorzugsweise als 90 % und besonders bevorzugt mehr als 95 % aufweist.
Eine erfindungsgemäße modifizierte Nucleinsäure oder ein erfindungsgemäßes Nucleinsäureanalogon enthält mindestens einen 12 Basen, vorzugsweise mindestens 15 Basen langen Abschnitt der Nucleinsäuresequenz wie zuvor angegeben. Solche Substanzen sind als Hybridisierungssonden, Antisense-Moleküle bzw. kata- lytisch aktive Ribozyme geeignet.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein von einer Nucleinsäure wie oben angegeben codiertes Polypeptid. Dieses Polypeptid weist vorzugsweise
a) die in SEQ ID No. 2 dargestellte Aminosäuresequenz mindestens im Bereich zwischen den Aminosäuren 20 und 29,
b) eine mehr als 70 %, vorzugsweise mehr als 80 % und besonders bevorzugt mehr als 90 % zur Sequenz aus (a) homologe Aminosäuresequenz oder/und c) eine mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) immunologisch kreuzreaktive Aminosäuresequenz auf.
Erfindungsgemäße Nucleinsäuren sind aus Cytomegaloviren, ins- besondere aus humanen Cytomegaloviren erhältlich. Sie können nach bekannten Techniken unter Verwendung kurzer Abschnitte der in SEQ ID No. 1 gezeigten Nucleotidsequenz als Hybridisierungssonden oder/und Primer nach bekannten Methoden isoliert werden. Weiterhin können erfindungsgemäße Nucleinsäuren durch Mutagenese aus natürlich vorkommenden Nucleinsäuren oder durch chemische Synthese hergestellt werden. Bei der chemischen Synthese können gegebenenfalls anstelle der üblichen Nucleotidbausteine auch modifizierte Nucleotidbausteine eingesetzt werden. Nucleinsäuren, die teilweise oder vollständig aus modifizierten Nucleotidbausteinen bestehen oder Nuclein- säureanaloga wie etwa peptidische Nucleinsäuren, deren Basensequenz einer erfindungsgemäßen Nucleinsäure entspricht, können beispielsweise als therapeutische Mittel eingesetzt werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein rekombinanter Vektor, der mindestens eine Kopie einer erfindungsgemäßen Nucleinsäure enthält . Dieser Vektor kann ein beliebiger prokaryontischer oder eukaryontischer Vektor sein, auf dem sich die erfindungsgemäße Nucleinsäure unter Kontrolle eines Expressionssignals (Promotor, Operator, Enhancer etc.) befindet. Beispiele für prokaryontisehe Vektoren sind chromo- somale Vektoren wie etwa Bakteriophagen und extrachomosomale Vektoren wie etwa Plasmide, wobei zirkuläre Plasmidvektoren besonders bevorzugt sind. Geeignete prokaryontischen Vektoren sind z. B. bei Sambrook et al . , Supra, Kap. 1-4 beschrieben.
Besonders bevorzugt ist der erfindungsgemäßer Vektor ein eukar- yontischer Vektor, insbesondere ein Vektor für Säugerzellen. Besonders bevorzugte Vektoren sind für die Gentherapie geeignete Vektoren wie etwa Retroviren, modifizierte Adenoviren oder Adeno-assoziierte Viren. Derartige Vektoren sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie und Gentherapie geläufig. Insbesondere wird in diesem Zusammenhang auf Sam- brook et al . , supra, Kap. 16 auf Kriegler, M. ; Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual; Freeman and Company (N.Y.) 1990 und auf Vos, I.M.H.; Viruses in human gene thera- py; Caroline Academic Press, 1995 verwiesen.
Neben dem in SEQ ID No. 2 dargestellten Polypeptid betrifft die Erfindung auch Muteine, Varianten und Fragmente davon. Darunter sind Sequenzen zu verstehen, die sich durch Substitution, Deletion oder/und Insertion einzelner Aminosäuren oder kurzer Aminosäureabschnitte von der in SEQ ID No. 2 dargestellten Aminosäurensequenz unterscheiden.
Unter den Begriff "Variante" fallen sowohl natürlich vorkommende Variationen in einzelnen Virenstämmen sowie durch rekom- binante DNA Technologie (insbesondere in vitro Mutagenese mit Hilfe von chemisch synthetisierten Oligonucleotiden) erzeugte Proteine, die in der Lage sind, die Antigenpräsentation von MHC Klasse I Molekülen an der Oberfläche von Zellen zu beeinflussen. Ebenfalls fallen unter diesen Begriff auch chemisch modifizierte Polypeptide, die an den Termini oder/und reaktiven Aminosäurenseitengruppen durch Acylierung, z. B. Acetylie- rung, oder Amidierung modifiziert sind.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Zelle, die mit einer erfindungsgemäßen Nucleinsäure oder einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert, bzw. transfiziert ist. Die Zelle kann sowohl eine eukaryontische als auch eine pro- karyontische Zelle sein. Verfahren zur Transformation von Zellen mit Nucleinsäuren sind allgemeiner Stand der Technik und brauchen daher nicht näher erläutert zu werden. Beispiele für besonders bevorzugte Zellen sind eukaryontische Zellen, insbesondere tierische Zellen und besonders bevorzugt Säugerzel- len. Ebenfalls ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Polypeptids oder Fragmenten dieses Polypeptids als Immunogen zur Herstellung von Antikörpern. Die Herstellung von Antikörpern kann dabei auf übliche Weise durch Immunisierung von Versuchstieren mit dem vollständigen Polypeptid oder Fragmenten davon und anschließende Gewinnung der resultierenden polyklonalen Antiseren erfolgen. Nach der Methode von Köhler und Milstein oder deren Weiterentwicklungen können aus den Antikörper-produzierenden Zellen der Versuchstiere auf bekannte Weise durch Zellfusion monoklo- nale Antikörper erhalten werden. Ebenso können nach bekannten Methoden humane monoklonale Antikörper hergestellt werden. Als Immunogen bevorzugt sind das rekombinante US6 Protein oder Peptidfragmente hiervon.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Antikörper gegen das US6 Protein oder eine Variante davon, vorzugsweise ein Antikörper, der keine Kreuzreaktion mit anderen CMV-codierten Proteinen zeigt. Besonders bevorzugt ist der Antikörper gegen das gesamte Polypeptid oder gegen eine Pep- tidsequenz gerichtet, die den Aminosäuren 20 bis 29 der in SEQ ID No. 2 dargestellten Aminosäuresequenz entspricht.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als aktive Komponenten Nucleinsäuren, modifizierte Nucleinsäuren oder Nucleinsäurenanaloga, Vektoren, Zellen, Polypeptide oder Antikörper wie zuvor angegeben, enthält .
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann weiterhin pharmazeutisch übliche Träger-, Hilfs- oder/und Zusatzstoffe sowie gegebenenfalls weitere aktive Komponenten enthalten. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann insbesondere für diagnostische Zwecke oder zur Herstellung eines the- rapeutischen Mittels eingesetzt werden. Besonders bevorzugt ist die Verwendung als therapeutisches Mittel zur Modulation des Immunsystems. Diese Modulation des Immunsystems kann durch Beeinflussung, insbesondere durch Inhibierung, der Antigenpräsentation von MHC-Klasse I Molekülen an der Oberfläche von Zellen erreicht werden.
Aufgrund der immunmodulatorischen Eigenschaften des US6 Genprodukts eignet sich die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung insbesondere für Anwendungen in der Gentherapie, z. B. zur Verringerung der Immunogenität von transfizier- ten Zellen. Hierzu wird eine erfindungsgemäße Nucleinsäure in operativer Verknüpfung mit einem in der vorgesehenen Wirts- zelle aktiven Expressionssignal in einen für gentherapeutische Zwecke geeigneten Transfektionsvektor eingebaut. Durch Expression des US6 Genprodukts in der mit dem Vektor transfizierten Zelle wird eine Erkennung der transfizierten Zelle durch das Immunsystem verhindert oder doch zumindest verringert . Die erfindungsgemäße Nucleinsäure kann sowohl im Körper als auch extrakorporal in Zellen eingebracht werden.
Gegebenenfalls kann die erfindungsgemäße Nucleinsäure zusammen mit anderen bereits bekannten immunmodulatorisch wirkenden Mitteln eingesetzt werden, die beispielsweise ausgewählt sein können aus viralen MHC I Inhibitoren und dafür codierenden Nucleinsäuren. Spezifische Beispiele sind die eingangs genannten viralen Gene US2 , US3 , US11, ICP47 und E3/19K sowie deren Genprodukte .
Dabei zeichnet sich der erfindungsgemäße Inhibitor gegenüber bekannten Inhibitoren dadurch aus, daß er in einem recht späten Stadium in den Mechanismus zur Präsentation von Antigenen durch den MHC-Klasse I Komplex an der Oberfläche von Zellen eingreift. Diese späte Blockierung kann auf besonders vorteilhafte Weise mit den frühen Blockierungen durch die Inhibitoren des Standes der Technik kombiniert werden.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele und Sequenz- Protokolle näher erläutert: Es zeigen :
SEQ ID No. 1. eine Nucleotidsequenz, die für das US6 Gen codierende genetische Information enthält und SEQ ID No. 2 die Aminosäuresequenz des US6 Gen Produkts.
Die beigefügten Fig. 1 und 2 sind wie folgt:
Fig. 1 zeigt, daß die US6-Expression die CD8+ T-Zellerkennung, die MHC-Klasse-I -Oberflächenexpression und die MHC-Klasse-I- Komplexbildung aufgrund einer Inhibierung des TAP-vermittelten Peptidtransports verhindert.
(A) 293-Zellen, welche mit dem Plasmid pcDNAI-US6 oder einer Kontrolle (pcDNAI) stabil transfiziert worden waren, wurden mit 51Cr markiert und in einem 4-Stunden-Standard-Freisetzungs- Assay mit einer abgestuften Anzahl von Effektorzellen getestet. Die Effektoren waren die HLA-A2 allospezifischen CD8+ CTL-Klone IE2 (Kreise) und JS132 (Dreiecke) (Goulmy et al . , Immunigenetics 20 (1984) 13) .
(B) Cytofluorometrische Analyse der MHC-Klasse-I-Oberflächen- expression von HeLa-Zellen, welche mit pcDNAI-US6 transfiziert waren und HeLa-Kontrollzellen. Die Zellen wurden mit den mono- klonalen Antikörpern W6/32 (ATCC HB95) , der HLA-Klasse-I- schwere-Kette//32m Dimere erkennt (dicke Linien) oder BA06 (Onocogene Science, Uniondale, N. Y.), der gegen CD44 gerichtet ist (dünne Linien) , inkubiert und anschließend mit Ziege- Anti-Maus IgG-FITC angefärbt. Die gestrichelte Linie ist eine Kontrollanfärbung mit lediglich dem zweiten Antikörper.
(C) Die ATP-abhängige Peptidtranslokation wurde für permeabi- lisierte HeLa-Zellen und einzelne US6-transfizierte Klone (oberes und mittleres Diagramm) bzw. Zellen der Zellinie 293 und 293 -US6-Transfektanten (unteres Diagramm) analysiert. Dazu wurde ein wie bei Hengel et al . , J. Gen. Virol. 77 (1996) 2287 beschriebener Transportassay durchgeführt . Hierzu wurden die
Peptide Nr. 67 (RYWANATRSF) , Nr. 600 (TNKTRIDGQY) und Nr. 802 (RRYQNSTEL) durch Chloramin-T-katalysierte Jodierung mit 12SI radiomarkiert. Die Zellen wurden mit Streptolysin 0 (2,5 U/ml) permeabilisiert . 1,25 x 106 Zellen pro Probe wurden mit dem Peptid (1 μM) und 10 mM ATP in 0,1 ml Inkubationspuffer (130 mM KC1, 5 mM Hepes pH 7,3, 10 mM NaCl , 1 mM CaCl2, 2 mM EGTA, 2 mM MgCl2) für 20 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach Lyse in 1% NP40 wurde die glykosilierte Peptidfraktion mit 30 μl Concana- valin A (ConA) Sepharose-Aufschlämmung isoliert und durch γ- Zählung quantifiziert. Die nach Con A Behandlung erhaltenen Impulse pro Minute (c.p.m.) wurden als Prozent der eingesetzten c.p.m. angegeben.
HeLa-Zellen wurden über Nacht mit einem US6-rekombinanten Vaccinia-Virus oder einem Kontroll -Vaccinia-Virus mit einer Infektionsmultiplizitat von 3 infiziert. Die schwarzen Balken stellen die Transportgeschwindigkeit in Gegenwart von ATP dar, die weißen Balken in Abwesenheit von ATP als Kontrolle. Es ist jeweils der Mittelwert aus 2 Versuchen angegeben.
(D) Nichttransfizierte und US6-transfizierte HeLa-Zellen wurden für 25 Minuten metabolisch markiert. Lysate in 1 % NP40 wurden vor der Immunpräzipitation mit dem mAb W6/32 entweder bei 4°C gehalten oder bei 37°C für die angegebene Zeit inkubiert. Präzipierte Moleküle wurden mit Endoglycosidase H(Endo H) gespalten, "s" zeigt Endo-H-sensitive MHC-Klasse-I-Moleküle an.
(E) Die Kinetik der TAP-Funktion wurde mit dem Peptid RYWANATRSF (gestrichelte Linie) während einer permissiven Infektion von MRC-5-Fibroblasten mit HCMV AD169 (Infektionsmultiplizitat = 5) bestimmt. Der Grad der US6-Expression in mit HCMV AD169 inifizierten MRC-5-Zellen wurde durch Immunpräzipitation mit Anti-US6-Antiserum bestimmt. Bei dem Antise- rum handelte es sich um ein polyklonales Kaninchen-Antiserum, welches durch Immunisierung von Kaninchen mit KLH-gekoppelten synthetischen Peptiden der Amminosäuren 20 - 29 der US6-Sequenz hergestellt wurde. Der Grad der US6 -Expression wurde dann durch SDS-PAGE analysiert (oben) . Die US6-Expression (durchgezogene Linie) ist in willkürlichen Einheiten nach Phosphoimager-Quantifizierung der US6-Banden gezeigt.
5 In Fig. 2 ist die Identifizierung und Charakterisierung von US6-assoziierten Proteinen des endoplasmatischen Reticulums (ER) gezeigt.
(A) HeLa- und HeLa-US6-Transfektanten wurden über Nacht meta-
10 bolisch markiert und in einem Digitonin-Lysepuffer lysiert . US6 wurde mit einem Kaninchen-Anti-US6-Antiserum immunpräzipi- tiert, und die Proteine wurden gelektrophoretisch aufgetrennt. Die Immunpräzipitation wurde wie von H. Hengel et al . , J. Gen. Virol. 76 (1995) 2987 und H. Hengel et al . J. Gen. Virol. 77
15 (1996) 2287 beschrieben durchgeführt. Dazu wurden semikonflu- ente Schichten von HeLa-Zellen mit IFNγ (500 U/ml) inkubiert und über Nacht mit [35S] -Methionin und [35S] -Cystein (1200 Ci/- mmol; Amersham, Braunschweig, Germany) bei einer Konzentration von 350 μCi/ml markiert und in einem Lysepuffer (140 mM NaCl,
20 20 mM Tris pH 7,6, 5 mM MgCl2, 0 , 2 mM PMSF, Leupeptin und Leu- statin) mit 1 % Detergens wie angegeben lysiert. Nach dem Entfernen der Zellkerne durch Zentrifugation wurden die Lysate mit präimmunem Kaninchenserum und Protein-A-Sepharose vorgereinigt. Immunkomplexe wurden mit Probepuffer eluiert und
25 durch 10 - 15 % Polyacrylamid-Gradientengelelektrophorese analysiert. Die Gele wurden mit Amplify (Amersham) behandelt, getrocknet und mit BioMaxMR-Filmen (Kodak) bei -70°C für 1 bis 7 Tage entwickelt.
30 US6-assoziierte Proteine sind durch Pfeile gekennzeichnet. Die erhaltenen Immunkomplexe wurden mit Endo H (2mU pro Probe, 37 °C über Nacht) gespalten oder einer Scheinbehandlung unterzogen. Die Banden mit einer Mobilitätsänderung nach Endo H- Spaltung sind durch ein "s" angezeigt.
35
(B) HeLa-US6-Zellen wurden, wie unter (A) beschrieben, metabo- lisch markiert und in einem Digitonin-Lysepuffer lysiert. Das mit Anti-US6-Antiserum präzipitierte Material wurde erwärmt und in einem l%igen NP40/1, 5%igen SDS-Puffer gelöst. Proteine, die nicht vom Protein-A-Sepharose-Pellet dissoziierten, wurden in Spur 1 analysiert. Aliquots des Überstands wurden mit mono- klonalen Antikörper gegen TAPl und TAP2 (Spur 2) , Kaninchen- Anti-HC-Antiserum (Spur 3) , Anticalnexin Ab (Spur 4) , Kanin- chen-Anticalreticulin-Antiserum (Spur 5) und Kaninchen Anti- BiP-Antiserum (Spur 6) nochmals präzipitiert .
Beispiele
1. Methoden
1.1 Klonierungsarbeiten, Viruspropagierung und Herstellung rekombinanter Vacciniaviren
HCMV Stamm AD 169 (ATCC-VR538) wurde nach Standardmethoden in der Gewebekultur gezüchtet. Der offene Leserahmen des US6 Gens wurde nach PCR Amplifikation von HCMV AD169 DNA kloniert . Die Primer waren wie folgt: Vorwärtsprimer 5'-CGC GGG GGA TCC GCC GCC ATG GAT CTC TTG ATT CGT CTC-3' ; Rückwärtsprimer 5'-CGC GGG TCT AGA GAA TTC GCA TCA GGA GCC ACA ACG TCG-3' . Das PCR Produkt wurde unter Verwendung der 5'-BamHI- und der 3'-EcoRI- Restriktionsstellen in das Plasmid p7.5K131 (H. J. Schlicht et al., J. Virol. 63 (1989) 5399) kloniert. Dieses Plasmid wurde dann zur Herstellung eines rekombinanten Vacciniavirus nach homologer Rekombination mit dem Vacciniastamm Kopenhagen verwendet. Die Expression des US6 Gens im Vacciniavirus erfolgt unter Kontrolle des Vaccinia 7.5K Promotors.
Parallel dazu wurde der offene Leserahmen des US6 Gens nach PCR Amplifikation von HCMV AD169 DNA in den Expressionsvektor pcDNAIneo (Invitrogen, San Diego, CA) unter Verwendung des Vorwärtsprimers 5'-CGC GGG GGA TCC GCC GCC ATG GAT CTC TTG ATT CGT CTC-3' und des Rückwärtsprimers 5'-CGC GGG TCT AGA GAA TTC GCA TCA GGA GCC ACA ACG TCG-3' kloniert, was in einem Amplifi- kationsprodukt von 591 bp resultierte. Weiterhin wurde ein US6 Konstrukt welches 3'-seitig die 24 bp lange FLAG Sequenz (Eastman Kodak, New Heaven, CT) enthielt unter Verwendung des Rückwärtsprimers 5'-CGC CCC TCT AGA TTA CTA CTT GTC ATC GTC GTC CTT GTA GTC CTC GAG GAT ATC GGA GCC ACA ACG TCG AAT GGG ACG-3' hergestellt. Das PCR Produkt wurde in die 5'BamHI und 3'XbaI Restriktionsstellen von pcDNAIneo kloniert . Die hydrophile FLAG Sequenz (N-AspTyrLysAspAspAsp- AspLys-C) ist mit einem kurzen Oligopeptidspacer (Asp, Ile, Leu, Glu) an die für US6 kodierende Sequenz fusioniert.
1.2 Zellen und Transfektanten
Menschliche Nierenzellen der Zellinie 293 und HeLa-Zellen wurden mit Plasmid DNA durch Calciumphosphatpräzipitation transfiziert . Zeilklone wurden in Gegenwart von 0,5 mg/ml G418 selektiert und auf US6-Proteinexpression durch Immunpräzipi- tation mit US6 spezifischen Antikörpern untersucht.
2. Ergebnisse
2.1
Auf der Suche nach viralen Genen, die eine TAP Hemmung verursachen, wurden die offenen Leserahmen (orf) der HCMV-Gene USl, US2, US3, US4, US5, US6, US7, US8/9, US10, US12 und US13 in HLA-A2+ 293 -Nierenzellen und HeLa Zellen stabil exprimiert . Die Transfektanten wurden auf Antigenpräsentation an HLA-A2 allospezifischen CD8+ CTL Klonen, MHC-Klasse I Oberflächenexpression und TAP-vermittelten Peptidtransport gescreent . Die isolierten Gene US2 (Daten nicht gezeigt) und US6 reduzierten sowohl die Oberflächenexpression von MHC-Klasse I Molekülen als auch die Erkennung durch CD8+CTL (Fig. 1A und B) . In HeLa oder 293-Zellen, welche mit US6 stabil transfiziert waren oder mit einem rekombinanten, US6 exprimierenden Vacciniavirus infiziert waren, wurde eine signifikante Verringerung des Peptidtransports durch TAP gefunden (Fig. IC) . Diese Verringerung war vergleichbar mit der Hemmung, die in Transfektanten beobachtet wurde, die den TAP-Inhibitor ICP47 des Herpes Simplex Virus Typ 1 (HSV-1) exprimieren (A. Hill et al . , Nature 375 (1995) 411; K. Früh et al . , Nature 375 (1995) 415). Gleichermaßen hemmte ein US6 Polypeptid, welches mit der hydrophi- len FLAG-Sequenz am C-Terminus markiert war, den Peptidtrans- port durch TAP (Fig. IC) .
Darüber hinaus war die Bildung von HC/jß2m Heterodimeren, die durch mAb W6/32 nachgewiesen wurden, in HeLa US6 Zellen dra- stisch verringert. Diese Komplexe waren bei 37°C in NP40 Lysa- ten instabil und blieben gegenüber Endoglykosidase H (EndoH) sensitiv (Fig. ID) , was auf eine defekte Peptidbeladung hinweist (J. J. Neefjes et al . , J. Exp. Med. 178 (1993) 1971; A. Townsend et al . , Cell 62 (1990) 285).
Die Kinetik der US6 Proteinexpression in HCMV Wildtyp AD169 infizierten Fibroblasten während des Verlaufs einer permissi- ven Infektion wurde nach metabolischer Markierung und Immun- präzipitation zusammen mit der Peptidtranslokationsfunktion beurteilt. Wie in Figur 1E dargestellt, korrelierte die kontinuierliche Abnahme des Peptidtransports mit der US6 Proteinsynthese, welche 72 Stunden nach der Infektion ein Maximum erreichte. Dies deutet darauf hin, daß US6 die TAP-abhängige Peptidtranslokation in das ER hemmt.
2.2 Subzelluläre Verteilung des US6 Proteins
Die Aminosäuresequenz von US6 entspricht einem Typ Ia Transmembranprotein mit einer Masse von 21 KD und einer möglichen N-verknüpften Glykosilierungsstelle . Zur Untersuchung der subzellulären Verteilung des US6 Proteins wurde eine konfokale Laserscann-Mikroskopie an transfizierten HeLa Zellen unter Verwendung eines affinitätsgereinigten polyklonalen Kaninchen- Antiserums, welches die luminale Domäne des Proteins US6 er- kennt, durchgeführt. Hierzu wurden HeLa-US6-Transfektanten mit 500 U/ml IFNγ für 48 Stunden vorbehandelt, bevor sie einer Paraformaldehydfixierung und Solubilisierung mit 0,1 % NP40 unterzogen wurden. Die Zellen wurden markiert mit (A) , einem polyklonalen Kaninchen-Anti US6-Antiserum, welches durch Immunisierung von Kaninchen mit KLH-gekoppelten synthetischen Peptiden der Aminosäuren 20 - 29 der US6-Sequenz erzeugt wurde und Antikörpern gegen die zelluläre Proteine TAPl, BiP, p53 bzw. gegen die eis- und medial -Zisternen des Golgi und anschließend angefärbt mit Ziege-Anti-Kaninchen IgG-FITC und Ziege-Anti-Maus IgG-TRITC. Dabei wurde in HeLa-US6-Zellen ein typisches ER Anfärbemuster beobachtet, während HeLa Kontroll - zellen negativ waren. Die Lokalisierung des Polypeptids US6 im ER wurde durch die nahezu perfekte Kolokalisierung mit dem ER- Markerprotein BiP (G. Russ et al . , J. Biol . Chem. 270 (1995) 21312; D. Vaux et al . , Nature 345 (1990) 495) und mit TAPl (G. Russ et al . , J. Biol. Chem. 270 (1995) 21312) bestätigt. Das Verteilungsmuster von US6 unterschieden sich hingegen deutlich von dem des Markers p53 für das endoplasmatischen Reticulum Golgi Zwischenkompartement (ERGIC) (A. Schweizer et al . , Eu- rop. J. Cell. Biol. 53 (1990) 185; Figur 2D) und dem, welches mit einem coatomerspezifischen mAb, der an Cis- und Medial- Golgi-Zisternen bindet, (B. J. Palmer et al . , J. Biol. Chem. 268 (1993) 12083) erhalten wurde.
2.3 Wechselwirkung von US6 mit zellulären Komponenten
Zur Untersuchung, mit welchen zellulären Komponenten US6 wechselwirkt, wurde US6 aus Digitonin-Lysaten, welche aus HeLa-US6 Transfektanten hergestellt wurden, immunpräzipitiert . Dabei wurden Banden mit ungefähren Molekulargewichten von 97 kDa, 70 kDa, 55 kDa, 48 kDa und 44 kDa zusammen mit US6 kopräzipitiert (siehe Fig. 2A) . Es wurde festgestellt, daß davon nur die Banden bei 48 kDa, 44 kDa und 21 kDa vollständig sensitiv gegenüber Endoglykosidase H waren, was eine N-verknüpfte Gly- kosilierung und Retention dieser Moleküle im ER anzeigt. Zur Identifizierung der Bestandteile der US6 Komplexe wurde das aus einem Digitonin-Lysat von HeLa-US6 Zellen gewonnene Immun- präzipitat in einem 1,5 % SDS enthaltenden NP40 Lysepuffer erwärmt, was in der Freisetzung der Proteine resultierte (siehe Fig. 2B, Spur 1) .
Für eine Reimmunpräzipitation wurden HeLa-US6- und Kontroll- zellen über Nacht metabolisch markiert und in einem l%igen Digitonin-Lysin-Puffer lysiert, bevor eine Immunpräzipitation mit Anti-US6-Antikörpern durchgeführt wurde. Nach dem Waschen wurden die präzipitierten Proteine in einem 1,5 % SDS enthaltenden 1 % NP40 Lysepuffer gelöst und für 35 min auf 65 °C erwärmt. Nach Verdünnung auf eine SDS Endkonzentration von 0,15 % wurden die Anti-US6-Antikörper durch zweimalige Inkubation mit Protein A-Sepharose entfernt, bevor eine Reimmunpräzipitation des Überstands mit polyklonalen Kaninchenantikörpern gegen Calreticulin und BiP (StressGen, Victoria, BC, Kanada) , freies MHC I Schwere Kette (HC) (bezogen von Dr. H. L. Ploegh, Cambridge, MA) und gegen Calnexin (bezogen von Dr. M. Brenner, Boston, MA) durchgeführt wurde.
Eine Repräzipitation mit Antikörpern gegen TAPl und TAP2 (Fig. 2B, Spur 2) Klasse I HC (Fig. 2B, Spur 3) und Calnexin (Fig. 2B, Spur 4) ergab deutliche Banden mit den erwarteten Molekulargewichten der Proteine zusammen mit einer schwächeren Bande bei 21 kDa, die US6 entspricht. Eine Repräzipitation mit Anti- TAP1/2 oder Anti-Klasse I schwere Kette resultierte ebenfalls in einer Bande von 48 kDa, welche Tapasin entspricht (B. Ort- mann et al . , Nature 368 (1995) 864; B. Sadasivan et al . , Immu- nity 5 (1996) 103) .
Eine Repräzipitation mit einem Anti-Calreticulin-Antikörper (Fig. 2B, Spur 5) ergab kleine Mengen von US6, während dies mit Anti-BiP nicht der Fall war (Fig. 2B, Spur 6) . Im Gegensatz dazu gelang es bei der Immunpräzipitation mit Antikörpern gegen jß2-Mikroglobulin (ß2m) nicht, das Protein US6 zurückzugewinnen. Daraus ist ersichtlich, daß US6 eine direkte Wechsel - Wirkung mit dem vor kurzem beschriebenen transienten Assemblierungskomplex zeigt, der TAPl/2, Tapasin, Klasse I HC und Calreticulin enthält (B. Sadasivan et al . , Immunity 5 (1996), 103) . Zusätzlich bindet US6 am Calnexin, welches als molekulares Chaperon in Schritten vor der Faltung der schweren MHC I Kette beteiligt ist (E. Degen et al . , J. Cell. Biol. 112 (1991), 1099; S. Rajagopalan et al . , Science 263 (1994), 387).
2.4 Zellulärer Wirkungsmechanismus von US6
2.4.1
Es wurde gezeigt, daß der Cytosol -TAP- Inhibitor ICP47 mit der ATP-unabhängigen Bindung von Peptiden an den Transporter konkurriert (K. Ahn et al . , EMBO J. 15 (1996), 3247; R. Tomazin et al., EMBO J. 15 (1996), 3256). Unter Verwendung des pho- toaktivierbaren radiojodierten Peptids [125 I] TYDNKTRA [4- Trifluormethyl-diazirinyl) phenylalanin] wurde untersucht, ob eine Bindung von Peptiden an TAP in Gegenwart von US6 auftreten kann. Hierzu wurden nach der Methode von Nijenhuis et al . , J. Immunol . 156 (1996), 2186 steigende Mengen des Photopeptids mit Mikrosomen inkubiert, die aus vacUS6 infizierten und vac- Kontroll-infizierten HeLa-Zellen in Abwesenheit von ATP präpariert worden waren. Die UV-Quervernetzung und Immunpräzipitation mit TAPl spezifischen Antikörpern resulierte in einer Bande bei 70 kDa, deren Intensität im Vergleich zur Kontrolle nicht verändert war. Dieses Ergebnis zeigt, daß der Mechanis- mus von US6 für die Blockade des Peptidtransports durch TAP verschieden von ICP47 ist, das direkt die Peptidbindung an TAP hemmt .
2.4.2
Um zu untersuchen, welche Rolle die US6-assoziierten Polypeptide für die Inaktivierung von TAP1/2 spielen, wurde US6 mRNA (hergestellt durch in vitro Transkription von pcDNAIneo-US6 mit T+ RNA-Polymerase, Promega, Heidelberg, Deutschland) in Gegenwart von Mikrosomen in vitro translatiert , die aus HLA- A^'C* Tapasin-negativen LCL721.220 und HLA-A, B, C-negativen, aber Tapasin-positiven LCL721.221 Lymphoblastoidzelllinien hergestellt worden waren (B. Sadasivan et al . , Immunity 5 (1996) 103; R. De Mars et al . , Proc. Natl. Acad. Sei USA 82 (1985) 8183; R. Greenwood et al . , J. Immunol . 153 (1994), 5525; Grandea III et al . , Science 270 (1995) 105). Die Mikro- s somen wurden auf ATP abhängigen Peptidimport untersucht . In Gegenwart von US6 konnten die Mikrosomen aus keiner der beiden Zellinien Peptide ansammeln. MHC Klasse I schwere Ketten und Tapasin sind somit für die funktioneile Inaktivierung von TAP 1/2 entbehrlich. 0
2.4.3
HCMV exprimiert eine Kaskade von aufeinanderfolgenden US-Genfunktionen, welche den Mechanismus der Antigenpräsentation 5 durch MHC Klasse I Moleküle unterbrechen. Das (IE) Protein gpUS3, welches am Anfang einer Infektion exprimiert wird, behindert den Transport von MHC Klasse I Komplexen (K. Ahn et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA 93 (1996), 10990; T. R. Jones et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA 93 (1996), 11327). Die von 0 US2 und USll kodierten Glykoproteine leiten gebildetes MHC Klasse I HC in das Cytosol, wo es schnell abgebaut wird (E. Wiertz et al . , Cell 84 (1996), 769). Beide Gene werden praktisch bis zu einer Zeitdauer von 24 h nach einer Infektion stark exprimiert, zu späteren Zeiten aber nur sehr schwach 5 transkribiert (T. R. Jones et al . , J. Virol. 65 (1991) 2024; D. J. Tenney et al . , J. Virol. 65 (1991) 6724). Im Gegensatz dazu findet das maximale Auftreten von US6 48 bis 96 h nach einer Infektion statt, wenn andere Gene, welche mit der MHC Klasse I Antigenpräsentation interferieren, faktisch keine 0 Rolle mehr spielen. SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: Boehringer Mannheim GmbH
(B) STRASSE: Sandhofer Strasse 112-132 (C) ORT: Mannheim-Waldhof
(E) LAND: Deutschland
(F) POSTLEITZAHL: 68305
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Gen aus dem humanen Cyto megalovirus
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 2
(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER : Floppy disk
(B) COMPUTER : IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM : PC-DOS/MS -DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPA)
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1: (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 552 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: beides (D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE :1..549
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1
ATG GAT CTC TTG ATT CGT CTC GGT TTT CTG TTG ATG TGT GCG TTG CCG 48 Met Asp Leu Leu Ile Arg Leu Gly Phe Leu Leu Met Cys Ala Leu Pro 1 5 10 15
ACC CCC GGT GAG CGG TCT TCG CGT GAC CCG AAA ACC CTT CTC TCT CTG 96 Thr Pro Gly Glu Arg Ser Ser Arg Asp Pro Lys Thr Leu Leu Ser Leu 20 25 30
TCT CCG CGA CAA CAA GCT TGT GTT CCG AGA ACG AAG TCG CAC AGA CCC 144 Ser Pro Arg Gin Gin Ala Cys Val Pro Arg Thr Lys Ser His Arg Pro 35 40 45 GTT TGT TAC AAC GAT ACA GGG GAC TGC ACA GAT GCA GAT GAT AGC TGG 192 Val Cys Tyr Asn Asp Thr Gly Asp Cys Thr Asp Ala Asp Asp Ser Trp 50 55 60 AAA CAG CTG GGT GAG GAC TTT GCG CAC CAA TGC TTG CAG GCG GCG AAA 240 Lys Gin Leu Gly Glu Asp Phe Ala His Gin Cys Leu Gin Ala Ala Lys 65 70 75 80 AAG AGG CCT AAA ACG CAC AAA TCC CGT CCG AAC GAT AGG AAC CTT GAG 288 Lys Arg Pro Lys Thr His Lys Ser Arg Pro Asn Asp Arg Asn Leu Glu 85 90 95
GGT AGG CTG ACC TGT CAA CGA GTC CGT CGG CTA CTG CCC TGT GAT TTG 336 Gly Arg Leu Thr Cys Gin Arg Val Arg Arg Leu Leu Pro Cys Asp Leu 100 105 110
GAT ATT CAT CCT AGC CAC CGG TTG TTA ACG CTT ATG AAT AAC TGC GTC 384 Asp Ile His Pro Ser His Arg Leu Leu Thr Leu Met Asn Asn Cys Val 115 120 125
TGT GAC GGG GCC GTT TGG AAC GCG TTT CGC TTG ATA GAA CGA CAC GGA 432 Cys Asp Gly Ala Val Trp Asn Ala Phe Arg Leu Ile Glu Arg His Gly 130 135 140
TTC TTC GCT GTG ACT TTG TAT TTA TGT TGC GGG ATT ACC CTG CTG GTT 480 Phe Phe Ala Val Thr Leu Tyr Leu Cys Cys Gly Ile Thr Leu Leu Val 145 150 155 160 GTT ATT CTA GCA TTG CTG TGC AGC ATA ACA TAC GAA TCG ACT GGA CGT 528 Val Ile Leu Ala Leu Leu Cys Ser Ile Thr Tyr Glu Ser Thr Gly Arg 165 170 175
GGG ATT CGA CGT TGT GGC TCC TGA 552 Gly Ile Arg Arg Cys Gly Ser 180
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 183 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear
( i i ) ART DES MOLEKÜLS : Protein
(xi ) SEQUENZBESCHREIBUNG : SEQ ID NO : 2 : Met Asp Leu Leu Ile Arg Leu Gly Phe Leu Leu Met Cys Ala Leu Pro 1 5 10 15
Thr Pro Gly Glu Arg Ser Ser Arg Asp Pro Lys Thr Leu Leu Ser Leu 20 25 30
Ser Pro Arg Gin Gin Ala Cys Val Pro Arg Thr Lys Ser His Arg Pro 35 40 45
Val Cys Tyr Asn Asp Thr Gly Asp Cys Thr Asp Ala Asp Asp Ser Trp 50 55 60
Lys Gin Leu Gly Glu Asp Phe Ala His Gin Cys Leu Gin Ala Ala Lys 65 70 75 80 Lys Arg Pro Lys Thr His Lys Ser Arg Pro Asn Asp Arg Asn Leu Glu
85 90 95
Gly Arg Leu Thr Cys Gin Arg Val Arg Arg Leu Leu Pro Cys Asp Leu 100 105 110 Asp Ile His Pro Ser His Arg Leu Leu Thr Leu Met Asn Asn Cys Val 115 120 125
Cys Asp Gly Ala Val Trp Asn Ala Phe Arg Leu Ile Glu Arg His Gly 130 135 140
Phe Phe Ala Val Thr Leu Tyr Leu Cys Cys Gly Ile Thr Leu Leu Val 145 150 155 160 Val Ile Leu Ala Leu Leu Cys Ser Ile Thr Tyr Glu Ser Thr Gly Arg
165 170 175
Gly Ile Arg Arg Cys Gly Ser 180

Claims

Ansprüche
1) . Isolierte Nucleinsäure, welche für ein die MHC Klasse I Antigenpräsentation beeinflussendes Polypeptid codiert, umfassend
(a) die in SEQ ID NO. 1 dargestellte Nucleotidsequenz mindestens im Bereich zwischen den Nucleotiden 58 und 88,
(b) eine der Sequenz aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nucleotidsequenz oder
(c) eine mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nucleotidsequenz .
2) Nucleinsäure nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Homologie von mehr als 80% zu der in SEQ ID No. 1 dargestellten Nucleotidsequenz aufweist.
3) Modifizierte Nucleinsäure oder Nucleinsäureanalogon, die eine Nucleotidsequenz nach Anspruch 1 oder 2 oder einen mindestens 12 Basen langen Abschnitt davon aufweist.
4) Rekombinanter Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens eine Kopie einer Nucleinsäure nach Anspruch 1 oder 2 oder einen Abschnitt davon enthält .
5) Vektor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß er ein eukaryontischer Vektor ist. 6 ) Zelle , dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einer Nucleinsäure nach Anspruch 1 oder 2 oder einem Vektor nach Anspruch 4 oder 5 transformiert oder transfiziert ist.
7) Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Säugerzelle ist.
8) Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es von einer Nucleinsäure nach Anspruch 1 oder 2 codiert ist .
9) Polypeptid nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es
(a) eine in SEQ ID No. 2 dargestellte Aminosäuresequenz mindestens im Bereich zwischen den Aminosäuren 20 und 29,
(b) eine mehr als 70% zur Sequenz aus (a) homologe Aminosäuresequenz oder/und
(c) eine mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) immuno- logisch kreuzreaktive Aminosäuresequenz aufweist.
10) Verwendung des Polypeptids nach Anspruch 8 oder 9 oder von Fragmenten dieses Polypeptids als Immunogen zur Herstellung von Antikörpern.
11) Antikörper gegen ein Polypeptid, nach Anspruch 8 oder 9.
12) Antikörper nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen das gesamte Polypeptid oder eine Peptidse- quenz entsprechend den Aminosäuren 20 bis 29 aus SEQ ID No. 2 gerichtet ist. 13) Pharmazeutische Zusammensetzung dadurch gekennzeichnet, daß sie als aktive Komponente umfasst:
(a) eine Nucleinsäure nach Anspruch 1 oder 2,
5 (b) eine modifizierte Nucleinsäure nach Anspruch 3,
(c) einen rekombinanten Vektor nach Anspruch 4 oder 5,
(d) eine Zelle nach Anspruch 6 oder 7,
(e) ein Polypeptid nach Anspruch 8 oder 9 oder/und
(f) einen Antikörper nach Anspruch 11 oder 12. 0
14) Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 13 als diagnostisches Mittel.
15) Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 13 zur 15 Herstellung eines therapeutischen Mittels.
16) Verwendung nach Anspruch 15 zur Modulation des Immunsystems .
20 17) Verwendung nach Anspruch 15 oder 16 zur Inhibierung der Antigenpräsentation durch MHC Klasse I Moleküle an der Oberfläche von Zellen.
18) Verwendung nach einem der Ansprüche 14-17 in der Genthe- 25 rapie.
19) Verwendung nach Anspruch 18 zur Verringerung der Immuno- genität von transfizierten Zellen.
30 20) Verwendung nach einem der Ansprüche 15 bis 19 in Kombination mit mindestens einem weiteren immunmodulatorisch wirkenden Mittel .
35 21) Verwendung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß weitere immunmodulatorisch wirkende Mittel ausgewählt ist aus viralen MHC-Klasse I Inhibitoren und dafür codierenden Nucleinsäuren.
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