KR20020011418A

KR20020011418A - Ｍａｇｅ로부터 유래된 면역성 펩티드 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20020011418A
Application number: KR1020017014828A
Authority: KR
Inventors: 트라베르사리카티아; 탄자렐라실비아; 볼디그논클라우디오
Original assignee: 제네라 에스.피.아.
Priority date: 1999-05-21
Filing date: 2000-05-17
Publication date: 2002-02-08
Also published as: AU5067600A; CN1227264C; HK1047116A1; ITMI991121A1; CA2374354A1; AU777474B2; IL146605A0; JP2003502026A; CN1360595A; WO2000071573A2; EP1179019A2; WO2000071573A3; IT1312568B1

Abstract

MAGE 과(family)의 단백질로부터 유도된 펩티드, 종양 치료에 면역유발 물질로서 전기 펩티드의 사용 용도, 전기 펩티드를 포함하는 조성물, 종양세포에 대한 세포독성 반응을 유도하는 방법, 조직적합 항원(histocompatibility antigen)을 발현하지 않는 흑색종 세포주 및 전기 세포주의 응용.

Description

ＭＡＧＥ로부터 유래된 면역성 펩티드 및 그의 용도{Immunogenic peptides derived from MAGE and the use thereof}

지난 수년 간, 종양 특이적 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte, CTL)를 사용하여 종양 항원을 암호화하는 몇 개의 유전자를 분리하였다(참조: Van den Eynde, B. J. et al., Curr. Opin. Immunol., 9: 684-693, 1997). 암 및 정상 조직에서의 발현 양상에 따라, 종양 특이성 및 임상적 타당성에 의거하여 전기 종양 항원들을 4 종류로 분류할 수 있다. 첫 번째 종류는 MAGE(Melanoma Associated Antigen), GAGE 및 BAGE 등과 같은, 정소 생식세포 이외의 정상 조직에서는 발현되지 않고 각기 다른 조직 기원의 다양한 종양에서 발현되는 유전자에 의해 암호화되는 항원들이다. 두 번째 종류는 티로시나아제(Tyrosinase), Melan-A/MART-1, gp100, TRP-1 및 TRP-2 등과 같은, 흑색종(melanoma) 및 흑색종세포(melanocyte)에서만 발현되는 분화 항원들을 대표한다. 세 번째 종류에 속하는 항원은 광범위하게 발현되는(ubiquitously expressed) 유전자의 점 돌연변이(point mutation)에 의해 발생된다. 최근에 비로소 정의된 네 번째 종류의 항원은 TRP-2-INT2에 의해 대표되는데, 흑색종 사이에 공유되나 흑색종 계열의 정상세포에서는 발현되지 않는 항원이다.

특히, MAGE 과(family)에 속하는 종양-항원이 상당한 관심을 일으켰는데, 그 이유는 전기 MAGE 과 종양항원 중의 6개, 즉 MAGE-1, 2, 3, 4, 6, 및 12가 흑색종, 폐암, 방광암, 난소암 및 유방암을 포함하는 일차 종양 및 전이 종양의 상당한 부분에 의해 선택적으로 발현되기 때문이다(참조: Van der Bruggen, P., et al., Science, 254: 1643-1647, 1991).

8 내지 10개 아미노산 길이의 펩티드 중에서, MAGE-1 및 MAGE-3 단백질의 세포내 처리 과정으로부터 유도된 9개 아미노산 펩티드(참조: Van der Bruggen, P., et al., Science, 254: 1643-1647, 1991)가 개시되었고 면역유발 물질로서 제안되었다(참조: WO 95/19783).

MAGE-1 및 MAGE-3에 의해 암호화된 항원성 펩티드의 사용에 기초하여, 흑색종 및 다른 암 질병에 의해 고통받는 환자들에 대한 백신접종 임상 시험이 진행중에 있다(참조: Marchand, M. et al. Int. J. Cancer 80: 219-230, 1999). 현재, MAGE-2, 4 및 6 항원은 실제로 종양항원으로 간주되고 있지 않으며 따라서 종양 특이적 면역요법에 대한 표적으로서 사용되고 있지 않다. 그 이유는 MAGE-2, 4, 6로부터 유도된 펩티드를 인식할 수 있는 세포독성 T 림프구가 아직 식별되지 않았기 때문이다.

펩티드 사용에 기초한 치료적 접근법은, 제한된 숫자의 규명화된 CTL 에피톱(epitope)(예를 들어, 종양-항원-펩티드 및 적당한 HLA class I 대립유전자산물) 및 1가지 항원만 인식하는 백신에 의해 유발된 면역반응을 피할 수 있는 항원-손실 변형체(antigen-loss variant)의 in vivo 발생에 의해 제한받는다(참조: Restifo, N. P., et al., J. Natl. Cancer. Inst., 88: 100-108, 1996). 특히, 면역화 방법에 있어서 실패의 주요 요인이 되는 항원-손실 변형체의 발생이, 예를 들어 HLA class I 대립유전자의 손실 또는 하강 조절(downregulation)로 나타나는 분자적 결함(참조: Garrido, F., et al., Immunol. Today, 14: 491-499, 1993)의 결과로서, 종양 반응성 림프구에 의해 인식되는 항원을 발현하는 데 실패한 종양세포의 선택(selection)에 기인한다는 것이 발견되었다. 그러나, 어떤 환경하에서는 종양은 면역 조절을 피하기 위한 또 다른 메카니즘을 사용하여 종양 항원을 암호화하는 유전자를 잃거나 변형시킨다(참조: Jager, E. et al., Int. J. Cancer, 71: 142-147, 1997).

대개, 종양-특이적 백신접종은 잘 알려진 종양 항원을 발현하는 종양 및 제한된 HLA 대립유전자를 가지고 있는 환자들에게만 적용된다. 불행하게도, 대부분의 암 환자들이 이러한 기준을 만족하지 못한다. 따라서, 바람직하게는 광범위의, 즉 보다 많은 조직 기원의 종양에 의해 발현되거나 또는 같은 종양에서 다양한 형태로 발현되는, 항 종양 백신접종에 사용할 수 있는 새로운 항원 결정기(antigenic determinant)를 식별할 필요가 있다.

본 발명은 MAGE 과(family) 단백질로부터 유도된 펩티드 및 종양의 치료 및 예방에 사용되는 면역 물질로서의 전기 펩티드의 용도에 관한 것이다.

도 1은 MSR3-mel 및 MSR3-B37에 의한 HLA-class I 분자의 발현을 나타낸 도이다.

도 2는 CTL 337에 의한 HLA-B*3701-항체의 인식을 나타낸 도이다.

도 3은 CTL 337에 인식되는 종양-항원의 식별을 나타낸 도이다.

도 4 A)는 펩티드 MAGE._127-136.의 CTL337 인식을 나타낸 도이다.

도 4 B)는 펩티드 M4._127-136및 M12.1_127-136의 HLA-B*3701에 대한 결합을 나타낸 도이다.

도 5는 CTL337에 의한 MAGE-6 양성 흑색종 세포주의 인식을 나타낸 도이다.

본 발명의 첫 번째 측면인, 새로운 HLA-B *3701-제한된 에피톱을 식별하는, MAGE-1, 2, 3, 4, 6 및 12 유전자의 상동성 영역(homologous region)에 의해 암호화된 펩티드 그룹이 발견되었다.

각각의 기원에 따라, 본 발명의 펩티드는 MAGE-1, 2, 3, 4, 6, 12_127-136로 명명되었으며, 서열번호 1 내지 3에 개시된 서열을 가지고 있다. MAGE-1, 2, 3, 6_127-136는 서열 번호 1에 개시된 같은 서열을 가지는 반면, MAGE-4_127-136및 12_127-136는 각각 서열 번호 2 및 3에 개시된 서열을 갖는다.

in vitro 세포 독성 분석 결과, 세포독성 T 림프구는 MAGE-1, 2, 3, 4, 6, 12의 서로 다른 항원을 발현하는 다양한 세포주 상의 HLA-B*3701 조직 적합 대립 유전자(histocompatibility allele)에 결합된 본 발명의 펩티드를 인식하고 활성화되는 것이 증명되었다. 상기 분석에서, 서열 번호 1을 가지는 펩티드가 가장 높은 활성을 나타내었고 따라서, 가장 바람직한 펩티드이다.

MAGE 과의 다양한 항원에 공통적인 에피톱을 식별하는 것은 상기 언급된 결함을 적어도 부분적으로 극복하도록 한다는 점에서 상당히 유리하다. 보다 중요하게, 그러한 "복수항원성(pluriantigenic)" 에피톱, 즉 MAGE 과의 보다 다양한 항원에 의해 공유되는 에피톱의 사용은 상기 언급된 항원성의 손실을 극복하도록 해 주는데, 그 이유는 흔히 종양이 둘 이상의 MAGE 유전자를 같이 발현하여, 본 발명의 펩티드에 의해 유도되는 면역 반응의 손실이 거의 일어나지 않게 하기 때문이다. 이것은 성공적인 암 백신접종 임상 시험을 받을 수 있는 환자의 수를 증가하도록 한다.

비록 MAGE-1 및 MAGE-3의 비존재하에서, 12%의 난소암이 MAGE-2 및/또는MAGE-6를 발현한다고 알려졌지만, MAGE-2 및 MAGE-6의 면역유발 능력은 현재까지 증명되지 않았다는 사실은 강조되어야 한다.

본 발명의 펩티드는 바람직하게는 예를 들어 Merrifield(참조: Science 232: 341-347, 1986) 및 Barany and Merrifield(참조: The peptides, Gross and Meienhofer, eds (N.Y., Academic Press, pp. 1-284(1979))에 기술된 방법을 따라서 합성적으로, 통상적인 기술로 제조할 수 있다. 용액 내, 고체상 내 또는 자동화 합성기(참조: Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., Rockford III., Pierce Chemical Co. (1984))를 가지고 합성을 수행할 수 있다. 선택적으로, 재조합 DNA 기술 또는 원하는 절편을 함유한 자연산 단백질 전구 물질로부터 출발하여 펩티드를 제조할 수 있다. HLA 분자에 대한 더 높은 친화도, 더 높은 면역 유발성, 면역 반응 유도의 보다 높은 선택성 또는 투여 후 보다 높은 생체이용률 등의 보다 선호하는 특성을 획득하기 위해 예를 들어, 지질(lipid)과의 결합, 당쇄화, 다른 펩티드와의 접합에 의해 아미노산 잔기를 화학적으로 변형할 수 있다. 같은 또는 다른 클래스의 MHC 분자를 통하여 T helper 면역반응을 유도한다고 알려진 다른 에피톱과 펩티드를 또한 접합시킬 수 있다.

본 발명은 더 나아가서 여기 기술된 펩티드의 유효량을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 바람직한 실시태양에 의하면, 전기 조성물은 암에 걸리기 쉬운 환자의 예방 백신접종 또는 암환자의 치료 백신접종에 특히 적합한 백신이다. 활성 성분에 부가하여, 전기 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다. "유효량"은 종양에 대해 효율적인 CTL 반응을 유발하는데 충분한 양을 의미한다.그러한 양은 사용한 펩티드, 투여 경로 및 유형, 치료될 병의 심각성, 환자의 일반적 상태에 의존할 것이며 대개 1 달 간격, 또는 더 가까운 시간에서 3회 또는 그 이상의 투여로 100 내지 300μg의 범위에 있다. 두 번의 피하(subcutaneous) 접종 및 두 번의 피부 내(intradermal) 접종이 효과적인데, 각각의 피하 접종에 대해서는 전체 투여용량의 4/10에 해당하는 투여량으로, 각각의 피부 내 접종에 대해서는 전체 투여용량의 1/10의 투여량으로 한다. 가능하면, 각각의 백신 접종시, 주입 부위를 변화시킨다. 백신의 제조 및 사용에 관한 기술은 당업계의 전문가에게 잘 알려져 있고, 예를 들어, Paul, Fundamental Immunology, Raven Press, New York(1989) 또는 Cryz, S. J., Immunotherapy and Vaccines, VCH Verlagsgesselschaft (1991)에 기술되어 있다. 백신은 대개 주사용 현탁액 또는 용액의 제형으로 제조되나, 고체 또는 리포조옴의 제조형태로 사용될 수 있다. 면역유발 성분을 유화제, 완충 물질 및 백신의 효율을 증진시키는 아주방트 등의 약학적으로 허용가능한 부형제와 혼합할 수 있다. 백신을 단일 투여 또는 다회 투여 계획에 따라 투여할 수 있다. 다회 투여의 경우, 1 내지 10회의 분리된 투여량이 제공되며, 각각은 1 내지 1000μg 범위의 항원 양을 포함하며, 면역 반응을 유지하고 증진시키는 데 필요한, 적당한 시간 간격의 2차 투여(booster)가 뒤따르며, 필요하다면, 수개월 후 추가적인 투여가 뒤따른다. 각각의 경우에, 치료 섭생(regimen)은 치료환자의 반응, 환자의 일반적 상태 및 종양의 진행상황에 의존한다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 세포독성 T 림프구 활성화에 적합한 조건에서본 발명의 펩티드 및 T 림프구를 접촉시키는 단계를 포함하는, 하나 또는 그 이상의 MAGE 항원을 발현하는 종양 세포에 대한 세포독성 반응을 유도해내는 방법을 제공한다. 원하는 세포 독성 효과를 획득하기 위한 적당한 조건이란 배양액에서 T 림프구를 직접 펩티드에 노출시키거나, 펩티드를 HLA class I 분자, 바람직하게는 HLA-B*3701과 미리 결합 또는 전기 HLA 분자를 발현하는 항원제시세포(antigen presenting cell, APC)에 결합시키고 T 림프구에 노출시키는 것을 포함한다. 적당한 항원제시세포는 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC), 수상세포, 대식세포 및 활성화된 B 세포이다. 항원제시세포 배양액에 펩티드를 첨가하고 서로 결합하기에 충분한 시간 후에, 활성화되고 분열할 T 림프구를 포함하는 세포군을 첨가한다. 림프구를 환자로부터 취하여, 활성화 후에 다시 그 환자에게로 재주입한다. 항원제시세포 상에 존재하는 조직 적합(histocompatibility) 분자의 "스트리핑(stripping)"을 통해, 펩티드/항원제시세포 결합을 증가시킬 수 있다. 선택적으로, 항원제시세포를 HLA-B*3701 조직적합 대립유전자를 발현하도록 조작할 수 있다. 더 나아가서, 배양 배지는 CD8+ 전구체 활성화를 증진시키는 하나 또는 그 이상의 사이토카인(cytokine)을 포함할 수 있다. 환자로의 T 림프구 재주입 전에, 특정 리간드를 갖는 친화성 컬럼을 통해 림프구를 정제할 수 있다.

본 발명은 또한 HLA class I 분자, 바람직하게는 HLA-B*3701 분자 및 서열 번호 1 내지 6번으로부터 선택된 펩티드로 구성되는 복합체를 특이적으로 인식하는 세포독성 T 림프구 세포주에 관한 것이다. 세포독성 T 세포주는 림프구 풀(pool)로부터 출발하여, 여기 기술된 항원 결정기를 포함하는 종양세포에 노출시 활성화되는 세포들을 선별하여 획득할 수 있다.

또 다른 측면에 의하면, 본 발명은 본 발명의 펩티드를 암호화하는 벡터(예를 들어, 아데노바이러스, 렌티바이러스 또는 MLV 등으로부터 유도된 바이러스 또는 레트로바이러스 벡터)로 조작된 항원제시세포, 수상세포 등의, 면역반응을 유도하는 세포를 제공하는데, 조건적으로 상기 펩티드는 적당한 담체와의 융합 단백질 형태로서 세포 내에서 효율적으로 발현되고, 처리되고 세포 표면상에 노출된다. 이 경우에, 본 발명에 개시된 에피톱을 암호화하는 DNA를, 높은 발현수준이 필요하다면 CMV 혹은 SV40와 같은 바이러스 벡터 또는 에크디손(ecdisone)에 의해 조절되는 유도 프로모터 등의 적당한 프로모터 조절하에서 적당한 발현벡터 속으로 삽입한다. 이 경우, 기술된 에피톱은 127-136 아미노산에 해당하는 MAGE-1 cDNA 영역(Genbank, N.M77481)에 의해 암호화되며, MAGE 과의 다른 항원에 대해서는 상동 영역에 의해 암호화된다:

아미노산 MAGE-1 아미노산 서열 누클레오티드(cDNA)

127-136 REPVTKAEML 562-590

또 다른 측면에 의하면, 본 발명은 검출할 수 없는 수준의 조직적합 항원을 발현하는, MSR3-mel이라고 명명된 흑색종 세포주에 관한 것이다. 상기 세포주는 N. PD99001 하에서, CBA - interlab Cell Line Collection - (Genua, Italy)에 기탁되었다. 실시예 1에 더욱 자세히 기술되었듯이, 조직적합 시스템으로부터의 임의의 대립유전자를 암호화하는 cDNA로 상기 세포주를 트랜스펙션하고 곧 이어 상기 세포주가 발현하지 않는 종양 항원 또는 그것의 절편, 또는 바이러스 항원을 암호화하는 cDNA로 상기 세포주를 트랜스펙션시킨 후 상기 세포주를 in vitro 항원특이효과를 유도하는데 사용하거나, in vivo에서 능동적 면역요법의 적용에 따라 환자에 재주입할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 종양 항원은 흑색종 항원이며 조직 적합 분자는 HLA class I B*3701이다. 새로운 항원 결정기의 식별 및/또는 후천성 면역요법에 사용할 항원특이적 세포독성 T 림프구의 ex vivo 유발 및 팽창에 MSR3-mel 세포주를 편리하게 사용할 수 있다. 더 나아가서, HLA 분자 및/또는 종양 항원을 암호화하는 유전자로 유전적으로 변형된 MSR3-mel 세포주를 백신으로 사용할 수 있다.

또 다른 측면에 의하면, 본 발명은 상기 기술된 펩티드에 대한 항체, 그것의 절편 또는 유도체에 관한 것이다. 항체를 생산하는 일반적인 방법론은 잘 알려져 있으며, 예를 들어, Kohler and Milstein(참조: Nature, 256, (1975)) 또는 J.G. R. Hurrel(참조: Monoclonal hybridoma antibodies: Techniques and applications, CRC press Inc., Boco Raron, FL(1982))에 기술되어 있다. 항체는 단일클론 항체, 또는 다중클론 항체를 포함하는데, 바람직하게는 단일클론항체이며 그것의 절편이란 F(ab')₂, Fab, Fv 또는 scFv이다.

도면의 설명

도 1: MSR3-mel 및 MSR3-B37에 의한 HLA-class I 분자의 발현. 종양세포를 mAb W6/32(항-HLA-class I) 또는 이소타입(isotype) 대조항체와 배양하고, 세척한 후, 플루오레신(fluorescein)과 결합된 항-생쥐 Ig 항체로 표지시켰다. HLA-B*3701을 MSR3-mel로 트랜스펙션 하기 전 및 후에 분석을 수행하였다.

도 2: CTL 337에 의한 HLA-B*3701-항체의 인식. 다양한 E/T 비율에서 자가조직의(autologous) 흑색종 MSR3-mel 및 MSR3-B37에 대해서 및 동종조직의(allogenic) 흑색종 ET1에 대하여 CTL337의 세포독성 활성을 측정하였다.

도 3: CTL 337에 인식되는 종양-항원의 식별. HLA-B*3701을 단독으로 또는 MAGE-1, 2, 3, 6 및 12 유전자를 코딩하는 cDNA와 함께 COS-7 세포에 트랜스펙션하였다. 48시간 후, CTL 337을 첨가하고 방출된 IFN-γ의 양을 시약 및 실험에 기술된 대로 24시간 후에 측정하였다. MSR3-B37을 양성 대조군으로 포함하였다.

도 4: A) 펩티드 MAGE._127-136.의 CTL337 인식. 10mM로부터 시작하여 펩티드 MAGE._127-136.의 3배 희석액으로 MSR3-EBV을 배양한 후, 표준 세포독성 분석에 표적 세포로서 사용하였다. E/T 비율을 10 : 1로 고정하였다. 최고값의 절반을 용해(lysis)시키는데 필요한 펩티드의 양을 ED₅₀으로 나타내었다. B) 길항작용 분석에 사용되는 펩티드 M4._127-136및 M12.1_127-136의 HLA-B*3701에 대한 결합. 길항 펩티드는 M4._127-136펩티드 KELVTKAEML 및 M12.1_127-136펩티드 REPFTKAEML을 포함한다. HLA-B*3701과 결합할 수 없는 M3.A1(즉, M3._271-279) 펩티드를 음성 대조군으로 사용하였다. 길항 펩티드가 없는 상태에서의 용해는 52%였다.

도 5: CTL337에 의한 MAGE-6 양성 흑색종 세포주의 인식. HLA-B*3701 음성 세포주 Me 14932 및 HLA-B*3701 양성 세포주 Me 14932-LB37을 16μM의 펩티드MAGE._127-136와 함께 또는 없이 펄스하고 지시된 E/T 비율에서 표준 세포독성 분석의 표적 세포로서 사용하였다.

시약 및 방법

합성 펩티드

합성 펩티드를 PRIMM(Milan, Italy)로부터 구입하였다. 펩티드는 MAGE-1, 2, 3 및 6 유전자의 코돈 127-136에 의해 암호화된 MAGE._127-136(REPVTKAEML)이고 M4._127-136및 M12._127-136는 각각 MAGE-4 및 MAGE-12 유전자에 의해 암호화된 아미노산 127-136에 해당한다. 펩티드를 10mM DMSO에 녹이고 0.9% 염화나트륨으로 희석하였다.

HLA-B*3701 대립유전자의 서브클로닝

RNeasy Total RNA 키트(Qiagen, Hilden, Germany)에 의해 MSR3 PBL 로부터 total RNA를 제조하였다. 제조사의 방법에 따라, RNase H 활성이 없는 MMLVRT(Moloney murine leukemia virus-derived reverse transcriptase; MMLVRT RNase-H- Superscript; Gibco BRL, Gaithersburg, MD) 및 올리고-dT 프라이머를 사용하여 total RNA 2μg으로부터 한가닥의 cDNA 합성을 수행하였다. HLA-B 대립유전자의 전체 암호화 영역을 특이적으로 증폭하고 클로닝하는데 적합한 프라이머 쌍을 이용하여 300ng의 total RNA에 해당하는 cDNA를 중합효소 연쇄반응으로 증폭하였다. 1.1 kb의 중합효소 연쇄반응 산물을 진핵세포 발현벡터 pcDNA3.1(Invitrogen Corporation, Oxon, U.K.)에 서브클로닝하였다. 제한효소를사용하여 HLA-B*3701 또는 B*52011(MSR3 환자의 HLA-B37 및 B5 대립 유전자)를 암호화하는 플라스미드 클론을 식별하였다. HLA-B*3701 유전자의 서열을 결정하여 이미 개시된 DNA 서열과 일치하는지를 확인하였다. 상기 플라스미드를 pcDNA3.1/B*3701이라고 명명하였다.

흑색종 세포주의 트랜스팩션

인산 칼슘 침전 기술로 pcDNA3.1/B*3701을 흑색종 세포주에 트랜스펙션 시키고 G418로 선택하였다. HLA-A, B 및 C에 특이적인 단일클론 항체 W6/32를 사용하여 흘림 세포계측법(flow cytometry)에 의해 안정하게 트랜스펙션된 세포에서 HLA-B*3701 분자의 발현을 확인하였다.

세포독성 T 림프구 337(CTL337)의 in vitro 유도

다른 이들에 의해 이미 기술된 방법(참조: Van den Eynde, et al., Int. J. Cancer., 44: 634-640, 1989)에 약간의 변형을 가하여 CTL337을 획득하였다. 간단히 하면, MSR3 환자로부터 피콜 농도구배(Ficoll gradient)에 의해 PBL을 분리하고 10% 인간 혈청, 글루타민 및 항생제를 첨가한 IMDM 배지 2ml에 감마선 처리한 자가조직 MSR3-B37 흑색종 세포(0.5 내지 1 × 10⁵/well)와 같이 배양하였다. 3일 배양후, 10U/ml의 IL-2(Chiron, Milan, Italy) 및 5ng/ml의 IL-7(Genzyme Corp.)을 첨가하였다. 0.5 × 10⁵개의 감마선 조사 세포로 림프구를 주마다 재 흥분(restimulation) 시켰으며, 3번 재흥분 후에 세포독성 분석 시험을 하였다. 5번째 재흥분 후, 2 × 10⁵개의 감마선 조사된 LG2-EBV를 먹이 세포(feeder cell)로서 첨가하였고, IL-2의 양을 50U/ml로 증가시켰다.

세포독성 활성 분석 및 펩티드 결합 연구

예전에 기술된 방법(참조: Fleischhauer, K., et al., Cancer Res., 58: 2969-2972, 1988)인 크롬(chromium) 방출 분석으로 세포독성 T 세포주의 용해 활성(lytic activity)을 시험하였다. 크롬 방출 분석으로 펩티드를 시험하였다: 고정된 주효세포(effector cell)/표적세포(target cell) 비율(E/T ratio)에서 주효세포를 첨가하기 전에⁵¹Cr-표지된 표적 세포를 다양한 농도의 펩티드와 함께 96웰 플레이트에서 1시간동안 실온에서 배양하였다. M4._127-136및 M12._127-136펩티드의 HLA-B*3701 분자에 대한 결합을 예전에 기술된 방법(참조: Herman, J., et al., Immunogenetics, 43: 377-384, 1996)인 길항작용 분석(competition assay)으로 연구하였다. 표준 펩티드로서, 본 발명자들은 CTL337에 의해 인식되는 MAGE._127-136(300nM)을 사용하였다. 30:1의 E/T 비율로 CTL을 사용하였다.

MAGE-1 부절편(subfragment)의 생성

MAGE-1 cDNA를 BglII 및 EcoRI으로 잘라서 MAGE-1 유전자의 부절편(495 - 1072bp)을 획득하였다. 아가로오스 겔에서 정제 후, 절편을 pcDNA3.1(Invitrogen) 플라스미드로 클로닝하였다. 클론을 분리하고, 플라스미드 DNA를 추출하여 HLA-B*3701 유전자와 함께 Cos-7 세포로 트랜스펙션하였다.

Cos-7 세포의 트랜스펙션 및 γ-IFN 방출 분석

DEAE-덱스트란-클로로퀸(DEAE-dextran-chloroquine) 법으로 Cos-7 세포의 트랜스펙션을 수행하였다(참조: Coulie, P. G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 6458-6463, 1994). 간단히 요약하면, 1.5 × 10⁴개의 Cos-7 세포를 100ng의 pcDNA3.1/B*3701 플라스미드 및 MAGE-1, 2, 3, 4, 6, 12 유전자 중의 어느 하나의 cDNA를 포함하는 발현벡터 100ng으로 트랜스펙션하였다. 48시간후 트랜스펙션된 Cos-7 세포를 γ-IFN 분석시험에 사용하였다: 흥분 후 5일째에 5000개의 반응 CTL을 25 U/ml IL-2가 첨가된 IMDM/10% 인간혈청 150μl에 첨가하였다. 37℃에서 24시간후, 100μl의 상등액을 수집후, 제조사의 방법에 따라서, γ-IFN 분석 키트(Genzyme, MA)를 사용하여 γ-IFN 농도를 측정하였다.

레트로 바이러스 벡터를 매개로 한 Me14932로의 HLA-B*3701 유전자 전달

MSR3 환자의 HLA-B*3701 분자를 암호화하는 레트로 바이러스 벡터 B37-CSM을 예전에 기술된 방법(참조: Fleischhauer, K., et al., J. Immunol., 159: 2513-2521, 1997)에 의해 제조하였다. 간단히 설명하면, HLA-B*3701 분자를 암호화하는 전체 길이 cDNA를 바이러스 LTR의 조절하에 있도록 클로닝하는 반면, 인간의 저 친화성 신경세포 성장 인자 수용체(Low affinity nerve growth factor receptor)의 잘려진 형태(truncated form, ΔLNGFR)는 SV40 프로모터에 의해 조절되도록 하였다. 자기지향성 생쥐 섬유아세포(ecotropic murine fibroblast) 세포주 GP+E86을 표준적인 인산 칼슘 방법으로 레트로 바이러스 구조물 30μg을 일시적으로 트랜스펙션하였다. 8μg/ml의 폴리브렌(polybrene) 존재하에서 양성지향적 생쥐 패키징(amphotropic murine packaging) 세포주인 GP+env Am12에 대해, 트랜스펙션된 GP+E86 세포의 48시간 배양상등액으로 4시간동안 감염시켰다. LNGFR-특이적 단일클론 항체 20.4(American Type Culture Collection, Rockville, MD)로 코팅된 자기 베드(magnetic bead, Dynabeads M-450, Dynal A. S., Oslo, Norway)에 의해 ΔLNGFR을 발현하는 감염된 패키징 세포를 면역 선택하였다. 폴리브렌 8μg/ml의 존재하에서 레트로 바이러스를 포함하는 상등액과 배양함으로써 Me 14932의 트랜스덕션을 수행하였다. 적어도 4시간동안 5 또는 6회의 감염을 수행하였다. LNGFR-특이적 단일클론 항체 20.4 및 HLA-Bw4-특이적 단일클론 항체를 가지고 면역형광(immunofluorescence) 분석을 통하여 감염의 효율을 평가하였다.

RT-PCR 분석

MAGE-1, 2, 3, 4, 6, 12 및 β₂-마이크로글로불린(microglobulin, β₂m) cDNA를 PCR 증폭으로 검출하였다. 반응 혼합물은 5μl의 cDNA 혼탁액, 4μl의 10mM dNTPs(각각의 dNTP 2.5mM을 포함하는), 5μl의 10x DNA 중합효소 완충액(Finnzymes Oy, Espoo, Finland), 2 U Dynazyme DNA 중합효소(Finnzymes Oy)를 포함하며, 멸균된 증류수로 전체반응 부피를 50μl로 맞추었다. 올리고누클레오티드 프라이머 서열 및 PCR 증폭 프로그램에 대해서는 Weynants, P., et al., Int. J. Cancer, 56: 826-829, 1994; MAGE-1, 2 및 3, De Plaen, E., et al., J. Immunol., 159: 2513-2521, 1997; MAGE-4, 6 및 12를 참조하면 된다. 센스 프라이머 베타 5'(5'-AAC CAC GTG ACT TTG TCA CAG C-3') 및 안티센스 프라이머 베타 3'(5'-CTG CTC AGA TAC ATC AAA CAT G-3')을 사용하여 β₂m cDNA를 증폭하였다; PCR증폭을 30사이클(94℃에서 1분, 56℃에서 30초, 72℃에서 2분) 동안 수행하였다; β₂m 증폭 산물의 예상되는 길이는 230 염기쌍이다. β-액틴(actin) 특이적 올리고누클레오티드 프라이머로 PCR을 수행하여 RNA 집합도(integrity)를 시험하였다(참조: De Smet, C., et al., Immunogenetics, 39: 121-129, 1994). EtBr의 존재하에 아가로오스 겔에서 적당한 크기의 밴드가 보일때 시료를 양성이라고 평가하였다.

본 발명은 하기 실시예에 의해서 더욱 더 자세하게 예시될 것이다.

실시예 1 : MSR3-B37로 항원-특이적 면역반응을 유발한다.

흑색종 세포주 MSR3는 MSR3 환자로부터 잘라낸 피부전이암으로부터 수립되었다. HLA-A, B 및 C에 특이적인 단일클론 항체 W6/32를 가지고 면역형광 분석을 하여 종양세포에 의한 HLA-class I 대립유전자의 발현을 평가하였다.

검출되지 않거나 거의 밋밋하게 검출된 수준의 관찰된 표면 분자는 면역 주효세포에 항원을 제시하기에는 부적당한 것으로 보였다(도 1). 실제로, MSR3 세포주는 자가조직 PBL로부터 세포독성 반응을 유발하는데 실패하였다. MSR3-mel에 의한 class I 세포 표면 발현의 부족은 약화된 β₂m 발현에 기인하는 것이 아니다; 그 이유는 RT-PCR 분석에 의해 β₂m -특이적 mRNA를 검출할 수 있었기 때문이다.

HLA class I 항원 발현을 회복할 수 있을지의 여부를 결정하기 위해, MSR3-mel 세포를 자가조직의 HLA-B*3701 분자를 암호화하는 cDNA로 안정하게 트랜스펙션시켰다. G418 선택 후, 흘림 세포계측법(flow cytometry)에 의해 W6/32 단일클론 항체에 의해 트랜스펙션된 MSR3-B37 세포주가 염색됨이 밝혀졌다(도 1).

MSR3-B37 세포주의 표면에 종양-특이적 항원이 존재하는가를 평가하기 위해, 전기 흑색종 세포가 종양-특이적 세포독성 주효세포를 유도하는 능력 및 이러한 CTL에 의해 용해(lysis)되는 민감성에 대해 시험하였다. 환자의 PBL을 시약 및 방법에 기술된 대로, MSR3-B37로 in vitro 상에서 자극하였다. 3회의 자극 후에, 다중클론 세포독성 T 세포주 337(CTL337)이 특이적으로 MSR3-B37 세포주를 용해하였으나 트랜스펙션되지 않은 MSR3-mel을 용해하지는 못하였다(도 2). 지기조직의 MSR3-EBV 세포 및 PHA-활성 T 블라스트(blast)는 인식되지 않았으며, 이것은 상기 CTL에 의해 인식되는 에피톱이 흑색종/흑색종 세포에 특이적이라는 것을 암시한다. 실제로, 자가조직 흑색종 세포에 부가하여, CTL337은 HLA-B*3701 양성 흑색종 세포주인 ET1도 또한 용해시켰는데(도 2), 하나 또는 그 이상의 공유된 흑색종 항원이 인식되는 것을 암시한다.

상기 자료는 MSR3 세포주의 트랜스펙션에 의해 HLA class I 발현이 회복될 수 있고, HLA-B*37701 분자로 트랜스펙션된 흑색종 세포주는 종양-특이적 세포독성 T 세포 반응을 유발할 수 있다는 것을 암시한다.

실시예 2 : CTL337에 의해 인식되는 항원성 에피톱의 인식.

CTL337에 의해 인식되는 항원을 식별하기 위해, 플라스미드 pcDNA3.1/B*3701 및 MAGE 과의 6 종류를 암호화하는 cDNA(즉, MAGE-1, 2, 3, 4, 6 및 12, 일부는 MSR3-mel 및 ET1 모두에 의해 발현된다)와 함께 트랜스펙션된 Cos-7 세포주의 존재하에서 CTL337의 γ-IFN 방출을 평가하였다. CTL337은 MAGE-1, 2, 3 및 6로 트랜스펙션된 Cos-7 세포를 특이적으로 인식하였는데, 이것은 CTL337의 표적 에피톱이 4개의 서로 다른 항원 사이에서 공유되거나 또는 몇 개의 클론을 인식할 수 있는 T 세포주의 서로 다른 구성요소들이 4개의 MAGE-유전자 산물로부터 유도된 펩티드들을 인식한다는 것을 암시한다. MAGE-4 및 MAGE-12로 트랜스펙션된 Cos-7 세포의 존재하에서는 낮은 수준의 γ-IFN이 검출되었다(도 3).

CTL337에 의해 인식되는 항원성 펩티드를 암호화하는 서열을 식별하기 위해, MAGE-1을 암호화하는 cDNA를 BglII 및 EcoRI으로 잘라 약 495 및 1072 염기쌍의 두 개의 부절편을 획득하였다. 상기 절편들을 플라스미드 pcDNA3.1로 클로닝하고 HLA-B*3701 분자와 함께 Cos-7 세포에 트랜스펙션시켰다. 495 및 1072 염기쌍 절편 각각에 202 번째 염기쌍 및 707번째 염기쌍에 인-프레임(in-frame) 시작 코돈이존재하기 때문에 트랜스펙션된 세포에서 상기 두 부절편의 발현이 확실하게 일어난다. 495 염기쌍 절편으로 트랜스펙션된 Cos-7 세포 존재하에서 CTL337에 의해 방출된 γ-IFN 수준은 전체 MAGE-1 유전자에 의해 유도된 수준에 상당하였는데, 이것은 항원성 펩티드가 이 영역안에 암호화되어 있다는 것을 암시한다. 495 염기쌍 절편에 의해 암호화된 아미노산 서열에 대해 HLA-B*3701에 대한 결합 모티프(motif)를 지니는 펩티드를 스크리닝하였다(참조: Rammensee, H.G., et al., Immunogenetics, 41: 178-228, 1995). 2번 위치에 아스파르트 산 또는 글루탐산을 갖고 9/10번 위치에 이소류신 또는 류신을 갖는 5개의 펩티드가 식별되었다. 이들중의 하나인 REPVTKAEML은 MAGE-2, MAGE-3 및 MAGE-6에 의해 암호화된 아미노산 서열에도 또한 존재한다. 역가 분석에서, CTL337에 의한 용해에 MSR3-EBV 세포주를 민감화시키는데 MAGE._127-136이라고 명명된 상기 펩티드를 사용하였다. MSR3-EBV 세포를 펩티드 REPVTKAEML로 펄스시키고 세포독성 분석에서 표적 세포로서 사용하였다(도 4a). 최대 용해값의 절반에 해당하는 펩티드 농도는 90nM이었다. HLA-B*3701에 결합할 수 있고 관련이 없는 펩티드로 펄스된 MSR3-EBV에서는 어떠한 용해도 관찰되지 않았다(도 4b).

MAGE-4 및 MAGE-12를 발현하는 Cos-7 세포의 존재하에서 CTL337에 의해 낮은 수준의 γ-IFN이 방출되었다(도 3). 상기 낮은 수준의 방출이 MAGE-4 내의 코돈 127-136에 의해 암호화된 펩티드의 인식에 의한 것인지를 증명하기 위해, 두 개의 펩티드로 펄스된 MSR3-EBV 세포를 표적으로 사용하여 펩티드 결합 연구를 수행하였다. 펩티드 M4._127-136, KELVTKAEML은 펩티드 REPVTKAEML과 두 개의 아미노산이 다르며(1번 위치의 라이신 대 아르기닌 및 3번 위치의 류신 및 프롤린), 반면에 펩티드 M12._127-136, REPFTKAEML은 오직 하나의 아미노산이 다르다(4번 위치의 페닐알라닌 대 발린). 두 개의 펩티드 양을 증가시킴에 따라, 모두 REPVTKAEML 펩티드로 표지된 MSR3-EBV의 용해를 억제하는 반면, 관련이 없는 HLA-A1 결합 펩티드(즉, M3._271-279) 로 펄스시킨 세포주의 용해는 억제하지 못하는 것으로 보아, 두 개 펩티드 모두 HLA-B*3701과 결합함이 밝혀졌다(도 4b). 그러나, M4._127-136및 M12._127-136펩티드로 펄스시킨 EBV 세포의 인식은 관찰되지 않았다.

결론적으로, 상기 자료는 CTL337이 내생적으로 처리된 MAGE-1, 2, 3 및 6 펩티드를 인식할 수 있음을 암시한다.

실시예 3 : CTL337은 MAGE-2 및 MAGE-6 유전자 산물을 특이적으로 인식한다.

현재, 인간에서 MAGE-2 및 MAGE-6에 의해 암호화된 단백질의 면역유발성이 존재한다는 증거는 아무 것도 없다. 실제로, HLA class I 분자와 결합하여 다양한 CTL에 의해 인식되는 항원 복합체를 형성하는 MAGE-1, 3, 4 및 12에 의해 암호화된 펩티드는 식별된 반면, MAGE-2 또는 MAGE-6 유전자에 의해 암호화된 펩티드는 식별되지 않았다.

펩티드 REPVTKAEML이 흑색종 내의 MAGE-2 및 MAGE-6 유전자로부터 처리되어 CTL337에 제시될 수 있다는 것을 증명하기 위해, MAGE-2 또는 MAGE-6를 발현하고,다른 MAGE 유전자는 발현하지 않는 흑색종 세포주를 탐색하였다. 불행하게도, 흑색종 내에서 MAGE 유전자의 발현은 엄격하게 상호관련되어 있으며, 대부분의 흑색종은 MAGE 과의 한 구성 요소 이상의 것을 발현한다. 실제로, MAGE-2만을 선택적으로 발현하는 흑색종 세포주는 발견할 수 없었으나, 반면에 MAGE-6만을 선택적으로 발현하는 Me 14932 흑색종 세포주를 발견하였다.

각각의 MAGE 유전자에 특이한 올리고누클레오티드 프라이머를 사용하여 RT-PCR에 의해 Me 14932 흑색종 세포주를 분석하였으며, 낮은 발현 수준으로 MAGE-6만을 발현함이 증명되었다. REPVTKAEML 펩티드가 MAGE-6 산물로부터 내생적으로 처리되어 HLA-B*3701에 의해 제시되는지를 결정하기 위하여, 시약 및 방법에 기술된 대로, Me 14932를 HLA-B*3701 및 표면 마커(surface marker) ΔLNGFR을 암호화하는 레트로 바이러스 벡터로 트랜스덕션하였다. 트랜스덕션된 Me 14932-LB37 세포를 자기 베드(magnetic bead)에 의해 ΔLNGFR 발현에 대해서 면역선택하였다. HLA-Bw4-특이적 단일클론 항체로 면역형광 분석에 의해 암시되는 바, 트랜스덕션된 Me 14932 상의 세포 표면 HLA-B*3701의 발현은 MSR-B37 흑색종 세포의 것에 비해 적어도 2배 이상 낮았다. CTL337은 세포독성 분석에서 Me 14932-LB37 세포주를 인식할 수 있었으며, 펩티드 REPVTKAEML을 헥소지너스(hexogenous)하게 첨가했을 때 용해 수준이 증가하는 반면, 펄스 또는 비펄스된 Me 14932 세포주는 인식되지 않았다(도 5). Me 14932-LB37 흑색종의 낮은 용해 수준은 MAGE-6 유전자의 약한 발현 또는 HLA-B*3701 표면 분자의 약한 발현에 관계될 수 있다.

종양 특이적 면역 요법에 대한 표적 항원의 리스트에 MAGE-2 및 MAGE-6를 포함시키는 것이 치료받을 수 있는 환자의 비율을 증가시키는지의 여부를 평가하기 위해, 다양한 조직 기원의 신선한 종양 시료로부터 MAGE-1, 2, 3 및 6의 발현을 분석하였다. 흑색종은 분석하지 않았는데, 그 이유는 서로 다른 MAGE 유전자의 발현이 명백히 상호관련되어 있기 때문이다(참조: Dalerba, P., et al., Int. J. Cancer, 77: 200-204, 1998). 결과는 난소암의 12%, 결장암 및 유방암의 5%가 MAGE-1 및 MAGE-3 없이 MAGE-2 및/또는 MAGE-6를 발현한다는 것을 암시한다(표 1). 반면, 연구된 방광암 및 폐암에서는 4개의 유전자가 항상 같이 발현되었다.

결론적으로, 상기 연구에서 보고된 자료는 MAGE-2 및 MAGE-6는 종양-특이적 면역요법에 대한 가능한 표적 항원의 리스트에 포함될 수 있으며, 본 발명의 치료법으로 혜택을 받을 수 있는 환자의 수를 증가시킨다는 것을 암시한다.

신선한 종양 시료에 의한 MAGE 유전자의 발현^(a)

조직 유형	MAGE-1	MAGE-3	MAGE-2	MAGE-6	MAGE-2 또는 MAGE-6만
폐암(n 28)^(b)	35	39	32	29	0
유방암(n 20)	30	10	10	15	5
난소암(n 25)	24	20	32	20	12
방광암(n 25)	28	28	20	24	0
결장암(n 17)	0	5	5	5	5

(a) RT-PCR 분석에 의해 결정. 결과는 RT-PCR 양성 종양의 수를 %로 나타내었다.

(b) 분석된 신선한 종양 시료의 수.

참고문헌 목록

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Claims

하기 항목으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 HLA-B*3701 대립유전자에 결합하는 펩티드:

a) REPVTKAEML;

b) KELVTKAEML; 및

c) REPFTKAEML.
제 1항의 펩티드에 대해 생성된 단일클론(monoclonal) 또는 다중클론(polyclonal) 항체.
약학적으로 허용가능한 부형제 및 제 1항의 펩티드의 유효량을 포함하는 약학적 조성물.
제 3항에 있어서, 백신 용도로서의 약학적 조성물.
T 림프구를 활성화시키기에 적당한 조건에서 제 1항의 펩티드를 T 림프구와 접촉시키는 단계를 포함하는, MAGE-1, 2, 3, 4, 6, 12 항원을 발현하는 종양 세포에 대한 세포독성 반응을 유도하는 방법.
제 5항에 있어서, 림프구는 배양액에서 펩티드에 직접 노출되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서, 펩티드는 HLA class I 분자, 바람직하게는 HLA-B*3701 대립유전자 산물과 미리 결합해 있는 것을 특징으로 하는 방법.
HLA class I 분자, 바람직하게는 HLA-B*3701 및 제 1항의 펩티드로 구성되는 복합체를 특이적으로 인식하는 세포독성 T 세포주.
N.PD99001 규약하에 CBA-Interlab Cell Line Collection에 기탁된, 조직적합 항원(histocompatibility antigen)을 발현하지 않는 흑색종 세포주.
제 9항에 있어서, HLA 분자(들) 및/또는 종양 항원(들)을 암호화하는 유전자(들)로 유전학적으로 조작된 것을 특징으로 하는 세포주.
제 10항에 있어서, 상기 HLA 분자는 class I B*3701이며, 종양 항원은 흑색종에 있는 항원인 것을 특징으로 하는 세포주.
ex-vivo에서 항원-특이적 세포독성 T 림프구를 유도하고 팽창시키기 위한 제 9항 내지 제 11항에 개시된 세포주를 사용하는 용도.
백신 제조를 위해 제 10항 및 제 11항에 개시된 세포주를 사용하는 용도.
항종양 의약품의 제조를 위해 제 1항의 펩티드를 사용하는 용도.
제 14항에 있어서, 상기 의약품은 백신인 것을 특징으로 하는 용도.