JP2002538166A

JP2002538166A - Ｍｈｃクラスｉｉによって提示されるｍａｇｅ−３由来免疫原性ペプチドおよびその使用

Info

Publication number: JP2002538166A
Application number: JP2000602269A
Authority: JP
Inventors: プロッティ，マリア，ピア; デラボナ，パオロ
Original assignee: フォンダジオーネセントロサンラファエロデルモンテタボール
Priority date: 1999-02-26
Filing date: 2000-02-23
Publication date: 2002-11-12
Also published as: ITMI990396A1; EP1161443A2; IT1309584B1; CA2364002A1; AU2913400A; WO2000052045A3; WO2000052045A2

Abstract

(57)【要約】タンパク質MAGE-3に由来するペプチド、該ペプチドを含む医薬組成物、および腫瘍に対する免疫応答を誘導するためのこれらの使用。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、MAGE-3タンパク質に由来するペプチド、および免疫刺激物質(immun
ostimulants)として、特に、CD4⁺T細胞免疫応答を刺激することができる物質と
してのペプチドの使用に関する。

【０００２】

【従来の技術】

抗腫瘍免疫性におけるCD4⁺Tリンパ球の重要性は、動物モデルにおいて明らか
にされている。CD4⁺T細胞は、抗腫瘍CD8⁺T細胞の誘導および維持のためのヘルパ
ー機能を発揮する（Greenberg, P.D., 1991., Adv. Immunol. 49:281-355; Chen
, P.ら, 1993,J: Immunol. 151:244-255; Mandelboim, O.,ら, 1995., Nat. Med
. 1:1179-1183; Mayordomo, J.I.ら, 1995, Nat. Med. 1:1297-1302; Bellone,
M.ら, 1997,. J. Immunol. 158:783-789; Ostrand-Rosemberg, S.ら, 1990,. J.
Immunol. 144:4068-4071; James, R.ら, 1991, Immunology 72: 213-218）。ま
た、CD4⁺T細胞はMHCクラスII陰性腫瘍に対する間接的な機構によって、マクロフ
ァージの活性化を介して、またはMHCクラスII陽性腫瘍に対する直接的な機構に
よって、エフェクター機能を持つこともできる。

【０００３】近年、抗腫瘍CD8⁺ CTLの最適な誘導のためにはコグネイトCD4⁺T細胞の助けが
必要であることが示された（Ossendorp, F.ら,1998. J. Exp. Med. 187:693-70
）。ヒトにおいて、抗腫瘍免疫性におけるCD4⁺T細胞の役割の証拠は、腫瘍部位
にCD8⁺およびCD4⁺T細胞の両方が存在することを証明した腫瘍浸潤性リンパ球(tu
mor infiltrating lymphocyte)の研究（Goedegebuure, P.S.ら, 1995. Immunol.
Res. 14:119-131; Maccalli, C.ら, 1994. Int. J. Cancer 57:56-62）、およ
び、新形成患者 (neoplastic patient) の血清中における腫瘍抗原に対する抗体
の検出から得られる（Sahin U.ら, 1997, Curr. Opin. Immunol. 9: 709-716）
。

【０００４】しかし、ヒト腫瘍に対するT細胞の免疫力についての近年の研究は、CD8⁺HLAク
ラスI限定性CTL応答(CD8⁺ HLA class I restricted CTL response)の同定に主に
焦点が絞られていた。例えば、国際特許出願公開 WO95/19783号では、MHCクラ
ス１分子に結合することができるMAGE-3由来ペプチド（例えば、対立遺伝子HLA-
A1など）を開示している。このようなペプチドは通常、8〜10個のアミノ酸残基
を有する。

【０００５】これまでのところ、メラノサイト系列の正常細胞および腫瘍細胞の中で発現さ
れる組織特異的抗原であるチロシナーゼ（Topalian, S.L.ら, 1994. Proc. Natl
. Acad. Sci. USA 91: 9461-9465; Yee, C.ら, 1996. J. Immunol. 157: 4079-4
086）は、CD4⁺メラノーマ反応性T細胞の特異的標的として示された唯一のメラノ
ーマ会合抗原であり、そのためのCD4⁺T細胞エピトープが同定されている（Topal
ian, S.L.ら, 1996. J. Exp. Med. 183: 1965-1971）。国際特許出願公開WO97/1
1669号（Topalianら）は、この抗原に由来するペプチドがMHCクラスII分子と会
合して認識される旨を報告している。

【０００６】他の腫瘍会合抗原（特に腫瘍特異的且つ幾つかの組織型(histotype)の腫瘍間
で共有される抗原）上のCD4⁺T細胞エピトープレパートリーの特徴付け（Van den
Eynde, B.J.ら, 1997. Immunol. Today 9:684-693）は、新生組織形成患者にお
けるペプチドベースの免疫化プロトコールの効率を上げるのに大きく貢献するで
あろう。

【０００７】 MAGE遺伝子のファミリー（「メラノーマ会合抗原」）は、様々なタイプの腫瘍
において発現される約12のメンバーからなる。MAGE-3は、大多数のメラノーマお
よび幾つかの他の腫瘍組織型（頭部および頚部の鱗状細胞がん腫、膀胱がん腫、
肺がん腫および肉腫）において発現されるが精巣および胎盤以外の正常細胞では
発現されない遺伝子によりコードされる腫瘍特異的抗原である（Van den Eynde,
B.J.ら, 1997. Immunol. Today 9: 684-693）。メラノーマ患者に由来するCD8⁺ CTLは、HLAクラスI限定性MAGE-3エピトープ（Van den Eynde, B.J.ら, 1997. I
mmunol. Today 9:684-693）を認識し、HLA-A1および/または-A2 MAGE-3結合配列
に対応する合成ペプチドを用いた臨床試験が、メラノーマおよび他の腫瘍性疾患
に罹患した患者において行われている（Van den Eynde, B.J.ら, 1997. Immunol
. Today 9: 684-693）。

【０００８】

【発明の実施の形態】

第１の態様に従って、本発明は、MHCクラスII分子に結合することができるMAG
E-3由来免疫原性ペプチドに関する。このようなペプチドは、12〜15残基長を有
し、（Gaugler B.ら, 1994, J. Exp. Med. 179, 921-930に報告されたアミノ酸
配列によると）MAGE-3フラグメント21〜35、111〜125、161〜175、251〜265、28
6〜300に、好ましくは141〜155、146〜160、156〜170、より好ましくは171〜185
、191〜205および281〜295に対応する。この対応するアミノ酸配列は、配列番号
1〜11に報告されている。

【０００９】本発明のペプチドは、MHCクラスII分子の異なる対立遺伝子に無差別に(promis
cuous)結合することを特徴とする。このような特徴は、同じ１つのペプチドがよ
り広範囲の患者集団によって認識され得るという意味で、有益である。 in vitro結合アッセイにおいて、本発明のペプチドは、広範囲のHLA-DR対立遺
伝子に属する異なる精製された分子に結合することができ、且つCD4⁺細胞の活性
化を誘導することができる、ということが分かった。より詳細には、本発明のペ
プチドで刺激すると、CD4⁺T細胞の増殖およびこれらの細胞融解活性の大幅な促
進が誘導されることが観察された。このようなペプチドに曝露されたCD4⁺T細胞
は、MAGE-3タンパク質およびHLA-DR分子を発現するメラノーマ細胞の溶解を引き
起こすことができた。このような実験的証拠の詳細は、実施例で報告する。

【００１０】これらのペプチドは、好ましくは、例えばMerrifield, (1986) Science 232:3
41-347ならびにBaranyおよびMerrifield, The Peptide, GrossおよびMeienhofer
編(N.Y., Academic Press), pp.1-284(1979)に記載された手法に従って、合成に
より調製される。合成は、液相もしくは固相において、または自動合成装置を用
いて行うことができる(StewartおよびYoung, Solid Phase Peptide Synthesis,
第2版, Rockford I11., Pierce Chemical Co. (1984)）。あるいは、組換えDNA
技術を用いたり、または天然タンパク質の断片化もしくは酵素消化によりペプチ
ドを調製することができる。さらに、このアミノ酸残基は、L-もしくはD-アミノ
酸の他の残基によって（好ましくは保存的に）置換したり、または開示されたペ
プチドに付加することができる。あるいは、例えば、カルボキシル末端残基のア
ミド化により、または脂肪親和基（例えば、ミリスチル）との結合により、また
はグルコシル化もしくは他のペプチドとの結合により、これらを化学的に修飾し
、より好ましい特性（例えば、MHC分子へのより高い親和性、高い免疫原性、免
疫応答の誘導における優れた選択性、または投与後の高いバイオアベイラビリテ
ィ等）を得ることができる。また本発明のペプチドの側鎖を化学的に誘導体化し
て修飾することもできる。例えば、遊離カルボキシル基を誘導体化して、塩、メ
チルエステルおよびエチルエステル、または他のタイプのエステルもしくはヒド
ラジドを形成することができる。

【００１１】また本発明のペプチドは、細胞毒性型およびヘルパー型の両方のより完全な反
応スペクトルを誘導し、および腫瘍に対する反応を増強するために、既知のエピ
トープ（例えばクラスIのHLA分子に結合するエピトープ）とコンジュゲートさせ
ることもできる。正常組織中ではあまり発現されない抗原（MAGE-3等）に由来する新しいエピト
ープを提供することにより、同じ抗原を発現する腫瘍を有する患者の免疫治療で
使用するワクチンを調製することができる。さらに、該エピトープにより誘導さ
れるCD4⁺T細胞応答は、これらの細胞が、内因性細胞毒活性以外に、他のT細胞（
例えばCD8⁺T細胞など）の刺激および増殖ならびにマクロファージの活性化を介
してヘルパー活性も示すという意味で、強化される。

【００１２】従って、更なる態様に従って、本発明は、有効量の本発明のペプチドを、場合
により、MHCクラスI分子に結合し且つCD8⁺T細胞エピトープに対応する他の既知
のペプチド（例えば国際特許出願公開番号第WO95/19783号に記載されたペプチド
など）と一緒に含む、医薬組成物を提供する。この活性成分に加え、該組成物は
製薬上許容可能な賦形剤を含む。本明細書中において「有効量」とは、特定のリ
ンパ球を活性化して腫瘍に対して効果的な応答を誘導するのに十分な量を意味す
る。このような量は、使用するペプチド、投与、治療する病気の重症度、および
その患者の一般的な状態によって異なり、例えば樹状細胞にペプチドを負荷する
場合は、通常は1〜50μg/mlの範囲である。

【００１３】好適な実施形態に従って、このような組成物は、新生組織形成の疾病素質を有
する患者の予防ワクチン接種のため、または新生組織形成患者の治療的ワクチン
接種に使用される。本明細書中において「ワクチン接種」とは、例えば病原体に
対する従来のワクチン接種プロトコールにおけるような能動免疫化（すなわち患
者の体内で直接in vivo免疫応答を引き出すペプチドのin vivo投与）、および受
動免疫化（すなわちin vitroで抗腫瘍CD4⁺細胞（後にその患者の体内に再接種さ
れる）を活性化するためのペプチドの使用）の両方を含む。

【００１４】ワクチンを調製および使用するための技法は、当業者には公知であり、例えば
Paul, Fundamental Immunology, Raven Press, New York (1989)またはCryz, S.
J. Immunotherapy and Vaccines, VCH Verlagegesselschaft (1991)に記載され
ている。ワクチンは通常は注射可能な懸濁液または溶液の形態で調製されるが、
固体調製物またはリポソームの形態で使用することもできる。免疫原性成分を薬
理学的に許容可能な賦形剤（例えば乳化剤、緩衝剤、およびそのワクチンの効能
を上げるアジュバント等）と混合することができる。後者は、一回または複数回
の投薬スケジュールで投与することができる。複数回投薬は、1〜10回に分けて
線量を提供し、各投薬量は1μg〜1000μgの量の抗原を含み、その後その免疫応
答を維持または強化するために必要な一定時間をおいた後、他の用量が投与され
る。また、被験者が必要とする場合は、数ヶ月後に更に投薬が行われる。いずれ
の場合にせよ、治療レジメは、治療される患者において引き出される応答、全体
的な状態、および腫瘍の進行によって異なる。

【００１５】さらに、別の態様において、本発明は、エフェクターT CD4⁺の活性化に適した
条件下でAPC細胞（抗原提示細胞）を本発明のペプチドと共にインキュベートす
る工程を含む、MAGE-3抗原を発現する腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導するため
の方法を提供する。このような条件は、自己由来APCを該ペプチドと共に負荷した後、精製したT C
D4⁺リンパ球に曝露する工程ことを含む。好適なAPC細胞は、自己由来末梢血単核
細胞(PBMC)、樹状細胞、マクロファージまたは活性化されたB細胞である。この
ペプチドをAPC培養物に加えてペプチド/APC結合を得るのに十分な時間おき、次
にCD4⁺CTLを含む細胞集団を加えることにより、CTLの活性化および増殖を促す。
好適な実施形態に従って、治療を受ける患者からT細胞を採取し、場合によりこ
れを精製した後、上記のように活性化させて好適な培養培地で増殖させた後、こ
れらの細胞を同じ患者の体内に再び導入した。培養培地は、CD4⁺前駆体の増殖に
貢献する１以上のサイトカイン（例えばIL-2またはT細胞増殖因子など）を含む
ことができる。

【００１６】好適な実施形態において、本発明のペプチドをコードするベクター（例えばア
デノウイルス、レンチウイルスもしくはMLVに由来するベクター等のウイルスベ
クターまたはレトロウイルスベクター）を用いて、免疫応答の誘導において重要
な役割を果たす細胞（例えばAPC、樹状細胞など）を遺伝子操作する。さらに、
このペプチドを適切なタンパク質キャリアと融合させて、その細胞表面で十分に
プロセッシングおよび発現させることもできる。このように、本発明のエピトー
プをコードするDNAは、適切な発現ベクターの中に、非常に効率的な発現が必要
である場合は適切なウイルスプロモーター（例えばCMVまたはSV40）の制御下に
、または誘導プロモーター（エクジソンにより制御される誘導プロモーターなど
）の制御下に、挿入してもよい。本明細書中において「エピトープ」とは、GenB
ankに受託番号U03735として受託された（ヒト）MAGE-3遺伝子配列に従って、以
下の表１にリストされたヌクレオチド断片に対応する。

【００１７】

【表１】また、本発明は、上記ペプチドに対する抗体、該抗体のフラグメントまたは誘
導体にも関する。抗体を産生するための一般的な方法論は周知であり、例えばKo
hlerおよびMilstein, 1975, Nature 256, 494またはJ.G.R. Hurrel, Monoclonal
Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press Inc., Boco
Raron, FL (1982)に開示されている。この抗体は、ポリクローナル抗体、また
は好ましくはモノクローナル抗体、またはF(ab')2、Fab、FvもしくはscFv等の抗
体フラグメントであってもよい。

【００１８】さらに、本発明の他の態様では、能動ワクチン接種を行う新生組織形成患者に
おいて、このペプチドまたは完全MAGE-3タンパク質に特異的な前駆体の頻度およ
び増殖をELISPOT技法（Herr, W.ら, 1997, J. Immunol. Methods 203:141-52）
によって、または関連するペプチドでパルスした４量体可溶性分子であるアビジ
ン-ビオチン-MHCクラスIIからなる４量体を用いた細胞蛍光分析(cytofluorimetr
ic analysis)（Yee, C.ら, 1999, J. Immunol. 162:2227-2234）によって、モニ
ターするための方法である。

【００１９】

【実施例】

以下の実施例は、本発明をより詳細に示すものである。［実施例１］ DR-ペプチド結合アッセイ洗浄剤で可溶化したDR分子とのペプチドの相互作用を、ELISAベースの高流量(
high-flux)競合アッセイを用いて測定した（Radrizzani, L.ら, 1997. J. Immun
ol. 159:703-711）。HLA-DR分子を以下のヒトリンパ芽球細胞系(LCL)から単離し
た：HOM-2からDR1(DRB1*0101)；WT49からDR3(DRB1*0301)；PREISSからDR4(DRB1*
0401)；およびSWEIGからDR5(DRB1*1101)；EKRからDR7(DRB1*0701)；BM9からDR8(
DRB1*0801)。DR2(DRB1*1501)は、L細胞トランスフェクタントL466.1から単離し
た。Sinigaglia,F.ら, 1992. Methods Enzymol. 230:370-386に記載されたよう
に、mAb 1-1C4を用いてこの分子をアフィニティー精製した（Cammarota, G.ら,
1992. Nature 356: 799-801）。精製DR分子への結合について非標識ペプチドが
ビオチン化指標ペプチド(indicator peptide)と競合する能力を測定するために
、ペプチド競合アッセイを行った。以下のビオチン化指標ペプチドを用いた：DR
1およびDR7にはGFKA₇；DR2にはGIRA₂YA₄；DR3にはLAYDA₅；DR4にはUD4（Hammer,
J.ら, 1995. J. Exp. Med.181:1847-1855）；DR5にはTT830-843；およびDR8に
はGIRA₆L。ビオチン化した指標ペプチドおよびHLA-DR分子を、非標識競合ペプチ
ド（MAGE-3の推定配列に対応するペプチド）の10倍希釈液(0.001〜100mM)と共に
インキュベートした。ペプチド結合親和性を測定するために、インフルエンザ血
球凝集素に由来する無作為のHA_307-319ペプチド（Roche, P.A.ら, 1990. J. Imm
unol. 144:1849-1858）を各競合アッセイに含めた。非標識競合ペプチドの相対
結合データを、阻害濃度(IC₅₀)、つまりビオチン化指標ペプチドの結合の50％を
阻害するのに必要な競合ペプチドの濃度として表した。

【００２０】結合アッセイの結果を、以下の表２に示す。

【００２１】

【表２】この結合データは、ビオチン化指標ペプチド（指標ペプチド）の結合の50％を
阻害するのに必要な競合ペプチドの濃度として計算した相対結合能力(IC₅₀μM)
で表される。 (a)100μMを超えるIC₅₀値は、この結合アッセイの感度の範囲外である。［実施例２］ペプチド合成 9050 Millipore合成装置（Millipore Volketswil、スイス国）でペプチドを合
成した。RP-HPLCおよび電子スプレー質量分析法によりペプチドの純度を評価し
た。合成ペプチドを凍結乾燥した後、DMSO中2mg/mlの濃度で再構成し、必要に応
じてPBSで希釈した。［実施例３］CD4⁺T細胞の増殖および増殖アッセイ HLA-DR結合に対して最も無差別なMAGE-3配列に対応する合成ペプチド(141、15
5、146-160、156-170、171-185、281-295)（表1および2を参照されたい）をプー
ルし（MAGE-3プール）、標準的な血清学的タイピング(serologic typing)（Prot
ti, M.P.ら, 1990. J. Immunol. 144:1711-1720に記載されている）により同定
したHLA型がA1、A2/B41、B52/DR11である健康なドナーのPBMCを刺激するために
使用した。簡単にまとめると、10％熱不活化ヒト血清（Technogenetics, 伊国ミ
ラノ）、2mM 1-グルタミン、100U/mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイシン(
Biowhittaker, Walkersville, MD)(TCM)を補充した、MAGE-3プール（各ペプチド
1μg/ml）を含むRPMI 1460(GIBCO, Grand Island, NY)中で、20×10⁶PBMCを7日
間培養した。反応性リンパ芽球をパーコール勾配（Protti, M.P.ら, 1990. J. I
mmunol. 144:1711-1720）で単離し、T細胞増殖因子（Lymphocult, Biotest Diag
nostic Inc., Dreieich、独国）の中で更に増殖させ、そして同量の抗原+照射し
た(4000rad)自己由来PBMCをAPCとして用いて一週間間隔で再刺激した。

【００２２】増殖アッセイにおいて、CD4⁺T細胞および自己由来照射PBMCをTCMでそれぞれ2
×10⁵/mlおよび2×10⁶/mlに希釈し、96丸底ウェルプレートに入れたものを３つ
ずつ作製した（CD4⁺T細胞100μlおよびAPC100μl）。これらの細胞を、異なる濃
度のMAGE-3プール（0.05、0.1、0.5、1および5μg/ml）、各ペプチド(10μg/ml)
および異なる濃度のrMAGE-3タンパク質（5、10および20μg/ml）で刺激した。CT
4⁺T細胞のみを入れたウェルおよびAPCのみを入れたウェルをそれぞれ３つずつ、
対照として使用した。基底増殖率（ブランク）を測定するために、CT4⁺T細胞とA
PCを両方入れた３つのウェルには刺激を与えなかった。阻害実験において、異な
る濃度のmAb L243またはアイソタイプのマッチングした無関係のmAb（0.25およ
び0.5μg/ml）を、MAGE-3プール(5μg/ml)またはMAGE-3_281-295(10μg/ml)で刺
激したCT4⁺T細胞とAPCを両方入れた３つのウェルに加えた。３日後に培養物を[³ H]TdR（1 mCi,ウェル, 6.7 Ci/mol, Amersham Corp、伊国ミラノ）で16時間パル
スした。これらの細胞をSkatron Titertek マルチ収穫機(Skatron Inc., Sterli
ng, VA)で回収し、チミジンの取り込みを液体シンチレーションカウンターで測
定した。

【００２３】１週間培養後、T細胞は94％CD4⁺であり、自己由来照射PBMCの存在下でMAGE-3
プールで毎週再刺激することにより長期培養で増殖させることができた。微量増
殖アッセイ(microproliferation assay)（図１）において、細胞は、低濃度(100
〜500ng/ml)であってもMAGE-3プール（パネルA）に対して活発に反応した。この
プールを形成する個々のペプチドの反応性も周期的に調査した（パネルC）。CD4 ⁺ T細胞はMAGE-3_281-295に対応するペプチドを優先的に認識したが、重複する配
列MAGE-3_141-154およびMAGE-3_146-160に対応するペプチドの認識程度はもっと低
かった。この系の増殖中にMAGE-3_281-295に対する反応性は増加した（パネルC）
。MAGE-3プール（パネルDa）またはMAGE-3_281-291（パネルDb）の存在下におけ
るCD4⁺T細胞の増殖活性は、異なる濃度のL243mAbの培養に加えることにより阻害
された（パネルD）。このことは、MAGE-3配列の認識がHLA-DRに限定されること
を示す。

【００２４】また健康なドナーに由来するHLA-DR11+ PBMCは、MAGE-3配列21〜35、111〜125
、161〜175、191〜205、251〜265および286〜300に対応する合成ペプチドの第２
プールによっても刺激された。CD4⁺T細胞は、異なる濃度のMAGE-3プールIIに対
して用量依存的に増殖し、MAGE-3特異的CD4⁺T細胞のエピトープレパートリーの
研究により、配列MAGE-3_111-125、MAGE-3_161-175および優先的にMAGE-3_191-205
を認識することが分かった。さらに、そのHLA-DR型がHLA-DR4/DR11であるメラノ
ーマ患者に由来するMAGE-3特異的CD4⁺T細胞は、配列MAGE-3_141-155、MAGE-3_146- ₁₆₀ 、MAGE-3_156-170、MAGE-3_171-185、およびMAGE-3_281-295を認識した。制限エ
レメントの研究により、全ての配列はHLA-DR4対立遺伝子に会合して認識された
ことが分かった。このことは、配列141〜155、146〜160および281〜295が少なく
とも２つの異なる対立遺伝子（HLA-DR11およびHLA-DR4）に会合してCD4⁺T細胞に
提示されることを示す。［実施例４］細胞毒性アッセイ Protti, M.P.ら, 1996. Cancer Res. 56: 1210-1213に記載された標準的な4時
間⁵¹Cr放出アッセイで、CD4⁺T細胞を、特異的細胞溶解活性についてテストした
。以下の標的を用いた：メラノーマ細胞（SK-Mel 28、HT144、Imro, M.A.ら, 19
98. Hum. Gene Ther. 9:1335-1344に記載されたOI TC、および皮膚転移(cutaneo
us metastasis)から我々の実験室で確立されたMD TC）、およびLCL。分子もしく
は血清学的タイピングによって同定された標的細胞のHLA-DR型は、以下の通りで
ある：SK-Mel 28(DR*04*13)、HT144(DR*04*07)、OI TC(DR*01*11)、MD TC(DR*04
*11)、LCL(DR11)。低温標的競合アッセイにおいて、非標識標的細胞（低温標的
）を、連続的な（高温標的細胞）対（低温標的細胞）比でプレートに接種した。
次に、エフェクターCD4⁺T細胞および⁵¹Crで標識した標的細胞（高温標的）を加
え、細胞毒性を上記のように評価した。阻害率（％）は以下のように計算した。

【００２５】 [（低温標的を含まない特異的細胞溶解％-低温標的を含む特異的細胞溶解％）
/（低温標的を含まない特異的細胞溶解％）]×100 CD4⁺T細胞は、HLA-DR11限定性対立遺伝子を発現するOI TCおよびMC TCに対す
る細胞溶解活性を示したが、これらの細胞は非関連HLA-DR対立遺伝子を発現する
SK-Mel 28およびHT144を殺傷しなかった（図２a）。細胞溶解性CD4⁺T細胞がメラ
ノーマ細胞上のHLA-DR11限定性MAGE-3エピトープを認識したか否かを証明するた
めに、まず、微量増殖アッセイにおいて認識される合成ペプチドでパルスした若
しくはしていないHLA-DR11⁺LCLに対するこれらの細胞溶解活性をテストした。MA
GE-3_281-295でパルスしたLCLはCD4⁺T細胞によって強力に認識されたが、MAGE-3₁ _41-154 およびMAGE-3_146-160でパルスした若しくはしていないLCLに対する殺傷活
性は検出されなかった（図３a）。次に、低温標的阻害実験を行ったところ、OI
TCに対するCD4⁺T細胞の細胞溶解活性は、MAGE-3_281-295でパルスしたLCLを加え
ることにより阻害されたことを示した（図３b）。このことは、この配列がHLA-D
R11によって事実上OI TCメラノーマ細胞上に提示されることを示す。これらの結
果はさらに、MAGE-3_281-295が自然にプロセッシングされ、細胞毒性CD4⁺T細胞エ
ピトープを形成することを示す。

【００２６】また配列MAGE-3_191-205に特異的なCD4⁺T細胞も、MAGE-3/HLA-DR11+メラノーマ
細胞に対する細胞溶解活性を示し、および低温/標的阻害実験は、配列191〜205
が事実上メラノーマ細胞の表面でHLA-DR11対立遺伝子と会合して認識されたこと
を示し、したがってこのエピトープは自然にプロセッシングされる。患者の場合、CD4⁺T細胞は、MAGE-3抗原を発現する自己由来腫瘍ならびに該抗
原およびHLA-DR4限定的対立遺伝子を発現するSK-Mel 28メラノーマ細胞に対する
細胞溶解活性を示したが、これらは、MAGE-3タンパク質を発現し非関連HLA-DR対
立遺伝子を発現しないメラノーマ細胞を殺傷しなかった。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 MAGE-3プールを用いて抗原刺激し、2-d微量増殖アッセイ(2-d microprolifera
tion assay)でテストしたCD4⁺T細胞の増殖活性を示した図。このデータは、(n=x)実験を表し、３回の測定値の平均値±SDである。パネルA
(n=6)は、MAGE-3プール（0.01、00.5、0.1、0.5、1および5μg/ml）に対する応
答である。パネルB(n=3)は、組換えMAGE-3タンパク質（5、10および20μg/ml）
に対する応答である。パネルC(n=7)は、様々な増殖週間を経た後のMAGE-3プール
を形成する個々の合成ペプチド(10μg/ml)に対する応答である。ブランク（つま
りAPCのみが存在する場合のCD4⁺T細胞の基底増殖レベル）を減じると、以下の通
りとなった：２週間＝30,866±1,115；４週間＝7,106±2,201；および６週間＝2
1,938±2,767。アスタリスクは、ブランクより有意に高い応答を示す（unpaired
one-tailed Student's t検定で測定した。*, P<0.001および** P<0.025）。パ
ネルD(n=5)は、異なる用量（0.25および0.5μg/ml）のL243mAbの存在下における
MAGE-3プール(5μg/ml)(a)および配列281〜295に対応するペプチド(b)に対する
応答である。ブランクは1,251±444、MAGE-3プールの存在下におけるCD4⁺T細胞
の増殖は28,191±373、および配列281〜295の存在下における増殖は22,504±141
であった。

【図２】 MAGE-3特異的CD4⁺T細胞の細胞溶解活性を示した図。データは、(n=x)実験を表し、３回の測定値の平均値±SDである。パネルA(n=6
)は、異なるHLA-DRとマッチしたまたはマッチしていないメラノーマ細胞に対す
る溶解活性である。CD4⁺T細胞およびHLA-DR型のメラノーマは、それらを表す記
号と共に底辺に示す。

【図３】 CD4⁺T細胞は、OI TC細胞上でHLA-DR11に会合したMAGE-3(281〜295)を認識する
ことを示した図。データは(n=x)実験を表し、３回の測定値の平均値±SDである。パネルA(n=3)
は、LCLのみまたはMAGE-3_141-154、MAGE-3_146-160およびMAGE-3_281-295でパルス
したLCLに対するCD4⁺CTLの溶解活性を示す。パネルB(n=3)は、低温標的阻害実験
を示す。低温標的[OI TC（丸）およびMAGE-3_281-295でパルスしたLCL（四角）]
を用いて、高温OI TC（E/T比40：1）に対するMAGE-3特異的CD4⁺CTLの溶解活性を
阻害した。低温標的の不在下におけるOI TC細胞に対する特異的溶解のパーセン
テージは、26±1.2％であった。 HLA表現型および細胞系の省略形については、実施例４を参照されたい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA01 4C085 AA03 BB01 BB11 CC31 EE01 EE03 EE05 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA17 CA40 DA76 DA86 EA31 FA10 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の群から選択されるMHCクラスII分子に結合するペプチド。ａ） EALGLVGAQAPATEE ｂ） RKVAELVHFLLLKYR ｃ） GNWQYFFPVIFSKAS ｄ） FFPVIFSKASSSLQL ｅ） SSLQLVFGIELMEVD ｆ） VGFIELMEVDPIGHL ｇ） PIGHLYIFATCLGLS ｈ） GDNQIMPKAGLLIIV ｉ） VQENYLEYRQVPGSD ｊ） TSYVKVLHHMVKISG ｋ） VLHHMVKISGGPHIS
【請求項２】請求項１に記載のペプチドに対する、モノクローナルもしくはポリクローナル
抗体。
【請求項３】製薬上許容可能な賦形剤と共に有効量の請求項１に記載のペプチドを含む医薬
組成物。
【請求項４】 CTL CD8⁺エピトープに対応するMHCクラスI分子に結合する１以上のペプチドを
さらに含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】ワクチンとして使用される請求項３および４に記載の組成物。
【請求項６】エフェクターCD4⁺T細胞の活性化に適した条件において、請求項１に記載のペ
プチドにAPC細胞を接触させることを特徴とする、MAGE-3抗原を発現する腫瘍細
胞に対する免疫応答を誘導するための方法。
【請求項７】自己由来APCに前記ペプチドを負荷（loaded）し、精製したCD4⁺リンパ球に接
触させることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】抗腫瘍薬剤を調製するための請求項１に記載のペプチドの使用。
【請求項９】前記薬剤がワクチンであることを特徴とする、請求項８に記載の使用。