CN1227264C - 来自mage的免疫原性肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及来源于MAGE家族蛋白质的肽及其作为治疗肿瘤的免疫原的用途，含有它们的组合物，诱导针对肿瘤细胞的细胞毒反应的方法，不表达组织相容性抗原的黑素瘤细胞系以及应用。

Description

来自MAGE的免疫原性肽及其应用
本发明涉及来源于MAGE家族蛋白的肽，还涉及这些肽作为免疫原在肿瘤预防和治疗中的用途。
在过去的几年里，使用肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)得以分离到几个编码肿瘤抗原的基因(Van den Eynde，B.J.等，Curr.Opin.Immunol.，9：684-693，1997)。按照在肿瘤和正常组织中的表达模式，这些抗原依据肿瘤特异性及临床相关性能分成四类。第一类包含在不同组织类型(histotype)的各种肿瘤中表达但在除睾丸生殖细胞外所有正常组织中都不表达的基因编码的抗原，例如：MAGE(黑素瘤相关抗原)、GAGE和BAGE。第二类代表分化抗原，仅在黑素瘤和黑素细胞中表达，例如酪氨酸酶、Melan-A/MART-1、gp100、TRP-1和TRP-2。属于第三类的抗原由普遍表达的基因经过点突变产生。第四类抗原，仅在最近才被定义，其代表是TRP-2-INT2，一种黑素瘤中共同存在的而在黑色素细胞谱系的正常细胞中不表达的抗原。
特别是属于MAGE家族的肿瘤抗原引起相当大的兴趣，因为它们中的六个，MAGE-1、2、3、4、6和12被相当一部分原发和转移瘤(包括黑素瘤、肺癌、膀胱癌、卵巢癌和乳腺癌)选择性表达(van der Bruggen，P.，等，Science，254：1643-1647，1991)。
来源于MAGE-1蛋白(van der Bruggen，P.，等，Science，254：1643-1647，1991)和MAGE-3蛋白的细胞内加工的9氨基酸肽，长度为8-10个氨基酸，已经公开并被认为是免疫原性物质(WO 95/19783)。
基于使用MAGE-1和MAGE-3编码抗原性肽的疫苗接种临床实验，在黑素瘤和其它肿瘤患者身上取得进展(Marchand，M.等，Int.J.Cancer80：219-230，1999)。迄今为止，实际上MAGE-2、4和6抗原不能被认为是肿瘤抗原，因此它们不能用作肿瘤特异性免疫治疗的靶子。原因是还没找到能够识别来源于MAGE-2、4和6的肽的细胞毒性T淋巴细胞。
基于使用肽的治疗方案的局限性在于已表征的CTL表位(也就是说，肿瘤抗原肽和适当的HLA-I类等位基因)是有限数量的，并且体内产生了丢失抗原性的变异体，其能够逃避由单抗原性疫苗引发的免疫反应(Restifo，N.P.，等，J.Natl.Cancer.Inst.，88：100-108，1996)。特别是，丢失抗原性的变异体的产生，是免疫程序失败的一个主要原因，已发现这是由于选择出不表达被肿瘤反应性淋巴细胞识别的抗原的肿瘤细胞，例如作为分子缺陷的结果，导致HLA-I类等位基因的缺失或下调(Garrido，F.，等，Immunol.Today，14：491-499，1993)。然而，在某些情况下，肿瘤失去或改变了编码肿瘤抗原的基因(Jager，E.等Int.J.Cancer，71：142-147，1997)，用另一种机制来逃避免疫控制。
通常，肿瘤特异性免疫的临床方案只应用于携带了表达熟知肿瘤抗原和确定HLA等位基因的肿瘤的患者。不幸的是，大多数肿瘤患者不满足这些标准。因此，有必要鉴定新的抗原决定簇以用于抗肿瘤的免疫方案中，优选的是“广谱”的那些，即被更多数量肿瘤组织类型表达的或在同一肿瘤的多种形式中表达的。
现已发现，并且这也是本发明的第一方面，由MAGE-1、2、3、4、6和12基因同源区域编码的一组肽，鉴别为新的HLA-B*3701限制的表位。
根据它们的来源，本发明中的肽被命名为MAGE-1、2、3、4、6和12127-136，并在SEQ ID NO.1-3中报道了其序列。MAGE-1、2、3和6有相同序列，如SEQ ID NO.1所述，而MAGE-4和12的序列分别是SEQ ID NO.2和3。
体外细胞毒性试验已证明细胞毒性T细胞识别表达MAGE-1、2、3、4、6和12不同抗原的各种细胞系上结合HLA-B*3701组织相容性等位基因(allele)的本发明肽，并在暴露于它们时被活化。在这些试验中，具有SEQ ID NO：1序列的肽显示最高活性，因此是优选的。
鉴别MAGE家族不同抗原的共同表位是非常有优势的，因为它使得至少能部分克服上述缺点。更重要的是，使用这种“多抗原性”(pluriantigenic)的表位，也就是说，MAGE家族更多抗原共有的表位，使得可以克服上述抗原性丢失，因为通常一确定的肿瘤共表达一个以上MAGE基因，因此非常不可能丢失本发明的肽诱生的免疫反应。这就可以提高临床肿瘤免疫试验能够成功的患者数量。
应该强调指出，人MAGE-2和MAGE-6的免疫原性潜力从没被证明过，即使已知12％的卵巢瘤缺乏MAGE-1和MAGE-3而表达MAGE-2和/或MAGE-6。
本发明中的肽能够用传统技术制备，优选合成地制备，例如按照Merrifield，(1986)科学(Science)232：341-347，和Barany与Merrifield，肽(The Peptides)，Gross and Meienhofer编，(N.Y.，Academic Press)，第1-284页(1979)所描述的方法进行。合成能在液相或固相或用自动合成仪进行(Stewart和Young，Solid Phase PeptideSynthesis，第2版，Rockford Ill.，Pierce Chemical Co.(1984))。或者，肽也可以用重组DNA技术或从含所需片段的天然前体蛋白开始制备。氨基酸残基能被化学修饰，例如结合到脂上、糖基化及与其它肽偶联，以获得更多有利的特点，例如与HLA分子亲和力更高，免疫原性更强，诱生免疫应答选择性更高，或施用后有更高的生物利用度。肽也能与其它已知通过相同或不同类型的MHC分子诱生T“辅助”细胞反应的表位偶联。
本发明进一步还涉及含有效量的这儿所述的肽的药物组合物。按照优选的实施方案，所说的组合物是疫苗，特别是适宜于癌症易感性患者的预防性接种免疫或在肿瘤患者中的治疗性接种免疫。除活性成份外，该组合物将包含药学上可接受的赋形剂。“有效量”指的是足以激发针对肿瘤的有效CTL应答的量。该量依赖于所使用的肽、给药途径和类型、待治疗的病理严重程度以及患者的一般情况，并且通常该量在100-300μg，间隔1个月或更短的时间以3次或更多次给药。通常进行两次皮下接种和两次真皮内接种，剂量是每次皮下接种为总剂量的4/10，每次真皮内接种为总剂量的1/10。尽可能每次接种时改变接种部位。疫苗的制备和使用技术为该领域技术人员所熟知，亦已被描述在例如Paul，FundamentalImmunology(基础免疫学)，Raven Press，纽约(New York)(1989)或Cryz，S.J.，免疫治疗与疫苗(Immunotherapy and Vaccines)，VCHVerlagsgesselschaft(1991)。疫苗通常制备成可注射的悬浮液或溶液的形式，但它们也能以固态或脂质体的形式使用。免疫原性成分可与药理上可接受的赋形剂混合，例如乳化剂、缓冲剂和增强疫苗效果的佐剂。疫苗可按单剂量或多剂量给药。在多剂量情况下，提供1到10个独立的剂量，每个含1μg-1000μg抗原，随后间隔一定时间进行维持或加强免疫反应所必需的另外的加强免疫，并且如果需要，几个月之后再免疫一次。每种情况下，处理方案将依赖于被治疗患者的反应、其一般状况及肿瘤的进程。
另一方面，本发明提供了一种方法，以诱生针对表达一种或多种MAGE抗原的肿瘤细胞的细胞毒反应，该方法包括使本发明肽与T淋巴细胞在适于激活细胞毒性T细胞的条件下接触。为获得理想的细胞毒效果的合适条件包括在培养时直接暴露T淋巴细胞给所述肽或预先使所述肽结合HLA I类分子，优选HLA-B*3701，或预防性地使所述肽结合表达所述HLA分子的抗原提呈细胞(APC)，接着暴露给T淋巴细胞。合适的APC细胞是外周血自身单个核细胞(PBMC)或树突细胞、巨噬细胞和活化的B细胞。给培养的APC加入肽足够长的时间，以形成肽/APC结合，并且随后加入含T淋巴细胞的细胞群使之活化和增殖。淋巴细胞可取自受治疗的患者，并且活化后回输给同一患者。能通过APC细胞上存在的组织相容性分子的预防性“剥离”(“stripping”)增强肽/APC结合。可选择地，APC细胞可被改造成表达HLA-B*3701组织相容性等位基因。而且培养基中可包含一种或更多有助于提高CD8+前体活化的细胞因子。在回输给患者之前，淋巴细胞可通过例如特异性配体亲和柱纯化。
本发明还涉及特异识别由HLA I类分子，优选HLA-B*3701分子，和选自SEQ ID 1-6的肽组成的复合物的细胞毒性T细胞系。细胞毒性T细胞系可通过从淋巴细胞库筛选在暴露给含有本文所述抗原决定簇的肿瘤细胞时能活化的细胞来获得。
按照另一方面，本发明提供了诱生免疫反应的细胞，例如APC、树突细胞等，所述细胞经编码本发明肽的载体(例如病毒或逆转录病毒载体，例如来源于腺病毒或慢病毒或MLV的)改造，本发明肽可选地采取与合适的担体融合的融合蛋白形式，在细胞中有效地表达，并加工和暴露在细胞表面。在这种情况下，将编码本发明公开表位的DNA插入适当表达载体中，使其处在合适启动子的控制之下，所述启动子的实例是病毒启动子，例如CMV和SV40(如果需要非常高水平表达)，或诱导型启动子例如蜕皮激素(ecdisone)控制的诱导型启动子。在这种情况下，所述的表位由MAGE-1cDNA对应于127-136位氨基酸的区域(Genbank，N.M77481)，和MAGE家族中其它抗原的同源区编码：
氨基酸    MAGE-1氨基酸序列    核苷酸(cDNA)
127-136   REPVTKAEML          562-590
按照另一方面，本发明涉及一黑素瘤细胞系，名为MSR3-mel并保存在CBA-联合实验室细胞系保藏中心(Interlab Cell line Collection)-(Genua，意大利)，编号为N.PD99001，其表达不可检测水平的组织相容性抗原。在实施例1中有更详细的描述，该细胞系能用编码组织相容性系统任何等位基因的cDNA转染，随后用编码它不表达的肿瘤抗原、或其片段、或病毒抗原的cDNA转染或转导。然后再用于体外诱生抗原特异性效应物或按照体内主动免疫治疗的应用回输至患者体内。在优选的实施方案中，肿瘤抗原是黑素瘤抗原，并且组织相容性分子是HLA I类B*3701。MSR3-mel细胞系能方便地用于抗原特异的细胞毒性T淋巴细胞的离体诱生或扩增以用于过继免疫疗法，和/或用于鉴定新的抗原决定簇。而且，用编码HLA分子和/或肿瘤抗原的基因遗传改造过的MSR3-mel细胞系能用作疫苗。
按照另一方面，本发明涉及针对上述肽的抗体，它们的片段或衍生物。产生抗体的一般方法是众所周知的并被描述在Kohler和Milstein，自然(Nature)256(1975)，494或J.G.R.Hurrel，单克隆杂交瘤抗体：技术及应用(Monoclonal Hybridoma Antibodies：Techniques andApplications)，CRC Press Inc.，Boco Raron，FL(1982)。抗体包括单克隆(mAb)或多克隆的，优选单克隆的，并且它们的片段可以是F(ab’)2、Fab、Fv或scFv。
图例说明
图1：MSR3-mel和MSR3-B37表达HLA I类分子。肿瘤细胞用mAbW6/32(抗HLA-I类)或同种型对照孵育、清洗和用偶联荧光素的羊抗鼠Ig抗体标记。在HLA-B*3701转染MSR3-mel之前和之后进行分析。
图2：CTLs 337识别HLA-B*3701限制的抗原。用自体黑素瘤MSR3mel及MSR3-B37，和不同效应物/靶(E/T)比的同种异体黑素瘤ET1来评估CTLs337的细胞毒活性。
图3：CTLs 337识别的肿瘤抗原的鉴定。单独用HLA-B*-3701或与编码MAGE-1、2、3、6和12基因的cDNA一起共转染Cos-7细胞。48小时后，加入CTLs 337并于24小时后按照“材料与方法”所述测量释放的γ干扰素。MSR3-B37作为阳性对照。
图4：A)CTLs 337识别肽MAGE.127136。MSR3-EBV与从10mM开始三倍稀释的肽MAGE.127 136孵育并且在标准细胞毒性试验中用作靶细胞。E/T比固定在10∶1。最大量裂解一半需要的肽量表述为ED50。B)用竞争性试验评估肽M4.127 136和M12.1127-136对HLA-B*3701的结合。竞争肽包括M4.127-136肽KELVTKAEML和M12.1127-136肽REPFTKAEML。不能结合HLA-B*3701分子的M3.A1(也就是M3.271-279)肽用作阴性对照。没有竞争肽的裂解是52％。
图5：CTLs 337识别MAGE-6阳性的黑素瘤细胞系。HLAB*3701阴性系Me 14932和HLA-B*3701阳性系Me  14932-LB37用或不用16μ M肽MAGE.127-136刺激，并且在按照所指明E/T比的标准细胞毒试验里用作靶细胞。
材料和方法
合成肽
合成肽购自PRIMM(Milan，意大利)。肽是MAGE.127-136(REPVTKAEML)，由MAGE-1、2、3和6基因第127-136位密码子编码；M4.127-136(KELVTKAEML)和M12.127-136(REPFTKAEML)，分别对应于MAGE-4和MAGE-12基因编码的第127-136位氨基酸。肽在DMSO中溶解成10mM，并用0.9％NaCl进一步稀释。
HLA-B*3701等位基因的亚克隆
用RNeasy Total RNA Kit(QIAGEN，Hilden，德国)从MSR3 PBLs制备总RNA。用oligo-dT引物和没有RNase-H活性的莫洛尼鼠类白血病病毒来源的逆转录酶(MMLVRT RNase-H-Superscript；Gibco BRL，Gaithersburg，MD)按照生产商的建议从2μg总RNA进行单链cDNA合成。用适宜于HLA-B等位基因全长编码区特异性扩增和定向克隆的一对引物PCR扩增对应于300ng总RNA的cDNA。1.1kb的PCR-产物被亚克隆进真核表达载体pcDNA3.1(Invitrogen Corporation，Oxon，U.K.)。用诊断性限制性酶鉴定编码HLA-B*3701或B*52011(患者MSR3的HLA-B37和B5等位基因)的质粒克隆。再对该HLA-B*3701基因测序以证实与发表的DNA序列对应。这个质粒被称作pcDNA3.1/B*3701。
黑素瘤细胞系的转染
用磷酸钙沉淀技术用pcDNA3.1/HLA-B*3701转染黑素瘤细胞系并用G418选择。在流式细胞仪上用HLA-A、B和C特异性单克隆抗体W6/32证实在稳定的转染子中转染的HLA-B*3701分子的表达。
体外诱导细胞毒性T淋巴细胞系337(CTLs 337)
按照以前他人描述的方案(Van den Eynde，等，Int.J.Cancer.，44：634-640，1989)少许更改得到CTL系337。简要地说，用Ficoll梯度分离患者MSR3的PBLs，并在2ml补充了10％人血清(HS)、谷氨酰胺和抗生素的IMDM中用自体的辐射过的MSR3-B37黑素瘤细胞(0.5-1×105/孔)培养(1-2×106/孔)。培养三天后，加入10U/ml IL-2(Chiron，Milan，意大利)和5ng/ml IL-7(Genzyme Corp.)。淋巴细胞每周用0.5×105辐射过的MSR3-B37细胞再刺激，并且刺激三次后在细胞毒性试验中测定。第五次再刺激后，加入2×106LG2-EBV辐射过的LG2-EBV作为饲养层细胞并且IL-2提高到50U/ml。
细胞裂解活性和肽结合研究的试验
按前述(Fleischhauer，K.，等，Cancer Res.，58：2969-2972，1998)铬释放试验检测细胞毒T细胞系的裂解活性。用铬释放试验检测肽：51Cr-标记的靶细胞在以固定效应物/靶比值加入效应细胞前在96-孔微量培养板中与不同浓度肽室温孵育1小时。按以前描述(Herman，J.，等，Immunogenetics，43：377-384，1996)用竞争性试验进行肽M4.127-136和M12.127-136对HLA-B*3701分子的结合。作为标准肽，我们用了CTLs 337识别的肽MAGE127-136(300nM)。按30∶1的E/T比使用CTLs。。
MAGE-1亚片段的产生
用BglII和EcoRI消化MAGE-1cDNA得到MAGE-1基因亚片段(495和1,072bp)。琼脂糖凝胶纯化后，片段被克隆进pcDNA3.1质粒(Invitrogen)。分离克隆，抽提质粒DNA并与HLA-B*3701基因一起转染Cos-7细胞。
Cos-7细胞的转染及γ-IFN释放试验
用DEAE-葡聚糖-氯奎方法进行Cos-7细胞转染(Coulie，P.G.，等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.)，91：6458-6463，1994)。简要地说，用100ng pcDNA3.1/B*3701质粒和100ng含基因MAGE-1、2、3、4、6和12之一的cDNA的表达载体转染1.5×104Cos-7细胞。48小时后对转染的Cos-7细胞进行γ-IFN试验检测：5000个反应者CTLs在刺激后第5天加到补充了25U/ml IL-2的150μl IMDM/10％HS中。37℃下24小时后，收获100μl上清并用γ-IFN释放试剂盒(Genzyme，MA)按照生产商建议测量γ-IFN浓度。
逆转录病毒载体介导HLA-B*3701基因转移进Me14392
按以前描述(Fleischhauer，K.，等，J.Immunol.，159：2513-2521，1997)构建了编码患者MSR3的HLA-B*3701分子的逆转录病毒载体B37-CSM。简要地说，编码HLA-B*3701分子的全长cDNAs被克隆到病毒LTR控制之下，而截短形式的人低亲和力神经生长因子受体(ΔLNGFR)在Sv40启动子控制之下。亲嗜性的鼠成纤维细胞系GP+E86用30μg逆转录病毒结构按标准磷酸钙方法瞬时转染。在8μg/ml Polybrene存在时用转染的GP+E86细胞48小时培养上清感染双嗜性鼠包装细胞系GP+env Am 124个小时。用包被了LNGFR-特异性单克隆抗体20.4(美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，Rockville，MD)的磁珠(Dynabeads M-450，Dynal A.S.，Oslo，挪威)对感染的包装细胞进行ΔLNGFR表达的免疫选择。在polybrene(8μg/ml)存在时用含逆转录病毒的上清培养以转导Me 14932。进行5或6轮至少4小时的感染。用LNGFR特异性单克隆抗体20.4和HLA-Bw4-特异性单克隆抗体进行免疫荧光分析以评价感染的有效性。
RT-PCR分析
通过PCR扩增检测MAGE-1、2、3、4、6、12和β2-微球蛋白(β2m)的cDNAs。反应混合物包含5μl cDNA悬液、4μl 10mM dNTPs混合物(含每种dNTP各2.5mM)、5μl 10×DNA聚合酶缓冲液(Finnzymes Oy，Espoo，芬兰)、2U DynaZyme DNA聚合酶(Finnzymes Oy)和无菌水补到50μl总反应体积。寡核苷酸引物序列和PCR扩增程序见Weynants等(Weynants，P.，等，Int.J.Cancer，56：826-829，1994)(MAGE-1、2和3)，De Plaen等(De Plaen，E.，等，J.Immunol.，159：2513-2521，1997)(MAGE-4、6和12)。用有义引物Beta5’(5’-AAC CAC GTG ACT TTGTCA CAG C-3’)，和反义引物Beta 3’(5’-CTG CTC AGA TAC ATC AAA CAT G-3’)扩增β2m cDNA；PCR扩增进行30个循环(94℃1分钟，56℃30秒和72℃2分钟)；β2m扩增产物的预期长度是230bp。用β-肌动蛋白特异性寡核苷酸引物进行PCR反应检测RNA完整性(De Smet，C.，等，Tmmnogenetics，39：121-129，1994)。在溴化乙锭存在时在琼脂糖胶上看到适宜大小带的样品判定为阳性。
本发明将在下述实施例中做更详细描述。
实施例
实施例1
MSR3-B37诱导抗原特异性免疫反应
从患者MSR3切除的皮肤转移癌建立黑素瘤细胞系MSR3。肿瘤细胞上HLA I类等位基因表达用HLA-A、B和C的特异性mAb W6/32进行免疫荧光分析来评价。
观察到的检测不出或刚刚可检测水平的表面分子(图1)似乎不足以使抗原呈递给免疫效应细胞。事实上，MSR3细胞系不能从自体的PBLs诱生细胞毒反应。MSR3-mel缺乏I类细胞表面表达不是由于损伤的β2m合成造成的，因为能够用RT-PCR检测到β2m特异性的mRNA。
为确定HLA I类抗原表达是否能够恢复，MSR3-mel细胞用编码自体HLA-B*3701分子的cDNA稳定转染。G418选择后，流式细胞仪分析表明转染的MSR3-B37细胞系被W6/32单克隆抗体所染色(图1)。
为评价MSR3-B37细胞系表面上是否存在肿瘤特异性抗原，检测了黑素瘤细胞诱生肿瘤特异性细胞毒效应细胞的能力和它们被这些CTLs裂解的易感性。按照“材料和方法”所述用MSR3-B37体外刺激患者的PBLs。刺激三轮后，多克隆细胞毒性T细胞系337(CTLs 337)特异性裂解MSR3B37细胞系，但不裂解未转染的MSR3-mel(图2)。自体的MSR3-EBV细胞和PHA-活化的T母细胞不被识别，表明这些CTLs识别的表位是黑素瘤/黑色素细胞特异的。事实上，除了自体的黑素瘤细胞外，CTLs 337也裂解HLA-B*3701阳性的黑素瘤细胞系ET1(图2)，表明识别一个或更多共有的黑素瘤抗原。
这些数据表明HLA I类表达能够通过MSR3黑素瘤细胞转染恢复，并且转染了HLA-B*3701分子的黑素瘤细胞系能够诱生肿瘤特异性的细胞毒性T细胞反应。
实施例2
鉴定CTLs 337识别的抗原表位
为鉴定CTLs 337识别的抗原，在转染了质粒pcDNA3.1/B*3701和编码MAGE家族6个成员(MAGE-1、2、3、4、6和12)的cDNA(某些被MSR3-mel和ET1两者表达)的Cos-7细胞存在下评价CTLs 337的γ IFN释放。CTLs337特异性识别转染了MAGE-1、2、3和6的Cos-7细胞，表明CTLs 337的表位靶标在四个不同的抗原中是共同的，或者寡克隆(oligoclonal)T细胞系不同成分识别来源于四个MAGE-基因产物的肽。在MAGE-4和MAGE-12转染的Cos-7细胞存在时检测到低水平的γ-IFN(图3)。
为鉴定CTLs 337识别的编码抗原肽的序列，编码MAGE-1的cDNA用Bgl II和EcoRI消化得到2个大约是495和1,072bp的亚片段。这些片段被克隆进质粒pcDNA3.1并与HLA-B*3701分子一起转染进Cos-7细胞。分别在495和1,072bp片段的第202bp和707bp处存在符合读码框架的起始密码子，保证了转染细胞里这两个亚片段的表达。在转染了495bp片段的Cos-7细胞存在时CTLs 337释放的γ-IFN的水平可与整个MAGE-1基因转染的Cos-7细胞释放的水平相当，表明抗原肽在这个区域编码。筛选这个495bp片段编码氨基酸序列中携带HLA-B*3701结合基序的肽(Rammensee，H.G.，等，Immunogenetics，41：178-228，1995)。鉴定出5个肽：在位置2处是天冬氨酸或谷氨酸并在位置9/10处是异亮氨酸或亮氨酸。其中一个肽，REPVTKAEML，也存在于MAGE-2、MAGE-3和MAGE-6编码的氨基酸序列里。这个肽，命名为MAGE.127-136，在滴定实验中被用于使MSR3-EBV细胞系致敏以被CTLs 337裂解。MSR3-EBV细胞用肽REPVTKAEML刺激并再在细胞毒性实验中用作靶细胞(图4a)。90nM肽达到半数最大量裂解。没有观察到用能结合HLA-B*3701的无关肽刺激的MSR3EBV有裂解(图4b)。
CTLs 337在表达MAGE-4和MAGE-12的Cos-7细胞存在时释放低水平的γ-IFN(图3)。为证实这种释放是否能被归因于MAGE-4中127-136位密码子编码肽的识别，使用用两个肽刺激的MSR3-EBV作为靶细胞，进行肽结合研究。肽M4.127-136(KELVTKAEML)与肽REPVTKAEML有两个氨基酸不同(位置1处精氨酸换成赖氨酸，并在位置3处脯氨酸换成亮氨酸)，而肽M12.127-136(REPFTKAEML)仅有1个氨基酸不同(位置4处缬氨酸换成苯丙氨酸)。结果揭示两个肽能与HLA-B*3701结合，因为两者的量增加都能够抑制用肽REPVTKAEML而不是用无关HLA-A1-结合肽(即M3.271-279)刺激的MSR3-EBV的裂解(图4b)。然而，没有观察到用肽M4.127-136和M12.127-136刺激的EBV细胞的识别。
总之，这些数据表明CTLs 337能够识别内源性加工的MAGE-1、2、3和6肽。
实施例3
CTL 337特异性识别MAGE-2和MAGE-6基因的产物
迄今为止，不存在人MAGE-2和MAGE-6编码蛋白有免疫原性的证据。事实上，尽管已经鉴定出能够结合HLA I类分子形成被各种CTLs识别的抗原复合体的MAGE-1、3、4和12编码肽，但还没有鉴定出MAGE-2或MAGE-6基因编码的肽。
为了证明在黑素瘤细胞中肽REPVTKAEML能够从MAGE-2和MAGE-6基因被加工并呈递给CTLs 337，曾寻找表达MAGE-2或MAGE-6而不表达其它MAGE基因的黑素瘤细胞系。不幸的是，黑素瘤中MAGE基因的表达是严格相关的，并且大多数黑素瘤表达MAGE基因家族一个以上的成分。事实上，没有能发现选择性地表达MAGE-2的黑素瘤细胞系，而发现了一株选择性表达MAGE-6的黑素瘤细胞系，Me 14932。
用每个MAGE基因的特异性寡核苷酸引物对Me 14932黑素瘤细胞系作RT-PCR分析，证实仅MAGE-6为阳性，呈低表达水平。为确定REPVTKAEML肽是否从MAGE-6产物内源性加工并被HLA-B*3701呈递，按照“材料和方法”所述用编码HLA-B*3701分子和一个表面标记(ΔLNGFR)的逆转录病毒载体转导Me14932。转导的细胞，Me 14932-LB37，用磁珠免疫选择ΔLNGFR的表达。用HLA-Bw4-特异性mAb做的免疫荧光分析表明，在Me 14932转导细胞表面上HLA-B*3701的表达比MSR3-B37黑素瘤细胞至少低两倍。在细胞毒性实验中CTLs 337能够识别Me 14932-LB37细胞系，并且外源性(hexogenous)加入肽REPVTKAEML时裂解水平提高，而刺激的和没刺激的Me 14932细胞系不被识别(图5)。Me 14932-LB37黑素瘤的低裂解水平可能与MAGE-6基因的低表达或与HLA-B*3701表面分子的低表达有关。
为评价在肿瘤特异性免疫治疗的靶抗原名单中包括MAGE-2和MAGE-6是否能够提高可治疗患者的比例，分析了各种组织类型新鲜肿瘤样品中MAGE-1、2、3和6的表达。没有分析黑素瘤，因为不同MAGE基因的表达明确相关联(Dalerba，P.，等，Int.J.Cancer，77：200-204，1998)。结果表明，12％的卵巢癌和5％的结肠癌及乳腺癌表达MAGE-2和/或MAGE-6，而缺乏MAGE-1和MAGE-3(表)。另一方面，在所有研究的膀胱癌和肺癌中这四个基因总是共表达的。
总之，本研究中报告的数据表明MAGE-2和MAGE-6能够被包括在肿瘤特异性免疫治疗可能的靶抗原名单中，提高了能从这种治疗受益的患者数量。
表
新鲜肿瘤样品中MAGE基因的表达(a)
  组织类型   MAGE-1   MAGE-3   MAGE-2   MAGE-6   仅MAGE-2或MAGE-6
  肺癌(n28)(b)   35   39   32   29   0
  乳腺癌(n20)   30   10   10   15   5
  卵巢癌(n25)   24   20   32   20   12
  膀胱癌(n25)   28   28   20   24   0
  结肠癌(n17)   0   5   5   5   5
(a)逆转录-PCR分析确定的。结果表示为RT-PCR阳性肿瘤的百分数(％)
(b)分析的新鲜肿瘤样品数量
参考文献
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序列表
<110>GENERA S.P.A
<120>来自MAGE的免疫原性肽及其应用
<130>Genera
<140>
<141>
<160>3
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>1
Arg Glu Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu
  1               5                  10
<210>2
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>2
Lys Glu Leu Val Thr Lys Ala Glu Met Leu
  1               5                  10
<210>3
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>3
Arg Glu Pro Phe Thr Lys Ala Glu Met Leu
  1               5                  10

Claims (13)

1.结合HLA-B*3701分子的肽，其选自：
a)REPVTKAEML
b)KELVTKAEML
c)REPFTKAEML。
2.针对权利要求1的肽的单克隆或多克隆抗体。
3.包含有效量的权利要求1的肽和可药用的赋形剂的药物组合物。
4.权利要求3的组合物，用作疫苗。
5.诱生针对表达MAGE-1、2、3、4、6、12抗原的肿瘤细胞的细胞毒性反应的方法，包括在体外让T淋巴细胞在适于活化淋巴细胞自身的条件下接触权利要求1的肽。
6.权利要求5的方法，其中在培养中将淋巴细胞直接暴露给所述肽。
7.权利要求5的方法，其中肽先前结合HLAI类分子。
8.根据权利要求7的方法，其中HLAI类分子是HLA-B*3701。
9.分离的细胞毒性T细胞系，其特异地识别由HLAI类分子和权利要求1的肽组成的复合物。
10.根据权利要求9的细胞毒性T细胞系，其中HLAI类分子是HLA-B*3701。
11.权利要求1的肽在制备用于治疗表达至少一种MAGE肿瘤抗原的肿瘤的药物中的用途。
12.权利要求11的用途，其中所述药物是疫苗。
13.权利要求11或12的用途，其中所述至少一种MAGE肿瘤抗原选自肿瘤抗原MAGE-1、2、3、4、6和12。
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