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Die
Erfindung betrifft ein rekombinantes, aufgereinigtes MHC-Protein,
welches im wesentlichen die gleiche Konformation, funktionelle Aktivität sowie
die Bindungseigenschaften für
spezifische Antikörper
und Antigene wie das native MHC-Protein aufweist.
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Humane
Leukozyten Antigene, oder abgekürzt
HLA Moleküle
sind innerhalb der adaptiven Immunabwehr von zentraler Bedeutung.
Ihre Funktion besteht darin, an der Zelloberfläche Peptide gegenüber T-Lymphozyten zu präsentieren.
Die Antigenspezifität
der T-Zellen hängt
dabei vom Major Histokompatibility Complex, abgekürzt MHC,
Genotyp ab, was als MHC Restriktion bezeichnet wird. Diese MHC-gebundene
Spezifität
stellt die Basis für
die Fähigkeit
des Immunsystems dar, zwischen Selbst und Nicht-Selbst, z.B. Infektionserregern,
viral infizierten Zellen oder Allotransplantaten, zu unterscheiden.
Die Gene des HLA Komplexes sind auf dem kurzen Arm von Chromosom
6, 6p21, lokalisiert. Aus historischen Gründen werden drei MHC Regionen
unterschieden, die zentromerwärts
als Klasse II oder Klasse III sowie telomerwärts als Klasse I bezeichnet werden.
Insbesondere HLA Klassen I und II sind durch einen enormen allelischen
Polymorphismus gekennzeichnet, welcher nach jetzigem Kenntnisstand
unter anderem 540 HLA-B Allele, und 418 HLA-DRB Allele umfasst. Bei HLA Klasse I
Molekülen
handelt es sich um heterodimere Glykolproteine, welche aus einer
schweren, variablen α-Kette und einer leichten,
invariablen β-Kette, β2-Mikroglobulin,
zusammengesetzt sind. Teile der α1
und α2 Domänen bilden
zusammen die Peptid-bindende Region PBR. In dieser grubenartigen
Vertiefung der Plattformstruktur werden okta- bis undecamere Fragmente
aus endogenen Proteinen nichtkovalent gebunden, und gegenüber CD8+ zytotoxischen T-Zellen präsentiert.
Die α1 und α2 Domänen sind besondere im
Bereich der PBR durch einen ausgeprägten Aminosäure Polymorphismus gekennzeichnet,
wohingegen die Variabilität
in den weiteren Molekülabschnitten
wesentlich geringer ist.
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Auch
bei HLA Klasse II handelt es sich um heterodimere Moleküle. Diese
bestehen aus jeweils einer α und
einer β Kette,
welche sich im Molekulargewicht geringfügig voneinander unterscheiden.
Bei HLA Klasse II sind beide Ketten mit ihrer α1 bzw. β1 Domäne gemeinsam an der Bildung
der Plattformstruktur beteiligt. Im Gegensatz zu HLA Klasse I werden
hier über
den exogenen Antigenpräsentationsweg
aufgenommene Proteinfragmente mit einer Länge von 15-24 AS präsentiert.
HLA Klasse II Moleküle
werden auf professionell antigenpräsentierenden Zellen (Makrophagen,
dendritische Zellen, B-Lymphozyten) sowie auf aktivierten T-Zellen exprimiert.
Die Präsentation
der Peptide erfolgt gegenüber
CD4+ inflammatorischen T-Zellen oder T-Helferzellen.
Die bei HLA Klasse I Molekülen
an den α1
und α2 Domänen, und
bei HLA Klasse II in den α1
und β1 Domänen vorhandenen
Aminosäure
Polymorphismen legen das Peptidbindungsverhalten des jeweiligen
HLA Moleküls
sowie die Konformation der präsentierten
Peptide fest.
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Aufgrund
der in den industrialisierten Ländern
bestehenden geringen durchschnittlichen Familiengröße kann
nur bei ca. 30 % der für
eine Stammzellentransplantation in Frage kommenden Patienten ein
HLA genotypisch identischer Geschwisterspender zur Verfügung gestellt
werden. Aus diesem Grunds werden mit steigender Häufigkeit
Blutstammzellen von HLA gematchten Frerndspendern transplantiert.
Ein wesentliches Problem bei der allogenen Blutstammzellentransplantation
stellt die Graft-versus-host Erkrankung (GVHD) dar, bei welcher
Donor-Lymphozyten
allogene HLA Merkmale im Empfängergewebe
erkennen. Der Einfluss von HLA Mismatchen auf das Risiko der Entwicklung
einer schweren akuten GVHD oder einer Transplantatabstoßung (Host-versus graft
Reaktion) wurde in einer Reihe von Studien untersucht. In der überwiegenden Mehrzahl
der Untersuchungen stellten sich HLA Klasse I Mismatche, insbesondere
für HLA-A
und B, als deutliche Risikofaktoren sowohl in GVH, als auch in der
Host-versus-graft (HVG) Richtung heraus. Hinsichtlich HLA Klasse
II waren bei der überwiegenden
Mehrzahl der Studien insbesondere Mismatche an den Genorten, welche
DRB1 und DQB1, welche die β-Ketten
der HLA-DR und DQ Merkmale codieren, mit einem erhöhten Risiko für die Entstehung
einer schweren akuten GVHD verbunden. Die Bedeutung von Mismatchen
am DPB1 Genort wird derzeit kontrovers diskutiert. Hinsichtlich
der übrigen
HLA Klassen II Genorte liegen derzeit für eine Bewertung deren Transplantationsrelevanz
zuwenig Daten vor. Unter Berücksichtigung
der gegenwärtigen
Datenlage besteht in Deutschland derzeit der Konsensus, dass bei
der allogenen Blutstammzellentransplantation des HLA Matching von
Donor und Rezipient die HLA Klasse I Merkmale HLA-A und B, d.h.
niedrigauflösende Typisierung
auf Allelgruppenebene, sowie die Klasse II Genorte DRB1 und DQB1,
d.h. hochauflösende
molekulargenetische Untersuchung auf Allelebene umfassen soll. Am
Stichtag 22. Juli 2003 standen weltweit 8.575.256 potenzielle Stammzellspender
bzw. Nabelschnurbluteinheiten zur Verfügung, wobei diese Zahl aufgrund
von Informationskampagnen und Aufrufen zur Stammzellspende kontinuierlich
wächst.
Somit kann davon ausgegangen werden, dass zukünftig für eine wachsende Zahl von Patienten
mehrere phänotypisch
HLA identische Fremdspender verfügbar
sein werden, und die Anforderungen an die Spender-Empfängerauswahl z.
B. durch Erhöhung
der Untersuchungsgenauigkeit oder durch Einbeziehung weiterer Merkmale
erhöht
werden können.
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Die
Organtransplantation stellt heute ein standardisiertes Verfahren
zur Behandlung von Organversagen dar. Die am häufigsten transplantierten Organe
betreffen Herz, Leber, Lunge, Niere und Pankreas. Im Jahr 2003 wurden
im Eurotransplantverbund Belgien, Deutschland, Luxemburg, Niederlande, Österreich,
Slovenien ca. 3500 Nieren, 1100 Lebern, 400 Pankreas, 600 Herzen
und 300 Lungen transplantiert.
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Nach
gegenwärtigem
wissenschaftlichen Kenntnisstand ist die Gewebeverträglichkeit
zwischen Spender und Empfänger
in der Übereinstimmung
der Antigene des HLA-Systems begründet. Für Nieren- und Herztransplantationen werden die
besten Ergebnisse bei völliger
Identität
des HLA-Antigene zwischen Spender und Empfänger erzielt. Es besteht kein
Zweifel, dass immunologische Abstoßreaktionen gegen diese Organe in
ihrer Inzidenz und Stärke
deutlich vermindert und therapeutisch besser beherrschbar sind,
wenn eine höchstmögliche Übereinstimmung
für die
HLA-Antigene besteht. Für
die Transplantation von Herz, Lunge und Pankreas konnte klinisch
bisher nicht nachgewiesen werden, dass durch HLA-Übereinstimmungen
zwischen Patienten und Spender das immunologische Abstoßungsrisiko
vermindert werden kann. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass präformierte
oder nach Transplantationen gebildete spenderspezifische anti-HLA-Antikörper in
jedem Fall zu einer humoralen Abstoßung bis zum Funktionsverlust
des transplantierten Organs führen.
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Die
Detektion von anti-HLA Antikörpern
ist im Rahmen der Transplantation von Blutstammzellen und soliden
Organen ein zentraler Bestandteil der Prä- und Posttransplantations-Diagnostik.
Bei allen Patienten zur Stammzellentransplantation und allen Patienten,
die auf den Wartelisten zur Transplantation solider Organe geführt werden,
erfolgt immer vor Transplantation und in Abhängigkeit vom klinischen Verlauf
nach Transplantation ein Screening nach HLA-Antikörpern. Bei
Patienten zur Nierentransplantation wird dieses Screening gemäß den Richtlinien
der Eurotransplant Foundation sogar quartalsweise durchgeführt, um
HLA-Antikörper-positive
Patienten auf den Wartelisten sicher zu identifizieren. In ca. 20
% der Patienten werden HLA-Antikörper
gefunden, die zur Charakterisierung nach transplantabler HLA Antigene
in weiteren Untersuchungen spezifiziert werden müssen. Die zum Screening und
zur Spezifizierung verwendeten Methoden basieren auf Zytotoxizitätstechniken
mit vitalen Lymphozyten oder ELISA Techniken mit aus Zelllinien
gewonnenen natürlichen
HLA Molekülen.
Aufgrund der Co-Expression
aller HLA Loci sowie dem Kopplungsungleichgewicht zwischen Allelen
der verschiedenen HLA Loci ist eine Identifizierung der Antikörperspezifitäten dadurch
nur sehr eingeschränkt
möglich.
Bei hochimmunisierten Patienten ist eine Spezifierung der Antikörper mit
diesen Techniken in fast keinem Fall möglich. Aber gerade in diesem
Fällen
ist die Identifizierung akzeptabler Mismatche, d. h., von HLA Antigenen,
gegen die keine Antikörper
gebildet worden sind, besonders bedeutsam, da dies häufig die
einzige Chance bietet, einen kompatiblen Spender zu ermitteln.
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Durch
die Verwendung rekombinanter humaner MHC-Proteine, rhMHC, können diese
Restriktionen durch Verwendung eines definierten Antigens pro Reaktion
als ELISA oder durch durchflusszytometrische Technik gelöst werden.
Durch Verwendung aller rhMHC Antigene pro Reaktion kann zudem ein
effektives Antikörper-Screening
System etabliert werden. Mit rhMHC kann weiterhin die Problematik
der begrenzten Verfügbarkeit
seltener HLA-Allele für
Screeningzwecke gelöst
werden. Rekombinante humane MHC stehen seit kurzem als prokaryote
und eukaryote Proteine zur Verfügung,
die nach den unten beschriebenen Verfahren hergestellt werden können.
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Das
langfristige Ziel einer allogenen Blutstammzellentransplantation
SCT ist zum einen die Etablierung einer dauerhaften T-Zellantwort
gegen MHC restringierte Tumorantigene und zum anderen die Entstehung
einer Toleranz gegenüber
gesunden Zellen. Das Potential allogener T-Zellen für die Kontrolle
von malignem Zellwachstum ist aus der engen Kopplung zwischen Graft
versus Host GvH und Graft versus Leukemia GvL Reaktion bekannt und
konnte eindrucksvoll durch die Reinduktion von Remissionen durch
T-Zellen nach Stammzelltransplantationen gezeigt werden. Unter Berücksichtigung
der bislang enttäuschenden
Ergebnisse der autologen Immuntherapie maligner Erkrankungen mit
einerseits modifizierten Tumorzellen, Tumorlysaten oder Hybridzellen
und andererseits Ansätzen
zur spezifischen Peptid-, Protein- oder DNA-Vakzinierungen kann
vermutet werden, dass eine erfolgreiche Immuntherapie eher im allogenen
als im autologen System zu erwarten ist. In die gleiche Richtung
weisen die bisherigen Daten zur Identifizierung tumorassoziierter
T-Zellepitope. Der allogene Ansatz beinhaltet auf der anderen Seite
den wesentlichen Nachteil der Abstoßung und der schweren GvH Reaktion,
die einem generellen Einsatz von Stammzellen zur Zeit entgegenstehen.
Um den Verlauf eines allogenen Ansatzes therapeutisch gezielter
steuern zu können,
ist die Charakterisierung von MHC Liganden sowie deren gewebespezifische
bzw. tumorspezifische Präsentation
ein unumgängliches
Ziel. Dazu war der Abschluss des Humanen Genomprojektes ein wesentlicher
Meilenstein, der es in zunehmenden Maße ermöglicht; komplette zellspezifische
Expressionsprofile zu definieren und der die Basis für das Nachfolgeprojekt
der genomweiten Identifizierung von Single Nucleotide Polymorphismen
SNP liefert. Mit zunehmendem Voranschreiten des SNP Projektes ist
unmittelbar eine stetige Identifizierung potentieller allogen relevanter
MHC Liganden zu erwarten. Eine vergleichbare Entwicklung ist in
der Infektionsbiologie mit fortschreitender Aufklärung mikrobieller
Genome und MHC allelspezifischer Peptidbindungsmotive zu erwarten.
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Virus-spezifische
und die Mehrzahl alloreaktiver T-Zellen erkennen MHC Moleküle in Peptid-abhängiger Weise.
Die Identifizierung und Klonierung Virus- und Allopeptid-restringierter
T-Lymphozyten ist mit konventionellen Methoden (Zytotoxizität oder Zytokineexpression)
technisch sehr schwierig und mit einem sehr hohen Anteil unspezifischer
Ergebnisse belastet. Mit Hilfe prokaryonter tetramerer HLA Komplexe
konnten Peptid-selektive CD8+ T-Zellen nach
viralen Infektionen sowie bei Autoimmunerkrankungen und Tumorpatienten
direkt nachgewiesen werden. Neben der direkten Visualisierung konnte
gezeigt werden, dass Tetramere zur Sortierung und Klonierung allorestringierter
CTLs geeignet sind. Parallel mit der Identifizierung potentieller allogener
und mikrobieller MHC Liganden wird der Bedarf nach rhMHC steigen,
die mit diesen Liganden bestückt
für die
Identifizierung targetierbarer T-Zellepitope eingesetzt werden können. Sobald
MHC allelspezifische T-Zellepitope identifiziert worden sind, kann
die Kaskade diagnostischer und therapeutischer Applikationen einsetzen.
Das gleiche gilt für
die Detektion von NK-Zellen, deren Rezeptoren Liganden für MHC-Proteine darstellen.
Hier ist jedoch noch unklar, ob diese Interaktion Peptid-selektiv
oder unabhängig
vom präsentierten Peptid
erfolgt.
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Rekombinante
humane MHC-Proteine können
in Prokaryonten oder Eukaryonten hergestellt werden. Die Herstellung
in Eukaryonten erfolgt entweder trunkiert oder komplett. Die trunkierte
Variante wird wie bei der prokaryonten Expression ohne den transmembranen
Abschnitt und ohne den cytoplasmatischen Abschnitt exprimiert. Dadurch
fehlt dem rekombinanten Molekül
die Möglichkeit
der Verankerung in der Zellmembran, so dass das Protein von den
Zellen sezerniert wird. Ein solches Protein ist in der US-Offenlegungsschrift 2003/0191286
A1 beschrieben. Bei diesem Protein besteht der Nachteil, dass dem
Protein der cytosolische Schwanz fehlt, obwohl er zum löslichen
Teil des Proteins gehört.
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Bei
der Herstellung kompletter rekombinanter Moleküle wird das Protein in der
Zellmembran exprimiert. Hierbei liegt der Nachteil aber darin, dass
keine löslichen
Proteine produziert werden.
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Die
Herstellung in Prokaryonten erfolgt als trunkiertes Molekül, wobei
das Molekül
ohne den transmembranen Abschnitt und ohne die cytoplasmatischen
Abschnitte exprimiert wird. Dabei werden die einzelnen Ketten unabhängig in
Prokaryonten exprimiert und in vitro zu einem funktionsfähigen MHC
Molekül
gefaltet. Neben dem Fehlen des cytosolischen Schwanzes bestehen
die Nachteile dieser Methode darin, dass der Faltungsaufwand sehr
hoch ist, den Proteinen die natürliche
Glykosilierung fehlt und in der Regel nur ein einziges synthetisch
hergestelltes Peptid, das zur Faltung verwendet wird, präsentiert
wird.
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Aufgabe
der Erfindung ist es deshalb, ein MHC-Protein und ein Verfahren
zu seiner Herstellung vorzuschlagen, welches löslich ist, aber dennoch die
gleiche Faltung, Aktivität
und die außerhalb
der Membran für
Antikörper
zugänglichen
Epitope aufweist, wie das native Protein.
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Eine
Lösung
dieser Aufgabe sieht überraschenderweise
vor, dass das rekombinante Protein löslich und nicht trunkiert,
also am Ende abgeschnitten, ist. Hierdurch ergeben sich mehrere
Vorteile. Durch die Löslichkeit
ist zum einen die Ausbeute bei der Produktion der rekombinanten
Proteine höher.
Die Proteine verbleiben nicht in oder auf der Zellmembran, sondern
werden sezerniert. Dadurch sind sie leichter zu ernten, weil sie
nur noch aus dem Überstand
des Zellkultivierungsmediums abgeschöpft werden brauchen. Zum anderen werden
die produzierenden Zellen nicht beschädigt oder zerstört, was
bei membranenständigen
Proteinen nötig
ist, um diese aus oder von der Membran zu entfernen. Auch hierdurch
wird die Ausbeute verbessert. Durch ihre Löslichkeit sind die Proteine
in Lösung
stabiler und besser aufzubewahren. Da die meisten physiologischen
Reaktionen in wässriger
Lösung
ablaufen, ist es von Vorteil, wenn auch die als Reagenz verwendeten Proteine
löslich
sind. Hierdurch sind sie vielseitig verwendbar. Weitere Vorteile
des erfindungsgemäßen Proteins
ergeben sich dadurch, dass es nicht trunkiert ist. Bei herkömmlichen
löslichen
MHC-Proteinen ist die Aminosäuresequenz
ab der Position komplett abgeschnitten, die den Beginn der transmembranen
Domäne
darstellt. Die Trunkierung kann beispielsweise durch eine geeignete
Protease vollzogen werden. Nach dem üblichen Verfahren geschieht
dies dadurch, dass mittels PCR die Nucleotidsequenz nur bis zu dem
Genort amplifiziert wird, welches vor dem den Membranteil kodierenden
Exon liegt. Hierdurch wird dieses Exon zwar nicht amplifiziert,
allerdings auch alle in der Sequenz folgenden Exons nicht, die die
intrazelluläre
Domäne
des Proteins kodieren. Diese Domäne
kann aber für
die Funktion und Konformation wichtig sein. Außerdem ist sie Träger von
Epitopen für
gegen MHC gerichtete spezifische Antikörper. Daher ist es von erheblichem
Vorteil, wenn ein rekombinantes MHC-Protein diese Domäne aufweist.
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Die
transmembrane Domäne
des MHC-Proteins sorgt für
dessen Verankerung in der Membran und verursacht die lipophilen
Eigenschaften des Proteins, die eine Löslichkeit verhindern. Das MHC-Protein
kann nun dadurch in ein lösliches
Protein überführt werden,
dass es keine transmembrane Domäne
aufweist. Dies kann dadurch erreicht werden, dass beispielsweise
beim Klasse 1 Allel mittels PCR und geeigneter Primer nur die Allelabschnitte
bzw. Exons amplifiziert werden, welche für die hydrophilen Domänen, also α1, α2, α3 und den
Schwanzteil kodieren, während
das den transmembranen Teil kodierende Exon nicht amplifiziert wird. Wird
die so amplifizierte ununterbrochene Basensequenz mittels geeigneter
Methoden zur Expression des Proteins verwendet, dann bleibt der
C-terminate Anteil des Proteins im wesentlichen unverändert. Das
Protein weist also alle Domänen
einschließlich
des cytosolischen Schwanzes mit Ausnahme des transmembranen Teils
auf. Eine andere Möglichkeit
besteht darin, im Prinzip das gesamte Protein einschließlich des
Membranteiles zu exprimieren, aber diesen hinsichtlich seiner Aminosäuresequenz
zu modifizieren. Beispielweise können
ein oder mehrere Codons innerhalb des den Membranteil kodierenden
Exons verändert
werden, so dass hydrophobe gegen hydrophile Aminosäuren ausgetauscht
werden. Der Austausch eines Codons kann auch bezwecken, dass die
Konformation der transmembranen Domäne funktionell derart verändert wird,
dass sie ihre Verankerungsfunktion nicht mehr erfüllen kann
und somit das gesamte Protein löslich
wird. Hierzu kann bereits der Austausch eines Codons bzw. einer
Aminosäure
ausreichend sein.
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Dadurch
dass das rekombinante MHC-Protein einen cytosolischen Schwanz aufweist,
hat es annähernd
die gleiche Konformation, funktionelle Aktivität und Epitop-Struktur wie das
native Protein.
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Vorteilhaft
ist es, dass das erfindungsgemäße rekombinante
MHC-Protein die Glykolisierung des nativen MHC-Proteins aufweist.
An Proteine gebundene Kohlenhydrate sind essentiell für die Konformation
und Funktion dieser Proteine. Die Glykolisierung ist außerdem wichtig
für die
Erkennung von MHC-Proteinstrukturen durch Komponenten des Immunsystems,
beispielsweise Antikörpern.
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Das
rekombinante MHC-Protein lässt
sich dadurch isolieren, dass es mittels Affinitätschromatographie und/oder
Gelchromatographie aufgereinigt wird. Eine einfache Methode zur
affinitätschromatographischen Aufreinigung
besteht in der Anwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen
die tag-Sequenzen der rekombinanten Moleküle z. B. antis-His, anti-V5.
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Das
rekombinante MHC-Protein kann ein HLA-Protein der Klasse I oder
der Klasse II sein. Wie oben beschrieben wurde, werden rekombinante
HLA-Proteine, also humane MHC-Proteine, dringend zum Screening von
Transplantationspatienten benötigt.
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Wenn
das rekombinante MHC-Protein an seiner Peptid-bindenden Region ein
dort gebundenes endogenes Peptid aufweist, hat dies eine Reihe von
Vorteilen. Zum einen kann das MHC-Protein zum Nachweis des präsentierten
Peptids durch Edman Sequenzierung und Massenspektrometrie des eluierten
Peptides verwendet werden. Dadurch lassen sich zum einen Peptidbindungsmotive
des betreffenden HLA Allels nachweisen und zum anderen die in der
jeweiligen Zelle exprimierten Proteine, die dann als Peptid in dem
rekombinanten HLA Molekül
erscheinen, identifizieren. Zum anderen kann der Nachweis von Peptidbindungsmotiven für Vakzineentwicklungen
bedeutsam sein. Außerdem
kann der Nachweis von Peptiden aus endogen synthetisierten Proteinen
der transfizierten oder transduzierten Zelle in Tumorzellen Hinweise
auf relevante Tumorantigene liefern. Weiterhin kann der Nachweis
von Peptiden aus endogen synthetisierten Proteinen der transfizierten
oder transduzierten Zelle in natürlicherweise
oder experimentell virusinfizierten Zellen Hinweise auf relevante
Virusantigene liefern, die für
Vakzineentwicklungen bedeutsam sein können.
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Das
beschriebene rekombinante MHC-Protein wird im wesentlichen nach
folgendem Verfahren hergestellt:
- a) Aufreinigung
eines MHC Allels bestehend aus gDNA oder cDNA oder RNA.
- b) PCR (Polymerase Chain Reaction) Amplifikation des MHC Allels
von Exon 1 bis Exon 4 mit zwei geeigneten Primern, vorzugsweise
mit dem Anfangs-Primer AE1S und dem End-Primer AE4AS.
- c) PCR Amplifikation eines MHC Allels, vorzugsweise des Allels
des ersten oder zweiten Verfahrensschrittes, bis zum Ende der kodierenden
Sequenz, die je nach MHC Allel in Exon 7 oder 8 liegt, also von
Exon 6 bis Exon 7 oder Exon 8 mit zwei geeigneten Primern, vorzugsweise
mit dem Anfangs-Primer AE6S_FS und dem End-Primer AE8AS_WOS, wobei
der Anfangs-Primer, vorzugsweise AE6S_FS, eine 5' Sequenz enthält, die zum 3' Ende von Exon 4
komplementär
ist, so dass über
diese Sequenz eine Fusionssequenz hergestellt werden kann, und wobei
der End-Primer, vorzugsweise AE8AS_WOS, kein Stoppcodon enthält. Dadurch
können
Teile des Vektors 3' wärts vom
Insert in das Transcriptat übernommen
werden, die für
eine tag-Markierung kodieren.
- d) gemeinsame PCR Amplifikation der beiden so erhaltenen Allelabschnitte
als eine ununterbrochene Sequenz mittels zweier geeigneter Primer,
insbesondere unter Verwendung des Anfangs-Primers aus Verfahrensschritt
b, vorzugsweise AE1S, und des End-Primers aus Verfahrensschritt
c, vorzugsweise AE8AS_WOS.
- e) Klonierung der amplifizierten ununterbrochenen Sequenz in
einen Klonierungsvektor, der auch als Expressionsvektor geeignet
ist z. B. pcDNA3.1, so dass ein Vektor-Insert Konstrukt entsteht,
wie z.B. HLAΔE5pcDNA3.1.
Alternativ kann auch ein einfacher Klonierungsvektor verwendet werden
und das klonierte Insert später
in einen beliebigen Expressionsvektor umkloniert werden. Das klonierte
PCR Produkt enthält
kein Stoppcodon, so dass auch Teile des Vektors 3' wärts vom
Insert, in das Transcriptat übernommen
werden können.
Dadurch können
Sequenzen, die für
eine tag-Markierung kodieren und aus dem Vektor stammen, mit übernommen
werden. Alternativ könnte
der tag, der beliebig gewählt
werden kann, auch im Primer AE8AS enthalten sein. In diesem Fall
wird der Primer mit einem Stoppcodon 3' wärts
vom tag versehen.
- f) Expansion des so erhaltenen Plasmids in geeigneten Prokaryonten,
vorzugsweise in kompetenten E. coli, und anschließende kontoaminationsfreie
Aufreinigung des Plasmids z. B. mit Endofree Plasmid-Aufreinigungskit,
so dass transfektierbare Plasmide gewonnen werden.
- g) Transfektion von eukaryonte Zellen oder Zelllinien, z. B.
K562 oder C1R Zellen, mit dem Plasmid. Die Transfektion kann mit
einer beliebigen Methode, z. B. Elektroporation, Lipofektion oder
Calciumchlorid- Transfektion
erfolgen. Die eukaryonten Zellen können beliebige Zellen sein,
die natürlicherweise
MHC Moleküle
bilden können.
Es können
auch Zellen verwendet werden, die z.B. wegen fehlender Expression der
zweiten Kette des MHC Moleküls
bzw. der β2-Microglobulin
bei HLA Klasse I, keine MHC Moleküle bilden können. In diesem Fall kann die
fehlende Kette in einem weiteren Plasmid oder im gleichen Plasmid wie
das beschriebene Insert co-transfiziert werden. Bei MHC Klasse II
muss die zweite Kette, die α-Kette bei
HLA Klasse II, co-transfiziert werden, da sie ebenfalls in der Membran
verankert ist. Die co-transfizierte Kette kann auf die gleiche Weise
wie das beschriebene Insert hergestellt werden oder durch Trunkierung der
zweiten Kette, so dass nur der extrazelluläre Teil dieser Kette gebildet
wird, erfolgen. Bei einer Transduktion wird homolog vorgegangen.
Die transfizierten oder transduzierten Zellen bilden dann die rekombinanten
MHC Moleküle,
die in das umgebende Medium sezerniert werden, da den rekombinanten
MHC Klasse I Molekülen
der normalerweise durch Exon 5 kodierte transmembrane Abschnitt
und den MHC Klasse II Molekülen
der normalerweise durch Exon 4 kodierte transmembrane Abschnitt
fehlt. Die rekombinanten MHC Moleküle können in einem ELISA nachgewiesen
werden. Dazu können
monoklonale Antikörper gegen
MHC, z. B. w6/32 gegen HLA Klasse I, oder gegen den tag des Proteins,
z. B. Anti-His oder Anti-V5 verwendet werden.
- h) Die gentechnisch veränderten
Zellen oder Zelllinien können
in Zellkulturflaschen und anderen Zellkulturtechniken kultiviert
und expandiert werden. Aus dem Überstand
können
die sezernierten, rekombinanten MHC Moleküle kontinuierlich geerntet.
Alternativ können
die produzierten Zelllinien auch in Hohlfaser-Bioreaktoren, z. B.
der Firma Biovest (BioVest International, Inc., 8500 Evergreen Blvd.
NW, Minneapolis, MN 55433, USA), kultiviert werden und das Medium
kontinuierlich geerntet werden.
- i) Aberntung der von den Zellen sezernierten, rekombinanten
MHC- Moleküle.
- j) Die rekombinanten Moleküle
können
gelchromatographisch und affinitätschromatorgraphisch
aus dem geernteten Medium isoliert und gereinigt werden. Eine einfache
Methode zur affinitätschromatographischen Aufreinigung
besteht in der Anwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen
die tag-Sequenzen der rekombinanten Moleküle (z. B. antis-His, anti-V5).
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Die
beiden folgenden Tabellen zeigen jeweils in Tabelle 1 die genomische
Organisation von HLA Klasse I Genen und in Tabelle 2 die genomische
Organisation von HLA Klasse II Genen. Hierbei sind jeweils die nicht
kodierenden Introns und die kodierenden Exons unter Angabe der Länge der
Basenpaare bp und der korrespondierenden Aminosäureposition gezeigt.
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Die
Erfindung wird in einer bevorzugten Ausführungsform unter Bezugnahme
auf eine Zeichnung beispielhaft beschrieben, wobei weitere vorteilhafte
Einzelheiten den Figuren der Zeichnung zu entnehmen sind.
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Die
Figuren der Zeichnung zeigen im Einzelnen:
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1:
Eine schematische Darstellung der genomischen Organisation von HLA
Klasse I Genen;
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2:
eine schematische Darstellung der genomischen Organisation wie in 2,
aber von HLA Klasse II Genen und
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3:
eine schematische Darstellung der PCR Strategie am Beispiel von
HLA-A.
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1 zeigt
eine schematische Darstellung der genomischen Organisation von HLA
Klasse I Genen. Hierbei ist die Nucleotidsequenz des Gens links
von 5' nach rechts
Richtung 3' dargestellt.
Die Exons sind als Kästchen
E1 bis E8 gezeigt, wobei der N-Terminus mit E1 beginnt und der C-Terminus
an E8 endet. E1 ist das Signalpeptid SP, welches nach der intrazellulären Synthese
des Proteins für
den Transport über
die Membran verantwortlich ist und E2 und E3 kodieren die α1 und α2 Domänen. Diese
sind genetisch variabel und deshalb für die Bindung des endogenen
Peptids verantwortlich. Die konservierte Region wird von den Exons
E4 bis E8 gebildet. E4 kodiert die α3 Domäne, E5 den Membranteil TM und
die Exons E6 bis E8 CP den cytosolischen Schwanz.
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2 zeigt
eine schematische Darstellung der genomischen Organisation wie in 2,
aber von HLA Klasse II Genen.
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3 zeigt
eine schematische Darstellung der PCR Strategie am Beispiel von
HLA-A. Es wird somit das wesentliche Prinzip der Erfindung dargestellt.
Die Figur zeigt die Gensequenz wie in 1, aber
ohne Introns. Zunächst
werden mittels PCR mit dem ersten Anfangs-Primer AE1S und dem ersten
End-Primer AE4AS die kodierende Sequenz von Exon 1 bis Exon 4 amplifiziert.
Dann wird vom gleichen Allel Exon 6 Exon 8 mit dem zweiten Anfangs-Primer
AE6S_FS und dem zweiten End-Primer
AE8AS_WOS amplifiziert. AE6S_FS enthält dabei eine 5' Sequenz, die zum
3' Ende von Exon
4 komplementär
ist, so dass über
diese Sequenz eine Fusionssequenz hergestellt werden kann. Die beiden
so erhaltenen Sequenzen als eine ununterbrochene Sequenz werden
zusammen mit AE1S als Anfangsprimer, und AE8AS_WOS als End-Primer amplifiziert.
Es entsteht dadurch wieder die ursprüngliche ununterbrochene Sequenz,
der allerdings das Exon 5 fehlt. Mit der Sequenz kann dann das nahezu
native Protein ohne Membranteil in löslicher Form hergestellt werden.
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Auf
diese Weise ist ein lösliches
rekombinante MHC Protein vorgeschlagen, das nicht trunkiert ist,
und so auf überraschende
Weise einen unveränderten
C-Terminus aufweist.
