JP4203097B2 - 変性低密度リポ蛋白質受容体 - Google Patents
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Description
一方、変性低密度リポ蛋白質は、低密度リポ蛋白質受容体とは異なる受容体を介してマクロファージや血管内皮細胞に取り込まれることが知られていた。マクロファージでは既に構造が決定されている(例えば、特許文献1〜3参照)スカベンジャー受容体を介して変性低密度リポ蛋白質は取り込まれ、マクロファージは動脈硬化巣で特徴的な泡沫細胞へと変化する。血管内皮細胞にはこのスカベンジャー受容体は発現しておらず、別の構造を持った受容体が存在することが予想されていた(例えば、非特許文献1参照)。
このような点から血管内皮細胞の変性低密度リポ蛋白質受容体の構造、すなわち、アミノ酸配列の解明が重要であるが、これまで全く構造はわかっていなかった。
また、本発明の目的は、変性低密度リポ蛋白質受容体またはその類似体を生産する方法を提供することでもある。
さらに、本発明の目的は、変性低密度リポ蛋白質受容体またはその類似体を含む蛋白質組成物を提供することでもある。
本発明は、哺乳類の血管内皮細胞の変性低密度リポ蛋白質受容体をコードする領域から実質的になるDNA配列を提供するものである。
あってもよい。さらに、以上述べたようなDNA配列について、遺伝暗号の縮重の結果として、同じ変性低密度リポ蛋白質受容体をコードしているDNA配列であってもよい。
従って、本発明は、哺乳類の血管内皮細胞の変性低密度リポ蛋白質受容体をコードする領域の配列番号1、配列番号3または配列番号5に示すDNA配列(当該塩基配列を有するDNA)、もしくはそのアナログにある。
また本発明は、哺乳類の血管内皮細胞の変性低密度リポ蛋白質受容体をコードする領域の配列番号1、配列番号3または配列番号5に示すDNA配列を有するcDNAクローン、もしくはそのアナログにある。
また、本発明は、42℃、20%(v/v)ホルムアミド水溶液中で、配列番号1、配列番号3または配列番号5に示すDNA配列のcDNAクローンとハイブリダイズでき、かつ哺乳類の血管内皮細胞の変性低密度リポ蛋白質と結合する機能を有する蛋白質(即ち受容体)をコードしているDNA配列(当該塩基配列を有するDNA)にもある。
そしてまた、本発明は、配列番号1、配列番号3または配列番号5に示すDNA配列と遺伝的コードの結果として縮重していて、かつ哺乳類の血管内皮細胞の変性低密度リポ蛋白質と結合する機能を有する蛋白質(即ち受容体)をコードしているDNA配列(当該塩基配列を有するDNA)にもある。
さらに本発明は、配列番号1、配列番号3または配列番号5に示す塩基配列を有するDNAもしくはそのアナログに対応する変性低密度リポ蛋白質受容体(あるいは配列番号1、配列番号3または配列番号5に示すアミノ酸配列もしくはそのアナログを含む変性低密度リポ蛋白質受容体)の抗体にもある。
さらに、本発明は、以上のように生産された生物学的活性を有する哺乳類の血管内皮細胞の変性低密度リポ蛋白質受容体またはその類似体を含む蛋白質組成物も提供する。
このように生産された哺乳類の血管内皮細胞の変性低密度リポ蛋白質受容体、その類似体およびそれらを含む蛋白質組成物は、哺乳類の変性低密度リポ蛋白質のアッセイに有用であり、また診断で用いる変性低密度リポ蛋白質受容体に対する抗体を調製する上でも有用である。
また、本発明の薬剤が動脈硬化症の疾患の診断に有効であることは、前述した変性低密度リポ蛋白質およびその受容体の生物学的活性から明らかである。
「変性低密度リポ蛋白質受容体のサブタイプ」とは、変性低密度リポ蛋白質受容体のうちで酸化変性低密度リポ蛋白質あるいはアセチル化変性低密度リポ蛋白質等の各種変性低密度リポ蛋白質に対して、異なる選択性、すなわち薬理学的親和性序列を示す各々の分子をいう。
具体的には後述する生物学的活性を有する、さらに具体的には、変性低密度リポ蛋白質と結合可能である範囲内で配列の変化が可能である。そのためには、変性低密度リポ蛋白質と結合する部分をコードする領域については、遺伝暗号の縮重を除き、配列番号1、配列番号3または配列番号5に示す参照配列と同じか、類似のアミノ酸への置換をもたらす程度の変更を加えた配列を有する必要がある。一方、上記以外の部分をコードする領域については、30%以上(好ましくは50%以上、さらに好ましくは80%以上)の相似性があればよい。
(1)モノアミノモノカルボン酸
Gly Ala Val Leu Ile
(2)オキシアミノ酸
Ser Thr
(3)含硫アミノ酸
Cys Met
(4)モノアミノジカルボン酸
Asp Glu
(5)ジアミノモノカルボン酸
Lys Arg
(6)芳香族環を有するアミノ酸
Phe Tyr
(7)複素環を有するアミノ酸
His Try Pro
(8)アミド基を有するアミノ酸
Asn Gln
類似性を決定する目的においては、参照配列の短縮あるいは内在的欠失は無視してよい。配列の相似性が低い場合でも、同程度の生物学的活性を有し、同等の発現特性を有する配列は、実質的に同等な配列とみなす。
変性低密度リポ蛋白質を結合可能であるとは、具体的には、基準とする酸化変性低密度リポ蛋白質に対する親和性(解離定数)が1マイクロモル以下であることを意味する。本発明においては、その親和性が0.1マイクロモル以下であることが好ましく、0.01マイクロモル以下であることがさらに好ましい。
生物学的活性は、変性低密度リポ蛋白質の結合に際して、血管内皮細胞内へ変性低密度リポ蛋白質の取り込みを促すことができることを意味する場合もある。
「組換え発現ベクター」は(a)遺伝子発現における調節の役割を持つ要素、例えばプロモーター或いはエンハンサーのような単独または複数の遺伝的要素、(b)mRNAに転写され、蛋白質に翻訳される構造あるいはコード配列、及び(c)適当な転写及び翻訳開始及び終止配列の集合を含む転写単位からなるプラスミドを示す。酵母の発現系で用いるための構造要素は、翻訳された蛋白質が宿主細胞によって細胞外に分泌されるためのリーダー配列を含んでいることが好ましい。組換え体蛋白質がリーダーあるいは輸送配列を持たずに発現された場合、その蛋白質はN−末端にメチオニン残基を含んでいる可能性がある。続いて、その残基は発現された組換え蛋白質から随意に切断され、最終産物を与える。
培養ウシ大動脈内皮細胞から抽出したPoly (A)+ RNAの逆転写によって調製されたcDNAライブラリーから、ウシ変性低密度リポ蛋白質受容体をコードするDNA配列が単離された。このライブラリーは、SV40、I型ヒトT細胞白血病ウイルス由来の調節配列を持った哺乳類発現べクター(pME18S)を用いて、サルのCOS−7細胞に蓄積されたDNA断片よりmRNAを直接発現させることによってスクリーニングした。形質導入されたCOS−7細胞をDiI(1,1'-di-octadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate )−酸化低密度リポ蛋白質を含む培地とともにインキュベートし、結合しなかったDiI−酸化低密度リポ蛋白質を除くために洗浄した後、トリプシン処理により細胞を浮遊状態にしてFACS(fluorescence-activated cell sorter)にかけ、DiIの蛍光を測定するとともに蛍光強度の高い細胞を回収した。形質導入細胞からプラスミドを抽出し、大腸菌を形質転換してプラスミドを精製し、再度上記の操作を繰り返した。このようにして4回この操作を繰り返すことにより、単一のクローンで変性低密度リポ蛋白質結合活性を持った表面蛋白質を合成することができた。このクローンは単離され、ウシの変性低密度リポ蛋白質受容体のcDNA配列を決定するために挿入断片の配列が調べられた。
DNA配列およびアミノ酸配列について説明する。
上記配列番号1及び3に示されるように、変性低密度リポ蛋白質受容体には少なくとも2種類のサブタイプが存在している。配列番号3は、配列番号1の24番目のアミノ酸(Gly) の後に三アミノ酸(Thr Thr Gly) が挿入している以外は、配列番号1と同様である。本明細書において特に断らない場合は、配列番号1を基準に説明する。
最初のATG(メチオニンをコードする開始コドン)からTGA(845−847)のストップコドンまで810bpのオープンリーディングフレームが存在し、270アミノ酸残基がコードされている。このcDNAがコードしている変性低密度リポ蛋白質受容体mRNAには過渡的に発現されるサイトカインや成長因子と同様に3’非翻訳領域にAUUUAというmRNAを不安定化する配列が7ヶ所存在する。
このポリペプチドには、一ヶ所において26個の疎水性アミノ酸(配列番号1におけるアミノ酸番号31〜56、配列番号2におけるアミノ酸番号34〜59)からなる膜貫通領域と思われる部分があり、膜貫通部分のC末端側に4つの糖鎖付加部位(配列番号1におけるアミノ酸番号69、135、179および208、配列番号3におけるアミノ酸番号72、138、182および211)が見出された。
配列番号5がヒトの変性低密度リポ蛋白質受容体のDNA配列およびアミノ酸配列である。
ヒトの配列は、ウシの配列と同様に、最初のATG(メチオニンをコードする開始コドン)からTGA(946−948)まで、819bpのオープンリーディングフレームが存在し、273個のアミノ酸残基がコードされている。
このcDNAがコードするポリペプチドには、ウシの配列と同様に一ヶ所において27個の疎水性アミノ酸からなる膜貫通領域と思われる部分があり、膜貫通部分のC末端側に4つの糖鎖付加部位(アミノ酸番号73、139、183および210)が見出された。
ウシおよびヒトのアミノ酸配列は、共にC型レクチンの細胞外ドメインに持っており、この部分(アミノ酸番号144−273)が変性LDLとの結合に重要と考えられる。従って、アミノ酸番号144−273の部分配列を有するペプチドも、変性LDLとの結合機能を有すると推定できる。
このような配列は、合成オリゴヌクレオチドを組み上げることにより調製されたDNA配列に連結しているか、あるいは隣接している。しかし、主にオリゴヌクレオチドから組み上げられた合成遺伝子は、ここで与えられる配列情報を用いることにより構築することができる。典型的な配列は、前述したものと実質的に同一な配列を含んでいる。コード配列は、N−末端に位置する、例えばヌクレオチド配列上で翻訳フレームと連結したメチオニンを特定するN−末端のATGコドンのような、1つ以上の付加的アミノ酸をコードするコドンを含むことができる。遺伝子コードの縮重のため、同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列にも相当の多様性がある。前述した典型的なDNA配列以外の態様には、中等度にストリンジェントな条件(すなわち、42℃、20%(v/v)ホルムアミド存在下)で、典型的なDNA配列にハイブリダイズすることができる配列が含まれる。その他の配列は生物学的な活性を有する変性低密度リポ蛋白質受容体ペプチドをコードする上記の配列に縮重している。
哺乳類の変性低密度リポ蛋白質受容体は、適当なプロモーターの調節の下、哺乳類細胞、酵母、細菌、あるいはその他の細胞中で発現することができる。無細胞翻訳系によっても、本発明のDNA構成物由来のmRNAを用いて哺乳類の変性低密度リポ蛋白質受容体を生産することができる。細菌、真菌、酵母および哺乳類細胞宿主に用いるための適当なクローニングおよび発現ベクターは、ポウエル(Pouwel)ら(Cloning Vectors: A Laboratory Manual, エルスビュー社、ニューヨーク州、(1985))によって述べられている。
酵母の系では、サッカロミセス・セレビシエのようなサッカロミセス属の種を用いることが好ましい。ピキア(Pichia)あるいはクリュベロミセス(Kluyveromyces )等の、他の属の酵母も、組換え体蛋白質の生産株として用いることができる。
一般に、有用な酵母ベクターは複製開始点と、例えば大腸菌のアンピシリン耐性Ampr 遺伝子とサッカロミセス・セレビシエのTRP1遺伝子のような、酵母と大腸菌の両方で形質転換に用いることが可能な選択マーカー及び下流の構造遺伝子の転写を誘導する酵母の高発現遺伝子由来のプロモーターを含んでいる。このようなプロモーターは3−ホスホグリセリン酸リン酸化酵素で、α−因子、酸性ホスファターゼおよび熱ショック蛋白質等、高率で発現される遺伝子をコードする酵母の転写単位に由来する。この異種構造配列は、翻訳開始および終止配列並びに好ましくは、翻訳された蛋白質を細胞外の培地中へ分泌することを可能にするリーダー配列とともに適当なフレームに組み上げられる。上記の異質配列は、N−末端の同定可能なペプチドまたは、例えば発現された組換え体産物の安定化を行う、あるいは精製が単純になるような所望の特徴を与える配列を含む融合蛋白質をコードすることも任意に可能である。
脱水素酵素2(ADH2)プロモーターを含む酵母のDNA配列を用いることにより組み上げることができる。ADH2プロモーターはルッセル(Russell )ら(J. Biol. Chem., 258, 2674 (1982)) とベイヤー(Beier )ら(Nature, 300, 724 (1982))によって開示されている。これらのベクターはまた、酵母TRP1遺伝子を選択マーカーとして持ち、酵母2μ複製開始点を含んでいる。酵母リーダー配列、例えば酵母宿主からの異種蛋白質の分泌を導くα−因子のリーダーは、プロモーターと発現される構造遺伝子との間に挿入することができる(U.S. Patent No. 4,546,082 ;Kurianet al., Cell, 30, 933 (1982);およびBittner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 983(1984))。
リーダー配列はその3’末端付近に、外来の遺伝子とそのリーダー配列の融合を促進するための、一つ以上の有用な制限酵素切断部位を含むように修飾することができる。
ADH2プロモーターからなるベクターによって形質転換された宿主株は、1%酵母抽出物、2%ペプトン、1%ブドウ糖、80μg/mlアデニン、80μg/mlウラシルを含む栄養豊富な培地で発現のために生育させる。ADH2プロモーターの脱制御は培地中のブドウ糖が消費されてしまったときに起きる。粗酵母上清は濾過によって集められ、続いての精製の前に4℃に保つ。
発現ベクターは、成熟蛋白質のN−末端残基をコードするコドンに近い部位でcDNAを切断することによって都合良く構築される。次いで、コード領域の欠失した部分を「埋め合わせる」ため、或いは発現ベクター中の適当な読み枠や開始メチオニンを特定するコドンとなるようにコード断片を連結するための連結配列を提供するために合成オリゴヌクレオチドを用いることも随時可能である。
特に有用な細菌の発現系は、λファージのPL プロモーターとc1857熱不安定なリプレッサーを用いている。アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから得られるλPL 由来のプロモーターを取り入れたプラスミドベクターには、大腸菌株JMB9(ATCC37092)に内在した形のpHUB2プラスミドと大腸菌株RR1(ATCC53082)に内在した形のpPLc28がある。大腸菌内での発現に有用なその他のプロモーターとしては、スツデェー(Studier) ら(J. Mol. Biol. 189:113,1986)によって述べられているT7RNAポリメラーゼのプロモーター、ラウェー(Lauer)(J. Appl. Genet. 1:139-147, 1981)によって記載されておりATCC37121として得られるlacZプロモーター及びマニアチス(Maniatis)(Molecular Coloning;A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.p.412) によって述べられているATCC37138として得られるtacプロモーターがある。
好ましくは、精製された哺乳類の変性低密度リポ蛋白質受容体あるいは生物学的に等価な類似体は、培養液から精製される本発明の合成遺伝子の組換え体翻訳産物を発現するために適した宿主/ベクター系を培養することによって調製される。
最後に、メチルあるいはその他の脂肪族基を有するシリカゲルなどの疎水性充填剤RP−HPLCを用いた一種以上の逆相系高速液体クロマトグラフィーRP−HPLCを、変性低密度リポ蛋白質受容体組成物を更に精製するために用いることが可能である。上述の精製段階のいくつかあるいは全てを様々に組み合わせることにより、均一な組換え体蛋白質を得ることが可能だろう。
哺乳類の変性低密度リポ蛋白質受容体を分泌タンパクとして発現する酵母の発酵は精製を大いに容易にしている。大規模な発酵の結果得られる分泌された組換え体蛋白質はウルダル(Urdal) ら(J. Chromatog. 296:171,1984)によって明らかにされた方法と類似した方法によって精製することが可能である。この引用文献には、組換え体ヒトGM−CSFの精製のための調製用HPLCカラムにおける、二段階の連続した逆相系HPLC処理が述
べられている。
本発明における組換え体である変性低密度リポ蛋白質受容体の蛋白質には、微生物中での発現あるいは微生物によって発現された蛋白質の精製を助けるような適当なペプチドあるいは蛋白質配列と融合された蛋白質として発現した哺乳類の変性低密度リポ蛋白質受容体も本発明により意図されているものである。
本発明の蛋白質の生物学的に等価な類似体とは、生物学的活性に不要な末端、あるいは細胞内側の残基または配列が削られた変性低密度リポ蛋白質受容体のような短縮された種々の類似体を含んでいる。
ここで用いられている「変異アミノ酸配列」とは、天然の配列から故意に作られた変種のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを示している。「変異蛋白質」あるいは「類似体」は、変異アミノ酸配列を含む蛋白質を意味している。「天然の配列」は野生型あるいは天然の形の遺伝子または蛋白質と同一なアミノ酸配列あるいはヌクレオチド配列を示している。
受容体を可溶化することにより、可溶化したペプチド断片を変性低密度リポ蛋白質に結合させて、リポ蛋白質を不活性化することが可能になる。すなわち、ペプチド断片を、変性低密度リポ蛋白質を原因とする疾患の治療に用いることが可能である。
具体的には、他の哺乳類の内皮細胞あるいは適当な臓器より抽出したpoly(A)+ RNAから、配列番号1、配列番号3または配列番号5に示されるDNA配列とハイブリダイズできるものを選択することにより、他の哺乳類の内皮細胞の変性低密度リポ蛋白質受容体をコードするDNAを得ることができる。これは、下記実施例1のように、手掛かりとなる配列が存在していない状況から該当するDNAを選択する場合と異なり、当業者であれば実施が容易である。
また、得られた配列の分析も、配列番号1、配列番号3または配列番号5に示されるDNA配列を参照することにより、下記実施例1の場合(参照すべき配列がない状況)よりも、容易に実施できる。
なお、以下の実施例では、酸化低密度リポ蛋白質結合に関してアッセイを実施したが、アセチル化低密度リポ蛋白結合に関するアッセイも同様に実施できる。
Chomczynski ら(Biotechniques 15, 532 (1993))と同様の手法を用いて培養ウシ大動脈内皮細胞より抽出した全RNAから単離したPoly(A)+ の付加したmRNAを逆転写
することによりcDNAライブラリーを作製した。具体的には、細胞を酸性イソチアン酸グアニジウム/フェノール溶液中で溶かし、溶解物にクロロホルムを加え、水層と有機層を遠心分離した。水層を回収し、アルコール沈澱によりさらに精製した。オリゴdTセルロースクロマトグラフィーによりpoly(A)+ RNAを単離し、二本鎖cDNAは、グブラー(Gubler)とホフマン(Hoffman)(Gene, 25, 263 (1983) )と同様の方法で調製した。具体的には、RNAはオリゴdTまたはランダムオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて逆転写酵素により、cDNAに複製した。cDNAを大腸菌DNAポリメラーゼIとRNaseHと共にインキュベーションすることにより二本鎖にし、その末端はさらにT4 DNAポリメラーゼとインキュベーションすることにより平滑化した。平滑末端を持つこれらのcDNAに、BstXIリンカーを付加した後、セファクリル(sephacryl) S−500HRによるゲル濾過クロマトグラフィーにより短いものを排除した。そして哺乳動物細胞用高発現プラスミドベクターpME18Sに結合させた。このpME18Sの模式図を図1(東京医科歯科大学、丸山博士より入手)に示す。
以上のようにしてできたpME18S上のウシ大動脈cDNAライブラリーを大腸菌(E. coli. ElectroMax DH 10B)を形質転換するのに用い、約7×105 のコロニーを得た。これらの組換え体を500mlの2xYT中で37℃にて振とう培養し、プラスミドDNAをCsCl密度勾配遠心にて調製した。Lipofectamine を用いてサルのCOS−7細胞の集密的になっていない(サブコンフルエント)細胞単層にトランスフェクトした。次に導入された配列が過渡的な発現をできるように細胞を3日間培養し、各プレートの細胞の単層を以下のように酸化低密度リポ蛋白質結合に関してアッセイした。
図2は、pBLOX−1を導入したCOS−7細胞および導入していない対照のCOS−7細胞のFACSによる蛍光強度分布を示すグラフである。
クローンpBLOX−1の挿入断片はBluescriptII SK-プラスミドにサブクローンし、ダイデオキシ法によってDNA配列を決定した(Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463(1977))。
受容体cDNAを使用したノーザンブロットによる各組織での発現状態
前記のような方法でウシの各組織からpoly(A)+RNAを抽出し、それぞれ5μgずつをホルムアルデヒド/1.1%アガロースゲル電気泳動で分離した後、ジーンスクリーンプラス膜(NEN, DuPont) に転写した。1.8kbのcDNA断片をランダムプライム法によってα−32P−dCTPで8×108 c.p.m./mgになるようにラベルしプローブとして用いた。ハイブリダイゼーションは1M塩化ナトリウム/1%SDS、250μg/mlサケ精子DNA溶液中で60℃で行ない、2×SSC/1%SDSにより洗浄した。オートラジオグラフィーは8時間行なった。
11のウシ組織から抽出したpoly(A)+RNAに対してノーザンブロットを行なったところ、多量の発現がみられたのは培養内皮細胞と肺であった。
CHO−K1細胞による変性低密度リポ蛋白質受容体の発現
変性低密度リポ蛋白質受容体cDNA挿入断片を、bsr(blasticidin S-resistance)遺伝子とSV40ウイルス由来のプロモーターを含む発現ベクターpSV2bsrと変性低密度リポ蛋白質受容体発現プラスミドpBLOX−1を用いて、変性低密度リポ蛋白質受容体発現細胞を作成した。
CHO(chinese hamster ovary )K1細胞は、10%FBS含有HamF12培地で、サブコンフルエント(subconfluent)に単層培養した。
変性低密度リポ蛋白質受容体発現プラスミドpBLOX−1とpSV2bsrをLipofectamine により、CHO−K1細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を24時間後、約10倍の培養面積にまき直し、さらに24時間待って細胞が充分接着した後、培地を5μgのblasticidin S 含有上記培地に替えた。
充分に成長したコロニーをペニシリンカップ法によりトリプシンにてはがし、12穴プレートにまき直して同じ培地で増殖させた。
こうして単離したクローナルな細胞が、実際に変性低密度リポ蛋白質受容体を発現していることを、前記のようにDiI標識変性低密度リポ蛋白質取り込みによる細胞質内蛍光強度上昇を蛍光顕微鏡を用いて観察することにより確認した。蛍光顕微鏡写真を図3に示す。
可溶性変性低密度リポ蛋白質受容体の作成
変性低密度リポ蛋白質受容体cDNAをPCR法により、プライマーペア(5'-gcggatcctgtgctctcaatagattcgc-3',5'-ggggatcctgatctcataaagaaacag-3')を用いて、細胞外ドメイン(変性低密度リポ蛋白質との結合部分を含む)をコードするDNA配列(配列番号1の塩基配列の215〜845)をBamHI の制限酵素部位を付けて増殖し、BamHI で消化した後、ヒスチジンの6回繰り返し配列をtagとして大腸菌に蛋白を発現するベクターpQE10(Qiagen社製)のBamHI siteに挿入した。このプラスミドを大腸菌株XL-2Blueにトランスフォーム後、2xYT培地にて37℃で振とう培養した。600nmの吸光度が0.6になったところでIPTG(isopropylthio-β-D-galactoside)を1mMの濃度で加え、30℃で20時間さらに培養した。大腸菌を遠心にて回収し、6M塩酸グアニジン、0.1Mリン酸二水素ナトリウム、0.01Mトリス(pH8.0)にて溶解した。不溶物を遠心にて除去後、Ni−NTAアガロース(Qiagen社製)を加え、可溶性変性低密度リポ蛋白質受容体を吸着させた。Ni−NTAアガロースを8M尿素、0.1Mリン酸二水素ナトリウム、0.01Mトリス(pH8.0)、および8M尿素、0.1Mリン酸二水素ナトリウム、0.01Mトリス(pH6.3)にて洗浄後、8M尿素、0.1Mリン酸二水素ナトリウム、0.01Mトリス、0.1M EDTA(pH6.3)にて可溶性変性低密度リポ蛋白質受容体を溶出し、精製した。上記の操作により得られた可溶性変性低密度リポ蛋白質受容体は、SDS−PAGEにて均一な標品であることが示された。
なお、tagは、GSTやc−myc等、他のものを用いてもよい。この場合は、精製法もそれに応じて、抗体等を用いた方法を用いることができる。また、適当な哺乳動物発現用ベクターを用いれば、組み替えDNAの操作により、同様に可溶性変性低密度リポ蛋白質受容体を作成することができる。
抗LOX−1抗体の作成
ポリメラーゼチェーン反応によりウシLOX−1cDNAの細胞外ドメインをコードする領域(アミノ酸61-270)を、BamHIを付加した2つのプライマー 5'-ggggatcctgat
ctcataaagaaacag-3'と5'-gcggatcctgtgctctcaatagattcgc-3'により増幅した。増幅したcDNA断片をBamHIで消化した後、キアゲン(QIAGEN)社のpQE10ベクターのBamHI部位にサブクローンした。細胞外ドメイン蛋白の合成と生成はキアゲン社のQIA express systemを用いて行なった。実際には、上記のプラスミドによりストラタジーン(Stratagene)社の大腸菌株XL−1 blue を形質転換し、2xYT培地にて培養した。蛋白の合成は、イソプロピル・チオ−β−D−ガラクトシドを最終濃度2mMで加えることで誘導した。
細胞を遠心分離により回収し、6Mグアニジン・HCl、0.1Mリン酸ナトリウム、および0.01M−Tris・HCl を含むpH8.0の溶液に溶解後、キアゲン社のNi-NTA樹脂カラムにかけてカラムクロマトグラフィーを行なった。次いで、8M尿素、0.1Mリン酸ナトリウム、及び0.01M−Tris・HCl を含むpH6.3の水溶液でカラムを洗浄した後、蛋白質を8M尿素、0.1M−EDTA、0.1Mリン酸ナトリウム、及び0.01M−Tris・HCl を含むpH6.3の溶液を用いて溶出した。バッファーを、アミコン社のCentriprep 10 にてリン酸塩緩衝生理食塩水に交換し、蛋白質を等容量のフロイント・コンプリート・アジュバントでエマルジョンにして、ウサギの肩甲骨脊椎間の皮内に隔週で接種することで免疫を行った。
免疫染色
培養ウシ大動脈内皮細胞をSDS−PAGEのサンプルバッファーにて直接溶解し、SDS−PAGEにより分離し、ナイロン膜に転写した。雪印乳業株式会社製のブロックエースにてブロッキングした後、ベクトール(Vector)社の免疫染色キットを用い、ペルオキシダーゼ抱合アビジン・ビオチン複合体による標準的な方法により、上記のウサギから得られた抗血清の染色を行った。
Claims (5)
- 配列番号2、配列番号4または配列番号6に示すアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号140から270迄のアミノ酸配列からなるペプチド。
- 配列番号2、配列番号4または配列番号6に示すアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号140から270迄のアミノ酸配列をコードする領域からなるDNAもしくは配列番号2、配列番号4または配列番号6に示すアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号140から270迄のアミノ酸配列において1つ以上のアミノ酸が置換、欠失あるいは付加されており且つ変性低密度リポ蛋白質と結合し、変性低密度リポ蛋白質を細胞内に取り込む機能を有する蛋白質をコードするDNA。
- 配列番号2、配列番号4または配列番号6に示すアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号140から270迄のアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体。
- 配列番号2に示すアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号61から270迄のアミノ酸配列をコードするDNA。
- 配列番号2に示すアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号61から270迄のアミノ酸配列を含むペプチド。
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