ES2265149T3 - Receptor de lipoproteina de baja densidad desnaturalizada. - Google Patents

Receptor de lipoproteina de baja densidad desnaturalizada. Download PDF

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Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNA SECUENCIA DE ADN QUE ESENCIALMENTE CODIFICA UN RECEPTOR ENDOTELIAL VASCULAR MAMIFERO DE LIPOPROTEINAS DE BAJA DENSIDAD MODIFICADAS. LA SECUENCIA SE INCLUYE EN LA SECUENCIA N

Description

Receptor de lipoproteína de baja densidad desnaturalizada.
La presente invención se refiere a un receptor de mamífero para lipoproteína de baja densidad (LDL) modificada), y se refiere con mayor detalle a un receptor endotelial vascular de mamífero para la lipoproteína de baja densidad modificada.
La disfunción endotelial vascular ha sido apuntada como un índice importante en las etapas iniciales de la ateroesclerosis progresiva. La célula endotelial vascular libera muchas clases de factores humorales para mantener la homeostasis circulatoria. La función endotelial vascular es inhibida por estímulos físicos o diversas sustancias que incluyen el factor más importante, la lipoproteína de baja densidad oxidada, que es una clase de la lipoproteína de baja densidad modificada. Por ejemplo, la célula endotelial vascular libera monóxido de nitrógeno como factor vasohipotónico para ajustar el tono vascular. La liberación de monóxido de nitrógeno es inhibida por la lipoproteína de baja densidad oxidada.
Se ha sabido que los macrófagos o células endoteliales vasculares internalizan la lipoproteína de baja densidad modificada a través de un receptor distinto de los receptores para la lipoproteína de baja densidad. Los macrófagos internalizan la lipoproteína de baja densidad modificada a través de receptores de barrido, que han sido ya analizados estructuralmente (véanse las Publicaciones Japonesas de Patente PCT Núms. 6 (1994)-500765 y 6 (1994)-508604, y la Publicación Provisional de Patente Japonesa No. 3 (1991)-290184). Los macrófagos cambian luego a células espumosas, que son específicas en el foco arterioesclerótico. Dado que los receptores de barrido de los macrófagos no se encuentran en las células endoteliales vasculares, se ha anticipado que receptores de otra estructura están presentes en las células endoteliales vasculares (véase, Hidenori Arai, Toru Kita, Oxidized LDL, Metabolism 28/4,
1991).
Por las razones arriba mencionadas, es necesario analizar la estructura de un receptor endotelial para la lipoproteína de baja densidad modificada, a saber, la secuencia de aminoácidos del receptor. Sin embargo, la estructura y la secuencia de aminoácidos no han sido esclarecidas hasta ahora.
J. Biol. Chem. 264(5): 2599-2604, 1989, describe un receptor de macrófagos que reconoce lipoproteína de baja densidad oxidada, pero no lipoproteína de baja densidad acetilada.
De acuerdo con el estudio de los autores de la presente invención, se ha esclarecido ahora la estructura del receptor endotelial vascular para la lipoproteína de baja densidad modificada. Las secuencias de aminoácidos del receptor endotelial vascular para la lipoproteína de baja densidad modificada se exponen en las Secuencias Núms. 2, 4 y 6.
Se proporciona por la presente invención una secuencia de DNA que codifica un receptor endotelial vascular de mamífero para la lipoproteína de baja densidad modificada, seleccionándose dicha secuencia del grupo constituido por SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, una secuencia de DNA que codifica SEQ ID NO: 2, una secuencia de DNA que codifica SEQ ID NO: 4, y una secuencia de DNA que codifica SEQ ID NO: 6.
La secuencia de DNA puede ser clones de cDNA derivados del marco de lectura abierto de un gen correspondiente a un receptor endotelial vascular de mamífero nativo para la lipoproteína de baja densidad modificada. La secuencia de DNA puede ser también una secuencia que es capaz de hibridarse a los clones de cDNA arriba mencionados y codifica un receptor endotelial vascular de mamífero biológicamente activo para la lipoproteína de baja densidad modificada. Adicionalmente, la secuencia puede degenerar como resultado del código genético para dar las secuencias de DNA arriba mencionadas. La degeneración incluye el mismo receptor biológicamente activo para la lipoproteína de baja densidad modificada.
Por esta razón, la presente invención proporciona una serie de secuencias de DNA expuesta en las Secuencias Núm. 1, 3 ó 5 (DNA que tiene la secuencia) o un análogo de las mismas, que corresponde a la región codificante de un receptor endotelial vascular de mamífero para la lipoproteína de baja densidad modificada.
La presente invención proporciona también un clon de cDNA, que tiene una secuencia de DNA que se indica en Secuencia No. 1, 3 ó 5 o un análogo de la misma, que corresponde a la región codificante de un receptor endotelial vascular de mamífero para la lipoproteína de baja densidad modificada.
La presente invención describe adicionalmente una secuencia de DNA que es capaz de hibridarse a un clon de cDNA de una secuencia de DNA expuesta en la Secuencia No. 1, 3 ó 5 (DNA que tiene la secuencia) en formamida al 20% (v/v) a 42ºC, y codifica una proteína de una célula endotelial vascular de mamífero, teniendo dicha proteína una función de fijación de una la lipoproteína de baja densidad modificada (a saber un receptor de la misma).
La presente invención describe adicionalmente una secuencia de DNA que está degenerada como resultado del código genético para dar una secuencia de DNA expuesta en la Secuencia No. 1, 3 ó 5 (DNA que tiene la secuencia) y codifica una proteína de una célula endotelial vascular de mamífero, teniendo dicha proteína una función de fijación de una la lipoproteína de baja densidad modificada (a saber, un receptor de la misma).
Además, la presente invención se refiere a un anticuerpo de un receptor para la lipoproteína de baja densidad modificada que corresponde a una secuencia de DNA expuesta en las Secuencias No. 1, 3 ó 5
o un análogo de la misma (o un receptor para la lipoproteína de baja densidad modificada que contiene una secuencia de aminoácidos expuesta en Secuencia No. 2, 4 ó 6 o un análogo de la misma).
La secuencia de DNA de la presente invención puede integrarse en un vector de expresión. Por esta razón, la presente invención proporciona adicionalmente un proceso para la producción de un receptor endotelial vascular de la invención para la producción de un receptor endotelial vascular de mamífero para la lipoproteína de baja densidad modificada o un análogo de la misma, que comprende insertar el vector de expresión recombinante en una célula hospedadora y cultivar la célula en condiciones promotoras de la expresión.
La invención proporciona adicionalmente una composición de proteína que contiene un receptor endotelial vascular de mamífero para la lipoproteína de baja densidad modificada que se produce por un cultivo de células recombinantes, teniendo dicho receptor una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, y SEQ ID NO: 6.
La composición de proteínas obtenida que contiene un receptor endotelial vascular de mamífero biológicamente activo para la lipoproteína de baja densidad modificada o un análogo de la misma es eficaz en un ensayo de la lipoproteína de baja densidad de mamífero modificada. La composición puede utilizarse también en la preparación de un anticuerpo para el receptor endotelial vascular de la lipoproteína de baja densidad modificada. El anticuerpo puede utilizarse en diagnóstico.
Es evidente, a partir de las actividades biológicas arriba descritas de la lipoproteína de baja densidad modificada y el receptor de la misma, que un agente que contenga un anticuerpo para el receptor endotelial vascular de la lipoproteína de baja densidad modificada es eficaz en el diagnóstico de la ateroesclerosis.
En la presente memoria descriptiva, el término "receptor para la lipoproteína de baja densidad modificada" significa proteínas que son capaces de fijar moléculas de la lipoproteína de baja densidad modificada y, en su configuración nativa como proteínas de la membrana plasmática de los mamíferos, juegan presumiblemente un papel en la transducción de la señal proporcionada por una la lipoproteína de baja densidad modificada a una célula endotelial vascular. En la memoria descriptiva, el término incluye análogos de proteínas nativas con actividad de fijación de una la lipoproteína de baja densidad modificada o actividad de transducción de señales.
El término "subtipo de un receptor para la lipoproteína de baja densidad modificada" significa moléculas de un receptor para la lipoproteína de baja densidad modificada que exhiben órdenes de rango de potencia farmacológica diferentes, a saber afinidades o selectividades diferentes para diversos isopéptidos de la lipoproteína de baja densidad modificada, tales como lipoproteína de baja densidad oxidada o lipoproteína de baja densidad acetilada.
De modo más detallado, la secuencia puede modificarse en tanto que una proteína correspondiente a la secuencia posea actividad biológica (descrita más adelante), a saber actividad de fijación de la lipoproteína de baja densidad modificada. Por esta razón, la región codificante de una porción la lipoproteína de baja densidad modificada de fijación debería ser la misma que la secuencia de referencia expuesta en la Secuencia No. 1, 3 ó 5, excepto por la variación debida a la degeneración del código y el reemplazamiento de un aminoácido por un aminoácido análogo. La otra región requiere simplemente al menos 30% (preferiblemente al menos 50%, y más preferiblemente al menos 80%) de semejanza en la secuencia.
La sustitución arriba mencionada para un aminoácido análogo significa sustitución de aminoácidos en un grupo en el cual los aminoácidos naturales se clasifican en los ocho grupos siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
(1)
ácido monoaminomonocarboxílico
\quad
Gly, Ala, Val, Leu, Ile
(2)
Oxiaminoácido
\quad
Ser, Thr
(3)
Aminoácido que contiene azufre
\quad
Cys, Met
(4)
Ácido monoaminodicarboxílico
\quad
Asp, Glu
\newpage
(5)
Ácido diaminomonocarboxílico
\quad
Lys, Arg
(6)
Aminoácido aromático
\quad
Phe, Tyr
(7)
Aminoácido heterocíclico
\quad
His, Trp, Pro
(8)
Aminoácido amídico
\quad
Asn, Gln
\vskip1.000000\baselineskip
Para los propósitos de determinación de la semejanza, no deben tenerse en consideración la truncación o deleciones internas de la secuencia de referencia. Las secuencias que tengan menores grados de semejanza, actividad biológica comparable, y características de expresión equivalentes, se consideran como equivalentes esenciales.
El término "biológicamente activo" utilizado como característica de un receptor para la lipoproteína de baja densidad modificada significa o bien que una molécula particular tiene una semejanza suficiente de secuencia de aminoácidos con las realizaciones de la presente invención que tienen actividad de fijación de la lipoproteína de baja densidad modificada, o que una molécula particular tiene suficiente semejanza de secuencia de aminoácidos con el receptor para la lipoproteína de baja densidad modificada que es capaz de transmitir un estímulo de la lipoproteína de baja densidad modificada a una célula como componente de constructos de receptores híbridos.
De modo más detallado, la afinidad (constante de disociación) de una molécula particular para la lipoproteína de baja densidad oxidada estándar es no mayor que 1 mM. En la presente invención, la afinidad es preferiblemente no mayor que 0,1 \muM, y modo más preferible no es mayor que 0,01 \muM.
El término "biológicamente activo" significa también que una molécula particular tiene una función de aceleración de la internalización de la lipoproteína de baja densidad modificada en las células endoteliales vasculares.
El término "secuencia de DNA" significa un polímero de DNA, en la forma de un fragmento separado o como un componente de constructos de DNA mayores. Los constructos de DNA se derivan de DNA aislado al menos una vez en forma esencialmente pura (exento de materiales endógenos contaminantes) y en una cantidad o concentración que permite la identificación, manipulación, y recuperación de la secuencia y sus secuencias de nucleótidos componentes por métodos bioquímicos estándar, por ejemplo, utilizando un vector de clonación. Las secuencias de DNA se proporcionan preferiblemente en la forma de un marco de lectura abierto no interrumpido por secuencias no traducidas internas, o intrones, los cuales están presentes típicamente en los genes eucariotas. Sin embargo, también puede utilizarse DNA genómico que contiene las secuencias relevantes. Secuencias de DNA no traducido pueden estar presentes en posiciones 5' o 3' respecto al marco de lectura abierto. El DNA no traducido no interfiere con la manipulación o expresión de las regiones codificantes.
El término "vector de expresión recombinante" significa un plásmido que comprende una unidad de transcripción. La unidad comprende (a) un elemento o elementos genético(s) que tiene(n) un papel regulador en la expresión génica, por ejemplo, promotores o intensificadores, (b) una secuencia estructural o codificante que se transcribe en mRNA y se traduce en proteína, y (c) secuencias apropiadas de iniciación y terminación de la transcripción y traducción. Elementos estructurales utilizados en sistemas de expresión de levadura incluyen preferiblemente una secuencia conductora que permite la secreción extracelular de la proteína traducida por una célula hospedadora. En el caso en que una proteína recombinante se expresa sin una secuencia conductora o de transporte, la misma puede incluir un residuo metionina N-terminal. Este residuo puede escindirse opcionalmente de la proteína recombinante expresada para proporcionar un producto final.
Breve descripción de los dibujos
Fig. 1 ilustra esquemáticamente un vector de plásmido de alta expresión, pME18S utilizado en el Ejemplo 1.
Fig. 2 es un gráfico que muestra la distribución de intensidad de fluorescencia de células COS-7 que se han transfectado con pBLOX-1 y una célula COS-7 de control que no se ha transfectado. La intensidad se midió por FACS.
Fig. 3 es una micrografía de fluorescencia que muestra el aumento de intensidad fluorescente en el citoplasma causado por incubación con la lipoproteína de baja densidad modificada marcada con DiI.
Realizaciones preferidas de la invención
Seguidamente, se describen a continuación el aislamiento de cDNA codificante del receptor para la lipoproteína de baja densidad modificada y la determinación de la secuencia de DNA.
Se preparó una genoteca de cDNA por una transcripción inversa de RNA poli(A)^{+}, que se aisló de células endoteliales aórticas de bovino cultivadas. Una secuencia de DNA que codificaba un receptor de bovino para la lipoproteína de baja densidad modificada se aisló de la genoteca de cDNA. La genoteca se escrutó por expresión directa de mRNA a partir de fragmentos de DNA acumulados en células COS-7 de mono utilizando un vector de expresión de mamífero (pME18S). El vector contiene secuencias reguladoras derivadas de SV40, y virus tipo I de la leucemia de los linfocitos T humanos. Las células COS-7 transfectadas se incubaron en un medio de cultivo que contenía lipoproteínas de baja densidad oxidadas marcadas con DiI (1,1'-di-octadecil-3,3,3',3'-tetrametilindocarbocianinaperclorato). Las células se lavaron para eliminar las lipoproteína de baja densidad oxidadas marcadas con DiI libres. Las células se sometieron a tripsinización para suspender las células. Las células se trataron en FACS (clasificador de células activado por fluorescencia) para medir la fluorescencia de DiI y recuperar células que exhiben alta intensidad fluorescente. Se extrajo el plásmido de las células transfectadas, y se transformó E. coli con los plásmidos. Los plásmidos se purificaron y se repitieron los procedimientos arriba descritos. Los procedimientos se repitieron cuatro veces para sintetizar proteína monoclonal de la superficie que tenía actividad de fijación de la lipoproteína de baja densidad modificada. Se aisló el clon, y la secuencia del fragmento de inserción se examinó para determinar la secuencia de cDNA de un receptor de bovino para la lipoproteína de baja densidad modificada.
Se transfectaron células COS-7 con el clon de cDNA aislado para expresar el gen. Como resultado, las células obtuvieron actividad de fijación específica para la lipoproteína de baja densidad oxidada. La lipoproteína de baja densidad modificada se internaliza en las células. Ulteriormente, las células no tienen actividad de fijación de la lipoproteína de baja densidad nativa (no modificada). De acuerdo con ello, el receptor se considera específico para la lipoproteína de baja densidad modificada.
La secuencia de DNA arriba determinada que codifica el receptor para la lipoproteína de baja densidad modificada y la secuencia de aminoácidos correspondiente se exponen en las secuencias Núms. 1 y 3/2 y 4.
La secuencia de DNA y la secuencia de aminoácidos se describen a continuación.
Como se muestra en las Secuencias Núms. 1 y 3, el receptor para la lipoproteína de baja densidad modificada tiene al menos dos subtipos. La Secuencia No. 3 es la misma que la Secuencia No. 1, excepto que están insertados 3 aminoácidos (Thr Thr Gly) después del aminoácido 24-avo (Gly) de la Secuencia No. 1. En la presente memoria descriptiva, la secuencia se describe tomando como referencia la Secuencia No. 1 a no ser que se especifique otra cosa.
Existe un marco de lectura abierto de 810 pb que codifica 270 residuos de aminoácidos desde el primer ATG (codón de iniciación que codifica metionina) al codón de parada TGA (811-813). La región 3' no traducida en el mRNA del receptor para la lipoproteína de baja densidad modificada, codificada por este cDNA, contiene siete secuencias AUUUA que desestabilizan el mRNA. Esto es análogo a la citoquina o factor de crecimiento expresado transitoriamente.
El oligonucleótido codificado contiene un tramo de 26 residuos de aminoácidos hidrófobos (aminoácidos Núms. 31-56 en la Secuencia No. 2 y aminoácidos Núms. 34-59 en la Secuencia No. 4), que representan probablemente un domino transmembranal. La región C-terminal después del dominio transmembranal supuesto contiene cuatro sitios de glicosilación potenciales (aminoácidos Núms. 69, 135, 179 y 208 en la Secuencia No. 2 y aminoácidos Núms. 72, 138, 182 y 211 en la Secuencia No. 4).
Adicionalmente, se preparó una genoteca de cDNA por una transcripción inversa de RNA poli(A)^{+}, que se extrajo de pulmón humano. Una secuencia de DNA codificante del receptor humano para la lipoproteína de baja densidad modificada se aisló de la genoteca de cDNA. La genoteca se escrutó de acuerdo con un método de hibridación en placas utilizando fragmentos XhoI/PstI de pBMLR1, que se marcó con [\alpha-^{32}P]dCTP. La hibridación se condujo a 55ºC en Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), NaCl 1M, 1% SDS, 0,2 g/l tRNA de levadura. Después de lavar el híbrido tres veces con 2xSSC/0,1% SDS durante 15 minutos, se identificó el clon positivo por autorradiografía. Se aisló el clon, y la secuencia del fragmento de inserción se examinó para determinar la secuencia de cDNA de un receptor humano para la lipoproteína de baja densidad modificada. La secuencia se asemejaba a una parte de un dominio codificante de la proteína. Por esta razón, se obtuvo cDNA codificante de la proteína entera a partir de una genoteca de cDNA preparada por una transcripción inversa de RNA poli(A)^{+}, que se extrajo de placenta humana. Los procedimientos se realizaron de acuerdo con el método 5'-RACE (amplificación rápida del extremo de cDNA) utilizando la secuencia parcial.
La Secuencia No. 5 muestra la secuencia de DNA y la secuencia de aminoácidos del receptor humano para la lipoproteína de baja densidad modificada.
La secuencia humana, así como la secuencia de bovino tiene un marco de lectura abierto de 810 pb que codifica 270 residuos de aminoácidos desde el primer ATG (codón de iniciación que codifica metionina) hasta el codón de parada TGA (811-813).
El polipéptido codificado por el cDNA contiene un tramo de 27 residuos de aminoácidos hidrófobos en analogía con la secuencia de bovino, que representan probablemente un dominio transmembranal. La región C-terminal después del dominio transmembranal supuesto contiene cuatro sitios de glicosilación potenciales (aminoácidos Núms. 69, 135, 179 y 206).
Ambas secuencias de aminoácidos de bovino y humana tienen la estructura de lectina de tipo C en un dominio extracelular. Se considera que el dominio (aminoácidos Núms. 140-270) tiene actividad de fijación de la lipoproteína de baja densidad modificada. Por esta razón, se considera también que el péptido que tiene la secuencia parcial de los aminoácidos Núms. 140-270 tiene actividad de fijación de la lipoproteína de baja densidad modificada.
La presente invención proporciona la secuencia de DNA arriba descrita que codifica el receptor para la lipoproteína de baja densidad modificada y la secuencia de DNA que codifica la secuencia parcial de los aminoácidos Núms. 140-270. La secuencia de DNA se proporciona preferiblemente en una forma que es capaz de expresarse en una unidad de transcripción recombinante bajo el control de elementos de control de la transcripción o traducción de mamífero, microbianos, o virales. Por ejemplo, una secuencia que se exprese en un microorganismo no contendrá intrón alguno. En una realización preferida, la secuencia de DNA comprende al menos uno, pero opcionalmente más de un componente de secuencia derivado de una secuencia de cDNA o copia de la misma.
Las secuencias pueden estar enlazadas o flanqueadas por secuencias de DNA preparadas por ensamblaje de oligonucleótidos sintéticos. Sin embargo, genes sintéticos ensamblados exclusivamente a partir de oligonucleótidos podrían construirse utilizando la información de secuencia proporcionada en esta memoria. Una secuencia representativa contiene las esencialmente idénticas a las secuencias de nucleótidos expuestas en las secuencias Núms. 1, 3 y 5. Las secuencias codificantes pueden incluir codones que codifican uno o más aminoácidos adicionales localizados en el término N, por ejemplo, un codón ATG N-terminal, que especifica metionina enlazado con marco de lectura en la secuencia nucleotídica. Debido a la degeneración del código, pueden existir variaciones considerables en las secuencias de nucleótidos codificantes de la misma secuencia de aminoácidos. Otras realizaciones incluyen secuencias capaces de hibridarse a la secuencia representativa en condiciones moderadamente severas (42ºC, 20% (v/v) de formamida). Las otras secuencias degeneran a las arriba descritas que codifican polipéptido biológicamente activo de un receptor para la lipoproteína de baja densidad modificada.
La secuencia puede expresarse en una unidad de transcripción recombinante que contiene un elemento regulador inducible derivado de un operón de microorganismo o virus. La presente invención proporciona también vectores de expresión para producir cantidades útiles de un receptor purificado para la lipoproteína de baja densidad modificada. Los vectores pueden comprender fragmentos de DNA sintéticos o derivados de cDNA que codifican un receptor de mamífero para la lipoproteína de baja densidad modificada o homólogos bioequivalentes enlazados operativamente a elementos reguladores derivados de genes de mamífero, bacterianos, de levadura, de bacteriófago o virales. Elementos reguladores útiles se describen con mayor detalle más adelante. Después de la transformación, transfección o infección de líneas de células apropiadas, tales vectores pueden inducirse para expresar la proteína recombinante.
Un receptor de mamífero para la lipoproteína de baja densidad modificada puede expresarse en células de mamífero, levadura, bacterias, u otras células bajo el control de promotores apropiados. Podrían emplearse también sistemas de traducción exentos de células para producir el receptor de mamífero para la lipoproteína de baja densidad modificada utilizando mRNAs derivados de los constructos de DNA de la presente invención. Vectores apropiados de clonación y expresión para uso con hospedadores celulares bacterianos, fúngicos, de levadura, y de mamífero han sido descritos por Pouwel et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nueva York, 1985).
Pueden emplearse diversos sistemas de cultivo de células de mamífero para expresar proteína recombinante. Ejemplos de líneas de células hospedadoras de mamífero adecuadas incluyen las líneas COS-7 de células de riñón de mono, descritas por Gluzman (Cell 23: 175, 1981), y otras líneas de células capaces de expresar un vector apropiado, por ejemplo, C127, 3T3, CHO, HeLa y líneas de células BHK. Vectores de expresión de mamífero pueden comprender elementos no transcritos tales como un origen de replicación, un promotor e intensificador adecuado, y otras secuencias flanqueantes 5' o 3' no transcritas, así como secuencias 5' o 3' no traducidas, tales como sitios de fijación de ribosoma necesarios, un sitio de poliadenilación, sitios donantes y aceptores de corte y empalme, y secuencias de terminación. Secuencias de DNA derivadas del genoma del virus SV40, por ejemplo, el origen de replicación de SV40, promotor temprano, intensificador, sitio de corte y empalme, y sitios de poliadenilación, pueden utilizarse para proporcionar los otros elementos genéticos requeridos para expresión de una secuencia de DNA heteróloga. Pueden construirse vectores ilustrativos como ha sido descrito por Okayama y Berg (Mol. Cel. Biol. 3, 280,
1983).
Un sistema útil para expresión estable de alto nivel de cDNAs de receptores de mamífero en células epiteliales mamarias de rata C127 puede construirse esencialmente como ha sido descrito por Cosman et al. (Molecular Immunol., 23: 935, 1986).
Sistemas de levadura, que emplean preferiblemente especies de Saccharomyces tales como S. cerevisiae, pueden emplearse también para la expresión de las proteínas recombinantes de la presente invención. Levadura de otros géneros, por ejemplo, Pichia o Kluyveromyces, ha sido empleada también como cepas de producción para proteínas recombinantes.
Generalmente, vectores de levadura útiles incluirán orígenes de replicación y marcadores seleccionables que permiten la transformación tanto de levadura como de E. coli, v.g. el gen de resistencia a la ampicilina (Amp^{r}) de E. coli y el gen TRP1 de S. cerevisiae, y un promotor derivado de un gen de levadura altamente expresado para inducir la transcripción de un gen estructural aguas abajo. Tales promotores pueden derivarse de unidades de transcripción de levadura que codifican genes altamente expresados tales como 3-fosfoglicerato-quinasa (PGK), factor \alpha, fosfatasa ácida, o proteínas de choque térmico, entre otros. La secuencia estructural heteróloga se ensambla en el marco de lectura apropiado con secuencias de iniciación y terminación de la traducción, y, preferiblemente, una secuencia conductora capaz de dirigir la secreción de la proteína traducida al medio extracelular. Opcionalmente, las secuencias heterólogas pueden codificar una proteína de fusión que incluye un péptido de identificación N-terminal u otra secuencia que imparta características deseadas, v.g., estabilización o purificación simplificada del producto recombinante expresado.
Vectores de levadura útiles pueden ensamblarse utilizando secuencias de DNA de pBR322 (gen Amp^{r} y origen de replicación) para selección y replicación en E. coli y secuencias de DNA de levadura que incluyen un promotor de alcohol-deshidrogenasa-2 (ADH2) reprimible por glucosa. El promotor ADH2 ha sido descrito por Russell et al. (J. Biol. Chem. 258: 2674, 1982) y Beier et al. (Nature 300: 724, 1982). Tales vectores pueden incluir también un gen TRP1 de levadura como marcador seleccionable y el origen de replicación de levadura 2 \mu. Una secuencia conductora de levadura, por ejemplo, el conductor del factor \alpha que dirige la secreción de proteínas heterólogas a partir de un hospedador de levadura, puede insertarse entre el promotor y el gen estructural a expresar (véase la Patente U.S. No. 4.546.082; Kurian et al., Cell 30: 933, 1982; y Bittner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 983, 1984).
La secuencia conductora puede modificarse para contener, cerca de su extremo 3', uno o más sitios de restricción útiles a fin de facilitar la fusión de la secuencia conductora a genes extraños.
Protocolos de transformación de levadura adecuados son conocidos por los expertos en la técnica; una técnica ilustrativa ha sido descrita por Hinnen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929, 1978), seleccionando transformantes Trp^{+} en un medio selectivo constituido por 0,67% de fuente de nitrógeno de levadura, 0,5% de casamino-ácidos, 2% de glucosa, 10 \mug/ml de adenina y 20 \mug/ml de uracilo.
Los hospedadores de levadura transformados por vectores que comprenden el promotor ADH2 pueden cultivarse para expresión en un medio rico constituido por 1% de extracto de levadura, 2% de peptona y 1% de glucosa complementado con 80 \mug/ml de adenina y 80 \mug/ml de uracilo. La desregulación del promotor ADH2 ocurre después del agotamiento de glucosa del medio. Los sobrenadantes de levadura brutos se cosechan por filtración y se mantienen a 4ºC antes de la purificación ulterior.
Vectores de expresión útiles para uso bacteriano se construyen por inserción de una secuencia de DNA que codifica un receptor de mamífero para la lipoproteína de baja densidad modificada junto con señales adecuadas de iniciación y terminación de la traducción en marco de lectura operable con un promotor funcional. El vector comprenderá uno o más marcadores fenotípicos seleccionables y un origen de replicación a fin de asegurar el crecimiento dentro del hospedador. Hospedadores procariotas adecuados para transformación incluyen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimuriun y diversas especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces, y Staphylococcus, aunque pueden emplearse también otros como materia de elección.
Los vectores de expresión se construyen convenientemente por escisión de clones de cDNA en sitios próximos al codón codificante del residuo N-terminal de la proteína madura. Pueden utilizarse luego oligonucleótidos sintéticos para "incorporar por retroadición" cualesquiera secciones delecionadas de la región codificante y proporcionar una secuencia enlazadora para ligación del fragmento codificante en marco de lectura apropiado en el vector de expresión, y opcionalmente un codón que especifique un iniciador metionina.
Como un ejemplo representativo pero no limitante, vectores de expresión útiles para uso bacteriano pueden comprender un marcador seleccionable y origen de replicación bacteriano derivados de plásmidos disponibles comercialmente que comprenden elementos genéticos del bien conocido vector de clonación pBR322 (ATCC 37017). Tales vectores comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3p (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y pGEM1 (Projema Biotec, Madison, WI, EE.UU.). Estas secciones pBR322 "de cadena principal" se combinan con un promotor apropiado y con la secuencia estructural a expresar.
Un sistema de expresión bacteriano particularmente útil emplea el promotor de fago \lambdaP_{L} y el represor termolábil c1857. Vectores de plásmido disponibles de la American Type Culture Collection que incorporan derivados del promotor \lambdaP_{L} incluyen el plásmido pHUB2, residente en la cepa JMB9 de E. coli (ATCC 37092) y pPLc28, residente en RR1 de E. coli (ATCC 53082). Otros promotores útiles para expresión en E. coli incluyen el promotor de RNA-polimerasa T7 descrito por Studier et al. (J. Mol. Biol. 189: 113, 1986), el promotor lacZ descrito por Lauer (J. Mol. Biol. Appl. Genet. 1: 139-147, 1981) que está disponible como ATCC 37121, y el promotor tac descrito por Maniatis (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, p412), que está disponible como ATCC 37138.
Después de la transformación de una cepa hospedadora adecuada y el crecimiento de la cepa hospedadora hasta una densidad de células apropiada, el promotor seleccionado se desreprime por medios apropiados (v.g., desplazamiento de temperatura o inducción química) y las células se cultivan durante un periodo adicional. Las células se cosechan típicamente por centrifugación, se disgregan por medios físicos o químicos, y el extracto bruto resultante se retiene para purificación ulterior. Las células se dejan crecer, por ejemplo, en un fermentador de 10 litros empleando condiciones de aireación máxima y agitación enérgica. Se emplea preferiblemente un agente anti-espumante (Antifoam A). Los cultivos se dejan crecer a 30ºC en el medio de superinducción descrito por Mott et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 88, 1985), que incluye alternativamente antibióticos, se desreprimen a una densidad de células correspondiente a
A_{600} = 0,4-0,5 por elevación de la temperatura a 42ºC, y se cosechan durante 2-20 horas, preferiblemente 3-6 horas después del cambio de temperatura ascendente. La masa celular se concentra inicialmente por filtración u otros medios, y se centrífuga luego a 10.000 x g (10.000 G) durante 10 minutos a 4ºC, seguido por congelación rápida del pelet de células.
Preferiblemente, se preparan receptores de mamífero purificados para la lipoproteína de baja densidad modificada o análogos bioequivalentes por cultivo de sistemas hospedador-vector adecuados a fin de expresar los productos de traducción recombinantes de los genes sintéticos de la presente invención, que se purifican luego a partir de los medios de cultivo.
Un proceso alternativo para producir un receptor purificado para la lipoproteína de baja densidad modificada implica purificación a partir de sobrenadantes o extractos de cultivo de células. En este enfoque, se emplea una línea de células que elabora cantidades útiles de la proteína. Sobrenadantes de tales líneas de células pueden concentrarse opcionalmente utilizando un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Falcon. Después del paso de concentración, el concentrado puede aplicarse a una matriz de purificación adecuada como se ha descrito previamente. Por ejemplo, una matriz de afinidad adecuada puede comprender un receptor para la lipoproteína de baja densidad modificada o lectina o molécula de anticuerpo fijada a un soporte adecuado. Alternativamente, puede emplearse una resina de intercambió de anión, por ejemplo, una matriz o sustrato que tiene grupos dietilaminoetilo (DEAE) colgantes. Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos empleados comúnmente en purificación de proteínas. Alternativamente, puede emplearse un paso de intercambio de catión. Cambiadores de catión adecuados incluyen diversas matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo.
Finalmente, pueden emplearse uno o más pasos de cromatografía líquida de alta eficiencia en fase inversa (RP-HPLC) que emplean medios RP-HPLC hidrófobos, v.g., gel de sílice que tiene grupos alifáticos metilo u otros, a fin de purificar ulteriormente una composición receptora para la lipoproteína de baja densidad modificada. Algunos o todos los pasos de purificación que anteceden, en diversas combinaciones, pueden emplearse también para proporcionar una proteína recombinante homogénea.
La proteína recombinante producida en cultivo bacteriano se aísla usualmente por extracción inicial a partir de pelets de células, seguida por uno o más pasos de concentración, salificación, intercambio de ion acuoso o cromatografía de filtración sobre gel. Finalmente, la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) puede emplearse para los pasos de purificación finales. Las células microbianas empleadas en la expresión de receptores de mamífero recombinantes para la lipoproteína de baja densidad modificada pueden disgregarse por cualquier método conveniente, que incluye sometimiento a ciclos de congelación-descongelación, tratamiento por ultrasonidos, disgregación mecánica o uso de agentes de lisis celular.
La fermentación de levadura que expresa un receptor de mamífero para la lipoproteína de baja densidad modificada como proteína secretada simplifica notablemente la purificación. La proteína recombinante secretada que resulta de una fermentación en gran escala puede purificarse por métodos análogos a los descritos por Urdal et al. (J. Chromatog. 296: 171, 1984). Esta referencia describe dos pasos de HPLC en fase inversa secuenciales para purificación de GM-CSF humana recombinante en una columna de HPLC preparativa.
En sus diversas realizaciones, la presente invención proporciona polipéptidos esencialmente homogéneos de un receptor de mamífero recombinante para la lipoproteína de baja densidad modificada exenta de material endógeno contaminante.
Proteínas recombinantes de un receptor para la lipoproteína de baja densidad modificada de acuerdo con la presente invención incluyen también secuencias de péptidos o proteínas adecuadas empleadas como adyuvantes para la expresión en microorganismos o purificación de proteínas expresadas microbialmente.
Análogos bioequivalentes de las proteínas de esta invención incluyen diversos análogos, por ejemplo, versiones truncadas de un receptor para la lipoproteína de baja densidad modificada en los cuales están delecionados los residuos o secuencias terminales, que existen en células internas y no son necesarios para la actividad biológica.
Tal como se utiliza en esta memoria, "secuencia de aminoácidos mutante" hace referencia a un polipéptido codificado por una secuencia nucleotídica variante producida intencionalmente a partir de una secuencia nativa. "Proteína mutante" o "análogo" significa una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos mutante. "Secuencia nativa" hace referencia a una secuencia de aminoácidos o ácido nucleico que es idéntica a una forma de tipo salvaje o nativa de un gen o proteína.
La proteína de un receptor para la lipoproteína de baja densidad modificada puede digerirse con una proteasa para obtener un fragmento peptídico soluble. El fragmento peptídico soluble puede obtenerse también por expresión de una parte de un receptor para la lipoproteína de baja densidad modificada en E. coli o mamíferos de acuerdo con un método de DNA recombinante. Los fragmentos obtenidos se incluyen también en la presente invención con tal que los fragmentos satisfagan la definición, es decir exhiban actividad de fijación de una la lipoproteína de baja densidad modificada.
Utilizando el receptor soluble obtenido, una la lipoproteína de baja densidad modificada puede desactivarse por fijación de la lipoproteína con el fragmento peptídico soluble. De acuerdo con ello, el fragmento peptídico puede utilizarse para curar una enfermedad causada por una la lipoproteína de baja densidad modificada.
A continuación se describen ejemplos de la presente invención. En los ejemplos que siguen, la secuencia de aminoácidos del receptor para la lipoproteína de baja densidad modificada y la secuencia de DNA que codifica el receptor se dilucidaron a partir de una célula endotelial aórtica de bovino. Después que se dilucidaron las secuencias expuestas en las secuencias Núms. 1/2 y 3/4, se dilucidaron más fácilmente las secuencias de aminoácidos de un receptor endotelial humano para la lipoproteína de baja densidad modificada y la secuencia de DNA codificante del receptor (Secuencia No. 5/6). La secuencia de aminoácidos del receptor para la lipoproteína de baja densidad modificada y la secuencia de DNA codificante del receptor pueden dilucidarse fácilmente a partir de otra célula endotelial de mamífero de una manera similar.
Expuesto de modo más detallado, una secuencia de DNA codificante de otro receptor endotelial de mamífero para la lipoproteína de baja densidad modificada puede seleccionarse a partir de RNA poli(A)^{+}, que fue extraído de otra célula endotelial de mamífero u otro organismo. La selección puede conducirse por hibridación con las secuencias de DNA expuestas en los Núms. de secuencia 1, 3 y 5. Un experto en la técnica puede dilucidar fácilmente la secuencia, como se ha mencionado arriba. La situación es ahora diferente del Ejemplo 1 en el que no existía indicio alguno para la secuencia diana.
La secuencia obtenida puede analizarse fácilmente haciendo referencia a las secuencias Núms. 1 a 6. El análisis puede conducirse mucho más fácilmente que el Ejemplo 1 (en el cual no existía secuencia alguna de referencia).
En los ejemplos que siguen, se realizó un ensayo con respecto a actividad de fijación de una proteína de baja densidad oxidada. El mismo ensayo puede conducirse también con respecto a actividad de fijación de una proteína de baja densidad acetilada.
Ejemplo 1
Se construyó una genoteca de cDNA por una transcripción inversa de mRNA que incluía RNA poli(A)^{+} de acuerdo con un procedimiento similar al de Chomczynski et al. (Biotechniques 15, 532, 1933). El RNA poli(A)^{+} se aisló a partir de RNA total extraído de células endoteliales aórticas de bovino cultivadas. Expuesto de modo más detallado, las células se disolvieron en una solución de isocianato de guanidinio ácido/fenol. Se añadió cloroformo a la solución, y la solución se centrifugó para separar una fase acuosa y una fase orgánica. Se recuperó la fase acuosa, y se purificó por sedimentación en alcohol. Se aisló RNA poli(A)^{+} por cromatografía con oligo dT-celulosa y se preparó cDNA bicatenario por un método similar al de Gubbler y Hoffman (Gene 25, 263, 1983). Resumidamente, el RNA se copió en cDNA por transcriptasa inversa utilizando oligo dT u oligonucleótidos aleatorios como iniciador. El cDNA se hizo bicatenario por incubación con DNA-polimerasa I de E. coli y RNasa H, y los extremos se hicieron cohesivos por incubación ulterior con DNA-polimerasa T4. Se añadió el enlazador BstXI al cDNA de extremos romos, y se separaron luego las cadenas cortas por una cromatografía de filtración sobre gel utilizando Sephacryl S-500HR. El cDNA se subclonó en un vector plasmídico de alta expresión para células de mamífero (pME18S). Una ilustración esquemática de pME18S se muestra en Fig. 1 (obtenida del Dr. Maruyama de la Tokyo Medical and Dental
University).
El vector pME18S es un vector plasmídico de 3,4 kb que contiene un punto de iniciación de la replicación de SV40 y un promotor de tipo I del virus de la leucemia de los linfocitos T SV40/humanos.
La genoteca de cDNA aórtica de bovino en pME18S se utilizó para transformar E. coli (ElectroMax DH 10B) para proporcionar aproximadamente 7 x 10^{5} colonias. Estos recombinantes se cultivaron en 500 ml de 2xYT a 37ºC. El DNA plasmídico se preparó por una centrifugación en gradiente de densidad con CsCl. El DNA preparado se transfectó a una mono-capa sub-confluente de células COS-7 de mono utilizando Lipofectamina. Las células se dejaron crecer luego en cultivo durante 3 días para permitir la expresión transitoria de las secuencias insertadas. Las monocapas de células se ensayaron en una placa respecto a la absorción de la lipoproteína de baja densidad modificada como
sigue.
Se añadieron a la placa 5 ml de medio DMEM con 10% de suero de bovino fetal (FBS) que contenía 15 \mug de lipoproteína de baja densidad oxidada marcada con DiI, y la placa se incubó durante 12 horas a 37ºC con 5% de CO_{2}. Este medio se desechó luego, y la placa se lavó dos veces con PBS (pH 7,4). Las células se separaron de la placa por tripsinización. Se aplicaron las células a FACS para medir la fluorescencia de DiI y recuperar las células que exhibían alta intensidad de fluorescencia. Se extrajo el plásmido de las células recuperadas. Los procedimientos se repitieron cuatro veces. Se escrutaron aproximadamente 7 x 10^{5} recombinantes a partir de la genoteca como se ha mencionado arriba. De este modo, se transfectaron células COS-7 con un solo clon pBLOX-1 que es capaz de inducir la expresión de un receptor para lipoproteína de baja densidad oxidada.
Fig. 2 es un gráfico que muestra la distribución de la intensidad de fluorescencia de células COS-7 que se han transfectado con pBLOX-1 y una célula COS-7 de control que no ha sido transfectada. La intensidad se midió por FACS.
Los fragmentos insertados del clon pBLOX-1 se subclonaron a SK-plásmido Bluescript II, y su secuencia de DNA se determinó de acuerdo con el método didesoxi (véase Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463, 1977).
Ejemplo 2 Expresión en tejidos por transferencias Northern utilizando cDNA receptor
Se extrajo RNA poli(A)^{+} a partir de diversos tejidos de bovino de la misma manera que se ha mencionado arriba. Se separaron 5 \mug de cada uno de los RNAs utilizando electroforesis con formaldehído/gel de agarosa al 1,1%, y se transfirieron a escrutinio de genes más membrana (NEN, DuPont). A continuación, se marcaron 1,8 kb de fragmentos de cDNA por \alpha-^{32}P-dCTP de acuerdo con un método de cebado aleatorio para 8 x 10^{8} cpm/mg, y se utilizaron como sonda. La hibridación se llevó a cabo a 60ºC en una solución de cloruro de sodio 1M, 1% SDS y 250 \mug de DNA de esperma de salmón. La membrana se lavó con 2 x SSC/1% SDS. La radiografía se llevó a cabo durante 8 horas.
Se realizaron transferencias Northern con respecto a RNAs poli(A)^{+} extraídos de 11 tejidos de bovino. Como resultado, se expresó una gran cantidad de mRNA del receptor de lipoproteína de baja densidad modificada en las células endoteliales cultivadas y el pulmón.
Ejemplo 3 Expresión de un receptor para la lipoproteína de baja densidad modificada por células CHO-K1
Las células que expresaban un receptor para la lipoproteína de baja densidad modificada se prepararon utilizando un vector de expresión pSV2bsr y el plásmido de expresión del receptor de la lipoproteína de baja densidad modificada pBLOX-1. El vector pSV2bsr contiene un gen bs^{r} (resistencia a la blasticidina S) y un promotor derivado del virus SV40.
Se cultivaron células CHO (de ovario de hámster chino) K1 como una monocapa subconfluente en un medio HamF12 que contenía 10% de FBS.
Las células CHO-K1 se transfectaron con el plásmido de expresión pBLOX-1 de expresión del receptor de lipoproteína de baja densidad modificada y pSV2bsr utilizando Lipofectamina. Después de 24 horas, Las células transfectadas se subcultivaron en un área aproximadamente 10 veces mayor que el área previa. Después de 24 horas, las células se adherían bien, y el medio se reemplazó con un medio que contenía 5 \mug de blasticidina S.
Así pues, solamente crecían las células transfectadas con el gen bs^{r} en el genoma, y se formó su colonia.
Las colonias bien desarrolladas se desprendieron utilizando tripsina de acuerdo con el método de la copa de penicilina, y se subcultivaron en placas de 12 pocillos utilizando el mismo medio DMEM.
Las células clonales así aisladas expresaban un receptor para la lipoproteína de baja densidad modificada, lo que se confirmó por medio de un microscopio fluorescente. Se observó al microscopio el aumento de la intensidad de fluorescencia. El aumento fue causado por la incorporación de la lipoproteína de baja densidad modificada marcada con DiI. Fig. 3 es la micrografía de fluorescencia.
Ejemplo 4 Preparación de un receptor de lipoproteína de baja densidad modificada soluble
Un fragmento de cDNA que abarcaba el dominio extracelular de la lipoproteína de baja densidad modificada (Núms. de bases 160-813 en la Secuencia No. 1) se amplificó por PCR con un para de iniciadores (5'-gcggatcctgtgctct
caatagattcgc-3'/SEQ ID NO: 7 y 5'-ggggatcctgatctcataaagaaacag-3'/SEQ ID NO: 8) marcados con un sitio de restricción BamHI. El fragmento amplificado se digirió con BamHI y se subclonó en el sitio BamHI de pQE10 (Qiagen), que expresa una proteína marcada con seis repeticiones de histidina en E. coli. El plásmido se transformó en una cepa de E. coli, XL-2 Blue, y se cultivó mientras se agitaba mediante sacudidas a 37ºC en medio 2xYT. Cuando la absorbancia a 600 nm fue 0,6, se añadió 1 mM de IPTG (isopropiltio-\beta-D-galactosido) al medio. El cultivo se continuó ulteriormente a 30ºC durante 20 horas. Se recuperó E. coli por centrifugación, se disolvió en hidrocloruro de guanidina 6M, dihidrogenofosfato de sodio 0,1M y Tris 0,01M (pH 8,0). Los materiales insolubles se eliminaron por centrifugación, y el receptor de lipoproteína de baja densidad modificada soluble se adsorbió sobre agarosa Ni-NTA (Qiagen). La agarosa Ni-NTA se lavó con urea 8M, dihidrogenofosfato de sodio 0,1M y Tris 0,01M (pH 8,0) y con urea 8M, dihidrogenofosfato de sodio 0,1M y Tris 0,01M (pH 6,3). Se eluyó el receptor de lipoproteína de baja densidad modificada soluble y se purificó con urea 8M, dihidrogenofosfato de sodio 0,1M, Tris 0,01M y EDTA 0,1M (pH 6,3). Se confirmó que e receptor de lipoproteína de baja densidad modificada soluble era una muestra homogénea utilizando SDS-PAGE.
Pueden utilizarse los otros marcadores tales como GST o c-myc. También se pueden utilizar los otros métodos de purificación tales como un método que utiliza un anticuerpo. Adicionalmente, se puede preparar un receptor de lipoproteína de baja densidad modificada soluble por procedimientos de DNA recombinante utilizando un vector de expresión de mamífero apropiado.
Ejemplo 5 Preparación del anticuerpo anti-LOX-1
La secuencia codificante del dominio extracelular (aminoácidos 61-270) de cDNA de bovino LOX-1 se amplificó por una reacción en cadena de polimerasa con un para de iniciadores (5'-ggggatcctgatctcataaagaaacag-3' y 5'-gcggatcctgtgctctcaatagattcgc-3') marcados con un sitio de restricción BamHI. El fragmento de cDNA amplificado se digirió con BamHI, y se subclonó en sitios BamHI del vector pQE10 (Qiagen). La síntesis de proteínas y la purificación del dominio extracelular se realizaron en el sistema exprés QIA (Qiagen). Expuesto de modo más detallado, una cepa de E. coli, XL-2 Blue (Stratagene) se transformó con el plásmido, y se cultivó en medio 2xYT. La síntesis de proteínas se indujo con isopropiltio-\beta-D-galactosido. Las células se recuperaron por centrifugación, y se disolvieron en hidrocloruro de guanidina 6M, fosfato de sodio 0,1M y Tris-HCl 0,01M (pH 8,0). Se condujo una cromatografía en columna con una columna de resina Ni-NTA (Qiagen). La columna se lavó con urea 8M, fosfato de sodio 0,1M y Tris-HCl 0,01M (pH 6,3). La proteína se eluyó con urea 8M, EDTA 0,1M, fosfato de sodio 0,1M y Tris-HCl 0,01M (pH 6,3). El tampón se reemplazó con solución salina tamponada con una sal fosfato por Centriprep 10 (Amicon). La proteína se emulsionó con el mismo volumen de adyuvante completo de Freund. Se inmunizaron conejos por inyección intracutánea de la emulsión en la piel entre la escápula y la columna vertebral cada dos semanas.
Inmunotransferencia
Células endoteliales aórticas de bovino cultivadas se solubilizaron directamente en un tampón muestra de SDS-PAGE. Los extractos se separaron por SDS-PAGE y se transfirieron sobre membranas de nailon. Después de bloqueo con Block Ace (Snow Brand Milk Products Co., Ltd.), se realizó la inmunotinción de las membranas con un anticuerpo, que se obtuvo a partir de los conejos arriba mencionados, utilizando complejo avidina-biotina conjugado con peroxidasa y un kit de inmunostaína (Vector).
Un objeto de la presente invención es dilucidar la estructura de un receptor endotelial vascular para la lipoproteína de baja densidad modificada y proporcionar con ello una secuencia de DNA codificante del receptor endotelial vascular para la lipoproteína de baja densidad modificada.
Otro objeto de la invención es proporcionar un proceso para la producción de un receptor endotelial vascular para la lipoproteína de baja densidad modificada o un análogo de la misma.
Un objeto adicional de la invención es proporcionar una composición de proteína que contiene el receptor endotelial vascular para la lipoproteína de baja densidad modificada o un análogo de la misma.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
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(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Nippon Chemiphar Co., Ltd.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 2-3, Iwamoto-cho 2-chome
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Chilloda-ku
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: Tokyo
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Japón
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CODIGO POSTAL (ZIP): 101
\vskip0.500000\baselineskip
(G)
TELÉFONO: 03-3863-1204
\vskip0.500000\baselineskip
(H)
TELEFAX: 03-3865-1378
\vskip0.500000\baselineskip
(I)
TÉLEX: 2655390 NIPCHE J
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: RECEPTOR DE LIPOPROTEÍNA DE BAJA DENSIDAD MODIFICADA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 8
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release #1.0. Versión 1.30 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: EP 95 938 615.2-2105
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE SOLICITUDES ANTERIORES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: JP 321705/94
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 30-NOV-1994
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE SOLICITUDES ANTERIORES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: JP 214206/95
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 31-JULIO-1995
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE SOLICITUDES ANTERIORES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: WO JP95/02444
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 30-NOV-1995
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1897 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Bos taurus 
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
TIPO DE TEJIDO: células endoteliales vasculares
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
GENOTECA: cDNA de células endoteliales aórticas de bovino
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: pBLOX-1
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 35..844
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
1
2
3 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 270 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
4
5 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1906 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Bos taurus 
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
TIPO DE TEJIDO: Células endoteliales vasculares
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
GENOTECA: cDNA de células endoteliales aórticas de bovino
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: pBLOX-1
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 35..853
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
6
7
8
9 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 273 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
10
11 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1318 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Homo sapiens 
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
TIPO DE TEJIDO: Pulmón, placenta
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
GENOTECA: Genoteca de cDNA de pulmón humano
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: lambda-hLOX-1
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 127..945
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
12
13
14
15 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 273 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
16
17 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "Iniciador PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCGGATCCTG TGCTCTCAAT AGATTCGC 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "Iniciador PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGGATCCTG ATCTCATAAA GAAACAG 
\hfill
27

Claims (13)

1. Una secuencia de DNA constituida por una secuencia de DNA que codifica un receptor endotelial vascular de mamífero para la lipoproteína de baja densidad modificada, seleccionándose dicha secuencia del grupo constituido por SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, una secuencia de DNA que codifica SEQ ID NO: 2, una secuencia de DNA que codifica SEQ ID NO: 4, y una secuencia de DNA que codifica SEQ ID NO: 6.
2. Una secuencia de DNA que codifica una secuencia de aminoácidos del aminoácido No. 140 al 270 en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6.
3. Una secuencia de DNA que codifica un receptor endotelial vascular de mamífero para la lipoproteína de baja densidad modificada, exponiéndose dicha secuencia en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 5.
4. Una secuencia de DNA que comprende una unidad de transcripción recombinante que comprende elementos de expresión reguladores inducibles derivados de un operón microbiano o viral enlazado operativamente a una secuencia seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, una secuencia de DNA que codifica SEQ ID NO: 2, una secuencia de DNA que codifica SEQ ID NO: 4, y una secuencia de DNA que codifica SEQ ID NO: 6.
5. Un proceso para la producción de un receptor endotelial vascular de mamífero para la lipoproteína de baja densidad modificada, que comprende transfectar la unidad de transcripción recombinante de la reivindicación 4 en una célula hospedadora y cultivar la célula en condiciones que promueven la expresión.
6. Un vector de expresión recombinante que contiene una secuencia de DNA que codifica un receptor endotelial vascular de mamífero para la lipoproteína de baja densidad modificada, exponiéndose dicha secuencia en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 5.
7. Una composición de proteínas que contiene un receptor endotelial vascular de mamífero para la lipoproteína de baja densidad modificada que se produce por un cultivo de células recombinantes, teniendo dicho receptor una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, y SEQ ID NO: 6.
8. Un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos Núms. 140 a 270 en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6.
9. Un agente para detectar la lipoproteína de baja densidad modificada, en el cual el agente comprende un receptor endotelial vascular de mamífero para la lipoproteína de baja densidad modificada, teniendo dicha secuencia una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6.
10. Un anticuerpo que se fija específicamente a un receptor endotelial vascular de mamífero para la lipoproteína de baja densidad modificada, teniendo dicho receptor una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, y SEQ ID NO: 6.
11. El anticuerpo de la reivindicación 10, en el cual el receptor endotelial vascular de mamífero se produce por cultivo de células recombinantes.
12. Un anticuerpo que se fija específicamente a un receptor endotelial vascular de mamífero para la lipoproteína de baja densidad modificada, estando codificado dicho receptor por DNA que comprende una secuencia de bases como se expone en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 5.
13. El anticuerpo de la reivindicación 13, en el cual el receptor endotelial vascular de mamífero se produce por cultivo de células recombinantes.
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