JPH06165680A - クロライドチャネル - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】腎のヘンレの係蹄上行脚部に偏在するクロライ
ドチャネルを発現させるＲＮＡに特異的であり、かつ前
記ＲＮＡに相補的であるＣＬＣ−Ｋ１ ｃＤＮＡプロー
ブ。 【効果】腎臓のヘンレの係蹄上行脚部のクロライドチャ
ネルの存在が明確に立証され、また単離され、かつ同定
されたので、腎臓の基本的原理の解明の基礎が達成され
る。更にクロライドの輸送異常、またはクロライドの機
能不全及び破損による疾病の診断、治療、診断又は治療
のための材料に新たな指針が得られる。またＣＬＣ−Ｋ
１ｃＤＮＡをプラスミドに導入した遺伝子操作大腸菌に
よりクロライド透過性のＣＬＣ−Ｋ１タンパクが容易に
大量に入手できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は腎髄質、特にヘンレの係
蹄の上行脚に偏在する新規なクロライドチャネル（Ｃｌ
Ｃ−Ｋ１）を形成する遺伝子及びタンパク分子に関する
ものである。

【０００２】

【従来技術】現在までに既にクローニングされているク
ロライドチャネルには３種ある。ＣｌＣ−０はTorpedo
チャネルともいわれ、エレキエイの発電器官から単離さ
れたクロライドチャネルである。これをもとにして骨格
筋、脳からそれぞれＣｌＣ−１、ＣｌＣ−２が単離され
た。ヒトにおいては、ＣｌＣ−１の欠損でミオトニアと
いう病気が起こることが判明している。ＣｌＣ−２につ
いてはその生理作用は未だ不明である。

【０００３】尿を濃縮するための機構は脱水というスト
レスの下に生きる哺乳類にとって基本的なことである。
ヘンレの係蹄の上行脚、この部位は例えばＮａ⁺，Ｃｌ^-
に対して高い透過性を示し、水に対しては殆ど不透過性
であるという特徴をもっているが、ここにおいて、高張
尿を得るために腎髄質は複雑な対向流系(counter syste
m)を形成している。そしてこのことは髄質内部にある皮
質−髄質(corticomedullary axis)の軸に沿って浸透圧
勾配を生じさせるのに重要である(Imai,M.,Taniguchi,
J.,and Tabei,K. Kidney Int.31,565-579,1987)。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】腎臓に特異的なクロラ
イドチャネルの分子レベルでの存在は現在まで立証され
ていない。このクロライドチャネルの存在が明確に立証
され、また単離され、かつ同定されることにより、腎臓
の基本的原理の解明の基礎が達成されるとともに、様々
な腎臓障害治療の基礎が得られる。

【０００５】本発明はかかる問題点の解明に基づき、腎
臓のクロライドチャネルを単離したものとして得るこ
と、さらにその複製物、複製の手段を得ることを目的と
する。また本発明のクロライドチャネルを組み込んだ人
工膜を提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明によれば単
離されたＣｌＣ−Ｋ１ ｃＤＮＡプローブを入手するこ
とができ、ＣｌＣ−Ｋ１タンパク分子を生産する大腸
菌、該大腸菌により生成されたＣｌＣ−Ｋ１タンパク分
子及び、該ＣｌＣ−Ｋ１タンパク分子の製造方法によ
り、上記目的を達成できる。更に、ＣｌＣ−Ｋ１タンパ
クを組み込んだ脂質膜を得る。

【０００７】具体的手段について以下に述べる。

【０００８】（１）腎のヘンレの係蹄上行脚部に偏在す
るクロライドチャネルを発現させるｍＲＮＡに特異的で
あり、かつ前記ｍＲＮＡに相補的であるＣｌＣ−Ｋ１
ｃＤＮＡプローブ。

【０００９】（２）ａ）哺乳類の腎臓のＲＮＡから逆転
写させて作成した一本鎖ｃＤＮＡについて ５’−ＣＣＧＧＡＴＣＣＣＴＮＧＧＮＧＡ（Ａ／Ｇ）Ｇ
Ａ（Ｔ／Ｃ）ＴＧＧＡＴ（Ｔ／Ｃ／Ａ）ＴＴ（Ｃ／Ｔ）
ＣＴ−３’（センス鎖） 及び ５’−ＣＣＧＡＡＴＴＣ（Ａ／Ｇ／Ｔ）ＡＴ（Ａ／Ｇ）
ＴＧＮＡＣ（Ａ／Ｇ）ＡＡＮＧＧＮＣＣ（Ｔ／Ｃ）ＴＣ
（Ｔ／Ｃ）ＴＴ−３’（アンチセンス鎖） をディジェネレートプライマーとしてＰＣＲにかける、 ｂ）前記ＰＣＲ生成物をプローブとして前記哺乳類の腎
ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして得られる、
ＣｌＣ−Ｋ１ ｃＤＮＡクローン。

【００１０】腎提供者はラットが好ましい。

【００１１】（３）配列番号１に示す前記ＣｌＣ−Ｋ１
ｃＤＮＡの塩基配列。

【００１２】（４）前記ＣｌＣ−Ｋ１ ｃＤＮＡプロー
ブを鋳型として得られるＣｌＣ−Ｋ１ｍＲＮＡプロー
ブ。

【００１３】（５）腎のヘンレの係蹄上行脚部に偏在す
るクロライドチャネルを構成するＣｌＣ−Ｋ１タンパク
分子。

【００１４】（６）配列番号１に示す塩基配列によって
コードされる前記ＣｌＣ−Ｋ１タンパク分子をあらわす
アミノ酸配列。

【００１５】（７）発現ベクターに配列番号１に示す塩
基配列であらわされるＣｌＣ−Ｋ１遺伝子を組み込んだ
組み替えプラスミド。

【００１６】好ましくは前記発現ベクターがｐＳＰＯＲ
Ｔ１であり、前記ｐＳＰＯＲＴ１のＮｏｔＩ及びＳａｌ
Ｉとの切断部位に前記ＣｌＣ−Ｋ１遺伝子を挿入した組
み替えプラスミド。

【００１７】（８）ＣｌＣ−Ｋ１遺伝子による、ラット
腎のヘンレの係蹄上行脚部に偏在するクロライドチャネ
ルを構成するタンパク分子を生産する大腸菌。（この大
腸菌は、工業技術院微生物工業研究所に識別のための表
示を「ＤＨ₅α−ＣＬＣＫ１」として寄託されており、
その受託番号は「微工研菌寄第13309号（FERM P-1330
9）」である。）

【００１８】（９）前記大腸菌により生成されたＣｌＣ
−Ｋ１タンパク分子。

【００１９】（１０）前記大腸菌を用いてＣｌＣ−Ｋ１
タンパク分子を採取することを特徴とするＣｌＣ−Ｋ１
タンパク分子の製造方法。

【００２０】前記大腸菌は、好ましくは、ＣｌＣ−Ｋ１
遺伝子を発現ベクターｐＳＰＯＲＴ１に挿入して得られ
た組み替えプラスミドを大腸菌ＤＨ１０αに導入し、形
質転換して得られた大腸菌であり、より好ましくは、ｐ
ＳＰＯＲＴ１のＮｏｔＩ及びＳａｌＩとの切断部位にＣ
ｌＣ−Ｋ１遺伝子を挿入したプラスミドを含む大腸菌、
またはイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（以下Ｉ
ＰＴＧと略記する。）添加により発現誘導可能なベクタ
ー（ｐＳＰＯＲＴ１）、宿主（ＤＨ１０α）系を用いた
前記プラスミドを持った大腸菌である。

【００２１】（１１）ＣｌＣ−Ｋ１タンパク分子を含有
することを特徴とする脂質膜。

【００２２】（１２）ＣｌＣ−Ｋ１タンパク分子を含有
する脂質膜からなることを特徴とするリポソーム。

【００２３】

【発明の概要】ここで本発明者らは腎髄質、特にヘンレ
の係蹄の上行脚部（以下ＴＡＬと略記する）において優
位に発現されるラットのクロライドチャネル（ＣｌＣ−
Ｋ１）をコードしているｃＤＮＡの単離について報告す
る。そのアミノ酸配列は既にクローンされたクロライド
チャネル(Jentsch,T.J.,Steinmeyer,K.,and Schwarz,G.
Nature 348,510-514,1990. Steinmeyer,K.,Ortland,C.,
and Jentsch,T.J. Nature 354 301-304,1991. Thieman
n,A.,Grunder,S.,Pusch,M.,and Jentsch,T.J. Nature 3
56,57-60,1992)とおよそ４０％が同一であり、よく似た
ヒドロパシープロフィルを示す。

【００２４】アフリカツメガエルの卵母細胞における発
現実験にて、Ｃｌ^-の電流が発現され、この電流は過分
極下、脱分極下で瞬間的に活性化し、わずかに外向き整
流の電流−電圧関係をあらわす。

【００２５】ラットが水の損失により脱水状態になった
とき、ＣｌＣ−Ｋ１ ｍＲＮＡの発現が増大した。この
ことはＣｌＣ−Ｋ１の機能が尿濃縮機構において重要で
あることを示唆している。

【００２６】＜定義＞本発明でＣｌＣ−Ｋ１とはＴＡＬ
に偏在するクロライドチャネルをさすこととし、便宜的
に前記クロライドチャネルを発現させるｃＤＮＡプロ−
ブ及び、このｃＤＮＡプロ−ブにコードされているＤＮ
Ａ配列も広義にはあらわすこととする。

【００２７】

【好適な実施態様】

＜ＣｌＣ−Ｋ１遺伝子の単離、及び配列の決定＞本発明
者らは既にクローンされた３種のクロライドチャネル(J
entsch,T.J.,Steinmeyer,K.,and Schwarz,G. Nature 34
8,510-514,1990. Steinmeyer,K.,Ortland,C.,and Jents
ch,T.J. Nature 354 301-304,1991. Thiemann,A.,Grund
er,S.,Pusch,M.,and Jentsch,T.J. Nature 356,57-60,1
9922,3,4)が重要なアミノ酸の同一性をあらわしている
領域に基づいてディジェネレートポリメラーゼ鎖反応
（ＰＣＲ）のプライマーとして下記に示すものをデザイ
ンした。

【００２８】センス鎖；ＣＣＧＧＡＴＣＣＣＴＮＧＧＮ
ＧＡ（Ａ／Ｇ）ＧＡ（Ｔ／Ｃ）ＴＧＧＡＴ（Ｔ／Ｃ／
Ａ）ＴＴ（Ｃ／Ｔ）ＣＴ

【００２９】アンチセンス鎖；ＣＣＧＡＡＴＴＣ（Ａ／
Ｇ／Ｔ）ＡＴ（Ａ／Ｇ）ＴＧＮＡＣ（Ａ／Ｇ）ＡＡＮＧ
ＧＮＣＣ（Ｔ／Ｃ）ＴＣ（Ｔ／Ｃ）ＴＴ

【００３０】腎のＲＮＡ全量である１μｇがＡＭＶリバ
ース トランスクリプターゼ（ベーリンガー マンハイ
ム社）によって４２℃、６０分間で逆転写され、その後
９４℃で５分間加熱された。合成されたｃＤＮＡを用い
てサブシーケンスのＰＣＲを次の要領、９４℃で１分、
５５℃で１分、７２℃で３分、３５サイクルで、行なっ
た。

【００３１】予想された大きさであった３３０ｂｐのＰ
ＣＲ生成物はＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩとで両端を切断
し、ｐＳＰＯＲＴ１（ＢＲＬ）のＥｃｏＲＩとＢａｍＨ
Ｉとの切断部位に挿入し、配列を決定した。

【００３２】クローンの約８０％がＣｌＣ−２であっ
た。しかし他のものは新たなクローンを含んでいたが、
ＣｌＣ−０，１，２と類似の配列を持っていた。

【００３３】非常に厳格な条件（６ｘＳＳＰＥ，５ｘDe
nhardt溶液，１％ＳＤＳ，１００μｇ／ｍＬ鮭精子のＤ
ＮＡ）のもとに、³²Ｐ−ｄＣＴＰでラベルされた３３０
ｂｐＰＣＲクローンをプロ−ブとして、λｇｔ２２Ａの
ラット腎ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。

【００３４】得られたクローンλ１−ｆ１を更にＮｏｔ
ＩとＳａｌＩとで切断し、２．４ｋｂインサート（Ｃｌ
Ｃ−Ｋ１）がｐＳＰＯＲＴ１のＮｏｔＩとＳａｌＩとの
切断部位に、サブクローニングされた。nested deletio
n clonesがErase-A-Baseシステムによって調製された。
センス鎖はＴ７ ＤＮＡポリメラーゼを用いた鎖終止法
によって十分に配列の決定が検討された。アンチセンス
鎖は合成プライマーを用いて配列が決定された。

【００３５】このインサートはＣｌＣ−Ｋ(kidney)１と
称することとし、その配列は２４０７ｂｐであることが
明らかになった。そのことからＣｌＣ−Ｋ１は他のＣｌ
^-チャネル(Jentsch,T.J.,Steinmeyer,K.,and Schwarz,
G. Nature 348,510-514,1990. Steinmeyer,K.,Ortland,
C.,and Jentsch,T.J. Nature 354 301-304,1991. Thiem
ann,A.,Grunder,S.,Pusch,M.,and Jentsch,T.J. Nature
356,57-60,1992)と貫通部の類似性を有する、相対的な
分子量が７６０００である６８６個のアミノ酸からなる
タンパクであることが予想される（図９〜図１１）。

【００３６】Torpedo チャネル（ＣｌＣ−０）との全体
的なアミノ酸配列の同一性は３９％であり、骨格筋チャ
ネル（ＣｌＣ−１）とは４１％であり、ＣｌＣ−２とは
４３％である。

【００３７】ＣｌＣ−０，１，２と比較して、ＣｌＣ−
Ｋ１は小さいタンパクである。これは、疎水性のドメイ
ン１２と１３（Ｄ１２とＤ１３）の間が短いことによる
（図１０〜図１１）。

【００３８】図９〜図１１はＣｌＣ−Ｋ１のアミノ酸配
列及びＣｌＣ−０，１，２のアミノ酸配列との比較を示
す対照図である。４種のチャネル間で保存された残基は
ボールド体で示し、推定された膜横断領域(Kyte,J.and
Doolittle,R.F. J.Molec.Biol.157,105-132,1982)には
下線を付した。潜在的にＮリンクされたグリコシル化部
位(Kornfelt,R.,and Kornfelt,S. Ann.Rev.Biochem.54,
631-664,1985)はアスタリスク（＊）で示し、ＰＣＲプ
ライマー部位には二重線を付した。

【００３９】本発明ではラットについて実験を行なった
が、哺乳類であれば他の動物種についても、上記作業に
より該動物種のＣｌＣ−Ｋ１ ｃＤＮＡが得られること
は明白であり、塩基配列及びアミノ酸配列においても、
かなりの部分で同一性を有するであろうことは容易に推
測される。（例えばＣＨＩＰ２８ではヒトとラットの間
での塩基配列の相同性は８８％であった。）

【００４０】本発明者らは、遺伝子バンクにヌクレオチ
ド配列を投稿している過程にある。

【００４１】＜ＣｌＣ−Ｋ１の存在組織の探索＞ＲＮＡ
が種々のラットの組織または腎皮質、外側髄質、内側髄
質から抽出され、ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡの１０μｇ（Ａ）
または５μｇ（Ｂ）をホルムアルデヒド含有アガロース
ゲル上で電気泳動させた。この際臭化エチジウム色素を
添加して等量をチェックした。

【００４２】ナイロン膜に転写後、ブロットは³²Ｐ−ｄ
ＣＴＰでラベルされた２．１４ｋｂインサート（ＣｌＣ
−Ｋ１）と共に非常に厳重な条件下で交雑された。

【００４３】ノーザン分析からＣｌＣ−Ｋ１ ｍＲＮＡ
（２．４ｋｂバンド；ｃＤＮＡと殆ど同じ大きさ）が腎
において、特に内側髄質(innner medulla)において優位
に発現していることが明らかになった。うっすらとした
バンドは膀胱でも認められたが、骨格筋、心臓、腸、
肺、脳ではバンドは検出されなかった（図１，図２）。

【００４４】腎におけるＣｌＣ−Ｋ１の局在性について
より詳しい情報を得るために、本発明者らは微小分離し
たネフロンセグメント（各２mm）を用いて、逆転写ＰＣ
Ｒを記載(Moriyama,T.,Murphy,H.R.,Martin,B.M.,and G
arcia-Perez,A.Am.J.Physiol.258,F1470-F1474,1990)に
従って行なった。この方法では正確にネフロンセグメン
トに従った多量の情報について比較することはできない
けれども、ＣｌＣ−Ｋ１が腎のどこに優位に発現するか
についての情報を得ることができる。

【００４５】結果は図３が示すようにクロライドの高い
上皮透過性が証明されているＴＡＬにおいて強いシグナ
ルが検出された。内側髄質集合管（ＩＭＣＤ）とヘンレ
の係蹄の下行脚（ＴＤＬ）でも穏やかなシグナルが与え
られた。最も弱いシグナルは近位曲尿細管（ＰＣＴ）か
らであった。

【００４６】＜ＣｌＣ−Ｋ１がクロライドチャネルであ
ることの証明＞アフリカツメガエルの卵母細胞におい
て、オリジナルである推定された全長ｃＤＮＡからはＣ
ｌ^-の電流は発現しなかった。同じ現象がＣｌＣ−１と
２においても報告された(Steinmeyer,K.,Ortland,C.,an
d Jentsch,T.J. Nature 354 301-304,1991. Thiemann,
A.,Grunder,S.,Pusch,M.,and Jentsch,T.J. Nature 35
6,57-60,1992)。

【００４７】それ故本発明者らはＣｌＣ−Ｋ１の最初の
ＡＴＧの前に、Torpedo クロライドチャネルの５’側非
翻訳配列である８３ｂｐが組み込まれるようにリコンビ
ナントＰＣＲ(Higuchi,R. in PCR Technology(ed. Erli
ch,H.A.)61-70(Stockton,NewYork,1989))によってキメ
ラＣｌＣ−Ｋ１クローンを作成した。新しいキメラクロ
ーンの配列を確かめ、このことによってオリジナルのＣ
ｌＣ−Ｋ１に新たなアミノ酸が付加されることがないこ
とを確認した。

【００４８】ＮｏｔＩによりプラスミドを線状化した
後、キャップのついたＲＮＡがＴ７ＲＮＡポリメラーゼ
を用いて試験管内で合成された。記載された通りに(Uch
ida,S.,Kwon,H.M.,Preston,A.S.,and Handler,J.S. J.B
iol.Chem.266,9605-9609,1991)前もって調製されたアフ
リカツメガエルの卵母細胞は１５〜２０ｎｇのトランス
クリプトが注入され、２〜４日間、Barth緩衝液中で培
養された。

【００４９】電気生理学的な分析は標準的な２−電極−
電圧クランプ技術(standard 2-electrode-voltage clam
p technique)とｐＣＬＡＭＰソフトウエアを用いて室温
にてＮＤ９６溶液中で、−２０ｍＶの電位から、＋６０
から−１２０ｍＶの間の値へと２秒間隔で電圧がかけら
れた。

【００５０】ＣｌＣ−Ｋ１トランスクリプトを注入した
アフリカツメガエルの卵母細胞では、水注入卵母細胞に
比べて大きな時間非依存性電流が観察された（図４，図
６）。コンダクタンスは−１２０〜＋６０ｍＶの間でわ
ずかに外向き整流であった（図７）。ＣｌＣ−Ｋ１注入
卵母細胞は４０ｍＶにおいて、クロライドチャネルの阻
害剤である１ｍＭ ＤＩＤＳ（4,4'ージイソシアナトスチ
ルベンー2,2'ージスルホン酸)及び１ｍＭ ９−ＡＣ（9-ア
ントラセンカルボン酸）によってコンダクタンスがそれ
ぞれ約９０％及び７０％に阻害された（図５、図７）。

【００５１】微小灌流の研究はＴＡＬでのクロライドの
高透過性を証明し(Imai,M.,and Kokko,J.P. J.Clin.Inv
est.53,393-402,1974)、クロライドチャネルの存在を想
定した(Imai,M.,and Kokko,J.P. J.Clin.Invest.58,105
4-1060,1976)。今井モデル(Imai,M.,Taniguchi,J.,and
Tabei,K. Kidney Int.31,565-579,1987)によれば、ＴＡ
Ｌは下行脚直管及びＩＭＣＤと共に対向流系を形成して
おり、ＴＡＬから下行脚直管までのクロライドの動きは
皮質−髄質軸(corticomedullary axis)に沿って浸透圧
勾配を引き起こすのに重要であると考えられている。

【００５２】前述したようにＣｌＣ−Ｋ１はＴＡＬに主
に発現した。従ってＴＡＬにおける微小灌流の結果は今
回の実験結果と非常によく一致している。そしてＩ−Ｖ
相関曲線（図７）がほとんど直線になっていることか
ら、ＣｌＣ−Ｋ１チャネルが細胞膜の両側に存在してい
るならば、クロライド濃度勾配が強いられる条件下で
は、クロライドイオンはこのチャネルを通って尿細管の
上皮を透過できるということが、示唆される。

【００５３】尿の濃縮機構においてＣｌＣ−Ｋ１は重要
であるという仮説をテストするために、本発明者らはコ
ントロールと脱水のラットについて腎臓でのＣｌＣ−Ｋ
１を比較した。

【００５４】水を飲むことが制限されないコントロール
群、水が２日間、又は５日間にわたって摂取できない脱
水ラット群の、３群にラットを分けた。全てのラットは
同時に殺され、全ＲＮＡを調製するために腎全体が使用
された。

【００５５】放射線標識されたＣｌＣ−Ｋ１及びＣｌＣ
−２に対するアンチセンスＲＮＡプロ−ブ各２０μｇを
調製された全ＲＮＡと混合し、８０％ホルムアミド、４
００ｍＭ 酢酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、４０ｍＭ
piperazine-N,N'-bis[2-ethanesulfonic acid]（ＰＩ
ＰＥＳ），ｐＨ６．４の溶液中で、一晩ハイブリダイゼ
ーションさせた。ＣｌＣ−Ｋ１に対しては、ＣｌＣ−Ｋ
１の５’末端の５４０ｂｐを含んでいる配列を決定する
ために用いたクローンが、線状化され、放射線標識され
たアンチセンスＲＮＡプロ−ブを作成するために使われ
た。

【００５６】ハイブリダイゼーション後、ＲＮａｓｅＡ
及びＴ１が加えられて、保護されたフラグメントは変性
ポリアクリルアミドゲル中で分析された。ＣｌＣ−Ｋ１
とＣｌＣ−２のｍＲＮＡの量がリボヌクレアーゼプロテ
クシヨンアッセイによって、測定された。β−アクチン
の量が全ＲＮＡの５０μｇをノーザン分析することによ
って、測定された。

【００５７】この結果（図８）、脱水状態のラットはＣ
ｌＣ−２及びβ−アクチンのｍＲＮＡ量が変化しなかっ
たのに対して、ＣｌＣ−Ｋ１ ｍＲＮＡの量が増加（２
日及び５日脱水させたラットはコントロールと比較して
各々およそ２．５倍及び４倍増加）した。このことはこ
のチャネルが尿濃縮機構において必要であるだろうこと
を示唆している。

【００５８】＜ＣｌＣ−Ｋ１タンパク質の複製手段＞環
状プラスミドｐＳＰＯＲＴ１を制限酵素ＮｏｔＩ及びＳ
ａｌＩで切って、切断された部位にＣｌＣ−Ｋ１ ｃＤ
ＮＡを挿入する。ＣｌＣ−Ｋ１遺伝子を組み込んだプラ
スミドは大腸菌１０ＤＨα株に導入して形質転換させ
る。

【００５９】上記組み替えＤＮＡ法による宿主の形質転
換は、公知の方法(Cohen,S.N.et al.,Proc.Natl.Acad.S
ci.,USA.,69,2110,1972)もしくは、それに準ずる方法に
より行なうことができる。

【００６０】このようにして、得られた形質転換体（組
換え体）を公知の培地、例えば L−Broth （アンピシリ
ン含有）培地で培養する。培養に際して、菌体増殖後の
一定時期にプロモーターをより効率よく働かせるため
に、ＩＰＴＧを添加する。添加後の培養は通常３７℃で
３〜４時間行なう。培養後、公知の方法で菌体を集め、
緩衝液に懸濁し、菌体を破砕し、カラムクロマトグラフ
ィー等の公知の方法によりＣｌＣ−Ｋ１タンパクを精製
する。

【００６１】＜今後の展望＞嚢胞性線維症及びミオトニ
ーにおいて、クロライドチャネルの機能不全及び破損が
発見された(Hyde,S.C.,Emsley,P.,Hartshorn,M.,Mimmac
k,M.M.,Gileadi,U.,Pearce,S.R.,Gallagher,M.P.,Gill,
D.R.,Hubbard,R.,and Higgins,C.F. Nature346,362-36
5,1990. Steinmeyer,K.,Klocke,R.,Ortland,C.,Groneme
ier,M.,Jockusch,H.,Gruender,S.,and Jentsch,T.J. Na
ture 354,304-308,1991)。腎でのクロライドの細胞透過
輸送、及びそのことの体液の恒常性への役割に関する分
子生理学については殆ど知られていない。ネフロン末端
での異常なクロライドの輸送はバーター症候群(Batter
syndrome)及び家族性II型偽性アルドステロン機能低下
症(familial type II pseudohypoaldosteronism)の原因
であると考えられている(Gill,J.R.,Jr.,and Bartter,
F.C. Am.J.Med.65,766-772,1978. Take,C.,Ikeda,K.,Ku
rasawa,T.,and Kurokawa,K.N.Engl.J.Med.324,472-476,
1991)。

【００６２】ＣｌＣ−Ｋ１はＴＡＬ以外では末端に位置
しているネフロンセグメントに発現されている。けれど
も、上記疾患とＣｌＣ−Ｋ１とのかかわり合いは依然と
して解明されていない。現段階では、脱水によるＣｌＣ
−Ｋ１の発現部位や調節により、ＣｌＣ−Ｋ１が尿濃縮
機構において重要な役割を担っていることが強く示唆さ
れているにすぎない。

【００６３】しかし、本発明によりＣｌＣ−Ｋ１の単離
に成功し、かつ多量に複製することが可能になったこと
により、今後の研究に大いに貢献するだろう。

【００６４】＜産業上の利用例＞本発明でＣｌＣ−Ｋ１
の単離、同定、複製が可能になったことにより、産業上
次のような利用価値が得られる。

【００６５】ＣｌＣ−Ｋ１タンパクを発現させた物質を
利用して、Ｃｌ^-の再吸収抑制作用による利尿剤のスク
リーニング法が確立できる。例えば以下に示す利尿剤の
スクリーニング法が挙げられる。

【００６６】１）ＣｌＣ−Ｋ１のアミノ酸配列から、い
くつかの活性中心と思われるペプタイドを人工合成し、
該ペプタイドと特異的に結合する物質をスクリーニング
する。

【００６７】２）ＣｌＣ−Ｋ１組み替えプラスミドを有
する本発明の大腸菌からＣｌＣ−Ｋ１タンパクを大量に
製造させ、該タンパクに特異的に結合する物質をスクリ
ーニングする。

【００６８】３）ＣｌＣ−Ｋ１タンパクの細胞外ドメイ
ンに対する抗体を作成し、該抗体がＣｌＣ−Ｋ１タンパ
クと結合するのを阻害する物質をスクリーニングする。

【００６９】ＣｌＣ−Ｋ１タンパクを組み込んだ人工膜
(Bear,C.E.,et al.Cell,68,809-818,1992)は、Ｃｌ^-透
過性を示し、例えば以下に示す利用法がある。

【００７０】１）カルキ（臭）の除去として家庭用の浄
水装置に用いる。

【００７１】２）人工透析装置においてクロライドイオ
ンの除去段階に用いる。

【００７２】特にＣｌＣ−Ｋ１タンパクを脂質膜の一種
であるリポソームに組み込んだものは例えば以下に示す
利用法がある。

【００７３】有機化合物等をクロライド化する場合にお
いて、穏やかに反応を進めなければならない時に、Ｃｌ
Ｃ−Ｋ１を組み込んだリポソームを反応液中に混ぜる。
始めは余剰のＣｌ^-イオンはリポソームに取り込まれて
いるが、反応が進むに従い徐々にＣｌ^-イオンがリポソ
ームから放出され、反応に供される。反応終了後、遠心
または透析処理等により、リポソームは除去できる。

【００７４】ＣｌＣ−Ｋ１タンパクを組み込んだリポソ
ームは公知の方法で製造でき、比較的一般的なのは凍結
融解法(M.Kasahara,P.C.Hinkle,J.Biol.Chem.,252,738
4,1977)、オクチルグルコシドによる希釈法(M.J.Newma
n,T.H.Wilson,J.Biol.Chem.,255,10583,1980)及び透析
法(Y.Kagawa,A.Kandrach,E.Racker,J.Biol.Chem.,248,6
76,1973)である。

【００７５】リポソームの大きさ、性状（単層または多
重層）は脂質の種類によって適宜選択する。

【００７６】例えばＣｌＣ−Ｋ１タンパクと脂質（リン
脂質との混合が好ましい。）と界面活性剤（例えばデオ
キシコール酸塩）を加えて、超音波によりよく攪拌混合
する。次に透析またはゲル瀘過により界面活性剤を除け
ば、ＣｌＣ−Ｋ１タンパクが組み込まれたリポソームが
できる。

【００７７】凍結融解法によるＣｌＣ−Ｋ１タンパクが
組み込まれたリポソームの調製例を以下に示す。

【００７８】

【調製例】１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５），５０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、アセトン処理したアゾレク
チン（ダイズ粗脂質）２２．５ｍｇに１０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）０．５ｍＬを加え、窒素ガス
を吹き込んだ後水浴型の超音波発振装置で約２０分、ほ
ぼ透明になるまで超音波処理する。

【００７９】このリポソーム１６７μＬ、精製ＣｌＣ−
Ｋ１タンパク質２０μｇ、及び１０ｍＭトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ７．５）を加え０．５ｍＬとする。窒素ガス
を吹き込んだ後−７０℃に冷やしたアセトン中で凍結す
る。室温で融解した後、水浴型の超音波発振装置を用い
て超音波処理を１５秒行なう。５０ｍＭ ＭｇＣｌ₂−１
００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）及び水で希
釈し、８ｍｇ脂質／ｍＬ−２ｍＭ ＭｇＣｌ₂−１０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液として、ＣｌＣ−Ｋ１タンパク質を
組み込んだリポソームを得る。

【００８０】また、本発明によりＣｌＣ−Ｋ１ｃＤＮＡ
の複製が可能となり、かつ人工的にＣｌＣ−Ｋ１ｍＲＮ
Ａを合成することができるようになったので、公知の技
術(M.Mishina,et al.Nature(London),307,604,1984)を
利用して生体膜上にＣｌＣ−Ｋ１タンパク質を発現させ
ることができる。

【００８１】例えばＣｌＣ−Ｋ１ｃＤＮＡを組み込んだ
プラスミドを細胞培養に移植し、あるいはＣｌＣ−Ｋ１
ｍＲＮＡを卵母細胞に注入して、細胞膜上にＣｌＣ−Ｋ
１タンパク質を発現させることができる。

【００８２】

【発明の効果】本発明により次のような効果が期待でき
る。

【００８３】腎臓のヘンレの係蹄上行脚部のクロライ
ドチャネルの存在が明確に立証され、また単離され、か
つ同定されたので、腎臓の基本的原理の解明の基礎が達
成される。

【００８４】更に腎臓の基本的原理が解明されるの
で、腎臓障害診断に新たな指針が得られる。

【００８５】また腎臓の基本的原理が解明されるの
で、腎臓障害治療または治療のための材料に新たな指針
が得られる。

【００８６】クロライドの輸送異常、またはクロライ
ドの機能不全及び破損による疾病の診断、治療、診断又
は治療のための材料に新たな指針が得られる。

【００８７】ＣｌＣ−Ｋ１ｃＤＮＡあるいはｍＲＮＡ
を細胞内に導入することにより、生体膜にＣｌＣ−Ｋ１
クロライドチャネルを発現させることができる。

【００８８】本発明の遺伝子操作大腸菌によりクロラ
イド透過性のＣｌＣ−Ｋ１タンパクが容易に大量に入手
できる。

【００８９】ＣｌＣ−Ｋ１タンパク質を組み込んだク
ロライド透過性の人工膜が得られる。

【００９０】ＣｌＣ−Ｋ１タンパク質を組み込んだク
ロライド透過性のリポソームが得られる。

【００９１】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：2407 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物：Sprague-Dawley rat 単離クローン名：ClC-K1 組織の種類：腎臓 配列 GCGCCACGAC GCAGGACCTC TGCAGGGTGG ACTGAGAGGA CGG ATG GAA GAA CTC 55 Met Glu Glu Leu 1 GTG GGA CTG CGT GAG GGC TCC TCT GGG AAG CCA GTA ACT CTG CAA GAG 103 Val Gly Leu Arg Glu Gly Ser Ser Gly Lys Pro Val Thr Leu Gln Glu 5 10 15 20 CTA TGG GGG CCG TGT CCA CCG ATC CGC CGA GGT GTC AGA AGG GGC CTA 151 Leu Trp Gly Pro Cys Pro Pro Ile Arg Arg Gly Val Arg Arg Gly Leu 25 30 35 GAG TGG CTG AAA GAG CGG TTG TTC CGT GTG GGT GAG GAC TGG CAC TTC 199 Glu Trp Leu Lys Glu Arg Leu Phe Arg Val Gly Glu Asp Trp His Phe 40 45 50 CTG GTG GCT CTC GGG GTG CTC ATG GCT CTG ATC AGC TAT GCC ATG AAC 247 Leu Val Ala Leu Gly Val Leu Met Ala Leu Ile Ser Tyr Ala Met Asn 55 60 65 TTT GCC ATT GGA CGT GTG GTC AGA GCA CAC AAA TGG CTA TAC CGG GAG 295 Phe Ala Ile Gly Arg Val Val Arg Ala His Lys Trp Leu Tyr Arg Glu 70 75 80 GTT GGG GAC GGC CAC CTG CTC CGG TAC CTC TCC TGG ACC GTC TAC CCT 343 Val Gly Asp Gly His Leu Leu Arg Tyr Leu Ser Trp Thr Val Tyr Pro 85 90 95 100 GTG GCT CTT CTG TCC TTC TCC TCC GGC TTC TCG CAG AGC ATC TCA CCC 391 Val Ala Leu Leu Ser Phe Ser Ser Gly Phe Ser Gln Ser Ile Ser Pro 105 110 115 TTC TCT GGA GGG TCT GGA CTC CCA GAG CTG AAG ACC ATG CTG TCC GGT 439 Phe Ser Gly Gly Ser Gly Leu Pro Glu Leu Lys Thr Met Leu Ser Gly 120 125 130 GTG GTC CTG GAG GAC TAC CTA GAC ATC AAG AAC TTC GGG GCC AAG GTG 487 Val Val Leu Glu Asp Tyr Leu Asp Ile Lys Asn Phe Gly Ala Lys Val 135 140 145 GTG GGC CTC TCC TGC ACC CTG GCA ACA GGC AGT ACC ATC TTC CTA GGC 535 Val Gly Leu Ser Cys Thr Leu Ala Thr Gly Ser Thr Ile Phe Leu Gly 150 155 160 AAA GTG GGC CCC TTC GTG CAC CTG AGC GTG ATG ATT TCT GCT TAT CTG 583 Lys Val Gly Pro Phe Val His Leu Ser Val Met Ile Ser Ala Tyr Leu 165 170 175 180 GGC CGA GTG CGC GCC AAG ACC ATT GGG GAA ACT GAG AAC AAG GCC AAG 631 Gly Arg Val Arg Ala Lys Thr Ile Gly Glu Thr Glu Asn Lys Ala Lys 185 190 195 GAA ATT GAA ATG CTC TCG GCG GCA GCG GCA GTG GGC GTG GCC ACA GTT 679 Glu Ile Glu Met Leu Ser Ala Ala Ala Ala Val Gly Val Ala Thr Val 200 205 210 TTC GCA GCC CCC TTC AGC GGT GTC CTG TTC AGC ATC GAG GTC ATG TCC 727 Phe Ala Ala Pro Phe Ser Gly Val Leu Phe Ser Ile Glu Val Met Ser 215 220 225 TCT CAC TTC TCC GTC TGG AAT TAC TGG AGG GGC TTC TTT GCC GCC ACA 775 Ser His Phe Ser Val Trp Asn Tyr Trp Arg Gly Phe Phe Ala Ala Thr 230 235 240 TGC GGG GCC TTC ATG TTC CGT CTC CTA GGG GTC TTC AAC AGT GAA CAG 823 Cys Gly Ala Phe Met Phe Arg Leu Leu Gly Val Phe Asn Ser Glu Gln 245 250 255 260 GAG ACC ATC ACC TCC ATC TAC AAG ACC AGA TTC CGA GTG GAT GTG CCC 871 Glu Thr Ile Thr Ser Ile Tyr Lys Thr Arg Phe Arg Val Asp Val Pro 265 270 275 TTT GAC CTG CCT GAA ATC TTC TTC TTT GTG GCT CTG GGG TTC ATC TGC 919 Phe Asp Leu Pro Glu Ile Phe Phe Phe Val Ala Leu Gly Phe Ile Cys 280 285 290 GGG GTC CTG AGC TGC GCG TAC CTG TTC TGT CAG AGA ACT TTT CTC CGC 967 Gly Val Leu Ser Cys Ala Tyr Leu Phe Cys Gln Arg Thr Phe Leu Arg 295 300 305 TTT ATC AAG ACC AAT CGG TAC ACC TCC AGA CTG TTG GCT ACA AGC AAG 1015 Phe Ile Lys Thr Asn Arg Tyr Thr Ser Arg Leu Leu Ala Thr Ser Lys 310 315 320 CCG TCC TAC GCA GCT CTG GTT GCC CTG GTC CTG GCC TCC ATC ACC TAT 1063 Pro Ser Tyr Ala Ala Leu Val Ala Leu Val Leu Ala Ser Ile Thr Tyr 325 330 335 340 CCA CCT GGT GTG GGT CGC TTC ATG GCC TCC CGG CTG TCC ATG GCA CAG 1111 Pro Pro Gly Val Gly Arg Phe Met Ala Ser Arg Leu Ser Met Ala Gln 345 350 355 CAT TTG CAC TCT CTG TTT GAC AAC AAC TCT TGG GCA CTG ATG ACC CGA 1159 His Leu His Ser Leu Phe Asp Asn Asn Ser Trp Ala Leu Met Thr Arg 360 365 370 AAT TCA TCC CCA CCC TGG CCT GCG GAC GCG GAC CCC CAG AAC CTG TGG 1207 Asn Ser Ser Pro Pro Trp Pro Ala Asp Ala Asp Pro Gln Asn Leu Trp 375 380 385 CCG GAA TGG TGT CAC CCA CGG TTC ACC ATC TTT GGG ACT CTG GCC TTC 1255 Pro Glu Trp Cys His Pro Arg Phe Thr Ile Phe Gly Thr Leu Ala Phe 390 395 400 TTC CTG GTC ATG AAG TTC TGG ATG CTG ATT CTG GCT ACC ACG ATC CCC 1303 Phe Leu Val Met Lys Phe Trp Met Leu Ile Leu Ala Thr Thr Ile Pro 405 410 415 420 ATG CCT GCT GGG TAT TTC ATG CCC ATA TTC ATC ATT GGA GCT GCC ATT 1351 Met Pro Ala Gly Tyr Phe Met Pro Ile Phe Ile Ile Gly Ala Ala Ile 425 430 435 GGG GCC TCT TGG GAG AGG CCC TGT CTG TCG CCT TCC AGA GGG CAT TGT 1399 Gly Ala Ser Trp Glu Arg Pro Cys Leu Ser Pro Ser Arg Gly His Cys 440 445 450 GGC TGG CAG AGA GGT CAA CCC CAT CAT GCC TGG GGG CTA TGC TCT GGA 1447 Gly Trp Gln Arg Gly Gln Pro His His Ala Trp Gly Leu Cys Ser Gly 455 460 465 GGT GCT GCT GCC TTC TCG GGG GCG GTG ACC CAC ACC ATC TCC ACA GCA 1495 Gly Ala Ala Ala Phe Ser Gly Ala Val Thr His Thr Ile Ser Thr Ala 470 475 480 CTG CTG GCC TTT GAG CTG ACC GGC CAG ATC GTT CAT GCA CTG CCT GTG 1543 Leu Leu Ala Phe Glu Leu Thr Gly Gln Ile Val His Ala Leu Pro Val 485 490 495 500 CTG ATG GCC GTG CTG GCG GCC AAT GCC ATC TCT CAA AAC TGT CAG CCG 1591 Leu Met Ala Val Leu Ala Ala Asn Ala Ile Ser Gln Asn Cys Gln Pro 505 510 515 TCT TTC TAC GAT GGC ACC ATC ATG GCC AAG AAA CTG CCG TAC CTG CCG 1639 Ser Phe Tyr Asp Gly Thr Ile Met Ala Lys Lys Leu Pro Tyr Leu Pro 520 525 530 TGG ATC CGT GGC CGA CAG ATT GGC TCC TAC CCT GTG ACT GTG GAA CAC 1687 Trp Ile Arg Gly Arg Gln Ile Gly Ser Tyr Pro Val Thr Val Glu His 535 540 545 TTC ATG AAC TGT AAC CTC ACC ACG CTG GCC AAG GAC ACG CCC CTG GAG 1735 Phe Met Asn Cys Asn Leu Thr Thr Leu Ala Lys Asp Thr Pro Leu Glu 550 555 560 GAG GTG GTC AAA GTT GTG ACC TCT ACA GAA GTG TCT CAA TAT CCC TTG 1783 Glu Val Val Lys Val Val Thr Ser Thr Glu Val Ser Gln Tyr Pro Leu 565 570 575 580 GTG GAG ACC AGA GAG TCT CAG ACC CTG GTG GGC ATT GTG GAA CGG ACC 1831 Val Glu Thr Arg Glu Ser Gln Thr Leu Val Gly Ile Val Glu Arg Thr 585 590 595 CAC TTG GTG CAA GCC CTC CAG ACC CAG CCA GCT TCC TGG GCT CCA GGC 1879 His Leu Val Gln Ala Leu Gln Thr Gln Pro Ala Ser Trp Ala Pro Gly 600 605 610 CAA GAG CGC TTT CTC CAG GAC ATC TTG GCA GGT GGC TGC CCC ACA CAG 1927 Gln Glu Arg Phe Leu Gln Asp Ile Leu Ala Gly Gly Cys Pro Thr Gln 615 620 625 CCA GTG ACC CTG CAG CTG TCC CCA GAG ACC TCC CTG TAT CAG GCA CAC 1975 Pro Val Thr Leu Gln Leu Ser Pro Glu Thr Ser Leu Tyr Gln Ala His 630 635 640 AGC CTC TTT GAG CGG CTG ACC CTT CAG TCG CTG TTC GTG ACG TCA CGG 2023 Ser Leu Phe Glu Arg Leu Thr Leu Gln Ser Leu Phe Val Thr Ser Arg 645 650 655 660 GGC AAA GCT GTG GGC TCT GTG TCC TGG GCG GAG CTG AAG AAA GCC ATT 2071 Gly Lys Ala Val Gly Ser Val Ser Trp Ala Glu Leu Lys Lys Ala Ile 665 670 675 TCC ACC TTG ATC AAC CCA CCA GCC CCC AAG TGAGCCAGCG TTGGGGTCAG 2121 Ser Thr Leu Ile Asn Pro Pro Ala Pro Lys 680 685 686 AACAGGACCC CAGCTAAGAG CTGCAGAGGC TGCACAGAGC CCCACCCCAT TTCCCTCCCT 2181 ACCCCACCCC TCCAGCCCAG CCCGGCTCCC CAGTGCCTCA GGCAGCTCTA CCCAGCTGAA 2241 CGGGACTCCG TATTCATCAT GGCCTACACC GAGAGCACAA CATCTCTCTG GTCTGGAAGG 2301 GACAAATCTC ACCCTGGTGC ATGTCCCTTC TGGGATTATC TATTCACAAC CAGTAGCTCC 2361 TGAGAAAATA AAAGTAAAGC TGGTTCCCAG AAAAAAAAAA AAAAAA 2407

【図面の簡単な説明】

【図１】種々のラットの組織でのＣｌＣ−Ｋ１の発現を
示すノーザンブロットの写真である。 英語表記の説明 cerebrum；大脳、 cerebellum；
小脳、atrium；心房、 ventri
cle；心室、aorta；大動脈、 l
ung；肺、stomach；胃、 int
estine；腸、liver；肝、
spleen；脾臓、pancreas；すい臓、
kidney；腎、adrenal gland；副腎、
testis；精巣、ovary；卵巣、
bladder；膀胱。

【図２】ラットの腎組織内でのＣｌＣ−Ｋ１の発現を示
すノーザンブロットの写真である。 英語表記の説明 cortex;髄質、 outer medulla;外側髄質、 inner
medulla;内側髄質

【図３】ラットのネフロンセグメントに沿ったＣｌＣ−
Ｋ１の発現の局在性を示すＰＣＲの写真である。 略号の説明 ＰＣＴ：近位尿細管曲部、 ＴＤＬ：ヘンレ
の係蹄の細い下行脚、ＴＡＬ：ヘンレの係蹄の細い上行
脚、 ＭＡＬ：髄質の太い上行脚、ＣＣＤ：皮質集合
管、 ＩＭＣＤ：内側髄質集合管

【図４】標準的な２個の電極電圧クランプによりＣｌＣ
−Ｋ１ ｃＲＮＡをあらかじめ注入した卵母細胞をＮＤ
９６溶液中で測定した電流記録図である。

【図５】標準的な２個の電極電圧クランプによりＣｌＣ
−Ｋ１ ｃＲＮＡをあらかじめ注入した卵母細胞を１０
ｍＭ ＤＩＤＳ溶液中に５分間インキューベーション
後、ＮＤ９６溶液中で測定した電流記録図である。

【図６】水注入卵母細胞を標準的な２個の電極電圧クラ
ンプにより測定した電流記録図である。

【図７】ＮＤ９６中の、１ｍＭ ＤＩＤＳ存在下、１ｍ
Ｍ ９−ＡＣ存在下、低クロライドＮＤ９６（７ｍＭ Ｃ
ｌ^-，９６ｍＭ （シクラメート）^-）中にある各々のＣ
ｌＣ−Ｋ１ ｃＲＮＡ注入卵母細胞の電流−電圧関係の
定状態を示す。

【図８】脱水状態のラットにおけるＣｌＣ−Ｋ１ ｍＲ
ＮＡの増量調節を示すノーザンブロットの写真である。

【図９】ＣｌＣ−Ｋ１のアミノ酸配列とＣｌＣ−０，
１，２のアミノ酸配列との比較を示し、ＣｌＣ−Ｋ１の
アミノ酸配列の１番目から３２５番目までの比較を示す
対照図である。４種のチャネル間で保存された残基はボ
ールド体で示し、推定された膜横断領域には下線を付し
た。潜在的にＮリンクされたグリコシル化部位はアスタ
リスク（＊）で示し、ＰＣＲプライマー部位には二重線
を付した。アミノ酸の略号は次の通りである。 Ａ；アラニン（Ａｌａ）、 Ｃ；システイン
（Ｃｙｓ）、Ｄ；アスパラギン酸（Ａｓｐ）、 Ｅ；
グルタミン酸（Ｇｌｕ）、Ｆ；フェニルアラニン（Ｐｈ
ｅ）、 Ｇ；グリシン（Ｇｌｙ）、Ｈ；ヒスチジン（Ｈ
ｉｓ）、 Ｉ；イソロイシン（Ｉｌｅ）、Ｋ；リ
ジン（Ｌｙｓ）、 Ｌ；ロイシン（Ｌｅ
ｕ）、Ｍ；メチオニン（Ｍｅｔ）、 Ｎ；アスパ
ラギン（Ａｓｎ）、Ｐ；プロリン（Ｐｒｏ）、
Ｑ；グルタミン（Ｇｌｎ）、Ｒ；アルギニン（Ａｒ
ｇ）、 Ｓ；セリン（Ｓｅｒ）、Ｔ；トレオニン
（Ｔｈｒ）、 Ｖ；バリン（Ｖａｌ）、Ｗ；トリ
プトファン（Ｔｒｐ）、 Ｙ；チロシン（Ｔｙｒ）。

【図１０】ＣｌＣ−Ｋ１のアミノ酸配列とＣｌＣ−０，
１，２のアミノ酸配列との比較を示し、ＣｌＣ−Ｋ１の
アミノ酸配列の３２６番目から６１７番目までの比較を
示す図９に続く対照図である。

【図１１】ＣｌＣ−Ｋ１のアミノ酸配列とＣｌＣ−０，
１，２のアミノ酸配列との比較を示し、ＣｌＣ−Ｋ１の
アミノ酸配列の６１８番目から６８６番目までの比較を
示す図１０に続く対照図である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成５年７月１９日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図１

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】種々のラットの組織でのＣＩＣ−Ｋ１の発現を
示すノーザンブロットの写真である。ここで、ノーザン
ブロットとはＲＮＡ断片を電気泳動で分離し、特殊な紙
（ここではナイロン膜）に移した後、放射性の一本鎖Ｄ
ＮＡ又はＲＮＡ（ここでは^３２Ｐ−ｄＣＴＰでラベルさ
れたＣｌＣ−Ｋ１）をプローブとしてハイブリッド形成
を行ない位置決定する方法のことであり、電気泳動法の
一種である。 英語表記の説明 ｃｅｒｅｂｒｕｍ；大脳、 ｃｅｒ
ｅｂｅｌｌｕｍ；小脳、ａｔｒｉｕｍ；心房、
ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ；心室、ａｏｒｔ
ａ；大動脈、 ｌｕｎｇ；肺、
ｓｔｏｍａｃｈ；胃、 ｉｎｔ
ｅｓｔｉｎｅ；腸、ｌｉｖｅｒ；肝、
ｓｐｌｅｅｎ；牌臓、ｐａｎｃｒｅａｓ；
すい臓、 ｋｉｄｎｅｙ；腎、ａｄｒ
ｅｎａｌ ｇｌａｎｄ；副腎、 ｔｅｓｔｉ
ｓ；精巣、ｏｖａｒｙ；卵巣、
ｂｌａｄｄｅｒ；膀胱。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図２

【補正方法】変更

【補正内容】

【図２】ラットの腎組織内でのＣｌＣ−Ｋ１の発現を示
すノーザンブロットの写真である。ここで、ノーザンブ
ロットとは前述したようにＲＮＡ断片の電気泳動法であ
る。 英語表記の説明 ｃｏｒｔｅｘ；髄質、 ｏｕｔｅｒ ｍｅｄｕｌｌ
ａ；外側髄質、 ｉｎｎｅｒ ｍｅｄｕｌｌａ；内側
髄質

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図３

【補正方法】変更

【補正内容】

【図３】ラットのネフロンセグメントに沿ったＣｌＣ−
Ｋ１の発現の局在性を示す逆転写ＰＣＲの写真である。
即ち、腎各部のＲＮＡ断片から逆転写してｃＤＮＡを作
製し、これをＰＣＲ法により増やした後電気泳動で分離
し、ＤＮＡを変性させてナイロン膜に移し、^３２Ｐ−ｄ
ＣＴＰでラベルされたＣｌＣ−Ｋ１をプローブとしてハ
イブリッド形成を行ない位置決定をし（サザンブロッ
ト）、発現の局在性を示した写真である。 略号の説明 ＰＣＴ：近位尿細管曲部、 ＴＤＬ：ヘンレ
の係蹄の細い下行脚、ＴＡＬ：へンレの係蹄の細い上行
脚、 ＭＡＬ：髄質の太い上行脚、ＣＣＤ：皮質集合
管、 ＩＭＣＤ：内側髄質集合管

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図８

【補正方法】変更

【補正内容】

【図８】脱水状態のラットにおけるＣｌＣ−Ｋ１ ｍＲ
ＮＡの増量調節を示すノーザンブロットの写真である。
ここで、ノーザンブロットとは前述したようにＲＮＡ断
片の電気泳動法である。

【手続補正５】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図７

【補正方法】変更

【補正内容】

【図７】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】腎のヘンレの係蹄上行脚部に偏在するクロ
   ライドチャネルを発現させるＲＮＡに特異的であり、か
   つ前記ＲＮＡに相補的であるＣｌＣ−Ｋ１ ｃＤＮＡプ
   ローブ。
2. 【請求項２】配列番号１に示す塩基配列であらわされる
   請求項１記載のＣｌＣ−Ｋ１ ｃＤＮＡ配列。
3. 【請求項３】請求項１又は２記載のＣｌＣ−Ｋ１ ｃＤ
   ＮＡプローブを鋳型として得られることを特徴とするＣ
   ｌＣ−Ｋ１ ｃＲＮＡプローブ。
4. 【請求項４】ａ）哺乳類の腎臓のＲＮＡから逆転写させ
   て作成した一本鎖ｃＤＮＡについて ５’−ＣＣＧＧＡＴＣＣＣＴＮＧＧＮＧＡ（Ａ／Ｇ）Ｇ
   Ａ（Ｔ／Ｃ）ＴＧＧＡＴ（Ｔ／Ｃ／Ａ）ＴＴ（Ｃ／Ｔ）
   ＣＴ−３’（センス鎖） 及び ５’−ＣＣＧＡＡＴＴＣ（Ａ／Ｇ／Ｔ）ＡＴ（Ａ／Ｇ）
   ＴＧＮＡＣ（Ａ／Ｇ）ＡＡＮＧＧＮＣＣ（Ｔ／Ｃ）ＴＣ
   （Ｔ／Ｃ）ＴＴ−３’（アンチセンス鎖） をディジェネレートプライマーとしてＰＣＲにかける、 ｂ）前記ＰＣＲ生成物をプローブとして前記哺乳類の腎
   ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして得られる、 ことを特徴とする請求項１又は２に記載のＣｌＣ−Ｋ１
   ｃＤＮＡ。
5. 【請求項５】請求項４における哺乳類がラットであるこ
   とを特徴とする請求項４に記載のＣｌＣ−Ｋ１ ｃＤＮ
   Ａ。
6. 【請求項６】腎のヘンレの係蹄上行脚部に偏在するクロ
   ライドチャネルを構成するＣｌＣ−Ｋ１タンパク分子。
7. 【請求項７】配列番号１の塩基配列によってコードされ
   る請求項６記載のＣｌＣ−Ｋ１タンパク分子のアミノ酸
   配列。
8. 【請求項８】発現ベクターに配列番号１に示す塩基配列
   であらわされるＣｌＣ−Ｋ１遺伝子を組み込んだことを
   特徴とする組み替えプラスミド。
9. 【請求項９】前記発現ベクターがｐＳＰＯＲＴ１であ
   り、前記ｐＳＰＯＲＴ１のＮｏｔＩ及びＳａｌＩとの切
   断部位に前記ＣｌＣ−Ｋ１遺伝子を挿入したことを特徴
   とする請求項８記載の組み替えプラスミド。
10. 【請求項１０】請求項５に記載のＣｌＣ−Ｋ１ ｃＤＮ
    Ａによる、 腎のヘンレの係蹄上行脚部に偏在するクロライドチャネ
    ルを構成するタンパク分子を生産する大腸菌。
11. 【請求項１１】配列番号１に示す塩基配列であらわされ
    るＣｌＣ−Ｋ１遺伝子による、 腎のヘンレの係蹄上行脚部に偏在するクロライドチャネ
    ルを構成するタンパク分子を生産する大腸菌。
12. 【請求項１２】前記ＣｌＣ−Ｋ１遺伝子を発現ベクター
    ｐＳＰＯＲＴ１に挿入して得られた組み替えプラスミド
    を大腸菌ＤＨ１０αに導入し、形質転換して得られた請
    求項１０又は１１に記載の大腸菌。
13. 【請求項１３】ｐＳＰＯＲＴ１のＮｏｔＩ及びＳａｌＩ
    との切断部位に前記ＣｌＣ−Ｋ１遺伝子を挿入したプラ
    スミドを含む請求項１２記載の大腸菌。
14. 【請求項１４】イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド
    添加により発現誘導可能なベクター（ｐＳＰＯＲＴ
    １）、宿主（ＤＨ１０α）系を用いた請求項１３記載の
    プラスミドを持った大腸菌。
15. 【請求項１５】請求項１０〜１４の一に記載の大腸菌に
    より生成されたＣｌＣ−Ｋ１タンパク分子。
16. 【請求項１６】請求項１０〜１４の一に記載の大腸菌を
    用いてＣｌＣ−Ｋ１タンパク分子を採取することを特徴
    とするＣｌＣ−Ｋ１タンパク分子の製造方法。
17. 【請求項１７】腎のヘンレの係蹄上行脚部に偏在するク
    ロライドチャネルを構成するＣｌＣ−Ｋ１タンパク分子
    を含有することを特徴とする脂質膜。
18. 【請求項１８】腎のヘンレの係蹄上行脚部に偏在するク
    ロライドチャネルを構成するＣｌＣ−Ｋ１タンパク分子
    を含有する脂質膜からなることを特徴とするリポソー
    ム。