KR102038155B1 - Mhc 클래스 i 포함 복합체를 사용한 순환 바이러스-특이적 세포독성 t-세포에 의한 표적 세포의 제거 - Google Patents

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Abstract

표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체-유래된 부분을 제1 부분으로서 포함하고 MHC 클래스 I 단백질 복합체에 연결된 바이러스-유래된 펩티드를 제2 부분으로서 포함하는 복합체가 본원에 보고되어 있다. 본원에 보고된 상기 복합체의 사용에 의해, 개체의 기존 바이러스-특이적 순환 세포독성 T-세포(T-기억 세포 또는 T-효과기 세포)는 급성 바이러스 감염을 모방하는 MHC 클래스 I 복합체로 이들 세포들을 장식함으로써 상기 공유 복합체의 항체-유래된 부분이 특이적으로 결합하는 표적 항원을 발현하는 세포로 향할 수 있다. 따라서, 본원에 보고된 한 양태는 (i) β2-마이크로글로불린 및 (ii) 1% 미만의 상대적 빈도를 갖는 MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3을 포함하거나, (i) 바이러스-유래된 펩티드, (ii) β2-마이크로글로불린 및 (iii) 1% 이상의 상대적 빈도를 갖는 MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 1개의 융합 폴리펩티드, 및 하나 이상의 다이설파이드 결합에 의해 연결되어 있는 2개의 폴리펩티드 쇄를 포함하고, 이때 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄가 (i) 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인, (ii) 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 불변 도메인 및 (iii) 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드를 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하고, 제2 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄가 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드를 포함하고, 상기 융합 폴리펩티드가 상기 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄들 중 하나의 C-말단 또는 N-말단에 공유결합되어 있거나, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄에 포함된 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인에 상보적인 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인인 항체 가변 도메인의 N-말단에 공유결합되어 있는 것을 특징으로 하는 복합체이다.

Description

MHC 클래스 I 포함 복합체를 사용한 순환 바이러스-특이적 세포독성 T-세포에 의한 표적 세포의 제거{REMOVAL OF TARGET CELLS BY CIRCULATING VIRUS-SPECIFIC CYTOTOXIC T-CELLS USING MHC CLASS I COMPRISING COMPLEXES}
항체 및 MHC 클래스 I 성분을 포함하는 융합 폴리펩티드, 및 순환 바이러스-특이적 세포독성 T-세포의 표적화된 유인에 의한 종양 세포의 제거를 위한 상기 융합 폴리펩티드의 용도가 본원에 보고되어 있다.
MHC 클래스 I 단백질은 α-쇄(α-1 내지 3 및 경막 도메인) 및 β2-마이크로글로불린으로 구성된다. 상기 단백질은 6개의 상이한 MHC 클래스 I 단백질 α-쇄들(인간에서 2개의 HLA-A, 2개의 HLA-B 및 2개의 HLA-C)를 발생시키는 다유전자성(polygenic)(반수체 게놈에서 MHC 클래스 I 단백질에 대한 3개의 유전자 좌위)을 갖는다. 또한, MHC는 다형성을 갖는다. 인간 HLA-A 대립형질 A*0201은 백인 인구의 약 30% 내지 50%에서 우성이다(문헌[Player, et al., J Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19 (1996) 357-363]).
인간 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) HCMV(= 인간 허페스바이러스(herpesvirus) 5, HHV-5)는 가장 큰 인간 바이러스들 중 하나이다. 이의 게놈은 약 230,000 bp의 선형 이중 가닥 DNA를 포함하고 160개 초과의 단백질들을 코딩한다(문헌[Davison, A.J., et al., J. Gen. Virol. 84 (2003) 17-28]).
CMV는 인간 게놈의 탁월한 기생충이 되도록 진화되었고 강력한 면역원이고 면역 시스템의 모든 무기들로부터 강한 면역 반응을 유발한다. 이 바이러스는 인간 면역 시스템에게 공지된 가장 우수한 면역우성 항원들에 속하는 것으로 보이고 전례 없는 규모의 CD8+ T-세포 반응을 자극한다.
CMV "잠복"은 바이러스 전사의 패턴에서의 변화보다는 CMV 바이러스의 만성 면역 억제에 의해 좌우된다(문헌[Moss & Khan, Human Immunology 65 (2004) 456-464]).
CD8+ T-세포 면역 반응은 모든 CMV 단백질들에 대해 균일하게 유도되지 않고 집중되어 있다. CMV 단백질 pp65 및 IE-1이 주요 표적이다(문헌[McLaughlin-Taylor, E., et al., J. Med. Virol. 43 (1994) 103-110]; 및 문헌[Moss & Khan, Human Immunology 65 (2004) 456-464]).
CMV-특이적 T-세포의 실제 빈도는 총 CD8+ T-세포 레퍼토리의 대략 최대 1% 내지 2%의 개별 펩티드에 대한 빈도로 매우 높다(문헌[Moss & Khan, Human Immunology supra]; 및 문헌[Wills, M.R., et al., J. Virol. 70 (1996) 7569-7579]).
CMV-특이적 CD8+ T-세포 반응은 연령에 따라 현저하게 증가하고, 개별 HLA-펩티드 사량체는 종종 총 CD8+ T-세포 풀의 10%를 초과하여 염색한다(문헌[Khan, N., et al., J. Immunol. 169 (2002) 1984-1992]).
건강한 노령 공여자에서 총 CD8+ T-세포 반응은 CD8+ T-세포 레퍼토리의 약 50%를 차지할 수 있다.
막대한 CD8+ T-세포 증폭이 종종 매우 클론적으로 제한되고, CMV는 노화와 함께 말초혈에서 관찰되는 클론성 CD8+ T-세포 증폭의 30% 이상의 원인인 것으로 추정된다. 총 CD8+ T-세포 수는 CMV-혈청음성 집단에 비해 60세 초과의 CMV-혈청양성 공여자에서 2배만큼 높다(문헌[Looney, R.J., et al., Clin. Immunol. 90 (1999) 213-219]).
가용성 HLA와 β2-마이크로글로불린의 융합은 문헌[Mottez et al., Eur. J. Immunol. 21 (1991) 467-471)], 문헌[Godeau et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 24223-24229] 및 문헌[Mage et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89 (1992) 10658-10662]에 보고되어 있다. 바이러스-유래된 펩티드와 가용성 HLA 및 β2-마이크로글로불린의 융합은 문헌[Mottez et al., J. Exp. Med. 181 (1995) 493-502]에 보고되어 있다. 면역글로불린 중쇄와 가용성 HLA 및 동시발현된 β2-마이크로글로불린의 융합은 문헌[Dal Porto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6671-6675]에 보고되어 있다. 바이오티닐화된 펩티드-가용성 HLA 및 β2-마이크로글로불린과 Fab에 화학적으로 커플링된 스트렙타비딘으로 구성된 사량체 복합체는 문헌[Robert et al., Eur. J. Immun. 30 (2000) 3165-3170]에 기재되어 있다. 바이러스-유래된 펩티드와 가용성 HLA 및 β2-마이크로글로불린의 융합체를 갖는 화학적으로 커플링된 Fab는 문헌[Robert et al., Cancer Immunity 1 (2001) 2]에 보고되어 있다. 뮤린 단일클론 항체 중쇄에 커플링된, 바이러스-유래된 펩티드와 가용성 HLA 및 β2-마이크로글로불린의 융합체는 문헌[Greten et al., J. Immunol. Methods 271 (2002) 125-135]에 보고되어 있다. 펩티드를 갖지 않는 scFv 융합체의 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 발현, 시험관내 재폴딩 및 펩티드 적재는 문헌[Lev et al., J. Immunol. 169 (2002) 2988-2996], 문헌[Lev et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (2004) 9051-9056] 및 문헌[Novak et al., Int. J. Cancer 120 (2006) 329-336]에 보고되어 있다. 펩티드로 적재되고 스트렙타비딘-융합된 Fab 또는 scFv 항체에 커플링된 바이오티닐화된 가용성 MHC의 사용은 문헌[Mous et al., Leukemia 20 (2006) 1096-1102]에 보고되어 있다.
국제 특허출원 공개 제2005/099361호에는 변경된 β2-마이크로글로불린을 갖는 MHC 클래스 I-펩티드-항체 접합체가 보고되어 있다. 국제 특허출원 공개 제2005/099361호에 보고된 예시적 접합체는 MHC-복합체의 α 쇄(HLA)의 시험관내 접합 또는 동일한 세포 내의 별개 유전자들로부터의 동시발현에 의해 수득된다.
미국 특허출원 공개 제2004/0091488호에는 특이적 담체 분자를 갖는 주조직적합성 복합체 클래스 I 항원의 항원성 구축물이 보고되어 있다. 여기에는 한지(hinge) 영역을 결여하는 융합 폴리펩티드가 보고되어 있다.
표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체-유래된 부분을 제1 부분으로서 포함하고 MHC 클래스 I 단백질 복합체에 공유연결된 바이러스-유래된 펩티드를 제2 부분으로서 포함하는 복합체를 재조합적으로 제조하는 방법 및 상기 복합체 자체가 본원에 보고되어 있다.
본원에 보고된 상기 복합체의 사용에 의해, 개체의 기존 바이러스-특이적 순환 세포독성 T-세포(T-기억 세포 및/또는 T-효과기 세포)는 MHC 클래스 I 단백질 복합체에 연결된 바이러스-유래된 펩티드에 의해 급성 바이러스 감염을 모방하는 MHC 클래스 I 복합체로 이들 세포들을 장식함으로써 상기 복합체의 항체-유래된 부분이 특이적으로 결합하는 표적 항원을 발현하는 세포로 향할 수 있다.
본원에서 보고된 한 양태는 (i) β2-마이크로글로불린 및 MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3으로 구성된 융합 폴리펩티드, (ii) 항체 힌지 영역을 각각 포함하는 한 쌍의 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄, 및 (iii) 하나 이상의 쌍의 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 중쇄 가변 도메인을 포함하는 복합체를 진핵 세포에서 재조합적으로 제조하는 방법으로서, (i) 상기 복합체를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 진핵 세포를 배양하는 단계, 및 (ii) 상기 세포 또는 배양 배지로부터 상기 복합체를 회수하는 단계를 포함하고, 이때 상기 복합체가 β2-마이크로글로불린 및 MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3으로 구성된 정확히 1개의 융합 폴리펩티드를 포함하는, 방법이다.
한 실시양태에서, 복합체는 정확히 1개의 MHC-유래된 폴리펩티드, 또는 MHC-유래된 분자를 포함하는 정확히 1개의 융합 폴리펩티드를 포함한다.
한 실시양태에서, 복합체는 배양 배지 중의 1 mg/㎖ 이상의 농도로 수득된다. 한 실시양태에서, 복합체는 배양 배지 중의 4 mg/㎖ 이상의 농도로 수득된다.
한 실시양태에서, 진핵 세포는 포유동물 세포이다. 한 실시양태에서, 포유동물 세포는 인간 배아 신장 세포, 중국 햄스터 난소 세포, 새끼 햄스터 신장 세포 또는 마우스 골수종 세포이다.
한 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 β2-마이크로글로불린, 및 1% 미만의 상대적 발생 빈도를 갖는 MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함한다.
한 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 T-세포 반응 유발 펩티드, β2-마이크로글로불린, 및 1% 이상의 상대적 발생 빈도를 갖는 MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3을 포함한다.
한 실시양태에서, 항체 힌지 영역으로부터 유래된 한 쌍의 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄의 폴리펩티드들은 (i) 하나 이상의 다이설파이드 결합에 의해 연결되고, (ii) 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄는 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인, 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 불변 도메인 및 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드를 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하고, 제2 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄는 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드를 포함한다.
한 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 (i) 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄들 중 하나의 C-말단 또는 N-말단에 공유결합되어 있거나, (ii) 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄에 포함된 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인에 상보적인 동족 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인인 항체 가변 도메인의 N-말단에 공유결합되어 있거나, (iii) 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄에 포함된 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인에 상보적인 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인인 항체 불변 도메인의 C-말단에 공유결합되어 있다.
한 실시양태에서, T-세포 반응 유발 펩티드는 바이러스-유래된 펩티드이다.
한 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는
(i) 서열번호 1 내지 9로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 바이러스-유래된 펩티드,
(ii) 서열번호 16, 17, 18, 21, 22 및 23으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 제1 연결제 펩티드,
(iii) 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 β2-마이크로글로불린,
(iv) 서열번호 16, 17, 18, 21, 22 및 23으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 제2 연결제 펩티드,
(v) 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3, 및
(vi) 서열번호 12, 16, 17, 18, 21, 22 및 23으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 제3 연결제 펩티드
를 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함한다.
한 실시양태에서, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄 및 제2 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄는 (i) 서열번호 31, 32 및 33으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG1 CH2 도메인, 및 (ii) 서열번호 34, 35 및 36으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG1 CH3 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 복합체는 (i) 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 제1 연결제 펩티드, (ii) 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 제2 연결제 펩티드, (iii) 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 제3 연결제 펩티드, (iv) 서열번호 32 또는 33의 아미노산 서열을 갖는 인간 IgG1 CH2 도메인, 및/또는 (v) 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드에서 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 인간 IgG1 CH3 도메인, 및 제2 다이설파이드-연결된 폴리펩티드에서 서열번호 36의 아미노산 서열을 갖는 인간 IgG1 CH3 도메인을 포함한다.
본원에 보고된 한 양태는
- (i) β2-마이크로글로불린 및 (ii) 1% 미만의 상대적 빈도를 갖는 MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3, 또는
(i) T-세포 반응 유발 펩티드, (ii) β2-마이크로글로불린 및 (iii) 1% 이상의 상대적 빈도를 갖는 MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3
을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 1개의 융합 폴리펩티드; 및
- 하나 이상의 다이설파이드 결합에 의해 연결되어 있는 2개의 폴리펩티드 쇄
를 포함하고,
이때, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄가 (i) 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인, (ii) 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 불변 도메인 및 (iii) 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드를 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하고,
제2 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄가 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드를 포함하고,
상기 융합 폴리펩티드가 상기 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄들 중 하나의 C-말단 또는 N-말단에 공유결합되어 있거나, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄에 포함된 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인에 상보적인 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인인 항체 가변 도메인의 N-말단에 공유결합되어 있거나, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄에 포함된 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인에 상보적인 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인인 항체 불변 도메인의 C-말단에 공유결합되어 있는 것
을 특징으로 하는 복합체이다.
모든 양태들의 한 실시양태에서, 복합체는 항원 결합 복합체이다.
모든 양태들의 한 실시양태에서, 복합체는 공유 복합체이다.
모든 양태들의 한 실시양태에서, 1% 이상의 상대적 빈도를 갖는 MHC 클래스 I 분자는 10% 이상의 상대적 빈도를 갖는다. 한 실시양태에서, 10% 이상의 상대적 빈도를 갖는 MHC 클래스 I 분자는 HLA-A*0201, HLA-A*1101, HLA-A*2402, HLA-A*340101, HLA-C*0304, HLA-C*0401 또는 HLA-C*0702이다.
모든 양태들의 한 실시양태에서, 10% 이상의 상대적 빈도를 갖는 MHC 클래스 I 분자는 다음과 같이 복합체가 투여되는 개체의 지역에 따라 선택된다:
- 유럽 출신의 개체의 경우 MHC 클래스 I 분자는 HLA-A*0101, HLA-A*0201, HLA-A*0301, HLA-B*0702, HLA-B*0801, HLA-B*4402, HLA-C*0401, HLA-C*0501, HLA-C*0701 및 HLA-C*0702를 포함하는 군으로부터 선택되고,
- 호주 출신의 개체의 경우, MHC 클래스 I 분자는 HLA-A*0201, HLA-A*1101, HLA-A*2402, HLA-A*340101, HLA-B*1301, HLA-B*1521, HLA-B*5601, HLA-B*5602, HLA-C*0102, HLA-C*0401, HLA-C*0403 및 HLA-C*1502를 포함하는 군으로부터 선택되고,
- 북아메리카 출신의 개체의 경우, MHC 클래스 I 분자는 HLA-A*0201, HLA-A*2402, HLA-C*0202, HLA-C*0304, HLA-C*0401 및 HLA-C*0702를 포함하는 군으로부터 선택되고,
- 동남아시아 출신의 개체의 경우, MHC 클래스 I 분자는 HLA-A*1101, HLA-A*2402, HLA-B*1504, HLA-C*0102, HLA-C*0304, HLA-C*0702 및 HLA-C*0801을 포함하는 군으로부터 선택된다.
모든 양태들의 한 실시양태에서, 10% 이상의 상대적 빈도를 갖는 MHC 클래스 I 분자는 다음과 같이 복합체가 투여되는 개체의 지역에 따라 선택된다:
- 유럽 출신의 개체의 경우, MHC 클래스 I 분자는 HLA-A*0201이고,
- 호주 출신의 개체의 경우, MHC 클래스 I 분자는 HLA-A*2402, HLA-B*1301, HLA-C*0102 및 HLA-C*0401을 포함하는 군으로부터 선택되고,
- 북아메리카 출신의 개체의 경우, MHC 클래스 I 분자는 HLA-A*2402 및 HLA-C*0304를 포함하는 군으로부터 선택되고,
- 동남아시아 출신의 개체의 경우, MHC 클래스 I 분자는 HLA-A*2402이다.
모든 양태들의 한 실시양태에서, β2-마이크로글로불린, 및 1% 미만의 상대적 빈도를 갖는 MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 융합 폴리펩티드는 그의 N-말단에서 MHC-펩티드 결합 홈(groove)에 결합하는 펩티드를 추가로 포함한다.
모든 양태들의 한 실시양태에서, T-세포 반응 유발 펩티드는 CD8+ T-세포 반응 유발 펩티드이다. 한 실시양태에서, T-세포 반응 유발 펩티드는 바이러스-유래된 펩티드이다.
모든 양태들의 한 실시양태에서, 1% 미만의 상대적 빈도를 갖는 MHC 클래스 I 분자는 HLA-B*4201, HLA-B*5901, HLA-B*6701 및 HLA-B*7802를 포함하는 군으로부터 선택된다.
모든 양태들의 한 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 (i) 바이러스-유래된 펩티드, (ii) β2-마이크로글로불린 및 (iii) 가용성 HLA-A 대립형질 A*0201을 포함한다.
모든 양태들의 한 실시양태에서, 바이러스는 아데노바이러스(adenovirus), 인간 허페스바이러스 1, 인간 허페스바이러스 2, 인간 허페스바이러스 4(엡스테인-바(Epstein-Barr) 바이러스), B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 인간 사이토메갈로바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 인간 유두종바이러스(papillomavirus) 유형 16, 인간 유두종바이러스 유형 18, 인간 유두종바이러스 유형 31, 인간 유두종바이러스 유형 33, 인간 유두종바이러스 유형 35, 인간 유두종바이러스 유형 39, 인간 유두종바이러스 유형 45, 인간 유두종바이러스 유형 51, 인간 유두종바이러스 유형 52, 인간 유두종바이러스 유형 56, 인간 유두종바이러스 유형 58, 인간 유두종바이러스 유형 59, 인간 유두종바이러스 유형 68, 인간 유두종바이러스 유형 73, 인간 유두종바이러스 유형 82, 인간 T-세포 림프친화성(lymphotropic) 바이러스 유형 I, 인간 인플루엔자 A 바이러스, 인간 인플루엔자 B 바이러스, 백시니아(vaccinia) 바이러스 및 뎅기열(dengue) 바이러스로부터 선택된다.
모든 양태들의 한 실시양태에서, 바이러스-유래된 펩티드는 NLVPMVATV(서열번호 1), SLYNTVATL(서열번호 2), GLCTLVAML(서열번호 3), GILGFVFTL(서열번호 4), STNRQSGRQ(서열번호 5), LLFGYPVYV(서열번호 6), FAEGFVRAL(서열번호 7), LIVIGILIL(서열번호 8), ILHTPGCV(서열번호 9), WYAQIQPHW(서열번호 52), AFSGVSWTM(서열번호 53), ILIGVVITW(서열번호 54), MMIPTVVAF(서열번호 55), PFPQSNAPI(서열번호 56), LLLTLLATV(서열번호 57), IVLEHGSCV(서열번호 58), LLFKTENGV(서열번호 59), PLNEAIMAV(서열번호 60), NLVRLQSGV(서열번호 61), LVISGLFPV(서열번호 62), LLLVAHYAI(서열번호 63), LALLAAFKV(서열번호 64), VILAGPMPV(서열번호 65), HVLGRLITV(서열번호 66), VTEHDTLLY(서열번호 67), NTDFRVLEL(서열번호 68), CVETMCNEY(서열번호 69), VLEETSVML(서열번호 70), NLVPMVATV(서열번호 71), RIFAELEGV(서열번호 72), IIYTRNHEV(서열번호 73), VLAELVKQI(서열번호 74), AVGGAVASV(서열번호 75), TVRSHCVSK(서열번호 76), IMREFNSYK(서열번호 77), GPISHGHVLK(서열번호 78), ATVQGQNLK(서열번호 79), VYALPLKML(서열번호 80), AYAQKIFKIL(서열번호 81), QYDPVAALF(서열번호 82), YVKVYLESF(서열번호 83), DIYRIFAEL(서열번호 84), VFETSGGLVV(서열번호 85), KARDHLAVL(서열번호 86), QARLTVSGL(서열번호 87), KARAKKDEL(서열번호 88), QIKVRVDMV(서열번호 89), RRRHRQDAL(서열번호 90), ARVYEIKCR(서열번호 91), KMQVIGDQY(서열번호 92), NVRRSWEEL(서열번호 93), CPSQEPMSIYVY(서열번호 94), KPGKISHIMLDVA(서열번호 95), ELRRKMMYM(서열번호 96), IPSINVHHY(서열번호 97), FEQPTETPP(서열번호 98), YAYIYTTYL(서열번호 99), QEFFWDANDIY(서열번호 100), YEQHKITSY(서열번호 101), QEPMSIYVY(서열번호 102), SEHPTFTSQY(서열번호 103), QAIRETVEL(서열번호 104), TRATKMQVI(서열번호 105), DALPGPCI(서열번호 106), CEDVPSGKL(서열번호 107), HERNGFTVL(서열번호 108), PTFTSQYRIQGKL(서열번호 109), QMWQARLTV(서열번호 110), HELLVLVKKAQL(서열번호 111) 및 DDYSNTHSTRYV(서열번호 112), 및 1개 내지 3개의 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실을 포함하는 이들의 변이체로부터 선택된다.
모든 양태들의 한 실시양태에서, β2-마이크로글로불린은 인간 β2-마이크로글로불린이다. 한 실시양태에서, β2-마이크로글로불린은 야생형 인간 β2-마이크로글로불린이다. 한 실시양태에서, β2-마이크로글로불린은 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성되거나 1개 내지 10개의 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실을 포함하는 이의 변이체이다.
모든 양태들의 한 실시양태에서, β2-마이크로글로불린은 인간 β2-마이크로글로불린이고, 10% 이상의 상대적 빈도를 갖는 MHC 클래스 I 분자는 인간 HLA-A*0201이다. 한 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3은 서열번호 11의 아미노산 서열로 구성되거나 1개 내지 10개의 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실을 포함하는 이의 변이체이다.
모든 양태들의 한 실시양태에서, 바이러스-유래된 펩티드는 제1 연결제 펩티드를 통해 β2-마이크로글로불린에 융합된다. 한 실시양태에서, 바이러스-유래된 펩티드는 β2-마이크로글로불린의 N-말단에 융합된다.
모든 양태들의 한 실시양태에서, β2-마이크로글로불린은 제2 연결제 펩티드를 통해 MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1에 융합된다.
모든 양태들의 한 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α3은 제3 연결제 펩티드를 통해 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄들 중 하나에 융합된다.
모든 양태들의 한 실시양태에서, 제1 연결제 펩티드, 제2 연결제 펩티드 및 제3 연결제 펩티드는 동일하거나 상이하다.
모든 양태들의 한 실시양태에서, 제1 연결제 펩티드, 제2 연결제 펩티드 및 제3 연결제 펩티드는 아미노산 서열 GS(서열번호 12), GGS(서열번호 13), GGGS(서열번호 14), GGGSGGGS(서열번호 15), GGGSGGGSGGGS(서열번호 16), GGGSGGGSGGGSGGGS(서열번호 17), GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS(서열번호 18), GGGGS(서열번호 19), GGGGSGGGGS(서열번호 20), GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 21), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 22) 및 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 23)로부터 서로 독립적으로 선택된다.
모든 양태들의 한 실시양태에서, 제1 연결제 펩티드는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함한다.
모든 양태들의 한 실시양태에서, 제2 연결제 펩티드는 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함한다.
모든 양태들의 한 실시양태에서, 제3 연결제 펩티드는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함한다.
모든 양태들의 한 실시양태에서, 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드는 클래스 IgG 또는 클래스 IgE의 인간 항체의 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드로부터 선택된다.
모든 양태들의 한 실시양태에서, 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드는 서브클래스 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 인간 항체의 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드로부터 선택된다.
모든 양태들의 한 실시양태에서, 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드는 EPKSCDKTHTCPPCP(서열번호 24), EPKSADKTHTCPPCP(서열번호 25), ERKCCVECPPCP(서열번호 26), ERKCAVECPPCP(서열번호 27), ERKACVECPPCP(서열번호 28), ELKTPLGDTTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3(서열번호 29), ESKYGPPCPSCP(서열번호 30), DKTHTCPPCP(서열번호 47), VECPPCP(서열번호 48), AVECPPCP(서열번호 49), DTTHTCPRCP(서열번호 50) 또는 PPCPSCP(서열번호 51)의 아미노산 서열을 포함하거나 이 아미노산 서열로 구성된다.
모든 양태들의 한 실시양태에서, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 및/또는 제2 다이설파이드-연결된 폴리펩티드는 인간 유래의 CH2 도메인 및/또는 CH3 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 유래의 CH2 도메인 및 CH3 도메인은 클래스 IgG 또는 IgE의 인간 항체의 CH2 도메인 및 CH3 도메인이다. 한 실시양태에서, CH2 도메인 및 CH3 도메인은 서브클래스 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 인간 항체의 CH2 도메인 및 CH3 도메인이다. 한 실시양태에서, CH2 도메인은 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, CH2 도메인은 서브클래스 IgG1 또는 IgG2의 인간 항체의 CH2 도메인이고 E233, L234, L235, G236, D265, D270, N297, E318, K320, K322, A327, P329, A330 및/또는 P331(카바트(Kabat)의 EU 지수에 따른 넘버링)에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 한 실시양태에서, CH2 도메인은 돌연변이 L234A 및 L235A, 및/또는 돌연변이 D265A 및 N297A를 갖고/갖거나, PVA236 돌연변이를 함유하고/하거나, 돌연변이 P329G를 함유하는 서브클래스 IgG1 또는 인간 서브클래스 IgG2의 인간 항체의 CH2 도메인이다. 한 실시양태에서, CH2 도메인은 돌연변이 L234A 및 L235A 및/또는 P329G를 갖는 서브클래스 IgG1의 인간 항체의 CH2 도메인이다. 한 실시양태에서, CH2 도메인은 돌연변이 S228P 및/또는 L235E를 갖는 서브클래스 IgG4의 인간 항체의 CH2 도메인이다. 한 실시양태에서, CH2 도메인은 서열번호 32 또는 33의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, CH3 도메인은 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함한다.
모든 양태들의 한 실시양태에서, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드는 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 다이설파이드-연결된 폴리펩티드는 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함한다.
모든 양태들의 한 실시양태에서, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 및 제2 다이설파이드-연결된 폴리펩티드는 서열번호 37 또는 38의 아미노산 서열을 포함한다.
모든 양태들의 한 실시양태에서, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 또는 제2 다이설파이드-연결된 폴리펩티드는 서열번호 37 또는 38의 아미노산 서열로 구성된다.
모든 양태들의 한 실시양태에서, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드는 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 다이설파이드-연결된 폴리펩티드는 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함한다.
모든 양태들의 한 실시양태에서, 하나 이상의 다이설파이드 결합에 의해 연결되어 있는 폴리펩티드 쇄들은 2개, 3개 또는 4개의 다이설파이드 결합에 의해 연결되어 있다.
모든 양태들의 한 실시양태에서, 복합체는 융합 폴리펩티드가
(i) 서열번호 1 내지 9를 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 바이러스-유래된 펩티드,
(ii) 서열번호 16, 17, 18, 21, 22 및 23을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 제1 연결제 펩티드,
(iii) 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖거나 1개 내지 10개의 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실을 포함하는 이의 변이체인 β2-마이크로글로불린,
(iv) 서열번호 16, 17, 18, 21, 22 및 23을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 제2 연결제 펩티드,
(v) 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖거나 1개 내지 10개의 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실을 포함하는 이의 변이체인 MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3, 및
(vi) 서열번호 12, 16, 17, 18, 21, 22 및 23을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 제3 연결제 펩티드
를 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 것을 특징으로 한다.
모든 양태들의 한 실시양태에서, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 및 제2 다이설파이드-연결된 폴리펩티드는
- 서열번호 31, 32 및 33으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG1 CH2 도메인, 및
- 서열번호 34, 35 및 36으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG1 CH3 도메인
을 추가로 포함한다.
모든 양태들의 한 실시양태에서, 복합체는
- (i) 서열번호 1 내지 9로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 바이러스-유래된 펩티드,
(ii) 서열번호 16, 17, 18, 21, 22 및 23으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 제1 연결제 펩티드,
(iii) 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖거나 1개 내지 10개의 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실을 포함하는 이의 변이체인 β2-마이크로글로불린,
(iv) 서열번호 16, 17, 18, 21, 22 및 23으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 제2 연결제 펩티드,
(v) 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖거나 1개 내지 10개의 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실을 포함하는 이의 변이체인 MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3, 및
(vi) 서열번호 12, 16, 17, 18, 21, 22 및 23으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 제3 연결제 펩티드
를 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 1개의 융합 폴리펩티드; 및
- 하나 이상의 다이설파이드 결합에 의해 연결되어 있는 2개의 폴리펩티드 쇄
를 포함하고,
이때, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄가 (i) 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인, (ii) 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 불변 도메인, (iii) 서열번호 24 내지 30 및 서열번호 47 내지 51로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드, (iv) 서열번호 31, 32 및 33으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG1 CH2 도메인 및 (v) 서열번호 34, 35 및 36으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG1 CH3 도메인을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하고,
제2 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄가 (i) 서열번호 24 내지 30 및 서열번호 47 내지 51로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드, (ii) 서열번호 31, 32 및 33으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG1 CH2 도메인 및 (iii) 서열번호 34, 35 및 36으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG1 CH3 도메인을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하고,
상기 융합 폴리펩티드가 제2 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄의 C-말단 또는 N-말단에서 공유결합되어 있는 것
을 특징으로 한다.
모든 양태들의 한 실시양태에서, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄 및 제2 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄는 동일한 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드를 포함한다.
모든 양태들의 한 실시양태에서, 바이러스-유래된 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, 제1 연결제 펩티드는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 연결제 펩티드는 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하고, 제3 연결제 펩티드는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하고, 인간 IgG1 CH2 도메인은 서열번호 32 또는 33의 아미노산 서열을 포함하고, 하나의 다이설파이드-연결된 폴리펩티드의 인간 IgG1 CH3 도메인은 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하고, 다른 다이설파이드-연결된 폴리펩티드의 인간 IgG1 CH3 도메인은 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함한다.
모든 양태들의 한 실시양태에서, 복합체는
- (i) 서열번호 1 내지 9로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 바이러스-유래된 펩티드,
(ii) 서열번호 16, 17, 18, 21, 22 및 23으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 제1 연결제 펩티드,
(iii) 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖거나 1개 내지 10개의 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실을 포함하는 이의 변이체인 β2-마이크로글로불린,
(iv) 서열번호 16, 17, 18, 21, 22 및 23으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 제2 연결제 펩티드,
(v) 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖거나 1개 내지 10개의 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실을 포함하는 이의 변이체인 MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3, 및
(vi) 서열번호 12, 16, 17, 18, 21, 22 및 23으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 제3 연결제 펩티드
를 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 1개의 융합 폴리펩티드; 및
- 하나 이상의 다이설파이드 결합에 의해 연결되어 있는 2개의 폴리펩티드 쇄
를 포함하고,
이때, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄가 (i) 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인, (ii) 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 불변 도메인, (iii) 서열번호 24 내지 30 및 서열번호 47 내지 51로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드, (iv) 서열번호 31, 32 및 33으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG1 CH2 도메인 및 (v) 서열번호 34, 35 및 36으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG1 CH3 도메인을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하고,
제2 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄가 서열번호 24 내지 30 및 서열번호 47 내지 51로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드를 포함하고,
상기 융합 폴리펩티드가 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄의 C-말단 또는 N-말단에 공유결합되어 있거나, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄에 포함된 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인에 상보적인 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인인 항체 가변 도메인의 N-말단에 공유결합되어 있거나, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄에 포함된 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인에 상보적인 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인인 항체 불변 도메인의 C-말단에 공유결합되어 있는 것
을 특징으로 한다.
모든 양태들의 한 실시양태에서, 바이러스-유래된 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, 제1 연결제 펩티드는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 연결제 펩티드는 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하고, 제3 연결제 펩티드는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하고, 인간 IgG1 CH2 도메인은 서열번호 32 또는 33의 아미노산 서열을 포함하고, 하나의 다이설파이드-연결된 폴리펩티드의 인간 IgG1 CH3 도메인은 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하고, 다른 다이설파이드-연결된 폴리펩티드의 인간 IgG1 CH3 도메인은 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함한다.
모든 양태들의 한 실시양태에서, 복합체는
- (i) 서열번호 1 내지 9로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 바이러스-유래된 펩티드,
(ii) 서열번호 16, 17, 18, 21, 22 및 23으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 제1 연결제 펩티드,
(iii) 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖거나 1개 내지 10개의 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실을 포함하는 이의 변이체인 β2-마이크로글로불린,
(iv) 서열번호 16, 17, 18, 21, 22 및 23으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 제2 연결제 펩티드,
(v) 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖거나 1개 내지 10개의 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실을 포함하는 이의 변이체인 MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3, 및
(vi) 서열번호 12, 16, 17, 18, 21, 22 및 23으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 제3 연결제 펩티드
를 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 1개의 융합 폴리펩티드; 및
- 하나 이상의 다이설파이드 결합에 의해 연결되어 있는 2개의 폴리펩티드 쇄
를 포함하고,
이때, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄 및 제2 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄가 (i) 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인, (ii) 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 불변 도메인, (iii) 서열번호 24 내지 30 및 서열번호 47 내지 51로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드, (iv) 서열번호 31, 32 및 33으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG1 CH2 도메인, 및 (v) 서열번호 34, 35 및 36으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG1 CH3 도메인을 N-말단에서 C-말단 방향으로 각각 포함하고,
상기 융합 폴리펩티드가 제2 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄의 C-말단 또는 N-말단에 공유결합되어 있거나, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄에 포함된 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인에 상보적인 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인인 항체 가변 도메인의 N-말단에 공유결합되어 있거나, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄에 포함된 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인에 상보적인 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인인 항체 불변 도메인의 C-말단에 공유결합되어 있는 것
을 특징으로 한다.
모든 양태들의 한 실시양태에서, 바이러스-유래된 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, 제1 연결제 펩티드는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 연결제 펩티드는 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하고, 제3 연결제 펩티드는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하고, 인간 IgG1 CH2 도메인은 서열번호 32 또는 33의 아미노산 서열을 포함하고, 하나의 다이설파이드-연결된 폴리펩티드의 인간 IgG1 CH3 도메인은 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하고, 다른 다이설파이드-연결된 폴리펩티드의 인간 IgG1 CH3 도메인은 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함한다.
모든 양태들의 한 실시양태에서,
- 제1 연결제 펩티드는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하고/하거나,
- 제2 연결제 펩티드는 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하고/하거나,
- 제3 연결제 펩티드는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하고/하거나,
- 인간 IgG1 CH2 도메인은 서열번호 32 또는 33의 아미노산 서열을 포함하고/하거나,
- 하나의 다이설파이드-연결된 폴리펩티드의 인간 IgG1 CH3 도메인은 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하고, 다른 다이설파이드-연결된 폴리펩티드의 인간 IgG1 CH3 도메인은 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함한다.
모든 양태들의 한 실시양태에서, 바이러스-유래된 펩티드는 서열번호 1 내지 9 및 서열번호 52 내지 112를 포함하는 군으로부터 선택되거나, 1개 내지 3개의 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실을 포함하는 이의 변이체이다.
본원에 보고된 한 양태는 본원에 보고된 복합체를 코딩하는 핵산이다.
한 실시양태에서, 상기 핵산은 상이한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드들을 코딩하는 구조 유전자들을 포함하는 2개 내지 4개의 발현 카세트를 포함한다.
본원에 보고된 한 양태는 본원에 보고된 핵산을 포함하는 숙주 세포이다.
본원에 보고된 한 양태는 본원에 보고된 복합체가 제조되도록 본원에 보고된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 상기 복합체를 제조하는 방법이다.
한 실시양태에서, 상기 복합체는 세포 또는 배양 배지로부터 회수되고, 이로써 상기 복합체가 제조된다.
본원에 보고된 한 양태는 본원에 보고된 복합체 및 세포독성제를 포함하는 면역접합체이다.
본원에 보고된 한 양태는 본원에 보고된 복합체 및 임의적으로 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 제제이다.
한 실시양태에서, 상기 약학 제제는 추가 치료제를 추가로 포함한다.
본원에 보고된 한 양태는 약제로서 사용되는 본원에 보고된 복합체이다.
본원에 보고된 한 양태는 암 또는 만성 바이러스 감염의 치료에 사용되는 본원에 보고된 복합체이다.
본원에 보고된 한 양태는 개체의 바이러스-특이적 세포독성 T-세포를 표적으로 유인하는 데에 사용되는 본원에 보고된 복합체이다.
본원에 보고된 한 양태는 암세포 또는 바이러스 감염된 세포의 제거에 사용되는 본원에 보고된 복합체이다.
본원에 보고된 한 양태는 약제의 제조에 있어서 본원에 보고된 복합체의 용도이다.
한 실시양태에서, 상기 약제는 암 또는 만성 바이러스 감염의 치료를 위한 약제이다.
한 실시양태에서, 상기 약제는 개체의 바이러스-특이적 세포독성 T-세포를 표적으로 유인하기 위한 약제이다.
한 실시양태에서, 상기 약제는 암세포 또는 바이러스 감염된 세포를 제거하기 위한 약제이다.
본원에 보고된 한 양태는 유효량으로 본원에 보고된 복합체를, 암 또는 만성 바이러스 감염을 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 또는 만성 바이러스 감염을 갖는 개체를 치료하는 방법이다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 추가 치료제를 상기 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 보고된 한 양태는 유효량으로 본원에 보고된 복합체를 개체에게 투여하여 개체의 바이러스-특이적 세포독성 T-세포를 표적으로 유인하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 개체의 바이러스-특이적 세포독성 T-세포를 표적으로 유인하는 방법이다.
본원에 보고된 한 양태는 유효량으로 본원에 보고된 복합체를 개체에게 투여하여 암세포 또는 바이러스 감염된 세포를 제거하거나/붕해시키는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 암세포 또는 바이러스 감염된 세포를 제거하는 방법이다.
도 1은 본원에 보고된 복합체의 주석 개요도를 보여준다.
도 2는 본원에 보고된 복합체에 포함된 예시적 폴리펩티드를 보여준다: 융합 폴리펩티드가 N-말단에서 항체 경쇄, 또는 항체 중쇄 힌지 영역 포함 폴리펩티드에 융합되었다.
도 3은 상응하는 발현 플라스미드로 형질감염된 HEK293 세포의 세포 배양물 상청액의 SDS 폴리아크릴아마이드 겔의 웨스턴 블롯을 보여준다. 퍼록시다제에 접합된 다중클론 토끼 항-인간 κ-경쇄 항체 및 호스라디쉬 퍼록시다제에 접합된 다중클론 토끼 항-인간 IgG 항체를 사용하여 염색을 수행하였다. 레인 1: 2-아암 펩티드-β2-마이크로글로불린-HLA-A0201-IgG-Fc; 레인 2: 1-아암 펩티드-β2-마이크로글로불린-HLA-A0201-IgG-Fc + IgG-Fc; 레인 3: 1-아암 펩티드-β2-마이크로글로불린-HLA-A0201-IgG-중쇄 + IgG-경쇄 + IgG-Fc; 레인 4: 1-아암 펩티드-β2-마이크로글로불린-HLA-A0201-IgG-중쇄 + IgG-중쇄 + IgG-경쇄; 레인 5: 2-아암 β2-마이크로글로불린-HLA-A0201-IgG-경쇄 + IgG-중쇄; 레인 6: 2-아암 펩티드-β2-마이크로글로불린-HLA-A0201-IgG-경쇄 + IgG-중쇄; 레인 7: 2-아암 펩티드-β2-마이크로글로불린-HLA-A0201-IgG-중쇄 + IgG-경쇄; 레인 8: 2-아암 펩티드-β2-마이크로글로불린-HLA-A0201-IgG-Fc-scFv; 레인 9: 1-아암 펩티드-β2-마이크로글로불린-HLA-A0201-IgG-Fc + 1-아암 IgG(중쇄 및 경쇄); 레인 10: 분자량 마커; 레인 11: 기준물 표준물 IgG1 항체.
도 4는 특이적 펩티드를 사용한 시험관내 자극 전 및 후 상이한 공여자들로부터 CMV-특이적 세포용해성 T-세포의 수를 측정하기 위한 유세포분석을 보여준다: 4명의 인간 공여자-유래된 말초혈 림프구(PBLs); Pro5 오량체 APC(프로이뮨(ProImmune), 카탈로그 번호 F008-4A-E)와 병용된 FITC 표지-접합된 항-CD8 항체 염색(BD, 카탈로그 번호 345772)은 CMV-유래된 펩티드(NLVPMVATV, 서열번호 1)로 적재된 MHC 클래스 I(HLA-A*0201)을 인식하는 TCR을 염색하였다. 원: CMV-특이적 CD8+ T-세포.
도 5는 CMV 펩티드로 적재된 MN60 종양 세포의 용해를 통해 자극된 CTL의 세포용해 능력을 분석하기 위한 유세포 분석을 보여준다.
도 6은 CMV-펄싱된 T-세포의 T-세포-특이적 제거를 보여준다: CMV 펩티드로 적재된 MN60 종양 세포의 용해를 통해 자극된 CTL의 세포용해 능력을 효과기 대 표적 세포 비에 따라 분석하기 위한 유세포 분석; 흑색: CMV 펩티드로 적재된 MN60 세포, 백색: CMV 펩티드로 적재되지 않은 MN60 세포.
도 7의 A는 쿠마시에(Coomassie) 염색을 이용한 SDS-PAGE 겔을 보여준다: 레인 1: 분자량 표준물, 레인 2: 1-아암 펩티드-β2-마이크로글로불린-HLA-A0201-IgG-Fc + 1-아암 IgG 복합체(중쇄 및 경쇄), 비환원 조건; 레인 3: 1-아암 펩티드-β2-마이크로글로불린-HLA-A0201-IgG-Fc + 1-아암 IgG 복합체(중쇄 및 경쇄), 환원 조건. 도 7의 B는 크기 배제 크로마토그래피 크로마토그램을 보여준다: 1: 고분자량 형태(0.7 면적%); 2: 단량체 복합체(99.3 면적%).
도 8의 A는 쿠마시에 염색을 이용한 SDS-PAGE 겔을 보여준다: 레인 1: 분자량 표준물, 레인 2: 1-아암 펩티드-β2-마이크로글로불린-HLA-A0201-IgG-중쇄 + IgG-경쇄 + IgG-Fc 복합체, 비환원 조건; 레인 3: 1-아암 펩티드-β2-마이크로글로불린-HLA-A0201-IgG-중쇄 + IgG-경쇄 + IgG-Fc 복합체, 환원 조건. 도 8의 B는 크기 배제 크로마토그래피 크로마토그램을 보여준다: 1: 고분자량 형태(1.8 면적%); 2: 단량체 복합체(98.2 면적%).
도 9는 FACS를 이용하여 본원에 보고된 복합체와 인간 IGF-1R 양성 세포주의 결합을 분석한 결과를 보여준다: 1: 1-아암 펩티드-β2-마이크로글로불린-HLA-A0201-IgG-중쇄 + IgG-경쇄 + IgG-Fc 복합체와 함께 항온처리된 H460M2 세포(염색되지 않음); 2: 4℃에서 1-아암 펩티드-β2-마이크로글로불린-HLA-A0201-IgG-중쇄 + IgG-경쇄 + IgG-Fc 복합체와 함께 항온처리된 H460M2 세포(형광 표지된 항-<인간 IgG> 항체로 염색됨); 3: 37℃에서 1-아암 펩티드-β2-마이크로글로불린-HLA-A0201-IgG-중쇄 + IgG-경쇄 + IgG-Fc 복합체와 함께 항온처리된 H460M2 세포(형광 표지된 항-<인간 IgG> 항체로 염색됨); 4: 1-아암 펩티드-β2-마이크로글로불린-HLA-A0201-IgG-중쇄 + IgG-경쇄 + IgG-Fc 복합체와 함께 항온처리된 H460M2 세포(형광 표지된 대조군 항체(항-DIG 항체)로 염색됨); 5: 형광 표지된 항-인간 IgG 항체로 염색된 H460M2 세포; 6: 형광 표지된 항-인간 IGF-1R 항체로 염색된 H460M2 세포.
도 10은 인간 IGF-1R 발현 I24 3T3 세포(큰 부착 생장 세포, 백색 화살표)의 본원에 보고된 항원 결합 복합체 매개된 용해의 현미경 영상화를 보여준다. 용해는 인간 CMV-특이적 T-세포(둥근 형태의 작은 세포(백색 화살표) 또는 아메바 모양의 이동 세포(흑색 화살표))에 의해 매개된다.
도 11은 본원에 보고된 복합체의 부재 하에 인간 CMV-특이적 T-세포(둥근 형태의 작은 세포(백색 화살표) 또는 아메바 모양의 이동 세포(흑색 화살표))와 함께 항온처리된 I24 3T3 세포(큰 부착 생장 세포, 백색 화살표)의 현미경 영상화를 보여준다.
도 12는 세포독성 어세이를 보여준다: 본원에 보고된 항원 결합 복합체는 인간 CMV-특이적 T-세포를 통해 H460M2 종양 세포의 용해를 유발한다. a) (6시간) 표적 세포 : CMV-특이적 효과기 T-세포 1:1.5; b) (6시간) 표적 세포 : CMV-특이적 효과기 T-세포 1:0.75; c) (6시간) 표적 세포 : CMV-특이적 효과기 T-세포 1:0.5; 좌측 막대: 본원에 보고된 복합체; 우측 막대: MAB IGF-1R-푸코실 결핍.
도 13은 세포독성 어세이를 보여준다: 본원에 보고된 항원 결합 복합체는 인간 CMV-특이적 T-세포를 통해 I24 3T3 종양 세포의 용해를 유발한다. a) (9시간) 표적 세포 : CMV-특이적 효과기 T-세포 1:1.5; b) (9시간) 표적 세포 : CMV-특이적 효과기 T-세포 1:0.75; c) (9시간) 표적 세포 : CMV-특이적 효과기 T-세포 1:0.5; 좌측 막대: 본원에 보고된 복합체; 중간 막대: MAB IGF-1R-afu; 우측 막대: MAB ed; 우측 막대: 항-다이곡시제닌(digoxygenin) 항체.
도 14는 항-IGF-1R 항체 및 본원에 보고된 복합체와 폐 선암종 세포주 H460M2의 결합의 FACS 분석을 보여준다. a) 이차 항체만(염소 항-인간 IgG(H+L)(잭슨 레이보레이토리스(Jackson Laboratories), 카탈로그 번호 109-116-088)); b) 융합 폴리펩티드가 한 쌍의 가변 도메인만을 포함하는 항-IGF-1R 항체의 중쇄의 N-말단에 융합되어 있는 본원에 보고된 복합체; c) 항-IGF-1R 항체.
도 15는 본원에 보고된 상이한 복합체들의 시험관내 효능 및 특이성(세포독성 어세이)을 보여준다. a) 1가 항-IGF-1R 항체 및 CMV-유래된 펩티드를 포함하는 복합체; b) 1가 항-IGF-1R 항체 및 EBV-유래된 펩티드를 포함하는 복합체(대조군); c) 2가 항-IGF-1R 항체 및 CMV-유래된 펩티드를 포함하는 복합체; d) 항-IGF-1R 항체(대조군); e) 항-다이곡시제닌 항체(대조군).
도 16은 상이한 표적(T) 대 효과기(E) 세포 비에서 측정된, 융합 폴리펩티드가 완전한 항-IGF-1R 항체의 중쇄의 N-말단에 융합되어 있는 본원에 보고된 복합체의 시험관내 효능 및 특이성(EC50 값)을 보여준다.
도 17은 1:1.5의 표적 대 효과기 세포의 비에서 a) 1가 항-IGF-1R 항체, 및 CMV-유래된 펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함하는 복합체, 및 b) 항-IGF-1R 항체와 함께 6시간 동안 항온처리한 후 표적 세포의 용해를 보여준다.
서열의 간단한 설명
서열번호 1: 인간 사이토메갈로바이러스-유래된 펩티드.
서열번호 2: 인간 면역결핍 바이러스-유래된 펩티드.
서열번호 3: 인간 허페스바이러스 4-유래된 펩티드.
서열번호 4: 인플루엔자 A 바이러스-유래된 펩티드.
서열번호 5: B형 간염 바이러스-유래된 펩티드.
서열번호 6: 인간 T-세포 림프친화성 바이러스 유형 1-유래된 펩티드.
서열번호 7: V-jun 육종 바이러스 17 발암유전자(Oncogene) 상동체(JUN)-유래된 펩티드.
서열번호 8: 인간 아데노바이러스 유형 3-유래된 펩티드.
서열번호 9: C형 간염 바이러스-유래된 펩티드.
서열번호 10: 인간 β2-마이크로글로불린 아미노산 서열.
서열번호 11: 인간 HLA-A*0201 α1 내지 α3 쇄 아미노산 서열.
서열번호 12 내지 23: 연결제 펩티드 아미노산 서열.
서열번호 24: 인간 IgG1 중쇄 힌지 폴리펩티드 아미노산 서열.
서열번호 25: 인간 IgG1 중쇄 힌지 변이체 폴리펩티드 아미노산 서열.
서열번호 26: 인간 IgG2 중쇄 힌지 폴리펩티드 아미노산 서열.
서열번호 27: 인간 IgG2 중쇄 힌지 변이체 폴리펩티드 아미노산 서열.
서열번호 28: 인간 IgG2 중쇄 힌지 변이체 폴리펩티드 아미노산 서열.
서열번호 29: 인간 IgG3 중쇄 힌지 폴리펩티드 아미노산 서열.
서열번호 30: 인간 IgG4 중쇄 힌지 폴리펩티드 아미노산 서열.
서열번호 31: 인간 IgG1 CH2 도메인 아미노산 서열.
서열번호 32: 인간 IgG1 CH2 도메인 L234A, L235A 돌연변이체 아미노산 서열.
서열번호 33: 인간 IgG1 CH2 도메인 L234A, L235A, P329G 아미노산 서열.
서열번호 34: 인간 IgG1 CH3 도메인 아미노산 서열.
서열번호 35: 인간 IgG1 CH3 도메인 크놉(knob) 변이체 아미노산 서열.
서열번호 36: 인간 IgG1 CH3 도메인 홀(hole) 변이체 아미노산 서열.
서열번호 37: 인간 IgG1 Fc-영역 아미노산 서열.
서열번호 38: 인간 IgG1 Fc-영역 L234A, L235A 돌연변이체 아미노산 서열.
서열번호 39: 인간 IgG1 Fc-영역 L234A, L235A 돌연변이체 및 홀 변이체 아미노산 서열.
서열번호 40: 인간 IgG1 Fc-영역 L234A, L235A 돌연변이체 및 크놉 변이체 아미노산 서열.
서열번호 41: 인간화된 항-IGF-1R 단일클론 경쇄 항체 아미노산 서열(카파).
서열번호 42: 인간화된 항-IGF-1R 단일클론 중쇄 항체 아미노산 서열(IgG1 L234A, L235A 돌연변이체).
서열번호 43: 인간화된 항-IGF-1R 단일클론 중쇄 항체 아미노산 서열(IgG1 L234A, L235A 돌연변이체 및 크놉 변이체).
서열번호 44: 인간화된 항-IGF-1R 단일클론 중쇄 항체 아미노산 서열(IgG1 L234A, L235A 돌연변이체 및 홀 변이체).
서열번호 45: 인간 IgG1 Fc-영역 돌연변이체 힌지 영역 및 L234A, L235A 돌연변이체 및 크놉 변이체.
서열번호 46: 인간화된 항-IGF-1R 단일클론 항체의 다이설파이드-안정화된 단일쇄 Fv.
서열번호 47 내지 51: 단축된 인간 항체 중쇄 힌지 폴리펩티드 아미노산 서열.
서열번호 52 내지 66: 뎅기열 바이러스-유래된 펩티드.
서열번호 67 내지 112: 인간 사이토메갈로바이러스-유래된 펩티드.
I. 정의
"친화성"은 분자(예를 들면, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너(예를 들면, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총 합계 강도를 의미한다. 달리 표시되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 바와 같이, "결합 친화성"은 결합 쌍(예를 들면, 항체 및 항원)의 구성원들 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화성을 의미한다. 그의 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화성은 일반적으로 해리 상수(Kd)로 표시될 수 있다. 친화성은 본원에 기재된 방법들을 포함하는 당업계에서 공지된 통상의 방법에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화성의 측정에 대한 구체적인 설명적 및 예시적 실시양태들이 후술되어 있다.
본원에서 사용된 용어 "아미노산"은 핵산에 의해 직접적으로 또는 전구체의 형태로 코딩될 수 있는 카복시 α-아미노산의 기를 의미한다. 개별 아미노산은 3개의 뉴클레오티드로 구성되어 코돈 또는 염기-삼중체로 지칭되는 핵산에 의해 코딩된다. 각각의 아미노산은 하나 이상의 코돈에 의해 코딩된다. 이것은 "유전 코드의 축퇴"로서 공지되어 있다. 본원에서 사용된 용어 "아미노산"은 알라닌(3 문자 코드: ala, 1 문자 코드: A), 아르기닌(arg, R), 아스파라긴(asn, N), 아스파르트산(asp, D), 시스테인(cys, C), 글루타민(gln, Q), 글루탐산(glu, E), 글리신(gly, G), 히스티딘(his, H), 이소류신(ile, I), 류신(leu, L), 라이신(lys, K), 메티오닌(met, M), 페닐알라닌(phe, F), 프롤린(pro, P), 세린(ser, S), 쓰레오닌(thr, T), 트립토판(trp, W), 티로신(tyr, Y) 및 발린(val, V)을 포함하는 천연 카복시 α-아미노산을 의미한다.
용어 "항-표적 항체" 및 "표적에 결합하는 항체"는 상기 항체가 표적을 표적화는 데에 있어서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화성으로 상기 표적에 결합할 수 있는 항체를 의미한다. 일부 실시양태들에서, 표적에 결합하는 항체는 ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM(예를 들면, 10-8 M 이하, 예를 들면, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수(Kd)를 갖는다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 다중특이적 항체(예를 들면, 이중특이적 항체) 및 항체 단편을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 항체 구조체들을 포괄하되, 이들은 원하는 항원 결합 활성을 나타내어야 한다.
"항체 단편"은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 상기 온전한 항체의 일부를 포함하는, 온전한 항체 이외의 분자를 의미한다. 항체 단편의 예에는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 다이아바디; 선형 항체; 단일 쇄 항체 분자(예를 들면, scFv); 단일 도메인 항체; 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함되나 이들로 한정되지 않는다.
항체의 "클래스"는 이의 중쇄가 보유하는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 의미한다. 항체의 5종의 주요 클래스, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 서브클래스(동종형), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 세분될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 클래스들에 상응하는 중쇄 불변 도메인들은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지칭된다.
용어 "의 상대적 빈도를 갖는 MHC 클래스 I 분자"는 각각의 MHC 클래스 I 분자가 특정 인간 집단에서 또는 모든 인간들에서 주어진 상대적 빈도의 발생 빈도를 갖는다는 것을 의미한다. 즉, 10% 이상의 상대적 빈도를 갖는 MHC 클래스 I 분자는 특정 집단의 모든 인간들의 10% 이상, 예를 들면, 유럽 출신의 모든 인간들의 27.2%에서 발견될 수 있다.
복합체와 그의 접합 파트너의 "접합"은 상이한 방법들, 예컨대, 화학적 결합 또는 특정 결합 쌍을 통한 결합에 의해 수행될 수 있다. 용어 "접합 파트너"는 예를 들면, 폴리펩티드, 검출가능한 표지, 특정 결합 쌍의 구성원을 의미한다. 한 실시양태에서, 복합체와 그의 접합 파트너의 접합은 복합체의 부분의 아미노산 서열의 N-말단 및/또는 ε-아미노 기(라이신), 상이한 라이신들의 ε-아미노 기, 카복시 작용기, 설프하이드릴 작용기, 하이드록실 작용기 및/또는 페놀 작용기, 및/또는 복합체의 탄수화물 구조의 당 알코올 기를 통한 화학적 결합에 의해 수행된다. 한 실시양태에서, 복합체는 특이적 결합 쌍을 통해 그의 접합 파트너에 접합된다.
본원에서 사용된 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제하거나 방해하고/하거나 세포 사멸 또는 파괴를 야기하는 물질을 의미한다. 세포독성제는 방사성 동위원소(예를 들면, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학치료제 또는 약물(예를 들면, 메토트렉세이트(methotrexate), 아드리아마이신(adriamicin), 빈카 알칼로이드(vinca alkaloids)(빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 에토포사이드(etoposide)), 독소루비신(doxorubicin), 멜팔란(melphalan), 미토마이신 C(mitomycin C), 클로람부실(chlorambucil), 다우노루비신(daunorubicin) 또는 다른 인터칼레이팅제); 성장 억제제; 효소 및 이의 단편, 예컨대, 핵분해 효소; 항생제; 세균, 진균, 식물 또는 동물 유래의 독소, 예컨대, 소분자 독소 또는 효소 활성 독소(이들의 단편 및/또는 변이체를 포함함); 및 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
발색체(형광 또는 발광 기 및 안료), 효소, NMR 활성 기 또는 금속 입자, 햅텐(hapten), 예를 들면, 다이곡시제닌이 "검출가능한 표지"의 예이다. 검출가능한 표지는 광활성화가능한 가교연결 기, 예를 들면, 아지도 또는 아지린 기일 수도 있다. 전기화학발광에 의해 검출될 수 있는 금속 킬레이트도 적합한 신호 방사 기이고, 이때 루테늄 킬레이트, 예를 들면, 루테늄 (비스피리딜)3 2+ 킬레이트가 특히 흥미롭다. 적합한 루테늄 표지 기는 예를 들면, 유럽 특허 제0 580 979호, 국제 특허출원 공개 제90/05301호, 국제 특허출원 공개 제90/11511호 및 국제 특허출원 공개 제92/14138호에 기재되어 있다. 직접적인 검출을 위해, 표지 기는 임의의 공지된 검출가능한 마커 기, 예컨대, 안료, 발광 표지 기, 예컨대, 화학발광 기, 예를 들면, 아크리디늄 에스터 또는 다이옥세탄, 또는 형광 안료, 예를 들면, 플루오레세인, 쿠마린, 로다민, 옥사진, 레소루핀, 시아닌 및 이들의 유도체로부터 선택될 수 있다. 표지 기의 다른 예는 발광 금속 착물, 예컨대, 루테늄 또는 유로퓸 착물, 효소, 예를 들면, ELISA 또는 CEDIA(클로닝된 효소 공여자 면역어세이, 예를 들면, 유럽 특허출원 제0 061 888호)에 사용되는 효소, 및 방사성 동위원소이다.
"효과기 기능"은 항체 동형체에 따라 달라지는, 항체의 Fc-영역에 기인할 수 있는 생물학적 활성을 의미한다. 항체 효과기 기능의 예에는 C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체 의존적 세포 매개된 세포독성(ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체(예를 들면, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화가 포함된다.
약제, 예를 들면, 약학 제제의 "유효량"은 필요한 기간 동안 필요한 용량에서 원하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기에 효과적인 양을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "발현"은 세포 내에서 일어나는 전사 및/또는 번역 및 분비 과정을 의미한다. 세포 내에서 관심 있는 핵산 서열의 전사 수준은 상기 세포에 존재하는 상응하는 mRNA의 양에 근거하여 결정될 수 있다. 예를 들면, 관심 있는 서열로부터 전사된 mRNA는 RT-PCR 또는 노던 혼성화에 의해 정량될 수 있다(문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)] 참조). 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드는 다양한 방법들, 예를 들면, ELISA, 상기 폴리펩티드의 생물학적 활성에 대한 어세이 수행, 또는 이러한 활성과 무관한 어세이, 예컨대, 상기 폴리펩티드를 인식하여 결합하는 면역글로불린을 사용하는 웨스턴 블롯팅 또는 방사면역어세이의 이용에 의해 정량될 수 있다(상기 문헌[Sambrook, et al., (1989)] 참조).
"발현 카세트"는 적어도 세포 내에 함유된 핵산의 발현에 필요한 조절 요소, 예컨대, 프로모터 및 폴리아데닐화 부위를 함유하는 구축물을 의미한다.
용어 "발현 기구"는 핵산 또는 유전자의 전사 단계(즉, "유전자 발현 기구"로도 지칭됨)로 시작되어 상기 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드의 번역 후 변경 단계에 이르는 단계들에 관여하는 세포의 효소, 보조인자 등의 전부를 의미한다. 발현 기구는 예를 들면, DNA를 전구-mRNA로 전사하는 단계, 전구-mRNA를 성숙 mRNA로 스플라이싱하는 단계, 상기 mRNA를 폴리펩티드로 번역하는 단계 및 상기 폴리펩티드를 번역 후 변경시키는 단계를 포함한다.
"발현 플라스미드"는 숙주 세포에 포함된 구조 유전자(들)의 발현을 위한 모든 필요한 요소들을 제공하는 핵산이다. 전형적으로, 발현 플라스미드는 복제 기점 및 선별가능한 마커를 포함하는 원핵, 예를 들면, 에스케리치아 콜라이용 플라스미드 증폭 유닛; 진핵 선별 마커; 및 프로모터, 구조 유전자, 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 전사 종결요소를 각각 포함하는, 관심 있는 구조 유전자(들)의 발현을 위한 하나 이상의 발현 카세트를 포함한다. 유전자 발현은 통상적으로 프로모터의 조절 하에 놓여 있고, 이러한 구조 유전자는 프로모터"에 작동가능하게 연결"되어 있다고 기재된다. 유사하게, 조절 요소와 코어 프로모터는 상기 조절 요소가 상기 코어 프로모터의 활성을 조절하는 경우 작동가능하게 연결되어 있다.
본원에서 용어 "Fc-영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는, 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc-영역 및 변이체 Fc-영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc-영역은 Cys226 또는 Pro230부터 중쇄의 카복실 말단까지 걸쳐 있다. 그러나, Fc-영역의 C-말단 라이신(Lys447)은 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 특정되어 있지 않은 한, Fc-영역 또는 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌[Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242]에 기재된 바와 같은, EU 지수로도 지칭되는 EU 넘버링 시스템에 따른다.
"Fc-영역"은 잘 공지된 용어이고 항체 중쇄의 파파인 절단에 근거하여 정의된다. 한 실시양태에서, 본원에 보고된 복합체는 인간 Fc-영역 또는 인간 기원으로부터 유래된 Fc-영역을 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드로서 포함할 수 있다. 추가 실시양태에서, Fc-영역은 Fcγ 수용체(예를 들면, FcγRIIIa) 결합 및/또는 C1q 결합이 검출될 수 없는 방식으로 변경되어 있는, 서브클래스 IgG4의 인간 항체의 Fc-영역, 또는 서브클래스 IgG1, IgG2 또는 IgG3의 인간 항체의 Fc-영역이다. 한 실시양태에서, Fc-영역은 인간 Fc-영역이고 특히 인간 IgG4 서브클래스로부터의 인간 Fc-영역, 또는 인간 IgG1 서브클래스로부터의 돌연변이된 Fc-영역이다. 한 실시양태에서, Fc-영역은 돌연변이 L234A 및 L235A를 갖는 인간 IgG1 서브클래스로부터 유래된다. IgG4는 감소된 Fcγ 수용체 (FcγRIIIa) 결합을 보이는 반면, 다른 IgG 서브클래스의 항체들은 강한 결합을 보인다. 그러나, Pro238, Asp265, Asp270, Asn297(Fc 탄수화물의 상실), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 및/또는 His435도 변경된 경우 감소된 Fcγ 수용체 결합을 제공하는 잔기이다(문헌[Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604]; 문헌[Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119]; 문헌[Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324]; 유럽 특허 제0 307 434호). 한 실시양태에서, 본원에 보고된 복합체는 IgG4 서브클래스, 또는 IgG1 또는 IgG2 서브클래스의 Fcγ 수용체 결합과 관련하여 L234, L235 및/또는 D265에서 돌연변이를 갖고/갖거나 PVA236 돌연변이를 함유한다. 한 실시양태에서, 돌연변이는 S228P, L234A, L235A, L235E 및/또는 PVA236(PVA236은 IgG1의 아미노산 위치 233 내지 236의 아미노산 서열 ELLG(1 문자 아미노산 코드로 제시됨) 또는 IgG4의 EFLG가 PVA로 치환되어 있다는 것을 표시함)이다. 한 실시양태에서, 돌연변이는 IgG4의 S228P, 및 IgG1의 L234A 및 L235A이다. 항체의 Fc-영역은 ADCC(항체 의존적 세포 매개된 세포독성) 및 CDC(보체 의존적 세포독성)에 직접적으로 관여한다. Fcγ 수용체 및/또는 보체 인자 C1q에 결합하지 않는 복합체는 항체 의존적 세포 세포독성(ADCC) 및/또는 보체 의존적 세포독성(CDC)을 유발하지 않는다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되고, 외래 핵산이 도입되어 있는 세포(이러한 세포의 자손을 포함함)를 의미한다. 숙주 세포는 일차 형질전환된 세포 및 계대배양의 수와 관계없이 이로부터 유래된 자손을 포함하는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함한다. 자손은 핵산 함량 면에서 모 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있으나 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래의 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선별된 기능 또는 생물학적 활성과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 여기에 포함된다.
"세포"는 플라스미드의 증폭에 사용되는 원핵 세포, 및 핵산의 발현에 사용되는 진핵 세포 둘다를 포함한다. 한 실시양태에서, 진핵 세포는 포유동물 세포이다. 한 실시양태에서, 포유동물 세포는 CHO 세포(예를 들면, CHO K1, CHO DG44), BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, HEK293 세포, HEK293 EBNA 세포, PER.C6® 세포 및 COS 세포를 포함하는 포유동물 세포 군으로부터 선택된다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성된 항체, 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체 코딩 서열을 사용하는 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하는 항체이다. 인간 항체의 이 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 특히 배제한다.
"면역접합체"는 세포독성제를 포함하나 이들로 한정되지 않는 하나 이상의 이종 분자(들)에 접합된 본원에 보고된 복합체를 의미한다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 가축(예를 들면, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예를 들면, 인간 및 비인간 영장류, 예컨대, 원숭이), 토끼 및 설치류(예를 들면, 마우스 및 래트)를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태들에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.
"단리된" 복합체는 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리되어 있는 복합체이다. 몇몇 실시양태들에서, 복합체는 예를 들면, 전기영동(예를 들면, SDS-PAGE, 등전점 포커싱(IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피(예를 들면, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정되었을 때 95% 또는 99% 초과의 순도까지 정제된다.
"단리된" 핵산은 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리되어 있는 핵산 분자를 의미한다. 단리된 핵산은 통상적으로 핵산 분자를 함유하는 세포 내에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 상기 핵산 분자는 염색체 외부에 존재하거나 그의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
용어 "1개의 융합 폴리펩티드"는 정의된 바와 같이 정확히 1개의 융합 폴리펩티드를 의미하고 정의된 바와 같이 추가 융합 폴리펩티드의 존재를 배제한다. 용어 "1개"는 "정확히 1개" 또는 "단일"을 의미한다.
"작동가능하게 연결된"은 2개 이상의 성분들의 병치를 의미하고, 이때 기재된 성분들은 그들이 그들의 의도된 방식으로 기능하는 것을 허용하는 관계로 존재한다. 예를 들면, 프로모터 및/또는 인핸서(enhancer)는 이것이 연결된 서열의 전사를 제어하거나 조절하기 위해 시스(cis)로 작용하는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 일반적으로(그러나, 반드시는 아니지만), "작동가능하게 연결된" DNA 서열들은 인접하여 존재하고, 2개의 단백질 코딩 영역들, 예컨대, 분비 리더 및 폴리펩티드를 연결할 필요가 있는 경우 인접하여 (판독) 프레임((reading) frame) 내에 존재한다. 그러나, 작동가능하게 연결된 프로모터는 일반적으로 코딩 서열의 업스트림에 존재하지만, 반드시 상기 코딩 서열과 인접하여 존재하지는 않는다. 인핸서는 인접하여 존재할 필요가 없다. 인핸서는 코딩 서열의 전사를 증가시키는 경우 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 작동가능하게 연결된 인핸서는 프로모터로부터 상당히 거리를 두고 코딩 서열의 업스트림에, 코딩 서열 내에 또는 코딩 서열의 다운스트림에 위치할 수 있다. 폴리아데닐화 부위는 코딩 서열의 다운스트림 말단에 위치하는 경우 전사가 코딩 서열을 통과하여 폴리아데닐화 서열로 진행하도록 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 번역 정지 코돈은 코딩 서열의 다운스트림 말단(3' 말단)에 위치하는 경우 번역이 코딩 서열을 통과하여 정지 코돈으로 진행하고 거기에서 종결되도록 엑손성 핵산 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 연결은 당분야에서 공지된 재조합 방법, 예를 들면, PCR 방법의 이용 및/또는 편리한 제한 부위에서의 라이게이션에 의해 달성된다. 편리한 제한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(adaptor) 또는 연결제가 통상적인 관행에 따라 사용된다.
용어 "포장 삽입물"은 치료 제품의 상업적 포장물 내에 통상적으로 포함되는 설명서로서, 증상, 용법, 용량, 투여, 병용 치료, 사용금지사유, 및/또는 이러한 치료 제품의 사용에 관한 경고에 대한 정보를 함유하는 설명서를 의미하기 위해 사용된다.
용어 "펩티드 연결제"는 천연 및/또는 합성 유래의 아미노산 서열을 의미한다. 이것은 선형 아미노산 쇄로 구성되고, 이때 20종의 천연 아미노산이 단량체 구축 블록이다. 펩티드 연결제는 1개 내지 50개 아미노산, 한 실시양태에서 1개 내지 28개 아미노산, 추가 실시양태에서 2개 내지 25개 아미노산의 길이를 갖는다. 펩티드 연결제는 반복 아미노산 서열 또는 천연 폴리펩티드의 서열을 함유할 수 있다. 상기 연결제는 서로 접합된 폴리펩티드들이 정확하게 폴딩되어 적절하게 제시되게 함으로써 그들의 생물학적 활성을 수행할 수 있게 하는 기능을 갖는다. 한 실시양태에서, 펩티드 연결제에는 글리신, 글루타민 및/또는 세린 잔기들이 풍부하다. 이들 잔기들은 예를 들면, 최대 5개의 아미노산으로 구성된 작은 반복 유닛, 예컨대, GS(서열번호 12), GGS(서열번호 13), GGGS(서열번호 14) 및 GGGGS(서열번호 19)로 정렬되어 있다. 이 작은 반복 유닛은 1회 내지 5회 반복될 수 있다. 최대 6개의 추가 임의적 천연 아미노산이 다량체 유닛의 아미노-말단 및/또는 카복시-말단에 추가될 수 있다. 다른 합성 펩티드 연결제는 10회 내지 20회 반복되는 단일 아미노산으로 구성되고 아미노-말단 및/또는 카복시-말단에서 최대 6개의 추가 임의적 천연 아미노산을 포함할 수 있다. 모든 펩티드 연결제들이 핵산 분자에 의해 코딩될 수 있으므로 재조합적으로 발현될 수 있다. 상기 연결제들 자체가 펩티드이기 때문에, 상기 연결제에 의해 연결된 폴리펩티드는 2개의 아미노산들 사이에 형성되는 펩티드 결합을 통해 상기 연결제에 연결된다.
용어 "약학 제제"는 내부에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이게 하는 형태로 존재하고 상기 제제가 투여될 대상체에게 허용불가능한 독성을 나타내는 추가 성분을 함유하지 않는 제제를 의미한다.
용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 활성 성분 이외에 대상체에게 독성을 나타내지 않는 약학 제제 중의 성분을 의미한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
용어 "폴리펩티드"는 천연적으로 제조되든 아니면 합성적으로 제조되든 관계없이 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산들로 구성된 중합체를 의미한다. 약 25개 미만의 아미노산 잔기들로 구성된 폴리펩티드는 "펩티드"로서 지칭될 수 있는 반면, 2개 이상의 폴리펩티드로 구성되거나 100개 초과의 아미노산 잔기들로 구성된 1개의 폴리펩티드를 포함하는 분자는 "단백질"로서 지칭될 수 있다. 폴리펩티드는 비아미노산 성분, 예컨대, 탄수화물 기, 금속 이온 또는 카복실산 에스터도 포함할 수 있다. 상기 비아미노산 성분은 상기 폴리펩티드를 발현하는 세포에 의해 추가될 수 있고 세포의 유형에 따라 달라질 수 있다. 폴리펩티드는 그의 아미노산 골격 구조 또는 그를 코딩하는 핵산의 관점에서 본원에 정의되어 있다. 추가, 예컨대, 탄수화물 기는 일반적으로 특정되지 않지만, 그럼에도 불구하고 존재할 수 있다.
"구조 유전자"는 신호 서열을 갖지 않는 유전자의 영역, 즉 코딩 영역을 의미한다.
용어 "T-세포 반응 유발 펩티드"는 MHC 클래스 I 복합체의 펩티드 결합 홈에 제시되어 순환 기억 또는 효과기 T-세포에 의해 인식되는 펩티드를 의미한다. 상기 펩티드의 인식은 이러한 펩티드-MHC 클래스 I 복합체를 제시하는 세포의 제거를 수행하는 면역 반응을 발생시킨다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료"(및 이의 문법적 어미변화, 예컨대, "치료한다" 또는 "치료하는")는 치료되는 개체의 자연 경과를 변경시키기 위한 시도에서의 임상 시술을 의미하고, 예방을 위해 또는 임상 병리학적 상태의 과정 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이의 예방, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 호전 또는 경감, 및 관해 또는 개선된 예후를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 몇몇 실시양태들에서, 본 발명의 항체는 질환의 발달을 지연시키거나 질환의 진행을 늦추기 위해 사용된다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체와 항원의 결합에 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 의미한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 이때 각각의 도메인은 4개의 보존된 골격 영역(FR들) 및 3개의 초가변 영역(HVR들)을 포함한다(예를 들면, 문헌[Kindt, T.J., et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91] 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원 결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 나아가, 특정 항원에 결합하는 항체는 상기 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 각각 상보적인 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Portolano, S., et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887] 및 문헌[Clackson, T., et al., Nature 352 (1991) 624-628]을 참조한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 그 자신에 연결된 또 다른 핵산을 증폭시킬 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 상기 용어는 자가 복제 핵산 구조체로서의 벡터뿐만 아니라 그 자신이 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 혼입된 벡터도 포함한다. 일부 벡터들은 그들이 작동가능하게 연결되어 있는 핵산의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로서 지칭된다.
II. 조성물 및 방법
A. 예시적 복합체
표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체-유래된 부분을 제1 부분으로서 포함하고 MHC 클래스 I 단백질 복합체에 연결된 바이러스-유래된 펩티드를 제2 부분으로서 포함하는 항원 결합 복합체가 본원에 보고되어 있다.
본원에 보고된 복합체의 사용에 의해, 개체의 기존 바이러스-특이적 순환 세포독성 T-세포(T-기억 세포 및/또는 T-효과기 세포)는 급성 바이러스 감염을 모방하는 MHC 클래스 I 복합체로 이들 세포들을 장식함으로써 상기 복합체의 항체-유래된 부분이 특이적으로 결합하는 표적 항원을 발현하는 세포로 향할 수 있다.
한 양태에서, 본 발명은 부분적으로, MHC 클래스 I 단백질에 연결된 바이러스-유래된 펩티드를 제1 부분으로서 포함하고 항체-유래된 다이설파이드-연결된 분자를 제2 부분으로서 포함하는 본원에 보고된 복합체를 사용하여 개체의 기존 바이러스-특이적 세포독성 T-세포를, 급성 바이러스 감염을 모방하는 표적 항원을 발현하는 세포로 향하게 함으로써 상기 표적 항원을 발현하는 세포의 제거를 개시할 수 있다는 발견에 근거한다.
일부 실시양태들에서, (i) 바이러스-유래된 펩티드, (ii) 가용성 HLA-A 대립형질 A*0201 및 (iii) β2-마이크로글로불린을 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함하는 복합체가 제공된다.
본 발명의 복합체는 예를 들면, 암 또는 바이러스 감염과 같은 다양한 질환의 진단 또는 치료에 유용하다.
한 양태에서, 본 발명은 (i) 세포 표면 항원 및 (ii) 세포독성 T-세포에 결합하는 융합 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태들에서, 상기 융합 폴리펩티드는 ≤ 10 nM의 친화성으로 세포 표면 항원에 결합한다.
본원에 보고된 복합체는 천연 고도 효과적 항-바이러스 면역 반응을 이용하여 표적 세포, 예를 들면, 종양 세포 또는 바이러스 감염된 세포를 제거하거나/붕해시킨다. 상기 세포 제거는 활성화를 위해 임의의 보조자극을 필요로 하지 않는 개체 자신의 매우 강력한 순환 T-세포의 사용에 의해 달성된다. 추가로, 작용 기작을 위해 세포 표면 상의 소수의 치료 분자가 필요하다(문헌[Mottez et al., 1995]).
치료 동안 융합 폴리펩티드는 면역화와 유사한 개체의 항-바이러스 면역 반응을 유발하여 다수의 치료/적용에 의한 효능을 향상시킨다.
제한된 환자 집단만이 특이적 동종이형(allotype)의 환자이고(HLA-A 동종이형: 대립형질 A*0201을 갖는 집단의 30% 내지 50%) 특정 바이러스 감염에 대한 유병률도 제한되지만(CMV 감염: 주로 연령에 따라 60% 내지 90%), 전처리로서의 면역화는 효능을 향상시키기 위해 이용될 수 있다.
대안적으로, 집단 내에서의 빈도가 매우 낮은, 한 실시양태에서 1% 미만인 동종이형이 사용될 수 있다. 상기 동종이형이 개체의 면역 시스템에 의해 외부물질로서 인식될 것이고 면역 반응이 개시될 것이기 때문에 이러한 동종이형의 사용은 면역화 단계의 이용을 불필요하게 만들 수 있다.
표적화 항체는 독성 및 부작용을 제한하기 위해 고도로 세포-특이적 또는 항원-특이적일 필요가 있다.
따라서, 본원에 보고된 복합체를 사용함으로써
(i) 고도 특이적 T-세포 집단만이 활성화되고(단일 MHC-펩티드 복합체에 대해 특이적인 CD8 양성 효과기/기억 세포), 모든 다른 CD3+ 세포는 영향을 받지 않고(CD4+ T-세포: TH1, TH2, TH17, 조절 T-세포);
(ii) 개체의 면역 시스템의 천연 반응이 모방되고(바이러스 감염된 세포의 정상적인 제거);
(iii) 적용에 대한 반응이 초기에 낮을 것이지만 치료 동안 부스팅될 수 있고(특이적 T-세포가 활성화될 것이고 수치에서 증폭될 것임), 이와 함께 초기 관주 반응 및 초기 사이토카인 방출이 감소될 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 선택된 바이러스-유래된 펩티드, 예를 들면, 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)-유래된 펩티드를 적용하여 CD8-양성 세포독성 T-세포를 자극하는 단계를 포함한다.
활성화된 CMV-펩티드 특이적 T-세포가 시험관내에서 효과적인 종양 세포(시험관내에서 CMV-유래된 펩티드로 적재된 종양 세포) 제거를 매개할 수 있다는 것이 밝혀졌다.
바이러스 감염된 세포들은 그들의 세포 표면 상에서 MHC 클래스 I 단백질과 함께 바이러스-유래된 펩티드를 제시한다. 이들은 제시 세포를 제거하는/고갈시키는 특이적 CD8+ T-세포에 의해 인식된다. 세포용해성(세포독성) CD8+ T-세포(CTL)들은 그들의 특이적 T-세포 수용체를 통해 MHC 클래스 I 단백질 내의 펩티드를 인식한다. 상기 CTL은 보조자극 신호를 요구하지 않으면서 바이러스 감염된 세포의 제거를 유발한다.
본원에서 보고된 융합 폴리펩티드에 포함된 CMV-유래된 펩티드로 미리 자극될 수 있는 효과기 세포, 예를 들면, 말초혈 단핵 세포(PBMC) 또는 FACS-분류된 CD8+ T-세포가 사용될 수 있다.
치료될 개체의 HLA-동종이형이 인식되어야 한다.
NCBI에 따르면, 10% 이상의 빈도를 갖는 HLA-동종이형은 하기 표에 나타낸 바와 같이 분포된다.
Figure 112013116864789-pct00001
따라서, 본원에 보고된 한 양태는
- (i) β2-마이크로글로불린 및 (ii) 10% 미만의 상대적 빈도를 갖는 MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3, 또는
(i) T-세포 반응 유발 펩티드, (ii) β2-마이크로글로불린 및 (iii) 10% 이상의 상대적 빈도를 갖는 MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3
을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 1개의 단일 융합 폴리펩티드; 및
- 하나 이상의 다이설파이드 결합에 의해 연결되어 있는 2개의 폴리펩티드 쇄
를 포함하고,
이때, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄가 (i) 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인, (ii) 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 불변 도메인 및 (iii) 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드를 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하고, 이때 상기 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인이 단독으로 또는 각각의 상보적인 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인과 함께 항원에 특이적으로 결합하고,
제2 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄가 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드를 포함하고,
상기 융합 폴리펩티드가 상기 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄들 중 하나의 C-말단 또는 N-말단에 공유결합되어 있거나, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄에 포함된 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인에 상보적인 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인인 항체 가변 도메인의 N-말단에 공유결합되어 있거나, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄에 포함된 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인에 상보적인 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인인 항체 불변 도메인의 C-말단에 공유결합되어 있는 것
을 특징으로 하는 항원 결합 복합체이다.
한 실시양태에서, β2-마이크로글로불린, 및 1% 미만의 상대적 빈도를 갖는 MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 융합 폴리펩티드는 그의 N-말단에서 MHC-펩티드 결합 홈에 결합하는 펩티드를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 펩티드는 T-세포 반응 유발 펩티드이다.
한 실시양태에서, 복합체는
- (i) β2-마이크로글로불린 및 (ii) 10% 미만의 상대적 빈도를 갖는 MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3, 또는
(i) T-세포 반응 유발 펩티드, (ii) β2-마이크로글로불린 및 (iii) 10% 이상의 상대적 빈도를 갖는 MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 1개의 융합 폴리펩티드; 및
- 하나 이상의 다이설파이드 결합에 의해 연결되어 있는 2개의 폴리펩티드 쇄
를 포함하고,
이때, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄가 (i) 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인, (ii) 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 불변 도메인 및 (iii) 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드를 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하고, 이때 상기 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인이 단독으로 또는 각각의 상보적인 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인과 함께 항원에 특이적으로 결합하고,
제2 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄가 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드를 포함하고,
상기 융합 폴리펩티드가 상기 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄들 중 하나의 C-말단 또는 N-말단에 공유결합되어 있거나, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄에 포함된 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인에 상보적인 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인인 항체 가변 도메인의 N-말단에 공유결합되어 있거나, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄에 포함된 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인에 상보적인 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인인 항체 불변 도메인의 C-말단에 공유결합되어 있는 것
을 특징으로 한다.
한 실시양태에서, 복합체는
- (i) T-세포 반응 유발 펩티드, (ii) β2-마이크로글로불린 및 (iii) 10% 이상의 상대적 빈도를 갖는 MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 1개의 융합 폴리펩티드; 및
- 하나 이상의 다이설파이드 결합에 의해 연결되어 있는 2개의 폴리펩티드 쇄
를 포함하고,
이때, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄가 (i) 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL), 및 면역글로불린 경쇄 불변 도메인(CL) 및 면역글로불린 중쇄 제1 불변 도메인(CH1)으로부터 선택된 불변 도메인; 또는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH), 및 면역글로불린 중쇄 제1 불변 도메인(CH1) 및 면역글로불린 경쇄 불변 도메인(CL)으로부터 선택된 불변 도메인, 및 (ii) 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드를 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하고, 이때 상기 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인이 단독으로 또는 각각의 상보적인 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인과 함께 항원에 특이적으로 결합하고,
제2 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄가 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드를 포함하고,
상기 융합 폴리펩티드가 상기 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄들 중 하나의 C-말단 또는 N-말단에 공유결합되어 있거나, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄에 포함된 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인에 상보적인 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인인 항체 가변 도메인의 N-말단에 공유결합되어 있거나, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄에 포함된 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인에 상보적인 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인인 항체 불변 도메인의 C-말단에 공유결합되어 있는 것
을 특징으로 한다.
한 실시양태에서, 복합체는
- (i) T-세포 반응 유발 펩티드, (ii) β2-마이크로글로불린 및 (iii) 10% 이상의 상대적 빈도를 갖는 MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 1개의 융합 폴리펩티드; 및
- 하나 이상의 다이설파이드 결합에 의해 연결되어 있는 2개의 폴리펩티드 쇄
를 포함하고,
이때, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄가 (i) 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL), 및 면역글로불린 경쇄 불변 도메인(CL) 및 면역글로불린 중쇄 제1 불변 도메인(CH1)으로부터 선택된 불변 도메인; 또는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH), 및 면역글로불린 중쇄 제1 불변 도메인(CH1) 및 면역글로불린 경쇄 불변 도메인(CL)으로부터 선택된 불변 도메인, (ii) 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드, 및 (iii) 면역글로불린 중쇄 제2 불변 도메인(CH2) 및 제3 불변 도메인(CH3)을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하고, 이때 상기 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인이 단독으로 또는 각각의 상보적인 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인과 함께 항원에 특이적으로 결합하고,
제2 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄가 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드를 포함하고,
상기 융합 폴리펩티드가 상기 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄들 중 하나의 C-말단 또는 N-말단에 공유결합되어 있거나, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄에 포함된 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인에 상보적인 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인인 항체 가변 도메인의 N-말단에 공유결합되어 있거나, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄에 포함된 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인에 상보적인 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인인 항체 불변 도메인의 C-말단에 공유결합되어 있는 것
을 특징으로 한다.
한 실시양태에서, 복합체는
- (i) T-세포 반응 유발 펩티드, (ii) β2-마이크로글로불린 및 (iii) 10% 이상의 상대적 빈도를 갖는 MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 1개의 융합 폴리펩티드; 및
- 하나 이상의 다이설파이드 결합에 의해 연결되어 있는 2개의 폴리펩티드 쇄
를 포함하고,
이때, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄가 (i) 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL), 및 면역글로불린 경쇄 불변 도메인(CL) 및 면역글로불린 중쇄 제1 불변 도메인(CH1)으로부터 선택된 불변 도메인; 또는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH), 및 면역글로불린 중쇄 제1 불변 도메인(CH1) 및 면역글로불린 경쇄 불변 도메인(CL)으로부터 선택된 불변 도메인, (ii) 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드, 및 (iii) 면역글로불린 중쇄 제2 불변 도메인(CH2) 및 제3 불변 도메인(CH3)을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하고, 이때 상기 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인이 단독으로 또는 각각의 상보적인 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인과 함께 항원에 특이적으로 결합하고,
제2 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄가 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드, 면역글로불린 중쇄 제2 불변 도메인(CH2) 및 면역글로불린 중쇄 제3 불변 도메인(CH3)을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하고,
상기 융합 폴리펩티드가 상기 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄들 중 하나의 C-말단 또는 N-말단에 공유결합되어 있거나, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄에 포함된 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인에 상보적인 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인인 항체 가변 도메인의 N-말단에 공유결합되어 있거나, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄에 포함된 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인에 상보적인 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인인 항체 불변 도메인의 C-말단에 공유결합되어 있는 것
을 특징으로 한다.
한 실시양태에서, 복합체는
- (i) T-세포 반응 유발 펩티드, (ii) β2-마이크로글로불린 및 (iii) 10% 이상의 상대적 빈도를 갖는 MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 1개의 융합 폴리펩티드; 및
- 하나 이상의 다이설파이드 결합에 의해 연결되어 있는 2개의 폴리펩티드 쇄
를 포함하고,
이때, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄가 (i) 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL), 및 면역글로불린 경쇄 불변 도메인(CL) 및 면역글로불린 중쇄 제1 불변 도메인(CH1)으로부터 선택된 불변 도메인; 또는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH), 및 면역글로불린 중쇄 제1 불변 도메인(CH1) 및 면역글로불린 경쇄 불변 도메인(CL)으로부터 선택된 불변 도메인, (ii) 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드, 및 (iii) 면역글로불린 중쇄 제2 불변 도메인(CH2) 및 제3 불변 도메인(CH3)을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하고, 이때 상기 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인이 단독으로 또는 각각의 상보적인 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인과 함께 항원에 특이적으로 결합하고,
제2 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄가 (i) 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL), 및 면역글로불린 경쇄 불변 도메인(CL) 및 면역글로불린 중쇄 제1 불변 도메인(CH1)으로부터 선택된 불변 도메인; 또는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH), 및 면역글로불린 중쇄 제1 불변 도메인(CH1) 및 면역글로불린 경쇄 불변 도메인(CL)으로부터 선택된 불변 도메인, (ii) 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드, 및 (iii) 면역글로불린 중쇄 제2 불변 도메인(CH2) 및 면역글로불린 중쇄 제3 불변 도메인(CH3)을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하고,
상기 융합 폴리펩티드가 상기 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄들 중 하나의 C-말단 또는 N-말단에 공유결합되어 있거나, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄에 포함된 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인에 상보적인 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인인 항체 가변 도메인의 N-말단에 공유결합되어 있거나, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄에 포함된 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인에 상보적인 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인인 항체 불변 도메인의 C-말단에 공유결합되어 있는 것
을 특징으로 한다.
한 실시양태에서, 복합체는
- (i) T-세포 반응 유발 펩티드, (ii) β2-마이크로글로불린 및 (iii) 10% 이상의 상대적 빈도를 갖는 MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 1개의 융합 폴리펩티드;
- 하나 이상의 다이설파이드 결합에 의해 연결되어 있는 2개의 폴리펩티드 쇄; 및
- 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄 내의 가변 도메인에 상보적인 면역글로불린 가변 도메인, 및 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄 내의 가변 도메인 다음의 불변 도메인에 상보적인 불변 도메인을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 1개의 폴리펩티드 쇄
를 포함하고,
이때, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄가 (i) 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL), 및 면역글로불린 경쇄 불변 도메인(CL) 및 면역글로불린 중쇄 제1 불변 도메인(CH1)으로부터 선택된 불변 도메인; 또는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH), 및 면역글로불린 중쇄 제1 불변 도메인(CH1) 및 면역글로불린 경쇄 불변 도메인(CL)으로부터 선택된 불변 도메인, (ii) 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드, 및 (iii) 면역글로불린 중쇄 제2 불변 도메인(CH2) 및 제3 불변 도메인(CH3)을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하고, 이때 상기 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인이 단독으로 또는 각각의 상보적인 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인과 함께 항원에 특이적으로 결합하고,
제2 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄가 (i) 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL), 및 면역글로불린 경쇄 불변 도메인(CL) 및 면역글로불린 중쇄 제1 불변 도메인(CH1)으로부터 선택된 불변 도메인; 또는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH), 및 면역글로불린 중쇄 제1 불변 도메인(CH1) 및 면역글로불린 경쇄 불변 도메인(CL)으로부터 선택된 불변 도메인, (ii) 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드, 및 (iii) 면역글로불린 중쇄 제2 불변 도메인(CH2) 및 면역글로불린 중쇄 제3 불변 도메인(CH3)을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하고,
상기 융합 폴리펩티드가 상기 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄들 중 하나의 C-말단 또는 N-말단에 공유결합되어 있거나, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄에 포함된 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인에 상보적인 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인인 항체 가변 도메인의 N-말단에 공유결합되어 있거나, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄에 포함된 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인에 상보적인 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인인 항체 불변 도메인의 C-말단에 공유결합되어 있는 것
을 특징으로 한다.
한 실시양태에서, 복합체는
- (i) T-세포 반응 유발 펩티드, (ii) β2-마이크로글로불린, (iii) 10% 이상의 상대적 빈도를 갖는 MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3, (iv) 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드, 및 (v) 면역글로불린 중쇄 제2 불변 도메인(CH2) 및 제3 불변 도메인(CH3)을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 1개의 융합 폴리펩티드;
- (i) 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL), 및 면역글로불린 경쇄 불변 도메인(CL) 및 면역글로불린 중쇄 제1 불변 도메인(CH1)으로부터 선택된 불변 도메인; 또는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH), 및 면역글로불린 중쇄 제1 불변 도메인(CH1) 및 면역글로불린 경쇄 불변 도메인(CL)으로부터 선택된 불변 도메인, (ii) 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드, 및 (iii) 면역글로불린 중쇄 제2 불변 도메인(CH2) 및 제3 불변 도메인(CH3)을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 1개의 제1 폴리펩티드 쇄; 및
- 제1 폴리펩티드 쇄 내의 가변 도메인에 상보적인 면역글로불린 가변 도메인, 및 제1 폴리펩티드 쇄 내의 불변 도메인에 상보적인 불변 도메인을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 1개의 제2 폴리펩티드 쇄
를 포함하고,
이때, 상기 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인이 단독으로 또는 각각의 상보적인 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인과 함께 항원에 특이적으로 결합하고, 상기 융합 폴리펩티드와 상기 제1 폴리펩티드 쇄가 다이설파이드-연결되어 있는 것
을 특징으로 한다.
한 실시양태에서, 복합체는
- (i) T-세포 반응 유발 펩티드, (ii) β2-마이크로글로불린, (iii) 10% 이상의 상대적 빈도를 갖는 MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3, (iv) 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL), 및 면역글로불린 경쇄 불변 도메인(CL) 및 면역글로불린 중쇄 제1 불변 도메인(CH1)으로부터 선택된 불변 도메인; 또는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH), 및 면역글로불린 중쇄 제1 불변 도메인(CH1) 및 면역글로불린 경쇄 불변 도메인(CL)으로부터 선택된 불변 도메인, (v) 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드 및 (vi) 면역글로불린 중쇄 제2 불변 도메인(CH2) 및 제3 불변 도메인(CH3)을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 1개의 융합 폴리펩티드;
- (i) 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드, 및 (ii) 면역글로불린 중쇄 제2 불변 도메인(CH2) 및 제3 불변 도메인(CH3)을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 1개의 제1 폴리펩티드 쇄; 및
- 제1 폴리펩티드 쇄 내의 가변 도메인에 상보적인 면역글로불린 가변 도메인, 및 제1 폴리펩티드 쇄 내의 불변 도메인에 상보적인 불변 도메인을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 1개의 제2 폴리펩티드 쇄
를 포함하고,
이때, 상기 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인이 단독으로 또는 각각의 상보적인 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인과 함께 항원에 특이적으로 결합하고, 상기 융합 폴리펩티드와 상기 제1 폴리펩티드 쇄가 다이설파이드-연결되어 있는 것
을 특징으로 한다.
한 실시양태에서, 복합체는
- (i) T-세포 반응 유발 펩티드, (ii) β2-마이크로글로불린, (iii) 10% 이상의 상대적 빈도를 갖는 MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3, 및 (iv) 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL), 및 면역글로불린 경쇄 불변 도메인(CL) 및 면역글로불린 중쇄 제1 불변 도메인(CH1)으로부터 선택된 불변 도메인; 또는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH), 및 면역글로불린 중쇄 제1 불변 도메인(CH1) 및 면역글로불린 경쇄 불변 도메인(CL)으로부터 선택된 불변 도메인을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 1개의 융합 폴리펩티드; 및
- (i) 상기 융합 폴리펩티드 내의 가변 도메인에 상보적인 면역글로불린 가변 도메인, 및 상기 융합 폴리펩티드 내의 불변 도메인에 상보적인 불변 도메인, (ii) 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드, 및 (iii) 면역글로불린 중쇄 제2 불변 도메인(CH2) 및 제3 불변 도메인(CH3)을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 1개의 제1 폴리펩티드 쇄
를 포함하고,
이때, 상기 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인이 단독으로 또는 각각의 상보적인 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인과 함께 항원에 특이적으로 결합하고, 상기 융합 폴리펩티드와 상기 제1 폴리펩티드 쇄가 다이설파이드-연결되어 있는 것
을 특징으로 한다.
한 실시양태에서, 복합체는
- (i) T-세포 반응 유발 펩티드, (ii) β2-마이크로글로불린, (iii) 10% 이상의 상대적 빈도를 갖는 MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3, (iv) 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL), 및 면역글로불린 경쇄 불변 도메인(CL) 및 면역글로불린 중쇄 제1 불변 도메인(CH1)으로부터 선택된 불변 도메인; 또는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH), 및 면역글로불린 중쇄 제1 불변 도메인(CH1) 및 면역글로불린 경쇄 불변 도메인(CL)으로부터 선택된 불변 도메인, (v) 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드, 및 (vi) 면역글로불린 중쇄 제2 불변 도메인(CH2) 및 제3 불변 도메인(CH3)을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 1개의 융합 폴리펩티드;
- (i) 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL), 및 면역글로불린 경쇄 불변 도메인(CL) 및 면역글로불린 중쇄 제1 불변 도메인(CH1)으로부터 선택된 불변 도메인; 또는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH), 및 면역글로불린 중쇄 제1 불변 도메인(CH1) 및 면역글로불린 경쇄 불변 도메인(CL)으로부터 선택된 불변 도메인, (iii) 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드, 및 (iii) 면역글로불린 중쇄 제2 불변 도메인(CH2) 및 제3 불변 도메인(CH3)을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 1개의 제1 폴리펩티드 쇄;
- 상기 융합 폴리펩티드 쇄 내의 가변 도메인에 상보적인 면역글로불린 가변 도메인, 및 상기 융합 폴리펩티드 쇄 내의 불변 도메인에 상보적인 불변 도메인을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 1개의 제2 폴리펩티드 쇄; 및
- 제1 폴리펩티드 쇄 내의 가변 도메인에 상보적인 면역글로불린 가변 도메인 및 제1 폴리펩티드 쇄 내의 불변 도메인에 상보적인 불변 도메인을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 1개의 제3 폴리펩티드 쇄
를 포함하고,
이때, 상기 융합 폴리펩티드 및/또는 제1 폴리펩티드 쇄의 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인이 단독으로 또는 각각의 상보적인 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인과 함께 항원에 특이적으로 결합하고, 상기 융합 폴리펩티드와 상기 제1 폴리펩티드 쇄가 다이설파이드-연결되어 있는 것
을 특징으로 한다.
한 실시양태에서, 복합체는
- (i) T-세포 반응 유발 펩티드, (ii) β2-마이크로글로불린, (iii) 10% 이상의 상대적 빈도를 갖는 MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3, 및 (iv) 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL), 및 면역글로불린 경쇄 불변 도메인(CL) 및 면역글로불린 중쇄 제1 불변 도메인(CH1)으로부터 선택된 불변 도메인; 또는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH), 및 면역글로불린 중쇄 제1 불변 도메인(CH1) 및 면역글로불린 경쇄 불변 도메인(CL)으로부터 선택된 불변 도메인을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 1개의 융합 폴리펩티드;
- (i) 상기 융합 폴리펩티드 내의 가변 도메인에 상보적인 면역글로불린 가변 도메인, 및 상기 융합 폴리펩티드 내의 불변 도메인에 상보적인 불변 도메인, (ii) 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드, 및 (iii) 면역글로불린 중쇄 제2 불변 도메인(CH2) 및 제3 불변 도메인(CH3)을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 1개의 제1 폴리펩티드 쇄;
- (i) 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL), 및 면역글로불린 경쇄 불변 도메인(CL) 및 면역글로불린 중쇄 제1 불변 도메인(CH1)으로부터 선택된 불변 도메인; 또는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH), 및 면역글로불린 중쇄 제1 불변 도메인(CH1) 및 면역글로불린 경쇄 불변 도메인(CL)으로부터 선택된 불변 도메인, (ii) 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드, 및 (iii) 면역글로불린 중쇄 제2 불변 도메인(CH2) 및 제3 불변 도메인(CH3)을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 1개의 제2 폴리펩티드 쇄; 및
- 제2 폴리펩티드 쇄 내의 가변 도메인에 상보적인 면역글로불린 가변 도메인 및 제2 폴리펩티드 쇄 내의 불변 도메인에 상보적인 불변 도메인을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 1개의 제3 폴리펩티드 쇄
를 포함하고,
이때, 상기 융합 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드 쇄의 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인이 단독으로 또는 각각의 상보적인 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인과 함께 항원에 특이적으로 결합하고, 상기 제1 폴리펩티드 쇄와 상기 제2 폴리펩티드 쇄가 다이설파이드-연결되어 있는 것
을 특징으로 한다.
한 실시양태에서, T-세포 반응 유발 펩티드는 바이러스-유래된 펩티드이다. 한 실시양태에서, 바이러스는 아데노바이러스, 인간 허페스바이러스 1, 인간 허페스바이러스 2, 인간 허페스바이러스 4(엡스테인-바 바이러스), B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 인간 사이토메갈로바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 인간 유두종바이러스 유형 16, 인간 유두종바이러스 유형 18, 인간 유두종바이러스 유형 31, 인간 유두종바이러스 유형 33, 인간 유두종바이러스 유형 35, 인간 유두종바이러스 유형 39, 인간 유두종바이러스 유형 45, 인간 유두종바이러스 유형 51, 인간 유두종바이러스 유형 52, 인간 유두종바이러스 유형 56, 인간 유두종바이러스 유형 58, 인간 유두종바이러스 유형 59, 인간 유두종바이러스 유형 68, 인간 유두종바이러스 유형 73, 인간 유두종바이러스 유형 82, 인간 T-세포 림프친화성 바이러스 유형 I, 인간 인플루엔자 A 바이러스, 인간 인플루엔자 B 바이러스 및 백시니아 바이러스로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 바이러스-유래된 펩티드는 NLVPMVATV(서열번호 1), SLYNTVATL(서열번호 2), GLCTLVAML(서열번호 3), GILGFVFTL(서열번호 4), STNRQSGRQ(서열번호 5), LLFGYPVYV(서열번호 6), FAEGFVRAL(서열번호 7), LIVIGILIL(서열번호 8) 및 ILHTPGCV(서열번호 9)로부터 선택된다.
한 실시양태에서, β2-마이크로글로불린은 인간 β2-마이크로글로불린이다. 한 실시양태에서, β2-마이크로글로불린은 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성된다.
한 실시양태에서, 10% 이상의 상대적 빈도를 갖는 MHC 클래스 I 분자는 인간 HLA-A*0201이다. 한 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3은 서열번호 11의 아미노산 서열로 구성된다.
한 실시양태에서, 바이러스-유래된 펩티드는 제1 연결제 펩티드를 통해 β2-마이크로글로불린에 융합되어 있다.
한 실시양태에서, β2-마이크로글로불린은 제2 연결제 펩티드를 통해 MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1에 융합되어 있다.
한 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α3은 제3 연결제 펩티드를 통해 (다이설파이드-연결된 또는 다이설파이드-연결되어 있지 않은) 폴리펩티드에 융합되어 있다.
한 실시양태에서, 제1 연결제 펩티드, 제2 연결제 펩티드 및 제3 연결제 펩티드는 동일하거나 상이하다.
한 실시양태에서, 제1 연결제 펩티드, 제2 연결제 펩티드 및 제3 연결제 펩티드는 아미노산 서열 GS(서열번호 12), GGS(서열번호 13), GGGS(서열번호 14), GGGSGGGS(서열번호 15), GGGSGGGSGGGS(서열번호 16), GGGSGGGSGGGSGGGS(서열번호 17), GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS(서열번호 18), GGGGS(서열번호 19), GGGGSGGGGS(서열번호 20), GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 21), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 22) 및 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 23)로부터 서로 독립적으로 선택된다.
한 실시양태에서, 제1 연결제 펩티드는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 제2 연결제 펩티드는 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 제3 연결제 펩티드는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드는 클래스 IgG 또는 클래스 IgE의 인간 항체의 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드는 서브클래스 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 인간 항체의 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드는 EPKSCDKTHTCPPCP(서열번호 24), EPKSADKTHTCPPCP(서열번호 25), ERKCCVECPPCP(서열번호 26), ERKCAVECPPCP(서열번호 27), ERKACVECPPCP(서열번호 28), ELKTPLGDTTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3(서열번호 29) 또는 ESKYGPPCPSCP(서열번호 30)의 아미노산 서열을 포함하거나 이 아미노산 서열로 구성된다.
한 실시양태에서, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 및/또는 제2 다이설파이드-연결된 폴리펩티드는 인간 유래의 CH2 도메인 및/또는 CH3 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 유래의 CH2 도메인 및 CH3 도메인은 클래스 IgG 또는 IgE의 인간 항체의 CH2 도메인 및 CH3 도메인이다. 한 실시양태에서, CH2 도메인 및 CH3 도메인은 서브클래스 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 인간 항체의 CH2 도메인 및 CH3 도메인이다. 한 실시양태에서, CH2 도메인은 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, CH2 도메인은 서브클래스 IgG1 또는 IgG2의 인간 항체의 CH2 도메인이고, E233, L234, L235, G236, D265, D270, N297, E318, K320, K322, A327, A330, P331 및/또는 P329(카바트의 EU 지수에 따른 넘버링)의 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 한 실시양태에서, CH2 도메인은 돌연변이 L234A 및 L235A, 및/또는 돌연변이 D265A 및 N297A를 갖고/갖거나, PVA236 돌연변이를 함유하고/하거나, 돌연변이 P329G를 함유하는 서브클래스 IgG1 또는 인간 서브클래스 IgG2의 인간 항체의 CH2 도메인이다. 한 실시양태에서, CH2 도메인은 돌연변이 L234A 및 L235A, 및/또는 P329G를 갖는 서브클래스 IgG1의 인간 항체의 CH2 도메인이다. 한 실시양태에서, CH2 도메인은 돌연변이 S228P 및/또는 L235E를 갖는 서브클래스 IgG4의 인간 항체의 CH2 도메인이다. 한 실시양태에서, CH2 도메인은 서열번호 32 또는 33의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, CH3 도메인은 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드는 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 다이설파이드-연결된 폴리펩티드는 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 및 제2 다이설파이드-연결된 폴리펩티드는 서열번호 37 또는 38의 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 또는 제2 다이설파이드-연결된 폴리펩티드는 서열번호 37 또는 38의 아미노산 서열로 구성된다.
한 실시양태에서, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드는 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 다이설파이드-연결된 폴리펩티드는 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 하나 이상의 다이설파이드 결합에 의해 연결된 폴리펩티드 쇄들은 2개, 3개 또는 4개의 다이설파이드 결합에 의해 연결되어 있다.
한 실시양태에서, 복합체는
- (i) 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 바이러스-유래된 펩티드, (ii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 제1 연결제 펩티드, (iii) 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 β2-마이크로글로불린, (iv) 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 제2 연결제 펩티드, (v) 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3, 및 (vi) 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 제3 연결제 펩티드를 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 1개의 융합 폴리펩티드; 및
- 하나 이상의 다이설파이드 결합에 의해 연결되어 있는 2개의 폴리펩티드 쇄
를 포함하고,
이때, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄가 (i) 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인, (ii) 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 불변 도메인, (iii) 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드, (iv) 서열번호 32 및 33으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG1 CH2 도메인, 및 (v) 서열번호 35 또는 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG1 CH3 도메인을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하고,
제2 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄가 (i) 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드, (ii) 서열번호 32 및 33으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG1 CH2 도메인, 및 (iii) 서열번호 35 또는 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG1 CH3 도메인을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하고,
상기 융합 폴리펩티드가 제2 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄의 C-말단 또는 N-말단에서 공유결합되어 있는 것
을 특징으로 한다.
한 실시양태에서, 복합체는
- (i) 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 바이러스-유래된 펩티드, (ii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 제1 연결제 펩티드, (iii) 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 β2-마이크로글로불린, (iv) 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 제2 연결제 펩티드, (v) 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3, 및 (vi) 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 제3 연결제 펩티드를 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 1개의 융합 폴리펩티드; 및
- 하나 이상의 다이설파이드 결합에 의해 연결되어 있는 2개의 폴리펩티드 쇄
를 포함하고,
이때, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄가 (i) 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인, (ii) 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 불변 도메인, (iii) 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드, (iv) 서열번호 32 및 33으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG1 CH2 도메인, 및 (v) 서열번호 35 및 36으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG1 CH3 도메인을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하고,
제2 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄가 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드를 포함하고,
상기 융합 폴리펩티드가 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄의 C-말단 또는 N-말단에서 공유결합되어 있거나, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄에 포함된 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인에 상보적인 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인인 항체 가변 도메인의 N-말단에 공유결합되어 있거나, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄에 포함된 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인에 상보적인 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인인 항체 불변 도메인의 C-말단에 공유결합되어 있는 것
을 특징으로 한다.
한 실시양태에서, 복합체는
- (i) 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 바이러스-유래된 펩티드, (ii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 제1 연결제 펩티드, (iii) 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 β2-마이크로글로불린, (iv) 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 제2 연결제 펩티드, (v) 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3, 및 (vi) 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 제3 연결제 펩티드를 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 1개의 융합 폴리펩티드; 및
- 하나 이상의 다이설파이드 결합에 의해 연결되어 있는 2개의 폴리펩티드 쇄
를 포함하고,
이때, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄 및 제2 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄가 (i) 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인, (ii) 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 불변 도메인, (iii) 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드, (iv) 서열번호 32 및 33으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG1 CH2 도메인, 및 (v) 서열번호 35 및 36으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG1 CH3 도메인을 N-말단에서 C-말단 방향으로 각각 포함하고,
상기 융합 폴리펩티드가 제2 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄의 C-말단 또는 N-말단에서 공유결합되어 있거나, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄에 포함된 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인에 상보적인 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인인 항체 가변 도메인의 N-말단에 공유결합되어 있거나, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄에 포함된 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인에 상보적인 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인인 항체 불변 도메인의 C-말단에 공유결합되어 있는 것
을 특징으로 한다.
도 14로부터, 본원에 보고된 복합체가 그 자신에 융합되어 있는 항체의 결합 성질을 유지한다는 것을 알 수 있다(도 14의 b) 및 c)).
도 15 및 17에서, 본원에 보고된 복합체의 시험관내 효능 및 특이성이 나타나 있다.
CMV-특이적 CD8+ T-세포의 존재 하에 세포독성 어세이를 수행하였다. CMV-유래된 바이러스 펩티드를 포함하는 복합체가 표적 세포의 용해/제거/붕해를 유도한다는 것을 알 수 있다(1가 항체에 대해서는 도 15의 a)를 참조하고, 2가 항체에 대해서는 도 15의 b)를 참조함). EBV-유래된 바이러스 펩티드(도 15의 b)) 및 대조군 항체(도 15의 d) 및 e))를 포함하는 복합체와의 항온처리가 광범위한 세포 용해를 초래하지 않기 때문에(자연발생적 용해는 약 3.5%임) 표적 세포의 용해가 고도로 특이적이라는 것도 알 수 있다.
도 17에서, IGF-1R 양성 폐 선암종 세포주 H460M2의 용해가 나타나 있다.
CMV-유래된 펩티드 및 2가 항체를 포함하는 복합체에 대한 EC50 값은 약 50 pM에 상응하는 약 10 ng/㎖이다. 측정된 EC50 값은 표적 세포 대 효과기 세포 비와 무관하다(도 16 참조; 1:0.44 대 1:0.14의 유효 비에 상응하는 1:3 대 1:1의 표적 세포 대 효과기 세포 비(76%의 효과기 세포가 CD8 양성이고 19%가 CMV-특이적임)).
따라서, 한 실시양태에서, 본원에 보고된 복합체는 약 50 pM의 EC50 값을 갖는다.
1. 친화성
일부 실시양태들에서, 본원에서 제공된 복합체는 항체 가변 도메인의 항원 결합 쌍을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 상기 가변 도메인은 그의 항원에 대해 ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM 또는 ≤ 0.001 nM(예를 들면, 10-8 M 이하, 예를 들면, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수(Kd)를 갖는다.
한 실시양태에서, Kd는 표면 플라스몬 공명 어세이의 이용을 통해 측정된다.
예를 들면, 이것은 25℃에서 약 10 반응 유닛(RU)의 고정된 항원 CM5 칩과 함께 비아코어(BIACORE, 등록상표)-2000 또는 비아코어(등록상표)-3000 기구(비아코어 인코포레이티드(BIACORE Inc.), 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)를 이용함으로써 수행될 수 있다. 요약하건대, 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, 비아코어 인코포레이티드)을 공급자의 설명서에 따라 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 아세트산나트륨(pH 4.8)으로 5 ㎍/㎖(약 0.2 μM)까지 희석한 후, 5 ㎕/분의 유속으로 주입하여 약 10 반응 유닛(RU)의 커플링된 단백질을 달성한다. 항원의 주입 후, 1 M 에탄올아민을 주입하여 미반응된 기를 차단한다. 동력학적 측정을 위해, 25℃에서 0.05% 폴리소르베이트 20(트윈(TWEEN)-20, 상표) 계면활성제를 갖는 PBS(PBST) 중의 2배 연속 Fab 희석물(0.78 nM 내지 500 nM)을 약 25 ㎕/분의 유속으로 주입한다. 결합 센서그램 및 해리 센서그램을 동시에 피팅함으로써 단순 1-대-1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델(비아코어(등록상표) 평가 소프트웨어 버젼 3.2)을 이용하여 결합속도(kon) 및 해리속도(koff)를 계산한다. 평형 해리 상수(Kd)를 비 koff/kon로서 계산한다. 예를 들면, 문헌[Chen, Y., et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881]을 참조한다.
2. 발현
HEK293 및 CHO에서 특정 형식의 본원에 보고된 복합체(상이한 연결제, HLA와 β2-마이크로글로불린의 상이한 조합)의 발현은 (적어도 검출가능한 경우) 소포체 내에서의 상기 복합체의 축적을 초래하였다(즉, 상기 복합체의 단리 및 분비가 많이 손상되었다).
복합체가 하기 표에 요약되어 있는 폴리펩티드들 중 하나를 포함하도록 의도된 경우 배양 배지로의 복합체의 분비가 전혀 검출될 수 없었다.
Figure 112013116864789-pct00002
MHC 클래스 I 단백질 복합체에 연결된 바이러스-유래된 펩티드의 2개 부분, 및 항체의 하나 이상의 가변 도메인 및 1개의 불변 도메인을 포함하는 복합체의 발현 및 특히 분비는 진핵 세포에서 가능하지 않다는 것이 발견되었다.
MHC 클래스 I 단백질 복합체에 연결된 바이러스-유래된 펩티드를 포함하는 2개의 융합 폴리펩티드, 하나 이상의 가변 도메인 및 한 쌍의 힌지 영역-유래된 다이설파이드-연결된 폴리펩티드를 포함하는 복합체의 발현 및 특히 분비는 진핵 세포에서 가능하지 않다는 것도 발견되었다.
따라서, 본원에 보고된 복합체에서, MHC 클래스 I 단백질에 연결된 바이러스-유래된 펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드는 1회 초과하여 존재할 수 없고, 하나 이상의 항체 가변 도메인 및 1개의 항체 불변 도메인은 진핵 세포를 사용한 상기 복합체의 제조 및 분비를 가능하게 하기 위해 존재하여야 한다.
따라서, MHC 클래스 I 단백질에 연결된 바이러스-유래된 펩티드의 정확히 1개의 융합 폴리펩티드, 항체 중쇄 힌지 영역, 하나 이상의 항체 가변 도메인 및 1개의 항체 불변 도메인을 포함하는 복합체는 진핵 세포에서 재조합적으로 제조될 수 있고 상기 진핵 세포로부터 분비될 수 있다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 불변 도메인은 항체 중쇄 불변 도메인 1(CH1) 또는 항체 경쇄 불변 도메인(CL)이다.
따라서, 항체 중쇄 힌지 영역; 하나 이상의 쌍의 항체 가변 도메인; 임의적으로 항체 불변 도메인; 및 MHC 클래스 I 단백질에 연결된 바이러스-유래된 펩티드로 구성된 정확히 1개의 융합 폴리펩티드를 포함하는 복합체는 진핵 세포에서 재조합적으로 제조될 수 있고 상기 진핵 세포로부터 분비될 수 있다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 불변 도메인은 항체 중쇄 불변 도메인 1(CH1) 또는 항체 경쇄 불변 도메인(CL)이다.
상이한 폴리펩티드들의 다양한 조합을 시험하였다. 분비된 발현은 바이러스-유래된 펩티드가 N-말단에서 MHC 클래스 I 분자에 융합되어 있는 복합체에서 예를 들면, 면역글로불린-유래된 신호 펩티드의 N-말단 융합에 의해 달성될 수 있다. MHC 클래스 I 분자 중쇄(경막 도메인 및 세포질 도메인을 결여하는 α1-α2-α3) 및 경쇄(β2-마이크로글로불린)는 순서에서 변화될 수 있다. 상이한 융합 폴리펩티드들은 N-말단에서 항체 경쇄 또는 항체 중쇄 힌지 영역 포함 폴리펩티드에 융합되었다. 예시적 조합은 도 2에 나타나 있다.
하기 표로부터 알 수 있는 바와 같이, 융합 폴리펩티드를 포함하는 복합체는 단일 바이러스-유래된 펩티드-마이크로글로불린-HLA-융합 폴리펩티드가 존재하는 경우 가변 항체 도메인 및 항체 중쇄 힌지 영역-유래된 폴리펩티드와 함께만 발현될 수 있다.
Figure 112013116864789-pct00003
Figure 112013116864789-pct00004
Figure 112013116864789-pct00005
몇몇 실시양태들에서, 본원에 보고된 복합체는 상이한 쌍의 폴리펩티드들을 포함한다. 상기 폴리펩티드들의 적절한 페어링을 가능하기 위해, 크놉스-인투-홀스(knobs-into-holes) 기술 또는 교차-mAb 기술을 이용하여 정확히 연결되지 않은 복합체의 양을 감소시킬 수 있다.
크놉 변경은 항체의 CH3 도메인 내의 돌연변이 T366W(카바트의 EU 지수에 따른 넘버링)를 의미한다.
홀 변경은 항체의 CH3 도메인 내의 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V(카바트의 EU 지수에 따른 넘버링)를 의미한다.
크놉 및 홀 변경 이외에, 1개의 CH3 도메인 내의 돌연변이 S354C 및 다른 CH3 도메인 내의 돌연변이 Y349C가 존재할 수 있다.
교차-mAb 기술은 예를 들면, 국제 특허출원 공개 제2009/080251호, 국제 특허출원 공개 제2009/080252호, 국제 특허출원 공개 제2009/080254호, 국제 특허출원 공개 제2009/080253호, 국제 특허출원 공개 제2010/112193호, 국제 특허출원 공개 제2010/115589호, 국제 특허출원 공개 제2010/136172호, 국제 특허출원 공개 제2010/145792호 및 국제 특허출원 공개 제2010/145793호에 보고되어 있다.
3. 변이체
일부 실시양태들에서, 본원에서 제공된 복합체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들면, 상기 복합체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 성질을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 복합체의 아미노산 서열 변이체는 적절한 변경을, 상기 복합체의 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내로 도입함으로써 제조할 수 있거나 펩티드 합성으로 제조할 수 있다. 이러한 변경은 예를 들면, 상기 복합체의 폴리펩티드의 아미노산 서열 내의 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구축물이 원하는 특성, 예를 들면, 항원 결합을 보유하는 한, 상기 최종 구축물에 도달하기 위해 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 만들 수 있다.
(a) 치환, 삽입 및 결실 변이체
일부 실시양태들에서, 폴리펩티드 쇄 내에 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 복합체 변이체가 제공된다. 보존적 치환은 "바람직한 치환"이라는 표제 하에 하기 표에 나타나 있다. 보다 실질적인 변경은 "예시적 치환"이라는 표제 하에 하기 표에 제공되어 있고 아미노산 측쇄 클래스에 대해 추가로 후술되어 있는 바와 같다. 아미노산 치환을 관심 있는 복합체 내로 도입할 수 있고, 생성물을 원하는 활성, 예를 들면, 보유된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝할 수 있다.
Figure 112013116864789-pct00006
아미노산은 측쇄 성질에 따라 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비보존적 치환은 이들 클래스들 중 한 클래스의 구성원을 또 다른 클래스의 구성원으로 교체하는 것을 수반할 것이다.
아미노산 서열 삽입은 길이에 있어서 1개 잔기부터 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 아미노-말단 및/또는 카복실-말단 융합뿐만 아니라, 단일 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열내 삽입도 포함한다. 말단 삽입의 예에는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 폴리펩티드를 포함하는 복합체를 포함한다. 다른 삽입 변이체는 복합체의 폴리펩티드 쇄의 N-말단 또는 C-말단에서 효소와의 융합을 포함한다.
(b) 글리코실화 변이체
일부 실시양태들에서, 본원에서 제공된 복합체의 폴리펩티드는 이 폴리펩티드가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변경된다. 글리코실화 부위를 폴리펩티드에 추가하거나 폴리펩티드로부터 결실시키는 것은 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 달성될 수 있다.
복합체가 항체 Fc-영역을 포함하는 경우, 이에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생성된 천연 Fc-영역은 전형적으로 이 Fc-영역의 CH2 도메인의 Asn297과의 N-연결에 의해 일반적으로 부착되는 분지된 바이안테나리(biantennary) 올리고사카라이드를 포함한다. 예를 들면, 문헌[Wright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32]을 참조한다. 상기 올리고사카라이드는 상기 바이안테나리 올리고사카라이드 구조의 "줄기" 내의 GlcNAc에 부착된 푸코스뿐만 아니라 다양한 탄수화물, 예를 들면, 만노스, N-아세틸 글루코스아민(GlcNAc), 갈락토스 및 시알산도 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태들에서, 일부 개선된 성질을 갖는 항체 변이체를 생성하기 위해 본 발명의 항체에서 올리고사카라이드를 변경할 수 있다.
한 실시양태에서, Fc-영역에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착된 푸코스를 결여하는 탄수화물 구조를 갖는 폴리펩티드 변이체를 포함하는 복합체가 제공된다. 예를 들면, 이러한 Fc-영역 내의 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코스의 양은 예를 들면, 국제 특허출원 공개 제2008/077546호에 기재된 바와 같이 MALDI-TOF 질량 분광측정에 의해 측정되었을 때 Asn297에 부착된 모든 당구조체들(예를 들면, 복합 구조체, 하이브리드 구조체 및 고만노스 구조체)의 합계를 기준으로 Asn29에서 당 쇄 내의 푸코스의 평균 양을 계산함으로써 결정된다. Asn297은 Fc-영역 내의 위치 약 297(Fc-영역 잔기의 EU 넘버링)에 위치하는 아스파라긴 잔기를 의미하나, Asn297은 항체의 소수 서열 변경으로 인해 위치 297의 약 ± 3개 아미노산 업스트림 또는 다운스트림, 즉 위치 294와 위치 300 사이에 위치할 수도 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들면, 미국 특허출원 공개 제2003/0157108호 및 미국 특허출원 공개 제2004/0093621호를 참조한다. "탈푸코실화된" 또는 "푸코스 결핍" 항체 변이체에 관한 공개문헌들의 예에는 하기 공개문헌들이 포함된다: 미국 특허출원 공개 제2003/0157108호; 국제 특허출원 공개 제2000/61739호; 국제 특허출원 공개 제2001/29246호; 미국 특허출원 공개 제2003/0115614호; 미국 특허출원 공개 제2002/0164328호; 미국 특허출원 공개 제2004/0093621호; 미국 특허출원 공개 제2004/0132140호; 미국 특허출원 공개 제2004/0110704호; 미국 특허출원 공개 제2004/0110282호; 미국 특허출원 공개 제2004/0109865호; 국제 특허출원 공개 제2003/085119호; 국제 특허출원 공개 제2003/084570호; 국제 특허출원 공개 제2005/035586호; 국제 특허출원 공개 제2005/035778호; 국제 특허출원 공개 제2005/053742호; 국제 특허출원 공개 제2002/031140호; 문헌[Okazaki, A., et al., J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249]; 및 문헌[Yamane-Ohnuki, N., et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622]. 탈푸코실화된 항체를 생성할 수 있는 세포주의 예에는 단백질 푸코실화 결핍 Lec13 CHO 세포(문헌[Ripka, J., et al., Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545]; 미국 특허출원 공개 제2003/0157108호; 및 국제 특허출원 공개 제2004/056312호, 특히 실시예 (11), 및 넉아웃 세포주, 예컨대, α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자(FUT8) 넉아웃 CHO 세포(예를 들면, 문헌[Yamane-Ohnuki, N., et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622]; 문헌[Kanda, Y., et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688]; 및 국제 특허출원 공개 제2003/085107호 참조)가 포함된다.
이등분된 올리고사카라이드, 예를 들면, Fc-영역에 부착된 바이안테나리 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분되어 있는 이등분된 올리고사카라이드를 갖는 Fc-영역 변이체를 포함하는 복합체도 제공된다. 이러한 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예는 예를 들면, 국제 특허출원 공개 제2003/011878호, 미국 특허출원 공개 제6,602,684호 및 미국 특허출원 공개 제2005/0123546호에 기재되어 있다. Fc-영역에 부착된 올리고사카라이드 내에 하나 이상의 갈락토스 잔기를 갖는 Fc-영역 변이체도 제공된다. 이러한 Fc-영역 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 상응하는 항체 변이체는 예를 들면, 국제 특허출원 공개 제97/30087호, 국제 특허출원 공개 제98/58964호 및 국제 특허출원 공개 제99/22764호에 기재되어 있다.
(c) Fc -영역 변이체
일부 실시양태들에서, 하나 이상의 아미노산 변경을 본원에서 제공된 복합체에 포함된 폴리펩티드의 Fc-영역 내로 도입하여 Fc-영역 변이체를 발생시킬 수 있다. Fc-영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변경(예를 들면, 치환)을 포함하는 인간 Fc-영역 서열(예를 들면, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc-영역)을 포함할 수 있다.
일부 실시양태들에서, 본 발명은 일부 효과기 기능들을 보유하나 모든 효과기 기능들을 보유하지는 않아, 복합체의 생체내 반감기가 중요하지만 일부 효과기 기능들(예컨대, 보체 및 ADCC)이 불필요하거나 해로운 적용분야에 바람직한 후보물질이 되는 Fc-영역 변이체를 고려한다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 어세이를 수행하여 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인할 수 있다. 예를 들면, Fc 수용체(FcR) 결합 어세이를 수행함으로써 복합체가 FcγR 결합을 결여하지만(이로써 ADCC 활성을 결여할 가능성이 높음) FcRn 결합 능력을 보유하는지를 확인할 수 있다. ADCC를 매개하는 일차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌[Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492]의 제464면의 표 3에 요약되어 있다. 관심 있는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 어세이의 비제한적 예는 미국 특허 제5,500,362호(예를 들면, 문헌[Hellstrom, I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063] 및 문헌[Hellstrom, I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502] 참조); 및 미국 특허 제5,821,337호(문헌[Bruggemann, M., et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361] 참조)에 기재되어 있다. 대안적으로, 비방사성 어세이 방법을 이용할 수 있다(예를 들면, 유세포분석을 위한 ACTI(상표) 비방사성 세포독성 어세이(셀테크놀로지 인코포레이티드(CellTechnology, Inc.), 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재) 및 사이톡스(CytoTox) 96(등록상표) 비방사성 세포독성 어세이(프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨 소재) 참조). 이러한 어세이들에 유용한 효과기 세포는 말초혈 단핵 세포(PBMC) 및 천연 살해(NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 관심 있는 분자의 ADCC 활성을 생체내, 예를 들면, 동물 모델, 예컨대, 문헌[Clynes, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656]에 개시된 동물 모델에서 평가할 수 있다. 또한, C1q 결합 어세이를 수행하여 항체가 C1q에 결합할 수 없어 CDC 활성을 결여하는지를 확인할 수 있다. 예를 들면, 국제 특허출원 공개 제2006/029879호 및 국제 특허출원 공개 제2005/100402호에 기재된 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 어세이를 수행할 수 있다(예를 들면, 문헌[Gazzano-Santoro, H., et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171], 문헌[Cragg, M.S., et al., Blood 101 (2003) 1045-1052] 및 문헌[Cragg, M.S. and Glennie, M.J., Blood 103 (2004) 2738-2743] 참조). 당분야에서 공지된 방법을 이용하여 FcRn 결합 및 생체내 제거/반감기 측정도 수행할 수 있다(예를 들면, 문헌[Petkova, S.B., et al., Int. Immunol. 18 (2006) 1759-1769] 참조).
감소된 효과기 기능을 갖는 Fc-영역은 Fc-영역 잔기 234, 235, 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 잔기의 치환을 갖는 Fc-영역을 포함한다(예를 들면, 미국 특허 제6,737,056호 참조). 이러한 Fc 돌연변이체는 잔기 265 및 297이 알라닌으로 치환된 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함하는, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상의 위치에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다(미국 특허 제7,332,581호).
FcR과의 개선된 또는 감소된 결합을 갖는 일부 Fc-영역 변이체들도 기재되어 있다(예를 들면, 미국 특허 제6,737,056호, 국제 특허출원 공개 제2004/056312호 및 문헌[Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604] 참조).
일부 실시양태들에서, 폴리펩티드 변이체는 ADCC를 개선하는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들면, Fc-영역의 위치 298, 333 및/또는 334(잔기의 EU 넘버링)에서의 치환을 갖는 Fc-영역을 포함한다.
몇몇 실시양태들에서, 예를 들면, 미국 특허 제6,194,551호, 국제 특허출원 공개 제99/51642호 및 문헌[Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184]에 기재된 바와 같이 변경된(즉, 개선된 또는 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존적 세포독성(CDC)을 야기하는 변경을 Fc-영역 내에서 만든다.
증가된 반감기 및 신생아 Fc 수용체(FcRn)(태아로의 모 IgG의 전달을 담당함(문헌[Guyer, R.L., et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593], 및 문헌[Kim, J.K., et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434])와의 개선된 결합을 갖는 항체는 미국 특허출원 공개 제2005/0014934호에 기재되어 있다. 이들 항체들은 Fc-영역과 FcRn의 결합을 개선하는 하나 이상의 치환을 그 내부에 갖는 Fc-영역을 포함한다. 이러한 Fc-영역 변이체는 Fc-영역 잔기 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 및 434 중 하나 이상의 잔기에서의 치환, 예를 들면, Fc-영역 잔기 434의 치환을 갖는 Fc-영역 변이체를 포함한다(미국 특허 제7,371,826호).
Fc-영역 변이체의 다른 예에 관해서는 문헌[Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740], 미국 특허 제5,648,260호, 미국 특허 제5,624,821호 및 국제 특허출원 공개 제94/29351호도 참조한다.
(d) 유도체
일부 실시양태들에서, 본원에서 제공된 복합체는 당분야에서 공지되어 있고 용이하게 입수될 수 있는 추가 비단백질성 모이어티(moiety)를 함유하도록 더 변경될 수 있다. 상기 복합체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 수용성 중합체의 비제한적 예에는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-다이옥솔란, 폴리-1,3,6-트라이옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예를 들면, 글리세롤), 폴리비닐 알코올 및 이들의 혼합물이 포함되나 이들로 한정되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 물에서의 그의 안정성으로 인해 제조에 있어서 이점을 가질 수 있다. 상기 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고 분지될 수 있거나 비분지될 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 달라질 수 있고, 1개 초과의 중합체들이 부착되는 경우, 이들은 동일한 또는 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선될 항체의 구체적인 성질 또는 기능, 항체 유도체가 정의된 조건 하에 치료에 사용될 것인지 여부 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 고려사항에 근거하여 결정될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 방사선에의 노출에 의해 선별적으로 가열될 수 있는 비단백질성 모이어티와 복합체의 접합체가 제공된다. 한 실시양태에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다(문헌[Kam, N.W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605]). 방사선은 임의의 파장의 방사선일 수 있고, 통상의 세포에게 유해하지 않지만 비단백질성 모이어티를 항체-비단백질성 모이어티에 인접한 세포가 사멸되는 온도까지 가열하는 파장을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
B. 재조합 방법 및 조성물
예를 들면, 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 복합체를 제조할 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체의 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 추가 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터(예를 들면, 발현 벡터)가 제공된다. 추가 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이러한 한 실시양태에서, 숙주 세포는 (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다(예를 들면, 상기 벡터로 형질전환되어 있다). 한 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵, 예를 들면, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 림프 세포(예를 들면, Y0, NS0, Sp2/0 세포)이다. 한 실시양태에서, 본원에 보고된 복합체를 제조하는 방법이 제공되고, 이때 상기 방법은 폴리펩티드의 발현 및 복합체의 형성에 적합한 조건 하에 상기 제공된 복합체의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 임의적으로 상기 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 상기 복합체를 회수하는 단계를 포함한다.
복합체의 재조합 제조를 위해, 예를 들면, 전술된 복합체의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 단리하고 숙주 세포에서의 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내로 삽입한다. 이러한 핵산은 통상적인 절차를 이용함으로써(예를 들면, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리될 수 있고 서열분석될 수 있다.
클로닝 또는 발현 벡터에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들면, 복합체는 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 요구되지 않는 경우 세균에서 제조될 수 있다. 세균에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 관해서는 예를 들면, 미국 특허 제5,648,237호, 미국 특허 제5,789,199호 및 미국 특허 제5,840,523호를 참조한다(에스케리치아 콜라이에서의 항체 단편의 발현을 기술하는 문헌[Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254]도 참조). 발현 후, 복합체를 가용성 분획으로 세균 세포 페이스트로부터 단리할 수 있고 더 정제할 수 있다.
원핵생물 이외에, 진핵 미생물, 예컨대, 사상 진균 또는 효모(부분적으로 또는 전체적으로 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체의 생성을 야기하는 "인간화된" 글리코실화 경로를 갖는 진균 및 효모 균주를 포함함)도 폴리펩티드 코딩 벡터를 위한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 문헌[Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414] 및 문헌[Li, H., et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215]을 참조한다.
글리코실화된 복합체의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터도 유래된다. 무척추동물 세포의 예에는 식물 세포 및 곤충 세포가 포함된다. 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 다수의 바큘로바이러스 균주들이 확인되어 있다.
식물 세포 배양물도 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들면, (형질전환 식물에서 항체를 제조하기 위한 플랜티바디스(PLANTIBODIES, 상표) 기술을 기술하는) 미국 특허 제5,959,177호, 미국 특허 제6,040,498호, 미국 특허 제6,420,548호, 미국 특허 제7,125,978호 및 제6,417,429호를 참조한다.
척추동물 세포도 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 현탁액으로 생장하도록 개조된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7); 인간 배아 신장 세포주(예를 들면, 문헌[Graham, F.L., et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74]에 기재된 HEK293 또는 293 세포); 새끼 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리 세포(예를 들면, 문헌[Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252]에 기재된 TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁경부암종 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간 세포(Hep G2); 마우스 유선 종양(MMT 060562); 예를 들면, 문헌[Mather, J.P., et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68]에 기재된 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포(DHFR- CHO(문헌[Urlaub, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220] 세포를 포함함); 및 골수종 세포주, 예컨대, Y0, NS0 및 Sp2/0를 포함한다. 항체 제조에 적합한 일부 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해서는 예를 들면, 문헌[Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268]을 참조한다.
C. 약학 제제
본원에 기재된 복합체의 약학 제제는 원하는 순도를 갖는 이러한 복합체를 하나 이상의 임의적 약학적으로 허용가능한 담체(문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)])와 혼합함으로써 동결건조된 제제 또는 수용액의 형태로 제조된다. 약학적으로 허용가능한 담체는 사용된 용량 및 농도에서 일반적으로 수용자에게 독성을 나타내지 않고 하기 물질들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다: 완충제, 예컨대, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예컨대, 옥타데실 다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대, 폴리(비닐피롤리돈); 아미노산, 예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 모노사카라이드, 다이사카라이드 및 다른 탄수화물(글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함함); 킬레이팅제, 예컨대, EDTA; 당, 예컨대, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대이온, 예컨대, 나트륨; 금속 착물(예를 들면, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜(PEG). 본원의 예시적 약학적으로 허용가능한 담체는 간질 약물 분산제, 예컨대, 가용성 중성 활성 히알루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들면, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예컨대, rhuPH20(하일레넥스(HYLENEX, 등록상표), 박스터 인터네이셔날 인코포레이티드(Baxter International, Inc.))을 추가로 포함한다. rhuPH20을 포함하는 일부 예시적 sHASEGP들 및 이들의 사용 방법은 미국 특허출원 공개 제2005/0260186호 및 미국 특허출원 공개 제2006/0104968호에 기재되어 있다. 한 양태에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가 글리코스아미노글리카나제(glycosaminoglycanases), 예컨대, 콘드로이티나제(chondroitinases)와 병용된다.
예시적 동결건조된 항체 제제는 미국 특허 제6,267,958호에 기재되어 있다. 수성 항체 제제는 미국 특허 제6,171,586호 및 국제 특허출원 공개 제2006/044908호에 기재된 제제들을 포함하고, 후자 제제는 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
본원의 제제는 치료될 구체적인 증상에 필요한 하나 초과의 활성 성분들, 바람직하게는 서로에게 불리한 영향을 미치지 않는 상보적인 활성을 갖는 활성 성분들도 함유할 수 있다. 이러한 활성 성분들은 적합하게는 의도된 목적에 효과적인 양으로 함께 존재한다.
활성 성분은 예를 들면, 코아세르베이션 기법 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들면, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들면, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 중의 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 이러한 기법들은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)]에 개시되어 있다.
지속 방출 제제가 제조될 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예에는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되고, 상기 매트릭스는 성형된 제품, 예를 들면, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태로 존재한다.
생체내 투여에 사용되는 제제는 일반적으로 멸균되어 있다. 멸균성은 예를 들면, 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
D. 치료 방법 및 조성물
본원에서 제공된 복합체들 중 임의의 복합체는 치료 방법에서 사용될 수 있다.
한 양태에서, 약제로서 사용되는 본원에 보고된 복합체가 제공된다.
추가 양태에서, 암 또는 바이러스 감염의 치료에 사용되는 본원에 보고된 복합체가 제공된다.
일부 실시양태들에서, 치료 방법에서 사용되는 본원에 보고된 복합체가 제공된다.
일부 실시양태들에서, 본 발명은 유효량의 본원에 보고된 복합체를 암 또는 바이러스 감염을 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체를 치료하는 방법에서 사용되는 본원에 보고된 복합체를 제공한다. 이러한 한 실시양태에서, 상기 방법은 예를 들면, 후술되어 있는 바와 같이 유효량의 하나 이상의 추가 치료제를 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 암세포의 제거 또는 바이러스 감염된 세포의 제거에 사용되는 본원에 보고된 복합체를 제공한다. 일부 실시양태들에서, 본 발명은 암세포의 제거 또는 바이러스 감염된 세포의 제거에 효과적인 본원에 보고된 복합체를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 암세포를 제거하거나 바이러스 감염된 세포를 제거하는 방법에서 사용되는 본원에 보고된 복합체를 제공한다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 약제의 제작 또는 제조에 있어서 본원에 보고된 복합체의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 약제는 암 또는 바이러스 감염의 치료를 위한 약제이다. 추가 실시양태에서, 상기 약제는 유효량의 약제를 암 또는 만성 바이러스 감염을 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 또는 바이러스 감염을 치료하는 방법에서 사용되는 약제이다. 이러한 한 실시양태에서, 상기 방법은 유효량의 하나 이상의 추가 치료제를 상기 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 상기 약제는 암세포의 제거 또는 바이러스 감염된 세포의 제거를 위한 약제이다. 추가 실시양태에서, 상기 약제는 유효량의 약제를 개체에게 투여하여 암세포를 제거하거나 바이러스 감염된 세포를 제거하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 암세포를 제거하거나 바이러스 감염된 세포를 제거하는 방법에서 사용되는 약제이다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 암 또는 바이러스 감염을 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 유효량의 본원에 보고된 복합체를 이러한 암 또는 바이러스 감염을 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 한 실시양태에서, 상기 방법은 유효량의 하나 이상의 추가 치료제를 상기 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 개체에서 암세포 또는 바이러스 감염된 세포를 제거하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 유효량의 본원에 보고된 복합체를 상기 개체에게 투여하여 암세포 또는 바이러스 감염된 세포를 제거하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, "개체"는 인간이다.
추가 양태에서, 본 발명은 예를 들면, 상기 치료 방법들 중 임의의 치료 방법에서 사용되는 임의의 본원에 보고된 복합체를 포함하는 약학 제제를 제공한다. 한 실시양태에서, 약학 제제는 임의의 본원에 보고된 복합체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 약학 제제는 임의의 본원에 보고된 복합체 및 하나 이상의 추가 치료제를 포함한다.
본 발명의 복합체는 치료에서 단독으로 또는 다른 약제와 함께 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 복합체는 하나 이상의 추가 치료제와 함께 공투여될 수 있다.
전술된 이러한 병용치료는 조합된 투여(2종 이상의 치료제들이 동일한 또는 별도의 제제에 포함되어 있음) 및 분리된 투여(이 경우, 본 발명의 복합체의 투여는 추가 치료제 및/또는 보조제의 투여 전에, 추가 치료제 및/또는 보조제의 투여와 동시에, 및/또는 추가 치료제 및/또는 보조제의 투여 후에 일어날 수 있음)를 포괄한다. 본 발명의 복합체는 방사선 치료와 함께 사용될 수도 있다.
본 발명의 복합체(및 임의의 추가 치료제)는 비경구 투여, 폐내 투여 및 비내 투여, 및 국소 치료가 요구되는 경우 병변내 투여를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 관주는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 투약은 부분적으로 투여가 단기 투여인지 아니면 장기 투여인지에 따라 임의의 적합한 경로, 예를 들면, 주사, 예컨대, 정맥내 또는 피하 주사에 의해 달성될 수 있다. 단회 투여 또는 다양한 시점에 걸친 다회 투여, 볼루스 투여 및 펄스 관주를 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 투약 스케쥴이 본원에서 고려된다.
본 발명의 복합체는 우수한 의학적 관행에 일치하는 방식으로 제제화되고 조제되고 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려될 인자는 치료될 구체적인 장애, 치료될 구체적인 포유동물, 개별 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 약제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케쥴 및 의료인에게 공지된 다른 인자를 포함한다. 상기 복합체는 해당 장애의 예방 또는 치료를 위해 현재 사용되는 하나 이상의 약제와 함께 제제화될 필요는 없지만 임의적으로 이러한 약제와 함께 제제화된다. 이러한 다른 약제의 유효량은 제제에 존재하는 복합체의 양, 장애 또는 치료의 유형 및 상기 논의된 다른 인자에 의해 좌우된다. 이들은 일반적으로 본원에 기재된 용량 및 투여 경로와 동일한 용량 및 투여 경로로 사용되거나, 본원에 기재된 용량의 약 1% 내지 99%의 용량으로 사용되거나, 실험적으로/임상적으로 적절한 것으로 확인된 임의의 용량 및 임의의 경로로 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, (단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가 치료제와 함께 사용될 때) 본 발명의 복합체의 적절한 용량은 치료될 질환의 유형, 복합체의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 복합체가 예방 목적으로 투여되는지 아니면 치료 목적으로 투여되는지 여부, 선행 치료, 환자의 임상 병력 및 복합체에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 의해 좌우될 것이다. 복합체는 적합하게는 한 시점에서 환자에게 투여되거나 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg(예를 들면, 0.5 mg/kg 내지 10 mg/kg)의 복합체가 예를 들면, 1회 이상의 분리된 투여 또는 연속 관주에 의해 환자에게 투여될 초기 후보 용량일 수 있다. 한 전형적인 1일 용량은 전술된 인자들에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상일 것이다. 여러 날 또는 그 이상의 기간에 걸친 반복된 투여를 위해, 치료는 병태에 따라 일반적으로 질환 증상의 원하는 억제가 일어날 때까지 지속될 것이다. 항체의 한 예시적 용량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg(또는 이들의 임의의 조합)의 1회 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은 (예를 들면, 환자가 약 2회 내지 약 20회, 또는 예를 들면, 약 6회 용량의 항체를 제공받도록) 간헐적으로, 예를 들면, 매주 또는 3주마다 투여될 수 있다. 초기 보다 높은 적재 용량 후 1회 이상의 보다 낮은 용량이 투여될 수 있다. 그러나, 다른 투약법이 유용할 수 있다. 이 치료의 진행은 통상적인 기법 및 어세이에 의해 용이하게 모니터링된다.
본원에 보고된 복합체 대신에 또는 이외에 본 발명의 면역접합체를 사용하여 상기 제제들 또는 치료 방법들 중 임의의 제제 또는 치료 방법을 수행할 수 있다는 것이 이해된다.
본원에 보고된 한 양태는 환자에서 암 또는 바이러스 감염을 치료하는 방법에서 사용되는 본원에 보고된 복합체이고, 이때 상기 복합체는 복합체에 포함된 바이러스-유래된 펩티드를 사용한 상기 환자의 면역화 전에, 상기 면역화와 동시에 또는 상기 면역화 후에 투여되어야 한다.
본원에 보고된 한 양태는 복합체에 포함된 바이러스-유래된 펩티드에 대한 면역화와 함께 암 또는 바이러스 감염의 치료용 약제의 제조를 위한 본원에 보고된 복합체의 용도이다.
제1 단계에서, 복합체에 함유된 바이러스-유래된 펩티드가 치료될 개체에게 먼저 투여된다. 일정한 기간 후, 즉 4일 내지 28일 후, 본원에 보고된 복합체가 상기 개체에게 투여된다.
본원에 보고된 복합체에서 제1 단계 단독 및 제2 단계에서의 바이러스-유래된 폴리펩티드의 이 연속적인 분리된 적용에 의해, 바이러스-유래된 펩티드-특이적 T-세포의 수를 증가시켜 치료 효능을 증가시킬 수 있다.
III. 제품
본 발명의 또 다른 양태에서, 전술된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 상기 제품은 용기; 및 용기 상의 또는 용기에 부착된 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들면, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대, 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 그 자체로 존재하는 조성물, 또는 병태의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 또 다른 조성물과 병용되는 조성물을 보유하고 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들면, 용기는 정맥내 용액 백일 수 있거나 피하 주사 바늘에 의해 천공될 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 조성물 중의 하나 이상의 활성 약제는 본 발명의 복합체이다. 표지 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택된 병태의 치료에 사용된다는 것을 표시한다. 나아가, 제품은 (a) 본 발명의 복합체를 포함하는 조성물을 내부에 함유하는 제1 용기; 및 (b) 추가 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함하는 조성물을 내부에 함유하는 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 이 실시양태에서 제품은 조성물이 특정 병태의 치료에 사용될 수 있다는 것을 표시하는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 제품은 약학적으로 허용가능한 완충제, 예컨대, 주사용 정균수(BWFI), 포스페이트 완충 식염수, 링커 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2(또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제품은 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하는, 상업적 및 사용자 관점에서 볼 때 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
상기 제품들 중 임의의 제품이 본원에 보고된 복합체 대신에 또는 이외에 본 발명의 면역접합체를 포함할 수 있다는 것이 이해된다.
IV . 실시예
하기 실시예는 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 상기 제공된 일반적인 설명이 주어진 한, 다양한 다른 실시양태들이 실시될 수 있다는 것이 이해된다.
실시예 1
인간 공여자로부터 CMV-특이적 CD8 양성 T-세포를 단리하고 자극하는 절차
PBL의 단리
피콜(Ficoll) 구배 원심분리로 인간 공여자 혈액(그레이너 바이오-원(Greiner bio-one), 카탈로그 번호 227290)으로부터 PBL을 단리하였다. PBL을 5% 인간 혈청(시그마(Sigma), 카탈로그 번호 H2520), 2 mM L-글루타민(판 바이오텍(PAN Biotech), 카탈로그 번호 P04-80100), 100 ㎍/㎖ 페니실린/스트렙토마이신(로슈(Roche), 카탈로그 번호 14001100)으로 보충된 RPMI에서 배양하였다.
PBL의 자극
세포(2 x 107개 세포/㎖)를 세포 배양 조건(37℃, 5% CO2, 80% 습도) 하에 50 ㎍/㎖ CMV pp65-유래된 펩티드(서열번호 1)로 보충된 세포 배양 배지에서 2시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포 현탁액을 배양 배지로 20배 희석하고 96웰 당 2 x 105개 세포의 시딩 밀도로 평저 96웰 플레이트에서 더 배양하였다. 4일 내지 5일 후, 20 U/㎖ IL-2(로슈, 카탈로그 번호 11011456001), 25 ng/㎖ IL-7(페프로텍(Peprotech), 카탈로그 번호 200-01) 및 25 ng/㎖ IL-15(페프로텍, 카탈로그 번호 200-15)를 첨가하고 세포를 또 다른 7일 내지 8일 동안 배양하였다. T-세포의 자극이 세포 클러스터로서 현미경 하에 가시화된다.
PBL의 재자극
T-세포를 (새로 준비되었거나 동결된 저장액으로부터 유래된) 동일한 공여자의 펩티드-펄싱된 자가 일차 PBL인 자극제 세포와 함께 공배양하였다. 상기 자극제 세포를 전술된 바와 같이 펩티드로 펄싱하였다. 2시간의 펩티드 항온처리 후, PBL을 방사선에 노출시키고(4000 rad; STS GmbH OB29 Nr.9510-5) 펩티드 없는 배양 배지로 2회 세척하였다. 재자극을 96웰 환저 플레이트에서 수행하였다. 96웰 당 8 x 104개 내지 1 x 105개 자극제 세포를 사용하였다. 일차 배양물로부터의 세포를 배양 배지로 2회 세척하고 200 ㎕ 배양 배지에 재현탁하고 80 ㎕를 상기 자극제 세포의 각각의 웰로 옮겼다. 3일 후, 20 U/㎖ IL-2, 25 ng/㎖ IL-7 및 25 ng/㎖ IL-15를 첨가하였다. 세포는 증식하지 않았고 새로운 배지를 갖는 새로운 웰에서 2일 내지 3일마다 증폭되었다.
T-세포의 분석
CD8 발현(BD, 카탈로그 번호 345772) 및 CMV-특이적 T-세포 수용체(프로이뮨, 카탈로그 번호 F008-4A-E)에 대해 세포를 염색하고 FACS에서 분석하였다.
세포 배양 배지
RPMI1640(판 바이오텍, 카탈로그 번호 P04-17500), 5% 인간 혈청(HS; 시그마 카탈로그 번호 H2520), 2 mM L-글루타민(판 바이오텍, 카탈로그 번호 P04-80100), 100 ㎍/㎖ 페니실린/스트렙토마이신(로슈, 카탈로그 번호 14001100).
결과
인간 공여자-유래된 말초혈 림프구(PBL)의 FACS 분석을 수행하였다. 세포를 APC-접합된 Pro5 오량체(프로이뮨, 카탈로그 번호 F008-4A-E)와 병용된 FITC-접합된 항-CD8 항체(BD, 카탈로그 번호 345772)로 표지하여, CMV-유래된 펩티드(NLVPMVATV(서열번호 1))로 적재된 MHC 클래스 I(HLA-A*0201)을 인식하는 T-세포 수용체(TCR)를 보유하는 T-세포를 염색하였다. 결과에 대해서는 도 4를 참조한다. 0일째 날, 공여자 1 및 4는 낮은 수의 CMV-특이적 CD8 T-세포(각각 0.08% 및 0.1%)를 보유한다. 공여자 2 및 3은 그들의 말초혈에서 보다 높은 수의 CMV-특이적 CD8 T-세포를 보유한다(각각 0.25% 및 3.12%). CMV-유래된 펩티드-펄싱된 자가 세포로 자극한 지 14일 후, 공여자 2 및 3만이 CMV-특이적 CD8 T-세포에서의 유의한 증가를 보인 반면(각각 6.2% 및 71.2%), 공여자 1 및 4는 증가된 수의 CMV-특이적 CD8 T-세포를 보이지 않는다(각각 0.01% 및 0.05%). CMV-유래된 펩티드-펄싱된 자가 세포로 다시 자극한 지 또 다른 14일 후, 공여자 2 및 3은 CMV-특이적 CD8 T-세포에서의 추가 증가를 보인다(각각 15.1% 및 96.6%).
실시예 2
세포독성 어세이
급성 림프모구성 백혈병 세포 MN60은 A*0201 HLA-A 대립형질을 보유한다. MN60 세포(1 x 106개 세포/㎖)를 세포 배양 조건(37℃, 5% CO2, 80% 습도) 하에 50 ㎍/㎖ CMV pp65 펩티드(서열번호 1)와 함께 45분 동안 항온처리하였다. 상기 항온처리는 HLA-A*0201 펩티드 결합 홈에서의 펩티드 교환을 야기한다. 펩티드 교환된 MN60 세포를 원심분리하고 PBS(판 바이오텍, 카탈로그 번호 P04-36500)로 1 x 106개 세포/㎖의 밀도까지 희석하고 실온(RT)에서 1 μM의 세포 트레이서 카복시플루오레세인 석신이미딜 에스터(CFSE, 인비트로겐(Invitrogen), 카탈로그 번호 34554)로 15분 동안 염색하였다. 그 후, 세포를 PBS로 1회 세척하고 AIM-V 배지(깁코(Gibco), 카탈로그 번호 0870112DK)로 1 x 105개 세포/㎖까지 희석하였다. 어세이를 위해, 세포 배양 조건 하에 MN60 세포(표적 세포)를 96웰 환저 플레이트에서 CMV-특이적 인간 공여자 3-유래된 CD8+ T-세포(효과기 세포, 실시예 1 참조)와 함께 4시간 동안 공배양하였다. 효과기 대 표적 세포 비는 4:1이었다. 사멸 세포를 1 ㎕/100 ㎕ 프로피듐 요오다이드(PI, 시그마, 카탈로그 번호 P-4864)로 염색하고 FACS로 분석하였다.
결과
유세포분석을 수행함으로써 CMV 펩티드로 적재된 MN60 종양 세포의 용해를 통해 자극된 CTL의 세포용해 능력을 분석하였다.
도 5a에서, CMV-유래된 펩티드로 적재되지 않은 MN60 세포의 공배양물의 FACS 분석이 나타나 있다. MN60 세포는 FITC 양성이다. 효과기 세포는 FITC 음성이다. 사멸 세포는 PI 양성이고, 생존 세포는 PI 음성이다. MN60 세포가 CMV-유래된 펩티드(Q2 및 Q4)로 적재되지 않은 경우 85% 초과의 MN60 세포가 생존한다는 것을 알 수 있다.
도 5b에서, CMV-유래된 펩티드로 적재된 MN60 세포의 FACS 분석이 나타나 있다. 80% 초과의 MN60 세포가 사멸한 반면(Q2 및 Q4), 생존 효과기 세포와 사멸 효과기 세포의 비는 도 5a에 나타낸 FACS 분석과 도 5b에 나타낸 FACS 분석 사이에 현저히 변경되지 않는다는 것을 알 수 있는데(도 5a 및 도 5b에서 Q1과 Q3을 비교함), 이것은 CMV 펩티드-적재된 표적 세포의 특이적 용해를 암시한다.
효과기 대 표적 세포 비에 따라 CMV 펩티드로 적재된 MN60 종양 세포의 용해를 통해 자극된 CTL의 세포용해 능력을 분석하기 위한 유세포분석:
상기 세포독성 어세이를 전술된 바와 같이 수행하였다. 표적 세포 당 0.5개 효과기 세포 내지 표적 세포 당 4개 효과기 세포의 상이한 효과기 세포 대 표적 세포 비를 적용하였다(도 6 참조). 항온처리 시간은 4시간이었다. CMV-유래된 펩티드로 적재되지 않은 MN60 세포는 증가된 효과기 대 표적 비에서 증가된 수의 사멸 세포를 보이지 않는다(즉, 비 0.5:1 내지 4:1에서 8% 내지 13%).
CMV-유래된 펩티드로 적재된 MN60 세포의 약 20%가 0.5:1의 낮은 효과기 대 표적 비에서 4시간 이내에 이미 사멸되어 있다. 사멸 세포의 수는 효과기 대 표적 비의 증가에 따라 급격히 증가하여 표적 세포 당 4:1 효과기 세포의 비에서 83%까지 도달한다.
실시예 3
DNA 준비, 형질감염, 발현, 정제 및 분석
DNA 준비
250 ㎖의 밤샘 세균 LB 배양물을 회수하고 플라스미드 DNA를 제조자의 프로토콜(하이 스피드 맥시(High speed Maxi) 키트, 퀴아젠(Qiagen), 카탈로그 번호 12663)에 따라 추출하였다. 수득된 플라스미드 DNA를 1 ㎖ TE 완충제로 용출하고 DNA 농도를 분광광도 측정(에포크 바이오텍(Epoch, BioTek))으로 측정하였다.
최종 발현 벡터는 하기 요소들을 포함하였다:
- 핵산내부분해 제한 부위 HindIII, NheI,
- CMV 프로모터,
- (인간 CMV로부터 유래된) 5' UTR 1,
- 인트론 A,
- 5' UTR 2,
- 앰피실린 내성 유전자,
- BGH 폴리 A 부위(소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호),
- pUC Ori.
복합체의 요소들의 아미노산 서열
Figure 112013116864789-pct00007
Figure 112013116864789-pct00008
Figure 112013116864789-pct00009
형질감염
HEK293 세포를 형질감염 전날 8 x 105개 세포/㎖까지 희석하였다. 약 1 내지 1.6 x 106개 세포/㎖를 제조자의 프로토콜에 따라 형질감염시켰다. 30 ㎖의 최종 형질감염 부피를 위해, 30 ㎍ DNA를 옵티(Opti)-멤(MEM, 등록상표) I 환원된 혈청 배지(깁코, 카탈로그 번호 31985070)로 1 ㎖의 최종 부피까지 희석하였다. 1 ㎍ DNA 당 2 ㎕의 293펙틴(fectin, 상표) 시약(인비트로겐, 카탈로그 번호 12347019)을 옵티-멤(등록상표) 배지로 1 ㎖의 최종 부피까지 동등하게 희석하고 5분 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 희석된 DNA를 희석된 293펙틴(상표) 시약에 첨가하고 약하게 혼합하고 또 다른 20분 내지 30분 동안 항온처리한 후 피펫으로 28 ㎖의 HEK293 세포에 적가하여 30 ㎖의 최종 부피를 수득하였다. 세포를 125 rpm에서 회전하는 궤도 진탕기 상에서 세포 배양 조건(37℃, 8% CO2, 80% 습도) 하에 항온처리하고 72시간 후 회수하였다. 회수물을 1000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후 3000 rpm에서 10분 동안 원심분리하고 22 ㎛ 멸균 필터(밀리포어(Millipore), 카탈로그 번호 SCGPU05RE)를 통해 여과하였다.
웨스턴 블롯팅
500 ㎕의 세포 배양물 상청액을 팔 나노셉 오메가-멤브란(Pall Nanosep Omega-Membran) 30KD 원심분리 장치(팔(Pall), 카탈로그 번호 OD030C33)로 50 ㎕의 부피까지 농축하였다. 각각의 농축물 17.5 ㎕를 4x XT 샘플 완충제(바이오라드(BioRad), 카탈로그 번호 161-0791) 및 20x XT 환원제(바이오라드, 카탈로그 번호 161-0792)로 25 ㎕의 최종 부피까지 희석하고 96℃에서 8분 동안 가열하고 4% 내지 12% 크리테리온 XT 프리캐스트(Criterion XT Precast) 겔(카탈로그 번호 345-0124) 상에 적재하였다. 트랜스-블롯 퓨어(Trans-blot Pure) 니트로셀룰로스 막(0.45 ㎛)(바이오라드, 카탈로그 번호 162-0117) 상에서 20 V에서 트랜스-블롯 SD 반건조 트랜스퍼 셀(Transfer Cell)(바이오라드)을 사용하여 블롯팅을 30분 동안 수행하였다. 실온에서 1x 웨스턴 차단 시약(로슈, 카탈로그 번호 11921681001)을 사용하여 상기 막의 차단을 1시간 동안 수행하였다. 실온에서 퍼록시다제-접합된 다중클론 토끼 항-인간 κ-경쇄(다코(DAKO), 카탈로그 번호 P0129, 1:3000으로 희석됨) 및 다중클론 토끼 항-인간 IgG 항체 HRP 접합체(다코, 카탈로그 번호 P0214, 1:5000으로 희석됨)를 사용하여 염색을 1시간 동안 수행하였다. 루미-이미저(LUMI-Imager) F1(로슈)을 사용하여 발광 검출을 수행하였다.
정제
원심분리로 배양 배지로부터 세포를 제거하였다. 단백질 A 친화성 크로마토그래피(악타-아반트(AKTA-Avant) 상의 맙셀렉트-세파로스(MabSelect-Sepharose))로 상청액으로부터 복합체를 정제하였다. 용출된 복합체를 아미콘(Amicon) 원심분리 튜브로 3 mg/㎖의 단백질 농도까지 농축하였다. 분취액을 크기 배제 크로마토그래피(HPLC TSKgel GFC300 Sys89) 상에서 분석하였다. 수퍼덱스(Superdex) 200 상의 분취 SEC를 수행하여 응집체를 제거하고 20 mM 히스티딘 및 140 mM NaCl(pH 6.0) 중의 융합 단백질을 완충시켰다. 용출된 복합체를 아미콘 원심분리 튜브로 1 mg/㎖의 단백질 농도까지 농축하고 멸균 여과하였다(0.2 ㎛ 공극 크기).
분석
UV 분광광도계를 이용하여 복합체 샘플을 OD280으로 분석하여 용액 중의 단백질 농도를 측정하였다. 이를 위해 요구되는 흡광 계수를 페이스(Pace)(문헌[Pace, et al., Protein Science 4 (1995) 2411-2423])에 따라 아미노산 서열로부터 계산하였다. 0.25 M KCl을 포함하는 0.2 M 인산칼륨 완충제(pH 7.0)를 이동상으로서 사용하여 TSK-Gel300SWXL 또는 수퍼덱스 200 컬럼 상에서 크기 배제 크로마토그래피(SE-HPLC)를 수행하여 샘플 중의 단량체 종, 응집된 종 및 분해된 종의 함량을 측정하였다. 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(환원 및 비환원)을 수행하여 생성물-관련된 분해 생성물 및 생성물-비관련된 불순물에 대하여 복합체 제제의 순도를 분석하였다. 환원된(TCEP) 샘플 및 탈글리코실화된(N-글리코시다제 F) 샘플을 사용하여 전기분무 이온화 질량 분광측정(ESI-MS)을 수행함으로써 각각의 쇄의 정확한 질량/본질을 확인하고 화학적 변경을 검출하였다. 탈글리코실화된 샘플의 ESI-MS를 수행하여 전체적으로 조립된 단백질의 성질 및 질을 분석하고 잠재적인 생성물-관련된 부산물을 검출하였다.
방법 SDS-PAGE 및 쿠마시에 염색
장치: 인비트로겐 엑스셀 슈어 락 미니-셀(Invitrogen XCell Sure Lock Mini-Cell)
겔: 4% 내지 20% 트라이스-글리신 겔, 인비트로겐 EC6025BOX
완충제: 트라이스-글리신 SDS 런닝 완충제(10x), 인비트로겐 LC2675-5
샘플 완충제: 트라이스-글리신 SDS 샘플 완충제(2x), 인비트로겐 LC2676
환원 완충제: NuPAGE 샘플 환원제(10x), 인비트로겐 NP0004
분자량 마커: 마크(Mark) 12, MW 표준물, 인비트로겐 LC5677
단백질 샘플 준비
샘플을 완충제로 1 mg/㎖의 단백질 농도까지 조절하였다. 샘플 환원을 위해, 하기 절차를 수행하였다:
- 환원 완충제: 4 ㎖ 샘플 완충제(2x) 및 1 ㎖ 환원 완충제(10x)
- 환원 완충제로 샘플을 1:1로 희석한다.
- 70℃에서 5분 동안 항온처리한다.
겔 전기영동을 125 V에서 90분 동안 수행하였다. 겔을 심플리 블루 세이프 스테인(Simply Blue Safe Stain)(인비트로겐, 카탈로그 번호 LC6065)으로 염색하였다.
결과
Figure 112013116864789-pct00010
Figure 112013116864789-pct00011
Figure 112013116864789-pct00012
선택된 복합체(상기 표에 따른 번호 1 및 2a)의 쿠마시에 염색을 이용한 SDS 겔 및 상응하는 SEC 크로마토그램은 도 7 및 8에 나타나 있다. 정의된 복합체가 수득될 수 있다는 것을 알 수 있다.
실시예 4
MHC-항체-융합체와 인간 IGF-1R 양성 세포주의 결합
H460M2 세포를 AIM-V 배지(깁코, 카탈로그 번호 0870112DK)로 8 x 105개 세포/㎖까지 희석하였다. 500 ㎕의 세포 현탁액을 4℃ 또는 37℃에서 10 ㎍의 본원에 보고된 복합체로 1시간 동안 염색하였다. 그 후, 세포를 빙냉 AIM-V 배지로 1회 세척하고, R-PE에 접합된 염소 F(ab')2 항-인간 IgG(H+L) 항체인 제2 항체(다이아노바(Dianova), 카탈로그 번호 109-116-088, 1:50으로 희석됨)로 4℃에서 30분 동안 염색하였다. 그 후, 세포를 빙냉 AIM-V 배지로 1회 세척하고 생존 세포에 대한 게이팅(gating)으로 FACS 칸토(Canto) II(비디 바이오사이언시스(BD Bioscience))를 통해 형광을 측정하였다. 이중특이적 항체는 동종형 대조군으로서 사용되었고, 항-IGF-1R 항체(예를 들면, 국제 특허출원 공개 제2004/087756호 및 국제 특허출원 공개 제2007/115814호 참조)는 양성 대조군으로서 사용되었다.
결과
결과는 도 9에 나타나 있다. PE-형광 측정(X-축)에서의 변동을 고려할 때, 본원에 보고된 복합체는 대조군 항체(도 9-6)에 비해 H460M2 표적 세포와의 결합에 있어서 가시적인 차이를 보이지 않는다(도 9-2). 또한, 본원에 보고된 복합체와의 항온처리가 4℃에서 달성되든 아니면 37℃에서 달성되든 차이가 없다(도 9-2 대 도 9-3 참조). 동종형 대조군과의 항온처리(도 9-4) 및 형광-표지된 이차 항체 단독과의 항온처리(도 9-5) 둘다가 PE 형광 측정에 있어서 임의의 변동을 보이지 않는다. MHC 클래스 I 분자의 융합에도 불구하고, 본원에 보고된 복합체의 항체 가변 도메인은 여전히 H460M2 표적 세포에 결합한다.
상기 발명은 명확한 이해를 목적으로 설명 및 실시예에 의해 다소 상세히 기재되어 있지만, 설명 및 실시예가 본 발명의 범위를 한정하는 것으로서 해석되어서는 안 된다. 본원에서 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 전체적으로 명백히 참고로 도입된다.
실시예 5
항원 발현 세포의 시험관내 제거
I24 표적 세포(1 x 105개 세포/㎖)를 세포 배양 배지(2 mM L-글루타민, 1 mM 피루브산나트륨, 0.1 mM NEAA 및 10%(부피/중량) FCS로 보충된 RPMI1640)에서 24시간 내지 48시간 동안 시딩하였다. 윌코(WillCo) 글래스 바닥 접시를 접시 당 50 ㎍/㎖ 폴리-L-라이신 하이드로클로라이드(시그마 알드리치(Sigma Aldrich), 카탈로그 번호 P2658)로 30분 동안 미리 코딩하였다. 코팅 후, 상기 접시를 멸균 조직 배양 등급의 물로 철저히 세정하고 2시간 동안 건조하였다.
배양 후, 세포 배양 배지를 제거하고, 1개의 [CMV-pp65-펩티드]-[연결제 1]-[β2-마이크로글로불린]-[연결제 2]-[HLA-A-α1-α2-α3]-[연결제 3]-[홀 변이를 갖는 IgG1-L234A, L235A 돌연변이체] 융합 폴리펩티드, 1개의 IgG1-L234A, L235A 돌연변이체 Fc-영역 크놉 변이체 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 및 1개의 Ig 경쇄를 포함하는 항원 결합 복합체(이때, 이 복합체는 본원에서 보고된 바와 같이 인간 IGF-1R에 특이적으로 결합함(예를 들면, 실시예 3 참조))를 (0.5 mM DL-다이티오트레이톨, 1 mM 아스코르브산 및 4 mM 글루타티온으로 보충된) 3 mM K+ 크렙스 링거(Krebs Ringer) HEPES 완충제(pH 7.3) 중의 5 ㎍/㎖의 최종 농도로 첨가하였다.
T-세포를 1:10의 표적 세포 대 효과기 세포 비로 첨가하였다. 제이스 악시오버트(Zeiss Axiovert) 135 현미경으로 영상화를 4시간 동안 수행하였다.
결과
도 10에서, 1개의 [CMV-pp65-펩티드]-[연결제 1]-[β2-마이크로글로불린]-[연결제 2]-[HLA-A-α1-α2-α3]-[연결제 3]-[홀 변이를 갖는 IgG1-L234A, L235A 돌연변이체] 융합 폴리펩티드, 1개의 IgG1-L234A, L235A 돌연변이체 Fc-영역 크놉 변이체 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 및 1개의 Ig 경쇄를 포함하는 항원 결합 복합체(이때, 이 복합체는 인간 IGF-1R에 특이적으로 결합함)의 항온처리의 현미경 영상화가 나타나 있다. 상기 복합체는 인간 IGF-1R 발현 I24 3T3 세포(큰 부착 생장 세포, 백색 화살표)의 용해를 매개하였다는 것을 알 수 있다. 용해는 인간 CMV-특이적 T-세포(둥근 형태의 작은 세포(백색 화살표), 또는 아메바 모양의 이동 세포(흑색 화살표))에 의해 매개된다. I24 세포를 5 ㎍/㎖ 농도의 상기 복합체 및 인간 CMV-특이적 T-세포(HLA-A0201+/CMV 펩티드-펄싱된 APC로 미리 활성화됨)와 함께 항온처리한다. 시간 경과는 각각의 사진 아래에 표시되어 있다. 56분 및 76분에서 I24 세포와 T-세포의 상호작용 및 나중에 125분 후 I24 세포의 붕괴를 주목한다.
도 11에서, 본원에 보고된 항원 결합 복합체의 부재 하에 인간 CMV-특이적 T-세포(둥근 형태의 작은 세포(백색 화살표), 또는 아메바 모양의 이동 세포(흑색 화살표))를 통한 I24 3T3 세포(큰 부착 생장 세포, 백색 화살표)의 용해의 부재를 보여주는 대조군의 현미경 영상화가 나타나 있다. I24 세포를 특이적 세포독성 T-세포(HLA-A0201+/CMV 펩티드-펄싱된 APC로 미리 활성화됨)와 함께 항온처리한다. 시간 경과는 각각의 사진 아래에 표시되어 있다.
실시예 6
세포독성 어세이
세포 배양 배지(50 ㎕)를 피펫으로 엑스셀리겐스(Xcelligence) 96웰 E-플레이트(로슈, 카탈로그 번호 05232368001)의 각각의 웰 내로 첨가하여 배경 측정을 수행하였다.
I24 세포를 세포 배양 배지(RPMI1640, 2 mM L 글루타민, 1 mM 피루브산나트륨, 0.1 mM NEAA, 10%(부피/중량) FCS)로 1 x 106개 세포/㎖까지 희석하고, 50 ㎕(2 x 104개 세포/웰)를 피펫으로 엑스셀리겐스 96웰 플레이트의 각각의 웰에 100 ㎕의 최종 부피까지 첨가하고 24시간 동안 배양하였다(37℃, 8% CO2, 80% 습도). 24시간 후, 배지를 제거하고, 세포를 200 ㎕의 AIM-V(무혈청 배지(인비트로겐) T-세포 배지(카탈로그 번호: 12055-083)) 배지로 세척하였다. 1개의 [CMV-pp65-펩티드]-[연결제 1]-[β2-마이크로글로불린]-[연결제 2]-[HLA-A-α1-α2-α3]-[연결제 3]-[홀 변이를 갖는 IgG1-L234A, L235A 돌연변이체] 융합 폴리펩티드, 1개의 IgG1-L234A, L235A 돌연변이체 Fc-영역 크놉 변이체 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 및 1개의 Ig 경쇄를 포함하는 항원 결합 복합체(이때, 이 복합체는 본원에 보고된 바와 같이 인간 IGF-1R에 특이적으로 결합함)를 AIM-V 배지 중의 1 ㎍/㎖의 최종 농도로 상기 세척된 표적 세포에 첨가하였다. 효과기 세포를 상당한 비로 150 ㎕의 최종 부피까지 AIM-V 배지에 첨가하였다. 인간 IGF-1R에 대해 유도된 푸코실 결핍된 IgG1 단일클론 항체(항-IGF-1R 항체-푸코실 결핍) 및 비결합 인간 항-다이곡시제닌 항체(항-다이곡시제닌 항체)는 각각 동종형 대조군 및 특이적 항체 대조군으로서 사용되었다. 엑스셀리겐스 시스템(로슈)을 사용하여 측정을 각각 6시간 내지 9시간 동안 수행하였다.
결과
본원에 보고된 복합체는 인간 CMV-특이적 T-세포를 통해 H460M2 종양 세포의 용해를 유발한다.
1개의 [CMV-pp65-펩티드]-[연결제 1]-[β2-마이크로글로불린]-[연결제 2]-[HLA-A-α1-α2-α3]-[연결제 3]-[홀 변이를 갖는 IgG1-L234A, L235A 돌연변이체] 융합 폴리펩티드, 1개의 IgG1-L234A, L235A 돌연변이체 Fc-영역 크놉 변이체 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 및 1개의 Ig 경쇄를 포함하는 1 ㎍/㎖의 복합체(이때, 이 복합체는 인간 IGF-1R에 특이적으로 결합함) 및 각각의 비(1:1.5 내지 1:0.5)의 특이적 T-세포를 종양 세포와 함께 4시간 동안 항온처리하였다(도 12 참조). 용해의 백분율은 각각의 막대 위에 표시되어 있다. 인간 IGF-1R에 대해 유도된 푸코실 결핍된 IgG1 단일클론 항체(MAB IGF-1R-afu)는 유의한 종양 세포 용해를 유발하지 않았다.
본원에 보고된 복합체는 인간 CMV-특이적 T-세포를 통해 I24 3T3 표적 세포의 용해를 유발한다.
1개의 [CMV-pp65-펩티드]-[연결제 1]-[β2-마이크로글로불린]-[연결제 2]-[HLA-A-α1-α2-α3]-[연결제 3]-[홀 변이를 갖는 IgG1-L234A, L235A 돌연변이체] 융합 폴리펩티드, 1개의 IgG1-L234A, L235A 돌연변이체 Fc-영역 크놉 변이체 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 및 1개의 Ig 경쇄를 포함하는 1 ㎍/㎖의 항원 결합 복합체(이때, 이 복합체는 인간 IGF-1R에 특이적으로 결합함) 및 각각의 비(1:1.5 내지 1:0.5)의 특이적 T-세포를 표적 세포와 함께 4시간 동안 항온처리하였다(도 13 참조). 용해의 백분율은 각각의 막대 위에 표시되어 있다. 인간 IGF-1R에 대해 유도된 푸코실 결핍된 IgG1 단일클론 항체(항-IGF-1R 항체-푸코실 결핍됨) 및 비결합 인간 항-다이곡시제닌 항체(항-다이곡시제닌 항체)는 유의한 표적 세포 용해를 유발하지 않았다.
실시예 7
시험관내 효능
낮은 효과기 세포 대 표적 세포 비(종양 세포 당 1.5 내지 0.5 특이적 T-세포)에서 IGF-1R 양성 폐 선암종 세포주 H460M2를, hCMV-유래된 펩티드 및 항-IGF-1R 항체를 포함하는 1 ㎍/㎖의 복합체 및 인간 CMV-특이적 CD8 양성 T-세포와 함께 항온처리하였다. 대조군 항체는 당조작된 항-IGF-1R 항체이었다. 항온처리 시간은 6시간이었다. 상기 복합체와의 항온처리는 H460M2 종양 세포의 강력한 제거를 야기한다.
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Removal of target cells by circulating virus-specific cytotoxic T-cells using MHC class I comprising complexes <130> 27493 <140> PCT/EP2012/061734 <141> 2012-06-19 <150> EP11171027.3 <151> 2011-06-22 <160> 112 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 1 Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 2 Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Human herpesvirus 4 <400> 3 Gly Leu Cys Thr Leu Val Ala Met Leu 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 4 Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 5 Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Human T-cell lymphotropic virus type 1 <400> 6 Leu Leu Phe Gly Tyr Pro Val Tyr Val 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V-jun Sarcoma Virus 17 Oncogene Homolog (JUN) 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Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 41 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ig Light Chain <400> 41 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Lys Trp Pro Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ser Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 42 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ig Heavy Chain (IgG1-L234A, L235A mutant) <400> 42 Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Gln Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ile Ile Trp Phe Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr 100 105 110 Leu Val Ser Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 43 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ig Heavy Chain (IgG1-L234A, L235A mutant with knob variation) <400> 43 Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Gln Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ile Ile Trp Phe Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr 100 105 110 Leu Val Ser Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 44 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ig Heavy Chain (IgG1-L234A, L235A mutant with hole variation) <400> 44 Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Gln Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ile Ile Trp Phe Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr 100 105 110 Leu Val Ser Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys 355 360 365 Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 45 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ig heavy chain Fc region (IgG1-L234A, L235A mutant Fc-region) <400> 45 Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 46 <211> 246 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv <400> 46 Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Gln Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ile Ile Trp Phe Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr 100 105 110 Leu Val Ser Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln 130 135 140 Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser 145 150 155 160 Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 165 170 175 Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Lys Arg 180 185 190 Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 195 200 205 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr 210 215 220 Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Lys Trp Pro Pro Trp Thr Phe Gly Cys Gly 225 230 235 240 Thr Lys Val Glu Ser Lys 245 <210> 47 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 48 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 <210> 49 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Ala Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 <210> 50 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro 1 5 10 <210> 51 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro 1 5 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 52 Trp Tyr Ala Gln Ile Gln Pro His Trp 1 5 <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 53 Ala Phe Ser Gly Val Ser Trp Thr Met 1 5 <210> 54 <211> 9 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 54 Ile Leu Ile Gly Val Val Ile Thr Trp 1 5 <210> 55 <211> 9 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 55 Met Met Ile Pro Thr Val Val Ala Phe 1 5 <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 56 Pro Phe Pro Gln Ser Asn Ala Pro Ile 1 5 <210> 57 <211> 9 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 57 Leu Leu Leu Thr Leu Leu Ala Thr Val 1 5 <210> 58 <211> 9 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 58 Ile Val Leu Glu His Gly Ser Cys Val 1 5 <210> 59 <211> 9 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 59 Leu Leu Phe Lys Thr Glu Asn Gly Val 1 5 <210> 60 <211> 9 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 60 Pro Leu Asn Glu Ala Ile Met Ala Val 1 5 <210> 61 <211> 9 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 61 Asn Leu Val Arg Leu Gln Ser Gly Val 1 5 <210> 62 <211> 9 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 62 Leu Val Ile Ser Gly Leu Phe Pro Val 1 5 <210> 63 <211> 9 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 63 Leu Leu Leu Val Ala His Tyr Ala Ile 1 5 <210> 64 <211> 9 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 64 Leu Ala Leu Leu Ala Ala Phe Lys Val 1 5 <210> 65 <211> 9 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 65 Val Ile Leu Ala Gly Pro Met Pro Val 1 5 <210> 66 <211> 9 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 66 His Val Leu Gly Arg Leu Ile Thr Val 1 5 <210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 67 Val Thr Glu His Asp Thr Leu Leu Tyr 1 5 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 68 Asn Thr Asp Phe Arg Val Leu Glu Leu 1 5 <210> 69 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 69 Cys Val Glu Thr Met Cys Asn Glu Tyr 1 5 <210> 70 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 70 Val Leu Glu Glu Thr Ser Val Met Leu 1 5 <210> 71 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 71 Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val 1 5 <210> 72 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 72 Arg Ile Phe Ala Glu Leu Glu Gly Val 1 5 <210> 73 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 73 Ile Ile Tyr Thr Arg Asn His Glu Val 1 5 <210> 74 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 74 Val Leu Ala Glu Leu Val Lys Gln Ile 1 5 <210> 75 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 75 Ala Val Gly Gly Ala Val Ala Ser Val 1 5 <210> 76 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 76 Thr Val Arg Ser His Cys Val Ser Lys 1 5 <210> 77 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 77 Ile Met Arg Glu Phe Asn Ser Tyr Lys 1 5 <210> 78 <211> 10 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 78 Gly Pro Ile Ser His Gly His Val Leu Lys 1 5 10 <210> 79 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 79 Ala Thr Val Gln Gly Gln Asn Leu Lys 1 5 <210> 80 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 80 Val Tyr Ala Leu Pro Leu Lys Met Leu 1 5 <210> 81 <211> 10 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 81 Ala Tyr Ala Gln Lys Ile Phe Lys Ile Leu 1 5 10 <210> 82 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 82 Gln Tyr Asp Pro Val Ala Ala Leu Phe 1 5 <210> 83 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 83 Tyr Val Lys Val Tyr Leu Glu Ser Phe 1 5 <210> 84 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 84 Asp Ile Tyr Arg Ile Phe Ala Glu Leu 1 5 <210> 85 <211> 10 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 85 Val Phe Glu Thr Ser Gly Gly Leu Val Val 1 5 10 <210> 86 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 86 Lys Ala Arg Asp His Leu Ala Val Leu 1 5 <210> 87 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 87 Gln Ala Arg Leu Thr Val Ser Gly Leu 1 5 <210> 88 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 88 Lys Ala Arg Ala Lys Lys Asp Glu Leu 1 5 <210> 89 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 89 Gln Ile Lys Val Arg Val Asp Met Val 1 5 <210> 90 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 90 Arg Arg Arg His Arg Gln Asp Ala Leu 1 5 <210> 91 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 91 Ala Arg Val Tyr Glu Ile Lys Cys Arg 1 5 <210> 92 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 92 Lys Met Gln Val Ile Gly Asp Gln Tyr 1 5 <210> 93 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 93 Asn Val Arg Arg Ser Trp Glu Glu Leu 1 5 <210> 94 <211> 12 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 94 Cys Pro Ser Gln Glu Pro Met Ser Ile Tyr Val Tyr 1 5 10 <210> 95 <211> 13 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 95 Lys Pro Gly Lys Ile Ser His Ile Met Leu Asp Val Ala 1 5 10 <210> 96 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 96 Glu Leu Arg Arg Lys Met Met Tyr Met 1 5 <210> 97 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 97 Ile Pro Ser Ile Asn Val His His Tyr 1 5 <210> 98 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 98 Phe Glu Gln Pro Thr Glu Thr Pro Pro 1 5 <210> 99 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 99 Tyr Ala Tyr Ile Tyr Thr Thr Tyr Leu 1 5 <210> 100 <211> 11 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 100 Gln Glu Phe Phe Trp Asp Ala Asn Asp Ile Tyr 1 5 10 <210> 101 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 101 Tyr Glu Gln His Lys Ile Thr Ser Tyr 1 5 <210> 102 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 102 Gln Glu Pro Met Ser Ile Tyr Val Tyr 1 5 <210> 103 <211> 10 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 103 Ser Glu His Pro Thr Phe Thr Ser Gln Tyr 1 5 10 <210> 104 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 104 Gln Ala Ile Arg Glu Thr Val Glu Leu 1 5 <210> 105 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 105 Thr Arg Ala Thr Lys Met Gln Val Ile 1 5 <210> 106 <211> 8 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 106 Asp Ala Leu Pro Gly Pro Cys Ile 1 5 <210> 107 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 107 Cys Glu Asp Val Pro Ser Gly Lys Leu 1 5 <210> 108 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 108 His Glu Arg Asn Gly Phe Thr Val Leu 1 5 <210> 109 <211> 13 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 109 Pro Thr Phe Thr Ser Gln Tyr Arg Ile Gln Gly Lys Leu 1 5 10 <210> 110 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 110 Gln Met Trp Gln Ala Arg Leu Thr Val 1 5 <210> 111 <211> 12 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 111 His Glu Leu Leu Val Leu Val Lys Lys Ala Gln Leu 1 5 10 <210> 112 <211> 12 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 112 Asp Asp Tyr Ser Asn Thr His Ser Thr Arg Tyr Val 1 5 10

Claims (30)

  1. (ⅰ) (a) T-세포 반응 유발 펩티드,
    (b) β2-마이크로글로불린, 및
    (c) MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3
    을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 융합 폴리펩티드;
    (ⅱ) 한 쌍의 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄로서,
    제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄는
    (a) 면역글로불린 중쇄 가변 도메인,
    (b) 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 1,
    (c) 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드,
    (d) 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 2, 및
    (e) 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 3
    을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하고,
    제2 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄는
    (a) 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드,
    (b) 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 2, 및
    (c) 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 3
    을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하되,
    하나의 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 3이 카바트의 EU 지수에 따라 넘버링된 돌연변이 T366W를 포함하고, 다른 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 3이 카바트의 EU 지수에 따라 넘버링된 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V를 포함하는, 한 쌍의 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄; 및
    (ⅲ) 면역글로불린 경쇄
    를 포함하는 복합체를 재조합적으로 제조하는 방법으로서,
    상기 복합체를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 진핵 세포를 배양하는 단계; 및
    상기 세포 또는 배양 배지로부터 상기 복합체를 회수하는 단계
    를 포함하고, 이때,
    상기 융합 폴리펩티드가 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄들 중 하나의 C-말단 또는 N-말단에 공유결합되어 있거나, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄에 포함된 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인에 상보적인 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인인 항체 가변 도메인의 N-말단에 공유결합되어 있거나, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄에 포함된 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인에 상보적인 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인인 항체 불변 도메인의 C-말단에 공유결합되어 있고,
    상기 복합체가, T-세포 반응 유발 펩티드, β2-마이크로글로불린 및 MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3의 융합 폴리펩티드를 정확히 1개 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    복합체가 배양 배지 중의 1 mg/㎖ 이상의 농도로 수득되는, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    진핵 세포가 포유동물 세포인, 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    포유동물 세포가 인간 배아 신장 세포, 중국 햄스터 난소 세포, 새끼 햄스터 신장 세포 또는 마우스 골수종 세포인, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    융합 폴리펩티드가 1% 이상의 상대적 빈도를 갖는 MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3을 포함하는, 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄들이 하나 이상의 다이설파이드 결합에 의해 연결된, 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    T-세포 반응 유발 펩티드가 바이러스-유래된 펩티드인, 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    융합 폴리펩티드가
    (ⅰ) 서열번호 1 내지 9로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 바이러스-유래된 펩티드,
    (ⅱ) 서열번호 16, 17, 18, 21, 22 및 23으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 제1 연결제 펩티드,
    (ⅲ) 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 β2-마이크로글로불린,
    (ⅳ) 서열번호 16, 17, 18, 21, 22 및 23으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 제2 연결제 펩티드,
    (ⅴ) 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3, 및
    (ⅵ) 서열번호 12, 16, 17, 18, 21, 22 및 23으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 제3 연결제 펩티드
    를 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는, 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄 및 제2 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄가 (ⅰ) 서열번호 31, 32 및 33으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG1 CH2 도메인, 및 (ⅱ) 서열번호 34, 35 및 36으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG1 CH3 도메인을 포함하는, 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    복합체가 (ⅰ) 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 제1 연결제 펩티드, (ⅱ) 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 제2 연결제 펩티드, (ⅲ) 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 제3 연결제 펩티드, (ⅳ) 서열번호 32 또는 33의 아미노산 서열을 갖는 인간 IgG1 CH2 도메인, 및/또는 (ⅴ) 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드에서 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 인간 IgG1 CH3 도메인, 및 제2 다이설파이드-연결된 폴리펩티드에서 서열번호 36의 아미노산 서열을 갖는 인간 IgG1 CH3 도메인을 포함하는, 방법.
  11. (ⅰ) (a) T-세포 반응 유발 펩티드,
    (b) β2-마이크로글로불린, 및
    (c) MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3
    을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 융합 폴리펩티드;
    (ⅱ) 한 쌍의 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄로서,
    제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄는
    (a) 면역글로불린 중쇄 가변 도메인,
    (b) 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 1,
    (c) 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드,
    (d) 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 2, 및
    (e) 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 3
    을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하고,
    제2 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄는
    (a) 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드,
    (b) 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 2, 및
    (c) 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 3
    을 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하되,
    하나의 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 3이 카바트의 EU 지수에 따라 넘버링된 돌연변이 T366W를 포함하고, 다른 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 3이 카바트의 EU 지수에 따라 넘버링된 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V를 포함하는, 한 쌍의 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄; 및
    (ⅲ) 면역글로불린 경쇄
    를 포함하는 복합체로서,
    상기 융합 폴리펩티드가 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄들 중 하나의 C-말단 또는 N-말단에 공유결합되어 있거나, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄에 포함된 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인에 상보적인 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인인 항체 가변 도메인의 N-말단에 공유결합되어 있거나, 제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 쇄에 포함된 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인에 상보적인 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인인 항체 불변 도메인의 C-말단에 공유결합되어 있고,
    상기 복합체가, T-세포 반응 유발 펩티드, β2-마이크로글로불린 및 MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3의 융합 폴리펩티드를 정확히 1개 포함하는, 복합체.
  12. 제11항에 있어서,
    융합 폴리펩티드가 1% 이상의 상대적 빈도를 갖는 MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3을 포함하는, 복합체.
  13. 제11항에 있어서,
    T-세포 반응 유발 펩티드가 바이러스-유래된 펩티드인, 복합체.
  14. 제11항에 있어서,
    융합 폴리펩티드가
    (ⅰ) 서열번호 1 내지 9로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 바이러스-유래된 펩티드,
    (ⅱ) 서열번호 16, 17, 18, 21, 22 및 23으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 제1 연결제 펩티드,
    (ⅲ) 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 β2-마이크로글로불린,
    (ⅳ) 서열번호 16, 17, 18, 21, 22 및 23으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 제2 연결제 펩티드,
    (ⅴ) 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 MHC 클래스 I 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3, 및
    (ⅵ) 서열번호 12, 16, 17, 18, 21, 22 및 23으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 제3 연결제 펩티드
    를 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는, 복합체.
  15. 제11항에 있어서,
    제1 다이설파이드-연결된 폴리펩티드 및 제2 다이설파이드-연결된 폴리펩티드가
    서열번호 31, 32 및 33으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG1 CH2 도메인, 및
    서열번호 34, 35 및 36으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG1 CH3 도메인
    을 추가로 포함하는, 복합체.
  16. 제11항에 있어서,
    제1 연결제 펩티드가 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖고/갖거나,
    제2 연결제 펩티드가 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖고/갖거나,
    제3 연결제 펩티드가 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖고/갖거나,
    인간 IgG1 CH2 도메인이 서열번호 32 또는 33의 아미노산 서열을 갖고/갖거나,
    하나의 다이설파이드-연결된 폴리펩티드의 인간 IgG1 CH3 도메인이 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖고, 다른 다이설파이드-연결된 폴리펩티드의 인간 IgG1 CH3 도메인이 서열번호 36의 아미노산 서열을 갖는,
    복합체.
  17. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 복합체를 코딩하는 핵산.
  18. 제17항에 따른 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  19. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 복합체 및 임의적으로 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 암 또는 만성 바이러스 감염을 치료하기 위한 약학 제제.
  20. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    약제로서 사용되는 복합체.
  21. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    암 또는 만성 바이러스 감염의 치료에 사용되는 복합체.
  22. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    개체의 바이러스-특이적 세포독성 T-세포를 표적으로 유인하는 데에 사용되는 복합체.
  23. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    암세포 또는 바이러스 감염된 세포의 제거에 사용되는 복합체.
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