DE69504808T3

DE69504808T3 - Corticotropin freisetzende rezeptoren des faktor 2

Info

Publication number: DE69504808T3
Application number: DE69504808T
Authority: DE
Inventors: Derek Chalmers; Errol B. De Souza; Dimitri E. Grigoriadis; Chen Wang Liaw; Timothy W. Lovenberg; Tilman Oltersdorf
Original assignee: Neurocrine Biosciences Inc
Current assignee: Neurocrine Biosciences Inc
Priority date: 1994-06-14
Filing date: 1995-06-14
Publication date: 2002-12-12
Anticipated expiration: 2015-06-15
Also published as: WO1995034651A2; ES2123269T3; US20040185533A1; WO1995034651A3; DE69504808T2; EP0724637A1; DK0724637T3; US6723841B2; US20020077468A1; ES2123269T5; CA2193072A1; ATE171212T1; US7034118B2; EP0724637B2; AU703140B2; AU2945595A; JPH10501420A; DE69504808D1; EP0724637B1; DK0724637T4

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Zelloberflächenrezeptoren und speziell Corticotropin-Freisetzungsfaktor&sub2;-Rezeptoren.

Hintergrund der Erfindung

Corticotropin-freisetzender Faktor ("CRF") ist ein 41-Aminosäuren langes Peptid, das ursprünglich aus dem Hypothalamus aufgrund seiner Fähigkeit isoliert wurde, die Produktion von adrenocorticotropem Hormon ("ACTH") und andere Proopiomelanocortin ("POMC")- Produkten der vorderen Hypophyse zu stimulieren (Vale et al., Science 213: 1394-1397, 1981). Kurz gesagt glaubt man, daß CRF seine biologischen Wirkungen durch Binden an einen Plasmamembranrezeptor initiiert, der überall im Gehirn (DeSouza et al., Science 224: 1449-1451, 1984), der Hirnanhangdrüse (Wynn et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 110: 602-608, 1983), den Nebennieren (Udelsmann et al., Nature 319: 147-150, 1986) und der Milz (Webster, E. L., und E. B. DeSouza, Endrocrinology 122: 609-617, 1988) verteilt ist. Dieser Rezeptor ist an ein GTP-Bindungsprotein gebunden (Perrin et al., Endocrinology 118: 1171-1179, 1986), der die CRF-stimulierte Erhöhung des intrazellulären cAMP vermittelt (Bilezikjian, L. M. und W. W. Vale, Endocrinology 113: 657-662, 1983).
Zusätzlich zu seiner Rolle bei der Stimulierung der Produktion von ACTH und POMC nimmt man auch an, daß CRF viele der endokrinen, autonomen und Verhaltensantworten auf Streß koordiniert und kann bei der Pathophysiologie von affektiven Störungen beteiligt sein. Darüber hinaus glaubt man, daß CRF ein Schlüsselzwischenprodukt bei der Kommunikation zwischen dem Immunsystem, dem Zentralnervensystem, dem endokrinen und cardiovaskulären System ist (Crofford et al., J. Clin. Invest. 90: 2555-2564, 1992; Sapolsky et al., Science 238: 522-524, 1987, Tilders et al., Regul. Peptides 5: 77-84, 1982; Fisher et al., Reg. Peptide 5: 153-161, 1983).
Man hat einen Rezeptor für CRF aus Ratten- (Perrin et al., Endo 133(6): 3058-3061, 1993) und menschlichem Gehirn (Chen et al., PNAS 90(19): 8967-8971, 1993; Vita et al., FEBS 335(1): 1-5, 1993) kloniert. Dieser Rezeptor ist ein 415 Aminosäureprotein, das sieben membrandurchspannende Domänen umfaßt, und weist ein vorgesagtes Molekulargewicht von 44,000 Dalton auf. Ein Identitätsvergleich zwischen Sequenzen von Ratte und Mensch zeigt einen hohen Grad an Homologie (97%) auf der Aminosäureebene. Zusätzlich zeigt die Scatchard-Analyse von rekombinant hergestelltem menschlichen Rezeptor eine einzelne Komponentenstelle mit einer hohen Affinität für CRF (Kd von 1,6 ± 0,3 nM).
Die vorliegende Erfindung sieht neue, vorher unindentifizierte CRF-Rezeptoren vor, bezeichnet als "Corticotropin-Freisetzungsfaktor-2 ("CRF&sub2;")-, Corticotropin-Freisetzungsfaktor- Rezeptoren. Zusätzlich sieht die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren, die derartige CRF&sub2;-Rezeptoren verwenden, ebenso wie andere, damit in Verbindung stehende Vorteile vor.

Zusammenfassung der Erfindung

Entsprechend der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes Nukleinsäuremolekül vorgesehen, das für einen CRF&sub2;-Rezeptor kodiert, wobei der CRIF&sub2;-Rezeptor kodiert wird durch:
(a) eine Nukleinsäuresequenz mit der kodierenden Region von einer der Sequenz LD. Nos. 1, 3 oder 7 oder einem Derivat davon mit einer Homologie mit der kodierenden Region von größer 80%
(b) eine Nukleinsäuresequenz, die in der Lage ist, unter hochstringenten Bedingungen an eine Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, die komplementär zu einer die codierende Region einer der Sequenz I.D. Nos. 1, 3 oder 7 aufweisende Nukleinsäuresequenz ist; oder
(c) Nukleinsäuresequenzen, die als ein Ergebnis des genetischen Codes degeneriert sind, für CRF&sub2;-Rezeptoren, die durch eine Nukleinsäuresequenz, wie definiert in (a) oder (b) kodiert sind.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung wird weiter ein isoliertes Nukleinsäuremolekül vorgesehen, das für eine CRF&sub2;-N-terminale extrazelluläre Domäne kodiert, wobei die CRF&sub2;- N-terminale extrazelluläre Domäne kodiert wird durch:
(a) eine Nukleinsäuresequenz, die abgeleitet ist von der die N-terminale extrazelluläre Domäne kodierenden Region, die durch Nukleotid Nr. 44 bis Nukleotid Nr. 457 von Sequenz I.D. No. 1, Nukleotid Nr. 216 bis Nukleotid Nr. 569 von Sequenz I.D. No. 3, oder der äquivalenten Region von Sequenz I.D. No. 7 definiert ist oder einem Derivat davon mit einer Homologie von mehr als 70% mit der kodierenden Region;
(b) eine Nukleinsäuresequenz, die in der Lage ist, unter Bedingungen hoher Stringenz an eine Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, die komplementär zu (a) ist; oder
(c) Nukleinsäuresequenzen, die als ein Ergebnis des genetischen Codes degeneriert sind, für CRF&sub2;-Rezeptoren, die durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert sind, wie definiert in (a) oder (b).
Kurz gesagt, sieht die vorliegende Erfindung, Zusammensetzungen und Verfahren vor, die CRF&sub2;-Rezeptoren (auch bezeichnet als "CRF&sub2;-Corticotropin-Freisetzungsfaktor-Rezeptoren" oder "CRF&sub2;R") verwenden. Innerhalb eines Aspekts der vorliegenden Erfindung sind isolierte Nukleinsäuresequenzen vorgesehen, die CRF&sub2;-Rezeptoren kodieren. In einer Ausführungsform sind Nukleinsäuremoleküle vorgesehen, die einen CRF&sub2;-Rezeptor kodieren, wie dasjenige in Sequenz I.D. No. 4 offenbarte, von Aminosäure 1 bis Aminosäure 411. In einer Ausführungsform sind Nukleinsäuremoleküle vorgesehen, die die Nukleotidsequenz in Sequenz I.D. No. 3 von Nukleotid Nr. 216 bis Nukleotid Nr. 1448 umfassen. In einer weiteren Ausführungsform sind Nukleinsäuremoleküle vorgesehen, die einen CRF&sub2;-Rezeptor kodieren, wie dasjenige, das in Sequenz I.D. No. 2 offenbart ist, von Aminosäure 1 bis Aminosäure 431. In einer weiteren Ausführungsform sind Nukleinsäuremoleküle vorgesehen, die die Nukleotidsequenz in Sequenz I.D. No. 1 von Nukleotid Nr. 44 bis Nukleotid Nr. 1336 umfassen. Nukleinsäuresequenzen, die CRF&sub2;-Rezeptoren der vorliegenden Erfindung kodieren, können von tatsächlich einem jeden warmblütigen Tier isoliert werden, einschließlich, z. B., Menschen, Makaken, Pferde, Rinder, Schafe, Schweine, Hunde, Katzen, Ratten und Mäuse.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden isolierte Nukleinsäuremoleküle vorgesehen, die Teile eines CRF&sub2;-Rezeptors kodieren, wie die N-terminale extrazelluläre Domäne. In einer Ausführungsform sind isolierte Nukleinsäuremoleküle vorgesehen, die die Nukleotidsequenz in Sequenz I.D. No. 3 von Nukleotid Nr. 216 bis Nukleotid Nr. 569 umfassen. In einer weiteren Ausfüshrungsform sind isolierte Nukleinsäuremoleküle vorgesehen, die ein Protein kodieren mit der Aminsosäuresequenz von Sequenz I.D. No. 4 von Aminosäure No. 1 bis Aminosäure Nr. 118. In einer weiteren Ausführungsform sind isolierte Nukleinsäuremoleküle vorgesehen, die die Nukleotidsequenz in Sequenz I.D. No. 1 von Nukleotid Nr. 44 bis Nukleotid Nr. 457 umfassen. In einer weiteren Ausführungsform sind isolierte Nukleinsäuremoleküle vorgesehen, die ein Protein kodieren mit der Aminosäuresequenz von Sequenz I.D. No. 2 von Aminosäure Nr. 1 bis Aminosäure Nr. 138.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind Expressionsvektoren vorgesehen, die in der Lage sind, die oben beschriebenen Nukleinsäuremoleküle zu exprimieren. In weiteren Aspekten sind rekombinante virale Vektoren vorgesehen, die in der Lage sind, die Expression der oben beschriebenen Nukleinsäuremoleküle zu steuern. Typische Beispiele derartiger viraler Vektoren schließen ein retrovirale Vektoren, adenovirale Vektoren und Herpes simplex- Virus-Vektoren. Durch die vorliegende Erfindung sind auch Wirtszellen vorgesehen, die die oben beschriebenen Expressionsvektoren enthalten, ebenso den Rezeptor oder Teile davon, die durch die oben beschriebenen Nukleinsäuremoleküle kodiert werden. In anderen Ausführungsformen sind isolierte Teile von CRF&sub2;-Rezeptoren vorgesehen, einschließlich, z. B., isolierter Teile von extrazellulären Domänen, wie die N-terminale extrazelluläre Domäne.
In weiteren Aspekten der Erfindung werden isolierte Antikörper vorgesehen, die in der Lage sind, spezifisch an die oben beschriebenen CRF&sub2;-Rezeptoren zu binden. In einer Ausführungsform können die Antikörper ausgewählt werden aus der Gruppe, die polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper und Antikörperfragmente umfaßt. In anderen Ausführungsformen werden Antikörper vorgesehen, die in der Lage sind, das Binden von CRF (oder anderen Substraten wie Sauvagin oder Urotensin I) an einen CRF&sub2;-Rezeptor zu blockieren. In bevorzugten Ausführungsformen können die Antikörper ausgewählt werden aus der Gruppe, die murine und menschliche Antikörper umfaßt. In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden die oben angegebenen Antikörper durch Hybridome produziert.
In einem noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Nukleinsäuremoleküle vorgesehen, die in der Lage sind, spezifisch an Nukleinsäuremoleküle zu binden, die irgendeinen der oben beschriebenen CRF&sub2;-Rezeptoren kodieren. Derartige Moleküle können zwischen wenigstens "y" Nukleotiden lang sein, wobei "y" eine ganze Zahl zwischen 14 und 1230 ist, und, weiterhin, in geeigneter Weise ausgewählt werden zur Verwendung als Sonden oder Primer, wie unten beschrieben. Besonders bevorzugte Sonden der vorliegenden Erfindung sind wenigstens 18 Nukleotide lang.
In weiteren Aspekten der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit einer Verbindung vorgesehen, die an einen CRF&sub2;-Rezeptor bindet, welche die Schritte umfassen (a) Exponieren einer oder mehrerer Verbindungen gegenüber Zellen, die CRF&sub2;-Rezeptoren unter Bedingungen und für eine Zeit exponieren, die ausreichend sind, um Binden der Verbindungen an die Rezeptoren zu erlauben und (b) Isolieren von Verbindungen, die an die Rezeptoren binden, so daß die Anwesenheit einer Verbindung, die an einen CRF&sub2;- Rezeptor bindet, nachgewiesen werden kann. In einem weiteren Aspekt werden Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit einer Verbindung vorgesehen, die an einen CRF&sub2;-Rezeptor bindet, welches die Schritte umfaßt (a) Exponieren einer oder mehrerer Verbindungen gegenüber einer N-terminalen extrazellulären CRF&sub2;-Rezeptor-Domäne unter Bedingungen und für eine Zeit, die ausreichend sind, um Binden einer Verbindung an die N-terminale extrazelluläre Domäne zu erlauben und (b) Isolieren von Verbindungen, die an die N-terminale extrazelluläre CRF&sub2;-Rezeptor-Domäne binden, so daß die Anwesenheit einer Verbindung nachgewiesen werden kann, die an einen CRF&sub2;-Rezeptor bindet. In einer Ausführungsform sind die Verbindungen mit einem Mittel markiert, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die fluoreszierende Moleküle, Enzyme und Radionuklide umfaßt.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren vorgesehen zum Bestimmen, ob eine ausgewählte Verbindung ein CRF&sub2;-Rezeptor-Agonist oder -Antagonist ist, welche die Schritte umfassen (a) Exponieren einer ausgewählten Verbindung gegenüber Zellen, die CRF&sub2;-Rezeptoren exprimieren, unter Bedingungen und für eine Zeit, die ausreichen, um Binden der Verbindung und eine assoziierte Antwort bezüglich intrazelluläre Titer von cAMP zu erlauben, und (b) Nachweisen entweder einer Erhöhung oder Verringerung des Titers an intrazellulärem cAMP, und dadurch Bestimmen, ob die ausgewählte Verbindung ein CRF&sub2;-Rezeptor-Agonist oder -Antagonist ist.
Innerhalb weiterer Aspekte sind Verfahren vorgesehen zum Nachweisen der Anwesenheit eines CRF&sub2;-Rezeptor-Agonisten oder -Antagonisten in einem Pool aus Verbindungen, welche die Schritte umfassen (a) Exponieren eines Pools aus Verbindungen gegenüber Zellen, die CRF&sub2;-Rezeptoren exprimieren unter Bedingungen und für eine Zeit, die ausreichen, um Binden der Verbindung und eine assoziierte Reaktion hinsichtlich intrazellulärer Titer an cAMP zu erlauben und (b) Isolieren von Verbindungen, die entweder den intrazellulären Titer an cAMP erhöhen oder verringern, so daß die Anwesenheit von einem CRF&sub2;-Rezeptor- Agonisten oder -Antagonisten nachgewiesen werden kann.
In einem weiteren Aspekt sind Verfahren vorgesehen, um zu bestimmen, ob eine ausgewählte Verbindung ein CRF&sub2;-Rezeptor-Antagonist ist, welche die Schritte umfassen (a) Exponieren einer ausgewählten Verbindung in Gegenwart eines CRF&sub2;-Rezeptor Agonisten gegenüber einem rekombinanten CRF&sub2;-Rezeptor, der an einen Reaktionsweg gekoppelt ist, unter Bedingungen und für eine Zeit, die ausreichen, um Binden der Verbindung an einen Rezeptor und eine assoziierte Reaktion durch den Reaktionsweg zu erlauben und (b) Nachweisen einer Verringerung der Stimulierung des Reaktionsweges, der aus dem Binden der Verbindung an den CRF&sub2;-Rezeptor resultiert, relativ zur Stimulierung des Reaktionsweges durch den CRF&sub2;- Rezeptor-Agonisten alleine, und dadurch Bestimmen der Anwesenheit eines CBF&sub2;- Antagonisten. In anderen Aspekten werden Verfahren vorgesehen, um zu bestimmen, ob eine ausgewählte Verbindung ein CRF&sub2;-Rezeptor-Agonist ist, welche die Schritte umfassen (a) Exponieren einer ausgewählten Verbindung gegenüber einem CRF&sub2;-Rezeptor, der an einen Reaktionsweg gekoppelt ist, unter Bedingungen und für eine Zeit, die ausreichen, um Binden der Verbindung an den Rezeptor und eine assoziierte Reaktion durch den Reaktionsweg zu erlauben und (b) Nachweisen einer Erhöhung der Stimulierung des Reaktionsweges, verglichen mit der Aktivität des Reaktionsweges vor Schritt (a), der aus dem Binden der Verbindung an den CRF&sub2;-Rezeptor resultiert, und daraus Bestimmen der Anwesenheit eines CRF&sub2;- Rezeptor-Agonisten.
In anderen Aspekten der vorliegenden Erfindung sind Verfahren offenbart zum Behandeln von CRF&sub2;-Rezeptor-assoziierten Erkrankungen, wobei es erwünscht ist, entweder die Stimulierung eines CRF&sub2;-Rezeptor-Antwortsreaktionsweges zu erhöhen oder zu verringern. Zum Beispiel sind in einem Aspekt Verfahren zum Behandeln von cerebrovaskularen Störungen wie Iktus, Reperfusionsverletzung und Migränen, vorgesehen, die die Schritte umfassen: Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines CRF&sub2;-Rezeptor-Antagonisten an einen Patienten, so daß die Störung geheilt oder gelindert wird. In anderen Verfahren werden Verfahren offenbart zum Behandeln von Lern- oder Gedächnisstörungen, die Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge von CRF&sub2;-Rezeptor-Antagonisten an einen Patienten umfassen. In noch anderen Aspekten werden Verfahren offenbart zum Behandeln von Alzheimerschen Krankheit, die Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines CRF&sub2;- Rezeptor-Antagonisten an einen Patienten umfassen. Typische Beispiele von geeigneten CRF&sub2;-Rezeptor-Antagonisten schließen ein α-helikalen oCRF (9-41) oder d-Phe r/h CRF (12- 41).
Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden nach Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung und die beigefügten Zeichnungen augenscheinlich werden. Zusätzlich werden unten verschiedene Literaturstellen angegeben, die detailliert bestimmte Verfahrensweise oder Zusammensetzungen (z. B. Plasmide etc.) beschreiben und die deshalb durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 veranschaulicht schematisch Struktur eines beispielhaften CRF&sub2;-Rezeptors (CRF2β; Sequenz ID No. 2).
Fig. 2 veranschaulicht schematisch die Struktur eines zweiten beispielhaften CRF&sub2;- Rezeptors (CRF2α; Sequenz ID No. 4).
Fig. 3 ist eine Graphik, die cAMP-Akkumulierung in Zellen darstellt, die mit CRF&sub1;- Rezeptor transfiziert wurden.
Fig. 4 ist eine Graphik, die cAMP-Akkumulierung in Zellen darstellt, die mit CRF&sub2;- Rezeptor transfiziert wurden.
Fig. 5 ist eine Graphik, die die Wirkung der Antagonisten α-helikaler und d-Phe auf Sauvagin-stimulierte cAMP-Produktion in CRF&sub1;-transfizierten Zellen darstellt.
Fig. 6 ist eine Graphik, die die Wirkung der Antagonisten α-helikaler und d-Phe auf Sauvagin-stimulierte cAMP-Produktion in CRF2α-transfizierten Zellen darstellt.
Fig. 7 ist ein Photo eines RNase-Schutztest von zwei CRF&sub2;-Subtypen (CRF&sub2;α und CRF&sub2;β) und β-Actin. Ts = Hoden; Ht = Herz; Sk = Skelettmuskel; Lv = Leber; Kd = Niere; Sp = Milz; Ol = olfaktorischer Bulbus; St = Striatum; Hy = Hypothalamus; Pt = Hypophyse; Cx = Cortex; Hp = Hippocampus.
Fig. 8A, A', B, B', C und C' sind eine Reihe von Photos, die die anatomische Verteilung von zwei CRF&sub2;-Subtypen zeigen. 8A, B und C sind coronale Abschnitte von Rattengehirn, das mit CRF2α und CRF2β sondiert wurde. Fig. 8A', B' und C' sind benachbarte Abschnitte, die mit CRF2β-antisense-cRNA sondiert wurden.
Fig. 9 ist eine schematische Darstellung der Nukleotid-Sequenzhomologie zwischen CRF&sub1;- und CRF&sub2;-Rezeptoren über die kodierende Region der Rezeptoren. Untere Balken zeigen die Region der Rezeptoren an, gegen die CRF&sub1;- und CRF&sub2;-cRNA-Sonden konstruiert wurden.
Fig. 10 zeigt zweifarbig-kodierte digitalisierte Bilder von CRF&sub1;- und CRF&sub2;-RezeptormRNA-Expression in benachbarten Horizontalgehirnschnitten. Regionen, die ein hohes Maß an mRNA-Expression zeigen, sind in rot und orange kodiert, wohingegen die geringsten Expressionsmaße in blau kodiert sind.
Fig. 11A, B, C, D und E sind eine Serie von Photos, die die rostro-caudale (A-E)- Verteilung von CRF&sub2;-Rezeptor-mRNA (linke Hemisphäre) und CRF&sub1;-Rezeptor-mRNA (rechte Hemisphäre) in digitalisierten Coronalgehirnschnitten zeigt. Epy, ependymale Schicht von olfaktorischem Bulbus; Int Gr, Innengranulazellschicht des olfaktorischen Bulbus; G1, Granulazellschicht von olfaktorischem Bulbus; LSI, lateraler Septalnukleus (Zwischenteil); LSV, Lateralseptalnukleus (ventraler Teil); MS, medialer septaler Nukleus; Fr Ctx, Stirncortex; Pir, piriformer Cortex; CA&sub1;, Feld CA&sub1; (Ammonshorn); CA&sub3;, Feld CA&sub3; (Ammonshorn); DG, dentater Gyrus; Chp, choroider Plexus; MeA, medialer amygdaloider Nukleus; VMH, ventromedialer hypothalamischer Nukleus; Cing Ctx, Cingulumcortex; BLA, basolateraler amygdaloider Nukleus; Pco, hinterer corticaler amygdaloider Nukleus; RN, roter Nukleus; Oc Ctx, occtipitaler Cortex; MG, medialer Nucleus geniculus; PDTg, hinterer dorsaler Tegmentalnukleus; Trg Nuc, Trigeminuskern; Pn, Brückengrau.
Fig. 12A und B sind zwei Dunkelfeld-Mikrophotographien von Zellen, die mit (³&sup5;S)- cRNA-CRF&sub2;-Sonde in (A) dem intermediären (LSI) und ventralem (LSV) lateralen Septalnukleus hybridisiert waren. Bei hoher Auflösung (B) ist das große Maß an CRF&sub2;-Rezeptor- Expression in Zellen im ventralen Lateralseptum zu beachten. Cau, caudat; LV, Lateralventrikel.
Fig. 13A, B und C sind eine Serie von Dunkelfeld-Mikrophotographien von Zellen, die mit (A) (³&sup5;S)-cRNA-CRF-Sonde, (B) (³&sup5;S)-cRNA-CRF&sub2;-Sonde und (C) (³&sup5;S)-cRNA-CRF&sub1;- Sonde in benachbarten Coronalabschnitten durch den Bett-Nukleus der Stria terminalis (BNST) hybridisiert wurde. Beachte in (A) die höhere Konzentration an CRFexprimierenden Zellen in dem posterolateralen Gebiet (BNSTpl), wohingegen in (B) CRF&sub2;-Rezeptor- Expression vorherrschend bei den Medialaspekten des Nukleus lokalisiert ist (BNSTpm). In (C) ist CRF&sub1;-Rezeptor-mRNA-Expression sowohl in medialen als auch lateralen Lagen des Nukleus offensichtlich. Fx, Formx.
Fig. 14A und B sind zwei Dunkelfeld-Mikrophotographien von Zellen die mit (A) (³&sup5;S)- cRNA-CRF&sub2;-Sonde und (B) (³&sup5;S)-cRNA CRF&sub1;-Sonde im vorderen corticalen amygdaloiden Nukleus (ACo) hybridisiert sind. Beachte in (A) das hohe Maß an CRF&sub2;-Rezeptor-mRNA- Expression in Zellen über den ganzen Nukleus, wohingegen in (B) CRF&sub1;-Rezeptor- Expression mit dem Hintergrundsignal vergleichbar ist. CRF&sub2;-Rezeptor-mRNA-Expression ist auch offensichtlich innerhalb des supraoptischen Nukleus in (A), einem Gebiet wo CRF&sub1;- Rezeptorexpression nicht nachweisbar ist (B). opt, optische Bahn, Pfeile in (A) zeigen die Schnittkante.
Fig. 15A, B und C sind eine Reihe von Dunkelfeld-Mikrophotographien von Zellen, die mit (A) (³&sup5;S)-cRNA-CRF&sub1;-Sonde und (B) und (C) (³&sup5;S)-cRNA-CRF&sub2;-Sonde in der hippocampalen Formation hybridisiert sind. Innerhalb des dosalen Hippocampus war sowohl die CRF&sub1;- als auch CRF&sub2;-Rezeptor-Expression vergleichsweise gering. Innerhalb des ventralen Hippocampus (C) waren jedoch Zellen, die ein hohes Maß an CRF&sub2;-Rezeptor-mRNA-Expression zeigten, im Gyrus dentatus und im Subiculum augenscheinlich. *, Emulsionsartefakt.
Fig. 16A und B sind zwei Dunkelfeld-Mikrophotographie von Zellen, die mit (³&sup5;S)- cRNA-CRF&sub2;-Sonde im ventromedialen hypothalamischen Nukleus (VMH) (A) und (B) hybridisiert sind. Beachte bei hoher Auflösung (B) das hohe Maß an CRF&sub2;-Rezeptor-Expression sowohl in den dorsomedialen (DM) als auch ventrolateren (VL) Aspekten des Nukleus. 3v, dritter Ventrikel; opt, optische Bahn.
Fig. 17A, B, C und D sind eine Reihe von Dunkelfeld-Mikrophotographien von Zellen, die mit (³&sup5;S)-cRNA-CRF&sub2;-Sonde (A) und (C) und (³&sup5;S)-cRNA-CRF&sub1;-Sonde (B) und (D) in benachbarten Coronalabschnitten durch den supraoptischen Nukleus (SO) und suprachiasmatischen Nukleus (Sch) hybridisieren. Beachte das Fehlen von CRF&sub1;-Rezeptor-Expression in entweder Nukleus (B) oder (D). Opt, optische Bahn; *, markierte Arteriole.
Fig. 18A, B und C sind eine Reihe von Dunkelfeld-Mikrophotographien von Zellen, die hybridisiert wurden mit (A) (³&sup5;S)-cRNA-CRF-Sonde, (B) (³&sup5;S)-cRNA-CRF&sub2;-Sonde und (C) (³&sup5;S)-cRNA-CRF&sub1;-Sonde in benachbarten Schnitten durch den paraventrikulären Nukleus des Hypothalamus. In (A) sind CRF-exprimierende Zellen innerhalb der medialen und dorsalen Aspekten des paraventrikulären Nukleus augenscheinlich. Beachte in (B), daß die CRF&sub2;- Rezeptor-Expression am stärksten ist im medialen parvozellulären Gebiet (mpv) mit nur verstreuten markierten Zellen, die in der dorsalen Unterabteilung augenscheinlich sind. CRF&sub1;- Rezeptor-Expression ist in beiden Unterabteilungen nicht bemerkbar (C). 3v, dritter Ventrikel; Fx, Formx.
Fig. 19A, B und C sind eine Reihe von Dunkelfeld-Mikrophotographien von Zellen, die hybridisiert sind mit (³&sup5;S)-cRNA-CRF&sub2;-Sonde in (A) dorsaler Raphe (DR) und Zentralgrau (CG), (B) medianer Raphe (MnR) und (C) interpedunkulärer Nukleus (IPN).
Fig. 20A ist eine Photomikrographie, die CRF&sub2;-Rezeptor-mRNA-Expression im Choroidplexus (ChP) zeigt. Fig. 20B ist ein Mikrophotographie, das einen benachbarten Nisslgefärbten Abschnitt zeigt. 4v, vierter Ventrikel.
Fig. 21A ist ein stark vergrößertes Dunkelfeldbild von CRF&sub2;-Rezeptor-mRNA-Expression in einer cerebralen Arteriole. Fig. 21B ist eine Hellfeld-Nissel-gefärbter Schnitt, der in (A) gezeigten Arteriole. Beachte die charakteristische muskuläre Arteriolenwand in (B).
Fig. 22A, B, C und D sind eine Reihe von Dunkelfeld-Mikrophotographien von CRF&sub1;- Rezeptor-mRNA-Expression (A) und (B) und CRF&sub2;-Rezeptor-mRNA-Expression (C) und (D) im Vorderlappen (AL) der Hypophyse. Beachte in (A) das Ansammeln von Zellen, die CRF&sub1;- mRNA exprimieren, was mutmaßlich die Verteilung von Hypophysen-Corticotropen wiederspiegelt, wohingegen CRF&sub2;-mRNA-Expression nur bei verstreuten Zellen (C) vorhanden ist. Bei hoher Auflösung ist eine vortretende Ansammlung von Silberkörnern über Zellen des vorderen Lobus augenscheinlich, die mit (³&sup5;S)-cRNA-CRF&sub1;-Sonde hybridisiert wurden, Pfeil in (B), wohingegen nur schwache Ansammlungen von Silberkörnern augenscheinlich waren über Zellen, die mit (³&sup5;S)-cRNA-CRF&sub2;-Sonde hybridisiert waren, Pfeil in (D).

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Definitionen

Bevor die Erfindung angegeben wird, mag es für deren Verständnis hilfreich sein, die Definitionen bestimmter hierin verwendeter Begriffe anzugeben.
"CRF&sub2;-Rezeptoren" (auch genannt "CRF&sub2;-Corticotropin-Freisetzungsfaktor-Rezeptoren" oder "CRF&sub2;R"), wie hierin verwendet, bezeichnet Rezeptor-Proteine, die Corticotropin- Freisetzungsfaktor und andere Proteine, wie Urotensin 1 und Sauvagin binden. CRF&sub2;- Rezeptoren können von anderen Rezeptoren, wie Corticotropin-Freisetzungsfaktor- Rezeptoren, unterschieden werden auf der Grundlage von Kriterien, wie Affinität der Substrat-Bindung, Gewebeverteilung und Sequenzhomologie. CRF&sub2;-Rezeptoren der vorliegenden Erfindungen sind mehr als 80% homolog, bevorzugtererweise mehr als 85-90% homolog und am bevorzugtesten mehr als 92%, 95% oder 97% homolog mit den hierin offenbarten CRF&sub2;- Rezeptoren (z. B., Sequenz I.D. No. 3). Man nimmt an, daß CRF&sub2;-Rezeptoren in ihrer nativen Konfiguration als membrangebundene Proteine existieren, die aus einer N-terminalen extrazellulären Domäne, sieben Transmembrandomänen, die durch drei intrazelluläre und drei extrazelluläre Schleifen getrennt sind, und einer C-terminalen intrazellullären Domäne bestehen (siehe Fig. 1 und 2). Wie im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet, sollten CRF&sub2;-Rezeptoren so verstanden werden, daß sie nicht nur die Proteine einschließen, die hierin offenbart sind (siehe Sequenz I.D. Nos. 2, 4 und 8), sondern auch im wesentlichen ähnliche Derivate und Analoge, wie unten diskutiert.
"Nukleinsäuremolekül" bezeichnet eine Nukleinsäuresequenz in der Form eines getrennten Fragmentes oder als ein Bestandteil eines größeren Nukleinsäurekonstruktes, das von der Nukleinsäure abgeleitet worden ist, das wenigstens einmal in im wesentlichen reiner Form, d. h. frei von kontaminierenden endogenen Materialien, und in einer Menge oder Konzentration isoliert worden ist, die Identifizierung, Manipulation und Wiedergewinnung der Sequenz und seiner Komponentennukleotidsequenzen durch biochemische Standardverfabren, z. B., unter Verwendung eines Klonierungsvektors, erlaubt. Derartige Sequenzen werden bevorzugterweise in der Form eines offenen Leserahmens vorgesehen, der nicht von internen untranslatierten Sequenzen, oder Introns, unterbrochen wird, die in eukaryotischen Genen typischerweise vorhanden sind. Genomische Nukleinsäure, die die relevanten Sequenzen enthält, kann auch verwendet werden. Sequenzen von nicht-translatierten Nukleinsäure kann 5'oder 3' vom offenen Leserahmen vorhanden sein, wo dieselbe Manipulation oder Expression der kodierenden Regionen stört nicht.
"Rekombinanter Expressionsvektor" bezeichnet ein replizierbares Nukleinsäurekonstrukt, das entweder verwendet wird, um Nukleinsäuresequenzen zu amplifizieren oder zu exprimieren, die CRF&sub2;-Rezeptoren kodieren. Dieses Konstrukt umfaßt eine Anordnung von (1) einem genetischen Element oder Elementen mit einer bei der Genexpression regulatorischen Funktion, z. B. Promotoren, (2) eine Struktur- oder Kodierungssequenz, die in mRNA transkripiert und in Protein translatiert wird, und (3) geeignete Transkriptions- und Translationsinitiations- und Terminationssequenzen.
Wie oben festgehalten, sieht die vorliegende Erfindung isolierte Nukleinsäuremoleküle vor, die CRF&sub2;-Rezeptoren kodieren. Kurz gesagt, sind CRF&sub2;-Rezeptoren G-gekoppelte Proteinrezeptoren, die in der Lage sind, ein Substrat zu binden (wie CRF, oder andere Substrate, wie Sauvagin und Urotensin I) und das Signal übertragen, das der Zelle durch das Substrat geliefert wird. Eine derartige Signaltransduktion erfolgt typischerweise, wenn ein Reaktionsweg durch einen äußeren Reiz aktiviert wird, der im allgemeinen, aber nicht immer, direkt an einen membrangebundenen Rezeptor gekoppelt ist. Reaktionswege induzieren im allgemeinen zelluläre Antworten, wie Sekretion von Extrazellulärmatrix von antwortenden Zellinien, Hormonausscheidung, Chemotaxis, Differenzierung oder die Initierung oder Inhibierung von Zellteilung von antwortenden Zellen. Wie hierin verwendet, bezeichnet das Koppeln von Rezeptoren an Reaktionswege die direkte Aktivierung eines Reaktionsweges oder die Transduktion eines Signals über einen sekundären Botenstoff, wie ein G-Protein, um einen zellulären Reaktionsweg zu aktivieren.
Ein typischer CRF&sub2;-Rezeptor, der erhalten werden kann, indem die hierin beschriebenen Verfahren angewandt werden (siehe Beispiel 1), ist schematisch dargestellt in Fig. 1 (siehe auch Fig. 2). Kurz gesagt ist dieser CRF&sub2;-Rezeptor zusammengesetzt aus einer extrazellulären Nterminalen Domäne (Aminosäuren 1-117), einer ersten Transmembrandomäne (Aminosäuren 118-138), einer ersten intrazellulären Domäne (139-147), einer zweiten Transmembrandomäne (148-167), einer zweiten extrazellulären Domäne (168-184), einer dritten Transmembrandomäne (185-208), einer zweiten intrazellulären Domäne (229-223), einer vierten Transmembrandomäne (224-244), einer dritten extrazellulären Domäne (245-261), einer fünften Transmembrandomäne (262-286), einer dritten intrazellulären Domäne (287-309), einer sechsten Transmembrandomäne (310-329), einer vierten extrazellulären Domäne (330-342), einer siebten Transmembrandomäne (343-363) und einer C-terminalen intrazellulären Domäne (364-411).
Obwohl der obige CRF&sub2;-Rezeptor zu Zwecken der Veranschaulichung vorgesehen ist (siehe auch Fig. 2 und Sequenz I.D. No. 2), sollte die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt sein. Insbesondere sieht die vorliegende Erfindung eine große Breite an weiteren CRF&sub2;-Rezeptoren vor mit wesentlicher Ähnlichkeit zu den in Sequenzen I.D. Nos 1-4 offenbarten Sequenzen. Wie hierin im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet, werden Nukleinsäuresequenzen, die CRF&sub2;-Rezeptoren kodieren, als im wesentlichen ähnlich zu den hierin offenbarten betrachtet, wenn: (a) die Nukleinsäuresequenz abgeleitet ist von der kodierenden Region eines nativen CRF&sub2;-Rezeptorgens (einschließlich, z. B., allelischer Varianten der hierin offenbarten Sequenzen); (b) die Nukleinsäuresequenz in der Lage ist, an Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung (oder deren komplementäre Stränge) unter Bedingungen hoher Stringenz zu hybridisieren (siehe Sambrook et al., Molecular Gloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989); oder (c) Nukleinsäuresequenzen, die degeneriert sind als ein Ergebnis des genetischen Codes, für die in (a) oder (b) definierten Nukleinsäuresequenzen. Weiterhin kann, obwohl auf Desoxyribonukleinsäuremoleküle hierin verwiesen wird, wie bei der hierin vorgesehenen Offenbarung für die Fachleute offensichtlich sein sollte, auch ein große Breite an verwandten Nukleinsäuremolekülen bei verschiedenen hierin beschriebenen Ausführungsformen verwendet werden, einschließlich, z. B., RNA, Nukleinsäure-Analoge, ebenso wie chimäre Nukleinsäuremoleküle, die aus mehr als einem Typ von Nukleinsäure zusammengesetzt sein können.
Zusätzlich sollte, wie oben festgehalten, "CRF&sub2;-Rezeptoren" im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung so verstanden werden, daß sie Derivate und Analoge der oben beschriebenen CRF&sub2;-Rezeptoren umfassen. Derartige Derivate schließen allelische Varianten und gentechnologisch veränderte Varianten ein, die konservative Aminosäuresubstitutionen und/oder kleine Additionen, Substitutionen oder Deletionen von Aminosäuren enthalten, deren Netto-Wirkung die biologische Aktivität (z. B. Signaltransduktion) oder Funktion des CRF&sub2;-Rezeptors nicht wesentlich ändert. Derartige Derivate sind größer als 80% bis 85% ähnlich, bevorzugtererweise größer als 90% bis 95% ähnlich und am bevorzugtesten mehr als 97% zu dem korrespondierenden nativen CRF&sub2;-Rezeptor ähnlich. Prozentuale Ahnlichkeit kann bestimmt werden, z. B., durch Vergleichen von Sequenzinformation mit dem GAP- Programm, welches das Ausrichtungsverfahren von Needleman und Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443, 1970), wie überarbeitet von Smith und Waterman (Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981) verwendet. Kurz gesagt definiert das GAPProgramm Ähnlichkeiten als die Anzahl von ausgerichteten Symbolen (Nukleotiden oder Aminosäuren), die ähnlich sind, geteilt durch die Gesamtanzahl an Symbolen in der kürzeren der zwei Sequenzen. Die bevorzugten Mangelparameter für das GAP-Programm schließen ein: (1) eine unäre Vergleichsmatrix (die einen Wert von 1 für Identitäten und 0 für NichtIdentitäten enthält) für Nukleotide und die gewichtete Vergleichsmatrix von Gribskov und Burgess (Nucl. Acids Res. 14: 6745, 1986), wie beschrieben von Schwartz und Dayhoff (Hrsg., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, 5. 353-358, 1979); (2) einen Strafpunkt für jede Lücke und einen weiteren 0,1-Strafpunkt für jedes Symbol in jeder Lücke; und (3) keinen Strafpunkt für Lücken am Ende.
Die primäre Aminosäurestruktur von CRF&sub2;-Rezeptoren kann auch modifziert werden durch Ausbilden von kovalenten oder aggregativen Konjugaten mit entweder chemischen Anteilen, wie Glycosylgruppen, Lipiden, Phosphat, Acetylgruppen und dergleichen, oder durch Erzeugen von Aminosäuresequenz-Mutanten. Kovalente Derivate können hergestellt werden durch Verbinden spezieller funktioneller Gruppen der CRF&sub2;R-Aminosäureseitenketten oder an den N- oder C-Termini. Andere Derivate von CRF&sub2;R innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung schließen kovalente oder aggregative Konjugate von CRF&sub2;R oder seine Fragmente mit anderen Proteinen oder Polypeptiden ein, wie durch Synthese in rekombinanter Kultur als Nterminale oder C-terminale Fusionen. Zum Beispiel kann das konjugierte Peptid eine Signal- (oder Leader)-Polypeptidsequenz an der N-terminalen Region des Proteins sein, die cotranslationell oder post-translationell die Überführung des Proteins von seiner Synthesestelle zu seiner Funktionsstelle innerhalb oder außerhalb der Zellmembran oder Zellwand steuert (z. B. der oc-Faktor-Leader von Hefe). CRF&sub2;R-Proteinfusionen können auch Peptide umfassen, die hinzugefügt sind, um die Reinigung oder Identifizierung von CRF&sub2;R zu erleichtern (z. B. poly-His, welches Reinigung des Proteins über, z. B., eine NTA-Nickel-chelatisierende Säule erlaubt) oder FLAG (Hopp et al., Bio/Technology 6: 1204-1210, 1988). Andere nützliche Fusionsproteine schließen ein Luciferase, beta-Galactosidase (Grev et al. PNAS 79: 6598, 1982), trp E (Itakura et al., Science 98: 1065, 1977) und Protein A (Ublen et al., Gene 23: 369, 1983). In bevorzugten Ausführungsformen können Fusionsproteine eine Stelle einschließen, die speziell erkannt und gespalten wird, z. B. durch eine Collagenase (welches x in der Sequenz Pro-x-Gly-Pro spaltet, wobei x eine neutrale Aminosäure ist; siehe Keil et al., FEBS Letters 56: 292-296, 1975), oder Faktor Xa (der nach Arginin in der Sequenz Ile-Glu-Gly-Arg spaltet; siehe Nogai et al., Methods Enzymol. 153: 461-481, 1987).
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch CRF&sub2;R-Proteine mit oder ohne assoziierter Glycosylierung im nativen Muster. Kurz gesagt, kann CRF&sub2;R, der in Hefe- oder Säugerexpressionsystemen, wie bspw. COS-7-Zellen, exprimiert wird, ähnlich oder signifikant verschieden sein hinsichtlich des Molekulargewichts und Glycosylierung-Musters von den nativen Molekülen, abhängig vom Expressionssystem. Expression von CRF&sub2;R-Nukleinsäuren in Bakterien wie E. coli liefert nicht-glycosylierte Moleküle. Funktionsmutanten-Analoge von Säugetier-CRF&sub2;R mit inaktivierten N-Glycosylierungsstellen können hergestellt werden durch Oligonukleotid- Synthese und Ligation oder durch ortsspezifische Mutagenese-Techniken. Diese Analog- Proteine können in einer homogenen Form mit verringerten Kohlenhydraten in guter Ausbeute unter Verwendung eines Hefe-Expressionsystems hergestellt werden. N- Glycosylierungsstellen in eukaryotischen Proteinen sind allgemein gekennzeichnet durch das Aminosäuretriplett Asn-A&sub1;-Z, wo A&sub1; eine jede Aminosäure ausgenommen Pro und Z Ser oder Thr ist. In dieser Sequenz liefert Asparagin eine Seitenkettenaminogruppe für kovälente Anbindung von Kohlenhydrat. Eine derartige Stelle kann eliminiert werden, indem Asn oder der Rest Z durch eine andere Aminosäure ersetzt wird, indem Asn oder Z deletiert wird, oder indem eine nicht-Z-Aminosäure zwischen A&sub1; und Z oder eine Aminosäure, die verschieden ist von Asn zwischen Asn und A&sub1;, inseriert wird.
Proteine, die biologisch aktiv sind und im wesentlichen ähnlich zu CRF&sub2;R-Proteinen sind, können auch konstruiert werden, indem, z. B., verschiedene Substituenten von Resten oder Sequenzen gemacht werden oder indem terminale oder interne Reste oder Sequenzen, die für biologische Aktivität nicht benötigt werden, deletiert werden. Zum Beispiel können Cystein- Reste deletiert oder ersetzt werden durch andere Aminosäuren, um die Bildung von nicht korrekten Intramoleküldisulfidbrücken nach Renaturieren zu verhindern. Andere Ansätze für Mutagenese umfassen Modifizieren von benachbarten dibasischen Aminosäureresten, um Expression in Hefesystemen zu verstärken, in denen KEX2-Protease-Aktivität vorhanden ist. Allgemein sollten Substitutionen konservativ gemacht werden, d. h., daß die bevorzugtesten Ersatz-Aminosäuren jene mit physiko-chemischen Eigenschaften sind, die denjenigen der ersetzten Reste ähneln.
Wenn eine Substitutions-, Deletions- oder Insertionsstrategie ergriffen wird, sollte die potentielle Wirkung der Deletion oder Insertion auf die biologische Aktivität in Betracht gezogen werden unter Verwendung von, z. B., einem Bindungstest, wie demjenigen, der in den Beispielen beschrieben ist. Besonders bevorzugte Regionen, worin Mutationen, Deletionen, Substitutionen oder Insertionen vorgenommen werden können, schließen jene ein, die nicht direkt mit der Bindung des Rezeptors an seinen Liganden verbunden sind. Derartige Regionen schließen alle Teile des Rezeptors ein, ausgenommen die N-terminale extrazelluläre Domäne, ebenso wie die dritte intrazelluläre Schleife zwischen Th5 und Th6 (siehe, z. B., Kobilka, Ann. Rev. Neuro. 15: 87-114, 1992).
Mutationen in Nukleotidsequenzen, die für Expression von Proteinen konstruiert wurden, die im wesentlichen ähnlich zu CRF&sub2;-Rezeptoren sind, sollten bevorzugterweise die Leserahmenphase der kodierenden Sequenz erhalten. Weiterhin sollten die Mutationen bevorzugterweise keine komplementären Regionen erzeugen, die hybridisieren könnten, um sekundäre mRNA- Strukturen zu erzeugen, wie Schlaufen oder Haarnadeln, die die Translation der RezeptormRNA negativ beeinflussen würden. Obwohl eine Mutationsstelle vorab bestimmt werden kann, ist es nicht notwendig, daß die Natur der Mutation per se vorab bestimmt ist. Zum Beispiel kann, um für optimale Eigenschaften von Mutanten an einer bestimmten Stelle zu selektieren, zufällige Mutagenese an einem Zielcodon oder über einer gegebenen Stelle durchgeführt werden und die exprimierten CRF&sub2;-Mutanten auf die biologische Aktivität gescreent werden.
Nicht alle Mutationen in der Nukleotidsequenz, die für CRF&sub2;R kodiert, werden im Endprodukt exprimiert werden. Zum Beispiel können Nukleotidsubstitutionen vorgenommen werden, um die Expression zu verstärken, in erster Linie, um Sekundärstrukturschlaufen in der transkripierten mRNA zu vermeiden, oder Codons vorzusehen, die leichter durch den ausgewählten Wirt translatiert werden, z. B., die gut bekannten E. coli-Präferenzcodons für E. coli- Expression.
Mutationen können an speziellen Orten durch Synthese von Oligonukleotiden eingeführt werden, die eine mutierte Sequenz enthalten, flankiert von Restriktionsstellen, die eine Ligation an Fragmente der nativen Sequenz erlauben. Nach Ligation kodiert die resultierende rekonstruierte Sequenz ein Analog mit der erwünschten Aminosäure-Insertion, -Substitution oder - Deletion.
Alternativ könne Oligonukleotid-gesteuerte ortsspezifische Mutagenese-Verfahrensweisen verwendet werden, um ein geändertes Gen mit besonderen Codons vorzusehen, die geändert sind entsprechend der erforderlichen Substitution, Deletion oder Insertion. Typische Verfahren zum Herstellen der oben angegebenen Änderungen sind offenbart von Walder et al. (Gene 42: 133, 1986); Bauer et al. (Gene 37: 73, 1985); Craik, Bio Techniques, Januar 1985, 12-19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981); Sambrook et al. (Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); und US-Patente 4,518,584 und 4,737,462.
CRF&sub2;-Rezeptoren, ebenso wie im wesentlichen ähnliche Derivate oder Analoge, können als therapeutische Reagenzien, Immunogene, Reagenzien in Immunoassays of Rezeptorbasis oder als Bindungsmittel für Affinitätsreinigungsverfahrensweisen für CRF, Sauvagine, Urotensin I oder andere verwandte Moleküle oder andere Bindungsliganden, wie anti-CRF&sub2;- Antikörper, verwendet werden. Darüber hinaus können CRF&sub2;-Rezeptoren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um Verbindungen auf CRF&sub2;-Rezeptor-Agonisten- oder Antagonisten-Aktivität zu screenen. CRF&sub2;-Rezeptor-Proteine können kovalent durch reaktive Seitengruppen an verschiedene unlösliche Substrate kovalent gebunden werden, wie Cyanogenbromin-aktivierte, Bisoxiran-aktivierte, Carbonyldümidazol-aktivierte oder Tosyl-aktivierte, Agarose-Strukturen oder durch Adsorbieren an Polyolefin-Oberflächen (mit oder ohne Glutaraldehyd-Quervernetzung). CRF&sub2;R kann, einmal an ein Substrat gebunden, verwendet werden, um selektiv anti-CRF&sub2;R-Antikörper oder CRF (zu Testzwecke oder Reinigungszwecken) zu binden.

Isolieren von CRF&sub2;-Rezeptor-DNA-Klonen

Wie oben festgehalten, sieht die vorliegende Erfindung isolierte Nukleinsäuremoleküle vor, die CRF&sub2;-Rezeptoren kodieren. Kurz gesagt, können Nukleinsäuremoleküle, die CRF&sub2;- Rezeptoren der vorliegenden Erfindung kodieren, leicht aus einer Vielzahl von warmblütigen Tieren, einschließlich z. B. Menschen, Makaken, Pferde, Rinder, Schafe, Schweine, Hunde, Katzen, Ratten und Mäuse isoliert werden. Besonders bevorzugte Gewebe, aus denen Nukleinsäuremoleküle, die CRF&sub2;-Rezeptoren kodieren, isoliert werden können, schließen Gehirn und neurale Gewebe, wie den Hypothalamus, Hippocampus und Frontalcortex, ebenso wie andere Gewebe, wie die Lunge, Herz, Skelettmuskel oder Niere, ein. Nukleinsäuermoleküle, die CRF&sub2;-Rezeptoren der vorliegenden Erfindung kodieren, können leicht isoliert werden aus konventionell hergestellten cDNA-Genbanken (siehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989) oder aus kommerziell erhältlichen Genbanken (z. Stratagene, La Jolla, Calif) unter Verwendung der hierin vorgesehenen Offenbarung. Besonders bevorzugte Verfahren zum Erhalten von isolierten Nukleinsäuremolekülen, die für CRF&sub2;-Rezeptoren der vorliegenden Erfindung kodieren, sind detaillierter unten in Beispiel 1 beschrieben (siehe auch Sequenz ID Nos 1 und 3).
Wie oben festgehalten, sind, in besonders bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung, isolierte Nukleinsäuremoleküle vorgesehen, die für menschlich CRF&sub2;-Rezeptoren kodieren. Kurz gesagt können derartige Nukleinsäuremoleküle leicht erhalten werden durch Sondieren einer menschlichen cDNA-Genbank entweder mit einer spezifischen Sequenz, wie beschrieben unten in Beispiel 1, oder mit einer Ratten-Sequenz (z. B. Sequenz ID Nos. 1 oder 3) unter Bedingungen mit geringer Stringenz (z. B. 35% Formamid, 5 x SSC, 5 x Denharts, 0,1% SDS, 100 ug/ml Lachssperma-Nukleinsäure bei 42ºC für 12 Stunden. Dem kann extensives Waschen mit 2x SSC folgen, das 0,2% SDS enthält, bei 50ºC. Geeignete cDNA-Genbanken können erhalten werden von kommerziellen Quellen (z. B. Stratagene, La Jolla, Calif.) oder hergestellt werden unter Verwendung von Standardtechniken (siehe z. B. Sambrook et al., oben).

Herstellung von rekombinanten CRF&sub2;-Rezeptoren

Wie oben festgehalten, sieht die vorliegende Erfindung auch rekombinante Expressionvektoren vor, die synthetische oder von cDNA abgeleitete Nukleinsäurefragmente umfassen, die CRF&sub2;-Rezeptoren oder im wesentlichen ähnliche Proteine kodieren, die in operativer Weise mit geeigneten Transkriptions- oder Translationsregulationselementen verbunden sind, die von Säugetier-, mikrobiellen, viralen oder Insektengenen abgeleitet sind. Derartige regulatorische Elemente schließen ein einen Transkriptionspromotor, eine optionale Operatorsequenz, um Transkription zu kontrollieren, eine Sequenz, die geeignete mRNA-ribosomale Bindungsstellen kodiert und, in bevorzugten Ausführungsformen Sequenzen, die die Termination von Transkription und Translation kontrollieren. Die Fähigkeit, in einem Wirt zu replizieren, gewöhnlicherweise verliehen durch einen Repliktionsursprung und ein Selektionsgen, um Erkennung von Transformanten zu erleichtern, kann zusätzlich eingebaut sein. Nukleinsäureregionen sind funktionsfähig miteinander verbunden, wenn sie funktionell untereinander in Beziehung stehen. Zum Beispiel ist Nukleinsäure für ein Signalpeptid (sekretorischer Leader) in funktionsfähiger Weise an Nukleinsäure für ein Polypeptid gebunden, wenn es als ein Vorläufer exprimiert wird, der an der Sekretion des Polypeptids teilnimmt. Ein Promotor ist funktionsfähig mit einer kodierenden Sequenz verbunden, wenn er die Transkription der Sequenz kontrolliert; oder eine Ribosomenbindungsstelle ist funktionsfähig verbunden mit einer kodierenden Sequenz, wenn sie so angeordnet ist, daß sie Translation erlaubt. Im allgemeinen bedeutet funktionsfähig verbunden benachbart und im Falle von sekretorischen Leadern, benachbart und im Leserahmen.
Expressionsvektoren können auch Nukleinsäuresequenzen enthalten, die notwendig sind, um die Sekretion eines interessierenden Polypeptids zu steuern. Derartige Nukleinsäuresequenzen können einschließen wenigstens eine sekretorische Signalsequenz. Typische Beispiele von sekretorischen Signalen schließen ein die alpha-Faktor-Signalsequenz (Prä-Pro-Sequenz; Kurjan und Herskowitz, Cell 30: 933-943), 1982; Kurjan et al., U. S. Patent Nr. 4,546,082; Brake EP 116,201), die PHO5-Signalsequenz (Beck et al., WO 86/00637), die BAR1- sekretorische Signalsequenz (MacKay et al., US-Patent Nr. 4,613,572; MacKay, WO 87/002670), die SUC2-Signalsequenz (Carlson et al., Mol. Cell. Biol. 3: 439-447), die α-1- Antitrypsin-Signalsequenz (Kurachi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6826-6830, 1981), und die β-2-Plasmin-Inhibitor-Signalsequenz (Tone et al., J. Biochem. (Tokyo) 102: 1033- 1042, 1987), die Gewebeplasminogen-Aktivator-Signalsequenz (Pennica et al., Nature 301: 214-221, 1983), die E.co/i-PhoA-Signalsequenz (Yuan et al., J. Biol. Chem. 265: 13528- 13552, 1990) oder irgend eine der bakteriellen Signalsequenzen, die, z. B., von Oliver (Ann. Rev. Microbiol. 39: 615-649, 1985) besprochen sind. Alternativ kann eine Sekretionssignalsequenz synthetisiert werden entsprechend den, z. B., von Heinje (Eur. J. Biochem. 133: 17-21, 1983; J. Mol. Biol. 184: 99-105, 1985; Nuc. Acids Res. 14: 4683-4690, 1986) angegebenen Regeln.
Für die Expression wird ein Nukleinsäuremolekül, das ein CRF&sub2;-Rezeptor kodiert, in einen geeigneten Expressionsvektor inseriert, der wiederum verwendet wird, um geeignete Wirtszellen für die Expression zu transformieren oder zu transfizieren. Wirtszellen, die bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, schließen Säugetier-, Vogel-, Pflanzen-, Insekten-, bakterielle und Pilzzellen ein. Bevorzugte eukaryotische Zellen schließen kultivierte Säugetierzellinien (z. B. Nagetier- oder menschliche Zellinien) und Pilzzellen, einschließlich Spezien von Hefe (z. B. Saccharomyces spp., insbesondere S. cerevisiae, Schizosaccharomyces spp. oder Kluyveromyces spp.) oder filamentösen Pilzen (z. B. Aspergillus spp., Neurospora spp.), ein. Stämme der Hefe Saccharomyces cerevisiae sind besonders bevorzugt. Verfahren zum Herstellen von rekombinanten Proteinen in einer Vielzahl von prokaryotischen und eukaryotischen Wirtszellen sind in der Technik allgemein bekannt (siehe "Gene Expression Technology", Method in Enzymology, Band 185, Goeddel (Hrsg.), Academic Press, San Diego, Calif., 1990; siehe auch "Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology," Methods in Enzymology, Guthrie und Fink (Hrsg.) Academic Press, San Diego, Calif., 1991). Allgemein wird eine Wirtszelle auf der Basis ihrer Fähigkeit ausgewählt werden, das interessierende Protein auf hohem Niveau zu produzieren, und ihrer Fähigkeit, wenigstens einige der Prozessierungs-Schritte auszuführen, die für die biologische Aktivität des Proteins erforderlich sind. Auf diesem Weg kann die Anzahl klonierter Nukleinsäuresequenzen, die in die Wirtszelle transfiziert werden müssen, minimiert und die gesamte Ausbeute an biologisch aktivem Protein maximiert werden.
Geeignete Hefe-Vektoren zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung schließen ein YRp7 (Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1035-1039, 1978), YEp13 (Bröach et al., Gene 8: 121-133, 1979), POT-Vektoren (Kawasaki et al., US-Patent Nr. 4,931,373, welches hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird), pJDB249 und pJDB219 (Beggs, Nature 275: 104-108; 1978) und Derivate davon. Derartige Vektoren werden allgemein einen geeigneten Marker aufweisen, der einer aus einer großen Anzahl von Genen sein kann, die einen dominanten Phänotyp aufweisen, für den ein phänotypischer Test existiert, um zu erlauben, daß Transformanten selektiert werden. Bevorzugte geeignete Marker sind jene, die Wirtszellen-Auxotrophy komplementieren, Antibiotika-Resistenz vorsehen oder eine Zelle in die Lage versetzen, spezifische Kohlenstoffquellen zu verwenden, und schließen ein LEU2 (Broach et al., aaO), URA3, (Botstein et al., Gene 8: 17, 1979), HIS3 (Struhl et al., aaO) oder POT1 (Kawasaki et al., aaO). Ein weiterer geeigneter auswählbarer Marker ist das CAT-Gen, welches Wirtszellen Chloramphenicol-Resistenz verleiht.
Promotoren, die zur Verwendung in Hefen geeignet sind, schließen Promotoren von glycolytischen Hefegenen (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 12073-12080, 1980; Alber und Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1: 419-434, 1982; Kawasaki, US-Patent No. 4,599,311) oder Alkoholdehydrogenasegene (Young et al., in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals, Hollaender et al. (Hrsg.), S. 355, Plenum New York, 1982; Ammerer, Meth. Enzymol. 101: 192-201, 1983) ein. In dieser Hinsicht besonders bevorzugte Promotoren sind der TPI1- Promotor (Kawasaki, US-Patent Nr. 4,599,311, 1986) und der ADH2-4c-Promotor (Russell et al., Nature 304: 652-654, 1983; Irani und Kilgore, US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 07/784,653, welche hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird). Die Expressionseinheiten können auch einen Transkriptionsterminator, wie den TPIl-Terminator (Alber und Kawasaki, aaO), einschließen.
Zusätzlich zu Hefen können Proteine der vorliegenden Erfindung in filamentösen Pilzen exprimiert werden, z. B. Stämmen des Pilzes Aspergillus (McKnight et al., US-Patent Nr. 4,935,349, welches hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird). Beispiele für nützliche Promotoren schließen jene ein, die von glycolytischen Genen von Aspergillus nidulans abgeleitet sind, wie der ADH3-Promotor (McKnight et al., EMBO J. 4: 2093-2099, 1985) und der tpiA-Promotor. Ein Beispiel für einen geeigneten Terminator ist der ADH3-Terminator (McKnight et al., aaO. 1985). Die Expressionseinheiten, die derartige Komponenten verwenden, sind in Vektoren kloniert, die in der Lage sind, in die chromosomale Nukleinsäure von Aspergillus zu inserieren.
Techniken zum Transformieren von Pilzen sind in der Literatur gut bekannt und sind, z. B., beschrieben worden von Beggs (aaO.), Hinnen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929- 1933, 1978), Yelton et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1740-1747, 1984) und Russell (Nature 301: 167-169, 1983). Der Genotyp der Wirtszelle wird im allgemeinen einen genetischen Defekt enthalten, der durch den selektierbaren Marker komplementiert wird, der sich auf dem Expressionsvektor befindet. Die Auswahl eines speziellen Wirtes und selektierbaren Markers ist sehr wohl im Rahmen der Fähigkeiten des Fachmannes. Um Produktion der heterologen Proteine in, z. B., Hefe, zu optimieren ist bevorzugt, daß der Wirtsstamm eine Mutation trägt, wie die pep4-Hefemutation (Jones, Genetics 85: 23-33, 1977), was zu verringerter proteolytischer Aktivität führt.
Zusätzlich zu Pilzzellen können kultivierte Säugetierzellen als Wirtszellen in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Bevorzugte kultivierte Säugetierzellen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung schließen ein die COS-1-(ATCC Nr. CRL 1650), COS-7-(ATCC Nr. CRL 1651), BHK-(ATCC Nr. CRL 1632) und 293-(ATCC Nr. CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59-72, 1977)-Zellinien. Eine bevorzugte BHK-Zellinie ist die BHK 570- Zellinie (hinterlegt bei der American Type Culture Collection unter Zugangsnummer CRL 10314). Zusätzlich kann eine Anzahl anderer Säugetierzellinien in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, einschließlich Ratten-Hep I (ATCC Nr. CRL 1600), Ratten-Hep II (ATCC Nr. CRL 1548), TCMK (ATCC Nr. CCL 139), menschliche Lunge (ATCC Nr. CCL 75.1), menschliches Hepatom (ATCC Nr. HTB-52), Hep G2 (ATCC Nr. HB 8065), Mäuseleber (ATCC Nr. CCL, 29.1), NCTC 1469 (ATCC Nr. CCL 9.1), SP2/0-Ag14 (ATCC Nr. 1581), HIT-T15 (ATCC Nr. CRL 1777), und RINm 5AHT&sub2;B (Orskov und Nielson, FEBS 229(1): 175-178, 1988).
Säugetierexpressionsvektoren zur Verwendung beim Ausführen der vorliegenden Erfindung sollten einschließen einen Promoter, der in der Lage ist, die Transkription eines klonierten Gens oder cDNA zu steuern. Bevorzugte Promotoren schließen virale Promotoren und zelluläre Promotoren ein. Virale Promotoren schließen den unmittelbaren frühen Cytomegalovirus- Promoter (Boshart et al. Cell 41: 521-530, 1985) und den SV40-Promoter (Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1: 854-864,1981) ein. Zelluläre Promotoren schließen den Metallothionein-1- Promoter von der Maus (Palmiter et al., U. S. Patent Nr. 4,579,821), einen Vj-Promoter von Mäusen (Bergmann et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 81: 7041-7045, 1983; Grant et al., Nuc. Acids Res. 15: 5496, 1987) und einen VH-Promoter von der Maus (Loh et al., Cell 33: 85-93, 1983) ein. Ein besonders bevorzugter Promoter ist der späte Hauptpromoter von Adenovirus 2 (Kaufhian und Sharp, Mol. Cell. Biol. 2: 1304-13199, 1982). Derartige Expressionsvektoren können auch einen Satz an RNA-Splice-Stellen enthalten, die stromabwärts vom Promoter und stromaufwärts von der Nukleinsäuresequenz angeordnet sind, die für das interessierende Peptid oder das interessierende Protein codiert. Bevorzugte RNA-Splice-Stellen können erhalten werden von SV40-Adenovirus und/oder Immunglobulingenen. Alternativ können in bestimmten Ausführungsformen RNA-Splice-Stellen stromabwärts von der Nukleinsäuresequenz angeordnet sein, die das interessierende Peptid oder Protein codiert. In den Expressionsvektoren ist auch ein Polyadenylierungssignal enthalten, das stromabwärts der interessierenden codierenden Sequenz angeordnet ist. Geeignete Polyadenylierungssignale schließen die frühen oder späten Polyadenylierungssignale von SV40 (Kauffrian und Sharp, aao) ein, das Polyadenylierungssignal von der Adenovirus 5 EIB-Region und den Terminator des menschlichen Wachstumshormongens (DeNoto et al., Nuc. Acids Res. 9: 3719-3730, 1981). Die Expressionsvektoren können eine nicht-codierende virale Leader-Sequenz, wie den dreiteiligen Adenovirus 2-Leader einschließen, die zwischen dem Promoter und den RNA-Splice- Stellen angeordnet ist. Bevorzugte Vektoren können auch Enhancer-Sequenzen einschließen, wie den SV40-Enhancer und den Maus 1-Enhancer (Gillies, Cell 33: 717-728, 1983). Expressionsvektoren können auch Sequenz einschließen, die die Adenovirus-VA-RNAs codieren. Geeignete Vektoren können erhalten werden von kommerziellen Quellen (z. B. Invitrogen, San Diego, CA; Stratagene, La Jolla, CA).
Klonierte Nukleinsäuresequenzen können in kultivierte Säugetierzellen eingeführt werden durch, z. B., Calciumphosphat-vermittelte Transfektion (Wigler et al., Cell 14: 725, 1978, Corsaro und Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981; Graham und Van der Eb, Virology 52: 456, 1973), Elektroporation (Neumann et al., EMBO J. 1: 841-845, 1982) oder DEAE- Dextran-vermittelte Transfektion (Ausubel et al., (Hrsg.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. NY, 1987), die hierin durch Bezugnahme aufgenommen sind. Um Zellen zu identifizieren, die die klonierte Nukleinsäure stabil integriert haben, wird im allgemeinen ein selektierbarer Marker in die Zellen zusammen mit dem interessierenden Gen oder der interessierenden cDNA eingeführt. Bevorzugte selektierbare Marker zur Verwendung in kultivierten Säugetierzellen schließen Gene ein, die Resistenz gegenüber Wirkstoffen, wie Neomycin, Hygromycin und Methotrexat verleihen. Der selektierbare Marker kann ein amplifizierbarer selektierbarer Marker sein. Bevorzugte amplifizierbare selektierbare Marker sind das DHFR-Gen und das Neomycin-Resistenzgen. Ausgewählte Marker sind besprochen bei Thilly (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA, welches hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist). Die Auswahl von selektierbaren Markern ist im Rahmen der Fähigkeiten der Fachleute.
Selektierbare Marker können in die Zelle auf einem getrennten Vektor zur gleichen Zeit eingeführt werden, wie die CRF&sub2;-Rezeptorsequenz, oder sie können auf demselben Vektor eingeführt werden. Wenn sie auf demselben Vektor sind, können der selektierbare Marker und die CRF&sub2;-Rezeptorsequenz unter der Kontrolle verschiedener Promotoren oder desselben Promoters sein, wobei die letzere Anordnung eine dicistronische Botschaft produziert. Konstrukte dieses Typs sind in der Technik bekannt (z. B. Levinson und Simonsen, U. S. Patent Nr. 4,713,339). Es kann auch vorteilhaft sein, zusätzliche Nukleinsäuren hinzuzufügen, die als "Trägernukleinsäure" bekannt ist, zu der Mischung, die in die Zellen eingeführt wird.
Man erlaubt, daß transfizierte Säugetierzellen für eine Zeitspanne, typischerweise 1-2 Tage, wachsen, um zu beginnen, die interessierende(n) Nukleinsäuresequenz(en) zu exprimieren. Wirkstoffselektion wird dann angewandt, um auf das Wachstum von Zellen zu selektieren, die die selektierbaren Marker stabil exprimieren. Für Zellen, die mit einem amplifizierbaren selektierbaren Marker transfiziert worden sind, kann die Wirkstoffkonzentration schrittweise gesteigerte werden, um auf gesteigerte Kopienanzahl der klonierten Sequenzen zu selektieren und dadurch den Umfang der Expression zu erhöhen. Zellen, die die eingeführten Sequenzen exprimieren, sind ausgewählt und auf Produktion des interessierenden Proteins in der erwünschten Form oder dem erwünschten Umfang gescreent. Zellen, die diesen Kriterien genügen, können dann kloniert und für die Produktion im Maßstab vergrößert werden.
Bevorzugte prokaryotische Wirtszellen zur Verwendung beim Ausführen der vorliegenden Erfindung schließen ein Escherichia coli (z. B. E. coli HB101, E. coli DHI, E. coli MRC1 und E. coli W3110), obwohl Bacillus, Pseudomonas und Streptomyces und andere Gattungen auch nützlich sind. Techniken zum Transformieren dieser Wirte und Exprimieren fremder Nukleinsequenzen, die darin kloniert sind, sind in der Technik gut bekannt (siehe z. B. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982; oder Sambrook et al., oben). Vektoren, die für die Expression klonierter Nukleinsäuresequenzen in bakteriellen Wirten verwendet werden, werden allgemein einen selektierbaren Marker, wie ein Gen für Antibiotikaresistenz, und einen Promoter enthalten, der in der Wirtszelle funktioniert. Geeignete Promotoren schließen ein den trp (Nichols und Yanofsky, Meth. Enzymol. 101: 155-164, 1983), lac (Casadaban et al., J. Bacteriol. 143: 971-980, 1980) und Phage k (Queen, J. Mol. Appl. Genet. 2: 1-10, 1983)-Promotersysteme ein. Plasmide, die zum Transformieren von Bakterien nützlich sind, schließen pBR322 (Bolivar et al., Gene 2: 95-113, 1977), die pUC-Plasmide (Messing, Meth. Enzymol. 101: 20-78, 1983; Vieira und Messing, Gene 19: 259-268, 1982), pCQV2 (Queen, aao), pMAL-2 (New England Biolabs, Beverly, MA) und Derivate davon ein. Plasmide können sowohl virale als auch bakterielle Elemente enthalten.
Auf der Grundlage der hierin gegebenen Lehren würden Promotoren, Terminatoren und Verfahren zum Einführen von Expressionsvektoren, die CRF&sub2;-Rezeptoren der vorliegenden Erfindung codieren, in Pflanzen-, Vogel- und Insektenzellen für die Fachleute offensichtlich sein. Die Verwendung von, z. B., Baculoviren als Vektoren zum Exprimieren von heterologen Nukleinsäuresequenzen in Insektenzellen ist besprochen worden von Atkinson et al. (Pestic. Sci. 28: 215-224, 1990). Zusätzlich ist die Verwendung von Agrobacterium rhizogenes als Vektoren zur Expression von Genen in Pflanzenzellen von Sinkar et al. (J. Biosci. (Bangalore) 11: 47-58, 1987) beschrieben worden.
Wirtszellen, die Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung enthalten, werden dann kultiviert, um ein Nukleinsäuremolekül zu exprimieren, das einen CRF&sub2;-Rezeptor exprimiert. Die Zellen werden in einem Kulturmedium kultiviert entsprechend Standardverfahren, das Nährstoffe enthält, die für das Wachstum der ausgewählten Wirtszellen erforderlich sind. Eine Vielzahl geeigneter Medien sind in der Technik bekannt und schließen im allgemeinen eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, essentielle Aminosäuren, Vitamine und Mineralien ebenso wie andere Komponenten ein, z. B. Wachstumsfaktoren oder Serum, die von den speziellen Wirtszellen benötigt werden. Das Wachstumsmedium wird allgemein Zellen selektieren, die die Nukleinsäuremoleküle enthalten, durch, z. B., Wirkstoffselektion oder Mangel an essentiellem Nährstoff, der durch den selektierbaren Marker auf dem Nukleinsäurekonstrukt komplementiert oder mit dem Nukleinsäurekonstrukt co-transfiziert wird.
Geeignete Wachstumsbedingungen für Hefezellen schließen, z. B., Kultivieren in einem chemisch definierten Medium ein, das eine Stickstoffquelle, die eine Nicht-Aminosäure- Stickstoffquelle oder ein Hefeextrakt sein kann, anorganische Salze, Vitamine und essentielle Aminosäuresupplemente enthält bei einer Temperatur zwischen 4ºC und 37ºC, wobei 30ºC besonders bevorzugt ist. Der pH des Mediums wird bevorzugterweise beibehalten bei einem pH größer als 2 und weniger als 8, bevorzugterweise pH 5-6. Verfahren zum Beibehalten eines stabilen pHs schließen Puffern und andauernde pH-Kontrolle ein. Bevorzugte Agenzien für die pH-Kontrolle schließt Natriumhydroxid ein. Bevorzugte Puffermittel schließen Bernsteinsäure und Bis-Tris (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) ein. In Folge der Neigung von Hefewirtszellen, heterologe Proteine zu hyperglycosilieren, kann es bevorzugt sein, die CRF&sub2;- Rezeptoren der vorliegenden Erfindung in Hefezellen zu exprimieren, die einen Defekt in einem Gen aufweisen, das für Asparagin-gekoppelte Glycosylierung erforderlich ist. Derartige Zellen werden bevorzugterweise in einem Medium angezogen, das einen osmotischen Stabilisator enthält. Ein bevorzugter osmotischer Stabilisator ist Sorbitol, das in das Medium mit einer Konzentration zwischen 0,1 M und 1,5 M, bevorzugterweise bei 0,5 M oder 1,0 M, suplementiert ist. Kultivierte Säugetierzellen werden im allgemeinen kultiviert in kommerziell erhältlichen Serum-enthaltenden oder Serumfreien Medien. Die Auswahl eines Mediums und Wachstumsbedingungen, die für die spezielle Zellinie angemessen sind, erfolgt im Rahmen der Fähigkeiten des Fachmannes.
CRF&sub2;-Rezeptoren können auch in nicht-menschlichen transgenen Tieren exprimiert werden, insbesondere transgenen warmblütigen Tiere. Verfahren zum Herstellen von transgenen Tieren, einschließlich Mäusen, Ratten, Kaninchen, Schafen und Schweinen, sind in der Technik bekannt und sind, z. B., offenbart bei Hammer et al. (Nature 315: 680-683, 1985), Palmiter et al. (Science 222: 809-814, 1983), Brinster et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4438-4442, 1985), Palmiter und Brinster (Cell 41: 343-345, 1985) und U. S. Patent Nr. 4,736,866, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen sind. Kurz gesagt wird eine Expressionseinheit, die eine Nukleinsäuresequenz enthält, die zusammen mit in geeigneter Weise angeordneten Expressionskontrollsequenzen exprimiert werden soll, in Pronuclei von befruchteten Eiern eingeführt. Das Einführen von Nukleinsäure erfolgt gewöhnlicherweise durch Mikroinjektion. Integration der injizierten Nukleinsäure wird nachgewiesen durch Blot-Analyse von Nukleinsäure von Gewebeproben, typischerweise Proben von Schwanzgewebe. Es wird allgemein bevorzugt, daß die eingeführte Nukleinsäure in die Keimbahn des Tieres eingebaut wird, so daß sie auf die Nachfahren des Tieres weitergegeben wird.
"Knockout"-Tiere können entwickelt werden von embryonischen Stammzellen durch die Verwendung von homologer Rekombination (Capecchi, Science 244: 1288-1292, 1989) oder antisense-Oligonucleotid (Stein und Chen, Science 261(5124): 1004-1012, 1993; Milligan et al., Semin. Conc. Biol. 3(6): 391-398, 1992).
Ein transgenes Tier, wie eine Maus, kann entwickelt werden durch Targetieren einer Mutation, um eine CRF&sub2;-Rezeptorsequenz zu zerreißen (siehe Mansour et al. "Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: A general strategy for targeting mutations to non-selectable genes," Nature 336: 348-352, 1988). Derartige Tiere können leicht verwendet werden als ein Modell, um die Rolle von CRF&sub2;-Rezeptoren im Metabolismus zu studieren.

CRF&sub2;-Rezevtorpeptide

Wie oben festgehalten, sieht die vorliegende Erfindung auch CRF&sub2;-Rezeptorpeptide vor. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sollte der CRF&sub2;-Rezeptor so verstanden werden, daß er Teile eines CRF&sub2;-Rezeptors oder Derivate davon, wie oben diskutiert, umfaßt, die keine Transmembrandomänen enthalten und die wenigstens 8, und bevorzugter 10 oder mehr Aminosäuren lang sind. Kurz gesagt kann die Struktur des CRF&sub2;-Rezeptors ebenso wie mutmaßliche Transmembrandomänen aus den primären Translationsprodukten vorhergesagt werden unter Verwendung der hydrophoben Plotfunktion von, z. B., P/C Gen oder Intelligenetics Suite (Intelligenetics, Mt. View, CA) oder entsprechend den von Kyte and Doolittle (J. Mol. Biol. 157: 105-132, 1982) beschriebenen Verfahren. Während man nicht wünscht, durch eine graphische Darstellung, auf der Basis dieser Hydrophobieanalyse gebunden zu sein, glaubt man, daß CRF&sub2;-Rezeptoren die in Fig. 1 und 2 gezeigte allgemeine Struktur aufweisen. Insbesondere glaubt man, daß diese Rezeptoren eine extrazelluläre aminoterminale Domäne, drei extrazelluläre Schlaufendomänen und vier intrazelluläre Schlaufendomänen umfassen, die jeweils durch eine Transmembrandomäne getrennt sind.
In einem Aspekt der Erfindung sind isolierte CRF&sub2;-Rezeptorpeptide vorgesehen, die die extrazelluläre aminoterminale Domäne eines CRF&sub2;-Rezeptors umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein isoliertes CRF&sub2;-Rezeptorpeptid vorgesehen, das die in Sequenz I.D. No. 4 gezeigte Aminosäuresequenz von Aminosäure 1 bis Aminosäurenummer 118 umfaßt. In einer weiteren Ausführungsform ist ein isoliertes CRF&sub2;-Rezeptorpeptid vorgesehen, das die in Sequenz I.D. No. 2 gezeigte Aminosäuresequenz von Aminosäure 1 bis Aminosäurenummer 138 umfaßt.
CRF&sub2;-Rezeptorpeptide können hergestellt werden, durch, neben anderen Verfahren, Kultivieren von geeigneten Wirts-/Vektorsystemen, um die rekombinanten Translationsprodukte der vorliegenden Erfindung herzustellen. Überständen von solchen Zellinien können dann durch eine Vielzahl von Reinigungsverfahrensweisen behandelt werden, um das CRF&sub2;- Rezeptorpeptid zu isolieren. Zum Beispiel kann der Überstand zuerst konzentriert werden unter Verwendung kommerziell erhältlicher Proteinkonzentrationsfilter, wie eine Amicon- oder Millipore Pellicon-Ultrafiltrationseinheit. Nach Konzentrierung kann das Konzentrat auf eine geeignet Reinigungsmatrix aufgetragen werden, wie, z. B., CRF oder ein anti-CRF&sub2;- Rezeptor-Antikörper, der an einen geeigneten Träger gebunden ist. Alternativ können Anionen- oder Kationenaustauschharze verwendet werden, um den Rezeptor oder das Peptid zu reinigen. Schließlich können ein oder mehrere Umkehrphasen- Hochleistungsflüssigchromatographie (RP-HPLC)-Schritte verwendet werden, um das CRF&sub2;- Rezeptorpeptid weiter zu reinigen.
Alternativ können CRF&sub2;-Rezeptorpeptide auch hergestellt werden unter Verwendung von Standardpolypeptidsyntheseprotokollen und unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahrensweisen gereinigt werden.
Ein CRF&sub2;-Rezeptorpeptid wird als "isoliert" oder gereinigt betrachtet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung, wenn nur eine einzelne Bande nachgewiesen wird nach SDS- Polyacrylamidgelanalyse, gefolgt von Färben mit Coomassie Brilliant Blau.

Antikörper gegen CRF&sub2;-Rezeptoren

In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung können CRF&sub2;-Rezeptoren, einschließlich Derivaten davon, ebenso wie Teile oder Fragmente dieser Proteine, wie die CRF&sub2;- Rezeptorpeptide, die oben diskutiert sind, verwendet werden, um Antikörper herzustellen, die spezifisch an CRF&sub2;-Rezeptoren binden. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung umfaßt der Begriff "Antikörper" polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper, Fragmente davon, wie F(ab')&sub2;- und Fab-Fragmente, ebenso wie rekombinant hergestellte Bindungspartner. Diese Bindungspartner schließen die variablen Regionen von einem Gen ein, welches einen spezifisch bindenden monoklonalen Antikörper codiert. Antikörper werden definiert als spezifisch bindend, wenn sie an den CRF&sub2;-Rezeptor mit einem Ka von größer als oder gleich 10&sup7; M&supmin;¹ binden. Die Affinität von einem monoklonalen Antikörper oder Bindungspartner kann leicht von einem Fachmann bestimmt werden (siehe Scatchard, Ann. N. Y. Acad. Sci. 51: 660-672, 1949).
Polyklonale Antikörper können leicht hergestellt werden durch den Fachmann von einer Vielzahl von warmblütigen Tieren, wie Pferden, Kühen, Ziegen, Schafen, Hunden, Hühnchen, Kaninchen, Mäusen oder Ratten. Kurz gesagt wird der CRF&sub2;-Rezeptor verwendet, um das Tier durch intraperitoneale, intramuskuläre, intraokulare oder subkutane Injektionen zu immunisieren. Die Immunogenität von einem CRF&sub2;-Rezeptor oder CRF&sub2;-Rezeptorpeptid kann erhöht werden durch die Verwendung eines Adjuvans wie vollständigem oder unvollständigem Freundschem Adjuvans. Nach mehreren Auffrischungsimmunisierungen werden kleine Serumproben gesammelt und auf Reaktivität mit dem CRF&sub2;-Rezeptor getestet. Eine Vielzahl von Tests kann verwendet werden, um Antikörper nachzuweisen, die spezifisch an einen CRF&sub2;-Rezeptor binden. Beispielhafte Tests sind detailliert beschrieben in Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (Herausgeber), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. Typische Beispiele derartiger Tests schließen ein: Gegenstromimmunelektrophorese (CIEP), Radioimmunotests, Radioimmunpräzipitationen, enzymgekoppelte Immunsorptionstests (ELISA), Dot Blot-Tests, Inhibitions- oder Kompetitionstests und Sandwichtest (siehe U. S. Patente 4,376,110 und 4,486,530; siehe auch Antibodies: A Laboratory Manual, oben). Besonders bevorzugte polyklonale Antiseren werden ein Signal geben, das wenigstens dreimal so groß ist wie der Hintergrund. Wenn der Titer des Tieres einmal ein Plateau hinsichtlich seiner Reaktivität mit dem CRF&sub2;-Rezeptor erreicht hat, können größere Mengen an polyklonalem Antiserum leicht erhalten werden entweder durch wöchentliches Zuraderlassen oder durch Ausbluten des Tieres.
Monoklonale Antikörper können leicht hergestellt werden unter Verwendung gut bekannter Techniken (siehe U. S. Patente RE 32,011, 4,902,614, 4,543,439 und 4,411,993; siehe auch Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn, und Bechtol (Herausgeber), 1980, und Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow und Lane (Herausgeber), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). Kurz gesagt wird in einer Ausführungsform einem Tier, wie einer Ratte oder Maus, eine Form von CRF&sub2;-Rezeptor injiziert, die in der Lage ist, eine Immunantwort gegen den CRF&sub2;-Rezeptor zu erzeugen. Typische Beispiele geeigneter Formen schließen ein, u. a. Zellen, die den CRF&sub2;- Rezeptor exprimieren oder Peptide, die auf der CRF&sub2;-Rezeptorsequenz basieren. Zusätzlich sind viele Techniken in der Technik zum Erhöhen der sich einstellenden Immunantwort bekannt, z. B. durch Koppeln des Rezeptors oder Rezeptorpeptids an ein weiteres Protein, wie Ovalbumin oder keyhole limpet hemocyanin (KLH), oder durch die Verwendung von Adjuvans, wie vollständiges oder unvollständiges Freundsches Adjuvans. Die anfängliche Immunisierung kann erfolgen auf intraperitonealem, intramuskulärem, intraokularem oder subkutanem Wege.
Zwischen einer und drei Wochen nach der anfänglichen Immunisierung kann das Tier erneut immunisiert werden mit einer weiteren Auffrischungsimmunisierung. Das Tier kann dann zu Testzwecken zur Ader gelassen werden und das Serum auf Bindung gegen den CRF&sub2;- Rezeptor getestet werden unter Verwendung von Tests, wie oben beschrieben. Zusätzliche Immunisierungen können auch durchgeführt werden, bis das Tier hinsichtlich seiner Reaktivität gegen den CRF&sub2;-Rezeptor ein Plateau erreicht hat. Dem Tier kann dann eine letzte Auffrischung von CRF&sub2;-Rezeptor oder CRF&sub2;-Rezeptorpeptide gegeben und drei bis vier Tage später getötet werden. Zu diesem Zeitpunkt können die Milz und Lymphknoten geernetet werden und zerteilt werden in eine Einzelzellsuspension, indem die Organe durch einen Maschenfilter gegeben werden oder durch Zerreißen der Milz- oder Lymphknotenmembranen, die die Zellen enkapsidieren. In einer Ausführungsform werden die Erythrozyten nachfolgend durch Hinzufügen einer hypotonischen Lösung, gefolgt von unmittelbarem Zurückkehren zur Isotonität, lysiert.
In einer weiteren Ausführungsform werden geeignete Zellen zum Herstellen von monoklonalen Antikörpern erhalten durch die Verwendung von in vitro-Immunisierungstechniken. Kurz gesagt wird ein Tier getötet und die Milz- und Lymphknotenzellen entfernt, wie oben beschrieben. Eine Einzelzellsuspension wird hergestellt und die Zellen werden in eine Kultur gegeben, die eine Form des CRF&sub2;-Rezeptors enthält, die in der Lage ist, eine Immuantwort, wie oben beschrieben, zu erzeugen. Nachfolgend werden die Lymphozyten geerntet und wie unten beschrieben fusioniert.
Zellen, die durch die Verwendung einer in vitro-Immunisierung, oder von einem immunisierten Tier, wie oben beschrieben, erhalten werden, können immortalisiert werden durch Transfektion mit einem Virus, wie dem Epstein-Barr-Virus (EBV) (siehe Glasky und Reading, Hybridoma 8(4): 377-389, 1989). Alternativ werden in einer bevorzugten Ausführungsform die geernteten Milz- und/oder Lymphknotenzellsuspensionen mit einer geeigneten Myelomzelle fusioniert, um ein "Hybridom" zu erzeugen, das monoklonale Antikörper sekretiert. Geeignete Myelomlinien sind bevorzugterweise hinsichtlich der Konstruktion und Expression von Antikörpern defekt und sind zusätzlich syngeneisch mit den Zellen des immunisierten Tieres. Viele derartige Myelomzellinien sind in der Technik bekannt und können erhalten werden von Quellen, wie der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland (siehe Catalogue of Cell Lines & Hybridomas, 6. Auflage, ATCC, 1988). Typische Myelomzellinien schließen ein: für Menschen, UC 729-6 (ATCC Nr. CRL 8061), MC/CAR- Z2 (ATCC Nr. CRL 8147), und SKO-007 (ATCC Nr. CRL 8033); für Mäuse SP2/0-Ag14 (ATCC Nr. CRL 1581), und P3X63Ag8 (ATCC Nr. TIB 9); und für Ratten Y3-Ag1.2.3 (ATCC Nr. CRL 1631), und YB2/0 (ATCC Nr. CRL 1662). Besonders bevorzugte Fusionslinien schließen ein NS-1 (ATCC Nr. TIB 18) und P3X63 - Ag 8.653 (ATCC Nr. CRL 1580), die für Fusionen mit entweder Mäuse-, Ratten- oder menschlichen Zellinien verwendet werden können. Die Fusion zwischen der Myelomzellinie und den Zellen von dem immunisierten Tier kann vorgenommen werden durch eine Vielzahl von Verfahren, einschließlich der Verwendung von Polyethylenglycol (PEG) (siehe Antibodies: A Laboratory Mannual, Harlow und Lane (Herausgeber), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988) oder Elektrofusion (siehe Zimmermann und Vienken, J. Membrane Biol. 67: 165-182, 1982).
Nach der Fusion werden die Zellen in Kulturplatten gegeben, die ein geeignetes Medium, wie RPMI 1640 oder DMEM (Dulbecco's modifiziertes Eagles Medium) (JRH Biosciences, Lenexa, KS) enthalten. Das Medium kann auch zusätzliche Bestandteile enthalten, wie fötales Rinderserum ("FBS", d. h., von Hyclone, Logan, Utah oder JRH Biosciences), Thymocyten, die von einem Jungtier derselben Spezies geerntet wurden, die für die Immunisierung verwendet wurde, oder Agar, um das Medium zu verfestigen. Zusätzlich sollte das Medium ein Reagens enthalten, das selektives Wachstum von fusionierten Milz- und Myelomzellen erlaubt. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von HAT (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Nach etwa sieben Tagen können die resultierenden fusionierten Zellen oder Hybridome gescreent werden, um die Anwesenheit von Antikörpern zu bestimmen, die den CRF&sub2;-Rezeptor erkennen. Nach mehreren klonalen Verdünnungen und erneuten Tests kann ein Hybridom isoliert werden, das Antikörper produziert, die an den CRF&sub2;-Rezeptor binden.
Andere Techniken können auch verwendet werden, um monoklonale Antikörper zu konstruieren (siehe Huse et al., "Generation of a Large Combinational Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda", Science 246: 1275-1281, Dezember 1989; siehe auch Sastry et al., "Cloning of the Immunological Repertoire in Escherichia coli for Generation of Monoclonal Catalytic Antibodies: Construction of a Heavy Chain Variable Region-Specific cDNA Library", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5728-5732, August 1989; siehe auch Alting-Mees et al., "Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas", Strategies in Molecular Biology: 3: 1-9, Januar 1990; diese Literaturstellen beschreiben ein kommerziell erhältliches System von Stratacyte, La Jolla, California, welches die Produktion von Antikörpern durch rekombinante Techniken erlaubt). Kurz gesagt wird mRNA aus einer B- Zell-Population isoliert und verwendet, um cDNA-Expressionsgenbanken von der schweren und leichten Kette von Immunglobulin in den kIMMUNOZAP(H)- und kIMMUNOZAP(L)- Vektoren zu erzeugen. Diese Vektoren können einzeln gescreent werden oder co-exprimiert werden, um Fab-Fragmente oder Antikörper zu exprimieren (siehe Huse et al., oben; siehe auch Sastry et al., oben). Positive Plaques können dann in nicht-lytisches Plasmid umgewandelt werden, was eine Expression von monoklonalen Antikörperfragmenten von E. coli auf hohem Niveau erlaubt.
In ähnlicher Weise können unter Verwendung von recombinanter Nucleinsäuretechniken auch Bindungspartner konstruiert werden, um die variablen Regionen eines Gens einzubauen, das für einen spezifisch bindenden Antikörper codiert. Die Konstruktion dieser Proteine kann leicht vorgenommen werden von einem Fachmann (siehe Larrick et al., "Polymerase Chain Reaction Using Mixed Primers: Cloning of Human Monoclonal Antibody Variable Region Genes From Single Hybridoma Cells", Biotechnology 7: 934-938, September 1989; Riechmann et al., "Reshaping Human Antibodies for Therapy", Nature 332: 323-327, 1988; Roberts et al., "Generation of an Antibody with Enhanced Affmity and Specificity for its Antigen by Protein Engineering", Nature 328: 731-734, 1987; Verhoeyen et al., "Reshaping Human Antibodies: Grafling an Antilysozyme Activity", Science 239: 1534-1536, 1988; Chaudhary et al., "A Recombinant Immunotoxin Consisting of Two Antibody Variable Domains Fused to Pseudomonas Exotoxin", Nature 339: 394-397, 1989, siehe auch, U. S. -Patent 5,132,405 mit dem Titel "Biosynthetic Antibody Binding Sites") auf der Grundlage der hierin zur Verfügung gestellten Offenbarung. Kurz gesagt werden in einer Ausführungsform Nukleinsäuremoleküle, die für CRF&sub2;-Rezeptor-spezifische Antigenbindungsdomänen codieren, von Hybridomen amplifiziert, die einen spezifisch bindenden monoklonalen Antikörper produzieren, und direkt in das Genom einer Zelle inseriert, welche menschliche Antikörper produziert (siehe Verhoeyen et al., oben; siehe auch Reichmann et al., oben). Diese Technik erlaubt, daß die Antigen-Bindungsstelle eines spezifisch bindenden monoklonalen Antikörpers von Maus oder Ratte in einen menschlichen Antikörper überführt wird. Derartige Antikörper sind bevorzugt für die therapeutische Anwendung beim Menschen, da sie nicht antigeneisch sind, wie die Antikörper von Ratte oder Maus.
Alternativ kann die Antigen-Bindungsstelle (variable Region) entweder verbunden werden mit, oder inseriert werden in, ein anderes vollständig verschiedenes Protein (siehe Chaudhary et al., oben) was zu einem neuen Protein mit Antigen-Bindungsstellen des Antikörpers ebenso wie der funktionellen Aktivität des anderen verschiedenen Proteins führt. Wie der Fachmann erkennen wird, können die Antigen-Bindungsstellen oder CRF&sub2;-Rezeptorbindungsdomänen des Antikörpers in der variablen Region des Antikörpers gefunden werden. Darüberhinaus können auch Nukleinsäuresequenzen, die geringere Teile des Antikörpers oder der variablen Regionen, die spezifisch an Säugetier-CRF&sub2;-Rezeptor binden, im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Diese Teile können leicht auf Bindungsspezifität gegen den CRF&sub2;-Rezeptor getestet werden unter Verwendung von unten beschriebenen Tests.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Gene, die für die variable Region von einem Hybridom codieren, das einen interessierenden monoklonalen Antikörper produziert, amplifiziert unter Verwendung von Oligonucleotidprimern für die variable Region. Diese Primer können durch den Fachmann synthetisiert werden, oder können von kommerziell erhältlichen Quellen erhalten werden. Stratacyte (La Jolla, CA) verkauft Primer für variable Regionen von Maus und Mensch, die, u. a., Primer für VHa-, VHb-, VHc-, VHd-, CH1-, VL- und CL-Regionen umfassen. Diese Primer können verwendet werden, um variable Regionen der schweren oder leichten Kette zu amplifizieren, die dann in Vektoren wie IMMUNOZAP*(H) bzw. IMMUNOZAP*(L) (Stratacyte) inseriert werden können. Diese Vektoren können dann zur Expression in E. coli eingeführt werden. Unter Verwendung dieser Technik können große Mengen an Einzelkettenprotein hergestellt werden, die eine Fusion der VH- und VL-Domänen enthalten (siehe Bird et al., Science 242: 423-426, 1988).
Andere "Antikörper" können auch hergestellt werden unter Verwendung der hierin vorgesehenen Offenbarung und die man somit ebenfalls unter den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung fallend betrachtet, schließen ein humanisierte Antikörper (z. B. U. S. Patent 4,816,567 und WO 94/10332), Mikrobodies (z. B. WO 94/09817) und transgene Antikörper (z. B. GB 2 272 440).
Nachdem einmal geeignete Antikörper erhalten worden sind, können sie isoliert oder gereinigt werden durch viele Techniken, die den Fachleuten gut bekannt sind (siehe Antibodies: A Laboratory Manual, oben). Geeignete Techniken schließen Peptid- oder Proteinaffinitätssäule, HPLC oder RP-HPLC, Reinigung auf Protein A- oder Protein G-Säulen oder eine beliebige Kombination dieser Techniken ein. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff "isoliert", wie verwendet, um Antikörper oder Bindungspartner zu definieren, "im wesentlichen frei von anderen Blutkomponenten".
Antikörper der vorliegenden Erfindung haben viele Anwendungen. Z. B. können Antikörper verwendet werden bei der Flußcytometry, um CRF&sub2;-Rezeptor-tragende Zellen zu sortieren, oder CRF&sub2;-Rezeptor-tragende Gewebe histochemisch zu färben. Kurz gesagt werden, um CRF&sub2;-Rezeptoren auf Zellen nachzuweisen, die Zellen (oder Gewebe) mit einem markierten Antikörper inkubiert, der spezifisch an CRF&sub2;-Rezeptoren bindet, gefolgt vom Nachweis der Anwesenheit von gebundenem Antikörper. Diese Schritte können auch vorgenommen werden mit zusätzlichen Schritten, wie Waschvorgängen, um ungebundenen Antikörper zu entfernen. Typische Beispiele geeigneter Markierungen, ebenso wie Verfahren zum Konjugieren oder Koppeln von Antikörpern an derartige Markierungen, sind detaillierter unten beschrieben.
Zusätzlichen können gereinigte Antikörper auch therapeutisch verwendet werden, um das Binden von CRF oder anderen CRF&sub2;-Rezeptorsubstraten, wie Sauvagin oder Urotensin I, an den CRF&sub2;-Rezeptor in vitro oder in vivo zu blockieren. Kurz gesagt sind blockierende Antikörper solche Antikörper, die an CRF&sub2;-Rezeptorepitope so binden, daß CRF vom Binden an den Rezeptor abgehalten wird, oder daß CRF daran gehindert wird, Signaltransduktion zu bewirken. Wie oben festgehalten, kann eine Vielzahl von Tests verwendet werden, um Antikörper nachzuweisen, die ein Binden von CRF an den CRF&sub2;-Rezeptor zu blockieren oder zu inhibieren, einschließlich, inter alia, Inhibitions- und Kompetitionstests, die oben festgehalten sind. In einer Ausführungsform werden monoklonale Antikörper (hergestellt wie oben beschrieben) auf Binden an den CRF&sub2;-Rezeptor bei Abwesenheit von CRF getestet, ebenso wie in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen an CRF. Blockierende Antikörper werden als jene identifiziert, die, z. B.; an CRF&sub2;-Rezeptoren binden und, in Gegenwart von CRF, Binden von CRF an den CRF&sub2;-Rezeptor blockieren oder inhibieren.
Antikörper der vorliegenden Erfindung können auch an eine Vielzahl von anderen Verbindungen für entweder diagnostische oder therapeutische Verwendung gekoppelt oder konjugiert sein. Solche Verbindungen umfassen, z. B., toxische Moleküle, Moleküle, die nichttoxisch sind, aber die nach Exposition gegenüber einer zweiten Verbindung toxisch werden, und Radionuklide. Typische Beispiele derartiger Moleküle sind detaillierter unten beschrieben.
Antikörper, die therapeutisch verwendet werden sollen, sind bevorzugterweise in einer therapeutischen Zusammensetzung vorgesehen, die den Antikörper oder Bindungspartner und einen physiologische akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel umfaßt. Geeignete Träger oder Verdünnungsmittel schließen, unter anderem, neutrale gepufferte Saline oder Saline ein und können auch zusätzliche Bindemittel oder Stabilisatoren, wie Puffer, Zucker, wie Glucose, Saccharose oder Dextrose, Chelat-Bildner, wie EDTA, und verschiedene Konservierungsmittel einschließen.

Isolierung und Verwendung von Verbindungen, die den CRF&sub2;-Rezeptor binden, einschließlich Agonisten und Antagonisten

Wie oben festgehalten, sieht die vorliegende Erfindung eine Vielzahl von Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit von Verbindungen vor, die an CRF&sub2;-Rezeptoren binden. Zum Beispiel sind in einer Ausführungsform Verfahren zum Nachweisen derartiger Verbindungen vorgesehen, die die Schritte umfassen (a) Exponieren einer oder mehrerer Verbindungen gegenüber Zellen, die CRF&sub2;-Rezeptoren exprimieren, unter Bedingungen und für eine Zeit, die ausreichen, um Binden der Verbindungen an die Rezeptoren zu erlauben und (b) Isolieren von Verbindungen, die an die Rezeptoren binden, so daß die Anwesenheit einer Verbindung, die an einen CRF&sub2;-Rezeptor bindet, nachgewiesen werden kann. Wie hierin verwendet, reichen Bedingungen, die ein Binden von Verbindungen an Zellen erlauben, die CRF&sub2;-Rezeptoren exprimieren, allgemein von pH 6,8 bis 7,8, und schließen einen geeigneten Puffer, wie Tris- HCl oder PBS, entweder mit oder ohne Rinderserumalbumin ("BSA") ein. Derartige Puffer können auch Magnesium in einer Konzentration von 5 bis 20 mM enthalten, ebenso wie Protease-Inhibitoren, wie Bacitracin oder Aprotinin. Die ausreichende Zeit für das Binden der Verbindungen an Zellen, die CRF&sub2;-Rezeptoren exprimieren, reicht allgemein von zwischen 30 und 150 Minuten nach Exposition.
In anderen Aspekten der vorliegenden Erfindung sind Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit einer Verbindung vorgesehen, die an CRF&sub2;-Rezeptoren bindet, die die Schritte umfassen (a) Exponieren einer oder mehrerer Verbindungen gegenüber einer N-terminalen extrazelluläre Domäne von CRF&sub2;-Rezeptor unter Bedingungen und für eine Zeit, die ausreichen, um Binden einer Verbindung an die N-tenninale extrazelluläre Domäne zu erlauben und (b) Isolieren von Verbindungen, die an die N-terminale extrazelluläre Domäne von CRF&sub2;- Rezeptor binden, so daß die Anwesenheit einer Verbindung, die an einen CRF&sub2;-Rezeptor bindet, nachgewiesen werden kann. Derartige Tests können eine Vielzahl von Formen einnehmen, einschließlich, z. B., als Enzym-gekoppelter Immunsorbtions-Test, "Sandwich"-Test oder dergleichen. In einer Ausführungsform werden die Verbindungen mit einem Mittel markiert, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus fluoreszierenden Molekülen, Enzymen und Radionukliden besteht.
Zusätzlich zu Tests, die die Anwesenheit von Verbindungen nachweisen, die an CRF&sub2;- Rezeptoren binden, sieht die vorliegende Erfindung auch Verfahren zum Nachweisen von sowohl CRF&sub2;-Rezeptor-Agonisten als auch CRF&sub2;-Rezeptor-Antagonisten vor. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sollten CRF&sub2;-Rezeptor-Agonisten so verstanden werden, daß sie Moleküle bezeichnen, die in der Lage sind, an Zelloberflächenrezeptoren zu binden und dadurch einen Reaktionsweg innerhalb der Zelle zu stimulieren. Im Gegensatz sollten CRF&sub2;-Rezeptor-Antagonisten so verstanden werden, daß sie Moleküle bezeichnen, die in der Lage sind, an einen CRF&sub2;-Rezeptor zu binden, die aber Stimulierung verhindern, oder eine stark verringerte Stimulierung eines Reaktionsweges innerhalb der Zelle zeigen. Verschiedene Tests können auf der Grundlage der hierin gegebenen Offenbarung verwendet werden, um CRF-Agonisten oder -Antagonisten zu screenen oder zu selektieren.
Zum Beispiel sind in einem Aspekt der vorliegenden Erfindung Verfahren vorgesehen zum · Bestimmen, ob eine ausgewählte Verbindung ein CRF&sub2;-Rezeptor-Agonist oder -Antagonist ist, die die Schritte umfaßt (a) Exponieren einer ausgewählten Verbindung gegenüber Zellen, die CRF&sub2;-Rezeptoren exprimieren, unter Bedingungen und für eine Zeit, die ausreichen, um Binden der Verbindung zu erlauben und eine assoziierte Antwort hinsichtlich intrazellulären Titern von cAMP erlaubt, und (b) Nachweisen entweder einer Erhöhung oder Verringerung des Titers an intrazellulärem cAMP, und dadurch Bestimmen, ob die ausgewählte Verbindung ein CRF&sub2;-Rezeptor-Agonist oder -Antagonist ist.
cAMP kann leicht gemessen werden unter Verwendung von Verfahren, die in der Technik gut bekannt sind, einschließlich, z. B., Verfahren, die von Salomon et al (Anal. Biochem. 58: 541- 548, 1976) oder Krishna et al. (J. Pharmacol. Exp. Ther. 163: 379, 1968) beschrieben sind oder, bevorzugterweise unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Kits, wie den Szintillations-Nachbarschafts-Test-Kit von der Amersham Corporation oder den ¹²&sup5;I-RIA-cAMP- Bestimmungskit von Incstar-Corporation (Stillwater, Minnesota). Der Szintillations- Nachbarschafts-Test-Kit mißt die Herstellung von cAMP durch Kompetition von jodiertem cAMP mit anti-cAMP-Antikörpern.
In weiteren Aspekten sind Verfahren vorgesehen zum Nachweisen von einem CRF&sub2;- Rezeptor-Agonisten oder -Antagonisten in einem Pool von Verbindungen, die die Schritte umfassen (a) Exponieren eines Pools von Verbindungen gegenüber Zellen, die CRF&sub2;- Rezeptoren exprimieren, unter Bedingungen und für eine Zeit, die ausreichen, um Binden der Verbindung und eine assoziierte Reaktion hinsichtlich intrazelluläre Titern an cAMP zu erlauben und (b) Isolieren von Verbindungen, die den intrazellulären Titer an cAMP entweder erhöhen oder verringern, so daß die Anwesenheit von einem CRF&sub2;-Rezeptor-Agonisten oder - Antagonisten nachgewiesen werden kann.
In einem weiteren Aspekt sind Verfahren zum Bestimmen, ob eine ausgewählte Verbindung ein CRF&sub2;-Rezeptor-Antagonist ist, vorgesehen, welches die Schritte umfaßt (a) Exponieren einer ausgewählten Verbindung in Gegenwart eines CRF&sub2;-Rezeptor-Agonisten gegenüber einem rekombinanten CRF&sub2;-Rezeptor, der an einen Reaktionsweg gekoppelt ist, unter Bedingungen und für eine Zeit, die ausreichen, um Binden der Verbindung an den Rezeptor und eine assoziierte Antwort durch den Reaktionsweg zu erlauben, und (b) Nachweisen einer Verringerung der Stimulierung des Reaktionswegs, die aus dem Binden der Verbindung an den CRF&sub2;-Rezeptor resultiert, relativ zur Stimulierung des Reaktionsweges durch den CRF&sub2;- Rezeptor alleine, und dadurch Bestimmen der Anwesenheit eines CRF&sub2;-Antagonisten. In anderen Aspekten sind Verfahren vorgesehen zum Bestimmen, ob eine ausgewählte Verbindung ein CRF&sub2;-Rezeptor-Agonist ist, welches die Schritte umfaßt (a) Exponieren einer ausgewählten Verbindung gegenüber einem rekombinanten CRF&sub2;-Rezeptor, der an einen Reaktionsweg gekoppelt ist, unter Bedinungen und für eine Zeit, die ausreichen, um ein Binden der Verbindung an einen Rezeptor und eine assoziierte Reaktion durch den Reaktionsweg zu erlauben, und (b) Nachweisen einer Erhöhung der Stimulierung des Reaktionsweges, die aus dem Binden der Verbindung an den CRF&sub2;-Rezeptor resultiert und daraus Bestimmen der Anwesenheit eines CRF&sub2;-Rezeptor-Agonisten.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen der Erfindungen ist der Reaktionsweg ein membrangebundener Adenylat-Cyclase-Reaktionsweg, und der Nachweisschritt umfaßt Messen der Erhöhung oder Verringerung der cAMP-Produktion durch den membrangebundenen Adenylat-Cyclase-Reaktionsweg. Adenylat-Cyclase-Aktivitätstests können durchgeführt werden, z. B., unter Verwendung von einem Verfahren/ von Verfahren, das/die in den Beispielen unten beschrieben ist/sind. Allgemein messen derartige Verfahren das Maß an cAMP- Stimulierung relativ zu bekannten Agonisten (z. B. Sauvagin, Urotensin I oder CRF) und umfassen im allgemeinen Exponieren eines Zellpräparates, das einen biologisch aktiven CRF&sub2;-Rezeptor exprimiert, gegenüber der ausgewählten Verbindung in Gegenwart von radiomarkiertem ATP.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung schließt der Reaktionsweg ein Reporter- System ein, wie Luciferase oder β-Galactosidase (siehe Konig et al., Mol und Cell. Neuro. 2: 331-337, 1991). Zum Beispiel ist in einer Ausführungsform der Erfindung ein Expressionsvektor vorgesehen, der ein zyklisches AMP-Antwortselement umfaßt, wie ein Proenkephalincyklisches AMP-Antwortselement, das in funktionsfähiger Weise an β-Galaktosidase- oder Luciferase-cDNA gebunden ist. Der Expressionsvektor wird dann stabil in eine Wirtszelle transfiziert und die Wirtszelle dann mit einem zweiten Expressionsvektor transfiziert, der einen CRF&sub2;-Rezeptor exprimiert. Nach Aktivieren des Reaktionsweges induzieren erhöhte cAMP-Titer die Expression des Reporterprodukts, wie der β-Galaktosidase oder der Luciferase. Wenn das Reporterprodukt Luciferase ist, wird es dann gegenüber Luciferin exponiert und Photonen, die während der Oxidation von Luciferin durch Luciferase freigesetzt werden, werden gemessen.
Eine Vielzahl von Verbindungen kann gescreent werden unter Verwendung derartiger Verfahren. Typische Beispiele schließen Blockierungsantikörper, die oben diskutiert sind, CRF&sub2;- Rezeptorpeptide und CRF-Analoge (einschließlich sowohl Peptid- als auch Nicht- Peptidliganden) ein. Zusätzlich kann eine große Anzahl von CRF-Analogen erzeugt werden durch Sättigungsmutagenese von Nukleinsäuresequenzen, die für CRF kodiert (z. B. Little, Gene 88: 143-151, 1989), durch segmentorientierte Mutagenese (z. B. Shortle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 5375-5379, 1980), durch erzwungenen Nukleotidfehleinbau (z. B. Liao und Wise, Gene 88: 107-111,1990) oder durch Verwendung von zufällig mutagenisierten Oligonukleotiden (Hutchison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 710-714, 1986). Einzelne Transformanten, die ein CRF&sub2;-Analog exprimieren, können dann wie oben diskutiert kloniert oder vereinigt werden.
Andere Verbindungen, die auch gescreent werden können unter Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung, schließen chemische Verbindungen ein, die bekannt sind und entweder kommerziell erhältlich sind (z. B. von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) oder leicht durch die Fachleute synthetisiert werden. Zusätzlich können auch viele neue Zusammensetzungen, die in kombinatorischen Genbanken vorgesehen sind, leicht gescreent werden, unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren, einschließlich, z. B., organischer und Protein- oder Peptid-Genbanken (s. z. B., Gold und Tuerk, US-Patent 5,270,163; und Ladner et al. US-Patente 5,096,815, 5,198,346 und 5,223,409).
In einem bevorzugten Aspekt der Erfindung kann das Screenen von chemischen Genbanken (einschließlich Peptid-Genbanken, Genbanken kleiner organischer Moleküle oder Genbanken von aus der kombinatorischen Chemie abgeleiteten Verbindungen) in einem Hochdurchsatzformat bewertet werden unter Verwendung der exprimierten CRF&sub2;-Rezeptoren. Genauer gesagt kann in einer Ausführungsform der Erfindung ein Hochdurchsatzrezeptorbindungstest vorgenommen werden in einer Platte mit 96 Näpfen und ist automatisiert unter Verwendung des BIOMEK 2000 (Beckmann, Fullerton CA). Kurz gesagt werden 1 · 10&sup5; Zellen, die mit CRF&sub2;-Rezeptoren transfiziert sind, in einem jeden Napfangezogen. Dazu werden 0,05 ml Testpuffer (Dulbecco's Phosphat-gepufferte Saline, 10 mM MgCl&sub2;, 20 uM Bacitracin) mit oder ohne unmarkiertem r/hCRF (Endkonzentration 1 uM) doppelt hinzugesetzt, um Gesamtbindung und nicht spezifische Bindung zu bestimmen. In Singletts werden 0,05 ml von Verbindungen (Mischungen von 1-30 Verbindungen) zu einem jeden Napfzusätzlich zu 0,05 ml von entweder [¹²&sup5;I]-oCRF oder [¹²&sup5;I]-r/hCRF (Endkonzentration ~ 200 pM) hinzugesetzt. Die Mischung wird für zwei Stunden bei 22ºC inkubiert. Da die transfizierten Zellen adhärent sind, ist ein Zentrifugationsschritt, um membrangebunden CRF abzutrennen, nicht erforderlich. Als nächstes wird Flüssigkeit abgesaugt und die Zellen werden dreimal mit etwa 0,9 ml PBS gewaschen. Nach dem dritten Waschen und Absaugen werden 0,2 ml 4 M Guanidinthiocyanat zu einem jeden Napfhinzugesetzt, um das Gewebe zu solubilisieren. Ein Aliquot (0,15 ml) der solubilisierten Probe wird in einem γ-Zähler auf Radioaktivität bei etwa 80% Effizienz überwacht. Verbindungen, die ≥ 50% Inhibierung von [¹²&sup5;I]CRF-Bindungen zeigen, werden in einem Ganzdosis-Antwortskompetitionstest getestet, um die Affinität dieser Verbindungen zum CRF&sub2;-Rezeptor zu bestimmen (Ki-Wert).
Nachdem sie einmal teilweise oder bis zur Homogenität gereinigt sind, wie erwünscht, können sowohl CRF&sub2;-Rezeptor-Agonisten als auch -Antagonisten therapeutisch verwendet werden. Im allgemeinen sind im wesentlichen reine rekombinante CRF-Antagonisten von wenigstens etwa 50% Homogenität bevorzugt, wobei wenigstens etwa 70%-80% Homogenität bevorzugter und 95%-99% oder mehr Homogenität am bevorzugtesten ist, insbesondere für pharmazeutische Verwendungen. Allgemein können die Antagonisten intradermal ("i.d.") intracranial ("i.c."), intraperitoneal ("i.p."), intrathekal ("i.t."), intravenös ("i.v."), subkutan ("s.c."), intramuskulär ("i.m.") oder direkt in einen Tumor verabreicht werden. Typischerweise sind die Antagonisten als freie Basen oder Säuresalze vorhanden. Geeignete Salze sollten pharmazeutisch akzeptabel sein. Typische Beispiele schließen ein Metallsalze, Akali- und Erdalkalimetallsalze, wie Kalium- oder Natriumsalze. Andere pharmazeutisch akzeptable Salze schließen Zitronen-, Bernstein-, Milch-, Chlorwasserstoff und Bromwasserstoffsäuren ein. Parenterale Zusammensetzungen können formuliert werden in wässrigen isotonischen Lösungen mit einem pH zwischen 5,6 und 7,4. Geeignete isotonische Lösungen können Natriumchlorid, Dextrose, Borsäure-Natriumtartrat und Propylenglykollösungen einschließen.

Markierungen

Die Nukleinsäuremoleküle, Antikörper, CRF&sub2;-Rezeptoren und CRF&sub2;-Agonisten und -Antagonisten der vorliegenden Erfindung können markiert oder konjugiert sein (entweder durch kovalente oder nicht kovalente Mittel) an eine Anzahl von Markierung oder anderen Molekülen, einschließlich z. B. fluoreszierende Marker, Enzymmarker, toxische Moleküle, Moleküle, die nicht toxisch sind, aber toxisch werden nach Exposition gegenüber einer zweiten Verbindung, und Radionuklide.
Typische Beispiele für fluoreszierende Markierungen, die zur Verwendung innerhalb der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen, z. B., ein Fluorescein-Isothiocyanat (FITC), Rodamin, Texas Rot, Luciferase und Phycoerythrin (PE). Besonders bevorzugt zur Verwendung bei der Flußzytometrie ist FITC, welches an die gereinigten Antikörper konjugiert sein kann entsprechend dem Verfahren von Keltkamp in "Conjugation of Fluorescein Isothiocyanate to Antibodies I. Experiments on the Conditions of Conjugation", Immunology 18: 865- 873, 1970. (Siehe auch Keltkamp, "Conjugation of Fluorescein Isothiocyanate to Antibodies. II. A Reproducible Method," Immunology 18: 875-8881, 1970; und Goding "Conjügation of Antibodies with Fluorochromes: Modification to the Standard Methods," J. Immunol. Methods 13: 215-226, 1970.). Für histochemisches Färben kann HRP, die bevorzugt wird, an den gereinigten Antkörpern entsprechen den Verfahren von Nakane und Kawaoi konjugiert werden ("Peroxidase-Labeled Antibody: A New Method of Conjugation," J. Histochem. Cytochem. 22: 1084-1091, 1974; siehe auch, Tijssen und Kurstak, "Highly Efficient and Simple Methods for Preparation of Peroxidase and Active Peroxidase Antibody Conjugates for Enzyme Immunoassays," Anal. Biochem. 136: 451-457, 1984).
Typische Beispiele für Enzymmarker oder Markierungen schließen alkalische Phosphatase, Meerrettichperoxidase und β-Galactosidase ein. Typische Beispiele für toxische Moleküle schließen ein Ricin, Abrin, Diphterie-Toxin, Choleratoxin, Gelonin, Pokeweed-antivirales Protein, Tritin, Shigella-Toxin und Pseudomonas Exotoxin A. Typische Beispiele von Molekülen, die nicht toxisch sind, aber toxisch werden nach Exposition gegenüber einer zweiten Verbindung, schließen ein Tymidinkinasen, wie HSVTK und VZVTK. Typische Beispiele von Radionukliden schließen ein Cu-64, Ga-67, Ga-68, Zr-89, Ru-97, Tc-99 m, Rh-105, Pd- 109, In-111, I-123, I-125, I-131, Re-186, Re-188, Au-198, Au-199, Pb-203, At-211, Pb-212 und Bi-212.
Wie für die Fachleute mit Blick auf die hierin vorgesehene Offenbarung offensichtlich, können die oben beschriebenene Nukleinsäuremoleküle, Antikörper, CRF&sub2;-Rezeptorenen, CRF&sub2;- Rezeptorpeptide und CRF&sub2;-Rezeptor-Agonisten und -Antagonisten auch markiert werden mit anderen Molekülen, wie kollodialem Gold, ebenso wie mit einem Mitglied eines Hochaffinitätsbindungspaares (z. B., Avidin-Biotin).

Diagnostische Verwendung von CRF&sub2;-Rezeptorseduenzen

In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindungen sind Sonden und Primer vorgesehen zum Nachweisen von CRF&sub2;- Rezeptoren. In einer Ausführungsform der Erfindung sind Sonden vorgesehen, die in der Lage sind, an CRF&sub2;-Rezeptornukleinsäure oder -RNA zu hybrisieren. Zu Zwecken der vorliegenden Erfindung sind Sonden an CRF&sub2;-Rezeptornukleinsäure "in der Lage zu hybrisieren", wenn sie an die Sequenzen ID. No. 1 oder 3 (oder deren komplementäre Stränge) unter Bedingungen moderater oder hoher Stringenz (siehe Sambrook et al., wie oben) hybridisieren; nicht aber an CRF-Rezeptornukleinsäuren. Bevorzugterweise kann die Sonde verwendet werden, um an geeignete Nukleotidsequenzen in Gegenwart von 50% Formamid, 5x SSPE, 5x Denhardt's, 0,1% SDS und 100 ug/ml Lachssperma-Nukleinsäure bei 42ºC zu hybrisieren, gefolgt von einem ersten Waschen mit 2x SSC bei 42ºC und einem zweiten Waschen mit 0,2x SSC bei 55 bis 60ºC.
Sonden der vorliegenden Erfindung können zusammengesetzt sein entweder aus Desoxyribonukleinsäuren (DNA), Ribonukleinsäuren (RNA), Nukleinsäurenanalogen oder irgendeiner Kombination aus diesen und kann so wenig wie etwa 12 Nukleotide lang, gewöhnlicherweise etwa 14 bis 18 Nukleotide lang und möglicherweise so groß wie die gesamte Sequenz des CRF&sub2;-Rezeptors sein. Auswählen der Sondengröße ist etwas abhängig von der Verwendung der Sonde. Zum Beispiel ist, um die Anwesenheit von verschiedenen polymorphen Formen des CRF-Rezeptors in einem Individuum nachzuweisen, eine Probe bevorzugt, die praktisch die gesamte Länge der CRF&sub2;- Rezeptor-codierenden Sequenz umfaßt. CRF&sub2;-Rezeptor-Sonden können verwendet werden, um Polymorphismen zu identifizieren, die an das CRF&sub2;- Rezeptorgen gebunden sind (siehe, z. B., Weber, Genomics 7: 524-530, 1990 und Weber und May, Amer. J. Hum. Gen. 44: 388-396, 1989). Solche Polymorphismen können mit Erbkrankheiten, wie Diabetes, verbunden sein.
Sonden können konstruiert und markiert werden unter Verwendung von Techniken, die in der Technik gut bekannt sind. Kurze Sonden aus, z. B. 12 oder 14 Basen, können synthetisch erzeugt werden. Längere Sonden mit etwa 75 Basen oder weniger als 1.5 kb werden bevorzugterweise erzeugt durch z. B. PCR-Amplifikation in Gegenwart von markierten Vorläufern, wie ³²P-dCTP, Digoxigenin-dUTP, oder Biotin-dATP. Sonden von mehr als 1,5 kb werden im allgemeinen am leichtesten amplifiziert durch Transifizieren einer Zelle mit einem Plasmid, das die relevante Sonde enthält, Anziehen der transfizierten Zelle in großen Mengen und Reinigen der relevanten Sequenzen aus den transfizierten Zellen (siehe Sambrook et al., oben.)
Sonden können markiert werden durch eine Vielzahl von Markern, einschließlich, z. B., radioaktiven Markern, fluoreszierenden Markern, enzymatischen Markern und chromogenen Markern. Die Verwendung von ³²P ist besonders bevorzugt zum Markieren oder Labeln einer speziellen Sonde.
Sonden der vorliegenden Erfindung können auch verwendet werden, um die Anwesenheit einer CRF&sub2;-Rezeptor-mRNA oder -Nukleinsäure in einer Probe nachzuweisen. Wenn jedoch CRF&sub2;- Rezeptoren nur in einer beschränkten Anzahl vorhanden sind, oder wenn es erwünscht ist, eine ausgewählte mutierte Sequenz nachzuweisen, die in nur einer beschränkten Anzahl vorhanden ist, oder wenn es erwünscht ist, einen CRF&sub2;-Rezeptor aus einem ausgewählten warmblütigen Tier zu klonieren, kann es vorteilhaft sein, die relevante Sequenz zu amplifizieren, so daß sie leichter nachgewiesen oder erhalten werden kann.
Eine Anzahl von Verfahren kann verwendet werden, um eine ausgewählte Sequenz zu amplifizieren, einschließlich, z. B., RNA-Amplifikation (siehe Lizardi et al., Bio/Technology 6: 1197-1202, 1988; Kramer et al., Nature 339: 401-402, 1989; Lomeli et al., Clinical Chem. 35(9): 1826-1831, 1989; U. S. Patent 4, 786,600), und Nukleinsäureamplifikation unter Verwendung von Polymerase-Kettenreaktion ("PCR") (siehe US-Patente 4,683,195, 4,683,202 und 4,800,159) (siehe auch US-Patente 4,876,187 und 5,011,769, die ein alternatives Nachweis-/Amplifikationssystem beschreiben, das die Verwendung von scissilen Verbindungen umfaßt).
In einer besonders bevorzugten Ausführungform wird PCR-Amplifikation verwendet, um CRF&sub2;-Rezeptomukleinsäure nachzuweisen oder zu erhalten. Kurz gesagt wird, wie detallierter unten beschrieben, eine Nukleinsäureprobe bei 95ºC denaturiert, um einzelsträngige Nukleinsäure zu erzeugen. Spezifische Primer, wie oben diskutiert, werden dann bei 37ºC bis 70ºC anelliert, abhängig vom Anteil an AT/GC in den Primern. Die Sonden werden bei 72ºC mit Taq-Polymerase verlängert, um den Gegenstrang zur Matrize zu erzeugen. Diese Schritte bilden einen Zyklus, der wiederholt werden kann, um die ausgewählte Sequenz zu amplifizieren.
Primer für die Amplifikation einer ausgewählten Sequenz sollten ausgewählt werden aus Sequenzen, die hochspezifisch sind und stabile Duplices mit der Zielsequenz bilden. Die Primer sollten auch nicht-komplementär sein, insbesondere am 3'-Ende sollten sie keine Dimere mit sich selbst und anderen Primern bilden und sie sollten keine Sekundärstrukturen und Duplices mit anderen Regionen von Nukleinsäuren bilden. Allgemein sind Primer mit etwa 18 bis 20 Nukleotiden bevorzugt und können leicht unter Verwendung von in der Technik gut bekannten Techniken synthetisiert werden.

Therapeutische Verwendungen von CRF&sub2;-Rezeptor(en) und CRF&sub2;-Rezeptor-Antagonisten

CRF&sub2;-Rezeptoren (oder Teile davon), CRF&sub2;Rezeptor-Agonisten und -Antagonisten, ebenso wie Nukleinsäuresequenzen, die diese Moleküle codieren, können in einer Vielzahl von therapeutischer Anwendungen verwendet werden. Zum Beispiel können CRF&sub2;-Rezeptoren (oder Teile davon, die an ein Substrat, wie CRF, Sauvagin oder Urotensin I binden) verwendet werden, um vaskuläre Titer des Substrats oder hohe ACTH-Titer infolge eines Überschusses des Substrates zu verringern. Somit können CRF&sub2;-Rezeptoren verwendet werden beim Behandeln von Erkrankungen, die mit hohen Titern an Cortisol verbunden sind, z. B. Cushingsche Krankheit, Alkoholismus, Anorexia nervosa und andere verwandte Krankheiten).
In ähnlicher Weise können CRF&sub2;-Rezeptoren oder Teile davon, die an ein Substrat wie oben diskutiert binden, beim Behandeln von Tumoren, die hohe Titer von einem Substrat (z. B., CRF) produzieren, wie Hypophysentumoren, ebenso wie beim Behandeln von Abnormalitäten während der Schwangerschaft verwendet werden, wie Präclempsie, die mit erhöhten CRF- Titern verbunden sind. In ähnlicher Weise können sie verwendet werden, um Hypotonie zu behandeln, die Wirkung von Immunsystemerkrankungen, wie Arthritis, und die Wirkung von Hypopyhsen-Erkrankungen zu modulieren. Zusätzlich können CRF&sub2;Rezeptoren (oder Teile davon) verwendet werden, um eine Vielzahl von Gehirnfunktionen zu modulieren, einschließlich z. B. Kontrolle von Sättigung, Reproduktionswachstum, Angst, Depression, Fieber, Metabolismus.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung sind virale Vektoren vorgesehen, die verwendet werden können, um Krankheiten zu behandeln, wobei entweder der CRF&sub2;- Rezeptor (oder ein mutierter CRF&sub2;-Rezeptor) überexprimiert ist, oder wo kein CRF&sub2;-Rezeptor exprimiert ist. Kurz gesagt sind in einer Ausführungform der Erfindung virale Vektoren vorgesehen, die die Funktion von Antisense-CRF&sub2;-Rezeptor-RNA steuern, um die Überexpression von CRF&sub2;-Rezeptoren oder die Expression von mutierten CRF&sub2;-Rezeptoren zu unterbinden. In einer anderen Ausführungsform sind virale Vektoren vorgesehen, die die Expression von CRF&sub2;Rezeptoren-cDNA steuern. Virale Vektoren, die zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen, unter anderem, ein, Herpesviren-Vektoren (z. B. US- Patent 5,288 641), Retroviren (z. B., EP 0 415 731; WO 90/07936; WO 91/0285, WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; US-Patent 5,219,740; WO 93/11230; WO 93/10218; Vile und Hart, Cancer Res. 53: 3860-3864, 1993; Vile und Hart, Cancer Res. 53: 962-967; 1993 Ram et al.; Cancer Res. 53: 83-88, 1993; Takamiya et al. J. Neurosci. Res 33: 493-503, 1992; Baba et al., J. Neurosurg 79: 729-735, 1993), pseudotypisierte Viren, adenovirale Vektoren (z. B. WO 94/26914, WO93/9191; Kolls et al., PNAS 91 (1): 215-219, 1994; Kass-Eisler et al., PNAS 90 (24): 11498-502, 1993; Guzman et al., Circulation 88(6): 2838-48, 1993; Guzman et al., Cir.Res. 73(6): 1202-1207, 1993; Zabner et al., Cell 75(2): 207-216, 1993; Li et al., Hum. Gene Ther. 4 (4): 403-409, 1993; Caillaud et al., Eur.J. Neurosci. 5(10: 1287-1291, 1993; Vincent et al., Nat. Genet. 5(2): 130-134, 1993; Jaffe et al., Nat. Genet. 1(5): 372-378, 1992; und Levrero et al. Gene 101 (2): 195-202, 1991), Adenovirusassozüerte virale Vektoren (Flotte et al., PNAS 90(22): 10613-10617, 1993), Parvovirus- Vektoren (Koering et al., Hum. Gene Therap. 5: 457-463, 1994) Baculovirus-Vektoren und Pockenvirus-Vektoren (Panicali und Paoletti, PNAS 79: 4927-4931, 1982; und Ozaki et al., Biochem. Biohys. Res. Comm. 193(2): 653-660, 1993). In verschiedenen Ausführungsformen kann entweder der virale Vektor selbst oder ein virales Partikel, das den viralen Vektor enthält, verwendet werden in den Verfahren und Zusammensetzungen, die unten beschrieben werden.
In anderen Ausführungsformen der Erfindung können die Vektoren, die Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung enthalten oder exprimieren, oder die Nukeinsäuremoleküle selbst, verabreicht werden durch eine Vielzahl von alternativen Techniken, einschließlich z. B. direkte Nukleinsäureinjektion (Acsadi et al., Nature 352: 815-818, 1991); Liposomen (Pickering et al., Circ. 89(1): 13-21, 1994; und Wang et al., PNAS 84: 7851-7855, 1987); Lipofektion (Felgner et al., Prod. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417, 1989); Mikroprojektilbombardierung (Williams et al., PNAS 88: 2726-2730, 1991); Nukleinsäureligand (Wu et al., J. of Biol. Chem. 264: 16985-16987, 1989); Verabreichung von Nukleinsäure, die an abgetöteten Adenovirus gekoppelt ist (Michael et al., J. Biol. Chem. 268(10): 6866-6869, 1993; und Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3(2): 147-154, 1992), Retrotransposons, Cytofectin-vermittelte Einführung (DMRIE-DOPE, Vical, Calif) und Transferrin-Nukleinsäurekomplexe (Zenke).

Verbessern von Lernen und Gedächtnis

Wie oben festgehalten, werden Verfahren zum Verbessern von Lernen und Gedächtnis durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines CRF&sub2;-Rezeptorantagonisten an den Patienten offenbart. Kurz gesagt, können solche Patienten durch eine klinische Diagnose auf der Grundlage von Symptomen von Dementia oder Lern- und Gedächtnisverlust identifiziert werden. Zum Beispiel sind Patienten mit einer amnesischen Erkrankung in ihrer Fähigkeit, neue Information zu lernen, behindert oder sind nicht in der Lage, sich an kürzlich erlernte Information oder vergangene Ereignisse zu erinnern. Der Gedächtnismangel tritt am offenkundigsten zutage bei Aufgaben, die spontanes Erinnern erfordern und kann auch offensichtlich sein, wenn der Prüfer Reize für die Person vorsieht, an die sie sich zu einem späteren Zeitpunkt erinnern soll. Die Gedächtnisstörung muß hinreichend schwer sein, um eine ausgeprägte Behinderung in der Sozial- und Beschäftigungsfunktion zu verursachen und muß eine wesentliche Abnahme gegenüber einem früheren Funktionsmaß darstellen.
Dementia ist gekennzeichnet durch mehrfache klinisch signifikante Defekte bei der Wahrnehmung, die eine wesentliche Änderung von einem früheren Funktionsmaß darstellen. Gedächtnisschwäche, die die Unfähigkeit, neues Material zu lernen, oder Vergessen von kürzlich Gelerntem umfaßt, ist erforderlich, um Dementia zu diagnostizieren. Gedächtnis kann formal getestet werden, indem die Person gebeten wird, Information zur Kenntnis zu nehmen, zu behalten, zu erinnern und wieder zu erkennen. Die Diagnose von Dementia erfordert auch wenigstens eine der folgenden Wahrnehmungsstörungen: Aphasie, Apraxie, Agnosie oder eine Störung bei der Ausführungsfunktion. Diese Mängel bei der Sprache, der motorischen Leistung, der Objekterkennung bzw. dem abstraktem Denken müssen in Verbindung mit dem Gedächtnismangel hinreichend schwer sein, um eine Schwäche Beschäftigungs- und Sozialfunktion zu verursachen und müssen eine Verringerung gegenüber einem kürzlich höheren Funktionsmaß darstellen.
Ein von Klinikern verwendeter Standardtest, um zu bestimmen, ob ein Patient Lern- und Gedächtnisschwäche hat, ist der minimentale Test zum Lernen und Gedächtnis (Folstein et al., J. Psychiatric Res. 12: 185, 1975). Dieser Test umfaßt eine Anzahl einfacher Aufgaben und schriftlicher Fragen. Zum Beispiel ist die " gepaarte-assoziierte" Lernfähigkeit beeinträchtigt bei verschiedenen Typen von amnesischen Patienten, einschließlich jener, die unter Kopftrauma, Korsakoffscher Erkrankung oder Schlaganfall leiden (Squire, 1987). Zehn Paare von untereinander beziehungslosen Wörtern (z. B. Armee-Tisch) werden der Person vorgelesen. Man bittet dann die Personen, sich an das zweite Wort zu erinnern, wenn das erste Wort von einem jeden Paar genannt wird. Das Messen der Gedächtnisschwäche ist eine verringerte Anzahl von gepaarten-assoziierten Wörtern, die relativ zu einer entsprechenden Kontrollgruppe erinnert werden. Dies dient als ein Index für Kurzzeit-, Arbeitsgedächtnis der Art, welches sich in den frühen Stadien von dementierenden oder amnesischen Erkrankungen verschlechtert.
Eine Verbesserung des Lernens und des Gedächtnisses bildet entweder (a) einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen der Leistung von mit CRF&sub2;-Rezeptor-Antagonisten behandelten Patienten verglichen mit Mitgliedern einer Placebogruppe; oder (b) eine statistisch signifikante Änderung der Leistung in Richtung auf Normalität bei Maßnahmen, die dem Krankheitsmodell angemessen sind, aus. Tiermodelle oder klinische Fälle von Erkrankung weisen Symptome auf, die per definitionem unterscheidbar sind von normalen Kontrollen. Somit wird das Maß für eine wirksame Pharmakotherapie eine signifikante, aber nicht notwendigerweise vollständige Umkehr der Symptome sein. Eine Verbesserung kann sowohl bei Tier- als auch menschlichen Modellen für Gedächtnispathologie erleichtert werden durch klinisch wirksame "kognitionserhöhende" Wirkstoffe, die dazu dienen, die Leistung einer Gedächtnisaufgabe zu verbessern. Zum Beispiel können kognitive Verstärker, die als cholinomimetische Ersatztherapien bei Patienten funktionieren, die unter Dementia und Gedächtnisverlust vom Alzheimer-Typ leiden, wesentlich das Kurzzeit-Arbeitsgedächtnis in solchen Paradigmen, wie die gepaarte-assoziierte Aufgabe, verbessern (Davidson und Stern, 1991). Eine weitere potentielle Anwendung für therapeutische Interventionen gegen Gedächtnisschwäche wird durch altersbedingte Leistungsmängel vorgeschlagen, die wirksam durch die Longitudinalstudie von rezentem Gedächtnis bei alternden Mäusen modelliert sind (Forster und Lal, 1992).
Bei Tieren sind mehrere etablierte Modelle zum Lernen und Gedächtnis verfügbar, um die vorteilhaften kognitiven Verstärkungswirkungen und potentielle mit Angst im Zusammenhang stehende Nebeneffekte der Aktivierung von CRF-sensitiven Neuronen zu untersuchen. Zum Beispiel mißt sowohl der Morris-Labyrinth- (Stewart und Morris, in Behavioral Neuscience, R. Saghal, Hrsg. (IRL Press, 1993), S. 107) als auch der Y-Labyrinth- (Brits et al., Brain Res. Bull. 6, 71 (1981)) -Test kognitive Verstärkungswirkungen. Mit der Angst im Zusammenhang stehende Wirkungen können bewertet werden in dem erhöhten Plus-Labyrinth (Pellow et al., J. Neurosci. Meth. 14: 149, 1985).
Kurz gesagt, ist das Morris-Wasserlabyrinth eines der am besten validierten Modelle zum Lernen und Gedächtnis und es ist empfindlich für die kognitiven Verstärkungswirkungen einer Vielzahl von pharmakologischen Mitteln (McNamara und Skelton, Brain Res. Rev. 18: 33, 1993). Die im Labyrinth erbrachte Aufgabe ist besonders empfindlich für Manipulationen des Hippocampus im Gehirn, einem Gebiet des Gehirns, das für räumliches Lernen bei Tieren und Gedächtnisverfestigung beim Menschen wichtig ist. Darüber hinaus sagt die Verbesserung der Leistung im Morris-Wasserlabyrinth etwas aus hinsichtlich der klinischen Wirksamkeit einer Verbindung als ein kognitiver Verstärker. Zum Beispiel kehrt die Behandlung mit Cholinesteraseinhibitoren oder selektiven muskarinen cholinergen Agonisten Lerndefekte im Morris-Labyrinth-Tiermodell zum Lernen und Gedächtnis, ebenso wie in klinischen Populationen mit Dementia (McNamara und Skelton, 1993; Davidson und Stern, 1991; McEntee und Crook, 1992; Dawson et al., 1992) um. Zusätzlich modelliert dieses Tierparadigma akkurat das sich erhöhende Maß an Schwäche mit zunehmendem Alter (Levy et al., 1994) und die zunehmende Verletzbarkeit der Gedächtnissstrecke gegenüber Vor-Testverzögerung oder Störung (Stewart und Morris, 1993), was für amnesische Patienten charakteristisch ist.
Der Test ist eine einfache räumliche Lernaufgabe, bei der das Tier in lauwarmes Wasser gesetzt wird, das opak ist infolge des Zusetzens von pulverisierter Milch. Die Tiere lernen die Stelle der Plattform relativ zu visuellen Fingerzeigen, die innerhalb des Labyrinths und dem Testraum angeordnet sind; dieses Lernen wird als Platzlernen bezeichnet. Kurz gesagt, erhalten Gruppen von Tieren 15 Minuten vor dem Training an einem jeden der Tage 1 bis 3 ICV- Injektionen von Kontrollösung oder 0,1, 1,5 oder 25 ug eines CRF&sub2;-Rezeptor-Antagonisten.
Kontrolltiere erreichen die Plattform nach dreitägigem Training typischerweise innerhalb von 5 bis 10 Sekunden. Das Maß für die gedächtnismodulierenden Wirkungen eines CRF&sub2;- Rezeptor-Antagonisten ist eine Verschiebung dieser Zeitspanne.
Der Y-Labyrinthtest, der auf visueller Diskriminierung basiert, ist ein weiterer Test zum Lernen und Gedächtnis bei Tieren. In diesem Labyrinth enden zwei Arme des Labyrinths in einer durchscheinenden Kunststofftafel, hinter der sich eine elektrische Birne mit 40 Watt befindet. Die Ausgangsbox ist vom dritten Arm durch eine per Hand bediente Falltüre getrennt. Im ersten Versuch erlaubt man allen Tieren, das Labyrinth für fünf Minuten zu untersuchen und Futterkörner sind in einem jeden Arm erhältlich. Am zweiten Tag wird jedes Tier in die Startbox bei geschlossener Türe gegeben. Wenn die Türe geöffnet wird, erlaubt man dem Tier die Arme entlangzulaufen und die Körner, die sich in beiden Armen befinden, zu essen. Am dritten Tag erhalten die Tiere in Gruppen zu dreien sechs Versuche, wobei ein Arm an dem Entscheidungspunkt geschlossen ist, kein diskriminierender Reiz vorhanden ist, und zwei Futterkörner in der offenen Zielbox verfügbar sind. An den Tagen vier bis zehn wird ein Licht am Ende des Arms mit den Futterkörner angeschaltet und es werden zehn Versuche durchgeführt, wiederum in Gruppen zu dreien. Die Zeit, die das Tier benötigt, um die Futterkörner zu erreichen, wird aufgezeichnet.
Die Wirksamkeit eines CRF&sub2;-Rezeptor-Antagonisten, Lernen und Gedächtnis im Y-Labyrinth zu verbessern, wird wie folgt getestet. 15 Minuten vor einem jeden dieser Versuchstrainingsblöcke an den Tagen 4 bis 10 erhalten die Gruppen von Tieren ICV-Injektionen von Kontrollösungen oder Dosen mit 1, S oder 25 ug eines CRF&sub2;-Rezeptor-Antagonisten. Man erwartet, daß Kontrolltiere 50% richtige Entscheidungen treffen. Das Maß für die Wirksamkeit der Behandlung betreffend das Gedächtnis ist eine Erhöhung der richtigen Antworten.
Der erhöhte Plus-Labyrinthtest mißt anxiogene Antworten in einer Annäherungs- Vermeidungs-Situation, die einen exponierten, erhellten Raum gegenüber einem dunklen, geschlossenen Raum umfaßt. Beide Räume sind erhöht und aufgebaut als zwei Laufstrecken, die sich in Form eines Plus-Zeichens kreuzen. Dieser Typ von Annäherungs-Vermeidungs- Situation ist ein klassischer Text für "Emotionalität" und ist sehr empfindlich für Behandlungen, die Disinhibition und Streß produzieren. Kurz gesagt werden Tiere in die Mitte des Labyrinths gesetzt und man erlaubt ihnen freien Zugang zu allen vier Armen in einer 5- minütigen Testperiode. Die in einem jeden Arm verbrachte Zeit wird aufgezeichnet.
Beim Menschen kann die Bestimmung der Verbesserung des Lernens und Gedächtnisses gemessen werden durch solche Tests, wie die Wechsler-Gedächnisskala oder eine Paarassoziierte Gedächtnisaufgabe. Die Wechsler-Gedächtnisskala ist ein weitverbreiteter Bleistift- und -Papiertest für kognitive Funktion und Gedächtnisleistung. Bei der normalen Population ergibt der Standardtest ein Mittel von 100 und eine Standardabweichung von 15, so daß milde Amnesie mit einer Verringerung der Wertzahl um 10 bis 15 Punkte nachgewiesen werden kann, oder schwerere Amnesie mit einer Verringerung um 20 bis 30 Punkt usw. (Squire, 1987). Während des klinischen Interviews wird eine Reihe von Tests einschließlich, nicht aber darauf beschränkt, des Minimental-Tests der Wechsler-Gedächtnisskala oder des gepaarten-assoziierten Lernens, angewandt, um symptomatischen Gedächtnisschwund zu diagnostizieren. Die Tests sehen eine allgemeine Empfindlichkeit gegenüber allgemeiner kognitiver Schwäche und spezifischem Verlust von Lern-/Gedächtniskapazität vor (Squire, 1987). Neben der spezifischen Diagnose von Dementia oder amnesischen Erkrankungen identifizieren diese klinischen Instrumente auch altersabhängige kognitive Verringerung, die eine objektive Verringerung der Geistesfunktion infolge des Alterungsprozesses widerspiegelt, der innerhalb normaler, durch das Alter der Person bedingten Grenzen ist (DSM IV, 1994). Wie oben festgehalten, ist "Verbesserung" beim Lernen und Gedächtnis im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung gegeben, wenn statistisch signifikante Unterschiede in Richtung Normalität des gepaarten-assoziierten Tests zwischen z. B. der Leistung von mit CRF&sub2;- Rezeptor-Antagonisten-behandelten Patienten verglichen mit Mitgliedern der Placebo-Gruppe oder zwischen nachfolgenden Tests, die am selben Patienten durchgeführt wurden, bestehen.

Alzheimersche Krankheit

Es werden Verfahren zum Behandeln von Alzheimersche Krankheit (AD) durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines CRF&sub2;-Rezeptor-Antagonisten an einen Patienten offenbart. Kurz gesagt können derartige Patienten identifiziert werden durch klinische Diagnose auf der Basis von Symptomen von Dementia oder Lern- und Gedächtnisverlust, die nicht anderen Ursachen zugewiesen werden können. Zusätzlich werden diese Patienten auch durch Diagnose von Gehirnatrophie identifiziert, wie bestimmt durch bildliche Darstellung mittels magnetischer Resonanz.
Es sind mehrere etablierte Tiermodelle zur Alzheimerschen Krankheit, die auf cholinerge Defekte fokussieren, verfügbar. Die primäre Rolle von cholinergen Defekten in AD ist gut etabliert. Bei AD bestehen signifikante positive Korrelationen zwischen Verringerter Cholin- Acetyltransferase-Aktivität und verringerter CRF-Titern in den frontalen, okzipitalen und temporalen Loben (DeSouza et al., 1986). In ähnlicher Weise gibt es negative Korrelation zwischen verringerter Cholin-Acetyltransferase-Aktivität und einer erhöhten Anzahl von CRF-Rezeptoren in diesen drei Cortices (Id.). Es gibt, bei zwei anderen neurodegenerativen Erkrankungen, eine hochsignifikante Korrelation zwischen CRF und Cholin- Acetyltransferase-Aktivität bei Parkinsonscher Erkrankung, aber nur eine leichte Korrelation bei progressiver supranukleärer Paralyse (Whitehouse et al., 1987).
Bei Ratten belegen anatomische und Verhaltensstudien Wechselwirkungen zwischen CRF und cholinergen Systemen. Zuerst sind in einigen Gehirnstammnuklei CRF und Acetylcholinesterase co-lokalisiert und einige cholinerge Neurone enthalten auch CRF. Zweitens inhibiert CRF Carbachol-induzierte Verhaltensweisen (Carbachol ist ein muskariner cholinerger Rezeptor-Antagonist), was vorschlägt, daß CRF Wirkungen auf cholinerge Systeme hat (Crawley et al., Peptides 6: 891, 1985). Behandlung mit einem anderen muskarinen cholinergen Rezeptor-Antagonisten, Atropin, führt zu einer Erhöhung der CRF-Rezeptoren (De Souza und Battaglia, Brain Res. 397: 401, 1986). Zusammengenommen zeigen diese Daten, daß CRF und cholinerge Systeme bei Menschen und bei Tieren in ähnlicher Weise zusammenwirken.
Ein Tiermodell für die Alzheimersche Krankheit, das auf cholinerge Mängel abstellt, wird hergestellt durch die Verabreichung von Scopolamin, einem nicht-selektiven postsynaptischen muskarinen Rezeptor-Antagonisten, der die Stimulierung von postsynaptischen Rezeptoren durch Acetylcholin blockiert. Bei diesen Tieren sind Gedächtnismängel leicht offensichtlich, wie gemessen durch passive Vermeidungstests oder verzögerte-Zuordnung-zu-einer Position-Tests, die motorische oder perzeptuale Mängel von Amnesie oder kognitive Verstärkungswirkungen von experimentellen Behandlungen unterscheiden. So werden Morris- Labyrinth- und Y-Labyrinth-Tests nach Scopolamin-induzierter Amnesie verwendet, um Gedächtnisschwäche und nachfolgende Verstärkung nach Verabreichung eines CRF&sub2;-Rezeptor- Antagonisten zu testen. Beim Morris-Labyrinth ist der Aufbau des Tests im wesentlichen so, wie oben beschrieben, ist aber so modifiziert, daß es eine Behandlung 30 Minuten vor dem Training an einem jeden der Tage eins bis drei mit einer ip-Injektion von Scopolaminhydrobromid (0,3 mg/kg) umfaßt. Diese amnesische Dosis von Scopolamin schwächt den Erwerb und die Beibehaltung von Raum- und Vermeidungslernparadigmen bei der Ratte. Die anti-amnesischen Wirkungen von 1,5 oder 25 ug eines CRF&sub2;-Rezeptor-Antagonisten werden gemessen relativ zu den gleichlaufenden Kontrollgruppen, die Scopolamin erhalten oder nicht erhalten. Die Wirkung des CRF&sub2;-Rezeptor-Antagonisten hinsichtlich Umkehrung von Scopolamin-induzierter Amnesie unter Verwendung des Y-Labyrinths wird vorgenommen in ähnlicher Weise, wie beim oben beschriebenen Y-Labyrinth-Test. Modifikation dieses Tests schließt die Behandlung 30 Minuten vor dem Training an den Tagen 5 bis 10 mit einer ip- Injektion von Scopolamin-Hydrobromid (0,3 mg/kg) ein. Die anti-amnesischen Wirkungen von 1,5 oder 25 ug eines CRF&sub2;-Rezeptor-Antagonisten, der ICV, zentral oder systemisch, verabreicht wurde, werden gemessen relativ zu parallel laufenden Kontroll- und Scopolaminbehandelten Kontrollgruppen.
Es sind auch mehrere Tests, die kognitives Verhalten bei AD messen, konstruiert worden (siehe Gershon et al., Clinical Evaluation of Psychotropic Drugs: Principles and Guidelines, Prien und Robinson (Hrsg.), Raven Press, Ltd., New York, 1994, S. 467). Einer dieser Test, BCRS, mißt Konzentration, rezentes Gedächtnis, vergangenes Gedächtnis, Orientierung und Funktionieren und Selbstschutz. Der BCRS ist so konstruiert, daß er nur kognitive Funktionen mißt. Dieser Test, ebenso wie die Weschler-Gedächtnis-Skala und die Alzheimersche Krankheit-assoziierte Skala können verwendet werden, um Verbesserung nach therapeutischer Behandlung mit einem CRF&sub2;-Rezeptor-Antagonisten zu bestimmen. Wie oben festgehalten ist "Verbesserung" bei Alzheimersche Krankheit im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung gegeben, wenn ein statistisch signifikanter Unterschied in Richtung Normalität im Weschler-Gedächtnis-Skalatest besteht zwischen, z. B., der Leistung von mit CRF&sub2;-Rezeptor- Antagonisten behandelten Patienten, verglichen mit Mitgliedern der Placebo-Gruppe oder zwischen nachfolgenden Tests, die am gleichen Patienten durchgeführt wurden. Zusätzlich kann Scopolamin-induzierte Amnesie beim Menschen als ein Modellsystem verwendet werden, um die Wirksamkeit der CRF&sub2;-Rezeptor-Antagonisten zu testen.

Cerebrovaskuläre Erkrankung

Wie oben festgehalten, werden Verfahren offenbart zum Behandeln von cerebrovaskulären Erkrankungen, wie Schlaganfall, Reperfusionsverletzung und Migräne, durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines CRF&sub2;-Rezeptor-Antagonisten an einen Patienten. Ein Patient wird als behandelt betrachtet, wenn die Verabreichung des CRF&sub2;-Rezeptor- Antagonisten zu einer statistisch signifikanten Verbesserung führt, verglichen mit Kontrollen, von einer klinischen oder diagnostischen Indizierung einer cerebrovaskulären Erkrankung (siehe z. B. Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill Book Co.). Typische Beispiele für Tiermodellsysteme, um die Wirkungen eines CRF&sub2;-Rezeptor-Antagonisten auf cerebrovaskuläre Erkrankung zu testen, schließt fokalen ischämischen Schaden von Injusionen von NMDA-Agonisten (1-Aminocyclobutan-cis-1,3-dicarboxylsäure) ein. Solche exzitotoxischen Verbindungen können in speziellen Gebieten des Gehirns infundiert und die Toxizität gemessen werden durch späteres Färben mit einer Verbindung, wie Tetrazolium. Indizien für neuralen Schutz können gezeigt werden durch die Verringerung des Volumens der Infarzierung der mit einem CRF&sub2;-Rezeptor-Antagonisten behandelten Tiere.
Die Verabreichung von CRF&sub2;-Rezeptor-Antagonisten kann erfolgen auf einer Reihe von Wegen, einschließlich z. B. durch direkte Injektion in eine Verletzungsstelle oder eine Stelle der Erkrankung, über andere intracraniale, intradermale, intraperitoneale, intrathekale, subkutane oder intramuskuläre Wege oder bevorzugtererweise oral oder intravenös.
Die folgenden Beispiele werden zu Zwecken der Veranschaulichung und nicht zu Zwecken der Beschränkung angegeben.

BEISPIELE

BEISPIEL 1

Isolierung von CRF&sub2;-Rezeptor-cDNA

A. Isolierung von CRW-Rezeptor-cDNA aus einer cDNA-Genbank von Ratten ehirn.

Männliche Sprague-Dawley-Ratten (Madison, WI) mit einem Gewicht zwischen 175-250 g werden dekapiert und das Gehirn herausgeschnitten. Gesamt-RNA wird dann aus dem Gehirn isoliert unter der Verwendung eines Promega RNAgents Total RNA Kit (Katalog Nr. Z5110, Promega, Wisc.) entsprechend den Anweisungen des Herstellers, gefolgt von der Isolierung einer poly A+-RNA unter Verwendung eines Promega PolyATract kit (Katalog Nr. Z5420). Eine cDNA-Phagengenbank wird dann hergestellt unter Verwendung eines Giga-Pack Gold- Genbank-Konstruktion-Kits entsprechend den Herstellerangaben (Katalog Nr. 237611, Stratagene, La Jolla, Calif.), die wiederum plattiert und gescreent wird, im wesentlichen wie beschrieben von Sambrook et al., (Molecular Cloning) mit Oligonukleotid 5'-CCCGGATGCC TACAGAGAAT GCCTGGAGGA TGGGACCTGG GCCTCAAGGG-3" (Sequenz I.D. No. 5). Diese Oligonukleotid ist komplementär zu Nukleotiden 440-490 der Ratten-CRF&sub2;- Rezeptor-cDNA-Sequenz, die in Fig. 1 gezeigt ist.
Die Phagengenbank wird erneut gescreent, bis ein einzelnes reines Phagensiolat erhalten wird. Der Phage wird dann auf dem bakteriellen Wirt XL1-Blue (Stratagene, La Jolla, Calif.) angezogen und Plasmidnukleinsäure mit ExAssist-Helferphage (Stratagene) in SOLR-Zellen herausgeschnitten. Die SOLR-Zellen werden dann ausplattiert, Plasmidnukleinsäure wird isoliert und unter Verwendung des Sanger-Dideoxy-Protokolls sequenziert.
Eine CRF&sub2;-Rezeptor-cDNA-Sequenz von der Ratte, die erhalten werden kann unter Verwendung dieser Verfahrensweise, ist unten in Fig. 2 und in Sequenz I.D. No. 1 angegeben.

B. Isolierung von CRF&sub2;-Rezeptor-cDNA aus einer cDNA-Genbank von Ratten- Hypothalamus

CRF&sub2;-Rezeptor-cDNA kann auch isoliert werden aus kommerziell erhältlichen cDNA- Genbanken von Ratten-Hypothalamus. Kurz gesagt werden zwei Millionen Plaques von einer Ratten-Hypothalamus-Phagengenbank (Stratagen, Katalog Nr. 936518) entsprechend den Angaben des Herstellers ausplattiert und mit Oligonukleotid-Sequenz I.D. No. 5 im wesentlichen wie oben beschrieben gescreent.
Eine cDNA-Sequenz für Ratten CRF&sub2;-Rezeptor, die erhalten werden kann unter Verwendung dieser Verfahrensweise, ist unten in Fig. 1 und in Sequenz I.D. No. 3 angegeben.

C. Isolieren von CRF&sub2;-Rezeptor-cDNA aus menschlicher cDNA-Genbank

CRF&sub2;-Rezeptor-cDNA kann auch isoliert werden aus kommerziell erhältlichen menschlichen cDNA-Genbanken. Kurz gesagt werden etwa 2 Million Plaques aus einer Phagengenbank von menschlichem Stirnkortex (Stratagene, Katalog Nr. 936212) entsprechend den Angaben des Herstellers ausplattiert und mit Oligonukleotid 5' -GATCAACTAC TCACAGTGTG AGCCCATTTT GGATGACAAG CAGAGGAAGT A-3' (Sequenz I.D. No. 6) wie im wesentlichen oben beschrieben gescreent.
Eine cDNA-Sequenz von menschlichem CRF&sub2;-Rezeptor, die erhalten werden kann unter Verwendung dieser Verfahrensweise, ist unten in Sequenz I.D. No. 7 angegeben. Kurz gesagt ist die menschliche Sequenz zu 89,1% identisch auf der Nukleotidebene und zu 93% identisch auf der Aminosäureebene zu der oben beschriebenen für CRF2α-Rezeptor von der Ratte (Sequenz I.D. No. 3).

BEISPIEL 2

Expression von CRF&sub2;-Rezeptor-cDNA

pCDM7-Amp wird zuerst konstruiert von pCDM8 (Seed, Nature 329: 840-842, 1987; Seed und Aruffo, Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 3365-3369, 1987; Thomsen et al., Cell 63: 485-493, 1990; Bernot und Auffray, Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 2550-2554, 1991; Han et al., Nature 349: 697-700, 1991) durch Deletion des Adeno-Replikationsursprungs, M13-Replikationsursprungs und sup F-Selektionsmarker. Ein Ampicillin-Resistenzmarker wird hinzugefügt, um Selektion des Plasmids zu erleichtern.
Ein CRF&sub2;-Rezeptorklon in seiner ganzen Länge in pBluescriptSK- wird aus dem oben beschriebenen Phagenklon isoliert und mit EcoRV und XhoI geschnitten, was zum Freisetzen des Inserts führt. Das Insert wird dann isoliert und in pCDM7-Amp ligiert, das in ähnlicher Weise geschnitten worden war. Das resultierende Produkt wird verwendet, um E. coli DHSct zu transformieren, aus dem größere Mengen an Plasmidnukleinsäure isoliert werden können.
COS-7 (ATCC Nr. CRL 1651)-Zellen werden dann transfisziert mit pCDM7-Amp, das CRF&sub2;- Rezeptor-cDNA enthält (10 ug Nukleinsäure/10 cm Platte mit Zellen), unter Verwendung von 400 ug/ml DEAE-Dextran und 100 uM Chloroquin. Die Zellen werden für vier Stunden transfiziert, dann mit 10% DMSO für zwei Minuten geschockt. Die Zellen werden dann gewaschen und in DMEM, das 10% fötales Rinderserum enthält, für zwei Tage in einer Platte mit 24 Näpfen angezogen.

BEISPIEL 3

CRF&sub2;-Rezeptorbindungstest

Materialien

¹²&sup5;I-Tyr-&sup0;-ovin-CRF (¹²&sup5;I-oCRF; spezifispezifische Aktivität 2200 Ci/mMol) wird erhalten von Du Pont-New England Nuclear (Boston, MA). Nicht markierter Ratten/Menschen-CRF wird gekauft von Peninsula Laboratories (Belmont, CA). Alle anderen Standardreagenzien wurden von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) gekauft.

A. Zellmembranherstellung

Transfizierte Zellen, die CRF&sub2;-Rezeptoren exprimieren, werden geerntet, einmal in PBS (pH 7,0 bei 22ºC) gewaschen, durch Zentrifugation pelletiert und bei -70ºC bis zur Verwendung gelagert. Am Tag des Tests werden gefrorene Pellets in 5 ml eiskaltem Puffer resuspendiert, der 50 mM Tris, 10 mM MgCl&sub2;, 2 mM EGTA pH 7,0 bei 22ºC enthält, und homogenisiert unter Verwendung eines Polytrons (PT3000, Brinkmann Instruments, Westbury, N. Y.) bei 27 000 Upm Ihr 20 Sekunden. Das Homogenat wird zentrifugiert bei 48 000 · g Ihr 10 Minuten bei 4ºC, der Überstand wird verworfen und das Pellet wird erneut homogenisiert im gleichen Volumen von Puffer und wieder zentrifugiert bei 48 000 · g für 10 Minuten bei 4ºC. Das resultierende Pellet, das Membranen enthält, wird im obigen Puffer resuspendiert, um eine Endproteinkonzentration von 300 mg/ml zur Verwendung in dem unten beschriebenen Test zu ergeben. Proteinbestimmungen wurden vorgenommen entsprechend dem Verfahren von Lowry et al. (J. Biol. Chem. 193: 265-275, 1951) unter Verwendung von Rinderserumalbumin (BSA) als Standard.

B. CRF-Rezeptor-Bindungstest

100 Mikroliter der Membransuspension werden hinzugegeben zu 1,5 ml (Polypropylenmikrofugenröhrchen), die 100 ul (100-200 pM) lzsl-oCRF in Inkubationspuffer (50 mM Tris, 10 mM MgCl&sub2;, 2 mM EGTA, 1,5% BSA, 0,15 mM Bacitracin und 1,5% Aprotinin) enthalten und 100 ul des Inkubationspuffers. Kompetierende Peptide (z. B., r/hCRF, Sauvagin, Urotensin I, Urotensin II, Rinder-CRF (b-CRF) und deamidierter Rinder-CRF (b-CRF-OH)) werden auch hinzugesetzt. Die Inkubationen werden ausgeführt bei Raumtemperatur (22ºC) für 2 Stunden und beendet durch Zentrifugieren in einer Mikrofuge für 5 Minuten bei 12 000 · g. Das resultierende Pellet wird vorsichtig mit 1,0 ml eiskalter phosphatgepufferter Saline, pH 7,2 enthaltend 0,01% Triton X-100, geWaschen und erneut zentrifugiert für 5 Minuten bei 12 000 · g. Die Mikrofugenröhrchen werden gerade oberhalb des Pellets abgeschnitten, in 12 · 75 mm Polystyrolröhrchen gegeben und auf Radioaktivität in einem Packard Cobra II- Gammazähler bei einer Effizienz von etwa 80% überwacht. Das nicht spezifische Binden von ¹²&sup5;I-o-CRF gegenüber Membranhomogenaten wird definiert in Gegenwart von 1 mM unmarkiertem CRF.

C. Sättigungskurvenanalyse

Für Sättigungsstudien werden 100 ul ¹²&sup5;I-oCRF (50 pM - 10 nM Endkonzentration), 100 ul Testpuffer (mit oder ohne 1 uM r/hCRF Endkonzentration, um nicht-spezifisches Binden zu definieren) und 100 ul Membransuspension (wie oben beschrieben) in der Reihenfolge zu 1,5 ml Polypropylenmikrofugenröhrchen gegeben. Alle Reaktionen werden für 2 Stunden bei 22ºC durchgeführt und durch Zentrifugation für 5 Minuten bei 12 000 · g beendet. Aliquots des Überstands werden gesammelt, um die Menge an ungebundenem Radioliganden zu bestimmen. Der restliche Überstand wird abgesaugt. Die Pellets werden vorsichtig mit eiskalter PBS plus 0,01% Triton X-100 gewaschen, erneut zentrifugiert und auf gebundene Radioaktivität überwacht. Daten aus Sättigungskurven werden analysiert unter Verwendung des nichtlinearen, kleinsten Quadratkurvenanpassungsprogramms LIGAND (Munson und Rodbard, Anal. Biochem 107: 220-229, 1980). Nicht-spezifisches Binden ist nicht willkürlich durch die Untersucher definiert, sondern wird als eine unabhängige Variable aus dem ganzen Datensatz abgeschätzt.

D. Kompetitionskurvenanalvse

Für Kompetitionsstudien werden 100 ul ¹²&sup5;I-oCRF (Endkonzentration 200-300 pM) zusammen mit 100 ul Puffer (in Gegenwart von 1 pM bis 10 mM kompetitierender Ligand) und 100 ul Membransuspension, wie oben hergestellt, inkubiert. Man erlaubt der Reaktion, für 2 Stunden bei 22ºC voranzuschreiten und beendete sie durch Zentrifugation, wie oben beschrieben. Die Daten aus Kompetitionskurven wurden auch durch das Programm LIGAND analysiert. Für jede Kompetitionskurve werden Abschätzungen für die Affinität des radiomarkierten Liganden für den CRF-Rezeptor (¹²&sup5;I-oCRF oder ¹²&sup5;I-r/hCRF) in unabhängigen Sättigungsexperimenten erhalten. Diese Abschätzungen werden während der Analyse der apparenten Inhibitionskonstanten (Ki) für die verschiedenen verwandten nicht und nichtverwandten Peptide eingeengt.
Routinemäßig werden die Daten analysiert unter Verwendung eines Ein- oder Zweistellenmodells durch Vergleich der "Güte der Anpassung" zwischen den Modellen, um akkurat den Ki zu bestimmen. Statistische Analysen, die durch LIGAND vorgesehen sind, erlaubten die Bestimmung, ob ein Einzelstellen- oder Mehrfachstellenmodell verwendet werden sollte. Für CRF-verwandte Peptide passen alle Daten zu einem Einzelstellenmodell, was nahelegt, daß die transfizierten Zellen eine einzelne homogene Population von Bindungsstellen mit hoher Affinität und dem geeigneten pharmakologischen Profil des CRF-Rezeptors enthielten.

BEISPIEL 4

cAMP-Test

Die Wirkung von CRF und verwandten Peptiden auf Adenylatcyclase-Aktivität in transfizierten Zellen kann im wesentlichen wie folgt bestimmt werden. Für das Testen auf Agonisten werden Verbindungen zu Näpfen mit Puffer alleine zugesetzt, um Verbindungen mit intrinsischer Aktivität zu identifizieren. Zum Testen auf Antagonisten werden Verbindungen in die Näpfe zusammen mit 1-100 nM CRF gegeben, um das Adenylatcyclase-System zu stimulieren. Verbindungen werden dann auf ihre Fähigkeit hin bewertet, CRD-stimulierte cAMP- Produktion in den transfizierten Zellen zu inhibieren. Kurz gesagt werden Zellen ausplattiert und in DMEM, das 10% fötales Rinderserum enthält, für 2 bis 4 Tage in Platten mit 24 Näpfen bei 37ºC angezogen. Am Tag des Tests wird das Medium durch Vakuumabsaugung entfernt und 100 ul DMEM, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM Isobutylmethylxanthin (ein Phosphodiesterase-Inhibitor, um Abbau von produziertem cAMP zu inhibieren) und 0,1% BSA (pH 7,2) zu einem jeden Napfhinzugesetzt. CRF, verwandte Peptide und organische Testmoleküle werden zu einzelnen Näpfen hinzugesetzt. Die Platten werden bei 37ºC für die Dauer von 1 Stunde inkubiert. Nach Inkubation werden die Näpfe abgesaugt, einmal mit PBS ausgespült und erneut abgesaugt. 300 ul 95% Ethanol und 20 mM HCl (EtOH/HCl) werden dann zu jedem Napfhinzugesetzt und die Platten bei -20ºC über Nacht inkubiert, um das produzierte cAMP zu extrahieren. Das EtOH/HCl wird entfernt, in 1,5 ml Polypropylen-Eppendorf-Röhrchen gegeben und die Näpfe mit zusätzlich 200 ul EtOH/HCl gewaschen und mit der ursprünglichen Probe vereint. Alle Proben wurden in einem Speed-Vac (Savant Instruments, Farmingdale NY) getrocknet und entweder bei -20ºC bis zur Verwendung gelagert oder mit 500 ul Natriumacetatpuffer pH 7,5 rekonstituiert und sofort auf cAMP-Konzentration unter Verwendung eines Radioimmungssay-Kits von Biomedical Technologies Inc. (Stoughton MA) entsprechend den Anweisungen des Hersteller getestet.
Fig. 3 stellt cAMP-Akkumulation in mit dem CRF1-Rezeptor transfizierten und mit ovinem CRF (oCRF), Ratte/Menschen-CRF (r/hCRF), Sauvagin oder Urotensin I stimulierten Zellen dar. Kurz gesagt zeigt dieses Diagramm eine Dosis-abhängige Erhöhung an cAMP in Anwort auf diese Verbindungen. All diese Verbindungen zeigen ähnliche Potenzen. In Fig. 4 ist der CRF2α- Rezeptor von Ratte in Zellen transfiziert worden und cAMP-Akkumulierung wird gemessen in Antwort auf dieselben Wirkstoffe, wie in Fig. 3 gezeigt. Wie in Fig. 4 gezeigt, sind Sauvagin und Urotensin I beim Stimulieren von cAMP potenter als entweder oCRF oder r/hCRF. Zusammen zeigen diese Ergebnisse ein deutlich verschiedenes pharmakologisches Profil zwischen CRF&sub1;- und CRF&sub2;-Rezeptoren.
Fig. 5 und 6 stellen die Wirkung von den Antagonisten α-helikalem oRCF(9-41) (siehe Rivier et al., Science224: 889-891, 1984) und d-Phe r/hCRF(12-41) in CRF&sub1;- bzw. CRF2α- transfizierten Zellen nach Sauvagin-stimulierter cAMP-Produktion dar (siehe Rivier et al., J. Med. Chem. 36: 2851-2859, 1993).
Die obigen Ergebnisse sind formuliert worden in Tabelle I unten, wobei die wirksame Konzentration für halbmaximale Adenylatcyclasestimulation (EC&sub5;&sub0;) angegeben sind. TABLE I

BEISPIEL 5

GEWEBEVERTEILUNG VON CRF&sub2;α- und β-REZEPTOREN

Um die anatomische Verteilung der zwei CRF&sub2;-Rezeptorformen zu bestimmen, wurden mRNA-Expressionsmuster in isolierter RNA (RNase-Schutz-Tests) und Ganzgewebeschnitten (in situ-Hyberisierung) von Rattengehirn und peripheren Geweben, im wesentlichen wie unten beschrieben, analysiert.

A. RNase-Schutz-Test

Eine 366-Basenribosonde, die eine 258-Basen-antisense-Sequenz enthält, die spezifisch für den CRF2α-Rezeptor von Ratten ist, und eine 278-Basenribosonde, die 181-Basen-antisense- Sequenz enthält, die spezifisch für die CRF2β-Rezeptor-mRNA ist, wurden erzeugt durch T3- RNA-Polymerase in 40 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl, 2 mM Spermidin, 10 mM NaCl, 10 mM DTT, 1 U/ul RNasin (Promega), jeweils 0,5 mM ATP, CTP, TTP und 3 uM ³²P-UTP (DuPont, 800 Ci/mMol), 0,1 ug/gl Matritzen-DNA, 1 U/gl T3-RNA-Polymerase in einem Gesamtvolumen von 10 ul bei 37ºC für 30 Minuten. Eine 712-Basenribosonde, die 632 Basen antisense-Sequenz enthält, die spezifisch für Ratten-β-Aktin mRNA ist, wurde unter denselben Bedingungen hergestellt mit der Ausnahme, daß T7-RNA-Polymerase verwendet wurde. Die Sondensynthesemischungen wurden dann mit DNase I bei einer Konzentration von 1 U/ul bei 37ºC für 10 Minuten behandelt und dann auf einem denaturierenden 5% Acrylamidgel elektrophoresiert. Die ³²P-markierten RNA-Sonden mit den erwarteten Größen wurden aus dem Gel mit einem RNA-Reinigungskit, RNaidkitt (Bio-101, La Jolla, CA) wiedergewonnen. RNA-Hybridisierung, RNase-Verdau und Trennen der geschützten RNAs wurde vorgenommen, wie von Sawbrook et al., oben beschrieben. In Tests auf CRF&sub2;-Rezeptor-mRNAs wurden 40 ug Gesamt-RNA in jeder Probe verwendet. In Tests auf β-Aktin-mRNA wurde für jede Probe 1 ug Gesamt-RNA verwendet.

B. In situ-Hybridisierung

Männliche Sprague-Dawley-Ratten wurden durch Dekapieren getötet und die Gehirne entfernt und in flüssigem Isopentan (-42ºC) gefroren. Nachfolgend wurden die Gewebe geschnitten (15 um) auf einem bei -20ºC gehaltenen Kryostaten und durch tauen aufgebracht auf Polylysin-beschichtete Mikroskopobjektträger. Die Schnitte wurden vor Gewebefixierung bei -80ºC gelagert.
Die Schnitte wurden aus dem Lager bei -80ºC entfernt und direkt auf 4% gepuffertes Paraformaldehyd bei Raumtemperatur gegeben. Nach 60 Minuten wurden die Objektträger in isotonischer Phosphat-gepufferter Saline abgewaschen (10 Minuten) und mit Proteinase K (1 ug/ml) in 100 mM Tris/HCl, pH 8,0) für 10 Minuten bei 37ºC behandelt. Nachfolgend wurden die Schnitte sukzessivem Waschen in Wasser (1 Minute), 0,1 M Triethanolamin (pH 8,0, plus 0,25% Essigsäureanhydrid) für 10 Minuten und 2X SSC (0,3 mM NaCl, 0,03 mM Natriumcitrat, pH 7,2) für 5 Minuten unterzogen. Die Schnitte wurden dann dehydratisiert durch abgestufte Alkohole und luftgetrocknet.
RNA-Sonden (wie oben beschrieben) wurden synthetisiert unter Verwendung von Maxiscript RNA-Transkriptions-Kits (Ambion, Austin, TX). Nachfixierte Schnitte wurden hybridisiert mit 1,0 · 10&sup6; dpm von [³&sup5;S]UTP-markierten Ribosonden in Hybridisierungspuffer, der 75% Formamid, 10% Dextransulphat, 3X SSC, 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,4), IX Denhardt's Lösung, 0,1 mg/ml Hefe-tRNA und 10 mM Dithiothreitol in einem Gesamtvolumen von 25 ul enthält. Die verdünnte Sonde wurde auf Schnitte auf einem Deckglas aufgetragen, das mit Gummizement am Ort versiegelt wurde. Die Schnitte wurden über Nacht bei 55ºC in einer feuchten Umgebung hybridisiert.
Nach Hybridisierung wurde der Gummizement entfernt und die Schnitte wurden in 2X SSC für 5 Minuten gewaschen und dann mit RNase A (200 ug/ml in 10 mM Tris/HCl, pH 8,0, enthaltend 0,5 M NaCl) für 60 Minuten bei 37ºC behandelt. Nachfolgend wurden die Schnitte gewaschen in 2X SSC für 5 Minuten, 1X SSC für 5 Minuten, 0,5X SSC für 60 Minuten bei Hybridisierungstemperatur, 0,5X SSC für 60 Minuten bei Raumtemperatur für 5 Minuten und dann in abgestuften Alkoholen dehydratisiert und luftgetrocknet. Für Signaldetektion wurden die Schnitte auf Kodak XAR-5 Röntgenfilm plaziert und für 7 Tage bei Raumtemperatur exponiert.

C. Ergebnisse

Wie in Fig. 7 gezeigt, weisen auf der Basis von RNase-Schutz-Tests CRF2α- und CRF2β- Rezeptor-mRNAs deutlich verschiedene Gewebeverteilungen auf. Insbesondere wird CRF2α in erster Linie im Gehirn gefunden, insbesondere im Hypothalamus, lateralen Septum und olfaktorischen Bulbus, wohingegen die CRFZß-mRNA in erster Linie, aber nicht darauf beschränkt, im Herzen und der Skelettmuskulatur gefunden wird. Dies ist im starken Gegensatz zu der früher offenbarten Verteilung des CRF&sub1;-Rezeptors (Potter et al., PNAS 91: 8777-8781, 1994).
Ergebnisse von in situ Hybridisierungstest sind in Fig. 8 gezeigt. Fig. 8A, B, C und 8A', B', C' zeigen koronale Schnitte von Rattengehirn, die mit antisense-CRF2α bzw. -CRF2β-Sonden sondiert wurden. Es gibt eine klare Expression von CRF2α im lateralen Septum (A), wohingegen CRF2β im choroiden Plexus (A') exponiert wird. Fig. 8B bzw. 8C zeigen CRF2α- Expression im paraventrikulären Nukleus und im ventromedialen hypothalamischen Nukleus. CRF2β wird in keinem dieser Gebiete nachgewiesen (Fig. 8B' und 8C'). CRF2α wird auch in den supraoptischen Nuklei (Fig. 8B) nachgewiesen, wohingegen CRF2ß in den benachbarten Arteriolen exprimiert wird (Fig. 8B'). Man hat auch gefunden, daß CRF2α auf vielen der Arteriolen im Gehirn exprimiert wird, die CRF2β, wenngleich auf einem geringeren Niveau, exprimieren (nicht gezeigt). Im Herzen war CRF2β die exprimierte Hauptform und man fand sie in vorherrschender Weise auf Arteriolen (nicht gezeigt).

BEISPIEL 6

ANATOMISCHE VERTEILUNG VON CRF&sub1;- UND CRF&sub2;-mRNA

A. Materialien und Methoden

1. Tiere: Männliche Sprague-Dawley-Ratten (200-220 g) wurden für Kartierungsstudien verwendet. Vor dem Töten wurden die Tiere in einem 12-stündigen Licht/Dunkelzyklus, versehen mit Futter und Wasser ad libitum, gehalten.
2. Ribosondenkonstruktion: CRF&sub2;-cRNA-Ribosonde wurde hergestellt aus einem 460 bp cDNA-Fragment des in pBluescriptSK+ (Stratagene, La Jolla) subklonierten CRF&sub2;- Rezeptors und linearisiert mit XbaI. Die CRF&sub1;-Sonde wurde synthetisiert aus einem 460 bp 5'-Fragment von CRF&sub1;-cDNA in pBluescriptSK+, linearisiert mit Xba I. Beide CRF&sub1;- und CRF&sub2;-Ribosonden waren gerichtet gegen die 5'-Region ihrer entsprechenden Rezeptoren, wobei die Sequenz bis zu der dritten mutmaßlichen Transmembranregion abgedeckt wurde (Fig. 9). Die ungefähre Nukleotidhomologie zwischen den zwei Sonden beträgt 65% in dieser Region. Es ist wichtig, daß in vorläufigen Experimenten cRNA- Sonden, die gegen die 3'-Region des CRF&sub2;-Rezeptors gerichtet sind, offensichtlich sowohl CRF&sub1;- als auch CRF&sub2;-Rezeptor-mRNAs markierten, wohingegen die zwei mRNA- Spezies klar durch 5'-spezifische Sonden unter ähnlichen Hybridisierungsbedingungen getrennt werden konnten. Somit scheint es notwendig zu sein, 5'-Sonden für Subtypenspezifisches Markieren zu verwenden. Für beide Sonden wurde die Spezifität bestätigt durch Abwesenheit von Signal in mit sense-Sonden markierten Schnitten und Schnitten, die mit RNase vor der Hybridisierung mit antisense-(cRNA)-Sonde vorbehandelt wurden. CRF-cRNA-antisense-Sonden wurden aus einem 779 bp-Fragment von CRF-cDNA synthetisiert, die in einen pGEM3Z-Vektor kloniert war (eine Gefälligkeit von Dr. Robert Thompson, University of Michigan). Ribosonden wurden hergestellt unter Verwendung von entweder T3- oder T7-Transkriptionssystemen in einer Standardmarkierungsreaktionsmischung, die bestand aus: 1 ug linearisiertem Plasmid, 5X Transkriptionspuffer, 125 uCi ³&sup5;S-UTP oder ³³P-UTP, 150 uM NTP's, 12,5 mM Dithiothreitol, 20U RNAse- Inhibitor und 6U der geeigneten Polymerase. Die Reaktion wurde bei 37ºC für 90 Minuten inkubiert und die markierte Sonde von freien Nukleotiden über Sephadex G-50 Spin- Säulen entfernt.
3. In situ-Hybridisierungs-Histochemie: Seziertes Gewebe wurde in Isopentan eingefroren, das auf -42ºC gekühlt war, und nachfolgend bei -80ºC vor dem Schneiden auf einem Kryostaten gelagert. Auf Objektträger befestigte Gewebeschnitte wurden dann bei -80ºC gelagert. Die Schnitte wurden aus der Lagerung entfernt und direkt in 4% gepuffertes Formaldehyd bei Raumtemperatur gegeben. Nach 60 Minuten werden die Objektträger in isotonischer Phosphat-gepufferter Saline (10 Minuten) abgewaschen und mit Proteinase K (1 ug/ml in 100 mM Tris/HCl, pH 8,0) für 10 Minuten bei 37ºC behandelt. Nachfolgend wurden die Schnitte gewaschen in Wasser (1 Minute), 0,1 M Triethanolamin (pH 8,0, plus 0,25% Essigsäureanhydrid) für 10 Minuten und 2X SSC (0,3 mM NaCl, 0,03 mM Natriumcitrat, pH 7,2) für 5 Minuten unterzogen. Die Schnitte wurden dann dehydratisiert durch abgestufte Alkohole und luftgetrocknet. Nachfixierte Schnitte wurden mit 1,0 · 10&sup6; dpm [³&sup5;S]UTP-markierte Ribosonden in Hybridisierungspuffer hybridisiert, der 75% Formamid, 10% Dextransulphat, 3X SSC, 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,4), 1X Denhardt's Lösung, 0,1 mg/ml Hefe-tRNA und 10 mM Dithiothreitol in einem Gesamtvolumen von 30 ul enthielt. Die verdünnte Sonde wurde auf Schnitte auf einem Glasdeckglas aufgetragen und über Nacht bei 55ºC in einer feuchten Umgebung hybridisiert. Nach Hybridisierung wurden die Schnitte in 2X SSC für S Minuten gewaschen und dann mit RNase A (200 ug/ml in 10 mM Tris/HCl, pH 8,0, enthaltend 0,5 M NaCl) für 60 Minuten bei 37ºC behandelt. Nachfolgend wurden die Schnitte gewaschen in 2X SSC für 5 Minuten, 1X SSC für 5 Minuten, 0,1X SSC für 60 Minuten bei 70ºC, 0,5 · SSC bei Raumtemperatur für 5 Minuten und dann in abgestuften Alkoholen dehydratisiert und luftgetrocknet. Für Signaldetektion wurden die Schnitte auf Kodak Bio Max Röntgenfilm plaziert und für die erforderliche Zeitspanne exponiert oder in photographische Emulsion (Amersham LM-1) für Hochauflösungsanalyse eingetaucht. Autoradiogramme wurden analysiert unter Verwendung von automatisierter Bildanalyse (DAGE-Kamera/Mac II/IMAGE- Programm). Kurz gesagt, wurden interessierende anatomische Regionen interaktiv ausgewählt und mittlere optische Dichtemessungen bestimmt von wenigstens 3 koronalen Schnitten. Hintergrundsignal wurde bestimmt von einer Fläche des Schnittes, in der keine Markierung nachweisbar war. Eingetauchte Schnitte wurden unter einem Zeiss Axioskop untersucht.

B. Ergebnisse

1. CRF&sub2;-Sonden-Selektion: Wie in Fig. 1 veranschaulicht, wurde die CRF&sub2;-cRNA-Sonde, die in den vorliegenden Studien verwendet wurde, synthetisiert von einem 460 bp 5'- Fragment von CRF&sub2;-cDNA. Vorläufige in situ-Hybridisierungsstudien unter Verwendung von cRNA-Sonden, die den 3'-Anteil des Rezeptors enthalten (der eine hohe Homologie zum CRF&sub1;-Rezeptor trägt) lieferte eine anatomische Verteilung, die inkonsistent war mit der unter Verwendung von 5'-spezifischen Ribosonden erhaltenen. Das Markierungsmuster war jedoch konsistent sowohl mit CRF&sub1;- als auch CRF&sub2;-Rezeptor-nßlNA-Verteilung. Die hohe Sequenzhomologie zwischen CRF&sub1;- und CRF&sub2;-Rezeptoren macht somit die Notwendigkeit erforderlich, 5'-enthaltende Ribosonden für spezifische Hybridisierung von CRF&sub2;- oder CRF&sub1;-Rezeptor-Subtypen-mRNA zu verwenden.
2. Anatomische Verteilung: Die vergleichende anatomische Verteilung von CRF&sub2;- und CRF&sub1;-mRNA wurde bestimmt in benachbarten koronalen Gehirnschnitten. Tabelle II unten faßt die semi-quantitative Analyse der Daten zusammen.
Wie im horizontalen Schnitt veranschaulicht (Fig. 10), unterscheidet sich die Verteilung von CRF&sub2;-Rezeptor-mRNA deutlich von der von CRF&sub1; und weist ein bestimmtes sub-kortikales Muster auf. Während CRF&sub1;-mRNA-Expression in einem Bereich von telencephalen Strukturen hoch war, wies CRF&sub2;-Rezeptor-Expression ein mehr anatomisch spezifisches Muster auf, einschließlich der lateralen septalen Region (LS), des Bettnukleus der Stria terminalis (BNST), des amygdaloiden Gebietes und des olfaktorischen Bulbus (Fig. 11, Tabelle 1). Der Unterschied in den Expressionsmustern zwischen CRF-Rezeptor-Untertypen war besonders offensichtlich in der Septalregion: CRF&sub2;-mRNA-Expression war sehr hoch in den lateralen septalen Nuklei, aber sehr gering im medialen Septum, dem septalen Nukleus, wo CRF&sub1;- mRNA-Fülle am offensichtlichsten war (Fig. 11B). Die Verteilung von CRF&sub2;-RezeptormRNA innerhalb der LS war, jedoch, heterogen. Sehr hohe Expression war offensichtlich in sowohl dem Zwischennuklus als auch den ventralen Subnuklei mit nur einer gelegentlich markierten, in der dorsalen Subdivision offensichtlichen Zelle (Fig. 12). Sowohl in der Zwischen- als auch der ventralen Region der LS wies das Maß an CRF&sub2;-Rezeptorexpression einen offensichtlichen rostro-kausalen Gradienten auf, wobei ein geringerer Prozentsatz an markierten Zellen im kaudalen Aspekt beider Gebiete nachgewiesen wird. Bei diesem Titer waren auch einige verstreute CRF&sub2;-exprimierende Zellen offensichtlich in sowohl den vertikalen als auch horizontalen Extremitäten des diagonalen Bandes. Wiederum im Gegensatz zu den höheren Titern an CRF&sub1;-mRNA, die in diesen Regionen gefunden wurden (Fig. 11). Differenzielle Muster an CRF-Subtypen-Expression waren auch offensichtlich innerhalb des olfaktorischen Bulbus (Fig. 11A). Hier war die CRF&sub1;-Rezeptor-Expression besonders hoch in der inneren Granualzell- und Mitralzellschicht mit geringeren Titern, die in der externen Granulaschicht und im Ependym nachweisbar waren. Die meisten Zellen, die CRF&sub2;-Rezeptoren exprimierten, wurden jedoch im Ventrikel innerhalb des ependymalen Gebietes und der inneren Granulazellschicht (Fig. 11A) gefunden. Sowohl CRF&sub1;- als auch CRF&sub2;-Rezeptoren wurden auch in dem akzessorischen olfaktorischen Nukleus gefunden.
Sowohl CRF&sub2;- als auch CRF&sub1;-Rezeptor-mRNA-Expression war offensichtlich in den BNST, insbesondere im medialen Aspekt und dem Amygdale-Gebiet. Innerhalb des BNST schien die CRF&sub2;-Rezeptor-Expression in den Lateralregionen geringer, wo die größte Fülle an CRFexprimierenden Zellen gefunden wurde (Fig. 13A und B). CRF&sub2;-Rezeptor-Expression wurde in sowohl medialen als auch lateralen Einheiten des BNST gefunden (Fig. 13C). Innerhalb der Amygdale waren die höchsten Titer an CRF&sub2;-Rezeptorexpression in den cortikalen und medialen Amygdale-Nuklei evident, mit geringerer Expression im basolateralen Nukleus (Fig. 11C). In komplementärer Weise war die CRF&sub1;-Rezeptor-Expression sehr hoch in dem basolateralen Gebiet, aber gering in der cortikalen Amygdale (Fig. 14). Sowohl CRF&sub1;- als auch CRF&sub2;-Rezeptor-mRNA-Expression war nicht bemerkbar im zentralen Nukleus. Innerhalb der hippocampalen Formation waren CRF&sub2;-Rezeptoren im allgemeinen in geringen bis mäßigen Titern in Pyramidalzellen von CA-Unterfeldern und Granulazellen des dentaten Gyrus exprimiert. Es waren jedoch verteilte Zellen mit hohen Titern an CRF&sub2;-Expression in nicht-Granulazellschichten im ventralen dentaten Gyrus offensichtlich (Fig. 15). Die CRF&sub1; - Rezeptor-Expression war am ausgeprägtesten in der Pyramidalzellschicht von CA3/4 mit gemäßigten Titern offensichtlich in CA&sub1;. An CRF&sub1;-Rezeptor-Expression fehlte es augenscheinlich im dorsalen dentaten Gyrus (Fig. 15). Interessanterweise waren hohe Titer an CRF&sub1;- Expression im ventralen Hippocampus offensichtlich, verglichen mit dem dorsalen Aspekt (Fig. 11C und D). Man fand Zellen, die sowohl CRF&sub1; als auch CRF&sub2; exprimierten, überall im entorhinalen Cortex.
Die Verteilung von CRF&sub2;-Rezeptortranskripten in diencephalen Strukturen war hauptsächlich beschränkt auf den Hypothalamus, wo markierte Zellen in präoptischen, vorderen und tuberalen Regionen offensichtlich waren. Das Maß an CRF&sub2;-mRNA-Expression, die in den ventromedialen hypothalamischen Nuklei (VMH) gefunden wurde, war unter den am höchsten im Gehirn gefundenen (Fig. 16). Sowohl dorsale als auch ventrale Aspekte von VMH zeigten hohe Titer an CRF&sub2;-mRNA relativ zu anderen Gehirnregionen, obgleich CRF&sub2;-mRNA- Expression am augenscheinlichsten war im dorsomedialem Bezirk. Auf dieser Ebene war jedoch die CRF&sub1;-Rezeptor-Expression vorherrschend im dorsomedialen hypothalamischen Nukleus (DMH) lokalisiert mit nur einer beschränkten Anzahl von markierten Zellen im VMH. Im vorderen Hypothalamus war CRF&sub2;-mRNA lokalisiert in hochexprimierenden Zellen im supraoptischen Nukleus (SO) und medialen Gebieten des paraventrikulären Nukleus (PVN) (Fig. 17, Fig. 18). Innerhalb des PVN schien CRF&sub2;-mRNA in medialen parvozellulären Zellen exprimiert zu sein, teilweise zusammenfallend mit CRF-mRNA-Expression ( Fig. 10A). Dies eröffnet die interessante Möglichkeit, daß CRF&sub2;-Rezeptoren in diesem Nukleus als Autorezeptoren in ausgewählten Zellen wirken können. Sowohl im SO als auch im PVN war die Zahl an Zellen, die CRF&sub1;-mRNA exprimierten, extrem gering (Fig. 17, Fig. 18). Zellen, die CRF&sub2;-mRNA exprimierten, waren auch offensichtlich in den vorderen und lateralen hypothalamischen Gebieten, dem suprachiasmatischen Nukleus und dem medialen präoptischen Gebiet (MPA).
Im Mittelhirn waren CRF&sub2;-exprimierende Zellen offensichtlich innerhalb Nuklei, die biochemisch als Serotonin-enthaltende Nuklei charakterisiert sind. Stark hybridisierende Zellen waren angeordnet entlang der Mittellinie im dorsalen Raphen-Nukleus (DR), dem cäudalen linearen Nukleus und in den seitlichen Aspekten des Zentralgraus (Fig. 19). Ventraler war CRF&sub2;-Rezeptorexpression auch in der medialen Raphe (MR) und dem interpedunukläeren Nukleus (IPN) nachweisbar, insbesondere innerhalb des rostralen Subnukleus (Fig. 19). Mit der Ausnahme von IPN waren CRF&sub1;-Rezeptor-mRNA-Titer in all diesen Gebieten im allgemeinen niedrig. Auf dieser Ebene waren CRF&sub2;-exprimierende Zellen auch offensichtlich in Clustern in den lateralen und dorsalen Regionen des inneren Colliculus. Höhere Titer an CRF&sub1;-mRNA-Expression waren jedoch auch vorhanden im unteren Colliculus. Höhere Titer an CRF&sub1;-mRNA wurden auch in den visuell-rezeptiven Feldern des oberen Colliculus gefunden, wo die CRF&sub2;-Rezeptorexpression sehr gering war. Dieses differenzielle Expressionsmuster war wiederholt in anderen sensorischen Relay-Strukturen des Gehirnstamms. Somit war die CRF&sub2;-Rezeptorexpression auf einige wenige zerstreute Zellen in diesen Strukturen beschränkt (Tabelle 2), wohingegen das Maß an CRF&sub1;-Rezeptor-mRNA-Fülle in Tegmentum- Nuklei und sensorischen trigeminalen Gebieten hoch war. In ähnlicher Weise waren im Cerebellum CRF&sub1;-Rezeptor-mRNA-Titer sehr hoch in Purkinje- und Granula-Zellschichten, wohingegen CRF&sub2;-Rezeptor-mRNA in Granulazellen in sehr beschränkten Titern vorhanden war (Fig. 11E).
In nicht-neuronalen Strukturen war ein sehr hohes Maß an CRF&sub2;-Rezeptor-Expression offensichtlich im choroiden Plexus der dritten, vierten und lateralen Ventrikel (Fig. 20). Zusätzlich wiesen Cerebralarteriolen konsistent CRF&sub2;-mRNA in allen untersuchten Gehirnebenen auf (Fig. 21). CRF&sub1;-mRNA war nachweisbar nahe den Hintergrundtitern in diesen Strukturen. In der Hypophyse war CRF&sub1;-Expresssion nachweisbar sowohl im vorderen als auch dem Zwischenlobus mit besonders hoher Expression in Clustern innerhalb des vorderen Lobus (Fig. 22). Im vorderen Lobus war CRF&sub2;-Rezeptor-Expression nur in verstreuten Zellen nachweisbar (Fig. 22).

C. Diskussion

Die vorliegenden in situ-Hybridisierungsstudien zeigen an, daß wenigstens zwei CRF- Rezeptorsubtypen, CRF&sub1; und CRF&sub2;, im Säugetierrattengehirn exprimiert werden. Die heterogenen anatomischen Verteilungsmuster von CRF&sub1;- und CRF&sub2;-mRNA-Expression schlagen distinkte funktionelle Rollen für jeden Rezeptor in CRFverwandten CNS-Schaltkreisen vor. Während CRF&sub1;-Rezeptorexpression am reichhaltigsten war in neocortikalen, cerebellaren und sensorischen Relais-Strukturen, war CRF&sub2;-Rezeptor-Expression im allgemeinen lokalisiert in spezifischen sub-kortikalen Strukturen, einschließlich dem lateralem Septum und verschiedenen hypotalamischen Nuklei.
Im Vorderhirn wurden die höchsten Titer an CRF&sub2;-Rezeptor-Expression in lateralen septalen Nuklei gefunden. Das laterale Septum, dank weit verstreuter reziproker Verbindungen innerhalb des Gehirns, ist beteiligt an einer Vielzahl von physiologischen Prozessen, die von höheren kognitiven Funktionen wie Lernen und Gedächnis bis zu autonomer Regulation einschließlich Futter- und Wasseraufnahme, reichen. Zusätzlich spielt das Septum eine zentrale Rolle bei klassischen limbischen Schaltkreisen und ist somit wichtig bei einer Vielzahl von emotionalen Zuständen, einschließlich Angst und Aggression. Die lateralen septalen Nuklei erhalten CRF-enthaltende Afferenzen von rostralen hypothalamischen Regionen, insbesondere dem vorderen hypothalamischen Gebiet (Sakanaka et al., j. Comp. Neurol. 270: 404-415, 1988). Interessanterweise findet man die Mehrheit dieser CRF-ähnlichen immunreaktiven Fasern in den lateralsten Aspekten des LSV und im LSI (Sakanaka et al., J. Comp. Neurol. 270: 404-415, 1988), wobei septale Sub-Nuklei die höchsten Titer an CRF&sub2;-Rezeptor-mRNA aufweisen (Fig. 12). Der Mangel an CRF&sub1;-Rezeptor-Expression in diesen Nuklei schlägt vor, daß CRF&sub2;-Rezeptoren alleine die postsynaptischen Wirkungen von CRF-Inputs zu dieser Region vermitteln. Die hauptsächlichen GABA-ergischen Neuronen des lateralen Septums sehen inhibitorischen Input zu hypothalamischen Regionen vor, ebenso wie Amygdale-Nuklei (Jakab et al., 1991, Calbindin-containing somatospiny neurons of the rat lateral septal area project to the medial amygdala and the anterior hypothalamus, Third IBRO World Congress Neuroscience Abstracts, 324) und erhalten exzitatorischen glutamaterischen Input aus der hippocampalen Formation (Joels und Urban, Experimental Brain Research 54: 455-462, 1984). Das laterale Septum wirkt somit sowohl als ein Integrator von limbischen Schaltkreisen als auch als ein Interface zwischen telencephalen und diencephalen Gebieten. Das hohe Maß an CRF&sub2;-Rezeptor-Expression in diesem Gebiet zeigt an, daß CRF&sub2;-Rezeptoren limbische Schaltkreise auf der Ebene septaler Aktivität modulieren.
In Übereinstimmung mit früheren in situ-Hybridisierungsstudien (Potter et al., Proceedings of the National Academy of Sciences 91: 8777-8781, 1994) wurde ein allgemeiner Mangel an CRF&sub1;-Rezeptorexpression in hypothalamischen Nuklei festgestellt. Aus den vorliegenden Studien ist klar, daß CRF&sub2;-Rezeptor-mRNA innerhalb des rostro-caudalen Umfanges des Hypothalamus offensichtlich war, wohingegen die CRF&sub1; -Rezeptor-Expression beschränkt war.
Der Unterschied hinsichtlich des Maßes an CRF-Rezeptor-Subtyp-Expression war besonders augenscheinlich im paraventrikulären Nukleus, wo CRF&sub2;-Rezeptor-Expression leicht nachweisbar war, wohingegen CRF&sub1;-Rezeptor-mRNA nur in verstreuten Zellen vorhanden war. Die Verteilung von Zellen, die CRF&sub2;-Rezeptor-mRNA exprimierten, innerhalb des PVN stimmt überein mit der zellulären Verteilung von CRF-mRNA (Fig. 18), was eine Autorezeptor-Rolle für CRF&sub2;-Rezeptoren in diesem Nukleus anzeigt. Die CRF-Neuronen des PVN spielen eine klassische hypophysiotrope Rolle beim Kontrollieren von ACTH-Freisetzung aus der vorderen Hypophyse (Wiegand und Price, J. Comp. Neurol. 192: 1-19, 1980) und sind als solche zentral für die Kontrolle des Hypothalamo-Hypophysen-Nebennieren-Systems bei Säugetieren. Zusätzlich zu dieser mit der Streß-Achse in Beziehung stehenden Rolle projizieren Unterpopulationen von PVN-CRF-Neuronen, insbesondere innerhalb der dorsalen parvozellulären Region und ventralen Aspekt der medialen parvozellulären Region (mpv), zu autonomen Zellgruppen im Gehirnstamm und im Rückenmark (Sawchenko, Brain Res. 437, 1987). Somit schlägt das hohe Maß an CRF&sub2;-Rezeptor-Expression eine präsynaptische Rolle für CRF&sub2;-Rezeptoren beim Modulieren von autonom-verwandten CRF-Projektions-Neuronen vor.
Eine selektive Expression von CRF&sub2;-Rezeptor-mRNA war auch offensichtlich in den magnozellulären neurosekretorischen Neuronen des supraoptischen Nukleus. Mit Blick auf die mutmaßlich Verbindung von CRF&sub2;-Rezeptor-Expression mit CRF-Neuronen im PVN ist beachtlich, daß eine Untergruppe von SO-Neuronen auch CRF synthetisiert (Kawata et al., Cell Tissue Research 230: 239-246, 1983). Die Anwesenheit von CRF&sub2;-Rezeptoren in sowohl SO- als auch PVN-Neuronen zeigt an, daß diese Stellen so wirken können, daß sie hypothalamischen Input zu sowohl der vorderen als auch hinteren Hypophyse beeinflussen können. Innerhalb der Hypophyse jedoch herrscht CRF&sub1;-Rezeptor-Expression gegenüber CRF&sub2;-Expression sowohl in den intermediären als auch den vorderen Loben vor. CRF&sub2;-Rezeptoren können somit, in Begrifflichkeiten von HPA-Achsenaktivität, CRF-Wirkungen auf der Ebene des Hypothalamus vermitteln, wohingegen CRF&sub1;-Rezeptoren verantwortlich sind für CRF-induzierte Änderungen in der ACTH-Freisetzung in Hypophysencorticotropen.
Innerhalb des caudalen Hypothalamus weisen CRF&sub1;- und CRF&sub2;-Rezeptoren wechselseitig exklusive Muster von mRNA-Verteilung auf: CRF&sub1;-Rezeptor-mRNA ist reichlich vorhanden im dorsomedialen Nukleus, aber gering vorhanden innerhalb des VMH, wohingegen CRF&sub2;- Rezeptor-mRNA-Expression sehr hoch war innerhalb des VMH, aber nicht nachweisbar innerhalb des DMH. CRF-enthaltende Fasern, die aus der corticomedialen Amygdale und dem Subikulum ihren Ursprung nehmen, enden innerhalb des VMH (Sakanaka et al., Brain Res. 382: 213-238, 1986). Afferenzen aus dem VMH wiederum innervieren das Septum, BNST und die Amygdale, ebenso wie Gehirnstammregionen (Simerly, R. B., Anatomical substrates of hypothalamic integration. In: The Rat Nervous System (Paxinos, G., Hrsg.), S. 353-376, Academic Press, 1995). Mikroinjektion von CRF in den VMH ist verbunden mit Änderungen sowohl im autonomen Ausfluß als auch in der gastrointestinalen Funktion (Brown und Fisher, Regulation of the autonomic nervous system by corticotropin-releasing factor. In: Corticotropin-releasing factor: Basic and clinical studies of a neuropeptide (De Souza, E. B., Nemeroff, C. B., Hrsg.), S. 291-298, Boca Raton, FL, CRC Press, Inc., 1990; Tache et al., CRF: Central nervous system action to influence gastrointestinal function and role in the gastrointestinal response to stress. In: Corticotropin-releasing factor: Basic and clinical studies of a neuropeptide (De Souza, E. B., Nemeroff, C. B., Hrsg.), S. 299-308, Boca Raton, FL, CRC Press, Inc., 1990). Das hohe Maß an CRF&sub2;-Rezeptor-Expression im VMH impliziert diesen CRF- Rezeptoruntertyp als einen terminalen oder somato-dendritischen Regulator dieser mit CRFverwandten physiologischen Funktionen. Darüber hinaus kann Dysregulierung von CRF&sub2;- Rezeptoren in diesem Lokus, oder dem PVN, teilhaben an der vorgeschlagenen Rolle von zentralen CRF-Systemen bei der Entwicklung von Fettleibigkeit/Appetit-verringernden Syndromen (Krahn und Gosnell, Psychiatric Medicine 7: 235-245, 1989).
Zusätzlich zur CRF-Beteiligung bei der Entwicklung von Eßstörungen existiert ein hohes Maß an Belegen dafür, daß diese Neuropeptide bei der Pathophysiologie von affektiven Erkrankungen wie Angst und Depression beteiligt sind. Zum Beispiel produziert CRF, der in den Locus coeruleus von Nagern injiziert wurde, eine anxiogene Antwort, während man gezeigt hat, daß Benzodiazepin-angstlösende Mittel CRF-Konzentration im selben Nukleus verringern (Owens et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 258: 349-356, 1991). In klinischen Studien betreffend starke Depression hat man gefunden, daß Patienten Zeichen von CRF- Hypersekretion aufweisen, einschließlich: erhöhte CRF-Konzentrationen in CSF, erhöhte HPA-Aktivität, eine abgestumpfte ACTH-Antwort auf CRF und Hypophysen- und Nebennierenhypertrophy (Owens und Nemeroff, The role of corticotropin-releasing factor in the pathophysiology of affective and anxiety disorders: laboratory and clinical studies. In: Corticotropin-Releasing Factor (Chadwick, D. J. Marsh, J., Ackrill, K., Hrsg.) S. 296-316, John Wiley and Sons, 1993). Mit Blick auf die stimulierende Rolle von CRF bei HPA-Aktivität bleibt es möglich, daß die bei Depression beobachtete Hypercortisolemi aus einem erhöhten zentralen CRF-Antrieb resultiert. Die Möglichkeit, daß die Hyperaktivität von Gehirn-CRF- Schaltkreisen zur Symptomatologie von depressiver Erkrankung beiträgt, wird gestützt durch präklinische Studien sowohl an Nagetieren als auch nicht-menschlichen Primaten. Bei beiden Spezies produziert die zentrale Verabreichung von CRF ein Spektrum an Verhaltensantworten, die an depressive Erkrankung beim Menschen erinnern (Koob und Britton, Behavioral effects of corticotropin-releasing factor. In: Corticotropin-releasing factor: Basic and clinical studies neuropeptide (De Souza, E. B., Nemeroff, C. B., Hrsg.), Boca Raton, FL, CRC Press, Inc., 1990; Kalin, Behavioral and endocrine studies of corticotropin-releasing hormone in primates. In: Corticotropin-releasing factor: Basic and clinical studies of a neuropeptide (De Souza, E. B., Nemeroff, C. B., Hrsg.), S. 275-290, Boca Raton, FL, CRC Press, Inc., 1990).
Während die speziellen zugrundeliegenden Mechanismen, durch die CRF derartige Verhaltensantworten hervorruft weithin undefiniert bleiben, ist es wahrscheinlich, daß die Modulierung von limbischen Schaltkreisen im Gehirn und die Beteilung spezifischer Populationen von CRF-Neuronen beteiligt sind (Rainnie et al., J. Pharm. Exp. Therap. 263: 846-858, 1992).
In dieser Hinsicht sieht die vorliegende Studie eine anatomische Grundlage für die Beteiligung von sowohl CRF&sub1;- als auch CRF&sub2;-Rezeptoren bei der Vermittlung limbischer CRF- Wirkungen vor. Während der CRF&sub2;-Rezeptor als der vorherrschende hypothalamische CRF- Rezeptor betrachtet werden kann, wurden CRF&sub1;- und CRF&sub2;-Rezeptoren in klassischen limbischen Strukturen lokalisiert, wie dem amygdaloiden Komplex, dem Hippocampus und den septalen Nuklei.
Zusätzlich zu neuroendokrinen Abnormitäten zeigt eine überzeugende Menge an Daten Dysfunktion bei zentraler serotonergischer Aktivität bei depressiver Erkrankung an. Aus post mortem Studien ist klar, daß der Serotoninmetabolismus und spezifische Rezeptorsubtypen in einigen Gehirnregionen bei deprimierten Patienten geändert sind (Meltzer, Br. J. Psychiat. 155: 25-31, 1989; Yates et al., Psychiatry 27: 489-496, 1990). Wirkstoffe, die den Serotoninmetabolismus inhibieren, die Serotoninaufnahme von der Synapse inhibieren oder dahingehend wirken, daß sie direkt Serotonin-Rezeptoren stimulieren, sind alle wirksame Antidepressiva (Peroutka und Snyder, Science 210: 88-90, 1980; Traber und Glaser, Trends Pharmacol. Sci 8: 432-437, 1987). Da somit sowohl das HPA-Achsen- als auch das serotonerge System bei affektiver Erkrankung eine Rolle spielen, ist es wahrscheinlich, daß Wechselwirkungen zwischen diesen beiden Systemen für die Pathophysiologie und Pharmakotheraphie von Depression relevant sein können (Chalmers et al., Clin. Neurosci. 1: 122-128, 1993). In diesem Zusammenhang zeigen die vorliegenden Daten eine selektive Expression von CRF&sub2;-RezeptormRNA in serotonergischen Zellkörpernuklei im Mittelhirn an. Sowohl dorsale als auch mediane Raphenuclei weisen CRF&sub2;-mRNA auf, ebenso Zellen in serotonin-assoziierten Regionen des interpeduncularen Nukleus und der zentralen grauen Substanz (Fig. 19). Da die Raphenuclei CRF-ergischen Input von Vorderhimregionen erhalten (Sawchenko und Swanson, Organization of CRF immunoreactive cells and fibers in the rat brain: immunohistochemical studies. In: Corticotropin-releasing factor: Basic and clinical studies of a neuropeptide (De Souza, E. B., Nemeroff, C. B., Hrsg.), S. 29-52, Boca Raton, FL, CRC Press Inc., 1990), ist es wahrscheinlich, daß eine jegliche CRF-induzierte Modulierung von serotonergischer Aktivität durch CRF&sub2;-Rezeptor vermittelt ist. Eine derartige Wechselwirkung sieht eine anatomische und biochemische Basis vor für die zentrale, mit "Streß" im Zusammenhang stehende Modulierung von serotonergischer Funktion und eine Grundlage für Theorien von Streßinduzierten affektiven Erkrankungen.
Zusätzlich zu neuronaler Lokalisierung zeigt die vorliegende Studie auch ein hohes Maß an CRF&sub2;-Rezeptor-Expression sowohl im choroiden Plexus als auch in den zerebralen Arteriolen an. Die Anwesenheit von Signal in beiden Strukturen kann ein Anzeichen für eine Endothelzellenlokalisation sein. Die bei der vorliegenden Studie verwendete CRF&sub2;-cRNA-Sonde differenziert nicht zwischen zwei offensichtlichen Splice-Formen des CRF&sub2;-Rezeptors, CRF2α und CRFzp (Lovenberg et al., Proc. Natl. Acad Sci USA 92: 836-840, 1995). Vorläufige Daten zeigen jedoch an, daß die CRF2β-Form des Rezeptors in Blutgefäßen vorherrschen kann. Interessanterweise wird der CRF2β-auch in peripheren Geweben wie Herz, Lunge und Skelettmuskel exprimiert, wo er dahingehend wirken kann, daß er vaskuläre Wirkungen von CRF vermittelt.
Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß eine differenzielle zelluläre Verteilung von CRF&sub2;- und CRF&sub1;-Rezeptor-RNA im Gehirn und der Hypophyse von der Ratte identifiziert worden ist. Diese Verteilung schlägt vor, daß der CRF&sub1;-Rezeptor der primäre neuroendokrine Hypophysen-CRF-Rezeptor ist und eine vorherrschende Rolle bei den kortikalen, cerebellaren und sensorischen Rollen von CRF im Gehirn spielt. Die regionale anatomische Verteilung von CRF&sub2;-Rezeptor-mRNA schlägt eine Rolle für diesen Rezeptor hinsichtlich hypothalamischer endokriner, autonomer und Verhaltenshandlungen von Gehirn-CRF vor. Die Anwesenheit von CRF&sub2;-Rezeptor-mRNA im hypothalamischen PVN und medialen und kortikalen amygdaloiden Regionen kann eine Autorezeptor-Rolle für diese Stelle in ausgewählten Schaltkreisen anzeigen.
Tabelle II
Semiquantative Bewertung der CRF&sub1;- und CRF&sub2;-Rezeptor-mRNA-Verteilung im Gehirn und der Hypophyse der Ratte
Die Menge an CRF&sub1;- und CRF&sub2;-mRNA wurde für jede anatomische Region aus optische Dichtemessungen bestimmt. Dichtewerte für jeden Parameter werden dargestellt entsprechend ihren entsprechenden prozentualen Verteilungen: ++++ (> 75%), sehr dicht; +++ (< 75%, > 50%), dicht; ++ (< 50%, > 25%), moderat; + (< 25%, > 10%), gering; -/+ (< 10%), verstreute Zellen.
SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER: Lovenberg, Timothy W.
Oltersdorf, Tilman
Liaw, Chen
Grigoriadis, Dimitri E.
Chalmers, Derek T.
DeSouza, Errol B.
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: CORTICOTROPIN- FREISETZUNGS-FAKTOR2-REZEPTOREN
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 8
(iv) KORRESPONDENZ-ADRESSE:
(A) ADRESSAT: SEED and BERRY
(B) STRASSE: 6300 Columbia Center, 701 Fifth Avenue
(C) STADT: Seattle
(D) STAAT: Washington
(E) LAND: USA
(F): 98104-7092
(v) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
(A): DATENTRÄGER: DISKETTE
(B) COMPUTER: IBM-PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release # 1.0, Version #1.25
(vi) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER:
(B) ANMELDETAG:
(C) KLASSIFIZIERUNG:
(viii) ANGABEN ZUM ANWALT/VERTRETER
(A) NAME: Mc Masters, David D.
(B) REGISTRIERNUMMER: 33,963
(C) REFERENZ/AKTENZEICHEN: 690068.401PC
(ix) INFORMATON ZUR TELEKOMMUNIKATION
(A) TELEFON: (206) 622-4900
(B) TELEFAX: (206) 682-6031
(C) TELEX: 3723836 SEEDANDBERRY
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN
(A) LÄNGE: 1514 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 44..1336
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN
(A) LÄNGE: 431 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1626 Basepaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 216..1449
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN
(A) LÄNGE: 411 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 50 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5.
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 51Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1468 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..1233
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 411 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:

Claims

1. Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das einen CRF&sub2;-Rezeptor codiert, wobei besagter CRF&sub2;-Rezeptor codiert wird durch:

(a) eine Nukleinsäuresequenz mit der codierenden Region einer der Sequenzen mit den Sequence I.D. Nos. 1, 3 oder 7 oder ein Derivat davon mit mehr als 80% Homologie mit besagter codierenden Region;

(b) eine Nukleinsäuresequenz, die unter Bedingungen hoher Stringenz an eine zu einer die codierende Region einer der Sequence I.D. Nos. 1, 3 oder 7 aufweisende Nukleinsäuresequenz komplementäre Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren in der Lage ist; oder

(c) Nukleinsäuresequenzen, die als ein Ergebnis des genetischen Codes für CRF&sub2;-Rezeptoren, die durch eine in (a) oder (b) definierte Nukleinsäuresequenz codiert sind, degeneriert sind.

2. Das isolierte Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, das die Nukleotidsequenz in Sequence I.D. No. 3 umfaßt, von Nukleotid Nr. 216 bis Nukleotid Nr. 1.448.

3. Das isolierte Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei besagtes Molekül ein Protein mit der Aminosäuresequenz von Sequence I.D. No. 4 codiert, von Aminosäure Nr. 1 bis Aminosäure Nr. 411.

4. Das isolierte Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei besagtes Molekül einen Ratten- CRF&sub2;-Rezeptor codiert.

5. Das isolierte Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei besagtes Molekül einen menschlichen CRF&sub2;-Rezeptor codiert.

6. Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das eine N-terminale extrazelluläre CRF&sub2;.-Domäne codiert, wobei besagte N-terminale extrazelluläre CRF&sub2;-Domäne codiert wird durch:

(a) eine Nukleinsäuresequenz mit der codierenden Region der N-terminalen extrazellulären Domäne, die durch Nukleotid Nr. 44 bis Nukleotid Nr. 457 von Sequence I.D. No. 1, Nukleotid Nr. 216 bis Nukleotid Nr. 569 von Sequence I.D. No. 3 oder die äquivalente Region von Sequence I.D. No. 7 definiert ist, oder ein Derivat davon mit mehr als 70% Homologie mit besagter codierenden Region;

(b) eine Nukleinsäuresequenz, die unter Bedingungen hoher Stringenz an eine zu (a) komplementäre Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren in der Lage ist; oder

7. Das isolierte Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 6, das die Nukleotidsequenz in Sequence I.D. No. 3 umfaßt, von Nukleotid Nr. 216 bis Nukleotid Nr. 569.

8. Das isolierte Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 6, wobei besagtes Molekül ein Protein mit der Aminosäuresequenz von Sequence I.D. No. 4 codiert, von Aminosäure Nr. 1 bis Aminosäure Nr. 118.

9. Ein rekombinanter Expressionsvektor, der einen operabel mit einem Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 8 verknüpften Promotor umfaßt.

10. Ein rekombinanter viraler Vektor, der in der Lage ist, die Expression eines Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zu steuern, wobei besagter viraler Vektor ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus retroviralen Vektoren, adenoviralen Vektoren und Herpes-simplex-Virus-Vektoren besteht.

11. Eine Wirtszelle, die einen rekombinanten Expressionsvektor nach Anspruch 9 oder 10 enthält.

12. Ein isolierter CRF&sub2;-Rezeptor oder eine Variante davon, codiert durch eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1.

13. Der isolierte CRF&sub2;-Rezeptor nach Anspruch 12, mit der Aminosäuresequenz von Sequence I.D. No. 4, von Aminosäure Nr. 1 bis Aminosäure Nr. 411.

14. Eine isolierte N-terminale extrazelluläre CRF&sub2;-Rezeptor-Domäne oder Variante davon, codiert durch eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 6.

15. Der isolierte CRF&sub2;-Rezeptor nach Anspruch 14, mit der Aminosäuresequenz von Sequence I.D. No. 4, von Aminosäure Nr. 1 bis Aminosäure Nr. 118.

16. Ein isolierter Antikörper, der zur spezifischen Bindung an einen CRF&sub2;-Rezeptor oder eine Variante davon, codiert durch eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1, in der Lage ist.

17. Ein isolierter Antikörper, der zur spezifischen Bindung an eine N-terminale extrazelluläre CRF&sub2;-Rezeptor-Domäne, codiert durch eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 6, in der Lage ist.

18. Der Antikörper nach Anspruch 16 oder 17, wobei besagter Antikörper ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus monoklonalen Antikörpern und Antikörperfragmenten besteht.

19. Der Antikörper nach Anspruch 16 oder 17, wobei besagter Antikörper ein polyklonaler Antikörper ist.

20. Der Antikörper nach Anspruch 16 oder 17, wobei besagter Antikörper in der Lage ist, die Bindung von CRF an einen CRF&sub2;-Rezeptor zu blockieren.

21. Der Antikörper nach Anspruch 16 oder 17, wobei besagter Antikörper ein muriner Antikörper ist.

22. Der Antikörper nach Anspruch 16 oder 17, wobei besagter Antikörper ein menschlicher Antikörper ist.

23. Ein Hybridom, das einen Antikörper nach einem der Ansprüche 16 bis 18 und 20 bis 22 produziert.

24. Eine Nukleinsäuresonde aus wenigstens 18 Nukleotiden in der Länge, die in der Lage ist, spezifisch an (a) eine Nukleinsäuresequenz, die einen CRF&sub2;-Rezeptor codiert, nach Anspruch 1, oder (b) eine Nukleinsäuresequenz, die komplementär zu einer Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 ist, unter Bedingungen mäßiger oder hoher Stringenz zu hybridisieren, aber nicht an CRF-Rezeptor-Nukleinsäuren, deren Sequenzen bei der Gen Bank-Datenbank eingereicht worden sind (Zugangsnummern L23332, L23333 bzw. L24096) und bei der EMBL Data Library (Zugangsnummern X72305 bzw. X72304) und nicht an die in Fig. 1 von EP-A- 695802 dargestellte Nukleinsäuresequenz.

25. Die Nukleinsäuresonde nach Anspruch 24, die außerdem eine Markierung umfaßt.

26. Die Nukleinsäuresonde nach Anspruch 25, wobei besagte Markierung ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus radioaktiven Markierungen, fluoreszierenden Markierungen, enzymatischen Markierungen und chromogenen Markierungen besteht.

27. Ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins einer Verbindung, die an einen CRF&sub2;- Rezeptor bindet, welches umfaßt:

(a) Daß eine oder mehrere Verbindungen Zellen oder Zellmembranen, die CRF&sub2;-Rezeptoren exprimieren, die durch eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 codiert werden, unter Bedingungen und für eine Zeit ausgesetzt werden, die ausreichend sind, um die Bindung besagter Verbindungen an besagte Rezeptoren zu ermöglichen; und

(b) daß Verbindungen, die an besagte Rezeptoren binden, isoliert werden, so daß das Vorhandensein einer Verbindung, die an einen CRF&sub2;-Rezeptor bindet, nachgewiesen werden kann.

28. Ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins einer Verbindung, die an einen CRF&sub2;- Rezeptor bindet, welches umfaßt:

(a) daß eine oder mehrere Verbindungen einer N-terminalen extrazellulären CRF&sub2;-Rezeptor- Domäne, die durch eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 6 codiert wird, unter Bedingungen und für einen Zeitraum ausgesetzt werden, die ausreichend sind, um dießindung einer Verbindung an die N-terminale extrazelluläre Domäne zu ermöglichen; und

(b) daß Verbindungen, die an besagte N-terminale extrazelluläre CRF&sub2;-Rezeptor-Domäne binden, isoliert werden, so daß das Vorhandensein einer Verbindung, die an einen CRF&sub2;- Rezeptor bindet, nachgewiesen werden kann.

29. Das Verfahren nach Anspruch 28, wobei besagte Verbindungen mit einem Agens markiert werden, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus fluoreszierenden Molekülen, Enzymen und Radionukliden besteht.

30. Ein Verfahren zum Bestimmen, ob eine ausgewählte Verbindung ein CRF&sub2;- Rezeptoragonist oder -antagonist ist, welches umfaßt:

(a) daß eine ausgewählte Verbindung Zellen, die CRF&sub2;-Rezeptoren, die durch eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 codiert werden, exprimieren, unter Bedingungen und für einen Zeitraum ausgesetzt wird, die ausreichend sind, um die Bindung der Verbindung und eine assoziierte Reaktion durch einen Reaktionsweg zu ermöglichen; und

(b) daß entweder eine Zunahme oder Abnahme der Aktivität des Reaktionsweges nachgewiesen wird, verglichen mit der Aktivität des Reaktionsweges vor Schritt (a), und dadurch bestimmt wird, ob besagte ausgewählte Verbindung ein CRF&sub2;-Rezeptoragonist oder -antagonist ist.

31. Ein Verfahren nach Anspruch 30, das weiter den Schritt umfaßt, daß Verbindungen isoliert werden, die die Aktivität des Reaktionsweges entweder erhöhen oder verringern, so daß das Vorhandensein eines CRF&sub2;-Rezeptoragonisten oder -antagonisten nachgewiesen werden kann.

32. Das Verfahren nach Anspruch 30, wobei der Nachweisschritt umfaßt, daß eine Verringerung in der Aktivität des Reaktionsweges nachgewiesen wird, die aus der Bindung der Verbindung an den CRF&sub2;-Rezeptor resultiert, relativ zur Stimulation des Reaktionsweges durch den CRF&sub2;-Rezeptoragonisten allein, und daß daraus das Vorhandensein eines CRF&sub2;- Antagonisten bestimmt wird.

33. Das Verfahren nach Anspruch 30, wobei der Nachweisschritt umfaßt, daß eine Zunahme in der Aktivität des Reaktionsweges nachgewiesen wird, die aus der Bindung der Verbindung an den CRF&sub2;-Rezeptor resultiert, und daß daraus das Vorhandensein eines CRF&sub2;- Rezeptoragonisten bestimmt wird.

34. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 33, wobei besagter Reaktionsweg der Adenylatcyclase-Reaktionsweg ist.

35. Verwendung eines CRF&sub2;-Rezeptorantagonisten zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer mit CRF&sub2;-Rezeptor assoziierten Erkrankung durch Verhinderung oder Verringerung der Stimulation eines CRF&sub2;-Rezeptor Reaktionsweges, wobei die Erkrankung eine zerebrovaskuläre Erkrankung ist und wobei besagter CRF&sub2;-Rezeptor durch eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 codiert wird.

36. Verwendung eines CRF&sub2;-Rezeptorantagonisten nach Anspruch 35, wobei besagte zerebrovaskuläre Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Schlaganfall, Reperfusionsverletzung und Migränen besteht.

37. Verwendung eines CRF&sub2;-Rezeptorantagonisten zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer mit CRF&sub2;-Rezeptor assoziierten Erkrankung durch Verhinderung oder Verringerung der Stimulation eines CRF&sub2;-Rezeptor Reaktionsweges, wobei die Erkrankung eine Lern- oder Gedächtnisstörung ist und wobei besagter CRF&sub2;-Rezeptor durch eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 codiert wird.

38. Verwendung eines CRF&sub2;-Rezeptorantagonisten zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer mit CRF&sub2;-Rezeptor assoziierten Erkrankung durch Verhinderung oder Verringerung der Stimulation eines CRF&sub2;-Rezeptor Reaktionsweges, wobei die Erkrankung Alzheimersche Krankheit ist und wobei besagter CRF&sub2;-Rezeptor durch eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 codiert wird.

39. Verwendung des CRF&sub2;-Rezeptorantagonisten nach einem der Ansprüche 35 bis 38, wobei besagter Antagonist α-helicaler oCRF(9-41) oder d-Phe-r/h-CRF(12-41) ist.

40. Verwendung eines CRF&sub2;-Rezeptors zur Herstellung eines Arzneimittels zur Modulation des Stoffwechsels und/oder der Sättigung, wobei besagter CRF&sub2;-Rezeptor durch eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 codiert wird.

41. Verwendung eines CRF&sub2;-Rezeptorantagonisten für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Anorexia nervosa, wobei besagter CRF&sub2;-Rezeptor durch eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 codiert wird.