CN1057775C - 具有抗血栓活性的肽及其制法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通过让具有抑制von Willebrand因子与血小板结合的活性的、得自蛇毒的多聚肽与蛋白质变性剂、谷胱甘肽和/或半胱氨酸共存，在使构成上述多聚肽的肽链的肽链内二硫键基本上获得保存的情况下，将肽链间的二硫键切断，而获得在活体内能显示上述活性的，在最小给药量下基本上不会造成血小板减少的肽。上述肽，其变异体或其一部分，是通过利用将其编码的基因的遗传工程技术制造的。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有抗血栓活性的肽及其制法，以及含有该肽的医药组合物，具体地说，涉及一种在活体内不会造成血小板减少的，得自蛇毒的肽。
背景技术
众所周知，以心肌梗塞、脑血栓为首的所谓血栓症的发病，与血小板有密切关系(“血小板”；山中、山崎编；医学书院，P158-163(1991))。近年来，就被视为导致这种血栓症的初期反应的血小板在血管内皮下组织的粘着而言，已有人指出，血中蛋白质之一的von Willebrand因子与血小板表面上的糖蛋白质Ib的结合是重要的(J.P.Cean等人，J.Lab.Clin.Med.，87，586-596(1976))。
这两种蛋白质的结合在一般状态下不会发生，已知，只有在活体内处在高剪切应力的状态下才会发生(T.T.Vincent等人，Blood，65，823-831(1985))。此外，作为在活体外观察这种结合的方法，使用抗生素瑞斯托菌素(ristocetin)(M.A.Howard，B.G.Firkin，Thromb.Haemostasis，26，362-369(1971))、得自蛇毒的蛋白质botrocetin(M.S.Read等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，75，4514～4518(1978))等物质的方法，已被广泛使用。把这些物质添加到血小板悬浮液中会引起血小板凝集，但这种凝集取决于von Willebrand因子与糖蛋白质Ib的结合(上述M.A.Howard，B.G.Firkin，M.S.Read等人)。
对于由上述瑞斯托菌素或bortocetin所造成的血小板凝集能显示抑制作用的若干种化合物，已有人报告。例如，已知有金精三羧酸(M.D.Phillips等人，Blood，72，1989-1903(1988))、芳香族脒基化合物等色素物质(J.D.Geratz等人，Thromb.Haemostasis，39，411-425(1978))，以及von Willebrand因子或糖蛋白质Ib的部分片段肽等(Y.Fujimura等人，J.Biol.Chem.261，381-385(1986)，K.Titani等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，84，5610-5614(1987))。
此外，已有人报告从蛇毒中也可获得同样具有血小板凝集抑制活性的肽，WO 9208472号国际公开手册中记载，响尾蛇(Crotalus horridus horridus)蛇毒及Cerastes cerastes蛇毒都有由至少N末端氨基酸序列同源性高、分子量约为25千道尔顿的两条不同的链构成的肽。Peng等人(M.Peng等人，Blood，81，2321-2328(1993))也报告，得自小蝰蛇(Echis carinatus)的血小板凝集抑制肽，在离体活性、分子量等方面也与上述肽非常类似。这些得自蛇毒的血小板凝集抑制肽，在离体试验中，均能以2-5μg/ml以下的低浓度抑制瑞斯托菌素或botrocetin所引起的血小板凝集。
在WO 9208472号国际公开手册中，并未提到动物给药时的抗血栓性。因此，如本发明书的实施例1所示，发明人考虑了该手册中所记载的得自响尾蛇(Crotalus horridushorridus)蛇毒的肽的纯化法，并对与所记载的肽具有同源性质的肽进行纯化，探讨了其对给药时的作用。结果观察到，在100μg/kg这样少量的给药时，血液中的血小板就几乎完全消失。然而，WO 9208472号国际公开手册中，并未指出对动物给药时存在的这一问题及其解决办法。
此外，Peng等人从小蝰蛇(Echis carinatus)蛇毒得到的肽，也是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的分子量在非还原条件下约为26千道尔顿而在还原条件下约为14千道尔顿及约16千道尔顿的两种肽，因此可以推断是与上述得自响尾蛇(Crotalus horridus horridus)蛇毒的肽相同，但据报告，在这种肽对动物给药时也观察到显著的血小板减少(M.Peng等人，Blood，81，2321-2328(1993))。
得自蛇毒、可抑制von Willebrand因子与血小板结合的肽，其氨基酸序列的同源性均高，分子量也非常类似，由上述结果可推论这些肽兼备有在活体内引起血小板减少的活性。亦即，这些肽在离体试验中虽可以低浓度抑制vonWillebrand因子与血小板结合，但是，却难以用来作为对活体给药的抗血栓药。本发明人，就引起血小板减少的机制进行如下考虑。
能以低浓度抑制瑞斯托菌素、botrocetin所引起的血小板凝集的、得自蛇毒的肽的氨基酸序列，在诸如WO 9208472号国际公开手册中已有记述。根据这一氨基酸序列，这种得自蛇毒的肽与Drickamer等人所报告的具有钙依赖性植物血凝素活性的肽(称为C型植物血凝素)(K.Drickamer，J.Biol.Chem.，263，9557-9560(1988))保持大致相同的半胱氨酸残基位置，以及据信是植物血凝素活性所必需的共同序列的一部分(W.I.Weis等人，Science，254，1608-1615(1991))。
除以上外，还有从Botrops jararaca得到的botrocetin(Y.Usami等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，90，928-932(1993))，从响尾蛇(Crotalus atrox)得到的响尾蛇植物血凝素(J.Hirabayashi等人，J.Biol.Chem.266，2320-2326(1991))，从白唇竹叶青(Trimerisurusalbolatris)得到的alboaggregin(E.Yoshida等人，Biochem.Biopys.Res.Commun.，191，1386-1392(1993))等从蛇毒得到的在氨基酸序列上与C型植物血凝素同源性高的肽。
这些肽也具有与C型植物血凝素大致相同的半胱氨酸残基位置，以及据信是植物血凝素活性所必需的共同序列的一部分。此外还知道，C型植物血凝素具有使细胞、细菌等通过其细胞膜上的糖蛋白质(糖链)发生凝集的活性(上述K.Drickamer.J.Hirbayashi等人)。
离体测定血小板的凝集时，许多情况下在采血血液中添加作为抗凝固剂的柠檬酸、柠檬酸钠、乙二胺四乙酸(EDTA)，在血小板凝集测定系统中由于钙被螯合，因而钙依赖性的反应受到抑制。因此，显示血小板凝集抑制活性的上述得自蛇毒的肽是否具有植物血凝素活性，在离体试验中难以检出。
因而，得自蛇毒的肽在对动物给药时，在活体内的钙存在下会表现出C型植物血凝素活性，造成血小板凝集，可认为这就是观察到微血管内凝集块聚集、甚至血小板减少等现象的要因之一。
因此，为了使在离体试验中能抑制von Willebrand因子与血小板结合、得自蛇毒的肽在动物实验等活体试验中也能作为有效抗血栓药起作用，有必要获得通过转换成不会造成血小板减少的分子而制备的新的活性肽。
发明概要
本发明基于上述观点开发而成，为了获得作为抗血栓药的有效药剂，其课题在于提供一种不会造成血小板减少且抑制von Willebrand因子与血小板结合的肽及其制法。
本发明者为了解决上述课题而进行深入研究的结果发现，将得自蛇毒的多聚肽(multimer peptide)在一定条件下解离而获得的单链肽，在对活体给药时不会造成血小板的减少且具有抗血栓活性，从而实现了本发明。
具体地说，本发明涉及一种肽，其特征在于此肽是从具有可抑制von Willebrand因子与血小板结合的活性的来源于蛇毒的多聚肽，通过切断构成多聚肽的肽链的肽链间二硫键，同时基本上保留了的肽链内二硫键而得到的单链肽，它在活体内，在能显示上述活性的最小给药量下，基本上不会造成血小板减少(以下称为“本发明的肽”或“活性肽”)。
本发明还提供一种在活体内显示出可抑制vonWillebrand因子与血小板结合活性的最小给药量下基本上不会造成血小板减少的单链肽的制备方法，其特征在于，使具有活性的蛇毒肽与蛋白质变性剂、谷胱甘肽和/或半胱氨酸共存，在构成上述多聚肽的肽链的肽链内二硫键基本上获得保存的情况下，将肽链间的二硫键切断。
本发明还提供一种在活体内显示出可抑制vonWillebrand因子与血小板结合活性的最小给药量下基本上不会造成血小板减少的肽的制备方法，该方法包括：将插入了编码上述肽或其一部分的DNA片段的载体所转化的大肠杆菌以适当培养基培养；将上述肽予以表达；以及在使蓄积于大肠杆菌细胞内的上述肽与蛋白质变性剂共存后，通过将蛋白质变性剂除去或通过减少蛋白质变性剂浓度，生成上述肽链内的二硫键。
本发明还提供一种在活体内显示出可抑制vonWillebrand因子与血小板结合活性的最小给药量下基本上不会造成血小板减少的肽的制备方法，该方法包括：将插入了编码上述肽或其一部分的DNA片段的载体所转化的昆虫培养细胞或动物培养细胞以适当培养基培养；将上述的肽予以表达；以及将蓄积于上述细胞内或培养基中的上述肽回收。
本发明还提供一种含有上述肽和/或药物上可接受的盐作为有效成分的医药组合物。
在本说明书中单独称“肽”的情况下，有时是指单链肽，有时也指多聚肽(multimer peptide)。以下详细说明本发明。<1>本发明的肽
本发明的肽，其特征在于：此肽是从具有抑制vonWillebrand因子与血小板结合的活性的来源于蛇毒的多聚肽，通过切断构成多聚肽的肽链的肽链间二硫键，同时基本上保留肽链内二硫键而获得的单链肽，且在活体内能显示上述活性的最小给药量下基本上不造成血小板减少。
作为蛇毒多聚肽，只要是具有能抑制von Willebrand因子与血小板结合的活性的多聚肽均可适用于本发明，其实例为：响尾蛇(Crotalus horridus horridus)，Cerastescerastes，小蝰蛇(Eches carinatus)，竹叶青(Trimeresurus albolabris)，蝰蛇(Vipera palaestina)等所产生的蛇毒肽。其中优选的是响尾蛇(Crotalushorridus horridus)所产生的蛇毒肽。
本发明的肽的实例是从响尾蛇(Crotalus horridushorridus)的蛇毒肽得到的单链肽，包括在N端有序列表序列1所示氨基酸序列的肽。还包括具有序列表序列2所示氨基酸序列，且在序列2中从N末端起第4号与第15号、第32号与第120号、以及第95号与第112号的半胱氨酸残基分别有二硫键的肽。此外，这种肽也可以用遗传工程技术生产，此时，序列表序列1或2中所示氨基酸序列的N末端有时会加上相当于翻译起始密码子的甲硫氨酸残基，这种在N端加上了甲硫氨酸残基的肽，也属于本发明的肽。
此外，按照众所周知的遗传工程技术，使用大肠杆菌，昆虫细胞或动物培养细胞等，也可生产具有序列表序列2中所记载的氨基酸序列或其一部分，且具有上述活性的肽。以大肠杆菌为宿主表达本发明的肽时，可在细胞内形成包含体，通过使这种包含体溶解并正确地形成二硫键，从而获得具有活性的肽。此时，通过将与二硫键无关的半胱氨酸残基以半胱氨酸以外的氨基酸如丙氨酸、丝氨酸等取代，防止形成错误的二硫键，可望提高所获得的肽的稳定性。再者，序列2中所示氨基酸序列中有对于活性并非必要的氨基酸或区域，也可构建使其中1个或2个以上的氨基酸发生取代、缺失、插入的肽。例如，如后述实施例6所示，从具有序列2所示氨基酸序列的肽，即使失去N末端的15个氨基酸残基或65个氨基酸残基和/或C末端的11个氨基酸残基，也能保持活性。
关于核苷酸序列的定点突变体的制备，可采用市售试剂盒(例如Mutan-G、Mutan-K；宝酒造公司)，也可利用“PCRProtocols”(Academic Press版)中所记述的PCR反应获得突变体。
如上所述，单链化的本发明的肽，可保持抑制vonWillebrand因子与血小板结合的活性且基本上不会引起可以由多聚肽引起的血小板减少。具有此种性质的本发明的肽在活体内可显示抗血栓活性，可用作抗血栓药。
<2>本发明的肽的制法作为从蛇毒肽获得具有抑制von Willebrand因子与血小板结合的活性而不会造成血小板减少的肽的手段之一，例如，可采用以下方法。假定将蛇毒肽在活体内给药时引起血小板减少，其原因之一是在钙存在下产生的蛇毒肽的血凝素活性，则可认为通过将血凝素分子中与糖结合位点对应的多个位点分别分离，就会观察不到使血小板交联的活性。为了使糖结合位点分离，例如，可将多聚肽分离成单键。
为了把多聚肽分成单链，众所周知的方法是使多聚肽还原，或在还原后使半胱氨酸残基的游离巯基发生羧甲基化、羧酰胺基甲基化、吡啶基乙基化等加以保护而使其稳定。然而，水溶性蛋白质一般具有许多亲水性氨基酸残基侧链朝外的高级结构，在强变性条件下又会使半胱氨酸残基间的二硫链切断而使三级结构还原，对还原后的半胱氨酸残基的游离巯基的保护等不会使二级结构丧失，在有些情况下会变得不溶于水。如后述实施例1所示，从响尾蛇(Crotalus horridushorridus)得到的双链肽，可通过还原羧酰胺基甲基化、还原吡啶基乙基化、用巯基乙醇进行还原等，变成难溶于水的肽。
Peng等人(M.Peng等人，Blood，81，2321-2328(1993))曾报告，从小蝰蛇(Echis Carinatus)得到的双链肽还原后的羧酰胺基甲基化反应混合物也具有与双链肽相同的血小板凝集抑制活性，但根本没有提到此处所观察的凝集抑制是否特异，所生成的哪一种分子有活性等。
因此，本发明针对的是得自蛇毒的肽，在温和的变性条件下实施不会造成显著高级结构破坏的温和还原，使双链肽中的单链内即分子内的二硫键基本上得以保存，而将链间即分子间的二硫键切断，可获得使其原先的高级结构至少维持在不会丧失活性的程度的高水溶性单链肽。
本发明中的活性肽可利用蛇毒中所含的可抑制vonWillebrand因子与血小板结合的多聚肽来制备。例如，可利用从响尾蛇(Crotalus horridus horridus)毒液或其冷冻干燥品得到的肽制备。又，vonWillebrand因子与血小板结合抑制，可根据在离体试验中瑞斯托菌素或botrocetin所造成的血小板凝集(以下只称“瑞斯托菌素凝集”或“botrocetin凝集”)的抑制作用来考虑。
作为使这样的多聚肽在保持肽链内半胱氨酸残基间的二硫键的情况下将肽链间的二硫键切断而使的单链化的具体手段，包括使该多聚肽与蛋白质变性剂、谷胱甘肽和/或半胱氨酸共存并使之反应的方法。作为蛋白质变性剂，可采用盐酸胍、尿素等，盐酸胍的最终浓度可采用0.01M至饱和浓度、优选1M～6M的浓度范围。又，谷胱甘肽和/或半胱氨酸是在温和条件下进行还原的，在其使用时，适当的浓度范围为0.1mM～100mM，优选为1mM以至50mM。
反应是在含Tris盐、磷酸盐、乙酸盐等的缓冲液、蒸馏水、或在其中添加了醇类等有机溶剂等的溶液中实施，通过在溶液状态下在-10℃～100℃、优选在10℃～40℃的范围内进行，可获得作为目的的单链肽。此外，以冻结、融解处理也可获得这种肽。
以上述方式制备的活性肽，可借助于不同的方法，例如凝胶过滤、离子交换、吸附、反相柱色谱法，或亲合柱色谱法、超滤、电泳、逆流分配等的组合进行分离。
此外，本发明的肽，还可利用涉及使用编码该肽的基因的基因重组技术，用微生物或培养的细胞来制备。编码本发明的肽的基因可由：从响尾蛇(Crotalus horridus horridus)毒腺得到的cDNA文库或从组织得到的基因组DNA文库，利用与从氨基酸序列的一部分可预期的DNA片段杂交进行筛选，或是利用来自表达了基因文库DNA的以大肠杆菌为首的原核生物、酵母等真菌类、昆虫或动物等的培养细胞等的转化细胞的表达蛋白质进行筛选而获得。此外，供参考的是，本发明的肽的氨基酸序列，也可藉组合使用对应于各氨基酸的密码子设计的DNA序列以及适当调节序列来合成。
例如，从响尾蛇(Crotalus horridus horridus)毒腺提取总RNA，进一步纯化mRNA级分，以这种mRNA为模板合成cDNA，并使用噬菌体等制备cDNA文库，通过利用从这种cDNA文库以本发明肽的氨基酸序列为基础制备的寡核苷酸探针进行杂交，可选择具有能编码本发明肽的cDNA的克隆。另外，作为用于杂交的探针，还可借助于使用以本发明肽的氨基酸序列为基础制作的寡核苷酸引物的RT-PCR法，使用从mRNA扩增的DNA片段。
锚定具有编码后述实施例得到的本发明肽的基因的质粒pCHA1的E.coli HB101/pCHA1(E.Coli AJ 13023)，从1994年8月12日开始，以FERM BP-4781的保藏号，根据布达佩斯条件，国际保藏于日本通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(邮政编码305，日本国茨城县筑波市东一丁目1番3号)中。
通过将所获得的基因插入含有可在宿主内表达的启动子、翻译启始信号等的质粒或病毒载体的DNA中，对于以大肠杆菌为代表的原核生物、酵母等真菌类、昆虫或动物等的培养细胞进行上述质粒导入或病毒感染，可在适当条件下表达所希望的肽。此时，既可在菌体或细胞内蓄积所希望的肽，也可使其在培养液中分泌生产。此外，既可以在所希望的肽中附加作为翻译起始密码子的甲硫氨酸的形式直接表达，也可以附加了分泌信号序列的形式表达，再在分泌过程中切断并除去信号序列，生产所希望的肽。此外，还可作为与其它适当蛋白质(例如大肠杆菌麦芽糖结合蛋白质)融合的嵌合体蛋白质予以表达，在这种情况下，在获得所表达的嵌合蛋白质后，可以用适当的蛋白酶或化学方法将其切割，而获得所希望的蛋白质。这样表达生产的蛋白质，在不具有由高级结构状态所产生的目的活性时，或者只具有弱活性时，也可通过适当变性条件、氧化还原条件处理，变成具有活性的高级结构。
以大肠杆菌为宿主生产本发明的肽时，如前所述，生成的肽是在细胞内形成包含体，再使这种包含体溶解、正确地形成二硫键，而获得具有活性的肽。具体而言，将由插有编码本发明的肽或其一部分的DNA片段的载体所转化的大肠杆菌以适当培养基培养，以表达上述肽，在积累于大肠杆菌细胞内的上述肽与蛋白质变性剂共存后，通过除去蛋白质变性剂或降低蛋白质变性剂浓度生成上述肽链内的二硫键，可获得本发明的肽。上述肽具有序列2所示氨基酸序列时，这种二硫键可在例如序列2内的第4号与第15号、第32号与第120号以及第95号与第112号半胱氨酸残基之间形成。
可任选地，将由插有编码上述肽或其一部分的DNA片段的载体所转化的昆虫培养细胞或动物培养细胞以适当培养基培养，以表达上述肽，再将上述细胞内或培养基中所积累的上述肽回收，可获得本发明的肽。
<3>本发明的医药组合物按上述方式获得的肽，即使对动物给药也不会造成血小板减少，而且对血栓模型动物给药时可显著抑制血栓形成。除金精三羧酸(Aurin tricarboxylis acid)等对蛋白质的非特异吸附性高的色素物质外，本发明首次公开在活体内有抗血栓活性的物质，其特征在于能抑制von Willebrand因子与血小板结合。即，首次揭示了以还原等方法从得自蛇毒的肽获得的单链肽存在着可抑制von Willebrand因子与血小板结合的活性，而且对活体给药时不会引起血小板减少，从而提供了非常有希望作为抗血栓药的医药组合物。
本发明的医药组合物含有本发明的肽和/或其药物上可接受的盐作为有效成分。也可使用其中一种或二种以上的混合物。而且也可以含有除本发明的肽以外有抗血栓作用的物质。在这种情况下，本发明的肽也可以不是该医药组合物中的主成分。此外，还可配入用于通常制剂中的其他材料，例如血清白蛋白等蛋白质，有缓冲作用、渗透压调整作用的盐，载体，赋形剂等成分。
作为剂型，可包括锭剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆剂、栓剂、软膏剂、注射剂、点眼剂等。其中，优选的是注射剂。而且，给药方法，除经静脉内给药、皮下给药、经口给药外，也可以是点眼、经肠给药等任崐何一种。其中优选的是经静脉内给药。
对动物或人类给药时的给药量，以本发明的肽和/或其药物上可接受的盐的量计，通常在0.1μg/kg～100mg/kg的范围内就可望有预期效果，可在此范围内选择能给出最良好药效的量。附图简单说明
图1是CH-1的反相色谱图。
图2是CH-2的反相色谱图。
图3是添加谷胱甘肽前CH-1的反相色谱图。
图4是添加谷胱甘肽5日后CH-1所生成物质的反相色谱图。
图5是CH-1所生成物质的反相色谱图。
图6是在各条件下(a)峰1、(b)峰2的生成量(μg/管)所经历的时间图。
图7是AS1051的氨基酸序列图(片段A、B、C是用赖氨酸端肽酶消化后，作为以二硫键连接的一个片段得到的)。
图8是(a)CH-1及(b)AS1051对瑞斯托菌素凝集和botrocetin凝集的抑制活性(相对于对照组的抑制率)图。
图9是AS1051对土拨鼠血小板的瑞斯托菌素凝集和botrocetin凝集的抑制活性图。
图10是AS1051给药(200μg/kg)后(a)瑞斯托菌素和(b)botrocetin对土拨鼠血小板的凝集活性图。
图11是AS1051(给药量200μg/kg)对光激发血栓模型土拨鼠的抗血栓活性图。
图12是大肠杆菌中AS1051表达质粒pCAHT7的构建过程图。
图13是昆虫培养细胞中AS1051表达质粒pCHAbac的构建过程图。
图14是在用昆虫培养液表达的细胞破碎液中AS1051对由botrocetin引起的von Willebrand因子与固定化血小板结合的抑制活性图。
图15是在用昆虫培养细胞表达的培养上清液中AS1051对由botrocetin引起的von Willebrand因子与固定化血小板结合的抑制活性图。
图16是动物培养细胞(CHO细胞)中AS1051表达质粒pCHASDX的构建过程图。
图17是在用CHO细胞表达的培养上清液中AS1051对由瑞斯托菌素引起的von Willebrand因子与固定化血小板结合的抑制活性图。
图18是在用CHO细胞表达的培养上清液中AS1051对由botrocetin引起的von Willebrand因子与固定化血小板结合的抑制活性图。
图19是质粒pCHAT7Ala的构建过程图，该质粒用于在大肠杆菌中表达突变的AS1051，所述突变是从N末端起第81号(但不包含翻译开始的甲硫氨酸残基)半胱氨酸残基被丙氨酸取代。
图20是用蛇毒制备的AS1051、用大肠杆菌生产的AS1051以及从N末端起算第81号半胱氨酸残基被丙氨酸残基取代的AS1051(Cys81Ala突变体AS1051)对由瑞斯托菌素或botrocetin所引起的von Willebrand因子与固定化血小板结合的抑制活性图。
图21是各种缩短的AS1051肽的结构的概略图。
图22是AS1051A-1的HPLC色谱图。
图23是AS1051A-2的HPLC色谱图。
图24是AS1051A-3的HPLC色谱图。
图25是AS1051A-4的HPLC色谱图。
图26是AS1051A-5的HPLC色谱图。
图27是各种缩短的AS1051肽对由瑞斯托菌素或botrocetin所引起的von Willebrand因子与固定化血小板结合的抑制活性图。
实施本发明的最佳方式以下说明本发明的实施例。实施例1 得自响尾蛇(Crotalus horridus horridus)的抗血栓性单链肽的制备<1>得自响尾蛇(Crotalus horridus horridus)且对vonWillebrand因子与血小板结合有抑制活性的肽的制备
首先，从得自响尾蛇(Crotalus horridus horridus)的蛇毒，进行对von Willebrand因子与血小板结合有抑制活性的肽的纯化，并以下述方法确定的瑞斯托菌素凝集抑制活性为指标。
将1/10容量的3.8％柠檬酸钠添加于从健康人采集的新鲜血液中，将该血液以900rpm离心15分钟，得到人类富血小板血浆(platelet rich plasma)，向其中添加同体积的含2％多聚甲醛的生理盐水，在4℃静置一夜保存之。保存后，用离心分离法将血小板回收，并以含20mM磷酸缓冲液(pH 7.4)的生理盐水洗涤二次。将测定样品添加于由此制备的福尔马林固定化血小板溶液中，再依次向其中添加人类血浆(最终浓度0.12％)、瑞斯托菌素硫酸盐(Sigma公司制)(最终浓度0.5mg)，在振荡搅拌后，以肉眼观察对血小板凝集是否有抑制活性。反应溶液量为50ml，样品经过适当稀释，以添加2～20μl为宜。
将冷冻干燥的得自响尾蛇(Crotalus horridushorridus)的蛇毒制品(Sigma公司制)1g溶解于含20mM Tris盐酸(pH 7.4)的生理盐水(10ml)中，以3000rpm离心10分钟除去不溶物。上清液用Sephadex G-75(微细)(Pharmacia公司制)(直径5.0cm，长90cm)、以相同缓冲液为溶剂进行凝胶过滤层析，分取于分级管中。收集溶出体积750～885ml，分三次每次15ml通过苯甲脒Sepharose(Pharmacia公司制)(直径1.6cm，长5cm)柱，收集非吸附级分。
这种级分用排阻分子量为10000的过滤膜(YM 10，Amicon公司制)过滤浓缩，浓缩部分以50mM乙酸铵缓冲液(pH 4.5)进行溶剂置换。而后，使之吸附于以同种溶剂平衡的CMSepharose CL6B(Pharmacia公司制)(直径2.6cm，长30cm)离子交换层析柱中，以起始溶剂洗涤50分钟后，用0.5M乙酸铵缓冲液(pH 6.4)与初溶剂的15％混合溶液至50％混合溶剂进行线性浓度梯度(810分钟)洗脱。分取溶出体积610ml～650ml的溶出级分，按与上述相同方式以超滤膜浓缩后，用含20mM Tris盐酸(pH 7.4)的生理盐水溶液进行溶剂置换。此外，由于溶出体积540ml～580ml的溶出级分同样存在血小板凝集抑制活性，相应地，对这个级分也进行同样处理。
从离子交换层析柱得到的各血小板凝集抑制活性级分浓缩物取出一部分，以使用反相柱(SSC-VP-304，仙修科学公司制，直径4.6mm，长250mm)的高速液体色谱技术，以含0.1％三氟醋酸的乙腈浓度31％～52％的线性浓度梯度(20分钟)洗脱进行分析的结果显示，两个级分中分别含有不同的单一肽(图1，2)。又，根据SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳得知，两个活性级分中所含的这些肽，都是在非还原条件下显示分子量约25千道尔顿的一条带而在添加1％巯基乙醇的还原下显示分子量约为14千道尔顿及15千道尔顿的两条带，均是类似的双链肽(序列1、3)。因此，把离子交换柱后半部溶出(溶出体积610ml～650ml)的溶出物称为CH-1，在前半部溶出(溶出体积540ml～580ml)的溶出物称为CH-2。CH-1的氨基末端侧的氨基酸序列分析按如下进行。CH-1约50μg在含有0.5M Tris盐酸(pH 8.5)、10mM乙二胺四醋酸二钠(EDTA·Na2)的7M盐酸胍水溶液100μl中溶解后，添加4-乙烯基吡啶(1μl)、三正丁基膦(2μl)，在室温下反应过夜，进行还原吡啶基乙基化。然后，反应液以使用TSKgel-Phenyl-5PW-RP(东曹公司制，直径4.6mm，长度75mm)柱的液体色谱法使所产生的各种肽链分离。洗脱流速为1ml/分钟，使用的直线浓度梯度为含有0.1％三氟乙酸的乙腈31％～52％，洗脱时间为20分钟。将分离的各肽链冷冻干燥后，再溶解于30％乙腈中，然后使用蛋白质测序仪470A(Applied Biosystems公司制)进行从氨基末端开始的氨基酸序列的分析。结果显示，各链的氨基末端侧的氨基酸序列如序列表序列1、3所示，这些序列分别与WO 9208470号国际公开手册中所记载的从相同蛇毒分离的肽CHH-B的α链及β链的N-末端侧的氨基酸序列一致。此外，如图1、2所示，在利用反相柱的分析中，从CH-1、CH-2的保持时间可以认为CH-2与同手册中所记载的CHH-A相同，而CH-1与同手册中所记载的CHH-B相同。<2>CH-1对动物给药时的活性
测定了按上述得到的CH-1对土拨鼠给药时的血小板数。把CH-1溶解于生理盐水中，配成10-100μg/ml的浓度，对土拨鼠经静脉内给药约5分钟后，从腹部大动脉采取动物血。采血中使用0.32％柠檬酸作为血液凝固抑制剂，用Sysmex E-2000(东亚医用电子)测定白血球数(WBC)、红血球数(RBC)及血小板数(PLT)。
给药量及各血球数值如表1所示。发现与给药量有关的只有血小板减少，还发现在100μg/kg的给药量下血小板几乎完全消失。
表1
<3>使双链CH-1变成单链的尝试(1)CH-1的还原羧酰胺甲基化
| 测定项目 | 生理盐水 | CH-1(μg/kg) | ||||
| 10 | 30 | 30 | 100 | 100 | ||
| WBC×102/μlRBC×104/μlPLT×104/μl | 35.0465.038.3 | 18.0440.041.0 | 20.0440.09.6 | 19.0457.013.7 | 19.0468.00.1 | 21.0448.00.8 |
CH-1的还原羧酰胺甲基化按以下进行。将CH-1200μg溶解于含0.5M Tris盐酸(pH 8.5)和10mM乙二胺四乙酸二钠(EDTA·Na2)的7M盐酸胍水溶液500μl中，添加二硫苏糖醇水溶液(20mg/ml)50μl，在37℃保存1小时。然后，向此溶液中添加50μl碘乙酰胺水溶液(50mg/ml)，在避光下于室温反应30分钟。
反应后，使用透析膜Spectra/porl(Spectra公司制：透析界限分子量6000～8000)，对5升含20mMTris盐酸(pH7.4)的0.15M氯化钠水溶液在4℃进行一夜透析。透析后，由于生成了白色不溶物，故在其中添加终浓度为2％的表面活性剂Tween-20，但不溶物未溶解。继之，将白浊的本溶液用Centricon-10(Amicon公司制)超滤浓缩，制成最终100μl的悬浮液。将此悬浮液弱离心后，使用其上清液10μl，按<1>中所示方法调查对瑞斯托菌素凝集的抑制活性，但并未观察到抑制活性。据信，这一结果可归因于上述方法还原羧酰胺甲基化的CH-1并不具有瑞斯托菌素凝集抑制活性，或是对水的溶解度非常低。(2)CH-1的还原吡啶基乙基化
CH-1的还原吡啶基乙基化按以下进行。将CH-1200μg溶解于含有0.5M Tris盐酸(pH 8.5)和10mM乙二胺四乙酸二钠(EDTA·Na2)的盐酸胍水溶液200μl中，向其中添加4-乙烯基吡啶(1μl)和三正丁基膦(2μl)，在室温反应一夜。反应液以利用反相柱(SSC-VP 304，仙修科学公司制，直径4.6mm，长250mm)的高速液体色谱法，以含有0.1％三氟乙酸的乙腈浓度10％～59％的浓度梯度淋洗(20分钟)进行洗脱，生成物以二种的吡啶基乙基化肽混合物级分加以收集。
把分别收集的级分冻结干燥后，将其全量溶解于含20mMTris盐酸(pH 7.4)的生理盐水50μl中，用其中的10μl按<1>中所示方法观察瑞斯托菌素凝集的抑制活性，但并未观察到抑制活性。此一结果据信可归因于上述方法还原吡啶基乙基化的CH-1不具有瑞斯托菌素凝集抑制活性，或是对水的溶解度非常低。(3)用巯基乙醇还原CH-1及二硫键再形成
用巯基乙醇还原CH-1以及还原后利用基于还原型-氧化型谷胱甘肽的氧化还原缓冲液进行二硫键再形成的操作按如下进行。
将CH-1240μg溶解于含0.5M Tris盐酸(pH 8.5)和10mM乙二胺四乙酸二钠(EDTA·Na2)的7M盐酸胍水溶液120μl中，在37℃放置10分钟。向此溶液中添加1/9量的10％巯基乙醇水溶液，使巯基乙醇的终浓度成为1％后，在37℃放置1小时。然后，添加2ml将含有0.5M Tris盐酸(pH 8.5)和10mM乙二胺四乙酸二钠(EDTA·Na2)的7M盐酸胍水溶液稀释成2/7的溶液(盐酸胍浓度2M，以下简称为“2M盐酸胍制备液”)后，以Centricon-10(Amicon公司制)进行超过滤浓缩。所得到的浓缩液中添加2M盐酸胍制备液2ml，再进行超过滤浓缩，多次重复这一浓缩操作以除去巯基乙醇，得到含CH-1还原物的2M盐酸胍制备液380μl。
将这样得到的含CH-1还原物的溶液分成5份各76μl，利用基于还原型-氧化型谷胱甘肽的氧化还原缓冲液进行二硫键再形成的操作。各溶液中分别添加374μl 2M盐酸胍制备液，再添加按表2所示比例混合氧化型与还原型谷胱甘肽的溶液50μl，再将内部置换了氮气的容器密封，在室温反应一夜。表2
| 氧化还原缓冲液组成 | 缓冲液 | ||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| 50mM氧化型谷胱甘肽水溶液 | 1 | 2 | 1 | 2 | 4 |
| 100mM还原型谷胱甘肽水溶液 | 5 | 5 | 1 | 1 | 1 |
表中数值是溶液的混合比
这五种反应液，以及刚用巯基乙醇还原后的溶液，利用有反相柱(SSC-VP 304，仙修科学公司制，直径4.6mm，长250mm)的高速液体色谱法，以含0.1％三氟醋酸的乙腈浓度10％～59％的浓度梯度淋洗(20分钟)进行洗脱，再进行观察216mm吸光度的分析，但任何溶液中均未观察到所生成的肽产生的峰。
上述结果据信可归因于用巯基乙醇还原使CH-1变成溶解性低的还原物，而利用氧化还原缓冲液进行的氧化还原反应也不会使之变成溶解性高的物质。(4)CH-1用谷胱甘肽还原
CH-1用谷胱甘肽的温和还原反应按以下进行。将CH-140μg溶解于上述2M盐酸胍制备液(450μl)后，添加溶解于同种溶液中的还原型谷胱甘肽(100mM)溶液50μl，在40℃放置3小时后再在室温下放置5日，生成物的内容利用有反相柱(SSC-VP 318，仙修科学公司制，直径4.6mm，长250mm)的高速液体色谱法分析。洗脱是利用含0.1％三氟乙酸的乙腈浓度10％～80％的浓度梯度(20分钟)进行，观察216nm的吸光度。
图3和4中分别表示谷胱甘肽添加前(图3)和谷胱甘肽添加5日后(图4)的色谱图。将用谷胱甘肽进行还原反应后的反应液全量，以同样的色谱法分离之，分别截取图4中所示峰1、2、3的部分。分别冻结干燥后，将其全量溶解于25μl含20mM Tris盐酸(pH 7.4)的0.15M氯化钠水溶液中，以其中10μl按<1>中所示方式测定瑞斯托菌素凝集抑制活性，发现峰1及峰3有抑制活性。但峰3是原料(CH-1)的峰。从以上结果可确认，上述方法生成了具有瑞斯托菌素凝集抑制活性的新物质(峰1)。
此外，又考察了在盐酸胍6M及2M存在下各种浓度的谷胱甘肽的影响。将CH-1(36μg)溶解于含0.5M Tris盐酸(pH 8.5)与10mM乙二胺四乙酸二钠(EDTA·Na2)的7M盐酸胍水溶液稀释成6/7所得的溶液(以下称为“6M盐酸胍制备液”)或是稀释成2/7所得的溶液(以下称为“2M盐酸胍制备液”)234μl中。对于溶解了CH-1的6M和2M盐酸胍制备液，分别添加下述10倍浓度的溶液26μl，使还原型谷胱甘肽的最终浓度为30mM、10mM、3mM与1mM而氧化型谷胱甘肽的最终浓度为30mM，1、2、3、4、7日后生成峰的内容用有反相柱(SSC-VP 318，仙修科学公司制，直径4.6mm，长250mm)的高速液体色谱法分析。洗脱以含0.1％三氟乙酸的乙腈浓度24％～59％的浓度梯度(20分钟)进行，观察216nm的吸光度。
这种分析所得色谱图的一例表示在图5中(2M盐酸胍，10mM还原型谷胱甘肽，4日)。由此分析系统可知，在与图4所示峰1相当的保持时间的洗脱物中，含有两种物质(相当于图5所示的峰1和2)。此外，峰4是原料(CH-1)的峰。这种峰1及峰2的物质生成量在各自反应条件下随时间的变化表示于图6中。<4>用还原型谷胱甘肽从CH-1制备单链肽
在CH-1的生理盐水溶液(1.3mg/ml)290μl中，添加蒸馏水7.39ml、含0.5M Tris盐酸(pH 8.5)和10mM乙二胺四乙酸二钠(EDTA·Na2)的7M盐酸胍水溶液3.57ml以及100mM还原型谷胱甘肽(贝林格曼海姆公司制)水溶液1.25ml，在28℃保存5日(盐酸胍的最终浓度2M)。
保存后的溶液以3000rpm离心分离，再用三氟乙酸将其上清液调整至pH4以下的酸性后，利用反相柱(Vydac214TP1022，拜达库公司制，直径22mm，长250mm)以流速15ml/min、含0.1％三氟乙酸的乙腈浓度27％～45％进行20分钟的浓度梯度淋洗，分级收集生成的肽。
结果发现，生成了与图5所示相同的生成物，将其峰1和峰2分别称为AS1051和AS1052。各自的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，AS1051在非还原下是分子量约14千道尔顿的单链肽，在1％巯基乙醇存在的还原下是分子量约15千道尔顿的单链肽，而AS1052在同样的非还原下和还原下的分子量分别为约26和15千道尔顿，是由两条相同的肽形成的均二聚体。
所得到的AS1051的氨基酸序列以及二硫键方式按如下确定。在AS1051 50μg的水溶液(50μl)中，依次添加含20mM乙二胺四乙酸二钠(EDTA)的1M Tris盐酸缓冲液(20μl)、蒸馏水(120μl)、含赖氨酰端肽酶(和光纯药公司制)5μg的水溶液(10μl)，在37℃进行2小时酶消化反应。而后，将反应液供给使用反相柱(SSC-VP 318，仙修科学公司制，直径4.6mm，长250mm)的高速液体色谱法利用，将消化片段分离、分级收集后，各消化片段用蛋白质测序仪-470A(Applied Biosystems公司制)进行氨基酸序列分析，所确定的AS1051的氨基酸序列如序列2及图7所示。本序列与WO 9208472号国际公开手册中所记载的CHH-B的α链比较，其氨基酸残基数少一个，而且第39、85、86号氨基酸不同。
图7中所示3条片段A、B、C，由于是作为经由二硫键结合的一个消化片段得到的，因此，对这一片段进一步用蛋白酶Glu-C(贝林格曼海姆公司制)进行消化，并分析所生成片段的氨基酸序列，结果发现，二硫键是在Cys4与Cys15、Cys32与Cys120、Cys95与Cys112之间形成的。这种结合方式与含有蛇毒提取物的C型血凝素是相同的，因此可以判断AS1051保持原有的二硫键结合方式。
此外，双链AS1052的氨基酸序列分析结果显示，它是由2条AS1051构成的均二聚体。<5>双链肽(CH-1)与单链化肽(AS1051)的血小板凝集抑制活性比较
在此比较了双链CH-1、单链化肽AS1052对于血小板凝集的抑制活性。在添加了1/10容积的3.8％柠檬酸钠、来自健康人的新鲜血液用900rpm离心15分钟得到的人类富血小板血浆(Platelet rich plasma：PRP)中添加这些肽时的血小板凝集抑制活性，是使用Hematracer-801(二光Bioscience公司制)，在盛有12.5μl肽溶液的比色杯中添加100μl富血小板血浆，用搅拌棒在37℃搅拌3分钟后，添加12.5μl凝集原，通过观察透射光进行测定。
作为凝集原，使用瑞斯托菌素(最终浓度1.2mg/ml)、botrocetin(1μg/ml)、ADP(3μM)、胶原(10μg/ml)，计算相对于未添加肽样品的对照组的凝集抑制率。CH-1、AS1051对瑞斯托菌素凝集、botrocetin凝集的抑制活性表示在图8中。对于瑞斯托菌素凝集、botrocetin凝集的抑制活性，两种肽(双链物(CH-1)及单链化物(AS1051))都观察到大致相同的抑制活性。此外，两者对于ADP、胶原凝集在20μg/ml的浓度均未显示抑制，而对瑞斯托菌素凝集、botrocetin凝集等依赖于von Willebrand因子与糖蛋白质Ib结合的凝集则显示特异的抑制。
此外，还发现双链AS1052也具有与AS1051大致相同的抑制活性。<6>双链肽(CH-1)与单链肽(AS1051)对小鼠给药的血小板数目比较
对小鼠经静脉内注射CH-1、AS1051(均为100μg/kg)的生理盐水溶液，以及作为对照只注射生理盐水，5分钟后从心脏采血，按照与<2>相同的方式测定白血球数(WBC)、红血球数(RBC)及血小板数(PLT)。
如表3所示，CH-1给药组的血小板几乎完全消失，相比之下，AS1051给药组(100μg/kg)并未观察到血小板数减少。此外，就白血球数(WBC)和红血球数(RBC)而言，与对照组相比，CH-1、AS1051给药组均无变化。从以上事实可以确认，单链化的AS1051不会引起双链肽CH-1给药时所观察到的血小板减少现象。表3
<7>使用土拨鼠测定单链化肽的抗血栓性
| 测定项目 | 生理盐水 | AS1051 100μg/kg | CH-1 100μg/kg | |||||
| WBC×102/μl | 7.0885.0130.9 | 21.0830.0136.3 | 51.0882.0122.4 | 13.0871.0107.7 | 20.0866.0119.7 | 37.0864.01.8 | 21.0921.01.0 | 21. 0891.00.9 |
| RBC×104/μl | ||||||||
| PLT×104/μl | ||||||||
首先，测定单链化肽AS1051对从土拨鼠得到的富血小板血浆的瑞斯托菌素凝集、botrocetin凝集的抑制活性。如图9所示，可知AS1051对瑞斯托菌素凝集、botrocetin凝集的抑制活性与对于人类富血小板血浆的数值(图8)大致相同。
其次，进行了对土拨鼠给药AS1051后的血小板等血球数的测定，以及用AS1051给药后采血的血液制备的富血小板血浆进行了旨在确定上述凝集是否受到抑制的活体外试验。此外，又将200μg/kg AS1051经静脉内对土拨鼠给药，给药5分钟后采取动脉血，按照与<2>相同的方法测定白血球数(WBC)、红血球数(RBC)及血小板数(PLT)(表4)。
表4
| 测定项目 | 生理盐水 | AS1051 100μg/kg | ||||
| WBC×102/μl | 35.0509.035.9 | 19.0512.046.3 | 22.0522.030.7 | 24.0518.034.6 | 21.0458.033.7 | 27.0471.040.0 |
| RBC×104/μl | ||||||
| PLT×104/μl | ||||||
在给药的AS1051中添加同量的牛血清白蛋白(bovineserumalbumin：BSA)，取只给药BSA者作为对照组。AS1051给药组与对照组比较，并未观察到血小板数等的变化。此外，又从这种血液制备富血小板血浆，用与上述相同的方法测定了瑞斯托菌素凝集、botrocetin凝集的状态(图10)。改变瑞斯托菌素添加量进行观察的结果显示，即使在能使对照组全部发生凝集的瑞斯托菌素浓度，AS1051给药组也几乎完全地使凝集受到抑制。而且，有关botrocetin凝集也获得了相同结果。
从以上结果可知，AS1051对土拨鼠以200μg/kg静脉给药时，与上述<5>(对小鼠给药)的情况相同也不会对血小板数造成影响，同时，可在血中保持足以抑制瑞斯托菌素凝集、botrocetin凝集的浓度。
其次，利用动物血栓模型，进行了AS1051在活体内抗血栓作用的评价。作为血型模型，采用松野等人(松野等人，血液与循环，4，p 20-23，(1990))报告的光激发血栓模型。
将土拨鼠的颈动脉剥离，装上多普勒血流探针，在设置探针的血管上游约5mm位置设置氙灯光源。然后，对该土拨鼠经静脉内给药含有BSA的AS1051(BSA与AS1051同量)，或作为对照只给药含BSA的样品，5分钟后将四碘四氯萤光素溶液(10mg/kg)经静脉内给药同时照射540nm的光，给血管壁设置障碍，用脉冲式多普勒血流计测定直至血流停止的时间。如图11所示，AS1051(200μg/kg)给药组与对照组相比，显然直至血流停止的时间延长了，表明AS1051具有抗血栓活性(p＜0.01)。实施例2 用大肠杆菌生产抗血栓性单链肽
为了利用遗传工程技术生产本发明的肽，从响尾蛇(Crotalus horridus horridus)分离出编码具有能抑制von Willebrand因子与血小板结合的活性的肽的基因，将其用大肠杆菌表达。<1>响尾蛇(Crotalus horridus horridus)cDNA基因文库的制作(1)从响尾蛇(Crotalus horridus horridus)提取mRNA
把响尾蛇(Crotalus horridus horridus)的毒腺摘出，立即用液氮冷冻，保存至使用时为止。此毒腺1.7g在RNA提取液(4M盐酸异氰酸胍、0.1M Tris盐酸(pH 7.5)、1％β-巯基乙醇、0.1％月桂基肌氨酸钠盐)20ml中用Polytron匀浆器(Kinematica公司制)破碎。此破碎液以10000G离心分离10分钟，除去不溶物后，将其上清液覆盖于超离心分离管中等量的密度平衡化缓冲液(4M氯化铯、10mM乙二胺四乙酸二钠pH 7.5)上，然后以30000rpm在20℃离心分离18小时，分离出全RNA 600μg。
从全RNA制备mRNA是使用POLY(A)Quik mRNA抽提试剂盒(Stratagene公司制)按照该试剂盒的实施方案进行的。即，把所得到的全RNA中的500μg吸附在Oligo dT柱上，以高盐缓冲液200μl洗涤2次、低盐缓冲液200μl洗涤3次后，让65℃、200μl洗脱缓冲液通过该柱4次，分离纯化mRNA(10μg)。(2)cDNA合成
cDNA合成是使用TimeSavor DNA合成试剂盒(Pharmacia公司制)按照该试剂盒的实施方案进行的。即，使纯化的mRNA3μg与随机六聚引物0.3μg、1mM二硫苏糖醇、含有反转录酶的第一链反应液混合，在37℃反应1小时，合成第一链。
将此反应液与含有大肠杆菌RNaseH、大肠杆菌DNA聚合酶的第二链反应液混合，在12℃反应30分钟、在22℃反应1小时以合成cDNA。在65℃培养10分钟后，反应液以苯酚/氯仿处理，使酶活性丧失。然后，使用附有试剂盒的凝胶过滤旋转柱，以400G下离心分离2分钟，除去未反应的引物，获得双链cDNA(3μg)。
(3)cDNA基因文库的制备在以上获得的双链cDNA的两端，按照TimeSavor DNA试剂盒的实施方案，连接其所附的EcoRI/NotI接合体。即，将cDNA 3μg、EcoRI/NotI接合体3μl，聚乙二醇缓冲液30μl、ATP溶液1μl、T4DNA连接酶1μl混合，在16℃进行1小时连接反应。而后，将反应液在65℃培养10分钟使酶活性丧失后，添加ATP溶液1.5μl、T4多核苷酸酶1μl，在37℃反应30分钟，进行接合体的5′端的磷酸化。此后，反应液在65℃培养10分钟，再进行苯酚/氯仿处理使酶活性丧失。然后，使用附有试剂盒的凝胶过滤旋转柱，将反应液以400G离心分离2分钟，除去未反应的接合体。
继之，将两端连接了接合体的cDNA连接到λ噬菌体载体λZAPII(Stratagene公司制)的EcoRI位点，制作重组噬菌体DNA。即，对于连接了接合体的cDNA 400ng，添加λZAPII/EcoRI/CIAP臂1μg，连接缓冲液(100mM Tris盐酸(pH 7.6))，25mM氯化镁、300mM氯化钠)，再等量添加含有T4 DNA连接酶的酶液B液(宝酒制备公司制，Ligation Kit)，在26℃进行10分钟连接反应。
按上述方式得到的重组噬菌体DNA的包装，是采用包装试剂盒GIGAPACKII GOLD(Stratagene公司制)，按该试剂盒的实施方案得到的。即，上述连接了cDNA的λZAPII臂DNA 3μg与试剂盒包装提取液混合，在22℃反应2小时进行包装。向此反应液中添加500μl噬菌体稀释液(0.58％氯化钠、0.2％硫酸镁、50mM Tris盐酸(pH 7.5)、0.01％明胶)。
在检查了所获得的重组噬菌体的效价后，使用噬菌体包装反应液的一半，利用作为受体菌的大肠杆菌XL-1 Blue(Stratagene公司制)，制作噬菌体基因文库。即，在10个直径150mm的噬菌斑形成培养基(细菌培养用胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％、氯化钠0.5％、硫酸镁1mM，麦芽糖0.2％)上，以使每板上有20,000个噬菌斑的方式涂覆用噬菌体稀释液稀释的噬菌体和受体菌，在37℃培养12小时，获得重组噬菌体的基因文库。<2>用以分离靶基因的探针DNA的获得(1)利用RT-PCR法扩增靶基因部分片段
以从响尾蛇(Crotalus horridus horridus)提取的全RNA作为材料，利用RT-PCR法，进行对可抑制vonWillebrand因子与血小板结合的肽编码的DNA片段的扩增。
以序列2中所记载的肽的氨基酸序列为基础，选取密码子简并度小的位点，制作RT-PCR(反转录聚合酶连锁反应)用的引物。该引物是委托Biologica公司进行化学合成的。这些引物的碱基序列表示在序列表序列4和5中。但在序列4中，第3号及第6号核苷酸是A与G的混合物，而第12号核苷酸是T、C、A与G的混合物。此外，在序列5中，第3号核苷酸是T、C、A与G的混合物，第6号及第15号核苷酸是T与C的混合物，第9号核苷酸是A与G的混合物。
对于以上述方式制备的响尾蛇(Crotalus horridushorridus)全RNA，使用上述引物进行RT-PCR。第一链的合成，是在全RNA 5μg中混合反转录酶SUPERSCRIPT II(GIBCO公司制)2.5μl、添加在酶液中的第一链缓冲液20μl、0.1M二硫苏糖醇10μl、10mM dNTP5μl，在42℃反应1小时而合成第一链。反应液在95℃培养5分钟，使反转录酶丧失活性。其次，以这种第一链作为模板进行PCR反应。即，将第一链反应液5μl、PCR反应缓冲液10μl、10mM dNTP5μl、引物各800pmol、Taq聚合酶10U混合，使用DNA热循环仪(Parkin-Elmer公司制)，以95℃ 0.5分钟、52℃1分钟、72℃2分钟作为1个循环，进行25个循环的反应。
将此PCR反应液进行2％琼脂糖凝胶电泳，分析扩增的DNA。结果在约300碱基对的位置上观察到DNA条带。(2)扩增片段的碱基序列的确定
使用pCR-ScriptSK(+)克隆试剂盒(Stratagene公司制)按该试剂盒的实施方案，将按上述方式扩增的DNA片段亚克隆到质粒中。即，在PCR反应液中添加并混合连接缓冲液、1mM ATP、作为载体的pCR script(Stratagene公司制)10ng、限制性内切酶SrfI(5单位)以及T4 DNA连接酶，在25℃进行1小时连接反应，然后将反应液在65℃培养10分钟，使连接酶丧失活性。用这种反应物，按感受态细胞法转化E.coli DH5α，并涂覆在L-Ap平板(细菌培养用胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠0.5％，氨苄青霉素钠100μg/ml)上，在37℃培养18小时。将形成了菌落的菌体从平板上分离下来，将其一部分进行液体培养，再依碱法(Molecular Cloning，2版，Vol.1，Cold Spring HarborPress编)进行质粒制备。这种质粒命名为pCHAprobe。
pCHAprobe克隆片段的碱基序列是使用DNA测序仪A 373(Applied Biosystems公司制)，以M13M4或M13reverse(宝酒制备公司制)作为引物，按该测序仪的使用法，用dyeTerminator法进行分析的。结果显示，克隆的DNA片段由272个碱基对构成，具有序列6所示的碱基序列。将此序列翻译成氨基酸观察时证明，它相当于所要得到的肽的一部分，所得到的无性系化片段是靶肽AS1051基因的一部分。(3)探针的标记
pCHAprobe用限制性内切酶SacI、BamHI切割克隆的插入片段两端所存在的相应位点，以2％琼脂糖凝胶电泳分离出340碱基对大小的DNA片段，使用DNA回收试剂盒(Takara EASYTRAP：宝酒制备公司制)按该试剂盒的实施方案回收DNA。此DNA 25ng用[α-32P]dCTP及随机引物标记试剂盒(宝酒制备公司制)进行放射性同位素标记。该标记反应液用凝胶过滤Nick柱(Pharmacia公司制)将未反应的[α-32P]dCTP除去，获得标记化的探针。<2>利用噬菌斑杂交制备靶基因
从cDNA噬菌体文库，利用上述探针进行噬菌斑杂交，筛选出编码全长AS1051肽的基因。
从按上述方式形成了λZAPII cDNA噬菌体文库的噬菌斑平板，按滤膜所附说明书把噬菌斑转移到尼龙滤膜Highbond-N(Amersham公司制)上。对此滤膜进行碱处理使噬菌体裂解后，在80℃烘烤2小时，将噬菌体DNA固定在滤膜上。
此滤膜与32P标记的探针1×106cpm/ml，在含有5×SSPE缓冲液(20×SSPC：3.6M氯化钠、0.2M磷酸钠缓冲液pH7.7、20mM EDTA二钠)、30％甲酰胺、5×Denhardt溶液(100×Denhardt溶液：2.0％牛血清白蛋白、2％Ficoll400、2％聚乙烯基吡咯烷酮)及0.5％SDS的溶液中，在37℃杂交16小时。此后，该滤膜在6×SSC(20×SSC：3M氯化钠、0.3M柠檬酸三钠)、0.1％SDS中在室温洗涤2次，再在2×SSC、0.1％SDS中在50℃洗涤2次，将与滤膜非特异结合的探针除去。将此滤膜与X射线底片HP20(富士film公司制)一起在-80℃曝光24小时。从噬菌体平板上把相当于底片阳性斑点位置的克隆分离下来，作为初级筛选阳性纯系。重复相同的筛选操作，取得形成单一噬菌斑的阳性纯系。
在所获得的阳性纯系的λZAPII cDNA噬菌体上感染辅助噬菌体ExAssist(Stratagene公司制)，通过将其感染在非琥珀抑制子大肠杆菌的SOLRCELL(Stratagene公司制)上，获得了具有在质粒pBluescript SK(-)(Stratagene公司制)的EcoRI位点插入了cDNA片段的质粒的大肠杆菌。从这种菌体用碱式SDS法制备质粒，利用DNA测序仪A 373(Applied Biosystems公司制)确定插入片段的碱基序列。
结果发现，4个阳性纯系具有对所要得到的肽编码的碱基序列，将分别予以编码的质粒命名为pCHA1、pCHA2、pCHA3及pCHA4。此外，具有pCHA1的E.coli HB101/pCHA1(EcoliAJI 3023)，从平成6年8月12日起以FERM BP-4781保藏编号，根据布达佩斯条约，国际保藏于日本通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(邮政编码305，日本茨城县筑波市东1丁目1番3号)。按上述方式克隆的AS1051肽编码基因的碱基序列表示在序列表序列7中，而由这种基因编码的肽的氨基酸序列则表示在序列8中。这种基因具有作为翻译起始氨基酸的甲硫氨酸以下22个氨基酸所构成的典型分泌信号。<4>以大肠杆菌为宿主表达和生产AS1051肽及活性肽的制备(1)大肠杆菌表达质粒pCHAT7的构建
在具有T7启动子的质粒pGEMEX-1(Promega公司制)中导入对上述得到编码AS1051肽的DNA片段，制作大肠杆菌用表达质粒(参照图12)。
首先，为便于以后操作起见，制备pGEMEX-1中存在的两个限制性内切酶NdeI切割位点中缺失了离T7启动子远的NdeI切割位点的质粒。即，用NdeI使pGEMEX-1部分消化，切割末端用DNA平末端试剂盒(宝酒制备公司制)平末端，再用连接试剂盒(宝酒制备公司制)再环化。用所获得的质粒转化大肠杆菌，从转化体中获得在所希望的位置只存在一个NdeI切割位点的质粒，命名为pGEMEX(NdeI)。
将上述pCHA1及pGEMEX(NdeI)用限制性内切酶NdeI及SacI消化，利用琼脂糖凝胶电泳提取分别为100碱基对和3200碱基对的DNA片段。pCHA1所产生的100碱基对的DNA片段含有AS1051肽编码基因的3′末端区域(相当于序列7中的核苷酸号490～559)。
利用连接试剂盒(宝酒制备公司制)进行这些DNA片段的连接反应，用这种反应液转化大肠杆菌HB101，在含有氨苄青霉素的平板上从所分离的转化体获得重组质粒pCHA(NS)。
然后，在所获得的质粒pCHA(NS)中插入AS1051肽编码基因的5′末端区域(相当于序列7中的核苷酸号135～489)，制作了在大肠杆菌内表达生产AS1051肽的质粒。
为了把AS1051肽编码基因的5′末端区域掺入到pCHA(NS)中，合成了用PCR法使这一区域扩增所需的DNA引物。此时，作为5′末端侧的引物，为了使扩增片段的5′末端有NdeI位点，使用了含有NdeI识别序列的引物(CHANdeI引物：序列9)。此外，这种引物在5′末端侧AS1051肽的N末端氨基酸的天冬氨酸的密码子前有作为翻译开始信号的碱基序列ATG(序列9中的核苷酸号9～11)。而且，这种开始密码子是与NdeI识别序列(序列9中的核苷酸号6～11)重复的。
另一方面，作为3′末端侧的引物，为了构建用于后述昆虫培养细胞表达系中的表达质粒，使用了含有HindIII识别序列的引物(CHAHindIII：序列10，HindIII识别序列系核苷酸号10～15)。
借助于使用上述引物的PCR反应，扩增AS1051肽编码基因。PCR反应以94℃15秒、50℃1分钟、72℃2分钟为1个循环，重复25个循环。然后，用苯酚/氯仿处理PCR反应液使Taq聚合酶丧失活性，用乙醇沉淀法将由400碱基对构成的扩增DNA片段纯化后，用限制性内切酶NdeI消化。这种DNA片段与用限制性内切酶NdeI消化的pCHA(NS)采用连接试剂盒(宝酒制备公司制)连接。用所获得的质粒，以感受态细胞法，转化E.coli HB101株，转化体用含有氨苄青霉素的平板培养16小时。
用碱式SDS法从所生长的转化体制备质粒，使用T7引物及SP6引物(Stratagene公司制)，以DNA测序仪A 373(Applied Biosystems公司制)确定碱基序列，从而确认构建了目的AS1051肽表达载体。所制作的表达载体命名为pCHAT7。以上的质粒构建过程显示在图12中。(2)利用大肠杆菌生产肽
为了利用AS1051肽表达载体pCHAT7由大肠杆菌生产AS1051肽，用pCHAT7以感受态细胞法转化E.coli JM109(DE3)(Promega公司制)，在含有氨苄青霉素的平板上在25℃培养2日，选择保有该质粒的菌株。这种E.coli JM109(DE3)是具有连接于lacUV5启动子下游的T7噬菌体RNA聚合酶基因、可通过添加IPTG(异丙基-B-D-硫代半乳糖苷)诱发lacUV启动子进行转录而生成T7噬菌体RNA聚合酶、使得只有T7启动子才能有效地表达这样构建成的菌株。因此，保有上述质粒的菌株可将AS1051肽有效率地表达。
将保有表达质粒的E.coli JM109(DE3)/pCHAT7接种于10个盛有100ml LB-Ap培养基(1％细菌培养用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠、100μg/ml氨苄青霉素)的500ml锥形瓶中，在30℃振荡培养16小时。在培养基中添加终浓度为0.5mM的诱导剂IPTG，再于37℃振荡培养4小时。培养后，离心收集菌体，然后将其悬浮于100ml缓冲液(30mM Tris盐酸pH 7.5，10mM EDTA(乙二胺四乙酸二钠)，30mM氯化钠)中以洗涤菌体。再次用离心分离法收集菌体，将其悬浮在20ml的菌体破碎缓冲液(0.5MEDTA，pH8)中。向此悬浮液中添加蛋白溶菌酶20mg，在0℃处理1小时，将菌体的细胞壁破坏。然后，此悬浮液在超声波破碎器Insonator 200M(Kubota公司制)中以180W功率破碎处理10分钟。破碎液以6000rpm离心20分钟，得到菌体不溶性部分(包含体)。(3)包含体溶解及活化
将从1升培养液得到的包含体溶解在含有10mM EDTA、0.5M Tris盐酸(pH 8.5)的7M盐酸胍溶液28.6ml中，向其中添加71.4ml蒸馏水，然后在4℃保存2天进行空气氧化。然后，将三氟乙酸0.5ml添加于该溶液中使其成为酸性后，离心法除去不溶物，上清液用配备反相柱(Vydac214TP1022，Vydac公司制)的高效液相色谱法分离，获得重组体AS1051(9.0mg)。所获得的纯化肽在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上显示与实施例1<4>所示AS1051具有相同分子量。此外，对所获得的重组体AS1051，也按照与实施例1<5>相同的方法测定其对血小板凝集的抑制活性，结果表明，它不抑制ADP凝集和胶原凝集，而对于瑞斯托菌素凝集和botrocetin凝集则显示与实施例1<4>所获得的AS1051具有同等的抑制活性。
以上述方式获得的重组体AS1051的氨基酸序列按下述方式确定。首先，将1μl 4-乙烯基吡啶添加于含重组体AS1051500μg的2mM EDTA、0.1M Tris盐酸(pH 8.5)溶液(450ml)中，然后再添加赖氨酰端肽酶(和光纯药公司制)15μg，在37℃进行3小时酶消化。消化物按与实施例1<4>所示方法相同的方法供给反相HPLC，分离消化肽片段。各消化片段的氨基酸序列分析的结果确认，重组体AS1051的氨基酸序列是在序列2所示氨基末端结合了甲硫氨酸残基的序列。再者，对于二硫键方式，Cys4-Cys15之间二硫键的存在是用含有两残基的肽片段的质谱(MS)确认的，此外，与实施例1<4>相同，将图7中所示片段A、B、C以二硫键交联的肽片段，以V8蛋白酶(和光纯药公司制)进行酶消化(0.1M碳酸氢铵溶液中，V8蛋白酶3μg)，再分析以反相柱分离的片段肽的氨基酸序列，也确认了Cys32-Cys120、Cys95-Cys112之间二硫键的存在。
所获得的重组体AS1051对小鼠以1000μg/kg静脉内给药时，并未发现血小板减少现象。实施例3利用杆状病毒/昆虫培养细胞表达系统生产抗血栓性单链肽
将实施例2所获得的AS1051基因以昆虫培养细胞表达系统表达，生产抗血栓性单链肽。<1>杆状病毒AS1051表达载体的构建杆状病毒表达系统，是使用MaxBac杆状病毒表达系统(Invitrogen公司制)构建的(参照图13)。即，将实施例2得到的pCHA1用限制性内切酶EcoRI消化，利用DNA平末端试剂盒(宝酒制备公司制)按该试剂盒的实施方案将其平末端化。进一步用限制性内切酶PstI将其消化，将消化物进行琼脂糖凝胶电泳，回收400碱基对的DNA片段。另一方面，以限制性内切酶HindIII将表达载体pBlueBacIII消化，利用DNA平末端试剂盒将其平末端化。然后，进一步用限制性内切酶PstI将其消化，将消化物进行琼脂糖凝胶电泳，回收10,300碱基对的DNA片段。使用连接试剂盒把回收的这些DNA片段连接，利用感受态细胞法转化E.coliHB101，在含氨苄青霉素的平板上选择转化体。所制作的质粒称为pCHAbac。质粒的构建过程表示在图13中。<2>用pCHAbac转化昆虫培养细胞Sf9株并制备重组病毒昆虫培养细胞的转化及重组病毒的制备，是按照MaxBac杆状病毒表达系统(Invitrogen公司制)的实施方案进行的。具体地说，将野生型核多角体病毒(Autographa californicanuclear polyhedrosis virus：AcMNPV)DNA 1μg、pCHAbac3μg，用脂质体法导入昆虫培养细胞草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)9株(Sf9株)内。这种病毒导入细胞在TNM-FM(FBS+)培养液(Invitrogen公司制)中在270℃培养48小时后，将培养液回收，获得病毒溶液。
使这种病毒溶液感染昆虫培养细胞Sf9株，以含有X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)150μg/ml的FNM-FH(FBS+)软琼脂培养基在27℃下培养7日。选择受发生了野生型AcMNPV与pCHAbac重组的病毒感染的细胞(蓝色)。将此细胞用巴斯德移液管从平板上拾取，予以适当稀释，再感染Sf9细胞。上述纯化操作重复2次，取得只有重组病毒存在的病毒溶液。<3>利用杆状病毒/昆虫培养细胞表达系统表达AS1051肽
用重组病毒表达AS1051肽。在细胞培养用烧瓶(NUNCLON260ml，底面积75cm2：Nunc公司制)中的FNM-FH(FBS+)培养液10ml中接种6×106个Sf9细胞，再进一步添加纯化重组病毒3×106cfu，在27℃培养24小时。此后，从烧瓶中取出培养液，添加不含胎牛血清的FNM-FH(FBS-)培养液10ml，再于27℃下培养7日。培养完成后，取出培养液4ml，用Centricon-10(Amicon公司制)浓缩成400μl，得到培养上清浓缩液(10倍浓缩液)。
另一方面，在取出了培养液的烧瓶中添加缓冲液(30mMTris盐酸pH 7.5、10mM EDTA、30mM氯化钠)，用吸移法使细胞从烧瓶壁剥离后，回收细胞悬浮液，用离心分离法将细胞洗涤1次后，再悬浮于缓冲液2ml中。这种细胞悬浮液用超声波破碎机Insonator 200M(Kubota公司制)以180W功率处理5分钟使细胞破碎。破碎后，以10000G离心分离30分钟，通过回收其上清液获得细胞破碎液。对照样品是使感染了野生型AcMNPV病毒的Sf9细胞和未感染病毒的Sf9细胞在与上述相同的条件下培养并进行样品制备而得到的物质。
将以上述方式制备的上清浓缩液5μl，或细胞破碎液10μl，分别在添加1％巯基乙醇的还原条件下进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，进行CBB(考马斯亮蓝)染色。结果显示，在感染了重组病毒的培养上清浓缩液和细胞破碎液两者任何一种中，均有显著量的蛋白在15千道尔顿的位置检出。另一方面，对照组Sf9细胞或感染了野生型病毒AcMNPV的Sf9细胞培养上清液浓缩液及细胞破碎液，在15千道尔顿的位置均无法检出蛋白。这种分子量15千道尔顿的数值，与从蛇粗毒纯化的AS1051的分子量一致。<3>利用杆状病毒/昆虫培养细胞表达系统生产的AS1051
肽的活性
按上述方式得到的昆虫培养细胞内的重组蛋白以及培养上清液中的重组蛋白对botrocetin所引起的vonWillebrand因子与血小板结合的抑制作用，用以下方法测定。
用福尔马林固定的血小板的制备如下进行。向添加了1/10容积的3.8％柠檬酸钠、从健康人采集的新鲜血液以900rpm离心15分钟，在所得到的人类富血小板血浆(platelet rich plasma：PRP)中添加与此相同容积的、含有溶解了2％多聚甲醛的20mM磷酸缓冲液(pH 7.4)的0.15M氯化钠水溶液，在4℃静置保存过夜。保存后，用离心分离法将血小板回收，用含有20mM磷酸缓冲液(pH 7.4)的0.15M氯化钠水溶液洗涤2次。洗涤后，将固定化血小板悬浮于相同溶液中保存。
对于用上述方式获得的固定化血小板，按照Chopek等人的方法(M.W.Chopek等人，Biochemistry，25，3146-3155(1986))进行125I标记von Willebrand因子与固定化血小板结合的抑制试验。即，在所制备的固定化血小板悬浮液中，添加待测定样品、botrocetin及125I标记vonWillebrand因子，在室温反应30分钟，对与血小板结合的von Willebrand因子量用γ计数器(PackardMulti-Prias，Packard公司制)测定。此时，反应液量是50μl，其中待测定样品是添加5μl测定的。
针对从AS1051重组病毒感染Sf9细胞和对照组Sf9细胞按上述方法制备的细胞破碎液，测定了对botrocetin所引起的von Willebrand因子与血小板结合的抑制活性，其结果表示在图14中。此外，针对从AS1051重组病毒感染Sf9细胞及对照组Sf9细胞按上述方法制备的培养上清浓缩液(3倍浓缩液)，测定了对botrocetin所引起的von Willebrand因子与血小板结合的抑制活性，其结果表示在图15中。由此结果可知，感染了重组病毒的细胞破碎液及细胞培养上清液，对von Willebrand因子与血小板结合都能几乎完全予以抑制。由此事实可知，借助于用杆状病毒/昆虫培养细胞表达系统生产，AS1051肽可作为细胞内的可溶性蛋白质及细胞外分泌蛋白质，以具有可抑制血小板与von Willebrand因子结合的活性的形态制备。实施例4 用动物培养细胞表达系统生产抗血栓性单链肽
借助于利用CHO细胞的动物培养细胞表达系统表达AS1051基因，生产了抗血栓性单链肽。
通过用限制性内切酶PstI消化pCHA1而切割出AS1051基因，所获得的DNA片段两端用DNA平末端试剂盒(宝酒制备公司制)平末端，进而在两端连接XhoI接头(宝酒制备公司制)。这种DNA片段用限制性内切酶XhoI消化后，供给琼脂糖凝胶电泳，提取500碱基对的DNA片段。把这种DNA片段插入CHO细胞表达载体pSD(X)(M.Murata等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85，2434-2438(1988))的XhoI位点。这种载体pSD(X)，是具有pBR322与SV40的复制开始点、氨苄青霉素抗性基因、氨甲蝶呤抗性基因，还具有SV40启动子、SV40剪接信号以及poly A附加信号，可在CHO细胞中表达外来基因的载体。以上的质粒的构建过程表示在图16中。
用上述插入了AS1051基因的pSD(X)转化大肠杆菌HB101，从所获得的转化体得到AS1051基因在预期方向上插入载体中的表达质粒，将其命名为pCHASDX。利用这种质粒pCHASDX，依磷酸钙法(Current Protocols in MolecularBiology：Greene Publishing Associates)，转化CHO细胞的二氢叶酸氧化还原酶缺失株。该转化体用含有α-MEM(核酸-)(GIBCO公司制)、10％胎牛血清(FCS)、氨甲蝶呤0.05μM的培养基培养，筛选在染色体上掺入了表达质粒的转化体。
所获得的细胞株以培养基中氨甲蝶呤浓度分阶段上升至0.5μM的方式培养，通过选择氨甲蝶呤抗性株，获得了据信在CHO细胞的染色体上AS1051基因业已扩增的细胞株。使此细胞株的单个克隆增殖而得到细胞，用ISOGEN试剂盒(Nippon Gene公司制)提取全RNA，再使用引物CHA16Y(序列13)及CHA115Q(序列14)，按照与实施例2<2>所述相同的RT-PCR法进行AS1051基因扩增，用琼脂糖凝胶电泳进行扩增DNA分析。结果检出了比从AS1051基因的核苷酸序列推测还大的DNA片段，从而确认AS1051基因的mRNA已在CHO细胞中转录。用这种细胞进行了AS1051肽的表达研究。具体地说，2×104个此细胞在含有α-MEM(核酸-)、10％胎牛血清、氨甲蝶呤0.5μM的培养基5ml中培养4日后，换成含有氨甲蝶呤0.5μM的无血清培养基AS104(味之素公司制)，再培养3日。
将培养完成后的培养基回收，取其中4ml以Centricon-10(Amicon公司制)浓缩至100μl，再将浓缩液依次稀释，按实施例3<4>记载的方法，测定对瑞斯托菌素及botrocetin所引起的vonWillebrand与血小板结合的抑制活性。AS1051肽生产细胞及对照组不生产AS1051肽的细胞的培养上清液，浓缩或稀释成一定浓度的溶液时的抑制活性表示在图17和图18中。如两图中所示，肽生产细胞的培养上清液的抑制活性依赖于浓度，并显示含有活性AS1051。实施例5 突变AS1051肽的生产
将具有从N末端起算第81号(但不包含翻译开始的甲硫氨酸残基)的半胱氨酸残基以丙氨酸取代而突变(以下简称“Cys81Ala变异”)的AS1051肽用大肠杆菌表达，考察其对von Willebrand因子与血小板结合的抑制活性。<1>Cys81Ala变异AS1051肽的生产
根据《PCR Proptocols》(Acadmic Press版)中所记载的位点特异性碱基序列变异法，将变异导入AS1051基因中，使得与AS1051肽的二硫键无关的半胱氨酸残基(序列2中第81号半胱氨酸残基)由丙氨酸取代。以pCHA1作为模板，使用实施例2合成的引物CHANdeI(序列9)及新合成的引物CHAAlaF(序列11)，或使用新合成的引物CHAAlaR(序列12)及实施例2合成的引物CHAHindIII(序列10)，进行PCR反应。将各反应生成物分别进行琼脂糖凝胶电泳，从凝胶中提取扩增的DNA片段。以这些DNA片段作为模板，使用引物CHANdeI及CHAHidIII，进行第二次PCR反应，制作突变基因。用限制性内切酶NdeI消化PCR扩增的DNA片段，进行琼脂溏凝胶电泳，从凝胶中提取360碱基对的DNA片段。把这种DNA片段插入由限制性内切酶NdeI消化的pCHA(NS)的NdeI位点。以上质粒的构建过程表示在图19中。
用这样制作的质粒，以感受态细胞法转化大肠杆菌HB101，在含氨苄青霉素的平板上选择转化体。从这种转化体用碱式SDS法制备质粒，并使用T7引物及SP6引物(Stratagene公司制)，按实施例8所记载的方法确定碱基序列，并选择导入了目的变异的质粒。所获得的表达载体命名为pCHAT7Ala。用pCHAT7Ala转化大肠杆菌JM109(DE3)，按照与实施例2<4>相同的方法培养转化体，表达生产具有Cys81Ala变异的AS1051肽。将菌体蛋白质进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后确认，可在大肠杆菌菌体内作为包含体生产并积累与实施例2<4>所生产的基因重组野生型AS1051肽大致同量的重组肽。<2>Cys81Ala变异AS1051肽包含体的溶解与活化
按照实施例2<4>所记载的方法进行了包含体的溶解与活化。所获得的纯化蛋白在SDS电泳上显示与实施例1<4>所示AS1051的分子量相同的分子量。此外，也确认二硫键方式与AS1051相同。进而对于所获得的Cys81Ala突变AS1051肽，按与实施例1<5>相崐同的方法测定其对血小板凝集的抑制活性时，发现对ADP凝集、胶原凝集并无抑制，而对瑞斯托菌素凝集、botrocetin凝集则有与AS1051相同程度的抑制。再者，对于瑞斯托菌素、botrocetin所引起的yon Willebrand因子与固定化血小板结合，也显示出与实施例1<4>所得到的AS1051及实施例2<4>所得到的重组AS1051有同等的抑制活性(图20)。这样获得的变异AS1051肽，在30℃保存于溶液中或在4℃透析时均是稳定的，反之，重组AS1051肽在30℃保存于溶液中以及在4℃透析时均出现不溶现象。由此结果可判断，重组变异AS1051肽的稳定性比重组AS1051肽更高。实施例6 缩短的AS1051肽的生产
其N末端部分和/或C末端部分缩短的AS1051肽用大肠杆菌表达，考察了缩短的AS1051肽对von Willebrand因子与血小板结合的抑制活性。<1>缩短的AS1051肽的生产
从具有Cys81Ala突变的AS1051肽(称为“AS1051Cys81Ala肽”)构建其N末端的15氨基酸残基或65氨基酸残基和/或C末端的11氨基酸残基缺失的肽的表达系统。即，所生产的肽，是有第16号酪氨酸残基至第126号精氨酸残基的肽(AS1051A-1)，有第67号酪氨酸至第126号精氨酸残基的肽(AS1051A-2)，有第1号天冬氨酸残基至第115号谷氨酸残基的肽(AS1051A-3)，有第16号酪氨酸残基至第115号谷氨酸残基的肽(AS1051A-4)，以及有第67号酪氨酸残基至第115号谷氨酸残基的肽(AS1051A-5)等5种。这些肽的构造概略表示在图21中。其中，氨基酸号码是除翻译开始的甲硫氨酸外所数的数目，也就是序列2中所示氨基酸序列中的氨基酸号码。缩短AS1051肽表达质粒的制作进行如下。用pCHAT7Ala作为模板，对于AS1051A-1使用引物CHA16Y(序列13)和CHAHindIII(序列10)、对于AS1051A-2使用引物CHA67Y(序列15)和CHAHindIII、对于AS1051A-3使用引物CHANdeI(序列9)和CHA115Q(序列14)、对于AS1051A-4使用引物CHA16Y和CHA115Q、对于AS1051A-5使用引物CHA67Y和CHA115Q，分别进行PCR反应。
关于用CHA16Y和CHAHindIII、以及用CHA67Y和CHAHindIII作为引物的扩增产物，是用NdeI使各扩增产物消化后供给琼脂糖凝胶电泳，提取各为310碱基对和160碱基对的DNA片段。将各DNA片段插入pCHA(NS)的NdeI位点，用所获得的重组质粒按氯化钙法转化E.coli HB101，在含氨苄青霉素的平板上筛选转化体。从这些转化体选择那些具有在相对于质粒的靶方向上插入了扩增DNA片段的质粒的转化体。这样获得的表达质粒中，有310碱基对插入片段的被命名为pCHAT7Ala(16Y126R)，而有160碱基对插入片段的被命名为pCHAT7Ala(67Y126R)。
另外，关于用CHANdeI和CHA115Q、用CHA16Y和CHA115Q以及用CHA67Y和CHA115Q作为引物的扩增产物，是用NdeI及HindIII使各扩增产物消化后供给琼脂糖凝胶电泳，提取各为360碱基对、310碱基对、160碱基对的DNA片段。将各DNA片段连接在用NdeI及HindIII消化后的pCHA(NS)上，用所获得的重组质粒按氯化钙法转化E.coli HB101，在含氨苄青霉素的平板上选择转化体。这样获得的表达质粒中，有360碱基对插入片段的被命名为pCHAT7Ala(1D115Q)，有310碱基对插入片段的被命名为pCHAT7Ala(16Y115Q)，而有160碱基对的插入片段者命名为pCHAT7Ala(67Y115Q)。
用上述5种缩短的AS1051肽表达质粒转化E.coli JM109(DE3)，获得各自的转化体。这些转化体按照与实施例2记载的方法一样进行培养，培养后的菌体用显微镜观察时确认，5种转化体均形成了包含体。此外，各转化体的菌体蛋白质用SDS-聚丙烯酰胺电泳分析时确认，在从各缩短的AS1051肽的氨基酸序列推测的分子量位置上，均有显著量的蛋白质。
从各转化体按与实施例2相同的方式制备包含体，把这些包含体溶解在含10mM EDTA、0.5M Tris盐酸(pH 8.5)的7M盐酸胍溶液286μl中后，在4℃保存过夜，然后以每次10μl的方式供给配备了SSC-VP318-1251柱(直径4.6mm，长250mm：仙修科学公司制)的高速液体色谱法，进行含0.1％三氟乙酸的乙腈浓度31％～52％的浓度梯度淋洗，获得分别如图22(AS1051A-1)、图23(AS1051A-2)、图24(AS1051A-3)、图25(AS1051A-4)及图26(AS1051A-5)所示由包含体产生的峰。
将溶解于上述7M盐酸胍溶液中保存过夜的AS1051A-1、AS1051A-2、AS1051A-3、AS1051A-4及AS1051A-5的残余总量，分别用三氟乙酸将其pH调整至酸性后，使用反相柱(Vydac214TP1022，Vydac公司制，直径22mm，长250mm)，以流速15ml、含0.1％三氟乙酸的乙腈浓度30％～60％的浓度梯度淋洗(20分钟)分级收集。所获得的肽分别添加10倍量的胎牛血清白蛋白后冷冻干燥，再溶解于生理盐水中。以这些溶液为样品，按照与实施例1<5>所示方法相同的方法，测定对botrocetin及瑞斯托菌素所引起的von Willebrand因子与福尔马林固定化血小板结合的抑制活性。结果表示在图27中。如图所示，任何一种缩短AS1051肽，凡是在图中示的浓度，都有显著的结合抑制活性。
[产业上的可利用性]
按照本发明，可从在活体内给药时会引起血小板减少的得自蛇毒的肽，获得不会使血小板减少又能抑制与血栓症发病有密切关系的von Willebrand因子与血小板结合的肽，还可提供有希望成为抗血栓药的医药组合物。
序列表序列号：1序列长：38序列型：氨基酸形态：直链状序列种类：肽序列Asp Leu Glu Cys Pro Ser Gly Trp Ser Ser Tyr Asp Arg Tyr Cys Tyr1 5 10 15Lys Pro Phe Lys Gln Glu Met Thr Trp Ala Asp Ala Glu Arg Phe Cys
20 25 30Ser Glu Gln Ala Lys Gly
35序列号：2序列长：126序列型：氨基酸形态：直链状序列种类：肽序列Asp Leu Glu Cys Pro Ser Gly Trp Ser Ser Tyr Asp Arg Tyr Cys Tyr1 5 10 15Lys Pro Phe Lys Gln Glu Met Thr Trp Ala Asp Ala Glu Arg Phe Cys
20 25 30Ser Glu Gln Ala Lys Gly Gly His Leu Leu Ser Val Glu Thr Ala Leu
35 40 45Glu Ala Ser Phe Val Asp Asn Val Leu Tyr Ala Asn Lys Glu Tyr Leu
50 55 60Thr Arg Tyr Ile Trp Ile Gly Leu Arg Val Gln Asn Lys Gly Gln Pro65 70 75 80Cys Ser Ser Ile Ser Tyr Glu Asn Leu Val Asp Pro Phe Glu Cys Phe
85 90 95Met Val Ser Arg Asp Thr Arg Leu Arg Glu Trp Phe Lys Val Asp Cys
100 105 110Glu Gln Gln His Ser Phe Ile Cys Lys Phe Thr Arg Pro Arg
115 120 125序列号：3序列长：21序列型：氨基酸形态：直链状序列种类：肽序列Asp Cys Pro Ser Asp Trp Ser Ser Tyr Glu Gly His Cys Tyr Arg Val1 5 10 15Phe Gln Gln Glu Met
20序列号：4序列长：17序列型：核酸链数：单链形态：直链状序列种类：其池核酸，合成DNA序列CARGARATGA CNTGGGC 17序列号：5序列长：17序列型：核酸链数：单链形态：直链状序列种类：其他核酸，合成DNA序列TCNACYTTRA ACCAYTC 17序列号：6序列长：272序列型：核酸链数：双链形态：直链状序列种类：cDNA来源 生物名：响尾蛇(Crotalus horridus horridus)序列特征序列CAGGAGATGA CTTGGGCCGA TGCAGAGAGG TTCTGCTCGG AGCAGGCGAA GGGCGGGCAT 60CTCCTCTCTG TCGAAACCGC CCTAGAAGCA TCCTTTGTGG ACAATGTGCT CTATGCGAAC 120AAAGAGTACC TCACACGTTA TATCTGGATT GGACTGAGGG TTCAAAACAA AGGACAGCCA 180TGCTCCAGCA TCAGTTATGA GAACCTGGTT GACCCATTTG AATGTTTTAT GGTGAGCAGA 240GACACAAGGC TTCGTGAGTG GTTCAAAGTC GA 272序列号：7序列长：690序列型：核酸链数：双链形态：直链状序列种类：cDNA来源
生物名：响尾蛇(Crotalus horridus horridus)
株名：序列特征
表示特征的记号：CDS
存在位置：66..512
确定特征的方法：P序列CTGAGCAGAC TTGCTACCTG TGGAGGCCGA GGAACAGTTC TCTCTGCAGG GAAGGAAAGA 60ACGCC ATG GGG CGA TTC ATC TTC GTG AGC TTC AAC TTG CTG GTC GTG TTC 110
Met Gly Arg Phe Ile Phe Val Ser Phe Asn Leu Leu Val Val Phe
1 5 10 15CTC TCC CTA AGT GGA ACT CTA GCT GAT TTG GAA TGT CCC TCC GGT TGG 158Leu Ser Leu Ser Gly Thr Leu Ala Asp Leu Glu Cys Pro Ser Gly Trp
20 25 30TCT TCC TAT GAT CGG TAT TGC TAC AAG CCC TTC AAA CAA GAG ATG ACC 206Ser Ser Tyr Asp Arg Tyr Cys Tyr Lys Pro Phe Lys Gln Glu Met Thr
35 40 45TGG GCC GAT GCA GAG AGG TTC TGC TCG GAG CAG GCG AAG GGC GGG CAT 254Trp Ala Asp Ala Glu Arg Phe Cys Ser Glu Gln Ala Lys Gly Gly His
50 55 60CTC CTC TCT GTC GAA ACC GCC CTA GAA GCA TCC TTT GTG GAC AAT GTG 302Leu Leu Ser Val Glu Thr Ala Leu Glu Ala Ser Phe Val Asp Asn Val
65 70 75CTC TAT GCG AAC AAA GAG TAC CTC ACA CGT TAT ATC TGG ATT GGA CTG 350Leu Tyr Ala Asn Lys Glu Tyr Leu Thr Arg Tyr Ile Trp Ile Gly Leu80 85 90 95AGG GTT CAA AAC AAA GGA CAG CCA TGC TCC AGC ATC AGT TAT GAG AAC 398Arg Val Gln Asn Lys Gly Gln Pro Cys Ser Ser Ile Ser Tyr Glu Asn
100 105 110CTG GTT GAC CCA TTT GAA TGT TTT ATG GTG AGC AGA GAC ACA AGG CTT 446Leu Val Asp Pro Phe Glu Cys Phe Met Val Ser Arg Asp Thr Arg Leu
115 120 125CGT GAG TGG TTT AAA GTT GAC TGT GAA CAA CAA CAT TCT TTC ATA TGC 494Arg Glu Trp Phe Lys Val Asp Cys Glu Gln Gln His Ser Phe Ile Cys
130 135 140AAG TTC ACG CGA CCA CGT TAAGATCCGG CTGTGTGAAG TCTGGAGAAG 542Lys Phe Thr Arg Pro Arg
145CAAGGAAGCC CCCCACCTCT CCCCACCCCC CACCTTCCGC AATCTCTGCT CTTCCCCCTT 602TGCTCAGTGG ATGCTCTCTG TAGCCGGATC TGGGTTTTCT GCTCCAGATG GGTCAGAAGA 662TCCAATAAAT TCTGCCTACC CAAAAAAA 690序列号：8序列长：149序列型：氨基酸形态：直链状序列种类：肽序列Met Gly Arg Phe Ile Phe Val Ser Phe Asn Leu Leu Val Val Phe Leu1 5 10 15Ser Leu Ser Gly Thr Leu Ala Asp Leu Glu Cys Pro Ser Gly Trp Ser
20 25 30Ser Tyr Asp Arg Tyr Cys Tyr Lys Pro Phe Lys Gln Glu Met Thr Trp
35 40 45Ala Asp Ala Glu Arg Phe Cys Ser Glu Gln Ala Lys Gly Gly His Leu
50 55 60Leu Ser Val Glu Thr Ala Leu Glu Ala Ser Phe Val Asp Asn Val Leu65 70 75 80Tyr Ala Asn Lys Glu Tyr Leu Thr Arg Tyr Ile Trp Ile Gly Leu Arg
85 90 95Val Gln Asn Lys Gly Gln Pro Cys Ser Ser Ile Ser Tyr Glu Asn Leu
100 105 110Val Asp Pro Phe Glu Cys Phe Met Val Ser Arg Asp Thr Arg Leu Arg
115 120 125Glu Trp Phe Lys Val Asp Cys Glu Gln Gln His Ser Phe Ile Cys Lys
130 135 140Phe Thr Arg Pro Arg145序列号：9序列长：34序列型：核酸链数：单链形态：直链状序列种类：其他核酸，合成DNA序列GGCGGCATAT GGATTTGGAA TGTCCCTCCG GTTG 34序列号：10序列长：40序列型：核酸链数：单链形态：直链状序列种类：其他核酸，合成DNA序列TATCTCGAGA AGCTTACAGC CGGATCTTAA CGTGGTCGCG 40序列号：11序列长：26序列型：核酸链数：单链形态：直链状序列种类：其他核酸，合成DNA序列GATGCTGGAG GCTGGCTGTC CTTTGT 26序列号：12序列长：27序列型：核酸链数：单链形态：直链状序列种类：其他核酸，合成DNA序列GGACAGCCAG CCTCCAGCA TCAGTTA 27序列号：13序列长：35序列型：核酸链数：单链形态：直链状序列种类：其他核酸，合成DNA序列GGTGGATCCA TATGTACAAG CCCTTCAAAC AAGAG 35序列号：14序列长：36序列型：核酸链数：单链形态：直链状序列种类：其他核酸，合成DNA序列CTCAGAAAGC TTTTATTGTT GTTCACAGTC AACTTT 36序列号：15序列长：35序列型：核酸链数：单链形态：直链状序列种类：其他核酸，合成DNA序列GGTGGATCCA TATGTATATC TGGATTGGAC TGAGG 35
Claims (16)
1.一种单链肽，其特征在于：此肽是通过如下方式得到的：(1)将来源于蛇毒的二聚或多聚肽分子变性，所述二聚或多聚肽分子由肽链组成，在所述肽链之间具有链间二硫键，在各肽链内具有三个链内二硫键，该分子具有可抑制von Willebrand因子与血小板结合的活性，并且在体内显示所述活性的最小给药量下会造成血小板减少，(2)还原所述链间二硫键，同时保留至少一个链内二硫键，
所述单链肽具有可抑制von Willebrand因子与血小板结合的活性，在体内显示上述活性的最小给药量下不会造成血小板减少。
2.根据权利要求1的肽，其中所述蛇毒是响尾蛇的蛇毒。
3.根据权利要求2的肽，其特征在于在N末端有序列1所示氨基酸。
4.根据权利要求2的肽，它含有序列2所示氨基酸序列，或其至少含有从第67号酪氨酸残基到第115号谷氨酰胺残基的部分氨基酸序列。
5.根据权利要求4的肽，其特征在于它含有序列2中所示氨基酸序列，或其至少含有从第67号酪氨酸残基到第115号谷氨酰胺残基的部分氨基酸序列，其中，在序列2所示氨基酸序列中，在第4号与第15号、第32号与第120号、以及第95号与第112号半胱氨酸残基之间分别有二硫键。
6.根据权利要求4的肽，其特征在于：序列2所示氨基酸序列的第81号半胱氨酸残基被另一种氨基酸取代。
7.一种单链肽的制备方法，所述单链肽可得自来源于蛇毒的二聚或多聚肽分子，所述二聚或多聚肽分子由肽链组成，在所述肽链之间具有链间二硫键，在各肽链内具有三个链内二硫键，该分子具有可抑制von Willebrand因子与血小板结合的活性，并且在体内显示所述活性的最小给药量下会造成血小板减少，所述单链肽具有可抑制von Willebrand因子与血小板结合的活性，并且在体内显示所述活性的最小给药量下不会造成血小板减少，所述方法包括如下步骤：
使所述多聚肽分子与选自谷胱甘肽和/或半胱氨酸的还原剂共存，由此使所述分子变性，并使链间二硫键还原，同时保留至少一个链内二硫键。
8.一种DNA片段，它编码权利要求1～6中任何一项所述的肽。
9.一种DNA片段，它编码序列2中所示氨基酸序列或其一部分。
10.一种重组载体，它是将权利要求8或9所述DNA片段插入适合于转化选自大肠杆菌、昆虫培养细胞和动物培养细胞的宿主细胞的载体中而形成的。
11.一种转化体，它是用权利要求10所述重组载体转化选自大肠杆菌、昆虫培养细胞和动物培养细胞的宿主细胞而形成的。
12.一种在体内显示抑制von Willebrand因子与血小板结合活性的最小给药量下不会造成血小板数量减少的肽的制备方法，该方法包括：
以适当的培养基培养用权利要求10所述重组载体转化的大肠杆菌；
使权利要求1所述肽表达；以及
使积累于大肠杆菌细胞内的上述肽与蛋白质变性剂共存，然后通过除去蛋白质变性剂或减少蛋白质变性剂的浓度，生成上述肽链内的二硫键。
13.根据权利要求12的方法，其特征在于该肽具有序列2所记载的氨基酸序列，或其至少含有从第67号酪氨酸残基到第115号谷氨酰胺残基的部分氨基酸序列，其中至少一个二硫键是在第4号与第15号、第32号与第120号、以及第95号与第112号半胱氨酸残基之间形成的。
14.根据权利要求13的方法，其中所述肽具有序列2所记载的氨基酸序列，其中二硫键是在第4号与第15号、第32号与第120号、以及第95号与第112号半胱氨酸残基之间形成的。
15.一种在体内显示抑制von Willebrand因子与血小板结合的活性的最小给药量下不会造成血小板数量减少的肽的制备方法，该方法包括：
以适当的培养基培养用权利要求10所述重组载体转化的昆虫细胞或动物细胞；
使权利要求1所述肽表达；以及
将积累于上述细胞内或培养基中的上述肽回收。
16.一种医药组合物，它含有作为有效成分的权利要求1～6中任何一项所述的肽和/或其药学上可接受的盐。
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