TW494104B - Peptide having antithronbotic activity and process for producing the same - Google Patents

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經濟部中央標準局員工消費合作社印製 494104 A7 __^___B7_____ 五、發明説明（i ) 〔技術領域〕 本發明係有關一種具有抗血栓活性之肽及其製法，以 及含有該肽之醫藥組成物，詳言之，尤有關一種於生體內 不會造成血小板減少之得自蛇毒之肽。 〔背景技術〕 如眾所知，以心肌梗塞、腦血栓爲首之所謂血栓症的 發病，與血小板有深切之關係（「血小板」：山中、山崎 編著；醫學書院，P15 8 — 163 (1991)。近年 ，被視爲到達血栓症之初期反應的血小板之於血管內皮下 組織的粘著，學界曾指出，血中蛋白質之一的von Willebrand因子與血小板表面上之糖蛋白質I b的結合， 有其重要性（J.P.Cean 等人，J.Lab.Clin.Med.87,586 -596(1976))。 此二種蛋白質之結合，在一般之狀態下不會發生，據 知，其係在生體內只是因有高剪切應力之狀態才會發生（ T. T.Vincent等人，Blood,65,823 - 83 1 ( 1985 ))。又，作爲 將此結合在生體外觀察之方法，還有使用抗生物質之瑞斯 托菌素（1^31:〇〇61:111)(11.人.11(^3厂(1,6.6.?卜1^11，/1111*〇1111)· Haemostasis ,26, 362-369(1971)，得自蛇毒之蛋白質 b u t r 〇 c e t i n ( Μ · S · R e a t 等人，P r 〇 c · N a t 1 · A c a d . S c i . U. S.A. ,75,4514〜4518(1978))等之物質的方法，己被廣 泛使用。藉著將此等物質添加於血小板浮遊液中，會引起 血小板之凝集，此一凝集係依存於von Willebrand因子與 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 494104 A7 __B7____ 五、發明説明（2 ) 糖蛋白質 I b 之結合（上述 M.A.Howard,B.G.Firkin,M.S· R e ad等人）〇 對於由上述瑞斯托菌素或bGtrGcetiii所造成之血小板 凝集，可顯示阻礙作用之若干種化合物，已由相關人士所 執告。例如，已知的有，金精三羧酸（M.D. Phillips等人 )，Blood，72，1 989 - 1 903 ( 1 988 )，芳香族脒基化合物等之 色素物質（J.D.Geratz等人），Thromb.Haemostasis,39, 41卜425(1978),以及vonWillebrand因子或糖蛋白質I b 之部份片段肽等之（Y.Fuzimura等人），J.BiGl.Chem· 261,381 -385 ( 1986 ),K.Titani 等氏，Proc.Natl.Acad·

Sci .U.S.A.,84,5610-5614(1987))。 又，蛇毒中也可獲得同樣之具有血小板凝集阻礙活性 的肽此點，也已由相關人士所報告，W 0 9 2 0 8 4 7 2 號國際公開手冊中，曾記載得自Crotalus horridus horridus蛇毒及Cerastes cerastes蛇毒之由至少N末端 側的胺基酸序列之相同性高，且分子量約爲2 5 kilodalton之不同的雙鏈所構成之肽。又，由Peng等人 (M. Peng等人，Blood，81，232 卜 2328 ( 1993 )所報告之得 自Ech is carina tus的血小板凝集阻礙肽，在玻管中之活性 ，分子量等方面，與上述肽非常之類似。此等得自蛇毒之 血小板凝集阻礙肽，在玻管中，均係將導因於瑞斯托菌素 或botrocetin之血小板凝集，阻礙於2〜5 # g / m 1以 下之低濃度。 W09 2 0 8 4 7 2號國際公開手冊中，並未就動物 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0'乂29<7公釐） ----!------^^^衣-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、訂 L0 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 494104 A7 B7 五、發明説明（3 ) 投與時之抗血栓性作記載。是以，本發明書之實施例1所 示，發明人曾就同手冊中所記載之得自Crotalus horridus horridus蛇毒之肽的精製法，進行考慮，並對 與記載之肽具有相同性質之肽進行精製，就動物投與時之 作用，進行檢討。結果觀察到，在1 0 O^g/kg此一 少量之投與下，血液中之血小板幾乎完全消失。然而， W09 2 0 8 4 7 2號國際公開手冊中，並未指出動物投 與時之此一問題點，以及其解決之道。 又，由Peng等人所獲得之得自Echis carinatus蛇毒 的肽，也是在S D S聚丙烯醯胺凝膠電泳下之分子量，在 非還原下約爲2 6 kilodalton，在還原下約爲1 4 kilodalton及約1 6 kilodaltoii之兩種肽，因此，被推定 係與上述得自Crotalus horridus horridus蛇毒之肽相同 ，但是，根據報告，其在動物投與時被觀察到有顯著之血 小板減少現象。 得自蛇毒之可阻礙von Willebrand因子與血小板之結 合的肽，其胺基酸序列之相同性均高，在分子量上非常類 似，由上述結果可推論，此等肽兼而具有在生體內引起血 小板減少現象之活性。亦即，此等肽，在玻管內雖可以低 濃度阻礙von Will ebr and因子與血小板之結合，但是，卻 難以利用作爲投與至生體內之抗血栓藥。發明人，曾就血 小板減少之引發機構，作以下之考慮。 可以低濃度阻礙導因於瑞斯托菌素，botrocetin之血 小板凝集的得自蛇毒之肽的胺基酸序列，例如係記載於 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） i----!-----— 4^^.-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 494104 A7 B7 五、發明説明（4 ) W09 2 0 8 4 7 2號國際公開手冊中，根據此一胺基酸 序列，此一得自蛇毒之肽，係與由Drickamer等人所報告 之具有鈣依存性血球凝集活性之肽（稱爲C型血球凝集素 )(K.Drickamer,J.Biol.Chem.,263,9557-9560(1988) > 保持半胱胺酸殘基之大致位置，以及據信對於血球凝集活 性有必要之共通序列的一部份（W.I.Weis等人，Science， 254，1608-1615 ( 1991)。 由蛇毒，此外還可獲得由Botrops jararaca蛇毒所得 之 botrocetin(Y.Usami 等人，Pr oc . Nat 1 . Acad . Sc i . U.S.A. ,90,928-932(1993),由 Crotalus atrox 蛇毒所得之 響尾蛇血球凝集物質（J.Hira bay as hi等人，J. Biol. Chem·,266, 2320-2326(1991)，由 Trimerisurus albolatris 戶斤得之 alboaggregin(E.Yoshida 等人， Biochem.Biophys.Res.Cominiiii· , 191, 1386-1392(1993)等 等之在胺基酸序列上與C型血球凝集素相同性之肽。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 此等肽也是與C型血球凝集素，保持半胱胺酸殘基之 大致位置，以及對於血球凝集素活性有必要之共通序列的 一部份。又，C型血球凝集素據知還具有將細胞、細菌等 ，介於其細胞膜上之糖蛋白質（糖鏈）予以凝集之活性（ 上述 K.Drickamer.J.Hirbayashi 等人）。 於玻管中測定血小板之凝集能時，許多場合係在採血 血液中添加作爲抗凝固劑之檸檬酸、檸檬酸鈉、乙二胺四 醋酸（EDTA )作爲抗凝固劑，在血小板凝集測定系中 ，由於螯合有鈣，因此鈣依存性之反應，受到妨礙。因此 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 494104 A7 B7 五、發明説明（5 ) ，具有血小板凝集阻礙活性之上述得自蛇毒之肽，其是否 具有血球凝集活性，在玻管中難以檢出。 是以，得自蛇毒之肽，在動物投與時，在生體內之鈣 存在下，會表現出C型血球凝集素活性，造成血小板之凝 集，可推論其爲微血管內之凝集塊聚集，甚至血小板減少 現象被觀察到的要因之一。 是以，爲了使在玻管內可阻礙von Wi 1 1 ebrand因子結 合於血小板之得自蛇毒的肽，在動物實驗等之生體內可作 爲有效之抗血栓藥作用，獲得變換成不會造成血小板減少 之分子的新穎活性肽，誠有其必要。 〔發明之概要〕 本發明係基於上述觀點開發而成者，爲了獲得作爲抗 血栓藥有效之藥劑，其課題係在提供一種不會造成血小板 減少，且可阻礙von Willebrand因子結合於血小板之肽， 以及其製法。 發明人等，爲了解決上述課題，銳意硏究的結果發現 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ，將得自蛇毒之多肽在一定之條件下解離獲得之單鏈肽， 在生體內投與時，不會造成血小板之減少，且具有抗血栓 活性。 具體言之，本發明係一種肽，其特徵係在：此肽係由 具有可阻礙von Willebrand因子與血小板之結合的活性之 得自蛇毒的多肽所獲得之單鏈肽，於生體內，在顯示上述 活性之最小投與量下，在實質上不會造成血小板之減少者 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 494104 A7 B7 五、發明説明（6 ) 。（以下，稱爲「本發明之肽或「活性肽」）。 本發明又提供一種單鏈肽之製法，該肽具有可阻礙 von Willebrand因子與血小板之結合的活性，於生體內， 在顯示上述活性之最少投與量下，在實質上不會造成血小 板減少；其特徵係在：藉著使具有阻礙vgh Willebrand因 子與血小板之結合的活性之得自蛇毒的肽，與蛋白質變性 劑，谷胱甘肽及/或半胱胺酸共存，使構成上述多肽之肽 鏈內之二硫鍵在實質上獲得保存的狀況下，將肽鏈間之二 硫鍵結切斷者。 本發明又提供一種肽之製法，具有可阻礙von i 1 1 ebrand因子與血小被之結合的活性，於生體內，該肽 在顯示上述活性之最少投與量下，在實質上不會造成血小 板減少；其包括： 一將由嵌入有將上述肽或其一部份編碼之DNA片段 的載體所轉形之大腸菌，以適當之培養基培養之過程； 一將上述之肽予以表現之過程；以及 一在將蓄積於大腸菌細胞內之上述肽與蛋白質變性劑 共存後，藉著將蛋白質變性劑除去，或是減少蛋白質變性 劑之濃度，而生成上述肽鏈內之二硫鍵結者。 本發明又提供一種肽之製法，該肽具有可阻礙von Willebrand因子與血小板之結合的活性，於生體內，該肽 在顯示上述活性之最少投與量下，在實質上不會造成血小 板減少；其包括： 一將由嵌入有將上述肽或其一部份編碼之D N A片段 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2丨0Χ297公釐） i----1-----— -- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T .1# 494104 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（7 ) 的載體所轉形之昆蟲培養細胞或動物培養細胞，以適當之 培養基培養之過程； 一將上述之肽予以表現之過程；以及 一將蓄積於上述細胞內或培養基中之上述肽，予以回 收之過程者。 本發明又提供一種醫藥組成物，含有上述之肽及/或 藥學上可容許之塩作爲有效成份者。 又，於本說明書中，單單稱「肽」之場合，有時係指 單鏈肽，有時也指多肽。 以下，茲將本發明詳細說明之。 < 1 >本發明之肽 本發明之肽，其特徵係在：此肽係由具有阻礙von Willebr* and因子與血小板之結合的活性之得自蛇毒的多肱 所獲得之單鏈肽，於生體內，在顯示上述活性之最小於與 量下，在實質上不造成血小板之減少表。 作爲得自蛇毒之多肽，只要是具有能阻礙von Willebrand因子與血小板結合之活性的多肽，均可適當地 用於本發明中，其實例爲：Crotalus horridus horridus, Cerastes ceras tes,Ech i s carinatus, Trimeresurus albolabris,Vipera palaestina 等所產生 之得自蛇毒的肽。其中較好的是，由Crotalus horridus horridus所產生之得自蛇毒的肽。 作爲本發明之狀，其具體例係由得自（Crotalus -10 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） i ^------ 衣-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 ·— 494104 A7 ____B7_ 五、發明説明（8 ) horridus horridus之蛇毒肽所獲得之單鍵肽，可舉實例 爲在N端具有由序列表序列編號1所示之胺基酸序列之肽 。其他之可舉實例爲具有序列表序列編號2所示之胺基酸 序列，且在序列編號2中，由N末端起算之第4號及第 1 5號，第3 2號及第1 2 0號，以及第9 5號及第 112號之半胱胺酸殘基，分別作二硫鍵結之肽。又，此 一肽也可以基因工程之手法生產，此時，序列表序列編號 1或2中所示之胺基酸序列的N末端，有時會附加有相當 於轉譯開始字碼子之甲硫胺酸殘基，此種在N末端附加有 甲硫胺酸殘基之肽，也包含於本發明之肽內。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 又，依習知之基因工程手法，使用大腸菌，昆蟲細胞 或動物培養細胞等，可生產具有序列表序列編號2中所記 載之胺基酸序列或其一部份，且具有上述活性之肽。以大 腸菌爲宿主將本發明之肽表現時，係在細胞內形成封套體 ，藉著將此一封套體可溶化，並使二硫鍵結確實地形成， 可獲得具有活性之肽。此時，藉著將與二硫鍵結無關之半 胱胺酸殘基，以半胱胺酸以外之胺基酸，例如以丙胺酸、 絲胺酸等取代，可防止錯誤之二硫鍵結形成，可期待所獲 得之胺的安定性之提高。再者，序列編號2中所示之胺基 酸序列中，有對於活性並非爲必要之胺基酸或區域，也可 製作1個或2個以上之發生有胺基酸的取代，缺失、嵌入 之肽。例如，如後述實施例6所示，由具有序列編號2所 示之胺基酸序列之肽，N末端之1 5胺基酸殘基或6 5胺 基酸殘基及/或C末端之11胺基酸殘基即使有缺失，仍 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) ~ — _ 11 _ 494104 A7 _^_B7___ 五、發明説明（9 ) 能保持活性。 有關氮基序列之部位特異變異體的製作，可採用市售$ 道具（例如Mutan-G、Mutaii-K:寶酒製造公司），也可如 P C R Protocols(Academic Press版）中所記載，利 用PCR反應獲得變異體。 如上所述之經單鏈化之本發明肽，可保持阻礙von Willebrand因子與血小板之結合的活性/且多肽所具有之 減少血小板之狀況也在實質上不會發生。具有此種性質之 本發明肽，在生體內可顯示抗血栓活性，可作爲有甩之抗 血栓藥。 <本發明之肽之製法> 由蛇毒肽獲得具有阻礙von ffillebrand因子與血小板 之結合的活性，而不會造成血小板減少之肽的手段之一， 例如可採用以下之方法。 生體內發生之蛇毒肽投與時之血小板減少，在鈣之存 在下產生之蛇毒肽的血球凝集素活性，是爲其一要因時， 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 藉著將與血球凝集劑分子中複數個存在之糖結合部分別分 離，據信可使將血小板交連之活性不會觀察到。爲了將糖 結合部位分離，例如將多肽- 一切斷或單鏈即可。 將多肽分成單鏈，已爲人充份明瞭的是，將多肽還原 ，或是在還原後，將半胱胺酸殘基的遊離硫赶基羧甲基化 ，羧醯胺基甲基化、吡啶基乙基化等，可予保護使其安定 化。然而，水溶性之蛋白質，一般而言，許多之親水性胺 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -12 - 494104 A7 B7__ 五、發明説明（10) 基酸殘基的側鏈，具有朝外側之髙次構造，以强變性條件 ，其三次構造又會將半胱胺酸殘基間之二硫鏈結切斷而還 原，藉由還原後之半胱胺酸殘基的遊離硫赶基的保護等， 二次構造會喪失，而對於水不溶化之場合亦是不少。如後 述實施例1所示，由Crotalus horridus horridus所得之 雙鏈肽，可藉羧醢胺甲基化、還元吡啶基乙基化、由氫硫 基乙醇所達成之還原等，變化成難溶於水之肽。

Peng等人（M.Peng等人，Blood ,81,232 1 - 2328 ( 1993 ) ，曾報告，在將由Echis Carinatus所得之雙鏈肽還原後 ，經羧醯胺甲基化之反應混合物，也具有與雙鏈相同之血 小板凝集阻礙活性。此處所觀察之凝集阻礙是否特異，且 生成之那一種分子具有活性等點，完全沒有報告。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 是以，本發明係係針對得自蛇毒之肽，在穩定之變性 條件下實施不會造成顯著之高次構造破壞的穩定性還原， 可將雙鏈肽中之單鏈內，亦即分子內之二硫鍵結在實質上 予以保存，並將鏈間，亦即分子間之二硫鍵結切斷，可獲 得原先之高次構造，至少維持於不會喪失活性之程度的高 水溶性單鏈肽。 本發明中，活性肽，係可利用蛇毒中所含之可阻礙 von Willebrand因子結合於血小板的多肽製造。例如，可 利用由Crotalus horridus horridus之毒液，或是其凍結 乾燥品所得之肽製造。又，von Willebrand因子之結合於 血小板的阻礙，在玻管中，可根據對於瑞斯托菌素或 botrocetin所造成之血小板凝集（以下只稱之爲「瑞斯托 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ~ 494104 A7 B7 五、發明説明（U) 菌素凝集」或「botrocetin凝集」）所造成之阻礙進行調 査0 將此種多肽，在保持肽鏈內之半胱胺酸殘基間之二硫 鍵結的狀況下，將肽鏈間之二硫鍵結切斷而予單鏈化之具 體手段，包括將多肽與蛋白質變性劑，谷胱甘肽及/或半 胱胺酸共存，使之反應之方法。作爲蛋白質變性劑，可採 用塩酸化胍，尿素等等，塩酸化胍之終濃度可採用 0. 01M以至飽和濃度，宜爲1M〜6M之濃度範圍。 又，谷胱甘肽及/或半胱胺酸係用以在穩定之條件下進行 還原，將其使用時，適當之濃度範圍爲0.ImM〜 1 0 OmM，宜爲ImM以至5 OmM之濃度範圍。 反應係在含tr* is塩、磷酸塩、乙酸塩等之緩衝液、蒸 餾水、或在此等液體中添加醇類等之有機溶媒等所成的溶 液中實施，在溶液之狀態下，藉著於一 1 〇 °C〜1 0 0 °C ，宜在1 0°C〜4 0°C之範圍內實施，可獲得目的之單鏈 之肽。又，以凍結，融解處理也可獲得。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 以上述方式製造之活性肽，可藉凝膠過濾，離子交換 、吸附、逆相等之各種層析法，或是親合柱層析法，超過 減、電泳、逆流分配等之方法的組合而單離。 又，本發明之肽，可利用使用將其編碼之基因的基因 重組技術，使用微生物或培養細胞製成。將本發明編碼之 基因，係可由：得自Crotalus horridus horridus之毒腺 的c DNA基因庫，或是由組織所獲得之基因體DNA基 因庫，實施由使用由胺基酸序列之一部可預想之DNA片 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ~~ 494104 經濟部中央標準局員工消費合作社印裂 第83111328號專利申請案 中文說明書修正頁 A7 民國87年8月修正夺, __ B7 二二：五、發明説明（12 ) 段的雜交所執行之篩選，或是利用來自以表現基因庫 DNA之大腸菌爲首的原核生物、酵母等之真菌類、昆蟲 或動物等之培養細胞等的轉形細胞之表現蛋白質的篩選而 獲得。又，附帶一提供參考的是，本發明之肽的胺基酸序 列，也可藉組合使用對應於各胺基酸之字碼子而設計的 D N A序列，以及適當之調節序列而合成。 例如’可由Crotalus horridus horridus之毒腺抽出 全RNA，進一步精製mRNA部份，將此一 mRNA作 爲框構，合成cDNA，並使用噬菌體等調製cDNA基 因庫，藉由使用由此一 c DNA基因庫以本發明肽之胺基 酸序列爲基礎製作的寡核苷酸探子之雜交法，可選擇具有 將本發明肽編碼之cDNA的純系。又，作爲用於雜交之 探子，可藉使用以本發明肽之胺基酸序列爲基礎製作的寡 核苷酸引子之RT-PCR法，使手由mRNA放大之DNA片段。 保持具有將後述實施例所獲得之本發明肽編碼之基因 的質體 PCHA1 之 E.Coli HBlOl/pCHAl ( E· Col i AJ 1 3023 )，由 1994 年 8 月 12 日開始，以 FERMBP-4781之寄存編號，根據布達佩期條約，國際寄存於日本通 商產業省工業技術院生命工學工業技術研究所（郵遞區號 305，日本國茨城縣筑波市東一丁目1番3號）中。p.CHAl ( 於大腸桿菌HB101中）亦寄存於食品工業發展研究所，寄 存曰期爲民國83年11月30日，編號爲94005 9。 藉由將所獲得之基因，嵌入在宿主內可表現之起動基因， 具有可開始轉譯信號等之質體或病毒載體的DNA，對於 本紙張尺度適用中國國家椋準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） I n 11 n I 丨 — — I 5^* n ϋ I -「I 訂 I n 111 I 線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -15 - 494104 A7 B7 五、發明説明（13) 以太腸菌爲首之原核生物、酵母等之眞菌類、昆蟲或動物 等之培養細胞，實施上述質體之導入或病毒之感染，可於 適當之條件下，表現生產所企求之肽。此時，菌體或細胞 內也可蓄稹所企求之肽，也可使其在培養液中分泌生產。 又，也可以在所企求之肽中附加有作爲轉譯開始字碼子之 甲硫胺基的形態直接表現，也可以分泌信號序列附著之形 態表現，藉由在分泌過程切斷除去的信號序列，可生產所 企求之肽。此外，還可作爲與其他之適當蛋白質（例如大 腸菌麥芽糖結合蛋白質）融合之嵌合體蛋白質予以表現， 此一場合下，在獲得表現之嵌合體蛋白質後，可以適當之 蛋白酶或化學方法，予以切斷而獲得企求之蛋白質。依此 一方式經表現生產之蛋白質，不具有由高次構造之狀態所 求得之活性時，或是具有弱的活性時，可藉適當之變性條 件，氧化還原條件處理，予以變化成具有活性之高次構造 〇 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 以大腸菌爲宿主之生產本發明之肽時，如前所述，生 成之肽係在細胞內形成封套體，藉著將此一封套體可溶化 ，正確地形成二硫鍵結，可獲得具有活性之肽。具體而言 ，藉由將：由嵌有將本發明之肽或其一部份編碼之DNA 片段的載體所轉形之大腸菌，以適當之培養基培養，表現 上述肽，將大腸菌細胞內蓄稹之上述肽與蛋白質變性劑共 存後，藉由除去蛋白質變性劑，或是減少蛋白質變性劑之 濃度，而生成在上述肽鏈內之二硫鍵結，可獲得本發明之 肽。此一二硫鍵結，當上述肽具有序列編號2所示之胺基 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 16 494104 A7 B7 五、發明説明（14 ) 酸序列時，在序列編號2內，係在第4號及第15號、 3 2號及第1 2 0號，以及9 5號及第1 1 2號之半胱胺 酸殘基間形成。 又，藉由，將：由嵌有將上述肽或其一部份編碼之 D N A片段的載體所轉形之昆蟲培養細胞或動物培養細胞 ，以適當之培養基培養，表現上述之肽， 將上述細胞內 或培養基中所蓄積之上述肽回收，可獲得本發明之肽。 < 3 >本發明之醫藥組成物 依上述方式獲得之肽，在動物投與時，也不會造成血 小板之減少，又，在投與至血栓模型動物時，可顯著地抑 制血栓之形成。 本發明係在生體內具有抗血栓性之物質，其特徵係在 :作爲對於玫紅三羧酸（Aurin tricarbo xylic acid) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 等蛋白質之非特異吸附性高的色素物質以外，首先能阻礙 von Willebrand因子結合於血小板者。具體言之，由得自 蛇毒之肽，以還原等之方法所獲得之單鏈肽，具有可阻礙 von Willebrand因子結合於血小板的活性此點，係首先揭 示，本發明又提供一種在生體投與時不會引起血小板減少 之作爲抗血栓藥非常具有期待性之醫藥組成物。 本發明之醫藥組成物，含有本發明之肽及/或其藥學 上可容許之塩作爲有效成份。其也可作爲一種或二種以上 之混合物使用。又，其中可含有本發明肽以外之具有抗血 栓作用的物質。此一場合下，本發明之肽，非爲其醫藥組 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 17 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 494104 A7 ___B7____ 五、發明説明（15) 成物中之主成份亦無妨。又，使用於一般製劑中之其他材 料，例如血清蛋白素等之蛋白質、緩衝作用、滲透壓調整 用之塩、擔體、賦型劑等之成份，亦可配合。 作爲劑型，其可舉實例爲錠劑、膠嚢劑、細粒劑、糠 漿劑、坐藥、軟育劑、注射劑、點眼劑等等。其中，較好 的是注射劑。又，有關投與方法，可爲靜脈內投與，皮下 投與，經口投與，除此之外，也可爲點眼，經腸等。其中 較好的是靜脈內投與。 投與動物或人類時之投與量，作爲本發明之肽及/或 其藥學上可容許之塩的量，通常在0.lAg/kg〜 1 0 Omg/kg之範圍內，可發揮所期望之效果，在此 範圍內，可選擇能獲得最良好之藥效者。 〔實施發明之最佳形態〕 以下，茲將本發明之實施例說明之。 實施例1 得自Crotalus horridus horridus之抗血栓性 單鏈肽之調製 < 1 > 得自 Crotalus horridus horridus之且有阻礙 von Willebrand因子結合於血小板的活性之肽的調製 首先，由得自 C r 〇 t a 1 u s h 〇 r r i d u s h 〇 r r i d u s 之蛇毒， 將具有阻礙von Willebr and因子結合於血小板之活性的肽 之精製，以下述方法之瑞斯托菌素凝集阻礙活性爲指標實 施之。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 一----ί-------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ 18 494104 五、發明説明 A7 B7

16 將1/10容量之3. 8%檸檬酸鈉，添加於由健康 請 閱 讀 背 \δ 之 注 意 事 項 再 填 寫裝 本衣 頁 人所採得之新鮮血液中，將該血液在9 0 0 r pm下離心 1 5分鐘，獲得人類多血小板血漿（paletelet rich plasma)，在其中添加同容之含2%多聚甲醛的生理食塩 水’以4 °C靜置一夜保存之，保存後，以離心分離法將血 小板回收，並以含20mM磷酸（ρΗ7· 4)之生理食 訂 塩水洗淨二次，將測定樣本添加於依此所調製成之福馬林 固定化血小板溶液中，而後，將人類血漿（終濃度 〇_ 12%)，瑞斯托菌素硫酸塩（Sigma公司製）（終 濃度0· 5mg)依序添加之，在振盪攪拌後，以肉眼觀 察是否有對血小板凝集之阻礙活性。反應溶液量爲5 0 //又，樣本係將適當稀釋者適宜地添加2〜20//又。 將得自Crotalus horridus horridus之蛇毒凍結乾燥 品（Sigma公司製）（終濃度0. 5mg/mj?) lg， 添加於含20mM tris塩酸（PH7. 4)之生理食塩 線 經濟部中央標準局員工消費合作來印製 水（1 Omj?)中，將不溶物於3000 r pm下離心 10分鐘下予以除去而後，以Sephadex G — 7 5 (微細 )(法馬西亞公司製）（直徑5· 0cm，長90cm) ，相同之緩衝爲溶媒，就所得之上清液進行凝膠過濾層析 ，將其區分採取於分級管中，集中溶出體積7 5 0〜 8 8 5m$之部份，分三次每次1 5m$通過苯甲脒賽法 羅斯（法馬西亞公司製）（直徑1. 6cm，長5cm) 柱，收集非吸附部份。

而後，利用排除分子量爲1 0 0 0 0之超濾膜（YM 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 一 19 一 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 494104 A7 ____B7__ 五、發明説明（17) 1 0，亞米康公司製），將此一部份過滤濃縮，將濃縮部 份以5 0mM醋酸銨緩衝液（ρΗ4· 5)作溶媒取代。 而後，予以吸附於使用同溶媒所平衡化之CM赛法羅斯· CL68 (法馬西亞公司製）（直徑2. 6cm，長3〇 cm )離子交換層析柱中，以初溶媒洗淨5 0分鐘後，由 0 · 5 Μ醋酸銨緩衝液（p Η 6 · 4 )以1 5 %混合於初 溶媒之溶液，以至以5 0 %混合部份溶媒之溶液的直線濃 度梯度（8 1 0分鐘）進行溶出。區分採取溶出體稹 6 lOmj?〜6 5 Omj?爲止之溶出部份，依與上述相同 之方式以超濾膜濃縮後，予以置於含2 0 m M tris塩酸 (Ρ Η 7 . 4 )之生理食塩水溶液中作溶媒取代。又，由 溶出體積5 4 Omi?〜5 8 Omj?爲止之溶出部份同樣地 存在有血小板凝集阻礙活性，因此，就此部份亦進行同樣 之處理。 取由離子交換層析柱所獲得之各血小板凝集阻礙活性 部份濃縮物的一部份，以使用逆相柱（S S C — VP — 3 0 4，仙修科學公司製，直徑4. 6mm，長2 5 0 mm)之高速液體層技術，以包含0.1%三氟醋酸之乙 睛濃度3 1%〜5 2%之直線濃度梯度（2 0分鐘間）予 以溶出進行分析的結果顯示，兩個部份中分別含有單一之 肽（圖1，2)。又，根據SDS聚丙烯醯胺電泳得知， 包含於兩個部份中之此等肽，在非還原下均顯示分子量約 爲1 4 kilodaltoii及1 5 kilodaltoii之兩條條帶，均是類 似之雙鍵肽序列編號1、3 )。是以，將以離子交換柱在 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T L· 20 494104 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（18) 後半溶出（溶出體稹6 1 Omj?〜6 5 Om$)之溶出物 命爲CH — 1 ，在前半溶出（溶出體積5 4 Omj?〜 5 8 Omj?)之溶出物命爲CH— 2。 C Η - 1之胺基末端側之胺基酸序列分析，係依次下 之方式實施。將CH—1約50#g溶解於含有0. 5 tris塩酸（pH8. 5) ，l〇mM乙二胺四醋酸二鈉（ EDTA · Na 2 )之7M塩酸胍水溶液1 0 0 "又中後 ，添加4 一乙烯基吡啶（1//$)，三正丁基膦（2a又 )，在室溫下令其反應一晚後，進行還原吡啶基乙基化。 而後，將反應液以使用TSK ge卜Pheny卜5PW-RP (東曹公 司製，直徑4. 6mm，長度75mm)之柱的液體層析 術，將產生之各肽鏈分離。溶出在實施時，流速爲lmj? /分鐘，使用之直線濃度梯度爲含有0. 1 %三氟醋酸之 乙睛3 1%〜5 2%，溶出時間爲2 0分鐘。繼之，將分 離之各肽鏈凍結乾燥後，予以溶解於3 0 %乙睛，而後， 使用蛋白質定序器4 7 0A (阿普來得biosystems公司製 ),進行由胺基末端而始之胺基酸序列的解析。結果顯示 ，各鏈之胺基末端側的胺基酸序列，係如序列表序列編號 1，3所示，此等序列分別係與記載於 W09 2 0 8 4 7 0號國際公開手冊中所記載之由相同蛇 毒所單離之肽CHH — B之α鏈及鏈之N —末端側的胺 基酸序列一致。又，由使用圖1、2所示之逆相柱的分析 中之CH—l、CH—2的保持時間，據信CH—2係與 同手冊中所記載之CHH — A相同，CH — 1係與同手冊 -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） r---l·.-----—I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T L# 494104 A7 B7 五、發明説明（19) 中所記載之CHH—B相同。 <2>CH—1於動物投與時之活性 就上述所獲得之C Η - 1投與於土撥鼠時的血小板數 ，進行測定。又，將CH-1溶解於生理食塩水中達10 一 1 0 0 〃 g/m又之濃度，在將其靜脈投與至土撥鼠約 5分鐘後，由腹部大動脈採取動脈血。採血中，係使用 〇 · 3 2 %檸檬酸作爲血液凝固阻礙劑，以Sysmex E — 2 0 0 0 (東亞醫用電子）就白血球（WBC)、紅血球 數（RBC)及血小板數（PLT)進行測定。 投與量及各血球數値係如表1所示，依存於投與量， 只有發現血小板之減少，在1 0 0 〃 g/k g之投與量下 ，確認有大致完全之血小板的消失。 —：------------IT------ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 表1 測定項目 生理食塩水 CH - 1 (μ g/k S ) 10 3 0 3 0 10 0 10 0 WBC X107//1 35.0 18.0 20.0 19.0 19.0 21.0 RBC xW/μΙ 465.0 440.0 440.0 457· 〇 468.0 448.0 PLT xlOV/zl 38.3 ^ 41.0 9.6 13.7 0· 1 0.8 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 22 494104 A7 B7 ______ 五、發明説明（2〇) < 3 >將雙鏈之CH — 1形成爲單鏈之嘗試 (1 ) CH — 1之還原羧醯胺甲基化

CH — 1之還原羧醯胺甲基化，係以下述之過程實施 。首先，將CH — 1 2 0 0#g溶解於含0. 5M tr is塩酸（pH8· 5) ，10mM乙二胺四醋酸二鈉（ EDTA*Na2)之7M塩酸胍水溶液500//^中， 然後再添加二硫蘇糖醇水溶液（2 Omj^/mg ) 5 0 #又，於3 7 °C下保存1小時。而後，於此溶液中添加 5 0 a/ $之碘乙醯胺水溶液（5 Omg/mj?)，在遮光 下於室溫下令其反應3 0分鐘。 反應後，使用透析膜Spectra/porl(Spectra公司製： 透過界限分子量6 0 0 0〜8 0 0 0 ),對於5升之含 2 0 m M tris塩酸（ρΗ7. 4)的 0. 15Μ 氯化鈉 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 水溶液，在4°C下進行一夜之透析。透析後，由於會生成 白色之不溶物，故在其中添加終濃度爲2 %之界面活性劑 Tween - 2 0，但不溶物未溶解。繼之，將白濁之本溶液 ，以使用仙特理光- 1 〇 (亞米康公司製）之超過濾予以 濃縮之，最後予以形成爲1 0 0 a 之懸浮液。在將此懸 浮液弱離心後，使用其上清液1 〇 # P，以< 1 >所示之 方法調査對於瑞斯托菌素凝集之阻礙活性，但是並未觀察 到阻礙活性。據信，此一結果是因爲，以上述方法經還原 羧醯胺甲基化之CH-1，不具有瑞斯托菌素凝集阻礙活 性，或是因爲，其對於水之溶解度非常之低。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -23 - 494104 A7 _B7___ 五、發明説明（21) (2 ) CH — 1之還原吡啶基乙基化 C Η - 1之還原吡啶基乙基化，係依以下之方式實施 。首先，將CH—l 200#g溶解於含有0· 5M tris塩酸（PH8· 5) ，10mM乙二胺四醋酸二鈉（ EDTA · Na 2 )之塩酸胍水溶液2 0 0 " $中，然後 再將4 一乙烯基吡啶（1#ί)，三正丁基膦（2"芡） 添加於其中，在室溫下令其反應一夜。而後，以利用逆相 柱（SSC — VP304，仙修科學公司製，直徑4· 6 mm，長2 5 0mm)之高速液體層析術，以含有0. 1 %三氟醋酸之乙腈濃度10 %〜5 9 %的濃度梯度溶出（ 2 0分鐘）進行溶出，將生成物以二種類之吡啶基乙基化 肽的混合物區分採取之。 在將區分採取之部份凍結乾燥後，將其全量溶解於含 2 0 m M tr* is塩酸（ρ Η 7 . 4 )的生理食塩水5 0 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Α又中，使用其中之1 〇 # 32依< 1 >所示之方法觀察瑞 斯托菌素凝集之阻礙活性，但並未觀察到。此一結果，據 信係導因於上述方法經還原吡D定基乙基化之C Η — 1，不 具有瑞斯托菌素凝集阻礙活性，或是導因於其對於水之溶 解度非常之低。 (3 ) CH — 1之利用氫硫基乙醇的還原及二硫鍵之再形 成CH — 1之利用氫硫基乙醇之還原，以及還原後之利用 使用還原型-氧化型谷胱甘肽之氧化還原緩衝液的二硫鍵 之再形成操作，係依下述方法實施。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 24 494104 A7 B7_—_ 五、發明説明（22)

首先，將CH - 1 240"g溶解於含〇· 5M tris塩酸（PH8. 5) 、10mM乙二胺四醋酸二鈉（ EDTA · N a 2 )之7M塩酸胍水溶液1 2 0 β又中， 在3 7 °C下放置1 0分鐘。而後，在此溶液中添加1 / 9 量之1 0 %氫硫基乙醇水溶液，使氫硫基乙醇之終濃度成 爲1 %後，在3 7 °C下放置1小時。而後，將含有0 · 5 M tris塩酸（ρΗ8· 5) ，10mM乙二胺四醋酸二 鈉（E D T A · N a 2 )之7 Μ塩酸胍水溶液稀釋成 2/7之溶液（塩酸胍濃度2Μ，以下，簡稱之爲「2Μ 塩酸胍調製液」）2 m坆添加後，以仙特理光一1 0 (亞 米康公司製）進行超過滤濃縮。而後，就所獲得之濃縮液 添加2M塩酸胍調製液2mj?，再進行超過濾濃縮，重複 此一濃縮操作數次，除去氫硫基乙醇，獲得含CH — 1還 原物之2M塩酸胍調製液3 8 0 # $。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 將依此所獲得之含CH — 1之還原物的溶液，分成 7 6 # j?之五份，進行利用使用還原型一氧化型谷胱甘肽 氧化還原緩衝液的二硫鍵之再形成操作。就各溶液，添加 3 7 4 a j?之2 Μ塩酸胍調製液，再以表2所示之比例， 添加混合有氧化型及還原型谷胱甘肽之溶液5 0 〃 Ρ，再 將內部經置換氮氣之容器密封之，在室溫下令其反應一夜 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 494104 A7 B7 五、發明説明（ 表 2 氧化還原緩衝液 之組成 緩 衝液 1 2 3 4 5 50mM氧化型谷胱 甘肽水溶液 1 2 1 2 4 lOOmM還原型谷 胱甘肽水溶液 5 5 1 1 1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 數値係溶液之混合比 將此五種反應液，以及利用氫硫基乙醇還原後立即之 溶液，以利用逆相柱（s S C - V P 3 0 4，仙修科學公 司製，直徑4. 6mm，長2 5 0mm)之髙速液體層析 術，以含0. 1%三氟醋酸之乙睛濃度10%〜5 9%之 濃度梯度溶出（2 0分鐘）進行溶出，再進行觀察2 16 mm之吸光度的分析，並未觀察到因任何溶液中所生成之 肽所造成的尖峰。 上述結果據信係導因於，藉由利用氫硫基乙醇之還原 ，CH - 1會變化成溶解性低之還原物，而利用氧化還原 緩衝液所實施之氧化還原反應，卻不會變成溶解性高的物 質。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 494104 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（24) (4 ) C Η — 1之利用谷胱甘肽的還原 CH — 1之利用谷胱甘肽的安定之還原反應，係依以 下之方法實施。首先，將CH — 1 4 0"g溶解於上述 2 Μ塩酸胍調製液（4 5 0 # $ )後，於同溶液中添加溶 解之還原型谷胱甘肽（1 〇 OmM)溶液5 0# P，在 4 0 °C下予以放置3小時後，在室溫下放置5日，將生成 物之內容，以利用逆相柱（SSC—VP3 1 8，仙修科 學公司製，直徑4. 6mm，長25Omm)之高速液體 層析術分析之。溶出係利用含〇. 1 %三氟醋酸之乙睛濃 度10%〜8 0%的濃度梯度（20分鐘）實施，觀察 2 1 6 n m之吸光度。 圖3、4中所示的是，谷胱甘肽添加前（圖3)、谷 胱甘肽添加5日後（圖4 )之色譜圖。將利用谷胱甘肽之 還原反應後的反應液全量，以同樣之層析術分離之，將圖 4中所示之尖峰1、2、3的部份分別區分採取之。將其 分別凍結乾燥後，將其全量溶解於含2 OmM tris塩酸 (P Η 7 . 4 )之2 5 之Ο . 1 5氯化鈉水溶液中， 取其中之1 0 // 32以< 1 >所示之方式測定瑞斯托菌素凝 集阻礙活性，發現尖峰I及尖峰3並無阻礙活性。該尖峰 3係原料（CH — 1 )之尖峰。由以上之結果可知，利用 上述方法，生成了具有瑞斯托菌素凝集阻礙活性之新物質 (尖峰1) 〇 此外，又調査塩酸胍6Μ及2Μ存在下之各種濃度的 谷胱甘肽之影響。將CH - 1 3 6# g，溶解於含 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ：----：------ -- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 494104 A7 _ B7 五、發明説明（25) 〇· 5 Tris 塩酸（pH8· 5) 〇10mM 乙二胺四醋 酸二鈉（EDTA · Na 2 )之7M塩酸胍水溶液稀釋成 6/7所得之溶液（以下稱之爲「6M塩酸胍調製液」） ，或是稀釋成2/7所得之溶液（以下稱之爲「2M塩酸 胍調製液」）2 3 4 a 中。對於該溶解有CH — 1之6 Μ，2 Μ塩酸胍調製液，分別添加下述1 0倍濃度之溶液 2 6# j?，使得還原型谷胱甘肽之終濃度爲3 0mM、 1 OmM、3mM、ImM，氧化型谷腕甘肽之終濃度爲 3 OmM，將其在1、2、3、4、7日後之生成尖峰的 內容，以使用逆相柱（S S C — V P 3 1 8，仙修科學公 司製，直徑4. 6mm，長25Omm)之高速液體層析 術分析之。溶出係以含0.1%三氟醋酸之乙睛濃度24 %〜5 9%之濃度梯度（2 0分鐘）實施，觀察2 1 6 n m之吸光度。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 依此分析所得之色譜圖之一例係示於圖5中（2 Μ塩 酸胍，1 OmM還原型谷胱甘肽，4日間）。由此分析系 可知，在相當圖4所示之尖峰1的保持時間內溶出的物質 中，含有兩種物質（相當於圖5所示之尖蜂1、2。又， 尖峰4係原料（CH— 1 )之尖峰。此一尖峰1及尖峰2 之物質的生成量之各反應條件下的時間變化，係示於圖6 中。 < 4 >由使用還原型谷胱甘肽之C Η - 1之單鏈化肽的製 造 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -28 - 494104 A7 __B7_ 五、發明説明（26) 首先，在C Η — 1之生理食塩水溶液（1 . 3 m g / m^) 290"芡中，添加蒸餾水7. 39m芡、0. 5 M Tris塩酸（ρΗ8. 5)，含10mM乙二胺四醋酸 二鈉（EDTA· Na2)之7M塩酸胍水溶液3. 57mj?、l〇 mM還原型谷胱甘肽（貝林格曼海姆公司製）水溶液 1· 2 5m$，在2 8°C下保存5日（塩酸胍之終濃度 2 Μ。 將保持後之溶液以3 0 0 0 r p m離心分離，再以三 氟醋酸將其上清液調整成P Η 4以下之酸性後，利甩逆相 柱（Vydac 214ΤΡ 1022，拜達庫公司製，直徑2 2mm， 長25Omm)以流速15m芡/min，含0.1%三 氟醋酸之乙睛濃度2 7%〜4 5%之2 0分鐘的濃度梯度 溶出，區分採取生成之肽。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 終果發現，生成與圖5所示者相同之生成物，將尖峰 1、尖峰2分別命爲AS 1 0 5 1、AS 1 0 5 2。各自 之SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳之結果顯示，AS 1 0 5 1 在非還原下，係分子量約爲1 4 kilo bait on之單鏈化肽， 在1%氫硫基乙醇存在之還原下，係分子量約爲15 kilodaltoii之單鏈化肽，又，AS1 0 5 2，同樣在非還 原下、還原下之分子量分別約爲2 6、1 5kilodaltoii， 係由同一之兩條肽所構成之同雙體物。

所獲得之AS 1 0 5 1之胺基酸序列，以及二硫鍵結 之方式，係依下述方法所決定。首先，在AS 1 0 5 1 5 0 a g之水溶液（5 0 a j?)中，依序添加含2 OmM 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -29 - 494104 A7 B7 五、發明説明（27) 之乙二胺四醋酸二鈉（EDTA)之1M tris塩酸緩衝 液（20#又），蒸餾水（120#又），含賴胺酸端肽 酶（和光純藥公司製）5#g之水溶液（lO^j?)，在 3 7 °C下進行2小時之酶切斷反應。而後，進而將反應液 供給至使用逆相柱（SSC — VP3 1 8，仙修科學公司 製，直徑4. 6mm，長25Omm)之高速液體層析術 中利用，將切斷之片段分離，區分採取後，將各切斷片段 利用蛋白質定序器一 4 7 0 A (阿普來得bios y stems公司 製），進行胺基酸序列之解析，AS 1 0 51之胺基酸序 列，係決定如序列編號2及圖7所示。本序列與W Ο 9 2 0 8 4 7 2號國際公開手冊中所記載之CHH — B的 α鏈比較，其胺基酸殘基數少一個，又，第3 9、8 5、 8 6號之胺基酸不同。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 圖7中所示之3條片段A、Β、C，係以介以二硫鍵 結而結合的一個切斷片段獲得，因此，針對此一片段，進 一步以蛋白酶G 1 u— C (貝林格曼海姆公司製）切斷， 並解析生成之片段的胺基酸序列，結果發現，二硫鍵結係 在 Cys4 與 Cysl5、Cys32 與 Cysl20、 Cy s 9 5與Cy s 1 1 5之間形成。此一結合方式，係 與包含得自蛇毒之物質的C型血球凝集素有共通之情形， 因此判斷AS 1 0 5 1保持原有之二硫鍵結方式。 又，雙鍵AS 1 0 5 2，其胺基酸序列分析之結果顯 示，係由2條AS 1 0 5 1所構成之同雙體物。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -30 - 494104 A7 B7 五、發明説明（28) <5>使用雙鍵肽（CH— 1)及單鏈化肽（ A S 1 0 5 1 )之血小板凝集阻礙活性的比較 此處，係比較雙鏈CH— 1、單鏈化肽AS 1 0 5 2 之對於血小板凝集的阻礙活性。在添加有1/1〇容之 3. 8檸檬酸鈉的由健康人所採取的新鮮血液，經900 r p m下離心1 5分鐘所得的人類多血小板血漿（ Platelet rich plasma:PRP)中，添加有此等肽時之血小 板凝集阻礙活性，係使用Hematracer-801(二光 bioscience公司製），在內容有1 2 · 5 # j?肽溶液之比 色杯中添加1 0 0 Α ί之多血小板血漿，利用攪拌桿在 3 7 °C下攪拌3分鐘後，添加12. 之凝集原，藉 由觀察透過光進行測定。 作爲凝集原，係使用瑞斯托菌素（終濃度1. 2 mg/mj? ) 、 botrocetin( 1 " g/mj? ) 、 ADP ( 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 3//M)、膠原（lO/zg/mj?)，計算對於未添加肽 樣本之對照群的凝集阻礙率。對於瑞斯托菌素凝集、 botrocetin凝集之CH - 1、AS 1 0 5 1之阻礙活性， /系示於圖8中。對於瑞斯托菌素凝集、botrocetin凝集之 阻礙活性，就兩個肽（雙鏈物）（CH — 1)及單鏈化物（ A S 1 0 5 1 ))，可觀察到大致相同之阻礙活性。又， 兩者對於ADP、膠原凝集，在2 0 〃 g/mj2之濃度下 ，均未顯示阻礙，而對瑞斯托菌素凝集、botrocetin凝集 等，依存於von Willebrand因子與糖蛋白質I b之結合的 凝集，可特異予以阻礙。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -31 - 494104 A7 B7 五、發明説明（29) 又，另外發現雙鏈AS 1 0 5 2，也具有與AS 1 0 5 1大致相同之阻礙活性。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) <6>雙鏈肽（CH — 1 )與單鏈化肽（AS 1 0 5 1 )投與於鼠時之血小板數目的比較 對於鼠，靜脈投與CH—l、AS 1 0 5 1 (均爲 10 0 y g/k g )之生理食塩水，以及作爲對照之生理 食塩水，在5分鐘後由心臟採血，然後依與< 2 >相同之 方式，測定白血球（WBC)、紅血球數（RBC)及血 小板數（P L· T ) 〇 如表3所示，有關C Η — 1投與群，血小板幾乎完全 消失，相對於此，有關AS 1 0 5 1投與群（1 0 0 ^ g / k g )，血小板數之減少並未觀察到。又，白血球 數（WBC)及紅血球數（RBC)，與對照群相比， CH— 1、AS 1 0 5 1投與群均無變化。由以上之事實 確認，單鏈化之AS 1 0 5 1不會造成雙鏈肽CH — 1投 與時可觀察到之血小板減少現象。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 表3 測定項目 生理食塩水 AS1051 lOO^g/kg CH-1 100//g/kg WBC X 107^1 7.0 21.0 51.0 13.0 20.0 37.0 21.0 21·0 RBC X 107^1 885.0 830.0 882.0 871.0 866. 0 864.0 921.0 891.0 PLT X 107^1 130.9 136.3 122.4 107.7 119.7 1.8 1.0 0.9 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 494104 A7 B7 五、發明説明（30) < 7 >使用土撥鼠之單鏈化肽的抗血栓性之測定 首先，測定對於由土撥鼠所獲得之多血板血漿的瑞斯 托菌素、botrocetin凝集之單鏈化肽A S 1 0 5 1的阻礙 活性。如圖9所示，對於AS 1 0 5 1之瑞斯托菌素凝集 、botrocetin凝集之阻礙活性，可知係與對於得自人類之 多血小板血漿的値大致相同之程度。 其次，進行對於土撥鼠投與AS 1 0 5 1後之血小板 等血球數的測定，以及進行使用AS1 0 5 1投與後採血 之血液所調製的多血小板血漿測定上述凝集是否受到阻礙 之活體外試驗。此外，又將2 0 0/zg/kg之AS 1 0 5 1靜脈內投與於土撥鼠內，採取投與5分鐘後之動 脈血，依與< 2 >相同之方法，測定白血球數（WBC) 、紅血球數（RBC)及血小板數（PLT)(表4)。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 表4 測定項目 生理食塩水 .AS1051 200//g/kg WBC X 107^1 35.0 19.0 22.0 24.0 21.0 27.0 RBC X 107^1 509.0 512.0 522.0 518.0 458.0 471.0 PLT xl〇4//il 35· 9 46.3 30· 7 34.6 33.7 40.0 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -33 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 494104 A7 _'_B7___ 五、發明説明（31) 在投與之AS 1 0 5 1中，添加同量之牛血清白蛋白 (bovine serum albumin :BSA)，將只於與 B S A 者作爲 對照群。將AS 1 0 5 1投與群與對照比較，並未觀察到 血小板數等之變化。此外，又由此血液調製多血小板血漿 ，將瑞斯托菌素、bo troce tin凝集之狀態，依與上述相同 之方法進行測定（圖1 0 )。將添加瑞斯托菌素之量變化 觀察的結果顯示，即使在對照群會完全引起凝集之瑞斯托 菌素濃度下，A S 1 0 5 1投與群之凝集也大致完全受到 阻礙。又，有關botrocetin凝集，也可獲得相同之結果。 由以上之結果可知，AS 1 0 5 1，在對於土撥鼠作 2 0 O^g/kg之靜脈投與時，與上述之<5> (對於 鼠之投與）之場合相同，不會對血小板數造成影響，同時 ，爲了阻礙瑞斯托菌素凝集、botrocetin凝集，其在血中 可維持充份的濃度。 其次，利用動物血栓模製，進行AS 1 〇 5 1之活體 內抗血栓作用的評估。作爲血型模型，係採用由松野等人 (松野等人，血液與循環，4，p 2 0 — 2 3，( 1990))所報告之光激發血栓模型。 將土撥鼠之頸動脈剝離，於其上安裝部卜勒血流探針 ，在設有探針之血管的上游約5 mm之位置，設置氙燈光 源。而後，對於土撥鼠，係含有BSA之AS 1 0 5 1 ( BSA之量與AS10 5 1同量），或作爲對照之只含 BSA的樣本，作靜脈內投與，5分鐘後，將四碘四氯螢 光素溶液（1 〇mg/k g )作靜脈內投與，同時照射 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1_.1 K-----— 费衣 II (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 34 494104

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（32 ) 5 4 0 n m之光，對於血管壁賦與障礙，並以脈衝都卜勒 血流測定至血流停止爲止之時間。如圖11所示， AS1051 (200/zg/kg)投與群與對照群相比 ，顯然至血流停止爲止之時間增長，顯示A S 1 0 5 1具 有抗血栓活性（Ρ<0· 01)。 實施例2 利用大腸菌之抗血栓性單鏈肽的生產 爲了利用基因工程之手法生產本發明之肽，由 Crotalus horridus horridus 單離出將具有阻礙 von ffillebrand因子結合於血小板的活性之肽編碼的基因，將 其以大腸菌表現。 < 1 >Crotalus horridus horridus之 c D N A 基因庫的 製作 (1 )由 Crotalus horridus horridus抽出 m R N A 首先，將Crotalus horridus horridus之毒腺摘出， 立即以液態氮予以凍結，保存至使用時爲止。將此毒腺 1 · 7 g 在 R N A 抽出液（4 Μ塩酸guarnidiumisoth iocyanate 、0· 1M trisi盘酸（ρΗ7· 5) 、1% 冷一氫硫基乙醇、0.1%月桂基肌胺酸鈉塩）20m芡 中，使用Poly tron均質器（基耐帝克公司製）予以破碎之 。將此破碎液作1 0 0 0 0XG下之1 〇分鐘離心分離， 將不溶物除去後，將其上清液重疊於超離心分離管中之等 量的密度平衡化緩衝液（4M氯化鉋、1 〇mM乙二胺四 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X25)7公釐） 1111 n 11 11 n I —訂 11111 I (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -35 - 494104 A7 B7 五、發明説明（33) 醋酸二鈉ρΗ7· 5)上，然後，在3 〇〇〇 or pm、

1 8小時、2 0 °C之條件下作離心分離，分離出全R N A 6 0 0 # g 0 有關由全RNA之調製mRNA，係使用POLY ( A ) Quik mRNA抽出套組（斯托拉塔基因公司製）， 依道具之規定說明書實施。亦即，由取得之全RNA，將 其中之5 0 0 # g吸附於Oligo dT柱，以髙塩緩衝液 2 0 0 # j? 2次，以低塩緩衝液2 0 0 j? 3次洗淨該柱 後，藉著將6 5 °C、2 0 0//P之溶出緩衝液通過該柱4 次，分離精製〇11^1^八（10;/111=8)。 (2)cDNA之合成 cDNA之合成，係使用TimeSavor DNA合成套組 (法普馬西亞公司製），依套組之規定說明書實施。亦即 ，對於精製之mRNA 3 ^ g，混合以無規六元引子 0 . 3 // g、ImM二硫蘇糖醇、含有反轉錄酶之第一股 反應液，在3 7°C下令其反應1小時，合成第一股。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 將此反應液與此含有大腸菌RN a s e Η、大腸菌聚 合酶之第二股反應液混合，在1 2°C下令其反應3 0分鐘 ，在2 2°C下令其反應1小時，合成cDNA。而後，在 6 5 °C下予以培養1 0分鐘後，將反應液以酚/氯仿處理 ，使酶活性喪失。而後，使用附有套組之凝膠過濾旋轉柱 ，在4 0 0XG下離心分離2分鐘，除去未反應之引子， 獲得雙鏈之cDNA(3#g)。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ~ 494104 A7 B7 五、發明説明（34 ) (3 ) c D N A基因庫之製作 在上獲得之雙鏈c DNA的兩端，依TimeSavor DNA套組之規定說明書，將其所附之E c o R I / Not I接合體連結之。亦即，將cDNA3#g、 EcoRI/Not I接合體，聚乙二醇緩衝液 3 0 " j、ATP溶液、T4DNA粘接酶1 " $混合， 在1 6 °C下進行1小時之連結反應。而後，將反應液在 6 5 °C下培養1 0分鐘，令酶活性喪失後，添加A TPM 汶1. 5#义、丁4多核苷酸酶1#又，在37。(：下令其 反應3G分鐘，進行接合體之5"末端的磷酸化。之後， 將反應液在6 5 °C下培養1 0分鐘，再以酚/氯仿處理， 使酶活性喪失。而後，使用附有套組之凝膠過旋轉柱，將 反應液以4 0 0XG離心分離2分鐘，附去未反應之接合 體。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 繼之’將兩末端連結有接合體之c DNA，連結於Λ 噬菌體載體λ ZAP I I (斯托拉塔基因公司製）之 E c 〇 R I部位，製作重組之啦菌體DNA。亦即，對於 連結有接合體之cDNA 4 0 0ng，添加 λΖΑΡΙ I/EcoRI/CIAP 臂 ，連結緩 衝液（1 0 0 m M Tris塩酸（ΡΗ7.6) ) ，2 5 m Μ氯化 鎂、3 0 OmM氯化鈉），再等量添加含有T4 DNA 粘接酶之酶液B液（寶酒製造公司製，粘接套組），在2 6 °C下進行1 0分鐘之連結反應。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） ---— 494104 A7 B7 五、發明説明（35) 依上述方式所獲得之重組噬菌體DNA的包裝，係採 用包裝套組GIGAPACKII GOLD(斯托拉塔基因公司製），依 套組之規定說明書實施。亦即，將上述連結有c DNA之 又ZAP I I臂DNA3 v g與套組之包裝抽出液混合， 在2 2 °C令其反應2小時，進行包裝。對於此一反應液， 添加500//$之噬菌體稀釋液（0. 58%氯化鈉、 0. 2% 硫酸鎂、5 OmM Tris 塩酸（ρΗ7· 5)) 、0 · 0 1 % 明膠）。 在將所獲得之重組噬菌體的酵價檢査後，使用噬菌體 之包裝體反應液的半量，使用作爲納入菌之大腸菌E. Col i XL-l Blue (斯托拉基因公司製），製作噬菌體基因庫。 亦即，在直徑1 5 0mm之溶斑形成培養基（雄鹿胰化陳 1%，酵母萃取物0. 5%、氯化鈉0. 5%、硫酸鎂1 πιΜ，麥芽糖0· 2%) 10片上，以使每片上有 2 0 0 0 0個溶斑之方式，將以噬菌體稀釋液稀釋之噬菌 體及納入菌被覆之，以3 7°C將其培養1 2小時，獲得重 組噬菌體之基因庫。 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) < 2 >用以單離目的基因之探子DNA的取得 (1 )利用RT — PCR法擴大目的基因部份片段 取得自 Crotalus horridus horridus之全 RNA 作爲 材料，利用RT — PCR法，將可阻礙von Willebrand因 子結合於血小板之肽編碼DNA片段擴大。 以序列編號2中所記載之肽的胺基酸序列爲基礎，選 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（210X297公釐） -38 - 494104 A7 B7 五、發明説明（36) 取字碼子縮聚少的部位，製作RT - P C R (反轉錄聚合 酶連鎖反應）用之引子。引子係委請biological公司化學 合成。此等引子之氮基序列，係示於序列表序列編號4、 5中。於序列編號4中，第3號及第6號之核苷酸係A與 G之混合物，而第1 2號之核苷酸T、C、A與G之混合 物。又，於序列編號5中，第3號之核苷酸，係T、C、 A與G之混合物，第6號及第15號之核苷酸係T與C之 混合物，第9號之核苷酸，係A與G之混合物。 對於同於上述方式調製之C r 〇 t a 1 u s h 〇 r r i d u s horridus之全RNA，使用上述引子，進行RT — PCR 。第一股之合成，係對全RNA5#g，混合反轉錄酶 SUPERSC RIPT II(GIBO公司製） 2. 5// £，在酶液中混合所附之第一股緩衝液2 0//又 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ，0. 1M 二硫蘇糖醇 10"i?、10mMdNTP5 ，在4 2 °C下令其反應1小時，如此而合成第一股。 將反應液在9 5 °C下培養5分鐘，使反轉錄酶喪失活性。 其次，將此第一股作模板，進行PCR反應。亦即，將第 一股反應液，PCR反應緩衝液1 0^32、1 〇 m M d Ν Τ Ρ 5"芡，引子各 8 00pmol ，

Ta q聚合酶1 〇 ν混合，使用DNA熱循環器（帕金愛 魯馬公司製），以9 5°C0. 5分鐘，5 2°C1分鐘， 7 2 °C分鐘作爲1個循環，進行2 5個環循之反應。 將此P C R反應液供2 %洋菜凝膠電泳，解析擴大 DNA。結果觀察到在約3 0 0氮基對之位置的DNA之 本紙張尺度適用中國國寥標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 494104 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（37) 條帶。 (2)擴大斷片之氮基序列決定 將依上述方式擴大之DNA片段，使用p CR — ScriptSK(+)選殖套組（斯托拉塔基因公司製），依該 套組之規定說明書，在質體上作次選殖。亦即，在 PCR反應液中，添加混合粘接緩衝液，ImM ATP ，作爲載體之pCRScript(斯托拉塔基因公司製）1 0 ng、鑑識酶Sr f I 5un i t，以及T4DNA粘 接酶，在2 5°C下進行1小時之連結反應，而後，將反應 液在6 5 °C下作1 0分鐘之培養，令粘接酶喪失活性。而 後，使用此反應物，依勝任細胞法將E.coli DH 5α轉形 ，並予被覆於L 一 A ρ板片（雄鹿胰化腺1%，酵母萃取物 0 . 5 %，氯化鈉0 . 5 %，安比西林鈉1 0 〇 ，在3 7°C下培養18小時。繼之，將形成 菌落之菌體由板片分離，將其一部份作液體培養，再依鹼 式法（mo 1 e cu 1 ar c 1 on i ng 2版 V。1 · 1 Co 1 d Spr i ng Harbor* Press編）調製質體。將此一質體命名爲 p C HAprobe。 p CHAprobe選殖片段的解析，係使用DNA定序 器A 3 7 3 (阿普來得biosystems公司製），使用

Ml 3M4或Ml 3reverse (寶酒製造公司製）作爲引 子，依該定序器之使用法，由dye Terminator法達成。結 果顯示，選殖之DNA片段，係由2 7 2個氮基對所構成 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T % 494104 A7 B7 五、發明説明（38) ，具有序列編號6所示之氮基序列。將此序列轉譯於胺 酸觀察後証明，其係相當於所欲求取之肽的一部份，所獲 得之選殖片段，係目的肽AS 1 0 5 1基因之一部份。 (3 )探子之標識 將p C HAprobe，以經選殖之嵌入片段兩端所存在 之鑑識酶Sac I、BamHI切斷，以2%洋菜凝膠電 泳，分離出3 4 0氮基對大小以D N A片段，使用D N A 回收套組（Takara EASYTRAP:寶酒製造公司製），依該 套組之規定說明書回收DNA。將此DNA 2 5 n g，以 〔α — 32P〕d CTP及無規引子標記套組（寶酒製造公 司製）作放射同位素標記。由該標記反應液，使用凝膠過 濾Nick柱（法魯馬西亞公司製），將未反應之〔沈一 32P〕dCTP除去，獲得標記化之探子。 < 3 >利用溶斑雜交取得目的基因 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 由c DNA噬菌體基因基，以利用上述探子之溶斑雜 交法，篩選將AS 1 0 5 1肽之全長編碼之基因。 由根據上述方式形成有λ ZAP I I c DNA噬菌體 基因庫之溶斑的板片，將溶斑依下述濾紙之說明書轉錄於 尼龍濾紙H ibond (阿馬夏姆公司製）上。將此濾紙鹼處理 溶解溶斑後，藉由在8 0 °C下予以培養2小時，將噬菌體 DNA固定於濂紙。 將此濾紙與32P標記化探子1 X 1 〇6c pm/m又 -41 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 494104 A7 ___B7_ 五、發明説明（39) ，在含有 5XSSPE 緩衝液（2 0XSSPC:3. 6 Μ氯化鈉、〇· 2M磷酸鈉緩衝液pH7. 7、2 OmM EDTA二鈉）、3 0%甲醯胺、5X丹哈魯特溶液（ 100X丹哈魯特溶液：2. 0%牛血清白蛋白，2%菲 考魯400、2%聚乙烯基吡咯烷酮），及〇. 5% S D S之溶液中，在3 7 °C下雜交1 6小時。而後，將該 濾紙在33〇 (2 0父33(：:3訄氯化鈉、0.3“檸 艨酸三鈉）、〇· 1%SDS中，在室溫下洗淨2次，再 於2XSSC、0· 1义3〇3中在50°(：下洗淨2次， 將與濾紙非特異結合之探子除去。將此濾紙在X射線膜片 HP2 0 (富士 film公司製）中於一 8 0°C下曝光2 4小 時。而後，由噬菌體板片，將相當於膜片之陽性點位置的 純系單離，作爲一次篩選陽性純系。重複相同之篩選作業 ，取得形成一溶斑之陽性純系。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在所獲得之陽性純系的λ ZAP I I cDNA噬菌體 上，感染以輔助噬菌體写xAs s i s t (斯托拉塔基因 公司製），藉著將其感染於非琥珀阻遏株大腸菌之 SOLRCELL (斯托拉塔基因公司製），獲得保持有c DNA片 段嵌入質體pBluescriptSK (-）（斯托拉塔基因公司製 )之E c 〇 R I部位的質體之大腸菌。由此一菌體，依鹼 式SDS法，調製質體，使用DNA定序器A3 7 3 (阿 普來得biosystems公司製），決定嵌入斷片之氮基序列。 結果發現，4個陽性純系，具有將所欲求取之肽編碼 的氮基序列，將分別予以編碼之質體命名爲PCHA1、 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印聚 494104 五、發明説明（） 一——…~ ~ 40 pCHA2、PCHA3 及 pCHA4。又，保持 p C H A 1 之E.coli HB101/pCHAl( E coli AJI 3023 )， 由平成6年8月12曰始/以FERM BP—4781 之寄存編號，根據布達佩斯條約，國際寄存於日本通商產 業省工業技術院生命工學工業技術研究所（郵遞區號 305，日本茨城縣筑波市東1 丁目1番3號）。將依上 述方式選殖之A S 1 0 5 1肽編碼的基因之氮基序列，係 示於序列表序列編號7中，由此一基因編碼之肽的胺基酸 序列，係示於序列編號8中。此一基因具有轉譯開始胺基 酸甲硫胺酸以下之2 3個胺基酸所構成的典型分泌信號。 pCHAl (於大腸桿菌HB101中）亦寄存於食品工業發展研究 所，寄存日期爲民國83年11月30日，編號爲940059。 < 4 >以大腸菌爲宿主之A S 1 0 5 1肽的表現生產及活 性肽的取得 (1 )大腸菌表現質體P CHAT7之製作 於保持T7起動基因之質體PGEMEX—1(普羅 美加公司製）中，導入將上述所獲得之AS 1 〇 5 1肽編 碼的DNA片段，製作大腸菌用表現質體（請參見圖12)。 首先，爲使以後之操作容易化，製作存在於 PGEMEX—1之二個位置的鑑識酶NdeI切斷部位 中，缺失與T7起動基因遠的NdeI切斷部位之質體。 亦即以Nd e I將pGEMEX - 1部份切斷，將切斷末 端以DNA平滑化套組（寶酒製造公司製）平滑化，並使 用粘接套組（寶酒製造公司製）再予環狀化。以所獲得之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I - I 辦衣 I 訂 I 線 ‘(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -43 - 494104 A7 B7 ___ 五、發明説明（41) 質體將大腸菌轉形，由轉形株中，獲得所求之位置中只存 在一個Nd e I切斷部份的質體，予以命名爲 pGEMEX(Ndel)。 將上述pCHAl及pGEMEX (Nde I )以鑑 識酶Nde I及Sac I切斷，藉由洋菜凝膠電泳，抽出 分別爲1 0 0氮基對，3. 2k i 1 〇氮基對之DNA片 段。得自pCHAl之1 0 0氮基對的DNA片段，包含 將AS 1 0 5 1肽編碼之基因的3 >末端側區域（相當序 列編號7中之核苷酸編號490〜559)。 而後，利用粘接套組（寶酒製造公司製）進行此等 D N A片段之連結反應，以此一反應液將大腸菌E.coli HB 101轉形，在含有安比西林之板片上，由分離之轉形體 獲得重組質體pCHA(NS)。 其次，對於所獲得之質體pCHA(NS)，嵌入將 A S 1 〇 5 1肽編碼之基因的5 >末端側區域（相當序列 編號7中之核苷酸編號135〜489)，製作在大腸菌 內將AS 1 0 5 1肽表現生產之質體。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 爲了把將AS 1 0 5 1肽編碼之基因的5，末端區域 納1入pCHA(NS)，乃合成將此一區域以PCR法 擴大之DNA引子。此時，作爲5 >末端側之引子，爲了 使擴大片段之5 /末端具有Nd e I，使用包含Nd e I 識別序列之引子（C H A N d e I引子··序列編號9 )。 又，此一引子，在5 >末端側AS 1 0 5 1肽的N末端胺 基酸的門冬胺酸之字碼子前，具有作爲轉譯開始信號之氮 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公董) ——— -44 - 494104 A7 B7 五、發明説明（42) 基序列ATG (序列編號9中，核苷酸編號9〜1 1 ) ° 又，此一開始字碼子，係與Nde I識別序列（序列編號 9中，核苷酸編號6〜11)重複。 另一方面，作爲3 *末端側之引子，爲了構築用於後 述昆蟲培養昆蟲細胞表現系中之表現質體，使用含有 H i n d I I I識別序列之引子（CHAH i nd I II :序列編號 1 0，H i n d I I I識別序列係核苷酸編號1 〇〜1 5 )° 藉由使用上述引子之PCR反應，將AS 1 〇 51肽 編碼基因序以擴大。P C R反應，係以9 4 °C 1 5秒’ 5 0°C1分鐘，7 2°C2分鐘作爲1個循環，重複2 5循 環。而後，將PCR反應液以酚/氯仿處理，令Ta Q聚 合酶喪失活性，再以乙醇沈澱法將由擴大之4 〇 〇氮基對 所構成之DNA片段精製，而後，再以鑑識酶N d e I予 以切斷。將此一 DNA片段與由鑑識酶Nd e I切斷之 p CHA (NS )以粘接套組（寶酒製造公司製）連結。 使用所獲得之質體，以勝任細胞法，將E.coli HB101株 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 轉形，將轉形使以含安比西林板片培養16小時。 由生育之轉形體，以鹼式S D S法調製質體，使用 T7引子及SP6引子（斯托拉塔基因公司製），以 DNA定序器A3 7 3 (阿普來得biosystems公司製）決 定氮基序列，藉此而確認目的之A S 1 0 5 1肽表現載體 構築完成。將製作之表現載體命名爲p CHAT 7。以上 之質體的構築過程，係示於圖12中。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -45 - 494104 A7 ____B7_ 五、發明説明（43) (2 )利用大腸菌生產肽 爲了使用AS 1 0 5 1肽表現載體pCHAT7，利 用大腸菌生產AS1 0 5 1肽，以pCHAT7將E. coli JM109(DE3)(普羅美加公司製）利用勝任細胞法轉 形，在含安比西林板片上於2 5 °C下培養2日，選擇質體 保有菌。此一 E.coli JM109(DE3)係連結於lacuV5起動基 因的下游，具有T 7噬菌體之RNA聚合酶基因，藉著 I PTG (異丙基一 B — D—硫代半乳糖吡喃苷）之添加 ，導因於lacUV起動基因之轉錄誘發，而生成T 7噬菌體 之RNA聚合酶，其係爲了只將T7起動基因有效地表現 而構築成之株。是以，上述質體保有株，可將 AS 1 0 51質體有效率地表現。 而後，將保有表現質體之E.coli JM109(DE3)/ PCHAT7，置於內容有1 〇 Omj?之LB — Ap培養 基（1%雄鹿胰化腺、0. 5%酵母萃取物、0. 5%氯 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

化鈉、1 0 0 " g/mj?安比西林）之5 0 0m芡坂口燒 瓶1 0瓶中植菌，在3 0°C下作1 6小時之振盪培養。而 後，在培養基中添加最終濃度爲0. 5mM之誘導劑 I PTG，再於3 7 °C下作4小時之振盪培養。培養後， 藉由離心分離將菌體收集後，藉著予以懸浮於1 0 OMi? 之緩衝液（3 OmM tris 塩酸 pH7 . 5，1 OmM EDTA (乙二胺四醋酸）二鈉，3 OmM氯化鈉）中， 將菌體洗淨。而後，藉由離心分離將菌體再收集，予以懸 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -46 - 494104 A7 B7 五、發明説明（44) 浮於2 Omj?之菌體破碎緩衝液（0· 5M EDTA， PH8 )中。而後，將蛋白溶菌酶2 Omg添加之，在0 °C下處理1小時，將菌體之細胞臂破壞。繼之，將此懸浮 液以超音波破碎器Insonator 200M (庫玻塔公司製）， 在1 8 0W下破碎處理1 〇分鐘。藉著將破碎液在 6 0 0 0 r pm下離心2 0分鐘，獲得菌體不溶性部份（ 封套體）。 (3 )封套體之可溶化及活性化 將由1升培養液所獲得之封套體，溶解於含有1 〇 m M EDTA、0. 5Μ Tris 塩酸（pH8. 5)之 7M塩酸胍溶液2 8. 6mj?，將7 1. 4mJ蒸餾水添 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 加於其中後，在4°C下予以保持2日，進行空氣氧化。而 後，將三氟醋酸0. 5mP添加於該溶液中使其成爲酸性 後，以離心除去不溶物，以使用逆相柱（Vydac 214 TP 1022,拜達庫公司製）之高速液體層析術將其上清液 區分之，獲得重組體AS1051(9. Omg)。所獲 得之精製肽，在S D S -聚丙烯醯胺凝膠電泳上顯示與實 施例1<4>所示之AS 1 〇 5 1具有相同之分子量。又 ，就所獲得之重組體AS10 51，依與實施例1<5> 相同之方法測定其對於血小板凝集之阻礙活性的結果顯示 ，並未阻礙AD P凝集、膠原凝集，而對於瑞斯托菌素凝 集、bGtrocetin凝集，顯示與實施例1 < 4 >所獲得之 AS 1 0 5 1具有同等之阻礙活性。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 47 494104 A7 B7 五、發明説明（45) 依上述方式所獲得之重組體AS 1 0 5 1的胺基酸序 列之決定，係依下述方式實施。首先，將1 //义之4 一乙 烯基吡啶添加於含重組體AS1 0 5 1 5 0 0vg之2 m M EDTA、0. 1 M Tris 塩酸（ρΗ8· 5)溶 液（4 5 Omj?)中，而後，再添加賴胺酸端肽酶（和光 純藥公司製）1 5 # g，在3 7 °C下作3小時之酶切斷。 繼之，將切斷物依與實施例1 < 4 >所示之方法相同的方 法供於逆相HP LC，區分採取切斷片段。各切斷片段之 胺基酸序列分析的結果確認，重組體A S 1 0 5 1之胺基 酸序列，係甲硫胺酸殘基結合於序列編號2所示之胺基末 端而成。再者，作爲二硫鍵結方式，Cy s 4 — Cy s_ 1 5間之二硫鍵結的存在，係以含有兩殘基之片段肽的 MS確認，又，與實施例1 < 4 >相同，將圖7中所示之 片段A、B、C以二硫鍵結交聯的片段肽，以V 8蛋白酶 (和光純藥公司製）作酶切斷（0. 1 Μ碳酸氫銨溶液中 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ，V8蛋白酶3#g)，藉著以逆相柱解析分離之片段肽 的胺基酸序列解析，確認Cy s 3 2 — Cy s 1 2 0、 Cy s 9 5— Cy s 1 1 2間之二硫鍵結的存在。 將所獲得之重組體AS1 0 5 1對於鼠作1 0 0 0 a g/k g靜脈內投與時發現，並未有血小板減少之現象 實施例3 利用桿狀病毒/昆蟲培養細胞表現系生產抗血 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -48 - 494104 A7 __^_B7____ 五、發明説明（46) 检性簞鏈肽 將實施例2所獲得之AS 1 0 5 1基因，以昆蟲培養 細胞表現系表現，生產抗血栓性單鏈肽。 <1>桿狀病毒AS 1 0 5 1表現載體之製作 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 桿狀病毒表現系，係使用Ma X B a c桿狀病毒表現 系統（英比托羅甘公司製）構築（請參見圖1 3 )。具體 言之，將實施例2所得pCHAl以鑑識酶EcoRI 切斷，利用D N A平滑化套組（寶酒製造公司製），依該 套組之規定說明書，將其末端平滑化。而後，將其進一步 以鑑識酶P s t I切斷，將切斷物供於洋菜凝膠電泳，回 收4 0 0氮基對之DNA片段。另一方面，以鑑識 Hindll I將表現載體pBlueBacI I I切斷 ，利用D N A平滑化套組，將其末端平滑化。而後，進一 步將其以鑑識酶P s t I予以切斷，將切斷物供於洋菜凝 膠電泳，回收1 0. 3k i 1 〇氮基對之DNA片段。而 後，使用粘接套組，將回收之此等DNA片段連結，利用 勝任細胞法，將E.coli HB101轉形，在含安比西林之板片 上選擇轉形體。將製作之質體稱爲pCHAba c。質體 之構築過程係示於圖13中。 <2>利用PCH Abac之昆蟲培養細胞s f 9株之 轉形及重組病毒之取得 昆蟲培養細胞之轉形及重組病毒之取得，係依 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） " -49 - 494104 A7 ____B7 __ 五、發明説明（47)

Ma X B a c桿狀病毒表現系統（英比托羅甘公司製）之 規定說明書實施。具體言之，將野生型核多角體病病毒（ Autographa cal ifornica nuclear polyhedrosis virus :AcMNPV) D N A l#g、pCHAbac 3#g，依 微脂粒法導入昆蟲培養細胞Spodoptera frugiperda 9株 (s f 9株）內。將此一病毒導入細胞以TNM— FM ( FBS+)培養液（英比托羅甘公司製），在2 7 0 °C下 培養4 8小時後，將培養液回收，獲得病毒溶液。 將此一病毒感染於昆蟲培養細胞s f 9株，以含有一 gal (5 —溴一 4 一氯一 3 — 口3丨躲基一/? 一 D —半乳糖 苷）150#g/m 芡之 FNM — FH(FBS+)軟瓊 脂培養基，在2 7 °C下培養7日。選擇感染野性型 AcMNPV與pCHAb a c重組之病毒的細胞。將此 細胞使用巴斯德吸移管由板片拾取，予以適當稀釋，再感 染於s f 9細胞。重複上述之純化操作2次，取得只有重 組病毒存在之病毒溶液。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) < 3 >利用桿狀病毒/昆蟲培養細胞表現系之 A S 1 0 5 1肽的表現 使用重組病毒表現AS 1 0 5 1肽。首先，在細胞培 養用燒瓶（NUNCL0N 2 6 Omj?底面稹7 5 cm2:努恩公司製）中FNM — FH (FBS+)培養液 1 Omj?中，接種6X1 06個s f 9細胞，然後再進一 步添加純化重組病毒3X 1 06c f u，在2 7°C下培養 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 50 494104 A7 _ _B7___ 五、發明説明（48) 2 4小時。而後，由燒瓶除去培養液，再添加不含胎牛血 清之FNM— FH (FBS — )培養液1 Omj?，再於 2 7 °C下培養7日。培養終了後，採取培養液4mj?，使 用仙特理光一 1 0 (亞米康公司製）予以濃縮成4 0 0 #又，獲得培養上清濃縮液（1 〇倍濃縮液）。 另一方面，在除去培養液之燒瓶中，添加緩衝液（ 3 0 m M Tris 塩酸 pH7. 5、10mM EDTA、 3 0 m M氯化鈉），以吸移法將細胞由燒瓶剝離後，回收 細胞懸浮液，利用離心分離將細胞洗淨1次後，再予懸浮 於緩衝液2m又中。將此細胞懸浮液，利用超音波破碎機 Insonator 2 0 0M (庫玻塔公司製）在1 80W下處 理5分鐘，將細胞破碎之。破碎後，以1 0 0 0 0XG予 以離心分離3 0分鐘，藉由回收其上清液，獲得細胞破碎 液。作爲對照樣本，係使用感染野生型A c Μ N P V病毒 之s f 9細胞及未感染病毒之s f 9細胞，依與上述相同 之條件培養，並進行樣本調製所得之物質。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 將依上述方式調製之上清濃縮液5 v又，或是細胞破 碎液1 0 a )?，分別在添加1 %氫硫基乙醇的還原條件下 ，供於SDS—聚丙烯醯胺凝膠電泳，進行CBB染色。 結果顯示，不管是感染重組病毒之上清濃縮液，細胞破碎 液之任一者，均有顯著量之蛋白在1 5 kilodalton的位置 檢出。另一方面，對照之只有s f 9細胞，或是s f 9細 胞感染有野生型病毒A c MN P V的培養上清濃縮液及細 胞破碎液，在1 5kilodalton之位置，均無法檢出蛋白。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 51 494104 A7 B7 —_ 五、發明説明（49) 此一分子量1 5 kilodaltoii的數値，與由蛇粗毒精製之 AS 1 0 5 1的分子量一致。 < 4 >利用桿狀病毒/昆蟲培養細胞表現系生產之 AS1051肽的活性 導因於依上述方式所獲得之昆蟲培養細胞的重組體蛋 白，以及培養上清液中之重組體蛋白的阻礙由 botorcetin所引起之von Willebrand因子結合於血小板， 係依以下之方式測定。 福馬林固定化血小板之調製，係依以下之方法達成。 首先，將添加有/10容之3. 8%檸檬酸鈉的由健康人 採集之新鮮血液，以9 0 0 I* p m離心1 5分鐘，對於所 獲得之人類多血小板血漿（platelet rich plasma :PRP )，添加與其同容之含溶解有2 %多聚甲醛之2 OmM磷 酸緩衝液（PH7. 4)的0· 15 Μ氯化鈉水溶液，在 4 °C下靜置一晚保存。保存後，利用離心分離將血小板回 收，以含2 0mM磷酸緩衝液（PH7. 4)之0.15 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Μ氯化鈉水溶液洗淨2次。洗淨後，將固定化血小板懸浮 於同溶液中予以保存。 對於依上述方式獲得之固定化血小板，125 I標識化 von Wi 1 1 ebrand因子之結合於固定化血小板的阻礙試驗， 係沿襲Chopek等人之方法（M.W.Chopek等人，

Biochemistry ，25， 3146 — 3155 (1986 )實施。具體言之，係對調製之固定化血小板懸浮液，添 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) ~ " " 494104 A7 _ B7 五、發明説明（5〇) 加添測定樣本，bGtrGcetin及1251檫識化von Willebrand因子，在室溫下令其反應3 0分鐘，將對於血 小板結合之von Willebrand因子量，以r計數器（ Packard Multi-Prias, Packard公司製）測定。此時，反 應液量係5 0 又，其中，測定樣本係添加5 #又測定。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 針對由AS 1 0 5 1重組病毒感染s f 9細胞及對照 之s f 9細胞依上述所調製之細胞破碎液，測定對於由 botrocetin所引起之von Willebrand因子結合於血小板的 阻礙活性之結果，係示於圖14中。又，針對由 AS 1 0 5 1重組病毒感染s f 9細胞及對照之s f 9細 胞依上述方法調製之培養上清濃縮液（3倍濃縮液），測 定對於由botrocetin所引起之von Willebrand因子結合於 血小板的阻礙活性之結果，係示於圖15中。由此結果可 知，感染重組病毒之細胞破碎液及細胞培養上清液，對於 von Willebrand因子之結合於血小板，可大致完全予以阻 礙。由此事實可知，藉著以桿狀病毒/昆蟲培養細胞表現 系生產，肽可作爲細胞內之可溶性蛋白及細胞外分泌蛋白 質，以具有可阻礙血小板與von Willebrand因子之結合的 活性之形態製造。 窗施例4 利用動物培養細胞表現系生產抗血拴性單鏈肽 藉由利用CHO細胞之動物培養細胞表現系，將 AS 1 0 5 1基因表現，而生產抗血栓性單鏈肽。 藉由鑑識酶Ps t I將pCHAl切斷，而切出 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 494104 A7 B7 五、發明説明（51) AS 1 0 5 1基因，將所獲得之DNA片段之兩末端，以 DNA平滑化套組（寶酒製造公司製）平滑化，而後，在 兩末端上連結Xhol接頭（寶酒製造公司製）。將此一 DNA片段以鑑識酶Xhol切斷後，供於洋菜凝膠電泳 ，抽出5 0 0氮基對之DNA片段。將此DNA片段嵌接 入〇110細胞表現載體口30(又）（]^.1111以13等人， Pro. Natl. Acad. S c i . U . S . A .， 85，2434 — 24 38 (1988))之 Xhol 部 位。此一載體pSD(X)，係具有PBR322與 SV 4 0之複製開始點，安比西林耐性基因，胺甲碟呤耐 性基因，此外又具有SV 4 0起動基因，SV 4 0剪接信 號，以及po 1 y A附著（加成）信號，可在CHO細 胞中表現外來基因之載體。以上之質體的構築過程，係示 於圖1 6中。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 以嵌接有上述AS 1 05 1基因之PSD (X)，將 大腸菌HB1 0 1轉形，由所獲得之轉形體，獲得 AS 1 0 5 1基因相對載體嵌入所期望方向之表現質體， 將其命名爲p CHASDX。利用此一質體 pCHASDX，依鱗酸鈴法（Current Protocols in Molecular Biology：Greene Publishing Associates )， 將C HO細胞之二氫葉酸氧化還原酶缺失株轉形。繼之， 將該轉形體以含有α—MEM(核酸）（吉布可公司製） 、10%胎牛血清（FCS)，胺甲碟呤〇. 0 5"M之 培養基培養之，而在染色體上選擇性培育納有表現質體之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 54 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 494104 A7 B7 五、發明説明（52 ) 轉形體。 將所獲得之株，在培養基中之胺甲蝶呤的濃度階段性 上昇至0. 5〃Μ之狀況下培養之，藉由選擇胺甲蝶呤耐 性株，獲得據信在CHO細胞之染色體上AS 1 0 5 1基 因擴大之株。由將此一株的信號純系增殖所得之細胞，利 用I SOGEN套組（日本基因公司製）將全RNA抽出 ，使用引子CHA1 6Y (序列編號1 3 )及 C H A 1 1 5 Q (序列編號1 4 )，依與實施例2 < 2 > 記載之方法相同的RT — PCR法，進行AS1 0 51基 因之擴大，再以洋菜凝膠電泳，進行擴大DNA解析。結 果檢出較AS 1 0 5 1基因之核苷酸序列預想爲大的 DNA片段之擴大，確認AS 1 0 5 1基因之mRNA， 在C Η Ο細胞中轉錄。利用此一細胞，進行A S 1 0 5 1 肽之表現的硏討。具體言之，將此細胞2X1 04個，在 含有MEM (核酸一），10%胎牛血清，胺甲碟呤 0. 5#M之培養基5mP中培養4日後，將培養基更換 成含有胺甲蝶呤0 . 5 之無血清培養基AS 1 0 4 ( 味之素公司製），再培養3日。 將培養終了後之培養基回收，取基中之4mj?以仙特 理光一 10 (亞米康公司製）濃縮至10 再將濃 縮液依序稀釋，依實施例3 < 4 >記載之方法，測定對於 因瑞斯托菌素及botrocetin所引起之von Willebrand結合 於血小板的阻礙活性。AS 1 〇 5 1肽生產細胞及對照之 不生產AS 1 0 5 1肽之細胞的培養上清液，濃縮或稀釋 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210乂297公釐） _ _ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) C. 、1Τ 494104 A7 B7 五、發明説明（53) 成一定濃度之溶液時的阻礙活性，係示於圖17，圖1 8 中。如兩圖中所示，肽生產細胞之培養上清液的阻礙活性 ，顯示含有活性型之AS 1 0 5 1。 實施例5 變異AS 1 0 5 1肽之生產 將具有由N末端起算第81號（但不包含轉譯開始之 甲硫胺基）之半胱胺酸殘基以丙胺酸取代之變異的 AS 1 0 5 1肽，以大腸菌表現，調査對於von Wi 1 1 ebrand因子結合於血小板之阻礙活性。 <l>Cy s 8 1A1 a變異AS 1 0 51肽之生產 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 根據「P C Rprotocols」（Acadmic Press版）中所 記載之部位特異性氮基序列變異法，將變異導入 AS1 0 5 1基因中，使與AS1 0 5 1肽之二硫鍵結無 關的半胱胺酸殘基（序列編號之中之第8 1號半胱胺酸殘 基）由丙胺酸取代。將PCHA1作爲模板，使用實施例 2所合成之引子CH A Nd e I (序列編號9 )及新合成 之引子CHAA1 aF (序列編號1 1 )，或是使用新合 成之引子CHAA1 aR (序列編號12 )及實施例2合 成之引子CHAHindlll (序列編號10)，進行 P C R反應。將各反應生成物供於洋菜凝膠電泳，由凝膠 抽出擴大之DNA片段。將此等DNA片段作爲模板，使 用引子CHANde I及CHAHi d I I I，進行第二 次之PCR反應，製作變異基因。繼之，以鑑識酶 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） ~ -56 - 494104 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（54) Nde I將PCR擴大DNA片段切斷，並予供於洋菜凝 膠電泳，由凝膠抽出3 6 0 bp之D NA片段。將此一 DNA片段，嵌接入由鑑識酶NdeI切斷之pCHA( N S )的N d e I部位。以上之質體的構築過程，係示於 圖1 9中。 使用依此方式製作之質體，將大腸菌HB101以勝 任細胞法轉形，在含安比西林板片上，選擇轉形體。由此 一轉形體，依鹼式SDS法調製質體，並使用T7引子及 SP 6引子（斯托拉塔基因公司製），依實施例8所記載 之方法，決定氮基序列，並選擇導入目的之變異的質體。 將所獲得之表現載體命名爲PCHAT7A1 a。以 pCHAT7Ala 將大腸菌 JM10 9 (DE3)轉形 ，依與實施例2 < 4 >相同之方法，培養轉形株，據以表 現生產具有〇丫381八1&變異之八31051肽。將 菌體蛋白質供於S D S聚丙烯醢胺凝膠電泳後確認，可在 大腸菌菌體內，作爲封套體蓄稹生產與實施例2 < 4 >所 生產之基因重組野生型AS 1 0 5 1肽大致同量的重組肽 0 <2>Cy s 8 1A1 a變異AS1 0 5 1肽封套體之可 溶化及活性化 依實施例2 < 4 >所記載之方法，進行封套體之可溶 化及活性化。所獲得之精製蛋白，在SDS電泳上，顯示 係與實施例1<4>所示之AS 1 0 5 1的分子量相同之 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) C. 、?τ .Ρ. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -57 - 494104 A7 __B7____ 五、發明説明（55) 分子。又，二硫鍵結樣式，也確認係與AS 10 5 1相同 。又，有關所獲得之Cy s 8 1A1 a變異AS 1 0 5 1 肽，依與實施例1 < 5〉相同之方法測定對於血小板凝集 之阻礙活性，發現對於AD P凝集，膠原凝集並未阻礙， 而對瑞斯托菌素凝集、botrocetin凝集’則有與 AS 1 0 5 1同程度之阻礙。再者，對於固定化血小板之 由瑞斯托菌素、botrocetin所引起的von Willebrand因子 結合，顯示與實施例1<4>所得之AS 1 0 5 1及實施 例2 < 4 >所得之重組A S 1 0 5 1，具有同等之阻礙活 性（圖20)。依此所獲得之變異AS1051肽，在 3 0°C下之保存於溶液中，或是在4 °C下之透析下均是安 定，相對於此，重組AS 1 0 5 1肽在3 0°C下之保存於 溶液中，以及在4 °C下之透析下，則有不溶化之現象。由 此結果可判斷，重組變異AS 1 0 5 1肽，其安定性較重 組AS 1 0 5 1肽爲高。 實施例6 縮短AS1051肽之生產 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 將N末端部份及/或C末端部份縮短之AS 1 0 5 1 肽，以大腸菌表現，調査縮短AS 1 05 1肽之對於 von Willebrand因子結合於血小板的阻礙活性。 <1>縮短八31051肽之生產 此處，構築由具有Cy s 8 1A1 a變異之 AS1051 肽（稱之爲「AS1051 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 58 494104 A7 B7 __ 五、發明説明（56 )

Cy s 8 1A1 a肽」，N末端之1 5個胺基酸殘基或6 5個胺基酸殘基，及/或C末端之11胺基酸殘基有缺失 的肽之表現系。亦即，生產之肽，係具有由第16號之酪 胺酸殘基以至第1 2 6號之精胺酸殘基爲止之肽（ 八31051八一1)，具有由第67號之酪胺酸以至第 12 6號之精胺酸殘基爲止之肽（AS 1 0 5 1A — 2 ) ，具有由第1號之門冬胺酸殘基以至第1 1 5號之谷胺酸 殘基爲止之肽（AS1051A — 3)，由第16號之酪 胺酸殘基以至第1 1 5號之谷胱甘殘基爲止之肽（ r 八31051八一4)，以及由第67號之酪胺酸殘基以 至第1 1 5號之谷胺酸殘基爲止之肽（AS 1 0 5 1A — 5)等5種。此等肽之構造的構略，係示於圖21中。此 處，胺基酸編號，係不包括轉譯開始之甲硫胺酸所數的數 目，表示序列編號2中所示之胺基酸序列中的胺基酸號數 〇 . 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 縮短AS 1 0 5 1肽表現質體之製作，係依以下之方 式進行。使用PCHAT7A1 a作爲模板，就 AS 1 0 5 1A—1使用引子CHA1 6Y (序列編號 13)及CHAHindlll (序列編號10)，就 AS 1 0 5 1A — 2使用引子CHA6 7Y (序列編號 1 5)及 CHAHindl I I、就 AS10 51A-3 使用引子CHANd e I (序列編號9 )及 CHA115Q (序列編號 14)，就 AS1051A — 4使用引子CHA1 6Y及CHA1 1 5Q、就 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 59 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 494104 A7 ____B7_ 五、發明説明（57) AS1 0 5 1A— 5使用引子CHA6 7Y及 CHA1 1 5Q，進行PCR反應。 有關以 C H A 1 6 Y 及 C H A H i n d d I I I、以 及CHA6 7Y及CHAHi n d I I I作爲引子使用之 擴大產物，將以Nde I切斷各擴大產物所得之物質，供 於洋菜凝膠電泳，抽出各爲3 1 0氮基對，1 6 0氮基對 久之DNA片段。將各DNA片段嵌接入pCHA (NS )的N d e I部位，利用所獲得之重組質體，將E.coli HB 1 0 1之氯化鈣法轉形，在含安比西林板片上，選擇 轉形體。由此等轉形體，選擇具有擴大DN A片段相對質 體在目的方向嵌入之質體者。將依此所獲得之表現質體中 ，具有310氮基對的嵌入片段者，命名爲 pCHAT7Ala(16Y126R)，具有160氮 基對之嵌入片段者，命名爲pCHAT7Ala ( 6 7 Y 1 2 6 R )。 另外，有關以CHANdeI及CHA115Q、以 及CHA6 7Y及CHA1 1 5Q作爲引子使用之擴大產 物，將以Nde I及Hi nd I I I切斷各擴大產物所得 之物質，供於洋菜凝膠電泳，抽出各爲3 6 0、3 1 0、 1 6 0氮基對之DNA片段。將各DNA片段連結於由 Ndel 及 Hindlll 所切斷之 pCHA(NS)， 以所獲得之重組質體將E.coli HB1 0 1以氯化鈣法轉形 ，在含安比西林板片上，選擇轉形體。將依此所獲得之表 現質體中，具有3 6 0氮基對之嵌入片段者，命名爲 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 494104 A7 __^___B7___ 五、發明説明（58) PCHAT7A1 a ( 1D1 1 5Q)，具有 3 1 0 氮基 對之嵌入片段者，命名爲PCHAT7A1 a ( 16Y115Q)，具有16 0氮基對之嵌入片段者，命 名爲pCHAT7Ala (67Y115Q)。 利用上述5種縮短AS 1 0 5 1肽表現質體，將 E.coli JM10 9 (DE3)轉形，獲得各種轉形體。將 此等轉形體依與實施例2記載之方法相同的方法培養之， 將培養後之菌體以顯微鏡觀察時確認，5種轉形體均形成 有封套體。又，將各轉形體之菌體蛋白質以S D S —聚丙 烯醯胺電泳解析時確認，由各縮短AS 1 0 5 1肽之胺基 酸序列預想之分子量的位置，有顯著量之蛋白質。 由各轉形體，依與實施例2相同之方式，調製封套體 ，將此封套體溶解於含10mM EDTA，、0. 5 Μ 1：1^3塩酸（0118.5)之7]^塩酸胍溶液2 8 6#芡中 後，在4 °C下保存一夜後，以每次1 之方式供用於 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 使用 SSC — VP3 18 — 125 1 柱（直徑 4. 6mm ，長2 5 0mm :仙修科學公司製）之高速液體層析術中 ，實施含0· 1%三氟醋酸之乙睛的濃度3 1%〜5 2% 爲止之濃度梯度溶出，分別獲得如圖22 (AS 1 0 5 1 A—1)、圖 23 (AS1051A — 2)、圖 24 ( AS1051A—3)、圖 25 (AS1051A — 4) 及圖2 6 (AS 1 0 5 1A — 5 )所示之得自封套體的尖 峰0 將溶解於上述7 Μ塩酸胍溶液保存一夜之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 61 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 494104 A7 ____B7 —_ 五、發明説明（59) AS1 051A-1、AS1 051A - 2、AS1 05 1八一3、八3105 1八一4及八3105 1八一5的 殘餘全量，使用三氟醋酸將其p Η調整成酸性後，使用逆 相柱（Vydac 214tpl022)，拜達庫公司製，直徑2 2mm ，長2 5 0mm)，以流速15mj?之含三氟醋酸乙睛濃 度3 0%〜6 0%之濃度梯度溶出（2 0分鐘）予以區分 採取。將所獲得之肽分別在添加1 0倍量之胎牛血清白蛋 白後，予以凍結乾燥，再予溶解於生理食塩水中。將此等 溶液取樣，依與實施例< 5 >所示之方法相同之方法，測 定對於由botrocetin及瑞斯托菌素所引起之von W i 1 1 ebrand因子結合於福馬林固定化血小板之阻礙活性。 結果係示於圖2 7中。如圖所示，不管是任何一種縮短 AS 1 0 51肽，在圖示之濃度下，有顯著之結合阻礙活 性0 〔產業上之可利用性〕 根據本發明，由生體內投與會引起血小板減少之得自 蛇毒的肽，可獲得能將與血栓症發病有深切關係之von WilUbrand因子的結合於血小板予以阻礙之肽，可提供作 爲抗血栓藥有將來性之醫藥組成物。 〔圖面之簡單說明〕 圖1係CH—1之逆相色譜圖。 圖2係CH — 2之逆相色譜圖。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ▼裝· 訂 -62 - 494104 A7 B7___ 五、發明説明（6〇) 圖3係谷胱甘肽添加前之CH — 1的逆相色譜圖。 圖4係谷胱甘肽添加5日後，由CH — 1生成之物質 的逆相色譜圖。 圖5係由CH—1生成之物質的逆相色譜圖。 圖6係各條件下之（a )尖峰1，（ b )尖峰2之生 成量（# g/管）之時間經過圖。 圖7係AS 1 〇 5 1之胺基酸序列圖（片段A、B、 C係藉賴胺酸端肽酶切斷，作爲以二硫鍵結所連接之一個 片段）。 圖8係對於瑞斯托菌素凝集、botrocetin凝集之（a )CH - 1及（b) AS1 0 5 1之阻礙活性（相對於對 照之阻礙率）的趨勢圖。 圖9係對於土撥鼠血小板之AS 1 0 5 1的瑞斯托菌 素凝集、botrocetin凝集之阻礙活性的趨勢圖。 圖 1 0 係 AS1 0 5 1 投與（2 0 0#g/kg)後 之對於土撥鼠血小板之（a)瑞斯托菌素、（b) botrocetin之凝集活性的比較圖。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 圖1 1係對於光激發血栓模型土撥鼠之AS 1 0 5 1 (投與量200//g/kg)之抗血栓活性比較圖）。 圖1 2係大腸菌中之AS 1 0 5 1表現質體 P C A Η T 7之構築過程圖。 圖1 3係昆蟲培養細胞中，AS1 0 5 1表現質體 pCHAbac之構築過程圖。 圖1 4係由昆蟲培養液所表現之細胞破碎液中之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ^ 494104 A7 __'_B7 _ 五、發明説明（61) A S 1 0 5 1的對於由botrocetin引起的von Willebrand因子結合於固定化血小板之阻礙活性比較圖。 圖1 5係由昆蟲培養細胞所表現之培養上清液中之A S 1 0 5 1 的對於由 b 〇 t r 〇 c e t i η 引起的 v 〇 n W i 1 1 e b r a n d 因 子結合於固定化血小板之阻礙活性比較圖。 圖1 6係動物培養細胞（CHO細胞）中， AS1 0 5 1表現質體pCHSDX之構築過程圖。 圖17係對於由CHO細胞所表現之培養上清液中之 AS 1 0 5 1的對於由瑞斯托菌素所引起的von ffi 1 lebrand因子結合於固定化血小板之阻礙活性趨勢圖。 圖1 8對於由CHO細胞所表現之培養上清液中之 A S 1 0 5 1的對 於由botrocetin所引起的von Willebrand因子結合於固定化血小板之阻礙活性趨勢圖。 圖1 9係將具有由N末端起算第8 1號（但不包含轉 譯開始之甲硫胺酸殘基）之半胱酸殘基以丙胺酸取代之變 異的AS 1 0 5 1，以大腸菌表現之質體 PCHAT7A1a的構築過程圖。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 圖2 0係由蛇毒所調製之AS 1 0 51，由大腸菌所 生產之AS 1 0 5 1、及由N末端起算第8 1號之半胱胺 酸殘基由丙胺酸殘基所取代之AS1051 (

CysSlAla變異AS1051)，對於由瑞斯托菌 素或bo troce t i η所引起的von Wi 1 1 ebrand因子結合於固定 血小板之阻礙活性趨勢圖。 圖2 1係各種縮短AS 1 0 5 1肽之構造的概略圖。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X 297公釐） -64 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 494104 A7 B7 五、發明説明（62) 圖2 2係AS 1 0 5 1A — 1之HPLC色譜圖。 圖2 3係AS 1 0 5 1A-2之HPLC色譜圖。 圖2 4係AS 1 0 5 1A — 3之H PLC色譜圖。 圖2 5係AS 1 0 5 1Α—4之HPLC色譜圖。 圖2 6係AS 1 0 5 1A-5之HPLC色譜圖。 圖2 7係各種縮短AS 1 〇 5 1肽對於由瑞斯托菌素 或botrocetiii所引起的von ffillebrand因子結合於固定 血小板之阻礙活性値圖。 序列表 序列編號：1 序列長：3 8 序列型：胺基酸 形態：直鏈狀 序列種類：肽 序列

Asp Leu Glu Cys Pro Ser Gly Trp Ser Ser Tyr Asp Arg Tyr Cys Tyr 1 5 10 15

Lys Pro Phe Lys Gin Glu Met Thr Trp Ala Asp Ala Glu Arg Phe Cys

I 20 25 30 !

Ser Glu Gin Ala Lys Gly 35 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ▼裝· 訂 -65 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 494104 A7 B7 五、發明説明（63) 序列編號：2 序列長：1 2 6 序列型：胺基酸 形態：直鏈狀 序列種類：肽 序列

Asp Leu Glu Cys Pro Ser Gly Trp Ser Ser Tyr Asp Arg Tyr Cys Tyr 1 5 10 15

Lys Pro Phe Lys Gin Glu Met Thr Trp Ala Asp Ala Glu Arg Phe Cys 20 25 30 . ! Ser Glu Gin Ala Lys Gly Gly His Leu Leu Ser Yal Glu Thr Ala Leu 35 40. 45

Glu Ala Ser Phe Val Asp Asn Val Leu Tyr Ala Asn Lys Glu Tyr Leu 50 55 60 %r Arg Tyr He Trp lie Gly Leu Arg Val Gin Asn Lys Gly Gin Pro 65 70 75 80 |

Cys Ser Ser lie Ser Tyr Glu Asn Leu Val Asp Pro Phe Glu Cys Phe j 85 90 95 ：

Met Val Ser Arg Asp Thr Arg Leu Arg Glu Trp Phe Lys Val Asp Cys 100 105 110 I

Glu Gin Gin His Ser Phe lie Cys Lys Phe Thr Arg Pro Arg 115 120 125 序列編號：3 序列長：2 1 序列型：胺基酸 形態：直鏈狀 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 66 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 一裝·

、1T 494104 A7 B7 五、發明説明（64) 序列種類：肽 序列

Asp Cys Pro Ser Asp Trp Ser Ser Tyr Glu Gly His Cys Tyr Arg Val ! 1 5 10 15

Phe Gin Gin Glu Met 20 序列編號：4 序列長：1 7 序列型：胺基酸 鏈數：單鏈 形態：直鏈狀 序列種類：其他核酸合成D N A 序列 丨

I CARGARATGA CNTGGGC 17 1 序列編號：5 \ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 序列長：1 7 序列型：核酸 鏈數：單鏈 形態：直鏈狀 序列種類：其他核酸合成DNA 序列 TCNACYTTRA ACCAYTC 17 序列編號：6 本紙張尺度適用中國國家梯準（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） 494104 A7 B7 五、發明説明（65) 序列長：2 7 2 序列型：核酸 鏈數：雙鏈 形態：直鏈狀 序列種類：c D N A 起源 生物名：C r 〇 t a 1 u s h 〇 r r i d u s h 〇 r r i d u s 序列特徵 序列 CAGGAGATGA CTTGGGCCGA TGCAGAGAGG TTCTGCTCGG AGCAGGCGAA GGGCGGGCAT 60 CTCCTCTCTG TCGAAACCGC CCTAGAAGCA TCCTTTGTGG ACAATGTGCT CTATGCGAAC 120 AAAGAGTACC TCACACGTTA TATCTGGATT GGACTGAGGG TTCAAAACAA AGGACAGCCA 180 TGCTCCAGCA TCAGTTATGA GAACCTGGTT GACCCATTTG AATGTTTTAT GGTGAGCAGA 240 ; i GACACAAGGC TTCGTGAGTG GTTCAAAGTC GA 272 \ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 序列編號：7 序列長：β θ 0 序列型：核酸 鏈數：雙鏈 形態：直鏈狀 序列種類：c D N A 起源 生物名：Crotalus horridus horridus 株名： 序列特徵 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -68 - 494104 A7 B7 五、發明説明（66) 表示特徵之記號：C D S 存在位置：66.. 512 決定特徵之方法：P 序列 j CTGAGCAGAC TTGCTACCTG TGGAGGCCGA GGAACAGTTC TCTCTGCAGG GAAGGAAAGA 60 ACGCC ATG GGG CGA TTC ATC TTC GTG AGC TTC AAC TTG CTG GTC GTG TTC 110 |

Met Gly Arg Phe lie Phe Val Ser Phe Asn Leu Leu Val Val Phe 1 5 10 15 CTC TCC CTA AGT GGA ACT CTA GCT GAT TTG GAA TGT CCC TCC GGT TGG 158

Leu Ser Leu Ser Gly Thr Leu Ala Asp Leu Glu Cys Pro Ser Gly Trp 20 25 30 TCT TCC TAT GAT CGG TAT TGC TAC AAG CCC TTC AAA CAA GAG ATG ACC 206

Ser Ser Tyr Asp Arg Tyr Cys Tyr Lys Pro Phe Lys Gin Glu Met Thr 35 40 45 TGG GCC GAT GCA GAG AGG TTC TGC TCG GAG CAG GCG AAG GGC GGG CAT 254

Trp Ala Asp Ala Glu Arg Phe Cys Ser Glu Gin Ala Lys Gly Gly His 50 55 60 ! i CTC CTC TCT GTC GAA ACC GCC CTA GAA GCA TCC TTT GTG GAC AAT GTG 302 丨 . j

Leu Leu Ser Val Glu Thr Ala Leu Glu Ala Ser Phe Val Asp Asn Val 65 70 75 經濟部中央標準局員工消費合作社‘印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) CTC TAT GCG AAC AAA GAG TAC CTC ACA CGT TAT ATC TGG ATT GGA CTG 350 i

* I

Leu Tyr Ala Asn Lys Glu Tyr Leu Thr Arg Tyr lie Trp lie Gly Leu | 80 85 90 95 ! Ϋ -.................… i ； ^AGG GTT CAA AAC AAA GGA CAG CCA TGC TCC AGC ATC AGT TAT GAG AAC 398 j

Arg Val Gin Asn Lys Gly Gin Pro Cys Ser Ser lie Ser Tyr Glu Asn 100 105 110 CTG GTT GAC CCA TTT GAA TGT TTT ATG GTG AGC AGA GAC ACA AGG CTT 446

Leu Val Asp Pro Phe Glu Cys Phe Met Val Ser Arg Asp Thr Arg Leu 115 120 125 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210X 297公釐） 69 494104 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 A7 B7 五、發明説明（67)

CGT GAG TGG TTT AAA GTT GAC TGT GAA CAA CAA CAT TCT TTC ATA TGC 494| Arg Glu Trp Phe Lys Val Asp Cys Glu Gin Gin His Ser Phe He Cys I 130 135 140 AAG TTC ACG CGA CCA CGT TAAGATCCGG CTGTGTGAAG TCTGGAGAAG 542

Lys Phe Thr Arg Pro Arg 145 CAAGGAAGCC CCCCACCTCT CCCCACCCCC CACCTTCCGC AATCTCTGCT CTTCCCCCTT 602 TGCTCAGTGG ATGCTCTCTG TAGCCGGATC TGGGTTTTCT GCTCCAGATG GGTCAGAAGA 662 TCCAATAAAT TCTGCCTACC CAAAAAAA 690 序列編號：8 序列長：1 4 9 序列型：胺基酸 形態：直鏈狀 序列種類：肽 序列

Met Gly Arg Phe lie Phe Val Ser Phe Asn Leu Leu Val Val Phe Leu ；

I 1 5 10 15

Ser Leu Ser Gly Thr Leu Ala Asp Leu Glu Cys Pro Ser Gly Trp Ser | 20 25 30

Ser Tyr Asp Arg Tyr Cys Tyr Lys Pro Phe Lys Gin Glu Met Thr Trp 35 40 45

Ala Asp Ala Glu Arg Phe Cys Ser Glu Gin Ala Lys Gly Gly His Leu j 50 55 60

Leu Ser Val Glu Thr Ala Leu Glu Ala Ser Phe Val Asp Asn Val Leu 65 70 75 80

Tyr Ala Asn Lys Glu Tyr Leu Thr Arg Tyr lie Trp lie Gly Leu Arg 85 90 95 本紙張尺度適用中®阈家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 冒裝· 訂 -70 - 494104 A7 B7 五、發明説明（68)

Val Gin Asn Lys Gly Gin Pro Cys Ser Ser lie Ser Tyr Glu Asn Leu 丨 100 105 110

Val Asp Pro Phe Glu Cys Phe Met Val Ser Arg Asp Thr Arg Leu Arg 115 120 125

Glu Trp Phe Lys Val Asp Cys Glu Gin Gin His Ser Phe lie Cys Lys 130 135 140

Phe Thr Arg Pro Arg 145 序列編號：9 序列長：3 4 序列型：核酸 鏈數：單鏈 形態：直鏈狀

序列種類：其他#酸合成D N A 序列 > GGCGGCATAT GGATTTGGAA TGTCCCTCCG GTTG 34 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 序列編號：1 0 1 序列長：4 0 序列型：核酸 鏈數：單鏈 形態：直鏈狀 序列種類：其他核酸合成DNA 序列 TATCTCGAGA AGCTTACAGC CGGATCTTAA CGTGGTCGCG 40 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ~ 494104 A7 B7 五、發明説明（69) 序列編號：1 1 序列長：2 6 序列型：核酸 鏈數：單鏈 形態：直鏈狀

序列種類：其他核酸合成DNA 序列 GATGCTGGAG GCTGGCTGTC CTTTGT 26 \ 序列編號：1 2 序列長：2 7 序列型：核酸 鏈數：單鏈 形態：直鏈狀 序列種類：其他核酸合成D N A 序列 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) GGACAGCCAG CCTCCAGCA TCAGTTA 27 ί 序列編號：1 3 序列長：3 5 序列型：核酸 鏈數：單鏈 形態：直鏈狀

序列種類：其他核酸合成DNA 序列 GGTGGATCCA TATGTACAAG CCCTTCAAAC AAGAG 35 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐1 -72 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 494104 A7 B7 五、發明説明（7〇) 序列編號：1 4 序列長：3 6 序列型：核酸 鏈數：單鏈 形態：直鏈狀

序列種類：其他核酸合成D N A 序列 CTCAGAAAGC TTTTATTGTT GTTCACAGTC AACTTT 361 序列編號：1 5 序列長：3 5 序列型：核酸 鏈數：單鏈 形態：直鏈狀 • i

序列種類：其他q酸合成D N A 序列 . ! GGTGGATCCA TATGTATATC TGGATTGGAC TGAGG 35 ^ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

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Claims (1)

1. 494104 公告I A8 B8 C8 D8 月 ΰ Ίψΐ}： 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 々、申請專利範圍 一 ---------—一一一U 附件la 第8 3 1 1 1 32 8號專利申請案 中文申請專利範圍修正本 民國9 1年5月修正 1 . 一種肽，其特徵係在：此肽係由具有可阻礙von W i 1 1 e b r a n d因子與血小板之結合的活性之得自蛇毒的多肽 所獲得之單鏈肽，係包含序列編號2中所示之胺基酸序列 或含有由序列編號之第6 7號之酪胺酸殘基至第11 5號之谷 胺酸殘基爲止之胺基酸序列，其中由序列編號2所示之胺 基酸序列中，第4號及第5號，第32號及第1 20號， 第9 5號及第1 1 2號之半胱胺酸殘基，係分別作二硫鍵 結，於生體內，在顯示上述活性之最小投與量下，實質上不 會造成血小板之減少者 序列編號：2 Asp Leu Glu Cys Pro Ser Gly Trp Ser Ser Tyr Asp Arg Tyr Cys Tyr ; 15 l〇 15 Lys Pro Phe Lys Gin Glu Met Thr Trp Ala Asp Ala Glu Arg Phe Cys 20 25 30 Ser Glu Gin Ala Lys Gly Gly His Leu Leu Ser Val Glu Thr Ala Leu 35 40. 45 Glu Ala Ser Phe Val Asp Asn Yal Leu Tyr Ala Asn Lys Glu Tyr Leu 50 55 60 ^hr Arg Tyr lie Trp lie Gly Leu Arg Val Gin Asn Lys Gly Gin Pro 65 70 75 80 Cys Ser Ser lie Ser Tyr Glu Asn Leu Yal Asp Pro Phe Glu Cys Phe 85 90 95 本紙張尺度適用中國國家襟準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） ---1-----參------訂-------^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 494104 D8 _ 11 一 1 六、申請專利範圍 Met Val Ser Arg Asp Thr Arg Leu Arg Glu Trp Phe Lys Val Asp Cys 100 105 110 Glu Gin Gin His Ser Phe lie Cys Lys Phe Thr Arg Pro Arg 115 120 125 2 .如申請專利範圍第1項之肽，該序列編號2所示 之胺基酸序列中，第8 1號之半胱胺酸殘基爲其他之胺基 酸取代。 3 . —種如申請專利範圍第1項之肽的製法，該肽具 有可阻礙von Wi 1 1 ebrand因子與血小板之結合的活性， 於生體內，在顯示上述活性之最少投與量下，在實質上不 會造成血小板減少；其特徵係在： 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 使具有阻礙von Wi 1 leb rand因子與血小板之結合的活 性之得自Crotalus horridus horridus蛇毒的肽，與選自 塩酸胍及脲的蛋白質變性劑，谷胱甘肽及/或半胱胺酸共 存，使構成上述多肽之肽鏈內之二硫鍵在實質上獲得保存 的狀況下，具有充分的時間切斷將肽鏈間之二硫鍵結。 4· 一種DNA片段，其特徵爲可編碼具有序列編號 2中所示之胺基酸序列或至少含有由序列編號之第6 7號之 酪胺酸殘基至第1 1 5號之谷胺酸殘基爲止之胺基酸序列的 申請專利範圍第1項之肽。 5 · —種D N A片段，其特徵係於序列編號7所示的 鹼序列中具有以鹼編號1 3 5〜5 1 2表示之鹼序列或至 本ϋ尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）' 一 2 - A8 B8 C8 D8 494104 六、申請專利範圍 少含有驗編號3 3 3〜4 7 9之驗序列。 序列編號：7 CTGAGCAGAC TTGCTACCTG TGGAGGCCGA GGAACAGTTC TCTCTGCAGG GAAGGAAAGA 60 ACGCC ATG GGG CGA TTC ATC TTC GTG AGC TTC AAC TTG CTG GTC GTG TTC 11〇 μ , * ! I Met Gly Arg Phe lie Phe Val Ser Phe Asn Leu Leu Val Val Phe 1 5 10 15 I CTC TCC CTA AGT GGA ACT CTA GCT GAT TTG GAA TGT CCC TCC GGT TGG 158 Leu Ser Leu Ser Gly Thr Leu Ala Asp Leu Glu Cys Pro Ser Gly Trp 20 25 30 I TCT TCC TAT GAT CGG TAT TGC TAC AAG CCC TTC AAA CAA GAG ATG ACC 206 ! Ser Ser Tyr Asp Arg Tyr Cys Tyr Lys Pro Phe Lys Gin Glu Met Thr 35 40 45 j TGG GCC GAT GCA GAG AGG TTC TGC TCG GAG CAG GCG AAG GGC GGG CAT 254 I Trp Ala Asp Ala Glu Arg Phe Cys Ser Gla Gin Ala Lys Gly Gly His 50 55 60 CTC CTC TCT GTC GAA ACC GCC CTA GAA GCA TCC TTT GTG GAC AAT GTG 302 Leu Leu Ser Val Glu Thr Ala Leu Glu Ala Ser Phe Yal Asp Asn Val 65 70 75 CTC TAT GCG AAC AAA GAG TAC CTC ACA CGT TAT ATC TGG ATT GGA CTG 350 Leu Tyr Ala Asn Lys Glu Tyr Leu Thr Arg Tyr lie Trp lie Gly Leu 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 I 80 85 90 95 ；AGG GTT CAA AAC AAA GGA CAG CCA TGC TCC AGC ATC AGT TAT GAG AAC 398:1 Arg Val Gin Asn Lys Gly Gin Pro Cys Ser Ser lie Ser Tyr Glu Asn 100 105 110 CTG GTT GAC CCA TTT GAA TGT TTT ATG GTG AGC AGA GAC ACA AGG CTT 446 Leu Val Asp Pro Phe Glu Cys Phe Met Val Ser Arg Asp Thr Arg Leu 115 120 125 紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) A4規格（210X297公釐） 3 - 494104 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 CGT GAG TGG TTT AAA GTT GAC TGT GAA CAA CAA CAT TCT TTC ATA TGC 494| Arg Glu Trp Phe Lys Yal Asp Cys Glu Gin Gin His Ser Phe lie Cys j 130 135 . 140 AAG TTC ACG CGA CCA CGT TAAGATCCGG CTGTGTGAAG TCTGGAGAAG 542 Lys Phe Thr Arg Pro Arg 145 CAAGGAAGCC CCCCACCTCT CCCCACCCCC CACCTTCCGC AATCTCTGCT CTTCCCCCTT 602 TGCTCAGTGG ATGCTCTCTG TAGCCGGATC TGGGTTTTCT GCTCCAGATG GGTCAGAAGA 662 TCCAATAAAT TCTGCCTACC CAAAAAAA 690 6. 如申請專利範圍第4項之DNA片段，係於序列 編號2所示之胺基酸序列中，第8 1號之半胱胺基酸殘基 爲其他的丙胺酸殘基取代。 7. —種如申請專利範圍第1項之肽的製造方法，其 特徵係含有 藉由含有如申請專利範圍第4〜6項中任一項之 D N A片段之重組載體轉形之大場菌，以適當之培養基培 養之過程； 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 表現申請專第1項之肽， 將蓄積於大腸菌細胞內之上述肽與選自塩酸胍及脲的 蛋白質變性劑共存後，藉著將蛋白質變性劑除去，或是減 少蛋白質變性劑之濃度，而生成上述肽鏈內之二硫鍵結的 過程。 8 .如申請專利範圍第7項的方法，其中該二硫鍵結 係於序列編號2所示之胺基序列中第4號與第1 5號，第 494104 as B8 C8 D8 六、申請專利範圍 3 2號與第1 2 0號，及第9 5號及第1 1 2號之半胱胺 基酸殘基間形成。 9. 一種如申請專利範圍第1項之肽的製法，其特 徵係含有藉由含有如申請專利範圍第4〜6項中任一項之 D NA片段的重組載體轉形之昆蟲細胞或動物細胞，以適 當的培養培養之過程；表現如申請專利範圍第1項之肽， 將蓄積於前述細胞內或培養基中之肽予以回收的過程。 1 0 . —種抗血栓藥用組成物，其特徵係含有如申請 專利範圍第1或2項的肽及/或其藥學上容許的塩之有效 成分。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 用 |適 一度 尺 張 一紙 本 準 |標 一家 國 國 格 I釐 公 7 9 2