JPH02480A - 組換えｄｎａ技術によつて産生されたウシ膵臓トリプシン阻害剤の変異型、それらの方法、発現ベクターおよび組換え宿主、およびそれらの製薬学的使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アプロチニンは、トリプシン、キモトリプシン、プラス
ミンおよびカリクレインにょうなプロテイナーゼの阻害
剤として作用する、５８アミノ酸のよく特徴づけられた
基本蛋白質である。それは種々の病気、例えば、過線維
芽溶解性出血および外傷性出血のショックの処置のため
に価値ある薬物、トラシロール（Ｔｒａｓｙｌｏ１反応
）と命名されている。となった。

最近、アプロチニン分子の位２２１５における残基リジ
ンを他のアミノ酸で置換すると、アプロチニンに比較し
て変更された阻害のスペクトルをもつ、価値あるプロテ
イナーゼ阻害剤が生ずることが立証された［Ｈ，ツシェ
シェ（Ｔｓｃｈｅｓｃｈｅ）ら、　（１９８５）、特許
出願ドイツ国公開明細３（ＤＯ５）３９　６９３．１９
８５年５月１５日１．導入されたアミノ酸に依存して、
これらの修飾された阻害剤は１例えば、膵臓からおよび
白血球および／または血漿カリクレインからのエラスタ
ーゼの阻害剤として作用することができる。アプロチニ
ン変異型はアプロチニンの半合成的転化によって得るこ
とができる［Ｈ，ツシェシ、（Ｔｓｃｈｅｓｃｈｅ）ら
、ドイツ国公開明細書（ＤＥ−Ｏ５）３３　３９　６９
３号］が、得ることのできる量は比較的少ない、さらに
、この方法は位ｉ１５におけるリジン残基に加えてアミ
ノ酸の複数の置換を可能としない。

したがって、組換えＤＮＡおよび関連する技術の応用は
、阻害の所望の特異性および動源をもつアプロチニン同
族体を大量に製造する最も適当な方法であろうと考えら
れてきた。

この分野において、既知のアミノ酸配列の蛋白質の遺伝
情報を指定するＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ配列またはｍＲ
ＮＡに対して相補的であるｃＤＮＡ配列を使用して調製
できる０次いで、アミノ酸の置換は、例えば１部位特異
性突然変異発生によって導入することができる。

既知の一次構造のの蛋白質の遺伝情報を指定するＤＮＡ
を得る他の可能性は、遺伝暗号に従いコドンを選択し、
そして合成遺伝子を調製することである。

組換え体微生物および／または真核細胞の中において異
質ＤＮＡの発現する方法は知られている。

本発明の目的は、高度の特異性と高い阻害効能とをＭ＠
する。製薬学的に有用なポリペプチド／蛋白質を提供す
ることである。前記ポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術
によって製造できる。アプロチニンおよびその変異型の
アミノ酸配列をもつペプチドである。用語「変異型」は
、もとのアプロチニン配列中のアミノ酸の１または２以
上が他の天然に産出するアミノ酸によって置換されてい
る。ポリペプチドを意味する。このような置換の好まし
い位置は、酵素−阻害剤複合体内の標的酵素に密接する
位ｎである。これらは位２１１２．１３．１４．１５，
１６，１７．１８．３４．３８および３９である。接触
領域中には位ｒｔ２０は含まれないが、その基本的性質
はある場合においてカリクレイン阻害のために重要であ
ることがある。

したがって１本発明によれば、ウシ膵臓トリズシン阻害
剤（アプロチニン、ＢＰＴＩ）の配列を本質的に有し１
位２７１５，１６．１７．１８．３４．３９および５２
におけるアミノ酸の１または２以上が天然に産出するア
ミノ酸によって置換されており、ただし １、　１５位置においてアミノ酸Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａ
ｌ、Ｌｅｕ、Ｉ　Ｉｅ、Ｍｅｔ　　Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｐ
ｈｅ、Ｓｅｒ、ＴｒｐまたはＴｙｒのいずれかによって
′；！を換されているアプロチニン、 ２、　　１、に記載するような位２２１５における１３
． ４、 換に加えて、さらに位１５２においてアミノ酸Ｇｌｕ、
Ｌｅｕ、Ｖａｔ、ＴｈｒまたはＳｅｒのいずれかによっ
て置換されているアプロチニン。

Ｎ−末端アミノ酸Ａｒｇ−１の前に追加のＭｅｔを有す
るｌ、および２、に記載するアプロチニン変異型、およ
び Ｖａｌ−１５−Ｓｅｒ−１６−Ｉ　Ｉｅ−１７−アプロ
チニン、 を除外することを特徴とするペプチド、が提供される。

したがって、また、 位ご１５において、アミノ酸Ｌｅｕ、Ｉｌｅ。

Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｔ
ｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｉｎ、Ａｓｎ、ＡｒｇまたはＬｙｓ。

位ｎ１６におイテ、アミノ酸Ｖａ１．Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、
Ｓｅｒ、Ｇｉｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、ＡｒｇまたはＡｌａ
。

位ｆｉ１７において、アミノｍＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ
、　　Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｔｈ
ｒ、　　Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、　　Ｇｌｙ、Ｈｉｓ
、ＬｙｓまたはＡｒｇ、 位置１８において、アミノ酸Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｔ、
Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｇｌ　ｕまたはＧｌｙ、 位置３４において、アミノ酸Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、
Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、ＡｌａまたはＴｈｒ。

位ｉ３９において、アミノｍＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、
Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｓ
ｅｒ、Ｇｌｕ、Ｇｉｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｌｙ
ｓ、ＡｓｐまたはＰｒｏ、および 位こ５２において、Ｌｅｕ、Ｉ　ｌｅ、Ｖａｌ。

Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｇｉｎ、Ａｓｐ、Ｌ
ｙｓまたはＡｒｇ、 を含むペプチドは、好ましい。

さらに好ましくは１本発明によれば１次のペプチドが提
供される： ｌ。

２、 位置１５において、アミノｆ！＃Ｖａｌ、Ｌｅｕまたは
Ｉｌｅ、 位置１７において、アミノ酸Ｌｅｕ、工Ｉｅ、Ｖａｌ、
Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａ
ｓｎまたはＡｒ　ｇ、 位１３９において、アミノ酸Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、
Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ。

Ｉｌｅ、ＧｌｎまたはＡｒｇ、および 、・位２２５２におい−（、Ｔｈｒ、ＧｌｕまたはＭｅ
ｔ、 を含むペプチド 位２２１５において、アミノ酸Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＩ
ｌｅ、 位こ１７において、アミノ酸Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａ１．
Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ。

Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、ＡｓｎまたはＡｒ　ｇ、 位ご３９において、アミノ酸ＧｌｕまたはＡｒｇ、およ
び ３． ４、 位置５２におイテ、Ｔｈｒ、ＧｌｕまたはＭ　ｅ　ｔ　
。

を含むペプチド。

位置１５において、アミノ酸Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＩｌ
ｅ。

位置１７において、アミノ＃Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌま
たはＡｒｇ。

位２１３９において、アミノ酸ＧｌｕまたはＡｒｇ、お
よび 位ｆｉ５２において、Ｔｈｒ、ＧｌｕまたはＭｅｔ、 を含むペプチド 位置１５において、アミノ酸Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＩｌ
ｅ。

位ｆｉ１７において、アミ／ｍＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ
またはＡｒｇ、 位ご３９において、アミノ＠ＧｌｕまたはＡｒｇ、およ
び 位２１５２において、Ｔｈｒ、ＧｌｕまたはＭｅｔ、 ４． ５゜ を含むペプチド。

位置１５において、アミノ酸ＶａｌまたはＬｅｕ。

位Ｆｌｌ１７において、アミノ酸Ｌｅｕ。

位置３９において、アミノ酸ＧｌｕまたはＡｒｇ、およ
び 位ｆｉ５２におい−ｒ−、Ｔｈｒ、Ｇ１ｕまたはＭｅｔ
、 を含むペプチド。

Ｖａｌ−１５−Ｌｅｕ−１７− Ｖａｌ−１５−Ｌｅｕ−１７−Ｇｌ　ｕ−Ｖａｌ−１５
−Ｌｅｕ−１７−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−１５−Ｌｅｕ−１７
−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−１５−Ｌｅｕ−１７−Ｇｌｕ−３９
−Ｇｌｕ−５２− Ｖａｌ−１５−Ｌｅｕ−１７−Ｇｌｕ−３９−Ｔｈｒ−
５２− Ｌｅ　ｕ　−１５−Ｌｅ　ｕ　−１７−Ｌｅ　ｕ　−１
５−Ｌｅ　ｕ　−１７−Ｇ　Ｉ　　ｕ　−Ｌｅ　ｕ　−
１５−Ｌｅ　ｕ　−１７−Ｔｈ　ｒ　−Ｌｅｕ−１５−
Ｌｅｕ−１７−Ｇｌ　ｕ　−Ｌｅ　ｕ　−１５−Ｌｅ　
ｕ　−１７−Ｇ　Ｉ　ｕ　−３９−Ｇｌｕ−５２− Ｌｅ　ｕ　−１５−Ｌｅ　ｕ　−１７−Ｇ　ｌ　ｕ　−
３９−Ｔｈｒ−５２−アプロチニン。

であるペプチド。

本発明は、また１組換えＤＮＡ技術によって蛋白質の発
現のある方法のためにｆｆｆ要である分子内の位ｎ、こ
とに位ｆｉ５２に関する。

本発明は、さらに、位こ−におけるメチオニンおよび／
またはリーダーペプチドをさらに含有する、上に概説し
た配列を有するポリペプチド／蛋白質に関する。用語「
リーダーペプチド」は１本発明の文脈において、発現産
生物の分泌を促進するシグナル配列を意味するばかりで
なく、かつまたアプロチニンまたはアプロチニン変異型
配列より前にシグナル配列およびリンカ−配列を含有す
る配列を意味する。さらに、用語「リーダー配列」は、
高い発現を可使とし、および／または分子の精製を促進
するはたらきをする、分子の両端における配列を意味す
る。

本発明は、また、上に概説した配列を有するが、阻害活
性を部分的にまたは完全に保持するように、分子の端の
一方または双方において、１または複数のアミノ酸によ
って短縮されている、ポリペプチド／蛋白質に関する。

上に特定したアプロチニンの相同体（変異型）は、プロ
テイナーゼの発現量の存在に関する病気１例えば、膵臓
エラスターゼ（肝臓炎）、血清エラスターゼ（動脈硬化
症）、結合組織の障害を伴う慢性および急性の炎症にお
ける白血球エラスターゼ、脈管壁の障害、壊死の病気お
よび肺組織の変性において治療学的に使用できる。免疫
学的プロセスによる炎症反応、例えば、リウマチ様関節
炎、または心筋抑制因子およびショック症候群において
、リポソームの酵素、とくに白血球エラスターゼが演す
る役割は等しく重要である。

組換えＤＮＡおよび関連する技術の応用は、所望の特異
性および阻害の動源を有するアプロチニン相同体を大量
で製造する最も適当な方法であろうことが、認識された
。

また、合成遺伝子がＩａｃ　　Ｚ遺伝子に融合されてい
る構成［Ｅ、アウエルスワルド（Ａｕｅｒｓｗａｌｄ）
ら（１９８５）、特許出願芙国特許（ＵＫ）８６０７５
２３号］または融合されていない構成（Ｖ、ウィルケン
−バーブマン（Ｎｉｌｃｋｅｎ−Ｂｅｒｇｍａｎ）ら（
１９８６）、ＥＭＢＯＪ、、５．３２１９−３２２５］
を使用する組換えＤＮＡ技術によって、アプロチニンの
相同体を得ることができるは立証された。さらに、アプ
ロチニンの天然コード配列は、ｐｈ。

Ａ　遺伝子のシグナル配列との融合として発現された（
アルカリ性ホスファターゼ）［Ｂ、マークス（Ｍａｒｋ
ｓ）ら（１９８６）、ジャーナ）Ｌｔ−オフ轡バイオロ
ジカル争ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、
）、２０４．７’１１５−７１１８］。

遺伝子の融合を使用してバクテリア宿主において、とく
に小さい異質蛋白質を高度に発現することは、しばしば
、容易である。これは種々の理由による。宿主細胞にお
いて異質ポリペプチドの蓄積にＢｆｆを及ぼすと思われ
る因子は、次のものを包含する： （１）　　異質ポリペプチドは、宿主細胞のプロテイナ
ーゼによって効率よく分解されうる（２）　異質ポリペ
プチドは、細胞への毒性作用を有することがある。

１０．０００ダルトンより大きい分子量を有する異質蛋
白質の広範な種類はＥ、　　ｃｏｌｆにおいて細胞内的
に首尾よく発現されてきているが。

小さい異質ポリペプチドの多数が試みられてきたにもか
かわらず、発現に成功した比較的わずかである。

この問題を克服するためのある数の努力において、融合
ポリペプチドが使用されてきている。このようなアプロ
ーチの欠点は１次のものを包含する： （１）　　挿入された構造遺伝子は、融合相手のＡＵＧ
開始コドンに関して適切なリーディングフレーム中に存
在しなくではならない。

（２）　異質ポリペプチドは、融合ポリペプチドを化学
的にあるいは酵麦的に切出さなくてはならない、したが
って、所望の蛋白質はそれぞれの切断部位を含有しては
ならない、この事実は、多くの場合において１重大な問
題を提供する。

しかしながら、遺伝子の多数のコピーを含有するプラス
ミドを使用して小さいポリペプチドを発現することは、
時には、回走である［Ｖ、ウイルケンーバーグマ７　（
Ｗｆ　ｌ　ｅｋｅ　ｎ−Ｂｅ　ｒｇｍａｎ）ら（１９８
６）、ＥＭＢＯＪ、、５．３２１９−３２２５］。

劣化および／または毒性の問題を克服するための他の可
能性は１分泌系において異質蛋白質を発現することであ
る。バクテリア、酵母菌および菌類の分泌系を使用でき
る０分泌を得るためには、適当なリンカ−配列は、Ｎ−
末端より前の対応するアミノ酸配列が分泌すべき蛋白質
を処理するシグナルペプチダーゼのための処理部位を含
むように、アプロチニンまたはアプロチニン変異型の５
′一端に結合しなくてはならない。

本発明は、アプロチニン相同体の遺伝情報を指定する合
成りＮＡに関する。とくに、本発明は。

第３図に示す配列を有する。以後「マスター遺伝子（ｍ
ａｓｔｅｒ　　ｇｅｎｅ）Ｊと呼ぶＤＮＡおよび／また
はその機能的同等体に関する。用語「機能的同等体（ｆ
ｕｎｃｔ　１ｏｎａｌ　　ｅｑｕｖａｌｅｎｔ）Ｊは１
本発明の文脈において、いくつかのコドンにおいて、塩
基の１．２または３つが、蛋白質中に組込むべきアミ／
＃へ影響を及ぼさないで他の１！！基によってｎ換され
ている。上のＤＮＡ配列の誘導体を、また１、を味する
（遺伝暗号の同義性）。

アプロチニン分子の変異型を産生ずるために。

ある種のアミノ酸のためのコドンが他のアミノ酸のため
のコドンによって２２ｍされるような方法で、マスター
遺伝子を組換えＤＮＡ技術（例えば、部位特異的突然変
異発生）によって修飾する。このアプローチを使用する
と１本発明によるアプロチニン相同体（例えば、前述の
アプロチニン変異型）の遺伝情報を指定する種々のＤＮ
Ａ配列を得ることができる。

このようなｔ換におけるコドンは、５〜１２ページに記
載した好ましいアミノ酸のためのコドンである。使用す
る発現系に依存して２本発明のＤＮＡは、また、５°−
末端より上流に追加の配列を有する、表１に列挙するポ
リペプチド変異型の１つの遺伝情報を指定するＤＮＡで
あることができる。

本発明のほかの目的は、ポリペプチドの遺伝情報を指定
するＤＮＡを含有する発現ベクター（プラスミド）であ
る、これらのプラスミドは宿主有機体の形質転換に使用
される０本発明は、また。

このような形質転換された有機体に関する。形質転換に
適する多数の種々の有機は、この分野において知られて
いる。プラスミドの性質は、主として、使用する宿主有
機体に依存する。

本発明のＤＮＡを含有するプラスミドで形質転換された
宿主生物は、アプロチニン相同体の産生に使用される。

この産生は１次の工程を含む：（１）　宿主生物を適当
な条件下に培養し。

（２）　前記培養物からペプチドを回収し、そして （３）　前記ペプチドを精製する。

ポリペプチドの精製は、蛋白質化学において既知の方法
、例えば、沈殿、クロマトグラフィーおよび電気泳動に
よって達成することができる。前述のリーダーペプチド
はこのような精製においてすぐれた道具である。なぜな
ら、その特性を使用して精製を促進できるからである［
１つの例は、次の文献に記載されている：Ｓ、Ｊ、ブル
ーパー（ＢｒｕｖｅｒおよびＨ，Ｍ、サツセンフェルド
（Ｓａｓｓｅｎｆａｌｄ）（１９８５）、バイオテクノ
ロジーにおける傾向（Ｔｒｅｎｄｓ　　ｉｎＢｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ）、３．１１９１２２］。

本発明は、また、上に概説したペプチドからなる製薬学
的組成物および調製物および前記製薬学的組成物の調製
における前記ペプチドの使用に関する。このような製薬
学的組成物は、前述の適用において非常の有用である。

本発明は、無毒の不活性の製薬学的に適当な賦形剤に加
えて１本発明の化合物の１または２種以上を含んでなる
製薬学的組成物または本発明の化合物の１または２種以
上から成る製薬学的組成物、およびこれらの製薬学的組
成物を調製する方法を包含する。

本発明は、また、投与単位の形態の製薬学的調製物を包
含する。これは、製薬学的調製物が個々の部分の形態、
例えば、錠剤、被覆された錠剤、カプセル剤、ビル、坐
薬およびアンプル剤の形態であることを意味し、その活
性化合物の含量は個々の投与量の数分の１あるいは多数
倍に相当する。投与単位は、例えば、１，２．３または
４倍の個々の投与量、あるいは個々の投与量のｌ／２．
１／３または１／４を含有することができる１個々の投
与量は、好ましくは、ｌ＠の投与で与えられかつ′ｉ１
１常１日分の全部、半分または３分の工または４分の１
に相当する量の活性化合物を含有する。

無毒の不活性の製薬学的に適当な賦形剤とは。

すべてのａ類の固体、半固体または液体の希訳剤、充填
剤および配合助剤であると解釈すべきである。

述べることのできる好ましい製薬学的１Ａ５２物は１錠
剤、被覆された錠剤、カプセル剤、ビル。

丸剤、坐薬、溶液、懸濁液および乳濁液、混合、軟膏、
ゲル、クリーム、ローション、粉末およびスプレーであ
る。

錠剤、糖剤、カプセル剤、ピルおよび顆粒剤は、活性化
合物の１種または２種以上を１次の普通の賦形剤と一緒
に含有できる：（ａ）充填剤および増量剤、例えば、澱
粉、ラクトース、グルコース、マンニトールおよびシリ
カ、（ｂ）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロー
ス、アルギン＃塩類、ゼラチンおよびポリビニルピロリ
ドン、（Ｃ）保湿剤１例えば、グリセロール、（ｄ）崩
壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウムおよび重炭酸ナト
リウム、（ｅ）溶解遅延剤１例えば、パラフィン、およ
び（ｆ）吸収促進剤１例えば、第四アンモニウム化合物
、（ｇ）湿潤剤、例えば、セチルアルコールまたはグリ
セロールモノステアレート、（ｈ）吸着剤、例えば、カ
オリンおよびベントナイト、および（ｉ）潤滑剤１例え
ば、タルり、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マ
グネシウムおよび固体のポリエチレングリコール、また
は上の（ａ）〜（ｉ）に記載した物質の混合物。

錠剤、糖剤、カプセル剤、ピルおよび顆粒剤は、普通の
被膜および外殻を含有することができ、これらは不透明
化剤を含むことができ、そして、また、活性化合物の１
種または２種以上のみを、あるいは優先的に、腸管の特
定の部分において、必要に応じて遅延した方法で、放出
するような組成物であることができ２ここで使用できる
埋め込み組成物の例はポリマー物質およびワックスであ
る。

活性化合物の１種または２種以上は、必要に応じて前述
の賦形剤の１種または２種以上と一諸に、マイクロカプ
セル化した形態にすることもできる。

坐薬は、活性化合物の１種または２種以上に加えて、ｆ
ｆ通の水溶性または水不溶性の賦形剤、例えば、ポリエ
チレングリコール、脂肪、例えば。

カカオ脂肪、高級エステル、（例えば、Ｃｌ４−アルコ
ールとＣｌ６−脂肪酸とのエステル）またはこれらの物
質の混合物を含有することができる。

軟介、混合、クリームおよびゲルは、活性化合物の１種
または２種以上に加えて、ｉ！ｆ通の賦形剤、例えば、
動物性および植物性の脂肪、ワックス、パラフィン、澱
粉、トラガヵント、セルソース誘導体、ポリエチレング
リコール、シリコーン、ベントナイト、シリカ、タルク
および酸化亜鉛またはこれらの混合物を含有することが
できる。

散剤およびスプレーは、活性化合物の１種または２種以
上に加えて、普通の賦形剤１例えば、ラクトース、タル
ク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムお
よびポリアミド粉末またはこれらの物質の混合物を含有
することができる。スプレーは、慣用の噴射剤、例えば
、クロロフルオロ炭化水套をさらに含有することができ
る。

溶液および乳濁液は、活性化合物の１種または２種以上
に加えて、慣用の賦形剤１例えば、溶媒、可溶化剤およ
び乳化剤、例えば、水、エチルアルコール、イソプロピ
ルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアル
コール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１
，３−ブチレンゲリコール、ジメチルホルムアミド、油
、ことに綿実油、落花生油、トウモロコシ肝油、オリー
ブ油、ヒマシ油およびごま油、グリセロール、グリセロ
ールホルマール、テトラヒドロフルフリルアルコール、
ポリエチレングリコールおよびンルビタンの脂肪酸エス
テル、またはこれらの混合物を含有することができる。

非経口的投与のために、溶液および乳濁液は。

また、血液と等重性の無菌の形態にすることができる。

懸濁液は、活性化合物の１種または２種以上に加えて、
ｆｆｌ用の賦形剤１例えば、液状希訳剤１例えば、水、
エチルアルコールまたはプロピレングリコール、懸濁剤
１例えば、エトキシル化インステアリルアルコール、ポ
リオキシエチレンソルビトールおよびンルビタンのエス
テル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、
ベントナイト、寒天およびトラガカント、またはこれら
に混合物を含有することができる。

前述の配合形態は、また、染料、防腐剤および、芳香お
よび風味を改良する添加剤、例えば。

ペパーミント油およびユーカリ油、および甘味剤、例え
ば、サッカリンを含有することができる。

治療学的に活性な化合物は、好ましくは、前述の製薬学
的調製物中に、全混合物の約Ｏ０１〜９９．５重量％、
好ましくは約０．５〜９５重量％の量で存在する。

前述の製薬学的ｒＡ製物は、また、本発明による化合物
に加えて、他の製薬学的に活性な化合物を含有すること
ができる。

前述の製薬学的３１製物は、既知の方法に従い通常の方
法で、活性化合物の１種または２種以上を賦形剤の１種
または２ａ以上と混合することによってつくられる。

活性化合物または製薬学的組成物は、局所的。

経口的、非経口的、腹腔内および／または経直腸的に、
好ましくは経口的または非経口的、例えば、静脈内また
は筋肉内に投与することができる。

一般に１人間の医学および獣医学において、所望の結果
を得るためには、本発明による活性化合物の１種または
２！！以上を２４時間毎に約０．５〜約５００　ｍ　ｇ
　／　ｋ　ｇ体重、好ましくは５〜１００　ｍ　ｇ　／
　ｋ　ｇ体重の合計量で、適当ならば数回に分けて投与
することが右利であることがわかった０個々の投薬物は
、好ましくは、本発明による活性化合物のｌ！！または
２種以上を約１〜約２５０　ｍ　ｇ　／　ｋ　ｇ体重、
とくに３〜６０ｍｇ／ｋｇ体重の量で含有する。しかし
ながら、前述の投薬量からはずれなければならないこと
があり、特にそのことは処こすべき患者の性質および体
重、病気の性質および重さ、調製物の性質および薬剤の
投与方法、投与を行う時間または間隔に依存する。

かくして、ある場合には、活性化合物は前述の量よりも
少量で十分であり、−万能の場合には前記量を超えなけ
ればならない場合も起こるであろう、必要な特定の鹸適
な投与量および活性化合物の投与方法は、この分野に粘
通するものにとっては、その専門知識に基づき容易に決
定することができる。

合成遺伝子 以下において、アプロチニンおよびアプロチニン相同体
の遺伝情報を指定するを遺伝子の合成の方法を記載する
： アプロチニンおよびその相同体の既知の蛋白質配列を使
用して、これらのポリペプチドの遺伝情報を指定するＤ
ＮＡ配列を設計した。すべての可能な塩基の鐙換（遺伝
暗号の同義性）ならびにすべての可能な制限部位を、ま
た、合成りＮＡ配列の設計において考慮した。

合成アプロチニンおよび相同体のための得られた主な設
計は、第１図、第２図および第３図に示されている０合
成マスター遺伝子は４つのブロック（α、β、γ、δ）
から成り、それらの各々は両端に制限エンドヌクレアー
ゼのための認識部位を有する（参照、また、実施例３．
第１図）、これは１例えば、融合しない発現または融合
蛋白質としての発現のための、ＤＮＡの容易な修飾およ
び変更を可能とする。所望の蛋白質が酵素的または化学
的方法によって融合から遊離されうるか、あるいはべり
プラスミンク空間中の分泌の間に遊芝されるような方法
で、融合蛋白質は設計される。

蛋白質工学の合計のスペクトルはこの４Ｘｌｉ虞を使用
して可能となる。遺伝子の増幅は適当なリンカ−配列を
添加することによって得ることができる。アミノ酸の芒
換は、ｒｒＪＪ限エンドヌクレアーゼのための認ａ部位
に屈するものを除外して、ナベでの位置において可能で
ある。これら（８よび他のすべて）は、例えば１部位特
異的突然変異発生を使用して、当業者によって変化させ
ることができる１合ｒＪｔ遺伝子のクローニングのため
に選択したプラスミドはｐｔｒｃ　　８であった［Ｊ、
ビエイラ（Ｖｆｅｆｒａ）およびＪ、メッシング（Ｍｅ
ｓｓｉｎｇ）（１９８２）、ｉｒｌ伝子金倉ｅｎｅ）、
１９．２５９］、プラスミドはＰ−Ｌバイオケミカルス
（Ｂｆ　ｏｃｈｅｍｉ　ｃａｌ　ｓ）から商業的に入手
可能である０合成遺伝子はｐＵＣａ中においてクローニ
ングし、そしてスーパーコイルＤＮＡ配列決定法によっ
て配列決定する［Ｋ、Ｊ、チェノ（Ｃｈ　ｅ　ｎ）およ
びＰ、Ｈ，シーバーブ（Ｓｅｅｂｕｒｇ）（１９８５）
、ＤＮＡ、４．１６５−１７０１゜ え叉を２王まヱ アプロチニン相同体を融合蛋白質として発現するため、
適当な遺伝子が（１）ｌａｃＺ遺伝子（β−ガラクトシ
ダーゼ）の解読領域の３°−末端に融合しているプラス
ミド［Ｕ、リュザー（Ｒｕｔｈｅｒ）およびＢ、ミュラ
ー−ヒル（ＭｕｌＩ　ｅ　ｒ−Ｈｉ　１１）　　（１９
８３）　、　ＥＭＢＯＪ、、冬、１９７１−１９７４］
または（２）ファージ　ＭＳ−２のポリメラーゼのアミ
ノ酸９８のコドンに融合しているプラスミド［Ｅ、レマ
ル）　（Ｒｅｍａｕ　１　ｔ）ら、遺伝子（Ｇｅｎｅ）
、１５．８１−９３］。

ペリプラスミック空間中にあるいは培地中に分泌された
アプロチニン相同体を発現するためにそれぞれの遺伝子
をα−アミラーゼベクター中にクローニングした［Ｍ、
Ａ、サリバン（Ｓｕｌｌｉｖａｎ）ら（１９８４）、遺
伝子（Ｇｅｎｅ）、２９．２１−２６］、遺伝子はブロ
ックαの５゛−末端にＸ　ｂ　ａ　Ｉ−切断部位を導入
することによって修飾した。このような構成は１分泌の
間、内因性リーダーペプチダーゼによって一次翻訳産生
物を切断して、所望のアプロチニンまたはアプロチニン
変異型の生じさせることを可能とする。

合成アプロチニンおよびアプロチニン変異型を適切なり
ローユング部位中におよび正しいリーディングフレーム
中に挿入すると、すべての場合において、所望の融合蛋
白質が得られる。

Ｅ、　　ｃｏｌｉ菌株Ｍ菌株全１５の３つの発現プラス
ミドｐＥＳ４４．１．１．ｐＥＳ４５　。

１．３またはｐＣＨ２７４２の１つで形質転換し、そし
てトイチエ・サンムルング・フォンψミクロオルガニス
メア　（Ｄｅｕｔ　５ｃｈｅ　　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　　
ｗｏｎ　　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ、Ｄ−３４
００Ｇ６ｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｒｉｓｅｂａｃｈｓｔｒ、
　　８／ＦＲＧ）に、次に示す番号で受託された： Ｅ、　　ｃｏｌｉ　　ＲＲＩ　　Ｍ２Ｓ　　ｐＥＳ４４
．１．Ｉ　　　ＤＳＭ　　　４１５７Ｅ、　　　ｃａｌ
ｆ　　　ＲＲＩ　　Ｍ２Ｓ　　　ｐＥＳ　　　４５．１
．３　　　ＤＳＭ　　　４１５８ Ｅ、　　　ｃｏｌｉ　　　ＲＲＩ　　Ｍ２Ｓ　　　ｐＣ
Ｈ２７４２ＤＳＭ　　　４１５７ アプロチニン変異型の効能 表１に示す位ｎにおけるアプロチニンのアミノ酸配列を
変化させることによって、渭〈べきことには、ヒト白血
球エラスターゼに向かう阻害活性を有意の増加できるば
かりでなく、かつまたヒト力テプシンＧまたはヒト膵臓
エラスターゼＩにような他のセリンプロテアーゼの効力
ある阻害剤である変異型を発見できることがわかった。

ヒト白血球エラスターゼに対して増大した阻害活性を示
すアプロチニン変異型の例は、位ｆｉ１７におけるアミ
ノ酸ロイシンを含有するものである。それらは１位２１
１７にもとのアミノ酸アルギニンを有する変異型を使用
して見出されるよりもほとんど１桁すぐれるＫｉ値を示
すことがわかった。これらの阻害剤が示す動源の改良は
、また。

より関連のある試験モデルにおいて、例えば、内皮下の
マトリックスを使用する分解アッセイにおいて、あるい
はハムスターにおける急性肺の炎症のモデルにおいて立
証された。

ヒト白血球エラスターゼに加えて他の白血球プロテアー
ゼ、例えば、カテプシンＧを阻害するアプロチニン変異
型の例は１位２２１５および１７にアミノ酸ロイシンを
含有する変異型である。

ヒト膵臓エラスターゼ■を阻害するアプロチニン変異型
の例は１位置３９にアミノ酸グルタメートおよび位ｆｆ
１１７にロイシンを含有するものである。

材料および方法 合成遺伝子１組換えプラスミドおよび合成遺伝子を含有
する発現ベクターは１次の材料および方法を使用して調
製しかつ特性づけることができるｌ）υ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノー：Ｔ４−リガーゼ（０，
９単位／ｕ−１）；リゾチーム；ＲＮａｓｅＡ　　ポリ
ヌクレオチドキナーゼ［ベーリンガ、マンハイム（Ｂｏ
ｅｒｉｎｇｅｒ、Ｍａｎｎｈ　ｅ　ｉ　ｍ）から］。

制限ｍＺ　［ベーリンガー、マンハイム（Ｂ　ｏ　ｅｒ
ｉｎｇｅｒ、Ｍａｎｎｈｅｆｍ）、ベセスダ・リサーチ
・ラプス（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　
Ｌａｂｓ）およびバイオラプス（Ｂｉｏｌａｂｓ）から
］を、製造業者の指示に従って使用した。

２）μ ＡＴＰ、ｄＡＴＰ、ＴＴＰ　Ｅシグマ（Ｓｉｇｍａ）か
らＪ　： ＤＴＥ、チミジン［サーバ（Ｓｅ　ｒｖａ）、　ハイデ
ルベルグから］： サッカロース［ベセスダ・リサーチ・ラプス（Ｂｅｔｈ
ｅｓｄａ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　ＬａｂＳ）からＪ　
； ジアミノピメリン酸、塩化ルビジウム［シグマ（Ｓ　ｉ
　ｇｍａ）から］　； すべての他の試薬は分析等級であった［メルク（Ｍａｒ
ｋ）、ダーマシュタット（Ｄｅｒｍａｓｔａｄｔ）およ
び／またはシグマ（Ｓｉｇｎａ）］。

２）ＤＮＡ／プラスミド プラスミド　ｐＵＣａｓｓｏ−ホスホリル化Ｂａｍ　Ｈ
ｌ　　リンカ−（Ｐ−Ｌバイオケミカルレス（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌｇ）］　　［ファーマシア（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ）］　； プラスミド　ｐＵＲ２７８［１１リユザー（ｎｕｔｈｅ
ｒ）およびＢ、ミュラー−ヒル（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈｉｌ
ｌ）（１９８３）、ＥＭＢＯＪ、、２．１９７１−１９
７４］　。

プラスミド　ｐＰＬｃ２４は、Ｗ、フィーアス（Ｆ　ｉ
　ｅ　ｒ　ｓ）　　（ゲント大学、ベルギー）から得た
［ｐＰＬｃ２４の４Ｒ成：Ｅ、レマルト（Ｒａｍａｕｌ
ｔ）ら、遺伝子（Ｇｅｎｅ）、１５，８１９３Ｊ。

４）芭株 Ｅ、　　ｃｏｌｉ　　ＲＲＩ　　Ｍ２Ｓ　［ＡＴＣＣか
ら（Ｎｏ、３５　１０２）］　；Ｅ、ｃｏｌｔＣ６００
［ｐｃＩ　　８５７］は、Ｗ、フィーアス（Ｆ　ｉ　ｅ
　ｒ　ｓ）　　（ゲント大学、ベルギー）から得た［ｐ
ＰＬｃ２４（７）構成：Ｅ、レマルト（Ｒｅｍａｕｌｔ
）ら、遺伝子（Ｇｅｎｅ）、↓乏、８１−９３；Ｅ、　
　ｃｏｌｔ　　Ｃ６００：ＡＴＣＣ２３７２４］。

５）廣墳 バクトートリプトン：バクトー酵母−二キス；バクトー
寒天［デイフコ（ＤＩＦＣＯ）から］　；ＬＢ−培ｊｌ
！！（１リツトルについて）：１０ｇのバクトートリプ
トン、５ｇのバクトー酵母−二キス、１０ｇのＮａＣ１
，ＮａＯＨでｐＨ７，５に脚筒した。

カッパ１７７６−培地（１リツトルについて）＝２５ｇ
のバクトートリプトン、７．５ｇのバクトー酵母−二キ
ス、２０ｍ１の１モルのトリス−ＨＣｌ　　ｐＨ７，５
，を９５０ｍ１（７）蒸留水中に溶解し、そしてオート
クレーブ処理する。冷却後、次の試薬を添加した：５ｍ
ｌの１モルの塩化マグネシウム、１０ｍ１の１％のジア
ミノピメリン酸、１０ｍ１の０．４％のチミジン、２５
ｍ１の２０％のグルコース（すべての添加した溶液は機
能的によって減菌した）。

寒天板は、１５ｇのバクトー寒天を１リツトルの適当な
培地に添加することによって調製した。

６）坑生焦１ クロランフェニコールおよびカナマイシン−サルフェー
ト［ベーリンガー、マンハイム（Ｂａｅｒｉｎｇｅｒ、
Ｍａｎｎｈｅｉｍ）から］。

アアンビシハルおよびテトラサイクリン［サーバ（Ｓｅ
ｒｖａ）、ハイデルベルグ、から］。

７）緩衝液および溶液 １０ミリモルの　水中 ＡＴＰ　： １０×リガーゼ　０．５モルのトリス−ＭＣＩ−混合物
：　　　　　（ｐＨ７，５）；０．１モルのＭｇＣｌ２
　；０．１モルのＤＴ Ｅ、１０ミリモルのＡＴＰ １０ＸＳＰ−５１００ミリモルのトリス−ＨＣｏ：　　
　　　　　　　　　　　］　　（ｐＨ７，５）　　；１
００　　ミ　リモルのＭｇＣｌ２．５００ミリ モルのＮａＣ１；１０ミリモル のＤＴＴ １０ＸＳＰ−１１００ミリモルのトリス−）ＩＣ００：
　　　　　　　ｌ　（ｐＨ７，５）；　１００ミリモル
のＭｇＣ１，；１モルのＣ ａｃ１２；１０ミリモル（７）ＤＴ Ｔ １０ＸｓＰ−ＯＺｏｏミリモルのトリス−ＨＣｌ　　（
ｐＨ７，５）；１００ミリ モルのＭｇＣｌ２．１０ミリモ ルのＤＴＴ ２０ＸＥ−９衝　０．８％ル１７））！Ｊスス；、４モ
液：　　　　　　ルの酢酸ナトリウム；４０ミリモルの
ＥＤＴＡ；　ｐＨ８，３ ＺｎＣ１２，ｔｏミリモルノス パーミジン 形質転換緩衝液（次のように調製した）：１５ｇのサッ
カロース、１ｍｌの３．５モル（７）ＫＯＨ，１ｍｌの
１モルのＣａＣｌ２．２ｍ１ｃ７）５゜０モルのＲｂＣ
１，アクアパイプスト（ａｑｕａｂｉｄｅｓｔ）で５０
ｍ１にし、１０％酢酸でｐＨ６，２にｍｍ　し、１ｍ　
ｌの４．５モルのＭｎＣｌ２を添加し、１０％酢酸でｐ
Ｈ５，８にし、１００ｍ１にアクアパイプストを充填し
、そしてろ過減菌する。

ＴＥ緩衝液：　　１０５９モルのトリス−ＨＣＩ（ｐＨ
８，０）、’０．１ミリモ ルのＥＤＴＡ １０ｘＮＴ−１ｔｉ　　０　、５　モルｃｖ　）リスー
ＨＣｌ衝液：　　　　　　　（ｐＩ（７，２）、０．１
７　　ＭｇｃＩ２．１ミリモルのＤＴＥ リゾチーム混合　５０ミリモルのグルコース、ｌ物：　
　　　　　　ミリモルのＥＤＴＡ中２ｍｇ／ｍ１．１０
５９モルのトリス− ＨＣｌ　　ｐＨ８，０，使用前新 しく調製する フェノール／セ　８０％のフェノールおよびｌ容バグ（
ＳｅＶａＣのセバグ（クロロホルム：イｇ）：　　　　
　ソアミルアルコール、２４：■）の混合物 ＴＥＡＢＣ−緩　ｉ留水中の１モルのトリエチル析液：
　　　　　アミン、気体の００２でＰＨ７，２に：Ａ節
した １０ＸＰＮＫ−０，５トリス−ＨＣｌ　（ｐ）ｌ混合物
：　　　　　７．６）、０．１モルのＭｇＣｌ２．５０
ミリモルのＭＤＴ Ｅ、１ミリモルのＥＤＴＡ １０Ｘリガーゼ　０．５モルのトリス−ＨＣｌ−混合物
：　　　　　（ｐＨ７，４）、０．１モルのＭｇＣ＋２
．０．１モルのＤＴ Ｅ、１０ミリモルのＡＴＰ 雄 組換えＤＮＡの研究のための標準法は、マニアチス（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ）ら（１９８２）、分子クローニング（
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、コールド・
スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　　Ｓ
ｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂ。

ｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、−−ユーヨ−り州。

コールド・スプリング争ハーバー１米国、に記載されて
いるようにして使用した。

標準のエタノール沈殿 ＤＮＡ沈殿を溶解するか、あるいは溶液を０゜３モルの
酢酸ナトリウムに調節し、２体積のエタノールを添加し
、−７０℃において１５分間インキュベーションし、そ
して遠心した。沈殿を８０％のエタノールで２回洗すし
、そして真空乾燥した。

標準のフェノール抽出 溶液をフェノール／セバグ（１：　ｌ）とよく混合し、
遠心し、そしてフェノール相を１／１０体積のＴＥ−緩
衝液または水で再抽出した。水性相をプールした。

ＤＮＡの標準の脱リン酸化 完全に消化しかつ精製したＤＮＡを水中に溶解し、モし
てＩＸＣＩＰ−緩衝液（標準の体積４８ルｌ）に調節し
た。３０分後、１ＩＬｌのコウシ腸ホスファターゼを３
７℃において添加することによって反応を開始し、再び
ＩＪＬｌのＣＩＰを添加した。１時皿％、５％ｌの５ミ
リモルのＥＧＴＡを添加することによって停止し、そし
て６５℃で１０分間インキュベーションした。平滑末端
または切除した５゛末端をもつＤＮＡを脱リン酸化する
ために、それぞれ、３７℃において１５分間および５６
℃において１５分間反復してインキュベーションした。

ＤＮＡをフェノール／セバグで抽出し、そしてエタノー
ルで沈殿させた。

標準の結合 標準の結合のため、ベクターより５倍モル過剰の断片を
使用した。最後のＤＮＡの濃度は２５ＩＬ１７　ｍ　１
であった。ＤＮＡを少量のＴＥ−緩衝液中に溶解した。

３０％Ｉの標準の体積で１×リ力−ゼ混合物（５０ミリ
モルのトリス−ＨＣｌｐＨ７，４，１０ミリモルのＭｇ
Ｃｌ２．１ミリモルのＡＴＰ）中のＴ４　　ＤＮＡリガ
ーゼを使用して、１４℃で１６時間結合を実施した。

標準の制限エンドヌクレアーゼの消化 ｒｒＪ１限エンドヌクレアーゼの消化は、主として供給
者のマニュアルに従って実施した。

精製した塩不含ＤＮＡを緩衝液（使用した酵素に依存し
てＳ−０，５−５０またはＳ−１００）中に溶解し、そ
して適当量の酵素で消化した。最後に、材料をフェノー
ルで抽出し、そしてエタノールで沈殿させた。

アガロースゲルの電気泳動後のＤＮＡ断片の標準の単離 ＤＮＡｌｌｉ片をアガロースゲルの電気泳動によって分
離し［参照、Ｔ、マニアチス（ＭａｎｆａｔｉＳ）ら（
１９８２）、分子クローニング（Ｍ。

１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、：＋−ルドース
プリングφハーバーφラボラトリ−（ＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）］、
臭化エチジウムで着色し、そして長波長の紫外線の下で
切出した。スライスを透析袋中に入れ、０．５ＸＥ−緩
衝液を充填しく容量比、緩衝液ニゲルのスライス　１５
：１）そして緩衝液で良好に取囲まなくてはならない、
気泡を含まない密閉した袋を、０．５ＸＥ−緩衝液を充
填し透析室内に入れた。電気泳動を２００Ｖで３０分間
実施し１次いで電流の極性を逆転してＤＮＡを透析袋の
壁から解放した。ゲルのスライスを取囲む緩衝液を注意
して取り出し、そしてＤＥＡＥまたはＤＥ　　５２カラ
ム（上を参照）でさらに精製した。

塁！二肛立養遣土μ 形質転換は、Ｄ、ハナバン（Ｈａｎａｂａｎ）（１９８
３）、ジャーナル・オフ・モレキュラー壷バイオロジー
（Ｊ、　　Ｍｏ１．　　Ｂ　　　ｉ　　　。

１、）、１６６．５５７−５８０．の手順に従い実施し
た。

単一のコロニーを接種しそしてカッパ１７７６培地中で
増殖させた（３７℃、２００ｒｐｍの振盪ａ）宿主菌株
の培養物の２０ｍ１の１夜の培養物の１ｍｌを使用して
、１００ｍ１の予備加温した（３７℃）のカッパ１７７
６培地を接種した。

この培養物を同一条件下に培養した。細胞の増殖を０．
２光学濃度（００）（５００ｎｍ）で停止させた。４℃
に冷却しそして遠心した後、細胞の沈殿物を２０ｍ１の
氷冷形質転換ａ衝液中に再懸濁させ、そして０℃におい
て５分間インキュベーションした。Ｆｊ濁液を再び遠心
（３００Ｏｒｐｍ、４℃、１５分）シ、そして沈殿を４
ｍｌの水冷形質転換緩衝液中に再懸濁させた。２００ル
１の７リコートに７モルのＤＭＳＯを添加した後、細胞
を氷水中でさらに１５〜６０分間インキュベーションし
た。このような完全な細胞のアリコートに、２０ｐｌの
ＴＥ−＠析液中に溶解したＤＮＡを添加し、そしてこの
混合物を氷水中で２０分間インキュベーションし１次い
で３分間４２℃でインキュベーションした０次いで、１
ｍｌの予備加温した。（３７℃）カッパ１７７６培地を
このようなアリコートで接種し、そして３７℃で１時間
培養した。形質転換体を平板培養するため、Ｓ胞を遠心
しく３０００ｒｐｍ、１５分、４”Ｃり、ＹＴ培地中に
再懸濁させ、インジケーター平板（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ
　　ｐｌａｔｅ）上に配こした０期待する数の形質転換
体に従い、適当量、の懸濁液を平板培養に使用した。

Ｐ２ＰＬの急′　析プラスミド単離 記載する手順は、Ｈ，Ｃ，バーンポイム（Ｂｉｒｎｂｏ
ｉｍ）およびＪ、ドリイ（Ｄ　ｏ　Ｉ　ｙ）（１９７９
）、核酸の研究（Ｎｕｃｌ、　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ
、）、ヱ、１５１３およびＴ、マニアチス（Ｍａｎ　＊
　ａｔ　ｉ　ｓ）ら（１９８２）、分子りａ−＝７グ（
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌａｎｉｎｇ）、コールド・
スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　　Ｓ
ｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
）の方法の修正法である６分析すべき形質転換体の各々
について、２ｍｌの１夜の培養物を調製した（３７℃、
１６時間５回転車〕、培養物の１．５ｍｌを１分間１２
．０００Ｘｇで遠心した。沈殿をリゾチーム混合物の新
しく調製した溶液中に再溶解し、そして２０℃で５分間
インキュベーションした。１％のＳＯ５を含有する新し
く調製した水冷０．２ミリモルのＮａＯＨを添加した後
、試料を５分間氷上でさらにインキュベーションした。

染色体ＤＮＡおよび蛋白質を沈殿させるために、１５０
ＩＬｌの酢酸カリウム、ｐＨ７，８，を添加した。氷上
で５分間インキュベーションしそして１０分間１２．０
００Ｘｇで遠心した後、上澄みを新しい管に移し、そし
てセバグ（Ｓｅｖａｇ）で抽出した。５００μ！のイソ
プロパツールを水性相に添加した０次いで、この混合物
を一２０ＣＦで３０分間インキュベーションした。遠心
（１０分、■２，０００Ｘｇ）後、沈殿を８０％のエタ
ノールで洗浄し、そして簡単に真空乾帰した。

標準のＤＭＡ配　決 標準の段配列決定は、製造業者のプロトコル［急速かつ
簡単なプラスミドの配列決定のためのガイドライｙ（Ｇ
ｕｉｄｅｌｉｎｅｓ　　ｆｏｒＱｕｉｃｋ　　ａｎｄ　
　Ｓｉｍｐｌｅ　　Ｐｌａｓｍｉｄ　　Ｓｅｑｕｅｎｃ
ｉｎｇ）、ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｒｉｎｇｅ
ｒ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ）（１９８６）］に記載されるよ
うにして実施した。

バクテリア菌株の増殖および誘導 バクテリアの培養物は、適当な抗生物質を補足した培地
中で増殖させた。β−ガラクトシダーゼ−融合蛋白質の
発現を試みるため、発現プラスミドｐＥ５４４．１．１
またはｐＥＳ４５．１．３で形質転換したＥ、　　ｃｏ
ｌｉ　　ＲＲＩ　　Ｍ２Ｓを２ｍｌのＬＢ−アンピシリ
ン培地中に接種した。振盪フラスコ内で３７℃において
１２〜１６時間増殖させた後、１ｍｌの試料を直接使用
して、０．２ミリモルのＩＰＴＧを含有するｉｏ。

ｍｌのＬＢ−アンピシリン培地を接種した。アプロチニ
ン遺伝子のインサートをもたないｐＵＲ２７８を含有す
るクローンを、Ｄ性の対照を提供する条件下に培養した
。攪拌しながら３７℃で１２〜１６時間増殖させた後、
ｌベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ＪＡ　　１０ローター
中で１０分間５００ｒｐｍで遠心することによって細胞
を収穫した。

標準５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動ラエムリ
（Ｌａｅｍｍｌ　ｉ）、Ｕ、に、（１９７９）、ネイチ
ュアー（Ｎａｔｕｒｅ）、２７７．６８０ページ、およ
びまたＢ、Ｄ、ヘイムス（Ｈａｍｅｓ）およびり、す７
クウツド（Ｒｉｃｋｗｏｏｄ）、１９８１．蛋白’ｌＪ
ノゲル電気泳動（Ｇｅｌ　　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅ
ｓｉｓ　　。

ｆ　　ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、ＩＲＬプレス会リミテッド
、オックスフォード、に従うＳＤＳポリアクリルアミド
ゲルの電気泳動を用いて蛋白質を検出した。

約ｌＸ１０９の細胞を遠心し、ＳＤＳ試料緩衝液（７０
ミリモルのトリス、１０％のグリセロール、１％のＳＤ
Ｓ、５％のβ−メルカプトエタノール、０．１ミリモル
のＥＤＴＡ）　中に再溶解し、９５℃で５分間インキュ
ベーションし、そしてレーンの各々に適用した。電気泳
動後、ゲルをクーマツシーブ／Ｌ／−（Ｃｏｏｍａｓｓ
ｉｅ　　ｂｌｕｅ）で着色した。

アミノ酸配列の決定 約０１．５〜２ナノモルの蛋白質を３０１ＬｌのＴＦＡ
中に可溶化した。試料を３ｍｇのポリブレンで予備処理
したガラスｍ雑のフィルターに適用した。配列の分析は
、ヘウィ７り（Ｈｅｗｉｃｋ）［Ｒ，Ｍ、ヘラ４−／り
（Ｈｅｗｆ　ｃｋ）、Ｍ。

Ｗ、７ｙカビラー（Ｈｕｎｋａｐｐｉ　ｌ　１ｅｒ）、
Ｌ、Ｅ、７−ド（Ｈｏｏｄ）、Ｗ、ドレガー（Ｄｒｅｇ
ｅｒ）１９８１、ジャーナルψオフ・バイオロジカル−
ケミストリー（Ｊ、　　Ｂｉｏ　１　、　　Ｃｈｅｍ−
）、２５６．７９９０−７９９７］に従って、アプライ
ド・バイオシステムス・インコーホレーテッド（Ａｐｐ
ｌｉｅｄ　　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　　Ｉｎｃ、）（米
国）からの気相蛋白質配列決定装置によって実施した。

各工程において遊離したアミノ酸フェニルチオヒダント
イン誘導体は、シアノ−ＨＰＬＣカラム（デュポン）お
よびペイレウサー（Ｂｅｙｒｅｕｔｈｅｒ）［Ｋ、ペイ
レウサー（Ｂｅｙｒｅｕｔｈｅｒ）、Ｂ、ビースラー（
Ｂｉｅｓｌｅｒ）、Ｊ。

ポウウェンス（Ｂｏｗｅｎｓ）、Ｒ，ディルドＥｆｆ、
プ（Ｄｉ　１ｄｒｏｐ）、に、ネウフ７−（Ｎｅｕｆｅ
ｒ）、に、スチューバ−（Ｓｔｕｂｅｒ）、Ｓ、ザイス
（Ｚａｆｓ）、Ｒ，ｚ−リング（Ｅｈｒｉｎｇ）、Ｐ、
ゼイベル（Ｚａｂｅｌ）（１９８３）、蛋白質化学にお
ける現代の方法（Ｍｏｄｅｒｎ　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　
ｉｎ　　ｐｒ。

ｔｅｉｎ　　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、３０３−３２５、
ウォルター〇デ・グルイタ−（Ｗａ　ｌ　ｔ　ｅ　ｒｄ
ｅ　　Ｇｒｕｙｔｅｒ）十カンパ＝−（ＣＯｌ）、ベル
リン］に記載される分離システムを使用して分析した。

ウォーターズ（Ｗａｅｔｅｒｓ）ＨＰＬＣシステム、Ｍ
５１０ポンプ、ＷＩＳＰ７１０オートインゼクター、Ｌ
Ｃ−分光光度計Ｍ４８１およびシマズ植分装ｆｉｃ−Ｒ
３Ａを含む、を使用した。

酸の加水分解およびアミノ酸分析 約１ｍｌの蛋白質をパイレックス管に入れ、これに０．
０５％の２−メルカプトエタノールを含有する６モルの
ＨＣＩ（一定佛点のＨＣ１）の２００＃Ｌｌ　［１，Ｔ
、ポッツ（Ｐｏｔｔｓ）Ｊｒ。

１９６９、アナリテイカル・バイオケミストリー（Ａｎ
ａｌ、　　Ｂｉｏｃｈｅｍ−）、１３１．１−１５１を
添加した。管を真空下に密閉し、そして１１０℃で２２
時間インキュベーションした。

加水分解物を急速に乾燥し、１５０．ＬＬＩの０．２モ
ルのクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ２，２中に再溶解し
そしてろ過した。蛍光検出器およびシマズＣ−Ｒ２ＡＸ
ａ分装置を装備したバイオトロニック（Ｂｉ　ｏｔ　ｒ
ｏｎｉ　ｃ）ＬＣ５０００アミノ酸分析装置で、アミノ
酸を分析した。アミノ酸は、Ｊ、Ｒ，ベンソン（Ｂ　ｅ
　ｎ　ｓ　ｏ　ｎ）　、　Ｐ　。

Ｅ、ヘアー（Ｈａｒｅ）、１９７５．プロシーデインゲ
ス・オフ・ナショナル・アカデミ−・オフΦサイｘ７シ
ズ（Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔ　１　、　　Ａｃａｃｌ、　
　Ｓｃｆ　、）ＵＳＡ、７２，６１９−６２２に本質的
に記載されるようにして、０−フタルジアルデヒドとの
反応後、定量した。

白血球エラスターゼについての阻害アッセイ白血球エラ
スターゼは、Ｋ、ナカジマら（１９７９）、ジャーナル
争オフ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ−Ｂｉｏｌ
、　　Ｃｈｅｍ、）。

２５４．４０２７に記載されるようにして決定した。ア
ッセイの条件は次の通りであった：ノ、（賀 （原溶液） ジメチルホルムアミド中のＯ９ １モルのメトキシスクシニル− Ｌ−アラニル−Ｌ−７ラニルー Ｌ−プロリル−し−バリン−Ｐ ニトロ−アニリン、この原溶 液は−１８℃で貯蔵した。

基質 （量／試験） ６．５ｐｌ 基質−供給者 ベイチェム（Ｂ　ａ　ｃ　ｈ　ｅ　ｍ）ブンデルドルフ
／スイス （量／試験） 酵素−供給者 エラスチン・プロダクツ・カン パニー（Ｅｌａｓｔｉｎ　　Ｐｒ ｏｄｕｃｔｓ　　Ｃｏｍｐａｎ ｙ） パシフィック／米国 緩衝液 ０．２モルのトリス／ＨＣＩ、 ｐＨ８，０＋０．０５％のツ イーン　８０ 酵素 （ｒＡ温溶液 ５０％のエチレングリコール中 の０．０１ｍｇ／ｍ１ｃ７）ヒト白 血球エラスターゼ、この原溶液 は−１８℃で貯蔵した。

酵素 ＩＬｌ 一般手順 阻害剤の試料を、最終体格（基質の添加後）０．６５ｍ
１になるような量の緩衝液で希釈した０次に、酵素を添
加し、そしてこの混合物を室温で３０分間放こした。最
後に、基質溶液を添加し、そして４０５ｎｍにおける光
学濃度の増加を引続いて各試料について自動的に記録し
た。最初の１０分間の光学濃度の直線的増加（ＯＤ）を
、酵素の活性として取った。

阻害活性を決定するために、ｌ１ＩＩ害剤を添加したと
きおよび添加しないときの酵素の活性を測定した。阻害
の程度（％）を１次のようにして決定した： 阻害（％）＝ 約２００ｎＨのヒト白血球エラスターゼを９０Ｏルｌの
０．２モルのトリス−緩衝液ｐＨ８。

０、各々０．０５％のツイーン８０を含む、中の溶液の
１系列に、異なる量の阻害剤を添加する。

試験緩衝液で体積を９８５！ｌに補足した後、この混合
物を室温で少なくとも２時間保持する０次いで、１０Ｉ
Ｌｌの基質原溶液−５９ｍ　ｇのＭ　ｅ　０５ｕｃ−Ａ
ｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ｐＮＡ／１ｍｌジメチ
ルスルホキシド−および９９０．１の試験緩衝液から構
成された混合物の１５ｋｌを、サーモスタット制御のク
ベットホルダー内で３０℃に５分間平衡にした後、各試
料に添加し、そして４０５ｎｍにおける光学濃度の増加
を決定した。Ｋｉ値はＭ、Ｗ、エンビー（Ｅｍｐｉｅ）
およびＭ、ラスコラスキー（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ）Ｊｒ
、、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ　ｒｙ
）、２１．２２７４−２２８４（１９８２）に従い、次
の等式を使用して計算する二 ［Ｅｆｌ　　・　［Ｉ　ｆｌ ［Ｅｆｌ この等式において、　　［Ｅｆｌおよび［Ｉ　ｆｌは、
それぞれ、複合体化しない酵素および複合体化しない阻
害剤のモル濃度である；［Ｅｆｌは酵素阻害剤複合体の
モル濃度である。

夾凰例 実施例１ 遺伝子を構成するオリゴヌクレオチド（第２図参照）を
、固相合成法に従い調製した。オリゴマーのための合成
法は、プロトン活性化、保護した２°−デオキシリボヌ
クレオチドホスホルアミダイトを利用した。すべての順
次の工程は、アプライドφバイオシステムズ３８０ＤＮ
Ａ合成装置で保護したヌクレオチド、溶媒、化学物質、
およびこの製造業者から得た試薬を使用して自動化した
方法で実施した。また、同一製造業者からの固相支持体
は、制御した孔のガラスであり、これに出発３°−ヌク
レオチドはすでに取付けられていた。ある種の修正は、
製造業者の操作の指示および使用の報告に従って、自動
化反応サイクル中に導入した０合成が完結したとき、オ
リゴマーを製造業者の推奨に従いＤＮＡ合成装置内で、
脱遮断しそして固体の支持体から切離した。

オリゴマーを含有する水溶液を濃水酸化アンモニウムと
ともに５５℃に４〜２４時間密閉したバイアル中で加熱
することによって、遮断基を除去した。生ずる溶液を蒸
発させ、残留物を０．０１モルの重炭酸トリエチルアン
モニウム緩衝液、ｐＨ７，０（ＴＥＡＢ緩衝液）中に溶
解した。この溶液をセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ
・）のゲルろ過樹脂のクロマトグラフィーにかけた。こ
の方ラムを同一のＴＥＡＢＩ衝液中で！ＩｉＩ製しかつ
溶離した。空隙体積で溶離される物質をプールし、そし
て溶液を蒸発させた。

残留物の一部（２６０ｎｍにおける吸収単位の１０〜４
０％）を装入緩衝液（組成：０，１％のブロモフェノー
ルブルー、０．１％のキシレンシアツール、１０ミリモ
ルのニナトリウムＥＤＴＡ、ホルムアルデヒド中）中に
溶解し、ポリアクリルアミドゲルの電気泳動によってさ
らに精製した。ゲルの大きさ１８Ｘ３２ｍｍであり、厚
さは１．５ｍｍであった。この方法で精製した各オリゴ
マーについてのウェルの大きさはｌ１Ｇ２〜５ｃｍであ
り、そして５つまでのオリゴマーを単一ゲルで精製した
。ゲル中のポリアクリルアミドゲルの濃度は、所望の産
生物の釦の長さに依存して、１４〜２０％で変化した。

長いオリゴマーについて、１４％のアクリルアミドゲル
が好ましいが、短いオリゴマーは２０％までのアクリル
アミドゲルで精製した。ゲルは、また、７モルの尿素お
よびトリス−ポレートＥＤＴＡＩｊ１衝液（０，１モル
のトリス、０．１モルのポレート、２ミリモルのＥＤＴ
Ａ　　ｐＨ８，３）を含有した。展Ｉｌｌ緩衝液は同一
のトリス−ボレー）ＲＤＴＡ混合物であった。１［気泳
動は２０〜６０ワツトの一定電力で１８〜６時間実施し
た。このような標準化された技術は、アプライド・バイ
オシステムスから入手可能な種々のユーザーの情報の報
告から得られる。

電気泳動の完結後、ゲルをプラスチックラップで包み、
そしてオリゴマーを紫外線でシャドーウィング（ｓｈａ
ｄｏｗｆ　ｎｇ）することによって可視化した。シャド
ーウィングは、包んだゲルを蛍光性ＱＪｅクロマトグラ
フィー板上に配置し、そしてゲルを短い波長の紫外線源
で見ることによって達成する。所望の産生物は最も遅い
移動する主要なブルーのＤＮＡ断片として、このシャド
ーウィング技術によって、現れる。所望のバンドをゲル
から切除する。ＤＮＡのオリゴマーは、エビゲネ（Ｅｐ
　ｆＧｅｎｅ）Ｄ−Ｇｅ　ｌ＠電気泳動装置を使用して
、粉末状ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セルロース
上にゲルスライスから溶離する。オリゴマーをセルロー
スから１モルのＴＥＡＢ緩衝液で溶離することによって
回収する。オリゴマーを含有する緩衝液を蒸発させ、残
留物を０．０１モルのＴＥＡＢ緩衝液中に溶解し、次い
でセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ・）Ｇ−５０のカ
ラムに前述のように通過させて脱塩する。

空隙体積中で溶離する物質をプールし、そして凍結乾燥
して最終産生物を得る。

上に概説した手順を使用して、精製したオリゴマーの各
々の約０．５〜５．ＯＡ　　２６０単位が得られた。

実施例２ マスター遺伝子の設計は第１図に示されている。それは
構成ブロックα、β、γおよびδから構成されており、
そして第２図に示す１５の精製したオリゴヌクレオチド
を集成することによって構成する。第３図に示すＤＮＡ
配列は、開始コドンＡＴＧ、２つの末端コドン、ＴＡＧ
およびＴＡＡ、末端制限部位ＥｃｏＲＩ、Ｈｉ　ｎｄＩ
　Ｉ　ＩおよびＢａｍＨＩおよび内部の制限部位を含む
、これらの部位の選択は解読配列のクローニングおよび
その修飾を促進した。

この合ｒ＆遺伝子を発生するために使用した構成は、断
片のほかに、材料および方法において詳述したように、
ポリヌクレオチドキナーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼおよび
制限エンドヌクレアーゼを使用した。

１５の精製したオリゴヌクレオチド断片を、５０ミリモ
ルのＴＥＡＢＣｌ炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液、
ｐＨ７，５）中に最終濃度１０２モル／ｐ−１で溶解し
た。すべての断片のリン酸化は４つの別々の部分で実施
した（断片ｌ、３；断片２，４．６；断片５，７．９、
ｉｔ、１３゜断片８．１０．１２．１４．１６）、調製
の目的で、それぞれ、断片の各々の８０ｐモルをＩＸＰ
ＮＫ−混合物、２ルモルのＡＴＰ、０．５１ＬＣｔの３
２γＡＴＰ／ＩＯｐモルの断片、１０中位ＰＮＫ／ｐモ
ルの断片の混合物中に溶解し１合計の体積を次のように
した：断片１．３について３００ＩＬｌ　；断片２．４
，６について４００井Ｉ：断片５，７．９，１１．１３
について４００ＩＬｌ：断片８．１０．１２．１４．１
６について７００ｐ＋）、すべての部分はフェノール化
し、エタノール沈殿させ、洗浄し、そして乾燥した。

ハイブリダイゼーションの目的で、断片１，３および断
片２，４．６　（ブロックＡ）を１合計の体［１２０ｇ
１で、ＩＸリガーゼ−混合物中に溶解しかつ混合し、７
０℃で５分間インキュベーションし、室温に５時間以内
に冷却した。他の断片（ブロックＢ）を２４０ＪＬｌで
同一手順に従ってハイブリダイゼーションした。

結合の目的で、ブロックＡの溶液を１２１Ｌ１のｌθミ
リモルのＡＴＰ、１２ルｌの１００ミリモルのＤＴＥ、
２０ルｌのＴ４　　ＤＮＡリガーゼで補足し、そしてブ
ロック溶液を２倍量で補足した０反応は１４℃で７時間
実施した。この後、１０ＩＬｌのＴ４　　ＤＮＡリガー
ゼをブロックＡについて添加し、そして２０ＩＬｌをブ
ロックＢについて添加し、そして再び１４化合物で４５
分間インキュベーションした。この混合物をフェノール
化し、エタノール沈殿させ、そして乾殻した。

得られたブロックＡを９０終１のｔｘｓｐ−ｔｏｏおよ
び１０ＩＬｌ（７）ＥｃｏＲＩ　（ＩＯＵ／＃Ｌ夏）、
中に溶解し、ブＯ−／　りＢ　ｆ　Ｉ　Ｘ　Ｓ　Ｐ　−
５０およびｌ０ＩＬＩのＢａｍＨＩ中に溶解し、そして
３７℃で１時間インキュベーションした０反応をフェノ
ール抽出およびエタノール沈殿によって停止させ、６％
のポリアクリルアミドゲルの電気泳動を実施し、そして
ＤＮＡブロックを実施例１に記載するのと同一手順に従
って回収した。

等量の放射性標識ブロックＡおよびＢを水中に溶解し、
ＩＸリガーゼ混合物に調節し、ゾーン最後の合成への結
合のため前述のようにハイブリダイゼーションした。し
たがって、３ＩＬｌのｌθミリモルのＡＴＰ、３ルＩの
１００ミリモルのＴ４ＤＮＡリガーゼを２２ｇ１のハイ
ブリダイゼーション混合物に添加し、そして１４℃で７
時間インキュベーションした。再び、ｌｐｌのＴ４　　
ＤＮＡリガーゼを添加し、そしてこの反応を１４℃で４
５分間実施した。結合産生物をフェノール抽出およびエ
タノール沈殿によって精製した。標準の制限酵素の消化
（ＢａｍＨＩ　　１．５ＪＬ１．ＥｃｏＲＩ　　１．５
川ｌの二重消化）を５Ｐ−２０中で実施した。この物質
をフェノール抽出し、そしてエタノール沈殿の前に、水
溶液を３ミリモルのＭｇＣｌ２．０．３モルの酢酸ナト
リウムに調節した０次いで、６％のポリアクリルアミド
ゲルの電気泳動を実施し、そして遺伝子を実施例１に記
載するのと同一手順に従って回収した。

この手順によって得られた合成Ｖａｔ−１５−Ｇｌｕ−
５２−アプロチニンマスター遺伝子を、次のようにして
、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ消化したｐＵＣａ中に挿入し
た［Ｊ、ビエイラ（Ｖｆｅ、１ｒａ）およびＪ、メッシ
ング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）（１９８２）、遺伝子（Ｇｅｎ
ｅ）、１９．２５９］　： 精製したｐＵＣ８ＤＮＡ　（約３０ｐモル）をＥｃｏＲ
ＩおよびＢａｍＨＩで標準の制限エンドヌクレアーゼの
消化条件下に２回消化して、小さい内部のＥｃｏＲＩ−
ＢａｍＨＩ断片を切出した。

この調製物をコウシ賜ホスファターゼで脱リン酸化し、
アガロースゲルの電気泳動によって分離し、そしてこの
ベクターの大きいＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を精製し
た（標準の条件）。

ＰＲＫ５４．１．１の構成（第４図参照）は、合計量の
精製した合成アプロチニン遺伝子を１Ｐモルのベクター
と結合することによって実施した（１．８単位のＴ４　
　ＤＮＡリガーゼＢ、ＩＸリガーゼ混合物、合計の体桔
４５ル１．１４℃における７時間のインキュベーション
、１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼの添加および１４℃にお
ける４５分間の再インキュベーション）。

Ｄ、ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）からの形質転換の手順
に従い、Ｅ、　　ｃａｌｆ　　ＲＲＩ　　Ｍ２Ｓ［Ａ、
カルニンス（Ｋａｌｎｉｎｓ）ら（１９８３）、ＥＭＢ
ＯＪ、、２，５９３；ＡＴＣＣ３５１０２］を宿主細胞
として使用した。１５「白色（７）　ＣＷｈ　ｉ　ｔ　
ｅ）　Ｊ形質転換体を、２００ｐ−ｇ／ｍｌのアンピシ
リンを含有する指示平板上に取った。すべての１５の形
質転換体を、バーンポイム（Ｂｆｒｎｂｏｉｍ）および
ドリイ（Ｄ。

１ｙ）１９７９の急速分析プラスミド分離法の修正法に
従いスクリーニングした。したがって、１５の試料の沈
殿をＩＪＬｇのＲＮアーセを含有する３０ル１のｌＸ５
Ｐ−１００中に再溶解した。ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨ
Ｉを使用する創成消化を実施した。

電気泳動後、１５の形質転換体のうちん４つはほぼ２０
０塩基対の長さのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨ■断片を有する
プラスミドＤＮＡを含有することがわかった。このＥｃ
ｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を有するすべての形質転換体を
大規模に増殖させ、そして各々からのプラスミドを分離
しそしてさらに分析した。それらのうち２つを材料およ
び方法において記載するような標準の配列決定手順によ
って配列決定し、すべてはＶａｌ−１５−Ｇｌｕ−５２
−アプロチニン遺伝子の配列を含有した。

−１５−Ｌｅｕ−１７−Ｇｌ　ｕ−５２−アブロア） 組換えプラスミドｐＮＨＯ２，１，１，（第５図）は１
合成Ｖａｌ−１５−Ｌｅｕ−１７−Ｇｌｕ−５２−アプ
ロチニン遺伝子のための解読領域を含有する０組換えプ
ラスミドｐＮＨ１６，１゜１（第６図）は、合成Ｖａ　
ｌ　−１５−Ｌｅ　ｕ　−１７−Ｇｌｕ−３０−Ｇｌｕ
−５２−アプロチニン遺伝子のための解読領域を含有す
る。

プラスミドｐＮＨＯ２，１，１，（Ｖａｌ−１５−Ｌｅ
　ｕ　−１７−Ｇ　１　ｕ−５２−アプロチニン）は、
Ａｒｇの代わりに位ｆｉ１７にＬｅｕのためのコドンを
含有する、ＡｐａＩ−３ｔｕＩ断片であるβ−ブロック
の交換によって構成した（第７図）。

合成５ｓＤＮＡ断片β−ＥＡ１０Ａおよびβ−ＥＡ１０
Ｂ（第７図）の約１００ｐモルのを２０１Ｌｌの水中に
溶解し、９５℃に５分間加熱し、そして室温にゆっくり
冷却した（５時間）、ハイブリダイゼーションした非リ
ン酸化断片を、ＡｐａＩ−５ｔｕＩ断片を欠＜ＰＲＫ５
４．１．１からの１．５ｐモルの精５１１ＤＮＡと結合
した。

Ｅ、　　ｃｏｌｔ　　ＲＲＩ　　Ｍ２Ｓの形質転換を、
結合混合物の５０％を使用して実施した。１５００の形
質転換体から２４を分析プラスミド弔はおよび制限分析
によって試験した。

すべは陽性であり、そしてそれらのうち２つを材料およ
び方法において記載するように配列決定した。形質転換
体ｐＮＨＯ２，１，１をそれ以上の実験のために使用し
た。

Ｖａｌ−１５−Ｌｅｕ−１７−Ｇｌｕ−３９−Ｇｌｕ−
５２−アプロチニン遺伝子を含有するプラスミドｐＮＨ
１６，１，１を、位置３９にＡｒｇの代わりにＧｌｕの
ためのコドンを含有するＰＮＨＯ２，１，１の５ｔｕＩ
−ＳｓｔＩＩ断片であるγ−ブロックの簡単な交換によ
って構成した。

合成５ｓＤＮＡ断片γ−ＥＡ　　２Ａおよびγ−ＥＡ　
　２Ｂの約ｔｏｏｐモル（第７図）を、２０ＩＬＬの水
中に溶解し、９５℃に５分間加熱し、そして室温にゆっ
くり冷却した（５時間）、ハイブリダイゼーションした
非リン酸化断片を、５ｔｕＩ−ＳｓｔＩＩ断片を欠＜ｐ
ＮＨＯ２，１，１からの１．５ｐモルの精製ＤＮＡと結
合した。

Ｅ、　　ｃｏｌｉ　　ＲＲＩ　　Ｍ２Ｓ（７）形質転換
を結合混合物の５０％を使用して実施した。Ｅ。

ｃｏｌｉの形質転換体は１分析プラスミド＠離および制
限分析によって試験した。陽性のクローンを材料および
方法において記載するように配列決定した。形質転換体
ｐＮＨ１６，１，１をそれ以上の実験のために使用した
。

プラスミドｐＲＫ１２６．１．２４　（Ｖａｌ　−１５
−Ｌｅｕ−１７−Ｍｅｔ−５２−アプロチニン）を、Ｇ
ｌｕの代わりに位２２５２にスレオニンのためのコドン
を含有する　−ブロックの交換によって、ＰＮＨＯ２，
１，１から銹導した。

合成５ｓＤＮＡ断片　−ＥＡ　　ＩＡおよび　ＥＡ　　
ＩＢの１００ｐモル（ｆｆｉ７図）を、２０弘ｌの水中
に溶解し、９５℃に５分間加熱し、そしてゆっくり室温
に冷却した（５時間）、ハイブリダイゼーションの非リ
ン酸化断片を、ＳｓｔＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を欠＜ｐＮ
ＨＯ２，ｉ、１からの１．５ｐモルの精製したＤＮＡと
結合した。

Ｅ、　　ｃｏｌｉ　　ＲＲＩ　　Ｍ２Ｓの形質転換は、
結合混合物の５０％を使用して実施した。

Ｅ、　　ｃｏｌｉ形賀転形体転換体プラスミド分離およ
び制限分析によって試験した。陽性クローンを材料およ
び方法において記載するように配列決定した。形質転換
体ｐＲＫ１２６−１．１をそれ以上の実験のために使用
した。

プラスミドｐＲＫ１１３．１．１　（Ｖａｌ−１５−Ｌ
ｅｕ−１７−Ｔｈｒ−５２−アプロチニン）を、グルタ
ミン酸の代わりに位ｆｉ５２にスレオニンのためのコド
ンを含有する　−ブロックの交換によって、ｐＮＨＯ２
，１，１から訝導した。

合成５ｓＤＮＡ断片　−ＥＡ７Ａおよび　−ＥＡ７Ｂ＋
７）約１ＯＯｐモル（第７ｒｇＪ）ｔ−１２０ＩＬ１の
水中に溶解し、９５℃に５分間加熱し、そして室温にゆ
っくり冷却した（５時間）、ハイブリダイゼーションし
た非リン酸化断片を、Ｓｓｔ　Ｉ　Ｉ／ＢａｍＨＩ断片
を欠＜ＰＮＨＯ２，１，１からの１．５ｐモルの精製し
たＤＮＡと結合した。

Ｅ、　　ｃｏｌｉ　　ＲＲＩ　　Ｍ２Ｓの形質転換を結
合混合物の５０％を使用して実施した。Ｅ。

ｃｏｌｉの形質転換体を、分析プラスミド単離および制
限分析によって試験した。陽性のクローンを、材料およ
び方法において記載するように配列決定した。形質転換
体ｐＲＫ１１３．１．１をそれ以上の実験に使用した。

ＮＨ４Ｉ、Ｉ Ｅ、　　ｃｏｌｉ中のアプロチニン変異型遺伝子の発現
のための実施例は、前記遺伝子を１ａｃＺ遺伝子［Ｕ、
リュザー（Ｒｕｔｈｅｒ）およびＢ、ミュラー−ヒル（
Ｍｕ　１１　ｅ　ｒ−Ｈｆ　１１）（１９８３）、ＥＭ
ＢＯＪ、、２．１９７１−１９７４］と、あるいはファ
ージＭＳ−２のＲＮＡポリメラーゼのＮ−末端部分［レ
マル）（Ｒｅｍａｕ　ｌ　ｔ）ら（１９８１）、遺伝子
（Ｇｅｎｅ）、１５．８１−９３］　と融合体として発
現させることによって与えられる。

プラスミドｐＮＨＯ２，１，１（Ｖａｌ−１５−Ｌｅｕ
−１７−Ｇｌ　ｕ−５２−アプロチニン）およびｐＮＨ
１６，１，１（Ｖａｌ−１５−Ｌｅｕ−１７−Ｇｌｕ−
３９−Ｇｌｕ−５２−アブロチニン）から得られたアプ
ロチニン遺伝子を、発現プラスミドｐＵＲ２７８［Ｕ、
リュザー（Ｒｕｔｈｅｒ）およびＢ、ミュラー−ヒル（
ＭｕｌＩｅｒ−Ｈｉ　１１）（１９８３）、ＥＭＢＯＪ
　、、２．１９７１−１９７４］中に結合した。

発現ベクターｐＵＲ２７８中の合成アプロチニン遺伝子
をクローニングするため、クローニング部位ＢａｍＨＩ
およびＨｉｎｄＩＩＩを選択した。したがって、Ｂａｍ
ＨＩ部位を遺伝子の５゜−ＥｃｏＲＩ末端に添加し、そ
してＨｉ　ｎｄＩ　Ｉ■部位を３′−末端において使用
することによって、アプロチニンを修飾することが必要
であった（第８図参照）。

プラスミドｐＮＨＯ２、ｌ　、ｌの５ｐモルを。

５０ＪＬｌ（７）ＩＸＳＰ−１００中においてＥＣ０Ｒ
Ｉ（１，５Ｐモル／弘ｌ）で３７℃において５時間完全
に消化した。

この物質の突起する５°ＥｃｏＲＩ末端を、ＤＮＡポリ
メラーゼ■（クレノー断片）、ｄＡＴＰおよびＴＴＰで
酵素的に充填した。

このＤＮＡの５ｐモルを２ＪＬｌの１０ミリモルのｄＡ
ＴＰ、２ル■の１０ミリモルのＴＴＰ、５ＩＬｌのｌ０
ＸＮＴ−緩衝液および３９ルｌの水中に溶解した０次い
で、２ＩＬ＋のＤＮＡポリメラーゼエ（クレノー断片、
５単位／ＩＬｉ）を添加し、そして室温においてインキ
ュベーションした（３０分）。

この物質をフェノール抽出、エタノール沈殿させ゛、８
０％のエタノールで２回洗浄し、そして２０ルｌのＴＥ
−Ｗ析液中に溶解した。平滑末端をもつこの物質の２０
ｐｌを、ＢａｍＨＩリンカ−との結合に使用した。した
がって、２００ｐモルのリン酸化Ｂａｍｌ４Ｉリンカ−
を１０ｐモルのＤＮＡ末端に結合しく標準の結合条件、
ａ、５ＪＬｔのＴ４　　ＤＮＡリガーゼ、合計の体格６
０ト１）、１４℃で１８１１ｆｊｌｌインキユベーシヨ
ンした。この反応混合物をフェノール／セバグで抽出し
、エタノール沈殿させ、洗浄し、乾燥し、そして１０終
ｌのＴＥ中に溶解した。

ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ末端をもつ合成アプロ
チニン遺伝子をｇＪ製するため、「リンカード（Ｉｉｎ
ｋｅｒｅｄ）Ｊ洗浄プラスミド（１０ｐモル）を、まず
Ｈｉ　ｎｄＩ　Ｉ　Ｉで切断しく１０．５ｐモルのｈｉ
ｔ／ル１．５時間、３７℃）、次いでＢａｍＨＩで切断
した（４０ｐモル、２０時間、３７℃、標準の条件）、
断片を１．８％のアガロースゲルの電気泳動後単離し。

そして注意して精製した（標準の手順参照）。

ベクターの調製 親のベクターｐＵＲ２７８（約５ｐモル）を、まず、Ｉ
ｆ　ｎｄＩ　Ｉ　Ｉで切断しｌ準の条件）、フェノール
／セバグの抽出によって精製し、エタノール沈殿させ、
再溶解し、次いでＢａｍＨＩで消化した（標準の条件）
、この物質を１％の７ガロースゲル上に装入し、電気泳
動し、単離し、そして標準の条件に従い精製して５合成
アプロチニン遺伝子と結合において競争するであろう、
１８塩基対の長さのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を
除去した。

級夜旦より厘二蒐葱 結合のため、０．３ｐモルのベクタ￥、■、５Ｐモルの
断片（はぼ）、２単位のＴ４　　ＤＮＡリガーゼを使用
した（標準の条件、合計の体請３０井１．インキュベー
ション、１４℃において４時間）。

形質転換はＥ、　　ｃｏｌｉ　　ＲＲＩ　　デルタＭ１
５を宿主として使用し、結合の３分の１を用いて実施し
た（標準の条件）、１７３の「ブルー」のコロニーを、
２００１Ｌｇのアンピシリン／　ｍ　ｌを含有する指示
板上に配欝した。これから、１２の形質転換体を、さら
に、急速分析プラスミド分離によって分析した（標準の
条件）、ベクターの結合によって受容された形質転換体
の百分率に基づいて計算して、１７３の形質転換体のう
ち３０はバックグラウンドの形質転換体であろう、この
結果は１２の形質転換体のプラスミドの制限分析によっ
て確証された。それらのうちの８つは陽性であり、約２
００塩基対のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄｌＩＩ制限断片を示
した。陽性の受容体プラスミドを、また、アプロチニン
遺伝子内で５ｓｔＩＩ独特制限部位によって直線化した
。塩基配列の分析を材料および方法において記載する標
準の手順に従って実施すると、プラスミドｐＥ５４４．
１．１は所望のアプロチニンＤＮＡ断片を挿入している
ことが明らかにされた（第８図参照）、プラスミドｐＥ
５４４．１．１を、それ以上の分析および発現の研究に
使用した。プラスミドｐＥ５４５．１．３の構成は、精
確に同一の手順によって、ｐＮＨ１６，１，１からのＶ
ａｌ−１５−Ｌｅｕ−１７−Ｇｌｕ−５２−アプロチニ
ン遺伝子を使用して実施した。陽性の組換え体プラスミ
ドｐＥｓ４５．１．３は正しいＤＮＡ配列を示し、そし
てこの４８成体をそれ以上の分析および発現の研究に使
用した。

プラスミドｐＮＨＯ５，１，１（Ｖａｌ−１５−Ｌｅ　
ｕ　−１７−Ｇ　ｌ　ｕ−５２−アプロチニン）（第９
図参照）およびｐＮＨ２１，１，１（Ｖａｌ−１５−Ｌ
ｅｕ−１７−Ｇｌｕ−３９−ぐる−５２−アプロチニン
）の構成は、第９図に示す手順を用いて実施した。Ｖａ
ｌ−１５−Ｌｅｕ−１７−Ｇｌｕ−５２−７ブロチニン
遺伝子は、ｐＮＨＯ２，１，１からＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ断片として得た０発現ベクターｐＰＬｃ２４中
のクローニングのため、遺伝子の５’−ＥｃｏＲＩ末端
にＢａｍＨＩ部位を加えることによってアプロチニン遺
伝子を修飾することが必要であった。

これは遺伝子のｐＵＲ２７ｇ中へのクローニングについ
て上に記載したようにして実施した。修飾した遺伝子は
、ＢａｍＨＩおよびＨｉ　ｎｄＩ　ＩＩで制限したベク
ターｐＰＬｃ２４中に挿入した。ｐＰＬｃ２４はＷ　、
　７　イーアス（ＦｉｅｒＳ）（ゲント大学、ベルギー
）から入手した。この構成において、アプロチニン遺伝
子をフレームにおいてファージＭＳ−２のＲＮＡポリメ
ラーゼのＮ−末端部分に接続する［レマル）　（Ｒｅｍ
ａｕｌｔ）ら、遺伝子（Ｇｅｎｅ）、１５．８ｌ−９３
（１９８１）］、プラスミドＰＮＨＯ５゜１．１をそれ
以上の分析および発現のために使用した。

プラスミドｐＮＨ２１，１，１は、ｐＮＨ０５，１，１
についてと同一の方法で、プラスミドｐＮＨ１６，１，
１から得られた修飾したＥｃ。

ＲＥ／ＨｆｎｄＩＩＩ断片を、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎ
ｄＩＩＩで制限したプラスミドｐＰＬｃ２４中に結合す
ることによって調製した。

実施例５ α−アミラーゼ分泌ベクターｐＣＨ２７４２の植成 Ｅ、　　ｃｏｌｉ分泌ベクターｐＣＨ２３７中のクロー
ニングのため、Ｖａｔ−１５−Ｌｅｕ−１７−Ｍｅｔ−
５２−アプロチニンのための遺伝子をＡｒｇ−１のため
のコドンにＸ　ｂ　ａ　Ｉ部位を導入することによって
修飾した。この目的で、ｐＲＫ１２６．１．２４をＥｃ
ｏＲＩで制限し、ＤＮＡポリメラーゼ（大きい断片）の
存在下にｄＮＴＰで充填し、ＸｂａＩリンカ−（バイオ
ラプス１０１０）を制限部位中に結合して（第１θ図参
照）ｐＷＢ２６０を得た。ｐＷＢ２６０をＸｂａＩおよ
びＸｈｏＩにおいて制限し、ベクターを単離し、そして
２つの合成りＮＡ断片（ＷＢ　１４およびＷＢ　１５）
から成るリンカ−をｐＷＢＺ６０中に結合してｐＷＢ２
６０１を得た（第１Ｏ図参照）。

α−アミラーゼ分泌ベクターの構成は次のようにして実
施した： Ｂ、スブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からノα−アミラ
ーゼシグナル配列は、バシルス番スブチシリス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤＳＭ　［トイチエ
・サンムルング・フォン・ミクロオルガニスメｙ　（Ｄ
ｅｕｔ　５ｃｈｅ　　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　　ｆｕｒ　　
Ｍｆｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ、Ｇ１５ｔｔｉｎｇｅ
ｎ］から、染色体ＤＮＡの部分的５ａｕ３Ａ消化物をｐ
ＭＫ３（７）ＢａｍＨＩ中にクローニングすることによ
って誘導した［Ｍ、Ａ、サリバン（Ｓｕｌｌｉｖａｎ）
ら（１９８４）、Ｊ金倉（Ｇｅｎｅ）　、２９．２ニー
２６］、α−アミラーゼ遺伝子をもつ３ｋｂのＤＮＡ断
片を含有するクローンの１つを、α−アミラーゼ構造遺
伝子の部分を欠失してｐＡＬＫｌを産生ずることによっ
て修飾した［Ｍ、Ａ、コートネイ（Ｃｏｕｒｔｎｅｙ）
、ロチニスター大学、ニューヨーク、微生物学部、との
個人的コミュニケーション］、ｐＡＬＫ１のＤＮＡ配列
は、Ｂ。

スブチリス（ｓｕｂｔ　ｉ　ｌ　ｉ　５）ＩＡ２８９か
らのα−アミラーゼと広い相同性をもつ、２３０ｂＰ（
７）ＥＣＯＲＩ−ＢｓｔＥＩ　Ｉ断片上に、回走なリポ
ソーム結合部位（ＲＢＳ）およびシグナル配列を明らか
にした［参照、第１１図中のＤＮＡ配列およびＭ、ヤン
グ（Ｙ　ａ　ｎ　ｇ）ら（１９８３）、核酸の研究（Ｎ
ｕｃｌ、　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、）、１１．２３７
−２４９］、Ｅ、　　　ｃ。

Ｉｆ中のα−アミラーゼシグナル配列のプロセシングは
アミノ酸位置３１の後に起こった［Ｗ、ブランス（Ｂｒ
ｕｎｓ）、未公表の結果］ので、ａ１ａ３１にＮｈｅＩ
−制限部位を導入した。この目的で、ｐＡＬＫｌ　［Ｍ
、Ａ、コートネイ（Ｃ。

ｕｒｔｎｅｙ）、ロチニスター大学、から供給された］
から、α−アミラーゼのシグナル配列の大きい部分およ
び可能なニスデイ−（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）
部位を含有する１８０ｂｐ（７）ＥｃｏＲＩ−ＨａｅＩ
ＩＩ断片を分離した（第１２図中の断片Ａ）、断片Ｂ（
第１２図）、アミラーゼシグナル配列のコドン１３にお
けるＮｈｅ工部位を発生する合成リンカ−を、断片Ａ（
第１２図）と−緒に、ｐＢ１３２２中に結合し、Ｅｃｏ
ＲＩおよびＮｈｅＩで切断した（ｐＷ８２２６）、ｐＷ
Ｂ２２６をＢａｍＨＩにおいて制限し、そしてｄＮＴＰ
で完膚した後、ＨｉｎｄＩＩニーリンカ−（バイオラプ
スｔｏ０２）をベクター中に結合してｐＷＢ２０２４を
産生した。

分泌ベクターＰＣＨ２３７は、ｐｔｒｃａにおいてアミ
ラーゼシグナル配列をＩａｃＺプロモーターより後に動
かすことによって構成した（第１２図）、この構成にお
いて、Ｉａｃ’ＺのリーディングフレームをＴＡＡ−停
止コドンで停止させるべきである（第１１図、断片Ａの
ＤＮＡ配列において位２２−５８／−５６）、同−ｍＲ
ＮＡ上の蛋白質合成の再開は、位ｉ−ｉ　ｏにおける停
止コドンから下流の約５０１１！基のα−アミラーゼの
可能なニスデイ一部位にリポソームを結合した後、起こ
るであろう。

Ｖａｌ−１５−Ｌｅｕ−１７−Ｍｅｔ−５２−７ブロチ
ニンの発現のため、アプロチニン遺伝子をｐＷＢ２６０
１からＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片として単離し、そ
してｐＣＨ２３７中のα−アミラーゼシグナル配列の後
に組込み、Ｎｈｅ　ＩおよびＨｉ　ｎ　ｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ
　テ制限してｐＣＨ２４７２を得る（第１３図）。

実施例６ Ｍ５−２−アプロチニン融合蛋白質を発現させるために
、プラスミドｐＮＨＯ５，１，１またはｐＮＨ２１，１
，１で形質転換されたＥ、　　ｃ。

１１ｃ６００　［ｐｃＩ８５７］を、３０　ｇ／　１の
、酵母エキス、３０　ｇ／　ｌの牛肉エキスおよびＩｇ
／ｌのに２　ＨＰＯ４を含有するブロス中で培養した。

ｐＨを７．０に調節した。１００ｍ１のブロスを１１の
エルレンマイヤーフラスコに入れ、そして１２１’Ｃで
２０分間オートクレーブ処理した。同一培地中で培養し
た種子培養物とともに２８℃で８時間インキュベーショ
ンした後、フラスコを２８Ｏｒｐｍ（振盪直径：５ｃｍ
）で回転振盪機上で４時間２８℃においてインキュベー
ションした。その時間までに、培養物の光学濃度は約４
であった（７００ｎｍにおいて測定した）０次いで、温
度を４２℃に上げ、そしてインキュベーションをさらに
３時間続けた。その時間までに、細胞は合計の細胞蛋白
質の約１５％の量の融合蛋白質を含有した。融合蛋白質
は、標準のポリアクリルアミドゲルの電気泳動によって
、１７％のアクリルアミドの濃度を用いかつクーマツシ
ーブルーで着色することによって可視化することができ
た。

加熱誘導細胞を培養ブロスから５００Ｏｒｐｍにおける
１５分間の遠心によって集め、１０ｍ１／ｇの湿潤重量
の緩衝液Ａ（０，１モルのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５
，１０ミリモルのＥＤＴＡ、５ミリモルのβ−メルカプ
トエタノールおよび５ミリモルのベンズアミジン−ＨＣ
ｌを含有する）中に再懸濁させ、そして激しい攪拌の下
に０．２ｍｇ／ｍｌのリゾチーム［約１００，０００単
位、フル力（Ｆｌｕｋａ）ＡＧ、スイス］とともに３０
分子１３０℃でインキュベーションした。

次いで、懸濁液を４複合体に冷却し、そしてフレンチ圧
力セル（アミコ、米国）に１８０００ｐｓｉにおいて２
回通過させて、細胞膜を破壊した。不溶性物質を１１０
００Ｏｒｐで３０分間遠心すること（ベックマンＪＡ−
１０）によって回収し、そして上澄みを廃棄した。

沈殿を、２モルの尿素を添加した緩衝液Ａ巾で、前述の
ように２回再懸濁および遠心した。上澄みを再び廃棄し
た。

次いで、沈殿を１０　ｍ　ｌ　／　ｇの湿潤重量の緩衝
液Ｅ　（０，０５モルの）　！ｊ、（−ＨＣ１，ｐＨ８
１，５，８モルのグアニジン−ＨＣｌおよび１０５９モ
ルのβ−メルカプトエタノールを含有する）中に綻解し
、この溶液を３０分１（ｒｌ　１８０００ｒｐｍで遠心
すること（ベックマンＪＡ−２０）によって清浄にし、
そして１００ｍ１を緩衝液Ｃ（ｏ、０ｓ−ｒ＝ルの）＋
ＪスーＨａｔ　　ＰＨ７，５，６モルの尿素および１０
５９モルのβ−メルカプトエタノールを含有する）と平
衡化したセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−３０
０（７７−マシアＡＢ、スウェーデン）を充填したカラ
ム上に装入した。１０ｍ１の分画を集め、そして融合蛋
白質を含有する分画を５０５−ＰＡＧＥによって還元性
条件下に同定した。ピークの分画を一緒にし、そして水
に対して広範に透析した。これらの条件下に、融合蛋白
質は沈殿し、そして３０分間１０００１００００ｒｐ遠
心（ベック？７ＪＡ−１０）によって共めた。融合蛋白
質の沈殿を一７０℃で貯蔵した。

第１４図は、タイプな分離を示す、融合蛋白質を含有す
る分画は棒で示されている。

融合蛋白質（実施例６に従って調製した）を約５ｍｌ／
１００ｍｇの湿潤重量の７０％ギ酸中に溶解し、そして
臭化シアン（メチオニン：ＣＮＢｒの比＝１：２５０）
で１８時間窒素の下に室温において処理した［ウィトコ
ツプ（Ｗｉｔｋ。

Ｐ）ら（１９６８）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、
１６２，３１８−３２６７、次いで、切断混合物を水で
１０〜２０倍に希訳し、モしてギ酸および残留物ＣＮＢ
ｒを減圧下に除去した。

この濃厚な溶液を５モルのＮａＯＨでｐＨ７。

５に処理し、そして固体の尿素を８モルの最終濃度に添
加した。２５ミリモルのβ−メルカプトエタノールを添
加しそして２時間３７℃でインキュベーションした後、
この溶液を１夜２０体錆の緩衝液Ｄ（０，０５モルの＃
酸ナトリウム　ｐＨ５，２，６モルの尿素および１０ミ
リモルのβ−メルカプトエタノールを含有する）に対し
て８℃で透析した。

Ｖａｌ−１５−Ｌｅｕ−１７−Ｇｌｕ−５２−アプロチ
ニンを復元するために、緩衝液り中で平衡化したＣＭ−
セファロースのファストフロー（ファーマシアＡＢ、ス
ウェーデン）を充用したカラム（２，５％５ｃｍ）上に
装入した。この方ラムを緩衝液Ｄ（約８〜ｌＯカラム体
積）で洗浄し、１５０ｍ１の緩衝液りおよびｔ５０ｍｌ
の緩衝液Ｅ（０，０５モルの酢酸ナトリウム、ｐＨ５，
２，２ミリモルのβ−メルカプトエタノール）の間で形
成した直線の勾配で展開し、次し〜で０．０５モルの酢
酸ナトリウムｐＨ５，２（約２〜３カラム体請）で簡単
に洗浄した。最後に、復元したＶａｌ−１５−Ｌｅｕ−
１７−Ｇｌｕ−５２−アプロチニンを０．０５モルの酢
酸ナトリウムｐＨ５，２，０，５モルのＮａＣ１を含有
する、で溶離した（第１５図参照）。

ＮａＣ１−溶離液のピーク分画（ＳＯ５−ＰＡＧＥによ
って同定した）を集め、そして２０ミリモルのヘベス（
Ｈｅｐｅｓ）、ｐＨ６，５，に対して広範に透析して、
同一緩衝液中で平衡化したモノ（Ｍｏｎｏ）Ｓカラム（
１ｍｌ）（ＦＰＬＣ、ファーマシ乙スウェーデン）でさ
らに精製した。アプロチニン変異型を含有するピーク分
画を集め、０．１モルの重炭酸アンモニウムに対して広
範に透析し、そして適当なアリコートで凍結乾燥した。

通常、０．５〜１＋５ｍｇの精製したＶａｌ−１５−Ｌ
ｅｕ−１７−Ｇｌ　ｕ−５２−アプロチニンが、培養ブ
ロスｌリットルにつき回収された。

精製した蛋白質は、アミノ酸組成、が線状配列（位ｆｉ
１〜２５）１分子量および逆相ＨＰＬＣ上の挙動に関す
るかぎり１期待した特性を有した（実施例９）。

ｐＷＢ２７４２で形質転換したＥ、　　ｃｏｌｉＲＲＩ
　　Ｍ２Ｓを１夜の培養物上で増殖させた。この培地は
３％の牛肉エキス（ギブコ）。

１．５％の酵母エキス（ギブコ）、０．５％のに２ＨＰ
Ｏ４および４％のモルホリノエタンスルホン酸を蒸留水
中に溶解して含有した。１００ｍ１の培地を１リツトル
のエルレンマイヤーフラスコに入れ、モして１２１”Ｏ
で２０分間オートクレーブ処理した。冷却後、蒸留水中
に溶解しそしてろ過により滅菌したアンピシリンを５０
ｇｇ／ｍ１（７）最終濃度に添加した。Ｖａｌ−１５−
Ｌｅｕ−１７−アプロチニンを調製するため、フラスコ
を２８℃において同一培地中で増殖させた１夜の培養物
の１ｍｌを接種した。５００ｎｍで測定した光学濃度が
約１となるまで、フラスコを回転振盪機上で２８Ｏｒｐ
ｍで３時間インキュベーションした。その時、ｌａｃプ
ロモーターの誘導は１ミリモルのイソプロピルチオガラ
クトシド（シグマ）の添加により実施した０発酵を２０
時間続け、そして細胞を８００Ｏｒｐｍの遠心により収
穫した（１０分、４℃、ローターＡ６．１４をもつコン
トロン・セントリコン（ＫｏｎｔｒｏｎＣｅｎｔ　ｒｉ
　ｋｏｎ）Ｈ−４０１）。

細胞を５００ｍ１の０．０１モルのトリス緩衝液ｐｒ−
ｉａ　、０中で均質にし、そして砕いた氷で冷却しなが
ら４００Ｗで超音波により、すべての細胞の９５％より
多くが破壊されるまで、破壊した＊　３０　ｍ　ｌの過
塩素＃（７２％）をこの懸濁液（７００ｍｌ）に攪拌し
ながら添加した。３０分後、上澄みを遠心（２０分／６
０００ｒｐｍ）により回収した。それを飽和トリス塩基
溶液の添加により中和し、モしてＢｒＣｎの方法によっ
てセファロースＣＬ４Ｂ上に固定化した５　０　ｍ　ｌ
のゲル床机アプロチニン（アプロチニンに対してウサギ
中でレイズした）上に通過させた。溶離液中に活性物質
は見出せなかった。ゲルを順次に０．２トリス緩衝液Ｐ
Ｈ８，０および水で洗浄し、これによって活性は脱着さ
れなかった。活性は０．２モルの酢酸、ＨＣＩでｐＨ１
，９に調節した。で溶離することによって脱着すること
ができた。この溶離液を凍結乾燥し、そして５　ｍ　ｌ
の０．０２モルのヘペス緩衝液ｐＨ６，０中に再溶解し
た。それ以上の１ａ製は、モノ（Ｍｏｎｏ）Ｓの（ファ
ーマシア、スウェーデン）のＦＰＬＣにより、ＮａＣ１
（０〜０．５モル）の増大する勾配を使用して達成した
。活性は分画４１〜４７中に見出され（第１８図参照）
、これをプールし、透析しそして凍結乾燥した。

実施例９ 合計のアミノ酸分析を材料および方法に記載するように
して実施した。

Ｖ　ａｌ−１５−Ｌ　ｅｕ−１７−Ｇ　Ｉｕ−５２−ア
プロチニン、Ｖ　ａｌ−１５−Ｌ　ｅｕ−１７−Ｔ　ｈ
ｒ−５２−アプロチニン、Ｌ　ｅｕ−１５−Ｌ　ｅｕ−
１７−Ｇ　Ｉｕ−５２−アプロチニン、Ｖ　ａｌ−１５
−Ｌ　ｅｕ−１７−Ｇ　Ｉｕ−３９−Ｇ　Ｌｕ−５２−
アプロチニン、および Ｖ　ａｌ−１５−Ｌ　ｅｕ−１７−Ｍｅｔ−５２−アプ
ロチニン、のアミノ酸組成に関して得られた結果は、次
の通りであったニ アミノ酸１本 Ａｓｐ　　−５，０９（５） Ｔｈｒ　　３．０３（３） Ｓａｒ　　　１．１９（１） にｌｕ　　４．４３（４） Ａｌａ　　６．００（６） Ｇｌｙ　　６．２８（６） Ｖａｌ　　　２．１３（２） Ｎｅｔ　　　−−−−（−） Ｉｌｅ　　　１．４５（２） Ｌｅｕ　　２．９７（３） Ｔｙｒ　　３．７３（４） Ｐｈｅ　　３．８３（４） Ｌｙｓ　　２．８４（３） Ａｒｇ　　４．８２（５） ２本　　　　　　　　３本 ５．１８（５）　　　　５．１５（５）３．８９（４）
　　　　２．８３（３）１．１３（１）　　　　１．０
２（１）３．３１（３）　　　　４．４４（４）６．０
０（６）　　　　６．００（６）５．８６（６）　　　
　５．８４（６）１．９７（２）　　　　０．９８（１
）−−一−（−）　　　　−一−−（−）１．３５（２
）　　　　１．３９（２）２．８７（２）　　　　３．
８７（４）３．６４（４）　　　　３．７３（４）３．
８３（４）　　　　３．８３（４）２．７９（３）　　
　　２．９２（３）４．７６（５）　　　　４．９５（
５）４本 ４．９５（５） ２．８１（３） １．１５（１） ５．５７（５） ５．８４（６） ５．９２（６） ２．００（２） −−−−＜−＞ １．４２（２） ２．８９（３） ３．０９（４） ３．６９（４） ２．９５（３） ３．７９（４） Ｖ　ａｌ−１５−Ｌ　ｅｕ−１７−Ｇ　Ｉｕ−５２−ア
ブロチニＶ　ａｌ−１５−Ｌ　ｅｕ−１７−Ｔ　ｈｒ−
５２−アブロチニＬ　ｅｕ−１５−Ｌ　ｅｕ−１７−Ｇ
　１ｕ−５２−アブロチニＶ　ａｌ−１５−Ｌ　ｅｕ−
１７−Ｇ　Ｉｕ−３９−Ｇ　Ｉｕ−５２−１５京 ５．１３（５） ２．８７（３） １．０１（１） ３．２０（３） ６．３１（６） ６．０２（６） １．８７（２） ０．８８（１） １．２８（２） ２．９０（３） ３．５８（４） ３．８３（４） ２．８０（３） ４．７７（５） チニン ５本　Ｖａｌ−１５−Ｌ　ｅｕ−１７−Ｍｅｔ−５２−
アプロチニンＣｙｓおよびＰｒｏは決定しなかった。

Ｎ−末端アミノ酸配列を、材料および方法に記載するよ
うにして決定しＩ；。２５サイクル後に得られたアミノ
酸配列は次の通りであった：Ｖａｌ−１５−Ｌｅｕ−１
７−Ｇ　１ｕ−５２−アプロチニン：Ａ　ｒｇ−Ｐｒｏ
−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｕ−Ｐｒｏ
−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｔｈ　ｒＧ　Ｉ　ｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙ
ｓ−Ｖａ　Ｉ　−Ａ　Ｉ　ａ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ
−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａ　１ａ
− Ｖａｌ−１５−Ｌｅｕ−１７−Ｔｈｒ−５２−アプロチ
ニンＡｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｈａ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ
−ＧＩｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−ＧＩｙ−
Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＶａＩＡＩａ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−＋１
ｅ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＰｈｅＴｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ− Ｌ　ｅｕ−１５ Ｌｅｕ １７−Ｇ　Ｉｌ＋−５２ アプロチニン Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇ
ｌｕＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ Ｇ　ｌ　ｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ａ　１ａ−Ｌｅ
ｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ
−Ａｓｎ−Ａｌａ− Ｖ　ａｌ−１５−Ｌ　ｅｕ−１７−Ｇ　１ｕ−３９−Ｇ
　１ｕ−５２−アプロチニンＡｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−
Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｇ　１ｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｖａ　
ｌ　−Ａ　１ａ−Ｌｅｕ−１１ａ−Ｉ　Ｉｓ−Ａｒｇ−
Ｔｙｒ−ＰｈｅＴｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ Ｖ　ａｌ−１５−Ｌ　ｅｕ−１７−Ｍ　ｅｔ−５２−ア
プロチニンＡ　ｒｇ−Ｐｒｏ−Ａ　５ｐ−Ｐｈｅ−Ｃｙ
ｓ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｕ−Ｐｒｏ−Ｐ　ｒｏ−Ｔ　ｙｒ−
ＴｈｒＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌｅ
ｕ−ＩｌｅＩｌｅ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ− Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ Ｅ、ｃｏｌｉ　ＲＲＩ　Ｍ２Ｓ　ｐＣＨ２７４２の発酵
によって得られｆ：　Ｖ　ａｌ−１５−Ｌ　ｅｕ−１７
−Ｍ　ｅｔ−５２−アプロチニンの約３０％は、Ｎ−末
端に追加のＡｌａ残基を含有した。これはα−アミラー
ゼシグナル配列中のＡｌａ−３０（第１１図）をＧｉｎ
で置換することによって回避できる。

実施例１Ｏ Ｖａｌ−１５−Ｌ　ｅｕ−１７−アプロチニン変異型の
反応速度定数の決定 Ｋｉ値は材料および方法に記載するようにして決定した
。Ｖ　ａｌ−１５−Ｇ　Ｉｕ−５２−およびＶａｌ−１
５−Ｌｅｕ−１７−Ｇｌｕ−５２−アプロチニンの量を
増加することによるヒト白血球エラスターゼ（ＨＬＥ）
の阻害を、第１８図に示す。アプロチニン変異型を用い
て得られたヒト白血球エラスターゼ、ヒト膵臓エラスタ
ーゼ■およびヒトカテプシンＧの阻害についての典型的
なＫｉ値は次の通りであった： Ｖａｌ−１５−Ｇｌｕ−５２ Ｖａｌ−１５−Ｌｅｕ−１７−Ｇｌｕ−５２Ｖａｌ−１
５−Ｌｅｕ−１７−Ｇｌｕ−３９−Ｔｈｒ−５２Ｖａｔ
−１５−Ｌｅｕ−１７−Ｍｅｔ−５２Ｖａｌ−１５−Ｌ
ｅｕ−１７−Ｔｈｒ−５２Ｌｅｕ−１５−Ｌｅｕ−１７
−Ｇｌｕ−５２Ｌｅｕ−１５−Ｌｅｕ−１７−Ｇ　１ｕ
−３９−Ｇ　ｌｕ−５２Ｋｉ（Ｍ） １．５ＸｌＯ−” ５−６Ｘ１０−” ２ＸＩＯ−” ６ＸｌＯ−” ７ＸｌＯ−” ｌＸｌ０−１０ ２Ｘ１０−’ ＞１０−’ ５ＸＩＯ−’ ＞１０−’ ＞１０−’ ＞１０−’ ｌＸｌ０−’　　　ｌＸｌ０−’ ２ＸＩＯ−’ 本発明の主な態様および特徴は１次の通りである。

１、ウシ膵臓トリプシン阻害剤（アプロチニン、ＢＰＴ
Ｉ）の配列を本質的に有し、位２１１５゜１６．１７．
１８．３４．３９および５２におけるアミノ酸の１また
は２以上が天然に産出するアミノ酸によって２２換され
ており、ただしａ）　　　１５位芒においてアミノ＠Ｇ
ｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉ　ｌｅ、Ｍｅｔ、Ａ
ｒｇ、Ｔｈｒ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、ＴｒｐまたはＴｙｒの
いずれかによってこ換されているアプロチニン。

ｂ）　　ａ）に記載するような位２１１５における置換
に加えて、さらに位芒５２においてアミノ酸Ｇｌｕ、Ｌ
ｅｕ、Ｖａ１．ＴｈｒまたはＳｅｔのいずれかによって
ご換されているアプロチニン。

ｃ）　　Ｎ−末端アミノ酸Ａｒｇ−１の前に追加のＭｅ
ｔを有するａ）およびｂ）に記載するアプロチニン変異
型、および ｄ）　　Ｖａｌ−１５−Ｓｅｒ−１６−ｒ　Ｉｅ−１７
−アプロチニン、 を除外することを特徴とするペプチド。

２、位ｆｉ１５において、アミノ酸Ｌｅｕ、ＩＩｅ、Ｖ
ａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｔｈ
ｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＡｒｇまたはＬｙｓ。

位ｉ１６において、アミノ酸Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、
Ｓｅｒ、Ｇｉｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、ＡｒｇまたはＡｌａ
、 位置１７において、アミノ酸Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、
Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｓ
ｅｒ、Ｇｉｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ。

Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｒｇ、 位２ｔ１８において、アミノ酸Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ
、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕまたはａｔｙ。

位ｆｉ３４において、アミノ酸Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ
、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、ＡｌａまたはＴｈｒ。

位２２３９において、アミノ酸Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ
、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、
Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ。

Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＡｓｐまたはＰｒｏ。

および 位置５２におい７．Ｌｅｕ、Ｉ　ｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ
、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｇｉｎ、Ａｓｐ、Ｌｙｓま
たはＡｒｇ。

を含む上記第１項記載のペプチド。

３、位ｆｉ１５において、アミノ酸Ｖａｌ、ＬｅＵまた
はＩｌｅ。

位２２１７において、アミノ酸Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ
、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、
ＰｈｅまたはＡｓｎ、 位２２３９において、アミノ酸Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ
、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、ＩＩｅまたはＧｉ
ｎ、および 位置５２において、Ｍｅｔ、ＴｈｒまたはＧＩＵ。

を含む上記第１項記載のペプチド。

４、位置１５において、アミノ酸Ｖａ１．ＬｅＵまたは
Ｉｌｅ、 位首１７において、アミノ酸Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、
Ｇｉｎ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔ”ｙｒ、
ＰｈｅまたはＡｓｎ。

位と３９において、アミノ酸ＧｌｕまたはＡｒｇ、およ
び 位ｆｉ５２において、Ｍｅ　ｔ、”ｒｈ　ｒまたはＧＩ
Ｕ。

を含む上記第１項記載のペプチド。

５、位ｆｉ１５において、アミノ酸Ｖａ１．ＬｅＵまた
はＩｌｅ。

位２２１７において、アミノ酸Ｌｅｕ、Ａｒｇ。

ＩｌｅまたはＶａｌ、 位２２３９において、アミノ酸ＧｌｕまたはＡｒｇ、お
よび 位置５２において、Ｍｅｔ、ＴｈｒまたはＧＩＵ。

を含む上記第１項記載のペプチド。

６、位２１１５において、アミノ酸ＶａｌまたはＬｅｕ
、 位ｆｆ１１７において、アミノ酸ＬｅｕまたはＡｒｇ。

位ご３９において、アミノ酸ＧｌｕまたはＡｒｇ、およ
び 位２１５２において、Ｍｅｔ、ＴｈｒまたはＧＩＵｌ を含む上記第１項記載のペプチド。

７、Ｖａｌ−１５−Ｌｅｕ−１７− Ｖａｌ−１５−Ｌｅｕ−１７−Ｇｌｕ−５２−Ｖａｌ−
１５−Ｌｅｕ−１７−Ｔｈｒ−５２Ｖａｌ−１５−Ｌｅ
ｕ−１７−Ｇｌｕ−３９−Ｖａｌ−１５−Ｌｅｕ−１７
−Ｇｌｕ−３９−Ｇｌｕ−５２− Ｖａｌ−１５−Ｌｅｕ−１７−Ｇｌｕ−３９−Ｔｈｒ−
５２− Ｌｅｕ−１５−Ｌｅｕ−１７− Ｌｅｕ−１５−Ｌｅｕ−１７−Ｇｌｕ−５２−Ｌｅｕ−
１５−Ｌｅｕ−１７−Ｔｈｒ−５２−Ｌｅｕ−１５−Ｌ
ｅｕ−１７−Ｇｌｕ−３９−Ｌｅ　ｕ　−１５−Ｌｅ　
ｕ　−１７−Ｇ　Ｉ　　ｕ−３９−Ｇｌｕ−５２− Ｌｅｕ−１５−Ｌｅｕ−１７−Ｇｌｕ−３９−Ｔｈｒ−
５２−アプロチニン。

である上記第１項記載のペプチド。

８、位２１１におけるＡｒｇの前にまたは位置５８にお
けるＡｌａの後に、アミノ酸またはペプチド配列を有す
る上記第１〜７項のいずれかに記載のペプチド。

９、さらに位置−１におけるメチオニンおよび／または
リーダーペプチドを含有する上記第１〜７項のいずれか
に記載のペプチド。

１０、分子の一端または両端において１つまたは複数の
アミノ酸によって短縮されている上記第１〜７項のいず
れかに記載のペプチド。

１１、、！ＩＩ換えＤＮＡ技術によって産生された上記
第１−１０項のいずれかに記載のペプチド。

１２、上記第１−１０項のいずれかに記載のペプチドの
遺伝情報を指定するＤＮＡ。

１３、上流にメチオニンのためのコドンまたはリーダー
ペプチドの遺伝情報を指定するＤＮＡあるいは下流に１
または２以上の追加のアミノ酸の遺伝情報を指定するコ
ドンをさらに含む上記第１２項記載のＤＮＡ。

１４、上記第１２または１３項記載のＤＮＡを含む発現
ベクター １５、ダラム陰性またはダラム陽性のバクテリア、酵母
菌またはｉａｍ状菌類であることができる上記第１４項
記載の発現ベクターで形質転換された宿主有機体。

１６、上記第１〜１０項のいずれかに記載のペプチドの
産生における上記第１５項記載の宿主有機体の使用。

１７、工程： ａ）上記第１４ＪＪ’ｉ記載の発現ベクターで形質転換
された宿主有機体を培養し。

ｂ）前記培養物からペプチドを回収し、そしてＳ　　　
４４．１．１　　（ＤＳＭ　　４１５７）、Ｅｃｏｌｉ
　　　ＲＲＩ　　Ｍ２Ｓ　　　ｐＥｓ　　　４５．１゜
３（ＤＳＭ　　４１５８）および’ｆ：、　　ｃｏｌｉ
ＲＲＩ　　Ｍ２Ｓ　　ｐＣＨ２７４２（ＤＳＭ　　４１
５７）。

Ｃ）前記ペプチドを精製する。

を含んでなることを特徴とする上記第１−１０項のいず
れかに記載のペプチドを調製する方法。

１８、薬剤の製造における上記第１〜１０項のいずれか
に記載のペプチドの使用。

１９、上記第１−１０項のいずれかに記載のペプチドを
含んでなる製薬学的組成物。

２０、Ｅ、　　ｃｏｌｉ　　ＲＲＩ　　Ｍ２Ｓ　　ｐＥ

【図面の簡単な説明】

第１図は１合成Ｖａｌ−１５−Ｇｌｕ−５２−アプロチ
ニンマスター遺伝子の設計を示す。 第２図は１合成Ｖａｌ−１５−Ｇｌｕ−１７−５２−ア
プロチニン遺伝子の構成のために使用した１５オリゴヌ
クレオチド断片のＤＮＡ配列を示す。 第３図は、プラスミドｐＲＫ５４．１．１中の合成Ｖａ
ｌ−１５−Ｇｌｕ−５２−アプロチニンマスター遺伝子
のＤＮＡ配列を示す。 第４図は１組換えプラスミドｐＲＫ５４．ｌ　。 ｌを示す。 第５図は、Ｖａｆ−１５−Ｌｅｕ−１７−Ｇｌｕ−５２
−アプロチニン遺伝子のＤＮＡ配列および組換えプラス
ミドｐＮＨＯ２，１，１の制限地図を示す。 ｔＪＳＢ図は、Ｖａｌ−１５−Ｌｅｕ−１７−Ｇｌｕ−
３９−Ｇｌ　ｕ−５２−アプロチニン遺伝子のＤＮＡ配
列および組換えプラスミドｐＮＨ１６゜１．１の制限地
図を示す。 第７図は、断片β−ＥＡＩＯＡおよびＢ、γ−ＥＡ２Ａ
およびＢ、δ−ＥＡＩＡおよびＢ、およびδ−ＥＡ７Ａ
およびＢのＤＮＡ配列を示す。 第８図は１発現プラスミドｐＥ３４４．１．１の構成を
示す。 ｔ５９図は１発現プラスミドｐＮＨＯ５，１，１のｕＩ
成を示す。 ２１０図は、ベクターｐＷＢ２６０１のＭＩｉ成を示す
。 第１１図は、プラスミドＰＡＬＫＩからのα−アミラー
ゼリーダーのＤＮＡ配列を示す。 第１２図は、プラスミドＰＣＨ２３７の構成を示す。 第１３図は、プラスミドｐＣＨ２４７２の構成を示す。 第１４図は、６モルの尿素およびｌＯミリモルのβ−メ
ルカプトエタノールを含有する５０ミリモルのトリス　
ＰＦ３．５中のセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ・）
Ｓ−３００（７）ゲルろ過によるＭＳ−２−Ｖａｌ−１
５−Ｌｅｕ−１７−Ｇｌｕ−５２−アプロチニン融合蛋
白質の精製を示す、プールの分画は棒によって示されて
いる。 ｔｊＳｌｓ図は、ＣＭ−セフ７０−ス（Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ＠）によるＶａｌ−１５−Ｌｅｕ−１７−Ｇｌｕ−
５２−アプロチニンの精製を示す。 プールの分画は棒によって示されている。 第１６図は、モノ（ＭｏｎｏＳの）カラムによるＶａｌ
−１５−Ｌｅｕ−１７−Ｇｌｕ−５２−アプロチニンの
精製を示す、プールの分画は棒によって示されている。 ｆｊＳ１６図は、Ｖａｌ−１５−Ｌｅｕ−１７−Ｇｌｕ
−５２−およびＶａｌ−１５−Ｌｅｕ−１７−Ｇ　Ｉ　
ｕ−３９−Ｇ　１　ｕ−５２−アブロチニンノＨＰＬＣ
−クロマトグラフィーを示す。 上のグラフにおいて、３ナノモルのＶａｌ−１５−Ｌｅ
　ｕ　−１７−Ｇ　ｌ　ｕ−５２−アプロチニンをペイ
カーポンド（Ｂａｋｅ　ｒｂｏ　ｎｄ）ＲＰ−１８−幅
の孔カラム（２５０Ｘ４．６ｍｍ）のクロマトグラフィ
ーにかけた０条件：流速０．７ｍ１／分；検出　２１０
ｎｍ；炉温度４０℃；溶液Ａ　　Ｏ，１％のＴＦＡ、溶
液Ｂ　　０．１％のＴＦＡ／６０％のＡＣＮ；勾配：０
分　０％のＢ、　　１０分０％の結合、７０分　１００
％のＢ、８０分０％のＢ：検出２１０　ｎ　ｒｎａ 下のグラフにおいて、４ナノモルのＶａｌ−１５−Ｌｅ
ｕ−１７−Ｇｌｕ−３９−Ｇｌｕ−５２−アプロチニン
をペイカーポンド（Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ）ＲＰ−１８−
輻の孔カラム（２５０Ｘ４．６ｍｍ）のクロマトグラフ
ィーにかけた０条件：流速０．７ｍｌ／分：検出　２１
０ｎｍ；炉温度４０℃；溶液Ａ　　Ｏ，１％のＴＦＡ、
溶液ＢＯ，１％のＴＦＡ／６０％のＡＣＮ；勾配二〇分
　０％のＢ、１０分θ％の結合、７０分ｉｏｏ％（７）
Ｂ、８０分　０％のＢ；検出２１０ｎｍ。 第１８図は、モノ（Ｍｏｎｏ　　Ｓ・）カラムによるＶ
ａ　ｌ−１５−Ｌｅｕ−１７−アプロチニンのクロマト
グラフィーを示す、詳細は実施例８に記載されている。 第１９図は、Ｖａｌ−１５−Ｇｌｕ−５２−およびＶａ
ｌ−１５−Ｌｅｕ−１７−Ｇｌｕ−５２−アプロチニン
の量を増加することによるヒト白血球エラスターゼの阻
害を示す。 グラフにおいて、Ｖａｔ−１５−Ｇｌｕ−５２−アプロ
チニンは−−−０−−−で示し、モしてＶａ　ｌ−１５
−Ｌｅｕ−１７−Ｇｌｕ−５２−アプロチニンは・−・
×Φ・・で示されている。ヒト白血球エラスターゼのＣ
度は５．５Ｘ１０”モルである。 特許出願人　バイエル・アクチェンゲゼルシャフト 断斤 哨斤 ＡＡＴＴＣＡＴＧＣＧＴＣＣＧＧＡＣＴＴＣＴＧＣＣＴ
ＣＧＡＧＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＧＧＡＣＧＣＡＴＧＦＩ
Ｇ、　２ ＦＩＧ。 図面の浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、　４ 図面の浄暑（内容に変更なし） 図面の浄書（内容に変更なし） Ｈｉｎｃｌｌｌｌ　ＸｂａｌＳａｌｌ　　８ａｍＨｌφ
も ■ 古 （ＸｂａＩ　） （ＮｈｅＩ） ＦＩＧ、　１４ 図面の浄吉（内容に変更なし） Ｊ＼ 図面の浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ　＋５ 図面の浄書（内容に変更なし７ 今１！Ｊｆ）番号 ＦＩＧ、旧 図面の浄書（内容に変′！！！なし） 図面の浄さ（内容スニ変ｙ！なり。 Ｄ 阻害網 （ｎ９） ＦＩＧ、　１９ 手続補正書 （方式） ％式％ １、事件の表示 昭和６３年特許願第１！３５３２３号 ２、発明の名称 ４、代 理 人 〒１０７ ５、補正命令の日付 昭和６３年１１月２９日（発送口） ６６補正の対象 明細書の図面の簡単な説明の欄及び図面容に変更なし）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ウシ膵臓トリプシン阻害剤（アプロチニン、ＢＰＴ
   Ｉ）の配列を本質的に有し、位置１５、１６、１７、１
   ８、３４、３９および５２におけるアミノ酸の１または
   ２以上が天然に産出するアミノ酸によって置換されてお
   り、ただし ａ）１５位置においてアミノ酸Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ
   、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｐｈｅ、
   Ｓｅｒ、Ｔｒｐまたは Ｔｙｒのいずれかによって置換されているアプロチニン
   、 ｂ）ａ）に記載するような位置１５における置換に加え
   て、さらに位置５２においてアミノ酸Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、
   Ｖａｌ、Ｔｈｒまたは Ｓｅｒのいずれかによって置換されているアプロチニン
   、 ｃ）Ｎ−末端アミノ酸Ａｒｇ−１の前に追加のＭｅｔを
   有するａ）およびｂ）に記載するアプロチニン変異型、
   および ｄ）Ｖａｌ−１５−Ｓｅｒ−１６−Ｉｌｅ−１７−アプ
   ロチニン、 を除外することを特徴とするペプチド。