CN101815724B

CN101815724B - 用于将轭合至其的试剂递送至组织的抑肽酶样多肽

Info

Publication number: CN101815724B
Application number: CN200880100847.XA
Authority: CN
Inventors: 理查德·贝利沃; 米歇尔·德默勒; 克里斯蒂安·切; 安东尼·雷吉纳
Original assignee: Angiochem Inc
Current assignee: Angiochem Inc
Priority date: 2007-05-29
Filing date: 2008-05-29
Publication date: 2015-02-25
Anticipated expiration: 2028-05-29
Also published as: WO2008144919A1; AU2008255556A1; EP2164866A4; EP2164866B1; EP2164866A1; EP2789628A2; CN101815724A; CA2688344A1; CA2688344C; PL2164866T3; EP2789628A3; AU2008255556B2

Abstract

基于我们对有效转运至诸如肝、肺、肾、脾和肌肉的细胞的多肽(Angiopep-7)的鉴定，本发明提供了多肽、包括该多肽的轭合物、以及用于治疗与这些细胞类型相关疾病的方法。不同于本文中鉴定的其他抑肽酶相关多肽(包括Angiopep-3，Angiopep-4a，Angiopep-4b，Angiopep-5以及Angiopep-6)，其有效地跨过血脑屏障(BBB)，Angiopep-7未被有效地转运跨过BBB。

Description

用于将轭合至其的试剂递送至组织的抑肽酶样多肽

技术领域

本发明涉及药物递送领域的改进。更具体地，本发明涉及多肽、包含本发明的多肽的轭合物及药物组合物，以及它们用于将试剂(例如治疗剂)转运入特定细胞类型如肝、肺或肾内的用途。

背景技术

肝的疾病，包括肝炎(例如病毒性肝炎)和肝的癌症(例如肝癌)，以及肺病，如肺癌(例如，小细胞和非小细胞肺癌)是严重的健康问题。许多用于这样的疾病的治疗剂具有不期望的副作用(例如化疗剂)，或者由于诸如体内稳定性、转运或其他药物动力学性能等原因，难以在靶组织中提供足够高的浓度或者足够长的持续时间，以在靶组织中达到最大疗效。

因此，仍然需要可增加靶器官或组织中治疗剂和诊断剂浓度的方法和组合物。

发明内容

我们已经发现，本文描述的多肽(例如Angiopep-7；SEQ IDNO：112)可有效地转运入特定细胞类型(例如肝、肺、脾、肾和肌肉)中，但未被有效地转运跨过血脑屏障(BBB)。当轭合于一种试剂时，该多肽作为载体起作用，能够增加细胞中所轭合试剂的浓度。我们还鉴定了Angiopep-3、Angiopep-4a、Angiopep-4b、Angiopep-5和Angiopep-6(SEQ ID NO：107-111)可作为有效转运跨过BBB的载体，还可转运入特定细胞类型中。因此，本发明的特征在于多肽、包括该多肽作为载体的轭合物以及利用这样的多肽和轭合物来诊断和治疗疾病(例如癌症)的方法。

因此，在第一个方面，本发明特征在于一种多肽，包括具有下式的氨基酸序列：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19

其中，X1-X19中每一个(例如X1-X6，X8，X9，X11-X14和X16-X19)独立地是任意氨基酸(例如天然氨基酸，如Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，GIu，Gly，His，He，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val)或者缺省，并且X1、X10和X15中至少一个是精氨酸。在一些实施方式中，X7是Ser或Cys；或X10和X15各自独立地是Arg或Lys。在一些实施方式中，X1至X19(含X1和X19)残基与SEQ ID NO：1-105和107-112中任一个的氨基酸序列中的任一个(例如，Angiopep-1，Angiopep-2，Angiopep-3，Angiopep-4a，Angiopep-4b，Angiopep-5，Angiopep-6和Angiopep-7)基本上相同。在一些实施方式中，氨基酸X1-X19中的至少一个(例如2，3，4或5个)是Arg(例如，X1、X10和X15中的任一个、两个或三个)。

在其他实施方式中，本发明特征在于一种多肽，包括与SEQ IDNO：1-105和107-112中任一个基本相同的氨基酸序列(例如，Angiopep-1，Angiopep-2，Angiopep-3，Angiopep-4a，Angiopep-4b，Angiopep-5，Angiopep-6和Angiopep-7)。在某些实施方式中，多肽可以包括或者可以是Angiopep-3、Angiopep-4a、Angiopep-4b、Angiopep-5、Angiopep-6或Angiopep-7(SEQ ID NO：107-112)，可以包括与Angiopep-7序列或其片段(例如功能性片段)大致相同的序列。该多肽可以具有长度为10至50个氨基酸，例如10-30个氨基酸的氨基酸序列。本发明的特征还在于这些多肽的功能性衍生物(例如化学衍生物或变异体)。

本发明的示例性多肽在位置10(相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列)具有赖氨酸或精氨酸，或者在位置15(相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列)具有赖氨酸或精氨酸，或者在位置10和位置15都具有赖氨酸或精氨酸。本发明的多肽还在位置7(相对于SEQ IDNO：1的氨基酸序列)具有丝氨酸或半胱氨酸。在需要进行多肽多聚化反应的情况下，多肽可以包括半胱氨酸(例如在位置7)。

在某些实施方式中，可对本发明的多肽(例如本文中披露的任何多肽)进行修饰(例如，如本文所描述的)。多肽可被酰胺化、乙酰化或者既酰胺化又乙酰化。例如，包括Angiopep-6或Angiopep-7的多肽可酰胺化，或SEQ ID NO：67可酰胺化(多肽No.67)。在另一实例中，SEQ ID NO：107-112中任一个的氨基酸或本发明的任何其他多肽均可酰胺化或乙酰化。可在所述多肽的氨基或羧基末端对本发明多肽进行这些修饰。本发明的特征还在于本文所述多肽中任一种的拟肽(例如本文中描述的那些)。本发明的多肽可以为多聚体形式。例如，多肽可以为二聚体形式(例如通过半胱氨酸残基的二硫键键接形成)。

本发明的多肽可被有效地转运入特定细胞(例如肝、肾、肺、肌肉或脾细胞)中，或者可有效跨过BBB(例如Angiopep-3、Angiopep-4a、Angiopep-4b、Angiopep-5和Angiopep-6)。在一些实施方式中，多肽有效转运入特定细胞(例如肝、肾、肺、肌肉或脾细胞)中而未被有效地转运跨过BBB(例如Angiopep-7)。多肽可以有效转运入至少一种选自由肝、肾、肺、肌肉或脾组成的组的细胞或组织中(例如至少2、3、4或5种)中。

对于本发明所述多肽和轭合物中的任一种，氨基酸序列可以特别地不包括(排除)包含SEQ ID NO：1-105和107-112中任一个(例如SEQ ID NO：1-96，Angiopep-1，Angiopep-2，Angiopep-3，Angiopep-4a，Angiopep-4b，Angiopep-5，Angiopep-6和Angiopep-7中的任一个)或由其组成的多肽。在一些实施方式中，本发明的多肽和轭合物不包括SEQ ID NO：102、103、104和105的多肽。在其他实施方式中，本发明的多肽和轭合物包括这些多肽。

在某些实施方式中，本发明的多肽可以具有本文描述的氨基酸序列，包含至少一个氨基酸取代(例如2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12个取代)。在某些实施方式中，多肽可以在对应于SEQ ID NO：1，Angiopep-1，Angiopep-2，Angiopep-3，Angiopep-4a，Angiopep-4b，Angiopep-5，Angiopep-6和Angiopep-7中任一个的氨基酸序列的位置1、10和15中的1个、2个或3个位置处具有精氨酸。例如，多肽可以包含1-12个氨基酸取代(例如SEQ ID NO：91)。例如，氨基酸序列可以包含1-10个(例如9，8，7，6，5，4，3，2个)氨基酸取代或1-5个氨基酸取代。依照本发明，氨基酸取代可以是保守性或非保守性氨基酸取代。

本发明的多肽可以化学合成(例如固相合成)或者可以通过重组DNA技术生成，如本领域中已知的。本文描述的多肽、组合物或轭合物中的任一种可以是分离形式或基本上纯化的形式。

在另一方面，本发明的特征在于一种编码本发明多肽(例如本文描述的任一种多肽，如Angiopep-3，Angiopep-4a，Angiopep-4b，Angiopep-5，Angiopep-6和Angiopep-7)的多核苷酸序列。更具体地，编码选自由SEQ ID NO：1-97和SEQ ID NO：107-112中任一个组成的组中多肽的核苷酸序列(脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其衍生物)也被本发明涵盖。期望的核苷酸序列可以通过本领域中已知的方法化学合成。

在另一个方面，本发明的特征在于一种轭合物，其包括选自由本文描述的多肽、类似物或其衍生物中任一种(例如Angiopep-3，Angiopep-4a，Angiopep-4b，Angiopep-5，Angiopep-6和Angiopep-7)组成的组中的载体以及一种试剂，其中该试剂轭合于所述载体。

该试剂可以选自由治疗剂(例如小分子药物，如抗癌剂、抗生素或本文描述的任何药剂)、可检测标记、多肽(例如酶)和蛋白复合物组成的组。在一些实施方式中，该试剂具有约160000Da的最大分子量。该试剂在中枢神经系统中可以是分子活性的。该试剂可以是对于治疗或检测神经学疾病、肝病、肺病、肾病或脾脏病有用的任何试剂。可检测标记可以例如是放射成像剂(例如同位素)、荧光标记(例如罗丹明、FITC、cy5.5、alexa)、报告分子(例如生物素)。可检测标记的其他实例包括绿色荧光蛋白、histag蛋白(组氨酸标记蛋白，histag protein)和β-半乳糖苷酶。轭合物可以是一种基本上由所述载体和一种蛋白构成的融合蛋白。可以轭合至本发明载体的蛋白基化合物的实例包括抗体(例如包括重链和/或轻链)、抗体片段(例如，抗体结合片段如Fv片段，F(ab)2，F(ab)2′和Fab)。可以轭合至该载体的抗体或其片段包括单克隆或多克隆抗体，并且进一步地可以是任何起源(例如，人类、嵌合和人源化抗体)。其他蛋白或蛋白基化合物包括细胞毒素(例如单甲基奥里司汀E)(auristatin E)(MMAE)，细菌内毒素和外毒素，白喉毒素，肉毒杆菌毒素、破伤风毒素，百日咳杆菌毒素、金黄色葡萄球菌肠毒素(staphylococcus enterotoxin)、毒素休克综合征毒素TSST-1，腺苷酸环化酶毒素和霍乱肠毒素)以及抗血管生成化合物(肉皮他汀(endostatin)、儿茶素、nutriceuticals(类药剂营养品)，趋化因子IP-10、基质金属蛋白酶的抑制剂(MMPI)、anastellin、玻联蛋白(vironectin)、抗凝血酶、胰蛋白激酶抑制剂、VEGF抑制剂、针对受体的抗体、赫赛汀、贝伐单抗(avastin)和帕尼单抗(panitumumab))。

可以使用瘦素exendin-4、GLP-I、PYY或PYY(3-36)，例如用于治疗肥胖症。可以包括在本发明的轭合物中的其他多肽是促肾上腺皮质激素(ACTH，促皮质素)、生长激素肽(例如，人胎盘促乳素(hPL)、生长激素和催乳激素(Prl))、促黑色素细胞激素(MSH)、氧毒素(催产素，oxytocin)、血管加压素(ADH)、促肾上腺皮质释放因子(CRF)、促性腺激素释放激素相关肽(GAP)、生长激素释放因子(GRF)、黄体生成素释放激素(LH-RH)、开胃素、促乳素释放肽、生长抑素、促甲状腺激素释放激素(THR)、降钙素(CT)、降钙素前体肽、降钙素基因相关肽(CGRP)、甲状旁腺素(PTH)、甲状旁腺素相关蛋白(PTHrP)、糊精、胰高血糖素、胰岛素和胰岛素样肽、神经肽Y、胰多肽(PP)、肽YY、促生长素抑制素、胆囊收缩素(CCK)、促胃液素释放肽(GRP)、胃泌激素、胃泌激素抑制肽、促胃动素、分泌素、舒血管肠肽(VIP)、促尿钠排泄肽(例如，心房利钠肽(ANP)、B型促尿钠排泄肽(BNP)、脑促尿钠排泄肽和C型促尿钠排泄肽(CNP))、速激肽(例如神经激肽A、神经激肽B和P物质)、P物质、血管紧张素(例如血管紧张素I和血管紧张素II)、肾活素、内皮缩血管肽(例如内皮缩血管肽-1、内皮缩血管肽-2、内皮缩血管肽-3、sarafotoxin(一种蛇毒)和蝎毒素)、sarafotoxin肽、吗啡样肽(例如酪啡肽、皮啡肽、内啡肽、脑啡肽、新皮啡肽、强啡肽)、胸腺肽(例如促胸腺生成素、胸腺刺激素、胸腺五肽、胸腺素、胸腺体液因子(THF)、肾上腺髓质素肽(AM)、咽侧体抑制素肽、β淀粉样-蛋白片段(Aβ片段)、抗菌肽(例如防御素、杀菌素、buforin和滑爪蟾素(magainin))、抗氧化肽(例如自然杀伤细胞增强因子B(NKEF-B)、铃蟾肽、骨Gla蛋白肽(例如骨钙素(骨Gla-蛋白或BGP)、CART肽、细胞粘附肽、皮质抑素肽、纤连蛋白片段和纤维蛋白相关肽、FMRF肽、促生长激素神经肽、鸟苷蛋白和尿鸟苷素，以及抑制素肽。

小分子药物包括抗癌剂(例如本文中描述的任何这种药剂)。抗癌剂的实例包括紫杉醇(紫杉酚)、长春碱、长春新碱、依托泊苷(etoposide)、多柔比星、环磷酰胺、秦素帝(taxotere)、美法仑、苯丁酸氮芥以及本文描述的任何抗癌剂，或其任意组合。抗癌剂可以具有允许轭合至本发明载体的化学部分。

在某些实施方式中，本发明的轭合物可以包括化学式V_x-L_y-A_z或其药用盐，其中V是本文描述的多肽或其衍生物(例如Angiopep-3、Angiopep-4a、Angiopep-4b、Angiopep-5、Angiopep-6、Angiopep-7，或本文描述的任何类似物、衍生物或片段)。V可以有效地转运入特定细胞类型(例如肝、肺、肾、脾、或肌肉细胞)或可以有效地转运跨过BBB(例如，在附着至L_y-A_z之后)。在某些实施方式中，载体或轭合物未被有效地转运跨过BBB，但被有效地转运入特定细胞类型中(例如Angiopep-7)。L是连接物或键(例如化学或共价键)。A是一种试剂，如选自由治疗剂(例如小分子药物)、可检测标签、蛋白质、或蛋白基化合物(例如抗体、抗体片段)、抗生素、抗癌剂、抗血管生成化合物和多肽或者在中枢神经系统水平有活性的任何分子组成的组。

X、Y和Z可以各自独立地是大于0的任何数(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10)，或者可以表示在1(例如2，3，4，5，6，7，8，9)和10(例如9，8，7，6，5，4，3，2)之间的数值范围。因此，化学式V_x-L_y-A_z不限于特定顺序或特定比值；例如，该轭合物可以包括1～5(1，2，3，4或5)个偶接于该试剂的载体。在其他实施方式中，可将多于一种试剂轭合至载体。试剂或轭合物在该试剂轭合至载体时可以是有活性的。在一些实施方式中，该化合物可以从载体释放，例如在转运跨过BBB或转运入特定细胞类型之后。该化合物可以在其释放后(例如作为前药)变为有活性的。在一些实施方式中，该试剂在转运后保持轭合于载体。这里，相比于未轭合的试剂，轭合物可以表现为外排转运减少(例如通过P-糖蛋白)。在这种情况下，可能期望该试剂和载体保持结合。轭合物可以在药用组合物中提供。

相比于未轭合至载体的试剂，当轭合至载体时，试剂可以表现为生物可利用度改良(例如提高)、效力(例如抗癌活性)增强、试剂的组织分布改变、毒性降低、或药物动力学改变。载体(例如Angiopep-3、Angiopep-4a、Angiopep-4b、Angiopep-5和Angiopep-6)可以促进该试剂在个体的脑中(例如，包含肿瘤细胞如成胶质细胞瘤，肺、乳房、结肠、肝、胰腺或脾肿瘤细胞)或在特定细胞或组织(例如肝、肺、肾、脾和肌肉)中的积累(积累)。载体如Angiopep-7可以能够促进在细胞类型如肝、肺、肾、脾或肌肉中的积累，但不促进在大脑中积累。更具体地，当提供(例如给予)至一个患者时，载体可以增加是P-gp底物的试剂或通过P-gp或P-gp相关蛋白(例如P-gp人或哺乳动物等位基因变异体，例如来自啮齿动物的mdr 1a或mdr 1b亚型)外排的治疗剂的积累或效力。细胞可以表达或能够表达P-gp或P-gp相关蛋白。轭合物转运入其中的细胞可以表达载体受体或运载体，例如低密度脂蛋白相关受体(LRP)(例如共表达P-gp或P-gp相关蛋白的细胞)。细胞可以例如是正常细胞、肿瘤细胞、或转移细胞(例如多药耐药性癌细胞)。细胞或肿瘤可以是转移灶(例如本文所描述癌症中任何一种的转移灶)。

载体或轭合物可以有效地转运入特定细胞类型(例如，肝、肺、肾、脾或肌肉)中并且可以有效地转运跨过BBB；这样的轭合物包括Angiopep-3、Angiopep-4a、Angiopep-4b、Angiopep-5和Angiopep-6。在某些实施方式中，载体本身的转运活性不影响其递送入其中的细胞完整性或者不影响BBB完整性。在其他实施方式中，载体或轭合物如Angiopep-7可有效地转运入特定细胞类型中，但未被有效地转运跨过BBB。这里描述的任何载体或轭合物均可以通过受体介导的胞吞或胞转作用或者通过被吸附物介导的胞吞或胞转作用进行转运。

本文描述的任何载体或轭合物均可存在于药用载体中(例如可以以药剂的形式)。因此，本发明的特征在于一种药物组合物，包括(a)一种轭合物(例如本文描述的任何轭合物)；(b)药用载体(例如本文描述的任何药用载体)。该轭合物可以进一步包括(c)增溶剂。增溶剂可以例如是脂肪酸的聚氧乙烯酯(例如-15)。该药物组合物可以用于改变一种化合物的药物动力学，用于降低肿瘤细胞的生长或用于检测肿瘤细胞。

在另一方面，本发明的特征在于本发明的载体或轭合物用于诊断或治疗肝病、肺病、肾病、脾病或肌肉病的用途(例如，用于制造药剂或用于治疗)。在某些实施方式中，神经疾病或中枢神经系统疾病(例如本文描述的任何疾病)可以利用本发明所述有效转运跨过BBB的轭合物进行治疗。例如，所述载体或轭合物可以用于这些疾病中任何一种的体内检测。治疗或诊断可以在需要其的哺乳动物中进行(例如人或非人哺乳动物)，如具有或处于患该疾病(例如癌症)风险(例如风险增加)的哺乳动物。给药可以利用本领域已知的任何方式实施，例如动脉内、鼻内、腹膜内、静脉内、肌肉内、皮下、经皮或经口。可以以治疗有效量进行给药。

通过将一种试剂轭合至本文描述的载体，可以降低该试剂的毒性，从而允许该试剂以高于该试剂单用时的推荐剂量的剂量提供给对象(患者，subject)。因此，本发明的特征在于一种治疗患有疾病或病症(例如本文描述的任何疾病或病症如癌症)的对象的方法，包括将本发明的轭合物提供给该对象，其中所述轭合物包括一种试剂，其剂量高于(例如至少5％、10％、25％、50％、75％、100％、250％、500％、1,000％、5,000％或10,000％高于)该试剂单用时的治疗剂量。

由于本文描述的载体能够使一种试剂靶向于特定细胞类型(例如本文描述的那些)，所以在某些实施方式中，当轭合至一种载体时，该试剂在给予患者时可以具有更高的效力。因此，本发明的特征还在于一种通过给予患者一种轭合物或一种包括本发明轭合物的组合物而治疗患疾病或病症(例如本文描述的任何疾病或病症如癌症)患者的方法，其中该轭合物包括的试剂的剂量低于(例如5％、10％、15％、20％、30％、50％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.9％低于)该试剂单用时的治疗剂量。

本发明的治疗方法可以进一步包括一个评估个体的肿瘤是否包括多药耐药性肿瘤细胞(例如，表达P-gp(MDR1)或决定该肿瘤是否可能具有多药耐药性表型的细胞)的步骤。该治疗方法可以包括一个提供化学疗法、放射疗法或者二者的步骤。可替换地，受治疗的对象可以已接受(或将接受)这样的疗法(例如在1年、6个月、3个月、2个月、1个月、2周、1周、3天、2天或1天内)。该个体可以已进行手术。个体可以患有脑肿瘤(例如原发性脑肿瘤)或不同于脑的部位处的肿瘤(例如不患有脑肿瘤)。需要的个体可以存在对至少一种药物的耐药或处于形成耐药的危险(例如多药耐药性(MDR)表型)。肿瘤可以是肺肿瘤、脑肿瘤的颅外转移灶(例如从成胶质细胞瘤)、转移起源的脑肿瘤(例如，来自肺肿瘤、乳腺肿瘤、黑色素瘤、结直肠癌、或泌尿器官肿瘤)。肿瘤可以包括表达P-gp、LRP或者二者的细胞，或能够表达P-gp、LRP或者二者的细胞。P-gp和LRP均可定位于细胞表面。

在其他方面，本发明的特征还在于一种增加试剂在细胞中的浓度或增强试剂转运到细胞的方法，其中该细胞表达一种LRP受体家族的成员。该方法包括使该细胞接触一种轭合物，其中该轭合物包含一种轭合至载体(例如本文描述的任何多肽)的试剂，由此增加该试剂在细胞中的浓度，或将该试剂转运至细胞。本发明的特征还在于一种增加细胞中试剂浓度的方法，其中该细胞表达P-糖蛋白。该方法包括使细胞与轭合物接触，其中该轭合物包括轭合至载体(例如本文中描述的任何多肽)的试剂，由此增加细胞中该试剂的浓度(相比于未轭合的试剂)。

依照本发明的任一方面，神经疾病包括脑肿瘤、脑转移、精神分裂症、癫痫症、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿氏病、中风和BBB相关功能障碍(例如肥胖症)。肝病可以是癌症如肝癌。其他肝病包括本文描述的那些。肺病可以是肺癌(例如本文描述的那些)。

轭合物可以包括多聚体如二聚体形式的载体。在一些实施方式中，载体的多聚体形式可以增强试剂的转运或积累。载体也可以为至少1∶1(试剂∶载体)、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6或1∶10的比率。如本文指出的，较高的载体与试剂的比值可以导致转运增强。同样，每个试剂的载体数量不受限制。

同样，依照本发明，药物组合物可用于例如将一种试剂递送至个体的CNS。

载体(多肽)或轭合物的药用盐包括在本发明中并且可以包括该试剂的药用酸加成盐。

本发明的载体或轭合物可以与传统治疗方法或疗法联合使用或单独使用。与其他试剂的联合疗法可以包括依次或同时给予个体。本发明的药物组合物可以包括本发明的载体-试剂轭合物以及药用赋形剂(如本文描述的)与本领域中已知的另一种治疗剂或预防剂的组合。

“载体”是指能够被转运入特定细胞类型(例如肝、肺、肾、脾或肌肉)中或转运跨过BBB的一种化合物或分子如多肽。载体可以附着至(共价地或非共价地)或轭合至一种试剂，由此能够将该试剂转运入特定细胞类型中或转运跨过BBB。在某些实施方式中，载体可以结合至在癌细胞或脑内皮细胞上存在的受体，由此被转运入癌细胞中或通过胞转作用而转运跨过BBB。载体可以是可获得其高水平跨内皮转运的分子，同时不影响细胞或BBB完整性。载体可以是多肽或拟肽并且可以是天然的或通过化学合成或基因重组技术产生的。

“轭合物”是指连接于试剂的载体。轭合可以实质上是化学的，如经由连接物，或者实质上是遗传的，例如通过基因重组技术，如在具有例如报告分子(例如绿色荧光蛋白，β-半乳糖苷酶、Histag等)的融合蛋白中。

“有效地转运跨过BBB(或跨BBB转运)”的载体是指至少能够如Angiopep-6一样有效(即在本文描述的原位脑灌注测定中大于Angiopep-1的38.5％(250nM))跨过BBB的载体。因此，未被有效地转运跨过BBB的载体或轭合物以较低水平转运至大脑(例如低于Angiopep-6的转运效率)。

有效转运至特定细胞类型的载体或轭合物是指能够在该细胞类型中积累(例如由于向细胞内转运增加、从细胞外排减少，或其组合)，比对照物质至少高10％(例如25％，50％，100％，200％，500％，1,000％，5,000％或10,000％)，或者在轭合物的情况中，则是与未轭合试剂相比。

“基本上纯化的”或“分离的”是指已与其他化学组分分离的化合物(例如多肽或轭合物)。通常，当化合物按重量计是至少30％不含其他组分时，则该化合物是基本上纯化的。在某些实施方式中，制剂按重量计是至少50％、60％、75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％不含其他组分。纯化的多肽可以通过例如表达编码该多肽的重组多核苷酸或通过化学合成该多肽而获得。纯度可以通过任何恰当方法例如柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳或通过HPLC分析进行检测。

“类似物”是指起源于初始序列或起源于初始序列的一部分并且可以包括一个或多个修饰的多肽；例如，氨基酸序列中的一个或多个修饰(例如，氨基酸添加、缺失、插入或取代)、一个或多个氨基酸主链或侧链中的一个或多个修饰，或一个基团或另一个分子添加至一个或多个氨基酸(侧链或主链)中。类似物可以具有一个或多个氨基酸插入，在多肽的两端之一或两端或者多肽的氨基酸序列内。类似物可以与初始序列或初始序列的一部分具有序列相似性和/或序列同一性(例如可以是基本上相同的)。类似物可以包括其结构的修饰，例如如本文所述的。两个序列之间的相似度基于同一性(相同的氨基酸)百分比和保守性取代的百比数。类似物可以与初始序列具有至少35％、50％、60％、70％、80％、90％或95％(例如96％、97％、98％、99％和100％)的序列相似性，其中氨基酸的主链或侧链中存在一个或多个修饰的组合、或者一个基团或另一个分子的添加。预计与其他氨基酸类似(保守性氨基酸)的示例性氨基酸在本领域中是已知的，且包括例如表3中列出的那些氨基酸。

“基本上相同的”是指表现出与参考氨基酸或核酸序列至少35％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、85％、90％、95％或甚至99％同一性的多肽或核酸。对于多肽，比较序列的长度通常为至少4个(例如至少5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，25，50或100个)氨基酸。对于核酸，比较序列的长度将通常为至少60个核苷酸，优选至少90个核苷酸，并且较优选至少120个核苷酸，或全长。本文中应当理解，在与初始多肽的氨基酸相同或相似的类似物的氨基酸之间可以存在间隙(gap)。这些间隙可以不包括氨基酸、包括一个或多个与初始多肽相同或相似的氨基酸。因此也包括本发明载体(多肽)的生物学活性类似物。同一性百分比可以使用默认间隙重量(gap weight)，例如利用Wisconsin GeneticsSoftware Package Release 7.0中的n算法GAP、BESTFIT或FASTA确定。

“功能性衍生物”是指本发明的载体或试剂或轭合物及其盐的“化学衍生物”、“片段”或“变异体”生物学活性序列或部分。载体功能性衍生物可附着至或轭合至一种试剂并且进入特定细胞类型，由此将该试剂转运入该细胞中。

“化学衍生物”是指这样的本发明载体、试剂或轭合物，其包含非该载体、试剂或载体-试剂轭合物一部分的其他化学部分，包括共价修饰。化学衍生物可以利用本领域已知的方法通过直接化学合成进行制备。这样的修饰可以通过使靶向氨基酸残基与能够与所选侧链或末端残基反应的有机衍生试剂反应而引入到蛋白或肽载体、试剂、或载体-试剂轭合物中。载体化学衍生物能够跨过BBB，或者进入特定细胞类型(例如本文描述的那些)中或在其中积累。在一个优选实施方式中，在未影响BBB完整性的情况下获得极高水平的跨内皮转运而越过BBB。

“片段”是指起源于初始或亲本序列的一部分或者起源于所述亲本序列的类似物的多肽。片段包括具有一个或多个氨基酸截短的多肽，其中该截短可以起源于氨基末端(N-末端)、羧基末端(C-末端)、或者起源于蛋白质内部。片段可以包括与初始序列对应部分相同的序列。本发明涵盖本文描述的载体(多肽)的功能性片段。片段可以为至少5个(例如至少5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，25，28，30，35，40，45，50，60，75，100或150个)氨基酸。本发明的片段可以包括例如7、8、9或10个氨基至18个氨基酸的多肽。片段可以包含本文中描述的任何修饰(例如乙酰化、酰胺化、氨基酸取代)。

“非天然氨基酸”是指不是在哺乳动物中自然产生或存在的氨基酸。

“试剂”是指任何化合物，例如，抗体或治疗剂、标记物、示踪剂或成像化合物。

“治疗剂”是指具有生物学活性的试剂。在一些情况下，治疗剂用来治疗疾病、身体或精神病症、损伤、或感染的症状，并且包括抗癌剂、抗生素、抗血管发生剂以及在中枢神经系统水平具有活性的分子。

“小分子药物”是指具有1000g/mol或更低分子量的药物(例如低于800、600、500、400或200g/mol)。

“对象”是指人或非人动物(例如哺乳动物)。

“治疗”、“处理”等是指获得期望的药理学或生理学效果，例如癌细胞生长的抑制，癌细胞死亡，疾病或病症(例如本文描述任何疾病或病症)的减轻，或与疾病或病症相关的至少一种症状减轻。效果可以是预防性的，例如完全或部分地阻止疾病或其症状，或者依据对一种疾病和/或归属于该疾病的不良反应的部分或完全治愈而可以是治疗性的。治疗包括：(a)防止疾病或病症(例如防止癌症)在个体(例如，对该疾病易感但还未诊断为患有该疾病的个体)中发生；(b)抑制疾病(例如阻止其发展)；或(c)减轻疾病(例如减少与疾病相关的症状)。治疗包括给予个体任何治疗剂以治疗、治愈、减轻、改善、消除或抑制该个体的病症，包括但不限于将载体-试剂轭合物给予个体。

“癌症”是指其独特特性是丧失正常控制的任何细胞增生，其可以导致失控生长、缺乏分化、或入侵组织的能力并且转移。癌症可以在任何组织或任何器官中形成。癌症预计包括但不限于脑、肝、肺、肾或脾的癌症。本文中还描述了其他癌症。

在本发明的载体或轭合物的上下文中，“提供”是指使载体或轭合物在体内或体外与靶细胞或组织接触。载体或轭合物可以通过将该载体或轭合物给予对象而提供。

“给予”和“给药”是指一种递送模式，包括但不限于动脉内、鼻内、腹膜内、静脉内、肌内、皮下、经皮或经口。日剂量可以以合适形式分成1、2或更多个剂量以在整个时间期内1次、2次或更多次给予。

“治疗有效”或“有效量”是指足以改善、降低、阻止、延缓、抑制或阻滞所治疗疾病或病症的任何症状的治疗剂的量。试剂的治疗有效量不需要治愈疾病或病症，但将提供对疾病或病症的治疗以使该疾病或病症的发作被延缓、受阻或阻止，或者该疾病或病症症状减轻，或者疾病或病症的病程改变，或例如是个体中严重度较低或恢复加速。

“病症”是指任何引起个体的疼痛、不适、不健康、疾病或残废(精神或身体)的情形，包括神经疾病、损伤、感染或者慢性或急性疼痛。神经疾病包括脑肿瘤、脑转移、精神分裂、癫痫、阿尔茨海默病、帕金森氏病、亨廷顿氏病以及中风。

“药物组合物”是指治疗有效量的试剂以及药用稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂或佐剂，例如本文描述的那些药物组合物中的任一种。

“治疗剂量”是指参照其毒性或效力可接受用于临床的试剂(不含载体)如药物的剂量。通过将试剂与本发明载体进行轭合，可以有可能以高于或低于治疗积累剂量积累的剂量而给予一种试剂。

如果针对特定特性(例如温度、浓度、时间等)提及一“系列”或一“组物质”，则本发明涉及并且明确地在本文中并入每一个特定成员以及其中子范围或子组的组合。因此，例如，对于9～18个氨基酸长度应理解为在本文中具体并入每一个单个长度，例如18、17、15、10、9以及其间任何数值的长度。因此，除非具体提及，本文中提到的每一个范围应理解为包括端值。例如5～19个氨基酸长的表述应是包括5和19。这对于其他参数如序列、长度、浓度、元件等同样适用。

本文定义的序列、区域、部分各自均包括所描述的每一个单个序列、区域和部分以及每一个可能的子序列、子区域和子部分，不管这样的子序列、子区域和子部分是否明确限定为包括特定的可能性、排除特定的可能性或其组合。例如，对于区域的排除性限定可以理解如下：“假定所述多肽不短于4、5、6、7、8或9个氨基酸”。负面列举式限制条件的进一步实例如下：包括SEQ ID NO：X的序列，其中不包括SEQ ID NO：Y的多肽等。负面列举式限制条件的另一个实例如下：假定所述多肽不是(不包括或不由其构成)SEQ IDNO：Z。

附图说明

图1举例说明了本发明示例性多肽的结构。

图2举例说明了利用交联剂BS³，用来轭合抑肽酶与IgG的方案。

图3举例说明了利用交联剂硫代-EMCS，用来轭合抑肽酶与IgG的方案。

图4举例说明了利用交联剂ECMS，用来轭合Angiopep-2与抗体的方案。

图5举例说明了利用交联剂SATA，用来轭合Angiopep-2与抗体的方案。

图6举例说明了经由酰肼，利用烃靶(carbohydrate target)，用来轭合Angiopep-2与抗体的方案。

图7举例说明了可用于制备轭合物的其他可能性连接物。

图8举例说明了一种用于将本发明的载体附着至紫杉酚(paclitaxel)的方法。

图9是在细胞表面处的排出泵(efflux pump)、P-糖蛋白(P-gp或MDR1)示意图。与多药耐药性相关的排出泵、P-gp或MDR1在多种癌细胞和各种组织包括血脑屏障(BBB)的细胞表面上高度表达。

图10A和10B图示了紫杉醇和TxlAn1轭合物的组织分布。

图11图示了紫杉醇和TxlAn1的肺分布。

图12图示了血浆和肺中的TxlAn1轭合物水平。

图13是一组照片，示出了在IV注射之后30分钟，大鼠脑内Angiopep-2和Angiopep-7的体内积累。相比于Angiopep-7，Angiopep-2在脑中积累的程度较大。

图14是一组照片，示出了在原位灌注荧光标记的Angiopep-2或Angiopep-7之后10min脑切片的荧光显微镜图像。这些照片表明，Angiopep-2定位于脑内，而Angiopep-7定位于毛细血管内。

图15A是一组照片，示出了Angiopep-2和Angiopep-7在大鼠的肝、肺和肾中的体内成像。观察到Angiopep-7在这些组织中积累的积累。

图15B是一个曲线图，示出了在大鼠中注射Angiopep-2或Angiopep-7之后24小时的离体器官成像。两种多肽均在肾、肝和肺中积累。相比于Angiopep-7，Angiopep-2在脑中积累的程度较大。

图16举例说明了游离和Angiopep轭合的IgG在脑薄壁组织中的分布体积。

图17是在亲本药物紫杉醇存在下细胞增生的曲线图。将胶质母细胞瘤细胞(U-87)暴露于各种浓度的紫杉醇达3天。将掺入细胞中的³H-胸腺嘧啶作为紫杉醇浓度的函数作图。

图18A和18B是表示TxlAn2治疗对皮下胶质母细胞瘤(U-87)肿瘤生长的作用的曲线图。

图19是一组显微照片，示出了在暴露于紫杉醇或TxlAn2轭合物的癌细胞中通过免疫荧光或可见光，在NCI-H460细胞中检测β-微管蛋白。作为对照，细胞暴露于1％DMSO。

图20是一组曲线，示出了通过FACS检测紫杉醇和TxlAn2轭合物对NCI-H460细胞周期的影响。细胞暴露于媒剂(DMSO)、紫杉醇(100nM)或TxlAn2轭合物(30nM，相当于100nM的紫杉醇)达24h。

图21A是柱状图，示出了在存在或不存在(对照)10μM CsA、P-gp抑制剂的情况下，各种药物在用MDR1转染的MDCK细胞中的积累。实验在1％DMSO存在下进行。

图21B是柱状图，示出了轭合物在过表达P-gp的细胞中的积累。

图22A和22B是蛋白质印迹的照片，示出了LRP在人脑肿瘤活组织检查中的免疫检测。

图23A和23B是药物与本发明载体轭合的示意图。

图24是层析图，举例说明了TxlAn2(3∶1)轭合物的生成。

图25是对利用AKTA-探测仪在疏水性柱子上纯化的峰进行HPLC分析。

图26举例说明了Angiopep-2与IgG轻链和重链的缔合。

图27举例说明了用硫代-EMCS交联的IgG-Angiopep-2轭合物的脑分布体积增加。

图28举例说明了利用原位脑灌注进行IgG-Angiopep-2轭合物的脑渗透。

图29举例说明了放射标记的[¹²⁵I]-IgG-Angiopep轭合物的放射自显影图。

图30举例说明了通过FACS分析，利用抗-EGFR和抗-EGFR-Angiopep-2轭合物在U87细胞上开展EGFR的类似检测。

图31举例说明了游离和Angiopep-2轭合的EGFR抗体在脑薄壁组织中的分布体积。

图32举例说明了游离和Angiopep-2轭合的VEFG抗体在脑薄壁组织中的分布体积。

图33举例说明了包含不同载体与试剂(抗体)比值的轭合物在薄壁组织中的摄取。

具体实施方式

我们已经发现，Angiopep-7可以有效地转运入特定细胞类型或器官如肝、肺、肾、脾和肌肉中，但相对于多肽如Angiopep-1或Angiopep-2，未被有效地转运跨过血脑屏障(BBB)。基于此，我们已经将Angiopep-7鉴定为一种适于转运试剂的载体(例如，用于治疗与这些组织相关的疾病，如癌症或本文描述的任一种疾病)。我们还鉴定了其他多肽，包括Angiopep-3、Angiopep-4a、Angiopep-4b、Angiopep-5和Angiopep-6，它们也可以用作本发明的载体。这些多肽可以保持被有效地转运跨过BBB或转运入特定组织或细胞类型(例如肝、肺、肾、脾和肌肉)中的能力。对于这些多肽，没有或未被有效地转运跨过BBB的试剂当轭合至该多肽时即可转运跨过BBB。轭合物可以为组合物的形式，如药物组合物，用于治疗或诊断一种病症或疾病。

相比于单独的试剂，本发明的轭合物(例如本文所述那些轭合物中的任一种)也可以具有有利的体内药物动力学性能。这些性能可以包括体内半衰期增加或在期望细胞类型中的浓度增加、积累速率增加或外排减少。基于此，可以有可能地将本发明的轭合物以比未轭合试剂更低的剂量、更低的频率或更短的持续时间给予对象。更低的给药量、频率或持续时间对于具有已知副作用的治疗来说是特别期望的。在其他情况下，试剂与本文描述的多肽轭合可以产生更高的效力，因为靶细胞或组织中浓度增加。事实上，通过将试剂集中在靶细胞类型中，可以减少不希望的副作用(例如具有增大的效力)。这可以降低治疗所需的持续时间。在一些情况下，相对于未轭合试剂，甚至有可能以增加的剂量、频率和持续时间给予该轭合物，并且观察到效力增加、副作用减少或者二者。

本发明的多肽

本发明的特征在于本文所述多肽中的任何一种，例如，表1中所述多肽的任何一种(例如在SEQ ID NO：1-105和107-112任一个如SEQ ID NO：1-97、99、100、101或107-112中定义的多肽)、或其任何片段、类似物、衍生物或变异体。在某些实施方式中，多肽与本文描述的多肽具有至少35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或甚至100％的同一性。相对于本文描述的序列之一，多肽可以具有一个或多个(例如2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，或15个)取代。下文将更为详细地阐述其他修饰。

本发明的特征还在于这些多肽的片段(例如功能片段)。在某些实施方式中，这些片段能够进入或积累在特定细胞类型(例如肝、肺、肾、脾或肌肉)中或能够跨过BBB。多肽的截短可以是从该多肽的N-末端、多肽的C-末端或它们的组合的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或更多个氨基酸。其他片段包括其中多肽的内部部分缺失的序列。

其他多肽可以通过利用美国专利申请公开No.2006/0189515(将其结合于此供参考)中描述的测定或方法之一或者通过本领域已知的任何方法进行鉴定。例如，候选载体可以通过常规多肽合成而生成、与紫杉醇轭合以及给予实验室动物。生物学活性载体可以例如基于其增大注射肿瘤细胞并用该轭合物处理的动物的存活率的效力进行鉴定(相比于未用轭合物处理(例如用未轭合试剂处理)的对照)。

在另一实施例中，生物学活性多肽可以基于原位脑灌注测定中其在薄壁组织中的定位进行鉴定。体外BBB测定，如由CELLIAL^TMTechnologies开发的模型可以用来鉴定这样的载体。

还可开展确定其他组织中积累的测定。参见例如本文中的实施例1。多肽的标记轭合物可以给予动物，并且可以检测不同器官中的积累。例如，轭合至可检测标签(例如近-IR荧光光谱标签如Cy5.5)的多肽允许在体内实时可视化。这样的多肽可以给予动物，并且可检测该多肽在器官中的存在情况，因而允许确定该多肽在期望器官中积累的速率和量。在其他实施方式中，多肽可以用放射活性同位素(例如¹²⁵I)进行标记。然后将该多肽给予动物。一段时间之后，处死动物，并提取动物的器官，随后利用本领域已知的任何方法检测每个器官中放射同位素的量。通过比较特定器官中标记候选多肽的量与标记对照的量，可以确定候选多肽的能力、候选多肽在特定组织中积累的速率或量。恰当的阴性对照包括已知不可转运入特定细胞类型中的任何多肽。

表1

SEQ ID NO：

1 T F V Y G G C R A K R N N F K S A E D

2 T F Q Y G G C M G N G N N F V T E K E

3 P F F Y G G C G G N R N N F D T E E Y

4 S F Y Y G G C L G N K N N Y L R E E E

5 T F F Y G G C R A K R N N F K R A K Y

6 T F F Y G G C R G K R N N F K R A K Y

7 T F F Y G G C R A K K N N Y K R A K Y

8 T F F Y G G C R G K K N N F K R A K Y

9 T F Q Y G G C R A K R N N F K R A K Y

10 T F Q Y G G C R G K K N N F K R A K Y

11 T F F Y G G C L G K R N N F K R A K Y

12 T F F Y G G S L G K R N N F K R A K Y

13 P F F Y G G C G G K K N N F K R A K Y

14 T F F Y G G C R G K G N N Y K R A K Y

15 P F F Y G G C R G K R N N F L R A K Y

16 T F F Y G G C R G K R N N F K R E K Y

17 P F F Y G G C R A K K N N F K R A K E

18 T F F Y G G C R G K R N N F K R A K D

19 T F F Y G G C R A K R N N F D R A K Y

20 T F F Y G G C R G K K N N F K R A E Y

21 P F F Y G G C G A N R N N F K R A K Y

22 T F F Y G G C G G K K N N F K T A K Y

23 T F F Y G G C R G N R N N F L R A K Y

24 T F F Y G G C R G N R N N F K T A K Y

25 T F F Y G G S R G N R N N F K T A K Y

26 T F F Y G G C L G N G N N F K R A K Y

27 T F F Y G G C L G N R N N F L R A K Y

28 T F F Y G G C L G N R N N F K T A K Y

29 T F F Y G G C R G N G N N F K S A K Y

30 T F F Y G G C R G K K N N F D R E K Y

31 T F F Y G G C R G K R N N F L R E K E

32 T F F Y G G C R G K G N N F D R A K Y

33 T F F Y G G S R G K G N N F D R A K Y

34 T F F Y G G C R G N G N N F V T A K Y

35 P F F Y G G C G G K G N N Y V T A K Y

36 T F F Y G G C L G K G N N F L T A K Y

37 S F F Y G G C L G N K N N F L T A K Y

38 T F F Y G G C G G N K N N F V R E K Y

39 T F F Y G G C M G N K N N F V R E K Y

40 T F F Y G G S M G N K N N F V R E K Y

41 P F F Y G G C L G N R N N Y V R E K Y

42 T F F Y G G C L G N R N N F V R E K Y

43 T F F Y G G C L G N K N N Y V R E K Y

44 T F F Y G G C G G N G N N F L T A K Y

45 T F F Y G G C R G N R N N F L T A E Y

46 T F F Y G G C R G N G N N F K S A E Y

47 P F F Y G G C L G N K N N F K T A E Y

48 T F F Y G G C R G N R N N F K T E E Y

49 T F F Y G G C R G K R N N F K T E E D

50 P F F Y G G C G G N G N N F V R E K Y

51 S F F Y G G C M G N G N N F V R E K Y

52 P F F Y G G C G G N G N N F L R E K Y

53 T F F Y G G C L G N G N N F V R E K Y

54 S F F Y G G C L G N G N N Y L R E K Y

55 T F F Y G G S L G N G N N F V R E K Y

56 T F F Y G G C R G N G N N F V T A E Y

57 T F F Y G G C L G K G N N F V S A E Y

58 T F F Y G G C L G N R N N F D R A E Y

59 T F F Y G G C L G N R N N F L R E E Y

60 T F F Y G G C L G N K N N Y L R E E Y

61 P F F Y G G C G G N R N N Y L R E E Y

62 P F F Y G G S G G N R N N Y L R E E Y

63 M R P D F C L E P P Y T G P C V A R I

64 A R I I R Y F Y N A K A G L C Q T F V Y G

65 Y G G C R A K R N N Y K S A E D C M R T C G

66 P D F C L E P P Y T G P C V A R I I R Y F Y

67 T F F Y G G C R G K R N N F K T E E Y

68 K F F Y G G C R G K R N N F K T E E Y

69 T F Y Y G G C R G K R N N Y K T E E Y

70 T F F Y G G S R G K R N N F K T E E Y

71 C T F F Y G C C R G K R N N F K T E E Y

72 T F F Y G G C R G K R N N F K T E E Y C

73 C T F F Y G S C R G K R N N F K T E E Y

74 T F F Y G G S R G K R N N F K T E E Y C

75 P F F Y G G C R G K R N N F K T E E Y

76 T F F Y G G C R G K R N N F K T K E Y

77 T F F Y G G K R G K R N N F K T E E Y

78 T F F Y G G C R G K R N N F K T K R Y

79 T F F Y G G K R G K R N N F K T A E Y

80 T F F Y G G K R G K R N N F K T A G Y

81 T F F Y G G K R G K R N N F K R E K Y

82 T F F Y G G K R G K R N N F K R A K Y

83 T F F Y G G C L G N R N N F K T E E Y

84 T F F Y G C G R G K R N N F K T E E Y

85 T F F Y G G R C G K R N N F K T E E Y

86 T F F Y G G C L G N G N N F D T E E E

87 T F Q Y G G C R G K R N N F K T E E Y

88 Y N K E F G T F N T K G C E R G Y R F

89 R F K Y G G C L G N M N N F E T L E E

90 R F K Y G G C L G N K N N F L R L K Y

91 R F K Y G G C L G N K N N Y L R L K Y

92 K T K R K R K K Q R V K I A Y E E I F K N Y

93 K T K R K R K K Q R V K I A Y

94 R G G R L S Y S R R F S T S T G R

95 R R L S Y S R R R F

96 R Q I K I W F Q N R R M K W K K

97 T F F Y G G S R G K R N N F K T E E Y

98 M R P D F C L E P P Y T G P C V A R I

I R Y F Y N A K A G L C Q T F V Y G G

C R A K R N N F K S A E D C M R T C G G A

99 T F F Y G G C R G K R N N F K T K E Y

100 R F K Y G G C L G N K N N Y L R L K Y

101 T F FY G G C R A K R N N F K R A K Y

102 N A K A G L C Q T F V Y G G C L A K R N N F

E S A E D C M R T C G G A

103 Y G G C R A K R N N F K S A E D C M R T C G G A

104 G L C Q T F V Y G G C R A K R N N F K S A

105 L C Q T F V Y G G C E A K R N N F K S A

107 T F F Y G G S R G K R N N F K T E E Y

108 R F F Y G G S R G K R N N F K T E E Y

109 R F F Y G G S R G K R N N F K T E E Y

110 R F F Y G G S R G K R N N F R T E E Y

111 T F F Y G G S R G K R N N F R T E E Y

112 T F F Y G G S R G R R N N F R T E E Y

第5号肽包括SEQ ID NO：5的序列并且在其C-末端被酰胺化(参见例如图1)；

第67号肽包括SEQ ID NO：67的序列并且在其C-末端被酰胺化(参见例如图1)；

第76号肽包括SEQ ID NO：76的序列并且在其C-末端被酰胺化(参见例如图1)；

第91号肽包括SEQ ID NO：91的序列并且在其C-末端被酰胺化(参见例如图1)；

第107号肽包括SEQ ID NO：97的序列并且在其N-末端乙酰化；

第109号肽包括SEQ ID NO：109的序列并且在其N-末端乙酰化；

第110号肽包括SEQ ID NO：110的序列并且在其N-末端乙酰化。

Angiopep-1(SEQ ID NO：67)和Angiopep-2(SEQ ID NO：97)的胺基团已被用作用于试剂轭合的位点。为了研究胺基团在轭合中的作用以及其在这些载体总体转运能力中的影响，将新载体(基于Angiopep-1和Angiopep-2序列)设计为具有可变的反应性胺基团和可变的总电荷。这些多肽如表2所示。

表2：具有可变胺基靶标的载体

多肽名称	多肽序列	反应性胺(位置)	电荷	SEQ ID No.
					Angiopep-3^*	Ac¹-TFFYGGSRGKRNNFKTEEY	2(10，15)	+2	107
Angiopep-4b	RFFYGGSRGKRNNFKTEEY	3(1，10，15)	+3	108
					Angiopep-4a	Ac¹-RFFYGGSRGKRNNFKTEEY	2(10，15)	+2	109
Angiopep-5	Ac¹-RFFYGGSRGKRNNFRTEEY	1(10)	+2	110
					Angiopep-6	TFFYGGSRGKRNNFRTEEY	1(1，10)	+2	111
Angiopep-7	TFFYGGSRGRRNNFRTEEY	1(1)	+2	112

^*Angiopep-3是Angiopep-2的乙酰化形式。

¹Ac表示乙酰化。

修饰的多肽

本发明还包括具有本文所述氨基酸序列修饰的多肽(例如，具有SEQ ID NO：1-105和107-112中任一个所述序列的多肽如Angiopep-3、-4a、-4b、-5、-6或-7)。在某些实施方式中，所述修饰不显著破坏期望的生物学活性。在一些实施方式中，修饰可以引起生物学活性降低(例如降低至少5％、10％、20％、25％、35％、50％、60％、70％、75％、80％、90％或95％)。在其他实施方式中，修饰对生物学活性没有影响或者可以增加初始多肽的生物学活性(例如增加至少5％、10％、25％、50％、100％、200％、500％或1,000％)。修饰的多肽可以具有或可以优化本发明多肽的一种或多种特性，其在一些情况下可能是需要或期望的。这样的特性包括体内稳定性、生物可利用度、毒性、免疫活性或免疫学同一性。

本发明的多肽可以包括通过天然过程如翻译后加工或者通过本领域中已知的化学修饰技术而修饰的氨基酸或序列。修饰可以在多肽的任何位置发生，包括多肽主链、氨基酸侧链以及氨基端或羧基端。相同类型的修饰可以在特定多肽的若干位点处以相同或不同程度存在，并且多肽可以包含一种以上类型的修饰。多肽可以由于泛素化(ubiquitination)而发生支化，并且它们可以是环状的，具有或不具有支化。环状、支化和支化的环状多肽可以来自翻译后的天然过程或者可以通过合成而制得。其他修饰包括聚乙二醇化、乙酰化、酰化、乙酰氨基甲基(Acm)加成、ADP-核糖基化、烷基化、酰胺化、生物素化、氨甲酰化、羧乙基化、酯化、共价附着至黄素、共价附着至血红素部分、共价附着至核苷酸或核苷酸衍生物、共价附着至药物、共价附着至标记物(例如荧光或放射活性的)、共价附着至脂质或脂质衍生物、共价附着至磷脂酰肌醇、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、形成共价交联、形成胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚着点形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白酶水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、转运RNA介导的将氨基酸加成至蛋白质如精氨酰化和泛素化。

修饰蛋白可以进一步包括多肽序列中的的氨基酸插入、缺失或者保守性或非保守性(例如D-氨基酸，去氨基酸(desamino acid))取代(例如其中这些改变基本不会改变多肽的生物学活性)。

取代可以是保守性的(即，其中残基被相同通用类型或分组的另一种氨基酸代替)或非保守性的(即，其中残基被另一种类型的氨基酸代替)。另外，非天然氨基酸可以取代天然氨基酸(即，非天然保守性氨基酸取代或非天然非保守性氨基酸取代)。

通过合成制得的多肽可以包括由非DNA天然编码的氨基酸取代(例如，非天然存在或非天然氨基酸)。非天然氨基酸的实例包括D-氨基酸、具有附着至半胱氨酸中硫原子的乙酰氨甲基基团的氨基酸、聚乙二醇化氨基酸、化学式为NH₂(CH₂)_nCOOH的ω氨基酸(其中n为2-6)、中性非极性氨基酸如肌氨酸、叔丁基丙氨酸、N-甲基异亮氨酸和正亮氨酸。苯基甘氨酸可以取代Trp、Tyr或Phe；瓜氨酸和蛋氨酸硫氧化物为中性非极性，磺基丙氨酸是酸性的，而鸟氨酸为碱性。脯氨酸可以用羟基脯氨酸取代并保持赋予性能的构象。

类似物可以通过取代突变产生并保持初始多肽的生物学活性。鉴定为“保守性取代”的取代实例示于表3中。如果这些取代导致不期望的改变，则引入其他类型的取代(表3中称为“示例性取代”，或如本文提及氨基酸种类时进一步描述的)并筛选产物。

功能或免疫同一性方面的实质性修饰通过选择如下的取代而完成，其中这些取代在其保持(a)取代区域中多肽主链的结构，例如作为片状或螺旋构象；(b)靶位点处分子的电荷或疏水性；或(c)侧链的体积的作用方面显著不同。天然残基基于共有侧链性能分成以下组：

(1)疏水性的：正亮氨酸、蛋氨酸(Met)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、组氨酸(His)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)；

(2)中性亲水性的：半胱氨酸(Cys)、丝氨酸、苏氨酸(Thr)；

(3)酸性/带负电的：天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)；

(4)碱性的：天门冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、组氨酸(His)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)；

(5)影响链取向的残基：甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro)；

(6)芳香族的：色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、组氨酸(His)；

(7)极性的：Ser、Thr、Asn、Gln；

(8)碱性带正电的：Arg、Lys、His；以及

(9)带电的：Asp、Glu、Arg、Lys、His。

其他保守性氨基酸取代列于表3中。

表3：氨基酸取代

初始残基	示例性取代	保守性取代
			Ala(A)	Val，Leu，Ile	Val
Arg(R)	Lys，Gln，Asn	Lys
			Asn(N)	Gln，His，Lys，Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro	Pro
			His(H)	Asn，Gln，Lys，Arg	Arg
Ile(I)	Leu，Val，Met，Ala，Phe，正亮氨酸	Leu
			Leu(L)	正亮氨酸，Ile，Val，Met，Ala，Phe	Ile
Lys(K)	Arg，Gln，Asn	Arg
			Met(M)	Leu，Phe，Ile	Leu
Phe(F)	Leu，Val，Ile，Ala	Leu
			Pro(P)	Gly	Gly
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr	Tyr
			Tyr(Y)	Trp，Phe，Thr，Ser	Phe
Val(V)	Ile，Leu，Met，Phe，Ala，正亮氨酸	Leu

另外的类似物

本发明的多肽和轭合物可以包括本领域中已知的抑肽酶的多肽类似物。例如，美国专利No.5,807,980描述了牛胰腺胰蛋白酶抑制剂(抑肽酶)源抑制剂以及一种用于其制备的方法和治疗用途，包括SEQ ID NO：102的多肽。这些多肽已被用于治疗特征在于组织因子和/或因子VIIIa的表现或量异常的病症，如异常血栓形成。美国专利No.5,780,265描述了能够抑制血浆激肽释放酶(plasmakallikrein)的丝氨酸蛋白酶抑制剂，包括SEQ ID NO：103。美国专利No.5,118,668描述牛胰腺胰蛋白酶抑制剂的变异体，包括SEQ IDNO：105。该抑肽酶氨基酸序列(SEQ ID NO：98)、Angiopep-1氨基酸序列(SEQ ID NO：67)和SEQ ID NO：104，以及一些生物学活性类似物的序列可以在国际申请公开案No.WO 2004/060403中查到。

编码抑肽酶类似物的示例性核苷酸序列列于SEQ ID NO：106(atgagaccag atttctgcct cgagccgccg tacactgggc cctgcaaagc tcgtatcatccgttacttct acaatgcaaa ggcaggcctg tgtcagacct tcgtatacgg cggctgcagagctaagcgta acaacttcaa atccgcggaa gactgcatgc gtacttgcgg tggtgcttag；Genbank登录号X04666)。该序列在位置16处编码赖氨酸而非缬氨酸，如在SEQ ID NO：98中存在的。SEQ ID NO：106核苷酸序列中的突变可以通过本领域已知的方法引入，以改变SEQ ID NO：98中位置16处具有缬氨酸的多肽产生。其他突变或片段可利用本领域中已知的任何技术获得。

利用在国际申请No.PCT/CA2004/000011中披露的合成抑肽酶序列(或其部分)，通过实施蛋白质BLAST(Genebank：www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)可发现抑肽酶类似物的其他实例。可以登录号CAA37967(GI：58005)和1405218C(GI：3604747)查到示例性抑肽酶类似物。

多肽衍生物和拟肽(类肽，peptidominietics)的制备

除了仅由天然氨基酸构成的多肽之外，拟肽或多肽类似物也涵盖于本发明中。多肽类似物通常作为性能类似于模板多肽的非多肽药物而用于制药工业。非多肽化合物称为“多肽模拟物”或拟肽(Fauchere et al.，Infect.Immun.54：283-287，1986；Evans et al.，J.Med.Chem.30：1229-1239，1987)。结构上与治疗有用多肽相关的多肽模拟物可以用来产生同等或增强的治疗性或预防性作用。一般地，拟肽在结构上类似于范式多肽(即，具有生物学或药理学活性的多肽)如天然受体结合多肽，但具有一个或多个通过本领域中熟知的方法被诸如-CH₂NH-、-CH₂S-、-CH₂-CH₂-、-CH＝CH-(顺式和反式)、-CH₂SO-、-CH(OH)CH₂-、-COCH₂-等键选择性代替的肽键(Spatola，Peptide Backbone Modifications，Vega Data，1(3)：267，1983)；Spatolaet al.(Life ScL 38：1243-1249，1986)；Hudson et al.(Int.J.Pept.Res.14：177-185，1979)；以及Weinstein.B.，1983，Chemistry andBiochemistry，of Amino Acids，Peptides and Proteins，Weinstein eds，Marcel Dekker，New-York)。这种多肽模拟物相对于天然多肽可以具有显著的优势，包括生产较经济，化学稳定性较强，药理学性能(例如半衰期、吸收、效力和有效性)增强，抗原性降低以及其他方面。

虽然本发明的多肽可有效进入特定细胞类型(例如本文描述的那些)中，但是其效力可能由于蛋白酶的存在而降低。血清蛋白酶具有特殊的底物要求。底物必须具有用于切割的L-氨基酸和肽键。此外，外肽酶(其代表血清中蛋白酶活性的最突出成分)通常作用于多肽的第一个肽键并且需要游离N-末端(Powell et al.，Pharm.Res.10：1268-1273，1993)。据此，使用多肽的修饰形式经常是有利的。修饰的多肽保持初始L-氨基酸多肽的结构特性(其赋予对于IGF-1的生物学活性)，但有利地不易于被蛋白酶和/或外肽酶切割。

用相同类型D-氨基酸对共有序列中的一个或多个氨基酸进行系统性取代(例如，D-赖氨酸代替L-赖氨酸)可以用来生成更加稳定的多肽。因此，本发明的多肽衍生物或拟肽可以都是L型、都是D型或混合的D、L型多肽。N-末端或C-末端D-氨基酸的存在增加多肽的体内稳定性，因为肽酶不能利用D-氨基酸作为底物(Powell et al.，Pharm.Res.10：1268-1273，1993)。反向-D多肽是含有D-氨基酸的多肽，以相对于含L-氨基酸多肽的反向序列排列。因此，L-氨基酸多肽的C-末端残基变为D-氨基酸多肽的N-末端等。反向D-多肽保持与L-氨基酸多肽相同的三级构象且因此具有相同活性，但对于体内外酶促降解更稳定，因而具有比初始多肽具有更高的治疗效力(rady and Dodson，Nature 368：692-693，1994；Jamesonet al.，Nature 368：744-746，1994)。除了反向-D-多肽，包含共有序列或基本上相同的共有序列变化的限制性多肽可以通过本领域熟知的方法生成(Rizo and Gierasch，Ann.Rev.Biochem.61：387-418，1992)。例如，限制性多肽可以通过插入能够形成二硫键由此得到环状多肽的半胱氨酸残基而产生。环状多肽没有游离的N-末端或C-末端。因此，它们不易于被外肽酶蛋白水解，尽管其的确易感于内肽酶，但内肽酶不在肽末端进行切割。具有N-末端或C-末端D-氨基酸的多肽或环状多肽的氨基酸序列通常与它们对应的多肽的序列相同，只是分别存在N-末端或C-末端D-氨基酸残基或其环状结构。

含有分子内二硫键的环状衍生物可以通过常规固相合成制备，同时在选择用于环化的位置如氨基和羧基末端并入合适的S-保护半胱氨酸或高半胱氨酸残基(Sah et al.，J.Pharm.Pharmacol.48：197，1996)。完成链组装之后，如下进行环化：(1)通过选择性去除相应的lian各个游离SH-官能团以形成S-S键，接着常规从载体去除产物以及恰当的纯化工序；或(2)通过从载体去除多肽以及完全侧链去保护，接着在高度稀释水溶液中氧化游离SH-官能团。

含有分子内酰胺键的环状衍生物可以通过常规固相合成制备，同时在选择用于环化的位置并入合适的氨基和羧基侧链保护的氨基酸衍生物。含有分子内-S-烷基键的环状衍生物可以通过常规固相化学制备，同时在选择用于环化的位置处并入具有合适氨基酸保侧链的氨基酸残基以及合适的S-保护的半胱氨酸或高半胱氨酸残基。

另一种赋予对作用于多肽N-末端或C-末端残基的肽酶的抗性的有效途径是在多肽末端添加化学基团，以使修饰的多肽不再是肽酶的底物。一种这样的化学修饰是在两个之一或两个末端对多肽进行糖基化。某些化学修饰，尤其是N-末端糖基化，已被证实增加多肽在人血清中的稳定性(Powell et al.，Pharm.Res.10：1268-1273，1993)。其他增强血清稳定性的化学修饰包括但不限于添加N-末端烷基，包括从1至20个碳的低级烷基，如乙酰基，和/或添加C-末端酰胺或取代的酰胺基团。特别的，本发明包括由带有N-末端乙酰基基团和/或C-末端酰胺基团的多肽构成的修饰多肽。

本发明还包括其他类型的多肽衍生物，其包含并非常见多肽一部分的其他化学部分，假定该衍生物保持多肽的期望功能活性。这种衍生物的实例包括(1)氨基末端或另一游离氨基基团的N-酰基衍生物，其中酰基基团可以是烷酰基(例如乙酰基，己酰基，辛酰基)、芳酰基(例如苯甲酰基)或封闭基团如F-moc(芴基甲基-O-CO-)；(2)羧基末端或另一游离羧基或羟基基团的酯；(3)羧基末端或另一游离羧基基团的酰胺，通过与氨或合适的胺反应产生；(4)磷酸化衍生物；(5)轭合至抗体或其他生物学配体的衍生物以及其他类型的衍生物。

将另外的氨基酸残基添加至本发明多肽产生的较长多肽序列也涵盖在本发明中。预期这种较长多肽序列具有与上述多肽相同的生物学活性(例如，进入特定细胞类型)。虽然不排除具有大量另外氨基酸的多肽，但是已认识到，一些大的多肽可能呈现掩盖有效序列的构象，从而阻止结合于靶标(例如LRP受体家族的成员如LRP或LRP2)。这些衍生物可以充当竞争性拮抗剂。因此，虽然本发明涵盖多肽具有附加部分的本文所述多肽的衍生物，但期望该附加部分不会破坏该多肽或衍生物的细胞靶向活性。

其他包括在本发明中的衍生物是由两个相同或两个不同的本发明多肽构成的二重多肽(dual polypeptide)，两个多肽彼此之间直接或通过间隔物共价连接，如通过一个丙氨酸残基短链或通过一个公认用于蛋白水解的位点(例如通过组织蛋白酶，参见例如美国专利No.5,126,249和欧洲专利No.495 049)。本发明多肽的多聚体由相同或不同多肽或其衍生物形成的分子聚合物构成。

本发明还涵盖一些多肽衍生物，其是含本文所述多肽的嵌合或融合蛋白或者其片段，在其氨基或羧基末端或者两端处连接至不同蛋白的氨基酸序列。这种嵌合或融合蛋白可以通过编码该蛋白的核酸重组表达而生成。例如，嵌合或融合蛋白可以含有本发明多肽中的至少6个氨基酸，并且期望其具有与本发明多肽相当或较高的功能活性。

本发明的多肽衍生物可以通过取代、添加或缺失氨基酸残基来改变氨基酸序列而制得，以提供功能相当的分子或者功能增强或降低的分子(根据需要)。本发明的衍生物包括但不限于包含本文所述多肽的全部或部分氨基酸序列作为一级氨基酸序列的那些衍生物(例如SEQ ID NOS：1-105和107-112中的任一个)，包括含有功能相当的氨基酸残基取代的改变序列。例如，该序列中的一个或多个氨基酸残基被另一种充当功能等价物的极性类似氨基酸取代，引起沉默改变。该序列中的氨基酸取代可以选自该氨基酸所属类别中的其他成员。例如，带正电(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。非极性(疏水性)氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、色氨酸和蛋氨酸。不带电的极性氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸。带负电的(酸性)氨基酸包括谷氨酸和天门冬氨酸。氨基酸甘氨酸可以包括在非极性氨基酸家族或不带电的(中性)极性氨基酸家族中。在氨基酸家族中形成的取代通常理解为保守性取代。

用于鉴定拟肽的测定

如上所述，产生以复制通过本发明方法所鉴定多肽的主链结构和药效基团显示的非肽基化合物(拟肽)经常具有更大代谢稳定性、更高效力、更长作用持续时间和更佳生物利用度的属性。

本发明的拟肽化合物可以利用本领域已知的组合文库方法中的大量途径中的任一种获得，包括：生物学文库；空间可定位平行固相或溶液相文库；需要信号简化(devonvolution)的合成文库方法；“一珠子一化合物”文库方法；以及利用亲和层析选择的合成文库方法。生物学文库途径限于多肽文库，而其他四种途径可应用于多肽、非肽寡聚物或化合物的小分子文库(Lam，Anticancer DrugDes.12：145，1997)。用于合成分子文库的方法的实例可以在本领域查到，例如在：De Witt et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6909，1993)；Erb et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：11422，1994)；Zuckermann et al.，J.Med.Chem.37：2678，1994)；Cho et al.(Science261：1303，1993)；Carell et al.(Angew.Chem，Int.Ed.Engl.33：2059，1994and ibid 2061)；以及在Gallop et al.(Med.Chem.37：1233，1994)中。化合物的文库可以存在于溶液中(例如Houghten，Biotechniques13：412-421，1992)或珠子(Lam，Nature 354：82-84，1991)、芯片(Fodor，Nature 364：555-556，1993)、细菌或孢子(美国专利No.5,223,409)、质粒(Cull et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：1865-1869，1992)上或在噬菌体上(Scott and Smith，Science 249：386-390，1990)或萤光素酶，以及通过测定恰当底物向产物的转化而检测的酶标。

一旦本发明的多肽被鉴定，则它可以通过任意数量的标准方法包括但不限于差异溶解(例如沉淀)、离心、层析(例如亲和性、离子交换、尺寸排除等)或通过用于纯化多肽、拟肽或蛋白的其他标准技术进行分离和纯化。已鉴定的感兴趣多肽的功能性能可以利用本领域中已知的任何功能性测定进行评估。期望地，使用用于评估胞内信号转导中下游受体功能(例如细胞增生)的测定。

例如，本发明的拟肽化合物可以利用下列三阶段工艺获得：(1)扫描本发明的多肽以鉴定对于靶向本发明所述特定细胞类型所需的二级结构区域；(2)使用构象受限二肽替代品来改进主链结构并提供对应于这些替代品的有机平台；以及(3)利用最佳有机平台来显示设计为模拟天然多肽期望活性的候选物文库中的有机药效基团。更详细地，该三个阶段如下。在第1阶段，扫描主要候选多肽并简化其结构以鉴定用于其活性的要求。合成一系列初始多肽的多肽类似物。在第2阶段，利用构象受限二肽替代品考察最好的多肽类似物。吲哚里西定-2-酮(Indolizidin-2-one)吲哚里西定-9-酮和喹啉里西定酮(quinolizidinone)氨基酸(分别是I²aa、I⁹aa和Qaa)用作用于研究最佳多肽候选物主链结构的平台。这些和相关平台(在Halab et al.，Biopolymers 55：101-122，2000；and Hanessian etal.Tetrahedron 53：12789-12854，1997中评述)可以在多肽的特定区域引入以将药效基团在不同方向上定向。这些类似物的生物学评价鉴定了改进的前导多肽，其模拟用于活性的结构要求。在第3阶段，来自最有活性主要多肽的平台用来显示负责天然多肽活性的药效基团的有机替代品。药效基团和支架以平行合成模式组合。多肽和以上阶段的衍化可以利用本领域已知的方法通过其他方式实现。

从本发明的多肽、多肽衍生物、拟肽或其他小分子确定的结构功能关系可以用来改进和治疗具有类似或更好性能的类似分子结构。因此，本发明的化合物还包括与本文所述多肽具有共同结构、极性、电荷特性和侧链性能的分子。

总之，基于本文的披露内容，本领域熟练技术人员能够开发对于鉴定将试剂靶向特定细胞类型(例如本文描述的那些)的化合物非常有用的多肽和拟肽筛选测定。本发明的测定可以开发用于低通量、高通量或超高通量筛选的模式。本发明的测定包括适于自动化的测定。

本发明的轭合物

本文描述的多肽或其衍生物可以连接至一种试剂。例如，多肽(例如Angiopep-7)可以附着至一种治疗剂、诊断剂或一种标签。在某些实施方式中，多肽连接至一种可检测标签或用可检测标签加以标记，如放射成像剂，用于诊断一种疾病或病症。这些试剂的实例包括放射成像剂-抗体-载体轭合物，其中抗体结合至疾病或病症-特异性抗原(例如，用于诊断或治疗)。其他结合分子也在本发明的范围内。在其他情况下，多肽或衍生物连接至治疗剂，以治疗疾病或病症，或者可以连接至其混合物或者用其混合物标记。疾病或病症可以通过在允许将试剂跨BBB转运或进入特定细胞类型内的条件下给予个体载体-试剂轭合物而进行治疗。每一种多肽可以包括至少1、2、3、4、5、6或7种试剂。在其他实施方式中，每一种试剂具有至少1、2、3、4、5、6、7、10、15、20或更多种附着至其的多肽。本发明的轭合物可以能够促进该试剂在对象的特定细胞类型或组织如肝、肺、肾、脾或肌肉中的积累(例如，由于吸收增加或外排减少)。

试剂可以在转运入特定细胞类型或跨BBB转运之后从载体释放。试剂例如可以通过载体和试剂之间的化学键的酶促裂解或其他破坏而释放。然后释放的试剂可在缺乏载体时以其期望能力起作用。

治疗剂

治疗剂可以是任何生物学活性剂。例如，治疗剂可以是治疗疾病(例如用于杀死癌细胞)的药物、药剂、发射辐射的试剂、细胞毒素(例如化疗剂)、其生物学活性片段或其混合物，或它可以是用于治疗个体疾病或病症的试剂。治疗剂可以合成产物或真菌、细菌或其他微生物(例如支原体或病毒)、动物如爬行动物或者植物起源的产物。治疗剂和/或其生物学活性片段可以是酶促活性试剂和/或其片段，或者可以通过抑制或阻断重要和/或必要细胞途径或通过与重要和/或必要的天然细胞组分竞争而起作用。其他治疗剂包括抗体和抗体片段。

抗癌剂。本领域已知的任何抗癌剂均可以是本发明轭合物的一部分。脑癌可以利用含有可有效转运跨过BBB的载体(Angiopep-3，Angiopep-4a，Angiopep-4b，Angiopep-5或Angiopep-6)的轭合物进行治疗。肝癌、肺癌、肾癌或脾脏癌可以利用轭合至有效转运入恰当细胞类型(例如Angiopep-7)内的载体的抗癌剂进行治疗。示例性试剂包括阿巴瑞克(abarelix)、阿地白介素(aldesleukin)、阿伦珠单抗(alemtuzumab)、阿利维a酸(alitretinoin)、别嘌呤醇(allopurinol)、六甲密胺(altretamine)、氨磷汀(amifostine)、阿那白滞素(anakinra)、阿那曲唑(anastrozole)、三氧化二砷、天冬酰胺酶、阿扎胞苷(azacitidine)、BCG活疫苗(BCG Live)、北伐单抗(bevacuzimab)、贝沙罗汀(bexarotene)、博来霉素(bleomycin)、博来霉素、硼替佐米(bortezombi)、硼替佐米(bortezomib)、白消安(busulfan)、白消安、卡普睾酮(calusterone)、卡培他滨(capecitabine)、卡铂、卡莫司汀(carmustine)、塞来考昔(celecoxib)、西妥昔单抗(cetuximab)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺铂、克拉屈滨(cladribine)、氯法拉滨(clofarabine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、阿糖胞苷(cytarabine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、更生霉素(dactinomycin)、放线菌素D(actinomycinD)、达肝素(dalteparin)(例如钠)、达依泊汀α(darbepoetin alfa)、达沙替尼(dasatinib)、柔红霉素(daunorubicin)、道诺霉素(daunomycin)、地西他滨(decitabine)、地尼白介素(denileukin)、地尼白介素2(denileukin diftitox)、右雷佐生(dexrazoxane)、多西紫杉醇(docetaxel)、多柔比星(doxorubicin)、丙酸甲雄烷酮(dromostanolone propionate)、艾库组单抗(eculizumab)、表柔比星(epirubicin)(例如HCl)、阿法依伯汀(epoetin alfa)、埃罗替尼(erlotinib)、雌氮芥(estramustine)、依托泊甙(etoposide)(例如磷酸盐)、依西美坦(exemestane)、芬太尼(fentanyl)(例如柠檬酸盐)、非格司亭(filgrastim)、氟尿苷(floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、5-FU、氟维司群(fulvestrant)、吉非替尼(gefitinib)、吉西他滨(gemcitabine)(例如HCl)、吉姆单抗(gemtuzumab)奥佐米星(ozogamicin)、戈舍瑞林(goserelin)(例如乙酸盐)、组氨瑞林(histrelin)(例如乙酸盐)、羟基脲(hydroxyurea)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、伊比达星(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊马替尼(imatinib)(例如去铁胺(mesylate))、干扰素α-2b(Interferon alfa-2b)、伊立替康(irinotecan)、二甲苯磺酸拉帕替尼(lapatinib ditosylate)、来那度胺(lenalidomide)、来曲唑(letrozole)、甲酰四氢叶酸(leucovorin)、亮丙瑞林(leuprolide)(例如乙酸盐)、左旋咪唑(levamisole)、洛莫司汀(lomustine)、CCNU、meclorethamine(氮芥)、甲地孕酮(megestrol)、美法仑(melphalan)(L-PAM)、巯嘌呤(mercaptopurine)(6-MP)、美司钠(mesna)、甲氨喋呤(methotrexate)、甲氧沙林(methoxsalen)、丝裂霉素c(mitomycinC)、米托坦(mitotane)、米托蒽醌(mitoxantrone)、苯丙酸诺龙(nandrolone phenpropionate)、奈拉滨(nelarabine)、诺非单抗(nofetumomab)、奥普瑞白介素(oprelvekin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、紫杉酚(paclitaxel)、帕利夫明(palifermin)、帕玛二磷酸(pamidronate)、帕尼单抗、培加酶(pegademase)、培门冬酶(pegaspargase)、聚乙二醇化非格司亭(pegfilgrastim)、培干扰素α-2b(peginterferon alfa-2b)、培美曲塞(pemetrexed)(例如二钠)、喷司他丁(pentostatin)、哌泊溴烷(pipobroman)、普利霉素(plicamycin)(光辉霉素(mithramycin))、卟菲尔钠(porfimer)(例如钠)、丙卡巴肼(procarbazine)、奎纳克林(quinacrine)、拉布立酶(rasburicase)、利妥昔单抗(rituximab)、沙镉司亭(sargramostim)、索拉菲尼(sorafenib)、链脲菌素(streptozocin)、舒尼替尼(sunitinib)(例如马来酸盐)、滑石、他莫西芬(tamoxifen)、替莫唑胺(temozolomide)、替尼泊甙(teniposide)(VM-26)、睾内酯(testolactone)、沙立度胺(thalidomide)、硫鸟嘌呤(thioguanine)(6-TG)、塞替派(thiotepa)、塞替派、塞替派、托泊替坎(topotecan)(例如HCl)、托瑞米芬(toremifene)、托西莫单抗/I-131(Tositumomab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、曲妥珠单抗、维a酸(ATRA)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)、戊柔比星(valrubicin)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春瑞滨(vinorelbine)、伏林司他(vorinostat)、唑来膦酸盐(zoledronate)和唑来膦酸(zoledronic acid)。紫杉酚的示例性衍生物描述于美国专利No.6911549，将其整个内容结合于此供参考。

可检测标签

对于检测或诊断目的，本发明的轭合物可以进行标记。可检测标签或标记物可以是放射性标签、荧光标签、核磁共振活性标签、发光标签、生色团标签(chromophore label)、用于PET扫描仪的阳电子发光同位素、化学发光标签、或酶促标签。发射辐射的示例性放射成像剂(可检测放射标签)包括铟-111、锝-99或低剂量碘-131。γ和β发光放射性核素包括⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、⁹⁰Y、¹¹¹In、^99mTc和²⁰¹Tl。阳电子发光核素包括¹⁸F、⁵⁵Co、⁶⁰Cu、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁶Ga、⁶⁸Ga、⁸²Rb和⁸⁶Y。荧光标签包括Cy5.5、绿色荧光蛋白(GFP)、荧光素和罗丹明。化学发光标签包括萤光素酶和β-半乳糖苷酶。酶促标签包括过氧化氢酶和磷酸酶。组氨酸标记物(Histag)也可以是可检测标签。例如，轭合物可以包括载体部分和抗体部分(抗体或抗体片段)，其可以进一步包括一个标签。在这种情况下，标签可以附着至载体或抗体。

抗体

抗体也可以通过本领域已知的任何方式(例如使用本文描述的轭合策略)轭合至本发明的多肽。任何诊断或治疗性抗体均可以轭合至本发明载体中的一个或多个(例如2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多)。另外，抗体片段(例如能够结合至抗原)也可以轭合至本发明的载体。抗体片段包括抗体(例如，本文中描述的任何抗体)的Fab和Fc区域、重链和轻链。用于诊断和治疗癌症的示例性抗体包括ABX-EGF(Panitimumab)、OvaRex(Oregovemab)、Theragyn(pemtumomab钇-90)、Therex、比伐单抗(Bivatuzumab)、Panorex(依决洛单抗(Edrecolomab))、ReoPro(阿昔单抗(Abciximab))、Bexxar(托西莫单抗(Tositumomab))、MAb、独特型105AD7、抗-EpCAM(Catumaxomab)、Mab肺癌(来自Cytoclonal)、赫赛汀(Herceptin)(曲妥珠单抗(Trastuzumab))、B细胞单抗(Rituxan)(利妥昔单抗(Rituximab))、阿瓦斯丁(Avastin)(贝伐珠单抗(Bevacizumab))、AMDFab(Ranibizumab)、E-26(2ndgen.IgE)(奥马珠单抗(Omalizumab))、泽娃灵(Zevalin)(Rituxan+钇-90)(替依莫单抗(Ibritumomabtiuxetan))、西妥昔单抗(Cetuximab)、BEC2(米妥莫单抗(Mitumomab))、IMC-ICl1、nuC242-DMl、LymphoCide(依帕珠单抗(Epratuzumab))、LymphoCideY-90、CEA-Cide(Labetuzumab)、CEA-CideY-90、CEA-Scan(Tc-99m-标记的阿西莫单抗(arcitumomab))、LeukoScan(Tc-99m-标记的硫索单抗(sulesomab))、LymphoScan(Tc-99m-标记的贝妥莫单抗(bectumomab))、AFP-Scan(Tc-99m-标记的)、HumaRAD-HN(+钇-90)、HumaSPECT(伏妥莫单抗(Votumumab))、MDX-101(CTLA-4)、MDX-210(her-2过表达)、MDX-210/MAK、Vitaxin、MAb425、IS-IL-2、Campath(阿伦珠单抗(alemtuzumab))、CD20抗生蛋白链菌素、Avidicin、(白蛋白+NRLUl3)、Oncolym(+碘-131)Cotara(+碘-131)、C215(+金黄色葡萄球菌肠毒素，Mab肺/肾癌症(来自PharmaciaCorp.)、他那可单抗他那托(nacolomabtafenatox)(C242金黄色葡萄球菌肠毒素)、Nuvion(Visilizumab)、SMARTM195、SMARTIDlO、CEAVac、TriGem、TriAb、NovoMAb-G2放射标记的、MonopharmC、GlioMAb-H(+白树素毒素(gelonintoxin))、Rituxan(利妥昔单抗)和ING-I。另外的治疗性抗体包括5G1.1(Ecluizumab)、5G1.1-SC(Pexelizumab)、ABX-CBL(Gavilimomab)、ABX-IL8、Antegren(那他珠单抗(Natalizumab))、抗-CD11a(依法珠单抗(Efalizumab))、抗-CD18(来自Genetech)、抗-LFA1、Antova、BTI-322、CDP571、CDP850、CorsevinM、D2E7(阿达木单抗(Adalimumab))、Humira(阿达木单抗)、Hu23F2G(罗维珠单抗(Rovelizumab))、IC14、IDEC-114、IDEC-131、IDEC-151、IDEC-152、英利昔单抗(Infliximab)(类克(Remicade))、LDP-01、LDP-02、MAK-195F(阿非莫单抗(Afelimomab))、MDX-33、MDX-CD4、MEDI-507(Siplizumab)、OKT4A、OKT3(Muromonab-CD3)和ReoPro(阿昔单抗(Abciximab))。

轭合连接物

轭合物(例如蛋白-蛋白轭合物)可以利用本领域已知的任何交联(轭合)试剂或方案获得，其中许多是商业上可获得的。这样的方案和试剂包括与氨基、羧基、巯基、羰基、烃和/或酚基团发生反应的交联剂。这种方案的量、次数和条件可以变化以优化轭合。交联剂包含至少两个反应性基团并且通常分成同型官能交联剂(含有相同的反应性基团)和异型官能交联剂(含有非相同的反应性基团)。本发明的交联剂可以是同型官能和/或异型官能的。此外，交联剂可以在反应性部分之间并入“间隔物”，或交联剂中的两个反应性部分可以直接连接。键可以包括酯键。

示例性连接物包括BS³[二(硫代琥珀酰亚胺基)辛二酸酯]、NHS/EDC(N-羟基琥珀酰亚胺和N-乙基-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺)、硫代-EMCS([N-e-马来酰亚胺基己酸]酰肼)、SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯)以及酰肼。BS³是一种同型二官能N-羟基琥珀酰亚胺酯，其靶向可接近的伯胺。轭合方案在图2中例举。NHS/EDC允许伯胺基团与羧基基团的轭合。硫代EMCS是异型二官能反应性基团(马来酰亚胺和NHS-酯)，其对于巯基和氨基是反应性的。利用硫代-NHS/EDC活化的胺偶接可以用来交联治疗性抗体与本发明的多肽，如图3和4例举的。这是一种快速、简单且可重复的偶接技术。所得到的轭合物稳定且保持抗体的生物学活性。此外，它在偶接过程中具有方便控制的高轭合能力以及低非特异性相互作用。SATA对胺有反应性，并加入受保护的巯基基团。NHS-酯与伯胺反应形成稳定的酰胺键。巯基基团可以利用羟基胺去保护。这种轭合方法在图5中例举。酰肼可以用来将羧基连接至伯胺，如图6所示，因此可以用于连接糖蛋白。其他示例性连接物在图7中举例说明。

小分子如治疗剂可以轭合至本发明的多肽。示例性小分子紫杉醇具有对于轭合有用的两个关键位置(位置C2’和C7)。本发明的一个载体或多个载体与紫杉醇的轭合可以如下实施(图8)。简而言之，紫杉醇与酸酐琥珀酸吡啶在室温下反应3小时以在位置2’连接琥珀酰基。2’-琥珀酰基紫杉醇在位置2’具有可裂解的酯键，可以简单地释放琥珀酸。如果需要，这种可裂解酯键可以利用连接物进一步进行各种修饰。所得的2’-O-琥珀酰基-紫杉醇然后与DMSO中的EDC/NHS在室温下反应9小时，接着在室温下加入在Ringer/DMSO中的载体或多种载体，再反应4小时。图8中描绘的轭合反应通过HPLC监控。纯化每一个中间体如紫杉醇、2’-O-琥珀酰基-紫杉醇和2’-O-NHS-琥珀酰基-紫杉醇并利用不同方法如HPLC、薄层液相色谱、NMR(¹³C或¹H交换)、熔点或质谱进行确认。最终的轭合物通过质谱和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。这允许确定在每个载体上轭合的紫杉醇分子的数量。

轭合物活性

通过将一种试剂轭合至本文描述的载体，可以实现期望的性能，如药物动力学改变、组织分布改变(例如增加至特定组织或细胞类型如肝、脑、肺、脾或肾的递送)。简而言之，我们已经鉴定了将试剂有效跨BBB转运的载体(例如Angiopep-3，Angiopep-4a，Angiopep-4b，Angiopep-5和Angiopep-6)。与Angiopep-2相同，这些载体也可以能够将试剂靶向其他细胞类型或组织(例如肝、肺、肾、脾或肌肉)。我们还鉴定了一种载体Angiopep-7，其未被有效地转运跨过BBB，但转运至特定组织(例如肝、肺、肾、脾或肌肉)。因此，在不需要跨BBB转运的情况下，具有这种活性的载体可以很有用。

由于本发明的轭合物将试剂转运至特定组织，所以轭合的试剂可以得到更低的毒性(例如更少的副作用)、更高的效力(例如，因为该试剂由于吸收增加或从组织或细胞的外排减少而浓缩到靶组织中或者因为轭合后试剂具有更大的稳定性)，或其组合。这些活性在下文以及国际公开案No.WO 2007/009229中加以阐述，将其并入本文供参考。

在一些情况下，试剂与载体的轭合允许该试剂逃避P-糖蛋白(P-gp)的作用，一种能够从细胞外排某些试剂的排出泵。通过降低P-gp从细胞外排一种试剂的能力，可以增大细胞中该试剂的效力。这些轭合物因此可以活跃的抑制癌细胞增生。此外，体内肿瘤生长获得的结果表明，本发明的载体可以靶向受体LRP。而且，轭合可以改变未轭合试剂的药物动力学或生物分布。

总之，可以使用轭合物来对抗原发性肿瘤包括乳腺癌、肺癌和皮肤癌以及起源于原发性肿瘤的转移灶。

P-糖蛋白旁路

由于对各种化疗剂如长春新碱、依托泊苷(etoposide)和多柔比星的耐药性通过P-gp(MDR1)过表达介导(图9)，所以避开这种排出泵可以增强这些药物对各种癌症类型的作用。通过将载体轭合至这种试剂，现在可以降低P-gp介导的该试剂外排。这些轭合物可以用于增加药物与通过P-gp介导的耐药性相关的药物效力。如以下例举的，本文描述的载体对其避免通过P-gp外排的能力进行测试。

LRP介导的吸收

基于我们之前的工作(参见国际专利公开No.PCT/CA2004/00011，将其结合于此供参考)，受体相关蛋白(RAP)在血脑屏障的体外模型中抑制抑肽酶的胞转作用(transcytosis)。LRP在各种各样的癌细胞上表达(参见，例如国际公开案No.WO2007/009229)。因此，我们提出，低密度抑肽酶相关受体(LRP)与抑肽酶透入脑中相关。还可获得Angiopep-1和Angiopep-2转运跨过血脑屏障体外模型的类似抑制(数据未显示)，表明这些多肽跨脑内皮细胞的胞转也涉及LRP。基于此，我们认为LRP可能与本文描述的抑肽酶相关多肽的摄取普遍相关。

LRP是由两个亚基(亚基-α(515kDa)和亚基-β(85kDa)构成的600kDa的杂二聚体膜受体。因为LRP可以与本文所描述的载体转运相关，所以本发明的轭合物可以靶向于表达这种受体的细胞和肿瘤。某些癌细胞例如表达LRP的成员(例如LRP或LRP2)。

治疗方法

本发明的特征还在于利用本文描述的多肽轭合物进行治疗的方法。有效跨BBB转运的轭合物(例如Angiopep-3、Angiopep-4a、Angiopep-4b、Angiopep-5和Angiopep-6)可以用来治疗任何脑或中枢神经系统疾病。这些轭合物也有效地转运到肝、肺、肾、脾或肌肉，因此也可以结合恰当治疗剂使用以治疗这些组织相关的疾病(例如癌症)。因为Angiopep-7不被有效地转运至脑，但可有效地转运至组织和细胞如肝、肺、肾、脾和肌肉，所以当不期望将该试剂靶向于脑时，Angiopep-7可以特别适用于治疗这些组织相关疾病的载体。

肝病包括阿米巴肝脓肿(amebic liver abscess)、肝硬化、播散性球孢子菌病(disseminated coccidioidomycosis)、药物诱导胆汁淤积、血色素沉积症、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、肝细胞癌、肝癌、由于酒精导致的肝病、原发性胆汁性肝硬变、化脓性肝脓肿、Reye综合征、硬化性胆管炎(sclerosing cholangitis)和胆豆状核变性(Wilson′s disease)。阿米巴肝脓肿可以通过给予轭合至甲硝唑的载体进行治疗。乙型肝炎可以例如通过给予轭合至干扰素-α、拉米夫定(lamivudine)、阿德福韦二匹伏酯(adefovirdipivoxil)、恩替卡韦(entecavir)或其他抗病毒剂的载体进行治疗。丙型肝炎可以例如通过给予轭合至聚乙二醇化干扰素或利巴韦林或其组合的载体进行治疗。

肺病包括肺癌如小细胞癌症(例如燕麦形细胞癌)、混合细胞/大细胞癌、合并小细胞癌和转移性肿瘤。转移性肿瘤可以起源于任何组织的癌症，包括乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肉瘤、膀胱癌、神经细胞瘤和Wilm肿瘤(Wilm′s tumor)。脾脏病包括癌症如淋巴癌、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin′s lymphoma)和某些T细胞淋巴瘤。

可以利用本发明的轭合物或组合物进行治疗的其他示例性癌症包括肝细胞癌、乳腺癌、头部和颈部的癌症包括各种淋巴瘤如外套细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、腺瘤、鳞状细胞癌(squamous cellcarcinoma)、喉癌(laryngeal carcinoma)、视网膜癌、食管癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、子宫癌、黑素瘤、结直肠癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌(包括非小细胞肺癌)、胰腺癌、宫颈癌、头颈癌、皮肤癌、鼻咽癌、脂肪肉瘤、上皮癌、肾细胞癌、胆囊腺癌、耳下腺癌、子宫内膜肉瘤、多药耐药性癌；以及增生性疾病和病症，如与肿瘤血管发生相关的新血管形成、黄斑变性(例如湿/干AMD)、角膜新血管化、糖尿病视网膜病变、新生血管性青光眼、近视性变性以及其他增生性疾病和病变，如再狭窄和多囊性肾病。可以利用有效跨BBB转运的载体进行治疗的脑癌包括星形细胞瘤(astrocytoma)、纤维状细胞性星形细胞瘤、胚胎发育不良性神经上皮瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤、多形性胶质母细胞瘤、混合神经胶质瘤、寡星状细胞瘤、髓母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、成神经细胞瘤、生殖细胞瘤和畸胎瘤。

本发明的轭合物或组合物可以通过本领域已知的任何方式给予；例如口服、动脉内、鼻内、腹膜内、静脉内、肌内、皮下、经皮或经口给予对象。试剂可以例如是抗血管生成的化合物。

药物组合物

本发明的药物组合物可以包括本文描述的多肽或轭合物以及药用载体。这种组合物为液体或者冻干的或以其他方式干燥的制剂，并且包括各种缓冲容量的稀释剂(例如Tris-HCl，乙酸盐，磷酸盐)、pH和离子强度、添加剂如白蛋白或明胶以防止吸附至表面、去污剂(例如Tween 20、Tween 80、Pluronic F68胆酸盐)。增溶剂(例如甘油、聚乙二醇)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、防腐剂(例如水杨乙汞(thimerosal)、苄基醇、对羟苯甲酸类(parabens))、膨胀物质或张力调节剂(例如乳糖、甘露醇)、聚合物如聚乙二醇共价附着至蛋白、与金属离子的复合、或该材料并入到特定聚合化合物如聚乳酸、聚乙醇酸、水凝胶等的制剂中或上，或脂质体上，微乳液、胶束、单层或多层泡囊、红细胞血影(erythrocyte ghosts)或球形体(spheroplast)。这种组合物将会影响物理状态、溶解度、稳定性、体内释放速率以及体内清除速率。控释或缓释组合物包括在亲脂性储库(例如脂肪酸、石蜡、油)中的制剂。本发明还涵盖用聚合物(例如泊洛沙姆(poloxamers)或泊洛沙胺(poloxamines)涂覆的颗粒组合物。本发明组合物的其他实施方式包括颗粒形式的保护涂层、蛋白酶抑制剂或用于各种给药途径的渗透增强剂，包括非肠道、肺、鼻、口、阴道、直肠途径。在一个实施方式中，药物组合物经非肠道、癌旁(paracancerally)、跨膜、经皮、肌地、静脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内、颅内和瘤内进行给药。

药用载体进一步包括0.01-0.1M或0.05M磷酸缓冲液或0.8％盐水。另外，这些药用载体可以是水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油以及可注射有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲的介质。非肠道媒剂包括氯化钠溶液、林格葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸化的林格或固化油。静脉内媒剂包括流体和营养补充物、电解质补充物如那些基于林格葡萄糖的补充物等。防腐剂或其他添加剂也可以存在，例如抗微生物剂、抗氧化剂、捕收剂(collating agent)、惰性气体等。

其他制剂包括脂肪酸(例如12-羟基硬脂酸)的聚氧化乙烯酯如因此，在一些实施方式中，药物组合物可以包括a)本文描述的轭合物、b)和c)水性溶液或缓冲液(例如pH为5～7的Ringer/Hepes溶液)。制剂中的浓度可以为至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或60％(例如30％)或者在这些数值中任意两个之间的任何范围内。轭合物的浓度可以基于有效治疗对象所需的剂量、或溶解所给予轭合物所需酯的量进行确定。例如在国际公开案No.WO 2007/009229中描述了用于给予紫杉醇(Taxol)轭合物的制剂中Solutol的用途，将其结合于此作为参考。

用于口服使用的固体剂型

用于口服使用的制剂包括片剂，其包含在与非毒性药用赋形剂的混合物中的活性成分，并且这种制剂已为本领域熟练技术人员所知(例如美国专利No.5,817,307、5,824,300、5,830,456、5,846,526、5,882,640、5,910,304、6,036,949、6,036,949、6,372,218，将其结合于此供参考)。这些赋形剂可以例如是惰性稀释剂或填料(例如蔗糖、山梨醇、糖、甘露醇、微晶纤维素、淀粉包括马铃薯淀粉、碳酸钙、氯化钠、乳糖、磷酸钙、硫酸钙或磷酸钠)；成粒剂或崩解剂(例如纤维素衍生物，包括微晶纤维素、淀粉包括马铃薯淀粉、交联羧甲纤维素钠、藻酸钠或海藻酸)；结合剂(例如蔗糖、葡萄糖、山梨醇、阿拉伯胶(acacia)、海藻酸、藻酸钠、明胶、淀粉、预凝胶化淀粉、微晶纤维素、硅酸铝镁、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、或聚乙二醇)；以及润滑剂、助流剂和抗粘附剂(例如硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、硅酸盐、氢化植物油或滑石)。其他药用赋形剂可以是着色剂、调味剂、增塑剂、保湿剂、缓冲剂等。

片剂可以是未涂覆的或者其可以通过已知的技术进行涂覆，以选择性延缓胃肠道中的崩解和吸收，由此在较长期间内提供持续作用。涂层可以适合于以预定模式释放试剂(例如为了获得控释制剂)或可以适合于在通过胃之后释放试剂(肠溶衣)。涂层可以糖涂层、薄膜涂层(例如基于羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、甲基羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维、丙烯酸酯共聚物、聚乙二醇、和/或聚乙烯吡咯烷酮)或肠溶衣(例如基于甲基丙烯酸共聚物、醋酸纤维素酞酸酯、羟丙基甲基纤维素酞酸酯、醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯、聚醋酸乙烯酯酞酸酯、虫胶和/或乙基纤维素)。此外，可以采用延时材料，例如单硬脂酸甘油或二硬脂酸甘油。

固体片剂组合物可以包括适于防止该组合物发生不希望的化学变化(例如在活性物质释放之前发生的化学降解)的涂层。该涂层可以以与在Encyclopedia of Pharmaceutical Technology，supra中描述的类似方式在固体剂型上施加。

本发明的组合物可以在片剂中混合在一起或可以分隔开。在一个实施例中，第一试剂包含在片剂内部，而第二试剂在外部，以使第二试剂的大部分在第一试剂释放之前被释放。

口服使用的制剂也可以作为可咀嚼片剂提供或作为硬胶囊提供，其中活性成分与惰性固体稀释剂(例如马铃薯淀粉、乳糖、微晶纤维素、碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合，或作为软胶囊提供，其中活性成分与水或油介质(例如花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。粉末和颗粒可以使用例如混合器、流体床设备、喷雾干燥设备以传统方式，利用上述在片剂和胶囊中的成分制备。

剂量

本文描述的或利用本文描述的方法鉴定的任何轭合物或组合物的剂量取决于若干因素，包括：给药方法、待治疗的疾病(例如癌症)、疾病严重度、癌症是要治疗还是预防、以及待治疗对象的年龄、体重和健康状况。

关于本发明的治疗方法，不计划将向对象给予载体、轭合物或组合物局限于特定的给药模式、剂量或给药频率；本发明考虑所有的给药模式。轭合物或组合物可以以单剂量或多剂量给予对象。例如，本文描述的或利用本发明的筛选方法鉴定的化合物可以一周给药一次，达例如2，3，4，5，6，7，8，10，15，20或更多周。应当理解，对于任何特定的对象，具体的剂量方案应根据个体需要以及给药或监测载体、轭合物或组合物给予人员的专业判断而随时间进行调整。例如，如果较低剂量在治疗本文描述的疾病或病症(例如癌症)中未提供足够的活性，则轭合物的剂量可以增加。相反，如果疾病(例如癌症)减轻或消除，则化合物的剂量可以降低。

虽然参与的医生最终将决定恰当的量和剂量方案，但是本文描述的载体、轭合物或组合物的治疗有效量可以例如在0.0035μg～20μg/kg体重/天或0.010μg～140μg/kg体重/周的范围内。期望地，治疗有效量在0.025μg～10μg/kg的范围内，例如每天、每隔一天或一周两次给予至少0.025、0.035、0.05、0.075、0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0或9.0μg/kg体重。另外，治疗有效量可以在0.05μg～20μg/kg的范围内，例如每周、每隔一周或每月一次地给予至少0.05、0.7、0.15、0.2、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、10.0、12.0、14.0、16.0或18.0μg/kg体重。此外，化合物的治疗有效量可以例如在每隔一天、每周一次或每隔一周地给予的100μg/m²～100,000μg/m²的范围内。在一个期望的实施方式中，治疗有效量在1,000μg/m²～20,000μg/m²的范围内，例如每天、每隔一天、每周两次、每周或每隔一周地给予至少1,000、1,500、4,000或14,000μg/m²的化合物。

以下实施例用于举例说明，而非限制本发明。

实施例1

轭合物的分布和药物动力学

试剂与载体的轭合对该试剂分布的影响可以通过向动物给予标记的多肽或轭合物以及检测该多肽或轭合物的器官分布而加以评价。在一个实施例中，向小鼠给予³H-紫杉醇(5mg/kg)或¹²⁵I-紫杉醇-Angiopep-1(TxlAn-1)(10mg/kg，相当于5mg紫杉醇/kg)。类似的实验可以利用Angiopep-3、Angiopep-4a、Angiopep-4b、Angiopep-5、Angiopep-6和Angiopep-7中任一种实施。这里，未轭合的抗癌剂和轭合物作为推注静脉内注射给小鼠。在不同时间(0.25、0.5、1和4h)收集组织并均质化。为了量化³H-紫杉醇的量，组织匀浆利用组织增溶剂消化，并将10ml液体闪烁剂加入样品中。在不同组织中，在TCA预沉淀之后检测¹²⁵I标记的轭合物的量。对与组织相关的放射活性进行量化。曲线下方的面积(AUC 0-4)利用Prism软件进行估算并对不同组织进行作图。利用Angiopep-1轭合物，获得的轭合物AUC 0-4值高于各种组织(包括脑、肾、肝和眼)中紫杉醇的该值(图10A)，表明相比于未轭合的试剂，这些组织中该轭合物的积累较多。轭合物在肺中的积累显著高于未轭合的试剂(图10B)。

利用紫杉醇-Angiopep-2轭合物进行的类似实验的结果总结在下表4中。尽管与TxlAn-1轭合物获得的结果存在差异，但是表4的轭合物也比未轭合的紫杉醇更有效地在肺、脑和肝中积累。

表4

相当于5mg/kg紫杉醇的治疗。

研究了肺中紫杉醇和紫杉醇-Angiopep-1积累的动力学(图11)。在不同时间检测肺中轭合物的量均显著高于未轭合的试剂。肺中轭合物的积累在不同时间也显著高于其在血清(血浆)中的浓度(图12)。这些结果表明，抗癌剂如紫杉醇的生物分布或药物动力学可以通过轭合至本发明的载体(例如Angiopep-2)而改变。

实施例2

Angiopep-7未有效地转运至脑

Angiopep-7未被有效地转运跨过血脑屏障。在IV注射之后30分钟检测Angiopep-2和Angiopep-7在大鼠脑中的积累，Angiopep-7以低于Angiopep-1或Angiopep-2的水平在脑中存在(图13)。

我们还在原位脑灌注10分钟后利用荧光显微镜考察了Angiopep-2和Angiopep-7在脑中的积累。这里，将各自轭合至Cy5.5荧光标记物的2mM的Angiopep-2或Angiopep-7注射到颈动脉中。然后通过荧光显微镜评价动物的脑。在每一种情况下，毛细血管用Vessel Green(FITC-凝集素)染色，脑细胞的细胞核用DAPI(蓝色)染色，并且Angiopep用Cy5.5标签可视化(图14)。根据这些切片，观察到Angiopep-2定位于脑中，而观察到Angiopep-7定位于毛细血管中。相比于Angiopep-2，在体内还观察到Angiopep-7的脑积累较低。将Angiopep-2和Angiopep-7中每一个均轭合至Cy5.5并给予大鼠。30分钟之后，利用Cy5.5指示剂的荧光检测脑中的积累。基于此，我们推断，Angiopep-7未被有效地转运跨过BBB，而Angiopep-2则有效地跨BBB转运。

实施例3

Angiopep-7有效地转运至肝、肾、肺、脾和肌肉

利用给予如实施例2中所述而轭合至Cy5.5的Angiopep-2或Angiopep-7的大鼠，检测Angiopep-7和Angiopep-2在器官如肝、肾和肺中的水平。在这些器官中，相比于Angiopep-2，观察到相似水平的Angiopep-7多肽。鉴于这些结果，我们认为，Angiopep-7在不期望递送至脑的应用中用于将试剂递送至肝、肾和肺是特别有用的。

为了检测动物中Angiopep-7的浓度，实施了轭合至Cy5.5的Angiopep-7的成像研究。基于注射后30分钟的体内成像研究，在肾、肝和肺中观察到Cy5.5信号的积累(图15A)。Angiopep-7注射后24小时实施了离体器官分析，并与利用Angiopep-2的注射进行对比。这些研究还表明，Angiopep-2和Angiopep-7二者在肝、肺和肾中均有显著积累。然而，相比于Angiopep-2，Angiopep-7在脑中的积累显著较低(图15B)。基于这些结果，我们认为在不期望递送至脑的应用中，Angiopep-7作为用于试剂进入到外周器官如肝、肾、肺、脾或肌肉中的载体是很有用的。

实施例4

IgG轭合物的转运

这些载体的脑摄取利用原位脑灌注实验模型进行检测。结果(下文表5示出)表明，位置10和15处的赖氨酸在这些载体跨过BBB的能力方面是非常重要的。

表5：通过原位脑灌注检测Angiopep的脑摄取

载体	薄壁组织(ml/100g)	相对于Angiopep-1(250nM)的转运，表示为百分数
			Angiopep-1(50nM)	34.9	155.46
Angiopep-1(250nM)	22.45	100.00
			Angiopep-1(二聚体)(250nM)	27.03	120.40
Angiopep-2(250nM)	19.62	87.39
			Angiopep-3(250nM)	17.08	76.08
Angiopep-4a(250nM)	17.57	78.26
			Angiopep-4b(250nM)	12.05	53.67
Angiopep-5(250nM)	11.82	52.65
			Angiopep-6(250nM)	8.64	38.49
Angiopep-7(250nM)	2.99	13.32

Angiopep多肽利用SATA交联剂轭合至IgG并且利用原位脑灌注研究其转运能力。如图16所示，Angiopep-2是脑薄壁组织中最高度分布的轭合物。还看出，多肽二聚体被有效地转运。Angiopep-7则未有效地转运入脑中。

实施例5

轭合物对体外细胞生长的影响

为了对包括载体和抗癌剂的轭合物杀死癌细胞的能力进行测试，实施了体外检测。在一个实施例中，证实紫杉醇(未轭合的)可阻断胶质母细胞瘤细胞(U-87)的增生，其中IC50值为约10nM(图17)。当轭合本文描述的载体时，对紫杉醇轭合物的效果进行评价并与未轭合的紫杉醇进行比较。如表6A所示，紫杉醇-Angiopep-2(TxlAn2)轭合物获得的IC50值在多种癌细胞中与未轭合紫杉醇非常类似。来自大鼠脑的内皮细胞(RBE4)比所测试的癌细胞系的敏感性低。为了进行比较，将获得的结果依据紫杉醇浓度表示。

这些细胞(U-87，U-118，NC1-H460，A549)中的大多数表达LRP。然而，不可获得RBE4细胞的该数据。评估了轭合物针对癌细胞的体外抗增生活性。在这个测定中，癌细胞(U87和U118)暴露于抗癌剂(例如紫杉醇)和轭合物(例如TxlAn2(3∶1))轭合物)48h。在U87和U118细胞中[³H]-胸腺嘧啶的掺入作为该试剂浓度的函数降低。表示为抑制细胞增生50％(IC50)所需的值。从增生测定获得的结果表明，抑制癌细胞增生所需的IC50值以nM表示并且证实TxlAn2(3∶1)轭合物比紫杉酚(paclitaxel)有效3倍，并且当以紫杉酚当量报告时处于相同范围内(表6B)。类似的实验可以利用本文描述的任何载体或轭合物实施。

还估计了轭合物(例如TxlAn2(3∶1)阻断其他癌细胞类型增生的能力。这样的测定可以在肺癌细胞(NC1-H460)和乳腺癌细胞系(MDA-MB231，MDA-MB-468，HCC-1954，BT-474)中以及在肝癌(SK-Hep1)和胶质母细胞瘤(U-87MG)中实施。我们已经证实，这些细胞对于TxlAn2(3∶2)轭合物也是非常敏感的(表6B)。

表6A：轭合物对细胞增生的影响

表6B：紫杉醇和TxlAn2(3∶1)轭合物的体外细胞毒性

实施例6

体内肿瘤生长的抑制(U-87)

轭合物抑制肿瘤生长的能力可以在体内模型中进行评价(例如参见图18A)。U-87细胞皮下植入小鼠的右侧中，并且在植入后第3天，对小鼠注射媒剂(DMSO/Ringer：80/20；对照)、未轭合的试剂(例如紫杉醇(5mg/kg))或作为轭合物一部分的试剂(例如紫杉醇-Angiopep-2(10mg/kg))，相当于5mg紫杉醇/kg)。肿瘤生长抑制在利用所述轭合物治疗的小鼠中比在利用未轭合抗癌剂治疗的小鼠中更显著。

在一个实施例中，在植入后第17天，利用TxlAn2抑制超过75％的肿瘤生长，而利用未轭合试剂抑制34％的肿瘤生长(表7)。因此，在抑制体内肿瘤生长方面轭合物比未轭合试剂更有效。总体来说，相比于未轭合的试剂，轭合物检测到2.2倍的肿瘤生长抑制水平。

表7：利用轭合物对肿瘤生长的抑制

相当于5mg/kg紫杉醇的治疗

^*对应于植入后3天(第1次治疗)

^**对应于植入后17天(4次治疗之后)

实施例7

体内肿瘤生长(肝癌)的抑制

执行体内研究以确定轭合物是否能够抑制皮下植入的肝癌细胞(SK-Hep 1)的生长。裸小鼠在它们的右侧接受2.5x10⁶人SK-Hep1细胞的皮下注射。当植入肿瘤的尺寸达到大约200mm³时开始治疗。动物接受通过腹膜内注射的轭合物或赋形剂进行的治疗。

图18B中示出了利用通过腹膜内注射给予80mg/kg TxlAn2(3∶1)实施的实验的结果；治疗用黑色箭头指示。在这个实验中，以最大指示的80mg/kg剂量一周两次地给予治疗，达5次。腹膜内给予的TxlAn2(3∶1)轭合物在抑制肝癌(一种通常对不敏感的癌症类型)生长方面表现出较高的效力(图18B)。

实施例8

用于评价轭合物活性的方法

以下方法在本文描述的实施例中使用。

细胞增生测定

对于体外细胞增生测定，将2.5～5x10⁴的U87或A549细胞接种在24孔组织培养微板中，含有10％血清的培养基终体积为1ml，并在37℃和5％CO₂下孵育24小时。然后该培养基用无血清培养基替换并孵育过夜。第二天早上，将试剂新鲜地溶解在二甲基亚砜(DMSO)中并且培养基用含有不同浓度该试剂的完全培养基一式三份地替换。DMSO的最终浓度为0.1％。使用的对照是含有细胞但没有试剂的微板。细胞在37℃和5％CO₂下孵育48～72h。孵育之后，更换培养基并用1ml含有[³H]-胸腺嘧啶的完全培养基(1pCi/测定)替换。该板在37℃和5％CO₂下孵育4h。移走培养基，并将细胞37℃下用PBS冲洗。将细胞用乙醇∶乙酸(3∶1)的混合物固定，用水清洗，并利用10％冰冷TCA(三氯乙酸)沉淀3次。最后将500μl PCA(高氯酸)加入孔中并将微板在65℃下加热30min以及在75℃下加热30min。每个孔的内容物然后转移到具有10ml闪烁混合物的闪烁瓶中，并且在液体闪烁计数器Tri-Carb(Packard)上在以CPM(每分钟计数)检测活性。

多肽的碘化

多肽使用来自Sigma的碘代-珠子利用标准步骤进行碘化。简而言之，多肽在0.1M磷酸盐缓冲液pH6.5(PB)中稀释。每种蛋白使用两种碘代-珠子。这些珠子在Whatman过滤器上用3ml的PB清洗两次并重悬于60μl的PB中。将来自Amersham-Pharmaciabiotech的¹²⁵I(1mCi)在室温下加入珠子悬浮液中达5min。每次碘化均通过加入多肽(100μg)启动。室温下孵育10min之后，游离的碘通过HPLC除去。

皮下植入

为了评估轭合物和制剂对肿瘤生长的有效性，我们开发了一种胶质母细胞瘤的皮下模式。在这种模式中，将在100μl包含1％甲基纤维素但没有血清的细胞培养基中的2.5x10⁶个细胞皮下注入小鼠侧面中。肿瘤清楚可见并且可以利用游标卡尺进行测量。估计的肿瘤体积然后作为时间的函数作图。

原位小鼠脑灌注

[¹²⁵I]-多肽至小鼠脑毛细血管内腔侧的摄取利用原位脑灌注方法进行检测，该方法在我们实验室被修改用于研究小鼠脑中的试剂摄取。简而言之，氯胺酮/塞拉嗪(140/8mg/kg，腹膜内)麻醉小鼠的右侧颈总动脉暴露并在颈总动脉二根分叉部的水平处(嘴侧)连接至枕动脉。颈总动脉然后利用填充肝素(25U/ml)且安装在26G针头上的聚乙烯管在嘴侧插入导管。含有灌注液([¹²⁵I]-多肽或[¹⁴C]-菊糖，在Krebs/碳酸氢盐缓冲液中，pH7.4，用95％O₂和5％CO₂充气)的注射器置于输液泵中(Harvard pump PHD 2000；HarvardApparatus)并连接至导管。灌注之前，通过割断心脏的心室而消除对侧血流贡献。以1.15ml/min的流速对脑灌注指定时间。在灌注14.5min之后，用Krebs缓冲液对脑再灌注60s以清洗过量的[¹²⁵I]-蛋白。然后将小鼠断头以终止灌注并将右半球在冰上分离，随后进行毛细血管放血。取匀浆、上清液和沉淀以及灌注液的等分式样，通过TCA沉淀来检测其[¹²⁵I]-轭合物含量及评价分布的表观体积。

实施例9

轭合物的作用机制

还可以实施轭合治疗剂的作用机制研究。在一个实施例中，肺癌细胞(NCI-H460)利用游离紫杉醇(30nM)或紫杉醇轭合物(例如TxlAn2 10nM；相当于30nM的紫杉醇；图19))孵育24h。在细胞利用连接于FITC的第二抗体标记β-微管蛋白之后，在可见和荧光模型中照相。在该实施例中，紫杉醇和紫杉醇轭合物对β-微管蛋白具有类似作用，导致其聚合。如图20中例举的，紫杉醇和紫杉醇轭合物的加入诱导NCI-H460细胞阻断于G2/M阶段。这些结果表明，TxlAn轭合物与紫杉醇一样对癌细胞具有类似的作用机制。

实施例10

轭合物的制备

试剂与本文描述的载体的轭合在图23A-23B中例举。在该实施例中，紫杉醇首先活化到N-琥珀酰亚胺(2’-NHS-Txl)衍生物中。例如在载体中存在的胺(例如氨基末端胺或赖氨酸残基)在活化的紫杉醇上反应而形成肽键(酰胺键)。如果多个胺可利用，则该反应产生轭合物的多种组合，例如将1、2或3种紫杉醇加入多肽中，取决于使用摩尔比。轭合产物通过HPLC进行分析，并且通过质谱(Maldi-Tof)进行确认。发现紫杉醇通过利用酯酶切割酯键而可从载体释放。

本文中描述的任何载体均可以利用这种方法轭合至一种试剂。TxlAn2(3∶1)轭合物的生产通过直接向2.5mol当量的2’-NHS-紫杉醇溶液中加入1mol当量的TxlAn2(3∶1)进行。反应于12℃在林格溶液(pH7.3)的68％DMSO中进行1h。在移走冷浴之后，允许反应在室温下持续约22h(图24)。Angiopep-2、2’-NHS-紫杉醇和TxlAn2(3∶1)轭合物通过箭头在色谱图上示出。反应的等分式样进行取样并如图24所示的在25min、2h 15min、5h和23h之后通过HPLC进行分析。Angiopep-2、2’-NHS-紫杉醇和TxlAn2(3∶1)轭合物的峰在色谱图上通过箭头示出。图24的结果表明反应期间Angiopep-2和2’-NHS-紫杉醇消失，主要对(mainly)TxlAn2(3∶1)轭合物的益处。

这种产物的混合物通过使用AKTA-探测器，以4ml/min流速、在RPC 300mm柱上的疏水性层析进行分离(图25)。对于对应于TxlAn2(3∶1)轭合物的峰值，汇集馏分，通过HPLC和MS分析。在图25中，上部层析对应于在t＝23h的运行反应，而下部层析则对应于TxlAn2(3∶1)轭合物，其已经在AKTA纯化之后通过质谱确认(MW5107)。

实施例11

抗体轭合和摄取

抗体可以轭合至抑肽酶，如美国专利申请公开案No.2006/0189515中所描述的。类似的结果可以利用本文描述的任何载体获得。

因此，我们利用SATA将Angiopep-2轭合至IgG。在轭合之后，将约3～5个分子的Angiopep-2结合于IgG的轻链和重链(图26)。因此，利用这种方法，预期对每个分子的抗体(重链和轻链)轭合2～6个分子的载体(例如Angiopep-1，Angiopep-2)。

还实施了利用硫代-EMCS的Angiopep-2轭合，如图4所示。利用EMCS-Angiopep-2，经由巯基偶接的IgG-Angiopep-2轭合物的脑分布在各种脑组织(总体脑，毛细血管，薄壁组织)中进行测试。[¹²⁵I]-IgG-Angiopep-2轭合物的脑摄取高于未轭合的[¹²⁵I]-IgG(大约3倍差异)(参见图27)。因此，与Angiopep-2的轭合在体内增加了IgG的脑内积累。

利用SATA方法偶接的Angiopep-2-IgG轭合物的转运还利用原位脑灌注实验进行测试。IgG-An2轭合物被转运入脑组织中(图28)。IgG-Angiopep-2轭合物在薄壁组织中的积累比IgG高约50倍。

在IgG与载体轭合之后，实施SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫检测和放射自显影以确保正确的轭合；例如参见图29，其示出了仅检测到[¹²⁵I]-IgG-Angiopep轭合物，而无游离Angiopep-2轭合物的证据，证明了该轭合途径的效力。

实施例12

抗-EGFR抗体与载体的偶接

经由表皮生长因子受体的信号转导诱导细胞增生性信号并且与正常细胞转化成恶性细胞相关。EGFR中的多个突变可以在肿瘤细胞中检测到。EGFR的最常见突变之一是EGFRvIII突变，其中氨基酸6-273缺失。

为了证实本发明载体与不同于IgG的抗体的偶接是可能的，以及该偶接保持抗体功能，利用交联剂SATA作为示例性治疗性多肽，将EGFR抗体(可从ATCC获得的单克隆528)交联于载体。偶接的EGFR抗体的生物学活性通过EGFR染色阳性的U87细胞进行测试。通过FACS分析，利用未偶接和偶接的EGFR抗体，证实了EGFR在U87中的类似检测(图30)，表明本发明载体与抗体的偶接不改变其活性。

在表8中，我们示出了抗体未由于轭合而被灭活并且在体外测定中提供相同的结合亲和性。

表8：通过FACS进行轭合物与EGFR受体结合的动力学分析

	抗-EGFR	抗-EGFR-Angiopep-2
			B_max(RFU)	23.6	22.0
半饱和(nM)	1.7	1.8

随后利用标记的轭合物检测EGFR抗体轭合物(例如抗-EGFR-Angiopep-2)跨BBB的转运。抗-[¹²⁵I]-EGFR-Angiopep-2摄取到小鼠脑毛细血管内腔侧利用原位脑灌注方法进行检测，如图31所示。在所有测试的组织中，对[¹²⁵I]-EGFR-Angiopep-2轭合物的脑摄取高于未轭合的[¹²⁵I]-EGFR Ab。因此，EGFR Ab与Angiopep-2的轭合增加其在体内脑薄壁组织中的积累。这些轭合物代表感兴趣的途径，因为若干不同肿瘤类型表现出以不同水平表达EGFR(参见表9)。

表9

肿瘤类型	具有表达的EGFR的肿瘤(％)
		头颈	90-95
乳腺	82-90
		肾癌	76-89
子宫颈/子宫	90
		食管	43-89
胰腺	30-89
		非小细胞肺	40-80
前列腺	40-80
		结肠	25-77
卵巢	35-70
		胶质瘤	40-63
膀胱	31-48
		胃	4-33

实施例13

抗-EGFR抗体与载体的偶接和转运

为了进一步证实抗体偶接至本发明载体的通用性和可应用性，使用了另一种示例性治疗用抗体阿瓦斯丁(Avastin)。阿瓦斯丁是一种可从Roche Biochemical获得的抗-VEGF的重组人源化单克隆IgG1κ亚型抗体，其结合并抑制血管内皮生长因子(VEGF)的生物学活性形式。

轭合之后，利用原位脑灌注方法检测阿瓦斯丁轭合物跨BBB的转运。对[¹²⁵I]-阿瓦斯丁-Angiopep-2轭合物脑摄取高于比未轭合[¹²⁵I]-阿瓦斯丁。因此，治疗用抗体(如阿瓦斯丁或Mab 528，可从ATCC获得)与载体(例如Angiopep-1、-2、-3、-4a、-4b、5和6)的轭合是一种对其转运入脑中的有用策略。

实施例14

二聚体转运

载体二聚体也可以被转运。在一个实施例中，Angiopep-1在4℃下孵育至少12h，由此使该多肽多聚化/二聚化。在体外评价Angiopep-1二聚体的胞转能力。Angiopep-1二聚体比IgG的胞转更好。此外，如表5示出的，Angiopep-1的二聚体形式表现出的分布体积高于Angiopep-1。因此，载体二聚体可以跨BBB转运。

实施例15

抗体与多于一种载体的轭合

通常，每一个分子的抗体(重链和轻链)与1～6个分子的载体之间产生交联反应。

Angiopep-2与IgG的轭合水平利用一种测定进行评估，其中这种测定在与Angiopep-2的N端上的马来酰亚胺基团反应之前和之后，允许在IgG的胺上的SATA去保护之后滴定巯基基团的量。通过改变在轭合方案中使用的不同反应物的相对浓度，轭合至IgG的Angiopep-2的量可以进行优化。

利用体内脑灌注实验，轭合水平越高，则轭合物的薄壁组织摄取越高(图33)。因此，期望每个分子具有更大数量的载体。同样，可以使用超过6个的载体用于将化合物(试剂)跨BBB转运。

其他实施方式

本申请中提到的每一个出版物、专利和专利申请的内容通过引用结合于此，包括于2007年5月29日提交的美国申请No.11/807,597和于2007年5月30日提交的11/807,917，以及于2007年12月20日提交的美国临时申请No.61/008,825。

尽管在本文中已经详细描述了本发明并在附图中举例说明，但是应当理解，本发明不局限于本文描述的实施方式并且在不背离本发明的范围和精神的情况下可以实现各种变化和改良。

虽然本发明已经结合其具体实施方式进行了描述，但是应当理解，总体上依照本发明的原理，其能够进一步更改并且本申请计划覆盖本发明的任何变形、用途或修改，并且包括这样的根据本披露内容的变更，如来自本发明所属技术领域中已知或常规实践和如可以应用于上文提出的基本特征以及如依据所附权利要求的范围作出的变更。

Claims

1.一种多肽，由SEQ ID NO:112的氨基酸序列构成，其中所述多肽被有效地转运到选自由肝、肺、脾、肾和肌肉组成的组中的至少一种细胞或组织，但未被有效地转运跨过血脑屏障。

2.一种组合物，包含权利要求1所述的多肽。

3.根据权利要求2所述的组合物，包含药用载体。

4.一种轭合物，包含：

(a)由权利要求1所述的多肽构成的载体；以及

(b)治疗剂、诊断剂或可检测标签，其中所述治疗剂或标签轭合于所述载体。

5.根据权利要求4所述的轭合物，其中，所述载体轭合于一种治疗剂。

6.根据权利要求5所述的轭合物，其中，所述治疗剂是一种抗癌剂。

7.根据权利要求6所述的轭合物，其中，所述抗癌剂选自由阿巴瑞克、阿地白介素、阿伦珠单抗、阿利维A酸、别嘌呤醇、六甲密胺、氨磷汀、阿那白滞素、阿那曲唑、三氧化二砷、天冬酰胺酶、阿扎胞苷、BCG活疫苗、北伐单抗、贝沙罗汀、博来霉素、硼替佐米、白消安、卡普睾酮、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、塞来考昔、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯法拉滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、放线菌素D、达肝素、达依泊汀α、达沙替尼、柔红霉素、道诺霉素、地西他滨、地尼白介素、地尼白介素2、右雷佐生、多西紫杉醇、多柔比星、丙酸甲雄烷酮、艾库组单抗、表柔比星、阿法依伯汀、埃罗替尼、雌氮芥、依托泊甙、依西美坦、芬太尼、非格司亭、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、5-FU、氟维司群、吉非替尼、吉西他滨、吉姆单抗、奥佐米星、戈舍瑞林、组氨瑞林、羟基脲、替伊莫单抗、伊比达星、异环磷酰胺、伊马替尼、干扰素α-2b、伊立替康、二甲苯磺酸拉帕替尼、来那度胺、来曲唑、甲酰四氢叶酸、亮丙瑞林、左旋咪唑、洛莫司汀、CCNU、氮芥、甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、美司钠、甲氨喋呤、甲氧沙林、丝裂霉素C、米托坦、米托蒽醌、苯丙酸诺龙、奈拉滨、诺非单抗、奥普瑞白介素、奥沙利铂、紫杉酚、帕利夫明、帕玛二磷酸、帕尼单抗、培加酶、培门冬酶、聚乙二醇化非格司亭、培干扰素α-2b、培美曲塞、喷司他丁、哌泊溴烷、普利霉素、卟菲尔钠、丙卡巴肼、奎纳克林、拉布立酶、利妥昔单抗、沙镉司亭、索拉菲尼、链脲菌素、舒尼替尼、舒尼替尼马来酸盐、滑石、他莫西芬、替莫唑胺、替尼泊甙、睾内酯、沙立度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、托泊替坎、托瑞米芬、Tositumomab/I-131、曲妥珠单抗、维a酸、尿嘧啶氮芥、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、伏林司他、唑来膦酸盐和唑来膦酸组成的组。

8.根据权利要求7所述的轭合物，其中，所述治疗剂是紫杉酚。

9.根据权利要求6所述的轭合物，其中，所述治疗剂是一种抗体。

10.根据权利要求9所述的轭合物，其中，所述抗体选自由ABX-EGF、OvaRex、Theragyn、Therex、比伐单抗、Panorex、ReoPro、Bexxar、独特型105AD7、赫赛汀、利妥昔单抗、阿瓦斯丁、E-26、泽娃灵、西妥昔单抗、BEC2、IMC-1Cl1、LymphoCide、LymphoCide Y-90、HumaRAD-HN、MDX-101、MDX-210、Vitaxin、MAb425、Campath、Oncolym+碘-131、Cotara+碘-131、C215+金黄色葡萄球菌肠毒素、Nuvion、SMART M195、SMART 1D10、CEAVac、TriGem、TriAb、NovoMAb-G2放射标记的、Monopharm C、GlioMAb-H+白树素毒素和ING-1组成的组。

11.根据权利要求4所述的轭合物，其中，相比于未轭合于所述载体时的所述试剂或标签，所述轭合物在肝、肺、肾或脾细胞中积累更迅速、积累浓度更高，且表现出减少的P-gp介导的外排。

12.一种组合物，包含权利要求4所述的轭合物以及药用载体。

13.权利要求6所述的轭合物在制备用于治疗患有癌症的对象的药物中的应用。

14.根据权利要求13所述的应用，其中，所癌症是肺癌、肝癌、肾癌或脾脏癌症。

15.根据权利要求13所述的应用，其中，所述癌症选自由肝细胞癌、乳腺癌、头部和颈部的癌症、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、子宫癌、结直肠癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、皮肤癌、脂肪肉瘤、上皮癌、肾细胞癌、胆囊腺癌、耳下腺癌、子宫内膜肉瘤和多药耐药性癌组成的组。

16.根据权利要求15所述的应用，其中，所述头部和颈部的癌症是喉癌、视网膜癌、食管癌、或鼻咽癌。

17.根据权利要求15所述的应用，其中，所述淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤。

18.根据权利要求17所述的应用，其中，所述非霍奇金淋巴瘤是外套细胞淋巴瘤。

19.根据权利要求15所述的应用，其中，所述皮肤癌是鳞状细胞癌或黑色素瘤。

20.根据权利要求15所述的应用，其中，所述肺癌是非小细胞肺癌或腺瘤。

21.根据权利要求15所述的应用，其中，所述子宫癌是宫颈癌。

22.根据权利要求13所述的应用，其中，所述抗癌剂是紫杉酚。

23.根据权利要求13所述的应用，其中，相比于未轭合至所述多肽时的所述抗癌剂，当轭合于所述多肽时，所述抗癌剂的效力增加或副作用减少。

24.根据权利要求13所述的应用，其中，所述对象是人。