JPH06506218A - ポリペプチドのｐｅｇ化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、メトキシポリエチレングリコールのような長鎖のポリマーに共有結合 したポリペプチドに関する。

本発明は、種々の生物学的に重要なポリペプチドと、活性化されたポリマー分子 との反応に関する方法と試薬も記述する。

本発明の背景 ヒｈ及び動物の資源から同定され、単離された多くの蛋白質は、■望な医薬的、 または治療的潜在性を示すことか見出されている。このような蛋白質を、比較的 紗枠な形で、そして比較的多量に生産する方法に加えて、このような蛋白質を同 定し、特徴づけるための方法に大幅な進歩がみられた。開発の過程は、このよう な潜在的に価値ある物質の利用と関連して進歩するにつれて、臨床的モデルにお いて使用するために、これらの化合物を製剤化する上て多くの障害か生じている 。

例えば、多くのこのような蛋白質は、血清中において半減期が極めて短いことか 見出されている。その大部分について、蛋白質は、腎臓を通って血清からクリア ーされる。比較的多量の蛋白質、特にヒトのシステムに対して、外来の蛋白質の 体系的導入により、他の問題の外に、免疫複合体による蛋白質の体内からの急速 な除去につながると思われる免疫反応を生し得る。他の蛋白質については、溶解 性と凝集の問題も該蛋白質の最適製剤化を妨げている。

これらの問題に取組む最も有望な技術の１つは、１つ以上の不活性ポリマー鎖を 問題となっているポリペプチド類に共有結合させることであった。最も普通に使 用されるポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、または、モノメトキ シルポリエチレングリコール（ｍＰＧＥ）である。例えは、Ｄａｖｉｓら、　Ｂ ｉｏｍｅｄｉｃａｌｐｏｌｙｍｅｒｓ　：　Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ　Ｍａｔｅｒｉ ａｌｓ　ａｎｄ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓｆｏｒ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ ｌ　Ｕｓｅ、　４４１−４５１頁（１９８０）を参照。ＰＥＧは、その無毒性が 証明されているために、これらの目的には理想的である。池の研究者は、同様な 目的のために、ポリオキシエチル化グリセロール（ＰＯＧ）を利用している。Ｋ ｎａｕｆら、Ｊ、ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇ、Ｃｈｅｍ。

ｖｏｌ、２６３．１５０６４頁（１９８８）を参照。

ポリエチレングリコールで蛋白質を共役結合によって修飾（“ＰＥＧ化“）した ため、該蛋白質に対して望ましい特性か付加された数多くの結果が記載されてい る。

例えば、ＩＬ−２のＰＥＧ化は、そのサイトカインの活性に有意に影響すること なく、ＩＬ−２のクリアランスを減少させることか示されている。クリアランス の減少は、ＰＥＧと結合していない物質よりも効率か増加することにつながる。

Ｋａｔｒｅら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ｕ、ｓ、八、ｖｏｌ、　８４．　１４８７　頁　（１９８７）　。

スーパーオギサイドジスムターゼ（ＳＯＤ）の血清中の半減期を増加させること は、種々の症状を治療するためのＳＯＤの使用にとって決定的な障壁となってい る。

ＳＯＤのＰＥＧ化がクリアランス速度の減少を生ずることが、多くの研究によっ て示されている。例えば、Ｃｏｎｆｏｒｔｉら、Ｐｈａｒｍ、　Ｒｅ５ｅａｒｃ ｈ　Ｃｏｍｍｕｎ、ｖｏｌ、　１９　、　２８７頁（１９８７）参照。

イムノグロブリンＧ（ＴｇＧ）の凝集は、静脈内にＩｇＧか投与される患者に対 する深刻な副作用につながる要因として仮定されている。ＩｇＧのＰＥＧ化によ って蛋白質の凝集か減少し、この問題を妨げることが示された。５ｕｚｕｋｉら 、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　ｖｏｌ、７８８゜２４８頁 （１９８４）。

ＰＥＧ化の技術によって、蛋白質の免疫原性に影響することができることも示さ れた。Ａｂｕｃｈｏｕｓｋｉと共同研究者か、ＰＥＧ化ウソ肝臓カタラーゼの免 疫性と循環ライフを研究している。Ａｂｕｃｈｏｗｓｋ　ｉら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ 、　ＣＩ＋ｅｍ、　ｖｏｌ。

２５２．３５８２頁（１９７７）。

これら、種々の蛋白質にＰＥＧ基を付加すると、ＰＥＧ化蛋白質の分−Ｐｌの大 きさが増加するため、クリアランスか減少する。ある大きさまでは、蛋白質の糸 球体濾過速度は、蛋白質の大きさに逆比例している。したがって、ＰＥＧ化のク リアランスを減少する能力は、蛋白質にいくつのＰＥＧ基かついているかの関数 ではなく、変化した蛋白質の全体の分子量の関数である。このことは、ＰＥＧＩ ＩＩＩＭの大きさによってもＩＬ−２に結合したＰＥＧの数によっても、変動し たクリアランスの検討によって支持されている。にａｔｒｅ、上記。

クリアランス、免疫原性、凝集及び物理的性質に関連したＰＥＧ化蛋白質の種々 の研究によって、すべて、ＰＥＧが該蛋白質の周りにフレキシブルで親水性の殻 を形成していることか示唆されている。ＰＥＧ鎖は、高度に加水されており、Ｐ ＥＧ化蛋白質に予測されるであろうよりも高い見かけ上の分子量を与え、蛋白質 上の荷電を遮蔽するように作用する。

この分野においてみられた多くの有望な結果のために、ＰＥＧユニットのポリペ プチドへの結合のための手順の便覧が開発されている。これらの手順における鍵 となる要素は、ポリエチレングリコールの末端−〇Ｈ基の“活性化”である。こ のような活性化が、ＰＥＧ基とポリペプチドとの間に結合を創製する上で必要で ある。結合手順の大多数は、ポリペプチドの遊離の一級アミノ基と反応させるた め、ＰＥ０部分を活性化する。これらの遊離アミンの大部分は、リジンアミノ酸 残基中に見出される。

一般的実行においては、複数のＰＥ０部分が蛋白質につなげられる。例えば、Ｄ ａｖｉｓらの米国特許第Ｎｏ、４゜１７９．３３７において、免疫原性を抑制す るためには、ポリペプチドのモルあたり１５と５０モルの間のポリマーを使用す ることが望ましいことか見出された。

複数ＰＥＧ鎖か、一般的に各ポリペプチドに結合され、各蛋白質には、典型的に は多数のりジン残基か存在するために、均質性の反応成績物を生じさせるために 、蛋白質をＰＥＧ化する努力は殆と払われていない。Ｇｏｏｄｓｏｎら、Ｒｉｏ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ、８．　３４３頁（１９９０）。

Ｓｔｒａｗの米国特許Ｎｏ、４，９０４．５８４参照。この反応の特異性の欠除 によって、無数の複雑性か生ずる。これらの中には、ＰＥＧ化の結果、しばしば 蛋白質の重大な活性の喪失を生ずることが挙げられる。決定的に重要なリジン酸 基への結合か、おそらく蛋白質の活性部位を変化させ、それを不活性化するので あろう。

言い換えれは、比較的小さい基質は蛋白質に近づくことかできると思われるか、 より大きな基質と反応する蛋白質の活性は、ランダムＰＥＧ化によって劇的に影 響されることかできる。Ｄａｖｉｓら、上記。このような蛋白質の部位選択的に ＰＥＧ化により、活性の喪失なしにＰＥＧ化の望ましい特性を獲得する修飾され た物質につながることか可能であろう。その上、もしＰＥＧ化蛋白質の治療的使 用が意図されるならば、非特異的ＰＥＧ化から生ずる複数の分子種の混合物は再 現性があり、特徴付けができる特性を有する生成物を調整する上での困難につな がる。このことによって、治療剤を評価し、有効性と投与情報を確立することは 極度に困難になる。

ある場合においては、２つ以上の生物学的ペプチド、または薬物を含む複合多量 体の投与が、相乗効果の利点につながることがあり得る。例えば、２つの同一の 結合ポリペプチドを含む複合体は、それが単量体ポリペプチドに比較して、それ か結合するリガンド、または活性部位への親和性が少なからず増強されることが ある。この理由から、蛋白質の複合多量体は、複合体の分子量を増加する外に該 蛋白質の親和性を増加するために望ましいことかあり得る。

蛋白質は、それらの生物学的効果を、他の蛋白質との相互作用を通して達成する ことが多い。２つの蛋白質の単純な複合体が、生物学的効果を達成するのに十分 である場合には、外因性蛋白質を投与することによって、内因性蛋白質の生物学 的効果を模倣することが可能であることが証明された。しかし、生物学的効果が 、３つ以上の蛋白質を含む複合体の集合を必要とする場合では、より高次の複合 体は不安定なことか多いので、遺伝子組換えの技術によって生産された外因性等 個物で、内因性蛋白質の機能を模倣することはもっと困難である。このような場 合には、生物学的に活性な複合体を模倣するために、複合体の２つの成分を含む 架橋分子種を使用することが有益なことがある。

本明細において記述された発明に続いて、少くとも３つの研究グループが、架橋 結合を有する蛋白質の産生を記述した。その蛋白質では、ＴＮＦ受容体の１つの 細胞外部分が、ヒトまたはマウスのＩｇＧの重鎮に結合されている。それは、次 に、ジスルフィド結合を通じて架橋される。Ｐｅｐｐｅｌら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　 Ｍｅｄ、　ｖｏｌ、１７４．　１４８３頁（１９９１）　；　Ａｓｈｋｅｎａｚ ｉ　ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

４頁（１９９１）。各々の場合において、蛋白質は、動物細胞の発現システムに おいて発現された。そして、ＴＮＦを阻害することにおいて、単量体の可溶性受 容体単独よりも少なからずより効果があった。同様な手順が、ＣＤ４蛋白質、（ Ｂｙｒｎら、Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　ｖｏｌ、　３４４　。

６６７頁（１９９０））ＣＲＩ蛋白質、（Ｋａｌｌｉ　ｅ。

Ｊ、Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　ｖｏｌ、　ｌ　７４．　ｌ　４５１頁（１９９１）； Ｈｅｂｅｌｌら、ＷＯ９１／１６４３７　（１９９１））及びＣＲ２蛋白質。（ Ｈｅｂｅｌｌら、５ｃｉｅｎｃｅ、　ｖｏｌ、２５４．　１０２頁（１９９１） ）の同様な架橋蛋白質を産生ずるためにも使用された。

ｍ−２のポリペプチド単位とＩｇＧ抗体の一部から構築されたｍ＝これらの架橋 蛋白質は、治療剤として有望であることか示された。架橋結合した蛋白質は、分 子量が増加しており、それは、それらの蛋白質のりガントへの親和性を明らかに 増強することの外に、身体からの複合体のクリアランス速度を減少するように働 く。しかし、このやり方で架橋結合した蛋白質は、これまて融合遺伝子の発現に よって、動物細胞の発現系による発現によってのみ調製された。これは、発現後 、該蛋白質のＩｇＧ部分が適切に折りたためられるためには必要であった。

その上、ポリペプチド単位の間のスペーサー、またはリンカ−として作用するＩ ｇＧ抗体の同定された重鎮の部分は、該スペーサーの長さ、大きさ、または幾何 学を変化する能力を許容しない。二重体蛋白質によって達成される明らかな相乗 作用を考慮すると、ポリペプチドの空間的方向性を変化させることによって相乗 効果的利益が最適化されることはありそうである。そして最後に、該架橋結合蛋 白質は、抗原性があることがあり、そして／または、溶解性が減少している。抗 体の重鎮は、生物学的に不活性ではない。

他の二重性、または“二価性”の複合体が記載されている。二重体化合物のこの ようなグループ標識されたヒルログであった。これらの化合物は、短かいポリグ リシンスペーサー、またはリンカ−によって結合されている極めて短かいポリペ プチドから成っている。ポリペプチド単位の１つは、トロンビン阻害剤でありｍ −６５アミノ酸からなる蛋白質であるヒルジンから取った５つのアミノ酸配列− 一そして、他のポリペプチドは、陰イオン結合エキソサイト（Ａ　Ｂ　Ｅ）認識 の阻害剤である。

Ｍａｒｇｎｏｒｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｖｏｌ、　２９　、　７０８ ５頁、（１９９０）　；　Ｂｏｕｒｄｏｎ　ら、ＦＥＢＳ　ｖｏｌ、２９４．１ ６３頁（１９９１）。

Ｃ−反応性蛋白質（ＣＲＰ）は、五つの同一の２３ＫＤａのサブユニットからな った急性期の血清蛋白質である。ＣＲＰは、沈澱および凝集の反応を誘発し、古 典的な補体の経路を活性化合物するためＣＩ！ｇと反応することもてきる。架橋 結合したＣＲＰのオリゴマーか、ヒス（スルホサクシニミジル）ズベレート、ま たは３゜３′−ジチオ（スルホサクシニミジルプロピオネート）を架橋結合剤と して使用し、生成された。Ｊｉａｎｇ　立ユＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ｖｏｌ、　 ７４　、７２５頁（１９９１）。

オポイト受容体を標的とする二量体、または二価のリガンドの生成も検討された 。非ペプチド性のβ−ナルトレキサミン、またはオキシモルフアミンファルマコ フォアは、短かいエチレンオキサイド、またはグリシンスペーサーによって結合 された。Ｅｒｅｚら、Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｃｈｅｍ。

ｖｏｌ−２５，８４７頁（＋　９８２　）　；　ＰｏｒｔｏｇｈｅｓｅＧ。

Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｃｈｅｍ、　ｖｏｌ、　２９　、１８５５頁（１９８６）。短 かいメチレン架橋結合されたテトラペプチドエンケファリンもオボイドを標的と してデザインされ、元のデルタ−リガンドよりもデルタ−受容体に対してより大 きな選択性と親和性を有することが示された。Ｓｈｉｍｏｈｉｇａｓ旧−チェＮ ａｔｕｒｅ　ｖｏｌ、　Ｉ　９　Ｌ　３３３頁（１９８２）。

細胞表面の糖蛋白であるＣＤ４も、糖をベースとした架橋政策によって、多量体 の形て産生された。利用された架橋剤は、ビスマレイミドヘキサン（ＢＨＭ）で あった。Ｃｈｅｎら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、ｖｏｌ、２６６、　１８２３７ 頁（＋９９１）。

リンパ球機能関連アンチゲン−３（ＬＦＡ−３）は、Ｔリンパ球ＣＤ２に対する リガンドである広く分布している細胞表面の糖蛋白である。ＬＦＡ−３は、その 随伴リピッドとともに、８つの単量体の蛋白質ミセルを形成し、それは、細胞表 面上のＣＤ２をもつ細胞と結合する能力か増加した。Ｄｕｓｔｉｎら、Ｊ、　Ｅ ｘｐ、　Ｍｅｄ、、　ｖｏｌ、　１６９゜５０３頁（１９８９）。

幾分関係のある技術において、１つのグループか、ペンタペプチンル単位の反復 からなる合成ポリペプチドの阻害効果を検討した。本ポリマーは、ジフェニルホ スフオリルアシトでの重合手順によって、約ｔｏ、ｏｏｏドルトンの大きさへと 合成された。重合したペンタペプチドは、いくつかの生物学的応答の必須の構造 の１つである。Ｍｏｒａｔａら、Ｉｎ５ｔ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｍａｃｒｏｍｏｌ、 ｖｏｌ、　ｌ　１．　９７頁（１９８９）。

内因物質を増強するか拮抗するために効果的な蛋白質を開発する上でのさらなる 障害物は、外因性蛋白質は適切な場所に局在させるのではなく、体系的に投与し なけれはならないということである。これは、低い有効性と副作用の増加へとつ ながり得る。いくつかのグループは、生物活性蛋白質を、これらの部位に自然に 帰ってくる他の蛋白質に結合させることによって、適切な標的部位に配送するこ とを報告している。このような結合は、活性及び標的蛋白質間の遺伝子融合を通 して作られることが多い。

ポリエチレングリコールスペーサー、またはリンカ一単位か、本発明の日付けの 後に、抗体を標的とした超抗原を創製するのに用いられた。結腸の癌腫細胞に対 して反応性の抗体が、細菌の超抗原ブドウ球菌のエンテロトキシンにつなげられ た。他の二価性の複合体と関連した利益を活用する（例えば、より高い分子量： 二価性の相乗効果）ようにデザインされたのではなく、これらの複合体は超抗原 を特定の部位に配達するようにデザインされる。これらの標的に運ばれる超抗原 を形成するために記述されたＰＥＧ化の手順は、物質の大きな混合物を含む複合 体を創製する。抗体と超抗原との結合は、Ｎ−サクシニミジル３−（２−ピリジ ルチオ）プロピオネートと、２４一原子の長さのＰＥＧに基づいた親水性スペー スによって成就された。この手順によれば、７から１８のスペーサーが、各抗体 の単位につなげられ、超抗原の各々の上の一つか二つのリジンが反応させられた 。

Ｄｏｈｌｓｔｅｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　ＵＳＡ　ｖｏｌ 、　８８　、　９２８７頁（１９９１年ｌθ月）。この手順を使用すると、成績 物、または手順を最適にするために、単一の分子種を単離することは不可能てあ ろう。

広い範囲の医学的適応性に対して有意な適用を有する２つのグループの蛋白様物 質には、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）阻害剤とインターロイキン−１受容体のアンタ ボニス１−（Ｉｆｆ−１ｒａ）がある。これらの物質は、それぞれ、ＴＮＦ及び ＩＬ−１媒介疾患の治療において有益な効果かあることか示された。それぞれ、 ＴＮＦによって媒介されているか、ＩＬ−１によって媒介されているかのいずれ かとして確認された適応症のなかには、成人呼吸窮迫症候群、肺線維症、慢性リ ュウマチ、炎症性腸疾患、及び細菌性ショックがある。

２７４には、天然に存在する一群の蛋白様ＴＮＦ阻害剤、及び高い純度をもった 同じものを、少なからぬ量だけ製造する方法が記述されている。特に、上に述べ た出願には、３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤と、４０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤と呼ばれ るＴＮＦ阻害剤の２つのサブセットが詳述されている。全長の４０ＫＤａ　ＴＮ Ｆ阻害剤の外に、４０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤の２つの、先端が切られた、けれど もなお活性を有する形も産生された。全長の蛋白質から５１番目と５３番目のカ ルボキシ末端アミノ酸が除去されているこれらの蛋白質は：それぞれ４０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤△５１と４０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤△５３と呼ばれる。

特に参照によって組み込まれている１９９０年４月６日に出願された同時系属米 国特許出願Ｎｏ、０７１５０６．５２２には、好ましいクラスの天然に存在する 蛋白様１ｆ−１阻害剤と、高純度の同じものの少なからぬ量を製造する方法が記 載されている。特に該出願は、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（Ｉ Ｌ−１ｒａ’　ｓ）すなわち、ＩＬ−１ｒａｃｚ、ＩＬ−Ｉｒａβ、及びＩＬ− １ｒａｘである３つのこのようなインターロイキン−■の阻害剤か、詳細に記述 されている。

様々な医学的適応症の治療に潜在的に有用であるさらなる２つのクラスの物質は 、インターロイキン−２阻害剤と補体の阻害剤である。インターロイキン−２の 潜在的に有力な阻害剤には、インターロイキン−２受容体、インターロイキン− ２受容体の細胞外部分、インターロイキン−２受容体アンタゴニスト、インター ロイキン−２を認識する抗体、およびＩＬ−２結合機能を含むこのような種のい ずれかの断片が含まれる。補体系の潜在能力のある阻害剤には、受容体ＣＲＩ、 ＣＲＩの細胞外部分、及び補体結合機能を含むＣＲＩの断片がある。

インターロイキン−２受容体は記載され、その単離法て開示されている。インタ ーロイキン−２受容体をコードしている遺伝子とその組み換え技術による産生の 方法４．５５１頁（１９８９）も参照。

いずれかのインターロイキン−２受容体の細胞外の可溶領域は、サイトカインで あるインターロイキン−２の作用に対する阻害剤として、ある程度作用すると推 定できるであろう。インターロイキン−２は、１９２３球の抗原特異的なりロー ナル増殖において、極めて重要な役割を演することか知られている最もよく特徴 付けられたサイトカインの一つである。インターロイキン−２は、免疫系におけ る様々な他の細胞に対して作用することも知られている。

ＩＬ−２ｒα、及びＩＬ−２ｒβと命名された二つの区別できる受容体分子から なるインターロイキン受容体の３つの別個の形がある。

最高親和性ＩＬ−２受容体は、２つの区別できるＩＬ−２受容体からなる。これ ら受容体の両方ともクローニングされ、特徴付けられている。低親和性ＩＬ−２ 受容体（ＩＬ−２ｒａ）は、１９８４年にクローニングが行胞外領域は、２４， ８２５の分子量を有し、２つのＮ−結合グリコシル化の部位を有している。該分 子は１１このシスティン残基を有し、その中ｌＯこは分子内ジスルフィド結合に 関与している。分子上の推定上のＩＬ−２結合領域は、突然変異誘発とエピトー プマツピングによってマツピングが行われた。中程度の親和性のＩＬ−２受容体 （ＩＬ−２ｒβ）は、１９８９年にクローニングされたか、ＩＬ−２ｒαはと完 全には特徴付けられていない。Ｈａｔａｋａｙａｍａら、５ｃｉｅｎｃｅ　ｖｏ ｌ、　２４４　、　５５１頁（１９８９）。ＩＬ−２ｒβの細胞外領域は、分子 量が２４．６９３である。該分子は、８このシスティン残基を有し、４このＮ− 結合グリコシル化部位を含んでいる。

分子中のジスルフィド結合は分っていない。ＩＬ−２ｒβは、２８６アミノ酸か らなる原形質領域を存している。

ＩＬ−２受容体類に対する解離定数（Ｋａ’　ｓ）が定量された。それらは、Ｉ Ｌ−２ｒαに対してはｔｏ−”Ｍ。

ＩＬ−２ｒβに対しては１０−”Ｍ、そして、ＩＬ−２ｒα、ＩＬ−２ｒβ、及 びＩＬ−２の複合体からなる高親和性の受容体に対しては、１０−”Ｍである。

現在のモデルからは、高親和性複合体の形成は、第１にＩＬ−２ｒαに対してＩ Ｌ−２が結合し、そして次にＩＬ−２ｒβに結合することによって形成されるこ とが示唆されている。Ｏｇｕｒａら、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ、　ｖｏｌ 、　５゜１２３頁（１９８８）。

ＩＬ−２の阻害剤は、移植拒絶、ならびに自己免疫疾患の防止に役立つものと考 えられる。現在では、ＩＬ−２結合を防＜’ＩＬ−２ｒｃｒに対するモノクロー ナル抗体が、ヒト腎臓移植において試験されつつある。

Ｈｉｅｓｓｅら、Ｌａ　Ｐｒｅｓｓｅ　Ｍｅｄｉｏｃｌｅ　ｖｏｌ、２０　、　 ２０３６頁（１９９１）。１５人の患者の試験において、免疫抑制剤と併用した 抗体は、同種異系移植の拒絶を防ぐ上で、より高濃度の免疫抑制剤を受けた対照 群と同程度に効果的であることが示された。高水準の可溶ＩＬ−２ｒαの循環が 、多数の疾患、ある感染、ならびに移植と拒絶において検出された。これは、こ れらの疾患にＩＬ−２が関与していることを示唆している。

ＣＲＩは、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ受容体とも呼ばれる蛋白質である。ＣＲＩは、赤血球 と種々の他の細胞系上に存在し、Ｃ３ｂ、Ｃ４ｂ、及び１Ｃ３ｂに特異的に結合 する。

ＣＲＩはまた、古典的な代替系路であるＣ３／Ｃ５変換酵素を阻害し、ファクタ ーｌによるＣ３ｂとＣ４ｂの開裂のためのコファクターとして作用することがで きる。

Ｆｅａｒｏｎら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　ｖｏｌ、 ７５．　５８６７頁（１９７９）。ＣＲＩは、単一ポリペプチド鎖からなる糖蛋 白質であり、４つのアロタイプ型がある。

ＣＲＩは、反復されたコーディング配列を含むことが知られており、この事実を 使用して、多数のアロタイプの存在が説明されている。Ｋｒ１ｃｋｓｔｅｉｎら 、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　ｖｏｌ。

２．４４頁（要旨’）（１９８５）。

赤血球上のＣＲＩの発現の減少は、全身性エリマド−デスと結びつけられている 。そして、ＣＲＩ数は、免疫複合体の血清水準と逆の相関を示すことが見出され た。

ＣＲＩ蛋白質、ＣＲＩの遺伝子とＣＲＩ遺伝子の産生のための方法は、Ｆｅａｒ ｏｎらのＷＯ９１１０５０４７とＷＯ８９１０９２２０に記述されている。上述 の如く、ＣＲＩと抗体の１部を含む二量体の分子も開示されている。

本発明の要約 本発明は、ポリペプチドを修飾する方法とその結果得られた修飾ポリペプチドに 関する。

本発明は、Ｒ１とＲ２が生物学的に活性な基であり、そして、Ｘは非ペプチドポ リマーのスペーサーである一般式Ｒ，−Ｘ−Ｒ１からなる実質的に精製された化 合物を包含する。Ｒ１とＲ２は、同じか、あるいは異なる基であってよく、Ｒ１ とＲ２の少なくとも１つはポリペプチドである。より好ましい態様においては、 Ｒ１とＲ２は、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト；３０ＫＤａｌｌ瘍 壊死因子ファクターの阻害剤；インターロイキン−２受容体とＣＲＩからなる基 から選ばれ、そしてＸは、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチル化グリセ ロール、デキストラン、コロニック酸、ポリβ−アミノ酸、及び炭水化物ポリマ ーからなる基から選ばれる。

また、医薬として受容できる担体中の、このように実質的に精製された化合物か らなる医薬的組成物も含まれる。

本発明には、さらにその必要がある患者を、このような医薬組成物で治療する方 法も含まれる。図１９に描かれている一般式Ｒ，−Ｘ−Ｒ，の化合物は、“亜鈴 ”と呼ばれる。

本発明にはまた、共有結合を形成することができる少くとも２つの反応性基を有 する非ペプチド性ポリマー基を、生活活性基Ｒと反応させ・そして、該化合物を 単離することからなる一般式ＲＩ　Ｘ　Ｒｔからなる実質的に精製された治療的 に価値ある化合物の調製のための方法も含まれる。

代替的態様においては、本発明は、Ｒ１とＲ２が異なっている一般式Ｒ＋　Ｘ　 Ｒ２からなる実質的に精製された価値ある化合物の調製のための方法が含まれる ：この方法は、生物学的活性の基Ｒ１と反応させたとき、共有結合を形成するこ とができる非−ペプチド性ポリマー基を反応させ、複合体Ｒ＋　Ｘを形成し；複 合体Ｒ＋−Ｘを生物活性基Ｒ２と反応させ、該化合物を形成し、そして、該化合 物を分離し、精製することからなる。

１つの態様においては、この発明は、ＴＮＦ阻害剤とＩＬ−１阻害剤蛋白質の部 位特異性ＰＥＧ化に関する。

ＰＥＧ化の部位特異性を維持するために、ポリペプチドのシスティン残基中の遊 離−３Ｈ基とのみ、はとんど例外なく反応するＰＥＧ試薬が選ばれる。はとんど 例外なくシスティンの−ＳＨ基に共有結合するＰＥＧ化の試薬の例は、０−（２ −マレイミドエチル）−〇′メチルポリエチレングリコールである。

部位特異的ＰＥＧ化は、与えられたポリペプチドの天然に存在する“遊離”シス ティン残基においてか、または天然に存在するポリペプチドのムティン上に含ま れる遊離システィンのいずれかにおいて行うことができる。

システィンは、天然に存在するポリペプチドのアミノ酸配列中に付加されるか、 挿入されるか、または選ばれた部位において、池のアミノ酸残基の代わりに置換 されてよい。

この発明の１つの態様においては、ＰＥＧ化されるべきポリペプチドは、細菌宿 主細胞からの組換えＤＮＡ技術を経て産生される。多くの場合においては、細菌 によって発現されたポリペプチドは、ＰＥＧ化の段階の前に、生物学的活性を得 るためには、たたみ直されなければなならない。本発明のある適用においては、 自然のポリペプチドは、遊離のシスティン残基を含まないか、変更されたポリペ プチドは、生物学的に活性なポリペプチドにおいて、少くとも１この遊離システ ィンを含むように産生される。この方法によれば、細菌によって発現されたポリ ペプチドのたたみ直しは、順番に、システィンのようなスルフヒドリル基を含む 化合物、そして、シスチンのようなジスルフィドを含む化合物を添加することに よって容易になる。たたみ直しと精製後、ポリペプチドは限られた量のジヂオト レイト−ル“ＤＴＴ”のような穏やかな還元剤で処理され、変更されたポリペプ チドの新規なシスティン残基のスルフヒドリル基を再生する。酸化を防ぐために デザインされた条件下での透析の後、ボリペブヂ１−は、部位特異的に共存結合 によって修飾されたポリペプチドを形成するために、ソステイン特異性ＰＥＧ化 試薬と反応させることかてきる。

本発明のより好ましいＰＥＧ化ポリペプチドは、位置特異的にＰＥＧ化されたＴ ＮＦ−阻害剤とＩＬ−１阻害剤である。さらに具体的には、本発明は、ＰＥＧ化 ３０Ｋ　Ｄ　ａのＴＮＦ阻害剤と、ＰＥＧ化ＩＬ−１受容体アンタゴニストを記 述している。最も好ましいＰＥＧ化ＴＮＦ阻害剤は、自然のヒト蛋白質の１０５ 番目の位置におけるアスパラギンのアミノ酸残基が、ｉｎ　ｖｉｔｒ。

突然変異誘発を使用して、システィンに変化し、ＰＥＧ化が１０５の位置におけ る遊離システィンにおいて起こっている３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤を含んでいる 。変異した３０ＫＤａのＴＮＦ阻害剤の他のＰＥＧ化誘導体には、システィンか １位、１４位、１１１位と１６１位において添加されている突然変位を含む。１ つだけＰＥＧ化されたムティンに加えて、種々の変位のいずれか、及びすへての 組合せが、単一のムティン内に包含され、ＰＥＧ化されることかできる２こ以上 のシスティン残基をもつ変更された３０ＫＤａのＴＮＦを創生ずることかできる 。

最も好ましいＰＥＧ化ＩＬ−１ｒαには、４この遊離システィンを含む、天然の 、すなわち天然に存在するＩＬ−１ｒａが含まれる。ＩＬ−１ｒａのモノＰＥＧ 化は、１１６位のシスティンの位置に、位置特異的ＰＥＧ化を生ずる。変異した ＩＬ−１ｒａの他のＰＥＧ化誘導体には、システィンがポリペプチドのアミノ末 端に加えられ、システィンか、６，８，９．８４または１４１の位置に加わり、 及び１１６位におけるシスティンが、セリンで置換されているムティンが含まれ る。ｌこだけＰＥＧ化されたムティンに加えて、種々の変異のいずれか、または すへての組合せか含まれ、ＰＥＧ化され得る２こ以上の遊離システィンをもつ修 飾ＩＬ−１ｒａか創製される。

本発明の他の面と有利な点は、発明の実施の図解例をはじめとする以下の詳細な 記述を考察する際明らかどな図１は、天然のＩＬ−１ｒａのアミノ酸配列を描い ている。

図２は、天然の３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤のアミノ酸配列を描いている。

図３は、ＰＥＧ化していないＩＬ−１ｒａとムティンｃ８４ｓｌ１６１Ｌ−１ｒ ａのＰＥＧ化していない、およびＰＥＧ化した形のラーマシー−５ＤＳ−ポリア クリルアミ１〜電気泳動を示す。レーン２，３，５．および６は、ＰＥＧ化反応 混合物を含む。レーンｌど４は無修飾の蛋白である。

レーンＩＩＬ−１ｒａ レーン２　ｍＰＥＧ：ｏｏｏｌＬ　Ｉ　ｒ　ａレーン３　ｍＰＥＧ：５ｏｏｌＬ 　１　ｒａている　クロマトグラムＡ、　ｍＰ　ＥＧ；ｏｏｏｌ　Ｌ　ｌ　ｒ　 ａの反応混合物、ビーク１は（１飾された、そして、ピーク２は、修飾されなか ったＩＬ−１ｒａてあり、そして、クロマトグラムＢは、精製されたｍＰＥＧＨ ｏｏｏｌＬ　Ｉｒａを示す。

図５は、サイズ排除、クロマトグラムを描き、いくつかのサイズ標準とｍＰＥＧ ；５ｏｏｌ　Ｌ　−１ｒ　ａ（画分７）、及びＩＬ−１ｒａ（画分＋３）の溶出 プロファイルを示す。

図６は、遊離のシスティンを標識するため、トリチル化したヨード酢酸と反応さ せたアルキル化ｍＰＥＧＨｏｏｏｌ　Ｌ　−１ｒ　ａのトリプシン消化物の逆相 ＨＰＬＣ分画を描いている。分離はＢｒｏｗｎｌｅｅ　Ｃ８（２、１ｘ２２０ｍ ｍ）カラムて環境温度て、１．０００μｆ／ｍｉｎの流速で線形グレーディエン ドをかけて行った。

溶剤Ａは０．＋９６ＴＦＡ水溶液て、溶剤Ｂはアセトニトリル８０９６と水２０ ９６の混液中０．０８５％のアセト二ｌ−リルてあった。

図７は、図６中のペプチド１８のキモトリプシン消化物の逆相ＨＰＬＣ分画を描 いている。条件は、図６におけるそれと同一であった。ペプチド５と８は、トリ チウムカウントを含み、ペプチド５はアミノ酸配列ＬＣＴＡＭ　Ｅ　Ａ　Ｄ　Ｑ 　Ｐ　Ｖ　Ｓ　Ｌを有していた。システィンは、カルボキシメチルシスティン誘 導体として同定された。このサイクルは、バックグラウンドを越えたカウントを 含む唯−のものであった。ペプチド８のアミノ酸配列は、■１．−１ｒａの１０ ３位のセリンで始まった。このペプチドをキモトリプシンで再消化することによ って本ペプチドのすへてのトリチウムカウントの分画が可能となった。

図８は、血漿中ＩＬ−１ｒａ濃度対成熟ＩＬ−１ｒａ。

ＰＥＧ化ＴＬ−１ｒａ、及びＩＬ−１ｒａのいくつかのＰＥＧ化のムティンの経 時プロファイルを描いている。

図９は、Ｃ１０５３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤とｍＰＥＧを示す５ＤＳ−ＰＡＧＥ ゲルを示し、ｍＰＥＧ　ＣｌＯ３３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤から、サイズ排除ク ロマトグラフティーによる未反応３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤の分離を示している 。

図１Ｏは、多数のＩこだけＰＥＧ化したＩＬ−１ｒａ分子種、二重にＰＥＧ／化 したＩＬ−１ｒａの公刊り及びＩＬ−１ｒａＰＥＧ亜鈴分子種についての静脈内 血漿中Ｉ　Ｌ　−１ｒ　ａ濃度の経時曲線を含むプロットを示す。

図１１は、図１Ｏにおけるように、多数のＴＬ−１ｒａ分子種についての皮下血 漿Ｉ　Ｌ　−１ｒ　ａ濃度の経時曲線を含むプロットを示す。

図１２は、マウスにｈｒＴＮＦを注射した後の血漿中ＩＬ−６水準のプロットを 示す。

図１３は、Ｃ１０５３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤対ＴＮＦ　（Ａ）の５種の比率、 及びＣ１０５３０ＫＤａのＴＮＦ阻害剤ＰＥＧ２０００ｄｂ対ＴＮＦ　（Ｂ）の ５種の比率の混合率物によってマウスに誘発されたＩＬ−６水準を比較している 。

図１４は、ＴＮＦ単独、及びＴＮＦ対ｃ１０５　３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤ＰＥ Ｇ３５００とＰＥＧＩｏ、０００亜鈴との１：ｌの比率の混合物によってマウス に誘発された血漿中ＩＬ−６水準を描いている。

図１５は、ＴＮＦ対ｃ１０５　３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤（Ａ）、ＴＮＦ対ｃ１ ０５　３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤ＰＥＧ、、、、ｄｂ　（Ｂ）；ＴＮＦ対ｃ１０ ５　３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤ＰＥＧ、、、、、、ｄｂ　（Ｃ）：そして、ＴＮ Ｆ対ｃ１０５　３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤ＰＥＧ２゜。。。ｄｂ（Ｄ）の様々な 比率の混合物によって誘発された好中球の百分率を描いている。

図１６は、天然３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤、Ｃ１０５３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤 、、。。及びＰ　Ｅ　Ｇ　＋ｏ、　。ｏｏそして３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤Ｐ　 Ｅ　Ｇ　、、、、、ＰＥＧＩｏｏｏ。

及びＰＥＧ２ｏ、。。。亜鈴についての静脈血漿中３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤濃度 の経時曲線を含むプロットを示す。

図１７は、図１６におけるように、多数の３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤分子種につい ての皮下血漿中３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤濃度経時曲線を含むプロットを示す。

図１８は、０Ｄ４０５対時間をプロットすることによって、天然のＩＬ−１ｒａ とｃ８４１Ｌ−１ｒａＰＥＧ、Ｓ。０の３溶液の溶解度を表している。

図１９は、亜鈴化合物と呼ばれる一般式Ｒ，−Ｘ−Ｒ２を有する本発明の化合物 の基本的構造を描いている。

本発明の詳細な説明 本発明は、医薬的に有用なポリペプチド、特に腫瘍環子因子（”ＴＮＦ”）阻害 剤、及びインターロイキン（”ＩＬ−１”）の阻害剤の選択的修飾を内容として いる。より具体的には、本発明は、３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤とＩＬ−１受容体 アンタゴニスト（“ＩＬ−Ｉｒａ”）の選択的修飾を記述している。該選択的修 飾はポリペプチド類の薬物動態学的性質を強化し、ならびに、ヒトの治療のため の使用に対して均質な組成物を提供するのに役立つ。

本発明の手順によって、選択的に修飾されるさらなるポリペプチドには、インタ ーロイキン−２受容体（“ＩＬ−２ｒ”）及びＣＲＩが含まれる。インターロイ キン本発明のより好ましい態様においては、修飾したポリペプチドとＤＮＡ配列 は、ヒトのものである。しかし、動物ＤＮＡとペプチド配列とヒトの形との間に 十分な相同性かある程度まで、それらは、本発明の範囲内に含められるであろう 。

１つの態様においては、本発明の修飾の方法には、問題のポリペプチド類に対し て、長鎖ポリマーを位置異的に共有結合させることが含まれる。選ばれたポリペ プチドは、問題とされる天然の、すなわち天然に存在するポリペプチドであるか 、または本発明中に記述された修飾過程を強化するために産生された生物学的に 活性なムティンであってよい。本発明の方法には、本発明の目的に適った望まし いムティンの選択、産生、及びスクリーニングが含まれる。本発明の他の態様に おいては、ポリペプチドを修飾する方法は、結果として生ずる成績物を、実質的 に精製された、本発明において定義されている様な形で手に入るように行われる ことが要求される。

成る態様においては、本発明の修飾ポリペプチドは、アミノ酸配列の特定の位置 て長鎖のポリマーに結合される。本発明の修飾されたポリペプチドは、それらの 生物活性の実質的な部分を保持する。より好ましい態様においては、修飾された ポリペプチドは天然のポリペプチドの生物活性の少なくとも１１５を保持し、最 も好ましい態様においては、活性の少なくともｌ／４か保持される。

その上、修飾ポリペプチドは、以下の領域の少くとも１つにおいて、薬物動態学 的性能の改善に役立つ：ｌ）　天然のポリペプチドのみかけの分子量を増加し、 皮下、または全身性投与の後のクリアランス速度を現象させること。

２）　天然のポリペプチドの水溶液の溶解度を増加させること：または、 ３）　天然のポリペプチドの抗原性を減少させること。

本発明の多くの態様においては、これらの目的のそれぞれか達成される。本発明 のより好ましい態様においては、長鎖のポリマーはポリエチレングリコール、ま たはモノメ１−キソポリエチレングリコールである。ポリエチレングリコール単 位は、ここではＰＥＧと呼ばれ、モノメトキシポリエチレン単位はｍＰＥＧと呼 ばれる。ポリマー単位のおおよその分子量は、下つき記号で与えれて本発明の範 囲内に含まれる他の長鎖のポリマーは、ポリプロピレングリコール（”ＰＥＧ” ）、ポリオキシエチル化グリセロール（“ＰＯＧ“）、デキス１〜ラン、コロニ ック酸、または他の炭水化物に基づくポリマーとβ−アミノ酸、及びヒオチン誘 導体のポリマーである。

本発明の代替的態様においては、長鎖ポリマー単位は、ジヒドロキシポリエチレ ングリコール、すなわち、Ｉ−Ｉ　Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２０）、−Ｈである。下に 記すようなポリペプチド、または他の生物学的に活性な化合物と共有結合するた めに活性化されるとき、ジし１−ロキシ物質は、２つの反応性部位をもつ。

本発明のより好ましい態様においては、長鎖ポリマー単位は、システィン残基の スルフヒドリル基（−Ｓ　Ｈ）への共有結合を経てポリペプチドへ結合される。

反応の選択性と均質な反応混合物を得るためには、スルフヒドリル基ど特異的に 反応する官能化ポリマーを利用することか作用である。長鎖ポリマーに結合した 官能性、または反応性基は、ここでは活性化基と呼ばれる。活性化基には、マレ イミド基、スルフヒドリル基、チオール基、トリフレート、トリフレート、アジ リジン、オキシラン、及び５−ピリジル基か含まれる。より好ましい活性化基は 、マレイミドである。

活性化ジヒドロキシポリエチレングリコールは、ポリマー鎖の両端の間が物理的 に離れているため、分子の各端において殆ど同等に反応性である。反応条件とポ リペ゛　プチトの適切な選択によって、活性化ジヒドロキシポリエチレングリコ ールーまたは他の多重活性化長鎖ポリマー単位は、ポリペプチドと反応して２こ のポリペプチドか長鎖のポリマー単位によって結合した“亜鈴”の形をした複合 体を形成する。

活性化ポリマーに結合した基と異なるシスティン含有ポリペプチドの間に見出さ れるであろう異なる反応速度を利用することによって、及び反応の速度論によっ て、また、２つの異なるペプチド基を含むか、またはｌこのポリペプチドと異な る生物活性基を含む実質的に精製された化合物が形成され得る亜鈴型複合体を産 生することは、容易にこの技術分野の人々の熟練の範囲内である。

このようなヘテロ亜鈴型化合物の例は、下に与えられている。

システィンの反応の程度と利用性は、ポリペプチドからポリペプチドへと劇的に 変動する。そのため、その生物学的活性型においては、多くのペプチドが、“遊 離”のシスティン、すなわち別のシスティンに結合していないシスティンをもっ ていない。その上、遊離のシスティンの存在は、システィンが反応性試薬と結合 するために接近できることを意味しない。修飾は、通常、活性な、つまり三次元 的に折りたたまれたポリペプチド上で起こるので、遊離のシスティンか折りたた まれた構造の゛内部”で見出されるときには、反応は殆ど、あるいは全く起こら ない。

ポリペプチド修飾する場合のさらなる制約は、修飾が、ポリペプチドの活性部位 −Ｆに及はすかもしれない潜在効果である。活性部位に対する近位関係を有する システィンの修飾は、ポリペプチドを効果的に不活性化することかある。選はれ たポリペプチドについて多くか知られている場合でさえ、いずれのシスティン残 基か効果的に修飾てきるかを正確にｒ知することは、不可能ではないにしても、 困難である。

同し要因は、さらにシスティン残基を含む変異したポリペプチドか産生されると きにも存在する。ポリペプチドか細菌での発現を経て、組み換え技術によって産 生されるときに、非天然システィンは、ポリペプチドの適切な再折りたたみを妨 害する可能性かある。その上、システィンは、ＰＥＧ化試薬に近づくことができ なければならない。そして、ＰＥＧ化システィンは、ポリペプチドの活性部位を 有意に妨害してはならない。

非天然システィン導入のための一定のポリペプチド内の選択は種々の源の情報に 基づいて影響され得る。例えば、グリコジルの部位は、遊離のシスティンを導入 するよい部位であると考えられる。ポリペプチドの結合、または活性部位につい て知られている程に、その情報も、潜在ムティンを選ぶのに使用することかでき る。ポリペプチドのアミノ末端に、またはカルボキシル末端における付加、また は置換も、その位置のために有望に思オ）れる。そして最後に、システィンへの りジン残基の変異は、リジンが一般的に生物活性ポリペプチド上で見出されると いう仮説に基づいて考慮することかできる。

種々の潜在性ムティンが、望ましい特徴に適う、一定のペプチドとして選択され ることができるか、いずれが本発明の目的に適うかが知られるのは、このような ムティンの合成、ＰＥＧ化、及び試験を通じてのみである。

本発明、及びこの技術分野に熟達している人々の熟練度と知識に照らすと、この ような合成、ＰＥＧ化、及び試験は、過度な実験を行うことな（遂行することが できる。

たとえあるポリペプチドのＰＥＧ化、ポリペプチドの生物活性をある程度減少さ せるように作用しても、該ポリペプチドの薬物動態学的性能の改善は、種々の治 療適用において、天然ポリペプチドの価値を著しく増加させることがあることに 注意すべきである。

標的ムティンの選択にあたっては、該ムティンの産生のためのより好ましい方法 は、ムティンをコードしている遺伝子を遺伝子組み換え技術によって発現するこ とによる。天然ポリペプチドをコードしている遺伝子か知られていると想定する ならば、変更された遺伝子は、自然の遺伝子上での標準的部位特異的突然変異誘 発手順によるか、標準遺伝子合成手順による変更遺伝子の構築のいずれかによっ て創製することかできる。これらの技術は、本技術分野において、普通の熟練度 をもった人々によって十分よく知られている。

標的ムティンをコードしている遺伝子は、動物、昆虫、及び細菌のシステムをは じめとする種々の発現系において発現することかできる。発現系が天然ポリペプ チドの発現のために遂行された程度によって、同じ系か標的ムティンのために使 用され得る。本発明のより好ましい態様においては、標的ムティンをコードする 遺伝子は、天然遺伝子の部位特異的突然変異誘発によって産生され、ムティンを コードする遺伝子は、細菌の発現システムから発現される。天然のＩＬ−１ｒａ をコートしている遺伝子と該遺伝子をＥ、ｃｏｌｉにおいて発現する方法は、１ ９９１年１２月２４日に公示されたＨａｎｎｕｍらの米国特許Ｎｏ、５，０７５ ，２２２に詳細に記述されている。天然３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤コードしてい る遺伝子とＥ、ｃｏｌｉ中における該遺伝子の発現の方法は、１９９０年７月１ ９［１に出願された米国特許出願０７１５５５，２７４に詳細に記述されている 。これらの出願の各々は、この参照によって本発明に組み込まれる。

本発明のムティンとＰＥＧ化物質は、蛋白質の配列中に対立遺伝子を含み（個人 から個人の天然の変異性による配列の変異）、そして、実質的に等価の蛋白質を 含んでいる。明細書と請求を通じて使用される“実質的に等価”はアミノ酸残基 の極めて高度の相同（一般的には、本発明中に参照により特別に組み込まれてい るＭ、Ｄａｙｈｏｆｆ、Ａｔ１ａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅ 　ａｎｄＳｔｒａｃｔｕｒｅ、　ｖｏｌ、５．　ｐ、１２４　（１９７２）。

Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａ ｔｉｏｎ。

Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　Ｄ、　Ｃ，を参照）、ならびに、同等な生物活性を有 することを意味するように定義されている。やはり、本発明の範囲内に含まれて いるのは、自然のポリペプチドの先端が部分的に短くなった型であるムティンと ＰＥＧ化ポリペプチドである。

本発明の方法のより好ましい１つの態様においては、標的ムティンか、細菌の発 現系において組み換えＤＮＡ技術を経て産生されるときには、以下の段階か遂行 される： ｌ）　標的ムティンをコードする遺伝子は、自然のポリペプチドをコートする遺 伝子の位置志向性突然変異誘発によって創製される。

２）　標的ムティンをコートする遺伝子は、バクテリアの発現系において発現さ れる： ３）　標的ムティンはバクテリアから分離され、精製される： ４）　標的ムティンはシスティン、または別のスルフヒドリル含有化合物の存在 下においてたたみ直される；５）　たたみ直された標的ムティンを分離し精製す る。

６）　精製され、たたみ直されたムティンは緩和な還元剤で処理されるニ ア）　反応混合物は、無酸素下で透析される。そして、８）　透析された反応混 合物は、活性化基を含む長鎖のポリマーて処理される。

３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤のＰＥＧ化ムティン産生のためのより好ましい態様に おいては、樽やかな還元剤は、ンチオトレイト−ル（“ＤＴＴ”）である。１つ の代替的態様においては、修飾は、発現蛋白質またはムティンのたたみ直しの前 に起こることかある。

本発明のより好ましい態様においては、ＰＥＧ化ムティンとＰＥＧ化天然ポリペ プチドは、精製され、従来法によって医薬組成物へ製剤化することかてきる。代 替の態様においては、精製ムティンも医薬組成物に製剤化することかできる。

不活性化された長鎖のポリマー単位の反応によって形成される本発明のＰＥＧ化 ポリペプチドは、さらなる有益な性質をもっている。これらの亜鈴型の分子は、 ただ１本のポリマー単位によってつながれた関心のある２つのポリペプチドを含 むことかできる。本構造は、ポリマー分子にある程度の直線性を与え、ポリエチ レングリコールのような大きな水和性のポリマーの使用に内在する立体障害を若 干減少させる。高生物活性を保持しつつ、増加したみかけの分子量をもった分子 を得るという目標が達成される。本発明の範囲内に、特に含められるのは、２つ のＩＬ−１ｒａ分子、または２つのＴＮＦ阻害剤が、共有結合でただ一本のポリ マー鎖につながれているが、２つの異なるポリペプチドかただ一本のポリマーに っなかれている歯状突起か２つある分子、すなわちＴＮＦ阻害剤とＩＬ−１ｒａ 分子の両方を含む歯状突起が２つあるただ一本の分子である。

天然のＩＬ−１ｒａ（図１）とＩＬ−Ｉｒａの種々のムティンか、本発明にした がってＰＥＧ化された。下の例において記述された方法によって、遊離のスルフ ヒドリル基における野生量のＩＬ−１ｒａのＰＥＧ化の結果、ＩＬ−１ｒａ　（ Ｃｌ　１６）の１１６単位のシスティン残基において、ｍＰＥＧの付加を生ずる 。完全に天然の分子においては、他の３つのシスティンは、ＰＥＧ化のために接 近することかできない。ＩＬ−１ｒａの異なる部位に、ｍＰＥＧ分子を付加させ るために、そして、２こ以上のｍＰＥＧを存するｍＰＥＧ結合体を作るためには 、ＩＬ−１ｒａ中の天然のアミノ酸か、システィンで置換されたか、さらなるシ スティンが該蛋白質のアミノ末端に付加されているＩＬ−１ｒａ、１１６位の残 基か、ＰＥＧ化されていない結合体を調整するためには、ＣＩ＋６は、多数のム ティンにおいてセリンに変化された。下記は、ｍＰＥＧとの反応のために生成さ れたムティン類のリストである（残基のナンバーリングは、図１に与えらねた配 列に基づいており、Ｃはノステイン、そして、Ｓはセリンを指している）。

ｃｏｓｌ１６　ｃｏｇ１１６ ｃ８４ｓｌ１６　ｃ８４ｎｌ１６ ＣＩ４１８１１６　Ｃｌ４１ＦＦ、＋１１６天然の３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤（ 図２）は、遊離のノステイン残基をよんでいない。以下の３０ＫＤａ　Ｔ−ＮＦ 阻害剤のムティンが調整された（残基のナンバーリングは図２において与えられ た配列に基づいており、Ｃはノステインをさす）。

ｃ１０５　３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤 ｃｌ　３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤 ｃ１４　３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤 ｃ　ｌ　ｌ　Ｉ　３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤ｃ１６］　３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害 剤 本発明の範囲内に３まれでいるのは、一般式Ｒ，−Ｘ−Ｒ２によって表すること かできる図１９に描かれているような全クラスの化合物である。式中：Ｒ３とＲ ２は生物学的に活性な基であり、Ｒ，とＲ２のうち少なくとも１つはポリペプチ ドてあり、Ｘは非ペプチド性ポリマースペーサーかりンカー基である。Ｒ１とＲ ２は、同じ基か異なる基であってよい。Ｒ１とＲ２か異なる基である場合、Ｒ， とＲ２は、両者ともポリペプチド性であってよく、またはＲ，はポリペプチド性 であってよく、そして、Ｒ２はいかなる生物学的に活性な基であってよい。

“亜鈴′型化合物と呼ばれている本構造をもった化合物は、実質的に精製される ことによって特徴付けられている。この意味合いにおける“実質的に精製されて いる”は、均質な組成物であるとして定義されている。

均質な組成物は、１分子のリンカ−Ｘと１分子のＲ１及び１分子のＲ２からなっ ている。均質な組成物には、生物学的活性基は、Ｒ１とＲ２か化合物のそれぞれ の分子の基土の正確に同じ位置におけるリンカ−に付加されていることが含まれ るが、要求されはしない。本発明のある態様においては、生物学的に活性な基は 、位置特異的にリンカ−に付加されている。例えば、ｃ１０５　３０　Ｋ　Ｄ　 ａ　Ｔ　Ｎ　Ｆ阻害剤　ＰＥＧ３０００ｄｂ化合物において、２つのｃ１０５　 ３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤基か、１０５位のンステイン残基において、ＰＥＧ　 ３０００リンカ−に結合されている。

“均質性組成物”について言う場合には、分子による分子に基づいて、亜鈴化合 物も、スペーサー基の正確な長さに関して均質ではないことが理解されるべきで ある。

与えられた分子量の範囲のＰＥＧまたは他の高分子量のポリマーを利用するいず れの生産過程も、“平均”分子量を含む溶液で始まるということが、この技術分 野において熟達した人々によって理解されている。したがって、二反応性ＰＥＧ 中位をポリペプチド基と反応させる場合には、ＰＥＧ単位は、定義によって多分 数であり、そして結果として生ずる亜鈴化合物は、リンカ−の長さが本技術分野 の熟達した人々によって存在することが知られている変動を受ける程度に不均質 である。

要約すると、この意味合いにおける“実質的に精製された“は、１）Ｒ１とＲ２ の組成において逸脱している。２）または、２つ以上のリンカ−によって統合さ れている化合物か、実質土倉まれていないことである。

Ｒ１とＲ２は、生物学的に活性な基として定義されている。生物学的活性基は、 天然の生物学的に分子と反応して、生物学的作用を誘発することができるいずれ の化合物をも含む。生物学的活性基には、蛋白質、ポリペブチ１〜、ステロイド 、炭水化物、ヘパリン、金属含有剤、ビタミン類、または、他のとのような生物 学的に活性な分子種のような可成分子種を含む。Ｒ１とＲ２基の少なくとも１つ は、ポリペプチド性である。より好ましい態様においては、Ｒ１とＲ２の両者が ポリペプチドである。

ポリペプチド性は、本質において、実質的に蛋白質様である化合物のすへてと定 義される。しかし、ポリペプチド性基は、若干の非ペプチド性要素を含むことが ある。

例えば、グルコツル化ポリペプチド、または合成的に修飾された蛋白質は、定義 の中に含まれる。

生物学的に活性な基、Ｒ１とＲ２は、結合基と標的へ配送する基を含む。結合基 は、与えられた生物学的リガンドに対する親和性によって定義される。標的へ配 送する基は、複合体を生物学的システム内に配送する能力によって定義される。

Ｒ４とＲ２は、同しりガントに対して親和性を有することかあり、その場合には 、その亜鈴は、そのリガンドに対して親和性が増強されることがある。Ｒ１とＲ ２は、異なるリガンドに対して親和性を有することかあり、そのときは、Ｒ１は Ｒ７に対するリガンドか優先する位置に複合体を配送するのに役立つ。

より好ましいポリペプチド性基は、受容体、受容体の細胞外部分、細胞表面の分 子、及び細胞外基質分子、結合蛋白質、及び受容体拮抗剤である。Ｒ１またはＲ ７として使用することができるポリペプチド性基の中には、以下のポリペプチド とそれらのいかなる断片も含まれる：ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、３０ＫＤ ａ　ＴＮＦ阻害剤、ＩＬ−２受容体、ＣＲＩ　（ＣＲＩ）に対するすべての参照 は、ＣＲＴのただ１本の、またはコンセンサス反復配列のいかなる組合せをも含 む。）、ＰＤＧＦ受容体、ＩＬ−２，ＭＣ３Ｆ受容体、ＥＧＦ受容体、ＩＬ−５ 受容体、ＩＬ−３受容体、ＧＭＣ３Ｆ受容体、Ｔ−細胞受容体、ＨＬＡ−Ｉ、Ｉ ＬＡ−［、ＮＧＦ受容体、ＩｇＧ　（Ｖ１２、Ｖ＋　）　、ＣＤ４０．ＣＤ２７ ．ＩＬ−６受容体、インテグリンズＣＲ３，ＶＬＡ、、ＩＣＡＭ、及びＶＣＡＭ 、ＣＲ２，ＧＭＰＩ４０Ｌｅｃドメイン、ラミニン結合蛋白質、ラミニン断片、 マンノース結合蛋白質、ＰＤＧＦのエキラン６ペプチド、及びプロテアーゼ（２ つの触媒的ドメイン、または標的配送ドメインと触媒ドメインをもった）。受容 体に対する参照すべては、２つ以上の形が存在するときは、いつでも受容体のす べての形を含む。より好ましい態様においては、ＲＩとＲ２の基は、ＩＬ−１受 容体アンタゴニスト、３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤、ＣＲＩ及びＩＬ−２受容体（α とβ鎖の両方）からなる基から選ばれる。

より好ましい態様においては、非−ペプチド性ポリマースペーサーを、さらに以 下の如く定義することができる： Ｘ＝　Ｙ＋　（Ｚ）−Ｙ２−中、Ｙ、とＹ２は、Ｒ１とＲ２と反応し、Ｒ１基と Ｒ２基に対して、スペーサーを結合させる活性基の残基を表し、（Ｚ）、は、ベ ースのポリマー基を表している。本発明によれば、ｎは６より大きく、より望ま しくはＩＯよりも大きい。

非ペプチド性は、本質的には、実質的にペプチド性でないポリマー基として定義 される。Ｙ＋　、Ｙ２　、及びＺのアミノ酸残基の重量による５０９６未満の包 含は、事実り実質的に非ペプチド性と考えられ、そして、非ペプチド性と考えら れるであろう。より好ましい態様においては、非ペプチド性スペーサーは抗原性 がなく、生物学的に不活性で親水性である。その上、より好ましいリンカ−は、 与えられたＲ１またはＲ２基のそのリガントに対する親和性を有意に減少するこ となく、免疫原性の減少、溶解性の増加、または身体からのクリアランス速度の 減少のような望ましい性質を、生物学的に活性なポリペブチＦ性の基に与えるこ とかできる。最も好ましい態様においては、化合物Ｒ１〜Ｘ−Ｒ２（式中Ｒ，＝ Ｒ２で、Ｒ１とＲ３は結合基である）は、誘導化されていない結合基か、リガン ドに対してもつ親和性を陵駕するそのリガンドに対する親和性を存している。例 えば、実質的に、精製されたｃ１０５　３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤ＰＥＧ３４０ ０ｄｂは、ｃ１０５　３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤がＴＮＦに対してもっている阻 害活性の２０倍を越える阻害活性をＴＮＦに対してもっている。

ポリマースペーサーＸの一部である活性化基Ｙ１とＹ２は、マレイミド基、スル フヒドリル基、千オール。

トリフレート、トリフレート、アジリジン、オキシラン、及び５−ピリジルを始 めとする上に記述したような活性基のいずれかからなっていてよい。より好まし い活性基は、マレイミドである。

ポリマー基（Ｚ）６は、好ましくは、ポリエチレングリコール、ポリブロングリ コール、ポリオキシエチル化グリセロール、デギストラン、ポリβ−アミノ酸、 コロニック酸、または他の炭水化物ポリマー及びピオチン誘導体からなる基から 選はれる。より好ましい態様においては、ポリマー基は、ポリエチレン基である 。本発明において記述された機能に役立ってあろういずれの非ペプチド性ポリマ ー基も、本発明の範囲内に包含されるであろう。

本発明の利点の１つは、２つの結合基を結ぶポリマー基の長さを変化させること によって、Ｒ２基とＲ２基の距離を変化させることかてきることである。理論に よって特定されてはいないか、本発明の多量性化合物についてみられた生物活性 の増加は、ｉｎ　ｖｉｖｏにおける細胞の受容体とりガントの多量性的性質か原 因と考えられることか提案されている。この理由から、Ｒ１とＲ２の一単位間の 至適距離（一般的にはポリマー単位（Ｚ）５の長さに直接比例するであろう）は 、スペーサーＸの大きさを変えることによって、本技術分野に熟練した者によっ て容易に決定できると考えられる。

本発明の１つの態様においては、Ｒ２基とＲ２基は同一である。しかし、代替的 態様においては、Ｒ５とＲ２は異なる分子種である。このような化合物は、Ｒ１ とＲ７が、同し一般的生物学的系の中で作用するヘテロダイマーを創製するよう デザインすることかできる。例えは、ＩＬ−１受容体アンタゴニストとＴＮＦ阻 害剤はともに炎症のカスケードを破壊すると考えられる。Ｒ１またはＲ２か複合 体を特定の基質に対するその結合親和性によって、特定の位置に”さしむける” 標的への配送”のための分子種、そして、向い側の結合基は、局在化された部位 において望ましい活性を存する三機能的複合体もデザインすることかできる。

首尾よいＩＬ−２阻害剤として大きな潜在性を有するヘテロダイマーの例は、Ｒ １かＩＬ−２ｒαてあり、Ｒ２か、ＩＬ〜２ｒβであるダイマーである。このよ うなヘテロダイマーは、ＩＬ−２に対して最高の親和性を有する受容体複合体を 模倣する。例Ｘ■を参照。補体の阻害剤として作用することかできるさらなるヘ テロダイマーは、Ｒ１か、ＣＲＩからのＣ３ｂ結合ドメインであり、Ｒ２か、Ｃ ＲＩからのＣ４ｂ結合ドメインであるヘテロダイマーである。例Ｘｖ■を参照。

さらなるヘテロダイマーにおいては、Ｒ，がＰＤＧＦのエキラン６ペブチトであ り、Ｒ２かＩＬ−１ｒａである。例ＸＩＸを参照のこと。

本発明のより好ましい態様においては、三機能性Ｒ１−Ｘ−Ｒ２を産生ずる手順 は、上述したように、ポリペプチドの部位選択的反応のために使用されたものと 本質的には同しである。ｃ１０５　３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤ＰＥＧ３４００の 合成は下記の例１３において記述される。二反応性ポリマー基は、システィン含 有ポリペプチドと反応し、その場合、二反応性ポリマー基土の活性化基は、選は れた遊離システィン残基とチオエーテル結合を形成する。上述されたように、こ のシスティンは、ポリペプチド基上に天然に存在している遊離のシスティン、ま たは自然の配列中に付加されたか、あるいは置換された非天然のシスティンであ ってよい。

本発明のより好ましいビス反応性ポリマー化合物は、α−（２−マレイミド）ω −マレイミドポリ（オキシエチレン）、または、ビスマレイミドＰＥＧである。

ビス−マレイミドＰＥＧの合成は、例１２において記述されている。より好まし い方法によれば、ビス−マレイミド化合物は、ビス−アミノ中間体を経てビス− ハイドロキシルＰＥＧから調整される。

ＰＥＧの末端水酸基の相当するアミノ基への変換のためのいくつかの方法は、Ｈ ａｒｒｉｓらによって総説されてい２５　（３）、３２５頁（１９８５）。これ は、スルフォン化、ハロゲン化、または水酸基の参加のいずれかを経て、反応性 の中間体を生成させ、続いて活性化末端を核試薬によって置換することによって 達成される。

例１２において与えられているビス−マレイミドＰＥＧの合成に対する実際的な 代替法も存在する。水酸基のアミンへの変換の反応性中間体は、続いてアンモニ アで直接置換されるハロゲン化誘導体（例えは、α−ブロモエチル）−ω−ブロ モポリ（オキソエチレン）中間体ドＰＥＧは、使用されうる唯一のスルフヒドリ ル特異性試薬ではない。Ｇｌａｓｓと協同研究者は、ＰＥＧのスルフヒドリル基 への付加の別の方法を開発した。Ｇｌａｓｓら、かし、本反応は、チオールに関 して可逆的である。ＰＥＧのシステイニルスルフヒドリルへの付加の別の方法は 、ヒス−４−ビニルピリジンＰＥＧ誘導体である。

Ｈａｒｒｉｓ　（上記）はまた、蛋白質を修飾するために試薬として使用するこ とができるＰＥＧの種々求電子性誘導体の合成も総説している。これらの試薬に は、クロロカーボナート、イソシアナート、エポキシド、スクシニミジルスクシ ナート、シアヌリッククロリド、混合無水物、カルボジイミド、及びスルホナー トか含まれる。後者のグループには、トレシレート、トシレート、及びメシレー トが含まれる。これら試薬のあるものは、アミンと選択的に反応する（例えば、 シアヌリッククロリドとカルボジイミド）が、他の試薬は、スルフヒドリルとア ミンの両方と反応する（例えば、エポキシドとトシレート）。

これらの試薬の若干は蛋白質を修飾するために使用され、その結果種々の程度に 活性の喪失を招くことがある。

Ｒ３とＲ２か異なるＲ、−Ｘ−Ｒ２複合体のより好ましい調整においては、ビス −反応性のポリマー基を連続的にＲ１と反応させ、次にＲ２と反応させる２つの 段階が必要となる。このようなヘテロダイマーの調整は、この技術に普通に熟練 した人々によって、過度な実験をすることなく達成されると考えられる。ある場 合には、中間体のＲ＋　Ｘは、Ｒ２との反応の前に、まず分離精製されなけれは ならない。そして、他の状況においては、中間体の精製は必要でないことかある 。

ＩＬ−２ｒαどＩＬ−２ｒβの細胞外ドメインは、ＰＣＲを使用してクローニン グされ、Ｅ、ｃｏｌｉにおいて発現を行うことかてきるベクター中にクローニン グすることかできる。蛋白質は、Ｅ、ｃｏｌｉからたたみ直され、精製さオ］、 それらのＩＬ−２活性を阻害する活性をバイオアッセイで測定することかできる 。ＰＥＧの位置志向性付加かてきるように、分子中の天然の残存をシスティンで 置換するために、Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異誘発を使用することができる。ＰＥ Ｇ化されたとき、活性を失わない効果的な付加かできるようにするＩＬ−２ｒα とＩＬ−２ｒβの両者のムティンを、次に同定することかできる。ＰＥＧに結合 したヘテロダイマーは、ビス−マレイミドＰＥＧの過剰のｒｒ在において、最初 にＩＬ−２ｒαをＰＥＧ化することによって形成することかできる。１つだけＰ ＥＧ化されたＩＬ−２ｒｃｒは、精製され、ＩＬ−２ｒβをＱＩＪえて、活性マ レイミド基と反応させ、ヘテロダイマーを形成する。この分子を精製し、そして 、その活性を測定することかできる。この分子は、細胞表面上に見出される高度 親和性ＩＬ−２の受容体を模倣する筈である。

Ｒ３かＩＬ−２てあり、Ｒ２かＩＬ−２ｒβである亜鈴複合体も、ＩＬ−２の受 容体アンタゴニストとして有ポリペプチドの誘導体をつくるために使用できる様 々な手段を示すために、３つの試薬を記述する。以下に記述される中間体と試薬 の構造については、例１に対する付録を参照のこと。以下に提供される参照は、 すへて本発明にこの参照によって特別に組み込まれている。

Ａ、試薬ｌの合成：　ｍ　Ｐ　Ｅ　Ｇ　ｘ−エステル−マレイミド ９頁（１９８１）によって記述されたように調整された。

その結果得られた成績物を秤量し、最小限の乾燥ジオキサンに６０°Ｃで溶解し た。溶液を環境温度まで冷却した後、トリーｎ−ブチルアミンとイソブチルクロ ロホルマートの両方の等モル量を加えた。反応は、攪拌下３０分間進行した。こ の間に、０．５Ｍホウ酸溶液を、１．６−ヘキサンジアミンで滴定することによ って、ｐＨ８゜８のホウ酸緩衝液を作った。混合無水物を含む溶液を、混合無水 物の１０倍モル過剰の１．６へキサアミジンを含むホウ酸緩衝液の部分量に滴下 した。反応混合物を４°Ｃて脱イオン水に対して徹底的に透析し、凍結乾燥した 。

このポリマー中間体（中間体２）を５０ｍＭリン酸またはＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐ Ｈ７，６１中の２５：１モル過剰のスルホスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミド エチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラード（スルホ−３ＭＣＣＰｉｅｒｃ ｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ　ＩＩｌ、）と室温で２時 間反応させた。その結果得られたポリマーを、５０ｍＭリン酸ナトリウム（また はＨＥＰＥＳ）緩衝液ｐＨ７，Ｏを４０°Ｃで溶出に用い、反応混合物を、セフ ァデックスＧ−２５上のサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。マレ イミド−ポリマー（試薬ｌ）は、カラムのボイド容積において溶出し、２６０ｎ ｍにおけるその吸光度によって検出された。試薬は、その精製後１時間以内に、 ポリペプチドをアルキル化するのに使用した。この反応からのｍＰＥＧは、塩基 による加水分解によって除去できるので、この試薬は、蛋白質に対するｍＰＥＧ の付加の部位を同定するのに作用である。

Ｂ、試薬２の合成：　ｍ　Ｐ　Ｅ　Ｇ　ｘ−アミドマレイミドｍＰＥＧ−トシラ ート（中間体３）は、Ｐｉｌｌａｉら、Ｊ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｍ、　ｖｏｌ、 ４５．５３６４−５３７０頁（１９８０）によって記述されたように調整された 。スルホン化された中間体の量は、Ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 、　ｖｏｌ、　１０４．５６−６９頁、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓ、ｌｎｃ 、、　Ｎ、　Ｙ、　。

Ｎ、Ｙ、（１９８４）におけるＮｉ１ｓｏｎとＭｏ５ｂａｃｈによって記述され たように、分光光度法によって測定した。この中間体はフタルイミド誘導体（中 間体４）に変換され、引き続いてＰｉｌｌａｉら、上記の手順によってｍ　Ｐ　 Ｅ　Ｇ　ｘ−Ｎ　Ｈ２中間体く中間体５）ヘヒトラジンヒドラートで還元した。

成績物のダラムのあたりの等量におけるアミノ基の容量は、塩酸でのミクロ滴定 によって定量された。

ｍ　Ｐ　Ｅ　Ｇ　ｘＮ　Ｈ２をＨＥＰＥＳ、　またはリン酸緩衝液ｐＨ７，２中 のスルホ−ＳＭＣＣと室温で２時間反応させた。ｍ　Ｐ　Ｅ　Ｇ　Ｘ−アミンの スルホ−ＳＭＣＣに対する量は、５：ｌからｌ：５のモル比において試験した。

最適条件を決定するために、最終試薬（試薬２）をＰＥＧ化反応に使用し、これ らの反応から得られたｍＰＥＧｘ　”　ＩＬ　１　ｒａ　（我々は試薬２と反応 したＩＬ−１ｒａのＰＥＧ化成績物に対してこの名称を、以下に記述される試薬 ３との反応からのＰＥＧ化ＩＬ−１ｒａに対しては、ｍＰＥＧｘ　ＩＬ−１ｒａ を使用するであろう。）の量と質を、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動 （ＰＡＥＧ）によって評価した。最適の結果は、ｍＰＥＧｘ−ＮＨ２に対するＳ ＭＣＣの比がｌ＝１のときにみられた。スルホ−ＳＭＣＣの比率がもっと大きく なると、５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で複数のより分子量が高い誘導体、及び分析用イオ ン交換クロマトグラフィー上に、複数のピークを生成した。そしてより低い比率 は、ＰＥＧ蛋白質の収率が減少する結果となった。試薬２を６２５セフアデツク スレジンを使用して、サイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。

Ｃ５試薬３の合成：　ｍ　Ｐ　Ｅ　Ｇ　ｘ−マレイミドｍＰＥＧ、−ＮＨ２（中 間体５）は、さらに修飾して異なるマレイミド−誘導体（試薬３）を産生ずるこ とができる。後者は、Ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　ｖｏｌ、Ｘ ＸＶ１９＋−１９９頁、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、、　Ｎ、Ｙ 、　。

Ｎ、Ｙ、におけるＢｕｔｔｅｒとＨａｒｔｌｅｙの手順の適応を経て、ｍＰＥＧ ＰＥＧ化反応２をマレイン酸無水物と反応させ、そして、この中間体（中間体６ ）をＷｕｎｓｃｈら、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

）１ｏｐＩｌｅ−５ｅｙｌｅｒ、　ｖｏｌ、　３６６　、５３−６１頁（１９８ ５）によって記述された方法を使用して、相当する０−（２−マレイミドエチル ）−〇′−メチルプロピルエチレングリコールへ閉環することによって達成され た。

例１に対する付録 試薬１の合成 合成Ｉからの出発物質、中間体、及び試薬の構造出発物質・ モノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧｘ）に対する一般式。

ＣＨＩ　Ｃ１−（ＣＨ２ＣＨ２０）、−８式中、Ｘは該ポリマーのキロドルトン における平均分子量を表し、ｎは反復するオキシエチレン基の平均数である。

中間体ｌ・ 中間体２ 試薬１： 試薬２の合成 合成２からの出発物質、中間体、及び試薬の構造出発物質・ モノメトキノポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ、）に対する一般式： ％式％） 式中、Ｘは該ポリマーのキロドルトンにおける平均分子量を表し、ｎは反復する オキソエチレン基の平均数である。

中間体３６ 中間体４： 中間体５： ＣＨ，０−（ＣＨ２Ｃ）＋２０）、、、−（ＣＨ２ＣＨ２）　−ＮＨ２試薬２： 試薬３の合成 合成３からの出発物質、中間体、及び試薬の構造出発物質・ 中間体５゜ （ｍＰＥＧＩｌ−ＮＨ２１： ＣＨ，Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２０）。、、−（ＣＨ２ＣＨ２）　−ＮＨ２中間体６： 試薬３゜ 天然のＩＬ−１ｒａのＰＥＧ化反応を最適化するために、種々のパラメーターを 試験した。ＰＥＧ化の成功は、クーマシー染色５ＤＳ−ＰＡＥＧ上２９キロドル トンにおける目視検査で単一のしっかりしたピークを与えること、及び分析イオ ン交換クロマトグラフによる単一な鋭いピークによってアッセイされた。特に断 りがない限り、ＰＥＧ化反応は、ＩＬ−１ｒａに対するｍＰＥＧ試薬の比が２： ｌでｐＨ７，２のＨＥＰＥＳ緩衝液中１　ｍｇ　／　ｍｌの天然ＩＬ−１ｒａて 室温において行われた。これらの検討において使用された試薬は、ｍＰＥＧ−ア ミド−マレイミド（試薬２）であり、成績物は、ｍＰＥＧｘ”ＩＬ　−１ｒ　ａ と呼ばれるが、結果は、３つの試薬すべてに対して適用できた。

Ａ９時間 室温におけるＰＥＧ化反応は、０．５時間から２４時間まで分析された。ＩＬ− １ｒａのＰＥＧ化型への変換は、２乃至４時間で完了（８０％−９０％）Ｌ、ｍ ＰＥＧ′″　ＩＬ−１ｒａの質は、さらに長時間インキュベーションを行った後 、増加も減少もしない。５ＤＳ−ＰＡＧＥによってアッセイされたｍＰＥＧ”　 ＩＬ−１ｒａの質は、さらにバンドか現れることと、染色ゲル上のより高い分子 量のスミアが生ずるために長時間において低下する。

Ｂ　温度 ＰＥＧ化反応を４°、２５°、３７°、及び５０’でインキュベートし、次に、 ０．　５．　１．　２．　４及び１７時間後に分析した。２５°と３７°Ｃにお ける反応は、Ｉ乃至２時間以内に多量（約５０９６−８０％）のＰＥＧ化蛋白質 を生成したか、４°Ｃと５０°Ｃにおける反応は、長時間においてさえ、はるか に低収率（１０％−２０９０の結果となった。ｍＰＥＧ’″　ＩＬ−１ｒａの質 は、温度とともに有意に変化しないよってある。

Ｃ蛋白質濃度 ＰＥＧ化反応は、５０％ｇ／ｍｌとｌｏｍｇ／＋＋＋／の間の蛋白質濃度（天然 のままのＩＬ−１ｒａ）で行った。試験した濃度のすへてはよい結果を与え、ｍ ＰＥＧ”　ＩＬ−Ｉｒａの質には差がなかった。

Ｄ、ｐＨ 天然のままのＩＬ−１ｒａを、上述のｐＨ５，５と７゜５の間の反応条件下でＰ ＥＧ化した。ｍＰＥＧ”１Ｌ−Ｉｒａの品質は、５ＤＳ−ＰＡＧＥとイオン交換 によると、低いｐＨ（５，５）において僅かによいが、交換の百分率は同しであ る。

Ｅ　天然のままのＩＬ−１ｒａに対するｍＰＥＧ−アミド−マレイミドの比率 我々は、天然のままのＩＬ−１ｒａに対するｍＰＥＧ−アミド−マレイミドの０ ．５１から２０：ｌの間の比を試験した。約２１より高い比率、ＩＬ−１ｒａの ｍＰＥＧ化の形への効率的な変換（５０９６−９０％）を生じた。しかし、５・ ｌより大きな比は、還元５ＤＳ−ＰＡＧＥ上での余分な高分子量バンドの増加、 及びイオン交換クロマトグラフィーより、複数のピークを示す低質のｍＰＥＧ” 　ＩＬ−１ｒａを生成する。

使用されたパラメーター内で得られたｍＰＥＧ”　ＩＬ−１ｒａの量と物質の質 の両者についての最適反応条件は、ｍＰＥＧ−アミンに対するスルホ−３Ｍαの １：Ｉ比で生成したｍＰＥＧ−アミド−マレイミドを使用して、２　：　ＩｍＰ ＥＧ−アミド−マレイミド／ＩＬ−ｌｒａを２５°Ｃで２−４時間であった。こ れらの条件てＩ　Ｌ　−１ｒａの８０９６−９０％は、ｍＰＥＧ５０００、また はｍＰＥＧ３５００のいずれかを出発物として合成された試薬を用いて、ＰＥＧ 化した形に変換される（図３）。

Ｆ、ＩＬ−１ｒａＰＥＧ亜鈴の調整 ＩＬ−１ｒａを含む亜鈴複合体は、他のＰＥＧ化ＩＬ−１ｒａの分子種と同じ手 順て作られる。ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７，０中のＩＬ−１ｒａに対する２−４モ ル過剰のビスマレイミドＰＥＧが使用される。ＴＬ−１ｒａについては、使用さ れた分子量は、遊離で利用できるシスティン残基をもつ野生型であってよく、ま たは本発明中に記述されたように調整されたムティンであってよい。

ＩＬ−１ｒａは、２−５ｍｇ／ｍｊの濃度においてである。

反応は、４から６時間環境温度においてインキニーベートされる。ＩＬ−１ｒａ ＰＥＧ亜鈴化合物は、０から１０００ｍＭ食塩へのグレーディエンドを使用し、 ２０−５０２０−５Ｏ緩衝液中ｐＨ５，５におけるＭｏｎｏＳ陽イオン交換によ ってＰＥＧ化されていない、及び１つだけＰＥＧ化された分子種から精製される 。それ以上の精製は、下記のように、ＢｉｏＲａｄ　Ｔ　Ｓ　Ｋ　２５０、また は５ｕｐｅｒｄｅｘ　７５カラムを使用してサイズ排除クロマトグラフィーによ って達成することができる。

例ＩＩ１．　ＰＥＧ化天然ＩＬ−１ｒａの精製ｍＰＥＧｘ　”　ＩＬ−１ｒａの 精製は、陽イオン交換、またはサイズ排除クロマトグラフィーによって達成する ことができる。これらの手順は、上述の３つの試薬すべてから誘導されたＰＥＧ 化ＩＬ−１ｒａに適用てきる。

Ａ、陽イオン交換クロマトグラフィー ｍＰＥＧ、”　ＩＬ−１ｒａはＭｏｎｏＳ　（ファルマシア）カラムを使用して 、２０ｍＭＭＥＳ緩衝液ｐＨ５゜５で精製することかできる。蛋白質は、同じ緩 衝液中０から５００ｍＭ食塩の塩のグレーディエンドを使用して、カラムから溶 出された。例え１＠、修飾されていないＩＬ−Ｉｒａは、２２０ｍＭＮａＣｌに おいて溶出し、一方純度は、分析用イオン交換クロマトグラフィー、及び５ＤＳ −ＰＡＧＥをはじめとする種々の技術によって評価される。ｍＰＥＧｓｏｏｏｌ 　Ｌ−１ｒ　ａは、１６０ｍＭて溶出する（図４）。

Ｂ、サイズ排除クロマトグラフィー 約５２ｋｄとして挙動するｍＰＥＧｓｏｏｏ”　Ｉ　Ｌ　Ｉ　ｒａ、及び約６８ ｋｄ（サイズ既知の標準品でのカラムの較正ニ基づく）として挙動するｍＰＥＧ ｓａｏｏ”　ＩＬ　Ｉｒａは、未修飾のＩＬ−１ｒａ　（１７ｋｄ）から５ｕｐ ｅｒｄｅｘ７５　（ファルマシア）カラム上のサイズ排除クロマトグラフィーに よって、標準的なりロマトグラフィーの技術を用いて容易に分離することかでき る（図５）。

例ＩＶ：ｍＰＥＧｘ”　ＩＬ−１ｒａの特徴付は精製したｍＰＥＧｘ”　ＩＬ− １ｒａはＭ　ｏ　ｎ　ｏ　Ｓ上での再クロマトグラフィーを行うとき、単一の対 称的ピークを与え、５ＤＳ−ＰＡＧＥとサイズ排除クロマトグラフィー（図３と ４）によって純粋のようであった。ＩＬ−ＩｒａとｍＰＥＧｓｏｏｏｌ　Ｌ　Ｉ 　ｒ　ａのトリプシンマツプを比較すると、ｃｌ１６とｃ１２２を含むペプチド に相当する１つのピークを示し、これは結合体のマツプには存在せず、新しい幅 広いピークか現れた。この新しいピークをキモトリプシンでさらに消化し、そし て、それに続くアミノ酸を分析することによって、ａｌ１６は、使用された条件 下てＰＥＧ化されていたことが示された突然変異誘発は、バクテリオファージＭ １３にクローニングされたＩＬ−１ｒａの遺伝子からの一本鎖ＤＮＡ上て遂行さ れた。Ｋｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　ｖｏｌ。

１５４．３６７−３８２頁（１９８７）によって記述された手順を使用している ＢｉｏＲａｄのＭｕｔａｇｅｎキットか使用れさた。手短かに述へると、一本鎖 ＤＮＡのテンブレー成され、その結果、チミジンの代りに、ウラツルを含むテン プレートを生じた。長さか２０と３０の塩基対の間の突然変異誘発オリゴヌクレ オチドを、テンブレー１−に対してアニールし、ＤＮＡポリメラーゼとＤＮＡリ ガーゼを使用して、２番ｌ−１のストランドか再合成された。反応混合物を使用 して、その中では、ウラツルを含むストランドか、ＤＮＡ修復によって分解され 、変異ス１〜ラントか複製できるようになっている、野生株Ｅ、ｃｏｌｉ、菌株 を形質転換した。変異ファージをスクリーニングし、標準技術によって配列を決 定した。変異遺伝子を含む断片にサブクローンし、そしてＴ７発現システム菌株 発現クローンを、１５μｇ／−テトラサイクリンを補添したＬｕｒｉａ　Ｂｒｏ ｔｈ中で、３７°Ｃて生育させた。培養物か６００ｎｍで吸光度０．８に達した とき、３０℃に移行させ、Ｉ　ＰＴＧを最終ａ度か１ｍＭの濃度になるように加 え、ＩＬ−１ｒａ遺伝子の発現を誘発した。ＩＬ−Ｉｒａの蛋白質の全蓄積量は 、４−６時間後に最大となり、誘発後１２時間までは、存意に変化しなかった。

例ＶＩ：ＩＬ−１ｒａムティンの精製 上に記述したように、誘発された細胞培養物を、１００００ｇで１０分間遠心分 離することによって収穫した。

細胞を２０　５０ｍ１ｓのｐＨ５，２の３０ｍＭのナトリウムアセテート緩衝液 中に再懸濁させた。溶菌は、１８０００ｐｓｉにおけるＦｒｅｎｃｈ　Ｐｒｅｓ ｓｕｒｅ　ｃｅｌｌを２回通過させることによって達成した。細胞溶解物を１０ ０００ｇで１０分間遠心分離した。可溶部分をＳ−セファロースカラム上にのせ 、７５ｍＭのＮａＣ１を含む同じ緩衝液で洗浄した。ＩＬ−１ｒａムテインは、 ２００ｍＭＮａＣｌを含む同し緩衝液で溶出した。イオン交換樹脂上を、ただ１ 回通過させると、ＰＥＧ化の検討には十分な純度（〉９５％）の成績物を生した 。それ以上の精製はＱ−セファロースやＭ　ｏ　ｎ　ｏ　Ｑのような他のイオン 交換樹脂を使用して達成することかできる。この手順は、いくつかのＩＬ−１ｒ ａムテインについて同様に首尾よく用いられた。ある場合には、アミノ酸配列の 変化により、蛋白質の荷電に小さい変化か生じているムティン類を精製するため にｐＨそして／または、食塩の濃度を僅かに変更することが必要であった。この 技術分野に普通に熟達した人々において、容易に操作されるであろうこれらの僅 かな変更とともに、この手順は、検討されたすべてのムティンに一般的に適用で きる。

例■：ＩＬ−１ｒａムティンのＰＥＧ化天然のままのＩＬ−１ｒａの外に、ｃ８ ４ｓｌ１６゜ｃ８４ｃｌ１６．ｃｏｓｌｌ、６．及びｃ９ｓｌ１６のムティンか ＰＥＧ化された。天然のままのＩＬ−１ｒａのために使用されたのと同じ条件を 使用して、ｃ８４ｓｌｌ６とｃ８４ｃｌ１６のＰＥＧ化形が産生され、精製され た。ｃ８４ｃｌ　１６は、２つの反応生システィンを含むので、ＰＥＧ化の結果 、ＳＤＳ　ＰＡＧＥ上で、約４０ｋｄにおけるより高い分子量の蛋白質を生ずる 。この蛋白質は、陽イオン交換、またはサイズ排除クロマトグラフィーによって 精製されることができ、ＰＥＧ５０００を使用したときには、後者で約６８ｋｄ の期待された分子量で溶出する。

例■：ｍＰＥＧ”　ＩＬ−１ｒａの有効性ＰＥＧ化さた自然のままのＩＬ−１ｒ ａ分子の有効性は、Ｓ”　−ＩＬ　−１ｒ　ａをリガンドとして使用する標準拮 抗的受容体結合アッセイによって試験された。マウスｌ型ＩＬ−１ｒａ受容体を 含むマウス細胞（ＥＬ４）、またはクローンド遺伝子からヒトタイプｌ受容体を 発現するハムスター細胞（ＣＨＯ）か、９６−ウェルミクロリッターディツシュ 中で、それぞれ、ウェルあたりＩ×１０＠細胞と、ウェルあたりｌＸｌ０’細胞 て使用された。比放射能か、４００　ＱＣｉ／ｍｍｏ　１のＳ”−ＩＬ−１ｒａ を、＋５０ｐＭの最終濃度になるように加えた。

非放射性リガンドを２８ｍＭから１３ｐＭの連続希釈において加え、４℃で４時 間インキュベートさせた。細胞は次に、ミリリッターフィルタープレート（Ｍｉ ｌｌｉｐｏｒｅ　、　、５ミクロンボーアサイズＤｕｒａｐｏｒｅｆｉｌｔｅｒ ）を通して濾過し、洗浄して非特異的に結合したカウントを取出し、フィルター を除去し、Ａｍｂ　ｉ　５Ｒａｄｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｉｍａｇｉｎｇ　 Ｓｙｓｔｅｍ上でカウントした。平衡解離定数（ＫＤｓ）を計算し、そして、Ｐ ＥＧ化された、及び修飾されていないＩＬ−１ｒａの型を比較するのに使用した 。修飾されていない野生型のＩＬ−１ｒａとｃ８４ｓｌ１６は、我々のアッセイ において、１５０−３００　Ｍのタイプｌマウス受容体について等しいＫＤ’　 ｓを有していた。ＩＬ−１ｒａのＰＥＧ化形についてのＫＤは約４００−８００ ０９Ｍであり、ＰＥＧ化ｃ８４ｓ１１６１：対しては、５００−１０００ｐＭで あり、それぞれ、非修飾蛋白質のそれより２．５倍、及び３．５倍高い。１つ（ ｃ６ｓｌ１６）を除き、すべてのＰＥＧ化されていないムティンのＫＤｓは、天 然のままの蛋白質の６５−１５０％以内であり、これは、アッセイの標準的誤差 の範囲内である。表１参照。

表１゜ ＰＥＧＩＬ−１ｒａ分子の分析 野生型　１７．５　１００ データは無修飾ｌｌ−１ｒａによって示された活性の百分率として示されている 。標準偏差はｌ０９６以内である。

例ＩＸ：ＰＥＧ化天然のままのムティンＩＬ−１ｒａいくつかのＰＥＧ化天然の まま、及びムティンのＩＬ−Ｉ　ｒａ分子の薬物動態学的特性が分子をラットに 静脈注射した後試験された。天然のままの、またはＰＥＧ化したＩＬ−１ｒａは 静脈内ポーラス投与（３■／　ｋｇ　）で注射された。連続の血液検体を尾静脈 から採取し、天然のままの、またはＰＥＧ化したＩＬ−１ｒａについて酵素−結 合イムノ゛ノルベントアッセイ（ＥＬ　ｉ　ＳＡ）によってアッセイした。その 結果得られた経時的血漿中濃度プロファイル（図８）は、ＰＥＧ化は、静脈注射 後の血漿からのＩＬ−１ｒａの消失に著しい影響を有していることを物語ってい る。血漿中のＩＬ−１ｒａとＩＬ−１ｒａのＰＥＧ誘導体の消失は、３つの指数 成分によって最もよく記述される。ラットにおいて、データによると、ＰＥＧ化 はこれらの指数成分の半減期を６倍まで延長することか示されている（表２）。

これらの指数成分の半減期は、ＰＥＧ分子のサイズか増加するにつれて増加する （表２）。その上、半減期の延長は、ＰＥＧ化の部位特異的であると考えられる 証拠かある。図８のデータを解釈するために標準コンパートメント解析か使用さ れた。半減期の延長は、受入れられた薬物動態学的理論に基づいて説明すること ができる。その理論によれば、薬物に対する血漿半減期は、薬物に対する血漿ク リアランスと逆の関係にあり、そして、薬物のための見かけの分布容量に直接関 係している。血漿からのＰＥＧ化ＩＬ−１ｒａの消失の薬物動態学的解析により 、半減期の減少は、天然のままのＩＬ−１ｒａに比へて、ＰＥＧ化分子について の血漿クリアランスか減少したことと逆の関係にあることが示唆される（表２） 。血漿クリアランスの減少は、腎臓によるＰＥＧ化分子の糸球体濾過の予想され た減少と一致している。また、ＰＥＧ化による半減期の延長は、ＰＥＧ化分子の 分布（Ｖｄ定常状態、表２）の増加に直接関係している。分布容積の増加は、Ｐ ＥＧ化分子の細胞外プールへのＰＥ０分子のより大きな透過を示している。この 機作によって、ＰＥＧ化は、活性分子が全身的循環から、ＩＬ−１受容体が位置 していると期待されるコンパートメントである血管外コンパートメントへ移動す る程度か増加することによってＩＬ−Ｉ　ｒａての治療が改善される。ラットと ヒトの間のＩＬ　−１ｒ　ａについてのクリアランスと分布の機作か類似してい るため、ＰＥＧ化が、ヒトにおけるＩＬ−１ｒａの薬物動態学的特性を同様に改 善することは明らかである。

８つのさらなるＰＥＧＩＬ−１ｒａのムティンについての静脈内薬物動態学か、 前に記述された方法を使用して特徴付けられた。各分子についての静脈血漿中濃 度の経時曲線を含むプロットが添付されている（図１０）。

静脈内薬物動態学的データ（表３）のすべてを検討するとＰＥＧＯサイズ（Ｉこ 結合か２こ結合）か増加するにつれて、血漿中クリアランスか減少し、そのため 静脈内平均残存時間と血漿中ＩＬ−１ｒａ消失半減期が増加することか示された 。ＰＥＧ化の部位は、ＰＥＧ化が平均血漿クリアランスを減少し、平均残存時間 を延長する程度を決定する上で重要である。ＩＬ−１ｒａに２このＰＥＧ５を付 加すると、野性型ＩＬ−１ｒａと比較して静脈内平均残存時間は１４倍延長され る。

２、ＰＥＧ化ＩＬ−１ｒａについての皮下薬物動態学分子をラットに皮下注射し た後、ＰＥＧ化ＩＬ−１ｒａムテインの吸収の薬物動態が特徴付けられた。連続 血液検体を尾静脈から採取し、天然のままの、またはＰＥＧ化されたＩＬ−１ｒ ａについて酵素拮抗イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）よってアッセイし た。その結果上じた皮下血漿ＩＬ−１ｒａの濃度の経時曲線か図１１にプロット されている。皮下薬物動態学的データ（表３）によってＰＥＧの部位とサイズに 関連した、そして非最適化製剤における皮下注射に関連したＰＥＧ化ムティンに ついての変動性全身性アベイラヒリティーか明らかになった。表３によって、ま たＰＥＧ化の皮下注射されたＩＬ−１ｒａについての平均残存時間に対する著し い正の影響が明らかとなっている。ＰＥＧのサイズか増加するにつれ、一般に平 均残存時間は増加する。この増加は、おそらくリンパ性循環（より長い平均吸収 時間）通じての分子量−サイズに関連したより遅い吸収、ならびにＰＥ０分子が 全身性循環（血漿）に到達した後のクリアランスの遅延のためであろう。この延 長は深くヒトにおける皮下ＩＬ−１ｒａの薬物動態学的み直しの過程を通じて付 着した余分のシステムを除去するために、環境温度で３０分間、ｐＨ７，０の５ ０ｍＭＨＥＰＥＳ中のモル濃度で６−倍過剰のＤＴＴに曝した。

次に、ＤＴＴを除くために、蛋白質を抜気した５０ｍＭＨＥＰＥＳ　ｐＨ７，０ に対して２時間透析した。次にｃ１０５　３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤を、モル濃 度で５倍過剰のＰＥＧ化試薬Ｉ　（例ＩＡ参照）とｐＨ７，０の５０ｍＭ　ＨＥ ＰＥＳ中環境温度で２時間反応させた。

ムティンの約６０％がＰＥＧ化形に変換された。

ｃ１０５ＰＥＧ化反応混合物をスーパーテックス−７５ＦＰＬＣカラム（ファル マシア）上にのせ、５０ｍＭトリスｐＨ７，０，１００ｍＭＮａＣ１中０．２５ ｍＮ’／分て流した。ｃ　Ｉ　Ｏ５−ＰＥＧ３０ＫＤａＴＮＦ−阻害剤を含む両 分をプールし、ＴＳＫ−２０００ＳＷＨＰＬＣカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　）　ｌ にのせ、同じ緩衝液中で、０゜２ｍｌ／分て流した。銀で染色した５ＤＳ−ＰＡ ＧＥによって決定した実質的に純粋なｃ　１０５−ＰＥＧ３０ＫＤａ　ＴＮＦ− 阻害剤をプールし、蛋白質濃度Ｂｉｏ−Ｒａｄ蛋白質アッセイによって測定した 。図９を参照。

活性は、１９９０年７月１９日に出願した米国特許出願Ｎｏ、０７１５５５，２ ７４に記述されたようにネズミＬ９２９細胞ＴＮＦ細胞毒性アツセイを使用して 測定した。

例Ｘ■：ビスーマレイミトＰＥＧの調整ＰＥＧのα−（２−アミノエチル）ω− アミノポリ（オキシエチレン）誘導体（以後、ビスアミノＰＥＧ）の合成は、３ つの段階から成り立っていた：　１　）　Ｎｉ１ｓｏｎとＭｏ５ｂａｃｋによっ て（Ｎｉｂｓｏｎ　ら、ＭｅｔｈＯｄＳ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　ｖｏｌ 、　１０４　、　５６頁、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｉｎｃ、、　Ｎ、　Ｙ、　、　Ｎ、　Ｙ、（１９８４）記述されたように、トレ シルクロライドを使用する水酸基のスルホン化。

２）トレシル化した中間体のフタルイミドによる置換（Ｐｉｌｌａｉ９．　Ｊ、 　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｍ、　ｖｏｌ、　４５．５３６４頁（１９８０））、　そし て、３）ヒドラジンヒトラードのフタイルミド中間体のアミンへの還元（Ｐｉｌ ｌａｉ、上記）。

出発物質、中間体、及び成績物の構造は、この例に対する付録１に示されている 。２，４．６−ドリニトロンベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳＡ）アッセイによっ て測定されたように、最適条件によって水酸基の約８０％の変換か可能であった 。ビスアミノＰＥＧは、反応混合物から、イオン交換クロマトグラフィーによっ て精製することができる。これは、ダイマー形成を妨害しつる反応副産物を除去 するための鍵となる段階である。

ビスアミノＰＥＧをマレイン酸無水物を使用してアシル化しくＢｕｔｌｅｒら、 ＩＪｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　ｖｏｌ、２５　。

１９１頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｎ、　Ｙ、　、　Ｎ 、　Ｙ。

（１９７２））、結果として得られた中間体を閉環して、α−（２−マレイミド エチル−ω−マレイミドポリ（オキシエチレン）（Ｗｉｎｓｃｈら、Ｂｉｏｌ、 　Ｃｈｅｍ、　Ｈｏｐｐｅ−３ｅｙ１ｇｒｖｏ１．３３６．　５３頁（１９８５ ））を産生じた。この誘導体は、マイケル付加を通じて、スルフヒドリル基と反 応し、安定な千オニーチルを形成する。

ポリエチレングリコールＰＥＧ、に対する一般式はＨＯ−（ＣＨ２ＣＨ２０）、 −Ｈ である。

式中、Ｘはキロトルトンにおけるポリマーの平均分子量を示し、ｎは反復するオ キシエチレンの平均数である。

中間体Ｉ Ｆ５−ＣＨ２−５０２−０−（ＣＨ２ＣＨ２０）。−、−（ＣＨ２ＣＨ２）　− ０−５ｏ２−ＣＨ２−Ｆ３８２Ｎ−（ＣＨ２ＣＨ２０）、、、−（ＣＨ２ＣＨ２ ）　−ＮＨ２Ｏ−（２−マレイミドエチル＞　−ｏ’　−メチルーボリエＰＥＧ 化ｃ１０５　３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤分子種のうち４つの分子種の阻害効果を、 ｉｎ　ｖｉｖｏで、ＴＮＦによって刺戟される２つの異なる生理作用について試 験された。１つのエンドポイントは、静脈内にヒト組換え体ＴＮＦを注射したマ ウスの血漿中に、ＩＬ−６が出現することであった。２番目のエンドポイントは ヒト組み換え体ＴＮＦの腹腔内投与後に腹腔への好中球の移動の増加であった。

実験１．　ヒト組み換え体ＴＮＦと同時にｃ１０５３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤（Ｐ ＥＧ、、ｏＯ，、ＰＥＧ５．ｓｏｏ　。

Ｐ　Ｅ　Ｇ　、、。。。）を静脈用投与すると、マウスの血漿中のＩＬ−６の誘 導を阻害する。

体重か２０から２３ｇのＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ雌性マウスを使用して、ヒト組 み換え体ＴＮＦによる血漿ＩＬ−６水準の誘導を測定した。予備的実験では、２ つの用量のヒト組換え体ＴＮＦ　（図１２）の尾静脈からの静脈内投与後、血漿 中に出現したＩＬ−６について経時的にプロットした。ピークＩＬ−６水準は、 マウスあたり１０または２０ｇｇの組み換え体ＴＮＦての刺戟後２時間で起った 。

その後の実験には、低い用量が使用された。

ＣｌＯ５３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤Ｐ　Ｅ　Ｇ　ｚ。。ｏ亜鈴の力価をＰＥＧ化 されていないＣｌＯ５３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤のそれと比較した。ヒト組み換え 体ＴＮＦをマウスあたり１０ｇｇ用量において、単独またはＴＮＦ阻害剤と同時 に静脈内に注射した。ＴＮＦに対する４つの異なる反応を試験した。（図１３） 。その比を蛋白質含量に基いて計算した。各用量において３匹のマウスを試験し た。ＩＬ−６濃度水準をＥＬＩＳＡによって測定した。

ＣｌＯ５３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤もＣｌＯ５３０Ｋ　Ｄ　ａ阻害剤ＰＥＧ２ｏ ｏ０亜鈴もＴＮＦに対してｌ０１１及び５．ｌの比で投与したとき、ＩＬ−６水 準のほぼ完全な阻害を生した。１　ｌの比率に゛おいては、ＣｌＯ５３０ＫＤａ 　ＴＮＦ阻害剤ＰＥＧｚｏｏ。亜鈴は、ＴＮＦ　、ＩＪＬ独によって刺戟された ＩＬ−６水準の９５９６の減少を起したのに対し、ＰＥＧ化していないＣｌＯ５ ３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤は、ＩＬ−６を約７０９６たけ減少させたに過ぎなか った。本実験の結果は、試験された比率において、ＣｌＯ５３０ＫＤａ　ＴＮＦ 阻害剤もＣｌＯ３３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤Ｐ　Ｅ　Ｇ　２．、、亜鈴とともに 、このＴＮＦによって刺戟された生理学的パラメーターのすぐれた阻害剤である ことを示している。１：１の比率においてＣｌＯ５３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤Ｐ ＥＧ２゜。。亜鈴は、ＰＥＧ化されていない阻害剤よりも大きな百分率阻害を示 した。

ＰＥＧ化、ＣｌＯ５３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤の２つの他の分子種を試験した。

ＣｌＯ３３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤Ｐ　Ｅ　Ｇ　ｘ、　ｓｏ。亜鈴とＣｌＯ５３ ０ＫＤａＴＮＦ阻害剤ＰＥＧ、。。。。亜鈴の阻害効果を血漿中ＩＬ−６誘導に ついて試験した。該阻害剤をヒト組み換え体ＴＮＦと同時に１＝１比率（ＣｌＯ ５３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤亜鈴：　ＴＮＦ）で静脈内注射によって投与した。

２つの阻害剤処置グループのそれぞれにおいて、３匹のマウスを試験した。１０ 匹のマウスにＴＮＦ単独で注射した。ｌ、１の比率で投与したとき、ＣｌＯ５３ ０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤Ｐ　Ｅ　Ｇ　、、　ｓｏｎ亜鈴か、ＣｌＯ５３０ＫＤａ 　ＴＮＦ阻害剤ＰＥＧ、。。。。亜鈴のいずれかを注射したマウスの血漿中に検 出され得るＩＬ−６は測定されなかったのに対し、ヒト組み換え体ＴＮＦ単独を 注射したマウスにおいては、有意なＩＬ−６応答かひき出された。

２つの実験の結果は、刺戟に対して低比率（ｌ・ｌ）で投与されたとき、ＣｌＯ ５３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤Ｐ　Ｅ　Ｇ　ｔｏｏ＝、Ｐ　Ｅ　Ｇ　＝、　ｇ−、 及びＰ　Ｅ　Ｇ　、、、　ｏｅｅ亜鈴は、ヒト組み換え体ＴＮＦによる血漿中Ｉ Ｌ−６の誘導のすぐれた阻害剤であることを示す。

実験２　ヒト組み換え体ＴＮＦの腹腔内投与と同時に行ったＣｌＯ５３０ＫＤａ 阻害剤（Ｐ　ＥＧｓ、ｓｏ。、ＰＥ　Ｇ　＋ｏ、　００＋１＋　及びＰ　Ｅ　Ｇ 　２０ｏ００）の皮下投与は、腹腔内における好中球の移動を阻害する。

体重２０ｇから２３ｇのＢＡＬＢ／ｃ雌性マウスを使用して、ヒト組換え体ＴＮ Ｆて刺戟した後、好中球の腹腔内への移動を測定した。使用される技術は、Ｋｉ ｍ　Ｍｃ　１ｎｔｙｒｅ　ら、　（Ｊ、Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、ｖｏｌ、Ｉ　７３． 　９３１頁（１９９１））のそれてあり、ここでは手短かに述へる。マウスに０ ．１ｍｌの容量のＴＮＦを腹腔内へ直接注射する。

４時間後にマウスを層殺し、死後直ちに腹腔内洗浄を行う。４　ｍｌのＨａｎｋ の平衡塩類溶液（ＨＢＳ）（カルシウムとマグネシウムを含まない）を腹腔内に 注射する。腹部を静かにマツサージする。腹腔液を針と注射筒で吸引回収する。

腹腔細胞の全数を、Ｃｏｕｌｔｅｒカウンター上で計数する。細胞懸濁液の一部 量を、スライド上で乾燥し、Ｄｉｆｆｋｗｉｋ染色を行う。細胞の分類計数は、 直接顕微鏡検査によって行われる。１０（ｌこの細胞を試験し、好中球、リンパ 球、またはマクロファージとして分類する。

予備的実験において、パイロジエンを含まない食塩水か、７．５ｎｇヒト組み換 え体ＴＮＦのいずれかの腹腔内投与の後に、洗浄液の組成を比較した。ＴＮＦは 、好中球の百分率と腹腔洗浄液に存在する好中球の絶対数の増加をひき起した。

食塩水で処理されたマウスでは、９゜４ＸＩＯ’の好中球が、洗浄液中に回収さ れ、全腹腔細胞の２．３％を占めているに過ぎなかった。ＴＮＦ　（７゜５ｎｇ ）処理マウスでは、好中球の総数は、１２．９Ｘ１（１５まて増加し、好中球の 百分率は１９．７％へと増加した。

ＰＥＧ化されていないＣｌＯ５３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤の力価も、ＣｌＯ５３ ０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤（ＰＥＧ、、６．、、ＰＥＣ；、、、、、、、及びＰ　 Ｅ　Ｇ　２ｏ、　。−ｏ亜鈴）と共に比較した。ＴＮＦの刺戟を、マウスあたり ７．５ｎｇの一定に保ちツツ、阻害剤を１００：１，１０・１．及びＩ：１（Ｃ ｌＯ５３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤分千種：ＴＮＦ）の比率で試験した。比率は、 蛋白質含量に基づいて計算した。マウスにはＴＮＦの腹腔内投与と同時に、Ｃｌ Ｏ５３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤を皮下注射した。６匹のマウスを、各投与群にお いて試験した。４時間後に腹腔洗浄液を採取し、分析した。図１５に示された値 は、腹腔洗浄液中の好中球の百分率である。

ＰＥＧ化されていなＣｌＯ５３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤と、ＣｌＯ５３０ＫＤａ 　ＴＮＦ阻害剤Ｐ　Ｅ　Ｇ　ｓ、　ｓ。。亜鈴が、好中球移動を有意に阻害した 最小濃度は、１００：ｌである。ＣｌＯ５３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤ＰＥＧ、、 。。。とＰＥＧ、。、。。。亜鈴は、好中球移動をｌＯ：１の比率で有意に阻害 した。

本実験の結果は、ＣｌＯ５３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤Ｐ　ＥＧ２．ｗ。、Ｐ　Ｅ Ｃｚｏ、ｏｏｏ、及びＰ　Ｅ　Ｇ　ｔ。、　ｏｏｏ亜鈴は、腹腔へのＴＮＦ−促 進好中球移動のすぐれた阻害剤であることを示している。ＣｌＯ５３０ＫＤａ　 ＴＮＦ阻害剤ＰＥＣｚｏ。。。とＰＥＧ、。６゜。。亜鈴は、ＰＥＧ化していな いＣ１０５３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤、及びＣ１０５３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤 Ｐ　Ｅ　Ｇ　Ｉ　５ｏｉ１よりも強力であった。

例ＸＩＶ：ｃ１０５　３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤ＰＥＧＤ組み換え体ｃ１０５　 ３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤２−３■／−をモル濃度で４倍過剰のＤＴＴで環境温 度で２時間処理する。次に、ＴＮＦ阻害剤を抜気した５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７，０に対して４０°Ｃで３時間透析する。ＰＥＧに結合した亜鈴を創製するた めに、ＴＮＦ阻害剤を、ｐＨ７，０の５０ｍＭＨＥＰＥＳ中の異なるモル比のヒ ス−マレイミドＰＥＧと反応させる。阻害剤は、等モル比ビス−マレイミドＰＥ Ｇと反応する。反応は、環境温度で３−１２時間インキュへ−１・される。イン キュベーション後、ＰＥＧと結合したＴＮＦ阻害剤亜鈴を、２６０ｍＭ、３１０ ｍＭ、及び３５０ｍＭ食塩の段階的グレーディエンドをかけて、ｐＨ４，０の５ ０ｍＭＨＯＡＣ中ＭＯＮＯ−３ＦＰＬＣを使用して、ＰＥＧ化されていない、及 びただ１つだけＰＥＧ化されたＴＮＦ阻害剤から精製する。ＰＥＧ−結合ＴＮＦ 阻害剤亜鈴は、３１０ｍＭ食塩段階において溶出する。残存するＰＥＧ化されて いないＴＮＦ阻害剤は、すべてスーパーデックスフ５上のクロマトグラフィーに よって除去される。

段階的試薬の添加 ＤＴＴ処理とｐＨ７，０の５０ｍＭＨＥＰＥＳへの透析の後、等モル量のビス− マレイミドＰＥＧを添加し、１．５時間のインキュベーションの後、もう１回等 モル量のビス−マレイミドＰＥＧを添加する。これを１．　５時間インキュベー トする。これは、ＰＥＧ−結合亜鈴形成の最適水準につながる。次にＰＥＧ試薬 のモル濃度で、２倍の過剰を添加上、最終ＰＥＧ−ＴＮＦ阻害剤の４＝１の比率 を与える。これを、２時間インキュベートし、混合物を５０ｍＭアセテートｐＨ ４，０中に透析し、ＭｏｎｏＳクロマトグラフィーにかける。これは、主として ＰＥＧ−結合ダイマーと１つだけＰＥＧ化されたＴＮＦ阻害剤の混合物を生ずる 。これによって、１つだけＰＥＧ化されたＴＮＦ阻害剤と亜鈴の間の方か、亜鈴 とＰＥＧ化されていないＴＮＦ阻害剤の間よりも大きな分離が得られるため、Ｐ ＥＧ−結合亜鈴のより効率的な精製かできるようになる。

この手順によって、亜鈴の生成が最適化され、より効率的な精製か可能となった 。

段階反応。

ＤＴＴ処理と５０ｍＭＥＰＥＳｐＨ７，０の透析の後、モル濃度で８倍過剰のヒ ス−マレイミドＰＥＧを添加する。これを環境温度において２時間インキュベー トする。

これにより実質的にすべてのＴＮＦ阻害剤がただ１つＰＥＧ化された形に変換さ れる。１つだけＰＥＧ化された阻害剤は、ＮａＣｌのグレーディエンドをかけ、 ｐＨ４゜０の５０ｍＭアセテート中てＭｏｎｏ−３ＨＰＬＣを使用してＰＥＧ試 薬と残存未反応ＴＮＦ阻害剤すべてから分離される。１つＰＥＧされた物質をｐ Ｈ７，０の５０ｍＭＨＥＰＥＳ中へダイアフィルターし、２−４ｍｇ／ｍｌまで 濃縮した。ＤＴＴで処理したＴＮＦ阻害剤を、次に、ＰＥＧ−結合亜鈴の形成が できるように添加する。２時間後に、ＰＥＧ−結合亜鈴をＭｏｎｏ−３ＨＰＬＣ を使用して精製する。この方法は、２番目の異なる蛋白質化合物を添加すること によって、ＰＥＧ結合へテロ亜鈴を形成するために使用できる。

この手順は、亜鈴形成を最適化し、ヘテロ亜鈴化合物の形成のために使用できる 。しかし、この手順は幾分労力と時間かかかる。

ＰＥＧ−結合ＴＮＦ阻害剤−亜鈴の生物活性ネズミＬ９２９細胞毒性アッセイに おいて、Ｃ１０５３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤亜鈴がＴＮＦαの細胞毒性を阻害す る能力を測定した。これによって、これらの分子についてＥＤ、。か測定できる ようになった。

それらは以下の様である： 野性型ｒＴＮＦ阻害剤　２２０ｎｇ／ｍｌＢＭ−結合亜鈴　２２０ｎｇ／ｍｔ’ １９００ＭＷ　ＰＥＧ−亜鈴　４．１ｎｇ／ｍ１３５００ＭＷ　ＰＥＧ−亜鈴　 ４．８ｎｇ／ｍ／１０、ＯＯＯＭＷ　ＰＥＧ−亜鈴　４．６ｎｇ／ｒｎ１２０、 ＯＯＯＭＷ　ＰＥＧ−亜鈴　４．２ｎｇ／ｒｄＴＮＦ阻害剤亜鈴は、Ｌ９２９バ イオアッセイにおいてＴＮＦβの細胞毒性を阻害する上でも活性が大きく増強さ れた。ＴＮＦβに対するＥＤ、。値は以下の如くである。

野性型ｒＴＮＦ阻害剤　７０μｇ／ｍ１３４００ＭＷ　ＰＥＧ−亜鈴　８０μｇ ／ｍ１２０、ＯＯＯＭＷ　ＰＥＧ−亜鈴　２２μｇ　／　ｍｌいくつかのＰＥＧ 化３０ＫＤａ　ＴＮＦ阻害剤分子の薬物動態的特徴が、ラットに対する分子の静 脈内投与後決定された。天然のままの、またはＰＥＧ化ＴＮＦ阻害剤を静脈内ポ ーラス投与として注射した。連続血液検体を尾静脈から採取し、ＰＥＧ化されて いないか、ＰＥＧ化されたＴＮＦ阻害剤について酵素結合イムノソルベントアッ セイ（ＥＬＩＳＡ）によってアッセイした。結果として得られた静脈内血漿中Ｔ ＮＦ阻害剤濃度の経時変化のプロファイル（図１６）は、ＰＥＧ化が、静脈注射 後の血漿からのＴＮＦ阻害剤の消失について著しい影響があることを説明してい る。統計学的モーメント理論（曲線化面積（ＡＵＣ）と初期モーメント曲線上面 積を使用して図１６のデータを解釈した。データは、ＰＥＧ化がＴＮＦ阻害剤の 静脈内平均残存時間をラットにおいて５０倍まで延長することを示している（表 ４）。静脈内平均残存時間は、結合したＰＥＧ分子の大きさが増加するにつれて 増加する（表４）理論によって特定されていないけれども、平均残存時間の延長 は、ある薬剤についての静脈内平均残存時間は、その薬剤についての血漿クリア ランスと逆の関係にあり、薬剤のみかけ上の分布容積に直接関係すると述へる在 来の薬物動態学的理論に基づいて説明することかできる。血漿からのＰＥＧ化Ｔ ＮＦ阻害剤の消失の薬物動態学的解析は半減期の延長は、ＰＥＧ化されていない ＴＮＦ阻害剤にくらへて、ＰＥＧ化された分子についての血漿クリアランスの減 少と逆の関係にある（表４）。血漿クリアランスの減少は腎臓による糸球体濾過 における期待されたＰＥＧ分子サイズ関連減少と一致している。ＴＮＦ阻害剤に 対する血漿クリアランスの機作におけるラットとヒトの間に、おそらく質的な類 似性かあるために、ＰＥＧ化がヒトにおいてＴＮＦ阻害剤薬物動態学的性質を改 善することは明らかでＰＥＧ化ＴＮＦ阻害剤の吸収薬物動態学かラットに分子を 皮下注射した後特徴付けられた。連続血液検体を尾静脈から採取し、ＰＥＧ化さ れていないか、ＰＥＧ化されたＴＮＦ阻害剤の濃度を、経時的にアッセイし、図 １７にプロットされている。皮下薬物動態学的データ（表４）から、ＰＥＧの大 きさと関係したモして非−最適化製剤における皮下注射と関係したＰＥＧ化分子 についての変動性の全身性アベイラビリティ−が明らかになっている。表４から 、皮下注射したＴＮＦ阻害剤についての平均残存時間に関するＰＥＧ化の陽性の 影響も明らかになっている。ＰＥＧのサイズが大きくなるにつれて一般的に平均 残存時間は増加する。理論によって特定されてはいないが、この増加は、リンパ 循環（より長い平均吸収時間）を通じてのサイズ−関連のより遅い吸収ならびに 、ひとたびＰＥＧ化した分子が血漿に達すると、クリアランスが遅延される結果 であるらしい。この延長は深く、ヒトにおける皮下ＴＮＦ阻害剤の薬物動態学的 特徴を改善する。

溶解度の検討の結果は、図１８に示されている。溶解度曲線は、ＩＬ−１ｒａの ３つの異なる調整物及びＩＬｌｒａＰＥＧｓｓ。。について示されている。実験 は、ミクロリッタープレート中で３７℃で行われ、すべての蛋白質は１６０■／ 　ｍｌであった。プレートは、カバーでシールされ、次にプレートリーターによ り、種々のタイムポイントで、４０５ｎｒｎにおいて読まれた。吸光度の増加は 、蛋白質の沈澱の証拠である。天然のままのＩＬ−Ｉｒａに比へて、ＰＥＧ検体 については、明らかに溶液から析出する蛋白質の量の減少がみられた。

３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤 天然のままの３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤は、５■／−を超える濃度まで濃縮できな い。ＰＥＧ化の後、溶解度は少くとも５倍増加した。

例Ｘ■：ＩＬ−２阻害剤へテロ亜鈴の調整ＰＥＧ−結合へテロ亜鈴は、最初にＩ Ｌ−２ｒαを過剰のヒス−マレイミドＰＥＧの存在下で、ＰＥＧ化することによ って形成することかできる。１つだけＰＥＧ化されたＩＬ−２ｒαを精製するこ とができ、そして、ＩＬ−２ｒβを加えて残存反応性マレイミド基と反応させ、 ヘテロダイマーを形成させることができる。

ＩＬ−２ｒαのＰＥＧ化の潜在部位には、アミノ及びカルボキシ末端残基、２つ のＮと結合したグリコジル化部位ならびに分子中の天然のままの遊離システィン 残基が含まれる。ＩＬ−２ｒαの可溶性ＩＬ−２ｒαの細胞外ドメイン中の１９ ２位のシスティン残基はジスルフィド結合に関与していないことが同定されてい る。

（Ｍｉｅｄｅｌら、ＢＢＲＣ，Ｖｏｌ、１５４．　３７２頁（１９８８））。こ のシスティン残基は、ＩＬ−２ｒαに対するＩＬ−２の結合に影響しない抗−Ｉ Ｌ−２ｒαモノクローナル抗体のエピトープ中に横たわっている（　Ｌｏｒｅｎ ｚ。

ら、Ｊ、　ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ、　１４７　、　２９７０頁（１９９１ ））。このことは、この残基は、ＩＬ−２ｒαの活性に影響することなく、ＰＥ Ｇ化を行うそれらしい候補であることを示唆している。

ＩＬ−２ｒβについては、潜在部位には、アミノ末端、カルボキシ末端の両方、 ４つのＮ−結合グリコシル化部位、及びネズミエリスロボイエチン受容体（Ｙｏ ｓｈ　ｉｍｕｒａ。

Ｌｏｎｇｍｏｒｅ　とＬｏｄｉｓｈ、　Ｎａｔｕｒｅ、ｖｏｌ、　３４８　、　 ６４７頁（１９９０））における生物学的に存意な領域に類似している領域（ａ 、ａ、＃１０８−１１８）が含まれる。

受容体中の他の残基の点突然変異解析によっても、ヘテロ亜鈴分子中において最 適の性質を生ずるＰＥＧ化の他の部位の同定ができるかもしれない。

補体系を調節する多くの蛋白質が同定されクローニングされた。それらの若干は 膜蛋白質である。膜蛋白質の１つは、ＣＲＩ（補体受容体ｌ）と呼ばれる。ＣＲ Ｉの可溶形は、疾患のｉｎ　ｖｉｖｏモデルにおいて検討されている。この補体 の阻害剤は、虚血後の心筋炎症と壊死９１）　）　、同種異系移植の拒絶（Ｐｒ ｕｔｔ　ら、９９１））を阻害する。

可溶性ＣＲＩはＣ３ｂとＣ４ｂに結合する。それは、３０の短いコンセンサスリ ピート配列（ＳＣＲ）から成っている。ＳＣＲの多くは、１つの可能なグリコジ ル化部位と４このシスティンを含んでいる。システィンのすべてはジスルフィド 結合に関与しているらしい。５ＣＲｓｌ−４は、Ｃ４ｂ結合に関与することが見 出されている。ＣＲＩの２つの別々の部分、５ＣＲｓ８−１１と５ＣＲｓ１５− １８がＣ３ｂとの結合に関与しているＶｏｌ、１７４．１４５１−１４６０頁（ １９９１））。本発明によれば、ＣＲＩのＣ４ｂ結合ドメインとＣ３ｂ結合ドメ インを含むヘテロ亜鈴を産生ずることが可能である。

ＣＲＩのＣ４ｂ結合及びＣ３ｂ結合ドメインはＰＣＲを使用してクローニングを 行うことができる。これらの５ＣＲｓは１から５まての５ＣＲｓ　（Ｃ４ｂ結合 ）、及び８から１２まての５ＣＲｓ　（Ｃ３ｂ結合）である。これらの５ＣＲｓ をコードする遺伝子は、Ｂ、ｃｏｌｉ、の発現ベクターにおいてクローニングす ることかできる。

Ｅ、ｃｏｌｉ、て発現された蛋白質はたたみ直され、精製されることかできる。

たたみ直しの成否は、ポリＣ３ｂ、またはポリＣ４ｂとの結合能によって分析す ることかできる。これらの遺伝子についてのｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異誘発を行 い、天然のままのアミノ酸残基をシスティンに置換することができる。これらの システィンを、次に、ＰＥ０分子を結合するのに使用することができる。ＰＥＧ 化の可能性としての部位は、グルコシル化部位、または５ＣＲ５とＳＣＲ１２の カルボキシ末端残基であろう。カルボキシ末端残基に対して余分のシスティンを 含むＣ４ｂと結合し、Ｃ３ｂと結合するドメインを構築し、ＰＥ０分子をつなぐ ために使用することができるであろう。ＰＥＧ結合へテロ亜鈴は、例！４の２段 階過程によって製造することができる。精製は、イオン交換クロマトグラフィー によって行うことかできる。

例ＸＩＸ：ＩＬ−１ｒａビス（マレイミド）−血小板由来生長因子ペプチドＰＥ Ｇヘテロ亜鈴の合成血小板由来生長因子（ＰＤＧＦ）ペプチドＹＧＲＰＲＥＳＧ ＫＫＲＫＲＫＲＬＫＰＴは、Ｋｈａｃｈｉｇｉａｎ、Ｌ、ら、Ｊ、　Ｂｉｏｒ、 　Ｃｈｅｍ、、ｖｏｌ、　２７６　。

１６６０−１６６６頁（１９９１）に記載されている。

末端Ｃを加えて、マレイミドへ結合できるようにした。

ヘテロ亜鈴を２段階で合成した。第１段階においては、３μｍの０　、　０５　 ＭＨｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７，５に懸濁させた１、６ナノモルのＩＬ−１ｒａに １１μＩの同じ緩衝液に溶かした６、４ナノモルのビス−マレイミドＰＥＧ１． 。０を混合させた。この反応は、２０°Ｃて３０分間行った。２番目の段階・に おいては、４μｌの０．２Ｍナトリウムホスフェート緩衝液、ｐＨ７，０に溶か した３２ナノモルのＰＤＧＦペプチドを最初の反応の成績物に加えた。反応を、 ２０°Ｃで１時間進行させた。次に、反応を３０μモルの２メルカプトエタノー ルを含む等量の５ＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液を添加することによって終結さ せた。

反応の最初の段階の成績物、そして、完了した２段階反応の成績物、ならびに適 切な分子量のマーカーの試料を、Ｘ５９６ポリアクリルアミドゲル上５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥによって分離し、そのとき、クーマシーブルーで染めた。

２番目の段階の反応は、ヘテロ亜鈴の予知されたサイズと一致したさらなるハン トを与えた。２段階反応によって、出発物ＩＬ−１ｒａの約３３９６か、ヘテロ 亜鈴に変換された。

反応の最初の段階の成績物は、樹脂Ｓ−セファロース上で、陽イオン交換クロマ トグラフィーによって単離することかできる。ヘテロダイマーは、該ペプチド中 に塩基性アミノ酸か豊富なため、陽イオン交換クロマトグラフィーによって単離 することかできると考えられる。

本発明の教えの特定の発現系、またはＰＥＧ試薬への適用は、ここに含まれる教 えに照らして、本分野において、普通の熟練した技術をもった人々の能力の範囲 内にあることを理解すべきである。したかつて、この分野で普通の熟練した技術 をもった人々にとっては、様々な修飾と変化か、本発明の過程と成績物において なされ得ることは明らかである。本発明は、添付した請求とその等価値の範囲に 入ることを条件として、これらの修飾と変化を網羅するよう意図されている。

表４ ＯＬ　Ｏｅ＋　Ｏコ　０ｅｌ−０フ　Ｏフ　Ｏ−＋　ｏｂＮＪ：　ｗｃ　−ｏＬ 　ｃｏｎ　Ｏ−〜−１つ　墳１ト　ζ　Ｊ（ｆ−＋Ｊ−ＩＬＩ−１）　−口＋’ ｌＬＩ！−ＣＣＷＡｋ ＞　１　＞　〜　−−メ　− ＵＩ−Ｕ：＞ａじＵ− ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、５ ■ ＦＩＧ、７ ＨｕＪ１５ｕ　’巳ＪＬ　１１　＝；ｇＶＦＩＧ、９ ０　６　１２　１Ｂ　２４　３０　３６埒開ｉｌ詩開 ＦＩＧ、ＩＯ ０　６　１２　１Ｂ　２４　３０　３６閂関、ヲ￥閲 ０　１　２　’３４５６７８ 斗旧し　ヲ畢１に凸符閉 ＦＩＧ、＋２ ＦＩＧ、１３Ｂ Ｃ１０５ＰＥＧ　、−＋　’＆−’＋　：　ＴＮＦのｍａｔＦＩＧ、＋４ ＦＩＧ　１５Ａ ＦＩＧ　１５Ｃ ＦＩ　Ｇ、旧 ０　６　１２　１８　２４　３０　３６　４２　４Ｂ、鳩関、涛閉 ＦＩＧ、＋７ （ＩＣＸ）°Ｘ）　にＯｔ７’Ｏ’０ ＦＩＧ、＋９ 国際調査報告 フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＰＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、 ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ、ＲＵ、　ＳＤ、５Ｅ （７２）発明者　エバンズ、ロナルド、ジェイ。

アメリカ合衆国８００２７　コロラド州ルイズビル、ウェスト　アイゼンハワー 　４０４（７２）発明者　ブリュワー、マイクル、ティー。

アメリカ合衆国８０３０４　コロラド州ポウルダー、メイプルトン　アベニュー 　２２３６（７２）発明者　コウノ　タダヒコ アメリカ合衆国８００２７　コロラド州ルイズビル、ヘイズ　コート１５５７

Claims (58)

【特許請求の範囲】
1. １．実質的に精製された式Ｒ１−Ｘ−Ｒ２の化合物（式中： Ｒ１とＲ２は、ポリペプチド性の基；であり、Ｘは非ペプチド性ポリマーのスペ ーサーである）。
2. ２．Ｒ１とＲ２が同じ基である実質的に精製された請求項１の化合物。
3. ３．Ｒ１とＲ２が異なる基である実質的に精製された請求項１の化合物。
4. ４．Ｒ１とＲ２が、以下からなる群より選ばれる実質的に精製された請求項２の 化合物： ＩＬ−１受容体アンタゴニスト，３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤，４０ＫＤａＴＮＦ阻 害剤，ＩＬ−２受容体，ＣＲ１，ＰＤＧＦ受容体，ＩＬ−２，ＭＣＳＦ受容体， ＥＧＦ受容体，ＩＬ−５受容体，ＩＬ−３受容体，ＧＭＣＳＦ受容体、Ｔ細胞受 容体、ＨＬＡ−１，ＨＬＡ−ＩＩ，ＮＧＦ受容体，ＩｇＧ（ＶＨ，Ｖ１），ＣＦ ４０，ＣＤ２７，ＩＬ−６受容体，インテグリンＣＲ３，ＶＬＡ４，ＩＣＡＭ， 及びＶＣＡＭ，ＣＲ２，ＧＭＰ１４０Ｌｅｃドメイン、ラミニン結合蛋白質、ラ ミニン断片、マンノース結合蛋白質，ＰＤＧＦのエキソン６ペプチド，及びプロ テアーゼ類。
5. ５．Ｒ１とＲ２が、以下からなる群より選ばれる実質的に精製された請求項４の 化合物：インターロイキン１受容体アンタゴニスト，３０ＫＤａ腫瘍壊死因子阻 害剤、インターロイキン−２受容体、及びＣＲ１。
6. ６．Ｒ１とＲ２がインターロイキン−１受容体アンタゴニストである実質的に精 製された請求項５の化合物。
7. ７．該インターロイキン受容体アンタゴニストが少くとも１この非天然システイ ン残基を含むように修飾されている実質的に精製された請求項６の化合物。
8. ８．該非天然システイン残基が、０，８４，６，８，９，及び１４１からなる群 より選ばれるアミノ酸残基の部位において見出される実質的に精製された請求項 ７の化合物。
9. ９．Ｒ１とＲ２が３０ＫＤａ腫瘍壊死因子阻害剤である実質的に梢摂された請求 項５の化合物。
10. １０．該３０ＫＤａ腫瘍壊死因子阻害剤が少くとも１この非天然システイン残基 を含むように修飾されている実質的に精製された請求項９の化合物。
11. １１．該非天然システイン残基、１，１４，１０５，１１１，及び１６０からな る群より選ばれるアミノ酸残基部位において見出される実質的に精製された請求 項１０の化合物。
12. １２．Ｒ１とＲ２がインターロイキン−２受容体である実質的に精製された請求 項１の化合物。
13. １３．該インターロイキン−２受容体が少くとも１この非天然システイン残基を 含むように修飾されている実質的に精製された請求項１２の化合物。
14. １４．Ｒ１がＩＬ−２ｒαであり、Ｒ２がＩＬ−２ｒβである実質的に精製され た請求項１２の化合物。
15. １５．Ｒ１とＲ２がＣＲ１である実質的に精製された請求項１の化合物。
16. １６．該ＣＲ１が少くとも１この非天然システイン残基を含むように修飾されて いる実質的に精製された請求項１５の化合物。
17. １７．Ｒ１とＲ２が以下からなる群より選ばれる実質的に精製された請求項３の 化合物： ＩＬ−１受容体アンタゴニスト，３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤、４０ＫＤａＴＮＦ阻 害剤、ＩＬ−２受容体、ＣＲ１，ＰＤＧＦ受容体，ＩＬ−２，ＭＣＳＦ受容体、 ＥＧＦ受容体、ＩＬ−５受容体、ＩＬ−３受容体、ＧＭＣＳＦ受容体、Ｔ細胞受 容体，ＨＬＡ−Ｉ，ＨＬＡ−ＩＩ，ＮＧＦ受容体，ＩｇＧ（ＶＨ，Ｖ１），ＣＦ ４０，ＣＤ２７，ＩＬ−６受容体、インテグリンＣＲ３、ＶＬＡ４，ＩＣＡＭ， 及びＶＣＡＭ，ＣＲ２，ＧＭＰ１４０Ｌｅｃドメイン、ラミニン結合蛋白質、ラ ミニン断片、マンノース結合蛋白質、ＰＤＧＦのエキソン６ペプチド，及びプロ テアーゼ。
18. １８．Ｒ１とＲ２が以下からなる群より選ばれる実質的に精製された請求項１７ の化合物：インターロイキン−１受容体アンタゴニスト；３０ＫＤａ腫瘍壊死因 子阻害剤；インターロイキン−２受容体，及びＣＲ１。
19. １９．Ｘが以下からなる群より選ばれる実質的に精製された請求項１の化合物： ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化グリ セロール、デキストラン、コロニック酸、ポリβ−アミノ酸、及び炭水化物ポリ マー。
20. ２０．Ｘが、ポリエチレングリコールである実質的に精製された請求項１９の化 合物。
21. ２１．該ペプチド性結合基Ｒ１とＲ２が該非ペプチド性ポリマーのスペーサーに チオエーテル結合によって共有結合している実質的に精製された請求項１の化合 物。
22. ２２．該ペプチド結合基であるＲ１とＲ２のシステイン残基が、該チオ−エーテ ル結合の一部である実質的に精製された請求項２１の化合物。
23. ２３．該ポリペプチド性結合基が、システイン残基を経て該非ペプチド性ポリマ ーのスペーサーにつなげられている実質的に精製された請求項１の化合物。
24. ２４．該システインが、天然に存在しているポリペプチド性結合基にとって、非 天然である実質的に精製された請求項２３の化合物。
25. ２５．該化合物が、Ｒ１とＲ２の単独の生物学的性質と区別される生物学的性質 を有する実質的に精製された請求項１の化合物。
26. ２６．Ｒ１とＲ２が受容体である実質的に精製された請求項２の化合物。
27. ２７．Ｒ１とＲ２が受容体アンタゴニストである実質的に精製された請求項２の 化合物。
28. ２８．Ｒ１とＲ２が、結合蛋白質である実質的に精製された請求項２の化合物。
29. ２９．Ｒ１とＲ２が、受容体アンタゴニスト、結合蛋白質、及び受容体からなる 群より選ばれる実質的に精製された請求項２の化合物。
30. ３０．Ｒ１とＲ２が以下からなる群より選ばれた蛋白質の生物学的に活性な部分 である実質的に精製された請求項１の化合物：インターロイキン−１受容体アン タゴニスト、３０ＫＤａ腫瘍壊死因子阻害剤，ＩＬ−２受容体、及びＣＲ１。
31. ３１．実質的に精製された式、Ｒ１−Ｘ−Ｒ２の化合物（式中： Ｒ１とＲ２は、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト、３０ＫＤａ腫瘍壊 死因子阻害剤、ＩＬ−２受容体、及びＣＲ１からなる群より選ばれた蛋白質、ま たは、蛋白質の生物学的に活性な部分であるポリペプチド性基であり； Ｘは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル 化グリセロール、デキストラン、コロニック酸、ポリβ−アミノ酸、及び炭水化 物ポリマー：からなる群より選ばれる非ペプチド性ポリマーのスペーサーであり 、そして、 Ｒ１とＲ２はＸにチオエーテル結合によって共有結合でつなげられている）。
32. ３２．薬理学的に許容できる担体中の実質的に精製された請求項１の化合物の有 効な量からなる医薬組成物。
33. ３３．患者がそれを必要とするとき、請求項３２の薬剤組成物の投与を受ける医 学的適応症を治療する方法。
34. ３４．式Ｒ１−Ｘ−Ｒ２（式中Ｒ１とＲ２は、システインを含むポリペプチド基 であり、Ｘは非ペプチド性ポリマーの分子種である。）からなる実質的に精製さ れた治療的に価値のある化合物の調整のための方法であって、システインのアミ ノ酸残基と反応させたときチオエーテル結合を形成することができる少なくとも ２つの反応性基を有する非ペプチド性ポリマーの基を、システインを含有するポ リペプチド基と反応させ、該化合物を分離精製することからなる方法。
35. ３５．該ポリペプチド基が以下からなる群より選ばれる請求項３４の方法：イン ターロイキン−１受容体アンタゴニスト、３０ＫＤａ腫瘍壊死因子阻害剤、イン ターロイキン−２受容体、及びＣＲ１。
36. ３６．該非ペプチド性ポリマーの基が、以下からなる群より選ばれるポリマーの 単位からなる請求項３４の方法：ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリ コール、ポリオキシエチル化グリセロール、デキストラン、コロニック酸、ポリ β−アミノ酸、及び炭水化物ポリマー。
37. ３７．該非ペプチド性ポリマーの基が、ビス−マレイミドポリエチレングリコー ルである請求項３４の方法。
38. ３８．Ｒ１とＲ２が異なっている式Ｒ１−Ｘ−Ｒ２からなる実質的に精製された 治療的に価値がある化合物の調整方法であって、 システインのアミノ酸残基と反応させたとき、チオエーテル結合を形成すること ができる少くとも２つの反応性基を有する非ペプチド性ポリマー基を、システイ ンを含むポリペプチド性基と反応させて、複合体Ｒ１−Ｘを形成し； 複合体Ｒ１−Ｘを、システインを含むポリペプチド性基Ｒ２と反応させ、該化合 物を形成し；該化合物を分離精製することからなる方法。
39. ３９．Ｒ１とＲ２が、以下の群より選択される請求項３８の方法：インターロイ キン−２受容体アンタゴニスト、３０ＫＤａ腫瘍壊死因子阻害剤、インターロイ キン−２受容体、ＣＲ１。
40. ４０．該非ペプチド性ポリマーの基が、以下からなる群より選ばれるポリマーの 単位からなる請求項３８の方法：ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリ コール、ポリオキシエチル化グリセロール、デキストラン、コロニック酸、ポリ β−アミノ酸、及び炭水化物ポリマー。
41. ４１．該非ペプチド性ポリマーの基がビスマレイミドポリエチレングリコールで ある請求項の方法。
42. ４２．請求項３４の方法によって調製される実質的に精製された化合物。
43. ４３．請求項３８の方法によって調製される実質的に精製された化合物。
44. ４４．システイン残基１１６が非ペプチドポリマーに共有結合でつなげられてい る天然インターロイキン−１受容体アンタゴニスト。
45. ４５．該ポリマーが、モノメトキシポリエチレングリコールである請求項４４の 天然インターロイキン−１受容体アンタゴニスト。
46. ４６．２つの天然インターロイキン−１受容体アンタゴニストが該非ペプチド性 ポリマーに結合している請求項４４の天然インターロイキン−１受容体アンタゴ ニスト。
47. ４７．天然のインターロイキン−１受容体アンタゴニストが、少くとも１つの非 天然システイン残基を含むように修飾されているインターロイキン−１受容体ア ンタゴニストのムテイン。
48. ４８．該非天然システインが、０，８４，６，８，９，及び１４１からなる群よ り選ばれるアミノ酸残基部位に見出される請求項４７のムテイン。
49. ４９．天然インターロイキン−１受容体アンタゴニストの１１６位におけるシス テインが、別のアミノ酸基で置換されている請求項４７のムテイン。
50. ５０．少くとも１つのシステイン残基が、非ペプチド性ポリマーに共有結合でつ ながれている請求項４７のムテイン。
51. ５１．該非天然システイン残基の少なくとも１つが、非ペプチド性ポリマーに共 有結合でつながれている請求項４９のムテイン。
52. ５２．２つのムテインが、非ペプチド性ポリマーに結合している請求項４７のム テイン。
53. ５３．２つのムテインが非ペプチド性ポリマーに結合している請求項４８のムテ イン。
54. ５４．天然の３０ＫＤａ腫瘍壊死因子阻害剤が少くとも１つの非天然システイン 残基を含むように修飾されている３０ＫＤａ腫瘍壊死因子阻害剤のムテイン。
55. ５５．該非天然システインが、１，１４，１０５，１１１，及び１６５からなる 群より選ばれるアミノ酸残基の部位において見出される請求項５４のムテイン。
56. ５６．該非天然システイン残基の少くとも１つが、非ペプチド性ポリマーに共有 結合でつながれている請求項５４のムテイン。
57. ５７．２つのムテインが、非ペプチド性ポリマーに結合している請求項５４のム テイン。
58. ５８．みかけ上の分子量の増加がみられる治療的に価値のあるポリペプチドの以 下からなる調整方法：部位志向性突然変異誘発によって該ポリペプチドをコード する遺伝子を変更して、少くとも１つの非天然システイン残基を含む該ポリペプ チドのムテインをコードする遺伝子を創製すること； 細菌の発現システムにおいて、該変更遺伝子を発現すさせること； 該発現ムテインを精製すること； 該ムテインを、スルフヒドリル基を含む化合物の存在においてたたみ直すこと； たたみ直した該ムテインを、穏やかな還元剤で還元し、該非天然システインを遊 離させること；そして、該ムテインを、スルフヒドリル基に特異的な活性化基を 含む非ペプチド性ポリマー基と反応させること。