JP2005518431A - 高分子コンジュゲート及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

第１高分子を安定な破壊性結合を介して固体に結合させ、追加の高分子を安定的に連結させ、高分子コンジュゲートを遊離させることを含む懸濁または可溶性高分子コンジュゲートの製造方法及びその方法により製造した高分子コンジュゲート。

Description

本発明は、新規な高分子コンジュゲート、その使用及びその製造方法に関する。

複合高分子コンジュゲートの製造はバイオテクノロジー産業界にとって重要である。診断アッセイ及び治療薬は高分子コンジュゲートを用いる複数の技術分野の２つである。

診断分野では、例えば抗体（及び抗原結合ポリペプチド）のようなタンパク質は、しばしば、前記抗体の抗原に対する結合が検出され得るように、検出可能な反応を触媒し得る酵素または他の高分子と、コンジュゲート形成されている。この技術の１例である１つの抗体−酵素コンジュゲートは、アルカリホスファターゼとコンジュゲート形成されたモノクローナルＦＡｂ断片である。ＦＡｂは特定のアナライトに結合し得、抗体と前記アナライトの結合はアルカリホスファターゼにより非発光または非発色物質を発光または発色物質に変換させることにより検出され、よってアナライトが検出できる。従って、当業者は試験サンプル中のアナライトの濃度を測定するために前記コンジュゲートを使用することができる。また、抗原結合ポリペプチド及び受容体リガンドもしばしば治療分野で治療用高分子とコンジュゲート形成されている。この場合、そのコンジュゲートは生物（または、その組織または流体）に接触すると抗原結合ポリペプチドまたは高分子受容体リガンドが生物の細胞、組織または領域の抗原または受容体に指向する。よって、毒素やホルモンのような治療用高分子は抗原または受容体の近くで濃縮され、治療用高分子の治療指数を好ましく上昇させる。当業者は高分子コンジュゲートの多くの他の用途及び実施態様が公知であり、生医学及び他の分野で使用されていることを認めている。

高分子コンジュゲートは、通常コンジュゲート形成しようとする２つの高分子上に反応性部分を形成し、前記２つの高分子間で安定な結合が形成されるような適当な条件下でこれらの高分子を接触させることにより製造される。高分子の一方または両方がその表面上に１つの反応性部分しか有していないときは、コンジュゲート形成反応はうまく制御し得る。こうした状況では、１つの（１つまたはそれ以上の反応性部分を含有する）第１タイプの高分子と特定数の（１つの反応性部分しか含有していない）第２タイプの高分子しかコンジュゲートに取り込まれない。

しかしながら、コンジュゲート形成反応中の２タイプ以上の高分子の各々が複数の反応性部分を含むときまたは自己反応性高分子が複数の反応性部位を含んでいるときは、コンジュゲート形成中に制御されない網状組織が形成される可能性が生ずる。これらのコンジュゲートまたは網状組織の大きさは様々であり得、コンジュゲート産物中に取り込まれる各反応物質の数も様々であり得る。例えば、上記したＦＡｂ−アルカリホスファターゼの例では、１つのＦＡｂが３個のアルカリホスファターゼに結合し、そのアルカリホスファターゼの各々が１〜３個のＦＡｂに結合し得、その後も同様である。こうすると、通常異なるサイズ、異なるアナライトまたは標的結合能、及び異なる受容体、エフェクターまたは他のエンドポイントモジュレーター含量を有するコンジュゲートの集団が生ずる。この変動を減らすために、コンジュゲート形成反応を制御する方法を１つまたはそれ以上使用することが望ましい。

余り制御されていないコンジュゲートは複数の理由で望ましくない。

診断分野では、例えば小さすぎるコンジュゲート（例えば、単純なダイマー）及び大きすぎる他のダイマー（例えば、各モノマーを１０個含むコンジュゲート）はいずれかある１つの特定用途において十分にまたは全く機能しないことがある。また、１つの高分子の別の高分子に対する比が大きすぎるコンジュゲートでは、（例えば、１つ以上のアナライトに結合するが、１単位のシグナルしか発生しない１つのコンジュゲートによって引き起される）感受性の低下及び／または（例えば、反応容器または汚染物質へのアナライト結合メンバーの非特異的結合の増加によって引き起される）特異性の低下があり、（例えば、高価な高分子前駆体を最適数をコンジュゲートに複数個導入することにより）コンジュゲートの製造及び使用コストが不必要に高くなることがある。更に、安定性（寿命）、精度、ロット毎の再現性等がコンジュゲートの平均サイズ及びサイズの分布によって有意に異なり得る。

治療分野では、例えば親和性部分または指向性部分がエフェクター分子とコンジュゲート形成され得る。例えば、腫瘍細胞に対して特異的なヒト化モノクローナル抗体は毒素とコンジュゲート形成され得る。コンジュゲート形成過程が十分に制御されないと、コンジュゲートの安定性、生物学的半減期（非限定的に分解及び半減期を含む）及び治療指数（すなわち、最高の医学的に許容され得る濃度での治療効果）が変動する恐れがある。

更に、コンジュゲート形成過程が制御されていないとコンジュゲートの表面の組成は、異なり得、制御しがたい。従って、他の分子に対する表面親和性、電荷または疎水性及び／または粒子直径により、望ましくない凝縮及び表面付着が起こり得る。

コンジュゲート形成過程を制御するために、従来方法はｐＨ、温度、前駆体活性化の程度、高分子前駆体の絶対濃度、前駆体の立体化学及び反応物質の混合度を制御することに焦点が当てられていた。前記したコンジュゲート形成過程を制御する方法は工業的に有用な用途を与えるのに十分に有効であった。また、これらの方法は本発明の新規な特徴と有効に組み合わされ得る。

同様に、広範囲のサイズ及び組成を有するコンジュゲートの集団はサイズ排除クロマトグラフィーまたは類似の方法により分画し得る。しかしながら、こうすると、所望サイズ範囲を外れるコンジュゲートが大量に無駄となる恐れがあり、大規模用途のためには余り実際的でないことがある。また同様、コンジュゲートのゲルクロマトグラフィーによる選択は、大きな多分散コンジュゲートにおいては達成可能な分離が比較的低いことから、限られている。従来のコンジュゲート形成方法のように、コンジュゲートを濃縮または精製する幾つかの従来方法は本発明の新規な特徴と組み合わせて使用され得る。

更に、品質保証を助けるためにコンジュゲートが十分に規定された組成を有することがしばしば望ましい。

従って、（診断分野、治療分野、農業及び食品加工分野、化学製造及び加工分野及び他の分野において）コンジュゲート形成過程での制御を改善することにより高分子コンジュゲートを改良することが要望されている。本発明はこの要望に向けられている。

本発明は、高分子のコンジュゲートを形成するための改良方法及びその方法により製造した新規なコンジュゲート形成された高分子（すなわち、コンジュゲート）に関する。本発明は、診断用高分子コンジュゲートを製造する改良方法により得た高分子コンジュゲートをアナライトと接触させることを含むアナライトの検出方法、治療用コンジュゲートを製造する新規方法を含む治療を要する生物に対して治療を施す方法、及び新規高分子コンジュゲートを含むキットをも提供する。

本発明の方法は、第１高分子を反応性支持体と接触させて固体結合高分子複合体を形成することを含む。必要であれば、第１高分子を活性化するステップ及び／または反応性表面上の未反応の反応性部分を失活させるステップを実施する。第２高分子を必要により活性化し、第１高分子と接触させる。固体、第１高分子及び第２高分子を結合させて３元複合体を形成した後、固体と第１高分子間の結合を破壊して、好ましくは水溶液中に溶解または分散し得る高分子コンジュゲートを得る。

高分子コンジュゲートに対して追加の高分子及び小さい分子もしくは原子を付加するために１つ以上の追加任意ステップを実施してもよい。追加の任意ステップを固体と第１高分子間の結合を破壊する前に実施することが好ましい。

コンジュゲートの品質を実質的に低下させず、また反応物質をコンジュゲートに付加しても特性を実質的にさせない技術または試薬を用いて反応性表面と第１高分子間の結合を破壊して懸濁、分散または可溶性高分子コンジュゲートを形成することによりコンジュゲート形成過程を完了することが好ましい。

好ましくは、過程の各ステップ、実際は全過程を酵素（例えば、ウシアルカリホスファターゼ）の生物学的活性を維持するのに適した水性条件下で実施する。

改良特性を有する高分子コンジュゲートも提供し、前記した改良特性にはコンジュゲートサイズの均一性、コンジュゲート組成の均一性、コンジュゲートに導入される高分子及び他の基の親水性または疎水性、表面電荷及び空間配置の改良が含まれるが、これらに限定されない。

本発明はまた、試験サンプルと本発明の高分子コンジュゲートを標的またはアナライトと高分子コンジュゲート間とで複合体を形成するのに適した条件下で接触させ、前記標的またはアナライトに結合した高分子コンジュゲートの存在または量を検出することを含む標的またはアナライトの検出方法を提供する。

本発明はまた、治療を要する生物（好ましくは、動物）を治療有効量の本発明の高分子コンジュゲートと接触させて、前記高分子コンジュゲートの少なくとも１つの高分子または他の化学基を前記生物の細胞、組織または分子成分（例えば、神経伝達物質）と相互作用させて生物の症状または状態を改善させることを含む前記生物の治療方法を提供する。

（発明の詳細な説明）
従来の高分子コンジュゲートの形成方法においてはコンジュゲート形成過程が十分に制御されていない。従って、従来の高分子コンジュゲートは、通常、該コンジュゲートを構成するモノマー間のような空間的関係が均一でなく、ランダムであり、制御されておらず、前記高分子コンジュゲートは架橋反応の制御されていない組合せの原因となっている。本発明は特にコンジュゲート形成過程に高度の制御を与える。本発明は、改良されたコンジュゲート形成方法を用いる方法によりコンジュゲート形成過程を改良し、本発明の方法により製造された生成物（すなわち、コンジュゲート）を改良する。本発明の方法を水性条件下で実施することが好ましく、全体を水性条件下で実施することがより好ましい。好ましくは、水性条件はコンジュゲート形成される高分子の所望活性を維持するように選択される。本発明方法の実施態様では、ウシ胃腸アルカリホスファターゼの触媒活性を維持するように水性条件を選択する。

本発明の高分子のコンジュゲートを形成する方法は、第１高分子を固体に連結させて固体−第１高分子間複合体を形成することを含む。これは多くの場合本発明のコンジュゲート形成過程の第１ステップであるが、必ずしもそうである必要がない。第１高分子はまたこの第１高分子と同一であっても異なっていてもよい第２高分子と反応させる。次いで、連結させた固体−第１高分子−第２高分子を場合により第３高分子及び任意に第４高分子と反応させる。前記固体を第１高分子及び（使用する場合には）キャッピング化合物のみと反応させることが好ましい。第２高分子との反応が起こったら第１高分子が更に固体と反応しないことが好ましい。また、第３高分子と反応後第２高分子が更に第１高分子と反応しないことが好ましい。添加した高分子が１つの結合複合体としか反応しない、すなわち２つ以上の結合複合体間で架橋を形成せず、１つの高分子が任意のときに別のタイプの高分子（例えば、第３高分子）の１つとしか反応せず、２つの高分子間の反応が１回しか起こらないように、すべての高分子反応を逐次実施することが好ましい。理論的には、コンジュゲートに結合し得る高分子の数は限定されない。

第１高分子の固体への結合により合成中心が与えられ、この中心の周りでコンジュゲートへの更なる付加が起こり得る。有利には、合成中心間の架橋を制御したり、好ましくは避けるように合成中心を固定し、通常は分散させる。よって、固体上のコンジュゲート間の架橋（または、ダイマー化）がないときに製造された分子コンジュゲートのモル量は、好ましくは、固体に連結させた第１高分子の量に等しいか、実質的に等しい。好ましくは、固体との反応へ添加した第１高分子の実質的にすべてが本発明の高分子コンジュゲートの製造方法の間、固体結合状態に変換させる。

本発明の方法では任意の適当な固体が使用され得る。しかしながら、回旋状(convoluted)固体が好ましく、多孔質の固体がより好ましい。特定の理論に束縛されないが、回旋した、特に多孔質固体が好ましい。何故ならば、（ｉ）表面の回旋または固体の孔は合成中心から成長した高分子コンジュゲートを他の合成中心から成長した他の高分子コンジュゲートから遮断する傾向を有すること、および（ｉｉ）回旋状多孔質固体の大表面積は、固体に結合する第１高分子結合部位間に分離（すなわち、距離）が生じるのに十分な領域を提供することによって、凝集度が制御され得るからである。固体は、好ましくはサイズ排除クロマトグラフィーにかけたビーズまたは粒子である。固体が架橋ポリアクリルアミドを含むかまたは本質的に架橋ポリアクリルアミドから構成されることがより好ましく、より好ましくはアガロースである。

第１高分子は、固体と希釈条件で及び／または遅い反応速度で反応させ得、それによって、第１高分子と固体との反応により形成される合成中心が物理的に分離される。例えば、第１高分子（例えば、抗体）のｐＨ、温度及び濃度は、第１高分子が結合する前に適当な固体の孔に浸透する良好な機会を有するように制御され得る。最適な反応条件を選択すると、第１高分子の大部分が固体の粒子の外表面上に結合する（すなわち、第１高分子が固体の他の粒子と接触している固体の外表面または固体を収容している容器の壁に結合する）のが防止され得る。

場合により、高分子コンジュゲートは、例えばアフィニティークロマトグラフィーまたはサイズベース選択を用いて分画化または精製され得る。高分子コンジュゲートの分画または精製は適当な技術またはその組合せにより実施され得る。有利には、本発明の高分子コンジュゲートはしばしば精製または選択することなく診断用途、治療用途または他の用途に使用され得る。

必要によりまたは所望により、第１高分子と反応性となるように固体が処理または製造される。必要ならば、固体を第１高分子と反応性となるように適当な部分または分子が使用され得る。これは、例えば固体を活性剤と接触させて固体表面上に反応性部分を生じさせるような方法を含めたいろいろな方法により達成され得る。前記した反応性部分の非限定例はヒドロキシル、アルデヒド、カルボン酸、ジエン、アミン、スルフヒドリル、ホスホリルまたは固体表面上の他の反応性化学部分である。場合により、反応性部分は水素以外に６個以上の原子を含む複合体であり得る。アビジン、ストレプトアビジンおよび類似分子と非常に安定な複合体を形成するビオチンは、固体表面を活性化するために使用し得る多様な適切な複合体反応性部分の１つである。

有利には、本発明において二官能性リンカー、ヘテロ二官能性リンカー及び多官能性リンカーを含めたリンカーを使用することができる。リンカーの使用及び組成の幾つかは当業界で理解されている。二官能性リンカーは、好ましくは式Ｘ−Ｒ−Ｙ［式中、Ｘは第１反応性部分であり、Ｒはスペーサーであり、Ｙは第２反応性部分である］を有する。Ｘ及びＹは同一（すなわち、ホモ二官能性リンカー）でも異なって（すなわち、ヘテロ二官能性リンカー）いてもよい、適当な反応性部分であり得る。適当な反応性部分にはアルデヒド、アミン、カルボン酸（活性化された、またはＥＤＡＣのような活性化剤の存在下で）、ジエン、ヒドラジド、ヒドロキシル、マレイミド、ＮＨＳエステル、ホスホリル、スルフヒドリル、チオール及び他の反応性部分が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、Ｘ及びＹのいずれかがアルデヒド、カルボン酸、ヒドラジド、マレイミドまたはチオールである。スペーサーＲは適当な未置換もしくは置換脂肪族または芳香族有機部分であり得る。適当な有機部分はメチレン、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アルアルキル、アリール、アルコシアルキル、ハロアリール、ヒドロキシアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルカノイル、アルケニル及びアルキニルからなる群から選択され得るが、必ずしもそうする必要はない。スペーサー部分により、高分子間の立体制限が有利に制御し得る。このため及び他の理由で、スペーサーは好ましくは１〜９０炭素原子、より好ましくは１〜３０炭素原子、更に好ましくは３〜２０炭素原子を含む。

固体、第１高分子、第２高分子、及び高分子コンジュゲートに結合させようとする他の高分子を、場合により二官能性リンカーまたは多官能性リンカー、好ましくは別々に反応させたり活性化し得る少なくとも２つの反応性部分を有するヘテロ二官能性リンカーと反応させてもよい。別の手段は、コンジュゲートに結合させようとする１つ以上の高分子を隠れていたりまたは利用できない状態の活性基を露出させる試薬で処理することである。例えば、これに限定されないがタンパク質または他の高分子をジチオトレイトール（ＤＴＰ）と接触させて適当に反応性であるスルホヒドリル部分を露出させる。

二官能性リンカーは高分子のコンジュゲート形成を容易にし、二官能性リンカーがヘテロ二官能性リンカーの場合には、リンカーの非対称によりコンジュゲート形成反応を異なる程度に制御できる。適当な二官能性リンカーは各種ソースから市販されている。例えば、イリノイ州ロックフォードに所在のＰｉｅｒｃｅ Ｉｎｃ．の２００１ Ｐｉｅｒｃｅカタログを参照されたい。また、二官能性リンカーは当業者により容易に合成し得る。本発明において適当な二官能性リンカーには、エチレングリコールビス［スクシンイミジルスクシネート］、ＮＨＳエステル、Ｎ−ε−マレイミドカプロン酸、Ｎ［ε−マレイミドカプロン酸］ヒドラジド、Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート及びＮ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオプロピオネートが含まれるが、これらに限定されない。好ましい二官能性リンカーには、Ｎ−スクインイミジルＳ−アセチルチオプロピオネート、Ｎ−スクインイミジルＳ−アセチルチオアセテート、２−イミノチオラン（Ｔｒａｕｔｓ試薬）、４−スクインイミジルオキシカルボニル−メチル−（２−ピリジルチオ）−トルエンスルホスクシンイミジル、４−［Ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ［γ−マレイミドブチリルオキシ］スルホ−スクインイミドエステル、Ｎ−（Ｋ−マレイミドウンデカノイルオキシ）スルホスクシンイミドエステル、マレイミド酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−（ε−マレイミドカプロン酸）ヒドラジド、Ｎ（Ｋ−マレイミドウンデカン酸）ヒドラジド、Ｎ−（β−マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド及び３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジドが含まれるが、これらに限定されない。

多官能性リンカーは少なくとも１つの追加反応性部分を有する二官能性リンカーである。好ましくは、多官能性リンカーは少なくとも３タイプの反応性部分を含み、各反応性部分はリンカーが３つの高分子を非ランダムに逐次複合体化するために使用され得るように選択的に反応され得る。或いは、第１タイプの反応性部分を１個しか含まず、第２タイプの反応性部分を複数含む多官能性リンカーも好ましい。しかしながら、当業者は他の多官能性リンカーが本発明において適切であることを認識している。

特定実施態様において、固体は特定の結合対を用いて誘導化される。特定結合対は、適当な条件下で相互に接触させたときに特異的に結合する特定結合エレメントの対である。特定結合対により、第１高分子と第２高分子間に結合、好ましくは予測できる特徴を有する結合が形成され得る。本発明では任意の適当な結合対を使用することができる。非限定例として、ビオチンとアビジン及び当業界で公知の均等分子（例えば、ビオチニル化ヌクレオシド及び／またはストレプトアビジン）が特定結合対クラスの１つである。他の実施態様では、１つまたは両方の特定結合対が核酸であり得る。非限定例として、第１高分子が核酸であり、固体の表面に結合しているときには第２高分子は場合により別の核酸、核酸に結合するかまたは固体に結合した第１高分子である特定核酸に結合する核酸結合ポリペプチドであり得る。別の実施態様では、特定結合対の１つの特定結合エレメントはポリペプチドであり得、例えば非限定例として、別の高分子に対して高親和性で結合し得る、抗原エピトープ、レクチン、ヒスチジニルオリゴポリマーが挙げられる。特定結合対の特異的結合エレメントはまた生体分子（非限定例として炭水化物、ジヌクレオチド、ファルネシル部分、ビタミン等が挙げられる）からなる群から選択され得、細胞または生物中に自然に特定対を形成するかまたは接種のような刺激に応答して細胞または生物により形成される、能力または傾向により特徴づけられ得る。別の好ましい特定結合対は抗原と抗原に対するアフィニティーを有し、好ましくは抗原に対して特異的である抗体または抗体断片である。

本発明の高分子コンジュゲートのより複雑な実施態様では、コンジュゲートの成長は固体支持体が占める空間により立体的に制限され得る。例えば、多数の高分子が高分子コンジュゲート中に連結されているときには実質的に半球体形分子が生じ得る。有利には、固体と第１高分子間の連結は、半球体コンジュゲートを避けることが望ましい用途では合成中固体の表面と第１高分子間に距離を与えるように実質的に線状の部分を含み得る。適当な線状部分を使用し得る。好ましくは、線状部分は成長コンジュゲートの固体立体排除を少なくすべく十分に長いが、成長コンジュゲート間の架橋を抑制すべく十分に短い。当業者は、線状部分の最長及び最短所望長さが実施態様毎に固体の多孔性、固体上の反応性部分の密度及び固体と接触させる第１高分子の初期量に依存して異なることを認識している。このため、線状部分は好ましくは少なくとも５ｎｍの長さ、より好ましくは１０ｎｍ以上の長さ、場合により２５ｎｍ以上の長さである。更に、線状部分は好ましくは７００ｎｍ以下の長さ、より好ましくは３５０ｎｍ以下の長さ、更に好ましくは２００ｎｍ以下の長さである。

非限定例として、リンカーは両端を−ＳＨ基で活性化したポリエチレングリコールを含み得る。前記−ＳＨ基はＥＭＣＨ活性化支持体と反応して、線状部分の末端にチオール基を与える。約２ｋＤａの分子量を有するポリエチレングリコールは約１６ｎｍの線状長さを有することが公知であるのに対して、約１０ｋＤａの分子量を有するポリエチレングリコールは約８０ｎｍの線状長さを有する。対照的に、ＥＭＣＨリンカーのみを使用したときには固体と第１高分子間を約１．２ｎｍだけ分離させる。有利には、本発明の方法で注目されるものを含めた多数の各種官能基で両端を官能化したポリエチレングリコールポリマーが市販されている。また、例えばポリマーのような他の線状部分の両端は当業者により容易に官能化し得る。

二官能性リンカーまたは反応物質（すなわち、固体、第１高分子、第２高分子及び／または他のコンジュゲート形成される高分子）上の部位が本発明の分子コンジュゲートを製造する際に反応物質分子をコンジュゲート形成するために使用されるかに関係なく、前記反応物質分子の各々上の残存反応性部分は固体または他の反応物質と反応後失活されるかまたは他の所望機能に変換され得る。第１高分子と反応させた後に残存する固体上の反応性部分を追加ステップを実施する前に失活させることが特に有利である。特に第１高分子上の反応性部分が成長コンジュゲートに対して追加高分子を連結させるために使用されるときにそうである。例えば（限定しないが）、第１高分子がヘテロ二官能性リンカーと反応させることにより活性化され得る。ヘテロ二官能性リンカーの第１反応性部分は第１高分子に共有結合される。誘導化第１高分子及び固体を接触させて第１高分子：固体の複合体を形成する。次いで、（第１高分子と同一でも異なっていてもよく、ヘテロ二官能性リンカーの第２反応性部分と反応性である）第２高分子を誘導化第１高分子と接触させ、固体−第１高分子−第２高分子の安定複合体を形成するのに適した所望期間インキュベートする。しかしながら、一般的な化学原則から、ヘテロ二官能性リンカーの第２反応性部分の一部は通常第２高分子と反応しない。ヘテロ二官能性リンカーの第２反応性部分が完全に反応させることができないことは、しばしば（常にではないが）反応を完全に進行させることにより避けられ得るが、これは多くの場合必要ではなく、また、高レベルの第２高分子を必要とし反応物質及び浪費産物の廃棄にかかるコストが高くなる点及び反応時間が商業的に魅力的でないくらい長くなる恐れがある点で望ましくない。従って、ヘテロ二官能性リンカーの第２反応性部分は不完全にしか反応し得ない。

二官能性リンカーの残存（すなわち、未反応の）第２反応性部分が存在すると、表面へコンジュゲートを保持する結合を破壊する前、より一般的には破壊した後に問題が生じ得る。第１に、未反応の反応性部分が後に分子コンジュゲート集団中の別の分子上の第２高分子と反応することがあり得る。もしこのことがあると、序の欄に記載したように、望ましくないであろう分子コンジュゲートの制御されない架橋反応を生じさせる傾向を生む。第２に、反応性部分は第３高分子、第４高分子または別の高分子の付加において使用され得る。この場合、二官能性リンカーの残存する未反応の第２反応性部分は後続反応で競合し得る。よって、各反応性部分を反復使用するのを避けたり、コンジュゲート形成反応の制御のロスをある程度容認しなければならない。

しかしながら、第３の観点から、未反応部分は、本発明の高分子コンジュゲートを取扱いしやすいように改善する機会を与える。未反応部分は、生じた高分子コンジュゲートの特性を取扱いしやすいように改変するために場合により使用され得るキャッピング化合物を用いて失活させ得る。キャッピング化合物は、高分子または高分子−結合リンカーの未反応の反応性残基のすべてまたは実質的にすべてを失活させるために使用され得る化合物である。典型的には、キャッピング化合物を特定タイプの残存する未反応の反応性部分を実質的に無くすのに十分な量で十分な期間、固体−高分子複合体と接触させる。１つ以上のキャッピング化合物が使用されるが、これらのキャッピング化合物は同時または逐次導入し得る。キャッピング化合物の適当なクラスには検出可能な化合物、電荷変更化合物、ポリマー化合物、立体スペーサー及び特異的結合対の特異的結合エレメントが含まれるが、これらに限定されない。例えば、スルフヒドリル反応性部分をキャップするためにハロアセトアミド及びマレイミドが好適に使用し得るが、マレイミド反応性部分をキャップするためにはチオール含有試薬が好適に使用し得る。

キャッピング化合物が高分子の最終層を付加後導入することによりコンジュゲートの表面に配置され得る。適切なキャッピング化合物を使用することにより高分子コンジュゲートに有利な特性が付与され得る。例えば、キャッピング化合物は免疫診断薬に使用されるコンジュゲートの非特異的結合を低下させ得、患者の免疫系による破壊からコンジュゲートを保護し得る。

適当な検出可能なキャッピング化合物の群は、非限定的にフルオレセイン−５−マレイミドのような小さな有機蛍光染料からなる。このキャッピング化合物を使用すると、コンジュゲートは蛍光検出システムにより検出、トレース及び定量し得る。蛍光団は、高分子コンジュゲートの（表面よりも）コアに配置したリンカーをキャップするために使用したときには、分子コンジュゲートが他の分子及び表面に粘着する傾向を増加させない。

好適な電荷変更キャッピング化合物の群は、非限定的に２〜２０炭素原子及び１つ以上の帯電部分を有するアルカニル、アルケニル、アルキニル化合物を含む。好適な帯電部分にはアミノ、カルボキシル、スルフヒドリル、ホスホリル及びチオホスホリル部分が含まれるが、これらに限定されない。（特定のアミノ酸のような）双イオン性帯電部分が水溶液中での高い可溶性及び他の理由で好ましい。荷電変更キャッピング化合物の好適な例にはシスタミン、チオ酢酸、システイン（２−アミノ−３−メルカプトプロピオン酸）、イミダゾール、アスパラギン酸（２−アミノブタン−ジオン酸）及びリシン（２，６−ジアミノヘザン酸）部分が含まれるが、これらに限定されない。システインのスルフヒドリル部分は例えば適当な未反応の第２反応性部分と反応して、約３〜約１０のｐＨでそれぞれ正及び負に帯電する傾向を有するアミノ部分及びカルボン酸部分を残し得る。

適当な立体スペーサーキャッピング化合物の群にはポリエチレングリコール及びポリサッカライドの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。

好適なポリマーキャッピング化合物の群にはデキストラン、ポリエチレングリコール及びポリサッカライドが含まれるが、これらに限定されない。好ましいポリサッカライドの中に、いずれもヒトを含めた動物に導入された化合物に対して有利な効果を与えることが公知のヘパリン及びシアル酸が含まれる。

本発明において有用な他のキャッピング化合物にはチオ酢酸、Ｎ−エチルマレイミド、ヨード酢酸及びＣ_１−２５ハロ脂肪族化合物が含まれる。

高分子コンジュゲートの合成は、場合により高分子コンジュゲートが固体から遊離されるように固体と第１高分子間の結合を破壊するステップをも含む。高分子コンジュゲートは水溶液中に不溶性であり得るが、好ましくは水溶液中に可溶性または分散性であり得る。高分子コンジュゲートが不溶性であるが水溶液に分散し得るときには、完全に分散することがより好ましい。

場合により、固体の反応性基を第１高分子と非反応性とするのに有用なキャッピング化合物をまた、第１高分子の前、第１高分子と一緒または第１高分子を固体と接触させた後に、導入し得る。有利には、固体表面結合部位と競合させ、第１高分子に対する結合部位をまばらに保持することによって、成長しつつある高分子コンジュゲートの架橋（すなわち、架橋反応）を減らすために、固体の反応性を減ずるキャッピング化合物を使用し得る。また、反応が適当な期間進行した後、第１高分子と固体の反応を停止させるために、固体特異的キャッピング化合物を使用し得る。

キャッピング化合物はまた、キャッピングする反応基とは異なる反応基を与えるためにも使用し得る。例えば、スルフヒドリル基をキャッピングするＥＭＣＨは、固体から高分子コンジュゲートを遊離させた後、選択的に修飾され得る。

任意の適当な固体が本発明で使用し得る。固体表面は、例えばガラス、ペーパー、アガロース、ポリアクリルイミド、ポリデキストラン、ポリビニルピロリドン及びポリスチレンからなる群から選択され得る。固体の個々の粒子が２０倍の倍率で正常な健康人の目に見えることが好ましく、肉眼で見えることがより好ましい。好ましくは、固体の粒子は合成の中心が相互に離れているように回旋状または窪んだ表面を含む。本発明において適した回旋状表面を有する固体の例には、核孔基板及びマイクロ電子技術分野で一般的に使用されており、生物分野で時々使用されているリソグラフィック表面が含まれるが、これらに限定されない。本発明において適当な多孔性固体の例にはセファデックスＧ２５やセファロースＣＬ２Ｂのようなゲル濾過粒子が含まれるが、これらに限定されない。本発明において有用な多孔性固体は、好ましくは５０，０００ダルトンの分子量、より好ましくは２００，０００ダルトンの分子量、更に好ましくは５００，０００ダルトン以上の分子量を有する球状分子を捕捉するのに十分な大きさの平均孔を有している。場合により、本発明において有用な多孔性固体は好ましくは１０，０００，０００ダルトンの分子量を有する球状分子を捕捉するのに十分な大きさの平均孔を有し、この多孔性固体は多くの高分子層を有する高分子コンジュゲートを製造するために好ましい。

第１高分子と固体間の結合は適当な形態をとり得る。例えば、前記結合は安定な結合、例えば共有、イオン性または疎水性結合であり得る。固体を高分子コンジュゲート中に組み込むときには安定な結合が最も有用である。結合が安定な非共有結合であるときには前記結合はヒト血清と等張性のｐＨ７．０の水溶液中で好ましくは１０^−５Ｍ未満、より好ましくは１０^−８Ｍ未満、更に好ましくは１０^−１０Ｍ未満のＫｄを有する。

しかしながら、第１高分子と固体間の結合は破壊性であることが好ましい。破壊性結合は予定された条件下で切断され得、分子コンジュゲートを破壊乃至分離せず、好ましくはウシ腸アルカリホスファターゼを失活させないものである。本発明において適当な破壊性共有結合にはヒドラゾン、セミカルバゾン、シッフ塩基、ジスルフイド、ビシナルジオール及びエステルが含まれるが、これらに限定されない。適当な破壊性非共有結合にはイオン性、抗体−抗原、水素結合（例えば、相補性核酸配列を介する）が含まれるが、これらに限定されない。

第１高分子、第２高分子及び任意に含まれる他の高分子（総称して高分子と呼ぶ）は独立してすべて着目高分子から選択される。例えば、前記高分子はタンパク質、核酸、ポリマー、サッカライド及び／または前記化合物の組合せから選択される。第１高分子または第２高分子がタンパク質または核酸の場合には、この高分子は少なくとも２つの位置で反応性（すなわち、二官能性）、より好ましくは少なくとも３つの位置で反応性、更に好ましくは少なくとも４つの位置で反応性、場合により１０個以上または２０個以上の位置で反応性である。

理論上、本発明の高分子コンジュゲートに取り込まれた高分子上の反応性部位の数に上限はない。しかしながら、本発明の殆どの実施態様では、高分子コンジュゲートに取り込まれた高分子は約２００個以下の反応性部位／分子、場合により約５０個以下の反応性部位／分子を有する。ある実施態様では、本発明の高分子コンジュゲートに結合される第１高分子、第２高分子または他の高分子はエンドポイント分子である。

エンドポイント分子は検出可能なシグナルを発生しまたは減衰し得る高分子であり得る。エンドポイント分子はまた、他の分子または表面に結合するように、反応を触媒するように、毒性作用を発揮するように、或いは有利なまたは治療効果を発揮するように、機能し得る。本発明において適当なエンドポイント分子には酵素（特に、無色反応物質を着色反応物質に変換させたり適当な条件下で基質と接触させると光を発することが当業界で公知の酵素）、蛍光体（例えば、非限定的に蛍光染料及び蛍光タンパク質が含まれる）、放射標識タンパク質、核酸及び他の分子、酵素に対するコファクター、発光分子及び発色団が含まれるが、これらに限定されない。エンドポイント分子により開始され得る相互作用には、それ自体例えば比色、分光光度、蛍光または放射性検出手段により容易に検出され得る基または複合体を生成する適当に特異的且つ選択的な相互作用が含まれる。前記相互作用はタンパク質−リガンド、酵素−基質、抗体−抗原、炭水化物−レクチン、タンパク質−コファクター、タンパク質−エフェクター、核酸−核酸及び核酸−リガンド相互作用の形態をとり得る。前記リガンド−リガンド相互作用の追加例にはジニトロフェニル−ジニトロフェニル抗体、ビオチン−アビジン、オリゴヌクレオチド−相補オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ及びＮＡＤＨ−デヒドロゲナーゼが含まれるが、これらに限定されない。このようなリガンド対の各々の１つがエンドポイント分子であり得る。

１実施態様では、可溶性または懸濁分子コンジュゲートの第１高分子はタンパク質である。前記タンパク質は好ましくは少なくとも３個の反応性部位、より好ましくは少なくとも５個の反応性部位を有する。更に、前記タンパク質は少なくとも２，０００ダルトンの分子量、より好ましくは少なくとも１０，０００ダルトンの分子量、更に好ましくは少なくとも３０，０００ダルトンの分子量を有する。この実施態様では、タンパク質を固体と接触させて表面結合タンパク質複合体を形成させ、好ましくは破壊性共有結合である。好ましくは、タンパク質の少なくとも大部分が固体の陥凹、回旋または孔内の表面に結合する。固体上の未反応の反応性部位を第１高分子と結合させた後失活させる。必要により、タンパク質を第２高分子または第２高分子の活性形態と反応性とすべく活性化する。同様に、第２高分子がタンパク質または活性化タンパク質と反応性とすることが必要ならば活性化する。次いで、第２高分子を結合第１高分子と接触させる。その後、高分子コンジュゲートは場合により上記したように処理され得る。こうした更なる処理は高分子コンジュゲートに取り込まれた第１高分子の残基と固体間の安定な結合を破壊する前、その間またはその後に実施され得る。

別の実施態様では、本発明は高分子コンジュゲートを、及び懸濁または可溶性高分子コンジュゲートの製造方法を提供する。第１高分子は、（本発明の方法において使用される活性化または元々反応性の形態の）第１高分子と反応し得る反応性部分を複数有する第２高分子と直接または活性化中間体を介して相互作用し得る反応性部分を複数有する任意の適当な高分子であり得る。第１高分子は抗体、別のタンパク質または別の適当な高分子であり得る。前記方法は、表面結合高分子を形成すべく安定な破壊性結合を形成するのに適した条件下で接触させたときに相互に反応し得る第１高分子及び反応性表面を用意するステップを含む。必要により、第１高分子及び／または第２高分子は相互に反応性とすべく活性化され、第１高分子−固体複合体と及び第２高分子とを接触させて固体表面：第１高分子：第２高分子の安定な複合体が形成される。

いずれの場合も、可溶性または分散性高分子コンジュゲートの製造には液体媒体中で固体表面と高分子コンジュゲートとの間の安定な結合を破壊して懸濁または可溶性高分子コンジュゲートを生じさせることを含む。

本発明の方法により、新規で有用なコンジュゲートを製造することができる。

例えば、本発明は特に、各コンジュゲートが単一抗体を含むコンジュゲート集団からなる組成物を提供する。

１実施態様では、アナライト、受容体または他の所望標的分子に対して特異的な抗体を特定数含むコンジュゲートを製造することが可能である。ある好ましい実施態様では、コンジュゲート集団中のすべてまたは実質的にすべてのコンジュゲートが単一抗体を含む。他の好ましい実施態様では、各コンジュゲートは２〜３０抗体を含み、より好ましくはコンジュゲート集団中のすべてまたは実質的にすべてのコンジュゲートが同数の抗体を含む。診断アッセイでは、このことはアナライトに結合する各コンジュゲートがたった１分子のアナライトにしか結合しないので有利である。対照的に、一般的な方法で製造した従来の凝集コンジュゲートは多くの場合多数の抗体及びエンドポイント分子（例えば、蛍光団または酵素）を含み得る。よって、これらのコンジュゲートは異なる量のアナライトに結合するが、アラナイトよりはむしろ含まれるエンドポイント分子の量により決定されるシグナルの量を発生する。従って、本発明のコンジュゲートは従来のコンジュゲートよりもより高い精度及び感受性を有する。

別の実施態様では、第１高分子（場合により所望の標的分子に対して特異的な抗体であり得る）を第２高分子（場合により、血清アルブミン、蛍光タンパク質または別の高分子であり得る）とコンジュゲート形成させる。第２高分子が蛍光タンパク質の場合には、Ｒ−フィコエリトリン、Ｂ−フィコエリトリン及びフィコビリプロテイン（例えばカリフォルニア州サンレアンドロに所在のＰｒｏｚｙｍｅ Ｉｎｃ．から市販されている）から選択することが好ましい。次いで、第２高分子は、第２高分子と第４高分子を分離するためにスペーサーとして機能する第３高分子とコンジュゲート形成される。本発明において好ましい適当なスペーサーの第３高分子は血清アルブミンであるが、当業者は多くの適当なスペーサー分子が存在することを認めている。次いで、第３高分子（スペーサー）は第４高分子とコンジュゲート形成される。この第４高分子は第２高分子と同一でも異なっていてもよく、好ましくは蛍光性である。場合により、１つの第１高分子層、１〜１０個（好ましくは１〜４個）の第２高分子層、第２高分子の層をカバーする第３高分子層、及び第３高分子層により第２高分子層から分離される第４高分子層、及び場合により追加の高分子層を含む可溶性または分散性コンジュゲートが得られるように１〜１０個の追加コンジュゲート形成層、好ましくは２〜５個の追加コンジュゲート形成層を存在させる。場合により、本発明の高分子コンジュゲートの幾つかまたはすべての高分子は上記したようにリンカー分子により連結される。更に、第４高分子の層及び追加の高分子層は、場合により、隣接蛍光団のフルオレッセンスを実質的に消光させないかまたはコンジュゲートのその後の使用において制御され得る方法によって消光させることを特徴とする蛍光高分子及びスペーサー高分子の混合物から構成され得る。

また、本発明は単一のアナライト特異的抗体、複数の特異的結合メンバー分子及び複数のエンドポイント分子からなる高分子コンジュゲートを提供する。

別の実施態様では、高分子コンジュゲートは３つの高分子層からなり、前記３層の少なくとも２層は複数の高分子からなり、これらの層は３次元で表面を形成する。

更に別の実施態様では、コンジュゲートは特異的結合対の１つの特異的結合エレメント、複数のエンドポイント分子及びエンドポイント分子を実質的に分離している複数のスペーサー分子からなる。

コンジュゲート集団は、分子の実質的に各々のコンジュゲートが１〜１００分子の特異的結合メンバーを含み、この特異的結合メンバーはそれぞれコンジュゲートの表面上に配置されていて、実質的に各々のコンジュゲートがコンジュゲートの表面上に配置されていない分子を少なくとも１つ含むコアを含む。この実施態様は、特にコンジュゲートのコアに配置されている分子が安価なスペーサー分子であり得、有用なフルオレッセンスを有するのに対して、コンジュゲートの外表面に配置されている分子は高分子コンジュゲートと接触するアナライト、治療用標的及び他の部分と相互作用させるために使用し得るので有利である。

更に別の実施態様では、本発明は高分子の１つが、好ましくは第１高分子が光学的に検出可能な高分子を含む高分子コンジュゲートを提供する。光学的に検出可能な分子は、好ましくは発色団または蛍光団であり、より好ましくはフィコビリプロテインであり、後者としてＲ−フィコエリトリン、Ｂ−フィコエリトリンまたはアロフィコシアニンが非限定的に例示される。発色団により、高分子コンジュゲートはコンジュゲートの他の高分子を光学的に区別し得、よって最終コンジュゲートは光学的に検出可能な高分子の光学量に従って定量され得る。

この実施態様では、第１高分子が光学的に検出可能なとき、高分子コンジュゲートの“粒子”の数（すなわち、集団中のコンジュゲートの数）は支持体に付加した第１高分子の分子の数により制限される。こうすると、核の周囲にすべての他の高分子が層毎に付加されている核を形成する。最終コンジュゲートが固体から分離されると、そのコンジュゲートは１つの中心第１高分子を含む。

有利には、Ｒ−フィコエリトリンは、多くの市販されている医学的診断及び研究アッセイで使用されているエンドポイント分子であるアルカリホスファターゼを含むコンジュゲート中の第１高分子として選択され得る。Ｒ−フィコエリトリンは５６５ｎｍで高い吸光係数を有しているのに対して、アルカリホスファターゼ及び抗体は５６５ｎｍで光を吸光しない。従って、この実施態様の分子コンジュゲートの正確な分子濃度は、コンジュゲート中に含まれるアルカリホスファターゼ及び抗体（または、抗体誘導）分子の数に関係なく容易に測定される。このことは、コンジュゲートの品質を評価する際に有利であり得る。

また、本発明は標的またはアナライトの検出方法を提供し、その方法は前記標的またはアナライトと高分子コンジュゲート間で複合体を形成するのに適した条件下で試験サンプルを高分子コンジュゲートと接触させ、前記標的またはアナライトに結合した高分子コンジュゲートの存在または量を検出することを含む。

また、本発明は治療を要する生物（好ましくは、動物）の治療方法を提供し、その方法は前記生物を治療有効量の本発明の高分子コンジュゲートと接触させ、前記生物の症状または状態を改善するために前記高分子コンジュゲートの少なくとも１つの高分子を生物の細胞、組織または分子成分（例えば、神経伝達物質またはサイトカイン）と相互作用させることを含む。

治療効果を達成すべく本発明の高分子コンジュゲートに配合するのに適した高分子はエンドポイント分子であり、その中には毒素、オートクライン、パラクライン、エキソクライン、放射性同位元素、受容体に対するリガンド（あらゆるタイプのアゴニスト及びアンタゴニストを含む）、受容体断片、抗体、抗体またはそのコード配列から誘導される抗原結合ポリペプチド、ニューロモジュレーター、病原体由来抗原断片、免疫抑制物質及び多種多様の他の高分子が含まれる。

好適なエンドポイント分子はまた、コンジュゲートの内部に配置され、標的細胞により飲み込まれ、プロセッシングされたときに小分子が標的細胞の行動を修飾し得る活性形態で放出されるように高分子の内側を覆った小分子から構成される高分子を含み得る。例えば、治療用分子は、高分子コンジュゲートが標的細胞により内部化されたときに高分子コンジュゲートの高分子と小分子間の連結が破壊され、小分子が細胞上で治療効果を発揮するように高分子コンジュゲートの高分子に対してヒドラゾンを介して連結され得る。

また、本発明は、医薬的に許容され得る担体及び治療有効量の少なくとも１つの本発明の分子コンジュゲートを含む医薬組成物をも提供する。適当な担体が医薬組成物中に使用され得、担体は部分的に投与の特殊手段またはルート及び他の実施要件に依存する。前記した実施要件には、高分子コンジュゲートの可溶性に適した担体の提供、高分子コンジュゲートとの化学反応の回避、及び標的細胞、組織及び系に送達する前の高分子コンジュゲートの失活または分解からの保護が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書に記載されている医薬的に許容され得る担体、例えばベヒクル、賦形剤、アジュバントまたは希釈剤は当業者に公知であり、市販もされている。従って、本発明の医薬組成物の好適な製剤は広範囲に及ぶ。以下製剤を例示するが、これらに限定されない。

注射製剤が好ましい製剤に含まれる。注射組成物用の有効な医薬用担体の要件は当業者に公知である（Ｂａｎｋｅｒ及びＣｈａｌｍｅｒｓ編，「医薬品及び製薬プラクティス(Pharmaceutics and Pharmacy Practice)」，ｐ．２３８−２５０，ペンシルバニア州フィラデルフィアに所在のＪ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８２年）発行；「注射薬のＡＳＨＰハンドブック(ASHP Handbook on Injectable Drugs)」，Ｔｏｉｓｅｌ，第４版，ｐ．６２２−６３０（１９８６年）発行参照）。好適な注射組成物は好ましくは静脈内または局所、すなわち治療を要する病気、損傷、機能不全または他の状態の部位またはその近くに投与され得る。

非経口投与に適した製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬、及び製剤を予定レシピエントの血液と等張性とする溶質を含有し得る水性及び非水性の等張性滅菌注射溶液、並びに懸濁剤、可溶化剤、粘ちょう剤、安定剤及び保存剤を含み得る滅菌懸濁剤が含まれる。高分子コンジュゲートは、場合により医薬的に許容され得る界面活性剤（例えば、石鹸または洗剤）、懸濁剤（例えば、ペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはカルボキシメチルセルロース）、または乳化剤及び他の医薬用アジュバンドを添加した水、食塩液、水性デキストロースや関連糖溶液、アルコール（例えば、エタノール、イソプロパノールまたはヘキサデシルアルコール）、グリコール（例えば、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）、ジメチルスルホキシド、グリセロールケタール（例えば、２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノール）、エーテル（例えば、ポリ（エチレングリコール）４００）、オイル、脂肪酸、脂肪酸エステルまたはグリセリド、またはアセチル化脂肪酸グリセリドを含めた滅菌水性液体または液体混合物のような医薬用担体中の生理学的に許容され得る希釈物の形態で投与され得る。

非経口製剤中に使用され得るオイルには石油、動物油、植物油または合成油が含まれる。オイルの具体例には落花生油、大豆油、ゴマ油、綿実油、コーン油、オリーブ油、ペトロラタム及び鉱油が含まれる。

非経口製剤中に使用するのに適した脂肪酸にはオレイン酸、ステアリン酸及びイソステアリン酸が含まれる。オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルが好適な脂肪酸カエステルである。

非経口製剤中に使用するのに適した石鹸には脂肪アルカリ金属、アンモニウム及びトリエタノールアミン塩が含まれ、好適な洗剤には（ａ）カチオン性洗剤、例えばジメチルジアルキルアンモニウムハライド及びアルキルピリジニウムハライド、（ｂ）アニオン性洗剤、例えばアルキル，アリール及びオレフィンスルホネート、アルキル，オレフィン，エーテル及びモノグリセリドスルフェート及びスルホスクシネート、（ｃ）ノニオン性洗剤、例えば脂肪アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミド及びポリオキシエチレン−ポリプロピレンコポリマー、（ｄ）両性洗剤、例えばアルキル−β−アミノプロピオネート及び２−アルキルイミダゾリン第４級アンモニウム塩、及び（ｅ）その混合物が含まれる。

非経口製剤は通常溶液中に約０．０００５〜約２５重量％の活性成分を含む。保存剤及び緩衝剤を使用し得る。注射部位の刺激を最小限とするかまたは無くすために、前記組成物は約１２〜約１７の親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）を有するノニオン性界面活性剤１つ以上を含み得る。前記組成物中の界面活性剤の量は通常約５〜約１５重量％である。好適な界面活性剤にはポリエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ソルビタンモノオレエート）、及びプロピレンオキシドとプロピレングリコールの縮合により形成される疎水性ベースとの高分子量エチレンオキシド付加物が含まれる。非経口製剤はアンプルやバイアルのような１回量及び複数回用量の密閉容器中に収容され得、使用直前に注射用の滅菌液体賦形剤（例えば、水）を添加することのみが必要な凍結乾燥状態で保存され得る。即時調合注射溶液及び懸濁液は上記した種類の滅菌粉末、顆粒及び錠剤から調製され得る。

局所製剤は当業者に公知であり、本発明に適している。前記製剤は通常皮膚または他の体表面に適用される。

経口投与に適した製剤は、（ａ）液体溶液、例えば有効量の高分子コンジュゲートを希釈剤（例えば、水、食塩液または有機液体）中に担持または懸濁させたもの、（ｂ）各々が所定量の活性成分を固体または顆粒として含むカプセル、サッシェ、錠剤、口内錠及びトローチ、（ｃ）粉末、（ｄ）適当な液体中の懸濁液、及び（ｅ）適当なエマルションから構成され得る。液体製剤は、場合により医薬的に許容され得る界面活性剤、懸濁剤または乳化剤を添加した希釈剤、例えば水及びアルコール（例えば、エタノール、ベンジルアルコール、ポリエチレンアルコール）を含み得る。カプセル剤は例えば界面活性剤、滑沢剤及び不活性充填剤（例えば、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム及びコーンスターチ）を含有する一般的な硬質または軟質ゼラチンタイプのものであり得る。錠剤は１つ以上のラクトース、スクロース、マンニトール、コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸、微晶質セルロース、アカシア、ゼラチン、グアーガム、コロイド状二酸化珪素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸及び他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、崩壊剤、湿潤剤、保存剤、矯臭剤及び医薬的に許容され得る賦形剤を含み得る。口内錠はフレーバー、通常スクロース、アカシアまたはトラガカント中活性成分を含み得、香剤は不活性基剤（例えば、ゼラチン、グリセリン、スクロース及びアカシア）中に活性成分を含み、エマルション、ゲル等は活性成分に加えて当業界で公知の賦形剤を含む。

本発明の方法で有用な高分子コンジュゲートは単独でまたは他の好適成分と共に吸入により投与されるエアロゾル製剤に製剤化され得る。エアロゾル製剤は加圧許容され得る噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等に配され得る。エアロゾル製剤はネブライザーまたはアトマイザーのような非加圧医薬品として製剤化され得る。スプレー製剤は粘膜にスプレーするために使用され得る。

更に、高分子コンジュゲートは乳化基材または水溶性基材のような各種基材と混合することにより坐剤に製剤化され得る。膣投与に適した製剤は活性成分に加えて、当業界で適当であると公知の担体を含むペサリー、タンポン、クリーム、ジェル、ペースト、フォームまたはスプレー製剤として製剤化され得る。

上記した医薬組成物に加えて、高分子コンジュゲートはシクロデキストリン封入複合体のような封入複合体としてまたはリポソームの形態で製剤化され得る。

本発明はキットをも提供する。前記キットは反応性コンジュゲート複合体及び開裂試薬を含む。反応性コンジュゲート複合体は第１高分子に結合した固体を含み、前記第１高分子は直接または間接的に反応性高分子と共有複合体化している。開裂試薬は固体と第１高分子間の結合を好ましくはウシ腸ホスファターゼを失活させない条件で開裂し得る。前記キットは活性化試薬をも含み得る。この活性化試薬は問題のタンパク質と接触して該タンパク質を反応性高分子と反応性とし得る。その後問題のタンパク質を反応性コンジュゲート複合体と反応させることが有利である。当業者は所定数の問題のタンパク質分子を有し、再現可能に製造され得るコンジュゲートを容易に得ることができる。

本実施例は、アルカリホスファターゼ及び甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）に対して特異的な抗体からなるコンジュゲートの製造及び初期特徴づけを例示する。

本実施例では、多数の分子コンジュゲートを多孔質固体上で製造する。製造した分子コンジュゲートの各々は、第１高分子としてのＲ−フィコエリトリン（ＲＰＥ）、１〜５つのアルカリホスファターゼ層、及び甲状腺刺激ホルモンのα−サブユニットに対して特異的な抗体からなる最終層からなる。製造した分子コンジュゲートの大きさ及びＴＳＨ特異的ＥＬＩＳＡ活性を比較する。

図１に、本実施例で使用した対照コンジュゲート形成方法を概略的に例示する。アガロース支持体を過ヨウ素酸塩で酸化して、固定化アルデヒドを生じた。ヘテロ二官能性リンカーのＮ−［ε−マレイミドカプロン酸］ヒドラジド（ＥＭＣＨ）のヒドラジド官能基を前記アルデヒドと反応させて、マレイミド基をヒドラゾンを介して支持体に連結した。スルフヒドリル活性化タンパク質をマレイミドと反応させて安定なチオエーテル結合を形成したが、これは依然としてアガロース支持体に保持されていた。残存マレイミド基をメルカプトエタンスルホン酸のナトリウム塩（ＭＥＳＮＡ）を添加することにより分解した。非結合反応性物質を除去するためにアガロースを洗浄した後、マレイミド基含有第２タンパク質を添加した。このマレイミド基は第１タンパク質上の残存−ＳＨ基と反応して、チオエーテル結合を再び形成した。第１タンパク質上の利用可能な結合位置をすべて占めるように過剰量の第２タンパク質を添加した。第１タンパク質上に残存する未反応スルフヒドリル基は小分子との反応のみに利用可能であった。成長コンジュゲートの露出表面は、スルフヒドリル基含有第３タンパク質との反応に利用可能なマレイミド基を有する第２タンパク質から構成されており、前記第３タンパク質は場合により第１タンパク質のリピートであってもよいが、ここではスルフヒドリル基で活性化した第２タンパク質のリピートまたはスルフヒドリル基で活性化した抗体のいずれかであった。所望するタンパク質層を全て付加したら、残存マレイミド基をＭＥＳＮＡにより非反応性チオエーテルに変換した。その後、ヒドロキシルアミンを添加することによりコンジュゲートを支持体から遊離させた。特定の理論に束縛されることは望ましくないが、ヒドロキシルアミンはコンジュゲートを支持体に対して保持するヒドラゾン連結と反応し、コンジュゲートをヒドラジドとして遊離させると考えられる。

アガロースを酸化するために、セファロースＣＬ２Ｂ（Ｓｉｇｍａ製）（約２０ｍｌ）を水で洗浄し、過剰の水（２０ｍｌ）中に懸濁させて５０％ｗ／ｖ スラリーを得た。このスラリーに１００ｍＭ ＮａＩＯ_４（２００μｌ）を添加し、混合物を数回倒置させて混合した。室温（約２５℃）で７５分間後、グリセロール（１ｍｌ）を添加し、混合物を数回倒置させて混合した。１５分後、カラムをフリットを取り付けたカラムを用いて排水し、数カラム容量の水で洗浄した後１カラム容量のリン酸緩衝食塩液（１０ｍＭ リン酸ナトリウム，１５０ｍＭ 塩化ナトリウム，ｐＨ７．２；ＰＢＳ）で洗浄した。

ＲＰＥを活性化するために、１００ｍＭ トリエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ７．６）中１０ｍｇ／ｍｌのＲ−フィコエリトリン（Ｐｒｏｚｙｍｅ製）（２００μｌ）をジメチルホルムアミド中１００ｍＭ Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）（１００μｌ）に添加した。室温で１時間後、５０％ ヒドロキシルアミン（１０ｕｌ）を添加した。室温で４０分後、混合物を、１０ｍＭ リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム及び５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する緩衝液（ｐＨ７．２）で予め平衡化したセファデックスＧ２５カラムを用いて脱塩して、５５０μｌを集めた。分光光度的に５６５ｎｍでの吸光度で調べた活性化ＲＰＥの濃度は１０．１μＭであり、Ｅｌｌｍａｎ試薬を用いて測定した１分子あたりのＳＨ基の数は２２．５であった。

アルカリホスファターゼを活性化するために、１００ｍＭ トリエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ７．６）中１０ｍｇ／ｍｌのウシ腸アルカリホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ製）（５００μｌ）に対してジメチルホルムアミド中１Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）（５０μｌ）及び１００ｍＭ ＳＡＴＡ（２５μｌ）を添加した。室温で１時間後、５０％ ヒドロキシルアミン（２５ｕｌ）を添加した。室温で４０分間後、混合物をセファデックスＧ２５を用いて１０ｍＭ リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム及び５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する緩衝液（ｐＨ７．２）中に脱塩して、１．２ｍｌを収集した。分光光度的に２８０ｎｍでの吸光度で測定した濃度は３０．５μＭであり、Ｅｌｌｍａｎ試薬を用いて測定した１分子あたりのＳＨ基の数は１５．３であった。

以下の手順を用いてマレイミド官能基で活性化したアルカリホスファターゼを作成した。１００ｍＭ トリエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ７．６）中１０ｍｇ／ｍｌのアルカリホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ製）（５００μｌ）に対してジメチルホルムアミド中１Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）（５０μｌ）及び１００ｍＭ γ−マレイミド酪酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）（２５μｌ）を添加した。室温で１００分間後、混合物をセファデックスＧ２５を用いて１０ｍＭ リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム及び５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する緩衝液（ｐＨ７．２）中に脱塩して、１．２ｍｌを収集した。分光光度的に２８０ｎｍでの吸光度で調べた濃度は２９．８μＭであり、マレイミド発色団を分解するためにＭＥＳＮＡを添加後３００ｎｍでの吸光度の変化で調べた１分子あたりのマレイミド基の数は１５．４であった。

以下の手順を用いてマレイミド活性化抗体を作成した。１００ｍＭ リン酸ナトリウム及び１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．２）中７．０３ｍｇ／ｍｌの抗−ＴＳＨ_αＩｇＧ（Ｇｅｎｚｙｍｅ製）（２００ｕｌ）に対して、ジメチルホルムアミド中１００ｍＭ ＧＭＢＳ（１０μｌ）及び１Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３（２μｌ）を添加して、ｐＨ７．７とした。室温で１００分間後、混合物を１０ｍＭ リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム及び５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する緩衝液（ｐＨ７．２）中に脱塩して、５５０ｕｌを収集した。分光光度的に２８０ｎｍでの吸光度で調べた濃度は１５．９μＭであり、マレイミド発色団を分解するためにＭＥＳＮＡを添加後３００ｎｍでの吸光度の変化で調べた１分子あたりのＳＨ基の数は２８．５であった。

以下の手順を用いてスルフヒドリル活性化抗体を作成した。１００ｍＭ リン酸ナトリウム及び１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．２）中７．０３ｍｇ／ｍｌの抗−ＴＳＨ_αＩｇＧ（Ｇｅｎｚｙｍｅ製）（１００ｕｌ）に対して、ジメチルホルムアミド中１００ｍＭ ＳＡＴＡ（５μｌ）及び１Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３（１μｌ）を添加した。室温で１時間後、５０％ ヒドロキシルアミン（１０μｌ）を添加した。室温で４０分間後、混合物を１０ｍＭ リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム及び５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）中に脱塩して、５５０ｕｌを収集した。分光光度的に２８０ｎｍでの吸光度で調べた濃度は１１．７μＭであり、Ｅｌｌｍａｎ試薬を用いて調べた１分子あたりのＳＨ基の数は２５．４であった。

以下の手順を用いて酸化アガロースをＥＭＣＨで活性化した。酸化アガロース（６．０ｍｌ）をフリットを取り付けた２０ｍｌカラムに注いだ。このカラムを１０ｍＭ リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、２ｍｇ／ｍｌ ＣＨＡＰＳ及び５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する緩衝液（ｐＨ７．２）（ＰＣＥ）（２０ｍｌ）で洗浄した。カラムの端部に栓を被せ、ＰＣＥ（３ｍｌ）及びジメチルホルムアミド中１００ｍＭ ＥＭＣＨ（９０μｌ）を添加し、全混合物を撹拌して、試薬を樹脂中に分散させた。室温で３０分間後、カラムを排水し、冷ＴＣ７５Ｅ緩衝液（１００ｍＭ トリス，０．２％ ＣＨＡＰＳ，５ｍＭ ＥＤＴＡ；ｐＨ７．５）（１５ｍｌ）で洗浄し、氷上に載せた。

以下の手順を用いてＲＰＥ−ＳＨを活性化アガロース上に固定化した。２ｍｌ容量のカラム８本のそれぞれにＥＭＣＨ処理樹脂（６００μｌ）を添加し、混合物をＴＣ７５Ｅ（２ｍｌ）で処理した。カラムに栓を被せ、ＴＣ７５Ｅ（２００μｌ）を添加し、カラムを氷上に置いた。冷却後、０．２００ｎＭ ＲＰＥ−ＳＨ（１９８μｌ）を各カラムに添加し、樹脂を撹拌して十分に分散させた。カラムを時々撹拌しながら氷上に保持した。２０分間後、１００ｍＭ ＭＥＳＮＡ（１０μｌ）を各カラムに添加し、混合物を撹拌し、氷上に置いた。５分間後、カラムを排水し、冷ＴＣ８Ｅ（１００ｍＭ トリス，０．２％ ＣＨＡＰＳ，５ｍＭ ＥＤＴＡ；ｐＨ８）（３．０ｍｌ）で洗浄した。最初に流出した流出液１．５ｍｌの吸光度を５６５ｎｍで分光光度的に測定して、流出液中のＲＰＥ−ＳＨの量を測定した。これを元々添加した量から差し引いて、支持体に結合したＲＰＥの量を求めた。

以下の手順を用いてアルカリホスファターゼ−マレイミド、アルカリホスファターゼ−ＳＨ及びＲＰＥ−ＳＨからコンジュゲート形成した。排水及び洗浄に費やした時間を除いて、カラムはコンジュゲート形成手順中氷浴に保持した。添加ステップを表１に示す。表中、１Ｓ、２Ｍ、３Ｓ等はどのタンパク質層を付加したかを示す（１はコンジュゲートの第１高分子コアを表し、付加したタンパク質がスルフヒドリル（Ｓ）またはマレイミジル（Ｍ）基で活性化されているかを表す）。表１に示す活性化タンパク質の量をそれぞれ１Ｍ 塩化マグネシウム（１００μｌ）及び沈降樹脂上に少なくとも２５０μｌ（撹拌により樹脂を完全に分散させるのに必要な最小量）の上記液体を与えるのに十分なＥＣ８Ｅを添加した。カラムを氷中で３０分間インキキュベートした。インキュベート中２〜３回撹拌した。次いで、カラムを排水し、流出液を全部でほぼ１カラム容量に対しカラム中を再循環させた。次いで、カラムをＴＣ８Ｅ（１．５ｍｌ）で洗浄して、流出液を収集した。カラムに栓を被せ、次の活性化タンパク質の添加を実施した。流出液の２８０ｎｍでの吸光度を測定して、残存タンパク質の量を調べた（アルカリホスファターゼの場合には、２８０ｎｍで１４００００Ｍ^−１ｃｍ^−１の吸光係数を使用した）。２８０ｎｍでの吸光度を測定する前に、１００ｍＭ ＭＥＳＮＡ（１０μｌ）をアルカリホスファターゼ−マレイミド含有流出液に添加して、マレイミド発色団を除去した。これから、各ステップにおいて結合した活性化タンパク質の量を計算した。

以下の手順を用いて抗体−マレイミド及び抗体−ＳＨからコンジュゲート形成した。表１に従って活性化アルカリホスファターゼを最終添加し、インキュベートした後、カラムをＴＣ７５Ｅ（１．５ｍｌ）で洗浄し、栓を被せ、氷浴に置いた。１０分間後、冷ＴＣ７５Ｅ（２００μｌ）及び指定量の活性化ＩｇＧを添加した。混合物を撹拌し、氷上に置いた。５分間後、１Ｍ 塩化マグネシウム（１００μｌ）を添加し、混合物を撹拌した。氷浴において３０分間後、カラムを排水し、ＴＣ８Ｅ（１．５ｍｌ）で洗浄した。流出液の２８０ｎｍでの吸光度を測定し、流出液中に残存するＩｇＧの量を２１００００という２８０ｎｍでの吸光係数を用いて計算した。これから、樹脂に結合したＩｇＧの量を計算した。

以下の手順を用いて支持体からコンジュゲートを遊離させた。非結合ＩｇＧを樹脂から洗浄した後、カラムに栓を被せ、ＴＣ８Ｅ（２００μｌ）及び１００ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド（５μｌ）を添加して、残存ＳＨ基を失活させた。混合物を撹拌して樹脂を分散させ、カラムを氷上に置いた。すべてのカラムについてタンパク質添加及び洗浄が完了するまでカラムを氷上に置いた。残存マレイミド基を失活させるために、１００ｍＭ ＭＥＳＮＡ（１０μｌ）を添加し、混合物を撹拌し、カラムを氷に戻した。１０分間後、５０％ ヒドロキシルアミン（２０μｌ）を添加し、カラムを撹拌して樹脂を分散させ、室温で６０分間インキュベートした。次いで、カラムを予めＰＢＳで平衡化したＰＤ１０脱塩素カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）に直接排水し、産物をＴＣ８Ｅ及びＰＢＳで十分洗浄して、産物２．５ｍｌを収集した。産物の濃度を５６５ｎｍでの吸光度に基づいて求め、収率はＲＰＥカラーの回収に基づいて計算した。コンジュゲートのタンパク質濃度は製造業者の指示に従って増強プロトコルを用いるＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ製試薬）により測定した。

サンプルをＨＰＬＣにより分析した。各コンジュゲート（３００μｌ）にＰＢＳ中１００ｍｇ／ｍｌのＣＨＡＰＳ（３０μｌ）を添加した。サンプル（２０μｌ）をＷｈａｔｍａｎｎ Ｍａｃｒｏｓｐｅｒｅ ＧＣ １０００Ａ（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）カラムに移動相としてのＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌのＣＨＡＰＳを０．２ｍｌ／分で流して、２８０ｎｍ及び５６６ｎｍでダイオードアレーデテクタを用いてモニターした。

製造したコンジュゲートのホスファターゼ活性を比較した。コンジュゲート形成反応における活性化アルカリホスファターゼの吸収に基づき、アルカリホスファターゼの回収がＲ−フィコエリトリンカラーの回収に比例していると仮定して、各コンジュゲートについて５０ｍＭ ビストリプロパン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＺｎＣｌ_２及び１０％ 市販の非特異的結合ブロック剤（すなわち、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（商標）（Ｐｉｅｒｃｅ））を含有する緩衝液（ｐＨ７．２）中の希釈物を調製して、１０ｎＭ 結合アルカリホスファターゼを得た。マイクロプレートのウェル中の各コンジュゲート５．０μｌに対して基質（ＰＮＰＰ，Ｐｉｅｒｃｅ）（１００μｌ）を添加し、混合物を撹拌し、５分間にわたって４０５ｎｍでの吸収を測定した。１０ｎＭの非コンジュゲートアルカリホスファターゼを基準として用いた。

コンジュゲートをＴＳＨ ＥＬＩＳＡアッセイにおいて比較した。９６ウェル微量測定プレートのウェルをＴＳＨのβ−サブユニットに特異的なモノクーナル抗体（ＰＢＳ中２０ｇ／ｍｌ）で３７℃において６０分間被覆し、市販されている非特異的結合ブロック剤（すなわち、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（商標）（Ｐｉｅｒｃｅ））でブロックした。ウェルにＴＳＨ含有標準溶液（２５μｌ）を添加した。これらの溶液は市販のＴＳＨアッセイに対するキャリブレーターとして用いた。サンプル容量の蒸発ロスを防ぐためにプレートにカバーを被せ、３７℃において３時間インキュベートした。ウェルを排水し、水で５回洗浄し、５０ｍＭ ビストリプロパン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＺｎＣｌ_２及び１０％ 市販の非特異的結合ブロック剤（すなわち、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（商標）（Ｐｉｅｒｃｅ））を含有する緩衝液（ｐＨ７．２）中コンジュゲート（１００μｌ）を添加した。コンジュゲート濃度は１つの試験で４０ｐＭ ＲＰＥであり、別の試験で２００ｎｇ／ｍｌであった。３７℃で３時間後、ウェルを排水し、水で５回洗浄した。基質（１００μｌ）を添加し、プレートを３７℃に置いた。４０５ｎｍでの吸光度を３０分間にわたり３０秒間隔で測定した。各ウェルについてＶ_ｍａｘを計算した。

結果
第１ステップ（１Ｓ）で、０．２００ナノモルのＳＡＴＡ活性化ＲＰＥを得た。このステップのｐＨは反応を遅らすために後続のステップよりも低くし、ＲＰＥを連結前に支持体中に分散するようにした。各コンジュゲートの結合を最小限とし、均質産物を得るために前記コアタンパク質の固定化分子間の距離を長くすることが望ましい。０．２００ナノモルの添加ＳＡＴＡ活性化ＲＰＥのうち、０．１６８〜０．１７８ナノモルがＥＭＣＨ活性化支持体に結合した。

残存マレイミド基をＭＥＳＮＡで失活させ、洗浄して残存ＭＥＳＮＡ及び活性化ＲＰＥを除去した後、マレイミド活性化アルカリホスファターゼ（０．８ナノモル）を添加した（ステップ２Ｍ）。この層及びその後の活性化ＡＰ層を成長コンジュゲートに結合する量を最大限とするような条件で付加した。前記条件とは過剰の活性化タンパク質、（チオール−マレイミド反応を助けるための）ｐＨ８及び（負に帯電したタンパク質のイオン反発を解消するための）マグネシウムイオンの存在であった。本実施例では、コンジュゲート間のサイズの違いを最小限とするので成長コンジュゲートを新しいタンパク質層で飽和させることが望ましかった。このステップ（２Ｍ）では、平均３．６分子のＡＰが存在するＲＰＥの各分子に結合した。

次のステップ（３Ｓ）では、前の層中のＡＰの各分子に対して平均２．０分子のＡＰが結合し、これによりＲＰＥの各分子に対して全部でほぼ１１分子のＡＰが結合した。ステップ４Ｍでは、ＡＰの摂取は再びほぼ２倍であった。ステップ５Ｓで残っている１反応は、大過剰の活性化タンパク質を使用したが、ステップ４Ｍで摂取された分子あたりたった１．４分子のＡＰの摂取だけであった。

最終タンパク質添加において使用されたＩｇＧをＳＨまたはマレイミド誘導体で活性化して前のＡＰ層の活性化を調節した。添加された量が多くのコンジュゲートにおいて予想された飽和レベルよりも有意に少なかったので、コンジュゲート上のタンパク質が不均一に摂取される危険性があり、コンジュゲートがより深い内部よりもアガロースビーズの表面近くに位置している。反応前にビーズ中への活性化ＩｇＧの分散を促進するために、このステップのｐＨを７．５に低下させ、ＩｇＧ添加から５分間塩化マグネシウムを控えた。活性化ＩｇＧの摂取は反応Ｇを除くすべての反応でほぼ定量的であり、反応ＧではコンジュゲートをＩｇＧで飽和させるために過剰量を使用した。反応Ｇでは、ＡＰの層を増やしたときに見られる傾向を維持しながら前の層中のＡＰの各分子につき１．２分子のＧＰを吸収させた。

各反応で抗体添加ステップのインキュベーション終了時に、Ｎ−エチルマレイミドを添加してコンジュゲート上の残存ＳＨ基を失活させた。遊離ステップの直前に、ＭＥＳＮＡを残存マレイミド基を失活させるために添加した。活性基の少なくとも１つを失活させると、支持体から遊離後のコンジュゲートの更なる連結（ダイマー化またはマルチマー化）が防止される。

遊離は室温において希ヒドロキシアミン溶液で処理することにより実施され、１時間で終了した。ヒドロキシルアミンは支持体へのタンパク質アセンブリを保持するヒドラゾン結合と反応して、コンジュゲートをその最終形態で遊離させる。

アガロースから分子コンジュゲートを遊離させた後に残存する１つのヒドラジド基は選択的に他の化合物に連結され得る。そのヒドラジドを介する連結のために適した化合物には、アルデヒド、ケトン及び活性化カルボン酸が含まれるが、これらに限定されない。

報告されている遊離コンジュゲートの収率は５６５ｎｍでの吸光度により調べた結合ＲＰＥの回収に基づく。収率は、ＡＰ層が１層しかないコンジュゲートＡの場合の７６％から、５層を有するコンジュゲートＨの場合の５０％の範囲である。残りは支持体中に残存するピンク色としてはっきりと目に見える。

ヒドロキシルアミンに長期間露出した後非常に少量の別のコンジュゲートが支持体から遊離する。

コンジュゲートのそれぞれ別個の単位中に１つのＲＰＥコアを仮定して、各コンジュゲートの平均分子量を活性化タンパク質の取り込み量から計算した。計算値はコンジュゲートＡの約１．５ＭＤａからコンジュゲートＨの約１１ＭＤａの範囲であり、サイズ排除カラムのコンジュゲートのＨＰＬＣは、計算分子量に一致するピークを示した。５６５ｎｍでのモニタリングはより大きなコンジュゲートではピーク強度の低下を示し、このことは低い収率を反映しており、一方２８０ｎｍでのモニタリングは大きいコンジュゲート上のＡＰレベルが高いために高いピーク強度を示す。

コンジュゲート中に存在するＲＰＥによりコンジュゲートのモル濃度を直接測定できる。コアとしてのその使用は、コンジュゲートの各最終単位中に１つしかＲＰＥ発色団が存在しないことを仮定するものである。その強い吸光率（５６５ｎｍで１９６００００の吸光係数）により、本実施例で示すように少なくともｎｍ範囲までコンジュゲート濃度を正確に測定できる。

コンジュゲートを用いてＴＳＨに対するＥＬＩＳＡアッセイを実施した。モル濃度を４０ｐＭで一定に維持し、抗−ＴＳＨ抗体が約６／コンジュゲート単位で一定であれば、ＰＮＰＰの加水分解のＶ_ｍａｘは各ＴＳＨレベルで高分子コンジュゲートあたりのアルカリホスファターゼの量に比例して増加する。コンジュゲートの分子量は大体マグニチュードのオーダーの範囲で異なるので、同一実験を２００ｎｇ／ｍｌコンジュゲートの一定濃度で実施した。重量ベース実験で、以前のモルベース実験と比較して、コンジュゲートＡの濃度は約３倍であり、コンジュゲートＨの濃度は１／２未満である。多くのコンジュゲートがモルベース濃度で見られたとものと類似のシグナルを与え、これはシグナルが実質的に各コンジュゲートのアルカリホスファターゼ含量に依存し、存在する高分子コンジュゲートの数に依存しないことを実証している。コンジュゲートＨは重量ベース実験で有意に少ないシグナルしか示さなかった。多分、高分子量及び低モル濃度によりコンジュゲートは結合ＴＳＨ含有表面へゆっくり拡散する。よって、この結果は、本発明の高分子コンジュゲートは従来方法で得られたものよりも優秀であることを示す。

アルカリホスファターゼ定数を保持しながらコンジュゲートの異なる抗体含量の影響を調べた。平衡で、抗体含量を２．２〜２．６／コンジュゲート単位とすると、シグナルは約２０％だけしか変化せず、各コンジュゲート単位のＡＰ含量がシグナルを発生させる能力の主な決定因子であることを示している。コンジュゲートの拡散速度及びコンジュゲートの固定アナライトに結合する速度は結合部位のサイズ及び含量の両方に依存し得る。

本実施例では、本発明の方法の具体例を用いて化学発光アッセイのためのコンジュゲートを製造した。従来技術では、多くの場合化学発光分子アクリジニウムを着目抗体のアミノ基に直接連結している。化学発光シグナルは１抗体あたりに結合したアクリジニウム部分の数に比例するので、できるだけ多くリンクさせることが望ましい。しかしながら、抗体に結合するアクリジニウムの量が過剰であると、標的分子に対するその特異的結合を妨害する可能性があり、またアッセイの他の成分への非特異的結合に関与する可能性があり、そのため性能が低下する。

本実施例では、Ｒ−フィコエリトリンをチオール基で十分に置換し、次いで固体支持体に結合させる。抗体をマレイミド基を含有するように活性化し、Ｒ−フィコエリトリンコアに連結させた。前記混合物の１部では抗体上の残存マレイミド基をＭＥＳＮＡを用いてスルホネート基でキャッピングし、別の部分では残存マレイミド基をジチオトレイトールで処理した。後者の場合ジチオトレイトールはホモ二官能性試薬として作用してマレイミドの代わりにチオールを生ずる。支持体から過剰の試薬を洗浄した後、ＥＭＣＨを添加した。この試薬上のマレイミド基は結合コンジュゲート上のチオール基とチオエーテルを形成して、ヒドラジド基を有するコンジュゲートが生ずる。両方の部分をヒドロキシルアミンで処理してコンジュゲートを遊離させ、このコンジュゲートを生理学的緩衝食塩液に透析する。コンジュゲートをアクリジニウム活性エステルで処理し、このエステルは中性ｐＨで優先的にヒドラジド基と反応し、この位置をアクリジニウムで占める。第１部分でアクリジニウムは主にコンジュゲートのＲ−フィコエリトリン部分に連結し、第２部分ではアクリジニウムはＲ−フィコエリトリン及び抗体部分の両方に連結する。

ＡｂＭ：
生理学的緩衝食塩液中２．６９ｍｇ／ｍｌの抗体（５００μｌ）に対して１００ｍＭ トリエタノールアミン（ｐＨ７．７）（１００ｕｌ）及びＤＭＦ中１００ｍＭ ＧＭＢＳ（１０ｕｌ）を添加した。室温で５０分間後、混合物を５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する生理学的緩衝食塩液中に脱塩して、１．２ｍｌを収集した。

ＲＳ：
１００ｍＭ トリエタノールアミン（ｐＨ７．７）中１０ｍｇ／ｍｌのＲ−フィコエリトリン（２００ｕｌ）に対して５００ｍＭ ＥＤＴＡ（１０μｌ）及び水中１００ｍＭ ２−イミノチオラン（４０μｌ）を添加した。室温で５５分間後、混合物を５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する生理学的緩衝食塩液中に脱塩して、１．２ｍｌを収集した。

Ｒ−フィコエリトリンに対する抗体のコンジュゲート形成：
フリットを取り付けたカラム中の酸化アガローススラリー（２．０ｍｌ）を１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、０．２％ ＣＨＡＰＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）（ＰＣＥ）で洗浄した。カラムに蓋を被せ、ＰＣＥ（５００μｌ）及びＤＭＦ中１００ｍＭ ＥＭＣＨ（５０μｌ）を添加し、混合物を撹拌し、室温で７０分間放置した。次いで、カラムを排水し、ＰＣＥ（２ｍｌ）及びＴＣ８Ｅ（１００ｍＭ トリス，０．２％ ＣＨＡＰＳ，５ｍＭ ＥＤＴＡ；ｐＨ８．０）（６ｍｌ）で洗浄し、氷浴中に置いた。ここにＲＳ（５６６μｌ，４．０ナノモル）を添加し、混合物を渦巻き撹拌し、氷に置いた。時々渦巻き撹拌しながら１５分間後、１００ｍＭ ＭＥＳＮＡ（１００μｌ）を添加した。混合物を渦巻き撹拌し、氷に置いた。５分間後カラムを排水し、ＴＣ８Ｅ（１０ｍｌ）で洗浄した。カラムに蓋を被せ、ＡｂＭ（１．０ｍｌ，９．４ナノモル）を添加した。混合物を渦巻き撹拌し、氷に置いた。時々渦巻き撹拌しながら１５分間後、カラムを排水し、冷ＴＣ８Ｅ（５．５ｍｌ）で洗浄した。

次いで、活性基をキャッピングし、コンジュゲートを次のように遊離させた。混合物をフリットを取り付けたカラム中に等分に２分（Ａ及びＢと命名）した。抗体上のマレイミド基をキャッピングするためにＡに対してＴＣ８Ｅ（３００μｌ）及び１００ｍＭ ＭＥＳＮＡ（２０μｌ）を添加した。抗体マレイミド活性化をチオール活性化に変換させるためにＢに対してＴＣ８Ｅ（３００μｌ）及び１００ｍＭ ＤＴＴ（２０μｌ）を添加した。Ａ及びＢの両方を渦巻き撹拌し、氷上に１０分間置いた後冷ＴＣ８Ｅ（４．０ｍｌ）で洗浄した。カラムに蓋を被せ、それぞれにＴＣ８Ｅ（３００μｌ）及びＤＭＦ中１００ｍＭ ＥＭＣＨ（２０μｌ）を添加し、混合物を渦巻き撹拌し、氷上に置いた。１０分間後、カラムを排水し、支持体をＴＣ８Ｅ（１ｍｌ）及びＴＣ７Ｅ（１００ｍＭ トリス，０．２％ ＣＨＡＰＳ，５ｍＭ ＥＤＴＡ；ｐＨ７．０）（２ｍｌ）で洗浄した。カラムに蓋を被せ、ＴＣ７Ｅ（３００μｌ）及び５０％ ヒドロキシルアミン（６０μｌ）を添加し、混合物を渦巻き撹拌した。室温において６０分間インキュベート後、カラムを排水し、ＴＣ７Ｅ（２ｍｌ）で洗浄した。集めた流出液を別々にリン酸緩衝食塩液に対して透析し、１／１５Ａ及びＢと命名した。産物のゲル透過カラムでのＨＰＬＣはＲ−フィコエリトリンコア上の２抗体のコンジュゲートと一致した。

次いで、コンジュゲートをアクリジニウム活性エステルと次のように反応させた。別々のチューブにおいてＡ及びＢ（各７０μｌ）に対してＤＭＦ中５ｍｇ／ｍｌのアクリジニウム活性エステル（２０μｌ）を添加した。室温で４．５時間後、混合物を生理緩衝食塩液で平衡化した脱塩カラムに通して、それぞれ１．０ｍｌを収集し、１／１６Ａ及びＢと命名した。

コンジュゲートの吸光度を２８０ｎｍ、３７０ｎｍ及び５６５ｎｍで測定した。計算のためのＲ−フィコエリトリン発色団（ＲＰＥ）のｅｘｔ_５６５は１９６００００であり、アクリジニウム発色団（Ａｃ）のｅｘｔ_５６５は１４６５０である。１／１５Ａ及びＢから比Ａ_３７０／Ａ_５６５は０．１１８と算出された。この比を用いて１／１６Ａ及びＢのＲ−フィコエリトリンが関与するＡ_３７０を計算した。これを測定したＡ_３７０値から差し引いて１／１６Ａ及びＢのＲ−フィコエリトリンが関与するＡ_３７０を計算した。これから、アクリジニウム濃度（単位：μＭ）及び置換率（ＳＲ）を計算した。

１／１６Ａは、ＳＲ（アクリジニウム／コンジュゲート）が元の活性化後測定したＲＰＥあたりのＳＨ基に非常に近いことを示している。１／１６Ｂはより多いＳＲを示し、これは多分抗体上の使用した追加活性基に由来するであろう。

本発明を特定実施態様を参照して詳細に説明してきたが、これらの実施態様に対して本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく各種の変化及び修飾を加え得ることは当業者に自明である。

実施例に示し、実施例中に更に説明する本発明の実施態様を示す。

Claims (29)

1. ａ）反応性表面、前記反応性固体表面と安定な破壊性結合を形成し得るタンパク質及び第２高分子を用意するステップ、
   ｂ）前記タンパク質を前記反応性固体表面と接触させて表面結合タンパク質複合体を形成するステップ、
   ｃ）必要ならば、前記タンパク質及び／または前記第２高分子を活性化させるステップ、
   ｄ）前記表面結合タンパク質を反応性第２高分子と接触させて固体表面：タンパク質：第２高分子安定複合体を形成するステップ、
   ｅ）液体媒体中で固体表面とタンパク質複合体との間の安定な結合を破壊してタンパク質及び第２高分子を含む懸濁または可溶性タンパク質コンジュゲートを得るステップ
   を含む、懸濁または可溶性タンパク質コンジュゲートの製造方法。
2. ａ）反応性表面を用意するステップ、
   ｂ）前記反応性固体表面と安定な破壊性結合を形成し得る第１高分子を用意するステップ、
   ｃ）前記第１高分子を前記反応性固体表面と接触させて表面結合第１高分子複合体を形成するステップ、
   ｄ）必要ならば、第１高分子及び／または第２高分子を活性化するステップ、
   ｅ）前記表面結合第１高分子を反応性第２高分子と接触させて固体表面：第１高分子：第２高分子安定複合体を形成するステップ、
   ｆ）液体媒体中で固体表面と第１高分子コンジュゲートとの間の安定な結合を破壊して第１高分子及び第２高分子を含む懸濁または可溶性高分子コンジュゲートを得るステップ
   を含み、前記第１高分子は第２高分子と相互作用し得る反応性部分を複数含み、および前記第２高分子は第１高分子と相互作用し得る反応性部分を複数含む、懸濁または可溶性高分子コンジュゲートの製造方法。
3. 第１高分子が破壊性共有結合を介して固体表面に結合している、請求の範囲第２項に記載の方法。
4. 第２高分子が二官能性リンカーを介して第１高分子に結合している、請求の範囲第２項に記載の方法。
5. 二官能性リンカーがＮ−スクシンイミジルＳ−アセチルチンプロピオネート、Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート、２−イミノチオラン（Ｔｒａｕｔｓ試薬）、４−スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル−（２−ピリジルジチオ）−トルエンスルホスクシンイミジル、４−［Ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スルホスクシンイミドエステル、Ｎ−（Ｋ−マレイミドウンデカノイルオキシ）スルホスクシンイミドエステル、マレイミド酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−（ε−マレイミドカプロン酸）ヒドラジド、Ｎ−（Ｋ−マレイミドウンデカン酸）ヒドラジド、Ｎ−（β−マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド及び３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジドからなる群から選択される請求の範囲第４項に記載の方法。
6. 第１高分子がタンパク質であり、前記タンパク質が反応性スルフヒドリル部分を含み、固体表面がヒドラゾン結合を介して該表面に結合したマレイミド部分を含む、請求の範囲第５項に記載の方法。
7. 更に、ステップ（ｃ）が終わった後に固体表面を、第１高分子と非反応性とすることを含む、請求の範囲第４項に記載の方法。
8. 更に、結合した固体表面：第１高分子：第２高分子を、前記第２高分子と反応性の第３高分子と接触させて、第２高分子を介して第１高分子に連結させた少なくとも１単位の第３高分子を含む表面結合複合体を形成することを含み、前記第１高分子及び前記第３高分子は同一でも異なっていてもよい、請求の範囲第７項に記載の方法。
9. 更に、第２高分子を、第３高分子と接触させた後、複合体中の第２高分子上の反応しなかった反応性部分を第３高分子上の使用した反応性部分に対して非反応性とするような、十分な失活試薬を添加するかまたは充分な条件下に表面結合複合体を置くこと、
   反応に添加した追加高分子上の反応性部分が失活しないように過剰量の失活試薬を除去するか上記条件を変化させること、および
   第３高分子と第４高分子間に結合を形成するのに十分な条件下に表面結合複合体と第４高分子を接触させること
   を含み、前記第２高分子及び前記第４高分子は同一でも異なっていてもよい、請求の範囲第８項に記載の方法。
10. 更に、高分子を１回またはそれ以上逐次添加することを含む、請求の範囲第８項に記載の方法。
11. 固体表面がアガロース、ポリアクリルアミド及びポリスチレンからなる群から選択され、前記固体支持体上の反応性部分がヒドラゾン基を介して前記支持体に連結されたマレイミドであり、第１高分子がスルフヒドリル基とマレイミド基の反応により形成されたチオエーテル基を介して固体支持体上のマレイミドに連結されている、請求の範囲第２項に記載の方法。
12. 固体表面と第１高分子コンジュゲート間の安定結合が、該結合を破壊性結合に対して特異的な試薬と接触させることにより破壊され、それによって前記コンジュゲートが固体表面から遊離させる、請求の範囲第２項に記載の方法。
13. 結合の破壊により高分子コンジュゲートの第１高分子上にヒドラジドを生成させ、前記ヒドラジドをコンジュゲートの特性を変化させるための化合物と反応させることを更に含む、請求の範囲第１２項に記載の方法。
14. 第１高分子を第２高分子と結合させる反応をしない第１高分子上の残存反応性部分または第２高分子上の残存反応性部分をキャッピング化合物を用いて失活させる、請求の範囲第２項に記載の方法。
15. キャッピング化合物が双イオン性である、請求の範囲第１５項に記載の方法。
16. キャッピング化合物がデキストラン、ポリエチレングリコール及びポリサッカライドからなる群から選択するポリマーである、請求の範囲第１５項に記載の方法。
17. キャッピング化合物がポリペプチド及び核酸からなる群から選択されるポリマーである、請求の範囲第１５項に記載の方法。
18. 第１高分子を、固体表面と反応するが第２高分子と反応しない第２分子を含む組成物の形態で用意する請求の範囲第２項に記載の方法。
19. コンジュゲートが１つの抗体のみを含む請求の範囲第１項に記載の方法により製造されるコンジュゲート。
20. コンジュゲートが２から３０個の間の所定数の抗体を含む請求の範囲第１項に記載の方法により製造されるコンジュゲート。
21. 各コンジュゲートが１つの抗体を含むコンジュゲートの集団からなる組成物。
22. 各コンジュゲートが２から３０個の所定数の抗体を含むコンジュゲートの集団からなる組成物。
23. ３高分子層からなり、前記３層のうち少なくとも２層が複数の高分子を含み、前記層が３次元で表面を形成するコンジュゲート。
24. 特異的結合メンバー、複数のエンドポイント分子、及び前記エンドポイント分子を実質的に分離する複数のスペーサー分子を含むコンジュゲート。
25. 分子の実質的に各コンジュゲートが１から３０分子の特異的結合メンバーを含み、各特異的結合メンバーはコンジュゲートの表面上に配置されており、実質的に各コンジュゲートがコアを含み、前記コアはコンジュゲートの表面上に配置されていない分子を少なくとも１個含む、コンジュゲートの集団。
26. 高分子の１つ、好ましくは第１高分子が、最終コンジュゲートが発色団の吸光度または蛍光に従って定量され得るようにその高分子をコンジュゲートの他の高分子と光学的に区別する発色団を含む、請求の範囲第１項に記載に従って製造されるコンジュゲート。
27. 高分子がＲ−フィコエリトリン、Ｂ−フィコエリトリン及びアロフィコシアニンから選択される、請求の範囲第２６項に記載のコンジュゲート。
28. 反応性高分子と共有複合体化した第１高分子に結合した固体からなる反応性コンジュゲート複合体、及び前記固体及び前記第１高分子間の結合を開裂させ得る開裂試薬を含むキット。
29. 更に、着目タンパク質を反応性高分子と反応性にするために前記タンパク質と接触させ得る活性化試薬を含む請求の範囲第２８項に記載のキット。

Images