FR2909881A1 - Nouveaux conjugues, utilisables a des fins therapeutiques, et/ou a titre d'agent de diagnostic et/ou d'imagerie et leur procede de preparation - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un procédé utile pour la préparation d'un conjugué de formule générale (I) ou l'un de ses dérivés : dans laquelle :- P représente un substrat, chimique ou biologique, physiologiquement acceptable, et- Q représente une entité, chimique ou biologique, physiologiquement acceptable différente de P et d'intérêt dans le domaine thérapeutique, du diagnostic et/ou de l'imagerie,Elle vise en outre l'utilisation de tels dérivés dans le domaine médical et notamment à des fins de diagnostic et/ou d'imagerie.

Description

La présente invention concerne un procédé utile pour la formation de

conjugués, notamment utilisables à des fins thérapeutiques, et en particulier à titre d'agent de diagnostic et/ou d'imagerie. Elle vise plus précisément à proposer un procédé permettant d'associer à un substrat, biologique ou chimique physiologiquement acceptable, au moins deux, voire plusieurs entités différentes et d'intérêt dans le domaine thérapeutique, du diagnostic et/ou de l'imagerie, à l'image par exemple des ligands de ciblage et des marqueurs. Le procédé selon l'invention peut notamment être utile pour la formation de radiopharmaceutiques permettant par exemple la mesure de la réserve fonctionnelle hépatique (RFH) par la scintigraphie dynamique d'albumines lactosylées. La mesure de la RFH est un paramètre quantitatif, objectif et validé de la fonction hépatique. Il est en effet le reflet direct du nombre d'hépatocytes fonctionnels. Les données épidémiologiques indiquent clairement une augmentation des pathologies hépatocellulaires et des transplantations hépatiques. Ainsi, 500 000 à 650 000 personnes en France seraient actuellement infectées par le virus de l'hépatite C (VHC). Or, la probabilité de développer une cirrhose pour une personne atteinte d'hépatite C chronique est estimée à 20 % après un délai moyen de 15 ans, tandis qu'entre 10 et 20 % des patients au stade de cirrhose évoluent vers un cancer du foie en 10 ans. Par ailleurs, les maladies virales du foie sont à l'heure actuelle la première cause de décès chez les malades infectés par le VIH. En effet, 30 % d'entre eux sont porteurs du virus de l'hépatite C et 10 % d'entre eux sont porteurs du virus de l'hépatite B. En conséquence, la protection, le dépistage et le traitement des hépatites virales sont aujourd'hui devenus une préoccupation centrale dans la prise en charge des personnes infectées par les virus de l'hépatite et/ou du sida.

Il est déjà connu d'utiliser le ciblage des asialoglycoprotéines pour l'imagerie du foie et l'évaluation de la fonction biliaire, tel que cela est décrit dans le brevet US 4 010 251, et en particulier l'utilisation du technétium-99m au titre de radionucléide de diagnostic médical est déjà décrite par exemple dans les brevets US 4 126 669, US 4 104 366, US 4 094 965, US 3 872 226, et US 3 466 361. Ainsi, l'utilisation de protéines, telles l'albumine, sous forme par exemple de technétium-99m-galactosylnéoglycoalbumine (99mTc-NGA), en tant que radiopharmaceutique se fixant préférentiellement sur les hépatocytes est déjà connue. 2909881 2 A la connaissance des inventeurs, la seule albumine galactosylée disponible commercialement à ce jour dans le monde est la technétium-99 m-galactosylalbumine (99mTc-GSA), distribuée par NIHON MEDYPHYSICS. Toutefois, l'obtention de la galactosylalbumine marquée au technétium-99 m est longue et difficile à mettre en oeuvre, 5 notamment en raison d'un nombre important d'étapes opératoires. De plus, la nécessité d'utiliser, lors de la synthèse, des composés toxiques et/ou dangereux, à l'image du cyanoborohydrure de sodium, constitue, pour des raisons évidentes, un handicap sur le plan thérapeutique dans la mesure où ce composé est destiné à être administré à un patient. Il demeure donc un besoin d'une voie de synthèse de conjugués de ce type, 10 utilisables à des fins thérapeutiques ou à titre d'agents de diagnostic et/ou d'imagerie, qui d'une part soit de mise en oeuvre rapide et simplifiée et d'autre part ne requière pas l'utilisation de composés toxiques et/ou dangereux pour les patients. De manière inattendue, les inventeurs ont constaté qu'il était possible de donner satisfaction à ces besoins sous réserve de mettre en oeuvre des agents de couplage 15 bifonctionnels spécifiques, lors de la dérivatisation d'un substrat chimique ou biologique, à l'image par exemple de la protéine albumine, par une et plus particulièrement plusieurs entités d'intérêt thérapeutique ou dans le domaine du diagnostic et/ou de l'imagerie. Il est connu de mettre en oeuvre un agent de couplage hétérobifonctionnel pour fixer sur une protéine par exemple un anticorps (voir US 6 537 519), ou encore un ion 20 métallique ou un chélatant d'ion métallique jouant le rôle de précurseur de marqueur (voir Simplified Method of Conjugating Macrocyclic Bifunctional Chelating Agent to Antibodies via 2-Iminothiolane , McCall et al., Bioconjugate Chem., 1990, 1, 222-226). Toutefois, ce type d'agent de couplage est généralement dédié à la dérivatisation d'un substrat chimique ou biologique par une unique entité. En effet, les deux fonctions 25 réactives de cet agent, destinées à assurer le couplage, sont précisément choisies pour garantir uniquement la réalisation du couplage recherché. Or, pour des raisons évidentes, il serait particulièrement avantageux de pouvoir procéder à de multiples dérivatisations sur un même substrat selon un unique mode opératoire. La présente invention a précisément pour objet de proposer un procédé 30 permettant de répondre également à ce besoin. 2909881 3 Ainsi, la présente invention concerne, selon un premier de ses aspects, un procédé utile pour la préparation d'un conjugué de formule générale (I) ou de l'un de ses dérivés : P (I) )qin m 5 dans laquelle : - P représente un substrat, chimique ou biologique, physiologiquement acceptable, - RI représente une chaîne hydrocarbonée en C1-Cm, notamment en C1-05, linéaire, ramifiée, ou cyclique, saturée ou insaturée, éventuellement interrompue par 10 un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O et S, et optionnellement substituée, - g est égal à zéro ou à 1, - R2 représente une chaîne hydrocarbonée, linéaire, ramifiée ou cyclique, saturée ou insaturée, en C1-C20, notamment en C1-C15, éventuellement interrompue par un ou plusieurs motifs cycloalkyles ou aralkyles en C4-C7, notamment en 15 C6, et éventuellement substitués par un radical alkyle, ladite chaîne étant en outre éventuellement substituée et/ou éventuellement interrompue par un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O et S, ou encore un groupement représentatif d'une fonction amide, ester, éther ou thioéther, - Y représente une fonction de liaison impliquant un ou plusieurs 20 hétéroatomes choisis parmi N, O et S, à l'image par exemple d'une fonction amide, ester, éther ou thioéther, - Q représente une entité, chimique ou biologique, physiologiquement acceptable différente de P et d'intérêt dans le domaine thérapeutique, du diagnostic et/ou de l'imagerie, 25 - n est égal à 0 ou est un entier allant de 1 à 1000, en particulier de 1 à 100, notamment de 1 à 50, et de préférence de 1 à 10, - m est un entier au moins égal à 2, notamment allant de 2 à 1000, en particulier de 2 à 100, de préférence de 2 à 60, voire de 10 à 50, de préférence de 25 à 40, 2909881 4 avec R2, Y et Q pouvant figurer des définitions différentes au sein de la formule (I), et Q possédant au moins deux définitions différentes dans le conjugué de formule générale (I), caractérisé en ce que ledit procédé comprend la réaction d'au moins un composé de formule générale (II) : P 5 dans laquelle : - p est un entier égal à n + m, et - P, R' et q sont tels que définis précédemment, avec, simultanément ou non, au moins deux composés de formule générale (III) : O 1 NùR2 ùYùQ 10 0 dans laquelle R2, Y et Q sont tels que définis précédemment, les deux composés de formule générale (III) étant différents l'un de l'autre par au moins la définition de Q, 15 la réaction dudit composé de formule générale (II) avec chacun des composés de formule générale (III) étant réalisée dans des conditions opératoires identiques et propices à l'établissement d'une liaison thioéther entre chacun des résidus maléimide des deux composés de formule générale (III) avec respectivement au moins une fonction thiol dudit composé de formule générale (II). 20 Selon un mode de réalisation, les réactions du composé de formule générale (II) avec chacun des deux composés de formule générale (III) différents sont réalisées simultanément, c'est-à-dire en une unique étape. Selon un autre mode de réalisation, le composé de formule générale (II) réagit, dans une première étape, avec un premier composé de formule générale (III) puis, le 25 composé mono fonctionnalisé ainsi obtenu réagit dans une étape consécutive, avec au moins un second composé de formule générale (III), différent du premier composé de formule générale (III) par au moins l'entité Q. 2909881 5 Le procédé selon l'invention s'avère particulièrement avantageux pour procéder rapidement, et voire même en unique étape, à la préparation de conjugués issus de la dérivatisation d'un unique substrat par plusieurs entités d'intérêt dans le domaine thérapeutique, du diagnostic et/ou de l'imagerie. 5 Grâce au procédé selon la présente invention, ce type de conjugués peut être obtenu de façon simple et reproductible, sans utiliser un trop grand nombre d'étapes de réaction, ni de réactifs dangereux et/ou toxiques. En particulier, lorsque les interactions du composé de formule générale (II) avec les composés de formule générale (III) ont lieu simultanément, les durées de préparation du composé final sont, de façon avantageuse, 10 considérablement réduites. Il n'est en outre pas nécessaire de réaliser de nombreuses et coûteuses étapes d'extraction et de purification pour éliminer des réactifs dangereux et/ou toxiques, ou encore pour isoler et purifier les produits intermédiaires. Par ailleurs, le procédé selon l'invention peut avantageusement être mis en 15 oeuvre dans des conditions suffisamment douces pour ne pas affecter l'intégrité du substrat P, ainsi que celles des entités Q, notamment en ce qui concerne leur configuration spatiale et/ou leur charge électrique respectives. En particulier, le procédé selon l'invention s'avère avantageux pour fixer sur un même substrat P, physiologiquement acceptable, au moins un ligand de ciblage et au moins un marqueur, un chélatant de marqueur(s) ou un couple 20 chélatant de marqueur(s) - marqueur. Ainsi, le procédé objet de la présente invention est plus particulièrement avantageux pour la formation de conjugués dotés de marqueurs fonctionnels particulièrement utiles, par exemple et de façon non limitante pour l'imagerie ou la radiothérapie ciblée des cellules spécifiques telles les hépatocytes ou encore les tumeurs 25 via le ciblage de l' endothélium tumoral ou des cellules tumorales, ou bien encore les zones d'ischémie cardiaque et cérébrale, les zones inflammatoires, etc. DEFINITION DE P Dans les formules générales (I) et (II) des composés selon la présente 30 invention, P représente un substrat, chimique ou biologique, physiologiquement acceptable, c'est-à-dire une entité compatible avec une administration à un être vivant. 2909881 6 Le substrat P est plus particulièrement utilisé dans le procédé selon l'invention pour la fixation d'au moins deux entités Q différentes et leur acheminement vers la cible biologique à traiter, à imager ou à diagnostiquer. Ce substrat peut lui-même présenter une activité, par exemple biologique, ou au contraire être totalement inerte. 5 Avantageusement, le substrat P selon l'invention est biodégradable. Au sens de l'invention, on entend désigner sous l'appellation biodégradable toute entité qui se dissout ou se dégrade en une période acceptable pour l'application à laquelle elle est destinée, habituellement en utilisation diagnostique,thérapeutique ou en imagerie in vivo. Généralement, cette période doit être inférieure à 5 ans et plus 10 préférentiellement à une année lorsque l'on expose une solution physiologique correspondante à un pH de 6 à 8 et à une température comprise entre 25 C et 37 C. Une entité biodégradable au sens de l'invention peut être aussi une entité pouvant être biodégradée in vivo par l'action de protéines telles que les enzymes, et qui ne se dégrade toutefois pas spontanément dans une solution physiologique. 15 Comme substrat P convenant à la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, on peut notamment citer les protéines, les polysaccharides, les vecteurs de type liposome, ou nano- et microparticules ou encore les polymères biocompatibles. Par protéine on entend désigner une macromolécule composée par une 20 chaîne (ou séquence) d'acides aminés liés entre eux par des liaisons peptidiques. Les protéines convenant à la mise en oeuvre de la présente invention peuvent présenter des masses moléculaires variées, allant notamment de 10 à 500 KDa, en particulier de 50 à 100 KDa. Elles peuvent notamment être choisies parmi l'albumine, l'ovalbumine, la 25 lactalbumine, les immunoglobulines, les macroglobulines, les microglobulines, les hormones et facteurs circulants, les hémocyanines, et leurs dérivés. Selon un mode de réalisation particulier, le substrat P peut être une protéine, et plus particulièrement l'albumine humaine (HSA) ou l'un de ses dérivés. 30 Les vecteurs, biologiques ou non, appartenant au domaine des liposomes et des nano- et microparticules peuvent notamment être constitués de polymères biodégradables organosolubles. 2909881 7 Par particules on entend désigner des particules de diamètre moyen compris entre 5 et 150 000 nm, et notamment compris entre 10 et 300 nm. Comme polymère biodégradable, on peut notamment citer les polyesters comme les poly(acide lactique) (PLA), poly(acide glycolique) (PGA), poly(c-caprolactone) 5 (PCL), les polyanhydrides, poly(hyaluronanes), poly(alkylcyanoacrylates), polyorthoesters, poly(alkylène tartrate), polyphosphazènes, polyamino acides, polyamidoamines, polysaccharides, polycarbonates, polyméthylidènemalonate, polysiloxane, le polyhydroxybutyrate ou le poly(acide malique), ainsi que leurs copolymères et dérivés. Dans le cadre de la présente invention, un polymère sera qualifié de 10 biocompatible Si le polymère ainsi que tous ses produits de dégradation sont non toxiques pour le receveur, ni ne présentent d'effets nuisibles dans l'organisme du receveur, par exemple du type d'une réaction immunitaire au niveau du site d'injection. Les polymères biocompatibles convenant à la mise en oeuvre de la présente invention peuvent être choisis parmi tous les polymères connus de l'homme de métier, et 15 notamment parmi l'hydroxypropylméthacrylamide (HMPA), le polyéthylène glycol (PEG), le collagène, les polysaccharides, le poly(2-méthoxyéthylacrylate) (PMEA), le polydimethyl siloxane (PDMS), le polyvinyl pyrrolidone (PVP), l'acide hyaluronique (AH), les héparanes, les héparanesulfates, les dextrans, les dextransulfates, les héparines, les cyclodextrines et leurs dérivés. 20 Le cas échéant, la surface des particules peut être modifiée pour par exemple conférer à ces particules des propriétés complémentaires, par exemple suppléer à leur caractère hydrophobe qui peut affecter leur réactivité in vivo en favorisant par exemple leur adsorption par des protéines plasmiques ou encore pour les fonctionnaliser de manière à ce qu'elles puissent interagir selon le procédé considéré selon l'invention avec au moins deux 25 entités de formule (III) différentes. Comme précisé précédemment, le substrat P est conjugué aux entités d'intérêt dans le domaine thérapeutique, du diagnostic et/ou de l'imagerie, via tout ou partie de ses fonctions thiols. 30 Les fonctions thiols peuvent être naturellement présentes sur le substrat P. Selon ce mode de réalisation, q est égal à zéro dans les formules générales (I) et (II). 2909881 8 Selon une autre variante, le composé de formule générale (II) est obtenu au préalable par activation de fonctions naturellement présentes sur le substrat P, mais différentes de fonctions thiols, en fonctions thiol, ou en groupements dotés de fonctions thiol. Cette activation relève clairement des compétences de l'homme de l'art. Elle peut 5 notamment être effectuée par un agent de liaison hétérobifonctionnel, par exemple la 2-iminothiolane, comme décrit ci-après. DEFINITION DE R' Dans les formules générales (I) et (II) des composés selon la présente 10 invention, le radical R' représente un espaceur ( spacer en terminologie anglaise) entre le substrat P tel que décrit précédemment et la fonction thiol ûSH. Lorsque R' est présent, c'est-à-dire lorsque q est égal à 1, ce radical dérive généralement structurellement de la structure chimique de l'agent utilisé pour fonctionnaliser une molécule du substrat P avec au moins une fonction thiol. 15 De manière générale, R' représente une chaîne hydrocarbonée en C,-Cio, notamment en C1-05, linéaire, ramifiée, ou cyclique, saturée ou insaturée, éventuellement interrompue par un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O et S, et optionnellement substituée. Par exemple, R' peut être substitué par un ou plusieurs substituants choisis 20 parmi un radical imine, un groupe imidyle, un radical hydroxyle, un motif oxo, un radical amino, un atome d'halogène, un radical alkyle, un radical alkoxy, un radical carboxy, un radical alkylamino, un radical dialkylamino, un radical aryle, et un radical aryloxy. La longueur et/ou la nature de R' pourront être adaptées selon l'utilisation envisagée, et notamment selon la nature du substrat P. 25 Ainsi, lorsque le substrat P est une protéine comportant au moins un acide aminé par exemple de type lysine, ou toute autre substance présentant à sa surface au moins un groupe amine, ce substrat peut être transformé avec un agent de liaison hétérobifonctionnel susceptible de réagir par l'une de ses fonctions avec ladite fonction amine, de telle sorte à introduire via sa deuxième fonction la fonction thiol requise en 30 surface dudit substrat P. Comme agent de liaison de ce type, on peut notamment citer la 2-iminothiolane, et ses dérivés, qui sont des thioimidates cycliques connus pour réagir avec 2909881 9 les groupes amines et conduire ainsi à des dérivés amidinés contenant des groupes sulfhydryles réactifs comme cela est illustré sur le schéma suivant : H R~N SH NH2+ Lorsque le substrat P est une protéine, on veillera à effectuer cette 5 fonctionnalisation dans des conditions douces, de sorte à ne pas provoquer de modifications structurales ou de charge trop importantes de celle-ci. Ainsi, la réaction de l'iminothiolane sur un substrat P de type protéine permet avantageusement de conserver les charges cationiques de ladite protéine tout en introduisant des fonctions thiol sur les amines latérales des lysines. 10 Selon cette variante de réalisation particulière de l'invention, RI représente plus particulièrement une chaîne hydrocarbonée en C1-05 linéaire, substituée par un groupe imidyle. Préférentiellement, RI représente un butyrimidyle. Lorsque le substrat P a été convenablement fonctionnalisé et se trouve sous la 15 forme d'un composé de formule générale (II), il peut interagir avec des composés de formule générale (III), à partir de ses fonctions thiol, notamment via une addition de Michael sur les groupes maléimide. DEFINITION DE Q 20 Dans les formules générales (I) et (III) des composés selon la présente invention, Q représente une entité, chimique ou biologique, physiologiquement acceptable différente de P et d'intérêt dans le domaine thérapeutique, du diagnostic et/ou de l'imagerie. L'entité Q peut être choisie parmi des ligands de ciblage, notamment de 25 cellules et tissus, des marqueurs, des chélatants de marqueur(s), notamment reconnus par des récepteurs cellulaires ou ayant une affinité pour certaines cellules ou tissus, et/ou des couples chélatant de marqueur(s) - marqueur. - Par marqueur , on entend désigner une entité détectable par radiochimie, médecine nucléaire (par exemple scintigraphie), imagerie par résonance RùNH2 + 2909881 10 magnétique (IRM), par rayons X, par fluorescence, par ultrasons, par radioactivité ou par détection optique. Comme marqueur utilisable dans le procédé selon la présente invention, on peut notamment citer le phosphore, l'ythrium, le rhenium ou tout autre isotope émettant 5 des radiations bêta ; l'actinium, le bismuth, l'astatine ou tout autre isotope émettant des radiations alpha ; le technétium, l'indium, l'iode, ou tout autre isotope émettant des radiations gamma, le carbone, l'azote, le fluor, le sodium, le magnésium, l'aluminium, le silicium, le potassium, le vanadium, le manganèse, le gallium, le nobium, l'iode. Il peut en particulier être choisi parmi Tc-99m, In-1 11, Ga-67, Rh-105, I-123, 10 Nd-147, Pm-151, Sm-153, Gd-159, Tb-161, Er-171, Re-186, Re-188 et Tl-201. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le marqueur peut être un émetteur de positron (ou positon), susceptible notamment d'être détecté par une caméra TEP-TDM. 15 - Par chélatant de marqueur(s) , on entend désigner une entité susceptible de fixer au moins un marqueur par chélation. Comme chélatant de marqueur(s) utilisable dans le procédé selon la présente invention, on peut notamment citer l'acide diéthylènetriaminepenta-acétique (DTPA), l'acide éthylènediaminetétra-acétique (EDTA), le 1,4,7,10-tétraazocyclododécane20 N,N',N",N'"tétra-acétate (DOTA), l'acide tétraazacyclotétradécane-N,N',N'',N"'tétraacétique (TETA), l'acide cyclohexyl 1,2-diamine tétra-acétique (CDTA), l'acide éthylène glycol-0,0'-bis(-2-aminoéthyl)N,N,N',N'-tétra-acétique (EGTA), l'acide N,N-bis(hydroxybenzyl)-éthylène diamine N,N'-diacétique (HBED), l'acide triéthylène tétramine hexa-acétique (TTHA), l'acide hydroxyéthyldiamine triacétique (HEDTA), 25 l' hydroxyéthylidène diphosphonate (HEDP), l'acide dimercaptosuccinique (DMSA), l'acide diéthylène triaminetétraméthylènephosphonique (DTTP) et le 1-(p-aminobenzyl)-DTPA, l'acide 1,6-diaminohexane-N,N,N',N'tétra-acétique, l'acide éthylène bis (oxyethylènenitrilo)-tétra-acétique et l'acide cyclohexyldiéthylènetriamine penta-acétique (CHX-DTPA). 30 Selon un mode de réalisation de l'invention, au moins une entité Q est un marqueur, un chélatant de marqueur(s) ou un couple chélatant de marqueurs(s)-marqueur notamment tels que définis ci-dessus. 2909881 11 Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, au moins une entité Q est un radical de l'acide diéthylènetriaminepenta-acétique (DTPA), associé ou non au marqueur Tc-99m. 5 - Par ligand de ciblage , on entend désigner une entité chimique ou biologique susceptible de s'adresser spécifiquement à une cellule, un tissu ou un organe. Comme ligand de ciblage utilisable dans le procédé selon la présente invention, on peut notamment citer les hormones et neuromédiateurs, des anticorps ou fragments d'anticorps, des fragments variables à simple chaîne (ScFv), des peptides, comme par 10 exemple un peptide hormonal ou un résidu RGD se fixant sur une intégrine, des sucres tels le mannose ou le galactose se fixant sur les lectines, des annexines se fixant sur les tissus ischémiés, ou encore le folate se fixant sur son récepteur surexprimé dans les cellules tumorales. Au sens de l'invention, un ligand de ciblage est un élément susceptible de 15 reconnaître ou de lier préférentiellement des cellules exprimant un élément cellulaire particulier. Avantageusement l'élément cellulaire est un élément membranaire, de préférence possédant une partie de sa structure disposé dans le milieu extracellulaire. Selon un mode de réalisation, cet élément cellulaire peut être spécifique d'un 20 état physiologique ou pathologique d'un type cellulaire ou du tissu environnant ce type de cellules ou de l'organe comprenant ce type de cellules. Comme exemples de telles cellules, on peut notamment citer les hépatocytes, les cellules endothéliales, les cellules épithéliales, et les myoblastes. L'expression "reconnaître ou de lier préférentiellement" vise à indiquer que le 25 ligand de ciblage possède une affinité particulière pour les cellules ou tissus considérés, même si une liaison non spécifique ou moins importante avec d'autres cellules ou d'autres tissus ne peut être totalement exclue in vivo ou ex vivo. La liaison préférentielle permet toutefois un ciblage des conjugués conformes à l'invention vers les sites d'intérêt, réduisant la dissémination du composé selon l'invention vers les tissus et/ou les cellules de moindre 30 intérêt. Ainsi, le ligand de ciblage peut être choisi, par exemple et de manière non limitative, parmi un sucre, un peptide tels que les peptides RGD (arginine-glycine-acide 2909881 12 aspartique), une lectine, un anticorps ou un fragment de celui-ci reconnaissant un élément présent à la surface des cellules, tel que par exemple une protéine (transferrine, HDL, LDL ou protéines constituantes des HDL ou LDL), un sucre, un lipide ; un ligand d'un récepteur cellulaire tel que par exemple un peptide comme le neuropeptide Y ou un peptide à 5 séquence RGD, un polypeptide, un neuromédiateur tel que l'adrénaline, un antagoniste ou un agoniste, comme par exemple un antagoniste ou un agoniste de récepteurs, notamment un antagoniste de récepteurs 13-adrénergiques tel que le propranolol, un facteur de croissance, un acide aminé ou un dérivé de celui-ci tel que par exemple le glutamate, une cytokine tel que par exemple une interleukine, une chemokine, un interféron ou un TNF, 10 une hormone, une vitamine comme par exemple l'acide folique, une apolipoprotéine, le cholestérol ; un ligand susceptible d'interagir avec un lipide ou phospholipide membranaire tel que par exemple une annexine ou un acide nucléique (ATP, AMP, adénosine), ou toute molécule synthétique ou naturelle possédant une affinité suffisante pour un composant de la membrane des cellules ou de leur matrice extracellulaire. 15 Il relève des connaissances de l'homme de l'art de déterminer la nature du ligand de ciblage appropriée au ciblage désiré, le cas échéant en faisant appel à des méthodes d'essais habituellement pratiquées dans le domaine. Selon un mode de réalisation, le ligand de ciblage peut être par exemple un polypeptide, capable de se lier à la surface de cellules présentes de façon caractéristique ou 20 spécifique dans un tissu particulier ou présentant une pathologie. A titre illustratif des ligands de ciblage pouvant plus particulièrement être utilisés selon l'invention, on peut notamment citer les sucres, les peptides, tels que les peptides RGD, et les vitamines tels que l'acide folique, et les antagonistes et les agonistes de récepteurs, ou toute molécule synthétique ou naturelle possédant une affinité suffisante 25 pour un composant de la membrane des cellules ou de leur matrice extracellulaire. Selon un mode de réalisation de l'invention, au moins une entité Q est un ligand de ciblage, notamment tels que définis ci-dessus. Selon ce mode de réalisation, le ligand de ciblage peut être choisi parmi ceux se fixant préférentiellement sur les hépatocytes. 30 L'entité Q peut plus particulièrement être un sucre, et de préférence du lactose, ou un de ses dérivés. 2909881 13 DEFINITION DE R2 Dans les formules générales (I) et (III) des composés selon la présente invention, R2 représente un espaceur ( spacer en terminologie anglaise) entre le groupe maléimide apte à réagir avec une fonction thiol du composé de formule générale (II), et 5 l'entité Q qui est liée audit composé de formule générale (III) via une fonction de liaison Y. La longueur et/ou la nature de R2 peut être adaptée selon l'utilisation envisagée, et notamment selon la nature des entités P et Q en présence. De manière générale, R2 représente une chaîne hydrocarbonée, linéaire, 10 ramifiée ou cyclique, saturée ou insaturée, en C1-C20, notamment en C1-C15, éventuellement interrompue par un ou plusieurs radicaux cycloalkyles ou aralkyles en C4-C7, notamment en C6, éventuellement substitués par un radical alkyle, ladite chaîne étant en outre éventuellement substituée et/ou éventuellement interrompue par un ouplusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O et S, ou encore un groupement représentatif 15 d'une fonction amide, ester, éther ou thioéther. Selon un mode de réalisation de l'invention, R2 représente une chaîne hydrocarbonée linéaire saturée en C1-C15 éventuellement interrompue par un radical cycloalkyle ou aryle en C5-C7, et notamment en C6. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, R2 peut représenter une 20 chaîne hydrocarbonée linéaire saturée en C1-C1o, notamment en C2. Selon encore un autre mode de réalisation de l'invention, R2 peut représenter une chaîne hydrocarbonée linéaire saturée en C1-C1o, notamment en C4, interrompue par un groupement représentatif d'une fonction amide, par exemple en position 2. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, R2 peut être un peptide 25 ou une chaîne glycosidique. DEFINITION DE Y Dans les formules générales (I) et (III) des composés selon la présente invention, la fonction de liaison Y représente une fonction organique établissant une 30 liaison entre R2 et l'entité Q. Cette fonction de liaison Y peut être choisie parmi toutes les fonctions usuellement rencontrées en chimie organique, et notamment représenter une fonction de 2909881 14 liaison impliquant un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O et S, à l'image par exemple d'une fonction amide, ester, éther, ou thioéther. L'entité Q peut ne pas présenter sous sa forme native une fonction convenant à l'établissement d'une liaison de fonction Y avec la chaîne R2. Dans ces cas, il peut être 5 nécessaire de procéder au préalable à une activation de l'entité Q. Généralement, cette activation consiste en une transformation de fonctions réactives présentes initialement sur cette entité. Cette transformation relève clairement des compétences de l'homme de l'art. Par exemple, il est bien connu d'aminer des sucres réducteurs, monosaccharides, disaccharides ou oligosaccharides, sur la position anomérique libre par réaction dudit sucre 10 avec de l'ammoniaque ou du carbamate d'ammonium, ou encore par azidation suivi d'une réduction. Le composé de formule générale (III) selon l'invention peut également être obtenu au préalable par réaction entre une molécule hétérobifonctionnelle comportant au moins une fonction maléimide avec une forme réactive d'une entité Q. 15 Comme molécule hétérobifonctionnelle de ce type convenant à la mise en oeuvre de ce mode de réalisation, on peut notamment citer le N-succinimidyl-3- maléimidylbenzoate, le N-succinimidyl-4-(4-maléimidylphényl)butyrate, le N-succinimidyl-trans-4-(maléimidyl-méthyl)cyclohexane-1-carboxylate, le N-succinimidyl-3-maléimidylpropionate, le N-succinimidyl-4-maléimidylbutyrate, le 20 N-succinimidyl-6-maléimidylhexanoate, le N-succinimidyl-8-maléimidyloctanoate, et le N- suc cinimidyl- 1 1 -maléimidylundecanoate. Bien entendu, un même type de molécule hétérobifonctionnelle peut être mis à réagir avec différents types d'entités Q, et il est donc possible selon le procédé de l'invention de réaliser une large gamme de composés de formule générale (III) ne différant 25 entre eux que de par la nature de l'entité Q. Ainsi, selon un mode de réalisation particulier de l'invention, les différents composés de formule générale (III) résultent de la réaction d'une même molécule hétérobifonctionnelle avec différentes entités Q. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les différents composés de 30 formule générale (III) résultent de la réaction de molécules hétérobifonctionnelles différentes pour chaque définition de l'entité Q. 2909881 15 Selon un mode de réalisation de l'invention, la fonction de liaison Y est une fonction amide, et notamment peut résulter de la réaction d'une fonction acide carboxylique présente à l'extrémité de la chaîne R2 avec une fonction amine présente sur l'entité Q, ou inversement. 5 DEFINITION DU CONJUGUE DE FORMULE GENERALE (I) Au sens de l'invention, le terme dérivé de composé de formule générale (I) désigne plus particulièrement les sels ou esters pharmaceutiquement acceptable du conjugué de formule générale (I). A titre d'exemple d'ester d'un conjugué selon l'invention, 10 on peut mentionner les succinate, hémisuccinate, malate, tartrate et glycolate. A titre d'exemple de sel d'un conjugué selon l'invention, on peut mentionner les sulfate, phosphate, sel de sodium, et sel de calcium. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le composé de formule générale (I) comprend au moins une entité Q de type ligand de ciblage et au moins une 15 entité Q de type marqueur, chélatant de marqueur(s) ou couple chélatant de marqueur(s) ù marqueur. Il est bien entendu envisageable de fixer sur un substrat P selon l'invention plusieurs types de ligands de ciblage et/ou plusieurs types de marqueurs, ou chélatants de marqueur(s). 20 Ainsi, selon un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé utile pour la préparation d'un conjugué de formule générale (I') : Q'ùY' RZ N' S~R O (1 m" dans laquelle P, R', q et n sont tels que définis précédemment, 25 m' et m" sont des entiers au moins égaux à 1, leur somme m'+m" allant notamment de 2 à 1000, en particulier de 2 à 100, de préférence de 2 à 60, voire de 10 à 50, de préférence de 25 à 40, R2' et R2", identiques ou différents, ont la même définition que R2 2909881 16 Y' et Y", identiques ou différents, ont la même définition que Y, et Q' représente un ligand de ciblage, et notamment un sucre, et Q" représente un marqueur, un chélatant de marqueur(s) ou un couple chélatant de marqueur(s) - marqueur. Selon un mode de réalisation de l'invention, Q' représente un ligand de ciblage 5 se fixant préférentiellement sur les hépatocytes, par exemple un sucre et de préférence du lactose ou un de ses dérivés, et Q" représente un chélatant du technétium, par exemple l'acide diéthylènetriaminepenta-acétique (DTPA). Selon un mode de réalisation, q est égal à 1. Selon un autre mode de réalisation, n est égal à zéro. 10 PROCEDE Dans le procédé objet de la présente invention, les différents composés de formule générale (III) peuvent être mis en présence simultanément ou consécutivement avec au moins un composé de formule (II). 15 Quelque soit le mode de réalisation considéré, les proportions relatives des différents composés de formule générale (III) peuvent être ajustées de manière à ce que le composé de formule générale (I) résultant de cette interaction comporte les quantités souhaitées en chacune des entités Q attendues. Ces proportions relatives peuvent en particulier être déterminées de façon empiriques, ou suivant des études de cinétiques de 20 réaction. Les composés de formule générale (III) peuvent notamment être mis à réagir dans des rapports compris entre 1/1 et 1/10, et notamment 1/2, 1/3, 1/4, 1/5, 1/6, 1/7, 1/8, ou 1/9. Le procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre à une température allant 25 de 0 à 60 C, et notamment de 20 à 35 C. Par ailleurs, la durée de réaction des composés de formule générale (III) avec le composé de formule générale (II) est généralement inférieure à 5 heures, et notamment peut aller de 0,5 à 2 heures. Selon une variante de l'invention, le composé de formule générale (II) peut 30 réagir avec un premier composé de formule générale (III) comportant à titre d'entité Q un sucre, par exemple du lactose, et un second composé de formule générale (III) comporte à titre d'entité Q un chélatant du technétium, par exemple l'acide diéthylènetriaminepenta-2909881 17 acétique (DTPA), l'ordre de succession entre les premier et second composés de formule générale (III) n'étant pas déterminant. Selon une autre variante, cette réaction est conduite en une unique étape. Il est par ailleurs possible dans le procédé objet de la présente invention 5 d'associer un marqueur à un chélatant de marqueur(s) déjà présent sur le conjugué de formule générale (I) dans une étape successive. Cette étape peut être réalisée à l'issue du procédé ou être réalisée simplement au moment de la mise en oeuvre du conjugué de formule générale (I) ou (I'), c'est-à-dire lors de son emploi à des fins de diagnostics et/ou d'imagerie. 10 Selon un autre de ses aspects, l'invention concerne un conjugué de formule générale (I) : (I) P m dans laquelle : 15 - P représente un substrat, chimique ou biologique, physiologiquement acceptable, - RI représente une chaîne hydrocarbonée en C,-C,0, notamment en C1_C5, linéaire, ramifiée, ou cyclique, saturée ou insaturée, éventuellement interrompue par un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O et S, et optionnellement substituée, 20 - g est égal à zéro ou à 1, -R2 représente une chaîne hydrocarbonée, linéaire, ramifiée ou cyclique, saturée ou insaturée, en C 1-C20, notamment en C1-C15, éventuellement interrompue par un ou plusieurs motifs cycloalkyles ou aralkyles en C4-C7, notamment en C6, et éventuellement substitués par un radical alkyle, ladite chaîne étant en outre 25 éventuellement substituée et/ou éventuellement interrompue par un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O et S ou encore un groupement représentatif d'une fonction amide, ester, éther ou thioéther, 2909881 18 - Y représente une fonction de liaison impliquant un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O et S, à l'image par exemple d'une fonction amide, ester, éther ou, thioéther, - Q représente une entité, chimique ou biologique, physiologiquement 5 acceptable différente de P et d'intérêt dans le domaine thérapeutique, du diagnostic et/ou de l'imagerie, - n est égal à 0 ou est un entier allant de 1 à 1000, en particulier de 1 à 100, notamment de 1 à 50 et de préférence de 1 à 10, - m est un entier au moins égal à 2, notamment allant de 2 à 1000, en 10 particulier de 2 à 100, de préférence de 2 à 60, voire de 10 à 50, de préférence de 25 à 40, avec R2, Y et Q pouvant figurer des significations différentes au sein de la formule (I), et Q figurant au moins deux définitions distinctes, dans le conjugué de formule générale (I), ou un de ses dérivés. Ce conjugué peut être plus particulièrement tel que défini précédemment. 15 Il peut notamment s'agir d'un conjugué de formule générale (I'), dans laquelle : - P est une protéine, - R' représente une chaîne hydrocarbonée en C1-05 linéaire, substituée par un groupe imidyle, - q= 1, 20 - n est égal à 0, ou est un entier allant de 1 à 50, et de préférence de 1 à 10, - m' et m" sont des entiers au moins égaux à 1, leur somme m'+ m" allant de 2 à 60, voire de 10 à 50, de préférence de 25 à 40, - R2' est une chaîne hydrocarbonée linéaire saturée en C1-C1o, notamment en C2, 25 - R2" est une chaîne hydrocarbonée linéaire saturée en C1-Cio, notamment en C4, interrompue par un groupement représentatif d'une fonction amide, - Y' et Y" sont identiques, et représentent une fonction amide, - Q' représente un ligand de ciblage, et de préférence un sucre, et - Q" représente un chélatant de marqueur(s), ou un couple chélatant de 30 marqueur(s)-marqueur. Selon ce mode de réalisation, P est de préférence l'albumine humaine (HSA) ou l'un de ses dérivés, Q' est de préférence du lactose ou un de ses dérivés et Q" est de 2909881 19 préférence un radical de l'acide diéthylènetriamine penta-acétique (DTPA), associé ou non au marqueur Tc-99m. Il peut notamment s'agir d'un conjugué de formule générale (I') dans laquelle : P est l'albumine humaine (HSA) ou l'un de ses dérivés, 5 R' est un butyrimidyle, m' est compris entre 25 et 30, m" est compris entre 3 et 5, R2' est une chaîne hydrocarbonée linéaire saturée en C2, R2' est une chaîne hydrocarbonée linéaire saturée en C4, interrompue par un 10 groupement représentatif d'une fonction amide en position 2, Q' est du lactose ou un de ses dérivés, Q" est un radical de l'acide diéthylènetriamine penta-acétique (DTPA), associé ou non au marqueur Tc-99m. Plus particulièrement, le composé de formule générale (I) ou (I') peut être le 15 lactosyl albumine DTPA. Selon un de ses aspects la présente invention se rapporte également à l'utilisation d'un conjugué de formule générale (I) conforme à l'invention et plus particulièrement de formule générale (I') pour la préparation d'une composition pharmaceutique notamment utile à des fins de diagnostic et/ou d'imagerie, in vitro ou 20 in vivo. Avantageusement, la mise en oeuvre in vivo d'un conjugué conforme à l'invention permet d'établir des images des tissus ou organes dans lesquels ledit phénomène à détecter/quantifier est susceptible de se produire. Selon un mode particulier de réalisation il est possible d'établir des images des 25 tissus ou organes susceptibles d'exprimer une entité biologique, et notamment des cellules particulières, à détecter et/ou à quantifier. Ainsi, selon un mode particulier de réalisation, les conjugués selon l'invention peuvent être mis en oeuvre dans des méthodes d'imagerie médicale. Selon un autre de ses aspects, l'invention vise une méthode de diagnostic 30 in vivo comprenant la détection et/ou la quantification d'une entité biologique, notamment des cellules particulières, au moyen d'un conjugué de formule générale (I) ou (I'). 2909881 20 Une telle méthode peut être appliquée, par exemple et de manière non exhaustive, à des visées diagnostiques médicales, expérimentales, cliniques ou pré-cliniques chez des êtres humains ou chez des animaux tels que des animaux de laboratoires ou des animaux utilisés dans l'agriculture, tels que le rat, la souris, le cobaye, 5 le primate non humain, le cochon d'inde, ou le cochon. Plus particulièrement, le présente invention vise l'utilisation d'un conjugué de formule générale (I), par exemple obtenu selon le procédé selon l'invention, ou tel que défini précédemment, dans laquelle au moins une première entité Q dérive d'un sucre, et notamment du lactose, et une seconde entité Q est un marqueur, un chélatant de 10 marqueur(s) ou un couple chélatant de marqueur(s) ù marqueur, et notamment dérive du DTPA associé ou non à un marqueur, pour la préparation d'une composition utile pour la détection des hépatocytes et destinée en particulier à mesurer la réserve fonctionnelle hépatique. A titre illustratif des possibles utilisations de tels conjugués, on peut 15 notamment citer : - l'évaluation fonctionnelle de la réserve hépatique et/ou la scintigraphie dynamique du foie en mode planaire, - la tomoscintigraphie du foie permettant la cartographie

fonctionnelle du foie (aide à la détermination du volume total et des segments résécables), 20 - l'évaluation de la gravité de l'atteinte hépatique dans les pathologies aiguës (hépatite virale aiguë), et la stadification des patients, - l'évaluation de la fonction hépatique chez des patients sous plasmaphérèse ou atteints de pathologies primitives des voies biliaires, - l'évaluation de la fonction hépatique globale et par tomoscintigraphie chez 25 les donneurs potentiels pour des transplantations hépatiques. - l'aide à la décision par tomoscintigraphie pré-opératoire de la fonction hépatique chez des patients devant bénéficier d'une hépatectomie partielle, - le suivi du receveur d'un transplant hépatique : dépistage d'une insuffisance hépatique précoce et valeur pronostique, 30 - le suivie des pathologies hépatiques pédiatriques graves (atrésie des voies biliaires, syndrome d'Alagille, ...), et 2909881 21 - l'évaluation de la fonction hépatique chez les patients présentant une coinfection VHC / HIV / VHB / HIV, VHC / VHB / HIV. Bien évidemment, le procédé selon l'invention peut être utilisé pour préparer des conjugués utilisables selon d'autres imageries fonctionnelles par exemple en vue de 5 l'imagerie des tumeurs ou des zones d'ischémies (ischémie cardiaque), par exemple par ciblage des cellules en apoptose fixant les annexines,ou des tumeurs fixant la transferrine ou le folate, ou un anticorps dirigé contre un antigène tumoral comme la PSA ou PMSA. L'utilisation des conjugués selon l'invention à titre de nouveaux traceurs pour l'évaluation de la fonction d'autres organes (rein, coeur, ...) ou de zones tumorales fait 10 ainsi également partie du domaine de la présente invention. L'ajustement des quantités efficaces adéquates du ou des conjugués conformes à l'invention, à mettre en oeuvre dans une méthode ou une utilisation selon l'invention, dépend du phénomène, ou de l'entité, à détecter/quantifier (chimique, physique, biologique) et de l'environnement dans lequel le procédé selon l'invention est conduit 15 (in vitro, ex vivo ou in vivo). In vivo, les quantités efficaces peuvent, également, être ajustées selon la taille, le poids de l'individu à qui le procédé selon l'invention est appliqué, ou chez qui l'utilisation selon l'invention est mise en oeuvre, ainsi que selon l'organe, le tissu ou les cellules ciblées.

20 Les ajustements peuvent être réalisés par toutes méthodes usuellement pratiquées par l'homme de l'art. Au sens de la présente invention, on entend par "quantité efficace", la quantité nécessaire et suffisante pour obtenir l'effet désiré, à savoir la détection et/ou la quantification d'un phénomène chimique, physique ou biologique, ou d'une entité 25 biologique. Dans le cadre de leur mise en oeuvre in vivo ou in vitro, les conjugués conformes à l'invention peuvent être mis en forme afin d'être adaptés à une administration par voie orale, ou parentérale, notamment intraveineuse, intraartérielle, intracardiaque, intracérébro-ventriculaire, intrapéritonéale, intratumorale, ou pour une administration par 30 voie pulmonaire, nasale, ophtalmique et éventuellement rectale, vaginale ou topique.

2909881 22 Les conjugués conformes à l'invention peuvent être ainsi mis en oeuvre dans une formulation adaptée au procédé de détection à réaliser et à la voix d'administration choisie. Par exemple, les conjugués conformes à l'invention peuvent être préparés sous 5 la forme d'un comprimé, d'une gélule ou d'une solution aqueuse concentrée ou non. Cette solution aqueuse peut être avantageusement stérile. Selon un autre mode de réalisation, les conjugués conformes à l'invention peuvent être sous forme solide, par exemple en poudre, et être préparés en solution aqueuse, avantageusement stérile, juste avant leur administration.

10 Les conjugués conformes à la présente invention peuvent être administrés à un être vivant, tel que par exemple un animal ou un être humain, puis la détection du marqueur peut être réalisée in vivo selon les moyens usuellement mis en oeuvre dans le domaine. Selon un autre mode particulier de réalisation, la présente invention se rapporte 15 à un kit de diagnostic comprenant au moins un conjugué obtenu selon le procédé selon l'invention, ou tel que défini précédemment. Il peut notamment s'agir d'une trousse de marquage prête à l'emploi pour des équipes travaillant sur des modèles expérimentaux de pathologie hépatique et souhaitant évaluer la réserve fonctionnelle.

20 Les exemples et figures présentés ci-après sont soumis à titre d'illustrations de l'invention et ne doivent pas être interprétés comme pouvant limiter la portée de la présente invention. EXEMPLES 25 Un lyophilisat conditionné sous argon et comprenant une proteine couplée à du lactose et au DTPA, et un réducteur (ex. chlorure stanneux, SnCl2) en quantité adéquate a été préparé. L'ajout d'une solution de technétium au pH optimum permet d'obtenir une solution prête à injecter.

30 2909881 23 Exemple 1 : Synthèse d'un conjugué selon l'invention Etape 1 ù Synthèse du premier composé de formule générale (III) (lactose maléimide) la ù Activation du lactose (ligand de ciblage Q) par amination : synthèse d'un 5 aminoglycoside Il est nécessaire d'activer le ligand de ciblage choisi, à savoir le lactose, pour 10 former le conjugué correspondant suivant le procédé selon l'invention. La synthèse de l'aminoglycoside tel que schématisée ci-dessus peut être conduite selon les deux modes de réalisation suivants. I- Le lactose (3,6 g; 10 mmol) est dissout dans une solution d'ammoniaque 15 (28 %, 50mL) et on ajoute du bicarbonate d'ammonium (0,79 g; 10 mmol). La solution est chauffée à 42 C pendant 36 h, concentrée à moitié de son volume et lyophilisée. (A. Lubineau et al. Carb. Res. (1995), 266, 211-219) II- Le lactose (1,37 g; 4 mmol) est dissout dans l'ammoniaque (28 %, 2 mL), 20 on ajoute le carbamate d'ammonium (0,625 g ; 8 mmol) et du methanol (rapport 4/1). On agite à 35 C pendant 24 h, refroidit et filtre le précipité. Le solide est lavé avec du méthanol et de l'éther, puis séché. (L.M.Likhosherstov et al. Dodlaky Chemistry, (2002), 383(4-6), 89-92.) HO 0 OOH^ONH2 "OH OH OH 25 2909881 24 lb - Synthèse d'une molécule hétérobifonctionnelle : N-succinimidyl-3-maléimidylpropionate (SMP) O O NHS N ù 0 O~ N carbodiimide O O La (3-alanine (0,89 g; 10 mmol) est broyée finement et suspendue dans la DMF O 1/ O O DMF 5 (12 mL.). On ajoute l'anhydride maléique (0,98 g; 10 mmol) et l'ensemble est laissé à température ambiante pendant une heure (la dissolution intervient après environ 15 min). Le mélange est refroidit à 0 C, puis on ajoute le N-hydroxysuccinimide (1, 44 g; 12,5 mmol) et le DCC (dicyclohexylcarbodiimide, 4,13 g; 20 mmol). Le bain de glace est 10 enlevé après 5 min et on laisse une nuit à température ambiante. On filtre et lave par de l'eau et une solution de bicarbonate de sodium à 5 %, on sèche sur sulfate de sodium filtre et concentre. On cristallise enfin dans l'éther de pétrole. Le produit est séché sous vide à 40 C (d'après N.J.Ede et al, Bioconj. Chem. (1994), 5, 373-378.) 15 20 25 2909881 25 l c û Obtention du premier composé de formule générale (III) par condensation de la molécule hétérobifonctionnelle (N-succinimidyl-3-maléimidylpropionate) sur le ligand de ciblage Q activé (aminoglycoside) OH OH 5 L'aminolactose (0,1g; 0,25mmol) est dissout dans la DMF (2mL). On ajoute ensuite la molécule hétérobifonctionnelle (0,073 g ; 0,28 mmol) et agite à température ambiante pendant une nuit. La solution est évaporée sous vide et le produit précipité par de l'acétone, lavé plusieurs fois à l'acétone et séché.

10 Etape 2 û Synthèse du deuxième composé de formule générale (III) (DTPA- maleimide) Elle est réalisée selon le schéma de synthèse suivante : NH, B H2N N H 2 COZH 3 COZH HOZC 15 4 Synthèse de 1 : A une solution d'éthylène diamine (10 g) dans 50 ml de dichlorométhane on ajoute à 0 C 3.6 g de Boc2O en solution dans 50 ml de dichlorométhane. Le mélange est 2909881 26 agité à température ambiante. En fin de réaction on ajoute 50 ml d'eau, on extrait, on récupère la phase organique, on sèche, on évapore et on récupère 4g d'amine Boc 1. Synthèse de 2 : 5 A une solution contenant 192 mg d'amine 1 dans 4 ml de chloroforme on ajoute 267 mg de molécule hétérobifonctionelle (N-succinimidyl-4-maléimidylbutyrate) et 159 l de triéthylamine (TEA). Le mélange est agité pendant 3h à température ambiante. Puis on ajoute 50 ml d'HC10.5 N, on extrait, on sèche la phase organique, on concentre et récupère 230 mg de maléimide 2.

10 Synthèse de 3 : A une solution contenant 90 mg de maléimide 2 dans 3 ml de dichlorométhane, on ajoute à 0 C 115 l d'acide trifluoroacétique (TFA) et on agite 12h à température ambiante. On évapore à sec, on précipite le produit avec 3 ml d'éther et on récupère 50 mg 15 de composé 3. Synthèse de 4 : A une solution contenant 46 mg d'acide diéthylènetriaminepenta-acétique (DTPA) dianhydride dans 1 ml de DMF on ajoute une solution d'amine 3 (14 mg) dans 20 1 ml de DMF puis 30 l de TEA. On agite 12h à température ambiante puis on ajoute 10 ml d'eau. On agite 30 min puis on évapore à sec et purifie sur colonne Kromasil (éluant : 100 % A à 40 % B en 30 min avec, A = eau et B = 70 % acétonitrile et 30 % eau). Etape 3 û Conjugaison des deux composés de formule générale (III) avec une 25 protéine Dans un tampon PBS (400 L; 5 mM ; 1 % d'EDTA), on ajoute l'albumine humaine (HSA) (40 L; 200 mg/mL, 6,8 mol NH2), l'iminothiolane; HC1(10 mg; mmol), le premier composé de formule générale (III) obtenu à l'issue de l'étape 1 (lactose maléimide) (5,2 mg; 13,6 mol), le deuxième composé de formule générale (III) obtenue à 30 l'issue de l'étape 2 (DTPA maléimide) (4 mg; 6,8 mol) et de la soude (160 L; 0, 1 M). On incube 1 h à température ambiante et lave avec NaCl 0,9 % sur filtre millipore (MWCO 30000), centrifugé à 4000 tours par minute.

2909881 27 Exemple II : Caractérisation physicochimique du conjugué synthétisé en Exemple I 1. Dosage de la protéine totale On utilise le réactif BCA avec détection à 562nm : 10 L d'échantillon sont 5 mélangés à 200 L de réactif BCA et on incube 30 min à 37 C. Les données en concentration obtenues à l'aide d'une gamme de HSA donnent 1,55 mg/mL soit un rendement de 77,5 %. 2. Dosage du lactose 10 On utilise le réactif de Dubois (M. Dubois et al. Anal. Chem. (1956), 28 350-356) : dans des tubes de verre de gros diamètre on introduit successivement la protéine lactosylée (10 L), du phénol à 5 % (190 L), et de l'acide sulfurique concentré (200 L). On chauffe à 90 C pendant 5min puis laisse reposer à température ambiante pendant 30 min. On lit la densité optique à 490 nm contre une gamme de lactose. On obtient entre 15 25 et 30 molécules de lactose par molécule de HSA. 3. Dosage du DTPA A 15 L de la solution de HSAlact-DTPA, on ajoute du CaCl2 (20 L; 1 M) et complète à 100 L d'eau. On ajoute alors 900 L du réactif au calcium (calcium working 20 solution Sigma), attend 10 min et lit la densité optique à 562 nm. Les résultats obtenus contre une gamme de calcium donnent de 3 à 5 molécules de DTPA par molécule de HSA. Exemple III : Utilisation du conjugué en imagerie dans l'animal 1. Protocole d'administration chez l'animal 25 Après marquage avec un éluat frais de technétium 99 m, un volume de 200 microlitres de la solution d'albumine lactosylée a été injecté dans la veine pénienne de rats Wistar mâles (poids 250-300 g) préalablement anesthésiés. L'activité totale injectée était comprise entre 5 et 10 mégas Becquerels pour une masse allant de 100 à 800 microgrammes d'albumine lactosylée. 30 2909881 28 2. Appareillage utilisé pour la caractérisation en imagerie L'acquisition des images a été effectuée sur un imageur petit animal de la société Biospace (y imager Biospace, diamètre du champ de vision de 10 cm et résolution spatiale de 2 mm). L'acquisition des images a été faite en mode liste sur des périodes 5 comprises entre 30 et 90 minutes, les animaux étant positionnés en décubitus dorsal contre le collimateur de la caméra (collimateur basse énergie dédié au traceurs marqués au 99m Tc). Les acquisitions sont stockées selon un format propriétaire et sont traitées sur une console dédiée. 10 3. Résultats obtenus le cas échéant par rapport à un témoin Un groupe contrôle a été injecté avec de l'albumine humaine native radiomarquée. Chez ces animaux contrôle, on observe une distribution générale de l'activité dans tous les territoires vasculaires témoignant de la distribution intravasculaire de cette molécule. A l'opposé, après injection d'albumine lactosylée radiomarquée, on note 15 une captation précoce et très importante au niveau du foie sans fixation notable au niveau des reins, ni de la rate. Cette fixation spécifique hépatique s'accompagne d'une clairance systémique vasculaire élevée dont témoigne la disparition rapide de l'activité mesurée en regard de l'aire cardiaque.

Claims (27)

REVENDICATIONS

1. Procédé utile pour la préparation d'un conjugué de formule générale (I) ou l'un de ses dérivés : (I) dans laquelle : P m - P représente un substrat, chimique ou biologique, physiologiquement - RI représente une chaîne hydrocarbonée en C,-C,o, notamment C1-05, 10 linéaire, ramifiée, ou cyclique, saturée ou insaturée, éventuellement interrompue par un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O et S, et optionnellement substituée, acceptable, - g est égal à zéro ou à 1, - R2 représente une chaîne hydrocarbonée, linéaire, ramifiée ou cyclique, saturée ou insaturée, en C1-C20, notamment C1-C15, éventuellement interrompue 15 par un ou plusieurs motifs cycloalkyles ou aralkyles en C4-C7, notamment en C6, et éventuellement substitués par un radical alkyle, ladite chaîne étant en outre éventuellement substituée et/ou éventuellement interrompue par un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O et S ou encore un groupement représentatif d'une fonction amide, ester, éther ou thioéther, 20 - Y représente une fonction de liaison impliquant un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O et S, à l'image par exemple d'une fonction amide, ester, éther ou thioéther, - Q représente une entité, chimique ou biologique, physiologiquement acceptable différente de P et d'intérêt dans le domaine thérapeutique, du diagnostic et/ou 25 de l'imagerie, - n est égal à 0 ou est un entier allant de 1 à 1000, en particulier de 1 à 100, notamment de 1 à 50, et de préférence de 1 à 10, 2909881 30 - m est un entier au moins égal à 2, notamment allant de 2 à 1000, en particulier de 2 à 100, de péférence de 2 à 60, voire de 10 à 50, de préférence de 25 à 40, avec R2, Y et Q pouvant figurer des significations différentes au sein de la formule (I), et Q possédant au moins deux définitions différentes dans le conjugué de formule générale (I) 5 caractérisé en ce que ledit procédé comprend la réaction d'au moins un composé de formule générale (II) : dans laquelle : - p est un entier égal à n + m, et - P, R' et q sont tels que définis précédemment, avec au moins deux composés de formule générale (III) : O ~I NùR2 YùQ (III) O dans laquelle R2, Y et Q sont tels que définis précédemment, les deux composés de formule générale (III) étant différents l'un de l'autre par au moins la définition de Q, la réaction dudit composé de formule générale (II) avec chacun des composés de formule générale (III) étant réalisée dans des conditions opératoires identiques et propices à l'établissement d'une liaison thioéther entre chacun des résidus maléimide des deux composés de formule générale (III) avec respectivement au moins une fonction thiol dudit composé de formule générale (II).

2. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel Q est choisi parmi des ligands de ciblage, des marqueurs, des chélatants de marqueur(s) et/ou des couples chélatant de marqueur(s) - marqueur.

3. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel au moins une entité Q est un marqueur, un chélatant de marqueur(s) ou un couple chélatant de marqueur(s) - marqueur. 2909881 31

4. Procédé selon la revendication 2 ou 3, dans lequel au moins une entité Q est formée d'au moins un chélatant de marqueur(s) choisi parmi l'acide diéthylènetriaminepenta-acétique (DTPA), l'acide éthylènediaminetétra-acétique (EDTA), le 1,4,7,10-tétraazocyclododécane-N,N',N",N"'tétra-acétate (DOTA), l'acide 5 tétraazacyclotétradécane-N,N',N",N"'tétra-acétique (TETA), l'acide cyclohexyl 1,2-diamine tétra-acétique (CDTA), l'acide éthylène glycol-0,0'-bis(-2-aminoéthyl)N,N,N',N'-tétra-acétique (EGTA), l'acide N,N-bis(hydroxybenzyl)-éthylène diamine N,N'-diacétique (HBED), l'acide triéthylène tétramine hexa-acétique (TTHA), l'acide hydroxyéthyldiamine triacétique (HEDTA), l' hydroxyéthylidène diphosphonate 10 (HEDP), l'acide dimercaptosuccinique (DMSA), l'acide diéthylène triaminetétraméthylènephosphonique (DTTP) et le 1-(p-aminobenzyl)-DTPA, l'acide 1,6-diaminohexane-N,N,N',N'tétra-acétique, l'acide éthylène bis (oxyethylènenitrilo)-tétra-acétique et l'acide cyclohexyldiéthylènetriamine penta-acétique (CHX-DTPA).

5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, dans lequel le 15 marqueur est choisi parmi Tc-99m, In-111, Ga-67, Rh-105, I-123, Nd-147, Pm-151, Sm- 153, Gd-159, Tb-161, Er-171, Re-186, Re-188 et Tl-201.

6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel au moins une entité Q est un radical de l'acide diéthylènetriamine penta-acétique (DTPA), associé ou non au marqueur Tc-99m. 20

7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, dans lequel au moins une entité Q est un ligand de ciblage.

8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, dans lequel le ligand de ciblage est choisi parmi un sucre, un peptide tels que les peptides RGD (argine- glycine-acide aspartique), une lectine, un anticorps ou un fragment de celui-ci 25 reconnaissant un élément présent à la surface des cellules, tel que par exemple une protéine (transferrine, HDL, LDL ou protéines constituantes des HDL ou LDL), un sucre, un lipide, un ligand d'un récepteur cellulaire tel que par exemple un peptide comme le neuropeptide Y ou un peptide à séquence RGD, un polypeptide, un neuromédiateur tel que l'adrénaline, un antagoniste ou un agoniste, comme par exemple un antagoniste ou un agoniste de récepteurs, notamment un antagoniste de récepteurs 13-adrénergiques, un facteur de croissance, un acide aminé ou un dérivé de celui-ci tel que par exemple le glutamate, une cytokine, une chemokine, un interféron ou un TNF, une hormone, une vitamine, une 2909881 32 apolipoprotéine, le cholestérol ; un ligand susceptible d'interagir avec un lipide ou phospholipide membranaire tel que par exemple une annexine, ou un acide nucléique (ATP, AMP, adénosine), ou toute molécule synthétique ou naturelle possédant une affinité suffisante pour un composant de la membrane des cellules ou de leur matrice 5 extracellulaire.

9. Procédé selon la revendication 2 à 8, dans lequel le ligand de ciblage est choisi parmi les ligands de ciblage se fixant préférentiellement sur les hépatocytes.

10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 9, dans lequel le ligand de ciblage est un sucre, de préférence du lactose ou un de ses dérivés. 10

11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel P est choisi parmi les protéines, les polysaccharides, les vecteurs de type liposome, ou nano- et microparticules ou encore les polymères biocompatibles.

12. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel P est une protéine, et plus particulièrement l'albumine humaine (HSA) ou l'un de ses dérivés. 15

13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le composé de formule générale (II) est obtenu au préalable par activation de fonctions naturellement présentes sur le substrat P en fonctions thiol ou en groupements dotés de fonctions thiol.

14. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel ladite activation est 20 effectuée par un agent de liaison hétérobifonctionnel, par exemple la 2-iminothiolane.

15. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel RI représente une chaîne hydrocarbonée en C1-05 linéaire, substituée par un groupe imidyle.

16. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans 25 lequel R2 représente une chaîne hydrocarbonée linéaire saturée en C1-C1o, notamment en C2, ou une chaîne hydrocarbonée linéaire saturée en C,-Cio, notamment en C4, interrompue par un groupe représentatif d'une fonction amide.

17. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel Y représente une fonction amide. 30

18. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les réactions du composé de formule générale (II) avec chacun des deux composés de formule générale (III) différents sont réalisées simultanément. 2909881 33

19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, dans lequel le composé de formule générale (II) réagit, dans une première étape, avec un premier composé de formule générale (III) et en ce que le composé mono fonctionnalisé ainsi obtenu réagit dans une étape consécutive avec au moins un second composé de formule 5 générale (III), différent du premier composé de formule générale (III) par au moins l'entité Q.

20. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les composés de formule générale (III) sont mis à réagir dans des rapports compris entre 1/1 et 1/10. 10

21. Conjugué de formule générale (I) : R ) q S (I) m O [HS ( R1 P dans laquelle : - P représente un substrat, chimique ou biologique, physiologiquement acceptable, 15 - RI représente une chaîne hydrocarbonée en C,-Cio, notamment C1-05, linéaire, ramifiée, ou cyclique, saturée ou insaturée, éventuellement interrompue par un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O et S, et optionnellement substituée, - g est égal à zéro ou à 1, - R2 représente une chaîne hydrocarbonée, linéaire, ramifiée ou cyclique, 20 saturée ou insaturée, en C1-C20, notamment C1-C15, éventuellement interrompue par un ou plusieurs motifs cycloalkyles ou aralkyles en C4-C7, notamment en C6, et éventuellement substitués par un radical alkyle, ladite chaîne étant en outre éventuellement substituée et/ou éventuellement interrompue par un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O et S ou encore un groupement représentatif d'une fonction amide, ester, éther ou thioéther, 25 - Y représente une fonction de liaison impliquant un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O et S, à l'image par exemple d'une fonction amide, ester, éther ou thioéther, 2909881 34 - Q représente une entité, chimique ou biologique, physiologiquement acceptable différente de P et d'intérêt dans le domaine thérapeutique, du diagnostic et/ou de l'imagerie, - n est égal à 0 ou est un entier allant de 1 à 1000, en particulier de 1 à 5 100, notamment de 1 à 50, et de préférence de 1 à 10, - m est un entier au moins égal à 2, notamment allant de 2 à 1000, en particulier de 2 à 100, de préférence de 2 à 60, voire de 10 à 50, de préférence de 25 à 40, avec R2, Y et Q pouvant figurer des significations différentes au sein de la formule (I), et Q figurant au moins deux définitions distinctes dans le conjugué de formule générale (I) ou 10 un de ses dérivés.

22. Conjugué selon la revendication précédente, tel que défini en revendications 2 à 17.

23. Conjugué selon la revendication 21 ou 22, de formule générale (I') : Q'ùY' RZ N' S~R O (1 m" 15 dans laquelle : - P est une protéine, - R' représente une chaîne hydrocarbonée en C1-05 linéaire, substituée par un groupe imidyle, 20 - q= 1, - n est égal à 0, ou est un entier allant de 1 à 50, et de préférence de 1 à 10, - m' et m" sont des entiers au moins égaux à 1, leur somme m'+ m" allant de 2 à 60, voire de 10 à 50, de préférence de 25 à 40, - R2' est une chaîne hydrocarbonée linéaire saturée en C1-C1o, notamment en 25 C2, - R2" est une chaîne hydrocarbonée linéaire saturée en C1-Cio, notamment en C4, interrompue par un groupement représentatif d'une fonction amide, - Y' et Y" sont identiques, et représentent une fonction amide, 2909881 35 - Q' représente un ligand de ciblage, et de préférence un sucre, et - Q" représente un chélatant de marqueur(s), ou un couple chélatant de marqueur(s)-marqueur.

24. Conjugué selon la revendication précédente, dans lequel : 5 - P est l'albumine humaine (HSA) ou l'un de ses dérivés, - Q' est du lactose ou un de ses dérivés, - Q" est un radical de l'acide diéthylènetriamine penta-acétique (DTPA), associé ou non au marqueur Tc-99m.

25. Utilisation d'un conjugué de formule générale (I) obtenu selon le procédé 10 défini en revendication 1 à 20, ou tel que défini en revendications 21 à 24, pour la préparation d'une composition pharmaceutique notamment utile à des fins de diagnostic et/ou d'imagerie.

26. Utilisation d'un conjugué de formule générale (I) obtenu selon le procédé défini en revendication 1 à 20, ou tel que défini en revendication 21 à 24 et dans laquelle 15 au moins une première entité Q dérive d'un sucre et une seconde entité Q est un marqueur, un chélatant de marqueur(s) ou un couple chélatant de marqueur(s) - marqueur pour la préparation d'une composition destinée à mesurer la réserve fonctionnelle hépatique.

27. Kit de diagnostic comprenant au moins un conjugué obtenu selon le procédé défini en revendications 1 à 20, ou tel que défini en revendications 21 à 24. 20