BRPI0719561A2 - polÍmeros anfifÍlicos de automontagem como agentes antivirais - Google Patents

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Abstract

POLÍMEROS ANFIFÍLICOS DE AUTOMONTAGEM COMO AGENTES ANTIVIRAIS. Há copolímeros biodegradáveis antifilicos fornecidos compreendendo uma espinha dorsal hidrofílica com grupos alifáticos pendentes como hidrofóbico. Os polímeros formam agregados de moleculares de nanoescala em meios aquosos, que têm os interiores hidrofóbicos que são capazes de solubizar compostos orgânicos insolúveis e de interromper as proteínas de revestimento viral. Os polímeros caracterizam opcionalmente os grupos funcionais reativos que fornecem pontos de anexação para anticorpos, ligandos, e outras porções alvo que mediam aderência do agregado a um alvo viral.

Description

V J
'Z
"POLÍMEROS ANFIFÍLICOS DE AUTOMONTAGEM COMO AGENTES ANTIVIRAIS"
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se aos campos de polímeros anfifílicos, e especifica- mente a polímeros tipo colméia de formação micela biocompatível. A invenção também refe- re-se aos campos de distribuição de droga direcionada e agentes antivirais.
FUNDAMENTO
Os copolímeros de bloco anfifílicos compreendendo um bloco hidrofóbico e um blo- co hidrofílico têm sido bem estudados nos últimos anos, por causa de sua capacidade para automontagem em uma variedade de nanoestruturas enquanto o solvente circundante é variado. Veja Cameron et al., Can. J. Chem./Rev. Can. Chim. 77:1311-1326 (1999). Em so- luções aquosas, o compartimento hidrofóbico de um polímero anfifílico tem uma tendência para automontar a fim de evitar contato com água e minimizar a energia interfacial livre do sistema. Ao mesmo tempo, os blocos hidrofílicos formam uma "corona" hidratada no ambi- ente aquoso, e assim os agregados mantêm uma estrutura termodinamicamente estável. O resultado é uma suspensão coloidal do tipo látex, estável de partículas agregadas de polí- mero tendo núcleos hidrofóbicos e coronas hidrofílicas.
Os copolímeros anfifílicos do tipo colméia diferem dos copolímeros de bloco em que a espinha dorsal é largamente hidrofóbica ou hidrofílica, com cadeias de polímero de polari- dade oposta pendentes da espinha dorsal em vez de incorporadas na mesma. Os copolíme- ros do tipo colméia foram preparados com espinhas dorsais hidrofóbicas e ramificações hi- drofílicas (Mayes et al., Patente U.S. N0 6.399.700), e também com espinhas dorsais hidrofí- licas e ramificações hidrofóbicas (Watterson et al., Patente U.S. N0 6.521.736). Os anteriores foram usados para fornecer apresentação multivalente dos Iigandos para os receptores de superfície de célula, quando os últimos foram usados para solubilizar drogas e as entregar às células.
Os agregados de polímero anfifílicos foram estudados como portadores para solubi- lizar drogas insolúveis, veículos de entrega direcionados à droga, e sistemas de entrega de gene. Têm uma estrutura mais estável do que as micelas de peso molecular baixo conven- cional, devido ao emaranhamento de cadeia e/ou à cristalinidade da região hidrofóbica inte- rior. A natureza polimérica do veículo torna os agregados relativamente imunes à desinte- gração que as Iipossomas ordinárias sofrem quando diluídas abaixo de sua concentração crítica de micela. A ausência de uma membrana de bicamada as permite mais prontamente fundir com membranas celulares e entregar sua carga diretamente à célula. A natureza anfi- fílica dos agregados também confere atividade tipo detergente, e agregados alvo apropria- damente surgem para ser capazes de fundir com e romper as proteínas de revestimento virais. Devido à biocompatibilidade excelente de poli (etileno glicol) (PEG)1 e à habilidade aparente de partículas "escondidas" revestidas-PEG para iludir o sistema reticuloendotelial, micelas, lipossomas, e polímeros incorporando PEG foram considerados extensivamente como materiais para sistemas de distribuição de droga. Há muitos relatórios do uso de po- li(etileno glicol) (PEG) como o componente hidrofílico dos PEG-lipídeos (formando liposso- mas e micelas); veja por exemplo Krishnadas et al., Pharm. Res. 20:297 - 302 (2003). Os copolímeros de bloco anfifílicos de automontagem, que automontam nas mais robustas "po- limersomas", foram investigados igualmente como veículos para solubilização e distribuição de droga (Photos et al., J. Controlled Release, 90:323-334 (2003)). Veja, também Gref etal., Int. Symp. Controlled Release Mater. 20:131 (1993); Kwon et al., Langmuir, 9:945 (1993); Kabanov et al., J. Controlled Release, 22:141 (1992); Allen et al., J. Controlled Release, 63:275 (2000); Inoue et al., J. Controlled Release, 51:221 (1998); Yu e Eisenberg, Macro- molecules, 29:6359 (1996); Discher et al., Science, 284:113 (1999); Kim et al., Patente U.S. N0 6.322.805; Seo et al., Patente U.S. N0 6.616.941 e Seo et al., Patente Européia N0 EP 0583955. O uso de poli(etilenoimina) (PEI) nesta capacidade foi relatado, com um foco na distribuição dos oligonucleotídeos (Nam et al., Patente U.S. N0 6.569.528; Wagner et al., publicação do pedido de Patente U.S. N0 20040248842). Em uma tendência similar, Luo et al., em Macromolecules 35:3456 (2002), descreve dendrímeros de poliamidoamina conjuga- da-PEG (" PAMAM") apropriados para distribuição de polinucleotídeos. Além da necessidade de solubilizar, distribuir, e entregar drogas, há uma necessi-
dade para os sistemas de distribuição de droga direcionada que atingem especificamente em um tecido, tumor, ou órgão alvo. Isto é realizado geralmente pela anexação de anticor- pos ou de outros Iigandos com uma afinidade específica para paredes celulares no local alvo. Entretanto, grupos funcionais perdem PEG a não ser que nas extremidades das cadei- as de polímero, e na maioria dos grupos terminais sejam ligados ao outro componente do copolímero de bloco. Por este motivo, a anexação de porções alvo tais como anticorpos ou moléculas de adesão celular a copolímeros de bloco PEG é limitada geralmente ao bloco de não-PEG, que não é infelizmente a parte do copolímero que é para expor normalmente na corona do agregado automontado. O fenômeno da separação de fase que resulta na automontagem de copolímeros
de bloco em agregados do polímero é prontamente reversível, e tentativas foram feitas para aumentar a estabilidade dos agregados por meio de reticular o núcleo hidrofóbico (veja Pa- tente Européia N0 EP 0552802). A anexação covalente da droga ao componente hidrofóbico de um copolímero de bloco foi tentada (Park e Yoo, Patente U.S. N0 6.623.729; Patente Eu- ropéia N0 EP 0397307).
Polímeros dendríticos são conjugados prontamente para alvejar porções, e igual- mente têm o potencial de alvejar in vivo células específicas (Singh et al. (1994) Clin. Chem. 40:1845) e obstrui a adesão dos patógenos bacterial e viral a substratos biológicos. Os po- límeros tipo colméia ramificados e enxerto dendrítico conjugado ao ácido siálico múltiplo foram avaliados para que sua habilidade iniba o hemaglutinação do vírus e obstrua a infec- ção in vitro de células mamíferas (Reuter et al. (1999) Bioconjugate Chem. 10:271). Os ini- bidores de vírus mais eficazes eram as macromoléculas tipo colméia ramificadas e enxerto dendrítico, que apareceram até 50.000 dobras aumentando a atividade de encontro a estes vírus.
Recentemente, a companhia farmacêutica Starpharma anunciou o desenvolvimento bem sucedido de um biocida baseado em dendrímero (VivaGel™) que impedisse a infecção do HIV ligando aos receptores na superfície do vírus (Halford (2005) Chem. & Eng. News 83 (24):30). Chen et al. (2000) (Biomacromolecules. 1:473) relatou que os dendrímeros po- li(propilenoimina) funcionalizados de amônio quaternário são biocidas muito potentes.
Permanece uma necessidade para um sistema de distribuição de droga que seja estável, biocompatível, favorável à anexação de porções alvo ao exterior dos agregados, e eficiente em entregar drogas aos alvos celulares desejados. Existe também uma necessida- de para agentes antivirais direcionados que são similarmente estáveis e biocompatíveis.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção fornece moléculas de polímero tipo colméia biocompatíveis, compreendendo uma espinha dorsal hidrofílica tendo porções de ponto de ramificação, e ramificações hidrofóbicas unidas nestas porções de ponto de ramificação. A invenção forne- ce suspensões aquosas dos agregados de polímero formados de tais polímeros, e fornece métodos para solubilizar compostos orgânicos insolúveis ou escassamente solúveis, tais como drogas, tinturas, vitaminas, e semelhante, incorporando tais compostos nos núcleos hidrofóbicos dos agregados de polímero. O método para solubilizar uma espécie orgânica insolúvel em água em um solvente aquoso compreende basicamente contactar as espécies orgânicas insolúveis em água com um polímero da invenção em um solvente aquoso ou aquoso misturado.
A invenção também fornece um método para o tratamento ou prevenção de uma in- fecção de um animal por vírus, que compreende administrar ao dito animal um polímero tipo colméia consistindo essencialmente na seguinte estrutura:
ι A estrutura compreende uma espinha dorsal formada de porções alternas B de pon- to de ramificação e hidrofílicas, blocos de polímeros A solúveis em água. Cadeias C laterais hidrofóbicas e Iigandos Z são unidos às porções de ponto de ramificação. Preferivelmente, as cadeias laterais C são hidrocarbonetos lineares ou ramificados, substituídos opcional- mente com um ou mais substituintes hidrofílicos, ou hidrocarbonetos C6-C30 cíclicos ou poli- cíclicos substituídos opcionalmente com um ou mais substituintes hidrofílicos. As cadeias laterais C podem igualmente ser aminoácidos hidrofóbicos, peptídeos, ou polímeros. Os substituintes hidrofílicos apropriados para as cadeias laterais C são hidroxila, carbóxi, e gru- pos amino, assim como grupos amida, sulfonamida, sulfóxido e sulfona. Os substituintes hidrofílicos preferidos são grupos apróticos polares tais como amida terciária, sulfóxido, e sulfona.
Os Iigandos Z são Iigandos tendo afinidade de ligação específica para a superfície de um vírus. "Afinidade de ligação específica" significa que o ligando é capaz de ligar à su- perfície de um vírus in vivo na presença de muitas superfícies e macromoléculas celulares encontradas no corpo mamífero. O grupo s é uma ligação ou uma porção espaçadora, e quando s é um espaçador cada s pode carregar de 1 a 4 grupos Ζ. O valor de η varia de 3 a aproximadamente 100; o valor médio de ρ varia de 1 a 2, e o valor médio de r varia de 1 a 4.
A porção B de ponto de ramificação é uma porção multivalente que tem ligações a dois blocos de polímero A, que liga a 1-2 cadeias laterais C (em média), e uma ou mais Iiga- ções a espaçadores "s" e/ou Iigandos Z. Em modalidades particulares, as ligações a B e s e/ou Z são estabelecidas através de uma pluralidade de grupos funcionais reativos, que são capazes de servir como pontos de anexação. Em particular, as modalidades preferidas, por- ções alvo tais como Iigandos ou anticorpos são unidos covalentemente às porções de ponto de ramificação dos polímeros da invenção, e uma droga é incorporada no núcleo dos agre- gados, de modo a formar um complexo de droga alvo.
A invenção igualmente fornece moléculas de polímero tipo colméia biocompatíveis como descritas acima, que mesmo na ausência de uma pequena molécula terapêutica tenha propriedades antivirais inerentes. Esta atividade antiviral é provavelmente devido à habilida- de tipo detergente dos polímeros anfifílicos para interromper o revestimento exterior de par- tículas de vírus. Em modalidades preferidas, a atividade antiviral é realçada pela anexação das porções alvo tendo afinidade de ligação para a superfície do vírion direcionado.
A invenção ainda fornece métodos para a preparação dos polímeros tipo colméia, agregados, agregados de polímero alvo e complexos de drogas descritos na mesma. Os polímeros da invenção de automontagem nos agregados de polímero que eficientemente solubilizam, distribuem, e entregam drogas in vivo, têm atividade antiviral; são não tóxicos, biocompatíveis, e estáveis, e são capazes de carregar porções alvo de vírus e célula múlti- pla em suas superfícies exteriores. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Fig. 1 mostra o efeito da administração de uma composição da invenção no tem- po médio de sobrevivência média de ratos contaminados por gripe.
A Fig. 2 mostra o aumento no tempo de sobrevivência de ratos contaminados por gripe quando tratados com uma composição da invenção.
A Fig. 3 mostra a perda de peso no curso de 7 dias de ratos contaminados por gripe quando tratados com uma composição da invenção.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Os polímeros da invenção, referidos no mesmo como "77-polímeros", têm uma ar- quitetura tipo colméia, com uma espinha dorsal formada de porções B alternadas de ponto de ramificação e de blocos de polímeros A solúveis em água, hidrofílicos; e tendo uma plu- ralidade de cadeias laterais C hidrofóbicas unidas a cada porção de ponto de ramificação, como mostrado na Fórmula 1. As cadeias laterais C são as porções relativamente curtas, hidrofóbicas, que podem ser moléculas, cadeias ou oligômeros alifáticos. O valor de ρ é ide- almente um número inteiro, ou 2, 3, ou 4. Na prática, as cadeias laterais são mais freqüen- temente introduzidas com eficiência menos do que perfeita através das reações químicas, tendo por resultado um valor médio de ρ para a preparação de polímero como um conjunto que não é o número inteiro pretendido. Os valores médios de números não inteiros podem igualmente ser obtidos pelo desenho, como discutidos abaixo. Assim, o valor médio de ρ nos polímeros da invenção é maior de um e pode ser tão elevado quanto quatro (1< ρ < 4). Nas modalidades preferidas, P varia de aproximadamente 2 a 4, e mais preferível mente 1,5 < ρ <2.
O bloco de polímero A da espinha dorsal é selecionado das cadeias de polímero solúveis em água e/ou hidrofílicas, incluindo mas não limitado a poli(etileno glicol), po- li(propileno glico), poli(etileno imina), poli(álcool vinílico), poli(vinilpirrolidona), polissacarí- deos, e semelhante. Preferivelmente, as unidades de polímero A são cadeias poli(etileno glicol) de fórmula -(CH2CH2O)m- onde m está entre 1 e 10.000, preferivelmente entre 3 e 3.000.
Na fabricação de poli(etileno glicol) de várias classes, sabe-se na indústria para a- copiar uma porção Iigante divalente (por exemplo, éter de diglicidil de bisphenol A) a duas cadeias poli(etileno glicol), dobrando eficazmente o peso molecular do polímero ao reter uma faixa de peso molecular relativamente estreita. Moléculas de "poli(etileno glicol)" resul- tantes são interrompidas conseqüentemente no ponto médio da cadeia de polímero pela porção Iigante não-glicol (veja, por exemplo, o poly(ethylene glycol)-bisphenol A diglycidyl ether adduct, N0 registro CAS 37225-26-6). Oligômeros mais elevados, isto é aqueles que têm três cadeias de PEG separadas por duas porções de éter de diglicidil de bisfenol A, i- gualmente são sabidos, vêem por exemplo, o pedido de patente internacional WO 00/24008. Como usado no mesmo, conseqüentemente, os termos "poli(etileno glicol)" e "poli(propileno gliool) abrangem cadeias de polímero poli(etileno glicol) e poli(propileno glicol) que incorpo- ram unidades Iigantes de não-glicol, incluindo mas não limitadas ao éter de diglicidil de bis- fenol A, éter de diglicidil de bisfenol B, éter de diglicidil de bisfenol S, éter de diglicidil de hi- droquinona, e semelhante. Para finalidades desta especificação, qualquer de tais porções Iigantes não são contadas como "unidades de monômero".
O bloco de polímero A tem mais preferivelmente um comprimento médio entre vinte e cinqüenta unidades de monômero. As cadeias de polietileno glicol podem ser substituídas na extremidade com grupos funcionais apropriados para uso como Iingantes a outras por- ções, incluindo mas não limitados a amino, mercapto, acrilato, acrilamida, maleato, maleimi- da, e semelhante, em uma ou ambas extremidades. O valor de η varia de 1 a 1000 e está preferivelmente entre 3 e 100. O peso molecular total de ^-polímero pode variar de 1000 a 100.000 dáltons ou mais; está preferivelmente acima de 2.000 dáltons, e mais preferivel- mente acima de 7.000 dáltons. As porções hidrofóbicas C podem ser as mesmas ou diferentes, e podem ser por
exemplo, hidrocarbonetos lineares (substituídos opcionalmente com um ou mais substituin- tes hidrofílicos), hidrocarbonetos policíclicos (substituídos opcionalmente com um ou mais substituintes hidrofílicos), aminoácidos hidrofóbicos, peptídeos e polímeros. Os substituintes hidrofílicos apropriados incluem, mas não são limitados a, grupos funcionais hidroxila, éter, ciano, e amida. São contemplados especificamente grupos Ce a C20 alquila portando substi- tuintes ω-hidróxi, ω-ciano, ω-amido, ou ω-alcóxi. Neste contexto, o termo "substituinte" inclui a substituição de um heteroátomo, tal como O, N, ou S, para um átomo de carbono na ca- deia hidrocarboneto ou sistema de anel da porção C. Assim, as ligações de éter e amida, e os anéis heterocíclicos podem ser incorporados em C. As porções hidrofóbicas C são cadeias alifáticas (C8-C2o) preferivelmente relativa-
mente curtas, mas podem igualmente ser oligômeros curtos. Os oligômeros apropriados incluem ácidos hidróxi oligo tais como poli(ácido glicólico), poli(ácido DL-láctico), poli(ácido L-láctico), e copolímeros de ácidos hidróxi poli(ácido glicólico) e poli(ácido láctico) e, poli (aminoácidos), poli(anidridos), poli(ortoésteres), e poli(fosfoésteres), polilactonas tais como poli(épsilon-caprolactona) poli(delta-valerolactona) poli(gama-butirolactona) e poli(beta- hidroxibutirato). As porções C podem igualmente ser selecionadas das moléculas hidrofóbi- cas, tais como o colesterol, ácido cólico, ácido litocólico, peptídeos hidrofóbicos, e seme- lhante. O peso molecular de cada porção C é maior de 40, preferivelmente entre 50 e 1.000, e mais preferencialmente entre 100 e 500. O valor IogP (octanol-água) da molécula C-H é maior que cerca de 1,4, e preferivelmente maior do que cerca de 2,0, e mais preferivelmente maior do que cerca de 2,5. Geralmente, qualquer porção C é considerada ser adequada para uso na presente invenção se a molécula C-H for substancialmente insolúvel em água. 10
"Substancialmente insolúvel" significa que o líquido C-H forma uma fase separada quando misturada com água.
É uma característica de distinção dos polímeros tipo colméia desta invenção que as cadeias laterais C não estão distribuídas regularmente e uniformemente ao longo da cadeia de polímero, mas ocorre um pouco nos conjuntos [C]p. Estes conjuntos são espaçados mais ou menos regularmente ao longo da cadeia de polímero, dependendo do grau de monodis- persividade das unidades de polímero A. Assim, a distância entre as duas cadeias C unidas a uma porção de ramificação comum B é diferente da distância entre as duas cadeias late- rais unidas às porções de ramificação diferentes.
Em uma segunda modalidade da invenção, as porções B do ponto de ramificação mais adicionais compreendem um ou mais grupos funcionais reativos X, como mostrado na fórmula 2.
Γ
V
■ P
B A
J
η
Na fórmula 2, os grupos reativos individuais X podem ser os mesmos ou podem ser diferentes um do outro, e podem opcionalmente ser obstruídos ou protegidos como pode ser necessário durante a montagem do polímero 2. O valor médio de r variará de 0 (nenhum grupos X) a aproximadamente 4. Tipicamente, os grupos reativos serão selecionados dos grupos funcionais conhecidos na técnica para ser úteis para formar ligações covalentes en- tre espécies moleculares. O grupo X serve como pontos de anexação para moléculas da droga, tecido ou porções de célula alvo, porções de vírus alvo, ou porções de anexação de matriz (tal como para a finalidade de revestir a superfície de um stent ou outro dispositivo médico). Em determinadas modalidades, pode haver um único ponto de anexação X. Em outras modalidades, pode haver três ou quatro tipos diferentes de grupos reativos. A porção de anexação da matriz pode unir a uma matriz através das ligações covalentes, interações não-covalentes específicas (por exemplo, anticorpo-antígeno, ou interações não específicas (por exemplo, através do emparelhamento iônico ou interação "hidrofóbica"). Os grupos rea- tivos apropriados X incluem mas não são limitados a -OH, -NH2, -SH, -CHO, - NHNH2, - COOH1 - ONHNH2, haloacila, acetoacetila, -CN, -OCN, -SCN, -NCO, -NCS, e semelhante; ligações duplas reativas tais como vinílicas, acrílicas, alílicas, maléicas, cinâmicas, e seme- lhante, e grupos com ligações triplas reativas tais como o acetilenocarbóxi e acetilenocarbo- xamido (apropriados para Michael additions, Diels-Alder reactions, e reações de adição de radical livre).
As porções de célula alvo exemplares incluem mas não são limitadas aos Iigandos receptor-específicos, anticorpos, e outras porções alvo, tais como peptídeos que possuem uma seqüência de aminoácido (RGD) ácido Arginina-Glicina-Aspártico ou um motife de Tiro- sina-lsoleucina-Serina-Arginina-Glicina (YISRG); fatores de crescimento incluindo fator de crescimento epidérmico, fator de crescimento endotelial vascular e fator de crescimento de fibroblasto; Iigandos de superfície virais tais como o ácido siálico e derivados de ácidos N- acetilneuramínico; Iigandos de receptor celular tais como folato, metotrexato, ácido pteróico, estradiol, estratriol, testosterona, e outros hormônios; mannose-6-fosfato, açúcares, vitami- nas, triptofano, e semelhante. Os anticorpos são anticorpos preferivelmente monoclonais dirigidos em antígenos de superfície celular específicos; as porções alvo apropriadas inclu- em não somente os anticorpos completos mas igualmente os fragmentos do anticorpo que contêm as seqüências de ligação antígenos ativas, tais como fragmentos Fab' 2, fragmentos Fab', ou análogos de peptídeo de cadeia curta da seqüência de ligação de antígeno ativo de tais anticorpos.
Os exemplos de porções alvo vírus incluem os Iigandos de moléculas curtas que li- gam a um vírus, tal como aminoalquiladamantanes, Fuzeon™, PRO-542, BMS-488043, áci- do siálico, ácido 2-deoxi-2,3-didehidro-N-acetilneuramínico, 4-guanidino-Neu5Ac2en (zana- mivir), oseltamivir, RWJ-270201, e semelhante; os oligopeptídeos, os oligossacarídeos, e os glicopeptídeos que ligam às superfícies virais, e os anticorpos e os fragmentos do anticorpo direcionados a antígenos de superfície vírus específicos. Em modalidades preferidas, a pre- sente invenção fornece ττ-polímeros que carregam Iigandos para o neuraminidase viral ou hemagglutinin. É bem conhecido que tais polímeros têm propriedades antivirais em seus próprios direitos; veja por exemplo T. Masuda et al., Chemical & Pharmaceutical Bulletin 51:1386-98 (2003); M. Itoh et al., Virology 212:340-7 (1995), e Reece et al., Patente US. N0 6.680.054 (2004). Os núcleos hidrofóbicos dos polímeros antivirais e agregados de polímero da presente invenção podem opcionalmente ser carregados com uma ou mais drogas antivi- rais convencionais, que são liberadas vantajosamente na proximidade da partícula viral.
Outros grupos de anexação de relevância médica podem ser produtos químicos pequenos, peptídeos, anticorpos ou fragmentos de anticorpo, enzimas, ou ingredientes far- macêuticos ativos, que podem afetar processos biológicos tais como hormônios ou agonis- tas de hormônios ou antagonistas, as substâncias que interferem com a ligação do vírus, as substâncias que interferem com o ciclo de célula ou os processos celulares após a entrada intracelular, e semelhante. As células de organismos unicelulares e multicelulares, incluindo as bactérias, fungos, animais mais elevados, e plantas, podem ser alvejadas. A biotina pode ser unida ao 77-polímero e ser usada como um ponto de anexação para as proteínas de avi- din e streptavidin acopladas, peptídeos, e outros agentes farmacologicamente ativos ou al- vo, tais como anticorpos, hormônios de crescimento, reagentes da imagem, e semelhante.
"Matrix" refere-se a materiais orgânicos ou inorgânicos, superfícies, e depósitos, tais como o vidro, as superfícies de sílica ou de metal, matriz extracelular, depósitos da pro- teína tais como chapas de amilóide de vários tipos, superfície da célula, superfície do vírus, e as superfícies homogêneas ou heterogêneas gerais que podem ou não podem ser bem caracterizadas, incluindo príons.
Os exemplos de porções de anexação da matriz de sílica ou vidro incluem vários halossilanos, alcoxissilanos, acilsilanos, assim como os produtos químicos que exibem tais grupos funcionais que incluem polímeros. Outros grupos de anexação podem ser planejados baseados nas características físico-químicas particulares da matriz. As porções de anexa- ção apropriadas, por exemplo, aquelas usadas no revestimento dos stents, são conhecidas por aqueles versados na técnica.
Em um terceiro aspecto da invenção, as porções B de ponto de ramificação são co- nectadas a outras porções de ponto de ramificação em outra parte na cadeia de polímero, de modo a formar uma estrutura hidrogel reticulada. Tal reticulação pode ser efetuada rea- gindo o polímero com as porções multifuncionais que contêm grupos homofuncionais ou heterofuncionais, pelo menos um que reage com o X ou grupo reativo em C situado em uma primeira porção de ponto de ramificação, e pelo menos um que reage com o X ou com um grupo funcional reativo presente em C em uma segunda porção de ponto de ramificação. A reticulação pode igualmente ser feita através de uma ligação aos grupos funcionais termi- nais da cadeia de polímero A. Tais polímeros reticulados* podem opcionalmente conter os grupos funcionais reativos apropriados para anexação de moléculas de droga ou porções alvo.
A porção B do ponto de ramificação é derivada tipicamente de uma molécula multi- funcional que tem uma pluralidade de grupos reativos, dois dos quais são apropriados para a anexação à unidade A de polímero hidrofílico, e dois dos quais são apropriados para a anexação das porções C hidrofóbicas. A porção B pode opcionalmente ter grupos reativos adicionais X como descritos acima.
Particularmente as porções de ponto de ramificação preferidas são os conjugados de ditiotreitol (DTT), ditioeritritol (DTE), ou 2,3-diaminobutano-1,4-ditiol com as duas molécu- las de ácido maléico. A combinação desta porção de ponto de ramificação com polietileno glicol como a porção A gera a espinha dorsal de polímero das fórmulas 3 e 3a onde YeY' podem ser os mesmos ou diferentes, e são selecionados preferivel- mente de OH1 NH2, ONH2, NHOH, e NHNH2. Em uma modalidade preferida, os grupos ami- no ou hidroxila do ditiol são os grupos reativos X, servindo como pontos de anexação para porções de droga ou alvo, quando os grupos funcionais Y e Y1 servem como pontos de ane- xação para porções C. Alternativamente, os grupos YeY podem servir como pontos de anexação, quando os grupos amino ou hidroxila são usados para unir as porções C.
As fórmulas 3 e 3a são pretendidas para transportar que cada átomo do enxofre pode independentemente ser unido a alfa ou beta a um grupo carbonila de éster de PEG. A invenção abrange composições de isômero únicas assim como misturas de regioisômeros em uma ou ambas ligações C-S. Além disso, devido aos quatro carbonos assimétricos na fórmula 1, a invenção abrange todos isômeros e misturas quiral, meso, e diastereomérica dos mesmos.
O aduto Diels-Alder do ácido acetileno dicarboxílico e um furano podem igualmente servir como uma porção de ponto de ramificação apropriada. Por exemplo, o poliéster 4 de- rivou-se do PEG e o ácido acetilenodicarboxílico é conhecido para submeter-se a reações do Diels-Alder com furanos (M. Delerba et al., Macromol. Rapid Commun. 18 (8): 723-728 (1997)). Assim, o mesmo pode ser sujeitado a uma reação de Diels-Alder com um furano 3,4-dissubstituído para gerar uma espécie tal como 5, e o polímero 5 pode ser modificado por hidroxilação ou epoxidação para fornecer grupos reativos (por exemplo, X e X1 no es- quema 1). !OCH2CH2L-
4
[oxidação]
X X O-V
31
Esquema 1
Similarmente, a reação de PEG com dianidrido de ácido etilenodiamina tetraacético fornecerá um poliéster de fórmula 6:
. 6
Outras porções de ponto de ramificação apropriadas podem ser derivadas de ácido tartárico, ácido acetilenodicarboxílico, ácido nitrilotriacético, dianidrido de ácido 3,4,3',4'- difenil sulfona tetracarboxílico, dianidrido de ácido 3,4,3',4'-difenil éter tetracarboxílico, diani- drido piromelítico, alcanoditióis tais como 1,2-etanoditiol e 1,4-butanoditiol, bis(2- mercaptoetil)éter, 2-mercaptoetilsulfide, dimercaptopropanol, dimercaptopurina, dimercapto- tiadiazol, ácido dimercaptossuccínico, benzenodimetanotiols, benzenoditiols, benzenodime- tanotiols dihalogenados, 4,4'-tiobisbenzenotiol dihalogenado, e semelhante.
Onde YeY' são OH1 grupos hidrofóbico C podem ser ligados ao polímero pela a - midação ou esterificação dos grupos de ácido carboxílico. Os grupos hidrofóbicos C são preferivelmente relativamente porções pequenas (C8-C20) e predominante hidrocarboneto, e podem ser lineares ou ramificados ou conter um ou mais anéis. Os exemplos incluem mas não são limitados a porções unidas covalentemente derivadas de moléculas C-N n-octanol, n-decanol, n-dodecilamina, n-pentadecilamina, colesterol, e ácido cólico. Embora os políme- ros da invenção sejam representados, para a conveniência, como tendo no máximo duas cadeias laterais hidrofóbicas diferentes, deve ser compreendido que misturas de dois ou mais compostos hidrofóbicos podem ser usadas para introduzir uma variedade de cadeias laterais hidrofóbicas em um polímero particular.
preparado reagindo um polietileno glicol com anidrido maléico para formar o poliéster 7, se- guido pela reação com ditiotreitol para formar 8. O ácido 7 foi então amidado com n- octadecilamina para formar o polímero tipo colméia desejado 9 (esquema 2). Os polímeros tipo colméia DTT derivados de amida representados pela fórmula 9 são referidos no mesmo como "/7-Polímero A" ; o polímero específico 9 no esquema 2 seria designado "C18-t7- Polímero A".
Como um exemplo específico, um polímero da fórmula 2, onde X=OH e r = 2, foi
o
7
O
S
Γ 9
(CHj)ITCH3
(CH2)17CH3 Esquema 2
Substituição de bis 2,3-(t-butoxicarbonilamino)butano-1,4-ditiol (preparado pelo mé- todo de DuPriest et al., Patente U.S. N0 4.755.528) para ditiotreitol conduzir, após desprote- ger, o 77-polímero 9b (esquema 3) funcionalizado por amino correspondente.
8a
"(OCH2CH2)m- -
Π
(CH2)17CH3
Esquema 3
O uso de butanoditiol 10c conduz do mesmo modo os polímeros da estrutura geral 9c, com grupos espaçadores L no lugar para anexação subseqüente de alvejar porções (es- quema 4). Os grupos espaçadores L podem ser qualquer dos grupos espaçadores conheci- dos na técnica para uso em Iigandos de anexação ou conduzir para moléculas de substrato, incluindo mas não Iimitsdos a C2 a C20 alquileno θ espaçadores oligo(etil6no glicol) tendo de um a dez unidades -CH2CH2-O-.
BeeHN
+ HS-
O^NH
T
^NHBoq IOc
Esquema 4
Em outras modalidades, um polímero PEG com grupos amino terminais pode ser usado para preparar os exemplos que têm ligações amida entre as unidades A e B1 como mostrado nas estruturas 10-14 abaixo. Cada uma destas poliamidas pode ser derivada atra- vés da reação de diamina PEG H2N-(CH2CH20)mCH2CH2-NH2 com o-anidrido cíclico apro- priado: H2N NH2
* N (CH2CH2O)m-CH2CH2-1-* 12 ri
O
Il
N-(CHzCH2O)ril-CH2CH8-
Ώ
13
X X'
O
^n-(CH2CHjD)lxPHzCHz-
StK
14
a
Sob circunstâncias suaves, os aminoácidos acima são os produtos previstos. Sob aquecimento, a formação de imida pode ser esperada, conduzindo aos polímeros com pou- cos grupos reativos mas ainda apropriados para anexação de porções C hidrofóbicas. Alter- nativamente, as cadeias laterais C pendentes podem ser adicionadas às extremidades dos blocos de polímero A, e as porções de ponto de ramificação podem entrar na existência no tempo de polimerização (esquema 5). -(CHaCBsOJsr^^pY'
CjeHisS
C13H13S
H
Ύ
π
14
Esquema 5
Em adição às diaminas simples tal como 1,3-diaminopropano, como mostrado no esquema 5, diaminas tendo (opcionalmente mascaradas) grupos funcionais reativos X po- dem ser empregadas, conduzindo aos polímeros 15 apropriados para anexação de alvejar porções (esquema 6). Nas fórmulas abaixo, ρ pode variar de 0-4, e cada X é independente- mente o mesmo ou diferente de qualquer outro grupo X que pode estar presente. Um grupo reativo X não precisa ser pendente, mas pode por exemplo ser um grupo NH dentro da ca- deia dos átomos que compõe a diamina, como no monômero H2N- (CH2) 3-NH-(CH2) 3-NH2.
(X)p
^CH2CHzOfe RS-j- -F-SR*
k^OH HOsJ
O O
13
NH2 Esquema 6
Certos /7-polímeros preparados como possui acima grupos reativos X apropriados para derivatização adicional, para unir porções alvo tais como moléculas, peptídeos, nucleo- tídeos, açúcares, anticorpos, etc., ou para efetuar reticulação das cadeias de polímero atra- vés de agentes de reticulação bifuncionais ou multifuncionais. Em modalidades particulares, derivatização parcial dos grupos reativos na cadeia de polímero é realizada para gerar n- polímeros que têm uma variedade de grupos reativos diferentes, que permite anexação de uma variedade de porções de droga e alvo a uma única cadeia de polímero. Assim, a adição de uma quantidade subestoiquiométrica de cloreto de acriloíla (ou anidrido maléico) ao n- polímero do exemplo 1 fornecerá um polímero com ambos grupos acriloíla (ou maleíla) e hidroxila residuais. A adição subseqüente de Michael de uma quantidade subestoiquiométri- ca de um ácido mercapto-carboxílico, por exemplo, HS-(CH2)3-COOH, forneceria um políme- ro com grupos hidroxila, acriloíla, e carboxila. A adição de cisteína introduz amino e grupos carboxila, além do que todos os grupos reativos residuais deixados atrás por quantidades subestoiquiométricas de reagentes.
Outra aproximação aos 77-polímeros polifuncionais envolve a omissão deliberada de uma fração das cadeias hidrofóbicas C. O 77-polímero do exemplo 1, por exemplo, pode ser preparado com grupos de ácido carboxílico não reativos por expediente simples de limitar a quantidade de alquilamina de formação pendente na etapa de amidação. Contudo uma ou- tra aproximação é amidação com uma mistura de aminas, uma fração de que contém um grupo reativo X. Também, sob circunstâncias apropriadas (anidrido maléico em excesso na etapa A e em excesso DTT na etapa B), uma preparação de polímero tendo uma população desejada de grupos tiol livres pode ser gerada.
O /7-polímero do exemplo 1 contém, pelo desenho, os grupos hidroxila derivados da porção DTT na espinha dorsal, que servem como grupos reativos X. Esterificação destes grupos com cloreto de acriloíla ou cloreto de metacriloíla em meios aquosos na presença dos resultados tampão de carbonato/bicarbonato na substituição acriloíla nos grupos -OH. O polímero acrilado pode prontamente ser sujeitado à polimerização radical (com ou sem o monômero radical adicionado tal como um composto acrílico ou reticulador tal como um composto bisacrílico) para obter hidrogéis apropriados para entrega controlada de droga (atuando como depósitos ou reservatórios de polímero) e para tratamentos tópicos (tais co- mo remendos ou pomadas de pele). O grupo acrila pode igualmente ser sujeitado a uma adição de Michael, em particular, com um tiol, tal como aquele de um resíduo de cisteína em uma proteína, enzima, peptídeo, anticorpo, fragmento Fab1 2 ou fragmento Fab', ou outra porção alvo (esquema 7). I proteína-SH
Esquema 7
Um /7-polímero que possui grupos hidroxila reativos, após secagem, pode igual- mente ser esterificado com anidrido maléico para unir o grupo maleato, um aceptor Michael1 gerando simultaneamente um grupo carboxílico livre. No polímero resultante, a ligação dupla maléica está disponível para uma adição de Michael, em particular, com um tiol, tal como aquela de um resíduo de cisteína em uma proteína, enzima, peptídeo, anticorpo, fragmento Fab' 2 ou fragmento Fab', ou outra porção alvo. (Esquema 8), e o grupo carboxila estão dis- poníveis para acoplar a grupos amino de drogas ou Iigandos1 ou os resíduos de Iisina nas proteínas e nos peptídeos.
Uma porção diferente pode adicionalmente ser unida ao grupo carboxílico recente-
mente introduzido (ou previamente disponível) através da amidação. Assim pelo menos du- as porções alvo deferentes podem ser unidas mesmo sob a saturação de condições de rea- ção (isto é, a porção a ser unida está presente no excesso estoiquiométrico). OH
^Yj
m
(CH2)17OH3
ίγΟ NH
OCHzCH2).,,-
(CH2)irCH1
maléico
anidrido
V i ν
(CH2)1JCHa
proteína-SH
w
tAj
W
QyJ
S-pestisft·»
O
A
£ -VOa-J2CM2Jm-" ■Í.O
íjM (CH2)IyCH3
prateiin-S-
v
Λ V0
V
NH .1
(CHj) IyCHa
Esquema 8
Os polímeros que carregam grupos carboxilato pendentes podem ser amidados com aminas sob condições típicas de acoplamento, e podem igualmente ser convertidos aos grupos isocianatos através do rearranjo de Curtius e então ser acoplados com aminas ou álcoois para formar uréias e carbamatos, respectivamente. Tais reações podem ser usadas para introduzir os grupos hidrofóbicos C, ou para unir as porções alvo.
As aminas livres podem ser introduzidas no polímero pelo menos parcialmente rea- gindo um dos grupos reativos com uma diamina. A diamina deve ser escolhida de modo que um dos grupos amina seja protegido ou não reativo sob as condições da reação. Os últimos podem freqüentemente ser realizados usando etilenodiamina em um pH de aproximadamen- te 7,5, desde o pKa' s dos dois grupos amino difere consideravelmente. Preferivelmente, esta amidação é realizada como uma etapa separada após a introdução dos grupos hidrofó- bicos pendentes. Um peptídeo ou uma outra molécula tendo um grupo carboxílico pode en- tão ser unida pela amidação nesta amina livre.
Assim, mesmo sob condições de saturação, tanto como três peptídeos diferentes ou outras porções alvo podem ser unidos ao /7-polímero: um através de tiol, um através de amina ou hidroxila, e um através do grupo de ácido carboxílico. Os grupos hidroxila e tiol podem igualmente ser convertidos às aminas primárias pela reação com aziridina ou uma haloalquil amina (tal como bromoetilamina ou cloroetila- mina). Amidação com cisteamina introduzirá um dissulfeto, que possa diretamente ser rea- gido com cisteína de um peptídeo ou anticorpo para unir o peptídeo ou anticorpo; ou pode primeiramente ser reduzido, por exemplo, com aminoetanotiol ou DTT, para uma reação mais adicional com um peptídeo ou anticorpo.
Executando reações parciais, uma pode introduzir grupos funcionais reativos adi- cionais a um polímero da invenção, incluindo mas não limitado a (1) grupos tiol reativos tais como derivados de ácido acrílico ou maléico, (2) grupos reativos de ácido carboxílico tais como amino ou hidroxila, (3) grupos amina reativos tais como carboxila, e (4) grupos dissul- feto reativos tais como mercapto. O número de tais grupos funcionais adicionados por molé- cula de polímero pode variar de 1/r até diversos múltiplos de r, dependendo do reagente usado e da quantidade usada.
Alternativamente, dois ou mais Iigandos específicos podem ser unidos para melho- rar a especificidade da ligação a dizer, de um vírus, ou da superfície da célula. Dois ou mais Iigandos específicos podem igualmente ser usados para causar uma interação entre alvos ceiuiares diferentes, por exemplo, um ligando pode alvejar uma partícula do vírus, e um ou- tro ligando pode facilitar ligar a um fagócito, desse modo trazendo a partícula do vírus na proximidade ou o contato com o fagócito e promover a fagocitose. Tal derivatização permite a anexação de três ou mais porções terapêuticas e/ou al-
vo distintas ao polímero, através da anexação do grupo funcional diferente (tais como ami- na, carboxilato, e tiol). Assim, um pode unir um agente alvo específico a tecido, um agente de imagem, e um agente terapêutico a uma única cadeia de polímero, e automontagem subseqüente do polímero renderá um terapêutico direcionado cuja distribuição e eficiência de alvo possam ser monitoradas.
A anexação de Iigandos às unidades de repetição dos polímeros da invenção for- nece exposição multivalente do ligando na cadeia de polímero e nas superfícies de nanopar- tículas. A exposição multivalente conduz freqüentemente aos grandes aumentos na afinida- de para o alvo. Por exemplo, os anticorpos multivalentes podem ser distantes mais eficazes no afastamento de seus alvos do que os anticorpos divalentes normais. As proteínas de li- gação carboidratos e carboidratos são conhecidos para ser multivalentes na natureza, e ineficazes se monovalentes. Similarmente, o peptídeo multivalente e porções carboidrato alvo serão distantes mais eficazes do que o monômero sozinho. O aumento no MW devido à anexação ao polímero resulta em taxas de afastamento renais reduzidas de peptídeos e outros ligandos. Além disso, a espinha dorsal de PEG fornece recursos para
os benefícios dos peptídeos similares àqueles de PEGilação, incluindo a evasão da fiscalização imune. Além disso, uma fração alvo multivalente decorará um alvo multivalente (digamos, uma partícula de vírus) e o neutralizará de modo mais eficaz do que a fração alvo monomé- rica. A habilidade de exibir peptídeos múltiplos (diferentes) em formato multivalente conduzi- rá à especificidade realçada. Por exemplo, um polímero verdadeiramente HlV-específico (ligante ao vírus HIV) pode ser construído anexando um peptídeo correspondente à região de ligação CD4 e um outro peptídeo correspondente à região de ligação CCR-5 ou CXCR-4 do vírus e, possivelmente, um terceiro peptídeo correspondente ao outro receptor (CXCR-4 ou CCR-5, respectivamente). Tal polímero poderia completamente mascarar as regiões de ligação de vírus e tornar o vírus incapaz de anexar a células e, desse modo, não infectante. Além disso, as propriedades surfactantes do polímero conduziriam à desestabilização da própria estrutura do vírus mediante ligação. Em vez dos peptídeos, moléculas pequenas que interferem com os mesmos padrões de ligação (CD4, CCR-5, CXCR-4) ou uma mistura de peptídeos e moléculas pequenas, preferivelmente com atividades complementares, podem ser empregadas. Os polímeros resultantes tornarão todo vírus livre ineficaz e, assim, podem ser ideais para parar a propagação da infecção, usando-os como componentes de lubrifican- tes de preservativo e semelhantes. Além disso, tais polímeros podem ser injetados em paci- entes para reduzir a carga de HIV.
Geralmente, quando um reagente polifuncional tal como DTT é empregado, pode haver uma reticulação parcial de cadeias de polímero via esterificação do ácido carboxílico com DTT ou reações laterais similares. Grupos hidroxila secundários na região central das cadeias de PEG, por exemplo, aqueles associados com resíduos de éter diglicidil de bisfenol A, podem igualmente contribuir para reticulação se estiverem presentes no material de par- tida de PEG. As estruturas resultantes de hidrogel reticulado são igualmente materiais úteis. Por exemplo, apropriadamente aumentando a extensão desta reticulação ou a reticulação explícita usando reticuladores alternativos (tal como bisoxiranos, por exemplo), podem ser feitos materiais que são os hidrogéis flexíveis que podem servir como depósitos repositórios para drogas. Apropriadamente modificando os materiais (por exemplo, comprimento de PEG inferior, maiores grupos carboxílicos abertos e modalidade de grupos acrílicos apropriados) materiais em hidrogel lineares ou reticulados podem ser feitos que podem servir como repo- sitórios que podem ser suportados ou imobilizados em dispositivos tais como stents ou ab- sorvidos em dispositivos tais como almofadas para emplastros adesivos ou emplastros de inserção subdermal. Geralmente, tais materiais reticulados serão apropriados para liberação controlada ao invés de liberação alvo realçada.
Os polímeros em colméia da invenção são úteis para solubilizar em sistemas sol- ventes aquosos materiais escassamente solúveis em água. O método de solubilizar uma substância em um solvente aquoso compreende o contacto da substância escassamente solúvel com um polímero tipo colméia da invenção na presença de água, para dar forma a um complexo solúvel em água da substância e do polímero. Alternativamente, o polímero e a substância a serem solubilizados podem ser combinados em uma emulsão aquosa- orgânica bifásica e o solvente orgânico pode ser removido por evaporação. Um processo exemplar é descrito na patente US 6.838.089, incorporada neste para referência. Acredita- se que na maioria dos casos, o polímero automonta em nanopartículas que têm a substân- cia escassamente solúvel dissolvida entre as cadeias C hidrofóbicas que coalescem no nú- cleo das partículas, enquanto os blocos A formam uma corona hidrófila que abaixa suficien- temente a energia livre interfacial para permitir que uma suspensão aquosa das partículas permaneça estável.
Em alguns casos, a substância escassamente solúvel pode não dissolver inteira-
mente no núcleo, mas pode existir como uma nanopartícula sólida cercada por e suspensa nas cadeias C no núcleo das partículas. Para as finalidades da invenção atual, isto é uma diferença de grau, porque a prática da invenção não depende de qualquer grau particular de mistura das cadeias C com a substância escassamente solúvel. A substância pode em al- guns casos dissolver-se a nível molecular entre as cadeias C, mas em outros casos ela po- de exibir qualquer grau de separação de fase do ambiente de cadeia C. Em alguns casos, pode-se esperar que o sistema se moverá de um estado para outro em função da tempera- tura.
O poder de solvatação do núcleo hidrofóbico das partículas do polímero pode ser modificado modificando as frações C hidrofóbicas. Modificações apropriadas incluem mas não são limitadas à introdução de um ou mais substituintes hidrofílicos, tais como hidroxila, éter, amida e grupos funcionais ciano, a fim de aumentar a polaridade e/ou a capacidade de polarização do núcleo hidrofóbico.
Materiais escassamente solúveis que podem ser tornados solúveis por estes polí- meros incluem vitaminas e nutrientes solúveis em gordura incluindo, mas não limitados às vitaminas A, D, E e K, carotenos, colecalciferol e coenzima Q; drogas insolúveis tais como docetaxel, anfotericina B, nistatina, paclitaxel, doxorubicina, epirubicina, rubitecano, tenipo- sida, etoposida, daunomicina, metotrexate, mitomicina C, ciclosporina, metabólito irinotecan (SN-3 8), estatinas e esteróides; tinturas, agentes fotodinâmicos e agentes de imagem, e ácidos nucléicos, análogos de ácido nucléico, e complexos de ácido nucléico. Os análogos de ácido nucléico incluem espécies tais como tiofosfatos e ácidos nucléicos de peptídeo; os complexos de ácido nucléico são complexos iônicos de ácidos oligonucléicos com uma quantidade substancialmente neutralizadora de carga de espécie catiônica ou policatiônica.
Para as finalidades desta divulgação, uma droga que seja insolúvel em pH neutro é considerada "escassamente solúvel", porque há em muitos casos uma necessidade de uma composição farmacêutica neutra. Por exemplo, a ciprofloxacina é razoavelmente solúvel em água em um pH abaixo de 4,5, mas este pH pode ser altamente irritante quando a droga é formulada para administração ocular. Um polímero da invenção atual solubilizará a ciproflo- xacina em salina normal em pH 7. Também, para as finalidades desta divulgação, "escas- samente solúvel" deve ser compreendido como se referindo a qualquer substância cuja so- Iubilidade em um veículo aquoso seja tal que um aumento na solubilidade renderia uma composição melhorada ou mais útil. Assim, uma droga que seja moderada solúvel, por e- xemplo, até o grau de 2g/litro, é "escassamente solúvel" se uma dose unitária para adminis- tração intravenosa é de 5g.
Como resultado da capacidade dos polímeros da invenção solubilizarem espécies farmacologicamente ativas, a invenção atual igualmente fornece composições farmacêuti- cas, que compreendem um ou mais π-polímeros da invenção em combinação com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais agentes farmacologicamente ativos. Os polímeros da invenção podem tornar eficaz o que seria de outra maneira uma quantidade ineficaz de um agente farmacologicamente ativo. Para finalidades desta divulgação, conse- qüentemente, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" é a quantidade de agente que tor- na a composição total eficaz.
Todas as patentes, os pedidos de patente e as publicações mencionadas neste são incorporadas por este meio para referência em sua totalidade. EXPERIMENTAL 1. Procedimentos gerais.
A invenção igualmente fornece processos para a preparação de polímeros em col-
méia da invenção. A síntese destes polímeros é realizada prontamente pela pessoa qualifi- cada em síntese orgânica, seguindo os procedimentos descritos abaixo. O material de parti- da chave é polietileno glicol, que é secado preferivelmente antes de usar. Isto é feito conve- nientemente agitando o PEG derretido sob o vácuo em uma temperatura elevada, até que as bolhas parem de se formar. Isto pode levar 8 a 12 horas, dependendo da qualidade do PEG. Uma vez secado, o PEG pode ser armazenado sob argônio indefinidamente. As clas- ses industriais e de pesquisa disponíveis no comércio de PEG podem ser empregadas para fazer os polímeros da invenção, por exemplo, o "PEG 1500" polidisperso do comércio que tem uma distribuição de peso molecular de 1430 - 1570. Tal material pode incorporar éter diglicidil de bisfenol A, que introduz grupos hidroxila secundários no centro da cadeia de PEG. A fim de assegurar que os polímeros da invenção tenham as propriedades mais re- produtíveis e consistentes, o PEG é preferivelmente livre de bisfenol A e de baixa capacida- de de dispersão. Mais preferíveis são os polímeros de PEG que são >95% monodispersos, tal como comercialmente disponíveis de Nektar Therapeutics (antigamente Shearwater Polymers), Huntsville, AL, e Polypure AS, Oslo, Noruega. Um exemplo de um PEG particu- larmente preferido é "PEG-28" de Polypure, que é >95% HO(CH2CH2O)28H, peso molecular 1252. Todas as reações são realizadas sob uma atmosfera inerte tal como nitrogênio ou argônio, com agitação magnética ou preferivelmente mecânica.
Na etapa A, PEG seco é derretido e anidrido maléico (2 moles por mole de PEG) é adicionado com agitação. A quantidade de anidrido maléico deve coincidir com o número de grupos hidroxila terminais do PEG tão próximo quanto possível. Uma falta de anidrido maléi- co conduzirá a cadeias de polímero terminadas em hidroxila, ao passo que um excesso de anidrido maléico consumirá grupos tiol na etapa seguinte, conduzindo à terminação da ca- deia prematura e grupos carboxila terminais. A temperatura de reação não é crítica, e o pro- cesso pode convenientemente ser realizado em temperaturas entre 45°C e 100°C. A tempe- ratura preferida da reação está entre 65°C e 90°C. Se temperaturas elevadas forem empre- gadas, o anidrido maléico tende a sublimar e medidas devem ser tomadas para verificar se o anidrido maléico permanece em solução. Minimização do espaço aéreo submersão do vaso de reação em um banho de óleo são métodos eficazes.
Dependendo da temperatura selecionada, a reação pode ser terminada em 2 horas ou menos ou pode ser conduzida durante a noite. A reação pode ser monitorada por TLC em placas de sílica gel e é continuada até depois do desaparecimento do anidrido maléico. Contraste visual, UV e mancha de iodo podem todos ser usados para examinar as placas TLC.
Na etapa Β, o éster de bis-maleato de PEG bruto produzido na etapa A é combina- do com o ditiotreitol (DTT) e N1N1N11N^tetrametiIetiIenodiamina (TEMED) (com água adicio- nada, caso necessário para fluidez), e a mistura agitada a 70°C. A reação está completa dentro de 30 minutos, como indicado pelo aumento rápido na viscosidade. O peso molecular do produto será reduzido se mais ou menos do que a quantidade ótima de DTT for empre- gada. O peso molecular do produto pode igualmente ser reduzido, se desejado, substituindo TEMED por uma base de amina terciária menos eficaz tal como TEA.
Na etapa C, água suficiente é adicionada à mistura de reação para reduzir a visco- sidade, e 0,1 mol de N-hidroxissuccinimida (NHS) e 1,05 mol de hexadecilamina por mol de grupos de ácido carboxílico no polímero são adicionados. (Esta quantidade de NHS parece minimizar de maneira ótima a extensão de reações laterais.) Um excesso de N-(3- dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (EDC) (1,4mol de EDC por mol de grupos de ácido carboxílico) é adicionado, então, em porções com água adicional adicionada como necessá- rio para manter a agitação. O pH da mistura de reação é mantido acima de 7, e preferivel- mente entre 9 e 11, para aperfeiçoar a reatividade da alquilamina. Com dodecilamina, esta reação pode ser conduzida a aproximadamente 40 a 45°C, ao passo que com octadecilami- na a temperatura é de cerca de 55°C a 57°C. A reação é seguida por TLC até que um nível constante de alquilamina restante seja observado, tipicamente após o funcionamento duran- te a noite. A mistura de reação é acidificada a um pH de aproximadamente 3,0 a aproximada- mente 4,5 e agitada à temperatura ambiente por aproximadamente 24 horas para destruir EDC não reagido, então, titulada a um pH de 7,0 usando NaOH 1N. A mistura de reação final é centrifugada a aproximadamente 800 xg por 1 a 3 horas, para remover contaminantes sólidos e subprodutos.
Após a centrifugação, o sobrenadante pode ser cromatografado em uma coluna GPC (Toyopearl (TM), Sephadex (TM), Sephacryl (TM), Biogel (TM), etc.). Os polímeros π são materiais anfipáticos e exibirão afinidade para a maioria de empacotamentos de coluna GPC, assim, complicando a remoção de contaminantes. Alternativamente, o polímero pode ser cromatog rafado em uma coluna de interação hidrofóbica de poros grandes (por exemplo, TOYOPEARLTM Phenyl 650C, Toshoh Biosciences, Montgomeryville, PA, EUA), eluindo com um gradiente de metanol em água. Preferivelmente, a mistura de reação é dialisada contra diversas mudanças de água acidificada e neutra para remover materiais de partida de baixo peso molecular e subprodutos de reação. A mistura de reação pode igualmente ser extraída com butanona, isopropanol, bu-
tanol ou outros solventes orgânicos polares para remover impurezas orgânicas, mas quanti- dades substanciais de polímero anfifílico são perdidas para o solvente de extração. A mistu- ra de reação é submetida preferivelmente a ultrafiltração usando membranas apropriadas para fracionar o produto em graus de peso molecular, tais como 5kDa a 10kDa; IOkDa a 30kDa, 30kDa a 50kDa, etc. dependendo da interrupção da membrana de filtragem empre- gada. Uma solução aquosa do polímero pode ser submetida à filtragem sem saída para pro- duzir uma solução estéril ou isenta de vírus, dependendo da escolha da membrana ou do meio de filtragem.
2. Síntese de π polímeros Exemplo 1: Polímero de peso molecular médio PEG-DI(alquilamidosuccinil)ditioéter
(C1 β-π-Polímero A)
Polietileno glicol (PEG-1500, Sigma Chemical Co.) foi secado sob vácuo a 80°C até que as bolhas pararam de se formar. (8-12 horas, dependendo da qualidade do PEG.) O PEG secado pode ser armazenado dessecado sob argônio indefinidamente. O PEG secado foi derretido sob argônio em um banho de óleo e anidrido maléico (2
moles por mole de PEG, corrigido para impurezas) foi adicionado gradualmente com agita- ção. A mistura foi agitada sob argônio a 90°C. Como o anidrido maléico tende a sublimar, o espaço aéreo foi minimizado e o vaso de reação inteiro foi mantido na temperatura de rea- ção. Qualquer anidrido maléico condensado nas paredes do vaso foi raspado de volta a mis- tura de reação. O progresso da reação foi monitorado por TLC em placas de sílica gel usan- do etanol e hexano como solventes separadamente, com visualização de UV e mancha de iodo. A reação foi continuada por uma hora após o desaparecimento do anidrido maléico. O dimaleato de PEG bruto foi diluído com dois volumes de água. Uma solução de ditiotreitol (DTT, 1,01 equivalentes por equivalente de PEG) e Ν,Ν,Ν',Ν- tetrametiletilenodiamina (TEMED, 1,02 equivalentes) em água (2 volumes de água por vo- lume de TEMED) foi, então, adicionada à mistura de reação com agitação. A reação foi agi- tada a 70°C sob argônio por 2,5 horas, deixada à temperatura ambiente durante a noite e, então, agitada novamente a 70°C por 2 horas. A reação foi monitorada por TLC e foi julgada completa mediante o completo desaparecimento do DTT.
Água foi adicionada à mistura de reação acima para reduzir a viscosidade, até que a mistura pudesse ser agitada (a cerca de 25% de sólidos), a mistura foi agitada a 65°C sob argônio e N-hidroxissuccinimida (0,1 mol por mol de grupos de ácido carboxílico no polímero PEG-dimaleato-DTT) foi adicionada, seguida por hexadecilamina (1,05 mol por mol de gru- pos de ácido carboxílico no polímero) e por N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (EDC, 0,56 mol por mol de grupos de ácido carboxílico no polímero). A mistura foi agitada sob argônio por 1 hora e uma segunda porção de EDC (0,56 mol por mol de grupos de ácido carboxílico no polímero) foi adicionada. Após uma outra hora, uma terceira parcela de EDC (0,28 mol por mol de grupos de ácido carboxílico no polímero, para um total de 1,4 mol de EDC por moi de ácido carboxílico) foi ainda adicionada para compensar a perda de EDC para hidrólise. Água adicional foi adicionada como necessário para manter a fluidez, porque os sólidos adicionados fizeram a suspensão difícil agitar, e o pH foi mantido entre 8 e 10 pela adição de NaOH 1N como necessário. A mistura foi agitada a 65°C sob argônio durante a noite, monitorada por TLC (sílica com etanol) até a alquilamina parecer ter alcançado uma concentração constante e foi agitada, então, por um adicional de 4h. A mistura de reação, então, foi acidificada com HCI 1N até um pH de aproximadamente 4,5, agitada por 24h para destruir EDC não reagido e ajustada para pH 7,0 por adição gota a gota de NaOH 1N. Com dodecilamina, esta reação foi conduzida a aproximadamente 40-45°C, ao passo que com octadecilamina a temperatura foi preferivelmente de 55 a 57°C.
A mistura foi transferida para garrafas de centrífuga e girada em uma centrífuga de topo de bancada a aproximadamente 800 xg por 2 horas para separar sólidos residuais. Após a centrifugação, a mistura de reação foi extraída com isopropanol para remover impu- rezas orgânicas. UItrafiItração é preferida como uma alternativa à extração com isopropanol.
Através deste método, os seguintes compostos amino são conjugados ao polímero: Exemplo 1a: undecilamina. Exemplo 1b: octadecilamina. Exemplo 1c: 4-nonilbenzilamina. Exemplo 1d: 3-[(4-fenoxi)fenil]propilamina.
Exemplo 2: Polímero de Peso MoIecuIarAIto PEG-Di(alquilamidosuccinil)ditioéter O procedimento esboçado no Exemplo 1 foi seguido, salvo que 0,55 mol de DTT e 0,55 mol de TEMED por mol de anidrido maléico foram usados. Agitação vigorosa foi neces- sária porque a viscosidade se acumulou rapidamente. Pareceu que a maioria da reação es- tava completa dentro de 5-10 minutos, seguidos pela conclusão lenta durante as próximas 4 horas à medida que a temperatura foi elevada de 55°C a 80°C.
Exemplo 3: Polímero PEG-Di(alquilamidosuccinil)ditioéter
O procedimento esboçado no Exemplo 1 foi seguido, salvo que 1,5 moles de dode- cilamina por mol de grupos de ácido carboxílico no polímero foram empregados. N- hidroxisuccinimida (NHS, 1,0 mol por mol de grupos de ácido carboxílico) e 1,1'- Carbonildiimidazola (CDI 3,0 moles por mol de grupos de ácido carboxílico) foram adiciona- dos e a reação foi agitada a 80°C por 4 horas e trabalhada como acima.
Através deste método, os seguintes compostos amino são conjugados ao polímero:
Exemplo 3a: undecilamina.
Exemplo 3b: tetradecilamina.
Exemplo 3c: octadecilamina. Exemplo 3d: dehidroabietilamina.
Exemplo 3e: colesterol 2-aminoetil éter.
Exemplo 3f: 10-fenoxidecilamina.
Exemplo 3g: hidrazida de ácido sebácido.
Exemplo 3h: hidrazida de ácido oléico. Exemplo 3i: hidrazida de ácido dehidroabiético.
Exemplo 3j: hidrazida de ácido cólico.
Exemplo 3k: hidrazida de ácido palmítico.
Exemplo 4: Polímero PEG-co-(alquilamidosuccinato)
Uma solução de PEG (6,66 mmoles) e trietilamina (2,32 ml, 16,65 mmoles) em éter dietil seco (10 ml) é esfriada até 0 0C sob argônio e tratada gota a gota com cloreto de me- tanosulfonil (1,03 ml, 13,32 mmoles). Agitação é continuada por 1 h a 0°C e, então, a tempe- ratura ambiente por 2 h. O éter é evaporado e acetona seca (15 ml) é adicionada ao resíduo a fim de precipitar cloridrato de trietilamina, que é filtrado da solução. O filtrado é tratado com brometo de lítio (2,31 g, 26,64 mmoles) e aquecido até refluxo por 20 h. Então, a mistu- ra é diluída com hexano e filtrada através de uma coluna curta de sílica (3 cm) coberta com Celite™ (0,5 cm) e eluída com hexano. O filtrado é secado, filtrado e evaporado para deixar um óleo α,ω-dibromo-PEG.
α,ω-dibromo-PEG é reagido com o um equivalente de 2,2-dibutil-4,5- bis(metoxicarbonil)-1,3,2-dioxastanolano pelo método de Godjoian et al., Tetrahedron Let- ters, 37:433-6 (1996). O poliéter dimetiltartrato-PEG resultante é saponificado com KOH em metanol e, então, aminado com dodecilamina ou hexadecilamina como nos exemplos 1 e 3 acima, ou com as aminas nos exemplos 3a-3k. Exemplo 5: Copolimerização de PEG com dianidrido de EDTA
PEG seco é reagido com o dianidrido de ácido etilenodiaminatetracético pelo méto- do descrito no Exemplo 1 e é, então, aminado com dodecilamina como no Exemplo 1 ou no hexadecilamina como no exemplo 3, ou com as aminas nos exemplos 3a-3k.
Da mesma maneira, os seguintes dianidridos são co-polimerizados com PEG e
subseqüentemente aminados:
Exemplo 5a: Napftalenotetracarboxílicodianidrido.
Exemplo 5b: Perílenotetracarboxílicodianidrido.
Exemplo 5c: Benzofenonatetracarboxílicodianidrido. Exemplo 5d: 4,4'-(Hexafluoroisopropilideno)diftálico anidrido.
Exemplo 5e: Butano ácido tetracarboxílico dianidrido.
Exemplo 5f: Biciclo(2,2,2)oct-7-eno-2,3,5,6,-tetracarboxílico dianidrido.
Exemplo 5g: Dietilenotetramina ácido pentacético dianidrido.
Exemplo 5h: 3,4,3',4,-Difenilsulfona ácido tetracarboxílico dianidrido. Exemplo 5i: 3,4,3',4'-Difenil éter ácido tetracarboxílico dianidrido.
Exemplo 5j: Dianidrido piromelítico.
Exemplo 6A: Copolímero PEG-diamina com tioéteres pendentes.
Dimaleato de PEG, preparado como no Exemplo 1, é reagido com dodecanotiol (dois equivalentes por equivalente de dimaleato de PEG) usando o mesmo procedimento que o usado para DTT no Exemplo 1. Nenhuma diluição é necessária, porque nenhuma po- limerização ocorre, e a reação é conduzida em PEG-dimaleato derretido. O catalisador TEMED é adicionado e o tiol é adicionado, então. A reação é seguida pelo desaparecimento de materiais de partida, usando TLC. Temperaturas até o ponto onde a perda de alquiltiol por vaporização se torna significativa podem ser empregadas (até cerca de 100°C). Um ex- cesso ligeiro de alquiltiol pode ser empregado para saturar inteiramente os grupos maléicos. O alquiltiol em excesso é expelido no fim da reação por aspersão com nitrogênio ou argônio e/ou aquecimento sob vácuo, até que nenhum seja detectado pelo odor ou por TLC.
Por este método, os seguintes tióis podem ser conjugados a dimaleato de PEG:
Exemplo 6Aa: mercaptosuccínico ácido di-t-butil éster. Exemplo 6Ab: tetradecanotiol.
Exemplo 6Ac: hexadecanotiol.
Exemplo 6Ad: 2-mercaptoetanosulfônico ácido.
Exemplo 6Ae: 3-mercaptopropanosulfônico ácido.
Exemplo 6Af: 6-mercaptohexanóico ácido t-butil éster. Exemplo 6Ag: 4-mercaptobenzóico ácido t-butil éster.
Exemplo 6Ah: mercaptoacético ácido t-butil éster.
Exemplo 6Ai: 4-(t-butoxicarbonilamino)butanotiol. Exemplo 6Aj: 3-(t-butoxicarbonilamino)benzil mercaptano. Exemplo 6Ak: 4-decilbenzil mercaptano.
Tióis que têm grupos funcionais reativos são apropriados para anexação a cadeias C e/ou os grupos funcionais reativos podem servir como pontos de anexação (X) para fra- ções alvo.
Exemplo 6B: Copolímero PEG-diamina com tioéteres pendentes.
O aduto de tiol obtido no Exemplo 6A é aminado com 1,4-diaminobutano (um equi- valente de diamina por dois grupos COOH), usando o mesmo procedimento usado para do- decilamina no Exemplo 1, com diluição com água como necessário para manter a fluidez da mistura de reação. As alíquotas adicionais de EDC são adicionadas como necessário para assegurar a polimerização completa. Por este método, os adutos de tio! dos Exemplos 6A e 6Aa até 6Ak são convertidos em uma poliamida PEG-diaminobutano.
Por este método, as seguintes diaminas podem ser convertidas para uma poliamida de PEG (BOC = f-butoxicarbonil):
Exemplo 6Ba: 2 (O-BOC)-1,3-diamino-2-propanol.
Exemplo 6Bb: N',N"-di(BOC)hexaetileno tetramina.
Exemplo 6Bc: N',N"-di(BOC)espermina.
Exempo 6Bd: Ν'-BOC espermidina.
Exemplo 6Be: N',N",N'"-tri(BOC)pentaetileno hexamina.
Exemplo 6Bf: agmatina.
Exemplo 6Bg: Iisina t-butil éster.
Exemplo 6Bh: 1,6-diaminohexano.
Exemplo 6Bi: 1,4-fenilenodiamina.
Exemplo 6Bj: 1,3-fenilenodiamina.
Exemplo 6Bk: 1,4-diaminobutano-2,3-diol acetonida.
Exemplo 7: PEG-Di(alquilsuccinato)ditioéter O éter 2,3-bis-O-hexadecil de DTT (meso-2,3-bis (hexadeciloxi)butano-1,4-ditiol) é preparado por uma modificação do procedimento de S. Sasaki et ai., Chem.Pharm.Buii. 33 (10): 4247-4266 (1985). Este é adicionado ao dimaleato de PEG pelo método do Exemplo 1. Por este método, os seguintes ditióis de éter são acoplados ao polímero de PEG: Exemplo 7a: meso-2,3-bis(n-butoxi)butano-1,4-ditiol.
Exemplo 7b: meso-2,3-bis(4-nonilfenilmetoxi)butano-1,4-ditiol. Exemplo 7c: meso-2,3-bis(fenil-4-metoxi)butano-1,4-ditiol. Exemplo 7d: 4,6-bis(deciloxi)benzeno-1,3-dimetanotiol. Exemplo 7e: 4,5-bis(deciloxi)benzeno-1,2-dimetanotiol. Exemplo 7f: 3,4-bis(deciloxi)tiofeno-2,5-dimetanotiol.
Exemplo 8A: Succinatos de PEG substituídos
O método do Exemplo 1 é seguido, salvo que o 2-dodeceno-1-il succínico anidrido é usado no lugar do anidrido maléico. O substituinte dodecenil fornece as cadeias C pen- dentes C no polímero final. Por este método os seguintes anidridos succínicos substituídos são esterificados
com PEG:
Exemplo 8Aa: anidrido isobutenilsuccínico. Exemplo 8Ab: anidrido 2-octeno-1-il. Exemplo 8Ac: anidrido octadecenil succínico. Exemplo 8Ad: 3-oxabiciclo-hexano-2,4-diona.
Exemplo 8Ae: anidrido ciclohexanodicarboxílico. Exemplo 8Af: anidrido ftálico. Exemplo 8Ag: anidrido 4-decil ftálico. Exemplo 8Ah: anidrido hexahidrometilftálico. Exemplo 8Ai: anidrido tetrahidroftálico.
Exemplo 8Aj: anidrido norbornenodicarboxílico. Exemplo 8Ak: cantaridina. Exemplo 8A1: anidrido biciclooctenodicarboxílico. Exemplo 8Am: anidrido exo-3,6-epoxi-1,2,3,6-tetrahidroftálico. Exemplo 8An: anidrido S-acetil mercaptosuccínico.
Exemplo 8B: PEG-Di(alquilamidosuccinil)ditioéter com grupos alquila pendentes. Pelo método do Exemplo 1, os succinatos de PEG substituídos obtidos como des- crito nos Exemplos 8A e 8Aa até 8An são reagidos com o DTT.
Por este método, os seguintes ditióis são reagidos com qualquer um dos succinatos de PEG substituídos obtidos como descrito nos Exemplos 8A e 8Aa até 8An: Exemplo 8Ba: etano-1,2-ditiol. Exemplo 8Bb: propano-1,3-ditiol. Exemplo 8Bc: butano-1,4-ditiol.
Exemplo 8Bd: pentano-1,5-ditiol.
Exemplo 8Be: hexano-1,6-ditiol.
Exemplo 8Bf: 1,4-benzenoditiol.
Exemplo 8Bg: 1,3-benzenoditiol.
Exemplo 8Bh: 1,4-benzenodimetanotiol.
Exemplo 8Bi 1,3-benzenodimetanotiol.
Exemplo 8Bj: 1,2-benzenodimetanotiol.
Exemplo 8C: Copolímero PEG-diamina com grupos alquila pendentes Pelo método do exemplo 6B, o succinato de PEG substituído obtido como descrito
no Exemplo 8A é copolimerizado com 1,4-diaminobutano.
Por este método, as seguintes diaminas são copolimerizadas com qualquer um dos succinatos de PEG substituídos dos Exemplos 8A e 8Aa até 8An:
Exemplo 8Ca: 20-B0C 1,3-diamino-2-propanol. Exemplo 8Cb: N',N"-di(BOC)hexaetileno tetramina.
Exemplo 8Cc: N',N"-di(BOC) espermina.
Exemplo SCd: N-BGC espermiaina.
Exemplo 8Ce: N\N",N"'-tri(BOC)pentaetileno hexamina.
Exemplo 8Cf: agmatina. Exemplo 8Cg: Iisina t-butil éster.
Exemplo 8Ch: 1,6-diaminohexano.
Exemplo 8Ci: 1,4-fenilenodiamina.
Exemplo 8Cj: 1,3-fenilenodiamina.
Exemplo 8Ck: 1,4-diaminobutano-2,3-diol acetonida. Exemplo 9: Trans-esterificação de PEG usando ácidos substituídos
Ditosilato de PEG: A 1 mol de PEG (dissolvido em DMF ou derretido como ele é) fo- ram adicionados 2,1 moles de cloreto de tosila (excesso molar de 5%) em agitação sob ar- gônio. A esta mistura de reação foram adicionados 2,2 moles de tetrametil etileno diamina (TEMED). A reação foi incubada, então, a 45°C por 2h. Os produtos foram re-dissolvidos usando TLC em etilacetato, tolueno ou etanol como solventes TLC. O ditosilato de PEG po- de ser extraído da mistura de reação com tolueno. Em vez do cloreto de toluenosulfonil, ou- tros agentes de sulfonação tais como cloreto de mesila (veja o exemplo 4), anidrido triflico ou cloreto de tresila podem igualmente ser usados (veja o pedido de patente 10/397332 dos E.U., publicação 20040006051). Poliesterificação de ditosilato de PEG: A 1 mol de ditosilato de PEG derretido, com
agitação sob o argônio, é adicionado 1 mol de S,S'-didecil-meso-2,3-dimercaptosuccínio ácido e 2 moles de TEMED. DMF é adicionado como necessário para manter a fluidez. A mistura de reação é aquecida a 80°C e agitada por 24 h ou até o término por TLC.
Exemplo 10: Polímero de Peso Molecular Médio PEG-Di(succinil)-di-(0- Acilado)tioéter (C16-nPolímero B).
Dimaleato de PEG (10,24 g, 6,1 mmoles) preparado como no Exemplo 1 foi coloca- do em um frasco seco de 125 ml e aquecido a 70°C sob argônio para derreter o dimaleato de PEG. A este material derretido, com agitação, foram adicionadas água (10 ml_) e uma solução de DTT (0,961 g, 6,168 mmoles) e TEMED (0,723 g, 6,166 mmoles) em água (3 ml_). A solução foi agitada a 70°C por aproximadamente 4 horas. A remoção de água in vá- cuo deu o polímero sólido em cerca de 90% de rendimento. O polímero seco (5 g, 2,7 mmoles) foi aquecido a 70-90°C sob argônio para derre-
tê-lo e TEMED (0,635 g, 5,5 mmoles) foi adicionado. Cloreto de palmitoil (1,689 g, 5,5 mmo- les) foi adicionado com agitação e a mistura foi agitada sob argônio durante a noite. (A rela- ção de polímero para cloreto de acila pode ser variada para obter graus de substituição de 0-100% de estequeometria.) Água foi adicionada à mistura de reação para isolar o "016-π- Polímero Β".
Por este método os seguintes ácidos são esterificados com os grupos hidroxila do copolímero di(succinil)PEG-DTT:
Exemplo 10a: Ácido Oléico.
Exemplo 10b: Colesteril succinato. Exemplo 10c: Ácido bifenil-4-carboxílico.
Exemplo 10d: Ácido 4-Octilfenilacético.
Exemplo 10e: Ácido Hexadec-6-inóico.
Como uma alternativa ao uso de haletos ácidos, os grupos hidroxila derivados de DTT de polímeros π podem igualmente ser ativados com 1,3-bis(2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4- ilmetil) carbodiimida (BDDC) e acoplados diretamente com ácidos carboxílicos; veja Hand- book of Reagents for Organic Synthesis, Reagents for Glycoside, Nucleotide, and Peptide synthesis, Ed. David Crich, Wiley, 2005 ρ 107-108 e referências nos mesmos).
Exemplo 11: Esteres de C16-n-Polimero A carboxil substituídos.
Polímeros substituídos por ácido carboxílico são usados para anexar Iigandos tendo grupos amino reativos usando metodologias de formação de ligação de peptídeo padrão (por exemplo, via reagentes de carbodiimida) para ligar os grupos amino à funcionalidade de ácido carboxílico do polímero. Estes materiais são prontamente obtidos por esterificação de grupos hidroxila do polímero π com anidridos cíclicos. Por exemplo, dimaleato de 016-π- Polímero A foi preparado reagindo o anidrido maléico com grupos hidroxila do 016-π- Polímero como a seguir:
C16-7t-Polímero A (2g) e anidrido maléico (0,85 g) foram moídos em um pilão seco
e transferidos a um frasco de fundo redondo de 50 ml_. O frasco foi aquecido a 90°C, sob argônio, por 2-3 horas com agitação. A mistura de reação sólida foi, então, moída e trans- formada em pasta com água e a mistura foi transferida a um saco de diálise (interrupção a 3,5 kDa). A mistura foi dialisada contra água para remover o ácido maléico em excesso e subprodutos de baixo peso molecular e o retentado foi removido do saco e secado a 60°C até peso constante para dar dimaleato de C1 β-π-Polímero A (1,79g). A razão de Polímero A para anidrido maléico pode ser variada para obter substituições variando de 0 a 100% da esterificação estequiométrica cheia.
Exemplo 11a: Diglicolato de C16-n-Polimero A C16-K-Polímero A (2g) e anidrido de ácido diglicólico (1,0g) foram reagidos pelo
método do Exemplo 11 acima, para dar diglicolato de C16-w-Polímero A. Como com o ani- drido maléico, a razão de Polímero A para anidrido pode ser variada para obter substituições variando de 0 a 100% de esterificação estequiométrica cheia.
Exemplo 11b: Bis(aconitato) de C16-w-Polimero A C16-w-Polímero A (2g) e anidrido de ácido aconítico (1,35g) foram reagidos pelo
método do Exemplo 11 acima, para dar bis(aconitato) de C16-w-Polímero A.
De uma maneira similar, os seguintes anidridos são acoplados ao C16-w-Polímero A. Quando usar anidridos de baixa solubilidade, o pH pode ser ajustado para entre 4,5 e 6,5 antes da diálise como um auxílio a purificação. Uma segunda diálise contra HCI 0,1 N pro- porciona a forma ácida do polímero, se desejado.
Exemplo 11c: anidrido succínico.
Exemplo 11 d: anidrido glutárico.
Exemplo 11e: anidrido ftálico.
A ligação dupla reativa introduzida pela esterificação com anidrido maléico ou cis- acotínico também pode ser usada para adicionar Iigandos contendo tiol ao polímero, como descrito no Exemplo 12 abaixo.
Exemplo 12: Aduto de Cisteina de Dimaleato de 016-π Polímero A:
Dimaleato de C16-7i-Polímero A em pó (Exemplo 11) (253mg) foi adicionado a água (5 ml_) e a mistura foi agitada vigorosamente. Cisteína (24mg) e TEMED (30,5μΙ) foram adi- cionados à mistura de reação, e a mistura foi agitada a temperatura ambiente sob uma at- mosfera de argônio. O progresso da reação foi monitorado por TLC (placas de sílica gel, n- butanol-ácido acético-água, 3:1:1) com detecção com ninhidrina. A mistura de reação mos- 10
15
20
trou uma mancha positiva a ninhidrina co-migrando com o polímero. Cisteína também deu uma mancha positiva a ninhidrina, ao passo que o polímero de partida não deu nenhuma cor com ninhidrina.
O método descrito acima foi usado para introduzir grupos carboxila adicionais para uso como pontos de anexação, usando tióis tendo múltiplos substituintes carboxila. Por e- xemplo, ácido mercaptossuccínico foi adicionado aos seguintes diésteres C16-7i-Polímero A.
Exemplo 12a: dimaleato de C16-7t-Polímero A.
Exemplo 12b: dicrilato de C16-7i-Polímero A.
Exemplo 12c: (bis)aconitrato de C16-7t-Polímero A.
Exemplo 12c
De uma maneira similar, ácido 3-mercaptoglutárico é adicionado aos seguintes di- ésteres de C16-7i-Polímero A:
Exemplo 12d: dimaleato de C16-7i-Polímero A.
Exemplo 12e: diacrilato de C16-7i-Polímero A.
Exemplo 12f: (bis)aconitato de C16-7i-Polímero A.
3. Uso de Polímeros π para Solubilizar Substâncias Insolúveis ou Fracamente Solú- veis
Exemplo 1: Solubilização de Tinturas
Λ alíquotas de 1,0 ml de uma solução aquosa 50mg/ml de polímero PEG1500-CO- succinil-DTT-bis-C16-amida (C16-Polímero A, Exemplo 1), centrifugadas para remover ma- teriais insolúveis, porém, não de outra maneira purificados, foram adicionadas quantidades em excesso das tinturas Eosina Y, diclorofluoresceína e Sudan IV, em recipientes separa- dos (FlexExcel™ barcos de pesagem de polipropileno claro, tamanho WB2.5, produto de AIIExceI, Inc., West Haven, CT), e os componentes foram agitados juntos para formar uma pasta. O fundo do recipiente foi unido, então, ao fundo de um pequeno banho limpador ultra- sônico de jóias usando uma fita dupla adesiva resistente à água. Apenas bastante água foi adicionada ao banho para imergir o barco de pesagem a aproximadamente 1/3 de altura. O ultra-som foi executado por 15 minutos em etapas de 5 minutos. Os líquidos foram transferi- dos para tubos de centrífuga e centrifugados duas vezes por 30 min. em uma centrífuga de topo de bancada para granular para fora a tintura não dissolvida. Os sobrenadantes foram transferidos para tubos limpos e centrifugados outra vez para remover sólidos arrastados. Suspensões das mesmas quantidades de tinturas na mesma quantidade de água destilada que a quantidade de solução de polímero foram tratadas da mesma forma, como controle. As soluções resultantes foram manchadas (25 μΙ) em placas TLC para formar círculos das gotas. As intensidades dos pontos foram comparadas com os pontos feitos de padrões de soluções de tintura feitas em etanol/água para determinar concentrações aproximadas; os pontos são mostrados na Figura 1. As solubilidades das tinturas na água foram determina- das dissolvendo uma quantidade apropriada da tintura em 1 I ou mais de água deionizada (não tamponada) à temperatura ambiente e adicionando (isto é, titulando) mais água como necessário para obter soluções saturadas. A concentração de Sudan IV em polímero de 50 mg/ml foi de aproximadamente 0,2
mg/ml, em contraste com 0,000 mg/ml em H2O (Sudan IV é insolúvel no pH neutro). A con- centração de diclorofluoresceína era aproximadamente de 5 mg/ml em polímero de 50 mg/ml, em contraste com 0,010 mg/ml em H2O. A concentração de Eosina Y em polímero de 50 mg/ml era aproximadamente de 5 mg/ml, em contraste com 0,007 mg/ml em H2O. As relações de carga útil (quantidade de droga por quantidade unitária de polímero, g/g) foram calculadas para serem aproximadamente 1:250 para Sudan IV, 1:10 para diclorofluoresceí- na e 1:10 para Eosina Y.
As relações de carga útil de 1:10 para os compostos polares que se assemelham a substâncias farmaceuticamente ativas em propriedades físico-químicas são mais elevadas do que aquelas geralmente atingíveis com lipossomas, ciclodextrinas, Cremophor™ ou de- tergente ou outros sistemas de solubilização. Eosina Y é um gerador fotoativável de oxigê- nio único com uma eficiência muito elevada e tais soluções concentradas de Eosina Y como são feitas com o polímero do Exemplo 1 podem ser consideradas farmacologicamente ati- vas como agentes citotóxicos fotoativáveis. A mudança no espectro de fluorescência de diclorofluoresceína na solução de po-
límero (amarelo avermelhado/laranja) sobre aquele na água (amarelo esverdeado) era visu- almente visível e dá uma indicação que a tintura não está em um ambiente aquoso, mas está encapsulada no ambiente orgânico dos núcleos de partículas de polímero automonta- do. Certamente, mudanças em espectros de fluorescência foram usadas como um método de determinar mudanças na polaridade do microambiente (por exemplo, "sondas de lipí- deos"). A cor da solução de Sudan IV no polímero era marrom avermelhada, ao contrário do vermelho em solução de etanol e pó marrom quando suspensa em água. A Eosina Y não mostrou um deslocamento visual significativo (cor-de-rosa na água à cor-de-rosa averme- lhada na solução do polímero).
Exemplo 2: Solubilização de substâncias medicamente relevantes
Purpurina Anfotericina B, Camptotecina e Doxorubicina foram selecionadas como ingredientes farmacêuticos ativos escassamente solúveis representativos (API). A anfoteri- cina B é usada em uma formulação Iipossomal como um antifungo injetável, enquanto Camptotecina e Doxorubieina são agentes anticancerosos. Purpurina é uma tintura interca- Iante de DNA com utilidade farmacêutica potencial e a Eosina Y é um reagente de oxigênio único fotossensível com uso potencial em terapia fotodinâmica. Cada API foi solubilizado em água com C16-/r-Polímero A, C18-/T-Polímero B e/ou conjugado C16-/7-Polímero A-ácido fólico (veja abaixo). A solubilização foi demonstrada manchando o API solubilizado e os con- troles não-solubilizados em placas de TLC, como descrito acima para as tinturas.
Os polímeros secados foram reconstituídos com água, com aquecimento, agitação, e ultra-som como necessário. Quando a solução era viscosa demais, ela foi diluída. C16-77- Polímero A foi usado a 10% p/v, C16-77-Polímero A com ácido fólico foi usado a 5% p/v e C18-77-Polímero B foi usado a 2% p/v.
A substância da droga (20 mg) foi adicionada diretamente a 1 ml de solução de po- límero, resultando em razões de massa polímero:API de 5:1 para C16-/7-Polímero A, 2,5:1 para C16-/r-Polímero A com ácido fólico e 1:1 para C18-77-Polímero B, exceção para doxo- rubicina (veja abaixo). As misturas passaram por ultra-som por 1 hora a baixa energia e, então, centrifugadas duas vezes a 2000 xg para remover sólidos não dissolvidos. A quanti- dade de sólidos granulados não foi significativa.
Cloridrato de doxorubicina foi combinado com os polímeros como acima em uma razão de massa de 10:1 C16-/r-Polímero A para cloridrato de doxorubicina ou a uma razão de massa de 5:1 C16-/7-Polímero A com ácido fólico para doxorubicina, seguido pela adição de acetato de sódio 3M suficiente para neutralizar o cloridrato de doxorubicina. As misturas foram agitadas vigorosamente por 24 horas e, então, centrifugadas duas vezes a 2000 xg para remover os sólidos não dissolvidos. A quantidade de sólidos granulados não foi signifi- cativa.
As razões de massa de APIs solubilizados para polímero são mostradas na Tabela
1. Nenhuma tentativa foi feita para maximizar o carregamento de polímero, conseqüente- mente, estas razões representam limites inferiores na quantidade de API que os polímeros são capazes de carregar para a solução.
Uma amostra de 50 μΙ de cada solução foi manchada em uma placa de TLC de síli- ca gel Bakerflex™ e deixada espalhar. A solução aquosa forma um limite exterior do círculo e um círculo interno é formado pela migração do polímero com material encapsulado. Em todos os casos, havia muito pouco API muito pequeno na franja periférica da zona somente aquosa, indicando solubilização bem sucedida e escapamento mínimo do material encapsu- lado.
Tabela 1: Solubilização de APIs Razões de Massa Polímero:Substrato
C16-77-Polímero A C16-77-Polímero A C18-/7-Polímero A
10% p/v
com ácido fólico 5% 2% p/v p/v
Purpurina Canfotecina Anfotericina B Doxorubicina Eosina Y
5:1 5:1 5:1 10:1
não realizado
não realizado não realizado não realizado não realizado 1:1
2,5:1 2,5:1 2,5:1 5:1
não realizado 4. Biocompatibilidade de Polímeros π
Exemplo 1: Capacidade de adequação a emolientes tópicos, cremes ou pastas Uma cera oleosa concentrada do polímero do Exemplo 1 foi friccionada na pele in- terna do pulso pelo inventor e observada quanto a absorção. O material pareceu ser absor- vido similarmente a cremes cerosos farmacológicos, com amaciamento ligeiro da área. Ne- nhuma resposta alérgica imediata ou atrasada, tal como vermelhidão, prurido ou coceira foi observada em cima desta única aplicação tópica.
Muitos destes polímeros são ceras higroscópicas na temperatura ambiente, com um ponto de fusão esperado de cerca de 45°C a 60°C ou maior, dependendo da composi- ção. Polímeros feitos PEGs de PM inferior podem mesmo ser líquidos na temperatura ambi- ente. Alguns polímeros podem ser sólidos na temperatura ambiente, derretendo na tempera- tura do corpo. Assim, as propriedades destes polímeros π os fazem excelentes substratos para fazer loções, cremes, ungüentos, emolientes e outras formas de liberação, seja por eles mesmos ou em mistura com várias substâncias, incluindo agentes farmacêuticos ativos. Exemplo 2: Capacidade de adequação para administração parenteral Uma solução aquosa do polímero do Exemplo 1 foi preparada*em salina tamponada
com fosfato e filtrada, então, para tubos estéreis através de filtros 0,22 μητι.
Um protocolo de dose tolerada máxima foi empregado, onde camundongos CD-1 foram submetidos a uma dose de 10ml por kg de peso corporal por injeção na veia da cauda de até 5% p/v de solução aquosa do polímero. Os camundongos foram observados por 12 horas continuamente e a cada 2 h depois disso até 48 a 72 horas, dependendo do grupo. Amostras de sangue foram tomadas e analisadas. Alguns camundongos foram sacrificados e examinados primeiramente para a histologia bruta. A histologia microscópica foi executa- da, então, em seções selecionadas.
Nenhuma diferença perceptível foi encontrada na química de sangue entre os ca- mundongos de controle e os camundongos tratados. Nenhuma diferença ou lesão perceptí- vel foi encontrada em comparação com os animais de controle na histologia bruta dos vários órgãos incluindo coração, pulmões, rins, baço, fígado, intestinos, estômago, bexiga, pele, músculos, ossos, cérebro e nodos linfáticos. Espécimes múltiplos de grupos diferentes de animais foram estudados com os mesmos resultados sendo observados. Nenhuma diferen- ça observável foi encontrada na estrutura do tecido celular dos tecidos examinados. Alguns dos rins mostraram certos depósitos que diminuíram com o tempo de exposição ao políme- ro. Isto implica que os depósitos são uma fase provisória e à medida que o tempo passa eles se tornarão normais. Conclui-se que o polímero é seguro para o uso médico como um agente farmacêu-
tico em preparações injetáveis e em outras formulações parenteral. É razoável esperar que o polímero é seguro em soluções orais, capsúlas e comprimidos, spray nasal, aerossóis o- rais/brônquicos, sublinguais, creme/loção/emplastro para pele, colírio, outras rotas tópicas e outras rotas de administração. 5. Anexação de Frações Alvo a Polímeros π
Exemplo 1: Anexação de galactosamina a C-16-K-Polímero B via formação de liga- ção amida.
Galactosamina (GA) objetiva o receptor de asialoglicoproteina hepática (ASGPR) e polímeros que carregam galactosamina covalentemente ligada são liberados para o fígado; veja L. Seymour et al., "Hepatic Drug Targeting: Phase I Evaluation of Polymer-Bound Doxo- rubicin" J. Clin. Oncology, 20(6): 1668-1676 (2002) e referências no mesmo.
C16-7i-Polímero B (Exemplo 10 na seção de método sintético acima) (461 mg, 0,2 mmoles de equivalente COOH por unidade de repetição) foi dispersado em 14 mL de água, e a esta dispersão foi adicionado EDC HCI (0,485 mmoles) e N-hidroxisuccinimida (0,464 mmoles). A mistura foi agitada na temperatura ambiente por 15 minutos e uma solução de galactosamina HC1 (0,386 mmoles) e TEMED (0,387 mmols) em 1 ml de água foi adiciona- da. A solução foi agitada e a reação foi seguida por TLC em sílica gel e revelação em 1- butanol-ácido acético-água (3:1:1). Um montante suplementar de TEMED (0,079 mmoles), NHS (0,078 mmoles) e EDC HC1 (0,193 mmoles) foi adicionado para forçar a reação à con- clusão. Quando a TLC mostrou um de estado estacionário no que diz respeito ao consumo de GA, a mistura de reação foi dialisada (membrana de interrupção de 3500 Da) contra 3 χ 1000 ml de água deionizada para remover os reagentes de peso molecular baixo e subpro- dutos. O retentado foi removido e secado a 60°C até peso constante (348 mg).
A TLC do produto não mostrou nenhuma GA livre (ninhidrina negativa). Uma amos- tra do produto foi hidrolisada com HCI 6N a 100°C para hidrolisar a ligação GA. A análise da TLC mostrou a presença de GA (ninhidrina positiva) na mesmo Rf que a GA de referência.
Exemplo 2: Anexação de ácido fólico a C18-n-Polímero A BDDC (2,44 g, 8,56 mmoles) foi pesado em um frasco de fundo redondo de 125 mL lavado com argônio (BDDC é muito viscoso com consistência similar a mel e difícil de mani- pular). C18-7i-Polímero A (10 g, 4,28 mmoles) foi adicionado ao frasco, a mistura foi aqueci- da até 70°C e os reagentes foram agitados junto por aproximadamente 30 minutos. Ácido Fólico (3 g) foi adicionado seguido por suficiente THF para tornar a agitação possível. Os reagentes foram agitados a 40-70°C durante a noite, protegidos da umidade. O THF foi permitido, então, evaporar e água (80 mL) foi adicionada e a mistura foi agitada a 50°C para um adicional de 2 h. Após esfriar até a temperatura ambiente, a mistura foi transferida a uma seção de tubulação de diálise com uma interrupção de 3500 Daltons e dialisada contra HCI 0,1 N (2 χ 2000 ml), água (2000 ml), carbonato de sódio 5% (2 χ 2000 ml) e água (4 χ 2000 ml), para remover reagentes não reagidos e subprodutos. O retentado amarelo-laranja bri- lhante foi removido. Uma parcela foi evaporada até peso constante para determinar a con- centração de sólidos e foi usada para as experiências de solubilização descritas acima.
Exemplo 3: Anexação de Ácido N-acetil neuramínico (NANA) ao C16-K-Po!ímero B Derivados de ácido neuramínico são esperados serem frações alvo para vírus da
gripe por causa das proteínas de revestimento hemaglutinina e neuraminidase, ambas são conhecidas por ligar ao ácido siálico. Vários métodos para acoplar NANA e seus derivados aos polímeros π da invenção foram desenvolvidos.
Exemplo 3a: Anexação de ácido N-acetil neuramínico (NANA) ao C16-n-PolímeroA via esterificação
BDDC (2,44 g, 8,56 mmoles) e C18-7i-Polímero A (10 g, 4,28 mmoles) são combi- nados e aquecidos até 70°C e agitados juntos sob argônio por aproximadamente 30 minu- tos. Ácido N-acetil neuramínico (3 g) é adicionado, seguido por THF como necessário para manter a fluidez. Os reagentes são agitados a 40-70°C durante a noite, protegidos da umi- dade. Água (80 mL) é adicionada e a mistura é agitada a 50°C por um adicional de 2 h. A- pós esfriar até a temperatura ambiente, a mistura é dialisada contra HCI 0,1 N, NaHC03 5% e água (2 χ 2000 ml cada) com uma membrana de interrupção de 3,5 kDa. Marcação em uma placa de TLC de sílica gel e visualização com orcinol 0,2% em ácido sulfúrico 70% a 130°C mostra modalidade de ácido neuramínico no polímero. Exemplo 3b: ASnexação de monomaleato de ácido N-acetil neuramínico (NANA) a
C1 β-π-Polímero A.
Ácido 5-N-Acetilneuramínico (NANA) (0,86 mmol), anidrido maléico (0,93 mmol) e trietilamina (1,77 mmoles) foram dissolvidos em 1,5 mL DMSO em um frasco de fundo re- dondo seco. O frasco foi lavado com argônio e colocado em um banho de óleo. A mistura foi agitada a 65°C a 85°C e o progresso foi verificado por TLC em placas de sílica (i-PrOH- EtOAc-água, 4:3:2) até a reação estar completa (ausência de NANA, detecção com orci- nol/H2S04 ou uréia/reagente HCI). A mistura de reação foi esfriada até a temperatura ambi- ente e água foi adicionada para hidrolisar o excesso de anidrido maléico. A solução resultan- te de monomaleato de NANA foi usada diretamente em reações subseqüentes.
Uma solução aquosa de diglicolato de C16-7r-Polímero A (ver "Síntese de polímeros π", exemplo 11a) (1,23 mmoles de unidades de repetição, 2,46 mmoles COOH) foi ajustada para pH 4,5-6,5. Carbodiimida (EDC HCI, 3,86 mmoles) e N-hidroxisuccinimida (2,6 mmoles) foram adicionados e a mistura agitada a temperatura ambiente por cerca de 60 minutos. Uma solução de monomaleato de NANA (2,49 mmoles), preparada como descrito acima, foi adicionada e o pH foi ajustado com TEMED para pH 6-7. A agitação foi continuada a tempe- ratura ambiente por até 26 horas. O produto foi purificado por diálise, primeiro contra acetato de sódio 20 mmolar, pH 4,5, então, contra água. O retentato foi removido e armazenado para uso.
Exemplo 3c: Anexação de ácido N-acetil neuramínico a C16-K-Poiímero A via um espaçador.
Cloridrato de cisteamina (2-aminoetanotiol) (0,93 mmol em água) foi adicionado a uma quantidade equimolar de monomaleato de NANA (solução preparada como descrito acima), seguido por uma quantidade equimolar de TEMED para facilitar a adição de tiol à ligação dupla. A reação foi seguida por TLC em sílica (i-PrOH-EtOAc-água, 4:3:2) até a rea- ção estar concluída (ausência de O-maleoil-NANA, detecção com reagente orcinol/H2S04 ou uréia/HCI) para dar fração alvo D.
B
Pelo mesmo método, ácido 5-N-ACetil-2,3-dehidro-2-deoxineuramínico (DANA) foi
1 Pelo mesmo método, cisteína e glutationa são adicionadas aos monoésteres de á- cido maléico de NANA e DANA.
Pelo mesmo método descrito no exemplo 3b acima, o conjugado de mercaptosuc- cinato de bis(aconitato)C16-n-Polímero A foi aminado com a fração alvo D. Este polímero continha até 8 grupos -COOH por unidade de repetição (ver "Síntese de polímeros π", e- xemplo 12c).
Exemplo 3d: Anexação de ácido N-acetil neuramínico (NANA) ao C16-n-Poíímero A via um espaçador.
Pelo método descrito acima, a fração alvo E foi conjugada ao diglicolato de 016-π- Polímero A (ver "Síntese de polímeros π", exemplo 11 a).
Exemplo 3e: Anexação ácido neuramínico β-metilglicosídeo (MNA) a 016-π- Poiímeros.
Polímero tendo na média uma única carboxila por unidade de repetição (0,396 mmol) foi dissolvido em água e deixado reagir com NHS (0,4 mmol) e EDC.HCI (0,64 mmol). Ácido neuramínico-p-metilglicosídeo (MNA) (0,42 mmol) foi adicionado. A mistura de reação foi agitada a temperatura ambiente (25-30°C) por 18 a 24 horas e, então, purificada por diá- lise.
Exemplo 3f: Uma segunda amostra de diglicolato de C16-u-Polímero A tendo dois grupos carboxila por unidade de repetição também foi conjugada com MNA da mesma ma- neira.
Exemplo 3g: Anexação de ácido β-Ο-metil neuramínico (MNA) a C16-K-PoHmero B.
C16-7i-Polímero B, 43 micromoles COOH base em 1 ml de água e β-metil glicosí- deo de ácido neuramínico (Toronto Research Chemicals), 40 micromoles, foram misturados juntos e 40 micromoles de NHS em 0,1 ml de água foram adicionados, seguidos de 40 mi- cromoles de cloridrato de EDC em 0,1 ml de água. A mistura de reação foi agitada na tem- peratura ambiente por 48 horas e analisada por TLC em sílica gel com isopropanol-etil ace- tato-água (4:3:2). A deteção com orcinol 0,2% em ácido sulfúrico 70% a 130°C não gera uma reação de cor com o polímero de partida, mas a TLC da mistura de reação deu um ponto roxo co-migrando com o polímero. Todos os conjugados de polímero nos exemplos acima (3a-3g) mostram uma ração
positiva após a diálise para a presença de ácido neuramínico quando visualizados com orci- nol/ácido sulfúrico ou uréia/reagente HCI em TLC.
Exemplo 4: Anexação de zanamivir a C16-n-Polímero B.
Zanamivir (GG167) é um inibidor potencial de neuraminidase viral e os polímeros que carregam esta molécula como um ligando multivalente são inibidores da replicação do vírus da gripe.
C16-7i-Polímero B (920 mg) é dispersado em 30 mL de água e a este é adicionado EDC HC1 (1,2 mmoles) e N-hidroxissuccinimida (1,1 mmoles). A mistura é agitada na tem- peratura ambiente por 20 minutos e uma solução do sal de ácido trifluoroacético de 5- acetamido-7-(6'-aminohexil)-carbamiloxi-4-guanidino-2,3,4,5-tetradeoxi-D-glicero-D-galacto- non-2-enopiranosônico ácido (patentes US 6.242.582 e 6.680.054) (0,39 g, 0,67 mmol) e TEMED (0,67 mmol) em 1 ml de água é adicionado. A solução é agitada na temperatura ambiente e a reação é seguida por TLC. A mistura de reação é dialisada (membrana de in- terrupção de 3500 kDa) contra a 3 χ 1000 ml de água deionizada para remover os reagentes de baixo peso molecular e subprodutos. O retentado é removido e secado a 60°C até peso constante. O nível de modalidade de açúcar pode ser determinado por um ensaio colorimé- tricô para o grupo guanidina (Can. J. Chem., 36:1541 (1958)). Um ensaio de neuraminidase pode ser realizado depois do procedimento de Potier et al., Anal. Biochem., 29 287 (1979).
Exemplo 5: Anexação de Mimosina
Diglicolato de C16-7>Polímero A (ver "Síntese de polímeros π", exemplo 11a) como uma solução 4,5% p/v (1 mmol unidades de repetição, cerca de 2 mmoles em grupos COOH) foi reagido com NHS (2,27 mmol) e EDC.HCI (2,23 mmoles) e à mistura resultante uma solução de 1-mimosina (2,14 mmol, preparada em 5-ml de água e pH ajustado com TEMED para aumentar a solubilidade) foi adicionada e agitada a temperatura ambiente e pH de cerca de 6,8-7 por carca de 22 a 24 horas. O pH foi ajustado para 3 a 4 com HCL 6N, a mistura agitada por 15 a 30 minutos e o pH elevado para 6,1 por adição de TEMED. A mis- tura foi, então, dialisada (3,5 kD de interrupção) contra água para remover impurezas e pro- dutos de baixo peso molecular.
Exemplo 6: Anexação de peptídeos e proteínas a Dimaleato e Diacrilato de π- Polímero A
Procedimento Geral para fragmentos Fab: ligações bissulfeto em fragmentos F(ab')2 de anticorpo são reduzidos com Gel Redutor de Bissulfeto TCEP (Pierce, Produto #0077712) usando o protocolo do fabricante; ou alternativamente com DTT ou TCEP em solução, os reagentes gastos sendo removidos por ultrafiltração usando filtros de 30 kD. Os fragmentosF(ab')2 reduzidos contendo os grupos sulfidril livres são, então, reagidos com dimaleato ou diacrilato de π-polímero A na presença de TEMED. Procedimento Geral para Cisteína e peptídeos contendo cisteína: o éster de acrilato
ou maleato de um π-polímero A é reagido com resíduos de cisteína usando trietilamina co- mo catalisador. A uma suspensão de diacrilato de polímero (0,3 mmol unidades de repeti- ção, 0,6 mmol de acrilatos) em água foi adicionada cisteína (0,66 mmol) e trietilamina (1,32 mmoles). O frasco foi lavado com argônio e agitado a temperatura ambiente durante a noite (cerca de 18 horas). TLC da mistura de reação em sílica (i-PrOH-Etil acetato-água, 4:3:2) mostrou a ausência de cisteína e uma mancha positiva a ninhidrina para o polímero, indi- cando adição de cisteína às ligações duplas de acrilato. Exemplo 6a: Anexação de fragmentos de anticorpo anti-raiva a Diglicolato de C16- π-Polímero A.
Dimaleato de C16u-Polímero Afoi preparado começando com PEG de peso mole- cular 4500. Imunoglobina de raiva humana (hlgG) BayRab™ foi tratada com pepsina da ma- neira usual em um tampão de pH acídico para gerar o fragmento F(ab')2 que foi purificado por ultrafiltração usando filtros de 50 kD. O fragmento F(ab')2 foi acoplado ao PEG 4500 diglicolato de C16K-Polímero A pelo método EDC descrito no Exemplo 5 acima.
Exemplo 6b: Anexação de fragmentos de anticorpo anti-raiva a Dimaleato de C16- π-Polimero A.
Os fragmentos F(ab')2 de BayRab™ hlgG (ver exemplo 6a) foram reduzidos com
DTT (ou alternativamente TCEP) e o reagente gasto foi removido por ultrafiltração usando filtros de 30 kD. Os fragmentos Fab'-SH foram acoplados ao PEG 4500 dimaleato de 016π- Polímero A pela adição do tiol livre à ligação dupla de ácido maléico a pH 7-8,3 (TEMED). Os conjugados foram purificados por ultrafiltração usando filtros de 100 kD para remover contaminantes de baixo peso molecular.
Exemplo 6c: PEG 8500 dimaleato de C16^Polímero A foi conjugado a fragmento F(ab')2 reduzido de hlgG BayRab™ como descrito acima.
Exemplo 6d: Anexação de Peptídeos a Dimaleato de C16w-Polimero A
O peptídeo KDYRGWKHWVYYTC ("Rab1") foi relatado como ligando ao vírus da Raiva (T.L. Lentz, 1990, J. Mol. Recognition, 3(2):82-88). O terminal Cis deste peptídeo foi usado para sintetizar um conjugado Peptídeo Anti Raiva-n-Polímero A. O dimaleato de C16u-Polímero A (duas frações de ácido maléico por unidade de repetição) derivado de PEG 1500 (0,157 mmol) foi dissolvido em água (6 ml_) e o pH da solução foi ajustado para cerca de 8 com TEMED. O peptídeo (0,157 mmol) dissolvido em DMF (3,1 ml) foi adicionado e a mistura de reação foi agitada a temperatura ambiente sob argônio enquanto o pH da reação era mantido entre 8 e 8,3. O progresso da reação foi verificado testando a mistura de reação com reagente de Ellman. Após cerca de 45 horas, o teste de Ellman foi quase signi- ficativo. Água foi adicionada para abaixar a concentração de DMF e a mistura de reação foi centrifugada para remover uma pequena quantidade de precipitado. O sobrenadante claro foi ultrafiltrado através de uma unidade de filtro centrífugo de 10 kD (Amicon Ultra 10 kD, cat #UFC901024) e o retentado lavado com água repetidamente para remover contaminantes de baixo peso molecular.
Os três seguintes peptídeos (O = ornitina; NH2 designa uma amida de terminal C) foram preparados por síntese de fase sólida automática e conjugados ao PEG 1500 dimale- ato de π-polímero A da mesma maneira que o peptídeo Rab 1:
Exemplo 6d: KDYRGWKOWVYYTC ("Rab2").
Exemplo 6e: KGWKHWVYC(NH2) ("Rab3") Exemplo 6f: KGWKOWVYC(NH2) ("Rab4")
6.Atividade antiviral de π-polímeros
Exemplo 1: Eficácia contra influenza.
Vírus de gripe Humana ATCC VR-1520 (H2NA) foi usado em um ensaio de prote- ção de camundongo. Uma única injeção na veia da cauda, 200 ^/20g PC levou a 99,5% de infecção letal em animais de controle (7 dias de sobrevivência não tratada).
Dez camundongos estavam em cada grupo. Os camundongos foram injetados na veia da cauda com 200 μΙ/20 g de massa corporal com uma dose baixa (0,0375%) e uma dose alta (0,15%) de solução de conjugado de π-polímero B-MNA do Exemplo 3 acima. A- nimais pós tratados foram dosados 24 horas após infecção, enquanto os animais pré- tratados foram dosados 6 horas antes da infecção. Animais de controle positivo foram inje- tados com uma quantidade equivalente de ligando livre, enquanto os controles negativos receberam uma injeção de tampão de salina.
O tempo de sobrevivência foi usado como o ponto final de eficácia de índice. O pe- so corporal foi rastreado como um parâmetro de estudo. Histologia de órgãos internos foi conduzida tanto em exame bruto como em exame microscópico. Os resultados estão mos- trados na Figura 2.
O aumento no tempo de sobrevivência foi de 5,93 horas (+/- 0,48h DP) para o gru- po de tratamento de dose alta em comparação com apenas 2,94 horas (+/- 0,75h DP) para o controle positivo (Figs. 1 e 2). Com base na massa de ligando, o tratamento com dose alta corresponde a, no máximo, 0,03% do ligando, supondo a razão máxima de substituição po- límero-conjugado de 0,2 p/p. Dessa forma, o conjugado de polímero mostrou um nível de eficácia significativamente alto em comparação com o controle de ligando não conjugado.
A histologia bruta assim como o exame microscópico de alguns camundongos no grupo de tratamento de conjugado polímero B-MNA de dose alta mostraram padrões nor- mais, exceto que em seções de medula óssea os camundongos tratados mostraram níveis ligeiramente reduzidos de células brancas, o que pode ser atribuído aos efeitos da infecção por gripe. A perda de peso corporal em grupos de proteção (dose alta - 8,9%, dose baixa - 6,2%) assim como em grupos de tratamento (dose alta - 9,0%, dose baixa - 9,4%) foi me- nor do que no controle positivo (-9,8%) sugerindo uma associação com o próprio ligando ao invés do polímero (Fig. 3). Um pequeno ganho de peso de 0,7% ocorreu em camundongos não tratados.
Exemplo 2: Eficácia contra Raiva.
Grupos de dez camundongos White Swiss, cerca de 20 g cada, sexos misturados, foram empregados em um ensaio de proteção in vivo. Os camundongos foram desafiados por injeção de 3x LD50 de vírus de raiva. As injeções foram de 0,03 ml de cepa de raiva CVS (padrão de vírus de desafio) a uma diluição de 10"6 (100 LD50/ml). Sobrevivência dia a dia, paralisia e massa corporal foram monitorados. Administração intraperitoneal de droga a 25, 48 e 72 horas e administração intracerebral de droga a 25 e 48 horas foram investiga- das. Os resultados são apresentados nas Tabelas 1 e 2. Tabela 1
Experimento Raiva em Camundongos Administração intraperitoneal; número de sobreviventes
Exemplo Dias pós infecção (dose/inj., 1* 2* 3* 4 5 6 7 8 9 10 1 mg) 6a (0,4) 10 10 10 10 10 10 4 1 1 1 0 6b (2,0) 10 10 10 10 10 10 5 3 0 0 6c (2,0) 10 10 10 10 10 10 7 1 0 0 6d (2,1) 10 10 10 1 10 10 5 1 1 1 0 6e (2,4) 10 10 10 10 10 10 5 0 0 6f (3,0) 10 10 10 10 10 10 5 1 1 1 0 6g (2,6) 10 10 10 10 10 10 4 0 0 Peptídeo 10 10 10 10 10 10 7 2 0 0 Rab 1 (0,5) Peptídeo 10 10 10 10 10 10 5 3 1 1 0 Rab 2 (0,5) Peptídeo 10 10 10 10 10 10 5 1 0 0 Rab 3 (0,5) Peptídeo 10 10 10 10 10 10 3 0 0 Rab 4 (0,5) 6d (1,0) 10 10 10 10 10 10 5 1 1 1 0 6e (1,2) 10 10 10 10 10 10 4 1 1 0 0 6f(1,5) 10 10 10 10 10 10 5 0 0 6g(1,3) 10 10 10 10 10 9 4 1 0 0 BayRab™ 10 10 10 10 10 10 5 0 0 (0,4) BayRab™ 10 10 10 10 10 10 6 1 0 0 (2,0) 6b (0,4) 10 10 10 10 10 9 3 0 0 6c (0,4) 10 10 10 10 10 10 4 0 0
Salina 10 10 10 10 10 10 6 2 0 0
Nenhum 10 10 10 10 9 9 5 1 1 1 0
* doses injetadas nos dias 1 a 3. Tabela 2
Administração intracerebral; número de sobreviventes Exemplo Dias pós infecção
(dose/inj., 1* 2* 3* 4 5 6 7 8 9 10 11 mg)
BayRab™ 99999997100 (0,4)
6g (0,4) 10 10 10 10 10 10 7 3 2 2 0 Salina 10 10 10 10 10 10 7 1 1 1 0
* doses injetadas nos dias 1 e 2
S

Claims (20)

1. Polímero tipo colméia, CARACTERIZADO pelo fato de que consiste essencialmente na seguinte estrutura: <formula>formula see original document page 48</formula> compreendendo uma espinha dorsal formada de porções B alternadas de ponto de ramificação e blocos de polímero A solúveis em água, hidrofílicos; e tendo cadeias C laterais hidrofóbicas e Iigandos Z anexados às porções de ponto de ramificação, onde: cada cadeia C lateral hidrofóbica é independentemente selecionada do grupo consistindo em hidrocarbonetos lineares ou ramificados C6-C30 substituídos opcionalmente com um ou mais substituintes hidrofílicos, hidrocarbonetos policíclicos ou cíclicos C6-C30 substituídos opcionalmente com um ou mais substituintes hidrofílicos; e aminoácidos hidrofóbicos, peptídeos e polímeros; cada ligando Z é independentemente um ligando tendo afinidade de ligação específica para a superfície do dito vírus; s é uma ligação ou uma porção espaçadora; o valor de η varia de 3 a aproximadamente 100; o valor médio de ρ varia de mais de um a quatro; e o valor médio de r varia de 1 a 8.
2. Polímero tipo colméia, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um ligando é ácido N-acetil neuramínico ou um derivado do mesmo.
3. Polímero tipo colméia, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito ligando é selecionado do grupo consistindo em ácido N-acetil neuramínico, ácido neuramínico /?-metil glicosídeo, e ácido 4-guanidino-2,4-dideoxi-2,3- dehidro-N-acetilneuramínico.
4. Polímero tipo colméia, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um ligando Z é um anticorpo ou fragmento de anticorpo tendo afinidade de ligação específica para a superfície do dito vírus.
5. Polímero tipo colméia, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito ligando é um fragmento F(ab')2 derivado de imunoglobina IgG de anti- raiva humana.
6. Polímero tipo colméia, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um ligando Z é um peptídeo selecionado do grupo consistindo em KDYRGmHWYYTC, KDYRC WKOWVYYTC, Kgwkhwvyc(Nh2), e kgwkowvyccnh2).
7. Polímero tipo colméia, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, CARACTERIZADO pelo fato de que o bloco de polímero A solúvel em água é selecionado do grupo consistindo em poli (etileno glicol), poli(propileno glicol), poli(etilenoimina), poli (álcool vinílico), poli(vinilpirrolidina), polissacarídeos, e copolímeros do mesmo.
8. Polímero tipo colméia, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o bloco de polímero A é selecionado do grupo consistindo em poli (etileno glicol), poli(propileno glicol), e copolímeros do mesmo.
9. Polímero tipo colméia, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o bloco de polímero A é poli (etileno glicol).
10. Polímero tipo colméia, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o bloco de polímero A tem um comprimento médio dentre 4 e 700 unidades de monômeros.
11. Polímero tipo colméia CARACTERIZADO pelo fato de que o polímero tem a estrutura onde m é 4-700, e Y e Y' são selecionados independentemente do grupo que consiste em R, OR, COOR, SR, NHR, NRR', ONHR, NHOR, NRNH2, NHNHR, NRNHR' e NHNRR', onde ReR' são selecionados independentemente do grupo que consiste nos hidrocarbonetos lineares ou ramificados C6-C30 substituídos opcionalmente com um ou mais substituintes hidrofílicos, hidrocarbonetos policíclicos ou cíclicos C6-C30 substituídos opcionalmente com um ou mais substituintes hidrofílicos; e aminoácidos hidrofóbicos, peptídeos e polímeros.
12. Polímero tipo colméia, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o polímero tem a estrutura <formula>formula see original document page 49</formula> onde m é 4-700, W é O ou NH, e Y e Y' são selecionados independentemente do grupo que consiste em R1 COR, COOR1 CONHR, CONRR', CONHOR, CONRNH2, CONHNHR, CONRNHR', e CONHNRR', onde ReR' são selecionados independentemente do grupo que consiste nos hidrocarbonetos lineares ou ramificados C6-C30 substituídos opcionalmente com um ou mais substituintes hidrofílicos, hidrocarbonetos policíclicos ou cíclicos C6-C30 substituídos opcionalmente com um ou mais substituintes hidrofílicos; e aminoácidos hidrofóbicos, peptídeos e polímeros.
13. Polímero tipo colméia, de acordo com a reivindicação, CARACTERIZADO pelo fato de que o polímero tem a estrutura <formula>formula see original document page 50</formula> onde a porção D é derivada de uma diamina tendo a estrutura geral <formula>formula see original document page 50</formula> onde cada X é independentemente um grupo funcional reativo, ρ é 0-4, e m é 4- 700; e onde ReR' são selecionados independentemente do grupo que consiste nos hidrocarbonetos lineares ou ramificados C6-C30 substituídos opcionalmente com um ou mais substituintes hidrofílicos, hidrocarbonetos policíclicos ou cíclicos C6-C30 substituídos opcionalmente com um ou mais substituintes hidrofílicos; e aminoácidos hidrofóbicos, peptídeos e polímeros.
14. Polímero tipo colméia, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o polímero tem a estrutura <formula>formula see original document page 50</formula> onde m é 4-700, W é O ou NH1 e R e R' são selecionados independentemente do grupo que consiste nos hidrocarbonetos lineares ou ramificados C6-C30 substituídos opcionalmente com um ou mais substituintes hidrofílicos, hidrocarbonetos policíclicos ou cíclicos C6-C30 substituídos opcionalmente com um ou mais substituintes hidrofílicos; e aminoácidos hidrofóbicos, peptídeos e polímeros.
15. Polímero tipo colméia, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o polímero tem a estrutura <formula>formula see original document page 51</formula> onde m é 4-700, L é fenileno, alquileno C2-C6, ou benzenodimetileno, W é O ou NH1 e R e R' são selecionados independentemente do grupo que consiste nos hidrocarbonetos lineares ou ramificados C6-C30 substituídos opcionalmente com um ou mais substituintes hidrofílicos, hidrocarbonetos policíclicos ou cíclicos C6-C3O substituídos opcionalmente com um ou mais substituintes hidrofílicos; e aminoácidos hidrofóbicos, peptídeos e polímeros.
16. Polímero tipo colméia, de acordo com qualquer das reivindicações 1-4, CARACTERIZADO pelo fato de que o vírus é um vírus influenza.
17. Polímero tipo colméia, de acordo com qualquer das reivindicações 4-6, CARACTERIZADO pelo fato de que o vírus é um vírus da raiva.
18. Peptídeo, CARACTERIZADO pelo fato de ser selecionado do grupo consistindo em KDYRGWKOWVYYTC, KGWKHWVYC(NH2), e KGWKOWVYC(NH2).
19. Uso do polímero tipo colméia, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-14, CARACTERIZADO pelo fato de ser na preparação de um medicamento para tratamento ou prevenção de infecção viral.
20. Uso do peptídeo, conforme definido na reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de ser na preparação de um medicamento para tratamento ou prevenção de infecção viral.
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3890410B2 (ja) * 2001-03-27 2007-03-07 独立行政法人農業生物資源研究所 栄養成長特異的プロモーターおよびそれにより得られた遺伝子組換え植物
AP2941A (en) * 2007-07-19 2014-07-31 Allexcel Inc Self-assembling amphiphilic polymers as anticanceragents
US9119866B2 (en) * 2008-04-08 2015-09-01 Huiru Wang Glycan-based drugs, therapies and biomarkers
US8496946B2 (en) 2011-03-10 2013-07-30 International Business Machines Corporation Antimicrobial hydrogels, methods of preparation thereof, and articles therefrom
US9642916B2 (en) 2012-12-12 2017-05-09 The Regents Of The University Of California Porphyrin modified telodendrimers
US9084740B2 (en) 2013-02-19 2015-07-21 Johnson & Johnson Consumer Companies, Inc. Methods and compositions for improving appearance and formation of scar tissue
EP3469706A4 (en) * 2016-06-12 2019-11-27 Array Technologies, Inc. FASTENABLE MOUNTING RAILS, MOUNTING BRACKETS AND METHOD OF MOUNTING SOLAR MODULES
DK3478233T3 (da) * 2016-06-30 2021-08-30 Safkan Inc Bærbar anordning til rensning af ører
JP7102005B2 (ja) 2016-09-15 2022-07-19 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 改善されたハイブリッドテロデンドリマー
US20210330806A1 (en) * 2020-04-23 2021-10-28 Johnson & Johnson Consumer Inc. Methods and compositions inhibiting enveloped viruses using high molecular weight hydrophobically modified alkali swellable emulsion polymers
US20210330701A1 (en) * 2020-04-23 2021-10-28 Johnson & Johnson Consumer Inc. Methods and compositions for inhibiting enveloped viruses using high molecular weight hydrophobically modified alkali swellable emulsion polymers and surfactant
WO2022271183A1 (en) * 2021-06-25 2022-12-29 Allexcel Inc. Self-assembling amphphlic polymers as anti-covid-19 agents

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998026662A1 (en) 1996-12-19 1998-06-25 The Penn State Research Foundation Compounds and methods for treating and preventing bacterial and viral disease
EP1063254A1 (de) * 1999-06-25 2000-12-27 Technische Uni München, Klinikum rechts der Isar, Inst. für Experiment. Onkoligie und Therapieforschung Copolymere für den Transport von Nukleinsäuren in die Zelle
JP5017107B2 (ja) * 2004-07-06 2012-09-05 ワーウィック イフェクト ポリマーズ リミテッド ポリペプチド等と反応し得る官能基を含むリビングラジカル重合開始剤、それを用いて得られる櫛形ポリマー、それから得られるポリペプチド複合体及び薬剤
US8617819B2 (en) * 2004-09-17 2013-12-31 Massachusetts Institute Of Technology Polymers for analyte detection
ES2523431T3 (es) * 2006-01-19 2014-11-25 Allexcel, Inc. Solubilización y suministro dirigido de fármacos con polímeros anfifílicos de autoensamblaje

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Publication number Publication date
CA2676239A1 (en) 2008-07-31
EA200900685A1 (ru) 2010-02-26
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IL198850A (en) 2017-08-31
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