EA026125B1 - Самособирающиеся амфифильные полимеры в качестве противовирусных средств - Google Patents

Самособирающиеся амфифильные полимеры в качестве противовирусных средств Download PDF

Info

Publication number
EA026125B1
EA026125B1 EA200900685A EA200900685A EA026125B1 EA 026125 B1 EA026125 B1 EA 026125B1 EA 200900685 A EA200900685 A EA 200900685A EA 200900685 A EA200900685 A EA 200900685A EA 026125 B1 EA026125 B1 EA 026125B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
polymer
group
comb
optionally substituted
virus
Prior art date
Application number
EA200900685A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200900685A1 (ru
Inventor
Энн Луизе Онтон
Энил Дайвен
Джейант Дж. Тетейк
Original Assignee
Элексел, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Элексел, Инк. filed Critical Элексел, Инк.
Publication of EA200900685A1 publication Critical patent/EA200900685A1/ru
Publication of EA026125B1 publication Critical patent/EA026125B1/ru

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82B—NANOSTRUCTURES FORMED BY MANIPULATION OF INDIVIDUAL ATOMS, MOLECULES, OR LIMITED COLLECTIONS OF ATOMS OR MOLECULES AS DISCRETE UNITS; MANUFACTURE OR TREATMENT THEREOF
    • B82B3/00—Manufacture or treatment of nanostructures by manipulation of individual atoms or molecules, or limited collections of atoms or molecules as discrete units
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/74—Synthetic polymeric materials
    • A61K31/795—Polymers containing sulfur
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds
    • A61K47/551—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds one of the codrug's components being a vitamin, e.g. niacinamide, vitamin B3, cobalamin, vitamin B12, folate, vitamin A or retinoic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6839—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting material from viruses
    • A61K47/6841—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting material from viruses the antibody targeting a RNA virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6907—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a microemulsion, nanoemulsion or micelle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01G—COMPOUNDS CONTAINING METALS NOT COVERED BY SUBCLASSES C01D OR C01F
    • C01G23/00—Compounds of titanium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • General Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Environmental & Geological Engineering (AREA)
  • Geology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Polyethers (AREA)

Abstract

В изобретении представлены амфифильные биоразлагаемые сополимеры, включающие гидрофильный остов с подвесными алифатическими группами как гидрофобный компонент. Полимеры образуют молекулярные скопления наномасштаба в водных средах, имеющие гидрофобные внутренние части, способные солюбилизировать нерастворимые органические соединения и разрушать белки вирусной оболочки. Полимеры содержат ковалентно-присоединенные антитела, лиганды и другие нацеливающие части, которые опосредуют адгезию скопления с вирусной целью.

Description

Область техники
Настоящее изобретение относится к области амфифильных полимеров, а конкретнее к биологически совместимым формирующим мицеллу полимерам гребенчатого типа. Изобретение также относится к области нацеленной доставки лекарств и противовирусных средств.
Предпосылки изобретения
Амфифильные блок-сополимеры, включающие гидрофобный блок и гидрофильный блок, были хорошо изучены в последние годы из-за их способности к самосборке во множество наноструктур при изменении окружающего растворителя (см. Сатегоп е! а1., Сап. 1. СНет./Кеу. Сап. СЫт. 77:1311-1326 (1999). В водных растворах гидрофобный компонент амфифильного полимера имеет тенденцию самособираться, чтобы избежать контакта с водой и минимизировать свободную энергию поверхности раздела фаз системы. В то же самое время гидрофильные блоки формируют гидратированную корону в водной среде, и таким образом скопления поддерживают термодинамически устойчивую структуру. В результате получается устойчивая сходная с латексом коллоидная суспензия частиц скопления полимера, имеющих гидрофобные ядра и гидрофильные короны.
Амфифильные сополимеры гребенчатого типа отличаются от блок-сополимеров тем, что остов является в значительной степени гидрофобным или гидрофильным, а полимерные цепи противоположной полярности свисают с остова, а не включены в него. Сополимеры гребенчатого типа были получены с гидрофобными остовами и гидрофильными ветвями (Мауек е! а1., патент США № 6399700), а также с гидрофильными остовами и гидрофобными ветвями (Уабеткоп е! а1., патент США № 6521736). Первые использовались для обеспечения мультивалентного представления лигандов для рецепторов поверхности клетки, а последние использовались для солюбилизации лекарственных препаратов и доставки их в клетки.
Амфифильные скопления полимера были изучены как носители для солюбилизации нерастворимых лекарственных препаратов, средства нацеленной доставки лекарства и системы доставки генов. Они обладают более устойчивой структурой, чем обычные низкомолекулярные мицеллы благодаря сплетению цепи и/или кристалличности внутренней гидрофобной области. Полимерная природа этой среды делает скопления относительно более стойкими к распаду, чем обычные липосомы, когда разбавление оказывается ниже их критической концентрации мицеллы. Отсутствие двухслойной мембраны позволяет им легче соединяться с мембранами клетки и доставлять полезный груз непосредственно в клетку. Амфифильная природа агрегатов также придает подобные моющим средствам свойства, и соответственно нацеленные агрегаты, по-видимому, способны соединяться с белками вирусной оболочки и разрушать их.
Благодаря отличной биологической совместимости поли(этиленгликоля) (РЕО) и наблюдаемой способности покрытых РЕО хитрых частиц избегать ретикулоэндотелиальной системы, мицеллы, липосомы и полимеры, включающие РЕО, активно рассматриваются как материалы для систем доставки лекарства. Есть много сообщений об использовании поли(этиленгликоля) (РЕО) в качестве гидрофильного компонента РЕО-липидов (образующих липосомы и мицеллы); см., например, Кпкйпабак е! а1, Рйатт. Кек. 20:297-302 (2003). Самособирающиеся амфифильные блок-сополимеры, которые самособираются в более устойчивые полимерсомы, также исследовали в качестве среды для солюбилизации и доставки лекарственного средства (Рйо!ок е! а1., 1. Соп1го11еб Ке1еаке, 90:323-334 (2003)). См. также Оте£ е! а1., 1п!. 8утр. Соп1го11еб Ке1еаке Ма!ег. 20:131 (1993); К\уоп е! а1., Ьапдтшт, 9:945 (1993); КаЬапоу е! а1., 1. Соп1го11еб Ке1еаке, 22:141 (1992); А11еп е! а1., 1. Соп!го11еб Ке1еаке, 63:275 (2000); 1поие е! а1., 1. Соп!го11еб Ке1еаке, 51:221 (1998); Уи апб Е15епЬегд, Масгото1еси1е5, 29:6359 (1996); Ихксйег е! а1., 8с1епее, 284:113 (1999); К1т е! а1., патент США № 6322805; §ео е! а1., патент США № 6616941 и §ео е! а1., Европейский патент № ЕР 0583955. Использование поли(этиленимина) (РЕ1) для этих целей также было описано применительно к доставке олигонуклеотидов (Ыат е! а1., патент США № 6569528; Уадпег е! а1., публикация патентной заявки США № 20040248842). В аналогичном смысле Ьио е! а1. в Масгото1еси1ек 35:3456 (2002) описывают РЕО-конъюгированные полиамидоаминовые (РАМАМ) дендримеры, подходящие для доставки полинуклеотидов.
В дополнение к необходимости в солюбилизации, распространении и доставке препаратов имеется потребность в системах нацеленной доставки лекарственных препаратов в являющуюся мишенью ткань, опухоль или орган. Это обычно достигается путем прикрепления антител или других лигандов с определенной афинностью к клеточным оболочкам на целевом участке. Однако РЕО испытывает недостаток в функциональных группах, кроме концов полимерных цепей, а большинство концевых групп неизбежно занимаются связями с другим компонентом блок-сополимера. По этой причине присоединение нацеливающих частей, таких как антитела или молекулы, приклеивающиеся к клетке, к РЕО блок-сополимерам, обычно ограничено блоком не-РЕО, который, к сожалению, не является частью сополимера, который обычно открыт в короне самособранного скопления.
Явление разделения фаз, приводящее к самосборке блок-сополимеров в полимерные скопления, легко обращается. Были предприняты попытки повысить стабильность скоплений путем поперечного связывания гидрофобного ядра (см. Европейский патент № ЕР 0552802). Также предпринимались попытки ковалентного присоединения лекарственного средства к гидрофобному компоненту блоксополимера (Рагк апб Уоо, патент США № 6623729; Европейский патент № ЕР 0397307).
- 1 026125
Дендритные полимеры легко конъюгируются с нацеливающими частями и также могут использоваться для нацеливания на определенные клетки ίη νίνο (8ίη§Η е! а1. (1994) СНп. СНеш. 40:1845) и блокирования адгезии вирусных и бактериальных патогенов к биологическим субстратам. Гребенчатые разветвленные и дендриграфтные полимеры, конъюгированные с несколькими молекулами сиаловой кислоты, подвергались оценке с целью определения их способности ингибировать гемагглютинации вируса и блокировать инфицирование клеток млекопитающих ίη νίίτο (Кеи1ег е! а1. (1999) В1осоп)и§а!е СНет. 10:271). Самые эффективные вирусные ингибиторы были гребенчатыми разветвленными и дендриграфтными макромолекулами, которые продемонстрировали до 50000-кратное увеличение активности против этих вирусов.
Недавно фармацевтическая компания 8!агрНагта объявила об успешной разработке биоцида на основе дендримера (УщаОе1™ который предотвращает ВИЧ-инфекцию, связываясь с рецепторами на поверхности вируса (На1£огб (2005) СНет. & Епд. \е\\з 83 (24):30). СНеп а! а1. (2000) (Вютасгото1еси1ез. 1:473) сообщили о том, что поли(пропиленимин)овые дендримеры с функциональными группами четвертичного аммония являются очень мощными биоцидами.
Остается необходимость в системе доставки лекарства, которая является устойчивой, биологически совместимой, позволяет присоединять нацеливающие части к внешней стороне скоплений и является эффективной при доставке препаратов к требуемым клеточным мишеням. Также существует потребность в нацеленных противовирусных средствах, устойчивых и биологически совместимых.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение обеспечивает биологически совместимые молекулы полимера гребенчатого типа, включающие гидрофильный остов, имеющий части с точками ветвления, и гидрофобные ветви, присоединенные в этих частях с точками ветвления. Изобретение обеспечивает водные суспензии полимерных скоплений, сформированных из таких полимеров.
Изобретение также предлагает способ лечения или предотвращения инфекции животного вирусом, включающий введение указанному животному полимера гребенчатого типа, имеющего, по существу, следующую структуру:
Структура включает остов, образованный из чередующихся частей с точками ветвления В и гидрофильных водорастворимых полимерных блоков А. Гидрофобные боковые цепочки С и лиганды Ζ прикреплены к частям с точками ветвления. Предпочтительно боковые цепочки С являются неразветвленными или разветвленными углеводородами, необязательно замещенными одним или несколькими гидрофильными заместителями, или С6-С30 циклическими или полициклическими углеводородами, необязательно замещенными одним или несколькими гидрофильными заместителями. Боковые цепочки С могут также быть гидрофобными аминокислотами, пептидами или полимерами. Подходящие гидрофильные заместители для боковых цепочек С: гидроксил, карбоксил и аминогруппы, а также амидные, сульфамидные, сульфоксидные и сульфоновые группы. Предпочтительными гидрофильными заместителями являются полярные апротонные группы, такие как третичный амид, сульфоксид и сульфон.
Лиганды Ζ являются лигандами, имеющими специфическую аффинность связывания с поверхностью вируса. Специфическая аффинность связывания означает, что лиганд способен связываться с поверхностью вируса ίη νίνΌ в присутствии многих поверхностей клеток и макромолекул, находящихся в теле млекопитающего. Группа з является связью или спейсерной частью, и в последнем случае каждая з может нести от 1 до 4 групп Ζ, η принимает значения от 3 до приблизительно 100; среднее значение р составляет от 1 до 2, а среднее значение г - от 1 до 8.
Часть с точками ветвления В является мультивалентной частью, связанной с двумя полимерными блоками А, 1-2 боковыми цепочками С (в среднем) и одним или несколькими спейсерами з и/или лигандами Ζ. В конкретных вариантах осуществления связи с В и/или Ζ осуществлены через множество реакционноспособных функциональных групп, способных служить в качестве точек прикрепления. В особенно предпочтительных вариантах осуществления нацеливающие части, такие как лиганды или антитела, ковалентно присоединены к частям с точками ветвления полимеров согласно изобретению.
Изобретение также предлагает биологически совместимые молекулы полимера гребенчатого типа, как описано выше, которые даже при отсутствии терапевтической малой молекулы обладают присущими антивирусными свойствами. Эта антивирусная активность, по-видимому, вызвана сходными с моющим средством свойствами амфифильных полимеров разрывать внешнюю оболочку вирусных частиц. В предпочтительных вариантах осуществления антивирусная активность усиливается прикреплением нацеливающих частей, обладающих афинностью связывания с поверхностью целевого вириона.
- 2 026125
Изобретение также предлагает способы получения полимеров гребенчатого типа, агрегатов и нацеленных полимерных агрегатов, а также описанных здесь лекарственных комплексов. Полимеры данного изобретения самособираются в полимерные агрегаты, которые эффективно солюбилизируют, распределяют и доставляют лекарственные средства ίη νίνο; обладают противовирусной активностью; являются нетоксичными, биосовместимыми и устойчивыми и способны нести несколько нацеливающих на клетку и вирус частей на своих внешних поверхностях.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 показано влияние введения композиции согласно данному изобретению на среднее время выживания зараженных гриппом мышей.
На фиг. 2 проиллюстрировано увеличение времени выживания зараженных гриппом мышей при лечении их композицией согласно данному изобретению.
На фиг. 3 проиллюстрирована потеря массы тела в течение 7 дней у зараженных гриппом мышей при лечении их композицией согласно данному изобретению.
Подробное описание изобретения
Полимеры согласно изобретению, называемые здесь как π-полимеры, имеют архитектуру гребенчатого типа с остовом, образованным из чередующихся частей с точками ветвления В и гидрофильных водорастворимых полимерных блоков А и имеющим множество гидрофобных боковых цепей С, присоединенных к каждой части с точками ветвления, как отображено формулой 1. Боковые цепочки С являются относительно короткими гидрофобными частями, которые могут быть алифатическими молекулами, цепями или олигомерами. Значение р в идеале является целым числом: 2, 3 или 4. На практике боковые цепочки чаще всего вводятся с менее чем совершенной эффективностью путем химических реакций, приводящих к среднему значению р для полимерного препарата, которое в целом не является требуемым целым числом. Нецелые средние значения также могут быть получены в соответствии с проектом, как описано ниже. Таким образом, среднее значение р у полимеров согласно изобретению больше единицы и может достигать четырех (1 < р<4). В предпочтительных вариантах осуществления р находится в диапазоне от приблизительно 2 до 4 и наиболее предпочтительно 1,5<р<2.
Полимерный блок остова А выбирают из гидрофильных и/или водорастворимых полимерных цепочек, включая без ограничения поли(этиленгликоль), поли(пропиленгликоль), поли(этиленимин), поли(виниловый спирт), поли(винилпирролидон), полисахариды и т. п. Предпочтительно полимерные звенья А являются поли(этиленгликолевыми) цепочками формулы - (СН2СН2О)т-, где т составляет от 1 до 10000, предпочтительно от 3 до 3000.
В производстве поли(этиленгликоля) различных видов в промышленности известно соединение двухвалентной линкерной части (например, бисфенол А диглицидиловый эфир) с двумя поли(этиленгликолевыми) цепочками, эффективно удваивающее молекулярную массу полимера при сохранении относительно узкого диапазона молекулярной массы. Полученные молекулы поли(этиленгликоля) прерываются в середине полимерной цепочки негликолевой линкерной частью (см., например, поли(этиленгликоль)-бисфенол А диглицидилового эфира аддукт, регистрация СА8 № 3722526-6). Высшие олигомеры, т. е. имеющие три цепочки РЕО, разделенные двумя частями бисфенол А диглицидилового эфира, также известны (см., например, международную патентную заявку νθ 00/24008. Таким образом, употребляемые здесь термины поли(этиленгликоль) и поли(пропиленгликоль) охватывают поли(этиленгликоля) и поли(пропиленгликоля) полимерные цепочки, включающие негликолевые линкерные звенья, включая без ограничения бисфенол А диглицидиловый эфир, бисфенол В диглицидиловый эфир, бисфенол 8 диглицидиловый эфир, гидрохинон диглицидиловый эфир и т. п.Для целей данного описания любые такие линкерные части не считаются мономерными звеньями.
Полимерный блок А наиболее предпочтительно имеет среднюю длину от 20 до 50 мономерных звеньев. Цепочки полиэтиленгликоля могут быть замещены на концах функциональными группами, подходящими для использования в качестве линкеров для других частей, включая без ограничения амино, меркапто, акрилат, акриламид, малеат, малеимид и т. п., на одном или обоих концах. Значение η находится в диапазоне от 1 до 1000, предпочтительно от 3 до 100. Полная молекулярная масса π-полимера может находиться в диапазоне от 1000 до 100000 Да или больше; предпочтительно более 2000 Да и более предпочтительно более 7000 Да.
Гидрофобные части С могут быть одинаковыми или различными и могут быть, например, линейными углеводородами (необязательно замещенными одним или несколькими гидрофильными заместителями), полициклическими углеводородами (необязательно замещенными одним или несколькими гидрофильными заместителями), гидрофобными аминокислотами, пептидами и полимерами. Подходящие гидрофильные заместители включают без ограничения гидроксильные, эфирные, циано и амидные функциональные группы. Конкретнее, имеются в виду С8-С20 алкильные группы, несущие ω-гидрокси, ω-циано, ω-амидо или ω-алкокси заместители. В этом контексте термин заместитель включает замещение гетероатомом, таким как О, N или 8, атома углерода в углеводородной цепочке или кольцевой системе части С. Таким образом, эфир и амидные связи и гетероциклические кольца могут быть включены в
- 3 026125
С.
Гидрофобные части С являются предпочтительно относительно короткими (С8-С2о) алифатическими цепочками, но могут также быть короткими олигомерами. Подходящие олигомеры включают олиго гидроксикислоты, такие как поли(гликолевая кислота), поли(БГ-молочная кислота), поли(Ь-молочная кислота) и сополимеры поли(гликолевой кислоты) и поли(молочной кислоты)гидроксикислоты и поли(аминокислоты), поли(ангидриды), поли(ортоэфиры) и поли(фосфоэфиры), полилактоны, такие как поли(эпсилон-капролактон) поли(дельта-валеролактон) поли(гамма-бутиролактон) и поли(бетагидроксибутират). Части С могут также быть выбраны из гидрофобных молекул, таких как холестерин, желчная кислота, литохолевая кислота, гидрофобные пептиды и т. п. Молекулярная масса каждой части С больше 40, предпочтительно от 50 до 1000 и наиболее предпочтительно от 100 до 500. Значение 1одР (октанол-вода) молекулы С-Н превышает примерно 1,4, предпочтительно больше примерно 2,0 и более предпочтительно больше чем приблизительно 2,5. В целом, любая часть С считается подходящей для использования в настоящем изобретении, если молекула С-Н, по существу, не растворима в воде. По существу нерастворимые означает, что жидкие С-Н формируют отдельную фазу при смешивании с водой.
Отличительным признаком гребенчатых полимеров данного изобретения является то, что боковые цепочки С не являются регулярно и равномерно расположенными вдоль полимерной цепочки, а находятся в группах [С]р. Эти группы располагаются более или менее регулярно вдоль полимерной цепочки в зависимости от степени монодисперсности полимерных звеньев А. Таким образом, расстояние между двумя боковыми цепочками С, присоединенными к общей части разветвления В, отличается от расстояния между двумя боковыми цепочками, присоединенными к различным частям разветвления.
Части с точками ветвления В также включают одну или несколько реакционноспособных функциональных групп X, как показано в формуле 2
В формуле 2 отдельные реакционноспособные группы X могут быть одинаковыми или могут отличаться от друг друга и могут необязательно быть заблокированы или защищены, как это может быть необходимо при сборке полимера 2. Среднее значение г будет находиться в диапазоне от 0 до приблизительно 8. Как правило, реакционноспособные группы выбирают из функциональных групп, известных из уровня техники, которые могут использоваться для образования ковалентных связей между молекулярными разновидностями. Группы X служат точками прикрепления для нацеленных на вирус частей. В некоторых вариантах осуществления может быть единственная точка прикрепления X. В других вариантах осуществления может быть три или четыре различных типа реакционноспособных групп. Подходящие реакционноспособные группы X включают без ограничения -ОН, -ΝΗ2, -8Η, -СНО, -ΝΗΝΗ2, -СООН, -ΟΟΝΗΝΗ2, галоацил, ацетоацетил, -ΟΝ, -ΟΟΝ, -8ΟΝ, -ΝΟΟ, -ΝΟ8 и т. п.; реакционноспособные двойные связи, такие как виниловые, акриловые, аллиловые, малеиновые, коричные и т. п., и группы с реакционноспособными тройными связями, такими как ацетиленкарбокси и ацетиленкарбоксамидо (подходят для дополнений Майкла, реакций Дильса-Альдера и реакций добавления свободных радикалов).
Образцы нацеленных на клетки частей включают без ограничения вирусные поверхностные лиганды, такие как сиаловая кислота и производные Ν-ацетилнейраминовой кислоты. Антитела предпочтительно являются моноклональными антителами, направленными на клеточно-специфичные поверхностные антигены; подходящие нацеливающие части включают не только полные антитела, но также и фрагменты антител, содержащие активные антигенсвязывающие последовательности, такие как ГаЪ'2 фрагменты, ГаЪ' фрагменты или короткоцепочечные пептидные аналоги активных антигенсвязывающих последовательностей таких антител.
Примеры нацеливающихся на вирус частей включают лиганды с малыми молекулами, которые связываются с вирусом, такие как аминоалкиладамантаны, Гихеоп™, РКО-542, ВМ8-488043, сиаловая кислота, 2-деокси-2,3-дидегидро-Ы-ацетилнейраминовая кислота, 4-гуанидино-Ыеи5Лс2еп (занамивир), оселтамивир, КУ.1-270201 и т. п.; олигопептиды, олигосахариды и гликопептиды, которые связываются с вирусными поверхностями, антитела и фрагменты антитела, направленные на вирусоспецифические поверхностные антигены. В предпочтительных вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает π-полимеры, несущие лиганды для вирусной нейраминидазы или гемагглютинина. Хорошо известно, что такие полимеры сами по себе обладают антивирусными свойствами (см., например, Т. Мазийа е! а1., Сйеш1са1 & РГагшасеийса1 Ви11е!т 51:1386-98 (2003); М. Ной е! а1., Уио1о§у 212:340-7 (1995) и Кеесе е! а1., патент США № 6680054 (2004).
Часть с точками ветвления В обычно получают из многофункциональной молекулы, имеющей
- 4 026125 множество реакционноспособных групп, две из которых подходят для прикрепления к гидрофильному звену полимера А, и две из которых подходят для прикрепления гидрофобных частей С. Часть В может необязательно иметь дополнительные реакционноспособные группы X, как описано выше.
Особенно предпочтительными частями с точками ветвления являются конъюгаты дитиотреитола (ΌΤΤ), дитиоэритритола (ΌΤΕ) или 2,3-диаминобутан-1,4-дитиола с двумя молекулами малеиновой кислоты. Сочетание этой части с точками ветвления с полиэтиленгликолем в качестве части А создает остов полимера формул 3 и 3 а
где Υ и Υ' могут быть одинаковыми или разными и предпочтительно выбраны из ОН, ΝΗ2, ΟΝΗ2, ΝΗΟΗ и ΝΗΝΗ2. В предпочтительном варианте осуществления гидроксильные или аминогруппы дитиола - это реакционноспособные группы X, служащие точками присоединения для нацеливающих частей или частей лекарственного средства, в то время как функциональные группы Υ и Υ1 служат точками присоединения для частей С. Альтернативно, группы Υ и Υ' могут служить точками присоединения, в то время как гидроксильные или аминогруппы используются для присоединения частей С.
Формулы 3 и 3а предназначены для иллюстрации того, что каждый атом серы может быть независимо присоединен в альфа- или бета-конфигурации к карбонильной группе сложного эфира ΡΕΟ. Изобретение охватывает композиции единственного изомера, а также смеси региоизомеров в одной или обеих С-8 связях. Кроме того, благодаря четырем асимметричным углеродам в формуле 1 изобретение охватывает все хиральные, мезо- и диастереомерные изомеры и их смеси.
Аддукт Дильса-Альдера ацетилен дикарбоновой кислоты и фурана может также служить подходящей частью с точками разветвления. Например, полиэфир 4, полученный из ΡΕΟ и ацетилендикарбоновой кислоты, как известно, вступает в реакции Дильса-Альдера с фуранами (М. Эс1сгЬа с1 а1., Масгото1. РарИ Соттип. 18(8):723-728 (1997)). Таким образом, он может подвергаться реакции Дильса-Альдера с 3,4-дизамещенным фураном с образованием таких соединений, как 5, и полимер 5 может быть изменен гидроксилированием или эпоксидированием с обеспечением реакционноспособных групп (например, X и X' на схеме 1).
Аналогично, реакция РЕС с этилендиаминтетрауксусной кислоты диангидридом дает полиэфир формулы 6
Другие подходящие части с точками разветвления могут быть получены из винно-каменной кислоты, ацетилендикарбоновой кислоты, нитрилотриуксусной кислоты, 3,4,3',4'-дифенил сульфон тетракарбоновой кислоты диангидрида, 3,4,3',4' дифенилового эфира тетракарбоновой кислоты диангидрида, пиромеллитового диангидрида, алкан-дитиолов, таких как 1,2-этандитиол и 1,4-бутандитиол, бис-(2меркаптоэтил)эфир, 2-меркаптоэтилсульфид, димеркаптопропанол, димеркаптопурин, димеркаптотиадиазол, димеркаптоянтарная кислота, бензолдиметантиолы, бензолдитиолы, дигалогенированные бензолдиметантиолы, дигалогенированный 4,4'-тиобисбензолтиол и т. п.
Где Υ и Υ' - ОН, гидрофобные группы С могут быть связаны с полимером путем амидирования или эстерификации групп карбоновых кислот. Гидрофобные группы С являются предпочтительно относительно малыми (С8-С20) и преимущественно углеводородными частями и могут быть линейными или разветвленными или содержать одно или несколько колец. Примеры включают без ограничения ковалентно связанные части, полученные из С-Н молекул, η-октанол, п-деканол, η-додециламин, ппентадециламин, холестерин и холевую кислоту. Хотя полимеры согласно изобретению представлены для удобства как имеющие максимум две различные гидрофобные боковые цепочки, следует понимать, что смеси двух или больше гидрофобных соединений могут использоваться для введения множества гидрофобных боковых цепочек в конкретный полимер.
В качестве конкретного примера полимер формулы 2, где Х=ОН и г=2, был получен путем реакции полиэтиленгликоля с малеиновым ангидридом с образованием полиэфира 7 и последующей реакции с дитиотреитолом с образованием 8. Кислоту 7 затем амидировали η-октадециламином с образованием требуемого гребенчатого полимера 9 (схема 2). ΌΤΤ-производные амидные гребенчатые полимеры, представленные формулой 9, называются здесь π-полимер А; конкретный полимер 9 на схеме 2 называется С18-п-полимер А.
Замещение 2,3-бис-(1-бутоксикарбониламино)бутан-1,4-дитиола (полученного способом ΌιιΡηοβΙ с1 а1., патент США № 4755528) дитиотреитолом после снятия защиты ведет к соответствующему аминофункционализированному π-полимеру 9Ь (схема 3).
- 6 026125
Использование бутандитиола 10с аналогично дает полимеры общей структуры 9с со спейсерными группами Ь на месте для последующего присоединения нацеливающих частей (схема 4). Спейсерные группы Ь могут быть любыми промежуточными группами, известными из уровня техники, для использования в присоединении лигандов или меток к молекулам субстрата, включая без ограничения С2-С20 алкиленовые и олиго(этиленгликолевые) спейсерные группы, имеющие от одного до десяти звеньев -СН2СН2О-.
В других вариантах осуществления РЕС полимер с концевыми аминогруппами может использоваться для получения соединений примеров, имеющих амидные связи между А и В звеньями, как показано в структурах 10-14 ниже. Каждый из этих полиамидов может быть получен посредством реакции РЕС диамина Η2Ν-(ΟΗ2ΟΗ2Θ)0ΟΗ2ΟΗ2-ΝΗ2 с соответствующим циклическим ангидридом:
- 7 026125
При умеренных условиях вышеупомянутые амидокислоты являются ожидаемыми продуктами. После нагревания можно ожидать образования имида, которое дает полимеры с меньшим количеством реакционноспособных групп, которые, однако, все еще подходят для присоединения гидрофобных частей С. Альтернативно, подвесные боковые цепочки С могут быть добавлены к концам блоков полимера А, и части с точками разветвления могут появиться во время полимеризации (схема 5).
В дополнение к простым диаминам, таким как 1,3-диаминопропан, как показано на схеме 5, могут использоваться диамины, имеющие (необязательно маскируемые) реакционноспособные функциональные группы X, приводя к полимерам 15, подходящим для присоединения нацеливающих частей (схема 6). В приведенных ниже формулах р может находиться в диапазоне 0-4, и каждый X независимо является таким же или отличным от любой другой группы X, которая может присутствовать. Реакционноспособная группа X не должна быть подвесной, но может быть, например, группой ΝΗ в цепочке атомов, составляющей диамин, как в мономере Η2Ν-(ΟΗ2)3-ΝΗ-(ΟΗ2)3-ΝΗ2.
- 8 026125
Некоторые π-полимеры, полученные согласно описанным выше способам, имеют реакционноспособные группы X, подходящие для последующей дериватизации для присоединения нацеливающих частей, таких как малые молекулы, пептиды, нуклеотиды, сахары, антитела и т. д., или осуществления поперечного сшивания полимерных цепочек посредством бифункциональных или многофункциональных поперечно-сшивающих агентов. В конкретных вариантах осуществления частичная дериватизация реакционноспособных групп на полимерных цепочках выполняется для получения π-полимеров, имеющих множество различных реакционноспособных групп, которые допускают присоединение множества нацеливающих частей и частей лекарственного средства к единственной полимерной цепочке. Таким образом, добавление субстехиометрического количества акрилоил хлорида (или малеинового ангидрида) к πполимеру примера 1 обеспечит полимер с акрилоильными (или малеильными) группами и остаточными гидроксильными группами. Последующее дополнение Майкла субстехиометрического количества меркапто-карбоновой кислоты, например Н§-(СН2)3-СООН, дает полимер с гидроксильной, акрилоильной и карбоксильной группами. Добавление цистеина вводит амино и карбоксильные группы в дополнение к любым остаточным реакционноспособным группам, оставленным субстехиометрическими количествами реагентов.
Другой подход к многофункциональным π-полимерам включает намеренный пропуск фракции гидрофобных цепочек С. Например, π-полимер примера 1 может быть получен с непрореагировавшими карбоновокислотными группами простым методом ограничения количества образующего подвесные цепи алкиламина на этапе амидирования. Еще один подход состоит в амидировании со смесью аминов, фракция которых содержит реакционноспособную группу X. Кроме того, при соответствующих условиях (избыток малеинового ангидрида на этапе А и избыток ΌΤΤ на этапе В) может быть получен полимер, имеющий желательное количество свободных тиоловых групп.
π-полимер примера 1 содержит в соответствии с проектом гидроксильные группы, полученные из части ΌΤΤ в остове, которые служат реакционноспособными группами X. Эстерификация этих групп акрилоил хлоридом или метакрилоил хлоридом в водных средах в присутствии карбонатного/бикарбонатного буфера обеспечивает замещение акрилоила на группах -ОН. Акрилированный полимер может быть легко подвергнут радикальной полимеризации (с или без добавленного радикального мономера, такого как акриловое соединение, или кросс-линкера, такого как бисакриловое соединение) с получением гидрогелей, подходящих для контролируемой доставки лекарственного средства (действующих как полимерные хранилища или резервуары) и для топических применений (таких как кожные пластыри или мази). Акриловая группа может также быть подвергнута дополнению Майкла, в частности, с тиолом, таким как тиол цистеинового остатка в белке, ферменте, пептиде, антителе, РаЬ'2 фрагменте или РаЬ' фрагменте, или другой нацеливающей частью (схема 7).
- 9 026125 π-полимер, обладающий реакционноспособными гидроксильными группами, после высыхания может также быть эстерифицирован с малеиновым ангидридом для присоединения группы малеата, акцептора Майкла с одновременным формированием свободной карбоксильной группы. В полученном полимере малеиновая двойная связь доступна для дополнения Майкла, в частности, с тиолом, таким как тиол из цистеинового остатка в белке, ферменте, пептиде, антителе, РаЬ'2 фрагменте или РаЬ' фрагменте, или другой нацеливающей частью (схема 8), и карбоксильная группа доступна для соединения с аминогруппами лекарственных препаратов, или лигандов, или лизиновых остатков в белках и пептидах.
Затем к нововведенной (или ранее имевшейся) карбоксильной группе посредством амидирования может быть присоединена другая часть. Таким образом, по меньшей мере две различных нацеливающих части могут быть присоединены даже при условиях реакции насыщения (т. е. присоединяемая часть присутствует в стехиометрическом избытке).
Полимеры, несущие подвесные карбоксильные группы, могут быть амидированы аминами при типичных условиях соединения, и они могут также быть преобразованы в изоцианатные группы посредством перестановки Куртиуса, а затем соединены с аминами или спиртами с образованием мочевин и карбаматов соответственно. Такие реакции могут использоваться для введения гидрофобных групп С или присоединения нацеливающих частей.
Свободные амины могут быть введены в полимер путем, по меньшей мере, частичной реакции одной из реакционноспособных групп с диамином. Диамин должен быть выбран так, чтобы одна из аминовых групп была защищена или была нереакционноспособной при условиях реакции. Последнее часто может достигаться путем использования этилендиамина при рН приблизительно 7,5, поскольку рКа двух аминогрупп значительно отличаются. Предпочтительно это амидирование выполняют как отдельный этап после введения гидрофобных подвесных групп. Пептид или другая молекула, имеющая карбоксильную группу, может затем быть присоединена амидированием к этому свободному амину.
Таким образом, даже при условиях насыщения целых три различных пептида или других нацеливающих частей могут быть присоединены к π-полимеру: один через тиол, один через амин или гидроксил и один через карбоновокислотную группу.
Гидроксил и тиоловые группы могут также быть преобразованы в первичные амины реакцией с азиридином или галоалкил амином (таким как бромэтиламин или хлорэтиламин). Амидирование цистеамином обеспечит введение дисульфида, который может непосредственно реагировать с цистеином пептида или антитела с присоединением пептида или антитела; или может быть сначала восстановлен, например, аминоэтантиолом или ΌΤΤ для дальнейшей реакции с пептидом или антителом.
Выполняя частичные реакции, можно ввести дополнительные реакционноспособные функциональные группы в полимер согласно изобретению, включая без ограничения (1) тиол-реакционноспособные группы, такие как акриловые или малеиновокислотные производные, (2) карбоновокислотные реакционноспособные группы, такие как амино или гидроксил, (3) амин-реакционноспособные группы, такие как карбоксил, и (4) дисульфид-реакционноспособные группы, такие как меркапто. Количество таких добавленных функциональных групп в молекулу полимера может колебаться от 1/г до нескольких кратных г в зависимости от используемого реагента и количества.
- 10 026125
Альтернативно, два или больше определенных лигандов могут быть присоединены с целью улучшения специфичности связывания, скажем, с вирусом или поверхностью клетки. Два или больше определенных лигандов могут также использоваться с целью обеспечения взаимодействия между различными клеточными мишенями, например один лиганд может быть нацелен на вирусную частицу, а другой лиганд может облегчать связывание с фагоцитом, таким образом, приводя вирусную частицу в окрестность или в контакт с фагоцитом и способствуя фагоцитозу.
Такая дериватизация обеспечивает возможность присоединения трех или больше различных нацеливающих и/или терапевтических частей к полимеру посредством прикрепления различных функциональных групп (таких как амин, карбоксилат и тиол). Таким образом, можно присоединить тканьспецифический нацеливающий агент, средство визуализации и терапевтическое средство к одной полимерной цепочке, а последующая самосборка полимера обеспечит получение нацеленного терапевтического средства, распределение и эффективность нацеливания которого можно контролировать.
Присоединение лигандов к повторяющимся звеньям полимеров согласно изобретению даст мультивалентное представление лиганда на полимерной цепочке и на поверхности наночастиц. Многовалентное представление часто приводит к значительному повышению афинности к мишени. Например, многовалентные антитела могут быть намного более эффективными в выведении их целей, чем обычные двухвалентные антитела. Углеводсвязывающие белки и углеводы, как известно, являются многовалентными по своей природе и не являются эффективными в моновалентном состоянии. Аналогично, многовалентные пептидные и углеводные нацеливающие части будут намного более эффективными, чем сам мономер. Увеличение молекулярной массы вследствие присоединения к полимеру приводит к снижению скорости почечного клиренса пептидов и других лигандов. Кроме того, остов РЕОА предоставляет пептиду преимущества, аналогичные РЕО илированию, в т.ч. уклонение от наблюдения иммунной системы.
Еще многовалентная нацеливающая часть обнаружит многовалентную мишень (например, вирусную частицу) и нейтрализует ее намного более эффективно, чем мономерная нацеливающая часть. Способность представления множественных (различных) пептидов в поливалентном формате обеспечивает улучшенную специфичность. Например, действительно ВИЧ-специфический (связывающийся с вирусом ВИЧ) полимер может быть построен путем присоединения пептида, соответствующего СИ4 связывающей области, и другого пептида, соответствующего ССК-5 или СХСК-4 связывающей области вируса, и, возможно, третьего пептида, соответствующего другому рецептору (СХСК-4 или ССК-5 соответственно). Такой полимер может полностью маскировать связывающие области вируса и делать вирус неспособным к присоединению к клеткам и, таким образом, неинфицирующим. Кроме того, поверхностноактивные свойства полимера приведут к дестабилизации самой вирусной структуры после связывания. Вместо пептидов могут использоваться малые молекулы, которые взаимодействуют с теми же связывающими структурами (СИ4, ССК-5, СХСК-4), или смесь пептидов и малых молекул предпочтительно с комплементарной активностью. Полученные полимеры делают неэффективным любой свободный вирус и, таким образом, могут идеально подходить для того, чтобы остановить распространение инфекции, путем использования их в качестве компонентов смазок для презервативов и т.п. Кроме того, такие полимеры могут вводиться инъекцией пациентам с целью уменьшения количества вирусов ВИЧ в их организме.
В целом, при использовании такого многофункционального реагента, как ΌΤΤ, возможно частичное поперечное сшивание полимерных цепочек посредством эстерификации карбоновой кислоты с ΌΤΤ или аналогичных побочных реакций. Вторичные гидроксильные группы в центральной области РЕО цепочек, например, связанные с бисфенол А диглицидилового эфира остатками, могут также поспособствовать поперечному сшиванию, если они присутствуют в РЕО исходном материале. Полученные поперечно сшитые структуры гидрогеля также являются полезными материалами. Например, путем соответствующего увеличения степени поперечного сшивания или путем явного поперечного сшивания с использованием альтернативных кросс-линкеров (таких как, например, бисок-сираны), можно получить материалы, являющиеся гибкими гидрогелями, которые могут служить емкостями для хранения препаратов. Путем соответствующего изменения материалов (например, уменьшение длины РЕОа, большие открытые карбоксильные группы и введение подходящих акриловых групп) можно получить линейные или поперечно сшитые материалы гидрогеля, которые могут служить хранилищами, поддерживаемыми в иммобилизированном состоянии в устройствах, таких как стенты, или поглощенными в устройствах, таких как прокладки для липких пластырей или подкожных вставок. В целом, такие поперечно сшитые материалы подходят скорее для контролируемого высвобождения, а не для улучшенного нацеленного высвобождения.
Гребенчатые полимеры согласно изобретению могут использоваться для солюбилизации в водных системах растворителя материалов, которые не очень хорошо растворяются в воде. Метод солюбилизации вещества в водном растворителе включает контакт плохо растворимого вещества с полимером гребенчатого типа согласно изобретению в присутствии воды с образованием водорастворимого комплекса вещества и полимера. Альтернативно, полимер и вещество, которое будет солюбилизироваться, могут быть объединены в двухфазной водно-органической эмульсии, а органический растворитель может быть удален путем испарения. Пример процесса описан в патенте США № 6838089, раскрытие которого
- 11 026125 включено сюда путем ссылки. Считается, что в большинстве случаев полимер самособирается в наночастицы, в которых плохо растворимое вещество растворено в гидрофобных цепочках С, которые соединяются в ядре частиц, в то время как блоки А формируют гидрофильную корону, которая достаточно снижает свободную энергию межфазного взаимодействия, чтобы позволить водной суспензии частиц оставаться стабильной.
В некоторых случаях плохо растворимое вещество может не полностью растворяться в этом ядре, и может существовать как твердая наночастица, окруженная и суспендированная в цепочках С в ядре частиц. Для целей настоящего изобретения - это различие в степени, поскольку практика изобретения не полагается на какую-либо конкретную степень смешивания цепочек С с плохо растворимым веществом. Вещество может в некоторых случаях распадаться на молекулярном уровне вдоль цепочек С, но в других случаях оно может демонстрировать любую степень отделения фазы от среды С-цепочки. В некоторых случаях можно ожидать, что система будет перемещаться из одного состояния в другое как функция температуры.
Сольватирующая сила гидрофобного ядра частиц полимера может быть изменена путем модификации гидрофобных частей С. Подходящие модификации включают без ограничения введение одного или нескольких гидрофильных заместителей, таких как гидроксильные, эфирные, амидные и цианофункциональные группы, чтобы увеличить полярность и/или поляризуемость гидрофобного ядра.
Плохо растворимые материалы, которые могут быть сделаны растворимыми данными полимерами, включают жирорастворимые витамины и питательные вещества, включая без ограничения витамины А, Ό, Е и К, каротины, холекальциферол и кофермент Ц; нерастворимые лекарственные препараты, такие как доцетаксель, амфотерицин В, нистатин, паклитаксель, доксорубицин, эпирубицин, рубитекан, тенипозид, этопозид, дауномицин, метотрексат, митомицин С, циклоспорин, иринотекан метаболит (§N-38), статины и стероиды; красители, фотодинамические средства и средства визуализации, нуклеиновые кислоты, аналоги нуклеиновых кислот и комплексы нуклеиновых кислот. Аналоги нуклеиновых кислот включают разновидности, такие как тиофосфаты и пептидные нуклеиновые кислоты; комплексы нуклеиновых кислот - это ионные комплексы олигонуклеиновых кислот с, по существу, нейтрализирующим заряд количеством катионных или многокатионных разновидностей.
Для целей данного описания лекарственное средство, которое является нерастворимым при нейтральном рН, считается плохо растворимым, поскольку во многих случаях существует необходимость в нейтральной фармацевтической композиции. Например, ципрофлоксацин разумно растворим в воде при рН ниже 4,5, но это значение рН может быть очень раздражающим, если лекарственное средство сформулировано для введения в глаз. Полимер согласно настоящему изобретению солюбилизирует ципрофлоксацин в нормальном солевом растворе при рН 7. Кроме того, для целей данного описания плохо растворимый следует понимать так, что любое вещество, растворимость которого в водном носителе такова, что увеличение растворимости обеспечит улучшенную или более полезную композицию. Таким образом, лекарственное средство, которое является умеренно растворимым, например до 2 г/л, является плохо растворимым, если единичная доза для внутривенного введения составляет 5 г.
В результате способности полимеров согласно изобретению солюбилизировать фармакологически активные разновидности настоящее изобретение также обеспечивает фармацевтические композиции, включающие один или несколько π-полимеров изобретения в сочетании с терапевтически эффективным количеством одного или нескольких фармакологически активных средств. Полимеры согласно изобретению могут сделать эффективным в ином случае неэффективное количество фармакологически активного средства. Таким образом, для целей данного описания терапевтически эффективное количество - это количество средства, которое делают всю композицию эффективной.
Все патенты, патентные заявки и публикации, упомянутые здесь, включены во всей их полноте путем ссылки.
Экспериментальная часть
1. Общие процедуры.
Настоящее изобретение также предлагает методы получения гребенчатых полимеров согласно изобретению. Синтез этих полимеров без труда выполнит специалист в области органического синтеза, следуя описанным ниже процедурам. Ключевым исходным материалом является полиэтиленгликоль, который предпочтительно высушивают перед использованием. Это удобно сделать путем перемешивания расплавленного РЕС под вакуумом при повышенной температуре, пока не прекратят образовываться пузырьки. Это может занять 8-12 ч в зависимости от качества РЕС. После сушки РЕС может храниться под аргоном неопределенно длительное время. Коммерчески доступные промышленные и исследовательские сорта РЕС могут использоваться для получения полимеров согласно изобретению, например полидисперсные РЕС 1500 коммерческого сорта с распределением молекулярных масс 1430-1570. Такой материал может включать бисфенол А диглицидиловый эфир, который вводит вторичные гидроксильные группы в центр цепочки РЕС. Для обеспечения того, чтобы полимеры согласно изобретению имели наиболее воспроизводимые и последовательные свойства, РЕС предпочтительно свободен от бисфенола А и имеет низкую дисперсность. Самые предпочтительные полимеры РЕС те, которые являются >95% монодисперсными, такие как коммерчески доступные от №к!аг Тйегареийск (ранее §11еаг\\а1ег Ро1- 12 026125 утег8), НипШуШс ЛЬ апб Ро1уриге Αδ, Θδίο, Νοπναν (Норвегия). Примером особенно предпочтительного РЕО является РЕО-28 от Ро1уриге, который является >95% НО(СН2СН2О)28Н, молекулярная масса 1252.
Все реакции проводятся в инертной атмосфере, такой как азот или аргон, с магнитной или предпочтительно механической мешалкой.
На этапе А сухой РЕО расплавляют, и малеиновый ангидрид (2 моль на моль РЕО) добавляют при перемешивании. Количество малеинового ангидрида должно соответствовать количеству концевых гидроксильных групп РЕО настолько близко насколько возможно. Нехватка малеинового ангидрида приведет к полимерным цепочкам с гидроксилом на конце, а избыток малеинового ангидрида поглотит тиоловые группы на следующем этапе, приводя к преждевременному завершению цепочки и концевым карбоксильным группам. Температура реакции не является важной, и процесс может удобно выполняться при температуре от 45 до 100°С. Предпочтительная температура реакции лежит в диапазоне от 65 до 90°С. При использовании повышенных температур малеиновый ангидрид имеет тенденцию к сублимации, и необходимо предпринять меры для того, чтобы малеиновый ангидрид оставался в растворе. Уменьшение свободного пространства и погружение реакционного сосуда в масляную ванну являются эффективными методами.
В зависимости от выбранной температуры реакция может быть завершена через 2 ч или меньше или может быть проводиться в течение ночи. Реакция может контролироваться ТСХ на силикагельных пластинах и продолжаться до исчезновения малеинового ангидрида. Визуальный контраст, УФ и окрашивание йодом могут применяться в исследовании ТСХ пластин.
На этапе В сырой РЕО бис-малеат сложный эфир, полученный на этапе А объединяют с дитиотреитолом (ΌΤΤ) и Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраметилэтилендиамином (ТЕМЕЭ) (с добавленной водой, при необходимости, для текучести), и смесь перемешивают при 70°С. Реакция завершалась в течение 30 мин, как демонстрировало быстрое увеличение вязкости. Молекулярная масса продукта будет уменьшена при использовании количества ΌΤΤ, большего или меньшего, чем оптимальное. Молекулярная масса продукта может быть также уменьшена, если это желательно, путем замены РЕМЕП менее эффективным третичным аминным основанием, таким как РЕА.
На этапе С добавляют достаточное количество воды к реакционной смеси для уменьшения вязкости и 0,1 моль Ν-гидроксисукцинимида (ΝΗδ) и 1,05 моль гексадециламина на моль карбоновокислотных групп в полимере. (Это количество ΝΗδ, похоже, оптимально минимизирует степень побочных реакций). Избыток ^(3-диметиламинопропил)-№-этилкарбодиимид (ЕЭС) (1,4 моль ЕЭС на моль карбоновокислотных групп) затем добавляют по частям, а дополнительную воду добавляют по мере необходимости для поддержания перемешивания. рН реакционной смеси поддерживали выше 7 и предпочтительно между 9 и 11, чтобы оптимизировать реакционноспособность алкиламина. С додециламином эта реакция может быть проведена при приблизительно 40-45°С, а в случае октадециламина температура составляет приблизительно 55-57°С. Реакция сопровождается ТСХ до наблюдения постоянного уровня остатка алкиламина, обычно после проведения в течение ночи.
Реакционную смесь подкисляли до рН приблизительно 3,0-4,5 и размешивали при комнатной температуре в течение приблизительно 24 ч, чтобы разрушить нереагировавший ЕЭС, а затем титровали до рН 7,0, используя 1Ν ΝαΟΗ. Конечную реакционную смесь центрифугировали приблизительно при 800 д в течение 1-3 ч, чтобы удалить твердые примеси и побочные продукты.
После центрифугирования супернатант может быть хроматографирован на колонке ОРС (^уоре^Е™, δерЬабеx™, δерЬас^у1™, Вюде1™ и т.д). π-полимеры являются амфифильными материалами и демонстрируют афинность к большинству набивок колонки ОРС, таким образом осложняя удаление примесей. Альтернативно, полимер может быть хроматографирован на столбце гидрофобного взаимодействия с большими порами (например, ΤΟΥΟРЕΑΡ^™ РНепу1 650С, Τοδίιοίι Βίο 8С1епсе8, МойдотегууП1е, РА, υ.δ.Α.), элюируя с градиентом метанола в воде. Предпочтительно реакционную смесь диализуют против нескольких изменений подкисленной и нейтральной воды, чтобы удалить низкомолекулярные исходные материалы и побочные продукты реакции.
Реакционную смесь можно также экстрагировать бутаноном, изопропанолом, бутанолом или другими полярными органическими растворителями, чтобы удалить органические примеси, однако значительное количество амфифильного полимера будет потеряно в растворителе экстракции. Предпочтительно реакционную смесь подвергают ультрафильтрации с использованием подходящих мембран для фракционирования продукта на сорта молекулярной массы, такие как 5-10; 10-30, 30-50 кДа и т. д., в зависимости от предела фильтрации используемой мембраны. Водный раствор полимера может быть подвергнут предельной фильтрации для получения стерильного или безвирусного раствора в зависимости от выбора мембраны фильтрации или среды.
2. Синтез π-полимеров.
Пример 1. РЕО-ди(алкиламидосукцинил)дитиоэфирный полимер средней молекулярной массы (С16-п-полимер А).
Полиэтиленгликоль (РЕО-1500, δ^дта СНеписа! Со.) сушили под вакуумом при 80°С до прекраще- 13 026125 ния образования пузырей (8-12 ч в зависимости от качества РЕС). Высушенный РЕС мог храниться в сухом состоянии под аргоном неопределенно долго.
Высушенный РЕС расплавляли под аргоном на масляной ванне, и постепенно при перемешивании добавляли малеиновый ангидрид (2 моль на моль РЕС с корректировкой на примеси). Смесь перемешивали под аргоном при 90°С. Поскольку малеиновый ангидрид имеет тенденцию к сублимации, свободное пространство минимизировали, и весь реакционный сосуд держали при температуре реакции. Сконденсировавшийся на стенках сосуда малеиновый ангидрид соскабливали назад в реакционную смесь. Ход реакции контролировали ТСХ на силикагельных пластинах, используя этанол и гексан в качестве растворителей по отдельности, с УФ визуализацией и окрашиванием йодом. Реакция продолжалась в течение одного часа после исчезновения малеинового ангидрида.
Сырой РЕС дималеат разбавляли двумя объемами воды. Раствор дитиотреитола (ΌΤΤ, 1,01 экв. на эквивалент РЕС) и Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраметил-этилендиамин (ТЕМЕО, 1,02 экв.) в воде (2 объема воды на объем ТЕМЕО) затем добавляли к реакционной смеси при перемешивании. Реакцию перемешивали при 70°С под аргоном в течение 2,5 ч, оставили при комнатной температуре на ночь, а затем перемешивали вновь при 70°С в течение 2 ч. Реакцию контролировали ТСХ и она считалась завершенной после полного исчезновения ΌΤΤ.
Воду добавляли к вышеупомянутой реакционной смеси, чтобы уменьшить вязкость до тех пор, пока смесь уже можно было перемешивать (при приблизительно 25 % твердых веществ), смесь перемешивали при 65°С под аргоном и добавляли Ν-гидроксисукцинимид (0,1 моль на моль карбоновокислотных групп в полимере РЕС-дималеат-ΌΤΤ), а затем гексадециламин (1,05 моль на моль карбоновокислотных групп в полимере) и Ж(3-диметиламинопропил)-№-этилкарбодиимид (ЕОС, 0,56 моль на моль карбоновокислотных групп в полимере). Смесь перемешивали под аргоном в течение 1 ч, и добавляли вторую часть ЕОС (0,56 моль на моль карбоновокислотных групп в полимере). Еще через час добавляли третью порцию ЕОС (0,28 моль на моль карбоновокислотных групп в полимере, в общей сложности 1,4 моль ЕОС на моль карбоновой кислоты), чтобы восстановить потерю ЕОС на гидролиз. Дополнительную воду добавляли по мере необходимости, чтобы поддержать текучесть, поскольку добавленные твердые вещества затрудняли перемешивание суспензии, и рН поддерживали в диапазоне 8-10 добавлением 1Ν ΝαΟΗ по мере необходимости. Смесь перемешивали при 65°С под аргоном в течение ночи, контролировали ТСХ (диоксид кремния с этанолом), пока алкиламин не достигал устойчивой концентрации, а затем перемешивали еще 4 ч. Реакционную смесь подкисляли 1Ν НС1 до приблизительно рН 4,5, перемешивали 24 ч, чтобы разрушить нереагировавший ЕОС, доводили рН до 7,0, по каплям добавляя 1Ν ΝαΟΗ. При использовании додециламина реакция проводилась при приблизительно 40-45°С, а при использовании октадециламина температура была предпочтительно 55-57°С.
Смесь переносили в емкости для центрифугирования и обрабатывали в настольной центрифуге приблизительно при 800 д в течение 2 ч, чтобы отделить оставшиеся твердые вещества. После центрифугирования реакционную смесь экстрагировали изопропанолом, чтобы удалить органические примеси. Ультрафильтрация является предпочтительной альтернативой экстрагирования изопропанолом.
Этим методом следующие аминосоединения конъюгировали с полимером:
Пример 1а. Ундециламин.
Пример 1Ь. Октадециламин.
Пример 1с. 4-Нонилбензиламин.
Пример 16. 3-[(4-Фенокси)фенил]пропиламин.
Пример 2. РЕС-ди(алкиламидосукцинил)дитиоэфирный высокомолекулярный полимер.
Следовали процедуре, изложенной в примере 1, за исключением того, что использовали 0,55 моль ΌΤΤ и 0,55 моль ЕЕМЕО на моль малеинового ангидрида. Необходимо было активное перемешивание, поскольку вязкость быстро увеличивалась. Большая часть реакции завершилась в течение 5-10 мин, а затем медленно завершалась в течение следующих 4 ч при повышении температуры от 55 до 80°С.
Пример 3. РЕС-ди(алкиламидосукцинил)дитиоэфирный полимер.
Следовали процедуре, изложенной в примере 1, за исключением того, что использовали 1,5 моль додециламина на моль карбоновокислотных групп. Добавляли Ν-гидроксисукцинимид (ΝΗδ, 1,0 моль на моль карбоновокислотных групп) и 1,1'-карбонилдиимидазол (СО1, 3,0 моль на моль карбоновокислотных групп), реакцию перемешивали при 80°С в течение 4 ч и обрабатывали, как описано выше.
Этим методом следующие аминосоединения конъюгировали с полимером:
Пример 3а. Ундециламин.
Пример 3Ь. Тетрадециламин.
Пример 3с. Октадециламин.
Пример 36. Дегидроабиэтиламин.
Пример 3е. Холестерин 2-аминоэтиловый эфир.
Пример 3Е. 10-Феноксидециламин,
Пример 3д. Себациновой кислоты гидразид.
Пример 31. Олеиновой кислоты гидразид.
Пример 3ί. Дегидроабиэтиновой кислоты гидразид.
- 14 026125
Пример 3). Желчной кислоты гидразид.
Пример 3к. Пальмитиновой кислоты гидразид.
Пример 4. РЕС-со-(алкиламидосукцинат) полимер.
Раствор РЕС (6,66 ммоль) и триэтиламина (2,32 мл, 16,65 ммоль) в сухом диэтиловом эфире (10 мл) охлаждали при 0°С под аргоном и обрабатывали по каплям метансульфонил хлоридом (1,03 мл, 13,32 ммоль). Перемешивание продолжали еще 1 ч при 0°С, а затем при комнатной температуре в течение 2 ч. Эфир выпаривали и добавляли сухой ацетон (15 мл) к остатку, чтобы преципитировать триэтиламин гидрохлорид, который отфильтровывали из раствора. Фильтрат обрабатывали литий бромидом (2,31 г, 26,64 ммоль) и нагревали с обратным холодильником в течение 20 ч. Затем смесь разбавляли гексаном и фильтровали через короткую силикагельную колонку (3 см), покрытую СеШе™ (0,5 см), и элюировали гексаном. Фильтрат сушили, фильтровали и выпаривали, получая в конечном итоге α,ω-дибром-РЕС в виде масла.
α,ω-дибром-РЕС реагировал с одним эквивалентом 2,2-дибутил-4,5-бис-(метоксикарбонил)-1,3,2диоксастаннолана методом Со6)О1ап е! а1., Те1гайебгоп ЬеИегк, 37:433-6 (1996). Полученный диметилтартрат-РЕС полиэфир омыляли КОН в метаноле, а затем амидировали додециламином или гексадециламином как в примерах 1 и 3 выше или аминами согласно примерам 3а-3к.
Пример 5. РЕС сополимеризация с ЕЭТА диангидридом.
Сухой РЕС реагировал с этилендиаминтетрауксусной кислоты диангидридом методом, описанным в примере 1, а затем амидировали додециламином, как в примере 1, или гексадециламином, как в примере 3, или аминами, как в примерах 3а-3к.
Таким же образом следующие диангидриды сополимеризировали с РЕС, а затем амидировали:
Пример 5а. Нафталинтетракарбоксилдиангидрид.
Пример 5Ь. Перилентетракарбоксилдиангидрид.
Пример 5с. Бензофенонтетракарбоксилдиангидрид.
Пример 56. 4,4'-(Гексафторизопропилиден)дифталевый ангидрид.
Пример 5е. Бутан тетракарбоксикислоты диангидрид.
Пример 5ί. Бицикло(2,2,2)окт-7-ен-2,3,5,6-тетракарбоксиловый диангидрид.
Пример 5д. Диэтилентетрамин пентауксусной кислоты диангидрид.
Пример 5й. 3,4,3',4'-Дифенилсульфон тетракарбоксикислоты диангидрид.
Пример 5ί. 3,4,3',4'-Дифенилового эфира тетракарбоксикислоты диангидрид.
Пример 5_). Пиромелитовый диангидрид.
Пример 6А. РЕС-диамина сополимер с подвесными тиоэфирами.
РЕС дималеат, полученный согласно примеру 1, реагировал с додекантиолом (2 экв. на эквивалент РЕС дималеата) с применением той же самой процедуры, которая использовалась для ΌΤΤ в примере 1. Разбавление не было необходимо, поскольку полимеризация не происходила, а реакцию проводили в расплавленном РЕС-дималеате. Добавляли катализатор ТЕМЕЭ. а затем тиол. Реакция сопровождалась исчезновением исходных материалов при использовании ТСХ. Могут использоваться температуры до точки, в которой потеря алкилтиола вследствие испарения становится значительной (до приблизительно 100°С). Небольшой избыток алкилтиола может использоваться, чтобы полностью насытить малеиновые группы. Избыток алкилтиола удаляли в конце реакции, барботируя азотом или аргоном и/или нагревая под вакуумом, пока они не обнаруживались по запаху или ТСХ.
Этим методом следующие тиолы могут конъюгироваться с РЕС дималеатом:
Пример 6Аа. Меркаптоянтарной кислоты ди-1-бутиловый сложный эфир.
Пример 6АЬ. Тетрадекантиол.
Пример 6Ас. Гексадекантиол.
Пример 6Аб. 2-Меркаптоэтансульфокислота.
Пример 6Ае. 3-Меркаптопропансульфокислота.
Пример 6АГ 6-Меркаптогексановой кислоты ΐ-бутиловый сложный эфир.
Пример 6Ад. 4-Меркаптобензокислоты ί-бутиловый сложный эфир.
Пример 6Ай. Меркаптоуксусной кислоты ί-бутиловый сложный эфир.
Пример 6АЕ 4-(1-Бутоксикарбониламино)бутантиол.
Пример 6А_). 3-(1-Бутоксикарбониламино)бензил меркаптан.
Пример 6Ак. 4-Децилбензил меркаптан.
Тиолы, имеющие реакционноспособные функциональные группы, подходят для присоединения С цепочек, и/или реакционноспособные функциональные группы могут служить точками присоединения (X) для нацеливающих частей.
Пример 6В. РЕС-диамина сополимер с подвесными тиоэфирами.
- 15 026125
Тиоловый аддукт, полученный в примере 6А, амидировали 1,4-диаминобутаном (один эквивалент диамина на две группы СООН), применяя ту же процедуру, которая использовалась для додециламина в примере 1, с разбавлением водой по мере необходимости для поддержания текучести реакционной смеси. Дополнительные аликвоты ЕЭС добавляли по мере необходимости для обеспечения полной полимеризации. Этим способом тиоловые аддукты примеров 6А и 6Аа-6Ак преобразовывали в ΡΕΟдиаминобутан полиамида.
Этим способом следующие диамины могут быть превращены в ΡΕΟ полиамид (ВОС=1бутоксикарбонил):
Пример 6Ва. 2-(О-ВОС)-1,3-диамино-2-пропанол.
Пример 6ВЬ. №,№'-ди(ВОС) гексаэтилен тетраамин.
Пример 6Вс. №,№'-ди(ВОС) спермин.
Пример 6В6. Ν'-ВОС спермидин.
Пример 6Ве. №,№',№-три(ВОС) пентаэтилен гексамин.
Пример 6ВГ. Агматин.
Пример 6Вд. Лизин ΐ-бутил сложный эфир.
Пример 6В1. 1,6-Диаминогексан.
Пример 6В1. 1,4-Фенилендиамин.
Пример 6 В]. 1,3 -Фениле ндиамин.
Пример 6Вк. 1,4-Диаминобутан-2,3-диол ацетонид.
Пример 7. РЕО-ди(алкилсукцинат) дитиоэфир
2,3-бис-О-гексадециловый эфир ΌΤΤ (мезо-2,3-бис-(гексадецилокси)бутан-1,4-дитиол) получали, модифицируя процедуру 8. 8а§ак1 с1 а1., 01011-1^1-1131-141111. 33(10):4247-4266 (1985). Его добавляли к ΡΕΟдималеату методом примера 1.
Этим способом соединяли следующие эфир дитиолы с ΡΕΟ полимером:
Пример 7а. Мезо-2,3-бис-(п-бутокси)бутан-1,4-дитиол.
Пример 7Ь. Мезо-2,3-бис-(4-нонилфенилметокси)бутан-1,4-дитиол.
Пример 7с. Мезо-2,3-бис-(бифенил-4-метокси)бутан-1,4-дитиол.
Пример 76. 4,6-Бис-(децилокси)бензол-1,3-диметантиол.
Пример 7е. 4,5-Бис-(децилокси)бензол-1,2-диметантиол.
Пример 7Г. 3,4-Бис-(децилокси)тиофен-2,5-диметантиол.
Пример 8А. Замещенные ΡΕΟ сукцинаты.
Использовали метод примера 1, за исключением того, что 2-додецен-1-ил янтарный ангидрид применяли вместо малеинового ангидрида. Додецениловый заместитель обеспечивал подвесные С цепочки в конечном полимере.
Этим способом эстерифицировали ΡΕΟ следующие замещенные янтарные ангидриды:
Пример 8Аа. Изобутенилянтарный ангидрид.
Пример 8АЬ. 2-октен-1-ил янтарный ангидрид.
Пример 8Ас. Октадеценил янтарный ангидрид.
Пример 8А6. 3-оксабицикло-гексан-2,4-дион.
Пример 8Ае. Циклогександикарбоновый ангидрид.
Пример 8АГ. Фталевый ангидрид.
Пример 8Ад. 4-Децилфталевый ангидрид.
Пример 8А1. Г ексагидрометилфталевый ангидрид.
Пример 8А1. Тетрагидрофталевый ангидрид.
Пример 8А|. Норборнендикарбоновый ангидрид.
Пример 8Ак. Кантаридин.
Пример 8А1. Бициклооктендикарбоновый ангидрид.
Пример 8Ат. Эксо-3,6-эпокси-1,2,3,6-тетрагидрофталевый ангидрид.
Пример 8Ап. 8-ацетил меркаптоянтарный ангидрид.
Пример 8В. РЕС-ди(алкиламидосукцинил)дитиоэфир с подвесными алкилированными группами.
Методом примера 1 замещенные ΡΕΟ сукцинаты, полученные как описано в примерах 8А и 8Аа8Ап, реагировали с ΌΤΤ.
Этим способом следующие дитиолы реагировали с любым из замещенных ΡΕΟ сукцинатов, полученных как описано в примерах 8А и 8Аа-8Ап:
Пример 8Ва. Этан-1,2-дитиол.
Пример 8ВЬ. Пропан-1,3-дитиол.
Пример 8Вс. Бутан-1,4-дитиол.
- 16 026125
Пример 8Вй. Пентан-1,5-дитиол.
Пример 8Ве. Гексан-1,6-дитиол.
Пример 8В£. 1,4-бензолдитиол.
Пример 8В§. 1,3-бензолдитиол.
Пример 8ВП. 1,4-бензолдиметантиол.
Пример 8В£ 1,3-бензолдиметантиол.
Пример 8В|. 1,2-бензолдиметантиол.
Пример 8С. РЕС-диаминовый сополимер с подвесными алкильными группами.
Методом примера 6В замещенный РЕС сукцинат, полученный как описано в примере 8А, сополимеризировали с 1,4-диаминобутаном.
Этим методом следующие диамины сополимеризировали с любым из замещенных РЕС сукцинатов примеров 8А и 8Аа-8Ап:
Пример 8Са. 2О-ВОС 1,3-диамино-2-пропанол.
Пример 8СЬ. №,№'-ди(ВОС) гексаэтилен тетраамин.
Пример 8Сс. №,Ы-ди(ВОС) спермин.
Пример 8Сй. Ν'-ВОС спермидин.
Пример 8Се. №,№\№-три(ВОС) пентаэтилен гексамин.
Пример 8С£. Агматин.
Пример 8Сд. Лизин ΐ-бутил сложный эфир.
Пример 8СН. 1,6-диаминогексан.
Пример 80. 1,4-фенилендиамин.
Пример 8С). 1,3-фенилендиамин.
Пример 8Ск. 1,4-диаминобутан-2,3-диол ацетонид.
Пример 9. РЕС транс-этерификация с использованием замещенных кислот РЕС дитосилат.
К 1 моль РЕС (растворенному в ΌΜΡ или расплавленному как есть) добавляли 2,1 моль тозил хлорида (5 мол.% избыток), перемешивая под аргоном. К этой реакционной смеси добавляли 2,2 моль гетраметил этилен диамина (ТЕМЕО). Реакцию затем инкубировали при 45°С в течение 2 ч. Продукты растворяли, используя ТСХ в этилацетате, толуоле или этаноле в качестве растворителей ТСХ. РЕС дитозилат можно экстрагировать из реакционной смеси толуолом. Вместо толуолсульфонил хлорида могут также использоваться другие сульфонилирующие средства, такие как мезил хлорид (см. пример 4), трифловый ангидрид или трезил хлорид (см. патентную заявку США 10/397332, публикация № 20040006051).
Полиэстерификация РЕС дитозилата.
К 1 моль расплавленного РЕС-дитозилата при перемешивании под аргоном добавляли 1 моль 8,8'дидецил-мезо-2,3-димеркаптоянтарной кислоты и 2 моль ТЕМЕО. ΌΜΡ добавляли по мере необходимости, чтобы поддержать текучесть. Реакционную смесь нагревали до 80°С и перемешивали в течение 24 ч или до завершения согласно данным ТСХ.
Пример 10. РЕО-ди(сукцинил)-ди-(О-ацилированный)тиоэфирный полимер средней молекулярной массы (С16-п-полимер В).
РЕС-дималеат (10,24 г, 6,1 ммоль), полученный в примере 1, помещали в сухую колбу на 125 мл и нагревали до 70°С под аргоном, чтобы расплавить РЕС-дималеат. К этому расплавленному материалу при перемешивании добавляли воду (10 мл) и раствор ΌΤΤ (0,961 г, 6,168 ммоль) и ТЕМЕО (0,723 г, 6,166 ммоль) в воде (3 мл). Раствор перемешивали при 70°С в течение приблизительно 4 ч. Удаление воды ίη уасио давало твердый полимер с выходом приблизительно 90%.
Высушенный полимер (5 г, 2,7 ммоль) нагревали до 70-90°С под аргоном, чтобы расплавить его, и добавляли ЕЕМЕО (0,635 г, 5,5 ммоль). Пальмитоил хлорид (1,689 г, 5,5 ммоль) добавляли при перемешивании, и смесь перемешивали под аргоном в течение ночи. (Отношение полимера к ацил хлориду может изменяться для получения степеней замещения от 0-100% стехиометрии). Воду добавляли к реакционной смеси, чтобы выделить С16-п-полимер В.
Этим методом эстерифицировали следующие кислоты гидроксильными группами ди(сукцинил) РЕС-ΌΤΤ сополимера:
Пример 10а. Олеиновая кислота.
Пример 10Ь. Холестерил сукцинат.
Пример 10с. Бифенил-4-карбоновая кислота.
Пример 10й. 4-Октилфенилуксусная кислота.
- 17 026125
Пример 10е. Гексадец-6-иновая кислота.
Как альтернатива использованию кислых галидов, ΌΤΤ-производные гидроксильный группы πполимеров могут также быть активированы 1,3-бис-(2,2-диметил-1,3-диоксолан-4-илметил) карбодиимидом (ΒΌΌΟ) и соединены непосредственно с карбоновыми кислотами; см. НапбЬоок оГ Реадепй Гог Огдатс 8уп1кс515. Реадепй Гог Сйсойбе, Ыис1еойбе апб Рерйбе ууШксхй. Еб. Ό;·ινί6 Сйск, УПсу. 2005, р. 107, 108 и приведенные там ссылки).
Пример 11. Карбоксильнозамещенные сложные эфиры С16-п-полимера А.
Карбоново-кислотнозамещенные полимеры используются для присоединения лигандов, имеющих реакционноспособные аминогруппы, используя стандартные методы образования пептидных связей (например, с помощью карбодиимидных реагентов) для присоединения аминогрупп к функциональной группе карбоновой кислоты полимера. Эти материалы можно легко получить путем эстерификации πполимерных гидроксильных групп с циклическими ангидридами. Например, СШ^-полимер А дималеат получали путем реакции малеинового ангидрида с гидроксильными группами СШ^-полимера А следующим образом.
СШ^-полимер А (2 г) и малеиновый ангидрид (0,85 г) растирали в сухой ступке и переносили в 50 мл круглодонную колбу. Колбу нагревали при 90°С под аргоном в течение 2-3 ч при перемешивании. Твердую реакционную смесь затем размалывали и суспендировали с водой, а смесь переносили в пакет для диализа (3,5 кДа отсечка). Смесь диализировали против воды, чтобы удалить избыток малеиновой кислоты и низкомолекулярные побочные продукты, и остаток удаляли из мешка и сушили при 60°С до постоянной массы с получением СШ^-полимер А дималеата (1,79 г). Отношение полимера А к малеиновому ангидриду может изменяться для получения замещений в диапазоне 0-100% полной стехиометрической эстерификации.
Пример 11а. С.'16-π-полимер А дигликолят.
СШ^-полимер А (2 г) и ангидрид дигликолевой кислоты (1,0 г) реагировали способом примера 11 выше с получением С.'16-π-полимер А дигликолята. Как и в случае с малеиновым ангидридом, отношение полимера А к ангидриду может быть различным для получения замещений в диапазоне 0-100% полной стехиометрической эстерификации.
Пример 11Ь. СШ^-полимер А бис-(аконинат).
СШ^-полимер А (2 г) и ангидрид акотиновой кислоты (1,35 г) реагировали способом примера 11 выше с получением СШ^-полимер А бис-(аконитата).
Аналогичным образом следующие ангидриды соединяли с СШ^-полимером А. При использовании ангидридов низкой растворимости рН можно отрегулировать от 4,5 до 6,5 перед диализом для содействия очистке. Второй диализ против 0,1Ν НС1 обеспечивает кислотную форму полимера, если это желательно.
Пример 11с. Янтарный ангидрид.
Пример 11б. Глютаровый ангидрид.
Пример 11е. Фталевый ангидрид.
Реакционноспособная двойная связь, введенная путем эстерификации малеиновым или цисакотиновым ангидридом, может также использоваться для добавления тиолсодержащих лигандов к полимеру, как описано в примере 12 ниже.
Пример 12. Цистеиновый аддукт С.'16-π-полимер А дималеата.
Измельченный в порошок СШ^-полимер А дималеат (пример 11) (253 мг) добавляли к воде (5 мл), и смесь энергично перемешивали. Цистеин (24 мг) и ΤΕΜΕΌ (30,5 мкл) добавляли к реакционной смеси, и смесь перемешивали при комнатной температуре под атмосферой аргона. За ходом реакции следили с помощью ТСХ (силикагельные пластины, п-бутанол-уксусная кислота-вода 3:1:1) с обнаружением нингидрина. Реакционная смесь демонстрировала нингидринположительное пятно, совместно мигрирующее с полимером. Цистеин также дал нингидринположительное пятно, тогда как исходный полимер не давал цвета с нингидрином.
Описанный выше способ использовался для введения дополнительных карбоксильных групп для использования в качестве точек присоединения, используя тиолы, имеющие множество карбоксильных заместителей. Например, меркаптоянтарную кислоту добавляли к следующим диэфирам СШ^-полимера А:
Пример 12а. Дималеат СШ^-полимера А.
Пример 12Ь. Дикрилат С.'16-π-полимера А.
Пример 12с. С.'16-π -полимера А (бис)аконинат.
- 18 026125
Аналогично 3-меркаптоглутаровая кислота была добавлена к следующим диэфирам С.'16-πполимера А.
Пример 12й. С.'16-π-полимер адималеат.
Пример 12е. СТб^-полимер А диакрилат.
Пример 12Г. С.'16-π-полимер А (бис)аконитат.
3. Использование π полимеров для солюбилизации нерастворимых или слабо растворимых веществ.
Пример 1. Солюбилизация красителей.
К 1,0 мл аликвотам 50 мг/мл водного раствора ΡЕС1500-со-сукцинил-^ΤΤ-бис-С1б-амид полимера (С1б-полимер А, пример 1), центрифугируемого для удаления нерастворимых материалов, но не очищаемого иным образом, добавляли избыточное количество красителей эозин Υ, дихлорфлуоресцеин и судан IV в отдельных контейнерах (Р1ехЕхсе1™ прозрачные полипропиленовые грузики, размер \УВ2.5. продукт А11Ехсе1, 1пс., ХУеЧ Науеи, СТ), и компоненты перемешивали вместе с образованием пасты. Затем основания контейнеров прикрепляли к дну ванны небольшого ультразвукового прибора для очистки ювелирных украшений, используя водостойкую двустороннюю липкую ленту. Добавляли в ванну как раз достаточное количество воды, чтобы погрузить грузики примерно на 1/3 высоты. Обработку ультразвуком проводили в течение 15 мин этапами по 5 мин. Жидкости переносили в центрифужные пробирки и центрифугировали дважды в течение 30 мин в настольной центрифуге для удаления нерастворенного красителя. Супернатанты переносили в чистые пробирки и вновь центрифугировали для удаления оставшихся твердых веществ. Суспензии одинакового количества красителей в одинаковом количестве дистиллированной воды, равном количеству раствора полимера, обрабатывали одинаковым образом, как контрольные группы. Полученные растворы наносили (25 мкл) на пластины ТСХ с образованием кругов из капель. Интенсивности пятен сравнивали с пятнами, сделанными из стандартов растворов красителей в этаноле или этаноле/воде, для определения приблизительных концентраций; пятна изображены на фиг. 1. Растворимость красителей в воде была определена путем растворения соответствующего количества красителя в 1 л или более деионизированной воды (без буфера) при комнатной температуре и добавления (т. е. титрования) воды по мере необходимости для получения насыщенных растворов.
Концентрация судана IV в 50 мг/мл полимере составляла приблизительно 0,2 мг/мл в противоположность 0,000 мг/мл в Н2О (судан IV нерастворим при нейтральном рН). Концентрация дихлорфлуоресцеина составляла приблизительно 5 мг/мл в 50 мг/мл полимере в противоположность 0,010 мг/мл в Н2О. Концентрация эозина Υ в 50 мг/мл полимере составляла приблизительно 5 мг/мл в противоположность 0,007 мг/мл в Н2О. Показатели нагрузки (количество лекарственного средства на единицу полимера, г/г) вычисляли как приблизительно равные 1:250 для судана IV, 1:10 для дихлорфлуоресцеина и 1:10 для эозина Υ.
Показатели нагрузки 1:10 для полярных соединений, которые соответствуют фармацевтически активным веществам по физико-химическим свойствам, являются более высокими, чем обычно достигаемые с применением липосом, циклодекстринов, СгеторЬог™, детергентов или других солюбилизирующих систем. Эозин Υ является фотоактивируемым синглетным кислородным генератором с очень высокой эффективностью, и такие концентрированные растворы эозина Υ, которые получают с полимером примера 1, могут оказаться фармакологически активными в качестве фотоактивируемых цитотоксических средств.
Изменение в спектре флюоресценции дихлорфлуоресцеина в растворе полимера (красноватый желтый/оранжевый) по сравнению с водой (зеленовато-желтый) было заметно визуально и свидетельствует о том, что краситель находится не в водной среде, а инкапсулирован в органической среде ядер самособранных полимерных частиц. Действительно, изменения в спектрах флюоресценции использовали как метод определения изменений полярности микросреды (например, липидные пробы). Цвет раствора судана IV в полимере был красновато-коричневымв противоположность красному в этанольном растворе и коричневому порошку при суспендировании в воде. Эозин Υ не показывал значительного визуального изменения (от розового в воде до красновато-розового в полимерном растворе).
Пример 2. Солюбилизация веществ, имеющих медицинское значение.
Пурпурин, амфотерицин В, камптотецин и доксорубицин выбирали как представителей плохо рас- 19 026125 творимых активных фармацевтических ингредиентов (ΑΡΙ). Амфотерицин В используется в липосомальной композиции как вводимое инъекцией противогрибковое средство, а камптотецин и доксорубицин - как средства против рака. Пурпурин -вводимый в ДНК краситель, имеющий потенциальные фармацевтические применения, а эозин Υ - фоточувствительный синглетный кислородный реагент, имеющий потенциальное применение в фотодинамической терапии. Каждый ΑΡΙ солюбилизировали в воде С16-п-полимером А, С18-п-полимером В и/или конъюгатом С16-п-полимера А и фолиевой кислоты (см. ниже). Солюбилизация была продемонстрирована путем нанесения солюбилизированных ΑΡΙ и несолюбилизированных контролей на пластины ТСХ, как описано выше для красителей.
Высушенные полимеры ресуспендировали с водой, нагревали, перемешивали и обрабатывали ультразвуком по мере необходимости. Когда раствор становился слишком вязким, его разбавляли. С.'16-πполимер А использовали при 10 % мас./об., фолатированный С16-п-полимер А использовали при 5% мас./об., а С18-п-полимер В использовали при 2% мас./об.
Лекарственное средство (20 мг) добавляли непосредственно в 1 мл раствора полимера, что давало массовое отношение полимер:АР1 5:1 для С16-п-полимера А, 2,5:1 для фолатированного С.'16-π-полимера А и 1:1 для С.'18-π-полимера В, за исключением доксорубицина (см. ниже). Смеси обрабатывали ультразвуком в течение 1 ч при низкой мощности, а затем центрифугировали дважды при 2000 д чтобы удалить нерастворенные твердые вещества. Количество гранулированных твердых веществ было незначительным.
Доксорубицин гидрохлорид объединяли с полимерами, как указано выше, в массовом соотношении 10:1 С16-п-полимера А к доксорубицин хлориду или массовом отношении 5:1 фолатированного С16-пполимера А к доксорубицину с последующим добавлением достаточного количества 3М ацетата натрия, чтобы нейтрализовать доксорубицин гидрохлорид. Смеси энергично взбалтывали в течение 24 ч, а затем дважды центрифугировали при 2000 §, чтобы удалить нерастворенные твердые вещества. Количество гранулированных твердых веществ было незначительным.
Массовые отношения солюбилизированных ΑΡΙ к полимеру приведены в табл. 1. Не предпринимались попытки максимизировать нагрузку полимера, поэтому эти отношения представляют нижние пределы количества ΑΡΙ, которое способны нести в раствор полимеры.
Пробу 10 мкл каждого раствора наносили на Вакетйех™ силикагельную ТСХ пластину и давали растечься. Водный раствор формирует внешнюю границу круга, а внутренний круг образуется миграцией полимера с инкапсулированным материалом. Во всех случаях было очень мало ΑΡΙ в периферическом краю исключительно водной области, указывая на успешную солюбилизацию и минимальную утечку инкапсулированного материала.
Таблица 1
Солюбилизация ΑΡΙ. Массовые отношения полимер:субстрат
С1 б-я-полимер А 10 % мас/об Фолатированный С1б-л-полимер А 5 % мас/об С18-д-полимер В 2 % мас/об
Пурпурин 5:1 2,5:1 не выполняли
Камптотецин 5:1 2,5:1 не выполняли
Амфотерицин В 5:1 2,5:1 не выполняли
Доксорубицин 10:1 5:1 не выполняли
Эозин Υ не выполняли не выполняли 1:1
4. Биологическая совместимость π полимеров.
Пример 1. Пригодность для топических смягчающих средств, кремов или паст.
Концентрированный масляный воск полимера примера 1 изобретатель втирал в кожу на внутренней стороне запястья и наблюдал поглощение. Материал, как казалось, поглощался аналогично фармакологическим восковым кремам с небольшим смягчением области. После этого однократного топического применения не наблюдали никаких сразу наступающих или отсроченных аллергических реакций, таких как покраснение, высыпание или зуд.
Многие из этих полимеров - гигроскопические воски при комнатной температуре с ожидаемой точкой плавления приблизительно 45-60°С или выше в зависимости от состава. Полимеры, полученные с более низкомолекулярными РЕО, могут быть даже жидкостями при комнатной температуре. Некоторые полимеры могут быть твердыми при комнатной температуре и расплавляться при температуре тела. Таким образом, свойства этих π-полимеров делают их превосходными субстратами для приготовления лосьонов, кремов, мазей, смягчающих средств и других форм доставки по отдельности или в смеси с различными веществами, включая активные фармацевтические средства.
- 20 026125
Пример 2. Пригодность для парентерального введения.
Водный раствор полимера примера 1 получали в забуференном фосфатом солевом растворе, а затем фильтровали в стерильные пробирки через 0,22 мкм фильтры.
Использовали протокол максимальной переносимой дозы, в котором СЭ-10 мыши подвергались инъекции в хвостовую вену дозы 5 мл за кг массы тела до 5% мас./об. водного раствора полимера. За мышами непрерывно наблюдали в течение 12 ч и каждые 2 ч после этого до 48-72 ч в зависимости от группы брали и анализировали пробы крови. Некоторыми мышами пожертвовали, и вначале проводили общее гистологическое исследование. Затем на отдельных участках проводили микроскопическую гистологию.
Не было обнаружено никаких заметных различий в химии крови между мышами контрольной группы и проходившими лечение мышами. Не было обнаружено никаких заметных различий или повреждений по сравнению с животными контрольной группы в общей гистологии различных органов, включая сердце, легкие, почки, селезенку, печень, кишечник, желудок, мочевой пузырь, кожу, мышцы, кости, мозг и лимфатические узлы. Несколько образцов от различных групп животных изучали, получая одинаковые результаты. Не наблюдали никаких заметных различий в структуре клеток исследованных тканей. В некоторых почках наблюдали некоторую грануляцию, которая уменьшалась со временем действия полимера. Это означает, что грануляция - временная фаза и с течением времени все вернется к норме.
Мы приходим к выводу о том, что полимер безопасен для медицинского использования в качестве фармацевтического средства в инъецируемых препаратах и других парентеральных композициях. Разумно ожидать, что полимер безопасен в пероральных растворах, таблетках в виде капсул и таблеток, носовом спрее, пероральных/бронхиальных аэрозолях, сублингавльных препаратах, кожных кремах/лосьонах/пластырях, глазных каплях, других топических путях и других путях введения.
5. Присоединение нацеливающих частей к π-полимерам.
Пример 1. Присоединение галактозамина к С-16 π-полимеру В посредством образования амидной связи.
Галактозамин (ОЛ) нацелен на печеночный рецептор азиалогликопротеина (ΆδΟΡΡ), и полимеры, имеющие ковалентно связанный глактозамин, доставляются в печень (см. Ь. δеутοи^ с1 а1., Нерайс Эгад Тагдейпд: Рйаке I Еуа1иайоп оГ Ро1утег-Воипй ЭохогиЫст! С1ш. Опсо1о§у, 20(6): 1668-1676 (2002) и приведенные там ссылки.
С16-п-полимер В (пример 10 в приведенной выше части метода синтеза) (461 мг, 0,2 ммоль эквивалент СООН на повторяющееся звено) диспергировали в 14 мл воды, и к этой дисперсии добавляли ЕЭС НС1 (0,485 ммоль) и Ν-гидроксисукцинимид (0,464 ммоль). Смесь перемешивали при температуре окружающей среды в течение 15 минут, и добавляли раствор галактозамина НС1 (0,386 ммоль) и ТЕМЕЭ (0,387 ммоль) в 1 мл воды. Раствор перемешивали, и после реакции следовала ТСХ на силикагеле и формирование в 1-бутанол-уксусной кислоте-воде (3:1:1). Добавляли дополнительное количество ТЕМЕЭ (0,079 ммоль), ΝΗδ (0,078 ммоль) и ЕЭС НС1 (0,193 ммоль), чтобы форсировать завершение реакции. Когда ТСХ показала устойчивое состояние относительно потребления ОА, реакционную смесь диализовали (мембрана с пределом 3500 Да) против 3x1000 мл деионизированной воды, чтобы удалить низкомолекулярные реагенты и побочные продукты. Остаток удаляли и сушили при 60°С до постоянной массы (348 мг).
ТСХ продукта показала отсутствие свободного ОА (нингидрин отрицательный). Пробу продукта гидролизировали 6Ν НС1 при 100°С, чтобы гидролизировать связанный ОА. Анализ ТСХ показал наличие ОА (нингидрин положительный) при том же значении Ρί, что и для базового ОА.
Пример 2. Присоединение фолиевой кислоты к С.'18-π-полимеру А.
ВЭЭС' (2,44 г, 8,56 ммоль) взвешивали в 125 мл круглодонной колбе, продутой аргоном (ВЭЭС является очень вязким, имеющим сходную с медом консистенцию, поэтому с ним сложно обращаться). С18-п-полимер А (10 г, 4,28 ммоль) добавляли в колбу, смесь нагревали до 70°С, и реагенты перемешивали вместе в течение приблизительно 30 мин. Фолиевую кислоту (3 г) добавляли с последующим добавлением достаточного количества ТНР, чтобы сделать возможным перемещение. Реагенты перемешивали при 40-70°С в течение ночи с защитой от влажности. Затем ТНР давали испариться, и добавляли воду (80 мл), смесь перемешивали при 50°С в течение еще 2 ч. После охлаждения до комнатной температуры смесь переносили в часть пробирок для диализа с пределом 3500 Да и диализовали против 0,1Ν НС1 (2x2000 мл), воды (2000 мл), 5% карбонат натрия (2x2000 мл) и воды (4x2000 мл) для удаления непрореагировавших реагентов и побочных продуктов. Удаляли ярко-желто-оранжевый остаток. Часть выпаривали до постоянной массы, чтобы определить концентрацию твердых веществ, и использовали для экспериментов с солюбилизацией, описанных выше.
Пример 3. Добавление Ν-ацетил нейраминовой кислоты (ЛАЛА) и аналогов к π-полимерам.
Производные нейраминовой кислоты являются нацеливающими частями для вирусов гриппа ввиду гемагглютинина и белков оболочки нейраминидазы, оба из которых, как известно, связываются с сиаловой кислотой. Были разработаны несколько способов соединения NАNА и ее производных с πполимерами изобретения.
- 21 026125
Пример 3а. Присоединение Ν-ацетил нейраминовой кислоты (ΝΑΝΑ) к С16-п-полимеру А посредством эстерификации.
ВЭЭС (2,44 г, 8,56 ммоль) и С18-п-полимер А (10 г, 4,28 ммоль) объединяли и нагревали до 70°С, перемешивали вместе под арговом в течение приблизительно 30 мин. Добавляли Ν-ацетил нейраминовую кислоту (3 г), а затем - ТНР по мере необходимости, чтобы поддержать текучесть. Реагенты перемешивали при 40-70°С в течение ночи, защищая от влажности. Добавляли воду (80 мл), и смесь перемешивали при 50°С еще 2 ч. После охлаждения до комнатной температуры смесь диализировали против 0,1Ν НС1, 5% ΝαΗί'Ό3, и воды (2x2000 мл каждого) мембраной с пределом 3,5 кДа. Нанесение пятен на силикагельной ТСХ пластине и визуализация с 0,2% орсинолом в 70%-ной серной кислоте при 130°С показывали включение нейраминовой кислоты в полимер.
Пример 3Ь. Присоединение Ν-ацетил нейраминовой кислоты (ΝΑΝΑ) мономалеата к С.'16-πполимеру А.
5-^Ацетилнейраминовую кислоту (ΝΑΝΑ) (0,86 ммоль), малеиновый ангидрид (0,93 ммоль) и триэтиламин (1,77 ммоль) растворяли в 1,5 мл ΌΜ8Θ в сухой круглодонной колбе. Колбу продували аргоном и помещали в масляную баню. Смесь перемешивали при 65-85°С, и процесс проверяли ТСХ на пластинах диоксида кремния (^-Р^ОН-ΕΐОΑс-вода, 4:3:2), пока реакция не завершалась (отсутствие ΝΑΝΑ, обнаружение орсинолом/Н28О4 или мочевина/НС1 реагент). Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, и добавляли воду для гидролизации излишка малеинового ангидрида. Полученный раствор мономалеата ΝΑΝΑ непосредственно использовали в последующих реакциях.
Водный раствор С16-п-полимер А диглиэолата (см. Синтез π-полимеров, пример 11а) (1,23 ммоль повторяющиеся звенья, 2,46 ммоль -СООН) регулировали до рН 4,5-6,5. Добавляли карбодиимид (ЕЭС НС1, 3,86 ммоль) и Ν-гидроксисукцинимид (2,6 ммоль), и смесь перемешивали при температуре окружающей среды в течение примерно 60 мин. Добавляли раствор мономалеата ΝΑΝΑ (2,49 ммоль), полученный как описано выше, и рН регулировали с помощью ΤΕΜΕΌ до рН 6-7. Перемешивание продолжали при температуре окружающей среды в течение максимум 26 ч. Продукт очищали диализом, сначала против 20 ммоль ацетата натрия, рН 4,5, а затем против воды. Остаток удаляли и хранили до использования.
Пример 3с. Присоединение Ν-ацетил нейраминовой кислоты (ΝΑΝΑ) к СШ^-полимеру А посредством спейсера.
Цистеамин (2-аминоэтантиол) гидрохлорид (0,93 ммоль в воде) добавляли к эквимолекулярному количеству мономалеата ΝΑΝΑ (раствор, полученный как описано выше), а затем эквимолекулярное количество ΤΕΜΕΌ для содействия добавлению тиола к двойной связи. Реакция сопровождалась ТСХ на диоксиде кремния (^-Р^ОН-ΕΐОΑс-вода, 4:3:2) до завершения реакции (отсутствие О-малеоил-ΝΑΝΑ, обнаружение орсинолом/Н28О4 или мочевина/НС1 реагент) с получением нацеливающей части Ό
Тем же самым способом дериватизировали 5-^ацетил-2,3-дегидро-2-деоксинейраминовую кислоту (ΌΑΝΑ) с получением нацеливающей части Е
Тем же самым способом добавляли цистеин и глютатион к моноэфирам малеиновой кислоты ΝΑΝΑ и ΌΑΝΑ.
Согласно способу, описанному в примере 3Ь выше, меркаптосукцинатный конъюгат С.'16-πполимера А бис(аконитат) амидировали нацеливающей частью Ό. Этот полимер содержал до 8 -СООН групп на повторяющееся звено (см. Синтез π-полимеров, пример 12с).
Пример 36. Присоединение Ν-ацетил нейраминовой кислоты (ΝΑΝΑ) к СШ^-полимеру А посред- 22 026125 ством спейсера.
Описанным выше способом нацеливающая часть Е была конъюгирована с полимером С.'16-πполимер А дигликолят (см. Синтез π-полимеров, пример 11а).
Пример 3е. Присоединение нейраминовой кислоты β-метилгликозида (ΜΝΑ) к С16-п-полимерам.
Первый образец С.'16-π -полимера А дигликолята, имеющий в среднем один карбоксил на повторяющееся звено (0,396 ммоль), растворяли в воде и давали прореагировать с ΝΗ8 (0,4 ммоль) и ЕИСИСЧ (0,64 ммоль). Добавляли нейраминовой кислоты-в-метилгликозид (ΜΝΑ) (0,42 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при температуре окружающей среды (25-30°С) в течение 18-24 ч, а затем очищали диализом.
Пример 3Е.
Второй образец С^^-полимера А дигликолята, имеющий две карбоксильных группы на повторяющееся звено, был также конъюгирован с ΜΝΑ таким же способом.
Пример 3д. Присоединение β-О-метил нейраминовой кислоты (ΜΝΑ) к С16-п-поличсру.
В С16-п-полимср В, 43 ммоль основы СООН в 1 мл воды и нейраминовой кислоты β-мстил гликозид (Тогоп1о Кекеагсй СйетюаИ), 40 ммоль смешали вместе, добавили 40 ммоль ΝΗ8 в 0,1 мл воды, а затем 40 ммоль БИС гидрохлорида в 0,1 мл воды. Реакционную смесь взбалтывали при температуре окружающей среды в течение 48 ч, и анализировали ТСХ на силикагеле с изопропанолом-этилацетатомводой (4:3:2). Обнаружение с использованием 0,2% орсинола в 70%-ной серной кислоте при 130°С не обеспечивает цветовую реакцию с исходным полимером, но ТСХ реакционной смеси дает фиолетовое пятно, совместно мигрирующее с полимером.
Все полимерные конъюгаты в приведенных выше примерах (3а-3д) показывают после диализа положительную реакцию на присутствие нейраминовой кислоты при визуализации с орсинолом/серной кислотой или мочевиной/ΗΟΕ реагентом в ТСХ.
Пример 4. Присоединение занамивира к С16-п-полимсру В.
Занамавир (00167) является мощным ингибитором вирусной нейраминидазы, и полимеры, несущие эту молекулу как мультивалентный лиганд, являются ингибиторами репликации вируса гриппа.
С16-п-полимср В (920 мг) диспергировали в 30 мл воды, к этому добавляли БИС ΗΟ (1,2 ммоль) и Ν-гидроксисукцинимид (1,1 ммоль). Смесь перемешивали при температуре окружающей среды в течение 20 мин, и добавляли раствор трифторуксусной кислой соли 5-ацетамидо-7-(6'-аминогексил)карбамилокси-4-гуанидино-2,3,4,5-тетрадеокси-И-глицеро-И-галакто-нон-2-энопираносоновой кислоты (патенты США №№ 6242582 и 6680054) (0,39 г, 0,67 ммоль) и ТЕМЕИ (0,67 ммоль) в 1 мл воды. Раствор перемешивали при комнатной температуре, и после реакции проводили ТСХ. Реакционную смесь диализовали (мембрана с пределом 3500 кДа) против 3x1000 мл деионизированной воды, чтобы удалить низкомолекулярные реагенты и побочные продукты. Остаток удаляли и сушили при 60°С до постоянной массы. Уровень введения сахара может быть определен колориметрической пробой для гуанидиновой группы (Сап. 1. Сйет., 36:1541 (1958)). Исследование нейраминидазы может быть выполнено согласно процедуре Ройег е! а1., Лпа1. Вюсйет., 29, 287 (1979).
Пример 5. Присоединение мимозина.
С.'16-π-полимер А дигликолят (см. Синтез π-полимеров, пример 11а) в виде 4,5% мас./об. раствора (1 ммоль повторяющиеся звенья, приблизительно 2 ммоль в группах СООН) реагировал с ΝΗ8 (2,27 ммоль) и ЕИС-Ηα (2,23 ммоль), и к получающейся смеси добавляли раствор 1-мимозин (2,14 ммоль, подготовленный в 5 мл воды с рН, отрегулированным ТЕМЕИ для повышения растворимости) и перемешивали при температуре окружающей среды и рН приблизительно 6,8-7 в течение приблизительно 2224 ч. рН отрегулировали до 3-4 с помощью 6Ν ΗΟ, смесь перемешивали в течение 15-30 мин, и рН повышали до 6,1 добавлением ТЕМЕИ. Затем смесь диализировали (3,5 кД предел) против воды, чтобы удалить примеси и низкомолекулярные продукты.
Пример 6. Присоединение пептидов и белков к π-полимер А дималеату и диакрилату.
Общая процедура для РаЪ фрагментов.
Дисульфидные связи во фрагментах Р(аЪ')2 антител восстанавливали с помощью иммобилизированного ТСЕР дисульфидного восстанавливающего геля (Р1егсе, Ргойис! # 0077712), используя протокол изготовителя; или, альтернативно, с использованием ТТ или ТСЕР в растворе, израсходованные реагенты удаляли путем ультрафильтрации на 30 кД фильтрах. Восстановленные Р(аЪ')2 фрагменты, содержащие свободные сульфгидрильные группы, затем реагировали с π-полимер А дималеатом или диакрилатом в присутствии ТЕМЕИ.
Общая процедура для цистеина и цистеинсодержащих пептидов.
Акрилатный или малеатный сложный эфир π-полимера А реагировал с остатками цистеина, используя триэтиламин в качестве катализатора. К диакрилату полимера (0,3 ммоль повторяющиеся звенья, 0,6 ммоль акрилата) в виде суспензии в воде добавляли цистеин (0,66 ммоль) и триэтиламин (1,32 ммоль). Колбу продували аргоном, и содержимое перемешивали при температуре окружающей среды в течение ночи (приблизительно 18 ч). ТСХ реакционной смеси на диоксиде кремния (ι-ΡγΟΗ-этил ацетатвода 4:3:2) показала отсутствие цистеина и нингидрин-положительное пятно полимера, указывающее на
- 23 026125 присоединение цистеина к двойным связям акрилата.
Пример 6а. Присоединение фрагментов антитела против бешенства к С16-п-полимер А дигликоляту.
С16-п-полимер А дималеат получали из РЕС с молекулярной массой 4500. Человеческий иммуноглобулин бешенства (ЫдС) ВауКаЪ™ обрабатывали пепсином обычным способом в буфере с кислым рН для получения Р(аЪ')2 фрагмента, который очищали ультрафильтрацией на 50 кД фильтрах. Р(аЪ')2 фрагмент соединяли с РЕС 4500 С-16-п-полимер А дигликолятом с использованием способа ЕОС. описанного в примере 5 выше.
Пример 6Ъ. Присоединение фрагментов антитела против бешенства к С16-п-полимер А дималеату.
Р(аЪ')2 фрагмент ВауКаЪ™ ЫдС (см. пример 6а) был восстановлен ΌΤΤ (или альтернативно ТСЕР), и израсходованный реагент был удален ультрафильтрацией на 30 кД фильтрах. РаЪ'-δΗ фрагменты соединяли с РЕС 4500 С-16-π-полимер А дималеатом путем добавления Майкла свободного тиола к двойной связи малеиновой кислоты при рН 7-8,3 (ТЕМЕО). Конъюгаты очищали ультрафильтрацией на 100 кД фильтрах, чтобы удалить низкомолекулярные загрязняющие примеси.
Пример 6с.
РЕС 8500 С.'16-π -полимер А дималеат конъюгировали с восстановленным Р(аЪ')2 фрагментом ВауКаЪ™ ЫдС, как описано выше.
Пример 64. Присоединение пептидов к С.'16-π-полимер А дималеату.
Пептид КЭУКС^КИ^УУУТС (КаЪ 1), как сообщали, связывается с вирусом бешенства (Т.Ь. Беп1/, 1990, I. Мо1. Кесодийюи, 3(2):82-88). Концевой Сук этого пептида использовали для синтеза конъюгата пептида^-полимера А против бешенства. С 16-π-полимер А дималеат (две части малеиновой кислоты на повторяющееся звено), полученный из РЕС 1500 (0,157 ммоль), растворяли в воде (6 мл), и рН раствора регулировали ТЕМЕО приблизительно до 8. Добавляли пептид (0,157 ммоль), растворенный в ΌΜΡ (3,1 мл), и реакционную смесь перемешивали при температуре окружающей среды под аргоном, в то время как рН реакции поддерживали на уровне 8-8,3. Ход реакции проверяли путем тестирования реакционной смеси реагентом Эллмана. Приблизительно через 45 ч тест Эллмана был почти отрицательным. Добавляли воду для снижения концентрации ΌΜΡ, и реакционную смесь центрифугировали, чтобы удалить малое количество осадка. Прозрачный супернатант ультрафильтровали на 10 кД центробежном фильтре (Атюои ИНга 10 кЭ, са!# ИРС901024), и остаток промывали несколько раз водой, чтобы удалить низкомолекулярные загрязняющие примеси.
Следующие три пептида (О - орнитин; ΝΗ2 означает С-конечный амид) были получены путем автоматизированного твердофазного синтеза и конъюгированы с РЕС 1500 π-полимером А дималеатом аналогично пептиду КаЪ1.
Пример 64. К1)¥КС.\\'КО\\'\У¥ТС (КаЪ2).
Пример 6е. КС,\\'К11\\'\Ύ('(ΝΙ Б) (КаЪ3).
Пример 6Б. КС,\\'КО\\'\УС(М Б) (КаЪ4).
6. Противовирусная активность π-полимеров.
Пример 1. Эффективность против гриппа.
АТСС νΚ-1520 (Η2Ν1) вирус человеческого гриппа использовали в анализе защиты мыши. Одна инъекция в вену хвоста, 200 мкл/20 г массы тела приводила к 99,5% смертельной инфекции у контрольных животных (уровень выживания в течение 7 дней при отсутствии лечения).
В каждой группе было по десять мышей. Мышам вводили инъекцией в хвостовую вену 200 мкл/20 г массы тела низкодозного (0,0375%) и высокодозного (0,15%) раствора конъюгата π-полимер В-ΜΝΑ примера 3 выше. Животным с последующим лечением давали лекарство через 24 ч после инфекции, а животным с предварительным лечением -за 6 ч до инфекции. Животным положительного контроля вводили инъекцией эквивалентное количество свободного лиганда, а животные негативного контроля получали инъекцию солевого буфера.
Время выживания использовали как показатель эффективности. Массу тела контролировали как параметр исследования. Гистологию внутренних органов проводили при общем обследовании и анализе с применением микроскопа. Результаты приведены на фиг. 2.
Увеличение времени выживания составляло 5,93 ч (+/0,48 ч §Ό) для группы высокой дозы и только 2,94 ч (+/-0,75 ч §Ό) для положительного контроля (фиг. 1 и 2). На основании массы лиганда лечение с высокой дозой соответствует максимум 0,03% лиганда, если принять максимальный показатель замещения полимерного конъюгата равным 0,2 мас./мас. Таким образом, полимерный конъюгат продемонстрировал значительно более высокий уровень эффективности по сравнению с неконъюгированным лигандным контролем.
Общая гистология, а также микроскопическое исследование некоторых мышей из группы лечения высокой дозой конъюгата полимера В-ΜΝΑ, показала норму, за исключением того, что в частях костного мозга получивших лечение мышей наблюдали немного уменьшенный уровень белых клеток, что могло быть вызвано инфекцией гриппа. Потеря массы тела в группах защиты (высокая доза - 8,9%, низкая доза - 6,2%), а также группах лечения (высокая доза - 9,0%, низкая доза - 9,4%) была меньше, чем в груп- 24 026125 пе положительного контроля (9,8%), что указывает на связь с самим лигандом, а не полимером (фиг. 3). Небольшое увеличение массы тела 0,7% наблюдали у мышей, не проходивших лечение.
Пример 2. Эффективность против бешенства.
Группы из десяти белых швейцарских (\У1й1с 8^188) мышей приблизительно 20 г каждая обоих полов использовались в исследовании защиты ш νίνο. Мышам вводили инъекцией 3X450 вируса бешенства. Инъекция представляла собой 0,03 мл СУ8 (стандартное контрольное заражение вирусом) штамма бешенства в разбавлении 10-6 (100 ЬО50/мл). Ежедневно контролировали выживание, паралич и массу тела. Исследовали внутрибрюшинное введение лекарства на 25, 48 и 72 ч и внутримозговое введение препарата на 25 и 48 ч. Результаты представлены в табл.1 и 2.
Таблица 1
Экспериментальное бешенство у мышей.
Внутрибрюшинное введение; количество выживших.
Пример № (доза/инъекц., мг) Дни после инфекции
1* 2* 3* 4 5 6 7 8 9 10 11
ба (0,4) 10 10 10 10 10 10 4 1 1 1 0
6Ь (2,0) 10 10 10 10 10 10 5 3 0 0
бс (2,0) 10 10 10 10 10 10 7 1 0 0
64(2,1) 10 10 10 10 10 10 5 1 1 1 0
бе (2,4) 10 10 10 10 10 10 5 0 0
6Г(3,0) 10 10 10 10 10 10 5 1 1 1 0
62(2,6) 10 10 10 10 10 10 4 0 0
Пептид КаЫ (0,5) 10 10 10 10 10 10 7 2 0 0
Пептид К.аЬ2 (0,5) 10 10 10 10 10 10 5 3 1 1 0
Пептид КаЪЗ (0,5) 10 10 10 10 10 10 5 1 0 0
Пептид КаЬ4 (0,5) 10 10 10 10 10 10 3 0 0
60(1,0) 10 10 10 10 10 10 5 1 1 1 0
бе (1,2) 10 10 10 10 10 10 4 1 1 0 0
6((1,5) 10 10 10 10 10 10 5 0 0
68(1,3) 10 10 10 10 10 9 4 1 0 0
ВауКаЬ™ (0,4) 10 10 10 10 10 10 5 0 0
ВауКаЬ™ (2,0) 10 10 10 10 10 10 6 1 0 0
бЬ (0,4) 10 10 10 10 10 9 3 0 0
6с (0,4) 10 10 10 10 10 10 4 0 0
Солевой раствор 10 10 10 10 10 10 6 2 0 0
Ничего 10 10 10 10 9 9 5 1 1 1 0
* дозы, введенные инъекцией в дни 1-3.
- 25 026125
Таблица 2
Внутримозговое введение; количество выживших

Claims (26)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ лечения или предотвращения инфекции животного вирусом, включающий введение указанному животному полимера гребенчатого типа, имеющего следующую структуру:
    ν Л р включающую остов, образованный из чередующихся частей с точками ветвления В и гидрофильных водорастворимых полимерных блоков А; и имеющую гидрофобные боковые цепочки С и лиганды Ζ, прикрепленные к частям с точками ветвления, где водорастворимый полимерный блок А выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, полиэтиленимина, поливинилового спирта и поливинилпирролидона и их сополимеров;
    часть с точками ветвления В является конъюгатом дитиотрейтола, дитиоэритритола или 2,3диаминобутан-1,4-диола с двумя молекулами малеиновой кислоты;
    каждая гидрофобная боковая цепочка С имеет величину 1одР больше чем 1,4 и независимо выбрана из группы, состоящей из С6-С30 неразветвленных или разветвленных углеводородов, необязательно замещенных одним или несколькими гидрофильными заместителями; С6-С30 циклических или полициклических углеводородов, необязательно замещенных одним или несколькими гидрофильными заместителями; и гидрофобных аминокислот, пептидов или полимеров;
    каждый лиганд Ζ независимо является лигандом, имеющим специфическую аффинность связывания с поверхностью указанного вируса;
    к является связью или спейсерной частью; η принимает значения от 3 до 100;
    среднее значение р варьируется от величины больше единицы до четырех и среднее значение г колеблется от 1 до 8, где гребнеобразный полимер не находится в комбинации с терапевтически эффективным количеством фармакологически активного средства.
  2. 2. Способ по п.1, в котором по меньшей мере один лиганд выбирают из группы, состоящей из Νацетилнейраминовой кислоты, β-метилгликозида нейраминовой кислоты и 4-гуанидино-2,4-дидезокси2,3-дегидро^-ацетилнейраминовой кислоты.
  3. 3. Способ по п.1, в котором по меньшей мере один лиганд Ζ является антителом или фрагментом антитела, имеющим специфическую аффинность связывания с поверхностью указанного вируса.
  4. 4. Способ по п.3, в котором лиганд является фрагментом Р(аЬ')2, полученным из человеческого иммуноглобулина 1дО против бешенства.
  5. 5. Способ по п.1, в котором по меньшей мере один лиганд Ζ является пептидом, выбранным из группы, состоящей из ΚΌΥΚΟΑΚΗΑνΥΥΤ0 ΚΙ)ΥΚΟ\\'ΚΘ\\'\ΎΥΤ('. ΚΟΑ'ΚΙ 1\\'\Ύ('(ΝΙ 12) и ΚΟΑΚΘΑνΥ^ΝΗ2).
  6. 6. Способ по п.1, в котором блок полимера А выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля и их сополимеров.
  7. 7. Способ по п.6, в котором блок полимера А является полиэтиленгликолем.
  8. 8. Способ по п.6, в котором блок полимера А имеет среднюю длину между 3 и 3000 мономерных звеньев.
  9. 9. Способ по п.1, в котором полимер имеет структуру
    - 26 026125 где т равно 3-3000, Υ и Υ' независимо выбраны из группы, состоящей из К, ОК, СООК, §К, ΝΗΚ, МКК', ΟΝΗΡ. ΝΗΟΚ ΝΡΝΗ2. ΝΗΝΗΚ Ν^ΝΗΡ' и ΝΗΝΡΡ'. где К и К' независимо выбраны из группы, состоящей из С6-С30 разветвленных или неразветвленных углеводородов, необязательно замещенных одним или несколькими гидрофильными заместителями, С6-С30 циклических или полициклических углеводородов, необязательно замещенных одним или несколькими гидрофильными заместителями, гидрофобных аминокислот, пептидов и полимеров.
  10. 10. Способ по п.1, в котором полимер имеет структуру где т равно 3-3000, У является О или ΝΗ, Υ и Υ' независимо выбраны из группы, состоящей из К, СОК, СООК, СОМ ИХ СОХНИХ СОМНОК, СОХНХН, СОМНЫНК, СОХНХНН' и СОМНМКК', где К и К' независимо выбраны из группы, состоящей из С6-С30 разветвленных или неразветвленных углеводородов, необязательно замещенных одним или несколькими гидрофильными заместителями, С6-С30 циклических или полициклических углеводородов, необязательно замещенных одним или несколькими гидрофильными заместителями, гидрофобных аминокислот, пептидов и полимеров.
  11. 11. Способ по п.1, в котором полимер имеет структуру где часть Ό получена из диамина, выбранного из группы, состоящей из 1,3-диаминопропана, Η2Ν(ΟΗ2)3ΝΗ(ΟΗ2)3ΝΗ2, 1,4-диаминобутана, 2-(О-ВОС)-1,3-диамино-2-пропанола, №,М-ди(ВОС)гексаэтилентетрамина, Ν',Ν''-спермина, Ν'-ВОС-спермидина, №,М,М'-три(ВОС)пентаэтиленгексамина, агматина, трет-бутилового эфира лизина, 1,6-диаминогексана, 1,4-фенилендиамина, 1,3-фенилендиамина и
    1,4-диаминобутан-2,3-диола ацетонида; где р равно 0-4, а т равно 3-3000 и где К и К' независимо выбраны из группы, состоящей из С6-С30 разветвленных или неразветвленных углеводородов, необязательно замещенных одним или несколькими гидрофильными заместителями, С6-С30 циклических или полициклических углеводородов, необязательно замещенных одним или несколькими гидрофильными заместителями, гидрофобных аминокислот, пептидов и полимеров.
  12. 12. Способ по любому из пп.1-3, в котором вирус является вирусом гриппа.
  13. 13. Способ по любому из пп.3-5, в котором вирус является вирусом бешенства.
  14. 14. Гребнеобразный полимер для лечения или предотвращения инфекции вирусом, упомянутый гребнеобразный полимер, имеющий следующую структуру:
    включающую остов, образованный из чередующихся частей с точками ветвления В и гидрофильных водорастворимых полимерных блоков А; и имеющую гидрофобные боковые цепочки С и лиганды Ζ, прикрепленные к частям с точками ветвления, где водорастворимый полимерный блок А выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, полиэтиленимина, поливинилового спирта и поливинилпирролидона и их сополимеров;
    часть с точками ветвления В является конъюгатом дитиотрейтола, дитиоэритритола или 2,3диаминобутан-1,4-диола с двумя молекулами малеиновой кислоты;
    каждая гидрофобная боковая цепочка С имеет величину 1одР больше чем 1,4 и независимо выбрана из группы, состоящей из С6-С30 неразветвленных или разветвленных углеводородов, необязательно за- 27 026125 мещенных одним или несколькими гидрофильными заместителями; С6-С30 циклических или полициклических углеводородов, необязательно замещенных одним или несколькими гидрофильными заместителями; и гидрофобных аминокислот, пептидов или полимеров;
    каждый лиганд Ζ независимо является лигандом, имеющим специфическую аффинность связывания с поверхностью указанного вируса, при условии, что Ζ не является занамивиром, Νацетилнейраминовой кислотой или β-О-метилнейраминовой кислотой;
    5 является связью или спейсерной частью; η принимает значения от 3 до 100;
    среднее значение р варьируется от величины больше единицы до четырех и среднее значение г колеблется от 1 до 8.
  15. 15. Гребнеобразный полимер по п.14, в котором по меньшей мере один лиганд Ζ является олигопептидом, антителом или фрагментом антитела, имеющим специфическую аффинность связывания с поверхностью указанного вируса.
  16. 16. Гребнеобразный полимер по п.15, в котором лиганд является фрагментом РаЬ или Р(аЬ')2, полученным из человеческого иммуноглобулина 1дС против бешенства.
  17. 17. Гребнеобразный полимер по п.14, в котором по меньшей мере один лиганд Ζ является пептидом, выбранным из группы, состоящей из Ι<ΌΥΚΟ\νΐ<Η\ννΥΥΤί.’. Κ^ΥКС\ΚО\VΥΥΤС, КС.\\'К11\\'\¥С(М С) и КС\\'КО\\'\¥С(М С).
  18. 18. Гребнеобразный полимер по п.14, в котором блок полимера А выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля и их сополимеров.
  19. 19. Гребнеобразный полимер по п.18, в котором блок полимера А является полиэтиленгликолем.
  20. 20. Гребнеобразный полимер по п.19, в котором блок полимера А имеет среднюю длину между 3 и 3000 мономерных звеньев.
  21. 21. Гребнеобразный полимер по п.14, имеющий структуру где т равно 3-3000, Υ и Υ' независимо выбраны из группы, состоящей из К, ОК, СООК, 8К, ΝΗΚ, ΝΚΚ', ОNΗК, NΗОК, ΝΚΝΗ2, ΝΗΝΗΚ, ΝΚΝΗΚ' и ΝΗΝΚΚ', где К и К' независимо выбраны из группы, состоящей из С6-С30 разветвленных или неразветвленных углеводородов, необязательно замещенных одним или несколькими гидрофильными заместителями, С6-С30 циклических или полициклических углеводородов, необязательно замещенных одним или несколькими гидрофильными заместителями, и гидрофобных аминокислот, пептидов или полимеров.
  22. 22. Гребнеобразный полимер по п.14, имеющий структуру где т равно 3-3000, \ представляет собой атом кислорода или ΝΗ-группу, и Υ и Υ' независимо выбраны из группы, состоящей из К, СОК, СООК, СОМИК, СОМКК', СОМ ЮК СОМКМ С, СОМ 1М ПС СОМК^К' и СОМЫМИК', где К и К' независимо выбраны из группы, состоящей из С6-С30 разветвленных или неразветвленных углеводородов, необязательно замещенных одним или несколькими гидрофильными заместителями, С6-С30 циклических или полициклических углеводородов, необязательно замещенных одним или несколькими гидрофильными заместителями, и гидрофобных аминокислот, пептидов или полимеров.
  23. 23. Гребнеобразный полимер по п.14, имеющий структуру где часть Ό получена из диамина, выбранного из группы, состоящей из 1,3-диаминопропана, Η2Ν(ΟΗ2)3ΝΗ(ΟΗ2)3ΝΗ2, 1,4-диаминобутана, 2-(О-ВОС)-1,3-диамино-2-пропанола, №,М-ди(ВОС)гексаэтилентетрамина, Ν',Ν''-спермина, Ν'-ВОС спермидина, М',М,М'-три(ВОС)пентаэтиленгексамина, агматина, трет-бутилового эфира лизина, 1,6-диаминогексана, 1,4-фенилендиамина, 1,3-фенилендиамина и
    - 28 026125
    1,4-диаминобутан-2,3-диола ацетонида;
    где р равно 0-4 и т равно 3-3000 и где К и К' независимо выбраны из группы, состоящей из С6-С30 разветвленных или неразветвленных углеводородов, необязательно замещенных одним или несколькими гидрофильными заместителями, С6-С30 циклических или полициклических углеводородов, необязательно замещенных одним или несколькими гидрофильными заместителями, и гидрофобных аминокислот, пептидов или полимеров.
  24. 24. Гребнеобразный полимер по любому из пп.14 и 15, в котором вирус является вирусом гриппа.
  25. 25. Гребнеобразный полимер по любому из пп.14 и 15, в котором вирус является вирусом бешенства.
  26. 26. Применение гребнеобразного полимера по любому из пп.14-25 в производстве медикамента для лечения или профилактики вирусной инфекции.
EA200900685A 2007-01-22 2007-01-22 Самособирающиеся амфифильные полимеры в качестве противовирусных средств EA026125B1 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/US2007/001607 WO2008091246A1 (en) 2007-01-22 2007-01-22 Self-assembling amphiphilic polymers as antiviral agents

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200900685A1 EA200900685A1 (ru) 2010-02-26
EA026125B1 true EA026125B1 (ru) 2017-03-31

Family

ID=39644738

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200900685A EA026125B1 (ru) 2007-01-22 2007-01-22 Самособирающиеся амфифильные полимеры в качестве противовирусных средств

Country Status (15)

Country Link
US (1) US20100008938A1 (ru)
EP (1) EP2120974B1 (ru)
JP (1) JP5539733B2 (ru)
KR (1) KR101405764B1 (ru)
CN (1) CN101636169B (ru)
AP (1) AP2523A (ru)
AU (1) AU2007344657B9 (ru)
BR (1) BRPI0719561A2 (ru)
CA (1) CA2676239C (ru)
EA (1) EA026125B1 (ru)
HU (1) HUE034416T2 (ru)
IL (1) IL198850A (ru)
MX (1) MX2009005345A (ru)
NZ (1) NZ576948A (ru)
WO (1) WO2008091246A1 (ru)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2437203A1 (en) * 2001-03-27 2002-10-03 National Institute Of Agrobiological Sciences Vegetative growth-specific promoter and genetically modified plants obtained thereby
NZ581210A (en) * 2007-07-19 2012-04-27 Allexcel Inc Self-assembling amphiphilic biocompatible copolymers as anticancer agents
US9119866B2 (en) * 2008-04-08 2015-09-01 Huiru Wang Glycan-based drugs, therapies and biomarkers
US8496946B2 (en) 2011-03-10 2013-07-30 International Business Machines Corporation Antimicrobial hydrogels, methods of preparation thereof, and articles therefrom
US9642916B2 (en) 2012-12-12 2017-05-09 The Regents Of The University Of California Porphyrin modified telodendrimers
WO2014130432A1 (en) 2013-02-19 2014-08-28 Johnson & Johnson Consumer Companies, Inc. Methods and compositions for improving appearance and formation of scar tissue
MX2018015432A (es) * 2016-06-12 2019-04-11 Array Tech Inc Pistas de montaje enganchables, soportes de montaje y metodos de modulos solares de montaje.
DK3478233T3 (da) * 2016-06-30 2021-08-30 Safkan Inc Bærbar anordning til rensning af ører
CN110392583B (zh) 2016-09-15 2023-01-03 加利福尼亚大学董事会 改进的杂化的末端树枝状聚合物
US20210330701A1 (en) * 2020-04-23 2021-10-28 Johnson & Johnson Consumer Inc. Methods and compositions for inhibiting enveloped viruses using high molecular weight hydrophobically modified alkali swellable emulsion polymers and surfactant
US20210330806A1 (en) * 2020-04-23 2021-10-28 Johnson & Johnson Consumer Inc. Methods and compositions inhibiting enveloped viruses using high molecular weight hydrophobically modified alkali swellable emulsion polymers
WO2022271183A1 (en) * 2021-06-25 2022-12-29 Allexcel Inc. Self-assembling amphphlic polymers as anti-covid-19 agents

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998026662A1 (en) * 1996-12-19 1998-06-25 The Penn State Research Foundation Compounds and methods for treating and preventing bacterial and viral disease
WO2006034081A2 (en) * 2004-09-17 2006-03-30 Massachusetts Institute Of Technology Polymers for analyte detection

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1063254A1 (de) * 1999-06-25 2000-12-27 Technische Uni München, Klinikum rechts der Isar, Inst. für Experiment. Onkoligie und Therapieforschung Copolymere für den Transport von Nukleinsäuren in die Zelle
WO2006003352A1 (en) * 2004-07-06 2006-01-12 Warwick Effect Polymers Limited Living radical polymerization initiator comprising a functional group capable of reacting with polyeptides or the like, comb polymer obtained therewith, polypeptide conjugates and drugs obtained therefrom
KR101263057B1 (ko) 2006-01-19 2013-05-09 올엑셀, 인크. 자기 조립형 양쪽성 중합체를 이용한 약물의 가용화 및 표적화된 전달

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998026662A1 (en) * 1996-12-19 1998-06-25 The Penn State Research Foundation Compounds and methods for treating and preventing bacterial and viral disease
WO2006034081A2 (en) * 2004-09-17 2006-03-30 Massachusetts Institute Of Technology Polymers for analyte detection

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JON D. REUTER et al., "Inhibition of Viral Adhesion and Infection by Sialic-Acid-Conjugated Dendritic Polymers". Bioconjugate Chemistry, 1999, 10, pages 271-278. See pages 272-275. *
MASAE ITOH et al., "Suppression of Influenza Virus Infection by an N-Thioacetylneuraminic Acid Acrylamide Copolymer Resistant to Neuraminidase", virology 1995, 212, pages 340-347. See pages 341 and 342. *
MYUNG GI-BAEK et al., "Design and Synthesis of Novel Glycopolythiophene Assemblies for Colorimetric Detection of Influenza Virus and E. coli." Bioconjugate Chemistry, 2000, 11, pages 777-788. See pages 777 and 784 in particular. *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2007344657B9 (en) 2014-02-20
IL198850A0 (en) 2010-02-17
AP2009004861A0 (en) 2009-06-30
BRPI0719561A2 (pt) 2013-01-29
WO2008091246A1 (en) 2008-07-31
KR101405764B1 (ko) 2014-06-10
CN101636169B (zh) 2014-05-07
HUE034416T2 (en) 2018-02-28
MX2009005345A (es) 2009-06-12
AU2007344657B2 (en) 2014-01-30
AP2523A (en) 2012-11-30
EP2120974B1 (en) 2017-03-01
JP5539733B2 (ja) 2014-07-02
CA2676239A1 (en) 2008-07-31
US20100008938A1 (en) 2010-01-14
AU2007344657A1 (en) 2008-07-31
NZ576948A (en) 2010-12-24
EP2120974A4 (en) 2012-11-21
JP2010516673A (ja) 2010-05-20
IL198850A (en) 2017-08-31
EA200900685A1 (ru) 2010-02-26
CN101636169A (zh) 2010-01-27
EP2120974A1 (en) 2009-11-25
CA2676239C (en) 2016-06-21
KR20100014255A (ko) 2010-02-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA026125B1 (ru) Самособирающиеся амфифильные полимеры в качестве противовирусных средств
KR101263057B1 (ko) 자기 조립형 양쪽성 중합체를 이용한 약물의 가용화 및 표적화된 전달
EP2167103B1 (en) Self-assembling amphiphilic polymers as anticancer agents
AU2012268917B2 (en) Solubilization and targeted delivery of drugs with self-assembling amphiphilic polymers
TW201438741A (zh) 作為抗病毒劑之自行聚集的兩親性聚合物
NZ590726A (en) Solubilization and targeted delivery of drugs with self-assembling amphiphilic polymers
TW201004657A (en) Self-assembling amphiphilic polymers as antiviral agents

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): KG