JP5539733B2 - 抗ウイルス薬としての自己集合性の両親媒性高分子 - Google Patents

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Description

（関連出願の相互参照）
本願は、２００６年１月１９日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１８２０号の優先権を主張するものであり、その内容は引用することによって本明細書に組み入れられる。
本発明は、両親媒性高分子および特に生体適合性のミセル形成くし形ポリマーの分野に関する。本発明は、また、標的化薬物送達および抗ウイルス薬の分野に関する。
疎水性ブロックおよび親水性ブロックを含む両親媒性ブロック共重合体は、周囲の溶媒が変更されると、種々のナノ構造に自己集合するそれらの能力のため、近年よく研究されている。Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．／Ｒｅｖ．Ｃａｎ．Ｃｈｉｍ．７７：１３１１−１３２６（１９９９）を参照。水溶液中において、両親媒性高分子の疎水性区画は、水との接触を避け、そして、系の自由界面エネルギーを最小化するために、自己集合する傾向がある。同時に、該親水性ブロックは、水性の環境において、水和した「コロナ」を形成するため、該会合体は、熱力学的に安定な構造を保持する。その結果物は、疎水性コアおよび親水性コロナを有するポリマー会合体粒子の、安定した、ラテックスのようなコロイド懸濁液である。
くし形両親媒性共重合体は、主鎖がほとんど疎水性または親水性であるという点で、ブロック共重合体とは異なり、それに組み込まれているというよりむしろ、主鎖とは反対の極性ペンダントのポリマー鎖を有する。くし形共重合体は、疎水性主鎖および親水性分岐（Ｍａｙｅｓ ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，３９９，７００号明細書）、また、親水性主鎖および疎水性分岐（Ｗａｔｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，５２１，７３６号明細書）で調製される。前者は、細胞表面受容体に対するリガンドの多価の授与を提供するために使用され、一方、後者は、薬物を可溶化し、細胞に送達するために使用される。
両親媒性高分子会合体は、不溶性薬物を可溶化するためのキャリア、標的化薬物送達媒体および遺伝子送達システムとして、研究されている。それらは、鎖のもつれおよび／または内部疎水性領域の結晶化度のため、従来の低分子量のミセルよりもさらに安定した構造を有する。媒体のポリマーの特性は、臨界ミセル濃度以下に希釈する場合、普通のリポゾームが受ける分解に比較的に影響されない会合体にする。二重層膜の欠如は、それをより容易に細胞膜と融合させ、そして細胞にそれらの搭載量を直接送達することを可能とする。また、該会合体の両親媒性の特性は、界面活性剤のような活性をもたらし、そして、適切に標的化された会合体は、ウイルス外被タンパク質と融合し、それを崩壊させることが可能であることは明白である。
卓越した生体適合性のあるポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）および細網内皮系を逃れるためのＰＥＧ−被覆「ステルス」粒子の見かけ上の能力のため、ＰＥＧを組み入れるミセル、リポゾーム、およびポリマーが、薬物送達システムのための物質として広範囲にわたって検討されている。ＰＥＧ−脂質（リポゾームおよびミセルの形成）の親水性成分として、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）の使用についての多くの報告がある。例えば、Ｋｒｉｓｈｎａｄａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２０：２９７−３０２（２００３）を参照。さらに強固な「ポリマーソーム」へ自己集合する自己集合両親媒性ブロック共重合体は、また、薬物可溶化および送達のための媒体として研究されている（Ｐｈｏｔｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，９０：３２３−３３４（２００３））。また、Ｇｒｅｆ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｍａｔｅｒ．２０：１３１（１９９３）、Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，９：９４５（１９９３）、Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，２２：１４１（１９９２）、Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，６３：２７５（２０００）、Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，５１：２２１（１９９８）、Ｙｕ ａｎｄ Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ｍａｃｒｏｌｅｃｕｌｅｓ，２９：６３５９（１９９６）、Ｄｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４：１１３（１９９９）、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，３２２，８０５号明細書、Ｓｅｏ ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，６１６，９４１号明細書およびＳｅｏ ｅｔ ａｌ．，欧州特許第０５８３９５５号明細書を参照。この能力におけるポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）の使用もまたオリゴヌクレオチドの送達を中心に報告されている（Ｎａｍ ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，５６９，５２８号明細書、Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願公開第２００４／０２４８８４２号明細書）。同様な傾向で、Ｌｕｏらは、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３５：３４５６（２００２）に、ポリヌクレオチドの送達に好適なＰＥＧ−接合ポリアミドアミン（「ＰＡＭＡＭ」）デンドリマーを記載する。
薬物の可溶化、分配、および送達の必要性に加えて、特に、標的組織、腫瘍、または臓器に誘導する標的化薬物送達システムの必要性がある。これは、通常、特定の親和力による標的側の細胞壁に対する抗体または別のリガンドの結合によって達成される。しかしながら、ＰＥＧは、ポリマー鎖の末端を除いて官能基が欠如し、そして、末端基の大部分は、別のブロック共重合体成分への結合により必然的に費やされる。この理由のため、抗体または細胞接着分子のような標的部分のＰＥＧブロック共重合体への結合は、一般に非ＰＥＧブロックに限定され、それは、あいにく、自己集合した会合体のコロナの中で通常露出される共重合体の一部ではない。
ポリマー会合体になるブロック共重合体の自己集合をもたらす相分離現象は容易に可逆し、そして、疎水性コアに架橋結合することによって会合体の安定性を増加させようとする試みがなされている（欧州特許第０５５２８０２号明細書を参照）。またブロック共重合体の疎水性成分への薬物の共有結合もまた試みられている（ＰａｒｋとＹｏｏ，米国特許第６，６２３，７２９号明細書、欧州特許第０３９７３０７号明細書）。
樹枝状ポリマーは、標的部分に容易に結合し、また、生体内の標的特定細胞（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４０：１８４５）ならびに、生物学的基体に対するウイルスのおよびバクテリアの病原菌のブロック付着に対する潜在力を有する。複数のシアル酸に結合されたくし形分枝ポリマーおよびデンドリグラフトポリマーは、ウイルス血球凝集を抑制し、生体外哺乳類細胞の感染を阻止する能力が評価されている（Ｒｅｕｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１０：２７１）。最も効果的なウイルス抑制剤は、くし形分枝およびデンドリグラフト高分子であり、これらのウイルスに対して５０，０００倍に増加された活性を示した。
最近、製薬会社のＳｔａｒｐｈａｒｍａは、ウイルスの表面上で受容体を結合することによってＨＩＶ感染を予防するデンドリマーベースのバイオサイドについての成功した開発を報告した（ＶｉｖａＧｅｌTM）（Ｈａｌｆｏｒｄ （２００５）Ｃｈｅｍ．＆ Ｅｎｇ．Ｎｅｗｓ ８３（２４）：３０）。Ｃｈｅｎら（２０００）（Ｂｉｏｍａｃｒｏｌｅｃｕｌｅｓ．１：４７３）は、第４アンモニウム機能化ポリ（プロピレンイミン）デンドリマーは、非常に強力なバイオサイドであることを報告している。
安定しており、生体適合性があり、会合体の外部に対する標的部分の結合に敏感に反応し、そして望ましい細胞内標的に薬物を送達する場合に効率的である薬物送達システムを依然として必要とする。また、同様に安定した、生体適合性のある標的化抗ウイルス薬に対する必要性もある。
本発明は、分枝点部分を有する親水性主鎖、およびこれらの分枝点部分で結合する疎水性分岐を含む、生体適合性のあるくし形ポリマー分子を提供する。本発明は、当該のポリマーから形成されたポリマー会合体の水性懸濁液を提供し、ポリマー会合体の疎水性コアに化合物を組み込むことにより、薬物、着色料、ビタミンなどの不溶性または難溶性有機化合物を可溶化する方法を提供する。水性溶媒中で不水溶性有機種を可溶化する方法は、基本的に不水溶性有機種を水性または混合水性溶媒中で本発明のポリマーと接触するステップを含む。
本発明はまた、ウイルスによる前記動物の感染の治療または予防のための方法を提供し、以下の構造のみから実質的になるくし形ポリマーを前記動物に投与するステップを含む。
Figure 0005539733
その構造は、交互の分枝点部分Ｂおよび親水性、水溶性ポリマーブロックＡから形成される主鎖を含む。疎水性側鎖ＣおよびリガンドＺは、分枝点部分に結合する。好ましくは、側鎖Ｃは、１種もしくは２種以上の親水性置換基で任意選択的に置換される直鎖もしくは分岐炭化水素、または１種もしくは２種以上の親水性置換基で任意選択的に置換されたＣ6−Ｃ30環式もしくは多環式炭化水素である。側鎖Ｃは、また、疎水性アミノ酸、ペプチド、またはポリマーであってよい。側鎖Ｃに対して好適な親水性置換基は、ヒドロキシル、カルボキシおよびアミノ基、ならびにアミド、スルホンアミド、スルホキシドおよびスルホン基である。好ましい親水性置換基は、第三アミド、スルホキシド、およびスルホンなどの非プロトン性極性基である。
該リガンドＺは、ウイルス表面に対して特異的結合親和力を有するリガンドである。「特異的結合親和力」とは、哺乳類の体内に認められる多くの細胞表面および高分子の存在下で、リガンドが生体内でのウイルス表面に結合できることを意味する。当該基ｓは結合またはスペーサー部分であり、そして、ｓがスペーサーである場合、各ｓは１〜４基のＺを運ぶことができる。ｎの値は３〜約１００の範囲であり、ｐの平均値は１〜２であり、ｒの平均値は１〜４である。
分枝点部分Ｂは、２つのポリマーブロックＡへの結合、１〜２の側鎖Ｃ（平均して）への結合、および１種もしくは２種以上のスペーサー「ｓ」および／またはリガンドＺへの結合を有する多価部分である。特定の態様において、Ｂおよびｓおよび／またはＺへの結合は、複数の反応官能基を介して構築され、結合点としての役割を果たすことができる。特定の好ましい態様において、リガンドまたは抗体などの標的部分は、本発明のポリマーの分枝点部分に共有結合し、薬物は、標的化薬物複合体を形成するために、会合体のコアに組み込まれる。
本発明はまた、上記に記載の生体適合性のあるくし形ポリマー分子を提供し、小分子治療薬の不在下でさえ、そのくし形ポリマー分子は、固有の抗ウイルス特性を有する。本抗ウイルス活性は、ウイルス粒子の外部のコーティングを分離する、両親媒性高分子の界面活性剤のような能力のためであると考えられている。好ましい態様において、抗ウイルス活性は、標的ビリオンの表面に対して結合親和力を有する標的部分の結合により高められる。
本発明は、本明細書に記載のくし形ポリマー、会合体および標的化ポリマー会合体の調製方法ならびに本明細書に記載された薬物複合体をさらに提供する。本発明のポリマーは、自己集合して、生体内で薬物を十分に可溶化し、分配させ、送達し、抗ウイルス活性を有し、非毒性であり、生体適合性があり、かつ安定しており、そして、外表面上に多数の細胞およびウイルスの標的部分を有することができるポリマー会合体になる。
図１は、インフルエンザに感染したマウスの平均生存時間における本発明の組成物の投与効果を示す。 図２は、本発明の組成物で治療される場合、インフルエンザに感染したマウスの生存時間の増加を示す。 図３は、本発明の組成物で治療される場合、インフルエンザに感染したマウスの７日間にわたる体重の減少を示す。
「πポリマー」と本明細書に称される本発明のポリマーは、式１に示されるように、交互の分枝点部分Ｂおよび親水性、水溶性ポリマーブロックＡが形成され、各分枝点部分に結合した複数の疎水性側鎖Ｃを有する主鎖を伴ったくし形構造を有する。側鎖Ｃは比較的短い疎水性部分であり、それは、脂肪酸分子、鎖またはオリゴマーであってよい。ｐの値は、理想的には２、３、または４のいずれかの整数である。実際には、ほとんどの場合、側鎖は、化学反応を介して完全には満たない効率で導入され、結果として、概して、意図した整数ではない、ポリマー調製に対するｐの平均値となる。非整数平均値は、また、下記に記載されるように、意図的に取得することができる。従って、本発明のポリマーにおけるｐの平均値は、１より大きく、そして４であってもよい（１＜ｐ≦４）。好ましい態様において、ｐは、約２〜４、そしてもっとも好ましくは、１．５≦ｐ≦２である。
主鎖ポリマーブロックＡは、親水性および／または水溶性ポリマー鎖から選択され、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、多糖類などを含むがこれらに限定されるものではない。好ましくは、ポリマー単位Ａは、式のポリ（エチレングリコール）鎖−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）m−（式中、ｍは、１〜１０，０００であり、好ましくは３〜３，０００である。）である。
様々な等級のポリ（エチレングリコール）の製造において、２つのポリ（エチレングリコール）鎖と２価リンカー部分（例、ビスフェノールＡジグリシジルエーテル）を連結して、分子量の範囲を比較的狭く維持しながら、ポリマーの分子量を実質的に２倍にするすることは、当業界では既知である。得られる「ポリ（エチレングリコール）」分子は、非グリコールリンカー部分（例えば、ポリ（エチレングリコール）−ビスフェノールＡジグリシジルエーテル付加化合物、ＣＡＳ登録番号３７２２５−２６−６を参照）により、ポリマー鎖の中点で必然的に中断される。高オリゴマー、すなわち、２つのビスフェノールＡジグリシジルエーテル部分で分離される３つのＰＥＧ鎖を有するオリゴマーは、また、既知であり、例えば、国際特許出願第ＷＯ００／２４００８号明細書を参照のこと。従って、本明細書において使用されるように、用語「ポリ（エチレングリコール）」および「ポリ（プロピレングリコール）」は、非グリコールリンカー単位を組み込むポリ（エチレングリコール）およびポリ（プロピレングリコール）ポリマー鎖を包含し、ビスフェノールＡジグリシジルエーテル、ビスフェノールＢジグリシジルエーテル、ビスフェノールＳジグリシジルエーテル、ハイドロキノンジグリシジルエーテルなどを含むがこれらに限定されるものではない。本明細書の目的のために、いかなる当該のリンカー部分も「モノマー単位」として数えない。
ポリマーブロックＡは、最も好ましくは、２０〜５０のモノマー単位の平均長さを有する。ポリエチレングリコール鎖は、１つまたは２つの末端で、別の部分へのリンカーとしての使用に好適な官能基で末端置換されてもよく、アミノ、メルカプト、アクリレート、アクリルアミド、マレイン酸エステル、マレイミド等を含むがこれらに限定されるものではない。ｎの値は、１〜１０００であり、好ましくは、３〜１００である。πポリマーの総分子量は、１０００〜１００，０００ドルトンの範囲またはそれより大きく、好ましくは、２，０００ドルトン以上、さらに好ましくは、７，０００ドルトン以上である。
疎水性部分Ｃは、同一または異なってもよく、例えば、（１種または２種以上の親水性置換基で任意選択的に置換される）直鎖炭化水素、（１種または２種以上の親水性置換基で任意選択的に置換される）多環式炭化水素、疎水性アミノ酸、ペプチドおよびポリマーであってよい。好適な親水性置換基は、ヒドロキシル、エーテル、シアノ、およびアミド官能基を含むがこれらに限定されるものではない。特に、ω−ヒドロキシ、ω−シアノ、ω−アミド、またはω−アルコキシ置換基を有するＣ8〜Ｃ20アルキル基が考えられる。これに関して、用語「置換基」とは、部分Ｃの炭化水素鎖または環系の炭素原子に対する、Ｏ、Ｎ、またはＳなどのヘテロ原子の置換を含む。従って、エーテルおよびアミド連鎖、ならびに複素環をＣに組み込んでもよい。
疎水性部分Ｃは、好ましくは、相対的に短い（Ｃ8−Ｃ20）脂肪族基であるが、短鎖オリゴマーであってもよい。好適なオリゴマーは、ポリ（グリコール酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸）、ポリ（Ｌ−乳酸）などのオリゴヒドロキシ酸、ならびにポリ（グリコール酸）およびポリ（乳酸）ヒドロキシ酸の共重合体、ならびにポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（オルソエステル）、ならびにポリ（ホスホエステル）、ポリアクトン（ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（δ−バレロラクトン）、ポリ（γ−ブチロラクトン）およびポリ（β−ヒドロキシブチラート）など）を含む。Ｃ部分はまた、コレステロール、コール酸、リトコール酸、疎水性ペプチドなどの疎水性分子から選択してもよい。各部分Ｃの分子量は、４０より大きく、好ましくは、５０〜１，０００であり、最も好ましくは、１００〜５００である。分子Ｃ−ＨのｌｏｇＰの値（オクタノール−水）は、約１．４より大きく、好ましくは、約２．０よりも大きく、さらに好ましくは、約２．５より大きい。一般に、分子Ｃ−Ｈが、水中で実質的に不溶性である場合、いずれの部分Ｃは、本発明の使用に対して好適であると考えられる。「実質的に不溶性である」とは、水と混合する場合、液体Ｃ−Ｈは、分離相を形成することを意味する。
側鎖Ｃは、ポリマー鎖に沿って規則的かつ均一に、分散されないが、クラスタ［Ｃ］pにむしろ生じることが、本発明のくし形ポリマーの際立った特徴である。これらのクラスタは、ポリマー鎖に沿ってほぼ規則的に配置され、これは、ポリマー単位Ａの単分散の程度による。従って、共通の分枝部分Ｂに結合する２つの側鎖Ｃ間の距離は、異なる分枝部分に結合する２つの側鎖間の距離とは異なる。
特に好適な本発明の態様において、分枝点部分Ｂは、式２に示される１種または２種以上の反応官能基Ｘをさらに含む。
Figure 0005539733
式２において、個々の反応基Ｘは、同一、または互いに異なってよく、ポリマー２の集合中、必要に応じて、任意選択的に妨げたりまたは保護したりしてもよい。ｒの平均値は、０（Ｘ基なし）〜約４である場合がある。通常は、反応基は、分子種間の共有結合を形成するために有用であり、従来知られている官能基から選択される場合がある。該基Ｘは、薬物分子、組織もしくは細胞の標的部分、ウイルス標的部分、マトリクス結合部分に対する結合点としての役割を果たす（たとえば、ステントまたはその他の医療装置の表面にコーティングする目的のために）。ある態様において、単一結合点Ｘであってもよい。別の態様において、３種または４種の異なる型の反応基であってもよい。マトリクス結合部分は、共有結合、特異性非共有結合相互作用（例、抗体−抗原）、または非特異性相互作用（例、イオン対を経由または「疎水性」相互作用）を介してマトリクスに結合してもよい。好適な反応基Ｘは、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＳＨ、−ＣＨＯ、−ＮＨＮＨ2、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨＮＨ2、ハロアシル、アセトアセチル、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−ＮＣＯ、−ＮＣＳなど、ビニル、アクリル、アリル、マレイン酸、桂皮酸などの反応２重結合、アセチレンカルボキシおよびアセチレンカルボキシアミド（Ｍｉｃｈａｅｌ付加、Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応、および遊離基付加反応に適する）などの反応３重結合を伴った基を含むがこれらに限定されるものではない。
例示される細胞標的部分は、受容体に特異的リガンド、抗体、およびアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）アミノ酸配列またはチロシン−イソロイシン−セリン−アルギニン−グリシン（ＹＩＳＲＧ）モチーフを所有するペプチドなどの別の標的部分、上皮細胞増殖因子、血管内皮増殖因子および線維芽細胞増殖因子を含む増殖因子、シアル酸およびＮ−アセチルノイラミン酸誘導体などのウイルス表面リガンド、葉酸、メトトレキサート、プテロイン酸、エストラジオール、エストラトリオール、テストステロン、およびその他のホルモンなどの細胞受容体リガンド、マンノース−６−リン酸塩、糖類、ビタミン、トリプトファンなどを含むがこれらに限定されるものではない。抗体は、好ましくは、細胞特異的な表面抗原に対して向けられる単クローン抗体であり、好適な標的部分は、完全抗体だけでなく、Ｆａｂ’２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメントなどの活性抗原−結合配列、または当該の抗体の活性抗原結合配列の短鎖ペプチドアナログを含む抗体フラグメントも含む。
ウイルス標的部分の例は、アミノアルキルアダマンタン、ＦｕｚｅｏｎTM、ＰＲＯ−５４２、ＢＭＳ−４８８０４３、シアル酸、２−デオキシ−２，３−ジデヒドロ−Ｎ−アセチルノイラミン酸、４−グアニジノ−Ｎｅｕ５Ａｃ２ｅｎ（ザナミビル）、オセルタミビル、ＲＷＪ−２７０２０１などのウイルス、オリゴペプチド、オリゴサッカライド、ウイルス表面、およびウイルス特異的な表面抗原に対して向けられる抗体および抗体フラグメントに結合するグリコペプチドに結合する、小分子リガンドを含む。好ましい態様において、本発明は、ウイルスノイラミニダーゼまたは血球凝集素に対するリガンドを有するπ−ポリマーを提供する。当該のポリマーは、自らの正当性において抗ウイルス特性を有することは既知であり、例えば、Ｔ．Ｍａｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１：１３８６−９８（２００３）、Ｍ．Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１２：３４０−７（１９９５）、およびＲｅｅｃｅ ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，６８０，０５４号明細書（２００４）を参照のこと。本発明の抗ウイルスポリマーおよびポリマー会合体の疎水性コアは、１つ以上の従来の抗ウイルス剤で任意選択的に充填してもよく、それはウイルス粒子の周辺で都合よく放出される。
医学的関連の別の結合基は、小化学物質、ペプチド、抗体もしくは抗体フラグメント、酵素または活性薬剤成分であってもよく、それらは、ホルモンもしくはホルモン作用薬または拮抗薬、ウイルス結合を妨害する物質、細胞内侵入後、細胞周期または細胞過程を妨害する物質など、生物過程に影響を及ぼす場合がある。細菌、菌類、高等動物、および植物を含む、単細胞および多細胞生物の細胞を標的にしてもよい。ビオチンは、π−ポリマーに結合し、アビジンおよびストレプトアビジン結合タンパク質、ペプチド、および抗体、成長ホルモン、画像剤などのその他の標的または薬学的活性剤のために結合点として使用される場合がある。
「マトリクス」とは、有機物または無機物、ガラス、シリカ、または金属面などの表面、および沈着物、細胞外マトリクス、様々な種類のアミロイド斑などのタンパク質沈着、細胞表面、ウイルス表面、およびプリオンを含む、うまく特徴づけられる場合もある、一般の均質または不均質表面を意味する。
ガラスまたはシリカマトリクス結合部分の例は、種々のハロシラン、アルコキシシラン、アシルシラン、ならびにポリマーを含む当該の官能基を示す化学物質を含む。特定のマトリクスの物理化学的特性に基づいて、別の結合基を考案することができる。例えば、ステントをコーティングするために使用される好適な結合部分は、当業者には既知である。
本発明の第３の態様において、該分枝点部分Ｂは、架橋ヒドロゲルの構造を形成するために、ポリマー鎖の別の場所にある、別の分枝点部分に接続される。当該の架橋結合は、同種官能性または異種官能性を含む多官能部分とポリマーを反応することにより生じる場合があり、同種官能性または異種官能性のうちの少なくとも１種は、第１の分枝点部分上に位置するＣ上のＸまたは反応基と反応し、そして、同種官能性または異種官能性のうちの少なくとも１つは、第２の分枝点部分でＣ上に存在するＸまたは反応官能基と反応する。架橋結合はまた、ポリマー鎖Ａの末端官能基に連結を通じて行われる場合もある。当該の架橋ポリマーは、薬物分子または標的部分の結合に適する反応官能基を任意選択的に含んでもよい。
分枝点部分Ｂは、通常は、複数の反応基を有する多官能分子から生じ、反応基のうちの２つは、親水性ポリマー単位Ａへの結合に適し、そして反応基のうちの２つは、疎水性部分Ｃへの結合に適する。部分Ｂは、上記に記載のように、追加の反応基Ｘを任意選択的に有する場合がある。
特に好ましい分枝点部分は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、またはマレイン酸の２つの分子を伴う２，３−ジアミノブタン−１，４−ジチオールの複合体である。部分Ａとしての本分枝点部分のポリエチレングリコールとの結合は、式３および３ａのポリマー主鎖を生成する。
Figure 0005539733
 ここで、ＹおよびＹ’は、同一または異なってよく、好ましくは、ＯＨ、ＮＨ2、ＯＮＨ2、ＮＨＯＨ、およびＮＨＮＨ2から選択される。好ましい態様において、ジチオールのヒドロキシルまたはアミノ基は、反応基Ｘであり、標的または薬物部分の結合点としての役割を果たす。一方、官能基ＹおよびＹ’は、Ｃ部分の結合点としての役割を果たす。あるいは、基ＹおよびＹ’は、結合点としての役割を果たし、一方、ヒドロキシルまたはアミノ基は、Ｃ部分と結合するために使用される。
式３および３ａは、各硫黄原子は独立して、ＰＥＧエステルカルボニル基にαまたはβを結合することができることを伝えることを意図している。本発明は、単一異性組成物ならびに１つまたは双方のＣ−Ｓ結合で位置異性体の混合物を含む。さらに、式１にある４つの不斉炭素のため、本発明は、すべてのキラル、メソ、ジアステレオ異性体およびその混合物を含む。
アセチレンジカルボキシル酸およびフランのＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ付加化合物はまた、好適な分枝点部分としての役割を果たしてもよい。例えば、ＰＥＧおよびアセチレンジカルボキシル酸から生じるポリエステル４は、フランとのＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応を行うことが知られている（Ｍ．Ｄｅｌｅｒｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．１８（８）：７２３−７２８（１９９７））。従って、３，４−２基置換フランとのＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応をしやすく、その結果、５などの化学種を生成し、ポリマー５は、反応基（例、スキーム１のＸおよびＸ’）を提供するために、ヒドロキシル化またはエポキシ化により修飾することができる。
Figure 0005539733
同様に、ＰＥＧのエチレンジアミン４酢酸２無水物との反応は、式６のポリエステルを提供する。
Figure 0005539733
別の好適な分枝点部分は、酒石酸、アセチレンジカルボキシル酸、ニトリロ３酢酸、３，４，３’，４’−ジフェニルスルホンテトラカルボキシル酸２無水物、３，４，３’，４’−ジフェニルエーテルテトラカルボキシル酸２無水物、ピロメリット酸２無水物、１，２−エタンジチオールおよび１，４−ブタンジチオールなどのアルカンジチオール、ビス（２−メルカプトエチル）エーテル、２−メルカプトエチルスルフィド、ジメルカプトプロパノール、ジメルカプトプリン、ジメルカプトチアジアゾール、ジメルカプトコハク酸、ベンゼンジメタンチオール、ベンゼンジチオール、ジハロゲン化ベンゼンジメタンチオール、ジハロゲン化４，４’−チオビスベンゼンチオールなどから生じる場合がある。
ＹおよびＹ’はＯＨである場合、疎水性基Ｃは、カルボキシル酸基のアミド化またはエステル化によりポリマーに結合することが可能である。疎水性基Ｃは、好ましくは、比較的小さい（Ｃ8−Ｃ20）および主に炭化水素部分であり、直鎖または分枝であってもよく、または１種または２種以上の環を含んでもよい。例は、Ｃ−Ｈ分子ｎ−オクタノール、ｎ−デカノール、ｎ−ドデシルアミン、ｎ−ペンタデシルアミン、コレステロール、およびコール酸から生じる共有結合部分を含むがこれらに限定されるものではない。便宜上、せいぜい２つの異なる疎水性側鎖を有するとして、本発明のポリマーを示すが、２つ以上の疎水性化合物の混合物が、種々の疎水性側鎖を特定のポリマーに導入するために使用することができることを理解すべきである。
一具体例として、Ｘ＝ＯＨ、ｒ＝２である、式２のポリマーを、無水マレイン酸とポリエチレングリコールの反応により調製し、ポリエステル７を形成し、その後、ジチオスレイトールと反応させ、８を形成する。酸７は、その後、ｎ−オクタデシルアミンでアミド化し、望ましいくし形ポリマー９を形成する（スキーム２）。式９に示されるＤＴＴ派生アミドくし形ポリマーは、本明細書に「π−ポリマーＡ」と称され、スキーム２の特定ポリマー９は、「Ｃ18−π−ポリマーＡ」と表す。
Figure 0005539733
ジチオスレイトールに対する２，３−ビス（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ブタン−１，４−ジチオール（ＤｕＰｒｉｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，７５５，５２８号明細書の方法により調製）の置換は、脱保護後、対応するアミノ官能化されたπ−ポリマー９ｂ（スキーム３）をもたらす。
Figure 0005539733
同様に、ブタンジチオール１０ｃの使用は、続いて起こる標的部分の結合の場所にスペーサー基Ｌを伴った一般構造９ｃのポリマーをもたらす（スキーム４）。スペーサー基Ｌは、基質分子へのリガンドまたはラベルの結合に使用するために、当技術分野において既知であるいずれかのスペーサー基であってもよく、Ｃ2〜Ｃ20アルキレンおよび１〜１０の−ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−単位を有するオリゴ（エチレングリコール）スペーサーを含むがこれらに限定されるものではない。
Figure 0005539733
別の態様において、末端アミノ基を伴うＰＥＧポリマーは、下記の構造１０〜１４に示されるように、ＡとＢとの単位間のアミド結合を有する例を調製するために使用してもよい。これらの各ポリアミドは、ＰＥＧジアミンＨ２Ｎ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）mＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ2の適切な環状無水物との反応を通して生じる場合がある。
Figure 0005539733
穏やかな状態下で、上記のアミド酸は、予想生成物である。加熱しながら、イミド形成を期待することができ、少数の反応基を有するポリマーをもたらすが、それでも疎水性Ｃ部分の結合に適している。あるいは、ペンダント側鎖ＣをポリマーＡブロックの末端に付加することができ、重合時に、分枝点部分は発生する可能性がある（スキーム５）。
Figure 0005539733
１，３−ジアミノプロパンなどの単一ジアミンに加えて、スキーム５に示されるように、（任意選択的にマスクされた）反応官能基Ｘを有するジアミンを使用してもよく、標的部分の結合に好適なポリマー１５を生じる（スキーム６）。下記の式において、ｐは、０〜４の範囲であってもよく、各Ｘは独立して、存在する可能性のあるいずれかの他の基Ｘと同一または異なる。反応基Ｘは、ペンダントである必要はないが、例えば、モノマーＨ2Ｎ−（ＣＨ2）3−ＮＨ−（ＣＨ2）3−ＮＨ2などの場合、ジアミンを作製する原子の鎖内でＮＨ基であってもよい。
Figure 0005539733
上記のように調製されたあるπ−ポリマーのいくつかは、さらに誘導体化に好適な反応基Ｘを有し、小分子、ペプチド、ヌクレオチド、糖類、抗体などの標的部分を結合し、２官能性または多官能性架橋剤を通じてポリマー鎖の架橋結合に影響を及ぼす。特定の態様において、ポリマー鎖上の反応基の部分的な誘導体化は、種々の異なる反応基を有するπ−ポリマーを生成するために行われ、種々の標的および薬物部分の単一ポリマー鎖に対する結合を可能にする。従って、例１のπ−ポリマーへのアクリロイルクロリド（または無水マレイン酸）の不足当量の添加は、ポリマーにアクリロイル（またはマレイル）基および残余ヒドロキシル基の双方を提供するであろう。次の、メルカプト−カルボキシル酸、例えばＨＳ−（ＣＨ2）3−ＣＯＯＨの不足当量のＭｉｃｈａｅｌ付加は、ヒドロキシル、アクリロイル、およびカルボキシル基をポリマーに提供するだろう。試薬の不足当量により残されるいずれかの残余反応基に加えて、システインの添加は、アミノおよびカルボキシル基を導入する。
多官能性π−ポリマーへの別の方法は、疎水性鎖Ｃの一部の意図的な削除を含む。例えば、例１のπ−ポリマーは、アミド化工程において、ペンダント形成のアルキルアミンの量を限定する簡単な方法により、未反応のカルボキシル酸基で調製することができる。さらに別の方法は、一部は反応基を含むアミンの混合によるアミド化である。また、適切な状態下で（ステップＡの過剰無水マレイン酸およびステップＢの過剰ＤＴＴ）、遊離チオール基の望ましい集団を有するポリマー調製を生成する場合がある。
例１のπ−ポリマーは、意図的に、主鎖内でＤＴＴ部分から生じるヒドロキシル基を含み、それは反応基Ｘとして役に立つ。炭酸塩／重炭酸塩緩衝液の存在下で、水媒体のアクリロイルクロリドまたはメタアクリロイルクロリドによるこれらの基のエステル化は、-ＯＨ基上にアクリロイル置換をもたらす。アクリレートポリマーは、ラジカル重合（アクリル酸化合物などのラジカルモノマーまたはビスアクリル酸化合物などの架橋の添加に関わらず）を容易に受けることができ、薬物送達（ポリマー貯蔵または蓄積として働く）を制御するのに、および局部用途（皮膚用パッチ剤または軟膏など）に好適なヒドロゲルを得る。アクリル基はまた、特に、タンパク質、酵素、ペプチド、抗体、Ｆａｂ’２フラグメントもしくはＦａｂ’フラグメント、またはその他の標的部分内のシステイン残基のチオールなどのチオールとのＭｉｃｈａｅｌ付加を受けることができる（スキーム７）。
Figure 0005539733
乾燥後、反応ヒドロキシル基を有するπ−ポリマーは、マレイン酸エステル基、Ｍｉｃｈａｅｌ受容体を結合するために無水マレイン酸でエステル化することもでき、同時に遊離カルボン酸基を生成する。得られるポリマーにおいて、マレイン２重結合は、特に、タンパク質、酵素、ペプチド、抗体、Ｆａｂ’２フラグメントもしくはＦａｂ’フラグメント、またはその他の標的部分内のシステイン残基のチオールなどのチオールとのＭｉｃｈａｅｌ付加に利用できる（スキーム８）。そして、カルボキシル基は、薬物もしくはリガンドのアミノ基、またはタンパク質およびペプチドのリジン残基に結合することに利用できる。
別の部分を、アミド化によって新規に導入した（または従来利用可能な）カルボン酸基にさらに結合してもよい。従って、少なくとも２つの異なる標的部分は、飽和反応状態下でさえ、結合することができる（すなわち、結合部分は、化学量の過剰において存在する）。
Figure 0005539733
ペンダントカルボキシレート基を有するポリマーは、典型的な結合状態下で、アミンとアミド化することができ、Ｃｕｒｔｉｕｓ再配列によってイソシアネート基に変換することもでき、その後、尿素およびカルバメートをそれぞれ形成するために、アミンまたはアルコールと結合する。かかる反応は、疎水性基Ｃを導入、または標的部分を結合するために使用することができる。
遊離アミンをジアミンと反応基の１つを少なくとも部分的に反応させることにより、ポリマー内に導入することができる。反応物の状態下で、アミン基の１つを保護するか反応しないように、ジアミンを選択しなければならない。２つのアミノ基のｐＫａが大幅に異なるため、後者は、多くの場合、約７．５のｐＨで、エチレンジアミンを使用して完了することができる。好ましくは、本アミド化は、疎水性ペンダント基の導入後、分離工程として実行される。カルボン酸基を有するペプチドまたは別の分子は、その後、本遊離アミンのアミド化により結合することができる。
従って、飽和状態下でさえ、３つもの異なるペプチドまたはその他の標的部分を、１つはチオール、１つはアミンもしくはヒドロキシル、ならびに１つはカルボキシル酸基を介して、π−ポリマーに結合することができる。
ヒドロキシルおよびチオール基はまた、アジリジンまたは（ブロモエチルアミンまたはクロロエチルアミンなどの）ハロアルキルアミンとの反応により、第一アミンに変換することができる。システアミンによるアミド化は、ペプチドまたは抗体を結合するために、ペプチドまたは抗体のシステインによって直接反応される、または、ペプチドまたは抗体との次の反応のために、例えば、アミノエタンチオールまたはＤＴＴで最初に還元される、ジスルフィドに導入することになる。
部分的な反応を行うことにより、本発明のポリマーにさらに付加反応官能基を導入することができ、（１）アクリルまたはマレイン酸誘導体などのチオール反応基、（２）アミノまたはヒドロキシルなどのカルボキシル酸反応基、（３）カルボキシルなどのアミン反応基、および（４）メルカプトなどのジスルフィド反応基を含むが、これらに限定されない。当該付加された官能基のポリマー分子あたりの数は、１／ｒからｒの数倍までであってよく、使用した試薬および使用した量により異なる。
あるいは、２つ以上の特異的リガンドは、例えばウイルスまたは細胞表面への結合の特異性を改善するために結合することができる。２つ以上の特異的リガンドはまた、異なる細胞内標的間で相互作用をもたらすために使用することもできる。例えば、あるリガンドがウイルス粒子を標的化し、別のリガンドが食細胞への結合を促進することができ、それによって、ウイルス粒子を食細胞と近接または接触させ、食作用を促進する。
当該の誘導体化は、異なる官能基結合（アミン、カルボキル酸、およびチオールなど）を通して、３つ以上の別個の標的部分および／または治療的部分のポリマーへの結合を可能にする。従って、組織特異的標的化剤、画像剤、および治療剤を単一ポリマー鎖に結合し、次のポリマーの自己集合によって、分配および標的化の有効性を監視できる標的化された治療剤が生み出されるであろう。
本発明のポリマーの繰り返し単位へのリガンド結合は、ポリマー鎖上およびナノ粒子表面上にリガンドの多価表示を提供する。多価表示は、多くの場合、標的の親和性の大幅な増加をもたらす。例えば、多価抗体は、通常の２価抗体よりも標的の除去にさらに効果的である。炭水化物結合タンパク質および炭水化物は、実際は多価であり、１価である場合、効果がないことは既知である。同様に、多価ペプチドおよび炭水化物標的部分は、モノマー単独よりもさらに効果的であろう。ポリマー結合によるＭＷの増加は、ペプチドおよびその他のリガンドの腎クリアランス率の低下をもたらす。さらに、ＰＥＧ主鎖は、ペプチドに、免疫学的監視の回避を含む、ＰＥＧ付加の有益性と同様の有益性を提供した。
さらに、多価標的部分は、多価標的（例えば、ウイルス粒子）を装飾し、１価標的部分よりもさらに効果的に中和する。多価形式の複数の（異なる）ペプチドを表示する能力は、強化した特異性をもたらすことができる。例えば、真のＨＩＶ特異性（ＨＩＶウイルス結合）ポリマーを、ＣＤ４結合領域に対応するペプチド、ウイルスのＣＣＲ−５またはＣＸＣＲ−４結合領域に対応する別のペプチド、あるいは、その他の受容体（ＣＸＣＲ−４またはＣＣＲ−５のそれぞれ）に対応する第３のペプチドに結合することにより構築することができる。当該のポリマーは、ウイルスの結合領域を完全に覆うことができ、ウイルスを細胞に結合できないようにし、それによって、非感染を可能にした。さらに、ポリマーの界面活性剤特性は、結合によりウイルス構成自体の不安定化をもたらす場合がある。ペプチドの代わりに、同一の結合形態を妨げる小分子（ＣＤ４、ＣＣＲ−５、ＣＸＣＲ−４）、またはペプチドと小分子との混合物、好ましくは、相補的活性を伴う混合物を使用することができる。得られるポリマーは、いかなる遊離ウイルスを非感染とすることができ、それ故に、コンドームの潤滑油などの成分として使用することにより感染の拡散を阻止するのに適している。さらに、当該のポリマーをＨＩＶの苦しみを低減するために患者に注射する場合がある。
一般に、ＤＴＴなどの多官能性の試薬を使用する場合、ＤＴＴによるカルボキシル酸のエステル化、または類似の副反応を通して、ポリマー鎖の部分的な架橋結合が存在する場合がある。例えば、ビスフェノールＡジグリシジルエーテル残渣に関連する、ＰＥＧ鎖の中心領域の第２ヒドロキシル基はまた、ＰＥＧ出発物質に存在する場合、架橋結合の一因となる場合がある。得られる架橋結合のヒドロゲル構造はまた、有用な物質である。例えば、本架橋結合の範囲の好適な増加、または他の架橋剤（例えば、ビソキシラン（ｂｉｓｏｘｉｒａｎｅｓ）など）を使用する明示的架橋結合により、薬物のための持続性貯蔵庫としての役割を果たす適応性のあるヒドロゲルである物質を生成することができる。物質を適切に修飾することにより（例、ＰＥＧの長さをより短くし、カルボン酸基をさらに解放し、そして好適なアクリル基を組み込む）、直鎖または架橋結合したヒドロゲル物質を生成することができ、それは、持続可能な、ステントなどの装置に固定されるか、接着性パッチまたは皮下挿入パッチのためのパッドなどの装置に吸収される貯蔵としての役割を果たす。一般に、当該の架橋結合した物質は、強化した、標的放出よりむしろ制御した放出に適している場合がある。
本発明のくし形ポリマーは、水性溶媒系において、難溶性物質の可溶化に有用である。水性溶媒中の物質を可溶化する方法は、物質およびポリマーの水溶性複合体を形成するために、水存在下で、本発明のくし形ポリマーと難溶性物質を接触するステップを含む。あるいは、水性有機エマルジョンと蒸発により除去した有機溶媒の２相において、ポリマーおよび可溶化される物質を混合することができる。例示される工程は、米国特許第６，８３８，０８９号明細書で記載され、参照により本明細書に組み込まれる。ほとんどの場合、ポリマーは、粒子のコアで合体する疎水性Ｃ鎖の中で溶解する難溶性物質を有するナノ粒子に自己集合することが考えられる。一方、Ａブロックは、粒子の水性懸濁液を安定な状態に維持させるために界面の自由エネルギーを十分に低減する親水性コロナを形成する。
場合によっては、難溶性物質は、コアの中で完全に溶解することができないが、粒子のコアで、Ｃ鎖で取り囲まれ、およびＣ鎖の中で懸濁されている固体ナノ粒子として存在することができる。本発明の実施は、Ｃ鎖の難溶性物質との混合のいかなる特定の程度にも依存しないので、本発明の目的で、これは程度の違いである。物質は、場合によっては、Ｃ鎖の中で分子レベルで溶解することができるが、その他の場合には、Ｃ鎖環境からの相分離のいずれかの程度を示すことができる。場合によっては、当該システムは、温度の関数として、ある状態から別の状態に移動することを予想することができる。
疎水性Ｃ部分を修飾することにより、ポリマー粒子の疎水性コアの溶媒力を修正することができる。好適な修飾は、疎水性コアの極性率および／または分極率を増加するために、ヒドロキシル、エーテル、アミド、およびシアノ官能基などの１つ以上の親水性置換基の導入を含むがこれらに限定されるものではない。
これらのポリマーにより溶解される難溶性物質は、脂溶性ビタミンおよび栄養素を含み、ビタミンＡ、Ｄ、ＥおよびＫ、カロチン、コレカルシフェロール、ならびにコエンザイムＱ、ドセタキセル、アムホテリシンＢ、ナイスタチン、パクリタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、ルビテカン、テニポシド、エトポシド、ダウノマイシン、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、シクロスポリン、イリノテカン代謝産物（ＳＮ−３８）、スタチン、およびステロイドなどの不溶性薬剤、着色料、光力学剤、造影剤、ならびに核酸、核酸類似体および核酸複合体を含むがこれらに限定されるものではない。核酸類似体は、チオリン酸塩およびペプチド核酸などの種類を含み、核酸複合体は、陽イオンまたはポリカチオン性の種の実質的な電荷中和量を有するオリゴ核酸のイオン結合型錯体である。
本開示のために、多くの場合、中性薬学的組成物の必要性があるため、中性ｐＨで不溶性である薬剤は、「難溶性」であると見なされる。例えば、シプロフロキサシンは、ｐＨ４．５以下で、水中に無理なく溶解できるが、本ｐＨは、薬物が眼球投与のために処方される場合、極めて刺激させる可能性がある。本発明のポリマーは、ｐＨ７で生理食塩水中にシプロフロキサシンを可溶化できる。また、本開示のために、「難溶性」は、溶解度の増加が、改良されたまたはさらに有用な組成物を生み出すような、水性媒体における溶解度のいかなる物質を意味することを理解するべきである。従って、例えば、静脈内投与用の単位用量が５ｇである場合、２ｇ／リットル程度で中度に溶解される薬剤は、「難溶性」である。
薬学的活性種を可溶化するための本発明のポリマーの能力の結果として、本発明はまた、薬学的組成物を提供し、それには、１つ以上の薬学的活性剤の治療有効量との併用で本発明の１つ以上のπ−ポリマーを含む。本発明のポリマーは、そうでなければ、薬学的活性剤の効果がない量であるものを効果的にする。従って、本開示の目的のために、「治療有効量」は、全ての組成物を効果的にする薬剤の量である。
本明細書に記載のすべての特許、特許出願、および出版物は、参照することにより本明細書にすべて組み込まれる。
実験
１．一般手順
本発明はまた、本発明のくし形ポリマーの調製のための工程を提供する。これらのポリマーの合成は、下記に記載の手順に従い、有機合成における技術の当業者によって、容易に実施される。主要な出発物質はポリエチレングリコールであり、好ましくは、使用前に乾燥させる。これは、気泡が形成を停止するまで、高温で、融解されたＰＥＧを真空下で撹拌することにより、便宜的に実施される。これは、ＰＥＧの質により異なるが、８〜１２時間かかる場合がある。一度乾燥すると、ＰＥＧは、アルゴン下で永久保存することができる。例えば、１４３０〜１５７０の分子量分布を有する商用の多分散系の「ＰＥＧ１５００」など、ＰＥＧにおける市販の産業用および研究用の等級を本発明のポリマーの生成において使用することができる。当該の物質は、ＰＥＧ鎖の中央で第２ヒドロキシル基を導入する、ビスフェノールＡジグリシジルエーテルに組み込むことができる。本発明のポリマーが最も再現性のある一定の特性を有することを保証するために、ＰＥＧは、好ましくは、ビスフェノールＡを含まず、低分散度でない。アラバマ州ハンツビルのＮｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（以前は、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）、およびノルウェーオスロのＰｏｌｙｐｕｒｅ ＡＳから市販されているような、９５％より高い単分散のＰＥＧポリマーが最も好ましい。特に好ましいＰＥＧの例は、９５％より高いＨＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）28Ｈ、分子量１２５２である「ＰＥＧ−２８」である。
すべての反応は、磁気的または好ましくは機械的撹拌を使用して、窒素またはアルゴンなどの不活性雰囲気下で実施される。
ステップＡにおいて、乾燥ＰＥＧを溶解し、無水マレイン酸（ＰＥＧモルあたり２モル）を撹拌しながら添加する。無水マレイン酸の量は、ＰＥＧ末端のヒドロキシル基の数にできるだけ一致させるべきである。無水マレイン酸の不足は、ヒドロキシル末端ポリマー鎖をもたらす一方で、無水マレイン酸の過剰は、次のステップでチオール基を消費し、早期連鎖停止反応および末端カルボキシル基をもたらす。反応温度は、臨界ではなく、工程は、４５℃〜１００℃の温度で、便宜的に実施することができる。本反応の好ましい温度は、６５℃〜９０℃である。高温を使用する場合、無水マレイン酸は昇華する傾向があり、工程では、無水マレイン酸が溶液に残っていることを確認するべきである。ヘッドスペースを最小化し、油浴の反応槽に浸すことは、効果的な方法である。
選択温度により異なるが、本反応は２時間以内に完了する、もしくは一晩実施することができる。本反応をシリカゲルプレート上のＴＬＣで監視してもよく、本反応は、無水マレイン酸の消失後まで継続される。視覚コントラスト、ＵＶ、およびヨード染色はすべて、ＴＬＣプレートを試験するために使用することができる。
ステップＢにおいて、ステップＡで生成された粗製ＰＥＧビス−マレイン酸エステルをジチオスレイトール（ＤＴＴ）およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）（流動性が必要である場合、水添加を伴う）と混合し、混合物を７０℃で撹拌する。本反応は、粘度の急増で示されるように、３０分以内で完了する。ＤＴＴの最適量より多く、または少なく使用する場合、生成物の分子量は減少する。生成物の分子量はまた、必要であれば、ＴＥＭＥＤをＴＥＡなどの効果の弱い第三アミン塩基で置換することにより、減少させることができる。
ステップＣにおいて、十分な水を反応混合物に添加し、粘度を低下させ、ポリマー中にカルボキシル酸基の１モルあたり０．１モルのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および１．０５モルのヘキサデシルアミンを添加する。（ＮＨＳのこの量が、副反応の程度を最適に最小化するように思われる。）Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）の過剰（カルボキシル酸基の１モルあたり１．４ｍｏｌのＥＤＣ）をその後、撹拌を維持するために必要に応じて添加するように、追加の水とともに少しずつ添加する。本反応混合物のｐＨは、７以上に維持し、好ましくは、９〜１１であり、アルキルアミンンの反応性を最適化する。ドデシルアミンとのこの反応は、約４０〜４５℃で実施され、一方、オクタデシルアミンとの反応での温度は、約５５℃〜５７℃である。残ったアルキルアミンンの一定レベルが観察されるまで、通常は一晩実施後、その反応はＴＣＬによって監視される。
本反応混合物を約３．０〜約４．５のｐＨに酸性化し、室温で約２４時間撹拌し、未反応のＥＤＣを壊し、その後、１Ｎ ＮａＯＨを使用して、ｐＨ７．０に滴定する。本最終反応混合物を約８００ｘｇで１〜３時間、遠心分離機で分離し、固体混入物質および副生成物を除去する。
遠心分離後、本上澄みをＧＰＣカラム（ＴｏｙｏｐｅａｒｌTM、ＳｅｐｈａｄｅｘTM、ＳｅｐｈａｃｒｙｌTM、ＢｉｏｇｅｌTMなど）で、クロマトグラフィー法で分離することができる。しかしながら、πポリマーは、両親媒性物質であり、大抵のＧＰＣカラム包装に対する親和性を示し、それは混入物質の除去を複雑にする。あるいは、本ポリマーを大孔径の疎水性相互作用カラム（例えば、米国ペンシルバニア州モントゴメリビルのＴｏｓｈｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬTM Ｐｈｅｎｙｌ ６５０Ｃ）で、クロマトグラフィー法で分離でき、水中のメタノール勾配で溶離する。好ましくは、酸性水および中性水のいくつかの変化に対して、本反応混合物を透析し、低分子量の出発物質および反応副生成物を除去する。
本反応混合物を、また、ブタノン、イソプロパノール、ブタノールまたはその他の極性有機溶媒で抽出し、有機不純物を除去してもよいが、両親媒性高分子のかなりの量が、抽出溶媒に失われる。好ましくは、本反応混合物は、使用するろ過膜の分画により異なるが、５ｋＤａ〜１０ｋＤａ、１０ｋＤａ〜３０ｋＤａ、３０ｋＤａ〜５０ｋＤａなどの分子量に生成物を分別するために好適な膜を使用して限外ろ過を行う。本ポリマーの水溶液は、ろ過膜または媒体の選択により異なるが、滅菌またはウイルスを含まない溶液を生成するために全量ろ過を行う場合がある。
２．π−ポリマーの合成
例１：ＰＥＧ−ジ（アルキルアミドスクシニル）ジチオエーテル中間分子量ポリマー（Ｃ１６−π−ポリマーＡ）
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−１５００、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を気泡の形成が停止するまで８０℃で真空下で乾燥した。（ＰＥＧの質により異なるが、８〜１２時間）。アルゴン下で永久に乾燥した状態にされた乾燥ＰＥＧを貯蔵することができる。
乾燥ＰＥＧを油浴でアルゴン下溶解し、無水マレイン酸（１モルのＰＥＧモルあたり２モル、不純物で補正）を撹拌しながら徐々に添加した。混合物を９０℃、アルゴン下で撹拌した。無水マレイン酸は昇華する傾向があるため、ヘッドスペースを最小化し、全反応槽を反応温度で維持した。容器壁上のいかなる濃縮した無水マレイン酸を擦り取り、反応混合物に戻した。エタノールおよびヘキサンを別々に溶媒として使用し、ＵＶ可視化およびヨード染色を用いて、反応物の進行をシリカゲルプレート上のＴＬＣで監視した。反応は、無水マレイン酸の消失後１時間継続した。
粗製ＰＥＧジマレイン酸エステルを２容積の水で希釈した。その後、水（ＴＥＭＥＤの１体積あたり２体積の水）にジチオスレイトール（ＤＴＴ、ＰＥＧの１当量あたり１．０１当量）およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ、１．０２当量）が入った溶液を、反応混合物に撹拌しながら添加した。反応物をアルゴン下７０℃で２．５時間撹拌し、室温で一晩放置し、その後、７０℃で２時間再度撹拌した。反応物をＴＬＣで監視し、ＤＴＴの完全消失で反応の完了を判断した。
水を上記の反応混合物に添加し、混合物を撹拌できるまで（約２５％の固体で）、粘度を低下させ、混合物をアルゴン下６５℃で撹拌し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＰＥＧ−ジマレイン酸エステル−ＤＴＴポリマーにおいてカルボキシル酸基の１モルあたり０．１モル）を添加し、次に、ヘキサデシルアミン（ポリマーにおいてカルボキシル酸基の１モルあたり１．０５モル）およびＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ、ポリマーにおいてカルボキシル酸基の１モルあたり０．５６モル）を添加した。混合物をアルゴン下で１時間撹拌し、ＥＤＣの第２部分（ポリマーにおいてカルボキシル酸基の１モルあたり０．５６モル）を添加した。加水分解でのＥＤＣの消失の理由のため、別の１時間後、ＥＤＣの第３部分（１モルのカルボキシル酸あたり総量の１．４モルのＥＤＣに対して、ポリマーにおいてカルボキシル酸基の１モルあたり０．２８モル）をさらに添加した。添加した固体が懸濁液の撹拌を困難にするので、流動性を維持する必要がある場合、さらに水を添加し、そして、必要に応じて１Ｎ ＮａＯＨを添加することにより、ｐＨは８〜１０に維持された。混合物をアルゴン下６５℃で一晩撹拌し、アルキルアミンンが安定した濃度に達したことを示すまで、ＴＬＣ（エタノールを伴ったシリカ）で監視し、その後、さらに４時間撹拌した。その後、約４．５のｐＨまで反応混合物を１Ｎ ＨＣｌで酸性化し、未反応のＥＤＣを破壊するために２４時間撹拌し、追加の１Ｎ ＮａＯＨの滴下によりｐＨ７．０まで調節した。ドデシルアミンとの反応は、約４０〜４５℃で実施され、一方、オクタデシルアミンとの反応での温度は、好ましくは、約５５℃〜５７℃である。
混合物を遠心分離瓶に移し、約８００ｘｇで２時間卓上遠心分離機で回転させ、残留固体を分離した。遠心分離後、反応混合物をイソプロパノールで抽出し、有機不純物を除去した。イソプロパノール抽出の代替物として限外ろ過が好ましい。
本方法により、以下のアミノ化合物をポリマーに共役する。
例１ａ：ウンデシルアミン
例１ｂ：オクタデシルアミン
例１ｃ：４−ノニルベンジルアミン
例１ｄ：３−［（４−フェノキシ）フェニル］プロピルアミン
例２：ＰＥＧ−ジ（アルキルアミドスクシニル）ジチオエーテル高分子量ポリマー
無水マレイン酸の１モルのあたり、０．５５モルのＤＴＴおよび０．５５モルのＴＥＭＥＤを使用することを除いては、例１で概略を述べた手順に従った。粘度が急速に上昇したので、激しい撹拌を必要とした。反応物のほとんどが５〜１０分以内に完了し、続いて、温度が５５℃から８０℃に上昇しながら、次の４時間にわたって、ゆっくりと完了したことを示した。
例３：ＰＥＧ−ジ（アルキルアミドスクシニル）ジチオエーテルポリマー
ポリマーにおいて、カルボキシル酸基の１モルあたりの１．５モルのドデシルアミンを使用することを除いては、例１で概略を述べた手順に従った。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、カルボキシル酸基の１モルあたりの１．０モル）および１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ、カルボキシル酸基の１モルあたりの３．０モル）を添加し、反応物を８０℃で４時間撹拌し、上記のように仕上げた。
本方法により、以下のアミノ化合物をポリマーに共役する：
例３ａ：ウンデシルアミン
例３ｂ：テトラデシルアミン
例３ｃ：オクタデシルアミン
例３ｄ：デヒドロアビエチルアミン
例３ｅ：コレステロール２−アミノエチルエーテル
例３ｆ：１０−フェノキシデシルアミン
例３ｇ：セバシン酸ヒドラジド
例３ｈ：オレイン酸ヒドラジド
例３ｉ：デヒドロアビエチン酸ヒドラジド
例３ｊ：コール酸ヒドラジド
例３ｋ：パルミチン酸ヒドラジド
例４：ＰＥＧ−ｃｏ−（アルキルアミドコハク酸エステル）ポリマー
乾燥ジエチルエーテル（１０ｍｌ）のＰＥＧ（６．６６ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２．３２ｍｌ、１６．６５ｍｍｏｌ）の溶液をアルゴン下０℃で冷却し、塩化メタンスルホニル（１．０３ｍｌ、１３．３２ｍｍｏｌ）で滴下処理した。１時間、０℃で撹拌を継続し、その後、室温で２時間撹拌した。エーテルを蒸発し、トリエチルアミン塩酸塩を沈殿させるために乾燥アセトン（１５ｍｌ）を残留物に添加し、それは溶液から濾過される。濾液を臭化リチウム（２．３１ｇ、２６．６４ｍｍｏｌ）で処置し、還流するために２０時間加熱した。その後、混合物をヘキサンで希釈し、ＣｅｌｉｔｅTM（０．５ｃｍ）で覆われたシリカ（３ｃｍ）の短カラムでろ過し、ヘキサンで溶離した。ろ液を乾燥し、ろ過し、α，ω−ジブロモ−ＰＥＧを油に残すために蒸発させる。
α，ω−ジブロモ−ＰＥＧをＧｏｄｊｏｉａｎらのＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３７：４３３−６（１９９６）の方法により２，２−ジブチル−４，５−ビス（メトキシカルボニル）−１，３，２−ジオキサスタンノランの１当量と反応させる。得られるジメチル酒石酸塩−ＰＥＧポリエーテルをメタノール中のＫＯＨで鹸化し、その後、上記の例１および３に記載のようにドデシルアミンもしくはヘキサデシルアミン、または例３ａ〜３ｋのアミンでアミド化する。
例５：ＥＤＴＡ２無水物とのＰＥＧ共重合
例１に記載の方法で、乾燥ＰＥＧをエチレンジアミンテトラ酢酸２無水物と反応させ、その後、例１に記載のドデシルアミンと、または例３に記載のヘキサデシルと、または例３ａ〜３ｋに記載のアミンとアミンアミド化する。
同様の方法で、以下の２無水物をＰＥＧと共重合し、続いてアミド化する。
例５ａ：ナフタレンテトラカルボン酸２無水物
例５ｂ：ペリレンテトラカルボン酸２無水物
例５ｃ：ベンゾフェノンテトラカルボン酸２無水物
例５ｄ：４，４’−（ヘキサフルオロイソプロピリデン）ジフタル酸無水物
例５ｅ：ブタンテトラカルボキシル酸２無水物
例５ｆ：ビシクロ（２，２，２）オクト−７−エン−２，３，５，６−テトラカルボキシル酸２無水物
例５ｇ：ジエチレンテトラアミン５酢酸２無水物
例５ｈ：３，４，３’，４’−ジフェニルスルホンテトラカルボキシル酸２無水物
例５ｉ：３，４，３’，４’−ジフェニルエーテルテトラカルボキシル酸２無水物
例５ｊ：ピロメリット２無水物
例６Ａ：ペンダントチオエーテルとのＰＥＧ−ジアミン共重合体
例１に記載のように調製されたＰＥＧジマレイン酸エステルを例１のＤＴＴに使用される同様の手順を使用して、ドデカンチオール（ＰＥＧジマレイン酸エステルの１当量あたり２当量）と反応させる。重合が行われない場合、希釈する必要はなく、反応を溶解ＰＥＧ−ジマレイン酸エステルにおいて行う。ＴＥＭＥＤ触媒を添加し、その後チオールを添加する。ＴＬＣを使用して出発物質の消滅後、反応を行った。蒸発によるアルキルチオールの損失が有意になる時点までの温度を使用することができる（約１００℃まで）。わずかな過剰アルキルチオールを、マレイン基を完全飽和するために使用してもよい。においまたはＴＬＣでなにも検出されなくなるまで、窒素もしくはアルゴンで散布および／または真空下で加熱することによって、反応の終わりで過剰アルキルチオールを除去する。
本方法により、以下のチオールをＰＥＧジマレイン酸エステルに共役することができる。
例６Ａａ：メルカプトコハク酸ジ−ｔ−ブチルエステル
例６Ａｂ：テトラデカンチオール
例６Ａｃ：ヘキサデカンチオール
例６Ａｄ：２−メルカプトエタンスルホン酸
例６Ａｅ：３−メルカプトプロパンスルホン酸
例６Ａｆ：６−メルカプトヘキサン酸ｔ−ブチルエステル
例６Ａｇ：４−メルカプト安息香酸ｔ−ブチルエステル
例６Ａｈ：メルカプト酢酸ｔ−ブチルエステル
例６Ａｉ：４−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ブタンチオール
例６Ａｊ：３−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ベンジルメルカプタン
例６Ａｋ：４−デシルベンジルメルカプタン
反応官能基を有するチオールは、Ｃ鎖の結合に好適であり、および／または反応官能基は、標的部分に対する結合点（Ｘ）としての役割を果たすことができる。
例６Ｂ：ペンダントチオエーテルを有するＰＥＧ−ジアミン共重合体
Figure 0005539733
例１のドデシルアミンに対して使用される同様の手順を使用して、反応混合物の流動性を維持するために必要な場合、水で希釈して、例６Ａで得たチオール付加化合物を１，４−ジアミノブタン（２つのＣＯＯＨ基あたりの１当量のジアミン）でアミド化する。完全な重合を確保するために必要な場合、ＥＤＣの追加の一定分量を添加する。本方法により、例６Ａおよび６Ａａ〜６Ａｋのチオール付加化合物をＰＥＧ−ジアミノブタンポリアミドに変換する。
本方法により、以下のジアミンをＰＥＧポリアミドに変換することができる（ＢＯＣ＝ｔ−ブトキシカルボニル）。
例６Ｂａ：２−（Ｏ−ＢＯＣ）−１，３−ジアミノ−２−プロパノール
例６Ｂｂ：Ｎ’，Ｎ’’−ジ（ＢＯＣ）ヘキサエチレンテトラアミン
例６Ｂｃ：Ｎ’，Ｎ’’−ジ（ＢＯＣ）スペルミン
例６Ｂｄ：Ｎ’−ＢＯＣスペルミジン
例６Ｂｅ：Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−トリ（ＢＯＣ）ペンタエチレンヘキサミン
例６Ｂｆ：アグマチン
例６Ｂｇ：リシンｔ−ブチルエステル
例６Ｂｈ：１，６−ジアミノヘキサン
例６Ｂｉ：１，４−フェニレンジアミン
例６Ｂｊ：１，３−フェニレンジアミン
例６Ｂｋ：１，４−ジアミノブタン−２，３−ジオールアセトニド
例７：ＰＥＧ−ジ（アルキルコハク酸エステル）ジチオエーテル
Figure 0005539733
ＤＴＴ（ｍｅｓｏ−２，３−ビス（ヘキサデシルオキシ）ブタン−１，４−ジチオール）の２，３−ビス−Ｏ−ヘキサデシルエーテルをＳ．Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３３（１０）：４２４７−４２６６（１９８５）の手順の修飾により調製する。これを例１の方法でＰＥＧ−ジマレイン酸エステルに添加する。
本方法により、以下のエーテルジチオールをＰＥＧポリマーに結合する。
例７ａ：ｍｅｓｏ−２，３−ビス（ｎ−ブトキシ）ブタン−１，４−ジチオール
例７ｂ：ｍｅｓｏ−２，３−ビス（４−ノニルフェニルメトキシ）ブタン−１，４−ジチオール
例７ｃ：ｍｅｓｏ−２，３−ビス（ビフェニル−４−メトキシ）ブタン−１，４−ジチオール
例７ｄ：４，６−ビス（デシロキシ）ベンゼン−１，３−ジメタンチオール
例７ｅ：４，５−ビス（デシロキシ）ベンゼン−１，２−ジメタンチオール
例７ｆ：３，４−ビス（デシロキシ）チオフェン−２，５−ジメタンチオール
例８Ａ：置換ＰＥＧコハク酸エステル
２−ドデセン−１−イル無水コハク酸を無水マレイン酸の代わりに使用することを除いては、例１の方法に従う。ドデセニル置換基は、最終ポリマーにおいてペンダントＣ鎖を提供する。
本方法により、以下の置換無水コハク酸をＰＥＧとエステル化する。
例８Ａａ：イソブテニル無水コハク酸
例８Ａｂ：２−オクテン−１−イル無水コハク酸
例８Ａｃ：オクタデセニル無水コハク酸
例８Ａｄ：３−オキサビシクロ−ヘキサン−２，４−ジオン
例８Ａｅ：シクロヘキサンジカルボン酸無水物
例８Ａｆ：フタル酸無水物
例８Ａｇ：４−デシル無水フタル酸
例８Ａｈ：ヘキサヒドロメチルフタル酸無水物
例８Ａｉ：テトラヒドロフタル酸無水物
例８Ａｊ：ノルボルネンジカルボン酸無水物
例８Ａｋ：カンタリジン
例８Ａｌ：ビシクロオクテンジカルボン酸無水物
例８Ａｍ：ｅｘｏ−３，６−エポキシ−１，２，３，６−テトラヒドロフタル酸無水物
例８Ａｎ：Ｓ−アセチルメルカプト無水コハク酸
例８Ｂ：ペンダントアルキル基を有するＰＥＧ−ジ（アルキルアミドスクシニル）ジチオエーテル
例１の方法により、例８Ａおよび８Ａａ〜８Ａｎに記載されるように取得した置換ＰＥＧコハク酸エステルをＤＴＴと反応させる。
本方法により、以下のジチオールを例８Ａおよび８Ａａ〜８Ａｎに記載されるように取得した置換ＰＥＧコハク酸エステルのいずれかと反応させる。
例８Ｂａ：エタン−１，２−ジチオール
例８Ｂｂ：プロパン−１，３−ジチオール
例８Ｂｃ：ブタン−１，４−ジチオール
例８Ｂｄ：ペンタン−１，５−ジチオール
例８Ｂｅ：ヘキサン−１，６−ジチオール
例８Ｂｆ：１，４−ベンゼンジチオール
例８Ｂｇ：１，３−ベンゼンジチオール
例８Ｂｈ：１，４−ベンゼンジメタンチオール
例８Ｂｉ：１，３−ベンゼンジメタンチオール
例８Ｂｊ：１，２−ベンゼンジメタンチオール
例８Ｃ：ペンダントアルキル基を有するＰＥＧ−ジアミン共重合体
例６Ｂの方法により、例８Ａに記載されるように取得した置換ＰＥＧコハク酸エステルを１，４−ジアミノブタンと共重合させる。
本方法により、以下のジアミンを例８Ａおよび８Ａａ〜８Ａｎのうちの置換ＰＥＧコハク酸エステルのいずれかと共重合させる。
例８Ｃａ：２Ｏ−ＢＯＣ１，３−ジアミノ−２−プロパノール
例８Ｃｂ：Ｎ’，Ｎ’’−ジ（ＢＯＣ）ヘキサエチレンテトラアミン
例８Ｃｃ：Ｎ’，Ｎ’’−ジ（ＢＯＣ）スペルミン
例８Ｃｄ：Ｎ’−ＢＯＣスペルミン
例８Ｃｅ：Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−トリ（ＢＯＣ）ペンタエチレンヘキサミン
例８Ｃｆ：アグマチン
例８Ｃｇ：リシンｔ−ブチルエステル
例８Ｃｈ：１，６−ジアミノヘキサン
例８Ｃｉ：１，４−フェニレンジアミン
例８Ｃｊ：１，３−フェニレンジアミン
例８Ｃｋ：１，４−ジアミノブタン−２，３−ジオールアセトニド
例９：置換酸を使用するＰＥＧ Ｔｒａｎｓエステル化
ＰＥＧ二トシル酸：１モルのＰＥＧ（ＤＭＦに溶解された、またはそのまま溶解した）に、アルゴン下で撹拌しながら、２．１モルのトシルクロリド（５％過剰モル）を添加した。本反応混合物に、２．２モルのテトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）を添加した。その後、反応物を４５℃で２時間温置した。ＴＬＣを使用して、ＴＬＣ溶媒として、エチルアセテート、トルエン、またはエタノールに生成物を溶解した。ＰＥＧ二トシル酸を、トルエンを使用して反応混合物から抽出することができる。トルエンスルホニルクロリドの代わりに、メシルクロリド（例４を参照）、トリフリック酸無水物、またはトレシルクロリドなどのその他のスルホニル剤をまた使用することもできる（米国特許出願第１０／３９７３３２号明細書、米国特許公開第２００４／０００６０５１号明細書を参照）。
ＰＥＧ二トシル酸のポリエステル重縮合：１モルの溶解ＰＥＧ−二トシル酸に、アルゴン下で撹拌しながら、１モルのＳ，Ｓ’−ジデシル−ｍｅｓｏ−２，３−ジメルカプトコハク酸および２モルのＴＥＭＥＤを添加する。流動性を維持する必要がある場合、ＤＭＦを添加する。反応混合物を８０℃で加熱し、２４時間またはＴＬＣにより完了するまで撹拌する。
例１０：ＰＥＧ−ジ（スクシニル）−ジ−（Ｏ−アシル化）チオエーテル中間分子量ポリマー（Ｃ１６−π−ポリマーＢ）
Figure 0005539733
例１に記載のように調製したＰＥＧ−ジマレイン酸エステル（１０．２４ｇ、６．１ｍｍｏｌ）を乾燥１２５ｍｌフラスコに移し、アルゴン下で７０℃まで加熱し、ＰＥＧ−ジマレイン酸エステルを溶解した。本溶解物質に、撹拌しながら、水（１０ｍＬ）、ならびにＤＴＴ（０．９６１ｇ、６．１６８ｍｍｏｌ）およびＴＥＭＥＤ（０．７２３ｇ、６．１６６ｍｍｏｌ）を水（３ｍＬ）に加えた溶液を添加した。溶液を７０℃で約４時間攪拌した。真空中で水の除去は、約９０％収率で固体ポリマーを得た。
乾燥ポリマー（５ｇ、２．７ｍｍｏｌ）をアルゴン下で７０〜９０℃で加熱し、溶解し、ＴＥＭＥＤ（０．６３５ｇ、５．５ｍｍｏｌ）を添加した。パルミトイルクロリド（１．６８９ｇ、５．５ｍｍｏｌ）を撹拌しながら添加し、混合物をアルゴン下で一晩撹拌した。（ポリマーとアシルクロリドの割合は、０〜１００％の化学量論の置換度を取得するために変更することが可能である。）水を反応混合物に添加し、「Ｃ１６−π−ポリマーＢ」を単離する。
本方法により、以下の酸を、ジ（スクシニル）ＰＥＧ−ＤＴＴ共重合体のヒドロキシル基でエステル化する。
例１０ａ：オレイン酸
例１０ｂ：コレステリルコハク酸エステル
例１０ｃ：ビフェニル−４−カルボキシル酸
例１０ｄ：４−オクチルフェニル酢酸
例１０ｅ：ヘキサデカ−６−イン酸
また、酸ハロゲン化物の使用の代替として、π−ポリマーのＤＴＴ由来のヒドロキシル基を、１，３−ビス（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イルメチル）カルボジイミド（ＢＤＤＣ）を用いて活性化でき、カルボキシル酸と直接結合することもできる。Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｅｄ．Ｄａｖｉｄ Ｃｒｉｃｈ，Ｗｉｌｅｙ，２００５ ｐ １０７−１０８およびその参考文献を参照）。
例１１：Ｃ１６−π−ポリマーＡのカルボキシル置換エステル
標準ペプチド結合形成方法（例えば、カルボジイミド試薬を通じて）を使用して、カルボキシル酸置換ポリマーを反応アミノ基を有するリガンドを結合するために使用し、アミノ基をポリマーのカルボキシル酸官能性に結合する。これらの物質は、環状無水物を有するπポリマーヒドロキシル基のエステル化で容易に取得される。例えば、Ｃ１６−π−ポリマーＡジマレイン酸エステルを、無水マレイン酸をＣ１６−π−ポリマーＡヒドロキシル基と以下のように反応させることにより調製した。
Ｃ１６−π−ポリマーＡ（２ｇ）および無水マレイン酸（０．８５ｇ）を乾式すり鉢内で磨り潰し、５０ｍＬの丸底フラスコに移した。フラスコをアルゴン下で、２〜３時間撹拌しながら９０℃に加熱した。その後、固体反応混合物を磨り潰し、水でスラリーにし、混合物を透析袋（３．５ｋＤａ分画）に移した。過剰マレイン酸および低分子量の副生成物を除去するために、混合物を水に対して透析し、濃縮水を袋から取り除き、６０℃で恒量になるまで乾燥し、Ｃ１６−π−ポリマーＡジマレイン酸エステル（１．７９ｇ）を得た。ポリマーＡの無水マレイン酸に対する割合は、０〜１００％の完全化学量論のエステル化と異なる置換を取得するために変更することが可能である。
例１１ａ：Ｃ１６−π−ポリマーＡジグリコール酸エステル
Ｃ１６−π−ポリマーＡ（２ｇ）およびジグリコール酸無水物（１．０ｇ）を上記の例１１の方法で反応させ、Ｃ１６−π−ポリマーＡジグリコール酸エステルを得た。無水マレイン酸と同様に、ポリマーＡの無水物に対する割合は、０〜１００％の完全化学量論のエステル化と異なる置換を取得するために変更することが可能である。
例１１ｂ：Ｃ１６−π−ポリマーＡビス（アコニット酸エステル）
Ｃ１６−π−ポリマーＡ（２ｇ）およびアコニット酸無水物（１．３５ｇ）を上記の例１１の方法で反応させ、Ｃ１６−π−ポリマーＡビス（アコニット酸エステル）を得た。
同様の方法において、以下の無水物は、Ｃ１６−π−ポリマーＡに結合する。難溶解性の無水物を使用する場合、精製の補助として透析する前に、ｐＨは、４．５〜６．５で調節される場合がある。０．１Ｎ ＨＣｌに対して第２透析は、必要に応じて、ポリマーの酸性型を提供する。
例１１ｃ：無水コハク酸
例１１ｄ：グルタル酸無水物
例１１ｅ：無水フタル酸
無水マレイン酸またはｃｉｓ−アコチニック酸無水物とエステル化することで導入した反応２重結合をまた、下記の例１２に記載されるように、チオール含有のリガンドをポリマーに添加するために使用する場合がある。
例１２：Ｃ１６−π−ポリマーＡジマレイン酸エステルのシステイン付加化合物：
粉末Ｃ１６−π−ポリマーＡジマレイン酸エステル（例１１）（２５３ｍｇ）を水（５ｍＬ）に添加し、混合物を激しく撹拌した。システイン（２４ｍｇ）およびＴＥＭＥＤ（３０．５μｌ）を反応混合物に添加し、混合物をアルゴン雰囲気下、室温で撹拌した。ニンヒドリンを用いた検出とともに、反応の進行をＴＬＣ（シリカゲルプレート、ｎ−ブタノール−酢酸−水、３：１：１）で監視した。反応混合物は、ポリマーとともに移動するニンヒドリン陽性スポットを示した。システインもまた、ニンヒドリン陽性スポットを付与したが、一方、出発ポリマーは、ニンヒドリンでいずれの色も付与しなかった。
上記に記載の方法は、結合点として使用するために追加のカルボキシル基を導入するために使用され、多数のカルボキシル置換基を有するチオールを使用する。例えば、メルカプトコハク酸を以下のＣ１６−π−ポリマーＡジエステルに添加した。
例１２ａ：Ｃ１６−π−ポリマーＡジマレイン酸エステル
例１２ｂ：Ｃ１６−π−ポリマーＡジグリコール酸エステル
例１２ｃ：Ｃ１６−π−ポリマーＡ（ビス）アコニット酸エステル
Figure 0005539733
同様な方法で、３メルカプトグルタル酸を以下のＣ１６−π−ポリマーＡジエステルに添加した。
例１２ｄ：Ｃ１６−π−ポリマーＡジマレイン酸エステル
例１２ｅ：Ｃ１６−π−ポリマーＡジアクリル酸エステル
例１２ｆ：Ｃ１６−π−ポリマーＡ（ビス）アコニット酸エステル
３．不溶性または弱可溶性物質を可溶化するためのπポリマーの使用
例１：染料の可溶化
溶性物質を除去するために遠心分離にかけられたがその他の点では精製されていないＰＥＧ１５００−コ−スクシニル−ＤＴＴ−ビス−Ｃ１６−アミドポリマー（Ｃ１６−ポリマーＡ、例１）の５０ｍｇ／ｍｌ水溶液の１．０ｍｌアリコートに、別々の容器（ＦｌｅｘＥｘｃｅｌTM透明ポリプロピレン舟形秤、ＷＢ２．５サイズ、Ｗｅｓｔ Ｈａｖｅｎ，ＣＴのＡｌｌＥｘｃｅｌ，Ｉｎｃの製品）中のエオシンＹ、ジクロロフルオレセイン、およびスーダンＩＶといった染料の超過量を添加し、成分を一緒に攪拌してペーストを形成した。その後、耐水性両面テープを使用して、容器の底を小型宝石超音波洗浄器槽の底に取り付けた。舟形秤を約３分の１の高さまで浸すのにちょうど十分な量の水を槽に加えた。超音波処理を５分のステップで１５分間行った。液体を遠心分離管に移して、卓上遠心分離機中で３０分間２度遠心分離にかけ、非溶解染料を沈殿させた。上澄みをきれいな管に移して再び遠心分離にかけ、混入固体を除去した。ポリマー溶液の量と同じ量の蒸留水中の同じ量の染料の懸濁液を、対照として同じ方法で処理する。液滴から円を形成するために、結果として生じた溶液をＴＬＣプレートに染みをつけた（２５ｕｌ）。染みの強度を、近似濃度を決定するためにエタノールまたはエタノール／水中で作られた染料溶液の標準から作られた染みと比較した。染みは図１に示す。水中の染料の溶解度は、室温で１ｌ以上の脱イオン水（非緩衝化）に適切な量の染料を溶解させ、飽和溶液を得るために必要に応じてさらに水を添加する（つまり水で滴定して）ことによって、決定した。
５０ｍｇ／ｍｌポリマー中のスーダンＩＶの濃度は、Ｈ2Ｏ中の０．０００ｍｇ／ｍｌとは対照的に、約０．２ｍｇ／ｍｌであった（スーダンＩＶは中性ｐＨで不溶性）。ジクロロフルオレセインの濃度は、Ｈ2Ｏ中の０．０１０ｍｇ／ｍｌとは対照的に、５０ｍｇ／ｍｌポリマー中で約５ｍｇ／ｍｌであった。５０ｍｇ／ｍｌポリマー中のエオシンＹの濃度は、Ｈ2Ｏ中の０．００７ｍｇ／ｍｌとは対照的に、約５ｍｇ／ｍｌであった。ペイロード比（１単位量のポリマーあたりの薬物の量、ｇ／ｇ）を計算したら、スーダンＩＶに対しては約１：２５０、ジクロロフルオレセインに対しては１：１０、およびエオシンＹに対しては１：１０となった。
物理化学的性質において薬学的活性物質に似ている極性化合物に対する１：１０のペイロード比は、リポソーム、シクロデキストリン、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒTM、もしくは界面活性剤またはその他の可溶化システムと概して結合可能なものよりも高い。エオシンＹは、能率が非常に高い光活性化可能な一重項酸素発生源であり、例１のポリマーで作られるようなエオシンＹの濃縮液は、光活性化可能な細胞毒性薬として薬学的に活性であると予期することができる。
水中のジクロロフルオレセインの蛍光スペクトル（緑がかかった黄色）について、ポリマー溶液中（赤みを帯びた黄色／オレンジ色）のジクロロフルオレセインの蛍光スペクトルの変化は、視覚的に顕著であり、染料が水性の環境中にないが、自己集合ポリマー粒子コアの有機的環境に封入されていることを示す。確かに、蛍光スペクトルの変化は、微小環境（例えば「脂質プローブ」）の極性の変化を決定する方法として使用されている。ポリマー中のスーダンＩＶ溶液の色は、エタノール溶液中の赤色および水に懸濁した時の茶色の粒子とは対照的に、赤褐色であった。エオシンＹは有意な視覚的変化を示さなかった（水中ではピンクに対しポリマー溶液中では赤みを帯びたピンク）。
例２：医学関連物質の可溶化
プルプリン、アムホテリシンＢ、カンプトセシン、およびドキソルビシンを、代表的な難溶性活性薬剤成分（ＡＰＩ）として選択した。アムホテリシンＢは、抗菌薬注射剤としてリポソーム製剤の形で使用され、一方、カンプトセシンおよびドキソルビシンは抗癌剤である。プルプリンは、薬剤実用性の潜在的可能性があるＤＮＡ挿入染料であり、エオシンＹは光線力学療法における利用の潜在的可能性がある感光性一重項酸素試薬である。各ＡＰＩは、Ｃ１６−π−ポリマーＡ、Ｃ１８−π−ポリマーＢ、および／またはＣ１６−π−ポリマーＡ−葉酸複合体（下記参照）とともに、水中で可溶化した。可溶化は、染料について上記に説明したように、可溶化ＡＰＩおよび非可溶化対照をＴＬＣプレートに染みをつけることによって実証した。
乾燥ポリマーは、必要に応じて水、加熱、攪拌、および超音波処理でもとに戻した。溶液の粘性が高すぎる場合は、希釈した。Ｃ１６−π−ポリマーＡを１０％ｗ／ｖで、葉酸エステルＣ１６−π−ポリマーＡを５％ｗ／ｖで、Ｃ１８−π−ポリマーＢを２％ｗ／ｖで使用した。
製剤原料（２０ｍｇ）を１ｍｌのポリマー溶液に直接添加し、ドキソルビシンを除いて、Ｃ１６−π−ポリマーＡに対しては５：１、葉酸エステルＣ１６−π−ポリマーＡに対しては２．５：１、Ｃ１８−π−ポリマーＢに対しては１：１というポリマー：ＡＰＩ質量比を結果としてもたらした（下記参照）。混合物は低出力で１時間超音波処理し、その後、２０００ｘｇで２度遠心分離にかけて非溶解固体を除去した。沈殿固体の量は有意ではなかった。
塩酸ドキソルビシンを、上記のように１０：１のＣ１６−π−ポリマーＡ対塩化ドキソルビシン質量比、または５：１の葉酸エステルＣ１６−π−ポリマーＡ対塩化ドキソルビシン質量比でポリマーと混合し、続いて十分な３Ｍ酢酸ナトリウムを添加して塩化ドキソルビシンを中和した。混合物は２４時間激しくに振り、その後、２０００ｘｇで２度遠心分離にかけて非溶解固体を除去した。沈殿固体の量は有意ではなかった。
可溶化ＡＰＩ対ポリマーの質量比を表１に示す。ポリマーの取り込みを最大限化しようという試行を行わなかった。それゆえ、これらの比は、ポリマーを溶液中に溶解することが可能であるＡＰＩの量の下限値を表す。
各溶液の１０ｕｌの試料をＢａｋｅｒｆｌｅｘTMシリカゲルＴＬＣプレートに染みをつけて広げさせた。水溶液は円の外側境界、および封入物質を伴うポリマーの移動によって形成される内側円を形成する。あらゆる場合において、水性のみの区域の縁の周辺にはＡＰＩが少ししかなく、可溶化の成功および封入物質の最小限の漏出を示す。
Figure 0005539733
４．πポリマーの生体適合性
例１：局所緩和薬、クリームまたはペーストに対する適合性
例１のポリマーの濃縮油性ワックスを、発明者が手首の内側の皮膚に擦り付け、取り込みについて観察した。該物質は、薬剤ワックス状クリームと同様に吸収され、該領域をやや柔らかくすると思われた。発赤、発疹、または痒みなどの即時または遅延型アレルギー反応は、この単回局所使用時に観察されなかった。
これらのポリマーの多くは、室温で吸湿性ワックスであり、組成によって約４５℃〜６０℃またはそれを超える予想ｍｐを有する。低分子量（ＭＷ）ＰＥＧでできたポリマーは、室温で液体になることさえできる。一部のポリマーは室温で固体となることができ、体温で融解する。よって、これらのπポリマーの特性は、πポリマーを、それら自体で、または活性医薬品を含む様々な物質との混合物として、ローション、クリーム、軟膏、皮膚軟化剤、およびその他の導入形態を作製するための優れた基質とする。
例２：非経口投与に対する適合性
例１のポリマーの水溶液を、リン酸緩衝生理食塩水中で調製し、そして０．２２ｕｍフィルタを通して無菌管内へろ過した。
最大許容量プロトコルを採用した。この場合、ＣＤ−１マウスが、ポリマーの最大５％ｗ／ｖ水溶液の尾静脈注射で、体重１ｋｇあたり１０ｍｌの投与を受けた。マウスは１２時間継続的に、その後、群に応じて４８〜７２時間まで２時間ごとに観察した。血液試料を採取して分析した。一部のマウスを屠殺し、最初に肉眼的組織学について検査した。その後、顕微鏡的組織学を選択された部分に行った。
対照マウスと処置マウスとの間に、血液化学の観察可能な差異は見出されなかった。心臓、肺、腎臓、脾臓、肝臓、腸、胃、膀胱、皮膚、筋肉、骨、脳、およびリンパ節を含む様々な臓器の肉眼的組織学では、対照動物と比較して観察可能な差異または病変は見出されなかった。異なる群の動物からの複数の試料を、観察されている同じ結果とともに検討した。検査した組織の細胞組織構造に観察可能な差異は見出されなかった。腎臓のうちのいくつかは、ポリマーへの暴露時間を短縮したなんらかの円柱を示した。このことは、該円柱が一時的状態であり、時間が進行するにつれて正常となることを暗示する。
ポリマーは、注射製剤およびその他の非経口製剤中の医薬品としての医学的用途に安全であることが結論付けられる。ポリマーが、経口液剤、カプレット、およびタブレット、鼻腔用スプレー、経口／気管支エアロゾル、舌下、皮膚用クリーム／ローション／パッチ、点眼薬、その他の局所経路、ならびにその他の投与経路において安全であると期待することは合理的である。
５．π−ポリマーへの標的部分の付着
例１：アミド結合形成を介したＣ−１６π−ポリマーＢへのガラクトサミンの付着
ガラクトサミン（ＧＡ）は、肝アシアロ糖タンパク受容体（ＡＳＧＰＲ）を標的にし、共有結合したガラクトサミンを有するポリマーは、肝臓に運搬される。Ｌ．Ｓｅｙｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｅｐａｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ｐｈａｓｅ Ｉ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｂｏｕｎｄ Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ”Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０（６）：１６６８−１６７６（２００２）およびその中の参考文献を参照。
Ｃ１６−π−ポリマーＢ（上記の合成方法の部の例１０）（４６１ｍｇ、繰り返し単位あたり０．２ｍｍｏｌ当量ＣＯＯＨ）を１４ｍＬの水中に分散し、この分散にＥＤＣ ＨＣｌ（０．４８５ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．４６４ｍｍｏｌ）を加えた。混合物は周辺温度で１５分間攪拌し、１ｍｌの水中のガラクトサミンＨＣｌ（０．３８６ｍｍｏｌ）およびＴＥＭＥＤ（０．３８７ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。溶液を攪拌し、反応に続いてシリカゲル上のＴＬＣおよび１−ブタノール−酢酸−水（３：１：１）中の展開を行った。追加量のＴＥＭＥＤ（０．０７９ｍｍｏｌ）、ＮＨＳ（０．０７８ｍｍｏｌ）、およびＥＤＣ ＨＣｌ（０．１９３ｍｍｏｌ）を添加して、反応の完了を強制した。ＴＬＣがＧＡの消費に関して定常状態を示した時、反応混合物を３×１０００ｍｌの脱イオン水に対して透析し（３５００Ｄａの分画膜）、低分子量反応物質および副生成物を除去した。濃縮水を除去し、恒量（３４８ｍｇ）まで６０℃で乾燥した。
生成物のＴＬＣは遊離ＧＡを示さなかった（ニンヒドリン陰性）。結合ＧＡを加水分解するために、生成物の試料を、１００℃で６Ｎ ＨＣｌにより加水分解した。ＴＬＣ分析は、参照ＧＡと同じＲｆでＧＡの存在を示した（ニンヒドリン陽性）。
例２：Ｃ１８−π−ポリマーＡへの葉酸の付着
ＢＤＤＣ（２．４４ｇ、８．５６ｍｍｏｌ）を、アルゴンで洗い流した１２５ｍＬの丸底フラスコ内で検量した（ＢＤＤＣは蜜のような粘度で非常に粘性が高く、扱いが困難である）。Ｃ１８−π−ポリマーＡ（１０ｇ、４．２８ｍｍｏｌ）をフラスコに添加し、混合物を７０℃に加熱し、濃縮液を一緒に３０分間攪拌した。葉酸（３ｇ）を添加し、続いて十分なＴＨＦを添加して攪拌を可能にした。反応物を４０〜７０℃で一晩攪拌し、湿気から保護した。その後、そしてＴＨＦを蒸発させ、水（８０ｍＬ）を添加し、混合物を５０℃でさらに２時間攪拌した。室温まで冷却した後、３５００ダルトン分画の透析管の一部分に混合物を移し、０．１Ｎ ＨＣｌ（２×２０００ｍｌ）、水（２０００ｍｌ）、５％炭酸ナトリウム（２×２０００ｍｌ）および水（４×２０００ｍｌ）に対して透析し、未反応の試薬および副生成物を除去した。明るい黄色〜オレンジ色の濃縮水を除去した。一部は恒量まで蒸発して固体濃度を決定し、上記の可溶化実験に使用した。
例３：π−ポリマーへのＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）および類似体の付着
ともにシアル酸に結合することが知られている血球凝集素およびノイラミニダーゼ外皮タンパク質のため、ノイラミン酸誘導体はインフルエンザウイルスに対する部分を標的にしている。ＮＡＮＡおよびその誘導体を本発明のπ−ポリマーに結合するためのいくつかの方法を開発した。
例３ａ：エステル化を介したＣ１６−π−ポリマーＡへのＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）の付着
ＢＤＤＣ（２．４４ｇ、８．５６ｍｍｏｌ）およびＣ１８−π−ポリマーＡ（１０ｇ、４．２８ｍｍｏｌ）を混合して７０℃まで加熱し、アルゴン下で約３０分間一緒に攪拌する。Ｎ−アセチルノイラミン酸（３ｇ）を添加し、それに続いて流動性を維持するのに必要に応じてＴＨＦを添加する。反応物を４０〜７０℃で一晩攪拌し、湿気から保護する。水（８０ｍＬ）を添加し、混合物を５０℃でさらに２時間攪拌する。室温まで冷却した後、混合物を、０．１Ｎ ＨＣｌ、５％ＮａＨＣＯ3、水（それぞれ２×２０００ｍｌ）に対して３．５ｋＤａ分画膜で透析する。シリカゲルＴＬＣプレートに染みをつけ、１３０℃で７０％硫酸中の０．２％オルシノールで視覚化すると、ポリマーへのノイラミン酸の取り込みを示す。
例３ｂ：Ｃ１６−π−ポリマーＡへのＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）モノマレイン酸エステルの付着
５−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）（０．８６ｍｍｏｌ）、無水マレイン酸（０．９３ｍｍｏｌ）、およびトリエチルアミン（１．７７ｍｍｏｌ）を、乾燥した丸底フラスコ内の１．５ｍＬのＤＭＳＯ中に溶解した。フラスコをアルゴンで洗い流し、油浴に入れた。混合物は６５℃〜８５℃で攪拌し、進行は、反応が完了するまで（ＮＡＮＡの欠如、オルシノール／Ｈ2ＳＯ4または尿素／ＨＣｌ試薬による検出）、シリカプレート上のＴＬＣ（ｉ−ＰｒＯＨ−ＥｔＯＡｃ−水、４：３：２）によって確認した。反応混合物を室温まで冷却し、水を添加して過剰な無水マレイン酸を加水分解した。ＮＡＮＡモノマレイン酸エステルの結果として生じた溶液は、後の反応で直接使用した。
Ｃ１６−π−ポリマーＡジグリコール酸エステル（「π−ポリマーの合成」、例１１ａを参照）（１．２３ｍｍｏｌ繰り返し単位、２．４６ｍｍｏｌ−ＣＯＯＨ）の水溶液をｐＨ４．５〜６．５に調整した。カルボジイミド（ＥＤＣ ＨＣｌ、３．８６ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（２．６ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を周辺温度で約６０分間攪拌した。上記のように調製したＮＡＮＡモノマレイン酸エステル（２．４９ｍｍｏｌｅｓ）の溶液を添加し、ｐＨをＴＥＭＥＤでｐＨ６〜７に調整した。攪拌を周辺温度で最大２６時間続けた。生成物は、最初にｐＨ４．５の２０ｍモル酢酸ナトリウムに対して、その後、水に対して、透析によって精製した。濃縮水は除去して使用のために保存した。
例３ｃ：スペーサーを介したＣ１６−π−ポリマーＡへのＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）の付着
システアミン（２−アミノエタンチオール）塩酸塩（水中で０．９３ｍｍｏｌ）を等モル量のＮＡＮＡモノマレイン酸エステル（上記のように調製した溶液）に添加し、それに続いて等モル量のＴＥＭＥＤを添加して２重結合へのチオールの付着を促進した。反応に続いて、反応が完了（Ｏ−マレオイル−ＮＡＮＡの欠如、オルシノール／Ｈ2ＳＯ4または尿素／ＨＣｌ試薬による検出）して標的部分Ｄを生じるまで、シリカ上のＴＬＣ（ｉ−ＰｒＯＨ−ＥｔＯＡｃ−水、４：３：２）を行った。
Figure 0005539733
同じ方法によって、５−Ｎ−アセチル−２，３−デヒドロ−２−デオキシノイラミン酸（ＤＡＮＡ）を誘導体化し、標的部分Ｅを生じた。
Figure 0005539733
同じ方法によって、システインおよびグルタチオンをＮＡＮＡおよびＤＡＮＡのマレイン酸モノエステルに添加する。
上記の例３ｂに記載の方法によって、Ｃ１６−π−ポリマーＡビス（アコニット酸エステル）のメルカプトコハク酸エステル複合体を標的部分Ｄでアミド化した。このポリマーは、繰り返し単位あたり最大８つの−ＣＯＯＨ基を含有する（「π−ポリマーの合成」、例１２ｃを参照）。
例３ｄ：スペーサーを介したＣ１６−π−ポリマーＡへのＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）の付着
上記の方法によって、標的部分ＥをＣ１６−π−ポリマーＡジグリコール酸エステル（「「π−ポリマーの合成」、例１１ａを参照」）ポリマーに共役した。
例３ｅ：Ｃ１６−π−ポリマーへのノイラミン酸β−メチル配糖体（ＭＮＡ）の付着
平均して繰り返し単位あたりの単一カルボキシル（０．３９６ｍｍｏｌ）を有するものを水中に溶解し、ＮＨＳ（０．４ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ−ＨＣｌ（０．６４ｍｍｏｌ）と反応させた。ノイラミン酸−β−メチル配糖体（ＭＮＡ）（０．４２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物は周辺温度（２５〜３０℃）で１８〜２４時間攪拌し、そして透析によって精製した。
例３ｆ：繰り返し単位あたり２つのカルボキシ基を有するＣ１６−π−ポリマーＡジグリコール酸エステルの第２の試料も、同じ方法でＭＮＡと共役した。
例３ｇ：Ｃ１６−π−ポリマーＢへのβ−Ｏ−メチルノイラミン酸（ＭＮＡ）の付着
１ｍｌの水中の４３ミクロモルＣＯＯＨ基準である、Ｃ１６−π−ポリマーＢ、および４０ミクロモルのノイラミン酸β−メチル配糖体（Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を共に混合し、０．１ｍｌの水中の４０ミクロモルＮＨＳを添加し、それに続いて０．１ｍｌの水中の４０ミクロモルＥＤＣ塩酸塩を添加した。反応混合物を周辺温度で４８時間振り、イソプロパノール−酢酸エチル−水（４：３：２）を伴うシリカゲル上のＴＬＣによって分析した。１３０℃の７０％硫酸中の０．２％オルシノールによる検出は、開始ポリマーによる呈色反応を生成しないが、反応混合物のＴＬＣにより、ポリマーによる紫斑点同時移動を生じた。
上記の例（３ａ−３ｇ）でのあらゆるポリマー複合体は、透析後に、ＴＬＣ上のオルシノール／硫酸または尿素／ＨＣＬ試薬で視覚化する場合のノイラミン酸の存在に対して、陽性反応を示す。
例４：Ｃ１６−π−ポリマーＢへのザナミビルの付着
ザナミビル（ＧＧ１６７）は、ウイルスノイラミニダーゼの強力阻害剤であり、多価リガンドとしてこの分子を有するポリマーは、インフルエンザウイルス複製の阻害剤である。
Ｃ１６−π−ポリマーＢ（９２０ｍｇ）を３０ｍＬの水中に分散し、これにＥＤＣ ＨＣｌ（１．２ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１．１ｍｍｏｌ）を加える。混合物を周辺温度で２０分間攪拌し、１ｍｌの水中の５−アセトアミド−７−（６’−アミノヘキシル）−カルバミルオキシ−４−グアニジノ−２，３，４，５−テトラデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ｎｏｎ−２−エノピラノソニック（ｅｎｏｐｙｒａｎｏｓｏｎｉｃ）酸（米国特許第６，２４２，５８２号明細書および同第６，６８０，０５４号明細書）（０．３９ｇ、０．６７ｍｍｏｌ）およびＴＥＭＥＤ（０．６７ｍｍｏｌ）のトリフルオロ酢酸塩の溶液を添加する。溶液は室温で攪拌し、反応に続いてＴＬＣを行う。反応混合物を３×１０００ｍｌの脱イオン水に対して透析し（３５００ｋＤａの分画膜）、低分子量反応物質および副生成物を除去する。濃縮水を除去し、恒量まで６０℃で乾燥する。糖の取り込みのレベルは、グアニジン基に対する比色分析によって決定することができる（Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．，３６：１５４１（１９５８））。ノイラミニダーゼ分析は、Ｐｏｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２９ ２８７（１９７９）の手順の後に行うことができる。
例５：ミモシンの付着
４．５％ｗ／ｖ溶液（１ｍｍｏｌの繰り返し単位、ＣＯＯＨ基において約２ｍｍｏｌ）としてのＣ１６−π−ポリマーＡジグリコール酸エステル（「π−ポリマーの合成」、例１１ａを参照）をＮＨＳ（２．２７ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ−ＨＣｌ（２．２３ｍｍｏｌ）と反応させ、結果として生じた混合物に、１−ミモシン（２．１４ｍｍｏｌ、５ｍｌの水中で調製し、溶解度を増加させるためにｐＨをＴＥＭＥＤで調整）の溶液を添加し、周辺温度および約６．８〜７のｐＨで約２２〜２４時間攪拌した。ｐＨは６Ｎ ＨＣｌで３〜４に調整し、混合物は１５〜３０分間攪拌し、ｐＨはＴＥＭＥＤの添加によって６．１まで上昇させた。その後、混合物は水に対して透析（３．５ｋＤ分画）し、不純物および低分子量生成物を除去した。
例６：π−ポリマーＡジマレイン酸エステルおよびジアクリル酸エステルへのペプチドおよびタンパク質の付着
Ｆａｂフラグメントに対する一般的な手順：抗体Ｆ（ａｂ’）２フラグメントにおけるジスルフィド結合は、製造者のプロトコルを使用する固定化ＴＣＥＰ ジスルフィド還元ゲル（Ｐｉｅｒｃｅ，製品番号００７７７１２）により、または代わりに、溶液中のＤＴＴもしくはＴＣＥＰにより還元し、使用済み試薬は、３０ｋＤフィルタを使用する限外ろ過によって除去される。その後、遊離スルフヒドリル基を含有する還元Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、ＴＥＭＥＤの存在下でπ−ポリマーＡジマレイン酸エステルまたはジアクリル酸エステルと反応させる。
システインおよびシステイン含有ペプチドに対する一般的な手順：π−ポリマーＡのアクリル酸エステルまたはマレイン酸エステルは、触媒としてトリエチルアミンを使用してシステイン残基と反応させる。水中のポリマージアクリル酸エステル（０．３ｍｍｏｌ繰り返し単位、０．６ｍｍｏｌアクリル酸エステル）懸濁液に、システイン（０．６６ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１．３２ｍｍｏｌ）を添加した。フラスコをアルゴンで洗い流し、周辺温度で一晩攪拌した（約１８時間）。シリカ上の反応混合物のＴＬＣ（ｉ−ＰｒＯＨ−酢酸エチル−水、４：３：２）は、システインの欠如およびポリマーに対するニンヒドリン陽性の染みを示し、アクリレート２重結合へのシステインの付加を示した。
例６ａ：Ｃ１６−π−ポリマーＡジグリコール酸エステルへの抗狂犬病抗体フラグメントの付着
分子量４５００のＰＥＧから始めて、Ｃ１６−π−ポリマーＡジマレイン酸エステルを調製した。ＢａｙＲａｂTMヒト狂犬病免疫グロブリン（ｈＩｇＧ）を、酸性ｐＨ緩衝液中で通常の方法でペプシンによって処理し、５０ｋＤフィルタを使用した限外ろ過によって精製されたＦ（ａｂ’）２フラグメントを生成した。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、上記の例５で説明したＥＤＣ方法によって、ＰＥＧ４５００ Ｃ−１６−π−ポリマーＡジグリコール酸エステルに結合した。
例６ｂ：Ｃ１６−π−ポリマーＡジマレイン酸エステルへの抗狂犬病抗体フラグメントの付着
ＢａｙＲａｂTMｈＩｇＧのＦ（ａｂ’）２フラグメント（例６ａを参照）はＤＴＴ（または代わりにＴＣＥＰ）で還元し、使用済み試薬は３０ｋＤフィルタを使用した限外ろ過によって除去した。Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントは、ｐＨ７〜８．３（ＴＥＭＥＤ）でマレイン酸２重結合への遊離チオールのマイケル添加によって、ＰＥＧ４５００Ｃ−１６−π−ポリマーＡジマレイン酸エステルに結合した。複合体は１００ｋＤフィルタを使用した限外ろ過によって精製し、低分子量汚染物質を除去した。
例６ｃ：ＰＥＧ８５００Ｃ−１６−π−ポリマーＡジマレイン酸エステルを、上記のようにＢａｙＲａｂ TM ｈＩｇＧの還元したＦ（ａｂ’）２フラグメントに共役した。
例６ｄ：Ｃ１６−π−ポリマーＡジマレイン酸エステルへのペプチドの付着：
ペプチドＫＤＹＲＧＷＫＨＷＶＹＹＴＣ（「Ｒａｂ１」）は、狂犬病ウイルスに結合すると報告されている（Ｔ．Ｌ．Ｌｅｎｔｚ，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，３（２）：８２−８８）。このペプチドの末端Ｃｙｓは、抗狂犬病ペプチド−π−ポリマーＡ複合体を合成するために使用した。ＰＥＧ１５００（０．１５７ｍｍｏｌ）由来のＣ１６−π−ポリマーＡジマレイン酸エステル（繰り返し単位あたり２つのマレイン酸部分）は、水（６ｍＬ）に溶解し、溶液のｐＨはＴＥＭＥＤで約８に調整した。ＤＭＦ（３．１ｍｌ）に溶解したペプチド（０．１５７ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物をアルゴン下周辺温度で攪拌する一方で、反応ｐＨを８〜８．３に維持した。反応の進行は、エルマン試薬で反応混合物を検査することによって確認した。約４５時間後、エルマン試験はほぼ陰性であった。水を添加してＤＭＦ濃度を下げ、反応混合物を遠心分離にかけて少量の沈殿物を除去した。透明な上澄みは１０ｋＤ遠心ろ過機（Ａｒｎｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １０ｋＤ、カタログ番号ＵＦＣ９０１０２４）を通して限外ろ過し、残留物は繰り返し水で洗浄して、低分子量汚染物質を除去した。
次の３つのペプチド（Ｏ＝オルニチン、ＮＨ2はＣ末端アミドを指定する）を自動固相合成によって調製し、Ｒａｂ１ペプチドと同じ方法でＰＥＧ１５００π−ポリマーＡジマレイン酸エステルに共役した。
例６ｄ：ＫＤＹＲＧＷＫＯＷＶＹＹＴＣ（「Ｒａｂ２」）
例６ｅ：ＫＧＷＫＨＷＶＹＣ（ＮＨ2）（「Ｒａｂ３」）
例６ｆ：ＫＧＷＫＯＷＶＹＣ（ＮＨ2）（「Ｒａｂ４」）
６．π−ポリマーの抗ウイルス活性
例１：インフルエンザに対する有効性
ＡＴＣＣ ＶＲ−１５２０（Ｈ２Ｎ１）ヒトインフルエンザウイルスをマウス・プロテクション・アッセイ（ｍｏｕｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）で使用した。２００ｕｌ／２０ｇＢＷの単回尾静脈注射は、対照動物において９９．５％の致命的感染を引き起こした（７日の未治療生存）。
１０匹のマウスが各群にいた。マウスに、上記の例３のπ−ポリマーＢ−ＭＮＡ複合体の低用量（０．０３７５％）および高用量（０．１５％）溶液の２００ｕｌ／２０ｇ体重で尾静脈注射した。治療後の動物に感染後２４時間投薬した一方で、治療前の動物に感染前６時間投薬した。陽性対照動物に１当量の遊離リガンドを注射した一方で、陰性対照に生理食塩水緩衝液注射をした。
生存時間は、指標有効性評価項目として使用した。体重は研究パラメータとして追跡した。内臓の組織学は、肉眼的検査および顕微鏡的検査の両方で行った。結果を図２に示す。
生存時間の増加は、陽性対照（図１および２）に対して２．９４時間（＋／−０．７５時間ＳＤ）しかないのに比較して、高用量治療群に対して５．９３時間（＋／−０．４８時間ＳＤ）であった。リガンドの質量に基づいて、高用量治療は、０．２ｗ／ｗの最大ポリマー複合体置換比と仮定して、多くてもリガンドの０．０３％に対応する。よって、ポリマー複合体は、非共役リガンド対照と比較して、有意に高いレベルの有効性を示した。
高用量ポリマーＢ−ＭＮＡ複合体治療群の一部のマウスの肉眼的組織学ならびに顕微鏡的検査は、治療マウスが、インフルエンザ感染の影響に起因する場合がある白血球のやや低下したレベルを骨髄部分で示したことを除いて、正常なパターンを示した。保護群（高用量−８．９％、低用量−６．２％）ならびに治療群（高用量−９．０％、低用量−９．４％）における体重減少は、陽性対照（−９．８％）におけるものよりも少なく、ポリマーよりもむしろリガンド自体との関連を示唆した（図３）。０．７％のわずかな体重増加は、未治療マウスで発生した。
例２：狂犬病に対する有効性
雌雄を混ぜた、それぞれ約２０ｇの１０匹の白色スイスマウスの群を、生体内保護分析に採用した。マウスは、狂犬病ウイルスの３×ＬＤ５０の注射を接種された。注射は、１０-6（１００ＬＤ50／ｍｌ）の希釈で、０．０３ｍｌのＣＶＳ（病原体接種ウイルス標準）狂犬病株であった。日々の生存、麻痺、および体重を監視した。２５、４８、および７２時間での薬物の腹腔内投与と、２５および４８時間での薬物の脳内投与を調査した。結果を表１および２に表す。
Figure 0005539733
Figure 0005539733

Claims (17)

  1. 本質的に以下の構造からなるくし形ポリマーであって、
    Figure 0005539733
     交互の分枝点部分Ｂおよび親水性、水溶性ポリマーブロックＡから形成される主鎖を含み、前記分枝点部分に結合する疎水性側鎖ＣおよびリガンドＺを有し、
    各ポリマーブロックＡが、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、多糖類およびその共重合体からなる群から選択され：
    各疎水性側鎖Ｃが、１種もしくは２種以上の親水性置換基で任意選択的に置換されるＣ6−Ｃ30直鎖もしくは分岐炭化水素、１種もしくは２種以上の親水性置換基で任意選択的に置換されるＣ6−Ｃ30環式もしくは多環式炭化水素、ならびに疎水性アミノ酸、ペプチドおよびポリマーからなる群から、独立に選択され、
    各リガンドＺが、独立して、ウイルスの表面に対する特異的結合親和力を有するリガンドであり、
    ｓが結合またはスペーサー部分であり、
    ｎの値が３から１００の範囲であり、
    ｐの平均値が１より大きい値から４までの範囲であり、
    ｒの平均値が１から８の範囲である、くし形ポリマー。
  2. 少なくとも１つのリガンドが、Ｎ−アセチルノイラミン酸またはその誘導体である、請求項１に記載のくし形ポリマー。
  3. 前記リガンドが、Ｎ−アセチルノイラミン酸、ノイラミン酸β−メチル配糖体、および４−グアニジノ−２，４−ジデオキシ−２，３−デヒドロ−Ｎ−アセチルノイラミン酸からなる群から選択される、請求項２に記載のくし形ポリマー。
  4. 少なくとも１つのリガンドＺが、前記ウイルスの表面に対して特異的結合親和力を有するペプチド、抗体または抗体フラグメントである、請求項１に記載のくし形ポリマー。
  5. 前記リガンドが、ヒト抗狂犬病ＩｇＧ免疫グロブリンから誘導されるＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントである、請求項４に記載のくし形ポリマー。
  6. 少なくとも１つのリガンドＺが、ＫＤＹＲＧＷＫＨＷＶＹＹＴＣ、ＫＤＹＲＧＷＫＯＷＶＹＹＴＣ、ＫＧＷＫＨＷＶＹＣ（ＮＨ2）、およびＫＧＷＫＯＷＶＹＣ（ＮＨ2）からなる群から選択されるペプチドである、請求項１に記載のくし形ポリマー。
  7. 前記ポリマーブロックＡが、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、およびその共重合体からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載のくし形ポリマー。
  8. 前記ポリマーブロックＡが、ポリ（エチレングリコール）である、請求項７に記載のくし形ポリマー。
  9. 前記ポリマーブロックＡが、４〜７００のモノマー単位の平均長さを有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載のくし形ポリマー。
  10. 前記ポリマーが、構造
    Figure 0005539733
     を有しており、式中、ｍが４〜７００であり、ＹおよびＹ’が、独立して、Ｒ、ＯＲ、ＣＯＯＲ、ＳＲ、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＯＮＨＲ、ＮＨＯＲ、ＮＲＮＨ2、ＮＨＮＨＲ、ＮＲＮＨＲ’、およびＮＨＮＲＲ’からなる群から選択され、ＲおよびＲ’が、独立して、１種もしくは２種以上の親水性置換基で任意選択的に置換されるＣ6−Ｃ30分岐もしくは直鎖炭化水素、１種もしくは２種以上の親水性置換基で任意選択的に置換されるＣ6−Ｃ30環式もしくは多環式炭化水素、ならびに疎水性アミノ酸、ペプチドおよびポリマーからなる群から選択される、請求項１に記載のくし形ポリマー。
  11. 前記ポリマーが、構造
    Figure 0005539733
     を有しており、式中、ｍが４〜７００であり、ＷがＯもしくはＮＨであり、ＹおよびＹ’が、独立して、Ｒ、ＣＯＲ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲＲ’、ＣＯＮＨＯＲ、ＣＯＮＲＮＨ2、ＣＯＮＨＮＨＲ、ＣＯＮＲＮＨＲ’、およびＣＯＮＨＮＲＲ’からなる群から選択され、ＲおよびＲ’が、独立して、１種もしくは２種以上の親水性置換基で任意選択的に置換されるＣ6−Ｃ30分岐もしくは直鎖炭化水素、１種もしくは２種以上の親水性置換基で任意選択的に置換されるＣ6−Ｃ30環式もしくは多環式炭化水素、ならびに疎水性アミノ酸、ペプチドおよびポリマーからなる群から選択される、請求項１に記載のくし形ポリマー。
  12. 前記ポリマーが、構造
    Figure 0005539733
     を有しており、式中、部分Ｄが、Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）3−ＮＨ−（ＣＨ2）3−ＮＨ2、１，４−ジアミノブタン、２−（Ｏ−ＢＯＣ）−１，３−ジアミノ−２−プロパノール、Ｎ’，Ｎ’’−ジ（ＢＯＣ）スペルミン、Ｎ’−ＢＯＣスペルミジン、Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−トリ（ＢＯＣ）ペンタエチレンヘキサミン、アグマチン、リシンｔ−ブチルエステル、１，６−ジアミノヘキサン、１，４−フェニレンジアミン、１，３−フェニレンジアミンおよび１，４−ジアミノブタン−２，３−ジオールアセトニドからなる群から選択されるジアミンによって得られ、ｍが４〜７００であり、ＲおよびＲ’が、独立して、１種もしくは２種以上の親水性置換基で任意選択的に置換されるＣ6−Ｃ30分岐もしくは直鎖炭化水素、１種もしくは２種以上の親水性置換基で任意選択的に置換されるＣ6−Ｃ30環式もしくは多環式炭化水素、ならびに疎水性アミノ酸、ペプチドおよびポリマーからなる群から選択される、請求項１に記載のくし形ポリマー。
  13. 前記ポリマーが、構造
    Figure 0005539733
     を有しており、式中、ｍが４〜７００であり、ＷがＯまたはＮＨであり、ＲおよびＲ’が、独立して、１種もしくは２種以上の親水性置換基で任意選択的に置換されるＣ6−Ｃ30分岐もしくは直鎖炭化水素、１種もしくは２種以上の親水性置換基で任意選択的に置換されるＣ6−Ｃ30環式もしくは多環式炭化水素、ならびに疎水性アミノ酸、ペプチドおよびポリマーからなる群から選択される、請求項１に記載のくし形ポリマー。
  14. 前記ポリマーが、構造
    Figure 0005539733
     を有しており、式中、ｍが４〜７００であり、Ｌが、フェニレン、Ｃ2−Ｃ6アルキレン、もしくはベンゼンジメチレンであり、ＷがＯまたはＮＨであり、ＲおよびＲ’が、独立して、１種もしくは２種以上の親水性置換基で任意選択的に置換されるＣ6−Ｃ30分岐もしくは直鎖炭化水素、１種もしくは２種以上の親水性置換基で任意選択的に置換されるＣ6−Ｃ30環式もしくは多環式炭化水素、ならびに疎水性アミノ酸、ペプチドおよびポリマーからなる群から選択される、請求項１に記載のくし形ポリマー。
  15. 前記ウイルスは、インフルエンザウイルスである、請求項１〜４のいずれかに記載のくし形ポリマー。
  16. 前記ウイルスは、狂犬病ウイルスである、請求項４〜６のいずれかに記載のくし形ポリマー。
  17. ウイルス感染の治療または予防のための医薬の製造のための、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のくし形ポリマーの使用。
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Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2001244567B2 (en) * 2001-03-27 2006-04-27 National Institute Of Agrobiological Sciences Vegetative growth-specific promoter and genetically modified plants obtained thereby
AU2007356525B2 (en) * 2007-07-19 2014-07-17 Allexcel, Inc. Self-assembling amphiphilic polymers as anticancer agents
US9119866B2 (en) * 2008-04-08 2015-09-01 Huiru Wang Glycan-based drugs, therapies and biomarkers
US8496946B2 (en) 2011-03-10 2013-07-30 International Business Machines Corporation Antimicrobial hydrogels, methods of preparation thereof, and articles therefrom
US9642916B2 (en) 2012-12-12 2017-05-09 The Regents Of The University Of California Porphyrin modified telodendrimers
US9084740B2 (en) 2013-02-19 2015-07-21 Johnson & Johnson Consumer Companies, Inc. Methods and compositions for improving appearance and formation of scar tissue
WO2017218326A1 (en) * 2016-06-12 2017-12-21 Array Technologies, Inc. Clip-on mounting rails, mounting brackets, and methods of mounting solar modules
CA3029401A1 (en) * 2016-06-30 2018-01-04 Safkan, Inc. Wearable ear cleaning device
CN110392583B (zh) 2016-09-15 2023-01-03 加利福尼亚大学董事会 改进的杂化的末端树枝状聚合物
JP7620321B2 (ja) 2018-08-31 2025-01-23 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア シアニンベースをベースとするテロデンドリマー及び癌治療のための使用
US12186335B2 (en) * 2020-04-23 2025-01-07 Johnson & Johnson Consumer Inc. Methods and compositions for inhibiting enveloped viruses using high molecular weight hydrophobically modified alkali swellable emulsion polymers and surfactant
US12076414B2 (en) 2020-04-23 2024-09-03 Johnson & Johnson Consumer Inc. Methods and compositions inhibiting enveloped viruses using high molecular weight hydrophobically modified alkali swellable emulsion polymers
WO2022271183A1 (en) * 2021-06-25 2022-12-29 Allexcel Inc. Self-assembling amphphlic polymers as anti-covid-19 agents
WO2024215612A2 (en) * 2023-04-08 2024-10-17 Roc Biomedical Inc. Methods and compositions for targeted delivery by polymersomes

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU5610198A (en) * 1996-12-19 1998-07-15 Penn State Research Foundation, The Compounds and methods for treating and preventing bacterial and viral disease
EP1063254A1 (de) * 1999-06-25 2000-12-27 Technische Uni München, Klinikum rechts der Isar, Inst. für Experiment. Onkoligie und Therapieforschung Copolymere für den Transport von Nukleinsäuren in die Zelle
WO2006003352A1 (en) * 2004-07-06 2006-01-12 Warwick Effect Polymers Limited Living radical polymerization initiator comprising a functional group capable of reacting with polyeptides or the like, comb polymer obtained therewith, polypeptide conjugates and drugs obtained therefrom
WO2006034081A2 (en) * 2004-09-17 2006-03-30 Massachusetts Institute Of Technology Polymers for analyte detection
WO2007084126A1 (en) * 2006-01-19 2007-07-26 Allexcel, Inc. Solubilization and targeted delivery of drugs with self-assembling amphiphilic polymers

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Publication number Publication date
NZ576948A (en) 2010-12-24
AU2007344657A1 (en) 2008-07-31
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HUE034416T2 (en) 2018-02-28
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