KR20100014255A - 항바이러스성 제제로서 자기 조립성 양친매성 폴리머 - Google Patents

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KR20100014255A
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Abstract

본 발명은 소수성 성분과 같은 펜턴트 지방족 기를 가지는 친수성 백본을 포함하는 양친매성 생분해성 공중합체에 관한 것이다. 폴리머는 수성 환경에서 나노 크기 분자 응집체를 형성하며, 이는 불용해성 유기 화합물을 용해시킬 수 있고 바이러스성 코트 단백질을 파괴할 수 있는 소수성 내부를 가진다. 이 폴리머는 바이러스성 표적에 응집체의 부착을 중재하는 항체, 리간드 및 다른 표적 부분에 대한 부착 포인트를 제공하는 반응성 작용기에 특징이 있다.

Description

항바이러스성 제제로서 자기 조립성 양친매성 폴리머{SELF-ASSEMBLING AMPHIPHILIC POLYMERS AS ANTIVIRAL AGENTS}
관련 출원
본 출원은 2006년 1월 19일에 출원된 국제 특허 출원 PCT/US2006/01820호를 우선권으로 주장하며, 그 내용은 본원에 참고로 포함된다.
기술 분야
본 발명은 양친매성 폴리머의 분야에 관한 것이고, 특이적으로 생체적합성 미셀-형성 콤-형태 폴리머에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 약의 용해도 증대 및 표적화된 약 전달의 분야에 관한 것이다.
주위 용매가 변하는 경우에 다양한 나노 구조로 자기 조직화(self-assembly)의 능력 때문에, 소수성 블록 및 친수성 블록을 포함하는 양친매성 블록 코폴리머는 최근에 많이 연구되고 있다. 참조 [Cameron et al., Can. J. Chem./Rev. Can. CMm. 77:1311-1326 (1999)]. 수용액에서, 양친매성 폴리머의 소수성 부분은 물과의 접촉을 피하고 시스템의 자유 계면 에너지를 최소화하기 위해 자기 조직화의 경향을 가진다. 동시에, 친수성 블록은 수성 환경에서 수화된 "코로나"를 형성하고, 그래서 응집물은 열역학적으로 안정한 구조를 유지한다. 그 결과는, 소수성 코어 및 친수성 코로나를 가지는 폴리머 집합 입자들의 안정하고, 라텍스 같은 콜로이드 현탁물이다.
콤-타입 양친매성 코폴리머는 백본이 주로 소수성 또는 친수성이고, 이에 통합되기 보다 백본으로부터 달려있는 대항하는 극성의 폴리머 사슬을 가진다는 점에서블록 코폴리머와는 다르다. 콤-타입 코폴리머는 소수성 백본 및 친수성 가지(Mayes et al., 미국 특허 제 6,399,700호), 및 또한 친수성 백본 및 소수성 가지로(Watterson et al., 미국 특허 제 6,521,736호)로 제조되어오고 있다. 전자는 세포 표면 수용체를 위한 리간드의 다가를 제공하기 위해 사용되고, 한편 후자는 약을 용해시키고 이들을 세포로 전달하기 위해 사용된다.
양친매성 폴리머 응집물은 불용해성 약, 표적된 약 전달 비히클, 및 유전자 전달 시스템을 용해시키기 위한 담체로서 연구되고 있다. 이들은 내부 소수성 부분의 결정 및/또는 사슬 엉킴 때문에, 통상적 낮은 분자량 미셀보다 더욱 안정적 구조를 가진다. 비히클의 폴리머 특성은 이들의 최저 미셀 형성 농도 아래에서 용해되는 경우에 일반적 리포좀이 겪게 되는 분해에 대해 상대적으로 영향을 받지 않도록 한다. 이중층 막의 부재가 이들이 세포 막과 쉽게 융합되도록 하고 세포에 집적 이들의 페이로드(payload)를 전달하도록 한다는 점에서, 이들은 또한 전통적 리포좀 약 전달 조성물에 대한 이점을 가진다. 이중막의 부재가 이들을 세포 막과 더욱 용이하게 융합하도록하고 세포에 직접적으로 이들의 페이로드를 전달하도록 한다. 응집물의 양친매성 특성은 또한 세척제와 유사한 활동을 제공하고, 적당히 표적화된 응집물은 바이러스성 코트 단백질과 융합할 수 있고 이를 붕괴시킬 수 있 다.
훌륭한 생체 적합성 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 및 세망내피계를 피하는 PEG-코팅된 "스텔스" 입자의 명백한 능력 때문에, 미셀, 리포좀 및 PEG를 통합하는 폴리머는 약 전달 시스템을 위한 물질로서 간주되고 있다. PEG-지질(리포좀 및 미셀을 형성)의 친수성 성분으로서 폴리(에틸렌 글리콜)의 사용에 대한 많은 보고서가 존재한다. 예를 들어, [Krishnadas et al, Pharm. Res. 20:297-302 (2003)]. 더욱 강한 "폴리머좀"으로 자기 조직화되는, 자기 조직성 양친매성 블록 코폴리머는 또한 약 용해 및 전달을 위한 비히클로서 연구되고 있다(Photos et al, J. Controlled Release, 90:323-334 (2003)). 또한 [Gref et al, Int. Symp. Controlled Release Mater. 20:131 (1993); Kwon et al, Langmuir, 9:945 (1993); Kabanov et al, J. Controlled Release, 22:141 (1992); Allen et al, J. Controlled Release, 63:275 (2000); Inoue et al., J. Controlled Release, 51:221 (1998); Yu and Eisenberg, Macromolecules, 29:6359 (1996); Discher et al, Science, 284:113 (1999); Kim et al, 미국 특허 제 6,322,805호; Seo et al, 미국 특허 No. 6,616,941 및 Seo et al, 유럽 특허 제 EP 0583955이 참조된다. 이 능력에서 폴리(에틸렌이민) (PEI)의 사용은 올리고뉴클레오티드의 전달에 초점을 두고 보고되고 있다(Nam et al, 미국 특허 제 6,569,528호; Wagner et al, 미국 특허 출원 공개 제 20040248842호). 유사하게, Luo et al는 [Macromolecules 35:3456 (2002)]에서 폴리뉴클레오티드의 전달에 적합한 PEG-결합된 폴리마이도아민("PAMAM") 덴드리머를 기재하고 있다.
약을 용해, 분배 및 전달에 대한 필요성에 더하여, 표적 조직, 종양 또는 기관으로 특이적으로 표적된 약 전달 시스템에 대한 필요성이 존재한다. 일반적으로 표적 부위에 세포 벽에 대한 특이적 친화도를 가지는 항체 또는 다른 리간드의 부착에 의해 달성된다. 그러나, PEG는 폴리머의 사슬의 말단에서를 제외하고 작용기가 부족하고, 대부분의 말단 기는 불가피하게 다른 블록 코폴리머 성분에 결합에 의해 주어진다. 이 이유는, PEG 블록 코폴리머로의 항체 또는 세포 부착 분자와 같은 표적 부분의 부착은 일반적으로 자기 조직된 응집물의 코러나에 일반적으로 노출되는 코폴리머의 부분이 아닌, 비-PEG 블록에 제한되기 때문이다.
폴리머 응집물로의 블록 코폴리머의 자기 조직화를 가져오는 상 분리 현상은 쉽게 가역되고 소수성 코어를 가교함에 의해 응집물의 안정성을 증가시키려는 시도가 행해진다(참조 유럽 특허 제 EP 0552802호). 블록 코폴리머의 소수성 부분에 약의 공유 결합은 또한 시도된다(Park 및 Yoo, 미국 특허 제 6,623,729; 유럽 특허 제 EP 0397307호).
덴드리트산 폴리머는 표적 분자에 쉽게 컨쥬게이트되고, 또한 생체 내에서 특이적 세포에 표적하는 힘을 가지며(Singh et al. (1994) Clin. Chem. 40:1845), 바이러스성 및 박테리아성 병원체의 생물학적 기질에의 부착을 차단하는 힘을 가지고 있다. 다중 시알산에 컨쥬게이트되어 있는 콤-브랜치된 그리고 덴드리그라프트 폴리머는 적혈구응집(hemagglutination)을 억제하고 실험관에서 포유류 세포의 감염을 차단하는 이의 능력에 대해서 평가되고 있다(Reuter et al. (1999) Bioconjugate Chem. 10:271). 가장 효과적인 바이러스 억제자는 이 바이러스에 대 항하여 50,000-폴드 이하로 증가된 활성을 보여주는 콤-브랜치된 그리고 덴드리그라프 거대분자이다.
최근에, 제약회사 스타파르마(Starpharma)는 바이러스의 표면에 수용체에 결합함에 의해 HIV 감염을 차단하는 덴드리머-기재 살생제(VivaGelTM)의 성공적 개발을 알렸다(Halford (2005) Chem. & Eng. News 83 (24):30). Chen at al. (2000) (Biomacromolecules. 1:473)는 4차 암모늄 기능화된 폴리(프로필렌이민) 덴드리머가 매우 강한 살생제임을 알렸다.
응집물의 외부에 표적 부분의 부착이 쉽고, 생체 분해성이 있고, 안정하며 요구되는 세포 표적에 약을 전달하는데 효과적인 약 전달 시스템에 대한 필요성이 있다. 유사하게 안정적이고 생체적합성이 있는 표적화된 항바이러스성 제제에 대한 필요성이 있다.
발명의 개요
본 발명은 가지-포인트 부분을 가지는 친수성 백본과 이 가지-포인트 부분에 부착되어 있는 소수성 가지를 포함하는, 생체 적합적 콤-타입 폴리머 분자를 제공한다. 본 발명은 이러한 폴리머로부터 형성되는 폴리머 응집물의 수성 현탁액을 제공하고, 폴리머 응집물의 소수성 코어에서 이러한 화합물을 통합시킴에 의해, 약, 염료, 비타민 등과 같은 불용해성 또는 잘 용해되지 않는 유기 화합물을 용해시키는 방법을 제공한다. 수성 용매에서 물에 용해되지 않는 유기 표본을 용해시키는 방법은 기초적으로 물에 용해되지 않는 유지 표본을 수성 또는 혼합된 수성 용매에서 본 발명의 폴리머와 접촉시키는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 바이러스에 의한 동물의 감염의 치료 또는 차단하는 방법을 제공하며, 이는 하기 구조를 필수적으로 구성하는 콤-타입 폴리머를 상기 동물에 투여하는 것을 포함한다:
Figure 112009033403837-PCT00001
이 구조는 교호적 브랜치-포인트 부분 B 및 친수성, 물에 용해되는 폴리머 블록 A로 형성되는 백본을 포함한다. 소수성 측쇄 C 및 리간드 Z는 브랜치-포인트 부분에 부착되어 있다. 바람직하게, 측쇄 C는 하나 이상의 친수성 치환체로 치환되거나 치환되지 않은, 선형 또는 분지형 탄화수소 또는 하나 이상의 친수성 치환체로 치환되거나 치환되지 않은 C6-C30 사이클릭 또는 폴리사이클릭 탄화수소이다. 측쇄 C는 또한 소수성 아미노산, 펩티드 또는 폴리머일 수 있다. 측쇄 C를 위한 적합한 친수성 치환체는 하이드록실, 카르복시, 및 아미노 기뿐만 아니라, 아미드, 설폰아미드, 설폭시 및 설폰 기이다. 바람직한 친수성 치환체는 극성 비양자성 기 예를 들어 3차 아미드, 설폭사이드, 및 설폰이다.
리간드 Z는 바이러스 표면에 대한 특이적 결합 친화성을 가지는 리간드이다. "특이적 결합 친화성"은 이 리간드가 포유류 몸에서 발견되는 많은 세포 표면 및 거대 분자의 존재에서 생체 내에서 바이러스의 표면에 결합할 수 있음을 의미한다. 기 s는 결합 또는 스페이서 부분이고, s가 스페이서인 경우에 각 s는 1 내지 4의 기 Z를 운반할 수 있다. n의 값은 3 내지 약 100이고; p의 평균 값은 1 내지 2이며, r의 평균 값은 1 내지 4이다.
브랜치 포인트 부분 B는 두 개의 폴리머 블록 A에 결합, 1-2 측쇄 C에의 결합(평균), 및 스페이서 's'및/또는 리간 Z에의 하나 이상의 결합을 가지는 다-가 부분이다. 특별한 구체예에서, B 및 s 및/또는 Z에 대한 결합은 복수의 반응성 작용기를 통해 설치되며, 접착 포인트로 제공될 수 있다. 특별히 바람직한 구체예에서, 리간드 또는 항체와 같은 표적 부분은 본 발명의 폴리머의 브랜치-포인트 부분에 공유적으로 부착되고, 약은 응집체의 코어로 통합되어서 표적된 약 컴플렉스를 형성한다.
본 발명은 또한 상기 기재된 바와 같은 생체적합성 콤-타입 폴리머 분자를 제공하며, 작은 분자 치료의 부재에서 조차도, 본래의 항바이러스성 특성을 가진다. 항바이러스성 활동은 바이러스 입자의 외부 코팅을 방해하는 양친매성 폴리머의 세제와 유사한 활동에 기인된 것으로 생각된다. 바람직한 구체예에서, 항바이러스성 활동은 표적화된 바이러스의 표면에 대한 결합 친화성을 가지는 표적 부분의 부착에 의해 높아진다.
본 발명은 추가로 본원에 기재되어 있는 콤-타입 폴리머, 응집물 또는 표적된 약 컴플렉스의 제조를 위한 방법을 제공한다. 생체 내에서 약을 효과적으로 용해시키고, 분배시키고, 전달하는 폴리머 응집물로의 자기 조직화되는 본 발명의 폴리머는 비 독성이고, 생체 적합성이 있고, 이의 외부 표면에 다중 세포 표적 부분을 가질 수 있고, 안정적이다.
도 1은 인플루엔자 감염된 주의 평균 생존 시간에서 본 발명의 조성물의 투여의 효과를 보여준다.
도 2는 본 발명의 조성물로 치료되는 경우에 인플루엔자-감염된 주의 생존 시간에서의 증가를 보여준다.
도 3은 본 발명의 조성물로 치료되는 경우에, 인플루엔자 감염된 주의 7일의 과정에 걸쳐 중량 손실을 보여준다.
본 발명의 상세한 설명
"π-폴리머"로 본원에서 불리는, 본 발명의 폴리머는 화학식 1에 기재되어 있듯이, 콤(comb)-타입 구조를 가지고, 교차되는 가지-포인트 부분 B 및 친수성, 물에 용해되는 폴리머 블록 A의 형태의 백본을 가지고, 복수의 소수성 사슬 C를 가지며, 이는 각 가지-포인트 부분에 부착되어 있다. 측쇄 C는 상대적으로 짧고, 소수성 부분이며, 이는 지방족 부분, 사슬 또는 올리고머일 수 있다. p의 값은 이상적으로 정수, 2, 3 또는 4이다. 실시에서, 측쇄는 화학 반응을 경유하여 거의 완벽한 효능으로 종종 도입되어서, 의도된 정수가 아닌 전체적으로 폴리머 제조를 위한 p의 평균 값을 가져온다. 정수가 아닌 평균 값은 또한 아래에 논의되는 고안에 의해 얻어질 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리머에서 p의 평균 값은 1보다 크고 4와 같은 높이 일 수 있다(1 < p ≤ 4). 바람직한 구체예에서, P는 약 2 내지 4의 범위이고, 가장 바람직하게는 1.5 < p ≤ 2이다.
백본 폴리머 블록 A는 친수성 및/또는 물에 용해되는 폴리머 사슬로부터 선택되며, 비록 제한되지 않지만, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(프로필렌 글리콜), 폴리(에틸렌 이민), 폴리비닐 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리사카라이드, 등을 포함한다. 바람직하게, 폴리머 단위 A는 화학식 -(CH2CH2O)m-의 폴리(에틸렌 글리콜) 사슬이며, 여기서 m은 1 내지 10,000, 바람직하게는 3 내지 3,000이다.
여러 등급의 폴리(에틸렌 글리콜)의 제조에서, 상대적으로 접은 분자량 범위를 보유하면서 폴리머의 분자량을 효과적으로 두 배로 하는, 두 개의 폴리(에틸렌 글리콜) 사슬로 2가 링커 부분(예를 들어, 비스페놀 A 디글리시딜 에테르)을 결합하는 것이 산업에 알려져 있다. 그 결과 얻어진 "폴리(에틸렌 글리콜)" 분자는 결과적으로 비-글리콜 링커 부분에 의해 폴리머 사슬의 중간 지점에서 방해된다(참조, 예를 들어 폴리(에틸렌 글리콜)-비스페놀 A 디글리시딜 에테르 부가물, CAS 등록 제 37225-26-6). 더 높은 올리머, 즉 두 개의 비스페늘 A 디글리시딜 에테르 부분에 의해 분리되는 세 개의 PEG 사슬을 가지는 것들은 또한 알려져 있다, 예를 들어 국제 측허 출원 WO 00/24008이 참조된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 그래서, 용어 "폴리(에틸렌 글리콜)" 및 "폴리(프로필렌 글리콜)"은 비 글리콜 링커 단위를 통합하는 폴리(에틸렌 글리콜) 및 폴리(프로필렌 글리콜) 폴리머 사슬을 포 함한다. 비제한적으로 비스페놀 A 디글리시딜 에테르, 비스페놀 B 디글리시딜 에테르, 비스페놀 S 디글리시딜 에테르, 하이드로퀴논 디글리시딜 에테르 등이 포함된다. 본 발명의 목적은, 임의의 이러한 링커 부분이 "단량체 단위"로서 여겨지지 않는 것이다.
폴리머 블록 A는 가장 바람직하게 20 내지 50 단량체 단위의 평균 길이를 가진다. 폴리에틸렌 글리콜 사슬은 하나 또는 두 개의 말단에서, 제한적이지 않게 아미노, 메르캅토, 아크릴레이트, 아크릴아미드, 말레에이트, 말레이미드 등을 포함하는, 다른 부분에 링커로서 사용에 적합한 작용기로 말단이 치환될 수 있다. n의 값은 1 내지 1000의 범위이고, 바람직하게는 3 내지 100이다. π-폴리머의 전반적 분자량은 1000 내지 100,000 달톤 또는 그 초과의 범위일 수 있다. 바람직하게는 2,000 달톤 초과 및 더욱 바람직하게는 7,000 달톤 초과이다.
소수성 부분 C는 동일하거나 상이할 수 있고, 예를 들어 선형 탄화수소(하나 이상의 친수성 치환체로 치환되거나 치환되지 않음), 폴리시클릭 탄화수소(하나 이상의 친수성 치환체로 치환되거나 치환되지 않음), 소수성 아미노산, 펩티드 및 폴러머일 수 있다. 적합한 친수성 치환체는 제한되지 않게 하이드록실, 에테르, 시아노, 및 아미드 작용기를 포함한다. 특이적으로 ω-하이드록시, ω-시아노, ω-아미도, or ω-알콕시 치환체를 가지는 C8 내지 C20 알킬 기가 고려된다. 본원에서, 용어 "치환체"는 부분 C의 고리 시스템 또는 탄화수소 사슬에서의 탄소 원자를 위한 O, N, 또는 S와 같은 헤테로원자의 치환을 포함한다. 따라서, 에테르 및 아 미드 결합 및 헤테로사이클릭 고리는 C에 통합될 수 있다.
소수성 부분 C는 바람직하게 상대적으로 짧은(C8-C20) 지방족 사슬이지만, 또한 짧은 올리고머일 수 있다. 적합한 올리고머는 올리고 하이드록시 산, 예를 들어 폴리(글리콜산), 폴리(DL-락트산), 폴리(L-락트산), 및 폴리(글리콜산) 및 폴리(락트산)하이드록시 산의 코폴리머, 및 폴리(아미노 산), 폴리(무수물), 폴리(오르토에스테르), 및 폴리(포스포에스테르), 폴리락톤 예를 들어 폴리(엡실론-카프로락톤) 폴리(델타-발레로락톤) 폴리(감마-부티롤락톤) 및 폴리(베타-하이드록시 부티레이트). C 부분은 수소성 분자, 예를 들어 콜레스테롤, 콜산, 리토콜산, 소수성 펩티드 등으로부터 또한 선택될 수 있다. 각 부분 C의 분자량은 40 초과, 바람직하게는 50 내지 1,000, 및 가장 바람직하게는 100 내지 500이다. 분자 C-H의 logP 값(옥탄올-물)은 약 1.4 초과이고, 바람직하게는 약 2.0 초과이고, 더욱 바람직하게는 약 2.5 초과이다. 일반적으로, 일반적으로 분자 C-H가 물에서 실질적으로 용해되지 않는다면, 임의의 부분 C는 본 발명에서의 용도에 적합한 것으로 간주된다. "실질적으로 불용해성"은 물과 혼합되는 경우에 분리된 상을 액체 C-H가 형성하는 것을 의미한다.
측쇄 C가 폴리머 사슬을 따라 규칙적으로 및 균일하게 분배되지 않지만, 클러스터 [C]p로 발생되는 것이 이 본 발명의 콤 폴리머의 특징이다. 이 클러스터는 폴리머 유닛 A의 단순분산(monodispersity)의 정도에 의존하여, 폴리머 사슬을 따라 다소 규칙적으로 간격을 이루고 있다. 따라서, 공통 브랜칭 부분 B에 부착되어 있는 두 개의 측쇄 C 사이의 거리는 상이한 브랜칭 부분에 부착되어 있는 두 개의 측쇄와 상이하다.
본 발명의 구체예에서, 브랜치-포인트 부분 B는 화학식 2에 도시되어 있는 하나 이상의 반응성 작용기 X를 추가로 포함한다.
Figure 112009033403837-PCT00002
화학식 2에서, 개개의 반응성 기 X는 동일할 수 있거나 또 다른 것과 상이할 수 있고, 폴리머의 어셈블리 중 필요할 수 있는 차단되거나 보호될 수 있다. r의 평균 값은 0 (X 기가 없음) 내지 약 4일 것이다. 전형적으로 반응 기는 분자 종들 사이에 공유 결합을 형성하는데 유용한 것으로 당업에 알려져 있는 작용기로부터 선택될 것이다. 기 X는 약-분자, 조직- 또는 세포-표적 부분, 바이러스-표적 ㅂ부부분 또는 매트릭스 부착 부분(예를 들어 스텐트 또는 다른 의학적 장치의 표면을 코팅하는 목적을 위함)를 위한 부착 포인트로 제공된다. 특정 구체예에서, 단일 부착 포인트 X일 수 있다. 다른 구체예에서, 3 또는 4 상이한 형태의 반응성 기일 수 있다. 매트릭스 부착 부분은 공유 결합, 특이적 비공유 상호작용(예를 들어, 항체-항원) 또는 비특이성 상호작용(예를 들어, 이온 쌍 또는 "소수성" 상호작용)을 통해 매트릭스에 부착될 수 있다. 적합한 반응성 기 X는 제한됨 없이 -OH, -NH2, -SH, -CHO, -NHNH2, -COOH, -CONHNH2, 할로아실, 아세토아세틸, -CN, -OCN, -SCN, -NCO, -NCS, 등; 비닐산, 아크릴산, 알릴산, 말레산, 신남산 등과 같은 반응성 이중 결합, 및 아세틸렌카르복시 및 아세틸렌카르복사미도와 같은 반응성 삼중 결합을 가진 기(마이클 첨가(Michael additions), 디엘-알더(Diels-Alder) 반응, 및 자유 라디칼 첨가 반응에 적합함)를 포함한다.
예시적 세포-표적 부분은 제한적이지 않게 수용체-특이성 리간드, 항체, 및 다른 표적 부분, 예를 들어 아르기닌-글리신-아스파르트산(RGD) 아미노 산 서열 또는 티로신-이소류신-세린-아르기닌-글리신(YISRG) 모티프를 포함하는 펩티드; 상피 성장 인자, 혈관 내피 세포 성장 인자 및 피브로블라스트 성장 인자를 포함하는 성장 인자; 시알산 및 N-아세틸뉴라민산 유도체와 같은 바이러스 표면 리간드; 폴레이트, 메토트렉세이트, 프테로산, 에스트라디올, 에스트라트리올, 테스토스테논, 및 다른 호르몬; 만노스-6-포스페이트, 슈거, 비타민, 트립토판 등과 같은 세포 수용체 리간드를 포함한다. 항체는 바람직하게 세포 특이적 표면 항원에 지시되는 단클론성 항체이고; 적합한 표적 부분은 완전한 항체를 포함할 뿐만 아니라 활성 항원 결합 서열을 포함하는 항체 절편, 예를 들어 Fab'2 절편, Fab' 절편 또는 이러한 항체의 활성 항원 결합 서열의 짧은 사슬 펩티드 유사체를 포함한다.
바이러스-표적 부분의 예는 바이러스, 예를 들어 아미노알킬아다만탄, Fuzeon™, PRO-542, BMS-488043, 시알산, 2-데옥시-2,3-디데하이드로-N-아세틸류라민산, 4-구아니디노-Neu5Ac2en(zanamivir), 오셀타미비르(oseltamivir), RWJ- 270201, 등에 결합되는 작은 분자 리간드; 바이러스 표면에 결합되는 올리고펩티드, 올리고사카리드, 및 글리코펩티드, 및 바이러스-특이성 표면 항원에 지시되어 있는 항체 및 항원 절편을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 바이러스성 뉴라미니다제 또는 헤마그글루티닌을 위한 리간드 함유 π-폴리머를 제공한다. 이러한 폴리머가 그 자체로 항바이러스성 특성을 가지는 것으로 잘 알려져 있다(참조 예를 들어 T. Masuda et al., Chemical & Pharmaceutical Bulletin 51:1386-98 (2003); M. Itoh et al., Virology 212:340-7 (1995), 및 Reece et al., 미국 특허 제 6,680,054호 (2004)). 본 발명의 항바이러스성 폴리머 및 폴리머 응집물의 소수성 코어는 하나 이상의 통상적 항바이러스성 약으로 선택적으로 채워질 수 있으며, 바이러스성 입자의 주위에 이롭게 방출된다.
의학적 관련성의 다른 부착 기는 작은 화학물, 펩티드, 항체 또는 항체 절편, 효소 또는 활성 약제학적 성분일 수 있으며, 생물학적 과정 예를 들어 호르몬 또는 호르몬 작용제 또는 길항제, 바이러스 결합을 방해하는 물질, 세포 주기를 방해하는 물질 또는 내부세포 엔트리 후 세포 과정 등에 영향을 미칠 수 있다. 박테리아, 곰팡이, 더 높은 동물 및 식물을 포함하는 단세포 및 다세포 유기체의 세포는 표적될 수 있다. 비오틴은 π- 폴리머에 부착될 수 있고 아비딘- 및 스트렙타비딘-결합된 단백질, 및 다른 표적 또는 약리학적으로 활성 작용제, 예를 들어, 항체, 성장 호르몬, 이미징 시약 등을 위한 부착지점으로서 사용될 수 있다.
"매트릭스"는 유기 또는 무기 물질, 표면 및 증착물, 예를 들어 유리, 실리카 또는 금속 표면, 세포밖 매트릭스, 단백질 증착물 예를 들어 여러 종류의 아밀 로이드 플라스크, 세포 표면, 바이러스 표면 및 잘 특징될 수 있거나 그렇지 않을 수 있는 프리온과 같은 일반적 균일 또는 불균일 표면을 지칭한다.
글라스 또는 실리카 매트릭스 부착 부분의 예는 여러 할로실란, 알콕시실란, 아실실란, 뿐만 아니라 폴리머를 포함하는 이러한 작용기를 보여주는 화학물을 포함한다. 다른 부착 기는 매트릭스의 특정 물리화학 특성에 기초하여 변경될 수 있다. 적합한 부착 부분, 예를 들어 스텐트의 코팅에서 사용되는 것은 당업자에 알려져 있다.
본 발명의 제 3 측면에서, 브랜치 포인트 부분 B는 폴리머 사슬에서 다른 브랜치 포인트 부분 이외의 부분에 결합되어서, 가교된 하이드로젤 구조를 형성한다. 이러한 가교는 균일작용 또는 불균일작용기를 포함하는 다작용성 부분과의 폴리머의 반응의 결과일 수 있고, 이의 하나 이상은 X 또는 제 1 브랜치 포인트 부분에 위치하는 C의 반응기와 반응하고, 이의 하나 이상은 X 또는 제 2 브랜치 포인트 부분에 있는 C에 존재하는 반응성 작용기와 반응한다. 가교는 또한 폴리머 사슬 A의 말단 작용기에 연결을 통해 이뤄질 수 있다. 이러한 가교 폴리머는 선택적으로 약 분자 또는 표적 부분의 부착에 적합한 반응성 작용기를 포함할 수 있다.
브랜치-포인트 부분 B는 복수의 반응성 기를 가지는 다작용성 분자로부터 전형적으로 얻어지며, 이 중 두 개는 친수성 폴리머 유닛 A에 부착에 적합하고, 이 중 두 개는 소수성 부분 C의 부착에 적합하다. 부분 B는 상기 기재되어 있는 추가 반응 기 X를 선택적으로 가질 수 있다.
바람직하게 바람직한 브랜치-포인트 부분은 디티오트레이톨(DTT), 디티오에 리트리톨(DTE), 또는 2,3-디아미노부탄-l,4-디티올의 말레산의 두 분자와의 컨쥬게이트이다. 부분 A로서 폴리에틸렌 글리콜과의 이 브랜치 포인트의 조합은 화학식 3 및 3a의 폴리머 백본을 생성하며,
Figure 112009033403837-PCT00003
상기 식에서, Y 및 Y'는 동일하거나 상이할 수 있고, 바람직하게 OH, NH2, ONH2, NHOH, 및 NHNH2로부터 선택된다. 바람직한 구체예에서, 디티올의 하이드록실 또는 아미노기는 반응성 기 X이고, 약 부분 또는 표적을 위한 부착지점으로서 제공되며, 한편 작용기 Y 및 Y'는 C 부분을 위한 부착 포인트로서 제공된다. 대안적으로, 기 Y 및 Y'는 부착 지점으로서 제공될 수 있고, 한편 하이드록실 또는 아미노 기는 C 부분을 부착하기 위해 사용된다.
화학식 3 및 3a는 각 황 원자가 독립적으로 PEG 에스테르 카르보닐 기에 부착된 알파 또는 베타일 수 있음을 보여준다. 본 발명은 단일 이소머 조성물뿐만 아니라 하나 또는 두 개의 C-S 결합에서 레지오이소머의 혼합물을 포함한다. 더구나, 화학식 1에 4개의 비대칭 탄소 때문에, 본 발명은 모든 키랄, 메소, 및 부분입체이성질 이소머 및 이의 혼합물을 포함한다.
아세틸렌 디카르복실산 및 푸란의 디엘-알더(Diels-Alder) 첨가물은 또한 적합한 브랜치 포인트 부분으로서 제공될 수 있다. 예를 들어, PEG 및 아세틸렌디카르복실산으로부터의 폴리에스테르 4는 푸란과의 디엘-알더 반응을 겪는 것으로 알려져 있다(M. Delerba et al, Macromol Rapid Commun. 18(8):723-728 (1997)). 따라서, 3,4-2기 치환된 푸란과의 디엘-알더 반응을 받아 5와 같은 종을 생성할 수 있고, 폴리머 5는 하이드록실화 또는 에폭시화에 의해 변경되어 반응기(예를 들어, 도해 1에서 X 및 X')를 제공할 수 있다.
Figure 112009033403837-PCT00004
유사하게, PEG의 에틸렌디아민 테트라아세트산 디안하이드라이드와의 반응은 화학식 6의 폴리에스테르를 제공할 것이다:
Figure 112009033403837-PCT00005
다른 적합한 브랜치 포인트 부분은 타르타르산, 아세틸렌디카르복실산, 니트릴로트리아세트산, 3,4,3',4'-디페닐 설폰 테트라카르복실산 디안하이드라이드, 3,4,3',4'-디페닐 에테르 테트라카르복실산 디안하이드라이드, 피로멜리트산 디안하이드라이드, 알칸디티올 예를 들어 1,2-에탄디티올 및 1,4-부탄디티올, 비스(2-메르캅토에틸)에테르, 2-메르캅토에틸설피드, 디메르캅토프로판올, 디메르캅토푸린, 디메르캅토티아디아졸, 디메르캅토숙신산, 벤젠디메탄티올, 벤젠디티올, 디할로겐화된 벤젠디메탄티올, 디할로겐화된 4,4'-티오비스벤젠티올 등으로부터 유도될 수 있다.
Y 및 Y'가 OH인 경우에, 소수성 기 C는 카르복실산 기의 아미드화 또는 에스테르화에 의해 폴리머에 연결될 수 있다. 소수성 기 C는 바람직하게 상대적으로 작은(C8-C20) 및 우세하게 탄화수소 부분이고, 선형 또는 분지형일 수 있거나 하나 이상의 고리를 포함할 수 있다. 실시예는 제한적이지 않게 공유 부착된 도데실아민, 펜타데실아민, 콜레스테롤, 및 콜산 부분을 포함한다. 본 발명의 폴리머가 최대 2 개의 상이한 소수성 측쇄를 가지는 것으로 편의상 제공되지만, 둘 이상의 소 수성 화합물의 혼합물이 다양한 소수성 측쇄를 특정 폴리머에 도입하기 위해 사용될 수 있음을 이해해야 한다.
하나의 특정 실시예로서, 화학식 2의 폴리머(여기서, X = OH 및 r = 2)가 폴리에틸렌 글리콜의 말레산 무수물과의 반응하여 폴리에스테르 1을 형성함에 의해, 후속하여 디티오트레이톨과의 반응으로 8을 형성함에 의해 제조된다. 산 7을 그 다음에 옥타데실아민과의 아미드화를 시켜 요구되는 콤 폴리머 9를 형성시켰다(도해 2). 화학식 9에 의해 나타내어지는 DTT-유도된 아미드 콤 폴리머는 "π-폴리머 A"로서 본원에서 칭해지고, 도해 2에서의 특정 폴리머 9는 "C18-π-폴리머 A"일 것이다.
Figure 112009033403837-PCT00006
디티오트레이톨과의 (DuPriest et al., 미국 특허 제 4,755,528호의 방법에 의해 제조되는) 2,3-비스(t-부톡시카르보닐아미노)부탄-l,4-디티올의 치환은 탈보호 후 대응되는 아미노-기능성 π-폴리머 9b를 이끈다(도해 3).
Figure 112009033403837-PCT00007
유사하게 부탄디티올 10c의 사용은 표적 부분의 후속적 부착 대신에 스페이서 기 L를 가지는, 구조 9c의 폴리머를 이끈다(도해 4). 스페이서 기 L은 제한됨 없이 C2 내지 C20 알킬렌 및 1 내지 10개의 -CH2CH20- 유닛을 가지는 올리고(에틸렌 글리콜) 스페이서를 포함하는, 기질 분자에 리간드 또는 라벨을 부착하는데 있어서의 사용을 위해 당업에 알려진 임의의 스페이서 기일 수 있다.
Figure 112009033403837-PCT00008
다른 구체예에서, 말단 아미노 기를 가지는 PEG 폴리머는 아래 구조 10-14에 도시되어 있듯이, A와 B 유닛 사이의 아미노 결합을 가지는 실시예를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 이 폴리아미드의 각각은 PEG 디아민 H2N-(CH2CH2O)mCH2CH2-NH2의 적당한 사이클릭산 무수물과의 반응을 통해 얻어질 수 있다:
Figure 112009033403837-PCT00009
유순한 조건 하에서, 상기 아미도 산은 기대되는 생성물이다. 가열로, 이미드 형성이 기재될 수 있고, 더 작은 반응기를 가진 폴리머로 이끌지만, 소수성 C 부분의 부착에 여전히 적합하다. 대안적으로, 펜던트 측쇄 C는 폴리머 A 블록의 말단에 첨가될 수 있고, 브랜치 포인트 부분은 중합의 시간에 생길 수 있다(도해 5).
Figure 112009033403837-PCT00010
도해 5에 기재되어 있듯이, 간단한 디아민 예를 들어 1,3-디아미노프로판에 추가하여, (선택적으로 표시된) 반응성 작용기 X를 가지는 디아민은 사용될 수 있으며, 표적 부분의 부착에 적합한 폴리머 15를 이끈다(도해 6). 아래 화학식에서, p는 0-4 범위일 수 있고, 각 x는 독립적으로 존재할 수 있는 임의의 다른 기 X와 동일하거나 상이하다. 반응기 X는 펜던트일 필요가 없지만, 예를 들어 단량체 H2N-(CH2)3-NH-(CH2)3-NH2에서와 같이 디아민을 구성하는 원자의 사슬 내에 NH 기일 수 있다.
Figure 112009033403837-PCT00011
상기와 같이 제조된 특정 π-폴리머는 작은 분자, 펩티드, 뉴클레오티드, 슈가, 항체 등과 같은 표적 부분에 부착하도록 또는 이작용기성 또는 다중 작용기성 가교제를 경유하여 폴리머 사슬의 가교을 일으키는 추가 유도에 적합한 반응기 X를 가진다. 특정 구체예에서, 폴리머 사슬에서의 반응성 기의 부분적 유도는 여러 상이한 반응성 기를 가지는 π-폴리머를 생성하도록 수행되며, 단일 폴리머 사슬에 여러 표적 및 약 분자의 부착을 가능하게 한다. 따라서, 실시예 1의 π-폴리머에 아크릴로일 클로라이드(또는 말레산 무수물)의 화학양론 양 정도(sub-stoichiometric amount)의 첨가는 폴리머에 아크릴로일(또는 말레일) 기 및 잔여 하이드록실 기를 제공할 것이다. 메르캅토-카르복실산, 예를 들어 HS-(CH2)3- COOH의 화학양론 정도의 양의 후속적 마이클 첨가는 폴리머에 하이드록실, 아크릴로일, 및 카르복실 기를 제공할 것이다. 시스테인의 첨가는 시약의 화학양론 정도의 양 만큼 뒤에 남은 임의의 잔여 반응기에 추가로, 아미노 및 카르복실 기를 도입한다.
다작용기성 π-폴리머에 대한 또 다른 접근은 소수성 사슬 C의 분획의 고의적인 생략을 포함한다. 실시예 1의 π-폴리머는 예를 들어 아미드화 단계에서 펜던트-형성 알킬아민의 양을 제한하는 간단한 수단에 의해 비반응된 카르복실산으로 제조될 수 있다. 또 다른 접근은 아민의 혼합물과의 아미드화이며, 아민의 분획은 반응성 기 X를 포함한다. 또는, 적당한 조건 하에서(단계 A에서의 과량의 말레산 무수물 및 단계 B에서 과량의 DTT), 자유 티올 기의 요구되는 수를 가지는 폴리머 제형은 발생될 수 있다.
실시예 1의 π-폴리머는 고안에 의해 반응성 기 X로 제공되는, 백본에 DTT 부분으로부터 얻어지는 하이드록실 기를 함유한다. 카르보네이트/바이카르보네이트 완충물의 존재에서 수성 매질에서 아크릴로일 클로라이드 또는 메타크릴로일 클로라이드와의 이 기들의 에스테르화는 -OH 기 상에 아크릴로일 치환을 가져온다. 아크릴레이트된 폴리머는 쉽게 라디칼 중합을 받을 수 있어(아크릴 화합물과 같은 부가되는 라디칼 단량체 또는 바이사크릴산 화합물과 같은 가교제의 존재 또는 비존재에서) 조절된 약 전달에 적합한 (폴리머 보관 또는 저장으로서 작용하는) 그리고 국소적 용도(예를 들어 피부 패치 또는 연고)에 적합한 하이드로젤을 얻을 수 있다. 아실 기는 단백질, 효소, 펩티드, 항체, Fab'2 절편 또는 Fab' 절편, 또는 다른 표적 부분에서의 시스테인 잔기의 그것과 같이, 특히 티올로 마이클 첨가를 받을 수 있다(도해 7).
Figure 112009033403837-PCT00012
건조 후, 반응성 하이드록실 기를 가지는π-폴리머는 또한 말레산 무수물로 에스테르화될 수 있어 마이클 수용체인 말레에이트 기에 부착되고, 동시에 자유 카르복실산 기를 생성할 수 있다. 그 결과 얻은 폴리머에서, 말레산 이중 결합은 마이클 첨가, 특히 단백질, 효소, 펩티드, 항체, Fab'2 절편 또는 Fab' 절편, 또는 다른 표적 부분에 시스테인 잔기의 것과 같은 티올로의 마이클 첨가에 가용될 수 있다. (도해 8), 및 카르복실 기는단백질 및 펩티드에 리신 잔기, 또는 약 또는 리간드의 아미노산 기에 커플링에 가용될 수 있다.
상이한 부분은 추가로 새롭게 도입되는 (또는 이전에 가용되는) 카르복실기 에 아미드화를 통해 부착될 수 있다. 따라서, 둘 이상의 상이한 표적 부분은 포화 반응 조건에서 조차도 (다시 말해, 부착될 부분이 화학양론 초과로 존재하는 것) 부착될 수 있다.
Figure 112009033403837-PCT00013
펜던트 카르복실레이트 기를 가지는 폴리머는 전형적 커플링 조건 하에서 아민으로 아미드화될 수 있고, 이들은 쿠르티우스(Curtius) 재배열을 통해 이소시아네이트 기로 전환될 수 있으며, 그 다음에 아민 또는 알코올로 커플링되어 우레아 및 카르바메이트를 각각 형성할 수 있다. 이러한 반응은 소수성 기 C를 도입하기 위해 또는 표적 부분을 부착시키기 위해 사용될 수 있다.
자유 아민은 반응기 중 하나를 디아민과 부분적으로 또는 전체적으로 반응시킴에 의해 폴리머에 도입될 수 있다. 이 디아민은 아민 기 중 하나가 반응 조건 하에서 보호되거나 반응되지 않도록 선택되어야 한다. 후자는 두 개의 아미노 기의 pKa가 크게 상이하기 때문에, 약 7.5의 pH에서 에틸렌디아민을 사용함에 의해 종종 달성될 수 있다. 바람직하게, 이 아미드화는 소수성 펜던트 기의 도입 후에 별도의 단계로 수행된다. 펩티드 또는 카르복실산 기를 가지는 다른 분자는 그 다음에 이 자유 아민에서 아미드화에 의해 부착될 수 있다.
따라서, 포화 조건에서 조차도, 세 개 만큼의 상이한 펩티드 또는 다른 표적 부분은 π-폴리머에 부착될 수 있다: 하나는 티올을 통해, 다른 하나는 아민 또는 하이드록실을 통해, 그리고 또 다른 하나는 카르복실산 기를 통해.
하이드록실 및 티올 기는 또한 아지리딘 또는 할로알킬 아민(예를 들어 보로모에틸아민 또는 클로로에틸아민)과의 반응에 의해 1 차 아민으로 전환될 수 있다. 시스테아민으로의 아미드화는 펩티드 또는 항체의 시스테인에 의해 직접 반응되어 펩티드 또는 항체를 부착시킬 수 있거나; 펩티드 또는 항체와의 추가 반응을 위해, 예를 들어 아미노에탄티올 또는 DTT로 우선 환원될 수 있는, 디셀피드를 도입시킬 것이다.
부분적 반응을 수행함에 의해, 하나는 추가 반응성 작용기를 본 발명의 폴리머에, 비제한적으로 (1) 아크릴산 또는 말레산 유도체와 같은 티올-반응성 기, (2) 아미노 또는 하이드록실과 같은 카르복실산 반응성 기, (3) 카르복실과 같은 아민- 반응성 기 및 (4) 메르캅토와 같은 디설피드-반응성 기에, 도입시킬 수 있다. 폴리머 분자 당 이러한 추가 작용기의 수는 시용되는 시약 및 사용되는 양에 의존하여 1/r 내지 r의 여러 배수의 범위일 수 있다.
대안적으로, 둘 이상의 특이적 리간드는 바이러스 또는 세포 표면에 결합의 특이성을 개선하기 위해 부착될 수 있다. 둘 이상의 특이적 리간드는 또한 상이한 세포 표적들 사이에 상호작용을 야기하도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나의 리간드는 바이러스 입자를 표적할 수 있고, 또 다른 리간드는 파고사이트에 결합을 용이하게 할 수 있어서, 바이러스 입자를 파고사이트에 접촉 또는 그 부근으로 가져올 수 있거나 식균작용을 촉진할 수 있다.
이러한 유도는 (아민, 카르복실레이트 및 티올과 같은) 상이한 작용기 부착을 통해 폴리머에 세 이상의 별도의 표적 및/또는 치료 부분의 부착을 가능하게 한다. 따라서, 하나는 조직 특이적 표적제, 이미징 작용제 및 치료제를 단일 폴리머 사슬에 부착시킬 수 있고, 폴리머의 후속적 자가구축은 표적의 분배 및 효능이 모니터될 수 있는 표적화된 치료를 만들 것이다.
본 발명의 폴리머의 반복 단위에의 리간드의 부착은 폴리머 사슬 및 나노입자 표면 상의 리간드의 다가 디스플레이를 제공한다. 다가 디스플레이는 종종 표적에 대한 친화성을 크게 증가시킨다. 예를 들어, 다가 항체는 정상적 이가 항체보다 이들의 표적의 제거(clearance)에 더욱 효과적일 수 있다. 카르보하이드레이트-결합 단백질 및 카르보하이드레이트는 본래 다가이고 일가(monovalent)라면 효과가 없는 것으로 알려져 있다. 유사하게, 다가 펩티드 및 카르보하이드레이트 표 적 부분은 모노머 그 자체보다 더욱 효과적일 것이다. 폴리머의 부착에 따른 MW의 증가는 펩티드 및 다른 리간드의 감소된 신장 제거 속도를 가져온다. 추가로, PEG 백본은 면역 감시의 회피를 포함하는, PEGylation의 것과 유사한 펩티드 이점을 제공한다.
추가로, 다가 표적 부분은 다가 표적(바이러스 입자)을 꾸밀(decorate) 것이고 단일(monomelic) 표적 부분보다 더욱 효과적으로 이를 중화시킬 것이다. 다가 포멧에서의 다중 (상이한) 펩티드를 보여주는 능력은 높아진 특이성을 이끌 것이다. 예를 들어, 정확하게 HIV-특이적 (HIV 바이러스-결합) 폴리머는 CD4 결합 영역에 상응하는 펩티드 및 바이러스의 CCR-5 또는 CXCR-4 결합 영역에 상응하는 또 다른 펩티드, 및 다른 수용체(CXCR-4 또는 CCR-5 각각)에 상응하는 가능하게 제 3 펩티드를 부착시킴에 의해 만들어질 수 있다. 이러한 폴리머는 바이러스의 결합 영역을 완전히 마스크할 수 있고 바이러스를 세포에 부착되도록 그리고 이로써 전염성이 없도록 할 수 있다. 추가로, 폴리머의 계면 활성 특성은 결합에 바이러스 구조 그 자체의 탈안정성을 이끌 것이다. 펩티드 대신에, 동일한 결합 패턴(CD4, CCR-5, CXCR-4)을 방해하는 작은 분자 또는 펩티드 및 작은 분자의 혼합물은 바람직하게 보완적 활성으로, 사용될 수 있다. 그 결과 폴리머는 임의의 자유 바이러스를 효과적이지 않게 할 것이고, 따라서 콘돔 윤활제 등의 성분으로서 이들을 사용함에 의해 전염의 번짐을 멈추기 위해 이상적일 수 있다. 추가로, 이러한 폴리머는 환자에 주입되어 HIV 짐(burden)을 줄일 수 있다.
일반적으로, DTT와 같은 폴리작용성 시약이 사용되는 경우에, DTT와 카르복 실산의 에스테르화 또는 다른 유사한 부반응(side reaction)을 통해 폴리머 사슬의 부분적 가교가 있을 수 있다. PEG 사슬의 중심 영역에서 2차 하이드록실 기, 예를 들어 비스페놀 A 디글리시딜 에테르 잔기와 관련된 것은 이들이 PEG 출발 물질에 존재하는 경우에 가교에 또한 기여할 수 있다. 이 결과로 얻은 가교된 하이드로젤 구조는 또한 유용한 물질이다. 예를 들어, 이 가교의 정도를 적절히 증가시킴에 의해 또는 (예를 들어, 바이속시란(bisoxirane)과 같은) 대안적 가교제를 사용하는 명확한 가교에 의해, 약의 저장 공간으로서 제공될 수 있는 유연한 하이드로젤인 물질은 만들어질 수 있다. 물질을 적절히 변경시킴에 의해(예를 들어, 더 낮은 PEG 길이, 더 많은 열린 카르복실기, 및 적합한 아크릴기의 통합), 스텐트와 같은 장치에 고정되거나 접착 패드 또는 피하 삽입 패치를 위한 패드와 같은 장치에 흡수될 수 있는 저장물로서 제공될 수 있는 선형 또는 가교된 하이드로젤 물질은 만들어질 수 있다. 일반적으로, 이러한 가교된 물질은 높아진, 표적된 방출이라기 보다는 조절된 방출에 적합할 것이다.
본 발명의 콤 폴리머는 물에 잘 용해되지 않는 물질을 수송 용매 시스템에서 용해시키는데 유용하다. 수성 용매에서 물질을 용해시기는 방법은 물의 존재에서 물에 잘 용해되지 않는 물질을 본 발명의 콤-타입 폴리머와 접촉시켜 물질과 폴리머의 물 용해성 컴플렉스를 형성하는 것을 포함한다. 대안적으로, 용해될 물질과 폴리머는 두 상 수성 유기 에멀젼에 통합될 수 있고, 이 유기 용매는 증발에 의해 제거된다. 예시적인 방법은 본원에 참조로서 통합되어 있는 미국 특허 No. 6,838,089호에 기재되어 있다. 대부분의 경우에, 입자의 코어에서 합체되는 소수 성 C 사슬 중에 용해되는 잘 용해되지 않는 물질을 가지는 나노입자로 폴리머는 자가조립(self-assemble) 되며, 한편 A 블록은 입자의 수성 현탁액을 안정하게 유지하도록하는 계면 자유 에너지를 충분히 낮추는 친수성 코로나를 형성한다.
몇몇 경우에, 잘 용해되지 않는 물질은 코어에서 완전히 용해될 수 없지만, 입자의 코어에 C 사슬에 의해 둘러싸여 있고, 그 안에 서스펜드되어 있는 고체 나노입자로 존재할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 본 발명의 실시가 상기 잘 용해되지 않는 물질과의 C 사슬의 혼합의 임의의 특별한 정도에 의존하지 않기 때문에, 이는 정도의 차이이다. 이 물질은 몇몇 경우에 C 사슬 중 분자 수준에서 용해될 수 있지만, 다른 경우에 C 사슬 환경으로부터 상 분리의 임의의 정도를 보일 수 있다. 몇몇 경우에, 시스템이 하나의 상태로부터 다른 상태로 온도의 함수로서 이동할 것임을 기대할 수 있다.
폴리머 입자의 소수성 코어의 용해력(solvating power)은 이 소수성 C 부분을 변경함에 의해 변경될 수 있다. 적합한 변경은 제한 없이 소수성 코어의 극성 및/또는 편광성을 증가시키기 위해, 하이드록실, 에테르, 아미드, 및 시아노 작용기와 같은 하나 이상의 친수성 치환체의 도입을 포함한다.
이 폴리머에 의해 잘 용해되는 것으로 될 수 있는 잘 용해되지 않는 물질은 지방 용해성 비타민 및 영양성분을 포함한다. 제한 없이 비타민 A, D5 E 및 K, 코로텐, 콜레칼시페롤, 및 코엔자임 Q; 도세탁셀, 암포테리신 B, 니스타틴, 파클리탁셀, 독소루비신, 에피루비신, 루비테칸, 테니포시드, 에토포시드, 아우노미신, 메토트렉세이트, 미토미신 C, 사이클로스포린, 이리노테칸 메타볼라이트(SN-38), 스 타틴, 및 스테로이드와 같은 불용해성 약; 염료, 광역학적 작용제 및 이미징 작용제 및 핵산, 핵산 유사체 및 핵산 복합체를 포함한다. 핵산 유사체는 티오포스페이트 및 펩티드 핵산과 같은 종을 포함하고; 핵산 컴플렉스는 올리고핵산의 양이온 또는 폴리양이온 종의 실질적으로 중성 하전 양과의 이온성 컴플렉스이다.
본 발명의 목적을 위해, 중성 pH에서 용해되지 않는 약은 "잘 용해되지 않는(sparingly soluble)"으로 간주된다. 왜냐하면 중성 약제학적 조성물에 대한 많은 경우의 필요성이 있기 때문이다. 예를 들어, 시프로플록사신은 4.5 아래의 pH에서 물에서 잘 녹지만, 이 pH는 약이 눈 용도를 위해 제형되는 경우에 매우 자극적이 될 수 있다. 본 발명의 폴리머는 pH 7에서 시프로플록사신을 정상 염류에서 용해시킬 것이다. 또한, 본 발명의 목적을 위해, "잘 용해되지 않는"은 용해도의 증가가 개선되거나 더욱 유용한 조성물을 만드는 정도의 수성 비히클에서의 용해도를 가지는 임의의 물질을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 정맥내 투여를 위한 단위 투여량이 5g이라면 예를 들어 2g/리터 정도의 적당한 용해성이 있는 약은 "잘 용해되지 않는" 것이다.
본 발명의 폴리머의 약리학적으로 활성 종을 용해시키는 능력의 결과로서, 본 발명은 또한 하나 이상의 약리학적으로 활성인 작용제의 치료상 유효량과의 조합으로 본 발명의 하나 이상의 π-폴리머를 포함하는, 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 폴리머는 약리학적으로 활성인 작용제의 효과적이지 않은 양이 효과적이게 될 수 있다. 그래서, 본 발명의 목적을 위해, "치료상 유효량"은 전반적 조성물이 효과적이게 되는 작용제의 양이다.
본원에 언급된 모든 특허, 특허 출원 및 공개는 그대로 본원에 참조로서 통합되어 있다.
실험
1. 일반 과정
본 발명은 또한 본 발명의 콤 폴리머의 제조를 위한 방법을 제공한다. 이 폴리머의 합성은 아래 기재되어 있는 과정을 따름에 의해, 유기 합성의 당업자에 의해 쉽게 수행된다. 주요 출발 물질은 사용 전에 바람직하게 건조되는, 폴리에틸렌 글리콜이다. 이는 버블이 형성되는 것이 멈출 때까지 증가된 온도에서 진공 하에서 용융된 PEG를 교반함에 의해 편하게 수행된다. 이는 PEG의 질에 의존하여, 8-12시간이 걸릴 수 있다. 건조하자마자, PEG는 무한히 아르곤 하에서 저장될 수 있다. PEG의 상업적으로 가용되는 산업 및 연구 등급은 본 발명의 폴리머를 제조에서 사용될 수 있다. 예를 들어 1430 - 1570의 분자량 분포를 가지는 상업품(commerce)의 복잡분산 "PEG 1500". 이러한 물질은 비스페놀 A 디글리시딜 에테르를 통합시킬 수 있으며, 이는 PEG 사슬의 중심에 제 2 하이드록실 기를 도입시킨다. 본 발명의 폴리머가 재생될 수 있고 일관된 특성을 가짐을 보장하기 위해, PEG는 바람직하게 비스페놀 A가 없고 낮은 분산이다. 가장 바람직한 것은 Nektar Therapeutics(이전 Shearwater Polymers), Huntsville AL, 및 Polypure AS5 Oslo, Norway로부터 상업작으로 가용되는 것과 같은 >95% 단순분산인 PEG 폴리머이다. 특별히 바람직한 PEG의 예는 Polypure로부터의 "PEG-28"이다. 이는 >95% HO(CH2CH2O)28H이고, 분자량이 1252이다.
모든 반응은 질소 및 아르곤과 같은 불활성 대기 하에서 수행되고, 마그네틱 또는 바람직하게는 기계적으로 교반된다.
단계 A에서, 건조 PEG는 용융되고, 말레산 무수물(PEG의 몰당 2 몰)을 교반하면서 첨가시켰다. 말레산 무수물의 양은 가능한 가깝게 PEG 말단 하이드록실 기의 수에 맞춰져야 한다. 말레산 무수물의 부족은 하이드록시 1-말단 폴리머 사슬을 가져올 것이며, 반면에 과량의 말레산 무수물은 다음 단계에서 티올 기를 소비할 것이며, 이른 사슬 말단 및 말단 카르복실 기를 이끌 것이다. 반응 온도는 결정적이지 않고, 이 방법은 편의상 45℃ 내지 100℃ 사이의 온도에서 수행될 수 있다. 이 반응의 바람직한 온도는 65℃ 내지 90℃이다. 증가된 온도가 사용된다면, 말레산 무수물은 승화되는 경향이 있고, 말레산 무수물이 용액에 남아있는 것이 확인되어야 한다. 헤드스페이스를 최소화하고 오일 바스에 반응 용기를 침하시키는 것이 효과적인 방법이다.
선택되는 온도에 의존하여, 반응은 2 시간 또는 그 미만에서 환성될 수 있거나 밤새 수행될 수 있다. 반응은 실리카 젤 플레이트 상의 TLC에 의해 모니터될 수 있고, 말레산 무수물의 소실 후에까지 계속된다. 가시적 대조, UV 및 요오드 염색은 TLC 플레이트를 시험하기 위해 사용될 수 있다.
단계 B에서, 단계 A에서 생성되는 미정제 PEG 비스-말레에이트 에스테르는 디티오트레이톨(DTT) 및 N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민(TEMED)과 통합되고(유 동성이 필요하다면, 물 첨가), 그 혼합물을 70℃에서 교반하였다. 반응은 30분 내에서 완성되며, 점도의 빠른 증가가 나타난다. 생성물의 분자량은 DTT의 최적 양 정도가 사용된다면 감소될 것이다. 생성물의 분자량은 TEA와 같은 덜 효과적인 4차 아민 염기로 TEMED를 대체함에 의해, 요구된다면 또한 감소될 수 있다.
단계 C에서, 충분한 물은 반응 혼합물에 첨가되어 점도를 줄이고, 폴리머에서 카르복실산 기 몰 당 0.1 mol N-하이드록시숙신이미드(NHS) 및 1.05 mol 헥사데실아민이 첨가된다. (NHS의 이 양은 부반응의 정도를 최적으로 줄이는 것으로 보인다.) 과량의 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드(EDC)(카르복실산 기의 몰당 1.4mol EDC)은 그 다음에 부분적으로 첨가되고, 교반을 유지하기 위해 필요한 만큼 추가 물이 첨가된다. 반응 혼합물의 pH는 7 위에서 유지되고, 바람직하게는 9 내지 11에서 유지되어 알칼아민의 반응성을 최적으로 한다. 도데실아민으로, 이 반응은 약 40-45℃에서 수행될 수 있고, 반면에 옥타데실아민으로, 이 온도는 약 55℃ 내지 57℃이다. 반응은 낮은 알킬아민의 일정한 수준이 관찰될 때까지, 전형적으로 밤해 작동 후에, TLC에 의해 후속된다.
반응 혼합물은 약 3.0 내지 약 4.5 pH로 산화되고, 약 24 시간 동안 상온에서 교반되어 비반응된 EDC5를 파괴하고 그 다음에 1N NaOH를 사용하여 7.0의 pH로 적정된다. 최종 반응 혼합물은 1 내지 3 시간 동안 약 800 xg에서 원심분리되어서 고체 오염원 및 부산물을 제거한다.
원심 분리 후, 상청액은 GPC 칼럼(Toyopearl(TM), Sephadex(TM), Sephacryl(TM), Biogel(TM), 등)에서 크로마토그래프될 수 있다. π 폴리머는 양 친매성 물질이고, 대부분의 GPC 칼럼 팩킹에 대한 친화성을 보여줄 것이고, 따라서, 오염원의 제거를 복잡하게 한다. 대안적으로, 폴리머는 일정 구배의 물 내의 메탄올로 용리되는, 큰-포어 소수성 상호작용 칼럼(e.g., TOYOPEARL™ Phenyl 650C, Toshoh Biosciences, Montgomeryville, PA, U.S.A.)에서 크로마토그래프될 수 있다. 바람직하게, 반응 혼합물은 산성 및 중성 물의 여러 변화에 대항하여 투석되어서 낮은 분자량 출발 물질 및 반응 분산물을 제거한다.
반응 혼합물은 또한 유기 불순물을 제거하도록 부탄온, 이소프로판올, 부탄올 또는 다른 극성 유기 용매로 추출될 수 있지만, 양친매성 폴리머의 실질적 양은 추출 용매로 소실된다. 바람직하게 반응 혼합물은 사용되는 여과 막의 컷오프(cutoff)에 따라, 5kDa 내지 1OkDa; 1OkDa 내지 3OkDa, 30kDa 내지 5OkDa 등과 같은 분자량 등급으로 생성물을 세분화시키는 적합한 막을 사용하여 초여과(ultrafiltration)를 받는다. 폴리머의 수성 용액은 여과 막 또는 매질의 선택에 따라, 데드 엔드 여과(dead end filtration)를 받아 살균된 또는 바이러스 없는 용액을 생성할 수 있다.
2. π-폴리머의 합성
실시예 1: PEG-디(알킬아미도숙신일)디티오에테르 Medium Molecular Weight 폴리머 (C16-π-폴리머 A)
폴리에틸렌 글리콜(PEG-1500, Sigma Chemical Co.)를 80℃에서 진공 하에서 버블이 형성됨이 멈출 때까지 건조시켰다. (8-12 시간, PEG의 특성에 의존). 건조된 PEG를 무한히 아르곤 하에서 저장 건조시킬 수 있다.
건조된 PEG는 오일 바스 상 아르곤 하에서 용융되고 말레사 무수물(불순물에 대해 수정된, PEG의 몰당 2 몰)을 교반하면서 점차적으로 첨가시켰다. 혼합물을 90℃에서 아르곤 하에서 교반시켰다. 말레산 무수물은 승화되는 경향이 있기 때문에, 헤드 공간을 줄였고, 전체 반응 용기를 반응 온도로 유지하였다. 이 용기 벽에 임의의 응축된 말레산 무수물을 반응 혼합물로 긁어 되돌렸다. 반응의 진행을 UV 가시화 및 요오드 염색으로, 용매로서 에탄올 및 헥산을 별도로 사용하여, 실리카 젤 플레이트 상 TLC에 의해 모니터하였다. 말레산 무수물의 소멸을 지나 반응을 1시간 동안 계속하였다.
미정제 PEG 디말레에이트를 2 부피의 물로 희석하였다. 물(TEMED의 부피 당 1 부피 물) 내 디티오트레이톨(DTT, PEG의 당량 당 1.01 당량) 및 N,N,N',N'-테트라메틸-에틸렌디아민(TEMED, 1.02 당량)의 용액을 그 다음에 교반하면서 반응 혼합물에 첨가하였다. 2.5 시간 동안 아르곤 하에서 반응을 70℃에서 교반하였고, 상온에 밤새 두었고, 그 다음에 2 시간 동안 70℃에서 다시 교반하였다. 반응물을 TLC에 의해 모니터하였고, DTT의 완전한 소멸로 완성을 판단하였다.
물을 상기 반응 혼합물에 첨가하여 혼합물이 교반될 수 있을 때까지(약 25% 고체에서) 점도를 줄였고, 그 혼합물을 아르곤 하에서 65℃에서 교반하였고, N- 하이드록시숙신이미드(PEG-디말레에이트-DTT 폴리머에 카르복실 산 기 몰당 당 0.1 mol)를 첨가하였고, 헥사데실아민(폴리머에 카르복실산 기 몰 당 1.05 mol) 및 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드(EDC, 폴리머에 카르복실 산 기 몰당 0.56 mol)이 후속되었다. 이 혼합물을 1 시간 동안 아르곤 하에서 교반하였고, EDC의 제 2 부분(폴리머의 카르복실산 몰 당 0.56 mol)을 첨가하였다. 또 다른 시간 후에, EDC의 제 3 부분(폴리머의 카르복실 산 기 몰 당 0.28 mol, 카르복실 산의 몰 당 총 1.4 mol EDC)을 가수 분해로 EDC의 손실을 위해 추가로 첨가되었다. 첨가된 고체가 현탁액을 교반하기 힘들게 하기 때문에, 추가 물을 유동성을 유지하기 위해 필요한 만큼 첨가하였고 pH를 1N NaOH의 필요한 만클의 첨가에 의해 8 내지 10으로 유지하였다. 혼합물을 65℃에서 아르곤 하에서 밤새 교반하였고, 알칼아민이 일정한 농도에 다다른 것 같을 때까지 TLC(에탄올을 가진 실리카)에 의해 모니터하였고, 그 다음에 추가 4 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 그 다음에 1N HCl로 약 4.5의 pH로 산성화시켰고, 24시간 동안 교반하여 비반응된 EDC를 파괴하였고, pH 7.0으로 1N NaOH의 점적 방식의 첨가에 의해 조절하였다. 도데실아민으로, 이 반응을 약 40-45℃에서 수행하였고, 반면에 옥타데실아민으로 온도를 바람직하게 55-57℃였다.
혼합물을 원심 분리 병으로 이동시켰고 2 시간 동안 약 800xg에서 벤치탑(benchtop) 원심 분리에서 회전시켜서 잔여 고체를 분리하였다. 원심 분리 후, 반응 혼합물을 이소프로판올로 추출하여 유기 불순물을 제거하였다. 초여과는 이소프로판올 추출에 대안으로서 바람직하다.
이 방법에 의해, 하기 아미노 화합물은 폴리머와 컨쥬게이트된다:
실시예 Ia: 운데실아민
실시예 Ib: 옥타데실아민
실시예 Ic: 4-노닐벤질아민
실시예 Id: 3-[(4-페녹시)페닐]프로필아민
실시예 2: PEG-디(알킬아미도숙신일)디티오에테르 고분자 중량 폴리머
실시예 1에 설명된 과정은 말레산 무수물 1 몰당 0.55 mol DTT 및 0.55 mol TEMED이 사용되는 것을 제외하고 후속된다. 점도가 빠르게 증가하기 때문에 강한 교반이 필요하다. 대부분의 반응은 5-10 분 내에 완성되는 것 같고, 온도가 55℃ 내지 80℃로 증가되기 때문에 다음 4 시간에 걸친 느린 완성이 후속된다.
실시예 3: PEG-디(알킬아미도숙신일)디티오에테르 폴리머
실시예 1에서 설명된 과정이 폴리머의 카르복실산 기의 몰당 1.5 mol 도데실아민이 사용되는 것을 제외하고, 후속된다. N-하이드록시숙신이미드(NHS, 카르복실산 기의 몰당 1.0 mol) 및 l,1'-카르보닐디이미다졸(CDI, 카르복실산 기의 몰당 3.0 mol)을 첨가하였고, 반응물을 4 시간 동안 80℃에서 교반하였고, 상기와 같이 작업하였다.
이 방법에 의해, 하기 아미노산 화합물을 폴리머에 컨쥬게이트시켰다:
실시예 3a: 운데실아민
실시예 3b: 테트라데실아민
실시예 3c: 옥타데실아민
실시예 3d: 데하이드로아비에틸아민
실시예 3e: 콜레스테롤 2-아미노에틸 에테르
실시예 3f: 10-페녹시데실아민
실시예 3g: 세바크산 하이드라지드
실시예 3h: 올레산 하이드라지드
실시예 3i: 데하이드로아비에트산 하이드라지드 하이드라지드
실시예 3j: 콜산 하이드라지드
실시예 3k: 팔미트산 하이드라지드
실시예 4: PEG-Di(알킬아미도숙신에이트) 폴리머
건조 디에틸 에테르(10 ml) 내 PEG (6.66 mmol) 및 트리에틸아민 (2.32 ml, 16.65 mmol)의 용액을 0℃에서 아르곤 하에서 냉각시켰고, 메탄설폰일 클로라이드(1.03 ml, 13.32 mmol)로 점적 방식으로 처리하였다. 0℃에서 1 시간 동안 교반을 계속하였고, 그 다음에 상온에서 2 시간 동안 계속하였다. 에테르를 증발시켰고, 건조 아세톤(15 ml)을 잔여물에 첨가시켜 트리에틸아민 하이드로클로라이드를 침저시켰고, 이를 용액으로부터 여과시켰다. 여과물을 리튬 브로마이드(2.31 g, 26.64 mmol)로 처리하였고, 20 시간 동안 가열 환류하였다. 그 다음에 그 혼합물을 헥산으로 희석시켰고, Celite™(0.5 cm)로 커버되고, 헥산으로 용리되는 실리카(3 cm)의 짧은 칼럼을 통해 여과시켰다. 이 여과물을 건조시켰고, 여과시켰고 증발시켜 α,ω-디브로모-PEG를 오일로 남겼다.
α,ω-디브로모-PEG를 [Godjoian et ah, Tetrahedron Letters, 37:433-6 (1996)]의 방법에 의해 2,2-디부틸-4,5-비스(메톡시카르보닐)-l,3,2-디옥사스탄놀란의 1 당량으로 반응시켰다. 그 결과 얻은 디메틸타르트레이트-PEG 폴리에테르를 메탄올 내 KOH로 비누화시켰고, 그 다음에 상기 실시예 1 및 3에서와 같이 도데실아민 또는 헥사데실아민으로 또는 실시예 3a-3k의 아민으로 아미드화 시켰다.
실시예 5: EDTA 디안하이드라이드로의 PEG 공중합
건조 PEG를 에틸렌디아민테트라세트산 디안하이드라이드과 실시예 1에 기재되어 있는 방법에 의해 반응 시켰고, 그 다음에 실시예 1에서와 같이 도데실아민으로 또는 실시예 3에서와 같이 헥사데실아민으로, 또는 실시예 3a-3k에서의 아민으로 아미드화시켰다.
동일 방법으로, 하기 디안하이드라이드를 PEG로 공중합시켰고, 후속적으로 아미드화시켰다:
실시예 5a: 나프탈렌테트라카르복실산 디안하이드라이드
실시예 5b: 페릴렌테트라카르복실산 디안하이드라이드
실시예 5c: 벤조페논테트라카르복실산 디안하이드라이드
실시예 5d: 4,4'-(헥사플루오로이소프로필리덴)디프탈산 무수물
실시예 5e: 부탄 테트라카르복실산 디안하이드라이드
실시예 5f: 바이사이클(2,2,2)옥트-7-엔-2,3,5,6-테트라카르복실산 디안하이드라이드
실시예 5g: 디에틸렌테트라민 펜타아세트산 디안하이드라이드
실시예 5h: 3,4,3',4'-디페닐설폰 테트라카르복실산 디안하이드라이드
실시예 5i: 3,4,3',4'-디페닐 에테르 테트라카르복실산 디안하이드라이드
실시예 5j : 피로멜리트산 디안하이드라이드
실시예 6A: 펜던트 티오에테르와의 PEG-디아민 코-폴리머
실시예 1에서 제조된, PEG 디말레에이트를 실시예 1에서의 DTT를 위해 사용 된 동일한 방법을 사용하여 도데칸티올(PEG 디말레에이트의 당량 당 2 당량)과 반응시켰다. 중합이 발생되지 않기 때문에, 어떠한 희석도 필요하지 않고, 반응을 용융된 PEG-디말레에이트에서 수행시켰다. TEMED 촉매를 첨가하였고, 그 다음에 티올을 첨가하였다. TLC을 사용하여, 반응을 출발 물질의 소멸에 후속하였다. 증발에 의한 알킬티올의 손실이 중요한 지점까지 온도를 사용할 수 있다(약 100℃ 이하). 약간의 과량의 알킬티올을 말레산 기를 완전히 포화시키기 위해 사용할 수 있다. TLC에 의해 또는 냄새에 의해 아무것도 감지되지 않을 때까지, 과량의 알킬티올을 질소 또는 아르곤으로 살포함 및/또는 진공에서 가열함에 의해 반응 말단에서 드라이브-오프(driven off) 시켰다.
이 방법에 의해, 하기 티올을 PEG 디말레에이트로 컨쥬게이트 시킬 수 있다:
실시예 6Aa: 메르캅토숙신산 디-t-부틸 에스테르
실시예 6Ab: 테트라데칸티올
실시예 6Ac: 헥사데칸티올
실시예 6Ad: 2-메르캅토에탄설폰산
실시예 6Ae: 3-메르캅토프로판설폰산
실시예 6Af: 6-메르캅토헥사노산 t-부틸 에스테르
실시예 6Ag: 4-메르캅토벤조산 t-부틸 에스테르
실시예 6Ah: 메르캅토아세트산 t-부틸 에스테르
실시예 6Ai: 4-(t-부톡시카르보닐아미노)부탄티올
실시예 6Aj: 3-(t-부톡시카르보닐아미노)벤질 메르캅탄
실시예 6Ak: 4-데실벤질 메르캅탄
반응성 작용기를 가지는 티올은 C 사슬의 부착에 적합하고/거나 반응성 작용기는 표적 부분에 대한 부착 지점(X)으로서 제공될 수 있다.
실시예 6B: 펜던트 티오에테르와의 PEG-디아민 공중합
Figure 112009033403837-PCT00014
실시예 6A에서 얻어지는 티올 부가물을 실시예 1에서의 도데실아민을 위해 사용된 동일한 방법을 사용하여, 1,4-디아미노부탄 (두 개의 COOH기 당 디아민의 일당량)으로 아미드화시켰고, 반응 혼합물의 유동성을 유지하기 위한 필요한 만큼 물로 희석하였다. EDC의 추가 일부분을 완전한 중합을 보장하는데 필요한 만큼 첨가하였다. 이 방법에 의해, 실시예 6A 및 6Aa 내지 6Ak의 티올 부가물을 PEG-디아미노부탄 폴리아미드로 전환시켰다.
이 방법에 의해, 하기 디아민을 PEG 폴리아미드(BOC = t-부톡시카르보닐)로 전환할 수 있다:
실시예 6Ba: 2-(O-BOC)-l,3-디아미노-2-프로판올
실시예 6Bb: N',N"-디(B0C) 헥사에틸렌 테트라아민
실시예 6Bc: N',N"-디(B0C) 스페르민
실시예 6Bd: N' -BOC 스페르미딘
실시예 6Be: N',N",N'"-트리(BOC) 펜타에틸렌 헥사민
실시예 6Bf: 아그마틴
실시예 6Bg: 리신 t-부틸 에스테르
실시예 6Bh: 1,6-디아미노헥산
실시예 6Bi: 1,4-페닐렌디아민
실시예 6Bj: 1,3-페닐렌디아민
실시예 6Bk: l,4-디아미노부탄-2,3-디올 아세토나이드
실시예 7: PEG-디(알킬숙시네이트)디티오에테르
Figure 112009033403837-PCT00015
DTT (메소-2,3-비스(헥사데실옥시)부탄-l,4-디티올)의 2,3-비스-O-헥사데실 에테르를 [S. Sasaki et al., Chem.Pharm.Bull. 33(10):4247-4266 (1985)]의 방법의 변경에 의해 제조하였다. 이를 실시예 1의 방법에 의한 PEG-디말레에이트에 첨가하였다.
이 방법에 의해, 하기 에테로 디티올을 PEG 폴리머에 커플링 시켰다:
실시예 7a: 메소-2,3-비스(n-부톡시)부탄-l,4-디티올
실시예 7b: 메소-2,3-비스(4-노닐페닐메톡시)부탄-l,4-디티올
실시예 7c: 메소-2,3-비스(바이페닐-4-메톡시)부탄-l,4-디티올
실시예 7d: 4,6-비스(데실옥시)벤젠-l,3-디메탄티올
실시예 7e: 45-비스(데실옥시)벤젠-l,2-디메탄티올
실시예 7f: 3,4-비스(데실옥시)티오펜-2,5-디메탄티올
실시예 8A: 치환된 PEG 숙시네이트
말레산 무수물 대신에 2-도데센-1-일 숙신산 무수물가 사용되는 것을 제외하고, 실시예 1의 방법을 후속하였다. 도데세닐 치환체는 최종 폴리머에 펜던트 C 사슬을 제공한다.
이 방법에 의해 하기 치환된 숙신산 무수물을 PEG로 에스테르화시켰다:
실시예 8Aa: 이소부테닐숙신산 무수물
실시예 8Ab: 2-옥텐-1-일 숙신산 무수물
실시예 8Ac: 옥타데세닐 숙신산 무수물
실시예 8Ad: 3-옥사바이사이클로-헥산-2,4-디온
실시예 8Ae: 사이클로헥산디카르복실산 무수물
실시예 8Af: 프탈산 무수물
실시예 8Ag: 4-데실 프탈산 무수물
실시예 8Ah: 헥사하이드로메틸프탈산 무수물
실시예 8Ai: 테트라하이드로프탈산 무수물
실시예 8Aj: 노르보르넨디카르복실산 무수물
실시예 8Ak: 칸타리딘
실시예 8Al: 바이사이클로옥텐디카르복실산 무수물
실시예 8Am: 엑소-3,6-에폭시-l,2,3,6-테트라하이드로프탈산 무수물
실시예 8An: S-아세틸 메르캅토숙신산 무수물
실시예 8B: 펜던트 알킬 기를 가진 PEG-디(알킬아미도숙시닐)디티오에테르
실시예 1의 방법에 의해, 실시예 8A 및 8Aa 내지 8An에 기재되어 있는 바와 같이 얻어진 치환된 PEG 숙시네이트를 DTT와 반응시켰다.
이 방법에 의해, 하기 디티올을 실시예 8A 및 8Aa 내지 8An에 기재되어 있는 바와 같은 임의의 치환된 PEG 숙시네이트와 반응시켰다:
실시예 8Ba: 에탄-1,2-디티올
실시예 8Bb: 프로판-l,3-디티올
실시예 8Bc: 부탄-1,4-디티올
실시예 8Bd: 펜탄-l,5-디티올
실시예 8Be: 헥산-l,6-디티올
실시예 8Bf: 1,4-벤젠디티올
실시예 8Bg: 1,3-벤젠디티올
실시예 8Bh: 1,4-벤젠디메탄티올
실시예 8Bi: 1,3-벤젠디메탄티올
실시예 8Bj: 1,2-벤젠디메탄티올
실시예 8C: 펜던트 알킬기와의 PEG디아민 공중합체
실시예 6B의 방법에 의해, 실시예 8A에 기재되어 있는 바와 같이 얻어진 치환된 PEG 숙시네이트를 1,4-디아미노부탄으로 공중합시켰다.
이 방법에 의해, 하기 디아민을 실시예 8A 및 8Aa 내지 8An의 임의의 치환된 PEG 숙시네이트와 공중합시켰다:
실시예 8Ca: 2O-BOC l,3-디아미노-2-프로판올
실시예 8Cb: N',N"-디(BOC) 헥사에틸렌 테트라아민
실시예 8Cc: N',N"-디(BOC) 스페르민
실시예 8Cd: N' -BOC 스페르미딘
실시예 8Ce: N',N",N"'-트리(BOC) 펜타에틸렌 헥사민
실시예 8Cf: 아그마틴
실시예 8Cg: 리신 t-부틸 에스테르
실시예 8Ch: 1,6-디아미노헥산
실시예 8Ci: 1,4-페닐렌디아민
실시예 8Cj: 1,3-페닐렌디아민
실시예 8Ck: l,4-디아미노부탄-2,3-디올 아세토나이드
실시예 9: 치환된 산을 사용하는 PEG 트랜스-에스테르화
PEG 디토실레이트: 아르곤하에서 교반하면서, (DMF에 용해된 또는 용융된) 1 mol의 PEG에 2.1 mol의 토실 클로라이드(5% molar excess)을 첨가하였다. 이 반응물에 2.2 mol의 테트라메틸 에틸렌 디아민 (TEMED)을 첨가하였다. 그 다음에 반응물을 2 시간 동안 45℃에서 배양시켰다. 생성물을 TLC 용매로서 에틸아세테이트, 톨루엔, 또는 에탄올 내 TLC를 사용하여 용해시켰다. PEG 디토실레이트를 톨루엔과의 반응 혼합물로부터 추출할 수 있다. 톨루엔설폰일 클로라이드 대신에, 다른 설폰일화제 예를 들어 메실 클로라이드(참조 실시예 4), 트리플산 무수물, 또는 트레실 클로라이드를 또한 사용할 수 있다(참조 미국 특허 출원 제 10/397332호, 공게 제 20040006051호).
PEG 디토실레이트의 폴리에스테르화: 아르곤 하에서 교반하면서, 1 mol의 용융된 PEG-디토실레이트를 1 mol의 S,S'-디데실-메소-2,3-디메르캅토숙신산 및 2 mol의 TEMED에 첨가하였다. DMF를 유동성을 유지하기 위해 필요한 만큼 첨가하였다. 반응 혼합물을 80℃로 가열하였고 24 시간 동안 또는 TLC에 의해 완성될 때까지 교반하였다
실시예 10: PEG-디(숙신일)-디-(O-아실화된)티오에테르 Medium Molecular Weight 폴리머 (C16-π-폴리머 B)
Figure 112009033403837-PCT00016
실시예 1에서와 같이 제조된 PEG-디말레에이트(10.24 g, 6.1 mmol)을 건조 125 ml 플라스크에 두었고 아르곤 하에서 70℃로 가열하여 PEG-디말레에이트를 용융시켰다. 이 용융된 물질에, 교반하면서, 물(10 mL) 및 물(3 mL)에 DTT(0.961 g, 6.168 mmol) 및 TEMED(0.723 g, 6.166 mmols)의 용액을 첨가하였다. 그 용액을 약 4 시간 동안 70℃에서 교반하였다. 진공에서 물의 제거는 약 90% 수율로 고체 폴리머를 제공하였다.
이 건조된 폴리머(5 g, 2.7 mmol)를 아르곤 하에서 70-90℃로 가열하여 이를 용융시켰고, TEMED(0.635 g, 5.5 mmol)를 첨가하였다. 팔미토일 클로라이드(1.689 g, 5.5 mmol)를 교반하면서 첨가하였고, 그 혼합물을 밤새 아르곤 하에서 교반하였다. (폴리머에 아실 클로라이드에 대한 비는 화학양론의 0-100%로부터 치환의 정도를 얻기 위해 변경될 수 있다.) 물을 반응 혼합물에 첨가하여 "C16-π-폴리머 B"를 분리시켰다.
이 방법을 사용하여 하기 산을 디(숙신일)PEG-DTT 공중합체의 하이드록실 기로 에스테르화시켰다:
실시예 10a: 올레산
실시예 10b: 콜레스테르일 숙시네이트
실시예 10c: 바이페닐-4-카르복실산
실시예 1Od: 4-옥틸페닐아세트산
실시예 1Oe: 헥사덱-6-이노산
산 할라이드의 사용에 대안으로서, π- 폴리머의 DTT-유도된 하이드록실 기는 1,3-비스(2,2-디메틸-l,3-디옥솔란-4-일메틸) 카르보디이미드(BDDC)으로 또한 아실화될 수 있고, 카르복실산으로 직접 커플링될 수 있다; 참조 Handbook of Reagents or Organic Synthesis, Reagents for Glycoside, Nucleotide, and Peptide synthesis, Ed. David Crich, Wiley, 2005 p 107-108 및 이의 참조문헌.
실시예 11: Cl6-π-폴리머 A의 카르복실 치환된 에스테르
카르복실산-치환된 폴리머는 폴리머의 카르복실 산 작용기에 아미노 기를 결 합시키도록, 표준 펩티드 결합 형성 방법론을 사용하여(예를 들어 카르보디이미드 시약을 통해), 반응성 아미노 기를 가지는 리간드를 부착시키기 위해 사용되었다. 이 물질은 n-폴리머 하이드록실 기의 사이클릭 무수물과의 에스테르화에 의해 쉽게 얻어진다. 예를 들어, C16-π-폴리머 A 디말레에이트는 하기와 같이 C16-π-폴리머 A 하이드록실 기와의 말레산 무수물의 반응에 의해 제조되었다.
C16-π-폴리머 A(2 g) 및 말레산 무수물(0.85 g)을 건조 모르타르에서 분쇄시켰고, 50 mL 둥근 바닥 플라스크에 이동시켰다. 플라스크를 교반하면서 2-3시간 동안 90℃에서 가열하였다. 고체 반응 혼합물을 그 다음에 물의 도음으로 반투석 백(dialysis bag)(3.5 kDa cut-off)에 이동시켰고, 물에 대해서 반투석시켜 과량의 말레산 및 낮은 분자량 부산을 제거하였다. 보전물을 그 다음에 백으로부터 제거하였고, 60℃에서 일정 중량으로 건조하여, C16-π-폴리머 A 디말레에이트(1.79 g)를 제공하였다. 폴리머 A의 말레산 무수물에 대한 비율은 전체 화학양론 에스테르화의 0-100%로 변하는 치환을 얻기 위해 변할 수 있다.
실시예 11α : C16-π-폴리머 A 디글리콜레이트
C16-π-폴리머 A(2 g) 및 디글리콜산 무수물(1.0 g)를 상기 실시예 11의 방법에 의해 반응하여 C16-π-폴리머 A 디글리콜레이트를 제공하였다. 말레산 무수물로서, 무수물에 대한 폴리머 A의 비율은 M1 화학양론 에스테르화의 0-100%로 변하는 치환을 얻기 위해 변경될 수 있다.
실시예 11b: C16-π-폴리머 A 비스(아코니테이트)
C16-π-폴리머 A(2 g) 및 아토니트산 무수물(1.35 g)을 상기 실시예 11의 방 법에 의해 반응하여, C16-π-폴리머 A 비스(아코니테이트)를 제공하였다.
유사한 방법으로, 하기 무수물을 C16-π-폴리머 A과 커플링시켰다. 낮은 용해도의 무수물을 사용하여, 정제의 보조로서 투석 전에, pH는 4.5 내지 6.5로 조절될 수 있다. 0.1 HCl에 대항한 제 2 투석은 필요한 경우에, 폴리머의 산 형태를 제공한다.
실시예 11c: 숙신산 무수물
실시예 11d: 글루타르산 무수물
실시예 11e: 프탈산 무수물
실시예 12에서 아래에 기재된 바와 같이, 말레산 또는 시스-아코틴산 무수물로의 에스테르화를 통해 도입되는 반응 이중 결합은 티올-함유 리간드를 이 폴리머에 도입하기 위해 또한 사용될 수 있다.
실시예 12: C16-π-폴리머 A Di말레에이트의 시스테인 부가물:
분말화된 C16-π-폴리머 A 디말레에이트(실시예 11) (253 mg)을 물(5 mL)에 첨가하였고, 그 혼합물을 강하게 교반하였다. 시스테인(24 mg) 및 TEMED(30.5 ul)를 반응 혼합물에 첨가하였고, 그 혼합물을 상온에서 아르곤 대기 하에서 교반하였다. 반응의 경과를 닌하이드린으로 감지하면서 TLC(실리카 젤 플레이트, n-부탄올-아세트산-물, 3:1:1)에 의해 모니터하였다. 반응 혼합물은 폴리머와 함께 이동하는 닌하이드린-파지티브한 스팟(ninhydrin-positive spot)을 보여주었다. 또한 시스테인은 닌하이드린-파지티브 스팟을 제공하였고, 반면에 출발 폴리머는 닌하이드린으로 어떠한 색을 제공하지 않았다.
상기 방법은 다중 카르복실 치환체를 가지는 티올을 사용하여, 부착 포인트로세 사용을 위한 추가 카르복실 기를 도입하기 위해 사용되었다. 예를 들어, 메르캅토숙신산을 하기 분말화된 C16-π-폴리머 A 디에스테르에 첨가하였다:
실시예 12a: C16-π-폴리머 A 디말레에이트
실시예 12b: C16-π-폴리머 A 디크릴레이트
실시예 12c: C16-π-폴리머 A (비스)아코니테이트
Figure 112009033403837-PCT00017
실시예 12c
유사한 방법으로, 3-메르캅토글루타르산을 하기 C16-π-폴리머 A 디에스테르에 첨가하였다:
실시예 12d: C16-π-폴리머 A 디말레에이트
실시예 12e: C16-π-폴리머 A 디아크릴레이트
실시예 12f: C16-π-폴리머 A (비스)아코니테이트
3. 불용해성 또는 약하게 용해되는 물질을 용해시키는 π 폴리머의 사용
실시예 1: 염료의 용해
불용해성 물질을 제거하기 위해 원심 분리된 그러나 달리 정제되지 않은, PEG15OO-co-숙신일-DTT-비스-C16-아미드 폴리머의 50mg/ml 수용액의 1.0 ml 분분에, 과량의 염료 에오신(Eosin) Y, 디클로로플루오레세인(dichlorofmorescein), 및 수단(Sudan) IV를 별도의 용기(FlexExcel™ 투명한 폴리프로필렌 웨잇-보트(weigh-boats), WB2.5 사이즈, AllExcel, Inc., West Haven, CT의 제품에 첨가하였고, 그 성분을 파스트를 형성하도록 함께 교반하였다. 방수 더블 스틱 테이프를 사용하여 그 용기 바닥을 그 다음에 작은 주얼리 울트라소닉 클리너 바스의 바닥에 부착시켰다. 충분한 물을 바스에 첨가하여서 웨이트 보트를 약 1/3 rd 높이로 침수시켰다. 소니케이션을 15분 동안 5분의 단계로 수행하였다. 액체를 원심분리 튜브로 이동시켰고, 두 번 30분 동안 벤치 탑 원심분리에서 원심분리하여 용해되지 않은 염료를 펠렛 아웃(pellet out)시켰다. 상청액을 깨끗한 튜브로 이동시켰고, 다시 원심분리하여 비말동반된 고체를 제거하였다. 폴리머 용액의 양과 동일한 양의 증류된 물에서 염료의 동일 양의 현탁액을 동일 방식으로 대조군으로서 처리하였다. 그 결과 얻은 용액을 TLC 플레이트에서 스팟(spot)팅하여(25 ul) 드롭(drop)으로부터 원을 형성하였다. 스팟의 강도를 에탄올 또는 에탄올/물에서 만들어지는 염료 용액의 표준으로부터 만들어진 스팟과 비교하여 대략적 농도를 결정하였다; 이 스팟은 도 1에 도시되어 있다. 물에서의 염료의 용해도를 상온에서 11 이상의 탈이온수(완충되지 않은)에서 염료의 적당한 양을 용해시킴에 의해 결정하였고, 포화된 용액을 얻기 위해 필요한 만큼 추가 물을 첨가하였다(즉 적정).
50mg/ml 폴리머에서 수단 IV의 농도는 H2O에서 0.000 mg/ml에 대조적으로, 약 0.2 mg/ml이었다(수단 IV는 중성 pH에서 불용성이다). 디클로로플루오레세인의 농도는 50mg/ml 폴리머에서 약 5mg/ml이었고, H2O에서 0.010 mg/ml와 대조된다. 50mg/ml 폴리머에서 에오신 Y의 농도는 약 5 mg/ml이었고, H2O에서 0.007 mg/ml와 대조된다. 패이로드(payload) 비율(폴리머의 단위량 당 약의 양)은 수단 IV에 대해 약 1:250, 디클로로플루오레세인에 대해 1:10 및 에오신 Y에대해 1:10로 계산되었다.
물리화학적 특성에서 약제학적으로 활성인 물질을 닮은 극성 화합물의 1:10의 패이로드 비율(payload ratios)은 리포솜, 사이클로덱스트린, Cremophor™, 또는 세척제으로 일반적으로 달성될 수 있는 것 또는 다른 용해 시스템보다 더 높다. 에오신 Y는 매우 높은 효능을 가진 광활성가능한 싱글렛 산소 생성기(photoactivable singlet oxygen generator)이고, 에오신 Y의 이러한 농축된 용액은 실시예1의 폴리머로 만들어지는 것과 같이 광활성 사이토톡식 작용제로서 약리학적으로 활성인 것으로 기대될 수 있다.
물(푸른 노란색)에서에 대한 폴리머 용액(붉은 노란색/오렌지)에서 디클로플루오레세인의 형광 스펙트럼에서의 변화는 가시적으로 감지될 수 있고 염료가 수성 환경에 있지 않음을 보여주지만 자기 조립된 폴리머 입자 코어의 유기 환경에 캡슐화되어 있음을 보여준다. 실제로, 형광 스펙트럼에서의 변화는 미세환경(예를 들어 "지질 프로브")의 극성에서의 변화를 결정하는 방법으로서 사용되오고 있다. 폴리머에서 수단 IV 용액의 색은 붉은 갈색이며, 에탄올 용액에서 붉은 색 및 물에 현탁되었을 때 갈색 파우더에 대조된다. 에오신 Y는 큰 가시적 시프트를 보여주지 않았다(물에서 핑크에서 폴리머 용액에서 붉은 핑크).
실시예 2: 의학적으로 관련된 물질의 용해도
푸르푸린(Purpurin), 암포테리신(Amphotericin) B, 캄토테신(Camptothecin) 및 독소루비신(Doxorubicin)을 대표적인 잘 용해되지 않는 활성 약제학적 성분(active pharmaceutical ingredients (API))으로서 선택하였다. 암포테리신(Amphotericin) B을 주입가능한 항균제로서 리포솜 제형으로 사용하였고, 한편 캄토테신 및 독소루비신은 항암제이다. 푸르푸린은 잠재적 약제학적 효용을 가진 DNA 삽입 염료이고, 에오신 Y은 광역학 치료에서 잠재적 용도를 가지는 광민감성 싱글렛 산소 시약이다. 각 API는 C16-π-폴리머 A, C18-π-폴리머 B, 및/또는 C16-π-폴리머 A-폴산 컨쥬케이트(아래 참조)를 가지는 물에서 용해된다. 용해도는 염료를 위해 상기 기재된 바와 같이, TLC 플레이트 상의 용해된 API 및 용해되지 않은 대조군을 스팟팅함에 의해 증명된다.
건조된 폴리머는 물로 재구성되고, 가열하고, 교반하고 필요한 경우 고주파 분해시켰다. 이 용액이 너무 점성이 있는 경우에, 희석된다. C16-π-폴리머 A는 10%w/v로 사용되고, 폴레이트화된 C16-π-폴리머 A는 5% w/v에서 사용되고, C18-π-폴리머 B는 2% w/v에서 사용된다.
약 물질(20 mg)은 1 ml의 폴리머 용액으로 직접 첨가되었고, 폴리머:API 질량 비가 C16-π-폴리머 A에 대해 5:1, 폴레이트화된 C16-π-폴리머 A에 대해 2.5:1 그리고 C18-π-폴리머 B에 대해 1:1이며, 독소루비신에 대한 것은 예외이다(아래 참조). 이 혼합물을 낮은 전력에서 1 시간 동안 고주파 분해하였고, 그 다음에 2000 xg에서 두 번 원심분리하여서 용해되지 않은 고체를 제거하였다. 펠렛화된 고체의 양은 중요하지 않다. 실리카 젤 TLC 플레이트 상의 용액을 스팟팅하는 것은 약이 용해되었음을 보여주고, 이동은 용매 프론트로부터 지연된다(도 2).
독소루비신 하이드로클로라이드는 10:1의 C16-π-폴리머 A의 독소루비신 하이드로클로라이드 질량 비 또는 5:1 폴레이트화된 C16-π-폴리머 A의 독소루비신 질량 비 질량 비로 상기와 같이 폴리머로 통합되며, 후속하여 충분한 3M 소듐 아세테이트를 첨가하여 독소루비신 하이드로클로라이드를 중화시켰다. 혼합물을 24시간 동안 강하게 흔들었고, 그 다음에 두 번 2000 xg로 원심 분리하여 용해되지 않은 고체를 제거하였다. 펠렛화된 고체의 양은 중요하지 않다.
용해된 API의 폴리머에 대한 질량 비는 표 1에 도시되어 있다. 어떠한 시도도 폴리머의 로딩을 최대화하기 위해 하지 않았고, 그래서 이 비율은 폴리머가 용액으로 이동될 수 있는 API의 양에서의 더 낮은 제한을 나타낸다.
각 용액의 10 ㎕ 샘플은 Bakerflex™ 실리카 젤 TLC 플레이트에 스팟팅되었고 퍼지도록 하였다. 수용액은 원의 외부 경계 및 캡슐화된 물질을 가진 폴리머의 이동에 의해 형성되는 내부 원을 형성한다. 모든 경우에, 단지 수성 영역의 주변 프린지(fringe)에 매우 적은 API가 있고, 성공적인 용해도 및 캡슐화된 물질의 최소한 누출을 나타낸다.
표 1: API의 용해도
폴리머: 기질 질량 비율
Figure 112009033403837-PCT00018
4. π 폴리머의 생체적합성
실시예 1: 국소 유화제, 크림 또는 파스트(paste)의 적합성
실시예의 폴리머의 농축된 오일성 왁스를 발명자에 의해 내부 손목 피부에 문질고, 업테이크(uptake)를 관찰하였다. 물질은 영역의 약간의 부드럽게 함을 가지는, 약리학적 왁스 크림에 유사하게 흡수되는 것 같다. 붉어짐, 발진, 또는 가려움과 같은 즉각적이거자 지연된 알레르기 반응이 이 단일 국소 적용에 관찰되지 않았다.
많은 이 폴리머는 상온에서 흡습성 왁스이고, 기대되는 mp는 약 45℃ 내지 60℃ 또는 그 초과이며, 조성물에 의존한다. 더 낮은 MW PEG로 만들어지는 폴리머는 상온에서 액체일 수 있다. 몇몇 폴리머는 상온에서 고체일 수 있고, 바디 온도에서 용융된다. 따라서, 이 π 폴리머의 특성은 그를 혼자 또는 활성 약제학적 제제를 포함하는 여러 물질과 함께 로션, 크림, 연고, 연화제 및 다른 전달 형태를 만들기 위해 이들을 훌륭한 기질로 만든다.
실시예 2: 비경구 용도의 적용성
실시예 1의 폴리머의 수용액을 포스페이트-버퍼 염류에서 제조하였고, 그 다음에 0.22 ㎛ 필터를 통해 살균 튜브로 여과시켰다.
최대 내성 용량 프로토콜을 사용하였다. 여기서 CD-I 쥐에 폴리머의 5% w/v 이하의 수용액을 몸무게 kg 당 10 ml의 용량으로 꼬리 정맥 주입하였다. 군에 의존하여, 쥐를 12 시간 동안 계속적으로 그리고 매 2시간 그 후 48 내지 72시간 동안 관찰하였다. 혈액 샘플을 취하였고 분석하였다. 몇몇 쥐는 희생되었고, 우선 그로스 히스톨로지(gross histology)를 시험하였다. 마이크로스코픽 히스톨로지를 그 다음에 선택된 섹션에서 수행하였다.
대조군 쥐와 치료된 취 사이에 혈액 화학에서 어떠한 관찰가능한 차이는 발견되지 않았다. 심장, 폐, 콩팥, 비장, 간, 장, 위, 방광, 피부, 근육, 뼈, 뇌 및 림프 노드를 포함하는 여러 조직의 그로스 히스톨로지에서 대조군 동물에 비교하여 어떠한 관찰가능한 차이 또는 병변은 발견되지 않았다. 동물의 상이한 군으로부터 여러 종을 연구하였고, 동일한 결과가 관찰되었다. 시험된 조직의 세포 조직 구조에서 어떠한 관찰가능한 차이는 발견되지 않았다. 몇몇 콩팥은 폴리머에 대한 노출 시간과 함께 줄어드는 몇몇 캐스팅(casting)을 보여주었다. 이는 캐스팅은 일시적인 상이고 시간이 지남에 따라 정상이 될 것임을 보여준다.
결론적으로 이 폴리머는 주입가능한 제형 및 다른 비경구형 제형에서 약제학적 제제로서 의학적 용도에 안전하다. 합리적으로 예상할 수 있는 것은 이 폴리머가 경구 용액, 캡플렛 및 타블렛, 비강 스프레이, 구강/기관지 에어로졸, 설하, 피 부 크림/로션/패치, 안약, 다른 국소 루트 및 다른 투여 경로에서 안전하다는 것이다.
5. π-폴리머에 대한 표적 부분의 부착
실시예 1: 아미드 결합 형성을 통한 C-16 π-폴리머 B에 대한 갈락토사민의 부착
갈락토사민(GA)은 헤파틱 아시알로글리코단백질 수용체(ASGPR)를 표적하고, 공유결합된 글락토사민을 가지는 폴리머는 간에 전달된다; 참조 L. Seymour et al., "Hepatic Drug Targeting: Phase I Evaluation of Polymer-Bound Doxorubicin" J Clin. Oncology, 20(6): 1668-1676 (2002) 및 이의 참조 문헌.
C16-π-폴리머 B(상기 합성 방법 섹션에서 실시예 10)(461 mg, 반복 유닛 당 0.2 mmol 당량 COOH)를 14 mL 물에서 분산시켰고, 이 분산액에 EDC HCl(0.485 mmols) 및 N-하이드록시숙신이미드(0.464 mmols)을 첨가하였다. 이 혼합물을 15분 동안 주위 온도에서 교반하였고, 1 ml 물 내 갈락토사민 HCl(0.386 mmol) 및 TEMED(0.387 mmols)의 용액을 첨가하였다. 그 용액을 교반하였고, 반응은 실리카 젤 상 TLC 및 1-부탄올-아세트산-물(3:1:1)에서의 전개에 의해 후속되었다. TEMED(0.079 mmols), NHS(0.078 mmols) 및 EDC HCl(0.193 mmols)의 추가 양을 첨가하여 반응이 완성되도록 하였다. TLC이 GA의 소비에 대한 지속 상태를 보여주는 경우에, 반응 혼합물을 3 x 1000 ml 탈이온수에 대항하여 투석하여(3500 Da cut-off membrane) 낮은 분자량 반응물 및 부산물을 제거하였다. 보전물을 제거하였고, 일정한 중량(348 mg)으로 60℃에서 건조시켰다.
생성물의 TLC는 유리 GA가 존재하지 않는 것을 나타내었다(닌히드린 음성). 생성물의 샘플을 100℃에서 6 N HCl로 가수분해시켜서 결합된 GA를 가수분해하였다. TLC 분석은 참조 GA와 동일한 Rf에서 GA의 존재를 보여주었다(닌히드린 양성).
실시예 2: 폴산의 C18-π-폴리머 A에의 부착
아르곤으로 플러쉬된 BDDC(2.44 g, 8.56 mmol)를 125 mL 둥근 바닥 플라스크에 일정량을 배분하였다(weighed out)(BDDC는 벌꿀과 같은 농도를 가지는 매우 점성이 있고 다루기 어렵다). C18-π-폴리머 A(1O g, 4.28 mmol)를 플라스크에 첨가하였고, 그 혼합물을 70℃로 가열하였고, 반응물을 약 30분 동안 함께 교반하였다. 폴산(3 g)을 첨가하였고, 교반이 가능하도록 충분한 THF가 후속되었다. 반응물을 40-70℃에서 밤새 교반하였고, 습기로부터 보호되었다. THF를 그 다음에 증발되도록 하였고, 물(80 mL)을 첨가하였고, 혼합물을 50℃에서 추가 2시간 동안 교반하였다. 상온으로 냉각한 후에, 그 혼합물을 컷오프로 튜빙하는 투석의 섹션으로 이동시켰고, 0.1 N HCl(2 x 2000 ml), 물(2000 ml), 5% 소듐 카르보네이트(2 x 2000 ml) 및 물(4 x 2000 ml)에 대항하여 투석하여 미반응된 시약 및 부산물을 제거하였다. 밝은 노란색-오렌지 색 보전물을 제거하였다. 한 부분을 일정한 질량으로 증발시켜서 고체 농도를 결정하였고, 상기 기재되어 있는 용해도 실험을 위해 사용하였다.
실시예 3: N-아세틸 류라민산 (NANA)의 C16-π-폴리머 B에 대한 부착
류라민산 유도체는 인플루엔자 바이러스를 위한 표적 부분으로 기재된다. 왜냐하면 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제 코트 단백질 때문이며, 이 둘은 시알산에 결합하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 π-폴리머에 NANA 및이의 유도체를 커플링하기 위한 여러 방법을 개발하였다.
실시예 3a: 에스테르화를 통한 C16-π-폴리머 A에 대한 N-아세틸 뉴라민산 (NANA)의 부착.
BDDC (2.44 g, 8.56 mmols) 및 C18-π-폴리머 A (10 g, 4.28 mmols)를 결합시키고 70 ℃로 가열하고 아르곤하에서 약 30분 동안 함께 교반하였다. N-아세틸 뉴라민산 (3 g)을 첨가하고 난 다음, 필요에 따라 유동성이 유지되도록 하기 위해 THF를 첨가하였다. 반응물을 밤새 40-70℃에서 교반하여, 습기로부터 보호하였다. 물 (80 mL)을 첨가하고, 혼합물을 추가의 2시간 동안 50 ℃에서 교반하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 혼합물을 3.5 kDa 컷오프 막을 사용하여 0.1N HCl, 5% NaHCO3, 및 물(각각 2 x 2000 ml)에 대하여 투석시켰다. 실리카 겔 TLC 플레이트 상에서 스포팅(spotting), 및 13O℃에서, 70% 황산 중의 0.2% 오르시놀에 의한 가시화는 상기 폴리머에 대한 뉴라민산의 통합을 보여주었다.
실시예 3b: C16-π-폴리머 A에 대한 N-아세틸 뉴라민산 (NANA) 모노말레이트의 부착.
5-N-아세틸뉴라민산 (NANA) (0.86 mmols), 말레산무수물 (0.93 mmols) 및 트리에틸아민 (1.77 mmols)을 건조된 둥근 바닥 플라스크 안의 1.5 mL DMSO에 용해시켰다. 상기 플라스크를 아르곤으로 플러시(flush)해내고 오일 욕조에 두었다. 혼 합물을 65 ℃ 내지 85 ℃에서 교반하고 반응이 완료될 때까지(NANA의 부재, 오르시놀 /H2SO4 또는 우레아/HCl 시약으로 검출) 진행과정을 실리카 플레이트 상에서의 TLC(i-PrOH-EtO Ac-물, 4:3:2)로 확인하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시기고, 물을 첨가하여 과량의 말레산무수물을 가수분해시켰다. 그 결과 얻어진 NANA 모노말레이트 용액을 후속 반응에 직접적으로 사용하였다.
C16-π-폴리머 A 디글리콜레이트 수용액(실시예 11a, "π-폴리머의 합성" 참조) (1.23 mmols 반복 단위, 2.46 mmols -COOH)의 pH를 pH 4.5-6.5로 조정하였다. 카르보디이미드 (EDC HCl, 3.86 mmols) 및 N-히드록시석신이미드 (2.6 mmols)를 첨가하고 혼합물을 주위 온도에서 약 60분 동안 교반하였다. 위에 기술한대로 제조한, NANA 모노말레이트(2.49 mmoles) 용액을 첨가하고, TEMED를 이용하여 pH를 pH 6-7로 조정하였다. 교반을 주위 온도에서 최대 26시간 동안 지속하였다. 생성물을 투석으로 정제하였는데, 제일 먼저 아세트산 나트륨(20 mmolar, pH 4.5)으로 투석하고 난 후, 물로 투석하였다. 잔류물(Retentate)을 제거하고 사용을 위해 저장하였다.
실시예 3c: 스페이서를 통한, C16-π-폴리머 A에 대한 N-아세틸 뉴라민산 (NANA)의 부착.
시스테아민 (2-아미노에탄티올) 히드로클로라이드(물 중의 0.93 mmol)를 동일 몰당량의 NANA 모노말레이트(위에서 기술한 대로 제조한 용액)에 첨가하고 난 후, 이중 결합에 대한 티올의 부가를 용이하게 하기 위해 동일 몰당량의 TEMED를 첨가하였다. 반응이 완료되어 표적 모이어티 D가 생성될 때까지(O-말레오일-NANA의 부재, 오르시놀/H2SO4 또는 우레아/HCl 시약으로 검출) 반응액을 실리카 상의 TLC(i-PrOH-EtO Ac-물, 4:3:2)로 확인하였다.
Figure 112009033403837-PCT00019
동일한 방법으로, 5-N-아세틸-2,3-데히드로-2-데옥시뉴라민산 (DANA)를 유도체화하여 표적 모이어티 E를 생성시켰다.
Figure 112009033403837-PCT00020
동일한 방법으로, 시스테인 및 글루타치온을 NANA 및 DANA의 말레산 모노에스테르에 부가하였다.
상기 실시예 3b에 기술한 방법에 의해, C16-π-폴리머 A 비스(아코니테이트)의 머캅토석시네이트 컨주게이트를 표적 모이어티 D와 함께 아미드화시켰다. 이 폴리머는 반복 단위 당 최대 8개의 -COOH 기를 내포하였다(실시예 12c, "π-폴리머의 합성'을 참조).
실시예 3d: 스페이서를 통한, C16-π-폴리머 A에 대한 N-아세틸 뉴라민산 (NANA)의 부착.
위에 기술한 방법에 의해, 표적 모이어티 E를 C16-π-폴리머 A 디글리콜레이트에 컨주게이션시켰다(실시예 11a, "π-폴리머의 합성'을 참조).
실시예 3e: C16-π-폴리머에 대한 뉴라민산 β-메틸글리코시드(MNA)의 부착.
평균적으로 반복 단위 당 1개의 카르복시기를 지니는(0.396 mmol)을 물에 용해시키고 NHS(0.4 mmol) 및 EDC·HCl(0.64 mmol)와 반응시켰다. 뉴라민산-β-메틸글리코시드(MNA)(0.42 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 주위 온도에서(25-30 ℃) 18 내지 24시간 동안 교반하고 난 다음 투석으로 정제하였다.
실시예 3f: 반복 단위 당 2개의 카르복시기를 지니는 C16-π-폴리머 A 디글리콜레이트의 제 2 샘플을 또한 동일한 방식으로 MNA에 컨주게이션시켰다.
실시예 3g: C16-π-폴리머 B에 대한 β-O-메틸 뉴라민산 (MNA)의 부착.
1 ml 물 중의, COOH 기준 43 마이크로몰, C16-π-폴리머 B, 및 뉴라민산 β-메틸 글리코시드(토론토 리서치 케미칼즈)(40 마이크로몰)을 함께 섞고, 0.1 ml 물 중의 40 마이크로몰의 NHS를 첨가하고 난 다음 0.1 ml 물 중의 40마이크로몰의 EDC 히드로클로라이드를 첨가하였다. 반응 혼합물을 주위 온도에서 48시간 동안 진탕시키고 이소프로판올-에틸아세테이트-물(4:3:2)을 이용한 실리카 겔 상의 TLC로 분석하였다. 13O℃에서, 70% 황산 중의 0.2% 오르시놀을 이용한 검출은 출발 폴미머와 발색 반응을 일으키지 아니하였으나, 반응 혼합물에 대한 TLC는 폴리머와 함께 동시-이동하는(co-migrating) 자주색 스폿을 나타내었다.
상기 실시예들(3a-3g)에서 모든 폴리머 컨주게이트들은, 투석 후, TLC에 따른 오르시놀/황산 또는 우레아/HCL 시약으로 가시화될 때 뉴라민산의 존재에 대하여, 양성 반응을 나타내었다.
실시예 4: C16-π-폴리머 B에 대한 자나미비르의 부착.
자나미비르 (GG 167)는 바이러스 뉴라미니다아제의 유력한 억제자이고, 다가 리간드로서 이 분자를 지니는 폴리머는 인플루엔자 바이러스 복제의 억제자이다.
C16-π-폴리머 B (920 mg)를 30 mL 물에 분산시키고, 이 분산액에 EDC HCl (1.2 mmol) 및 N-히드록시석신이미드 (1.1 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 주위 온도에서 20분 동안 교반하고, 1 ml 물 중의 5-아세트아미도-7-(6'-아미노헥실)-카바밀옥시-4-구아니디노-2,3,4,5-테트라데옥시-D-글리세로-D-갈락토-논-2-에노피라노손산(미국 특허 제6,242,582호 및 제6,680,054호)(0.39 g, 0.67 mmol)의 트리플루오로아세트산 염 및 TEMED (0.67 mmols)를 첨가하였다. 상기 용액을 실온에서 교반하고, 반응액을 TLC로 분석하였다. 반응 혼합물을 3 x 1000 ml 탈이온수로 투석시켜(3500 kDa 컷-오프 막) 저분자량 반응물 및 부산물을 제거하였다. 잔류물을 제거하고 60℃에서 균일 중량으로 건조시켰다. 당 통합 수준을 구아니딘 기에 대한 비색 분석(colorimetric assay)으로 측정하였다(Can. J. Chem., 36:1541 (1958)). 뉴라미니다아제 분석을 포티에 등의 문헌(Potier et al, Anal Biochem., 29 287 (1979))에 기술된 절차에 따라 수행하였다.
실시예 5: 미모신의 부착.
4.5 % w/v 용액(1 mmol 반복 단위, COOH 기 약(ca.) 2 mmol)으로서 C16-π-ρolymer A 디글리콜레이트(실시예 11a, "π-폴리머의 합성" 참조)를 NHS (2.27 mmol) 및 EDC-HCl (2.23 mmols)와 반응시키고, 그 결과 얻어진 혼합물에 1-미모신 용액(2.14 mmol, 5 ml 물에서 제조되었고 용해도를 증가시키기 위해 TEMED로 pH가 조정됨)을 첨가하고 약 22 내지 24시간 동안 pH 약 6.8-7 및 주위 온도에서 교반하였다. pH를 6 N HCl을 사용하여 3-4로 조정하고, 혼합물을 15-30분 동안 교반하고 TEMED를 첨가하여 pH를 6.1로 증가시켰다. 그런 다음 혼합물을 물로 투석시켜(3.5 kD 컷오프) 불순물 및 저 분자량 생성물을 제거하였다.
실시예 6: π-폴리머 A 디말레이트 및 디아크릴레이트에 대한 펩티드 및 프로테인의 부착:
Fab 단편에 대한 일반적 절차: 항체 F(ab')2 단편내의 이황화 결합을 제조업자의 프로토콜에 따라 고정화된 TCEP 이황화결합 환원 겔(TCEP Disulfied Reducing Gel, 피어스, 제품번호 0077712)을 사용하여 제거하거나; 대안적으로 용액으로 DTT 또는 TCEP를 사용하여 제거하였는데, 3OkD 필터를 이용한 초원심분리로 소모된 시약을 제거하였다. 그런 다음 유리 설프히드릴 기를 포함한 환원된 F(ab')2 단편을 TEMED 존재하에 π-폴리머 A 디말레이트 또는 디아크릴레이트와 반응시켰다.
시스테인 및 시스테인-포함 펩티드에 대한 일반적인 절차: π-폴리머 A의 아크릴레이트 또는 말레이트 에스테르를 촉매로서 트리에틸아민을 사용하여 시스테인 잔기와 반응시켰다. 물 중의 폴리머 디아크릴레이트 (0.3 mmols 반복 단위, 0.6 mmols 아크릴레이트) 현탁액을 시스테인 (0.66 mmol) 및 트리에틸아민 (1.32 mmol)에 첨가하였다. 플라스크를 아르곤으로 플래시시키고 주위온도에서 밤새(약 18시간) 교반하였다. 실리카 상에서 반응물에 대한 TLC(i-PrOH-에틸아세테이트-물, 4:3:2)는 시스테인의 부재 및 폴리머에 대한 닌히드린-양성 스폿을 나타내었는데, 이는 아크릴레이트 이중 결합에 대한 시스테인의 첨가를 의미한다.
실시예 6a: C 16-π-폴리머 A 디글리콜레이트에 대한 항-광견병 항체 단편의 부착:
C16-π-폴리머 A 디말레이트를, 분자량 4500의 PEG와 함께 시작하여, 제조하였다. 베이랩(BayRab™) 인간 광견병 면역글로불린(MgG)을 일반적 방식으로 산성 pH 완충액 중에서 펩신으로 처리하여 F(ab')2 단편을 생성시켰는데, 5OkD 필터를 사용한 초원심분리로 상기 단편을 정제하였다. F(ab')2 단편을 상기 실시예 5에 기술된 EDC 방법으로 PEG 4500 C-16-π-폴리머 A 디글리콜레이트에 커플링시켰다.
실시예 6b: C16-π-폴리머 A 디말레이트에 대한 항-광견병 항체 단편의 부착:
베이랩 hIgG의 F(ab')2 단편(실시예 6a 참조)을 DTT(또는 대안적으로 TCEP)로 환원시키고, 소모된 시약을 3OkD 필터를 사용한 초원심분리로 제거하였다. Fab'-SH 단편을 pH 7-8.3(TEMED)에서 말레산 이중 결합에 대한 유리 티올의 마이클(Michael) 첨가로 PEG 4500 C-16-π-폴리머 A 디말레이트에 커플링시켰다. 컨주게이트를 10OkD 필터를 사용한 초원심분리로 정제하여 저 분자량 오염체를 제거하였다.
실시예 6c: PEG 8500 C-16-π-폴리머 A 디말레이트를 위에 기술한 대로 베이랩 hlgG의 환원된 F(ab')2 단편에 컨주게이션시켰다.
실시예 6d: C16-π-폴리머 A 디말레이트에 대한 펩티드의 부착:
펩티드 KDYRGWKHWVYYTC("Rab 1")는 광견병 바이러스에 결합하는 것으로 보고되었다(T.L. Lentz, 1990, J. MoI. Recognition, 3(2):82-88). 이 펩티드의 말단 Cys는 항-광견변 펩티드-π-폴리머 A 컨주게이트를 합성하는데 사용되었다. PEG 1500 (0.157 mmol)에서 유래한 C16-π-폴리머 A 디말레이트(반복 단위 당 2개의 말레산 모이어티들)를 물 (6 mL)에 용해시키고 TEMED를 이용하여 상기 용액의 pH를 약 8로 조정하였다. DMF (3.1 ml) 중에 용해된 상기 펩티드(0.157 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 아르곤하 주위 온도에서 교반하였는데, 이때 반응액 pH는 8- 8.3 사이에서 유지되었다. 반응의 진행과정을 엘만(Ellman) 시약을 이용하여 반응 혼합물을 시험함으로써 확인하였다. 약 45시간 경과 후, 엘만 시험은 거의 음성반응을 나타냈다. 물을 첨가하여 DMF 농도를 떨어뜨리고 반응 혼합물을 원심분리시켜 소량의 침전물을 제거하였다. 깨끗한 상청액을 10 kD 원심분리 필터 유닛(Arnicon Ultra 10 kD, 카탈로그 번호(cat#) UFC901024)을 이용하여 초원심분리시키고 진류물을 물로 반복 세척하여 저 분자량 오염체를 제거하였다.
하기 3가지 펩티드들(O = 오르니틴; NH2는 C-말단 아미드를 의미함) 자동화 고체-상 합성에 의해 제조하고, Rabl 펩티드에서와 마찬가지로 동일한 방식으로 PEGl 500 π-폴리머 A 디말레이트에 컨주게이션시켰다:
실시예 6d: KDYRGWKOWVYYTC ("Rab2")
실시예 6e: KGWKHWVYC(NH2) ("Rab3")
실시예 6f: KGWKOWVYC(NH2) ("Rab4")
6. π-폴리머의 항바이러스 활성.
실시예 1: 인플루엔자에 대한 효능.
ATCC VR-1520 (H2N1) 인간 인플루엔자 바이러스를 생쥐 보호 분석에 사용하였다. 1회 꼬리 정맥 주사(200ul/20g BW)가 대조군 동물에서 99.5% 치사 감염을 일으켰다(7일간 비치료 생존).
각 그룹은 10마리의 생쥐로 구성되었다. 생쥐에게 꼬리-정맥-주사로 200ul/20g 체중의 저 용량(0.0375%) 및 상기 실시예 3의 π-폴리머 B-MNA 컨주게이트의 고 용량(0.15%) 용액을 주입하였다. 치료-후 동물들은 주입 후 24시에 투여받았으나, 한편 비치료 동물은 주입 전 6시에 투여받았다. 양성 대조군 동물들에게 동일한 양의 유리 리간드를 주입하였고, 한편 음성 대조군에는 염수 완충 주사를 주입하였다.
생존 시간을 지표 효능 종결점(index efficacy end point)으로 사용하였다. 체중을 연구 파라미터로 추적조사하였다. 내부 장기에 대한 조직연구를 육안 검사 및 현미경 검사 둘 모두로 수행하였다. 결과는 도 2에 제시되어 있다.
양성 대조군의 경우 생존 시간이 단지 2.94시간(+/- 0.75h SD)으로 나타났으나 이에 비하여, 고 용량 처치 그룹의 경우 증가된 생존 시간은 5.93 시간 (+/-0.48h SD)으로 나타났다(도 1 및 2). 리간드의 양에 기초하여, 고 용량 처치는, 기껏해야, 리간드의 0.03%에 상당하는데, 이는 0.2 w/w의 최대 폴리머-컨주게이트 대체율로 추산된다. 따라서 폴리머 컨주게이트는 비컨주게이션된 리간드 대조군에 비하여 상당히 높은 수준의 효능을 나타내었다.
골수 절편에서 처치된 생쥐들은 백혈구 수준이 약간 감소된 것을 제외하고(이는 인플루엔자 감염의 영향의 탓일 수 있음), 고 용량 폴리머 B-MNA 컨주게이트 처치 그룹의 몇몇 생쥐에 대한 육한 조직검사 뿐만 아니라 현미경 검사는 정상 패턴을 보여주었다. 보호 그룹(고 용량 - 8.9%, 저 용량 - 6.2%)에서 뿐만 아니라 처치 그룹(고 용량 - 9.0%, 저 용량 - 9.4%)에서 체중 감소는 양성 대조군(- 9.8%)에서의 감소에 비해 더 적었는데, 이는 리간드 그 자체 보다 폴리머와의 결합을 시사한다(도 3). 0.7%에 해당하는 소량의 체중 증가가 비처치된 생쥐에서 발생하였다.
실시예 2: 광견병에 대한 효능.
10마리의 흰색 스위스 생쥐로 구성된 그룹(각각 약 20g, 성별 혼재)을 생체내 보호 분석에 사용하였다. 생쥐들을 광견병 바이러스(LD50 3x) 주사로 공격하였다. 주사는, 10-6(100 LD50/ml)로 희석된, 0.03 ml CVS(공격 바이러스 표준) 광견병 종이었다. 일일 생존, 마비, 및 체중을 모니터하였다.
25시, 48시, 및 72시에 복막내 약물 투여, 및 25시와 48시에 뇌내 약물 투여를 조사하였다. 결과는 표 1 및 2에 제시되어 있다.
Figure 112009033403837-PCT00021
Figure 112009033403837-PCT00022

Claims (18)

  1. 교호적 브랜치-포인트 부분 B 및 친수성, 수용성 폴리머 블록 A로 형성되는 백본을 포함하고; 브랜치-포인트 부분에 부착되어 있는 소수성 측쇄 C 및 리간드 Z를 가지는, 하기 구조로 실질적으로 구성되는 콤(comb) 폴리머를 동물에 투여하는 것을 포함하는 바이러스에 의한 동물 감염의 치료 또는 예방 방법:
    Figure 112009033403837-PCT00023
    상기 식에서, 각 소수성 측쇄 C는 독립적으로 하나 이상의 친수성 치환체로 치환되거나 치환되지 않는 C6-C30 선형 또는 분지형 탄화수소; 하나 이상의 친수성 치환체로 치환되거나 치환되지 않는 C6-C30 사이클릭 또는 폴리사이클릭 탄화수소; 및 소수성 아미노산, 펩티드 및 폴리머로 구성되는 군으로부터 선택되며;
    각 리간드 Z는 독립적으로 상기 바이러스의 표면에 대한 특이적 결합 친화성을 가지는 리간드이고;
    s는 결합 또는 스페이서 부분이며;
    n의 값은 3 내지 약 100의 범위이고;
    p의 평균 값은 1 초과 내지 4이며;
    r의 평균 값은 1 내지 8이다.
  2. 제1항에 있어서, 하나 이상의 리간드가 N-아세틸 뉴라민산 또는 이의 유도체임을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 리간드가 N-아세틸 뉴라민산, 뉴라민산 β-메틸 글리코사이드 및 4-구아니디노-2,4-디데옥시-2,3-데히드로-N-아세틸뉴라민산으로 구성되는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 하나 이상의 리간드 Z가 상기 바이러스의 표면에 대한 특이적 결합 친화성을 가지는 항체 또는 항체 절편임을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 리간드가 인간 항-광견병 IgG 면역 글로빈으로부터 유도된 F(ab')2 절편임을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 하나 이상의 리간드 Z가 KDYRGWKHWVYYTC, KDYRGWKOWVYYTC, KGWKHWVYC(NH2), 및 KGWKOWVYC(NH2)로 구성되는 군으로부터 선택되는 펩티드임을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수용성 폴리머 블록 A가 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(프로필렌 글리콜), 폴리(에틸렌이민), 폴리(비닐 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리사카라이드, 및 이의 공중합체로 구성되는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 폴리머 블록 A가 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(프로필렌 글리콜), 및 이의 공중합체로 구성되는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 폴리머 블록 A가 폴리(에틸렌 글리콜)임을 특징으로 하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 폴리머 블록 A가 4 내지 700 단량체 단위의 평균 길이를 가짐을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 폴리머가 하기 구조를 가짐을 특징으로 하는 방법:
    Figure 112009033403837-PCT00024
    상기 식에서, m은 4-700이며, Y 및 Y'는 독립적으로 R, OR, COOR, SR, NHR, NRR', ONHR, NHOR, NRNH2, NHNHR, NRNHR', 및 NHNRR'로 구성되는 군으로부터 선택되며, 여기서 R 및 R'은 독립적으로 하나 이상의 친수성 치환체로 치환되거나 치환되지 않는 C6-C30 선형 또는 분지형 탄화수소; 하나 이상의 친수성 치환체로 치환되거나 치환되지 않는 C6-C30 사이클릭 또는 폴리사이클릭 탄화수소; 및 소수성 아미노산, 펩티드 및 폴리머로 구성되는 군으로부터 선택된다.
  12. 제1항에 있어서, 상기 폴리머가 하기 구조를 가짐을 특징으로 하는 방법:
    Figure 112009033403837-PCT00025
    상기 식에서, m은 4-700이며, W는 O 또는 NH이며, Y 및 Y'는 독립적으로 R, COR, COOR, CONHR, CONRR', CONHOR, CONRNH2, CONHNHR, CONRNHR', 및 CONHNRR'로 구성되는 군으로부터 선택되며, 여기서 R 및 R'은 독립적으로 하나 이상의 친수성 치환체로 치환되거나 치환되지 않는 C6-C30 선형 또는 분지형 탄화수소; 하나 이상의 친수성 치환체로 치환되거나 치환되지 않는 C6-C30 사이클릭 또는 폴리사이클릭 탄화수소; 및 소수성 아미노산, 펩티드 및 폴리머로 구성되는 군으로부터 선택된다.
  13. 제1항에 있어서, 상기 폴리머가 하기 구조를 가짐을 특징으로 하는 방법:
    Figure 112009033403837-PCT00026
    상기 식에서, 부분 D는
    Figure 112009033403837-PCT00027
    을 가지는 디아민으로부터 유도되며, 각 X는 독립적으로 반응성 작용기이며, p는 0-4이고, m은 4-700이고, R 및 R'은 독립적으로 하나 이상의 친수성 치환체로 치환되거나 치환되지 않는 C6-C30 선형 또는 분지형 탄화수소; 하나 이상의 친수성 치환체로 치환되거나 치환되지 않는 C6-C30 사이클릭 또는 폴리사이클릭 탄화수소; 및 소수성 아미노산, 펩티드 및 폴리머로 구성되는 군으로부터 선택된다.
  14. 제1항에 있어서, 상기 폴리머가 하기 구조를 가짐을 특징으로 하는 방법:
    Figure 112009033403837-PCT00028
    상기 식에서, m은 4-700이며, W는 O 또는 NH이며, R 및 R'은 독립적으로 하나 이상의 친수성 치환체로 치환되거나 치환되지 않는 C6-C30 선형 또는 분지형 탄 화수소; 하나 이상의 친수성 치환체로 치환되거나 치환되지 않는 C6-C30 사이클릭 또는 폴리사이클릭 탄화수소; 및 소수성 아미노산, 펩티드 및 폴리머로 구성되는 군으로부터 선택된다.
  15. 제1항에 있어서, 상기 폴리머가 하기 구조를 가짐을 특징으로 하는 방법:
    Figure 112009033403837-PCT00029
    상기 식에서, m은 4-700이고, L은 페닐렌, C2-C6 알킬렌 또는 벤젠디메틸렌이고, W가 O 또는 NH이며 R 및 R'은 독립적으로 하나 이상의 친수성 치환체로 치환되거나 치환되지 않는 C6-C30 선형 또는 분지형 탄화수소; 하나 이상의 친수성 치환체로 치환되거나 치환되지 않는 C6-C30 사이클릭 또는 폴리사이클릭 탄화수소; 및 소수성 아미노산, 펩티드 및 폴리머로 구성되는 군으로부터 선택된다.
  16. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스가 인플루엔자 바이러스임을 특징으로 하는 방법.
  17. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스가 광견병 바이러스임을 특징으로 하는 방법.
  18. KDYRGWKOWVYYTC, KGWKHWVYC(NH2), 및 KGWKOWVYC(NH2)로 구성되는 군으로부터 선택되는 펩티드.
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