JPH048748B2 - - Google Patents

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【発明の詳細な説明】 本発明は免疫化学的分析法とくに酵素免疫測定
法（以下、EIAと略称する。）用試薬に関する。

EIAは放射免疫測定法（以下、RIAと略称す
る。）と同様に、極めて微量の物質を測定するこ
とのできる優れた臨床検査法として、疾病の診
断、病態把握、管理などに繁用されている。しか
し、RIAは放射性同位元素を利用することに起因
する難点を持つているのでその普及には制限があ
る。一方、EIAは標識に酵素を利用するものであ
り、特殊な検査室を必要としないという特徴があ
るので、近年急速に発展してきた。EIAの手法と
して「酵素免疫測定法」〔石川栄治編、医学書院
（1978年）〕に記載された方法があり、競合法、非
競合法に２分される。とくに、非競合法すなわち
サンドイツチ法ならびにそれに類する方法が繁用
されている。

EIAで用いられる標識用酵素として、安定で高
感度測定が可能であり、標識化反応時に損傷を受
けないことが望ましい。これまでにペルオキシダ
ーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリフオ
スフアターゼ、グルコースオキシダーゼなどが用
いられているが、上記の酵素のうち、ペルオキシ
ダーゼは分子量約４万の極めて安定な酵素で、酵
素活性も高いため最も繁用されている。

ペルオキシダーゼをEIAに利用するにあたつ
て、ペルオキシダーゼと免疫化学的活性物質とを
予め結合させる必要がある。以下に、通常行なわ
れている方法を示すが、それぞれ欠点を有し、改
善が切望されていた。

グルタルアルデヒド架橋法；ペルオキシダーゼ
と免疫化学的活性物質例えばタンパクとをグルタ
リアルデヒドで架橋する方法である。ペルオキシ
ダーゼとタンパクとを同時に加える１段階法〔イ
ムノケミストリー（Immunochemistry）、第６巻
（1969年）第43頁参照〕とペルオキシダーゼをグ
ルタルアルデヒドで処理し洗浄後タンパクを結合
させる２段階法〔イムノケミストリー、第８巻
（1971年）、第1175頁参照〕 があるが、前者では、得られた酵素複合体は重合
物を含む極めて不均一なものとなる。後者では比
較的重合物は少ないが、酵素の複合体生成のため
の収率が10％以下となり低収率であるという欠点
を有する。

過ヨウ素酸架橋法；中根らによつて開発された
方法〔ザ・ジヤーナル・オブ・ヒストケミトリ
ー・アンド・サイトケミストリー〔The Journal
of Histochemistry and Cytochemistry）第22
巻（1974年）第1084頁参照〕であり、ペルオキシ
ダーゼの糖の部分を過ヨウ素酸酸化してアルデヒ
ド基を生成させ、免疫化学的活性物質例えばタン
パクの有するアミノ酸と結合させてシツフ塩基を
つくり、さりに還元して安定な酵素複合体を調製
する。この方法は酵素の利用率は高いが重合体が
できやすいという欠点を有する。

グルタルアルデヒド架橋法あるいは過ヨウ素酸
架橋法で得られた酵素複合体はセフアデツクスＧ
−200〔フアルマシア・フアインケミカル社（スエ
ーデン）製〕などのゲルクロマトグラフイーを行
なつて精製しても不均一な酵素複合体しか得られ
ず、したがつてEIAに供しても重合した酵素複合
体による非特異的反応が大きく、高感度測定用と
しては不適当であるとされた。またこれらの方法
はペルオキシダーゼに結合させる免疫化学的活性
物質例えばタンパクが種々の程度の損傷を受ける
ので、測定感度の低下をきたす。

本発明者は、高感度測定が可能なペルオキシダ
ーゼ複合体の作成方法について鋭意検討したとこ
ろ、ペルオキシダーゼと免疫化学的活性物質と
を、サウシンイミド基とマレイミド基とを有する
化合物により結合させると、上記欠点を有しない
極めて優れた酵素複合体が得られることを見いだ
し、これに基づいてさらに研究した結果、本発明
を完成した。

本発明は、(1)一般式 ［式中、Ａは免疫化学的活性物質としての抗体
Fab′フラグメント（Ａ−SH）の残基を、Ｂはペ
ルオキシダーゼ（Ｂ−NH₂）のを、ｎは０ない
し５の整数を、Ｒは化学結合またはシクロヘキシ
レンをそれぞれ示す。］で表わされるペルオキシ
ダーゼと免疫化学的活性物質との複合体（）、
(2)ペルオキシダーゼ（Ｂ−NH₂）に 一般式 ［式中、ｎは０ないし５の整数を、Ｒは化学結合
またはシクロヘキシレンをぞれぞれ示す。］で表
わされる化合物（）を反応させ 一般式 ［式中、Ｂはペルオキシダーゼの残基を表わす。
ｎおよびＲは前記と同意義を有する。］で表わさ
れる化合物（）を得、ついでこれに免疫化学的
活性物質としての抗体Fab′フラグメント（Ａ−
SH）を反応させることを特徴とする 一般式 ［式中、Ａは免疫化学的活性物質としての抗体
Fab′フラグメントの残基を示す。Ｂ、ｎおよび
Ｒは前記と同意義を有する］で表わされるペルオ
キシダーゼと免疫化学的活性物質との複合体
（）の製造法および(3)一般式 ［式中、Ａは免疫化学的活性物質（Ａ−SH）の
残基を、Ｂはペルオキシダーゼ（Ｂ−NH₂）の
残基を、ｎは０ないし５の整数を、Ｒは化学結合
またはシクロヘキシレンをそれぞれ示す。］で表
わされるペルオキシダーゼと免疫化学的活性物質
との複合体（）を含有する免疫化学的測定試薬
である。

Ａ−SHを示される免疫化学的活性物質として
抗体Fab′フラグメントは、分子中にチオール基
を有していることが必須である。分子中にチオー
ル基がない場合でもＳ−アセチルメルカプトコハ
ク酸無水物などを用いて免疫化学的活性物質にチ
オール基を導入したものでもよい。分子中にジス
ルフイド結合を有する場合は、２−メルカプトエ
チルアミンなどの還元剤を用いてチオール基を生
成させたものでもよい。

本発明における免疫化学的活性物質としては、
具体的には、例えば免疫グロブリン、アルブミ
ン、フイブリノーゲン（フイブリンおよびそれら
の分解産物）、α−フエトプロテイン、Ｃ反応性
タンパク、β₂−ミクログロブリン、ミオグロブリ
ン、ガン胎児性抗原、肝炎ウイルス抗原、ヒト絨
毛性ゴナドトロピン（以下、hCGと略称する）、
ヒト胎盤性ラクトーゲン、インスリンなどのタン
パク、ホルモン、投与薬剤などの抗体などが挙げ
られる。

ペルオキシダーゼとしては、種々の起源のもの
を用いることができるが、その例としてはたとえ
ば西洋わさび、パイナツプル、イチジク、甘藷、
ソラマメおよびトウモロコシなどから得られるペ
ルオキシダーゼが挙げられ、特に西洋わさびから
抽出されたホースラデイツシユ パーオキシダー
ゼ（horseradish peroxidase）が好ましい。

本発明の方法において用いられる化合物（）
は、たとえばザ・ジヤーナル・オブ・バイオケミ
ストリー（The Journal of Biochemistry）第
79巻233頁（1976年）、ヨーロピアン・ジヤーナ
ル・オブ・バイオケミストリー（European
Journal of Biochemistry）第101巻395頁（1979
年）、特開昭52−85163号公報、特開昭52−85164
号公報等に記載の方法あるいはこれらの方法に準
じて製造することができる。たとえば、一般式 〔式中、Ｘは水酸基またはハロゲン原子を示す。
ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わさ
れるマレイミド化合物（）と一般式 〔式中、Ｙは水素原子またはアルカリ金属原子を
示す。〕で表わされるサクシンイミド化合物（）
とを脱水剤あるいは脱酸剤の存在下で反応させる
ことにより製造することができる。上記一般式に
おいて、ハロゲン原子としては塩素、臭素などが
挙げられ、アルカリ金属原子としてはたとえばナ
トリウム、カリウムなどが挙げられる。また反応
に用いられる脱水剤としてはたとえば、硫酸、ジ
シクロヘキシルカルボジイミドなどが、脱酸剤と
してはたとえばピリジン、トリエチルアミンなど
が挙げられる。

前記化合物（）は、たとえば特開昭52−
85164号公報に記載の方法あるいはこれに準じて
製造することができる。たとえば一般式 （式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。） で表わされる化合物（）を脱水閉環せしめるこ
とにより得られる。該脱水閉環させるには、脱水
剤たとえば無水酢酸又は無水酢酸と酢酸ナトリウ
ム（無水物）を用い、温和に加熱することにより
反応させることができる。

さらに別法として、ヘルベテイカ・キミカ・ア
クタ（Helvetica Chimica Acta）第58巻（1975
年）531頁に記載されている方法あるいはこれに
準じて製造することができる。

たとえば、一般式 （Ｚはアルキル基を示す）で表わされるＮ−アル
コキシカルボニルマレイミドと、一般式 NH₂（CH₂）_oRCOOH （） 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕 で表わされるアミノ酸とを反応させて、一般式 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕 で表わされるマレイミド化合物を得る。次に一般
式（）で表わされるサクシンイミド化合物を加
え先に述べたと同様の脱水剤もしくは脱水剤の存
在下で反応させることにより製造することができ
る。

上記一般式（）で表わされる化合物において
Ｚで表わされるアルキルとしては、メチル、エチ
ルが挙げられる。

ペルオキシダーゼに化合物（）を反応させる
には、両者をPH約６ないし８の緩衝液中で約10な
いし50℃の温度で約10分ないし24時間反応させる
ことによつて行なわれる。該緩衝液としては、た
とえばPH7.0の0.1Mリン酸緩衝液、PH6.3の0.05M
リン酸緩衝液などが挙げられる。

このようにして化合物（）が得られる。得ら
れた化合物（）の精製は、たとえばゲルクロマ
トグラフイーなどにより行なうことができる。該
ゲルクロマトグラフイーを行なう際に用いられる
担体としてはたとえばセフアデツクスＧ−25〔フ
アルマシア・フアインケミカル社（スエーデン）
製〕、バイオゲルＰ−２〔バイオ・ラツド・ラボラ
トリーズ社（米国）製〕などが挙げられる。

化合物（）に免疫化学的活性物質を反応させ
るには、両者を緩衝液中で約０℃ないし40℃の温
度で、約１ないし48時間反応させることにより行
なうことができる。該緩衝液としては、たとえば
PH6.0の５ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナトリウ
ム塩を含む0.1Mリン酸緩衝液などが挙げられる。

このようにして得られた化合物（）は、たと
えばゲルクロマトグラフイーなどにより精製する
ことができる。該ゲルクロマトグラフイーに用い
られる担体としては、たとえばウルトロゲル
AcA44〔LKB社（スエーデン）製〕、セフアクリ
ルＳ−200〔フアルマシア・フアインケミカル社
（スエーデン）製〕などが挙げられる。

本発明の複合体（）を用いて免疫化学的測定
を行なう際の被測定物質としては、臨床診断に利
用できる物質が挙げられ、例えば体液中に含まれ
るヒトイムノグロブリンＧ、ヒトイムノグロブリ
ンＭ、ヒトイムノグロブリンＡ、ヒトイムノグロ
ブリンＥ、ヒトアルブミン、ヒトフイブリノーゲ
ン（フイブリンおよびそれらの分解産物）、α−
フエトプロテイン、Ｃ反応性タンパク、β₂−ミク
ログロブリン、ミオグロビン、ガン胎児性抗原、
肝炎ウイルス抗原、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、
ヒト胎盤性ラクトーゲン、インスリンなどのタン
パク、ホルモン、投与薬剤などが挙げられる。

本発明の複合体（）は、免疫化学的分析法に
おける試薬として用いることができる。

たとえば、複合体（）において、Ａが抗体の
残基であるものは、サンドイツチ法による酵素免
疫測定法に用いることができる。

本発明の複合体（）を含むEIA用試薬の例と
して、サンドイツチ法によるキツトを以下に挙げ
る。

(1) 担体上に保持された抗体 (2) 本発明方法により得られたペルオキシダーゼ
で標識化された抗体フラグメント（Fab′）。

(3) 被測定物質の標準品 (4) 上記(2)〜(3)の試薬および被検試料の希釈に用
いる緩衝液（該試薬および該被検試料の希釈に
用いることができる緩衝剤であればいずれでも
よいが、その一例としてはPH６〜９のリン酸緩
衝液またはグリシン緩衝液が挙げられる）。

(5) インキユベーシヨン後、担体の洗浄に用いる
緩衝液（該担体の洗浄に用いることができる緩
衝液であればいずれでもよいが、その一例とし
てはリン酸緩衝液またはグリシン緩衝液が挙げ
られる。） (6) ペルオキシダーゼ活性測定に必要な試薬。そ
の一例として螢光法の場合、酵素基質としてＰ
−ハイドロキシフエニル酢酸と過酸化水素、比
色法の場合、ｏ−フエニレンジアミンと過酸化
水素。酵素基質の溶解に用いる緩衝液（好まし
くはリン酸緩衝液）および酵素反応停止液が挙
げられる。

上記のキツトは例えば下記の方法により使用す
ることができる。

被測定物質の標準品もしくは被検液約10〜
200μに試薬(4)を加えて希釈し、一定量の試薬
(1)、次いで試薬(2)を10〜300μを加えたのち、
約０〜40℃で反応させる。約１〜24時間反応後、
試薬(5)で洗浄し担体上に結合しているペルオキシ
ダーゼの活性を測定する。即ち、基質液約10〜
1000μを加えて約20〜40℃で約0.2〜24時間反応
させたのち、酵素反応を停止させ、反応液中の吸
光度もしくは螢光強度を測定する。

本発明の免疫化学的分析法用試薬を用いれば、
通常の検査室において簡単な操作で高感度測定が
可能となる。とくにEIAが臨床診断法として極め
て有用であるが、この他に免疫組織化学の領域に
おいても本発明の酵素複合体は組織への非特異的
な反応が少ないところから極めて効果的である。

本発明方法において用いられる結合用試薬は、
サクシンイミド基とマレイミド基とを有してお
り、ペルオキシダーゼに存在するアミノ基と反応
して酵素にマレイミド基を導入し、さらに免疫化
学的活性物質例えば免疫グロブリンフラグメント
（Fab′）に存在するチオール基と反応して、酵素
と免疫化学的活性物質との複合体を容易に調製す
ることができる。本発明の複合体（）の製造方
法によると収率は約70％以上と極めて優れてお
り、しかも複合体の重合物はほとんど認められ
ず、前述のグルタルアルデヒド架橋法や過ヨウ素
酸架橋法と比べて極めて高性能の酵素複合体を得
ることができる。本発明の酵素複合体を非競合法
によるEIAに供した場合、前述の二法で得られた
酵素複合体による結果と比べて測定感度は約10倍
以上向上する。さらに、本発明の複合体における
高濃度の酵素複合体を用いても固相への非特異的
吸着は大きくならないので測定に要する時間を短
縮することができる。

上記の如く、本発明による酵素複合体を用いる
ことにより非特異的吸着が小さくなり、したがつ
て測定感度が向上した原因は、ペルオキシダーゼ
１分子にほぼ１分子の免疫化学的活性物質が結合
し、また複合体の重合体の生成が極めて少なく、
調整した複合体が非常に均一であることに基因す
ると考えられる。

以下に参考例および実施例を挙げて本発明をさ
らに具体的に説明する。

参考例 １ 過ヨウ素酸架橋法 仲根らの方法〔ザ・ジヤーナル・オブ・ヒスト
ケミストリー・アンド・サイトケミストリー
（The Journal of Histochemistry and
Cytochemistry）第22巻（1974年）第1084頁〕に
従つて行なつた。７mgの西洋わさびペルオキシダ
ーゼを１mlの0.3M重炭酸ナトリウム溶液（PH
8.1）にとかし、0.1mlの１％１−フルオロ−２，
４−ジニトロベンゼンを加えて室温で１時間反応
させた。次に0.06M NaIO₄1mlを加えて室温で30
分間撹拌したのち、0.16Mエチレングリコール水
溶液１mlを加えて室温で１時間放置した。0.01M
炭酸ナトリウム緩衝液（PH9.5｝に対して１夜透
析した。

加藤らの方法〔ザ・ジヤーナル・オブ・イムノ
ロジー（The Journal of Immunology）第116
巻（1976年）1554頁〕により得られたウサギ抗ヤ
ギIgG（Fab′フラグメント）５mgを24ｍＭエチル
マレイミドの0.1Mリン酸緩衝液（PH6.0）に加え
てチオール基をブロツクし（室温、30分間）、セ
フアデツクスＧ−150のカラムを用いるゲルクロ
マトグラフイーで精製しコロジオン膜法で濃縮し
たのち、先に調製したアルデヒドペルオキシダー
ゼと混合して室温で３時間反応させてから、５mg
のNaHB₄を加えて４℃で１夜反応させた。
0.15M NaClを含む0.01Mリン酸緩衝液（PH7.1）
に対して４℃で１夜透析した後、ウルトロゲル
AcA44〔LKB社（スエーデン）製〕を充てんした
カラム（1.5×45cm）を用いれゲルクロマトグラ
フイーにかけ、0.1Mリン酸緩衝液（PH6.5）で溶
出させた。溶出液の280および403nｍの吸光度な
らびに酵素活性を測定した。溶出液の酵素活性は
溶出フラクシヨンを0.1％ウシ血清アルブミンを
含む0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）で500倍に希釈
したのち、この10μについてギルバルト
（Guilbalt）らの方法〔アナリテイカル・ケミス
トリー（Analytical Chemistry）第40巻（1968
年）1256頁〕に従つて測定した。即ち希釈された
溶出液10μに0.1％ウシ血清アルブミンを含む
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）に溶解した0.5％ｐ−
ハイドロキシフエニル酢酸0.25mlを加えて混合
し、30℃で５分間インキユベートした。次に0.01
％過酸化水素0.05mlを加えて30℃で20分反応させ
た。0.1Mグリシン緩衝液（PH10.3）2.5mlを加え
て酵素反応を停止させ、1μｇ／mlのキニンの螢
光強度を100として励起光320nｍにおける405nｍ
の螢光強度を測定した。結果を第１図に示す。第
１図において、―○―は280nｍにおける吸光度
を、―□―は403nｍにおける吸光度を、―●―は
ペルオキシダーゼ活性（螢光強度として）をそれ
ぞれ示す。

実施例 １ (1) マレイミド基の導入 ６mgの西洋わさびペルオキシダーゼ〔ベーリ
ンガ マンハイム社（西ドイツ）製〕を１mlの
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）に溶解し、50μ
のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドにとかした結
合試薬MMC（一般式（）において、ｎ＝１、
Ｒ＝シクロヘキシレンである化合物）4.8mgを
加えて30℃で60分間撹拌しながら反応させた。
生成した沈殿を遠心分離して除去し、上清をセ
フアデツクスＧ−25のカラム（1.0×45cm）に
通し、0.1Mリン酸緩衝液で溶出させた。タン
パクを含む画分を分取し、コロジオン膜を用い
て濃縮した。このようにして調製したマレイミ
ド化ペルオキシダーゼにおいてペルオキシダー
ゼ１分子あたり導入されたマレイミド基の数は
1.0〜1.2個であつた（ペルオキシダーゼの分子
量を40000、Ｅ280nm １％＝22.75として計算）。

(2) マレイミド化ペルオキシダーゼとウサギ抗ヤ
ギIgGFab′フラグメントとの結合 ウサギ抗ヤギIgG血清〔マイルズ・ラボラト
リーズ社（米国）製〕から、加藤らの方法
〔ザ・ジヤーナル・オブ・イムノロジー（The
Journal of Immunology）第116巻（1976年）
1554頁〕に準じてFab′フラグメントを調製し
た。即ち、ウサギ抗ヤギIgG血清を硫酸ナトリ
ウム法で塩析し、DEAE−セルロースのカラム
クロマトグラフイーでIgGフラクシヨンとした
のち、ペプシン消化してＦ（ab′）₂とし、さらに
２−メルカプトエチルアミンで還元し、セフア
デツクスＧ−25のカラムによるゲルクロマトグ
ラフイーで精製してウサギ抗ヤギIgGFab′フラ
グメントを得た。

実施例１−(1)で調製したマレイミド化ペルオ
キシダーゼ1.5mgを0.1Mリン酸緩衝液（PH6.0）
0.15mlに溶解し、先に得たウサギ抗ヤギ
IgGFab′フラグメント1.7mgをとかした５ｍＭ
エチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩を含む
0.1Mリン酸緩衝液（PH6.0）0.15mlを加えて４
℃で20時間反応させた。反応後、ウルトロゲル
AcA44を充てんしたカラム（1.5×45cm）を用
いるゲルクロマトグラフイーにかけ、0.1Mリ
ン酸緩衝液（PH6.5）で溶出させた。溶出液の
280および403nｍの吸光度ならびに酵素活性を
測定した。ペルオキシダーゼとウサギ抗ヤギ
IgGFab′フラグメントの複合体が生成している
ことを、以下の方法で確認した。

まず、酵素活性の測定はギルバルトらの方法
〔アナリテイカル・ケミストリー（Analytical
Chemistry）、第40巻（1968年）、1256頁〕で行
なつた。即ち、溶出液の各フラクシヨンを0.1
％ウシ血清アルブミンを含む0.1Mリン酸緩衝
液（PH7.0）で1800倍に希釈した。この10μに
0.1％ウシ血清アルブミンを含む0.05M酢酸ナ
トリウム緩衝液（PH5.0）に溶解した0.5％ｐ−
ハイドロキシフエニル酢酸0.25mlを加えて混合
し30℃で５分間インキユベートした。次に0.01
％過酸化水素0.05mlを加えて30℃で20分反応さ
せた。0.1Mグリシン緩衝液（PH10.3）2.5mlを
加えて酵素反応を停止させ、1μｇ／mlのキニ
ンの螢光強度を100とし励起光320nｍにおける
405nｍの螢光強度を測定した。結果を第２図
に示す。第２図において、―○―は280nｍにお
ける吸光度を、―□―は403nｍにおける吸光度
を、―●―はペルオキシダーゼ活性（螢光強度
として）をそれぞれ示す。

参考例１で得られた溶出パターン第１図と比
較すると、フラクシヨン２９前後で溶出する酵
素複合体の重合物は全く認められず、フラクシ
ヨン35前後のペルオキシダーゼとウサギ抗ヤギ
IgGFab′フラグメントとの複合体の生成が極め
て良好であることが分かつた。

(3) EIA EIA用の試薬として、次のものを用いた。

ヒトIgG感作シリコンゴム片 実施例１(2)で得られたペルオキシダーゼと
ウサギ抗ヤギIgGFab′フラグメントとの複合
体 標準ヤギ抗ヒトIgG 洗浄ならびに、の希釈に用いる0.1M
NaCl、１ｍＭ MgCl₂、0.1％ウシ血清アル
ブミン、0.002％メチルオレートを含むPH7.0
の0.01Mリン酸緩衝液 ペルオキシダーゼ活性測定に必要な試薬
0.5％ｐ−ハイドロキシフエニル酢酸を含む
PH5.0の酢酸緩衝液、0.01％過酸化水素水お
よび反応停止液（PH10.3の0.1Mグリシン緩
衝液） 抗体結合固相の調製：清浄なシリコンゴム片
（内径３mm、長さ４mm、富士高分子工業株式会社
製シリコンNo.３、SH型から作製）をヒト
IgG100μｇ／mlを含む0.25Mリン酸緩衝液（PH
7.5）に室温で30分浸漬したあと４℃で１夜放置
した。0.25Mリン酸緩衝液（PH7.5）および緩衝
液Ａ〔0.1M NaCl、１ｍＭ MgCl₂、0.1％ウシ血
清アルブミン、0.002％メルチオレートを含む
0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）〕で洗浄し、緩衝液
Ａ中に冷所保存した。

測定：緩衝液A0.15ml中でヤギ抗ヒトIgG（IgG
フラクシヨン）〔マイルズ・ラボラトリーズ社
（米国）製〕と、先に調製したヒトIgG感作シリ
コンゴム片とを37℃で６時間、続いて４℃で１夜
反応させた。シリコンゴム片を緩衝液Ａで２回洗
浄後、実施例１(2)で調製したペルオキシダーゼ−
ウサギ抗ヤギIgG（Fab′フラグメント）複合体溶
液（第２図、フラクシヨン37〜39を分取し緩衝液
Ａで希釈したもの、560nｇ／ml）（第３図中、―
○―で示す。）0.15mlを加えて37℃で６時間反応さ
せたのち、シリコンゴム片を緩衝液Ａで２回洗浄
し、固相に結合した酵素活性を実施例１(2)に示し
たギルバルトらの方法に従い測定した。結果を参
考例１で得られた過ヨウ素酸架橋法によるペルオ
キシダーゼ−ウサギ抗ヤギIgG（Fab′フラグメン
ト）複合体溶液〔第１図、重合体混入の少ない画
分としてフラクシヨン37−39を分取し緩衝液Ａで
希釈したもの（1020nｇ／ml）（第３図中、―●―
で示す。）、重合体混入の大きな画分としてフラク
シヨン28〜30を分取し緩衝液Ａで希釈したもの
（800nｇ／ml）第３図中、―□―で示す。）。〕を用
いて同一のアツセイ操作での測定で得られた結果
と比較した（それぞれの複合体溶液の酵素活性は
同一である）。第３図に示したように、本発明の
実施例１(2)で得られた酵素複合体を用いたシステ
ムでは他と比べて固相への非特異的吸着が最小で
約10倍の高感度であつた。

実施例 ２ ヒトIgGの測定 (1) ペルオキシダーゼとウサギ抗ヒトIgG
（Fab′フラグメント）との複合体 実施例１(1)で得たマレイミド化ペルオキシダ
ーゼ1.5mgとウサギ抗ヒトIgG血清〔マイルズ・
ラボラトリーズ社（米国）製〕から実施例１(2)
と同様の方法で得たウサギ抗ヒトIgG（Fab′フ
ラグメント）1.7mgとを実施例１(2)と同様の方
法で結合させ、ペルオキシダーゼ−ウサギ抗ヤ
ギIgG（Fab′フラグメント）複合体を得た。

(2) EIA EIA用の試薬として、次のものを用いた。

ウサギ抗ヒトIgG（IgGフラクシヨン）感作
シリコンゴム片 実施例２(1)で得られたペルオキシダーゼと
ウサギ抗ヒトIgGFab′フラグメントとの複合
体 標準ヒトIgG 洗浄ならびに、に希釈に用いる0.1M
NaCl、１ｍＭ MgCl₂、0.1％ウシ血清アル
ブミン、0.002％メルチオレートを含むPH7.0
の0.01Mリン酸緩衝液 ペルオキシダーゼ活性測定に必要な試薬
0.5％ｐ−ハイドロキシフエニル酢酸を含む
PH5.0の酢酸緩衝液、0.01％過酸化水素水お
よび反応停止液（PH10.3の0.1Mグリシン緩
衝液） 抗体結合固相の調製：清浄なシリコンゴム片
（内径３mm、長さ４mm、富士高分子工業株式会社
製シリコンNo.３、SH型から作成）をウサギ抗ヒ
トIgG（IgGフラクシヨン）100μｇ／mlを含む
0.25Mリン酸緩衝液（PH7.5）に室温で30分浸漬
したあと４℃で１夜放置した。0.25Mリン酸緩衝
液（PH7.5）および緩衝液Ａで洗浄し、緩衝液Ａ
中に冷所保存した。

測定：緩衝液A0.15ml中でヒトIgG〔マイルズ・
ラボラトリーズ社（米国）製〕と先に調製したウ
サギ抗ヒトIgG感作シリコンゴム片とを37℃で６
時間、続いて４℃で１夜反応させた。シリコンゴ
ム片を緩衝液Ａで２回洗浄後、実施例２(1)で調製
したペルオキシダーゼ−ウサギ抗ヒトIgG
（Fab′フラグメント）複合体溶液0.15mlを加えて
37℃で６時間反応させたのち、シリコンゴム片を
緩衝液Ａで２回洗浄し、固相に結合した酵素活性
を実施例１(2)に示したギルバルトらの方法に従い
測定した。結果を第４図に示す。第４図において
は、―○―はMMCで結合させた複合体を使用し
た場合の結果を、―●―および―■―は参考例１
（過ヨウ素酸架橋法）と同様の方法で架橋させ、
ゲルクロマトグラフイーを行なつて得られた重合
体混入の極小な画分および重合体が比較的混入し
ている画分をそれぞれ使用した場合の結果をそれ
ぞれ表わす。第４図から明らかなごとく、本発明
の複合体を用いた場合の方が、固相への非特異的
吸着は極めて小さく、過ヨウ素酸架橋法によるペ
ルオキシダーゼ−ウサギ抗ヒトIgG（Fab′フラグ
メント）複合体を用いた場合と比べて10〜20倍の
高感度を与えた。

実施例 ３ hCGの測定 (1) 抗体の製造 人尿より公知の方法で精製した約10000IU／
mgのhCG1mgを生理食塩水１mlに溶解し、これ
にフロインドの完全アジユバント〔Freund′s
complete adjuvant、免疫の生化学、橘ら著、
共立出版株式会社（1967年）〕１mlを加えてよ
く混和し乳剤を作り、これをウサギの両大腿部
筋肉内および背部皮下数箇所に注射する。以上
の操作を３週毎に５回行ない最終免疫後１週間
で採血し、抗hCG血清を得た。

hCG5mgを0.5M NaClを含む0.1M
NaHCO₃8mlに溶解し、予めＮ／1000HClで洗
浄したブロムシアン活性化セフアロース4B（フ
アルマシア・フアイン・ケミカルズ社製）１ｇ
に加え、５℃で一夜撹拌した。反応終了後同じ
0.5M NaClを含む0.1M NaHCO₃で十分に洗
浄し、次いでHClでPH８に調整した0.5Mエタ
ノールアミン10mlを添加して室温で１時間反応
させた後、(1)1M NaClを含む0.1M酢酸緩衝液
（PH4.0）、(2)1M NaClを含む0.1Mホウ酸緩衝液
（PH8.0）および(3)0.15M NaClを含み0.02Mホ
ウ酸緩衝液（PH8.0）で順次洗浄しカラムに充
填した。

先に得られた抗hCG血清８mlを1.5ｇの無水
硫酸ナトリウムを用いて塩析沈殿させ、得られ
たγ−グロブリン画分を上記のhCG結合セフア
ロース4Bカラム（0.9×４cm）に付した。

0.15M NaClを含む0.02Mホウ酸緩衝液（PH
8.0）でカラムを洗浄し、次いで0.17Mグリシ
ン−塩酸緩衝液（PH2.3）で溶出することによ
つてウサギ抗hCG抗体を得た。

(2) ペルオキシダーゼとウサギ抗hCG（Fab′フラ
グメント）の複合体 実施例１(1)で得たマレイミド化ペルオキシダ
ーゼ1.5mgと、実施例３(1)で調製したウサギ抗
hCG抗体を実施例１(2)の方法に従つて得たウサ
ギ抗hCG（Fab′フラグメント）1.8mgとを実施例
１(2)に示した方法で結合させペルオキシダーゼ
−ウサギ抗hCG（Fab′フラグメント）複合体を
得た。

(3) EIA EAI用の試薬として、次のものを用いた。

抗hCG抗体感作ポリスチレンボール 実施例３(2)で得られたペルオキシダーゼと
ウサギ抗hCGFab′フラグメントとの複合体 標準hCG 洗浄ならびに、の希釈に用いる緩衝液
Ａ ペルオキシダーゼ活性測定に必要な試薬
0.02％過酸化水素と0.15％ｏ−フエニレンジ
アミンを含むPH4.8の0.1Mクエン酸−リン酸
二ナトリウム緩衝液および反応停止液（1N
−塩酸） 抗体結合固相の調製：ポリスチレンボール、直
径6.4mm、プレシジヨン・プラステイツクス・ボ
ール社〔Precision Plastics Ball Co.（米国）製〕
300個に実施例３(1)で調製した抗hCG抗体2.5mgを
0.01Mリン酸緩衝液（PH7.7）50mlに溶解した液
を加えて室温で１時間浸漬したあと４℃で１夜放
置した。0.1％ウシ血清アルブミンを含む0.05M
リン酸緩衝液（PH7.0）で洗浄したのち、用時ま
で冷所保存した。

測定：緩衝液Ａ中でhCGと先に調製したウサギ
抗hCG感作ポリスチレンボールとを室温で１夜反
応させた。ポリスチレンボールを緩衝液Ａで洗浄
後、実施例３(2)で調製したペルオキシダーゼ−ウ
サギ抗hCG（Fab′フラグメント）複合体溶液0.15
mlを加えて37℃で６時間反応させたのち、ポリス
チレンボールを緩衝液Ａで洗浄し、これに0.02％
過酸化水素と0.15％ｏ−フエニレンジアミンを含
む0.1Mクエン酸−リン酸ニナトリウム緩衝液
（PH4.8）0.5mlを加えて30℃で１時間反応させた
のち、1N塩酸２mlを添加して反応を停止させ、
492nｍにおける吸光度を測定し標準曲線を得た。
結果を第５図に示したが固相への非特異的吸着は
極めて小さく、高感度測定ができた。

【図面の簡単な説明】

第１図は参考例１で得られたペルオキシダーゼ
とウサギ抗ヤギIgGFab′フラグメントとの反応生
成物のゲルクロマトグラフイーにおける溶出パタ
ーンを、第２図は実施例１で得られたペルオキシ
ダーゼとウサギ抗ヤギIgGFab′フラグメントとの
反応生成物のゲルクロマトグラフイーにおける溶
出パターンを、第３図は実施例１もしくは参考例
１で得られたペルオキシダーゼとウサギ抗ヤギ
IgGFab′フラグメントとの複合体を用いて得られ
たヤギ抗ヒトIgGの標準曲線を、第４図は実施例
２もしくは過ヨウ素酸架橋法によるペルオキシダ
ーゼとウサギ抗ヒトIgGFab′フラグメントとの複
合体を用いて得られたヒトIgGの標準曲線を、第
５図は実施例３で得られたペルオキシダーゼとウ
サジ抗hCGFab′フラグメントとの複合体を用い
て得られたhCGの標準曲線をそれぞれ表わす。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式 ［式中、Ａは免疫化学的活性物質としての抗体
   Fab′フラグメント（Ａ−SH）の残基を、Ｂはペ
   ルオキシダーゼ（Ｂ−NH₂）の残基を、ｎは０
   ないし５の整数を、Ｒは化学結合またはシクロヘ
   キシレンをそれぞれ示す。］で表わされるペルオ
   キシダーゼと免疫化学的活性物質との複合体。 ２ ペルオキシダーゼ（Ｂ−NH₂）に一般式 ［式中、ｎは０ないし５の整数を、Ｒは化学結合
   またはシクロヘキシレンをぞれぞれ示す。］で表
   わされる化合物を反応させ一般式 ［式中、Ｂはペルオキシダーゼの残基を表わす。
   ｎおよびＲは前記と同意義を有する。］で表わさ
   れる化合物を得、ついでこれに免疫化学的活性物
   質としての抗体Fab′フラグメント（Ａ−SH）を
   反応させることを特徴とする一般式 ［式中、Ａは免疫化学的活性物質としての抗体
   Fab′フラグメントの残基を示す。Ｂ、ｎおよび
   Ｒは前記と同意義を有する］で表わされるペルオ
   キシダーゼと免疫化学的活性物質との複合体の製
   造法。 ３ 一般式 ［式中、Ａは免疫化学的活性物質としての抗体
   Fab′フラグメント（Ａ−SH）の残基を、Ｂはペ
   ルオキシダーゼ（Ｂ−NH₂）の残基を、ｎは０
   ないし５の整数を、Ｒは化学結合またはシクロヘ
   キシレンをそれぞれ示す。］で表わされるペルオ
   キシダーゼと免疫化学的活性物質との複合体を含
   有する免疫化学的測定試薬。