JPH0746106B2

JPH0746106B2 - 免疫測定方法

Info

Publication number: JPH0746106B2
Application number: JP63184669A
Authority: JP
Inventors: 貴明窪田; 仁美本田; 健治細田
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1988-07-26
Filing date: 1988-07-26
Publication date: 1995-05-17
Anticipated expiration: 2010-05-17
Also published as: JPH0236353A

Description

【発明の詳細な説明】（イ）産業上の利用分野本発明は、抗原−抗体反応を利用して免疫学的に物質の
量を測定するに際し、被検液中の測定目的物質以外の成
分による血清干渉（以下血清干渉と記す）を排除し、被
検液中の測定目的物質を正確に測定する新規な免疫測定
方法に関するものである。

（ロ）従来の技術抗原と抗体の特異的な反応を利用した免疫測定方法は、
特異性が高く又測定感度が非常に高いことから広く用い
られている方法であり、1975年モノクローナル抗体の発
見とともに、ますます発展が期待される。この免疫測定
方法の検出手段が放射性物質であるラジオイムノアッセ
イ（RIA）（Yalowら、Nature.184,P1648〜1649,1959）
は、その特異的選択性と共に、特に高感度の測定が可能
となることから、血清，尿，組織液等の生体試料中の微
量物質の測定に利用されてきた。

その後、酵素を検出手段として用いる酵素免疫測定法
（Immuno chemistry 8:871〜874,1971）や、螢光物質を
用いる方法が開発され、特にEIAは、放射性物質に比
べ酵素が長期保存時の安定性，経済性に優れているこ
と、測定方法が簡便且つ汎用性を有し、且つRIAと同
等の測定感度であること等の利点を有しているため、近
年急速に普及している。

EIAのなかでも競合法，サンドイッチ法（酵素免疫測定
法、第２版医学書院1982P30〜49），同時サンドイッ
チ法等が広く用いられ、いずれも、既知濃度の標準物質
を用いて得られる標準曲線に基いて被検液中に含まれる
測定対象物質（抗原）の量が測定されている。

さて、これらの免疫測定法を構成する場合、標準物質と
しては体液等から抽出や分離操作によって精製したもの
を使用する場合が多いのに対し、一方被検液としては血
清や血漿等がよく用いられる。被検液中には測定対象物
質以外の成分が含まれており、その物質が測定時の免疫
反応に影響し、いわゆる血清干渉と呼ばれる現象を起こ
す。そのため標準物質と被検液との間に免疫反応に差異
を生じて、正確な測定値が得られないことが多い。

したがって、この血清干渉を極力低く抑えることが正確
な免疫測定法を完成するための重要な技術的ポイントで
ある。それゆえに、従来から種々の試みが行われてい
る。

その手段として最も広く行われているのは、測定用緩
衝液に血清干渉を抑制する添加剤を加えることである。
例えば、特開昭56−42142号公報はゼラチン分解物又は
ゼラチン分解物と塩類を共存させて添加する方法、特開
昭60−53846号公報は、0.001〜0.1％の非イオン性また
は陰イオン性界面活性剤を添加する方法、また特開昭55
−152458号公報は、疎水性蛋白と塩類を添加する方法に
ついて各々記載している。そのほか、免疫反応時に用い
る緩衝液の塩濃度を高めてヒト成長ホルモンの測定系に
おける血清干渉を抑制した例が知られている（Nashida
S.ら,Clin−Chim−Acta,1983 Dec.30.135（３）.P263−
73）。

その他の手段としては、被検液の希釈倍率を高くして
測定系に添加する被検液の量を少なくすることにより血
清干渉を抑える方法等が行われている。

（ハ）発明が解決しようとする課題しかしながら、今まで述べてきた従来の方法も経験的な
ものが多く、しかも、いずれも特定の測定系に限られる
もので広い範囲の血清干渉を排除できないという問題点
があった。

さらにの方法においては、添加する物質の購入ロット
間に品質の違いがあって血清干渉抑制効果にバラツキを
生じることが多かった。特に動物血清を用いる場合大き
なバラツキがみられ、再現性よく血清干渉を抑制できな
いという問題があった。

又、緩衝液の塩濃度を変える場合は濃度を上げて抑制効
果をもたせる場合が多いのであるが、塩濃度を上げると
特異的な反応も同時に抑制してしまうので測定感度が低
下するという問題があり好ましい方法ではなかった。

次に、の被検液の希釈倍率を高くして測定系に添加す
る方法は、希釈によって測定感度が低下するので、被検
液中の測定対象物が微量の場合には用いることができな
い等の問題点があった。

（ニ）課題を解決するための手段そこで本発明者らは、かかる状況に鑑みて血清干渉を抑
える物質や手法を詳細に検討し鋭意研究した結果、免疫
反応溶液に、分子量約1000〜26000のカゼイン分解物を
免疫反応溶液における最終濃度が所定の範囲となるよう
に添加することにより血清干渉を抑制することができ、
標準物質と被検液との免疫反応の差異をなくして正確な
測定値が得られ、高感度の免疫測定ができることを見出
し本発明に到達した。

すなわち本発明は、抗原−抗体反応を利用した免疫測定
を行うに際し、免疫反応溶液に分子量約1000〜26000の
カゼイン分解物を含有せしめることを特徴とする免疫測
定方法、更に詳しくは溶液中における抗原−抗体反応を
利用した免疫測定を行うに際し、免疫反応溶液に分子量
約1000〜26000のカゼイン分解物を含有せしめ、該カゼ
イン分解物の免疫反応溶液中における最終濃度を0.05〜
2.5重量％に調整することを特徴とする免疫測定方法で
ある。

本発明のカゼイン分解物のカゼインは哺乳動物の乳汁中
に多く含まれておりそれを精製して使用するが、一般的
には牛乳が多く用いられている。

かかるカゼインを分解する方法としては、例えばキモト
リプシン，パパイン，トリプシン，パンクレアチン等の
消化酵素による加水分解法，酸又はアルカリによる加水
分解法等を上げることができ、分子量約100〜50000のカ
ゼイン分解物が得られる。かかる消化酵素は、１種又は
２種以上を同時に用いることもできるが、２種以上を用
いる例として、例えばカゼインと豚の臓の切片及びパン
クレアチン粉を混合し約10日間消化してカゼイン分解物
を得る方法を用いることもできる（J.Mowared Mueller
らが、J.Bacteriol 67 P−271〜277（1954））。

カゼイン（分子量約75000〜375000）をそのまま使用し
た場合はほとんど血清干渉の抑制効果が認められなかっ
たのに対し、上記カゼイン分解物のうちでも分子量約10
00〜26000のものが特に血清干渉の抑制効果が優れてい
た。

すなわち本発明のカゼイン分解物は、分子量約1000〜26
000のものをいう。

このようなカゼイン分解物としては、特にカゼインのト
リプシンによる分解物が好ましく挙げられるが、なかで
も例えばNZcase（Humko Sheffeld Chemical社製）が挙
げられる。

本発明の血清干渉抑制効果の発現メカニズムは十分解明
されていないが、カゼイン分解物の分子量約1000〜2600
0のものを免疫反応時の反応溶液に加えることにより、
血清や血漿のあるなしにかかわらず免疫反応時の環境を
一定の状況にする効果があるものと推定される。

本発明においてはかかるカゼイン分解物を免疫反応溶液
に含有せしめるが、特に免疫反応溶液における最終濃度
が0.05〜2.5重量％になるように調整して用いるが好ま
しい。カゼイン分解物濃度0.03重量％から血清干渉の抑
制効果があらわれはじめるが、0.05重量％未満では血清
干渉を抑制する効果がまだ十分でなく、また2.5重量％
より高濃度では免疫反応溶液中に完全に溶解することが
できず、室温に放置した場合に沈澱を生じて懸濁状態と
なり、免疫反応にバラツキを生じるため、カゼイン分解
物の最終濃度を0.05〜2.5重量％の範囲を決めた。より
好ましくは0.1〜1.5重量％の範囲である。

かかるカゼイン分解物は、例えばEIAの場合であれば免
疫測定用の試薬キットの構成要素の一部とするか、ある
いは不溶化抗体，標識化抗体，アッセイ緩衝液および標
準物質等からなる試薬キットのいずれかに含有せしめる
こともできる。後者の場合には、なかでも標識化抗体又
はアッセイ緩衝液が好ましく、特にアッセイ緩衝液が好
ましい。そして、例えば溶液中における抗原−抗体反応
を利用した免疫測定を行う場合には、免疫反応溶液にお
ける最終濃度が所定の濃度になるように、例えばアッセ
イ緩衝液におけるかかるカゼイン分解物の濃度を調整す
る。あるいは、例えば成形多孔体等を用いた、いわゆる
ドライEIA（特表昭62−500121号公報参照）の場合であ
れば、被検液，標識抗体等からなる試薬キットのいずれ
かに、特に好ましくは免疫反応溶液における最終濃度が
所定の濃度になるように調整してかかるカゼイン分解物
を含有せしめることができる。

本発明の免疫測定方法は、ポリスチレン，ポリカーボネ
ート，ポリエステル，ポリオレフィン，酢酸セルロー
ス，ナイロン，グラスファイバー，ミネラルファイバー
等を材料とした、ビーズ，チューブ，プレート，ラテッ
クス，成形多孔体等の担体に抗体を不溶化した固定抗体
と、測定対象物を含む溶液とを反応させるELISA系、あ
るいはリポソーム等を使用して抗体を不溶化させ、抗原
−抗体反応及び補体の作用によってリポソームを破壊さ
せて、リポソームに内蔵している標識物の漏出量により
抗原量を測定する系等にも適用できる。

（ホ）発明の効果本発明のカゼイン分解物をその最終濃度が0.05〜2.5重
量％となるように抗原−抗体反応を利用した免疫測定系
に使用した場合、血清干渉を約1/20に抑制する効果が表
われ被検液中の抗原量を正確に測定することが可能とな
った。

すなわち本発明によるカゼインの分解物を例えば血清中
に存在するヒト・胎盤由来酸性グルタチオンＳ−トラン
スフェラーゼ（胎盤由来酸性GST）を測定する場合の緩
衝液に添加して使用すると高い特異性及び高い感度で容
易に測定することができるとともに、正確な測定値を得
る免疫測定法を提供することができる。かかる場合に抗
ヒト・胎盤由来酸性GST抗体としては、ポリクローナル
抗体あるいはモノクローナル抗体のいずれを用いること
もできる。かかるモノクローナル抗体は本出願人の先に
出願した再公表公報昭和62−803377号に記載されている
方法によって得ることができる。

以下具体的に実施例を用いて説明するが実施例によって
本発明が限定されるものではない。

実施例中の％は重量％を意味する。

実施例１ヒト・胎盤由来酸性GST測定系におけるNZcas
eによる血清干渉の抑制効果（１）ポリクローナル抗体固定化ビーズの調製ポリスチレン製ビーズ（直径6mm）をよく洗浄してか
ら、兎抗ヒト・胎盤由来酸性GST−ポリクローナル抗体
の20μg/mlの濃度を有する、0.01Mリン酸0.15M NaCl pH
7.4（PBS）溶液中に４℃の温度で１昼夜放置した後、PB
Sで洗浄し、１％牛血清アルブミン（BSA）を含むPBS溶
液中に４℃の温度で１昼夜放置してポストコーティング
処理を実施して、ポリクローナル抗体固定化ビーズを得
た。

（２）ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ標識モ
ノクローナル抗体の調製抗ヒト・胎盤由来酸性GSTモノクローナル抗体6A（再公
表公報昭和62−803377号に記載されている方法で得られ
た）の1.0mg/mlのPBS溶液にＮ−（ｍ−マレイミド安息
香酸）−Ｎ−サクシミドエステル（MBS）の10mg/mlのジ
メチルホルムアミド溶液50μを添加し、25℃の温度で
30分間反応させた。次いでセファデックスＧ−25を充填
したカラムを用いて、0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）でゲ
ル濾過を行い、マレイミド化モノクローナル抗体の未反
応MBSとを分離した。

一方、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（HRP）
の1.0mg/mlのPBS溶液に、Ｎ−サクシンイミジル−３−
（２−ピリジルチオ）プロピオネート（SPDP）の10mg/m
lの濃度のエタノール溶液を添加し、25℃の温度で30分
間反応させた。次いで、セファデックスＧ−25を充填し
たカラムを用い、0.1M酢酸緩衝液（pH4.5）でゲル濾過
して精製し、ピリジルジスルフィド化HRPを含有する画
分を採取し、これをコロジオンバック中において氷冷中
に約10倍濃縮した後、これに0.85％NaClと0.1Mジチオス
レイトールとを含有する0.1M酢酸緩衝液（pH4.5）1mlを
添加して、25℃の温度で30分間攪拌してHRP分子中に導
入しピリジルジスルフィド基を還元した。還元後、セフ
ァデックスＧ−25カラムにかけてゲル濾過し、チオール
化HRPと混合し、コロジオンバックを用いて氷冷下に4mg
/mlの蛋白質濃度まで濃縮し、４℃の温度で１昼夜放置
した。その後、ウルトロゲルAcA44（LKB社）を充填した
カラムでゲル濾過し、HRP標識モノクローナル抗体を得
た。

（３）ヒト・胎盤由来酸性GST欠損血清の作製（イ）抗ヒト・胎盤由来酸性GST抗体固定カラムの作
製アガロースゲルをCNBrで活性化したもの、例えばファル
マシア社のCNBr活性化Sepharose4Bに抗ヒト・胎盤由来
酸性GSTポリクローナル抗体をアミノ基を介して化学的
に結合させた。その場合ゲル1mlに対して５〜10mgの抗
体蛋白を、0.1M炭酸0.15MNaCl緩衝液（pH8.5）2mlに溶
解して加え、４℃の温度で16時間ゆっくり攪拌しながら
固定した。次いで、ガラスフィルターにてゲルと抗体溶
液を分離し、ゲルを0.1M酢酸,0.15M NaCl緩衝液（pH4.
0）及び0.1M炭酸,0.15M NaCl緩衝液（pH8.5）で交互に
３回洗浄して、固定しなかった抗体を除去した。その
後、CNBr活性化Sepharose4Bの残った活性部位を1Mエタ
ノールアミン（pH8.0）溶液5mlを加えて室温で２時間ゆ
っくり攪拌してブロックした。ブロック後再びガラスフ
ィルター上に移し、抗体固定後の洗浄方法と同一操作に
て洗浄した。次にアフィニティークロマトグラフィーに
使用するPBSにて２回洗浄した。

この様にして作製したゲルをカラムに充填した。

（ロ）アフィニティークロマトグラフィー抗ヒト・胎盤由来酸性GSTポリクローナル抗体を固定し
たSepharose4Bカラムを、PBSで平衡化した後、健常人血
清を２回通液して、ヒト・胎盤由来酸性GST欠損血清を
得た。

（４）本測定法における血清干渉抑制試験免疫測定用緩衝液（1.0％BSA,0.1％スキムミルクPBS）
でヒト・胎盤由来酸性GSTの0,12.5ng/ml溶液を作製し、
それぞれの100μと同上緩衝液で２倍に希釈したヒト
・胎盤由来酸性GST欠損血清を100μ及びHRP標識抗ヒ
ト・胎盤由来酸性GSTモノクローナル抗体6A（再公表公
報昭和62−803377号に記載されている方法で得られた）
を含有する同上緩衝液100μをガラス試験管に入れ、
「血清あり」の試料を得た。同様にしてヒト・胎盤由来
酸性GST欠損血清の代わりに同上緩衝液を用いて「血清
なし」の試料を得た。次に終濃度が０〜２％になるよう
調製したNZcaseを含む同上緩衝液100μを添加してよ
く混和した。これに、兎抗ヒト・胎盤由来酸性GSTポリ
クローナル抗体を固定したビーズ１個をそれぞれの試験
管に入れて、37℃の温度で２時間インキュベートした。
次に試験管内の溶液を吸引除去した後、生理食塩水2ml
で３回洗浄してから、3,3′,5,5′テトラメチルベンジ
ジン塩酸塩0.02％,H₂O₂ 2.5mMを含有する0.1Mリン酸−
クエン酸緩衝液（pH4.0）を0.4mlずつ各試験管に加え
て、37℃の温度で30分間インキュベートした後、反応停
止剤として、1N硫酸水溶液を1mlずつ加えて酵素反応を
停止させた。

次いで、この溶液を分光光度計を用いて、精製水を対照
として450nmにおける吸収強度を測定し、得られた結果
を第１図に示した。

第１図から、ヒト・胎盤由来酸性GST0,12.5ng/mlいずれ
の場合もNZcaseの添加量が０％のときには、「血清な
し」（○印，●印）と、「血清あり」（△印，▲印）の
吸光度に差異を生じているが、NZcaseの添加量が0.03％
から血清干渉抑制効果が現われはじめた。その程度は、
ヒト・胎盤由来酸性GST12.5ng/mlにおける「血清なし」
の吸光度（○印）を100％とした場合、「血清あり」の
場合の吸光度（△印）はNZcaseが０％時は血清干渉によ
って38％の吸光度差があるが、0.1％のNZcaseを添加す
るとその差は7.5％となる。更に0.5％のNZcaseを添加す
るとその差は3.3％となり正確な測定値が得られること
がわかった。

実施例２ヒト・胎盤由来酸性GSTの同時サンドイッチ
酵素免疫測定法兎抗ヒト・胎盤由来酸性GST−ポリクローナル抗体を固
定化したビーズ各１個と精製したヒト・胎盤由来酸性GS
T0,6.25,12.5,25,50ng/mlを含有する１％BSA,0.5％NZca
se,0.1％スキムミルク,PBS溶液200μと、HRP標識抗ヒ
ト・胎盤由来酸性GSTモノクローナル抗体6Aを含有する
１％BSA,0.5％NZcase,0.1％スキムミルクPBS溶液200μ
とをそれぞれのガラス試験管に添加して37℃の温度で
２時間インキュベートした。次に、試験管内の溶液を吸
引除去した後、生理食塩水2mlで３回洗浄してから、3,
3′,5,5′−テトラメチルベンジジン塩酸塩0.02％,H₂O₂
2.5mMを含有する0.1Mリン酸−クエン酸緩衝液（pH4.
0）を0.4mlずつ各試験管内に加え、37℃の温度で30分間
インキュベートした後、反応停止剤として1N硫酸水溶液
を1mlずつ加えて酵素反応を停止させた。次いでこの溶
液を分光光度計を用いて精製水を対照として450nmにお
ける吸収強度を測定し、これを標準物質濃度に対してプ
ロットすることにより濃度依存性のよい検量線を得た。
結果を第２図に示した。

実施例３臨床検体中のヒト・胎盤由来酸性GSTの測定健常人及び大腸癌患者血清を採取し、この血清各50μ
をガラス試験管に添加し１％BSA,0.5％NZcase,0.1％ス
キムミルク,PBS溶液150μ加えて希釈した後、これに
兎抗ヒト・胎盤由来酸性GST−ポリクローナル抗体を固
定化したビーズ１個と、HRP標識抗ヒト・胎盤由来酸性G
STモノクローナル抗体6Aを含有する１％BSA,0.5％NZcas
e,0.1％スキムミルク,PBS溶液200μとを、それぞれ試
験管に添加して37℃の濃度で２時間インキュベートし
た。次に、実施例２の検量線を作成するのと全く同じ操
作により、洗浄，酵素反応及び反応停止を行った後、分
光光度計を用いて、精製水を対照として450nmにおける
吸収強度を測定し、検量線より濃度を求めた。その結
果、健常人血清中のヒト・胎盤由来酸性GST濃度は12.8n
g/mlであり、大腸癌患者血清中のヒト・胎盤由来酸性GS
T濃度は51.0ng/mlであった。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒト・胎盤由来酸性GST測定系におけるNZcase
濃度と血清干渉抑制効果を示している。第１図中、○，
△印は各々ヒト・胎盤由来酸性GST12.5ng/mlで血清な
し，ありを示し、●，▲印は各々ヒト・胎盤由来酸性GS
T0ng/mlで血清なし，ありを示している。第２図はヒト・胎盤由来酸性GST測定系におけるヒト・
胎盤由来酸性GSTの検量線を示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献特開昭61−25062（ＪＰ，Ａ) 特開昭62−289766（ＪＰ，Ａ) 特開昭62−272156（ＪＰ，Ａ) 特開昭56−42142（ＪＰ，Ａ) 特開昭57−108666（ＪＰ，Ａ) 特開昭54−17115（ＪＰ，Ａ) 国際公開87／3377（ＷＯ，Ａ) Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，130 （１），Ｐ．129−135，（1983) Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ, 85（２），Ｐ．409−420，（1985)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】溶液中における抗原−抗体反応を利用した
免疫測定を行うに際し、免疫反応溶液に、分子量約1000
〜26000のカゼイン分解物を含有せしめ、該カゼイン分
解物の免疫反応溶液における最終濃度を0.05〜2.5重量
％に調整することを特徴とする免疫測定方法。
【請求項２】カゼイン分解物がカゼインの消化酵素によ
る分解物であることを特徴とする請求項１記載の免疫測
定方法。
【請求項３】測定対象がヒト・胎盤由来酸性グルタチオ
ンＳ−トランスフェラーゼである請求項１記載の免疫測
定方法。