JP6635985B2 - 免疫測定用試薬、免疫測定用キット及び免疫測定方法 - Google Patents
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Description
本発明は、免疫測定用試薬、免疫測定用キット及び免疫測定方法に関する。
近年、臨床検査や免疫学などの分野で、操作が簡単なことから免疫反応を利用した測定法が多用されている。そのうち、酵素免疫測定法や化学発光免疫測定法が高感度化の観点から多く用いられる。酵素免疫測定法では、一般的に、酵素標識された抗体が用いられている（非特許文献１）。
酵素で標識された抗体は特に低濃度では不安定なことが多く、保存中に劣化することが知られている。この問題を解決するため、いくつかの技術が知られている。例えば、マレイミドヒンジ法による標識化、クエン酸緩衝液の使用、標識抗体の凍結乾燥等の報告がなされている。その他、酵素標識された抗体が含まれる溶液中に、遊離した酵素を共存させる方法なども提案がなされている（特許文献１及び特許文献２）。
このように酵素標識された抗体の安定化には様々な工夫がなされてきたが、少なくとも１年以上の安定性が求められる市販試薬としての使用に耐えるだけの保存性を有するものは少ない。また、凍結乾燥すれば安定性は保持されるが、使用する際に操作が煩雑になるといった別の問題が生じ、更なる改良が望まれている。
酵素で標識された抗体は特に低濃度では不安定なことが多く、保存中に劣化することが知られている。この問題を解決するため、いくつかの技術が知られている。例えば、マレイミドヒンジ法による標識化、クエン酸緩衝液の使用、標識抗体の凍結乾燥等の報告がなされている。その他、酵素標識された抗体が含まれる溶液中に、遊離した酵素を共存させる方法なども提案がなされている（特許文献１及び特許文献２）。
このように酵素標識された抗体の安定化には様々な工夫がなされてきたが、少なくとも１年以上の安定性が求められる市販試薬としての使用に耐えるだけの保存性を有するものは少ない。また、凍結乾燥すれば安定性は保持されるが、使用する際に操作が煩雑になるといった別の問題が生じ、更なる改良が望まれている。
免疫化学的同定法 第３版、Ｊ．Ｃｌａｕｓｅｎ著、１９９３年発行
本発明の目的は、酵素で標識された物質（Ｆ）｛測定対象物質（Ｆ１）、測定対象物質の類似物質（Ｆ２）、及び測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）からなる群より選ばれる少なくとも１種の物質｝の保存安定性に優れた免疫測定用試薬、該免疫測定用試薬を含む免疫測定用キット及び該キットを使用する免疫測定方法を提供することにある。
本発明者は、上記目的を達成すべく鋭意検討した結果本発明に到達した。
即ち本発明は、物質（ＦＣ）及び親水性タンパク質（Ｄ）を含有する免疫測定用試薬（Ｘ）であって、物質（ＦＣ）が物質（Ｆ）が酵素（Ｃ）により標識されてなる物質であり、物質（Ｆ）が測定対象物質（Ｆ１）、測定対象物質の類似物質（Ｆ２）及び測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）からなる群より選ばれる少なくとも１種の物質であり、前記測定対象物質が癌胎児性抗原、前立腺特異抗原又は遊離チロキシンであり、親水性タンパク質（Ｄ）が２５℃、ｐＨ７．０の水１００ｇに２．０ｇ以上溶解するタンパク質であり、親水性タンパク質（Ｄ）が親水性カゼインタンパク質（Ｄ１）であり、免疫測定用試薬（Ｘ）中の親水性タンパク質（Ｄ）の含有量が（Ｘ）の重量を基準として２〜６重量％である免疫測定用試薬（Ｘ）；標識試薬（Ａ）及び固相担体試薬（Ｅ）を含む免疫測定用キットであって、標識試薬（Ａ）が請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫測定用試薬（Ｘ）であり、固相担体試薬（Ｅ）が固相担体（Ｂ）の表面に物質（Ｆ）が固定化された固相担体（ＢＦ）を含有するものである免疫測定用キット；該免疫測定用キットを使用する免疫測定方法でる。
即ち本発明は、物質（ＦＣ）及び親水性タンパク質（Ｄ）を含有する免疫測定用試薬（Ｘ）であって、物質（ＦＣ）が物質（Ｆ）が酵素（Ｃ）により標識されてなる物質であり、物質（Ｆ）が測定対象物質（Ｆ１）、測定対象物質の類似物質（Ｆ２）及び測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）からなる群より選ばれる少なくとも１種の物質であり、前記測定対象物質が癌胎児性抗原、前立腺特異抗原又は遊離チロキシンであり、親水性タンパク質（Ｄ）が２５℃、ｐＨ７．０の水１００ｇに２．０ｇ以上溶解するタンパク質であり、親水性タンパク質（Ｄ）が親水性カゼインタンパク質（Ｄ１）であり、免疫測定用試薬（Ｘ）中の親水性タンパク質（Ｄ）の含有量が（Ｘ）の重量を基準として２〜６重量％である免疫測定用試薬（Ｘ）；標識試薬（Ａ）及び固相担体試薬（Ｅ）を含む免疫測定用キットであって、標識試薬（Ａ）が請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫測定用試薬（Ｘ）であり、固相担体試薬（Ｅ）が固相担体（Ｂ）の表面に物質（Ｆ）が固定化された固相担体（ＢＦ）を含有するものである免疫測定用キット；該免疫測定用キットを使用する免疫測定方法でる。
本発明の免疫測定用試薬は、酵素で標識された物質の保存安定性が極めて優れている。
本発明の免疫測定用試薬（Ｘ）は、物質（ＦＣ）及び親水性タンパク質（Ｄ）を含有する免疫測定用試薬（Ｘ）であって、物質（ＦＣ）が物質（Ｆ）が酵素（Ｃ）により標識されてなる物質であり、物質（Ｆ）が測定対象物質（Ｆ１）、測定対象物質の類似物質（Ｆ２）及び測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）からなる群より選ばれる少なくとも１種の物質であり、親水性タンパク質（Ｄ）が２５℃、ｐＨ７．０の水１００ｇに２．０ｇ以上溶解するタンパク質であり、免疫測定用試薬（Ｘ）中の親水性タンパク質（Ｄ）の含有量が（Ｘ）の重量を基準として２〜６重量％である免疫測定用試薬である。
本発明における物質（ＦＣ）は、物質（Ｆ）が酵素（Ｃ）により標識されてなる物質である。物質（Ｆ）としては、測定対象物質（Ｆ１）、測定対象物質の類似物質（Ｆ２）及び測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）からなる群より選ばれる少なくとも１種の物質が含まれる。
本発明における測定対象物質（Ｆ１）は、例えば血清，血液，血漿，尿等の生体体液、リンパ液、血球、各種細胞類等の生体由来の試料中に含まれるタンパク質、脂質タンパク質、核酸、免疫グロブリン、血液凝固関連因子、抗体、酵素、ホルモン、癌マーカー、心疾患マーカー及び各種薬物等が代表的なものとして挙げられる。更に具体的には、例えばアルブミン，ヘモグロビン，ミオグロビン，トランスフェリン，プロテインＡ，Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）等のタンパク質、例えば高比重リポ蛋白質（ＨＤＬ），低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ），超低比重リポ蛋白質等の脂質蛋白質、例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ），リボ核酸（ＲＮＡ）等の核酸、例えばアルカリ性ホスファターゼ，アミラーゼ，酸性ホスファターゼ，γ−グルタミルトランスフェラーゼ（γ−ＧＴＰ），リパーゼ，クレアチンキナーゼ（ＣＫ），乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ），グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ），グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ），レニン，プロテインキナーゼ（ＰＫ），チロシンキナーゼ等の酵素、例えばＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ等の免疫グロブリン（或はこれらの、例えばＦｃ部，Ｆａｂ部，Ｆ（ａｂ）２部等の断片）、例えばフィブリノーゲン，フィブリン分解産物（ＦＤＰ），プロトロンビン，トロンビン等の血液凝固関連因子、例えば抗ストレプトリジンＯ抗体，抗ヒトＢ型肝炎ウイルス表面抗原抗体（ＨＢｓ抗原）、抗ヒトＣ型肝炎ウイルス抗体、抗リュウマチ因子等の抗体、例えば甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、甲状腺ホルモン［遊離トリヨードチロニン（ＦＴ３），遊離チロキシン（ＦＴ４），トリヨードチロニン（Ｔ３），チロキシン（Ｔ４）］、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）エストラジオール（Ｅ２）等のホルモン、例えばα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１９−９、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）等の癌マーカー、例えばトロポニンＴ（ＴｎＴ）、ヒト脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｎ端フラグメント（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）等の心疾患マーカー、例えば抗てんかん薬、抗生物質、テオフィリン等の薬物等が挙げられる。
上記したものの中でも、商業的ニーズの観点から、抗体、ホルモン、癌マーカー及び心疾患マーカーからなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましい。
本発明における測定対象物質（Ｆ１）は、例えば血清，血液，血漿，尿等の生体体液、リンパ液、血球、各種細胞類等の生体由来の試料中に含まれるタンパク質、脂質タンパク質、核酸、免疫グロブリン、血液凝固関連因子、抗体、酵素、ホルモン、癌マーカー、心疾患マーカー及び各種薬物等が代表的なものとして挙げられる。更に具体的には、例えばアルブミン，ヘモグロビン，ミオグロビン，トランスフェリン，プロテインＡ，Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）等のタンパク質、例えば高比重リポ蛋白質（ＨＤＬ），低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ），超低比重リポ蛋白質等の脂質蛋白質、例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ），リボ核酸（ＲＮＡ）等の核酸、例えばアルカリ性ホスファターゼ，アミラーゼ，酸性ホスファターゼ，γ−グルタミルトランスフェラーゼ（γ−ＧＴＰ），リパーゼ，クレアチンキナーゼ（ＣＫ），乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ），グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ），グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ），レニン，プロテインキナーゼ（ＰＫ），チロシンキナーゼ等の酵素、例えばＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ等の免疫グロブリン（或はこれらの、例えばＦｃ部，Ｆａｂ部，Ｆ（ａｂ）２部等の断片）、例えばフィブリノーゲン，フィブリン分解産物（ＦＤＰ），プロトロンビン，トロンビン等の血液凝固関連因子、例えば抗ストレプトリジンＯ抗体，抗ヒトＢ型肝炎ウイルス表面抗原抗体（ＨＢｓ抗原）、抗ヒトＣ型肝炎ウイルス抗体、抗リュウマチ因子等の抗体、例えば甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、甲状腺ホルモン［遊離トリヨードチロニン（ＦＴ３），遊離チロキシン（ＦＴ４），トリヨードチロニン（Ｔ３），チロキシン（Ｔ４）］、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）エストラジオール（Ｅ２）等のホルモン、例えばα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１９−９、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）等の癌マーカー、例えばトロポニンＴ（ＴｎＴ）、ヒト脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｎ端フラグメント（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）等の心疾患マーカー、例えば抗てんかん薬、抗生物質、テオフィリン等の薬物等が挙げられる。
上記したものの中でも、商業的ニーズの観点から、抗体、ホルモン、癌マーカー及び心疾患マーカーからなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましい。
本発明における測定対象物質の類似物質（アナログ）（Ｆ２）は、測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）が有する測定対象物質（Ｆ１）との結合部位と結合し得るもの、言い換えれば、測定対象物質（Ｆ１）が有する測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）との結合部位を有するもの、更に言い換えれば、測定対象物質（Ｆ１）と測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）との反応時に共存させると該反応と競合し得るものであれば何れでもよい。
本発明における測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）としては、例えば「抗原」−「抗体」間反応、「糖鎖」−「タンパク質」間反応、「糖鎖」−「レクチン」間反応、「酵素」−「インヒビター」間反応、「タンパク質」−「ペプチド鎖」間反応又は「染色体又はヌクレオチド鎖」−「ヌクレオチド鎖」間反応、「ヌクレオチド鎖」−「タンパク質」間反応等の相互反応によって測定対象物質又はその類似物質（Ｆ２）と結合するもの等が挙げられ、上記各組合せに於いて何れか一方が測定対象物質（Ｆ１）又はその類似物質（Ｆ２）である場合、他の一方がこの測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）である。
例えば、測定対象物質（Ｆ１）又はその類似物質（Ｆ２）が「抗原」であるときは測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）は「抗体」であり、測定対象物質（Ｆ１）又はその類似物質（Ｆ２）が「抗体」であるときは測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）は「抗原」である（以下、その他の上記各組合せにおいても同様である）。
例えば、測定対象物質（Ｆ１）又はその類似物質（Ｆ２）が「抗原」であるときは測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）は「抗体」であり、測定対象物質（Ｆ１）又はその類似物質（Ｆ２）が「抗体」であるときは測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）は「抗原」である（以下、その他の上記各組合せにおいても同様である）。
（Ｆ３）として具体的には、例えばヌクレオチド鎖（オリゴヌクレオチド鎖、ポリヌクレオチド鎖）；染色体；ペプチド鎖（例えばＣ−ペプチド、アンジオテンシンＩ等）、タンパク質〔例えばプロカルシトニン、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ），免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ），免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ），免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ），免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ），β２−ミクログロブリン、アルブミン、これらの分解産物、フェリチン等の血清タンパク質〕；酵素〔例えばアミラーゼ（例えば膵型，唾液腺型，Ｘ型等）、アルカリホスファターゼ（例えば肝性，骨性，胎盤性，小腸性等）、酸性ホスファターゼ（例えばＰＡＰ等）、γ−グルタミルトランスファラーゼ（例えば腎性，膵性，肝性等）、リパーゼ（例えば膵型，胃型等）、クレアチンキナーゼ（例えばＣＫ−１，ＣＫ−２，ｍＣＫ等）、乳酸脱水素酵素（例えばＬＤＨ１〜ＬＤＨ５等）、グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（例えばＡＳＴｍ，ＡＳＴｓ等）、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（例えばＡＬＴｍ，ＡＬＴｓ等）、コリンエステラーゼ（例えばＣｈＥ１〜ＣｈＥ５等）、ロイシンアミノペプチダーゼ（例えばＣ−ＬＡＰ，ＡＡ，ＣＡＰ等）、レニン、プロテインキナーゼ、チロシンキナーゼ等〕及びこれら酵素のインヒビター，ホルモン（例えばＰＴＨ，ＴＳＨ，インシュリン，ＬＨ，ＦＳＨ，プロラクチン等）、レセプター（例えばエストロゲン，ＴＳＨ等に対するレセプター）；リガンド（例えばエストロゲン，ＴＳＨ等）；例えば細菌（例えば結核菌，肺炎球菌，ジフテリア菌，髄膜炎菌，淋菌，ブドウ球菌，レンサ球菌，腸内細菌，大腸菌，ヘリコバクター・ピロリ等）、ウイルス（例えばルベラウイルス，ヘルペスウイルス，肝炎ウイルス，ＡＴＬウイルス，ＡＩＤＳウイルス，インフルエンザウイルス，アデノウイルス，エンテロウイルス，ポリオウイルス，ＥＢウイルス，ＨＡＶ，ＨＢＶ，ＨＣＶ，ＨＩＶ，ＨＴＬＶ等）、真菌（例えばカンジダ，クリプトコッカス等）、スピロヘータ（例えばレプトスピラ，梅毒トレポネーマ等）、クラミジア、マイコプラズマ等の微生物；当該微生物に由来するタンパク質又はペプチド或いは糖鎖抗原；気管支喘息，アレルギー性鼻炎，アトピー性皮膚炎等のアレルギーの原因となる各種アレルゲン（例えばハウスダスト、例えばコナヒョウダニ，ヤケヒョウダニ等のダニ類、例えばスギ、ヒノキ、スズメノヒエ，ブタクサ，オオアワガエリ，ハルガヤ，ライムギ等の花粉、例えばネコ，イヌ，カニ等の動物、例えば米，卵白等の食物、真菌、昆虫、木材、薬剤、化学物質等に由来するアレルゲン等）；脂質（例えばリポタンパク質等）；プロテアーゼ（例えばトリプシン，プラスミン，セリンプロテアーゼ等）；腫瘍マーカータンパク抗原（例えばＰＳＡ，ＰＧＩ，ＰＧＩＩ等）；糖鎖抗原〔例えばＡＦＰ（例えばＬ１からＬ３等）、ｈＣＧ（ｈＣＧファミリー）、トランスフェリン、ＩｇＧ、サイログロブリン、Ｄｅｃａｙ−ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ−ｆａｃｔｏｒ（ＤＡＦ）、癌胎児性抗原（例えばＣＥＡ，ＮＣＡ，ＮＣＡ−２，ＮＦＡ等）、ＣＡ１９−９、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ、ＣＡ１２５、前立腺特異抗原、癌細胞が産生する特殊な糖鎖を有する腫瘍マーカー糖鎖抗原、ＡＢＯ糖鎖抗原等〕；糖鎖（例えばヒアルロン酸、β−グルカン、上記糖鎖抗原等が有する糖鎖等）；糖鎖に結合するタンパク質（例えばヒアルロン酸結合タンパク、βグルカン結合タンパク等）；リン脂質（例えばカルジオリピン等）；リポ多糖（例えばエンドトキシン等）；化学物質（例えばＴ３，Ｔ４，例えばトリブチルスズ，ノニルフェノール，４−オクチルフェノール，フタル酸ジ−ｎ−ブチル，フタル酸ジシクロヘキシル，ベンゾフェノン，オクタクロロスチレン，フタル酸ジ−２−エチルヘキシル等の環境ホルモン）；人体に投与・接種される各種薬剤及びこれらの代謝物；アプタマー；核酸結合性物質；およびこれらに対する抗体等が挙げられる。尚、本発明に於いて用いられる抗体には、パパインやペプシン等の蛋白質分解酵素、或いは化学的分解により生じるＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント等の分解産物も包含される。
上記の如き測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）としては、「抗原」−「抗体」間反応或いは「糖鎖−タンパク質」間反応によって測定対象物質（Ｆ１）又はその類似物質（Ｆ２）と結合するものが、入手が容易であることから好ましい。
具体的には、測定対象物質（Ｆ１）又はその類似物質（Ｆ２）に対する抗体、測定対象物質（Ｆ１）又はその類似物質（Ｆ２）が結合する抗原及び測定対象物質（Ｆ１）又はその類似物質（Ｆ２）に結合するタンパク質が好ましく、測定対象物質（Ｆ１）又はその類似物質（Ｆ２）に対する抗体及び測定対象物質（Ｆ１）又はその類似物質（Ｆ２）に結合するタンパク質が更に好ましい。
具体的には、測定対象物質（Ｆ１）又はその類似物質（Ｆ２）に対する抗体、測定対象物質（Ｆ１）又はその類似物質（Ｆ２）が結合する抗原及び測定対象物質（Ｆ１）又はその類似物質（Ｆ２）に結合するタンパク質が好ましく、測定対象物質（Ｆ１）又はその類似物質（Ｆ２）に対する抗体及び測定対象物質（Ｆ１）又はその類似物質（Ｆ２）に結合するタンパク質が更に好ましい。
本発明に用いられる酵素（Ｃ）としては、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）に於いて用いられるアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ（以下においてＰＯＤと略記することがある）、マイクロペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ルシフェラーゼ、チロシナーゼ及び酸性ホスファターゼ等の酵素類が挙げられる。
これらの内、感度等の観点から、好ましいのはアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ及びグルコースオキシダーゼであり、特に好ましいのはペルオキシダーゼである。
これらの内、感度等の観点から、好ましいのはアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ及びグルコースオキシダーゼであり、特に好ましいのはペルオキシダーゼである。
本発明において物質（ＦＣ）は、上記物質（Ｆ）が酵素（Ｃ）により標識されてなる物質である。酵素（Ｃ）を物質（Ｆ）に結合させて物質（ＦＣ）とする方法、一般的にこの分野で用いられる方法［例えば、医化学実験講座、第８巻、山村雄一監修、第１版、中山書店、１９７１；図説 蛍光抗体、川生明著、第１版、（株）ソフトサイエンス社、１９８３；酵素免疫測定法、石川栄治、河合忠、室井潔編、第２版、医学書院、１９８２等］等を利用すればよい。
本発明において、免疫測定用試薬（Ｘ）中の物質（ＦＣ）の含有量は、免疫測定用試薬（Ｘ）の重量を基準として、酵素免疫測定法における測定感度の観点から、０．００５〜０．８重量％が好ましく、さらに好ましくは０．０１〜０．３重量％である。
本発明における親水性タンパク質（Ｄ）とは、２５℃、ｐＨ７．０の水１００ｇに２．０ｇ以上溶解するタンパク質である。
（Ｄ）は１種用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
親水性タンパク質（Ｄ）としては、親水性カゼインタンパク質（Ｄ１）、ペプチド（Ｄ２）、アルブミン（Ｄ３）等が挙げられる。
（Ｄ１）としては例えばカゼイン加水分解物、κ−カゼイン及びブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル（株）製）等が挙げられる。
ペプチド（Ｄ２）としては、例えばコラーゲンペプチド、ミルクペプチド及び大豆ペプチド等が挙げられる。
アルブミン（Ｄ３）としては、例えば卵アルブミン、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）等の血清アルブミン、及び乳アルブミン等が挙げられる。
上記（Ｄ）のうちで、保存安定性の観点から親水性カゼインタンパク質（Ｄ１）が好ましく、さらに好ましくはカゼイン加水分解物である。
（Ｄ）は１種用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
親水性タンパク質（Ｄ）としては、親水性カゼインタンパク質（Ｄ１）、ペプチド（Ｄ２）、アルブミン（Ｄ３）等が挙げられる。
（Ｄ１）としては例えばカゼイン加水分解物、κ−カゼイン及びブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル（株）製）等が挙げられる。
ペプチド（Ｄ２）としては、例えばコラーゲンペプチド、ミルクペプチド及び大豆ペプチド等が挙げられる。
アルブミン（Ｄ３）としては、例えば卵アルブミン、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）等の血清アルブミン、及び乳アルブミン等が挙げられる。
上記（Ｄ）のうちで、保存安定性の観点から親水性カゼインタンパク質（Ｄ１）が好ましく、さらに好ましくはカゼイン加水分解物である。
本発明において、免疫測定用試薬（Ｘ）中の親水性タンパク質（Ｄ）の含有量は、免疫測定用試薬（Ｘ）の重量を基準として、２〜６重量％であり、酵素で標識された物質の保存安定性の観点から、２〜６重量％が好ましく、さらに好ましくは３〜５重量％である。
（Ｄ）の含有量が２重量％以上であることで、親水性タンパク質（Ｄ）が免疫測定用試薬（Ｘ）中の物質（ＦＣ）の親水性を向上させることができ、物質（ＦＣ）の溶液中（特に水溶液中）での活性を維持することができるので、免疫測定試薬（Ｘ）としての保存安定性が向上する。また、（Ｄ）の含有量が６重量％以下であることで、疫測定用試薬（Ｘ）中への溶解が容易である。また、上記範囲であることで、特に磁性シリカ粒子（Ｂ１）を用いた酵素免疫測定法における磁性シリカ粒子（Ｂ１）の分散性を向上させることができる。
（Ｄ）の含有量が２重量％以上であることで、親水性タンパク質（Ｄ）が免疫測定用試薬（Ｘ）中の物質（ＦＣ）の親水性を向上させることができ、物質（ＦＣ）の溶液中（特に水溶液中）での活性を維持することができるので、免疫測定試薬（Ｘ）としての保存安定性が向上する。また、（Ｄ）の含有量が６重量％以下であることで、疫測定用試薬（Ｘ）中への溶解が容易である。また、上記範囲であることで、特に磁性シリカ粒子（Ｂ１）を用いた酵素免疫測定法における磁性シリカ粒子（Ｂ１）の分散性を向上させることができる。
本発明の免疫測定用試薬（Ｘ）は、（Ｘ）中の酵素で標識された物質である物質（ＦＣ）の保存安定性が極めて優れているので、免疫測定における標識試薬（Ａ）として好ましく用いることができる。
本発明の免疫測定用キットは、標識試薬（Ａ）及び固相担体試薬（Ｅ）を含む免疫測定用キットであって、標識試薬（Ａ）が上記本発明の免疫測定用試薬（Ｘ）であり、固相担体試薬（Ｅ）が固相担体（Ｂ）の表面上に物質（Ｆ）が固定化された固相担体（ＢＦ）を含有するものである免疫測定用キットである。
本発明において、固相担体（Ｂ）は、一般的にこの分野で使用されるものであれば特に限定されないが、例えばガラスビーズ、ポリスチレンビーズ、磁性シリカ粒子（Ｂ１）、マイクロプレート、ラテックス等が代表的なものとして挙げられる。
磁性シリカ粒子（Ｂ１）としては、特開２０１４−２１０６８０号公報及び特開２０１３−０１９８８９号公報等に記載の公知の磁性シリカ粒子等が挙げられる。
これらのうち、免疫測定時に親水性タンパク質（Ｄ）の影響を受けにくい観点から、磁性シリカ粒子（Ｂ１）が好ましい。
磁性シリカ粒子（Ｂ１）としては、特開２０１４−２１０６８０号公報及び特開２０１３−０１９８８９号公報等に記載の公知の磁性シリカ粒子等が挙げられる。
これらのうち、免疫測定時に親水性タンパク質（Ｄ）の影響を受けにくい観点から、磁性シリカ粒子（Ｂ１）が好ましい。
該磁性シリカ粒子（Ｂ１）は、シリカのマトリックス中に数平均粒子径が１〜１５ｎｍで超常磁性を有する金属酸化物を分散されているものである。超常磁性とは、外部磁場の存在下で物質の個々の原子磁気モーメントが整列し誘発された一時的な磁場を示し、外部磁場を取り除くと、部分的な整列が損なわれ磁場を示さなくなることをいう。
数平均粒子径が１〜１５ｎｍで超常磁性を示す超常磁性金属酸化物としては、鉄、コバルト、ニッケル及びこれらの合金等の酸化物が挙げられるが、磁界に対する感応性が優れていることから、酸化鉄が特に好ましい。超常磁性金属酸化物は、１種を単独で用いても２種以上を併用してもよい。
酸化鉄としては、公知の種々の酸化鉄を用いることができる。酸化鉄の内、特に化学的な安定性に優れることから、マグネタイト、γ−ヘマタイト、マグネタイト−α−ヘマタイト中間酸化鉄及びγ−ヘマタイト−α−ヘマタイト中間酸化鉄が好ましく、大きな飽和磁化を有し、外部磁場に対する感応性が優れていることから、マグネタイトが更に好ましい。
該磁性シリカ粒子（Ｂ１）中の超常磁性金属酸化物の含有量の下限は、６０重量％が好ましく、さらに好ましくは６５重量％であり、上限は９５重量％が好ましく、さらに好ましくは８０重量％である。
超常磁性金属酸化物の含有量が６０重量％以上であると、得られた磁性シリカ粒子（Ｂ１）の磁性が十分であるため、実際の用途面における分離操作に時間がかからないので好ましい。また９５重量％以下であると、合成が容易であるので好ましい。
超常磁性金属酸化物の含有量が６０重量％以上であると、得られた磁性シリカ粒子（Ｂ１）の磁性が十分であるため、実際の用途面における分離操作に時間がかからないので好ましい。また９５重量％以下であると、合成が容易であるので好ましい。
超常磁性金属酸化物の製造方法は、特に限定されないが、Ｍａｓｓａｒｔにより報告されたものをベースとして水溶性鉄塩及びアンモニアを用いる共沈殿法（Ｒ．Ｍａｓｓａｒｔ，ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓ．Ｍａｇｎ．１９８１，１７，１２４７）や水溶性鉄塩の水溶液中の酸化反応を用いた方法により合成することができる。
該磁性シリカ粒子（Ｂ１）の数平均粒子径は、好ましくは１〜５μｍ、更に好ましくは１〜３μｍである。平均粒子径が１μｍ以上であると、分離回収の際に時間がかからない傾向にあり、５μｍ以下であると、表面積が大きくなり、固定化する物質（対象物質、測定対象物質の類似物質又は測定対象物質と特異的に結合する物質）の結合量が多く結合効率が上昇する傾向にある。
該磁性シリカ粒子（Ｂ１）の数平均粒子径は、任意の２００個の磁性シリカ粒子について走査型電子顕微鏡（日本電子株式会社製「ＪＳＭ−７０００Ｆ」）で観察して測定された粒子径の平均値である。
該磁性シリカ粒子（Ｂ１）の数平均粒子径は、後述の水中油型エマルションを作製する際の混合条件（せん断力等）を調節して水中油型エマルションの粒子径を調整することにより制御することができる。また、磁性シリカ粒子製造時の水洗工程の条件変更や一般的な分級等の方法によっても平均粒子径を所望の値とすることができる。
該磁性シリカ粒子（Ｂ１）は、例えば数平均粒子径が１〜１５ｎｍの超常磁性金属酸化物粒子、前記超常磁性金属酸化物粒子の重量に基づいて３０〜５００重量％の（アルキル）アルコキシシラン及び分散剤を含有する分散液と、水、水溶性有機溶媒、非イオン性界面活性剤及び（アルキル）アルコキシシランの加水分解用触媒を含有する溶液とを混合して水中油型エマルションを形成後、（アルキル）アルコキシシランの加水分解反応及び縮合反応を行い、超常磁性金属酸化物がシリカに包含された磁性シリカ粒子の水性分散体が得た後、磁性シリカ粒子の水性分散体を遠心分離及び／又は集磁により固液分離し、水又はメタノール等で洗浄することにより得られる。
上記及び以下において、（アルキル）アルコキシシランとは、アルキルアルコキシシラン又はアルコキシシランを意味する。
上記及び以下において、（アルキル）アルコキシシランとは、アルキルアルコキシシラン又はアルコキシシランを意味する。
該磁性シリカ粒子（Ｂ１）は、超常磁性金属酸化物がシリカに包含され、粒子表面に存在しないことから、多くの測定対象物質、測定対象物質の類似物質、又は測定対象物質と特異的に結合する物質をその表面に固定化することができる。
本発明において、固相担体（Ｂ）｛好ましくは磁性シリカ粒子（Ｂ１）｝に、測定対象物質（Ｆ１）、測定対象物質の類似物質（Ｆ２）及び測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）からなる群より選ばれる少なくとも１種（測定対象物質（Ｆ１）等）を固定化し、固相担体（Ｂ）の表面に物質（Ｆ）が固定化された固相担体（ＢＦ）を製造する方法としては、上述の（Ｂ）に測定対象物質（Ｆ１）等を物理吸着させる方法が挙げられるが、より効率良く測定対象物質（Ｆ１）等を固定化させる観点から、グルタルアルデヒド、アルブミン、カルボジイミド、ストレプトアビジン、ビオチン及び官能基を有するアルキルアルコキシシランからなる群から選ばれる少なくとも１種の有機化合物を（Ｂ）表面に結合させ、それらを介して測定対象物質（Ｆ１）等を（Ｂ）に固定化させるのが好ましい。これらの有機化合物の内、特定の測定対象物質（Ｆ１）等を結合させる観点から、官能基を有するアルキルアルコキシシランが更に好ましい。
本発明の免疫測定用キットは、上記固相担体試薬（Ｅ）及び標識試薬（Ａ）以外に、さらにルミノール発光試薬（Ｋ）及び過酸化物水溶液（Ｌ）を含んでいてもよい。
ルミノール発光試薬（Ｋ）は、上記標識試薬（Ａ）中に含まれる物質（ＦＣ）を標識するものとして用いられている酵素（Ｃ）に基づき選択され、例えば、酵素（Ｃ）がペルオキシダーゼである場合、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物及び化学発光増強剤を必須構成成分としてなるルミノール発光試薬等が挙げられる。
過酸化物水溶液（Ｌ）は、過酸化物及び水を必須構成成分としてなる過酸化物水溶液である。
ルミノール発光試薬（Ｋ）は、上記標識試薬（Ａ）中に含まれる物質（ＦＣ）を標識するものとして用いられている酵素（Ｃ）に基づき選択され、例えば、酵素（Ｃ）がペルオキシダーゼである場合、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物及び化学発光増強剤を必須構成成分としてなるルミノール発光試薬等が挙げられる。
過酸化物水溶液（Ｌ）は、過酸化物及び水を必須構成成分としてなる過酸化物水溶液である。
ルミノール発光試薬（Ｋ）において、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物としては、例えば、特開平２−２９１２９９号公報、特開平１０−３１９０１５号公報及び特開２０００−２７９１９６号公報等に記載の公知の２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物及びこれらの混合物等が使用できる。
これらの内、ルミノール、イソルミノール、Ｎ−アミノヘキシル−Ｎ−エチルイソルミノール（ＡＨＥＩ）、Ｎ−アミノブチル−Ｎ−エチルイソルミノール（ＡＢＥＩ）及びこれらの金属塩（アルカリ金属塩等）からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく、更に好ましいのはルミノール及び／又はその金属塩、特に好ましいのはルミノールのナトリウム塩である。
これらの内、ルミノール、イソルミノール、Ｎ−アミノヘキシル−Ｎ−エチルイソルミノール（ＡＨＥＩ）、Ｎ−アミノブチル−Ｎ−エチルイソルミノール（ＡＢＥＩ）及びこれらの金属塩（アルカリ金属塩等）からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく、更に好ましいのはルミノール及び／又はその金属塩、特に好ましいのはルミノールのナトリウム塩である。
化学発光増強剤としては、例えば、特開昭５９−５００２５２号公報、特開昭５９−１７１８３９号公報及び特開平２−２９１２９９号公報等に記載の公知の化学発光増強剤及びこれらの混合物等が使用できる。
これらの内、化学発光増強効果等の観点から、フェノールが好ましく、更に好ましいのはＰ−ヨードフェノール、４−（シアノメチルチオ）フェノール及び４−シアノメチルチオ−２−クロロフェノールからなる群より選ばれる少なくとも１種であり、特に好ましいのは４−（シアノメチルチオ）フェノールである。
これらの内、化学発光増強効果等の観点から、フェノールが好ましく、更に好ましいのはＰ−ヨードフェノール、４−（シアノメチルチオ）フェノール及び４−シアノメチルチオ−２−クロロフェノールからなる群より選ばれる少なくとも１種であり、特に好ましいのは４−（シアノメチルチオ）フェノールである。
ルミノール発光試薬（Ｋ）には、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物及び化学発光増強剤以外に、緩衝液及び／又はキレート剤等を含むことができる。
緩衝液としては、例えば、特開平１０−３１９０１５号公報及び特開２００３−２７９４８９号公報等に記載の公知の緩衝液等が使用できる。
これらの内、化学発光増強効果及び保存安定性等の観点から、３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液、２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸・１水和物／水酸化ナトリウム緩衝液及びピペラジニル−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）・２水和物／水酸化ナトリウム緩衝液からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく、更に好ましいのは３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液及び２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸・１水和物／水酸化ナトリウム緩衝液からなる群より選ばれる少なくとも１種であり、特に好ましいのは３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液である。
これらの内、化学発光増強効果及び保存安定性等の観点から、３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液、２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸・１水和物／水酸化ナトリウム緩衝液及びピペラジニル−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）・２水和物／水酸化ナトリウム緩衝液からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく、更に好ましいのは３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液及び２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸・１水和物／水酸化ナトリウム緩衝液からなる群より選ばれる少なくとも１種であり、特に好ましいのは３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液である。
キレート剤としては、例えば、特開平９−７５０９９号公報及び特開２００３−２７９４８９号公報等に記載の公知のキレート剤等が使用できる。
これらの内、化学発光増強効果及び保存安定性等の観点から、４配位キレート剤が好ましく、更に好ましいのはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びその塩（エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸三ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸二カリウム及びエチレンジアミン四酢酸三カリウム等）並びにトランス−１，２ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＣｙＤＴＡ）からなる群より選ばれる少なくとも１種であり、特に好ましいのはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及び／又はその塩である。
これらの内、化学発光増強効果及び保存安定性等の観点から、４配位キレート剤が好ましく、更に好ましいのはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びその塩（エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸三ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸二カリウム及びエチレンジアミン四酢酸三カリウム等）並びにトランス−１，２ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＣｙＤＴＡ）からなる群より選ばれる少なくとも１種であり、特に好ましいのはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及び／又はその塩である。
ルミノール発光試薬（Ｋ）は、液体であることが好ましく、また、酵素の蛍光強度の観点からはアルカリ性であることが好ましい。
第１液のｐＨは、７〜１１が好ましく、更に好ましくは８〜１０である。尚、ｐＨは、ＪＩＳ Ｋ０４００−１２−１０：２０００に準拠して測定される（測定温度２５℃）。
第１液のｐＨは、７〜１１が好ましく、更に好ましくは８〜１０である。尚、ｐＨは、ＪＩＳ Ｋ０４００−１２−１０：２０００に準拠して測定される（測定温度２５℃）。
ルミノール発光試薬（Ｋ）は、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物、化学発光増強剤並びに必要により緩衝液及び／又はキレート剤を均一混合することにより容易に得ることができる。
過酸化物水溶液（Ｌ）が含有する過酸化物としては、例えば、特開平８−２６１９４３号公報及び特開２０００−２７９１９６号公報等に記載の公知の酸化剤等［無機の過酸化物（過酸化水素、過ホウ酸ナトリウム及び過ホウ酸カリウム等）、有機過酸化物（過酸化ジアルキル及び過酸化アシル等）、ペルオキソ酸化合物（ペルオキソ硫酸及びペルオキソリン酸等）等］の水溶液が挙げられる。
これらの内、保存安定性等の観点から、過酸化水素水溶液、過ホウ酸ナトリウム水溶液及び過ホウ酸カリウム水溶液が好ましく、更に好ましいのは過酸化水素水溶液である。
これらの内、保存安定性等の観点から、過酸化水素水溶液、過ホウ酸ナトリウム水溶液及び過ホウ酸カリウム水溶液が好ましく、更に好ましいのは過酸化水素水溶液である。
過酸化物水溶液（Ｌ）が含有する水としては、蒸留水、逆浸透水及び脱イオン水等が挙げられる。これらの内、化学発光増強効果及び保存安定性等の観点から、蒸留水及び脱イオン水が好ましく、更に好ましいのは脱イオン水である。
過酸化物水溶液（Ｌ）は、過酸化物及び水以外にキレート剤等を含むことができる。
キレート剤としては、上述のルミノール発光試薬に含むことができるキレート剤として例示したものと同様のものが挙げられ、好ましいものも同様である。
過酸化物水溶液（Ｌ）は、過酸化物、水及び必要によりキレート剤を均一混合することにより容易に得られる。
キレート剤としては、上述のルミノール発光試薬に含むことができるキレート剤として例示したものと同様のものが挙げられ、好ましいものも同様である。
過酸化物水溶液（Ｌ）は、過酸化物、水及び必要によりキレート剤を均一混合することにより容易に得られる。
本発明の免疫測定用キットは、試料中の測定対象物質（Ｆ１）を定量する免疫測定方法としてこの分野で一般的に行われる方法に用いることができ、例えば、文献［例えば、酵素免疫測定法第２版（石川栄治ら編集、医学書院）１９８２年］記載のサンドイッチ法、競合法及び特開平６−１３００６３号公報記載の測定法に準じて行えばよい。
サンドイッチ法は、例えば、測定対象物質（Ｆ１）を含む試料と、測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）を磁性シリカ粒子（Ｂ１）の表面に固定化した磁性シリカ粒子（Ｂ１Ｆ３）と、酵素により標識された測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３Ｃ）とを接触させて、磁性シリカ粒子（Ｂ１）表面に測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）と測定対象物質（Ｆ１）と酵素により標識された測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３Ｃ）との複合体｛（Ｆ３）／（Ｆ１）／（Ｆ３Ｃ）｝を形成させ、該標識複合体をＢ／Ｆ分離して、複合体中の標識物質量を測定し、その結果に基づいて試料中の測定対象物質（Ｆ１）を定量することによりなされる。
具体的には例えば、測定対象物質（Ｆ１）を含む試料と測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）を磁性シリカ粒子（Ｂ１）の表面に固定化した磁性シリカ粒子（Ｂ１Ｆ３）とを接触させて、磁性シリカ粒子（Ｂ１）表面に測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）と測定対象物質（Ｆ１）との複合体を形成させ、更に該複合体に酵素により標識された測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３Ｃ）を接触させて、磁性シリカ粒子（Ｂ１）に担持された測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）と測定対象物質（Ｆ１）と酵素により標識された測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３Ｃ）との標識複合体｛（Ｆ３）／（Ｆ１）／（Ｆ３Ｃ）｝を形成させ、該標識複合体をＢ／Ｆ分離して、標識複合体中の標識物質量を測定し、その結果に基づいて試料中の測定対象物質を定量すればよい。該方法に於いては、測定対象物質（Ｆ１）と測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）が固定化された磁性シリカ粒子（Ｂ１Ｆ３）とを反応させた後、酵素により標識された測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３Ｃ）を反応させているが、標識された測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３Ｃ）と測定対象物質（Ｆ１）とを反応させた後に測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）が固定化された磁性シリカ粒子（Ｂ１Ｆ３）とを反応させても、これら３つを同時に反応させても構わない。
上記サンドイッチ法におけるＢ／Ｆ分離とは、上記標識複合体｛（Ｆ３）／（Ｆ１）／（Ｆ３Ｃ）｝と、標識複合体の形成に関与しなかった酵素により標識された測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３Ｃ）との分離を意味し、具体的には、磁性シリカ粒子（Ｂ１）に担持された測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）、磁性シリカ粒子（Ｂ１）に担持された測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）と測定対象物質（Ｆ１）との複合体｛（Ｆ３）／（Ｆ１）｝及び上記の標識複合体｛（Ｆ３）／（Ｆ１）／（Ｆ３Ｃ）｝と、他の成分（試料中の測定対象物質（Ｆ１）以外の成分、標識複合体の形成に関与しなかった酵素により標識された測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３Ｃ）等）との分離を意味する。
また、Ｂ／Ｆ分離工程は標識複合体｛（Ｆ３）／（Ｆ１）／（Ｆ３Ｃ）｝の形成後には必須の工程であるが、磁性シリカ粒子（Ｂ１）表面に測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）と測定対象物質（Ｆ１）との複合体｛（Ｆ３）／（Ｆ１）｝を形成させた後においても実施することができる。
また、Ｂ／Ｆ分離工程は標識複合体｛（Ｆ３）／（Ｆ１）／（Ｆ３Ｃ）｝の形成後には必須の工程であるが、磁性シリカ粒子（Ｂ１）表面に測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）と測定対象物質（Ｆ１）との複合体｛（Ｆ３）／（Ｆ１）｝を形成させた後においても実施することができる。
競合法としては、測定対象物質（Ｆ１）を含む試料、酵素により標識された測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３Ｃ）、及び、測定対象物質（Ｆ１）又は測定対象物質の類似物質（Ｆ２）をその表面に固定化している磁性シリカ粒子（Ｂ１Ｆ１）又は（Ｂ１Ｆ２）とを接触させて、磁性シリカ粒子（Ｂ１）上に測定対象物質（Ｆ１）又はその類似物質（Ｆ２）と酵素により標識された測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３Ｃ）との標識複合体｛（Ｆ１）／（Ｆ１）／（Ｆ３Ｃ）又は（Ｆ２）／（Ｆ１）／（Ｆ３Ｃ）｝を形成させ、該標識複合体を担持した磁性シリカ粒子をＢ／Ｆ分離して、標識複合体中の標識物質量を測定し、その結果に基づいて試料中の測定対象物質を定量することによりなされる。
具体的には例えば、測定対象物質（Ｆ１）を含む試料と、酵素により標識された測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３Ｃ）と、測定対象物質（Ｆ１）又はその類似物質（Ｆ２）を担持した磁性シリカ粒子（Ｂ１Ｆ１）又は（Ｂ１Ｆ２）とを接触させて、酵素により標識された測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３Ｃ）に、試料中の測定対象物質（Ｆ１）と磁性シリカ粒子（Ｂ１）表面の測定対象物質（Ｆ１）又はその類似物質（Ｆ２）と競合反応させて、磁性シリカ粒子（Ｂ１）表面に測定対象物質（Ｆ１）又はその類似物質（Ｆ２）と酵素により標識された測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３Ｃ）との標識複合体｛（Ｆ１）／（Ｆ１）／（Ｆ３Ｃ）又は（Ｆ２）／（Ｆ１）／（Ｆ３Ｃ）｝を形成させ、該標識複合体を担持した磁性シリカ粒子をＢ／Ｆ分離して、標識複合体中の標識物質量を測定し、その結果に基づいて試料中の測定対象物質（Ｆ１）を定量すればよい。該方法に於いては、測定対象物質（Ｆ１）、酵素により標識された測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３Ｃ）、及び磁性シリカ粒子（Ｂ１）表面に固定化された測定対象物質（Ｆ１）又はその類似物質（Ｆ２）を同時に競合反応させているが、測定対象物質（Ｆ１）と磁性シリカ粒子（Ｂ１）表面に固定化された測定対象物質（Ｆ１）又はその類似物質（Ｆ２）とを接触させた後に、酵素により標識された測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３Ｃ）を加えて競合反応させても、測定対象物質（Ｆ１）と酵素により標識された測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３Ｃ）を接触させた後に、測定対象物質（Ｆ１）又はその類似物質（Ｆ２）を担持した磁性シリカ粒子を加えて競合反応させてもよい。
上記競合法におけるＢ／Ｆ分離とは、上記標識複合体｛（Ｆ１）／（Ｆ１）／（Ｆ３Ｃ）又は（Ｆ２）／（Ｆ１）／（Ｆ３Ｃ）｝と、標識複合体の形成に関与しなかった、酵素により標識された測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３Ｃ）、及び酵素により標識された測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３Ｃ）と測定対象物質（Ｆ１）との複合体｛（Ｆ１）／（Ｆ３Ｃ）｝との分離を意味し、具体的には、測定対象物質（Ｆ１）又はその類似物質（Ｆ２）を担持した磁性シリカ粒子、及び測定対象物質（Ｆ１）又はその類似物質（Ｆ２）を担持した磁性シリカ粒子と酵素により標識された測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３Ｃ）との複合体｛（Ｂ１Ｆ１）／（Ｆ３Ｃ）又は（Ｂ１Ｆ２）／（Ｆ３Ｃ）｝と他の成分（試料中の測定対象物質（Ｆ１）以外の成分、酵素により標識された測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３Ｃ）、測定対象物質（Ｆ１）の複合体等）との分離を意味する。
また、競合法の別の態様としては、測定対象物質（Ｆ１）を含む試料と、酵素により標識された測定対象物質（Ｆ１Ｃ）又はその類似物質（Ｆ２Ｃ）と、測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）を担持した磁性シリカ粒子（Ｂ１Ｆ３）とを接触させて、磁性シリカ粒子（Ｂ１）上に測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）と酵素により標識された測定対象物質（Ｆ１Ｃ）又はその類似物質（Ｆ２Ｃ）との標識複合体｛（Ｆ３）／（Ｆ１Ｃ）又は（Ｆ３）／（Ｆ２Ｃ）｝とを形成させ、該標識複合体を担持した磁性シリカ粒子をＢ／Ｆ分離して、標識複合体中の標識物質量を測定し、その結果に基づいて試料中の測定対象物質を測定することによりなされる。
具体的には例えば、測定対象物質（Ｆ１）を含む試料と、酵素により標識された測定対象物質（Ｆ１Ｃ）又はその類似物質（Ｆ２Ｃ）と、測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）を担持させた磁性シリカ粒子（Ｂ１Ｆ３）とを接触させて、磁性シリカ粒子（Ｂ１）上の測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）に、試料中の測定対象物質（Ｆ１）と酵素により標識された測定対象物質（Ｆ１Ｃ）又はその類似物質（Ｆ２Ｃ）とを競合反応させて、磁性シリカ粒子（Ｂ１）上に測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）と試料中の測定対象物質（Ｆ１）との複合体｛（Ｆ３）／（Ｆ１）｝及び酵素により標識された測定対象物質（Ｆ１Ｃ）又はその類似物質（Ｆ２Ｃ）との標識複合体｛（Ｆ３）／（Ｆ１Ｃ）又は（Ｆ３）／（Ｆ２Ｃ）｝とを形成させ、該複合体又は標識複合体を担持した磁性シリカ粒子をＢ／Ｆ分離して、標識複合体中の標識物質量を測定し、その結果に基づいて試料中の測定対象物質（Ｆ１）を測定すればよい。該競合法に於いては、測定対象物質（Ｆ１）、酵素により標識された測定対象物質（Ｆ１Ｃ）又はその類似物質（Ｆ２Ｃ）、及び測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）を担持させた磁性シリカ粒子（Ｂ１Ｆ３）を同時に競合反応させているが、測定対象物質（Ｆ１）と測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）を担持させた磁性シリカ粒子とを接触させた後｛複合体（Ｆ３）／（Ｆ１）を形成させた後｝に、酵素により標識された測定対象物質（Ｆ１Ｃ）又はその類似物質（Ｆ２Ｃ）を加えて競合反応｛磁性シリカ粒子（Ｂ１Ｆ３）において、試料中の測定対象物質（Ｆ１）が反応しなかった（Ｆ３）に、（Ｆ１Ｃ）又は（Ｆ２Ｃ）を反応｝させても、酵素により標識された測定対象物質（Ｆ１Ｃ）又はその類似物質（Ｆ２Ｃ）と測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）を担持させた磁性シリカ粒子（Ｂ１Ｆ３）とを接触させた後｛複合体（Ｆ３）／（Ｆ１Ｃ）又は（Ｆ３）／（Ｆ２Ｃ）を形成させた後｝に、測定対象物質（Ｆ１）を加えて競合反応｛磁性シリカ粒子（Ｂ１Ｆ３）において、（Ｆ１Ｃ）及び（Ｆ２Ｃ）が反応しなかった（Ｆ３）に、試料中の測定対象物質（Ｆ１）を反応｝させてもよい。
上記競合法におけるＢ／Ｆ分離とは、上記標識複合体と、標識複合体の形成に関与しなかった酵素により標識された測定対象物質（Ｆ１Ｃ）又はその類似物質（Ｆ２Ｃ）との分離を意味し、具体的には、測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）を担持させた磁性シリカ粒子（Ｂ１Ｆ３）、磁性シリカ粒子（Ｂ１）上の測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）と、測定対象物質（Ｆ１）との複合体｛（Ｆ３）／（Ｆ１）｝、及び磁性シリカ粒子（Ｂ１）上の測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）と、酵素により標識された測定対象物質（Ｆ１Ｃ）又はその類似物質（Ｆ２Ｃ）との複合体｛（Ｆ３）／（Ｆ１Ｃ）又は（Ｆ３）／（Ｆ２Ｃ）｝と、他の成分（試料中の測定対象物質（Ｆ１）以外の成分、標識複合体の形成に関与しなかった酵素により標識された測定対象物質（Ｆ１Ｃ）又はその類似物質（Ｆ２Ｃ）等）との分離を意味する。
また、Ｂ／Ｆ分離工程は標識複合体の形成後には必須の工程であるが、測定対象物質（Ｆ１）と測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）を担持させた磁性シリカ粒子とを接触させた後においても実施することができる。
また、Ｂ／Ｆ分離工程は標識複合体の形成後には必須の工程であるが、測定対象物質（Ｆ１）と測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）を担持させた磁性シリカ粒子とを接触させた後においても実施することができる。
また、測定対象物質（Ｆ１）が酵素の場合には、上記サンドイッチ法や競合法以外の酵素活性方法を用いる方法、例えば、測定対象物質（Ｆ１）を含む試料と、測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）（例えば、抗体等の酵素と結合し得る物質）を表面に固定化した磁性シリカ粒子（Ｂ１Ｆ３）とを接触させて、磁性シリカ粒子（Ｂ１）上に測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）との複合体｛（Ｆ３）／（Ｆ１）｝を形成させ、複合体を担持した磁性シリカ粒子をＢ／Ｆ分離した後、酵素の種類に応じた基質、又は酵素の種類に応じた基質及び発色剤、要すれば更に共役酵素を添加し、その基質の変化又は発色剤の発色結果に基づいて試料中の酵素量を測定する方法により、測定してもよい。尚、基質、発色剤、共役酵素は、公知のものを用いればよく、例えば酵素がペルオキシダーゼの場合には、過酸化水素とルミノール発光試薬等を用いればよい。これらの使用量も一般的にこの分野で用いられる範囲であればよい。上記方法におけるＢ／Ｆ分離とは、測定対象物質（Ｆ１）と、磁性シリカ粒子上に固定化された測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）との複合体｛（Ｆ３）／（Ｆ１）｝と、その他の成分（試料中の測定対象物質（Ｆ１）以外の成分等）との分離を意味する。
本発明の免疫測定方法において、試料、物質（Ｆ）が固定化された磁性シリカ粒子（Ｂ１Ｆ）、標識された測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３Ｃ）、酵素により標識された測定対象物質（Ｆ１Ｃ）又はその類似物質（Ｆ２Ｃ）等を接触させる方法としては、一般的になされる撹拌、混合等の処理により、磁性シリカ粒子が分散されればよい。反応時間は、測定対象物質（Ｆ１）、用いられる測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）、サンドイッチ法、競合法等の違いに応じて適宜設定されればよいが、１〜１０分が好ましく、さらに好ましくは１〜５分である。
本発明の免疫測定方法におけるＢ／Ｆ分離は、例えば、磁性シリカ粒子の磁性を利用し、反応槽の外側等から磁石等により磁性シリカ粒子を集めて、反応液を排出し、洗浄液を加えた後、磁石を取り除き、磁性シリカ粒子を混合して分散させ、洗浄することによりなされる。上記操作を１〜３回繰り返してもよい。洗浄液としては、通常この分野で用いられるものであれば特に限定はされない。
以下、実施例により、本発明を更に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。以下において部は重量部を示す。尚、実施例２及び４は参考例である。
＜実施例１＞
固相担体試薬（Ｅ−１）（抗ＣＥＡモノクローナル抗体（Ｆ３）が固定化された磁性シリカ粒子（Ｂ１Ｆ３）を含有する試薬）、免疫測定用試薬（Ｘ）である標識試薬（Ａ−１）（ＰＯＤ標識抗ＣＥＡ抗体（Ｆ３Ｃ）試薬）、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）及び過酸化水素水（Ｌ−１）から構成される本発明の免疫測定用キット（Ｓ−１）を得た。
固相担体試薬（Ｅ−１）（抗ＣＥＡモノクローナル抗体（Ｆ３）が固定化された磁性シリカ粒子（Ｂ１Ｆ３）を含有する試薬）、免疫測定用試薬（Ｘ）である標識試薬（Ａ−１）（ＰＯＤ標識抗ＣＥＡ抗体（Ｆ３Ｃ）試薬）、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）及び過酸化水素水（Ｌ−１）から構成される本発明の免疫測定用キット（Ｓ−１）を得た。
磁性シリカ粒子（Ｂ１−１）の製造：
反応容器に塩化鉄（ＩＩＩ）６水和物１８６部、塩化鉄（ＩＩ）４水和物６８部及び水１２８８部を仕込んで溶解させて５０℃に昇温し、撹拌下温度を５０〜５５℃の保持しながら、２５重量％アンモニア水２８０部を１時間かけて滴下し、水中にマグネタイト粒子を得た。得られたマグネタイト粒子に分散剤であるオレイン酸６４部を加え、２時間撹拌を継続した。室温に冷却後、デカンテーションにより固液分離して得られたオレイン酸が吸着したマグネタイト粒子を水１０００部で洗浄する操作を３回行い、さらにアセトン１０００部で洗浄する操作を２回行い、４０℃で２日間乾燥させることで、超常磁性金属酸化物粒子を得た。
反応容器に塩化鉄（ＩＩＩ）６水和物１８６部、塩化鉄（ＩＩ）４水和物６８部及び水１２８８部を仕込んで溶解させて５０℃に昇温し、撹拌下温度を５０〜５５℃の保持しながら、２５重量％アンモニア水２８０部を１時間かけて滴下し、水中にマグネタイト粒子を得た。得られたマグネタイト粒子に分散剤であるオレイン酸６４部を加え、２時間撹拌を継続した。室温に冷却後、デカンテーションにより固液分離して得られたオレイン酸が吸着したマグネタイト粒子を水１０００部で洗浄する操作を３回行い、さらにアセトン１０００部で洗浄する操作を２回行い、４０℃で２日間乾燥させることで、超常磁性金属酸化物粒子を得た。
超常磁性金属酸化物粒子８０部をテトラエトキシシラン２４０部に加えて分散し、分散液（ａ１）を調製した。次に、反応容器に水５０５０部、２５重量％アンモニア水溶液３５００部、ＮＳＡ−１７（三洋化成工業株式会社製）４００部を加えてクリアミックス（エムテクニック社製）を用いて混合し溶液（ａ２）を得た。５０℃に昇温後、クリアミックスを回転数６，０００ｒｐｍで攪拌しながら、上記分散液（ａ１）を溶液（ａ２）に１時間かけて滴下後、５０℃で１時間反応させた。反応後、２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して微粒子の存在する上清を除き、コア層を得た。
反応容器にコア層８０部、脱イオン水２５００部、２５重量％アンモニア水溶液２６０部、エタノール２５００部、テトラエトキシシラン１２００部を加えてクリアミックス（エムテクニック社製）を用いて混合し、クリアミックスの回転数６，０００ｒｐｍで攪拌しながら２時間反応させた。反応後、２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して微粒子の存在する上清を除き、磁石を用いて粒子を集磁し上清を除く操作を１０回行った。次に、得られた固相に水５０００部を加えて粒子を分散させて６００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、微粒子の存在する上清を除く操作を２０回行い、続いて得られた固相に水５０００部を加えて粒子を分散させて３００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより、大きな粒子径の粒子を沈降させて除去することで分級を行った。さらに、磁石を用いて粒子を集磁し上清を除く操作を１０回行い、目的とする体積平均粒子径の磁性シリカ粒子（Ｂ１−１）を得た。
抗ＣＥＡモノクローナル抗体（Ｆ３）が固定化された磁性シリカ粒子（Ｂ１Ｆ３）を含有する固相担体試薬（Ｅ−１）の作製：
１重量％γ−アミノプロピルトリエトキシシラン含有アセトン溶液４０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に製造した磁性シリカ粒子（Ｂ１−１）４０ｍｇを加え、２５℃で１時間反応させ、ネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去した。次いで脱イオン水４０ｍＬを加えて蓋をし、ポリスチレン瓶をゆっくりと２回倒置攪拌した後、ネオジウム磁石で磁性シリカ粒子（Ｂ１−１）を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去して磁性シリカ粒子を洗浄した。この洗浄操作を５回行った。次いで、この洗浄後の磁性シリカ粒子を２重量％グルタルアルデヒド含有水溶液４０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、２５℃で１時間反応させた。そして、脱イオン水４０ｍＬを加えて蓋をし、ポリスチレン瓶をゆっくりと２回倒置攪拌したのち、ネオジウム磁石で磁性シリカ粒子（Ｂ１−１）を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去して磁性シリカ粒子（Ｂ１−１）を洗浄した。この洗浄操作を１０回行った。更にこの洗浄後の磁性シリカ粒子（Ｂ１−１）を抗ＣＥＡモノクローナル抗体（ダコジャパン（株）製、後述する標識試薬（Ａ−１）で用いている抗ＣＥＡモノクローナル抗体と認識部位が異なるもの。）（Ｆ３−１’）１０μｇ／ｍＬの濃度で含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．７）１２０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、２５℃で１時間反応させた。反応後、ネオジウム磁石で抗ＣＥＡモノクローナル抗体が固定化された磁性シリカ粒子（Ｂ１Ｆ３）を集磁後、残留抗ＣＥＡモノクローナル抗体（Ｆ３−１’）含有リン酸緩衝液を除去した。次いで、磁性シリカ粒子（Ｂ１Ｆ３）を１重量％の牛血清アルブミン含有の０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）４０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、２５℃で１２時間浸漬させたのち、ネオジウム磁石でシリカ粒子（Ｂ１Ｆ３）を集磁後、１重量％の牛血清アルブミン含有のリン酸緩衝液を除去した。抗ＣＥＡモノクローナル抗体が固定化された磁性シリカ粒子（Ｂ１Ｆ３）濃度として１．０ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈し、固相担体試薬（Ｅ−１）を調製し、冷蔵（２〜１０℃）で保存した。
１重量％γ−アミノプロピルトリエトキシシラン含有アセトン溶液４０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に製造した磁性シリカ粒子（Ｂ１−１）４０ｍｇを加え、２５℃で１時間反応させ、ネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去した。次いで脱イオン水４０ｍＬを加えて蓋をし、ポリスチレン瓶をゆっくりと２回倒置攪拌した後、ネオジウム磁石で磁性シリカ粒子（Ｂ１−１）を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去して磁性シリカ粒子を洗浄した。この洗浄操作を５回行った。次いで、この洗浄後の磁性シリカ粒子を２重量％グルタルアルデヒド含有水溶液４０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、２５℃で１時間反応させた。そして、脱イオン水４０ｍＬを加えて蓋をし、ポリスチレン瓶をゆっくりと２回倒置攪拌したのち、ネオジウム磁石で磁性シリカ粒子（Ｂ１−１）を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去して磁性シリカ粒子（Ｂ１−１）を洗浄した。この洗浄操作を１０回行った。更にこの洗浄後の磁性シリカ粒子（Ｂ１−１）を抗ＣＥＡモノクローナル抗体（ダコジャパン（株）製、後述する標識試薬（Ａ−１）で用いている抗ＣＥＡモノクローナル抗体と認識部位が異なるもの。）（Ｆ３−１’）１０μｇ／ｍＬの濃度で含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．７）１２０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、２５℃で１時間反応させた。反応後、ネオジウム磁石で抗ＣＥＡモノクローナル抗体が固定化された磁性シリカ粒子（Ｂ１Ｆ３）を集磁後、残留抗ＣＥＡモノクローナル抗体（Ｆ３−１’）含有リン酸緩衝液を除去した。次いで、磁性シリカ粒子（Ｂ１Ｆ３）を１重量％の牛血清アルブミン含有の０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）４０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、２５℃で１２時間浸漬させたのち、ネオジウム磁石でシリカ粒子（Ｂ１Ｆ３）を集磁後、１重量％の牛血清アルブミン含有のリン酸緩衝液を除去した。抗ＣＥＡモノクローナル抗体が固定化された磁性シリカ粒子（Ｂ１Ｆ３）濃度として１．０ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈し、固相担体試薬（Ｅ−１）を調製し、冷蔵（２〜１０℃）で保存した。
標識試薬（Ａ−１）の作製：
抗ＣＥＡモノクローナル抗体（ダコジャパン（株）製）（Ｆ３−１）、西洋ワサビ由来ＰＯＤ（東洋紡製）（Ｃ−１）を用い、文献（エス・ヨシタケ、エム・イマガワ、イー・イシカワ、エトール；ジェイ．バイオケム，Ｖｏｌ．９２，１９８２，１４１３−１４２４）に記載の方法でＰＯＤ標識抗ＣＥＡ抗体（Ｆ３Ｃ）を調製した。これを３．０重量％のカゼイン加水分解物（Ｄ−１）含有の０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で、ＰＯＤ標識抗ＣＥＡ抗体（Ｆ３Ｃ）の濃度として２０ｎＭの濃度に希釈し、免疫測定用試薬（Ｘ）に該当する標識試薬（Ａ−１）を調製し、冷蔵（２〜１０℃）で保存した。
抗ＣＥＡモノクローナル抗体（ダコジャパン（株）製）（Ｆ３−１）、西洋ワサビ由来ＰＯＤ（東洋紡製）（Ｃ−１）を用い、文献（エス・ヨシタケ、エム・イマガワ、イー・イシカワ、エトール；ジェイ．バイオケム，Ｖｏｌ．９２，１９８２，１４１３−１４２４）に記載の方法でＰＯＤ標識抗ＣＥＡ抗体（Ｆ３Ｃ）を調製した。これを３．０重量％のカゼイン加水分解物（Ｄ−１）含有の０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で、ＰＯＤ標識抗ＣＥＡ抗体（Ｆ３Ｃ）の濃度として２０ｎＭの濃度に希釈し、免疫測定用試薬（Ｘ）に該当する標識試薬（Ａ−１）を調製し、冷蔵（２〜１０℃）で保存した。
ルミノール試薬（Ｋ）の調製：
ルミノールのナトリウム塩［シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製］０．７ｇ及び４−（シアノメチルチオ）フェノール０．１ｇを１，０００ｍＬメスフラスコに仕込んだ。３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）を溶液の容量が１，０００ｍＬになるように仕込み、２５℃で均一混合してルミノール発光試薬（Ｋ−１）を調製した。測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）保存した。
ルミノールのナトリウム塩［シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製］０．７ｇ及び４−（シアノメチルチオ）フェノール０．１ｇを１，０００ｍＬメスフラスコに仕込んだ。３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）を溶液の容量が１，０００ｍＬになるように仕込み、２５℃で均一混合してルミノール発光試薬（Ｋ−１）を調製した。測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）保存した。
過酸化水素水（Ｌ）の調製：
過酸化水素［和光純薬工業（株）製、試薬特級、濃度３０重量％］６．６ｇを１，０００ｍＬメスフラスコに仕込んだ。脱イオン水を溶液の容量が１，０００ｍＬになるように仕込み、２５℃で均一混合して過酸化水素水（Ｌ−１）を調製した。測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）保存した。
過酸化水素［和光純薬工業（株）製、試薬特級、濃度３０重量％］６．６ｇを１，０００ｍＬメスフラスコに仕込んだ。脱イオン水を溶液の容量が１，０００ｍＬになるように仕込み、２５℃で均一混合して過酸化水素水（Ｌ−１）を調製した。測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）保存した。
＜実施例２＞
標識試薬（Ａ−１）の作製における「カゼイン加水分解物（Ｄ−１）」を「ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル（株）製）（Ｄ−２）」に変更した以外は、実施例１と同様にして固相担体試薬（Ｅ−１）、免疫測定用試薬（Ｘ）に該当する標識試薬（Ａ−２）、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）及び過酸化水素水（Ｌ−１）から構成される免疫測定用キット（Ｓ−２）を得た。
標識試薬（Ａ−１）の作製における「カゼイン加水分解物（Ｄ−１）」を「ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル（株）製）（Ｄ−２）」に変更した以外は、実施例１と同様にして固相担体試薬（Ｅ−１）、免疫測定用試薬（Ｘ）に該当する標識試薬（Ａ−２）、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）及び過酸化水素水（Ｌ−１）から構成される免疫測定用キット（Ｓ−２）を得た。
＜実施例３＞
標識試薬（Ａ−１）の作製における「３．０重量％のカゼイン加水分解物（Ｄ−１）」を「６．０重量％のカゼイン加水分解物（Ｄ−１）」に変更した以外は、実施例１と同様にして固相担体試薬（Ｅ−１）、免疫測定用試薬（Ｘ）に該当する標識試薬（Ａ−３）、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）及び過酸化水素水（Ｌ−１）から構成される及び免疫測定用キット（Ｓ−３）を得た。
標識試薬（Ａ−１）の作製における「３．０重量％のカゼイン加水分解物（Ｄ−１）」を「６．０重量％のカゼイン加水分解物（Ｄ−１）」に変更した以外は、実施例１と同様にして固相担体試薬（Ｅ−１）、免疫測定用試薬（Ｘ）に該当する標識試薬（Ａ−３）、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）及び過酸化水素水（Ｌ−１）から構成される及び免疫測定用キット（Ｓ−３）を得た。
＜実施例４＞
標識試薬（Ａ−１）の作製における「３．０重量％のカゼイン加水分解物（Ｄ−１）」を「３．０重量％の牛血清アルブミン（以下においてＢＳＡと略記する）（Ｄ−３）」に変更した以外は、実施例１と同様にして固相担体試薬（Ｅ−１）、免疫測定用試薬（Ｘ）に該当する標識試薬（Ａ−４）、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）及び過酸化水素水（Ｌ−１）から構成される免疫測定用キット（Ｓ−４）を得た。
標識試薬（Ａ−１）の作製における「３．０重量％のカゼイン加水分解物（Ｄ−１）」を「３．０重量％の牛血清アルブミン（以下においてＢＳＡと略記する）（Ｄ−３）」に変更した以外は、実施例１と同様にして固相担体試薬（Ｅ−１）、免疫測定用試薬（Ｘ）に該当する標識試薬（Ａ−４）、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）及び過酸化水素水（Ｌ−１）から構成される免疫測定用キット（Ｓ−４）を得た。
＜実施例５＞
標識試薬（Ａ−１）の作製における「３．０重量％のカゼイン加水分解物（Ｄ−１）」を「４．０重量％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｄ−３）」に変更した以外は、実施例１と同様にして固相担体試薬（Ｅ−１）、免疫測定用試薬（Ｘ）に該当する標識試薬（Ａ−５）、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）及び過酸化水素水（Ｌ−１）から構成される免疫測定用キット（Ｓ−５）を得た。
標識試薬（Ａ−１）の作製における「３．０重量％のカゼイン加水分解物（Ｄ−１）」を「４．０重量％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｄ−３）」に変更した以外は、実施例１と同様にして固相担体試薬（Ｅ−１）、免疫測定用試薬（Ｘ）に該当する標識試薬（Ａ−５）、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）及び過酸化水素水（Ｌ−１）から構成される免疫測定用キット（Ｓ−５）を得た。
＜実施例６＞
標識試薬（Ａ−１）の作製における「３．０重量％のカゼイン加水分解物（Ｄ−１）」を「２．０重量％のカゼイン加水分解物（Ｄ−１）」に変更した以外は、実施例１と同様にして固相担体試薬（Ｅ−１）、免疫測定用試薬（Ｘ）に該当する標識試薬（Ａ−６）、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）及び過酸化水素水（Ｌ−１）から構成される免疫測定用キット（Ｓ−６）を得た。
標識試薬（Ａ−１）の作製における「３．０重量％のカゼイン加水分解物（Ｄ−１）」を「２．０重量％のカゼイン加水分解物（Ｄ−１）」に変更した以外は、実施例１と同様にして固相担体試薬（Ｅ−１）、免疫測定用試薬（Ｘ）に該当する標識試薬（Ａ−６）、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）及び過酸化水素水（Ｌ−１）から構成される免疫測定用キット（Ｓ−６）を得た。
＜実施例７＞
固相担体試薬（Ｅ−１）の作製において、「抗ＣＥＡモノクローナル抗体（ダコジャパン（株）製）（Ｆ３−１’）」を「抗ＰＳＡモノクローナル抗体（ダコジャパン（株）製、標識試薬（Ａ−７）で用いている抗ＰＳＡモノクローナル抗体と認識部位が異なるもの。）（Ｆ３−２’）」に変更して固相担体試薬（Ｅ−２）を得て、標識試薬（Ａ−１）の作製において、「抗ＣＥＡモノクローナル抗体（ダコジャパン（株）製）（Ｆ３−１）」を「抗ＰＳＡモノクローナル抗体（ダコジャパン（株）製）（Ｆ３−２）」に変更する以外は、実施例１と同様にして固相担体試薬（Ｅ−２）、免疫測定用試薬（Ｘ）に該当する標識試薬（Ａ−７）、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）及び過酸化水素水（Ｌ−１）から構成される免疫測定用キット（Ｓ−７）を得た。
固相担体試薬（Ｅ−１）の作製において、「抗ＣＥＡモノクローナル抗体（ダコジャパン（株）製）（Ｆ３−１’）」を「抗ＰＳＡモノクローナル抗体（ダコジャパン（株）製、標識試薬（Ａ−７）で用いている抗ＰＳＡモノクローナル抗体と認識部位が異なるもの。）（Ｆ３−２’）」に変更して固相担体試薬（Ｅ−２）を得て、標識試薬（Ａ−１）の作製において、「抗ＣＥＡモノクローナル抗体（ダコジャパン（株）製）（Ｆ３−１）」を「抗ＰＳＡモノクローナル抗体（ダコジャパン（株）製）（Ｆ３−２）」に変更する以外は、実施例１と同様にして固相担体試薬（Ｅ−２）、免疫測定用試薬（Ｘ）に該当する標識試薬（Ａ−７）、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）及び過酸化水素水（Ｌ−１）から構成される免疫測定用キット（Ｓ−７）を得た。
＜実施例８＞
固相担体試薬（Ｅ−１）の作製において、「抗ＣＥＡモノクローナル抗体（ダコジャパン（株）製）（Ｆ３−１’）１０μｇ／ｍＬ」を「抗Ｔ４モノクローナル抗体（ダコジャパン（株））（Ｆ３−３）２μｇ／ｍＬ」に変更して固相担体試薬（Ｅ−３）を得て、標識試薬（Ａ−１）の作製において、「抗ＣＥＡモノクローナル抗体（ダコジャパン（株）製）（Ｆ３−１）」を「Ｌ−チロキシンナトリウム五水和物（和光純薬工業（株）製）（以下、Ｔ４と表記）（Ｆ１−１）」に変更し、「ＰＯＤ標識抗ＣＥＡ抗体（Ｆ３Ｃ）の濃度として２０ｎＭの濃度に希釈」を、「ＰＯＤ標識Ｔ４（Ｆ１Ｃ）の濃度として２ｎＭの濃度に希釈」に変更する以外は、実施例１と同様にして固相担体試薬（Ｅ−３）、免疫測定用試薬（Ｘ）に該当する標識試薬（Ａ−８）、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）及び過酸化水素水（Ｌ−１）から構成される免疫測定用キット（Ｓ−８）を得た。
固相担体試薬（Ｅ−１）の作製において、「抗ＣＥＡモノクローナル抗体（ダコジャパン（株）製）（Ｆ３−１’）１０μｇ／ｍＬ」を「抗Ｔ４モノクローナル抗体（ダコジャパン（株））（Ｆ３−３）２μｇ／ｍＬ」に変更して固相担体試薬（Ｅ−３）を得て、標識試薬（Ａ−１）の作製において、「抗ＣＥＡモノクローナル抗体（ダコジャパン（株）製）（Ｆ３−１）」を「Ｌ−チロキシンナトリウム五水和物（和光純薬工業（株）製）（以下、Ｔ４と表記）（Ｆ１−１）」に変更し、「ＰＯＤ標識抗ＣＥＡ抗体（Ｆ３Ｃ）の濃度として２０ｎＭの濃度に希釈」を、「ＰＯＤ標識Ｔ４（Ｆ１Ｃ）の濃度として２ｎＭの濃度に希釈」に変更する以外は、実施例１と同様にして固相担体試薬（Ｅ−３）、免疫測定用試薬（Ｘ）に該当する標識試薬（Ａ−８）、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）及び過酸化水素水（Ｌ−１）から構成される免疫測定用キット（Ｓ−８）を得た。
＜実施例９＞
固相担体試薬（Ｅ−１）の作製において、「抗ＣＥＡモノクローナル抗体（ダコジャパン（株）製）（Ｆ３−１’）１０μｇ／ｍＬ」を「Ｔ４（Ｆ１−１）２μｇ／ｍＬ」に変更して固相担体試薬（Ｅ−４）を得て、標識試薬（Ａ−１）の作製において、「抗ＣＥＡモノクローナル抗体（ダコジャパン（株）製）（Ｆ３−１）」を「抗Ｔ４モノクローナル抗体（ダコジャパン（株）製）（Ｆ３−３）」に変更し、「ＰＯＤ標識抗ＣＥＡ抗体（Ｆ３Ｃ）の濃度として２０ｎＭの濃度に希釈」を、「ＰＯＤ標識抗Ｔ４抗体（Ｆ３Ｃ）の濃度として２ｎＭの濃度に希釈」に変更する以外は、実施例１と同様にして固相担体試薬（Ｅ−４）、免疫測定用試薬（Ｘ）に該当する標識試薬（Ａ−９）、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）及び過酸化水素水（Ｌ−１）から構成される免疫測定用キット（Ｓ−９）を得た。
固相担体試薬（Ｅ−１）の作製において、「抗ＣＥＡモノクローナル抗体（ダコジャパン（株）製）（Ｆ３−１’）１０μｇ／ｍＬ」を「Ｔ４（Ｆ１−１）２μｇ／ｍＬ」に変更して固相担体試薬（Ｅ−４）を得て、標識試薬（Ａ−１）の作製において、「抗ＣＥＡモノクローナル抗体（ダコジャパン（株）製）（Ｆ３−１）」を「抗Ｔ４モノクローナル抗体（ダコジャパン（株）製）（Ｆ３−３）」に変更し、「ＰＯＤ標識抗ＣＥＡ抗体（Ｆ３Ｃ）の濃度として２０ｎＭの濃度に希釈」を、「ＰＯＤ標識抗Ｔ４抗体（Ｆ３Ｃ）の濃度として２ｎＭの濃度に希釈」に変更する以外は、実施例１と同様にして固相担体試薬（Ｅ−４）、免疫測定用試薬（Ｘ）に該当する標識試薬（Ａ−９）、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）及び過酸化水素水（Ｌ−１）から構成される免疫測定用キット（Ｓ−９）を得た。
＜実施例１０＞
固相担体試薬（Ｅ−１）の作製において、「抗ＣＥＡモノクローナル抗体（ダコジャパン（株）製）（Ｆ３−１’）１０μｇ／ｍＬ」を「抗Ｔ４モノクローナル抗体（ダコジャパン（株））（Ｆ３−３）２μｇ／ｍＬ」に変更して固相担体試薬（Ｅ−３）を得て、標識試薬（Ａ−１）の作製において、「抗ＣＥＡモノクローナル抗体（ダコジャパン（株）製）（Ｆ３−１’）」を「３，３’，５−トリヨード−Ｌ−チロニン（和光純薬工業（株）製）（以下、Ｔ３と表記）（Ｆ２−１）」に変更し、「ＰＯＤ標識抗ＣＥＡ抗体（Ｆ３Ｃ）濃度として２０ｎＭの濃度に希釈」を、「ＰＯＤ標識Ｔ３（Ｆ２Ｃ）濃度として２ｎＭの濃度に希釈」に変更する以外は、実施例１と同様にして固相担体試薬（Ｅ−３）、免疫測定用試薬（Ｘ）に該当する標識試薬（Ａ−１０）、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）及び過酸化水素水（Ｌ−１）から構成される免疫測定用キット（Ｓ−１０）を得た。
固相担体試薬（Ｅ−１）の作製において、「抗ＣＥＡモノクローナル抗体（ダコジャパン（株）製）（Ｆ３−１’）１０μｇ／ｍＬ」を「抗Ｔ４モノクローナル抗体（ダコジャパン（株））（Ｆ３−３）２μｇ／ｍＬ」に変更して固相担体試薬（Ｅ−３）を得て、標識試薬（Ａ−１）の作製において、「抗ＣＥＡモノクローナル抗体（ダコジャパン（株）製）（Ｆ３−１’）」を「３，３’，５−トリヨード−Ｌ−チロニン（和光純薬工業（株）製）（以下、Ｔ３と表記）（Ｆ２−１）」に変更し、「ＰＯＤ標識抗ＣＥＡ抗体（Ｆ３Ｃ）濃度として２０ｎＭの濃度に希釈」を、「ＰＯＤ標識Ｔ３（Ｆ２Ｃ）濃度として２ｎＭの濃度に希釈」に変更する以外は、実施例１と同様にして固相担体試薬（Ｅ−３）、免疫測定用試薬（Ｘ）に該当する標識試薬（Ａ−１０）、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）及び過酸化水素水（Ｌ−１）から構成される免疫測定用キット（Ｓ−１０）を得た。
＜比較例１＞
標識試薬（Ａ−１）の作製における「３．０重量％のカゼイン加水分解物（Ｄ）」を「１．０重量％のカゼインナトリウム塩」に変更し、カゼインナトリウム塩をｐＨ１０．０で溶解後ｐＨ７．０に調整した以外は、実施例１と同様にして固相担体試薬（Ｅ−１）、比較用の免疫測定用試薬である標識試薬（Ａ−１１）、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）及び過酸化水素水（Ｌ−１）から構成される比較免疫測定用キット（Ｈ−１）を得た。カゼインナトリウム塩はｐＨ７．０の水１００ｇに対する溶解性が１．０ｇ以下であり、疎水性タンパク質である。
標識試薬（Ａ−１）の作製における「３．０重量％のカゼイン加水分解物（Ｄ）」を「１．０重量％のカゼインナトリウム塩」に変更し、カゼインナトリウム塩をｐＨ１０．０で溶解後ｐＨ７．０に調整した以外は、実施例１と同様にして固相担体試薬（Ｅ−１）、比較用の免疫測定用試薬である標識試薬（Ａ−１１）、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）及び過酸化水素水（Ｌ−１）から構成される比較免疫測定用キット（Ｈ−１）を得た。カゼインナトリウム塩はｐＨ７．０の水１００ｇに対する溶解性が１．０ｇ以下であり、疎水性タンパク質である。
＜比較例２＞
標識試薬（Ａ−１）の作製における「３．０重量％のカゼイン加水分解物（Ｄ）」を「カゼイン加水分解物（Ｄ）を添加しない」に変更した以外は、実施例１と同様にして固相担体試薬（Ｅ−１）、比較用の免疫測定用試薬である標識試薬（Ａ−１２）、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）及び過酸化水素水（Ｌ−１）から構成される比較免疫測定用キット（Ｈ−２）を得た。
標識試薬（Ａ−１）の作製における「３．０重量％のカゼイン加水分解物（Ｄ）」を「カゼイン加水分解物（Ｄ）を添加しない」に変更した以外は、実施例１と同様にして固相担体試薬（Ｅ−１）、比較用の免疫測定用試薬である標識試薬（Ａ−１２）、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）及び過酸化水素水（Ｌ−１）から構成される比較免疫測定用キット（Ｈ−２）を得た。
＜比較例３＞
標識試薬（Ａ−１）の作製における「３．０重量％のカゼイン加水分解物（Ｄ）」を「０．５重量％のカゼイン加水分解物（Ｄ−１）」に変更した以外は、実施例１と同様にして固相担体試薬（Ｅ−１）、比較用の免疫測定用試薬である標識試薬（Ａ−１３）、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）及び過酸化水素水（Ｌ−１）から構成される比較免疫測定用キット（Ｈ−３）を得た。
標識試薬（Ａ−１）の作製における「３．０重量％のカゼイン加水分解物（Ｄ）」を「０．５重量％のカゼイン加水分解物（Ｄ−１）」に変更した以外は、実施例１と同様にして固相担体試薬（Ｅ−１）、比較用の免疫測定用試薬である標識試薬（Ａ−１３）、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）及び過酸化水素水（Ｌ−１）から構成される比較免疫測定用キット（Ｈ−３）を得た。
得られた免疫測定用キット（Ｓ−１）〜（Ｓ−６）及び（Ｈ−１）〜（Ｈ−３）を用いて、以下の方法により免疫測定における保存安定性及び磁性シリカ粒子の分散性を評価した。その結果を表１に示す。
＜本発明の免疫測定用キットの安定性評価方法１（測定対象物質１（Ｆ１）：ＣＥＡ）＞
磁性シリカ粒子を含有する固相担体試薬（Ｅ−１）０．０２５ｍＬと０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で調製したＣＥＡ（Ｆ１）濃度が１．０ｎｇ／ｍＬの標準ＣＥＡ（Ｆ１）液０．０２５ｍＬを試験管に入れて混合し、試験管中で３７℃３分間反応させ、抗ＣＥＡ抗体（Ｆ３）結合磁性シリカ粒子／ＣＥＡ（Ｆ１）複合体を形成させた。反応後、試験管の外側からネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を１０秒間集め、試験管中の液をアスピレーターで除き、ネオジウム磁石を側面から十分に離し、生理食塩水０．５ｍＬを加えて磁性シリカ粒子を分散させて集磁後、アスピレーターで液を除く洗浄操作を３回行った。
磁性シリカ粒子を含有する固相担体試薬（Ｅ−１）０．０２５ｍＬと０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で調製したＣＥＡ（Ｆ１）濃度が１．０ｎｇ／ｍＬの標準ＣＥＡ（Ｆ１）液０．０２５ｍＬを試験管に入れて混合し、試験管中で３７℃３分間反応させ、抗ＣＥＡ抗体（Ｆ３）結合磁性シリカ粒子／ＣＥＡ（Ｆ１）複合体を形成させた。反応後、試験管の外側からネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を１０秒間集め、試験管中の液をアスピレーターで除き、ネオジウム磁石を側面から十分に離し、生理食塩水０．５ｍＬを加えて磁性シリカ粒子を分散させて集磁後、アスピレーターで液を除く洗浄操作を３回行った。
続いて、標識試薬（Ａ−ｎ）（Ｓ−１においてはｎ＝１、Ｓ−２においてはｎ＝２、Ｓ−３においてはｎ＝３、Ｓ−４においてはｎ＝４、Ｓ−５においてはｎ＝５、Ｓ−６においてはｎ＝６、Ｈ−１においてはｎ＝１１、Ｈ−２においてはｎ＝１２及びＨ−３においてはｎ＝１３）０．０２５ｍＬを試験管に注入し、試験管中で３７℃３分間反応させ、磁性シリカ粒子（Ｂ１）上に抗ＣＥＡ抗体（Ｆ３）／ＣＥＡ（Ｆ１）／ＰＯＤ標識抗ＣＥＡ抗体（Ｆ３Ｃ）の複合体を形成させた。反応後、試験管の外側からネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を１０秒間集め、試験管中の液をアスピレーターで除き、ネオジウム磁石を側面から十分に離し、生理食塩水０．５ｍＬを加えて磁性シリカ粒子を分散させて集磁後、アスピレーターで液を除く洗浄操作を２回行った。
最後に、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）０．０７ｍＬと過酸化水素水（Ｌ−１）０．０７ｍＬとを同時に加え、３７℃で４３秒間発光反応させ、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）及び過酸化水素水（Ｌ−１）を添加後４３〜４５秒の平均発光量をルミノメーター［ベルトールドジャパン（株）製「Ｌｕｍａｔ ＬＢ９５０７」］で測定した。
最後に、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）０．０７ｍＬと過酸化水素水（Ｌ−１）０．０７ｍＬとを同時に加え、３７℃で４３秒間発光反応させ、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）及び過酸化水素水（Ｌ−１）を添加後４３〜４５秒の平均発光量をルミノメーター［ベルトールドジャパン（株）製「Ｌｕｍａｔ ＬＢ９５０７」］で測定した。
免疫測定用キットを作成してから５．０時間以内のものを用いて測定した値を初期発光量、免疫測定用キットを４℃で１年間（３６５日）、４０℃で５日間又は４０℃で１０日間保管後のものを用いて測定した値を１年間、５日間又は１０日間保管後の発光量として、以下の計算式にて安定率を算出した。
安定率（％）＝Ｂ／Ａ×１００
（Ａ：初期発光量、Ｂ：１年間、５日間又は１０日間保管後の発光量）
安定率（％）＝Ｂ／Ａ×１００
（Ａ：初期発光量、Ｂ：１年間、５日間又は１０日間保管後の発光量）
得られた免疫測定用キット（Ｓ−７）を用いて、以下の方法により免疫測定における保存安定性を評価した。その結果を表１に示す。
＜本発明の免疫測定用キットの安定性評価方法（測定対象物質２（Ｆ１）：ＰＳＡ）＞
磁性シリカ粒子を含有する固相担体試薬（Ｅ−２）０．０２５ｍＬと０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で調製したＰＳＡ（Ｆ１）濃度が０．１ｎｇ／ｍＬの標準ＰＳＡ（Ｆ１）液０．０２５ｍＬを試験管に入れて混合し、試験管中で３７℃３分間反応させ、抗ＰＳＡ抗体（Ｆ３）結合磁性シリカ粒子／ＰＳＡ（Ｆ１）複合体を形成させた。反応後、試験管の外側からネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を１０秒間集め、試験管中の液をアスピレーターで除き、ネオジウム磁石を側面から十分に離し、生理食塩水０．５ｍＬを加えて磁性シリカ粒子を分散させて集磁後、アスピレーターで液を除く洗浄操作を３回行った。
磁性シリカ粒子を含有する固相担体試薬（Ｅ−２）０．０２５ｍＬと０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で調製したＰＳＡ（Ｆ１）濃度が０．１ｎｇ／ｍＬの標準ＰＳＡ（Ｆ１）液０．０２５ｍＬを試験管に入れて混合し、試験管中で３７℃３分間反応させ、抗ＰＳＡ抗体（Ｆ３）結合磁性シリカ粒子／ＰＳＡ（Ｆ１）複合体を形成させた。反応後、試験管の外側からネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を１０秒間集め、試験管中の液をアスピレーターで除き、ネオジウム磁石を側面から十分に離し、生理食塩水０．５ｍＬを加えて磁性シリカ粒子を分散させて集磁後、アスピレーターで液を除く洗浄操作を３回行った。
続いて、標識試薬（Ａ−７）０．０２５ｍＬを試験管に注入し、試験管中で３７℃３分間反応させ、磁性シリカ粒子（Ｂ−１）上に抗ＰＳＡ抗体（Ｆ３）／ＰＳＡ（Ｆ１）／ＰＯＤ標識抗ＰＳＡ抗体（Ｆ３Ｃ）複合体を形成させた。反応後、試験管の外側からネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を１０秒間集め、試験管中の液をアスピレーターで除き、ネオジウム磁石を側面から十分に離し、生理食塩水０．５ｍＬを加えて磁性シリカ粒子を分散させて集磁後、アスピレーターで液を除く洗浄操作を２回行った。
最後に、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）０．０７ｍＬと過酸化水素水（Ｌ−１）０．０７ｍＬとを同時に加え、３７℃で４３秒間発光反応させ、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）及び過酸化水素水（Ｌ−１）を添加後４３〜４５秒の平均発光量をルミノメーター［ベルトールドジャパン（株）製「Ｌｕｍａｔ ＬＢ９５０７」］で測定した。
最後に、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）０．０７ｍＬと過酸化水素水（Ｌ−１）０．０７ｍＬとを同時に加え、３７℃で４３秒間発光反応させ、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）及び過酸化水素水（Ｌ−１）を添加後４３〜４５秒の平均発光量をルミノメーター［ベルトールドジャパン（株）製「Ｌｕｍａｔ ＬＢ９５０７」］で測定した。
免疫測定用キットを作成してから５．０時間以内のものを用いて測定した値を初期発光量、免疫測定用キットを４℃で１年間（３６５日）、４０℃で５日間又は４０℃で１０日間保管後のものを用いて測定した値を１年間、５日間又は１０日間保管後の発光量として、以下の計算式にて安定率を算出した。
安定率（％）＝Ｂ／Ａ×１００
（Ａ：初期発光量、Ｂ：１年間、５日間又は１０日間保管後の発光量）
安定率（％）＝Ｂ／Ａ×１００
（Ａ：初期発光量、Ｂ：１年間、５日間又は１０日間保管後の発光量）
得られた免疫測定用キット（Ｓ−８）を用いて、以下の方法により免疫測定における保存安定性を評価した。その結果を表１に示す。
＜本発明の免疫測定用キットの安定性評価方法（測定対象物質３（Ｆ１）：ＦＴ４）＞
磁性シリカ粒子を含有する固相担体試薬（Ｅ−３）０．０２５ｍＬと０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で調製したＦＴ４（Ｆ１）濃度が１ｎｇ／ｄＬの標準ＦＴ４（Ｆ１）液０．０２５ｍＬ、及び標識試薬（Ａ−８）０．０２５ｍＬを試験管に入れて混合し、試験管中で３７℃６分間反応させ、磁性シリカ粒子（Ｂ−１）上に抗Ｔ４抗体（Ｆ３）／Ｔ４（Ｆ１）の複合体、又は抗Ｔ４抗体（Ｆ３）／ＰＯＤ標識Ｔ４（Ｆ１Ｃ）の複合体を形成させた。反応後、試験管の外側からネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を１０秒間集め、試験管中の液をアスピレーターで除き、ネオジウム磁石を側面から十分に離し、生理食塩水０．５ｍＬを加えて磁性シリカ粒子を分散させて集磁後、アスピレーターで液を除く洗浄操作を３回行った。最後に、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）０．０７ｍＬと過酸化水素水（Ｌ−１）０．０７ｍＬとを同時に加え、３７℃で４３秒間発光反応させ、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）及び過酸化水素水（Ｌ−１）を添加後４３〜４５秒の平均発光量をルミノメーター［ベルトールドジャパン（株）製「Ｌｕｍａｔ ＬＢ９５０７」］で測定した。
磁性シリカ粒子を含有する固相担体試薬（Ｅ−３）０．０２５ｍＬと０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で調製したＦＴ４（Ｆ１）濃度が１ｎｇ／ｄＬの標準ＦＴ４（Ｆ１）液０．０２５ｍＬ、及び標識試薬（Ａ−８）０．０２５ｍＬを試験管に入れて混合し、試験管中で３７℃６分間反応させ、磁性シリカ粒子（Ｂ−１）上に抗Ｔ４抗体（Ｆ３）／Ｔ４（Ｆ１）の複合体、又は抗Ｔ４抗体（Ｆ３）／ＰＯＤ標識Ｔ４（Ｆ１Ｃ）の複合体を形成させた。反応後、試験管の外側からネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を１０秒間集め、試験管中の液をアスピレーターで除き、ネオジウム磁石を側面から十分に離し、生理食塩水０．５ｍＬを加えて磁性シリカ粒子を分散させて集磁後、アスピレーターで液を除く洗浄操作を３回行った。最後に、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）０．０７ｍＬと過酸化水素水（Ｌ−１）０．０７ｍＬとを同時に加え、３７℃で４３秒間発光反応させ、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）及び過酸化水素水（Ｌ−１）を添加後４３〜４５秒の平均発光量をルミノメーター［ベルトールドジャパン（株）製「Ｌｕｍａｔ ＬＢ９５０７」］で測定した。
免疫測定用キットを作成してから５．０時間以内のものを用いて測定した値を初期発光量、免疫測定用キットを４℃で１年間（３６５日）、４０℃で５日間又は４０℃で１０日間保管後のものを用いて測定した値を１年間、５日間又は１０日間保管後の発光量として、以下の計算式にて安定率を算出した。
安定率（％）＝Ｂ／Ａ×１００
（Ａ：初期発光量、Ｂ：１年間、５日間又は１０日間保管後の発光量）
安定率（％）＝Ｂ／Ａ×１００
（Ａ：初期発光量、Ｂ：１年間、５日間又は１０日間保管後の発光量）
得られた免疫測定用キット（Ｓ−９）を用いて、以下の方法により免疫測定における保存安定性を評価した。その結果を表１に示す。
＜本発明の免疫測定用キットの安定性評価方法４（測定対象物質３（Ｆ１）：ＦＴ４）＞
磁性シリカ粒子を含有する固相担体試薬（Ｅ−４）０．０２５ｍＬと０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で調製したＦＴ４（Ｆ１）濃度が１ｎｇ／ｄＬの標準ＦＴ４（Ｆ１）液０．０２５ｍＬ、及び標識試薬（Ａ−９）０．０２５ｍＬを試験管に入れて混合し、試験管中で３７℃６分間反応させ、磁性シリカ粒子（Ｂ−１）上にＴ４（Ｆ１）／ＰＯＤ標識抗Ｔ４モノクローナル抗体（Ｆ３Ｃ）複合体を形成させた。反応後、試験管の外側からネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を１０秒間集め、試験管中の液をアスピレーターで除き、ネオジウム磁石を側面から十分に離し、生理食塩水０．５ｍＬを加えて磁性シリカ粒子を分散させて集磁後、アスピレーターで液を除く洗浄操作を３回行った。最後に、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）０．０７ｍＬと過酸化水素水（Ｌ−１）０．０７ｍＬとを同時に加え、３７℃で４３秒間発光反応させ、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）及び過酸化水素水（Ｌ−１）を添加後４３〜４５秒の平均発光量をルミノメーター［ベルトールドジャパン（株）製「Ｌｕｍａｔ ＬＢ９５０７」］で測定した。
磁性シリカ粒子を含有する固相担体試薬（Ｅ−４）０．０２５ｍＬと０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で調製したＦＴ４（Ｆ１）濃度が１ｎｇ／ｄＬの標準ＦＴ４（Ｆ１）液０．０２５ｍＬ、及び標識試薬（Ａ−９）０．０２５ｍＬを試験管に入れて混合し、試験管中で３７℃６分間反応させ、磁性シリカ粒子（Ｂ−１）上にＴ４（Ｆ１）／ＰＯＤ標識抗Ｔ４モノクローナル抗体（Ｆ３Ｃ）複合体を形成させた。反応後、試験管の外側からネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を１０秒間集め、試験管中の液をアスピレーターで除き、ネオジウム磁石を側面から十分に離し、生理食塩水０．５ｍＬを加えて磁性シリカ粒子を分散させて集磁後、アスピレーターで液を除く洗浄操作を３回行った。最後に、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）０．０７ｍＬと過酸化水素水（Ｌ−１）０．０７ｍＬとを同時に加え、３７℃で４３秒間発光反応させ、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）及び過酸化水素水（Ｌ−１）を添加後４３〜４５秒の平均発光量をルミノメーター［ベルトールドジャパン（株）製「Ｌｕｍａｔ ＬＢ９５０７」］で測定した。
免疫測定用キットを作成してから５．０時間以内のものを用いて測定した値を初期発光量、免疫測定用キットを４℃で１年間（３６５日）、４０℃で５日間又は４０℃で１０日間保管後のものを用いて測定した値を１年間、５日間又は１０日間保管後の発光量として、以下の計算式にて安定率を算出した。
安定率（％）＝Ｂ／Ａ×１００
（Ａ：初期発光量、Ｂ：１年間、５日間又は１０日間保管後の発光量）
安定率（％）＝Ｂ／Ａ×１００
（Ａ：初期発光量、Ｂ：１年間、５日間又は１０日間保管後の発光量）
得られた免疫測定用キット（Ｓ−１０）を用いて、以下の方法により免疫測定における保存安定性を評価した。その結果を表１に示す。
＜本発明の免疫測定用キットの安定性評価方法（測定対象物質３（Ｆ１）：ＦＴ４）＞
磁性シリカ粒子を含有する固相担体試薬（Ｅ−３）０．０２５ｍＬと０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で調製したＦＴ４（Ｆ１）濃度が１ｎｇ／ｄＬの標準ＦＴ４（Ｆ１）液０．０２５ｍＬ、及び標識試薬（Ａ−１０）０．０２５ｍＬを試験管に入れて混合し、試験管中で３７℃６分間反応させ、磁性シリカ粒子（Ｂ−１）上に抗Ｔ４抗体（Ｆ３）／Ｔ４（Ｆ１）複合体、又は抗Ｔ４抗体（Ｆ３）／ＰＯＤ標識Ｔ３（Ｆ２Ｃ）複合体を形成させた。反応後、試験管の外側からネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を１０秒間集め、試験管中の液をアスピレーターで除き、ネオジウム磁石を側面から十分に離し、生理食塩水０．５ｍＬを加えて磁性シリカ粒子を分散させて集磁後、アスピレーターで液を除く洗浄操作を３回行った。最後に、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）０．０７ｍＬと過酸化水素水（Ｌ−１）０．０７ｍＬとを同時に加え、３７℃で４３秒間発光反応させ、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）及び過酸化水素水（Ｌ−１）を添加後４３〜４５秒の平均発光量をルミノメーター［ベルトールドジャパン（株）製「Ｌｕｍａｔ ＬＢ９５０７」］で測定した。
磁性シリカ粒子を含有する固相担体試薬（Ｅ−３）０．０２５ｍＬと０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で調製したＦＴ４（Ｆ１）濃度が１ｎｇ／ｄＬの標準ＦＴ４（Ｆ１）液０．０２５ｍＬ、及び標識試薬（Ａ−１０）０．０２５ｍＬを試験管に入れて混合し、試験管中で３７℃６分間反応させ、磁性シリカ粒子（Ｂ−１）上に抗Ｔ４抗体（Ｆ３）／Ｔ４（Ｆ１）複合体、又は抗Ｔ４抗体（Ｆ３）／ＰＯＤ標識Ｔ３（Ｆ２Ｃ）複合体を形成させた。反応後、試験管の外側からネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を１０秒間集め、試験管中の液をアスピレーターで除き、ネオジウム磁石を側面から十分に離し、生理食塩水０．５ｍＬを加えて磁性シリカ粒子を分散させて集磁後、アスピレーターで液を除く洗浄操作を３回行った。最後に、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）０．０７ｍＬと過酸化水素水（Ｌ−１）０．０７ｍＬとを同時に加え、３７℃で４３秒間発光反応させ、ルミノール発光試薬（Ｋ−１）及び過酸化水素水（Ｌ−１）を添加後４３〜４５秒の平均発光量をルミノメーター［ベルトールドジャパン（株）製「Ｌｕｍａｔ ＬＢ９５０７」］で測定した。
免疫測定用キットを作成してから５．０時間以内のものを用いて測定した値を初期発光量、免疫測定用キットを４℃で１年間（３６５日）、４０℃で５日間又は４０℃で１０日間保管後のものを用いて測定した値を１年間、５日間又は１０日間保管後の発光量として、以下の計算式にて安定率を算出した。
安定率（％）＝Ｂ／Ａ×１００
（Ａ：初期発光量、Ｂ：１年間、５日間又は１０日間保管後の発光量）
安定率（％）＝Ｂ／Ａ×１００
（Ａ：初期発光量、Ｂ：１年間、５日間又は１０日間保管後の発光量）
＜本発明の免疫測定用キットの磁性シリカ粒子の分散性試験＞
１．０ｍｇの抗ＣＥＡモノクローナル抗体が固定化された磁性シリカ粒子（Ｂ１Ｆ３）を２ｍＬのイオン交換水に分散させ、口内径×胴径×全高＝φ１０．３ｍｍ×φ１２．０ｍｍ×３５ｍｍのガラス容器に入れ、１ｃｍ×１ｃｍ×１ｃｍのネオジウム磁石を側面につけて、磁性シリカ粒子を完全に集磁し、上清を除去し、ネオジウム磁石を側面から十分に離し、２ｍＬの免疫測定用試薬（Ｓ−１〜Ｓ−１０）または免疫測定用試薬（Ｈ−１〜Ｈ−３）を磁性シリカ粒子に噴きつけながら加え、３回のピペッティングにより混合した後、１０秒以内に走査型電子顕微鏡（型番ＪＳＭ−７０００Ｆ、日本電子株式会社）で５，０００〜２０，０００倍で撮影し、画像中の全粒子数に対する凝集した粒子数の割合を算出して以下の基準で分散性判定した。
○：凝集粒子が５％未満
△：凝集粒子が５％以上かつ２０％未満
×：凝集粒子が２０％以上
１．０ｍｇの抗ＣＥＡモノクローナル抗体が固定化された磁性シリカ粒子（Ｂ１Ｆ３）を２ｍＬのイオン交換水に分散させ、口内径×胴径×全高＝φ１０．３ｍｍ×φ１２．０ｍｍ×３５ｍｍのガラス容器に入れ、１ｃｍ×１ｃｍ×１ｃｍのネオジウム磁石を側面につけて、磁性シリカ粒子を完全に集磁し、上清を除去し、ネオジウム磁石を側面から十分に離し、２ｍＬの免疫測定用試薬（Ｓ−１〜Ｓ−１０）または免疫測定用試薬（Ｈ−１〜Ｈ−３）を磁性シリカ粒子に噴きつけながら加え、３回のピペッティングにより混合した後、１０秒以内に走査型電子顕微鏡（型番ＪＳＭ−７０００Ｆ、日本電子株式会社）で５，０００〜２０，０００倍で撮影し、画像中の全粒子数に対する凝集した粒子数の割合を算出して以下の基準で分散性判定した。
○：凝集粒子が５％未満
△：凝集粒子が５％以上かつ２０％未満
×：凝集粒子が２０％以上
表１から、実施例１〜１０の本発明の免疫測定用試薬である標識試薬（Ａ）を含む免疫測定用キットは、４℃で１年間保管後において保管後安定率が９２〜９７％と極めて高く、４０℃で５日間保管後でも７２〜８２％、４０℃で１０日間保管後でも４８〜５６％と高いことから、保存安定性に優れていることがわかる。
また、本発明の免疫測定用キットは、磁性シリカ粒子分散性の評価結果において、凝集粒子が５％未満と低く、比較用の免疫測定用キットを用いた場合に比べて、抗体が固定化された固相担体（ＢＦ）の分散性が優れていることが分かる。
したがって、本発明の免疫測定用試薬である標識試薬（Ａ）を含む免疫測定用キットを用いれば、固相担体が凝集することなく長期間保管後も安定して免疫測定を行うことができる。
また、本発明の免疫測定用キットは、磁性シリカ粒子分散性の評価結果において、凝集粒子が５％未満と低く、比較用の免疫測定用キットを用いた場合に比べて、抗体が固定化された固相担体（ＢＦ）の分散性が優れていることが分かる。
したがって、本発明の免疫測定用試薬である標識試薬（Ａ）を含む免疫測定用キットを用いれば、固相担体が凝集することなく長期間保管後も安定して免疫測定を行うことができる。
本発明の標識試薬は保存安定性が優れることから、本発明の標識試薬を用いた免疫測定方法は、酵素免疫測定法等の臨床検査に幅広く適用できる。また、本発明の試薬は、上記測定方法に用いるのに適したものであり、同様に、酵素免疫測定法の臨床検査薬として用いることができる。
Claims (6)
- 物質（ＦＣ）及び親水性タンパク質（Ｄ）を含有する免疫測定用試薬（Ｘ）であって、物質（ＦＣ）が物質（Ｆ）が酵素（Ｃ）により標識されてなる物質であり、物質（Ｆ）が測定対象物質（Ｆ１）、測定対象物質の類似物質（Ｆ２）及び測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）からなる群より選ばれる少なくとも１種の物質であり、前記測定対象物質が癌胎児性抗原、前立腺特異抗原又は遊離チロキシンであり、親水性タンパク質（Ｄ）が２５℃、ｐＨ７．０の水１００ｇに２．０ｇ以上溶解するタンパク質であり、親水性タンパク質（Ｄ）が親水性カゼインタンパク質（Ｄ１）であり、免疫測定用試薬（Ｘ）中の親水性タンパク質（Ｄ）の含有量が（Ｘ）の重量を基準として２〜６重量％である免疫測定用試薬（Ｘ）。
- 親水性タンパク質（Ｄ）がカゼイン加水分解物である請求項１に記載の免疫測定用試薬。
- 標識試薬（Ａ）及び固相担体試薬（Ｅ）を含む免疫測定用キットであって、標識試薬（Ａ）が請求項１又は２に記載の免疫測定用試薬（Ｘ）であり、固相担体試薬（Ｅ）が固相担体（Ｂ）の表面に物質（Ｆ）が固定化された固相担体（ＢＦ）を含有するものである免疫測定用キット。
- さらにルミノール発光試薬（Ｋ）及び過酸化物水溶液（Ｌ）を含む免疫測定用キットであって、酵素（Ｃ）がペルオキシダーゼである請求項３に記載の免疫測定用キット。
- 固相担体（Ｂ）が磁性シリカ粒子（Ｂ１）である請求項３又は４に記載の免疫測定用キット。
- 請求項３〜５のいずれか１項に記載の免疫測定用キットを使用する免疫測定方法。
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