JPH11513378A - ポリペプチドと生体適合性ポリマーとのコンジュゲート - Google Patents

ポリペプチドと生体適合性ポリマーとのコンジュゲート

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JPH11513378A JP9513363A JP51336397A JPH11513378A JP H11513378 A JPH11513378 A JP H11513378A JP 9513363 A JP9513363 A JP 9513363A JP 51336397 A JP51336397 A JP 51336397A JP H11513378 A JPH11513378 A JP H11513378A
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Abstract

(57)【要約】 本発明はポリペプチドのインビボでの機能を、有機化学合成により生産されたリガンドを有するグループ特異的吸着剤との相互作用によりポリペプチドを固定化し、生体適合性ポリマーを活性化し、この活性化生体適合性ポリマーを固定化ポリペプチドとコンジュゲーションし、その後吸着剤からコンジュゲートを溶出させることにより、当該ポリペプチドの露出した標的を保護し、その保護により改善する方法に関する。本発明はさらに本工程により得られるポリペプチドと生体適合性ポリマーとのコンジュゲートおよび当該コンジュゲートの薬剤としての使用に関する。とりわけ、ポリペプチドは第VIII因子、フォン・ウィルブランド因子または第XI因子である。この発明は特に、ポリペプチドが高比活性を有する第VIII因子で、生体適合性ポリマーとしてモノメトキシポリアルキレンオキシド(mPEG)を用いたコンジュゲートが望ましい。

Description

【発明の詳細な説明】 ポリペプチドと生体適合性ポリマーとのコンジュゲート 発明の分野 本発明は、有機化学合成により生産されたリガンドを有するグループ特異的吸 着剤へポリペプチドを固定化し、生体適合性ポリマーを活性化し、この活性化生 体適合性ポリマーを固定化ポリペプチドとコンジュゲーションし、その後吸着剤 からコンジュゲートを溶出させることにより、当該ポリペプチドの露出した標的 を保護してそのポリペプチドのインビボでの機能を改善する方法に関する。本発 明はさらに本方法により得られるポリペプチドと生体適合性ポリマーとのコンジ ュゲートおよび当該コンジュゲートの薬剤としての使用に関する。とりわけ、ポ リペプチドは第VIII因子、フォン・ウィルブランド因子または第IX因子である。 この発明は特に、ポリペプチドが高比活性を有する第VIII因子で、生体適合性ポ リマーとしてモノメトキシポリアルキレンオキシド(mPEG)を用いたコンジュゲー トが望ましい。発明の背景 ポリペプチドのインビトロでの安定性とインビボでの半減期 が生体適合性ポリマー(biocompatible polymer)への共有結合により増加するこ とは良く知られている（以下、コンジュゲーションまたは修飾と呼ぶ）。ポリペ プチド表面の修飾はまた、ポリペプチドが示す免疫原性を減らすという利点もあ る。 ペジル化(pegylation)、すなわち、いろいろなポリエチレングリコール（PEG ）をポリペプチドに結合させることは、例えばタンパク質のインビトロでの安定 性とインビボでの半減期を増加するために広く用いられている技術である。ペジ ル化については何年にもわたって多くの技術が提案された。このことはZalipsky ,S.et al in Poly（Ethylene Glycol）Chemistry，Biotechnical and Biomedica l Applications，Plenum，New York(1992),and Katre N.V.,Adv.Drug Deliv.Rev .,10,91-114(1993)に論及されている。 ある種のタンパク質ではこのコンジュゲーションの結果、活性や機能の低下が 認められ、その効果は修飾程度により増加する(Inada,Y.et al,Trends in Biote chnology,13,86-91(1995))。この問題を回避すべく結合をより選択的にする方法 が開発された。例えば、部位特異的突然変異がリコンビナントインターロイキン ー２(rIL-2)に適用された。特異的な標的はシステイン の挿入により創られる(Goodson,R.J.and Katre,N.V.，Bio/Technology 8,344-34 6(1990);Katre 1993,上を参照)。そのような手段は一般的には治療用タンパク質 には適用できない。なぜならばアミノ酸置換は分子の元々の性格を変えその結果 、問題が生じるからである。その代わりに、ポリマーはタンパク質の糖鎖形成部 位に直接結合させることができる。例えば、WO/94/29370(Enzon)で開示された第 IX因子(factor IX)がある。しかし、この場合、糖タンパク質を過ヨウ素酸ナト リウムと反応させたりガラクトースオキシダーゼにより酵素的に処理をしたとき に起こりうる炭化水素部分の酸化を伴う。このような状態は分子にとって有害で あることが多い。この開示された例では、コンジュゲーションしようとする糖鎖 形成部位は第IX因子のインビボで加水分解活性化の間に除去されてしまうペプチ ド配列に存在していた。それゆえ、生体適合性ポリマーは活性ポリペプチドの機 能に影響しない。 WO94/13322(Farmitalia Carlo Erba)には、特定のタンパク質（第１物質）の 機能に不可欠な部位の機能を損なわずに行われるペジル化が示されている。これ は第１物質の機能部位に特異的に結合しうる第２物質と接触させ、その部位を防 護するこ とにより達成される。さらに詳細には、特定のタンパク質を当該タンパク質に対 して特異的な親和性を有するリガンドを用いてレジンに固定化して、ペジル化を 行う。第２物質は例えば相補的な生物学的分子である。WO94/13322には、抗体（ 第１物質）―対応する抗原（第２物質）、特異的阻害剤（第１物質）―酵素（第 ２物質）、成長因子（第１物質）―対応するレセプター（第２物質）の対、また はこれらの対を逆にした対が例として開示されている。 しかし、医薬製造を意図したプロセスでは、生物学的に複雑な物質の使用を最 小限に抑えることが好ましい。これは主として、当該物質の生物化学的な均一性 および使用時の安定性の考証が厳密に要求されるからである。従って、有機化学 合成により製造されるアフィニティーリガンドを使用するのが望ましい。 DE3717210はバイオポリマー、好ましくは電荷を有するバイオポリマーの修飾 に関する。バイオポリマーを、例えばイオン交換吸着剤に固定化し、酵素や他の 生物化学的試薬などの試薬と反応させ反応生成物を得て、次いで反応生成物を吸 着剤から脱着させるというプロセスである。反応生成物は好ましくは制限酵素に より切断された核酸である。DE3717210では、吸着し た状態のバイオポリマーを利用してバイオポリマーと試薬の接触（露出）をより 良好にし、それにより修飾効率を上げている。しかし、インビボでのバイオポリ マーを機能上有利にする、露出した標的を保護することについてもバイオポリマ ーの活性を維持することについても開示されていない。DE3717210の発明は核酸 などの生物分子の特性のマッピング、実際上のプロセシングによる元来の性質の 変更、または放射性同位元素の結合などによる高分子の機能的実体(functional entities)の数の増大を目的にしたにすぎない。 治療用を意図した多くのタンパク質が、様々なペジル化技術を用いてコンジュ ゲーションされている（Francis,G.E．et al,in Stability of Protein Pharmac euticals/Series:Pharmaceutical Biotechnology 3,235-263(1992);Inada,Y.et al,Trends in Biotechnology,13,86-91(1995)）。多くの例は静脈内投与に関す る。しかし、m-PEGとアレルゲンとのコンジュゲートの皮下投与後の血漿、肺、 肝臓、脾臓への取り込みが開示され、m-PEGとアレルゲンとのコンジュゲートの 皮下投与による免疫療法が有効であることが立証されている(Dreborg,S.and Åk erblom,E.B.,Crit.Rew.Therap.Drug Carr. Sys.6(4),315-365(1990))。また、筋肉内投与はアデノシンデアミナーゼの臨床 試験で用いられた(Hershfield,M.S.et al,New Eng.J.Med.316,589-596(1987)。 また、少数ではあるが、ペジル化は経口投与でも有益であると主張されている。 経口投与のためのIgGのペジル化はMount Sinai School of MedicineのEP-A-0614 373に開示された。経口投与のための第VIII因子と第IX因子のペジル化はSakurag awa et al,Acta Med.Biol.,34(3),77-84(1987)とNippon Chemifar Companyの日 本特許出願番号No.44509/83に開示された。 第VIII因子は本質的に備わっている血液凝固に関与するタンパク質であり、リ ン脂質とカルシウムイオンの存在下で、酵素第IXa因子が酵素前駆体第X因子を最 終的にフィブリン塊を導く活性体、第Xa因子に変える反応の補因子である。ヒト の第VIII因子は約３００キロダルトンの単鎖分子として合成され構造的ドメイン A1-A2-B-A3-C1-C2からなる（Gitschier et al.,1984,Nature 312,p.326;Wood et al.,1984,Nature 312,p.330;Vehar et al.,1984,Nature 312,p.337;Toole et a l.,1984,Nature,312,p.342）。前駆体産生物はゴルジ体で２００キロダルトンと ８０キロダルトンの２つのポリペプチド鎖にプロセス され、２つの鎖は金属イオンの働きで結合を保ち、血液中に出現する(Kaufman e t al.,1988,J.Biol.Chem.,263,p.6352;Andersson et al.,1986,Proc.Natl.Acad. Sci.,83,p.2979)。第VIII因子のBドメインは第VIII因子の補因子機能に関して不 可欠であるとみられているのに対して、A,Cドメインは止血において役割を果た す別の高分子と相互作用する部位を持つ（Sandberg et al.,1993,Thrombos.Haem ostas.,69,p.1204 and Lind et al.,1995,Eur.J.Biochem.,232,p.19）。 フォン・ウィルブランド因子(vWf)は約２４０キロダルトンのジスルフィド結 合したサブユニットからなる多機能ポリマー血漿タンパク質である。これらのサ ブユニットは、約１メガダルトンから２０メガダルトンの分子量を有する多量体 の不均一な集団を形成する。１次止血におけるvWfの機能は高い剪断速度の状況 下で血小板の血管壁への接着を促進することにある。vWfはまた第VIII因子と共 有結合ではないが、強く結合する。正常ヒト血漿中で第VII因子とvWfは互いに複 合体を作って循環する。vWf第VIII因子をプロテアーゼによる分解から保護する という点で、第VIII因子分子の重要な安定化効果を有する（Koedam et al.,19 87,Doctoral Thesis,ICG Printing,Dordrecht,1986,p83;Hamer et al.,1986,Haemostasis,1987,58,p.223 ）。ヒトの第VIII因子のインビボでの半減期は通常１０〜１５時間である。vWf 欠乏の患者において、低下したvWfレベルは第VIII因子の放出の低下と第VIII因 子の分解速度の上昇に起因する第VIII因子レベルの低下を伴う。Tuddenham et a l.,1982,Br.J.Haematol.,52,p.259およびBrinkhous et al.,1985,Proc.Natl.Aca d.Sci.,82,p.8752はvWfの存在が第VIII因子のインビボでの残存に対して重要な 効果があることを示した。第VIII因子を血友病の犬に注入したときの半減期は７ 〜１０時間であったが、vWf欠乏犬に注入した後は約１時間であった(Brinkhous et al.,上を参照)。 第IX因子は上述の第IXa因子の酵素前駆体である。第IX因子はセリンプロテア ーゼで、ビタミンＫ依存凝固タンパク質の１つであり、分子量は約５５キロダル トンである(DiScipio et al.,1977,Biochemistry,16,p.698)。第IXa因子は他の 成分と特異的に相互作用して第X因子を活性化する（In:Haemostasis and Thromb osis,1994,vol.1,third edition,ed.Bloom A.et al.）。 上のパラグラフから明らかなように、第VIII因子はそれぞ れ特異的な機能を引き受けるいくつかの相互作用部位を有するタンパク質である 。それゆえ、第VIII因子を生物学的機能を充分保持したまま修飾するのは困難で ある。 ペジル化技術は以前に第VIII因子を含むタンパク質混合物に適用された。WO94 /15625(Enzon)に、修飾程度は測定不可能であるが、第VIII因子に対して１００ 倍モル過剰のmPEGを混ぜ、カルバミン酸（ウレタン）結合を利用して第VIII因子 をペジル化すると、マウスのインビボでの半減期を１３時間から５５時間に増加 させ得ることが開示されている。マウスにおける半減期は通常約１時間であると 考えられている。それゆえ、１３時間というのは異常に長い半減期である。その 上、最初の第VIII因子試料の極めて低い精製度（20-50IU/mgタンパク質）を考え ると、カップリング反応の間第VIII因子よりも他のタンパク質が優勢であったこ とを考慮しなければならない。低い精製度の第VIII因子試料の中に通常存在する 重要なタンパク質はフォン・ウィルブランド因子であり、それは第VIII因子の機 能を安定化させると共にコンジュゲーションプロセスの間、対応する機能部位の 保護に非常に良く貢献し得る。コンジュゲーション後、mPEGは、通常第VIII因子 を少しだけ含むタンパ ク質混合物中のどのタンパク質上にも存在し得る。第VIII因子を含むペジル化タ ンパク質混合物は静脈内投与に用いられた。しかし、薬品製造に要求される管理 条件として、最初に含まれる物質を充分に明らかにすることが不可欠である。 他のポリマーも第VIII因子のコンジュゲーションに用いられている。U.S.Pate nt 4,970,300にはデキストランコンジュゲートが第VIII因子の半減期を長くでき ることが開示されている。 ほとんどのカップリング技術でポリマー試薬はポリペプチドのリシン残基のε -アミノ基と反応する。この基はポリペプチドの表面全体に存在し、機能部位に 近接してのコンジュゲーションが生じる。この結果、ランダムカップリングによ って、活性や機能が破壊されることが多い。我々の経験では、凝集活性を有する B-ドメイン欠失リコンビナント第VIII因子のような非常に精製度の高い試料にこ のような技術を適用するとき、第VIII因子１分子当たり約5mPEGの修飾程度で活 性は著しく低下する。発明の概要 本発明の発明者は、ポリペプチドをカップリング反応前にグ ループ特異的吸着剤(group-specific adsorbent)に単に固定化し、その後、通常 の技術により脱着させることにより、コンジュゲートされたポリペプチドの比活 性が高度に維持され得ることを見いだした。これは全く驚くべきことである。な ぜならば、これまでは生物学的機能に重要なドメインの保護を達成するためには 、問題となっているポリペプチドに関して特異的に結合する性質を有する吸着剤 を使用することが必要と考えられていたからである。 修飾に用いる生体適合性ポリマーの利点は修飾の程度に依存することが多い。 ゆえに、高度の修飾、即ちポリペプチド１分子当たりの多数の生体適合性ポリマ ーが加水分解活性に対する効率的な防御のために要求されるのが普通である。本 発明では生体適合性ポリマーがより選択的に導入されるので、特異的活性は良く 維持される。こうして、本発明の発明者は第VIII因子に対する分解活性が認めら れるインビトロの環境下で、第VIII因子を分解から効率的に保護し得ることを見 い出した。この効果は第VIII因子当たりわずか4-5mPEGの修飾程度で達成され得 る。 本発明によればグループ特異的吸着剤の使用は先行技術に開 示された吸着剤に比べ経済的である。グループ特異的吸着剤の使用はまた治療薬 としてコンジュゲートを登録するときに有利である。 本発明の方法によると、特に生物学的利用能(bioavailability)を含む薬物動 態学的機能を改善することにより、またポリペプチドが示す免疫原性を減らせる ことにより、ポリペプチドのインビボでの機能を改善することができる。 それゆえ、本発明はポリペプチドの露出された標的を防護することにより当該 ポリペプチドのインビボでの機能を改善する方法に関する。本方法においては、 a)有機化学合成により製造されたリガンドを有するグループ特異的吸着剤との相 互作用によりポリペプチドを固定化し、 b)生体適合性ポリマーを活性化し、 c)固定化ポリペプチドと活性化した生体適合性ポリマーとをコンジュゲーション し、その後 d)吸着剤からコンジュゲートを溶出する。発明の詳細な説明 本発明では、相互作用部位という語は特定のポリペプチドの生物学的機能に必 要ないろいろな部位に関連する。 本発明では、露出された標的という語は、インビボで望ましくない反応を受け やすい問題となるポリペプチド上の外側の部位に関連する。例えば、抗原性を有 するエピトープや加水分解の開裂部位がある。ある種の加水分解開裂部位は相互 作用部位とも呼ばれる。 本発明は、例えば加水分解開裂や凝集などのインビボでの望ましくない反応の 影響を低下させることを可能にする一方で、ポリペプチドの生物学的機能に必要 な相互作用部位には影響しない。従来、これは不可能であった。このことは（リ コンビナント）第VIII因子のmPEGコンジュゲーションの適用により明らかになっ た。より詳細には、有機化学合成により製造されたリガンドを有するグループ特 異的吸着剤との相互作用によるポリペプチドの固定化により、ポリペプチド上の 相互作用部位は生体適合性ポリマーへのコンジュゲーションから保護される。そ の上、活性化された生体適合性ポリマーをポリペプチドの望みの外側の部位へコ ンジュゲーションすることにより、露出した標的はタンパク質分解酵素などの働 きから守られる。 本発明において、ポリペプチドは鎖中に少なくとも２０アミノ酸を有するタン パク質やオリゴペプチドを意味する。本発明 により産生されるポリペプチドのアミノ酸の数は30〜4,500の間で、好ましくは4 0〜3,000である。ポリペプチドはほ乳類、特にヒト由来か,またはリコンビナン トDNA技術により生産されたものであってもよい。本発明によりコンジュゲート され得るポリペプチドには凝集活性を表すポリペプチド、または凝集に対して補 助機能を有するポリペプチドが含まれる。ポリペプチドは完全長のものであって もよい。すなわち、アミノ酸の配列は一般的にほ乳類に見出せる配列および特に ヒトに見出せる配列に一致するアミノ酸配列であっても良い。ポリペプチドはま た１つ以上のアミノ酸が失われた完全長ポリペプチドの欠失誘導体であっても良 い。ポリペプチドは第VIII凝集因子、フォン・ウィルブランド因子(vWf)並びに それらの組合せ、または第IX凝集因子が適しており、第VIII凝集因子が好ましい 。ヒト血しょうに存在する完全長第VIII因子は約３００キロダルトンの分子量を 有する。ヒト血しょう由来の第VIII因子濃縮物はAndersson et alに記載された いくつかの断片化された完全に活性な第VIII因子型を含む（上を参照）。最も小 さい活性型は約１７０キロダルトンの分子量を有し金属イオンにより結合してい る約９０キロダルトンと約８０キロダルトンの２ つの鎖からなる。このことはPharmacia & Upjohn ABによるEP-A-0 197 901で論 及されている。それゆえ、本発明に従って生産される生物学的に活性な第VIII因 子は約１７０キロダルトンから約３００キロダルトンまでの範囲の分子量を有す るものが適切である。 Pharmacia Ab of Stockholm,Swedenは治療用第VIII因子濃縮物中の１７０キロ ダルトン血しょう第VIII因子型に対応したリコンビナント第VIII因子を開発した 。截形(truncated)リコンビナント第VIII因子分子はr-VIIISQと呼ばれ無血清培 地での細胞培養系でチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞により生産される。r -VIIISQの比活性は総タンパク質１mg当たり約15,000IU VIII:Cであった。r-VIII SQの構造と生化学はPharmacia ABに譲渡されたWO-A-91/09122に記載されている 。 本発明では、第VIII因子は血しょう第VIII因子またはリコンビナント第VIII因 子のどちらでもよい。第VIII因子がリコンビナントのとき、それは完全長の第VI II因子であるか、または好ましくは凝集活性を有する完全長の第VIII因子からの 欠失誘導体である。さらに好ましくは、欠失誘導体はリコンビナント第VIIISQ因 子(r-VIIISQ)である。ここで、欠失誘導体 はBドメインの全部または一部が失われているが凝集活性は残っている疑集第VII I因子と定義される。残りのドメインはアミノ酸リンカーと結合する。いろいろ なリンカーの構造の例はP.Lind et al,Eur.J.Biochem.,vol.232(1995)pp.19-27 に示されている。 本発明は多種の第VIII因子製造物中に生体適合性ポリマーを選択的に導入する のに使用することができて有益である。それゆえ、本発明はフォン・ウィルブラ ンド因子(vWf)であるキャリアタンパク質との共働によりすでに安定化している インビボでの血しょう第VIII因子をさらに安定化させるために用いることができ る。 最終生産物が明確になっているのは有利である。それゆえ、本発明のカップリ ング後の第VIII因子比活性は少なくとも約1,000IU/mg総タンパク質であり、少な くとも2,000IU/mg総タンパク質が適している。第VIII因子比活性は好ましくは5, 000〜20,000IU/mg総タンパク質の間であり、さらに好ましくは10,000〜17,000IU /mg総タンパク質の間である。 カップリング後の第VIII因子活性は少なくとも約1,000IU/mlであり、少なくと も2,000IU/mlが適している。第 VIII因子活性は好ましくは5,000から50,000IU/mlの間であり、さらに好ましくは 20,000〜40,000IU/mlの間である。 本発明の生体適合性ポリマーは、モノアルキルでキャッピングされたポリアル キレンオキサイドのホモポリマー、共重合体またはブロック共重合体からなるグ ループから選択される。生体適合性ポリマーは直鎖でも分枝があってもよい。モ ノアルキルでキャッピングされたポリアルキレンオキシドはポリエチレングリコ ールホモポリマーとポリプロピレングリコールホモポリマーからなるグループよ り選択されるのが適している。生体適合性ポリマーは好ましくはポリエチレング リコール(PEG)ホモポリマーである。PEGの分子量は約300〜20,000までで、この なかでも1,500〜10,000までが適しており、好ましくは3,000〜5,000までである 。 生体適合性ポリマーは交差誘導体化(cross derivatization)を防止すべく一端 がキャッピングされている。この目的のために適した基の例は直鎖または分枝鎖 の低級アルコキシ基であり、好ましくはモノメトキシ基である。当該発明の中で 特に好ましい生体適合性ポリマーはモノメトキシポリエチレングリコール(mPEG) である。 他の生体適合性ポリマーもまた考えられる。例えばデキストラン、ポリビニル ピロリドンとDLアミノ酸がある。 生体適合性ポリマーは共有結合が形成されるようにカップリング反応の前に活 性化されなければならない。この目的のため、ポリペプチドに接する生体適合性 ポリマーの終端には活性化されやすい水酸基が結合していなければならない。生 体適合性ポリマーを活性化する方法は、共有結合形成のために選択されたアミノ 酸に依存して多数ある。アミノ基へのカップリングに適したmPEG誘導体はmPEGス クシニイミジルスクシネート、mPEGスクシニイミジルスクシンアミド、mPEGスク シニイミジルプロピオネート、mPEGスクシニイミジルカーボネート、カルボキシ メチル化されたmPEGスクシニイミジルエステル、mPEGオキシカルボニルイミダゾ ール、mPEGニトロフェニルカーボネート、mPEGトリクロロフェニルカーボネート 、mPEGトレシレート(最後のものはNilsson K.,Mosbach K.,Methods in Enzymolo gy,Vol104,pp56-69(1984)),(ここに挙げた総ての試薬はShearwater Polymer,Inc .,Huntsville,AL,USAで市販されている),mPEG無水マレイン酸並びにmPEG無水メ チルマレイン酸(Garman A.,Kajindjian S.B.,FEB Vol223:2,pp361-365)及び mPEGコハク酸の混合酸無水物、mPEG酢酸またはmPEGプロピオン酸である(Dreborg S.and Akerblom E.,上を参照)。 システイン残基はmPEGマレイミド、mPEGビニルスルフォン及びmPEGオルトピリ ジルジスルフィドとコンジュゲートしうる（Sheawater Polymers,Inc.,Huntsvil le,AL,USAが市販）。アルギニンのグアニジノ基のコンジュゲーションに適した 試薬はフェニルグリオキサールのmPEG誘導体である(Zalipski上を参照)。 炭化水素は最初に酸化されるに違いないのでアルデヒド基が存在しmPEGヒドラ ジドとコンジュゲートしうる(Zalipski上を参照)。 カップリング手順はアミノ酸がコンジュゲーションされるのに適したpHで行わ れる。この際、生体適合性ポリマーの反応性がpHに依存することと同様に、ポリ ペプチド全体として適したpHがあることも考慮されなければならない。それ故、 通常カップリングのためのpHは約７から約８の間にある。約７はカップリング過 程の延長を避けるための下限値であり、また約８はポリペプチドに対して穏和な 条件を与える上限値である。このpH範囲はリシンの関与するコンジュゲーション に適して いる。それゆえ、本出願の実施例では、そのような穏和な条件下で第VIII因子活 性を有する物質をコンジュゲートした。この範囲外のpH値もときには適している 。例えば、システインが関与するコンジュゲーションは約７より下のpHが適して いるが、アルギニンは約５．５から約９．３のpH範囲が適している。 カップリング手順は０℃より上の温度で行われ、約５℃から約４０℃が適して おり、好ましくは１０℃から３０℃である。ここでも、生体適合性ポリマーのへ 反応温度が影響するのと同じく、ポリペプチド全体に適した温度も考慮しなけれ ばならない。本出願の実施例では、すべてのカップリング過程は室温で行われた 。 本発明で用いられた吸着剤は固定化すべきポリペプチドに関してはグループ特 異的(group-specific)である。グループ特異的吸着剤はいろいろなポリペプチド に対して親和性を有する。とりわけ、その結合は比較的弱い場合が多く、その溶 出は、単一かまたは非常に少数のポリペプチドに結合する単一特異的(mono-spec ific)吸着剤の場合より穏和な条件で行われる。適切なグループ特異的な吸着剤 はJansson.J.-C.et al,Protein Purification,Principles.に例示されている。High Resolution Methods,and Ap plications,VCH Publishers,pp.274-285(1989)が参考文献として載っている。本 発明の吸着剤はさらに有機化学合成により製造されたリガンドを有することを特 徴とする。この基準に適合した吸着剤の例として、一般的にタンパク質の吸着に 使用できるクロマトグラフィー用樹脂がある。クロマトグラフィー用樹脂には例 えば、陰イオンおよび陽イオン交換基、スルフヒドリル基、固定化金属アフィニ ティークロマトグラフィー(IMAC)基、直鎖若しくは分枝鎖で飽和若しくは不飽和 の炭化水素鎖および芳香族基のようなリガンドを結合させた生体適合性基質があ る。混合機能リガンド、例えば、アミノアルキルまたはジメチルアミノプロピル カルバミルペンチルのようなイオン性及び疎水性部分を有するリガンドも有用で ある。これらの２つのリガンドは血しょう由来第VIII因子の精製に有益であると 報告されている。これらはMorgenthaler et al,Thromb.Haemostas.47(2),124ff. (1982)and Te Booy,M.P.W．M.,et al,J.Chrom.503,103-114(1990),にそれぞれ開 示されている。アミノアルキルの好ましい例はアミノヘキシルである。有機化学 合成により合成されたペプチド、リン脂質のようなよ り複雑なリガンドも使用しうる。当業者ならば、有機化学合成により合成された グループアフィニティーリガンドにはいろいろな物質が含まれることがわかる。 反応性のトリアジンベースの繊維染料は、キナーゼやヒドロゲナーゼのようない ろいろな酵素の吸着剤として有用である。また、有機化学合成により合成された 糖誘導体、ヌクレオチドやペプチド、それらの類似体も有益である（Dechow,F.J .,Separation and purification techniques in biotechnology,Noyes Publicat ions,Park Ridge,NJ,USA,p.440-443(1989)）。 本発明での使用に適したリガンドにはさらに陰イオン交換基があり、第４アミ ノエチル(QAE),トリメチルアミノエチル(TMAE),第４アミノメチル(Q)のように強 いものが好ましく,第４アミノメチル(Q)はさらに好ましい。リガンドはさらに基 質に強く結合しうる、またアルキルアミン、ヘキシルアミン、ジアミノジプロピ ルアミン、エチルアミノスクシンアミド(Persson &Lagerstrom,in Packings and stationary phases in chromatographic techniques,Unger,K.K.,ed.,Marcel Dekker Inc.1990,p.754)のようなスペーサーを介して,さらにまたリガンドが 結合する分枝した触手(tentacle)（Merck of Germany 製造のFractogel TMEMD Merck of Germanyが好例である）を介して強く結合しう る。 当該カップリング手順の後、ポリペプチドのコンジュゲートは通常の技術で溶 出される。この際、ポリペプチドのコンジュゲートの分解を避けるために、物理 化学的条件を考慮することが必須である。カップリング経路がある範囲内のpHで 不安定なコンジュゲーション結合に関わるならば、これを避けなければならない 。 カップリング手順の中で、ポリペプチドが吸着剤上に固定化されているとき、 ポリペプチドを可溶性ブロッキング試薬と接触させることにより、ポリペプチド の別の部位がコンジュゲートされるのを防止できる。そのようなブロッキング試 薬は有機化学合成により合成すべきで、さらに、ポリマーに結合した上記定義の リガンドのいずれとも結合するべきである。このポリマーは例えば、モノアルキ ルでキャッピングされたポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンオキシドの共 重合体またはブロック共重合体、ポリエチレングリコールホモポリマーまたはポ リプロピレングリコールホモポリマーから選ばれる。ブロッキング試薬はそれ自 体がポリペプチドに対する特異的親和性を有 することがある。 溶出後、可溶性ブロック試薬は適切な化学的条件下で脱着される。例えば、ブ ロッキング試薬が疎水結合で吸着しているならば、イオン強度を下げるか又は単 純に温度を下げることにより脱着できる。可溶性ブロッキング試薬はその後、通 常の条件でゲル浸透クロマトグラフィーによりコンジュゲートから分離される。 本発明に用いる吸着剤の基質（matrix）として、生物学的分子と適合すること が知られている市販のレジンが使用できる。基質としていろいろな強親水性基質 を選択しうる。強親水性基質には例えばPharmacia Biotech of Uppsala,Sweden により市販されている多様なSepharoseTMのようなアガロース基質、Tosoh Corp. of Tokyo,Japanにより市販されているTSK-GELのような有機ポリマー基質、PerSe ptive Biosystems of Boston,USAにより市販されている高度に多孔性の有機ポリ マー基質がある。また、膜基質も適している。例えば、Sartorius of Germanyに より市販されているSartobindTM、Millipore of USAにより市販されているMemSe pTMがある。アガロース基質が基質として好ましい。本発明に適したアガロース 基質は、 SepharoseTMに加え、Kem-EnTec A/S of Copenhagen,Denmarkにより売られている MinileakTM、Bio-Rad,of Brussels,Belgiumにより売られているBio-Gel Aがある 。基質は早い速度(FF)とそれがもたらす高い生産力を持つ架橋されたものが好ま しい。本発明のクロマトグラフィーはQ SepharoseTM FF gelにより行われること がさらに好ましい。さらに、オリゴエチレングリコール、グリシジルメタクリレ ート、FractogelTM（Merck of Germanyが市販）のようなペンタエリトロールジ メタクリレート、セルロースおよび多孔性ガラスも有益である。 本発明方法で得られるポリペプチドと生体適合性ポリマーのコンジュゲートは 新規である。本方法により、コンジュゲーション後のポリペプチド活性は当該コ ンジュゲーション前の少なくとも30％、好ましくは少なくとも50％、さらに好ま しくは少なくとも70％を維持できる。 本発明方法で得られるポリペプチドと生体適合性ポリマーのコンジュゲートは 医薬として用いることができる。特に、本方法により生産された第VIII因子、フ ォン・ウィルブランド因子、これらの組合せまたは第IX因子のいずれか１つと生 体適合性ポリマーのコンジュゲートは医薬として使用できる。第 VIII因子と生体適合性ポリマーのコンジュゲートの医薬としての使用は、コンジ ュゲーションの程度がモノアルキルでキャッピングされた PEG/第VIII因子の分 子比が１〜１５のときに有益で、好ましくは２〜１０で、さらに好ましくは３〜 ７である。この場合、リコンビナントDNA技術により産生された第VIII因子のコ ンジュゲートが適しており、凝集活性を有する完全長の第VIII因子のリコンビナ ント欠失誘導体が好ましく、リコンビナント第VIIISQ(r-VIIISQ)の欠失誘導体は さらに好ましい。 本発明のポリペプチドコンジュゲートは皮下、筋肉内、皮内または静脈内に投 与するのが適している。特に第VIII因子のコンジュゲートは血友病Aの治療、特 に皮内、筋肉内、皮下または静脈内投与による治療用医薬の製造に用いられる。 さらに、vWfコンジュゲートはフォン・ウィルブランド病の治療用、特に皮内、 筋肉内、皮下または静脈内投与による治療用医薬に用いられる。本発明に従って それぞれコンジュゲートさせた第VIII因子とフォンウィルブランド因子は組み合 わせて使うこともできる。また、第IX因子コンジュゲートも血友病Bの治療、特 に皮内、筋肉内、皮下または静脈内投与による治療用医 薬の製造に用いられる。 本発明は、さらに本方法に従って生産される第VIII因子と生体適合性ポリマー のコンジュゲートの皮内、筋肉内、皮下または静脈内投与による血友病Aの治療 法に関する。実施例 以下の実施例は例示を目的に挙げたに過ぎず、請求の範囲で明示された本発明 の範囲をいかなる意味でも限定的に解釈するためのものではない。 実施例１リコンビナント第VIII因子の調製 リコンビナント第VIIISQ(r-VIIISQ)因子の生産は本質的には特許WO-A-9109122 、実施例１〜３に記載されたように行った。DHFR欠損CHO細胞株(DG44N.Y)にr-VI IISQ遺伝子を含む発現ベクターとジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を含む発現ベ クターをエレクトロポレイションにより導入した。選択培地による選択後生き残 ったコロニーを、メトトレキサート量を段階的に増加させた増殖により増幅した 。生じたコロニーの上清はコロニー毎に第VIII因子活性を測定してスクリーニン グした。産生クローンを選択し、ついで明示の無血清培地で浮遊増殖さ せ、最後に大量培養により増やした。ある時間経ったところで上清を集め以下に 述べるように精製した。 コンディションドメディウムをフィルトレーションにより浄化し、pHを調整し 、次いで、ろ液をS SepharoseTM FFカラム（カラム容積は3L）にのせた。洗浄後 、第VIII因子を5mMCaCl2と0.02% TritonTM X-100を含む塩バッファーで溶出した 。この陽イオン交換クロマトグラフィー過程は2〜8℃で行った。S SepharoseTM FF過程で得られた溶出液（S-溶出液）はさらに精製するまで凍結した。 700mLのS-溶出液を融解させ室温に戻した。リン酸トリ-n-ブチル(TNBP)とTrit onTM X-100をそれぞれ最終濃度0.3%(V/V)、1%(V/V)で30分間インキュベーション することによりウィルスを不活性化した。260mLのモノクローナル抗体(mAb)イム ノアフィニティーカラムを、ウィルス不活性化薬品を前述の濃度で含むS-溶出液 を用いて平衡化した。次いで、第VIII因子溶液をmAbカラムにのせ、その後洗浄 した。溶出は50%のエチレングリコールを含むバッファーで行った。 Q SepharoseTMカラムは高濃度の塩化ナトリウムでプレ平衡化し、次いでイム ノアフィニティーカラムの溶出に用いたのと 同じ組成のバッファーで平衡化した。mAb溶出液をのせ平衡化バッファーで洗浄 し、次いで生理的イオン強度のバッファーで洗浄した。NaCl濃度を0.6Mに上げる ことによりカラムから溶出した。Q-カラムの洗浄、溶出には界面活性剤は使用し なかった。ブチルSepharoseTM 4FFカラムを50mMヒスチジン、1.4M NH4Ac、50mM C aCl2と0.02% TweenTM 80を含むバッファーpH6.8で平衡化した。NH4Acを最終濃度 1.0Mになるように、TweenTM80を最終濃度0.02%になるようにQ-溶出液に添加した 。この溶液を60cm/hの直線流速でブチルゲルカラムにのせた。次いで、カラム容 積の５倍量の平衡化バッファーでカラムを洗浄し、次いで、50mMヒスチジン、0. 5M NH4Ac、50mM CaCl2と0.02% TweenTM 80を含むpH6.8のバッファーを用いて35c m/hの直線流速で溶出した。この調製品の精製度は非常に高く12,000〜17,000IU/ mgタンパク質の比活性を有する。分析 実施例1〜8で第VIII因子活性は他の方法が述べられていない限り色素アッセイ （Chromogenix AB of Molndal,Sweden）で行った。第VIII因子の量はA280で分光 光度学的に,およびアミノ酸分析により決定した。ポリペプチドに結合したmPEG の量はプロトンNMR法（Dreborg,S.and Åkerblom,E.B.,Crit.Rew.Therap.Drug C arr.Sys.6(4),315-365(1990)）により測定した。 実施例２（比較のための実施例）mPEG コハク酸の混合無水物とコンジュゲーションされる第VIII因子 実施例１に従って調製されたHIC溶出液のバッファー組成は、あらかじめ0.25M hepes,4mM CaCl2,pH7.8の組成のバッファーで平衡化されたSuperose １２カラ ム（Pharmacia Biotech of Uppsala,Swedenが市販）を用いたゲル浸透クロマト グラフィーにより置換した。r-VIIISQ溶液の一部に35、60または100倍モル過剰 （r-VIIIに対して）のmPEGコハク酸の混合無水物(MW3,000)を添加した。混合液 を室温において回転装置上で1.5時間反応させた。過剰のmPEGコハク酸を除去し 、不均一なrVIIIコンジュゲートをサイズに従って分離するために、今度はSuper ose６カラム（Pharmacia Biotech of Uppsala，Swedenが市販）を用いて、ゲル 浸透クロマトグラフィーを行った。各々のカップリング反応でタンパク質ピーク の最初の半分と２番目の半分を別々に分析した（表１にプール１とプール２とし て示した）。表１はr-VIIISQとmPEGコハク酸混合無水 物とのコンジュゲーションの結果を示す。 表１から明らかなように、rVIIIの比活性はこのコンジュゲーション程度の低 い条件でも劇的に低下した。 実施例３mPEG コハク酸混合無水物との結合の間のQセファロースFFゲルに吸着した第VIII 因子 第VIII因子分子上の負電荷に囲まれた反応性のリシンは、陰イオン交換ゲル上 に第VIII因子が吸着しているのでmPEGとのコンジュゲーションから保護された。 50mM L-ヒスチジン,0.15M NaCl,4mMCaCl2,pH6.5の組成のバッファーで平衡化さ れたQ SepharoseTM FF（Pharmacia Biotech of Uppsala，Swedenが市販）を詰め たカラムを第VIII因子の吸着に用いた。実施例１に従って調製されたHIC溶出液 をカラムにのせた。 mPEGカップリングのための適当な条件を得るために、mPEGを添加する前にカラム を0.25M hepes,4mM CaCl2,pH7.8のバッファーで洗浄した。ゲルを反応容器に移 し、mPEGコハク酸混合無水物(MW 3,000)を、表２に示した第VIII因子に対するモ ル過剰に対応する量をスラリーに添加した。反応は回転させながら１．５時間行 った。カラムを再度ゲル詰めし、rVIIIコンジュゲートを50mM L-ヒスチジン,0.6 M NaCl,4mM CaCl2,pH6.8バッファーで溶出した。ゲルの量当たりのr-VIIISQ添加 量を一定にして、４回の調製を行った。総ての過程を室温で行った。表２はQ Se pharoseTM FFゲルに吸着したr-VIIISQコンジュゲートの結果を示す。 表２から明らかなように、r-VIIISQコンジュゲートの比活性は実施例２のr-VIII SQコンジュゲートに比較して有意に高く維持されている。 実施例４mPEG トレシレート(tresylate)とのカップリングの間にQセファロースFFゲルに吸 着されたFVIII この実施例でのr-VIIISQのQセファロースFFゲルとの吸着、カップリング、溶 出の総ての過程は実施例３と同様に行った。mPEGトレシレート(MW 5,000)を第VI II因子のコンジュゲートに用いた。表３は発明に従ってQ SepharoseTM FFゲル上 に吸着されたr-VIIISQとmPEGトレシレートのコンジュゲートでの結果を示す。 この場合の比活性は、おそらくmPEGの分子量が高いためか、実施例３より若干低 い。 実施例５mPEG コハク酸混合無水物とのカップリングの間に触手（tentacle）陰イオン交換 ゲルに吸着された第VIII因子 FractogelTM EMD TMAE650（Merckが販売）を詰めたカラム をr-VIIISQの吸着に用いた。総ての過程は実施例３のように行った。表４は発明 に従って触手陰イオン交換ゲル上に吸着されたr-VIIISQとmPEGコハク酸混合無水 物のコンジュゲートでの結果を示す。 実施例６mPEG とコンジュゲートした第VIII因子のトロンビンによる活性化 r-VIIISQコンジュゲートのトロンビンによる活性化は当業者に良く知られたイ ンビトロのアッセイにより行った。実施例３に従って調製した試料で修飾程度が r-VIIISQ当たり4mPEGである試料をアッセイに用いた。r-VIIISQコンジュゲート はヒトトロンビンにより量依存的に活性化された。続いて、不活性化が起こった 。図１はr-VIIISQコンジュゲート１ユニット当たり１NIHユニットのトロンビン を添加したときの活性変化 のカーブである。Mikaelsson et al.,1983.Blood 62,p1006に従い行う１段階凝 固法を反応混液から採取した試料の迅速なアッセイに用いた。１分以内で30倍の 活性が得られ、次いで不活性化した。トロンビンで得られた活性化―不活性化パ ターンは第VIII因子とトロンビンとの相互作用の研究の報告と適合する(Fulcher et al.,1983,Blood,61,p.807,Andersson et al.,1986,Proc,Natl.Acad.Sci.,83 ,p.2979,Eaton et al.,1986,Biochemistry,25,p.505,Rotblat et al.,1985,Bioc hemistry,24,p.4294)。 実施例７ブタ組織抽出液中でのmペジル化(mPEGlation)第VIII因子の安定性試験 皮下環境を表した溶液中で第VIII因子の安定性に対するmPEGコンジュゲーショ ンの影響を評価するために、ブタ組織抽出液を用いたインビトロ試験を行った。 mPEGと第VIII因子のコンジュゲートを実施例３に記載したように２つ調製し、抽 出液中でインキュベートし、一部分について０、２、４、６及び２４時間で色素 アッセイを用いて凝集活性を調べた。最初の６時間はコンジュゲーション程度は 残存活性と相関した。 表５と図２はmPEGコンジュゲーションが有意に第VIII因子の安定性を高めるこ とを示している。 実施例８カニクイサル(cynomolgus monkey)中でのmPEG化第VIII因子の生物学的利用能試 験 インビボでの第VIII因子の安定性に対するmPEGコンジュゲーションの影響を評 価するために、薬物動態学試験を行った。第VIII因子とmPEGのコンジュゲート調 製試料を２つ、実施例３のように生産し、それらの比活性を表６に示すように決 定した。カップリング手順で均一性の高い修飾物質を得るために、調製品の分画 をゲル浸透クロマトグラフィーを用いて２回行った。19mM L-ヒスチジン、0.31M NaCl,3.4mMNaCl2,0.02% Tween80,pH7.0で平衡化したSuperdex200PGXK16/60 カラ ム(Pharmacia Biotech of Uppsala,Swedenが市販)を用いた。２回目のゲル浸透クロマトグラフ ィーの前に第VIII因子溶液は加圧滅菌したCentriplus30 コンセントレイター； 遠心限外濾過器（カットオフ30キロダルトン、Amicon Inc.MA,USAが市販）で濃 縮した。濃縮は2,500gで45分間３回行った。２回目のゲル浸透クロマトグラフィ ー後に得られたプール分画は次いで最終製剤と同じバッファー、すなわち、19mM L-ヒスチジン、0.31MNaCl,3.4mMCaCl2,0.02%Tween80,17.5mMスクロース，pH7.0 で希釈した。タンパク質溶液は最後には0.22μm Millex GVフィルター（Millipo re,MA,USAが市販）で濾過し、加圧滅菌した瓶に詰めた。溶液は使用時まで-70℃ で保存した。 ６匹の雌カニクイサルに対して別々の時期に１キログラム当たり250IUの調製 試料１を静脈内投与し、また１キログラム当たり1,500IUの調製試料１および調 製試料２を皮下投与した。溶液は総て投与前に注射のために水で倍に希釈した。 皮下投与の注射部位は動物の左または右背部、静脈内投与の注射部位は左または 右橈側皮静脈(cephalic vein)であった。血液サンプルは総ての動物から大腿静 脈(femoral vein)の穿刺を通して抗凝固剤としてクエン酸ナトリウム（総容積の 10％）の入った チューブに集めた。サンプルは注射後以下に挙げる時間に集めた。 静脈内投与：0（投与前）,0.25,1,2,4,8,24,30,48時間 皮下投与：0（投与前）,3,6,9,12,15,24,30,48時間 コンジュゲーションしていない第VIII因子の薬物動態学試験も同じ種を用いて別 々に行った。投与量、投与方法と結果（平均（±標準偏差(SD)）を表６に示す。 ここでAUCは血しょう中濃度−時間曲線の下の面積を示す。 表６から明らかなように、どちらの第VIII因子とmPEGのコンジュゲートの調製 品も皮下投与した場合、コンジュゲーションしていないr-VIIISQの皮下投与に比 べ顕著に高い生物学的利用能を示した。Student's t検定による統計学的分析に よりその差は有意であることがわかった。
【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年１２月８日 【補正内容】 請求の範囲 １． ポリペプチドの露出された標的を保護することにより当該ポリペプチドの インビボでの機能を改良する方法であって a)有機化学合成により製造したリガンドを有するグループ特異的吸着剤との相互 作用によりポリペプチドを固定化し、固定化ポリペプチドの相互作用領域内また は近接している反応性のアミノ酸にポリマーがカップリングするのを防止し、 b)生体適合性ポリマーを活性化させ、 c)活性化した生体適合性ポリマーを固定化ポリペプチドの外側の部位とコンジュ ゲーションさせ、その後 d)吸着剤からコンジュゲートを溶出させる ことを特徴とする前記方法。 ２． ポリペプチドが凝固活性を持ちまたは凝固機能を補佐するものであること を特徴とする、請求項１に記載の方法。 ３． ポリペプチドが第VIII因子、フォン・ウィルブランド因子もしくはそれら の組合せまたは第IX因子の１つであることを特徴とする請求項２に記載の方法。 ４． ポリペプチドが完全長の第VIII因子からの欠失誘導体で あって凝固活性を有することを特徴とする請求項３に記載の方法。 ５． 第VIII因子の欠失誘導体が欠失誘導体リコンビナント第VIIISQ因子(r-VII ISQ)であることを特徴とする請求項４に記載の方法。 ６． 第VIII因子の比活性が、固定化前は少なくとも総タンパク質1mg当たり2,0 00IUであることを特徴とする請求項３から５のいずれか１つに記載の方法。 ７． 第VIII因子の比活性が固定化前は総タンパク質1mg当たり5,000から20,000 IUの範囲にあることを特徴とする請求項６に記載の方法。 ８． 第VIII因子の活性が固定化前は少なくとも2,000IU/mlであることを特徴と する請求項３から７のいずれか１つの請求項に記載の方法。 ９． 第VIII因子の活性が固定化前は5,000から50,000IU/mlの範囲にあることを 特徴とする請求項８に記載の方法。 10． 生体適合性ポリマーがモノアルキルでキャッピングされたポリアルキレン オキシドのホモポリマー、共重合体又はブロック共重合体からなる群より選ばれ たものであることを特徴と する請求項１から９のいずれか１つの請求項に記載の方法。 11． モノアルキルでキャッピングされたポリアルキレンオキシドがポリエチレ ングリコール・ホモポリマーとポリプロピレングリコール・ホモポリマーからな る群より選ばれたものであることを特徴とする請求項１０に記載の方法。 12． モノアルキルでキャッピングされたポリアルキレンオキシドがモノメトキ シ・ポリエチレングリコール(mPEG)であることを特徴とする請求項１１に記載の 方法。 13． リガンドが陰イオン若しくは陽イオン交換基、スルフヒドリル基、固定化 金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)基または直鎖の若しくは分枝した 、飽和もしくは不飽和の炭化水素鎖若しくは芳香族基からなる群より選ばれたも のである請求項１から12のいずれかに記載の方法。 14． 陰イオン交換基が第４アミノメチル、第４アミノエチル及びトリメチルア ミノエチルまたはそれらの混合物からなる群より選ばれたものである請求項１３ に記載の方法。 15． 活性化モノメトキシ・ポリエチレングリコール(mPEG)からなる群から選ば れた試薬によりポリペプチドのアミノ基に共有結合が形成されることを特徴とす る請求項１から14のいずれ かに記載の方法。 16． 活性化されたモノアルキル-キャッピングポリアルキレンオキシドがmPEG- トレシレートとmPEGコハク酸混合無水物からなる群から選ばれたものであること を特徴とする請求項１５に記載の方法。 17． 請求項１から16のいずれか１の請求項に記載の方法により得られた生体適 合性ポリマーとポリペプチドのコンジュゲート。 18． コンジュゲーション後に維持されるポリペプチドの活性が当該コンジュゲ ーション前の活性の少なくとも30%であることを特徴とする請求項17に記載のコ ンジュゲート。 19． コンジュゲーション後に維持されるポリペプチドの活性が当該コンジュゲ ーション前の活性の少なくとも50%であることを特徴とする請求項18に記載のコ ンジュゲート。 20． 請求項３から16のいずれか１つの請求項に記載の第VIII因子、フォン・ウ ィルブランド因子、それらの組合せまたは第IX因子と生体適合性ポリマーとのコ ンジュゲートであって、薬剤として使用されるコンジュゲート。 21． 請求項20に記載の欠失誘導体リコンビナント第VIIISQ 因子(r-VIIISQ)と生体適合性ポリマーのコンジュゲートであって、コンジュゲー ション程度がモノアルキルでキャッピングされたPEG/r-VIIISQ分子比が２から15 の範囲にあるコンジュゲート。 22． 請求項３から16のいずれか１つの請求項に記載の第VIII因子、フォン・ウ ィルブランド因子、それらの組合せまたは第IX因子と生体適合性ポリマーとのコ ンジュゲートの血友病A、フォン・ウィルブランド病または血友病Bの治療用薬剤 の生産への使用。 23． 請求項22に記載の第VIII因子、フォン・ウィルブランド因子、それらの組 合せまたは第IX因子と生体適合性ポリマーとのコンジュゲートの皮下、筋肉内ま たは皮内投与への使用。 24． 請求項22に記載の第VIII因子、フォン・ウィルブランド因子、それらの組 合せまたは第IX因子と生体適合性ポリマーとのコンジュゲートの静脈内投与への 使用。 25． 請求項３から16のいずれか１つの請求項に記載の第VIII因子と生体適合性 ポリマーのコンジュゲートの皮下、筋肉内、皮内または静脈内投与による血友病 Aの治療法。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＵ，ＢＧ ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＨＵ， ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＸ，ＮＯ，Ｎ Ｚ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＵＡ ，ＵＳ，ＶＮ (72)発明者 スメツズ，アンナ−リーサ スウエーデン国、エス−191 39・ソーレ ンチューナ、テーゲルハクスベーゲン・41 (72)発明者 オーケルブロム，エバ スウエーデン国、エス−756 52・ウプサ ラ、タリオクスベーゲン・15

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １． ポリペプチドの露出された標的を保護することにより当該ポリペプチドの インビボでの機能を改良する方法であって a)有機化学合成により製造したリガンドを有するグループ特異的吸着剤との相互 作用によりポリペプチドを固定化し、 b)生体適合性ポリマーを活性化させ、 c)活性化した生体適合性ポリマーを固定化ポリペプチドの外側の部位とコンジュ ゲーションさせ、その後 d)吸着剤からコンジュゲートを溶出させる ことを特徴とする前記方法。 ２． ポリペプチドが凝固活性を持ちまたは凝固機能を補佐するものであること を特徴とする、請求項１に記載の方法。 ３． ポリペプチドが第VIII因子、フォン・ウィルブランド因子もしくはそれら の組合せまたは第IX因子の１つであることを特徴とする請求項２に記載の方法。 ４． ポリペプチドが完全長の第VIII因子からの欠失誘導体であって凝固活性を 有することを特徴とする請求項３に記載の方法。 ５． 第VIII因子の欠失誘導体が欠失誘導体リコンビナント第VIIISQ因子(r-VII ISQ)であることを特徴とする請求項４に記載の方法。 ６． 第VIII因子の比活性が、固定化前は少なくとも総タンパク質1mg当たり2,0 00IUであることを特徴とする請求項３から５のいずれか１つに記載の方法。 ７． 第VIII因子の比活性が固定化前は総タンパク質1mg当たり5,000から20,000 IUの範囲にあることを特徴とする請求項６に記載の方法。 ８． 第VIII因子の活性が固定化前は少なくとも2,000IU/mlであることを特徴と する請求項３から７のいずれか１つの請求項に記載の方法。 ９． 第VIII因子の活性が固定化前は5,000から50,000IU/mlの範囲にあることを 特徴とする請求項８に記載の方法。 10． 生体適合性ポリマーがモノアルキルでキャッピングされたポリアルキレン オキシドのホモポリマー、共重合体又はブロック共重合体からなる群より選ばれ たものであることを特徴とする請求項１から９のいずれか１つの請求項に記載の 方法。 11． モノアルキルでキャッピングされたポリアルキレンオキ シドがポリエチレングリコール・ホモポリマーとポリプロピレングリコール・ホ モポリマーからなる群より選ばれたものであることを特徴とする請求項10に記載 の方法。 12． モノアルキルでキャッピングされたポリアルキレンオキシドがモノメトキ シ・ポリエチレングリコール(mPEG)であることを特徴とする請求項11に記載の方 法。 13． リガンドが陰イオン若しくは陽イオン交換基、スルフヒドリル基、固定化 金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)基または直鎖の若しくは分枝した 、飽和もしくは不飽和の炭化水素鎖若しくは芳香族基からなる群より選ばれたも のである請求項１から12のいずれかに記載の方法。 14． 陰イオン交換基が第４アミノメチル、第４アミノエチル及びトリメチルア ミノエチルまたはそれらの混合物からなる群より選ばれたものである請求項13に 記載の方法。 15． 活性化モノメトキシ・ポリエチレングリコール(mPEG)からなる群から選ば れた試薬によりポリペプチドのアミノ基に共有結合が形成されることを特徴とす る請求項１から14のいずれかに記載の方法。 16． 活性化されたモノアルキル-キャッピングポリアルキレ ンオキシドがmPEG-トレシレートとmPEGコハク酸混合無水物からなる群から選ば れたものであることを特徴とする請求項15に記載の方法。 17． 請求項１から16のいずれか１の請求項に記載の方法により得られた生体適 合性ポリマーとポリペプチドのコンジュゲート。 18． コンジュゲーション後に維持されるポリペプチドの活性が当該コンジュゲ ーション前の活性の少なくとも30%であることを特徴とする請求項17に記載のコ ンジュゲート。 19． コンジュゲーション後に維持されるポリペプチドの活性が当該コンジュゲ ーション前の活性の少なくとも50%であることを特徴とする請求項18に記載のコ ンジュゲート。 20． 請求項３から16のいずれか１つの請求項に記載の第VIII因子、フォン・ウ ィルブランド因子、それらの組合せまたは第IX因子と生体適合性ポリマーとのコ ンジュゲートであって、薬剤として使用されるコンジュゲート。 21． 請求項20に記載の欠失誘導体リコンビナント第VIIISQ因子(r-VIIISQ)と生 体適合性ポリマーのコンジュゲートであって、コンジュゲーション程度がモノア ルキルでキャッピングさ れたPEG/r-VIIISQ分子比が２から15の範囲にあるコンジュゲート。 22． 請求項３から16のいずれか１つの請求項に記載の第VIII因子、フォン・ウ ィルブランド因子、それらの組合せまたは第IX因子と生体適合性ポリマーとのコ ンジュゲートの血友病A、フォン・ウィルブランド病または血友病Bの治療用薬剤 の生産への使用。 23． 請求項22に記載の第VIII因子、フォン・ウィルブランド因子、それらの組 合せまたは第IX因子と生体適合性ポリマーとのコンジュゲートの皮下、筋肉内ま たは皮内投与への使用。 24． 請求項22に記載の第VIII因子、フォン・ウィルブランド因子、それらの組 合せまたは第IX因子と生体適合性ポリマーとのコンジュゲートの静脈内投与への 使用。 25． 請求項３から16のいずれか１つの請求項に記載の第VIII因子と生体適合性 ポリマーのコンジュゲートの皮下、筋肉内、皮内または静脈内投与による血友病 Aの治療法。
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