HU221208B1 - Conjugates of a polypeptide and a biocompatible polymer - Google Patents

Conjugates of a polypeptide and a biocompatible polymer Download PDF

Info

Publication number
HU221208B1
HU221208B1 HU9901203A HUP9901203A HU221208B1 HU 221208 B1 HU221208 B1 HU 221208B1 HU 9901203 A HU9901203 A HU 9901203A HU P9901203 A HUP9901203 A HU P9901203A HU 221208 B1 HU221208 B1 HU 221208B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
factor
polypeptide
factor viii
biocompatible polymer
viii
Prior art date
Application number
HU9901203A
Other languages
English (en)
Inventor
Johanna Dalborg
Helena Sandberg
Anna-Lisa Smeds
Eva Akerblom
Original Assignee
Biovitrum Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=20399642&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU221208(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biovitrum Ab filed Critical Biovitrum Ab
Publication of HUP9901203A2 publication Critical patent/HUP9901203A2/hu
Publication of HUP9901203A3 publication Critical patent/HUP9901203A3/hu
Publication of HU221208B1 publication Critical patent/HU221208B1/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/644—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/647—Blood coagulation factors not provided for in a preceding group or according to more than one of the proceeding groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21022—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y10S530/813—Carrier is a saccharide
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y10S530/815—Carrier is a synthetic polymer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Polyesters Or Polycarbonates (AREA)
  • Polyamides (AREA)

Abstract

A találmány tárgya eljárás egy javított in vivo működésű polipeptidelőállítására a polipeptid veszélyeztetett célpontjainak védelméveloly módon, hogy a polipeptidet rögzítik egy csoport specifikusadszorbenst hordozó szerves kémiai szintézissel előállítottligandumokkal való kölcsönhatással, a biokompatibilis polimeraktiválásával, az így aktivált biokompatibilis polimer és a rögzítettpolipeptid konjugálásával, majd a konjugátum adszorbensről valóeluálásával. A jelen találmány továbbá kiterjed egy, a találmányszerinti eljárással kapott polipeptid és biokompatibilis polimerkonjugátumaira, a konjugátum gyógyszerként történő alkalmazására. Apolipeptid közelebbről VIII faktor, von Wil- lebrand-faktor vagy IXfaktor. A találmány különösen előnyös olyan konjugátumokra, ahol apolipeptid VIII faktor, melynek igen nagy specifikus aktivitása vanmonometoxi-polialkilén-oxid (mPEG) mint biokompatibilis polimeralkalmazásával. ŕ

Description

Jelen találmány tárgya eljárás egy polipeptid in vivő működésének javítására a polipeptid védtelen célpontjainak megvédésére oly módon, hogy a polipeptidet egy csoport specifikus adszorbenshez rögzítjük, amely adszorbens szerves kémiai szintézissel előállított ligandumokat hordoz, továbbá a biokompatibilis polimert aktiváljuk, az így aktivált biokompatibilis polimert a rögzített polipeptidhez konjugáljuk, majd a konjugátumot az adszorbensről eluáljuk. A jelen találmány kiterjed továbbá egy polipeptid és a jelen eljárással kapott biokompatibilis polimer konjugátumaira, közelebbről ez a polipeptid a VIII faktor, a von Willebrand-faktor, vagy a IX faktor. A találmány különösen előnyös olyan konjugátumoknál, ahol a polipeptid VIII faktor, amelynek igen nagyfokú specifikus hatása van, monometoxipolialkilén-oxid (mPEG) mint biokompatibilis polimer alkalmazásával.
Jól ismert, hogy a polipeptidek in vitro stabilitását és in vivő felezési idejét növelhetjük a biokompatibilis polimerek kovalens kapcsolásával (a következőkben konjugációnak vagy módosításnak nevezzük). A polipeptidfelület módosításának az is az előnye, hogy csökkenti a polipeptid által mutatott immunogenicitást.
A pegilezés, azaz különböző polietilénglikolok (PEG) polipeptidhez történő kapcsolása széles körben elterjedt módszer például proteinek in vitro stabilitásának és in vivő felezési idejének növelésére. A pegilezésben sok módszert javasoltak az elmúlt évek alatt. Utalunk Zalipsky S. és munkatársai [Poly(Ethylene Gly col) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications, Plenum, New York (1992) és Katre, N.V. Adv. Drug Deliv. Rév., 10, 91-114 (1993)] irodalmi helyre.
Bizonyos polipeptideknél a hatás csökkenését vagy a működés csökkenését ennek a konjugációnak a következményeként ismerték fel, egy olyan hatás, amely a módosítás fokával nő [Inada Y. és munkatársai, Trend in Biotechnology, 13, 86-91 (1995)]. Módszereket fejlesztettek ki, hogy a kapcsolódást szelektívebbé tegyék, hogy ezt a problémát megkerüljék. Például irányított helyű mutagenezist alkalmaztak rekombináns interleukin ΙΙ-re (rIL-2). Egy specifikus célt alakítottak ki egy cisztein beépítésével [Goodson, R.J. és Katre, N.V., Bio/Technology 8, 344-346 (1990); Katre 1993, lásd fent]. Ez az út általánosan gyógyászati fehérjékre nem alkalmazható, minthogy az aminosavhelyettesítés megváltoztathatja a molekula eredeti jellemzőit, és ezért ellentmondásos. Egy másik módszer szerint a polimert a protein glikozilezett helye felé lehet irányítani, lásd például a IX faktort a WO 92/29370 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben (Enzon). Ez azonban a szénhidrátcsoportok oxidációját foglalja magában, amit úgy lehet elérni, hogy glikoproteint reagáltatnak nátrium-perjodáttal, vagy elérhető enzimes úton is galaktóz-oxidáz segítségével. Ezek a körülmények a molekula számára gyakran károsak. Ebben a különleges esetben a konjugációra szánt glikozilezett helyeket egy IX faktor peptidszekvencián helyezik el, melyet in vivő távolítanak el a proteolitikus aktiválás során. Ennélfogva a biokompatibilis polimer nem befolyásolja az aktív polipeptid működését.
A WO 92/13322 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben (Farmitalia Carlo Erba) leírták, hogy a pegilezést el lehet végezni anélkül, hogy a szóban forgó protein (első anyag) működéséhez fontos bizonyos helyek működését rontanák. Ezt úgy érik el, hogy a helyeket megvédik oly módon, hogy az első anyagot egy második anyaggal hozzák érintkezésbe, amely specifikusan kötődik a fenti helyekhez. Pontosabban, a pegilezést úgy végzik, hogy a szóban forgó proteint egy gyantára rögzítik a proteinnel szemben specifikus affinitást mutató ligandumokkal. A második anyagok például lehetnek kiegészítő biológiai molekulák. Az ilyen kapcsolódás példáit megtalálhatjuk a WO 94/13322 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben. Ilyen példák az antitest (első anyag) - megfelelő antigén (második anyag); a specifikus inhibitor (első anyag) - enzim (második anyag); növekedési faktor (első anyag) - megfelelő receptor (második anyag) vagy ezen párok fordítottja.
Gyógyszertermelés céljára szolgáló eljárásnál előnyös azonban, hogyha a biológiailag komplex anyagok alkalmazását minimális szinten tartjuk. Ez elsősorban a biokémiai homogenitás dokumentációjával és az anyagok alkalmazásának biztonságával szemben állított szigorú követelmények következménye. Ezért előnyös volna szerves kémiai szintézissel ellátott affinitásligandumokat alkalmazni.
A DE 3717210 számú szabadalmi bejelentés biopolimerek módosítási eljárására vonatkozik, előnyösen töltéshordozó biopolimerek módosítására oly módon, hogy a biopolimert például egy ioncserélő adszorbensre rögzítjük, a biopolimert reagensekkel, például enzimekkel vagy más biokémiai reagenssel reagáltatjuk a termék előállítására, majd a reakcióterméket az adszorbensről deszorbeáljuk. A reakció terméke előnyösen egy nukleinsav, amelyet egy restrikciós enzimmel hasítunk. A DE 3717210 számú szabadalmi bejelentésben a biopolimer adszorbeált állapotát hasznosítják azért, hogy a biopolimert jobban kitegyék a reagensek hatásának, ezáltal a módosítás hatékonysága nőjön. Nincs utalás azonban a védtelen célrészek megvédésére, sem pedig arra, hogy célul tűzték volna ki a biopolimer hatásának megtartását, amely előnyös lenne biopolimer in vivő működésénél. A DE 3717210 számú szabadalmi bejelentésben leírt találmánynak csak a biomolekulák (például a nukleinsavak) tulajdonságainak leképezése a célja, hogy megváltoztassák a feldolgozással az eredeti jellemzőket, vagy növeljék a makromolekula működési egységeinek számát, például radioaktív izotópok beépítésével.
Sok gyógyászati felhasználásra alkalmas proteint konjugáltak rendszerint különböző pegilezési technológia alkalmazásával [Francis, G.E. és munkatársai, Stability of Protein Pharmaceuticals/Series: Pharmaceutical Biotechnology 3, 235-263 (1992); Inada, Y. és munkatársai, Trends in Biotechnology, 13, 86-91 (1995)]. A legtöbb példa intravénás adagolásra vonatkozik. Azonban szubkután adagolás után a plazmába, tüdőbe, májba és lépbe a néhány mPEG-konjugált allergén felvételét írták le, és az mPEG-konjugált allergénekkel végzett immunoterápia hatékonynak bizonyult szubku2
HU 221 208 Bl tán adagolás esetén [Dreborg S. and Akerblom, E.B., Crit. Rew. Therap. Drug Carr. Sys, 6 (4), 316-366 (1990)]. Intramuszkuláris adagolást is alkalmaztak adenozin dezaminázzal végzett klinikai kísérletek során [Hershfíeld, M.S. és munkatársai, New Eng. J. Med, 316, 589-596 (1987)]. A pegilezés is bizonyos esetben hasznosnak bizonyul az orális adagolás esetén. így az IgG pegilezése orális adagolásra szerepel az EP-A-0 614 373 számú európai szabadalmi bejelentésben a Mount Sinai School of Medicin bejelentésében. A VIII faktor és IX faktor pegilezését orális adagolásnál Sakuragawa és munkatársai írták le a következő irodalmi helyen: Acta Med. Bioi., 34 (3), 77-84 (1987), és a 44509/83 számú japán szabadalmi bejelentésben (Nippon Chemifar Company).
A VIII faktor olyan protein, amely részt vesz a belsővér-koagulációban. Ez a reakció során egy olyan kofaktor, ahol a IXa enzim faktor foszfolipid és kalcium ionok jelenlétében a proenzim X faktort aktív Xa faktorrá alakítja, végül egy fibrin rög keletkezik. A humán VIII faktort egy körülbelül 300 kDa-os egyszerű láncú molekula formájában szintetizálják, és szerkezetileg A1-A2-B-A3-C1-C2 tartományokból áll [Gitschier és munkatársai, Natúré 312, 326 (1984); Wood és munkatársai, Natúré 312, 330 (1984); Vehar és munkatársai Natúré 312, 337 (1984); Toole és munkatársai, Natúré 312, 342 (1984)]. A prekurzor terméket két 200 és 80 kDa-os polipeptid lánccá alakítjuk a Golgiban és a két láncot fémionokkal tartjuk össze, és a vérben fejezzük ki [Kaufman és munkatársai, J. Bioi. Chem., 263, 6352 (1988); Andersson és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 2979 (1986)]. A VIII faktor B tartománya nélkülözhetőnek tűnik a VIII kofaktor működését illetően, míg az A és C tartomány számos kölcsönhatási hellyel rendelkezik más makromolekulák számára, melyek a vérzéscsillapításban szerepet játszanak [Sandberg és munkatársai, Thrombos. Haemostas, 69, 1203 (1993) és Lind és munkatársai, Eur. J. Biochem., 232, 19(1995)].
A von Willebrand-faktor (vWf) több funkcionális polimer plazmaprotein, amely diszulfíddal összekapcsolt, körülbelül 240 kilodaltonos alegységekből áll. Az alegységek multimerek heterogén populációját képezik, amely molekulatömeg tartománya 1 MDA-tól 20 MDA-ig terjed. A vWf működése primer vérzéscsillapításnál elősegíti a trombocita adhézióját az érfalakhoz magas nyírási sebesség körülményei között. A vWf a VIII faktort szintén szorosan megköti, de nem kovalens módon. Normális humán plazma VIII faktor és a vWf egymással komplexálva keringenek. A vWf fontos stabilizáló hatást gyakorol a VIII faktor molekulára, amennyiben megvédi a molekulát a proteázok általi lebomlástól [Koedam és munkatársai (1986), Doctoral Thesis, ICG Printing, Dordrecht, 1986, 83; Hamer és munkatársai, 1986, Haemostasis, 58, 223 (1987)]. A humán in vivő VIII faktor felezési idő rendszerint 10-15 óra. A vWf-hiányos pácienseknél a csökkent vWf-szinteket csökkent VIII faktor szintek kísérik a VIII faktor romlott felszabadulása és megnövekedett bomlási sebessége következtében [Tuddenham és munkatársai, Br. J. Haematol., 52, 259 (1982) és Brinkhous és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 8752 (1985)] azt mutatja, hogy a vWf jelenléte fontos hatással bír a VIII faktor in vivő túlélésére. Ha a VIII faktort hemofil kutyákba juttatják infúzióval, akkor a kapott felezési idő 7-10 óra, míg a felezési idő körülbelül 1 óra volt vWf-hiányos kutyáknak adagolt infúzió után [Brinkhous és munkatársai, lásd fent],
A IX faktor a fent leírt IXa faktor proenzimje. Ez egy szerinproteáz és a K-vitamin-fuggő koagulációs proteinek egyike. A molekulatömeg körülbelül 55 kDa [DiScipio és munkatársai, Biochemistry 16, 698 (1977)]. A IXa faktor specifikusan lép kölcsönhatásba más, a X faktor aktiválásában részt vevő komponensekkel [Haemostasis and Thrombosis, (1994), 1. kötet, harmadik kiadás, kiadó: Bloom A. és munkatársai].
A fenti fejezetekből nyilvánvaló, hogy a Vili faktor sok kölcsönhatási hellyel rendelkező protein, amelyek mindegyike speciális működésért felelős. Ezért nehéz a VIII faktort módosítani, miközben a teljes biológiai működést megőrizzük.
A pegilezési technológiát már korábban is alkalmazták a VIII faktort tartalmazó proteinelegyéknél. így leírták a WO 94/15625 nemzetközi szabadalmi bejelentésben (Enzon), hogy a VIII faktor pegilezése karbamát (azaz uretán) kapcsolódással előre meg nem határozott módosítási fokkal, amely egy százszoros mPEG mólfeleslegből származik a VIII faktorhoz képest, egéren az in vivő felezési időt 13 óráról 55 órára növelheti. Az egerek felezési idejét általában 1 órának vesszük, így a 13 óra rendkívül hosszú felezési idő egérnél. Továbbá figyelembe kell venni, hogy a kiindulási VIII faktorkészítmény (20-50 IU/mg protein) rendkívül alacsony tisztasága mellett a VIII faktortól eltérő más proteinek voltak túlnyomó részben jelen az összekapcsolási reakció során. Egy fontos protein van rendszerint jelen az alacsony tisztaságú Vili faktorkészítményekben, és ez a von Willebrand-faktor, amely stabilizáló hatású a VIII faktorra, és ezért ez is hozzájárulhat a konjugálási eljárás során a megfelelő funkcionális hely védelméhez. A konjugáció után az mPEG-t bármelyik proteinen lokalizálhatjuk, amelyik a proteinelegyben jelen van, és amelyből a VlII-as faktor rendszerint csak egy kis részt képvisel. A VlII-as faktort tartalmazó pegilezett proteinelegyet alkalmazzuk intravénás adagolásra. Egy jól definiált kiindulási anyag azonban a gyógyszertermeléshez szükséges szabályozott körülményeket képező lényeges faktorok egyike.
Más polimereket is alkalmaztunk a VIII konjugáló faktornál. így a 4 970 300 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban szerepel, hogy dextrán konjugációt alkalmazhatunk a VIII faktor felezési idejének meghosszabbítására.
A legtöbb összekapcsolási technikánál a polipeptid lizincsoportjainak ε-amino-csoportjaival reagál a polimer reagens. Ezek gyakran szét vannak terítve a polipeptid egész felületén, és könnyen konjugációt eredményezhetnek a funkcionális hely szomszédságában. Következésképpen tetszőleges összekapcsolással gyakran megzavarodik a hatás vagy működés. Az a tapasztala3
HU 221 208 Β1 tünk, hogy ha az ilyen technológiát igen tiszta készítménnyel alkalmazzuk, például B tartomány törölt rekombináns VlII-as faktornál, amely koaguláns hatással rendelkezik, ez a hatás lényegesen csökken már 5 mPEG/VIII faktor molekula módosítási fokánál.
A jelen találmány feltalálói azt találták, hogy a specifikus konjugált polipeptidhatás megőrizhető nagymértékben, ha mindössze a polipeptidet egy csoport specifikus adszorbensre rögzítjük, mielőtt az Összekapcsolódási reakció lejátszódik, majd a konjugátum deszorpciója következik a szokásos módszerekkel. Ez teljesen meglepő, minthogy korábban lényegesnek tartották, hogy specifikus kötődési tulajdonságokkal rendelkező adszorbenseket alkalmazzanak a szóban forgó polipeptid vonatkozásában, és hogy így bizonyos, a biológiai működőképesség szempontjából fontos területek védelmét elérjék.
A módosító biokompatibilis polimerek haszna gyakran függ a módosítás fokától. így egy nagyfokú módosítás, például a polipeptid molekulánkénti biokompatibilis nagy száma, rendszerint szükséges, hogy hatékony védelmet biztosítsunk proteolitikus hatás ellen. A jelen találmány segítségével, amelyben szelektívebben vezetik be a biokompatibilis polimereket, sikerült jobban megtartani a specifikus hatást. így a találmány feltalálói azt találták, hogy a VIII faktort hatékonyan lehet bomlás ellen megvédeni egy in vitro környezetben, amely bomlasztó hatással van a molekulára. Ezt a hatást csak 45 mPEG/VIII faktor módosítási fokon lehet elérni.
A találmány szerinti csoportspecifikus adszorbensek alkalmazása gazdaságilag kedvező az irodalomban leírt adszorbensekhez viszonyítva. A csoportspecifikus adszorbensek alkalmazása megkönnyíti a konjugátumok gyógyszerként történő regisztrálását.
A jelen eljárás lehetővé teszi, hogy a polipeptid in vivő működését javítsuk, különösen úgy, hogy javítjuk a farmakokinetikai működést. Ide tartozik a biohozzáférhetőség, és hogy csökkentsük a polipeptidek által mutatott immunogenicitást.
így a találmány kiterjed egy eljárásra egy polipeptid in vivő működésének javítására oly módon, hogy a polipeptid veszélyeztetett helyeit megvédj ük
a) polipeptid rögzítésével egy csoportspecifikus adszorbenst hordozó ligandumok kölcsönhatásával, mely ligandumokat szerves kémiai szintézissel állítottuk elő;
b) a biokompatibilis polimert aktiváljuk;
c) az aktivált biokompatibilis polimert a rögzített polipeptidhez konjugáljuk, majd
d) a konjugátumot az adszorbensről eluáljuk.
A jelen találmányban a kölcsönhatási hely a szóban forgó polipeptid biológiai működéséhez lényeges különböző helyeket foglalja magában.
A jelen találmány szerint a „veszélyeztetett cél kifejezés a polipeptid olyan külső helyeire vonatkozik, amelyek nem kívánt in vivő reakciónak vannak kitéve. Az ilyen veszélyeztetett helyekhez tartoznak az antigén epitópok és a proteolitikus hasadás helyszínei. A proteolitikus hasadás bizonyos helyei egyben a kölcsönhatás helyeiként is szerepelnek.
A jelen találmány lehetővé teszi eddig nem elérhető mértékben, hogy csökkentsük az in vivő nemkívánatos reakciók hatását, mint amilyenek például a proteolitikus hasadás és esetleg aggregáció, miközben egyidejűleg érintetlenül hagyjuk a polipeptid biológiai működéséhez alapvető fontosságú kölcsönhatási helyeket. Ezt leírtuk a VIII rekombináns faktor mPEG-konjugációjával kapcsolatos bejelentésben. Közelebbről, ha a polipeptidet úgy rögzítjük, hogy egy csoportspecifikus adszorbenst hordozó ligandumokkal hozzuk kölcsönhatásba, melyeket szerves kémiai szintézissel gyártottunk, akkor a polipeptiden lévő kölcsönhatás helyei kizáródnak a biokompatibilis polimerrel való konjugációból. Ezenkívül, hogyha az aktivált biokompatibilis polimert a polipeptidhez konjugáljuk a kívánt külső helyeken, akkor az exponált célpontokra például a proteázok hatása nem érvényesül.
A jelen szabadalmi bejelentésben a „polipeptidek kifejezés proteineket, és az oligopeptidek legalább láncban 20 aminosavat tartalmazó peptideket jelent. A találmány szerinti előállított polipeptid aminosavszáma előnyösen 30-4500 aminosav, előnyösen 40-legfeljebb 3000 aminosav között változik. A polipeptidek származhatnak emlősből, közelebbről emberből, vagy előállíthatok rekombináns DNS-technikával. A találmány szerint konjugálható polipeptidekhez tartoznak a koaguláló hatású vagy a koagulációt elősegítő hatású polipeptidek. A polipeptidek teljes hosszúságúak lehetnek, azaz aminosavszekvenciájuk megfelel az emlősöknél általában található szekvenciának, különösen az embernél található szekvenciának. A polipeptidek lehetnek a teljes hosszúságú polipeptidek törölt származékai, ahol egy vagy több aminosav hiányzik. A polipeptid előnyösen koagulációs VIII faktor, a von Willebrand-faktor (vWf) vagy ezek kombinációja, vagy koagulációs IX faktor, előnyösen koagulációs VIII faktor.
A humán plazmában jelen lévő teljes hosszúságú VIII faktor molekulatömege körülbelül 300 kDa. A VIII faktor koncentrátumok, amelyek a humán plazmából származnak, több fragmentált, teljesen aktív VIII faktor formát tartalmaznak Andersson és munkatársai (lásd fent) leírás szerint. A legkisebb aktív formának molekulatömege körülbelül 170 kDa és két, körülbelül 90 kDa-os és 80 kDa-os láncból áll, amelyeket fémionok vagy ionok tartanak össze. Lásd a 0 197 901 számú, Pharmacia and Upjohn AB európai szabadalmi bejelentést. A találmány szerint előállított biológiailag hatásos VIII faktor molekulatömege ezért 170 kDa-tól legfeljebb 300 kDa-ig terjed.
A Pharmacia AB, Stockholm, Svédország kifejlesztett egy rekombináns VIII faktor terméket, amely megfelel a 170 kDa-os plazma VIII faktor formának a terápiás VIII faktor koncentrátumokban. A megrövidített rekombináns VIII faktor molekula r-VIII SQ-val végződik, és a kínaihörcsög-petefészek (Chinese Hamster Ovary (CHO)) sejtek termelik egy szérummentes közegben egy sejttenyésztési eljárás során. Az r-VIII SQ fajlagos hatása körülbelül 15000 IU VIII :C 1 mg ossz proteinre vonatkoztatva. A r-VIII SQ szerkezetét és biokémiáját a WO-A 91/09122 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben írta le a Pharmacia AB.
A jelen találmány során a Vili faktor vagy plazma VIII faktor, vagy rekombináns VIII faktor lehet. Ha a
HU 221 208 Β1
VIII faktor rekombináns, akkor ez teljes hosszúságú VIII faktor lehet, vagy előnyösen koagulációs hatással rendelkező, teljes hosszúságú VIII faktor törölt származéka. Még előnyösebben ez a deléciós származék a VIII SQ rekombináns faktor, azaz r-VIII SQ. Ebben az összefüggésben a deléciós származékot koagulációs VIII faktorként definiáljuk, amelyben a B rész teljes egésze vagy egy része hiányzik, miközben a koagulációs hatás megmarad. A fennmaradó területek előnyösen egy aminosavlinkerrel vannak összekapcsolva. A különböző linkerkonstrukciók példái megtalálhatók P. Lind és munkatársai, Eur. J. Biochem, 232. kötet, 19-27 (1995) szakirodalmi helyen.
A jelen találmányt előnyösen arra használhatjuk, hogy szelektíven bevezetünk biokompatibilis polimereket a VIII faktor termékek egy széles skálájába, így a jelen találmányt alkalmazhatjuk arra, hogy tovább stabilizáljuk in vivő a VIII plazma faktort, amely már stabilizálva lett a hordozó proteinjével kapcsolatosan, azaz a von Willebrand-faktorral (vWf).
Előnyös, hogy a végtermékek jól definiáltak. Ezért a VIII specifikus faktor aktivitása a jelen találmány szerinti kondenzálási eljárás során legalább 1000 IU/mg ossz protein, előnyösen legalább 2000 IU/mg ossz protein. A specifikus VIII faktor hatása előnyösen 5000 IU/mg-tól legfeljebb 20 000 IU/mg ossz proteinig teijed, még előnyösebben 10 OOO-től maximum 17 000 IU/mg ossz protein.
A VIII faktor hatása a kondenzálási reakcióban legalább 1000 IU/ml, előnyösen legalább 2000 IU/ml. A VIII faktor hatása előnyösen 5000-től 50 000 IU/ml, még előnyösebben 20 000-40 000 IU/ml.
A találmány szerinti biokompatibilis polimer lehet monoalkil-végcsoporttal ellátott polialkilén-oxidok homopolimerje, kopolimeije vagy blokk-kopolimerje. A biokompatibilis polimerek lehetnek egyenes vagy elágazó láncúak. A monoalkil-végcsoporttal ellátott polialkilén-oxid előnyösen polietilénglikol homopolimerek és polipropilénglikol homopolimerek csoportjából áll. A biokompatibilis polimer előnyösen egy polietilénglikol (PEG) homopolimer. A PEG molekulatömege 300-tól 20 000-ig, előnyösen 1500-tól 10 000ig, előnyösen 3000-től 5000-ig változhat.
A biokompatibilis polimernek végcsoporttal ellátottnak kell lenni az egyik végén, hogy a keresztbe történő származékképzést megakadályozzuk. Erre a célra előnyösek az egyenes vagy elágazó láncú rövid szénláncú alkoxicsoportok, előnyösen a monometoxicsoport. Különösen előnyös biokompatibilis polimer a monometoxi-polietilénglikol (mPEG).
Más biokompatibilis polimerek is előfordulhatnak, például dextrán, polivinil-pirrolidon és DL-aminosavak.
A biokompatibilis polimert a kondenzálási reakció előtt aktiválni kell, hogy a kovalens kötések képződését lehetővé tegyük. Ebből a célból a biokompatibilis polimer végét, ami a polipeptiddel van szemben, össze kell kapcsolni az aktiválásra fogékony hidroxilcsoporttal. A biokompatibilis polimer aktiválásának számos módja ismeretes a kovalens kötődéshez kiválasztott aminosavtól függően. Előnyös mPEG-származékok az aminosavakhoz történő kondenzáláshoz az mPEG-szukcinimidil-szukcinát, az mPEG-szukcinimidil-szukcinamid, az mPEG-szukcinimidil-propionát, a szukcinamidil-karbonát és a karboxi-metilezett mPEG szukcinimidil-észtere, mPEG-oxikarbonil-imidazol, mPEG-nitrofenil-karbonátok, mPEG-triklór-fenil-karbonát, mPEG-trezilát (utóbbit Nilsson K., Mosbach K. írták le a Methods in Enzymology, 104. kötet, 55-69. oldal (1984)). Az összes említett reagenst Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, AL, USA forgalmazza, továbbá mPEG-maleinsavanhidrid és mPEG-metil-maleinsavanhidrid [Garman A., Kalindian S.B., FEB 223. kötet, 2, 361-365. oldal], és mPEG-szukcinát, mPEG-ecetsav és mPEG-propionsav vegyes anhidridjei (Dreborg S. és Akerblom E., lásd fent).
A ciszteinmaradékokat konjugálhatjuk mPEG-maleimiddel, mPEG-vinil-szulfonnal és mPEG-ortopiridil-diszulfiddal (melyeket Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, AL, USA forgalmaz). Az arginin guanidinocsoportjának konjugálása esetén megfelelő reagensek a fenil-glioxál mPEG-származékai. (Zalipski, lásd fent.)
A szénhidrátokat először oxidálni kell úgy, hogy aldehidcsoportok legyenek jelen, és ezeket utána mPEG-hidraziddal konjugálhatjuk (Zalipski, lásd fent).
A kondenzálási reakciót a konjugálandó aminosav számára megfelelő pH-η kell végezni. Figyelembe kell venni a polipeptidnek megfelelő pH-t is, valamint a biokompatibilis polimer reakcióképességének pHfüggőségét. Rendszerint ezért a kondenzálási reakció során a pH 7 és 8 között van, az alsó határt úgy állítjuk be, hogy elkerüljük a túlzott kondenzálási reakciót, és a felső határ a polipeptid számára biztosít enyhe körülményeket. A fenti pH-tartomány megfelel a lizinekkel végzett konjugálás céljára. Ezért a jelen találmány szerinti példákban ilyen enyhe körülmények között FVIII hatású anyagot konjugáltunk. Ezen tartományon kívüli pHértékek is megfelelők lehetnek bizonyos esetekben, így a ciszteinekre vonatkozó konjugálást 7 alatti pH-η végezzük, míg az argininek esetében a konjugációt 5,5-9,3 közötti ρΗ-tartományban hajthatjuk végre előnyösen.
A kondenzálási eljárást 0 °C felett, előnyösen 5-40 °C-on, még előnyösebben 10-30 °C közötti hőmérsékleten kell végrehajtani. Itt is figyelembe kell venni a polipeptidnek megfelelő hőmérsékletet, valamint a hőmérséklet befolyásának hatását a biokompatibilis polimer reakcióképességére. A jelen találmány szerinti példákban valamennyi kondenzálási lépést szobahőmérsékleten hajtunk végre. A találmány szerint alkalmazott adszorbens csoport specifikus a rögzítendő polipeptid vonatkozásában. A csoportspecifikus adszorbensek affinitást mutatnak több polipeptidhez. Ezenkívül gyakran kevéssé erősen kötődnek, és az eluálást enyhébb körülmények között lehet elvégezni, mint a monospecifikus adszorbensekkel, utóbbi egyetlen vagy igen kisszámú polipeptidhez kapcsolódik. A megfelelő csoportspecifikus adszorbensek példáit megtalálhatjuk Jansson J.C. és munkatársai, Protein Purification, Principles, High Resolution Methods and Applications,
HU 221 208 Β1
VCH Publishers, 274-285. oldal (1989) szakirodalmi helyen. A találmány szerinti adszorbenst továbbá az jellemzi, hogy szerves kémiai szintézissel előállított ligandumokat hordoz. Az ezen kritériumoknak megfelelő adszorbensek kromatográfiás gyanták, amelyeket általában proteinek adszorbeálására alkalmaznak, például biokompatibilis mátrixok, amelyekhez olyan ligandumokat kondenzáltunk, mint például anionos és kationos cserecsoportok, szulfhidrilcsoportok, rögzített fémaffinitás-kromatográfiás (IMAC) csoportok, egyenes vagy elágazó láncú, telített vagy telítetlen szénhidrogénláncok és aromás csoportok. Hasznosak a vegyes funkciójú ligandumok is, például mind az ionos és hidrofób részek, például amino-alkil- vagy dimetil-aminopropil-karbamil-pentil-csoport. Erről a két ligandumról leírták, hogy hasznosak a plazmából származó VIII faktor tisztításánál [lásd Morgenthaler és munkatársai, Thromb. Haemostas. 47(2), 124 ff (1982) és Te Booy, M.P. W. M. és munkatársai, J. Chrom, 503, 103-114 (1990)]. Előnyös amino-alkil az amino-hexil-csoport. Nagyobb komplexicitással rendelkező ligandumokat is használhatunk, például peptideket vagy foszfolipideket, melyeket szerves kémiai szintézissel állítottunk elő. A szakember számára a csoportaffinitásos ligandumokat szerves kémiai szintézissel lehet előállítani, ide sokféle anyag tartozik, így a reakcióképes tiazin alapú textilfestékek is hasznosak több enzim esetében mint adszorbensek, ilyen enzimek például a kinázok és hidrogenázok. A cukorszármazékok, nukleotidek és peptidek és analógjaik, melyeket szerves kémiai szintézissel állítunk elő, szintén hasznosak [Dechow, F.J., Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications, Park Ridge, NJ, USA, 440-443 (1989)].
A találmány szerint alkalmazható ligandumok közül alkalmasak a további anioncserélő csoportok, előnyösen erős, ilyen csoportok például kvatemer amino-etil(QAE), trimetil-amino-etil- (TMAE) vagy kvatemer amino-metil- (Q) csoport, még előnyösebb a kvatemer amino-metil- (azaz Q) csoport. A ligandumokat továbbá szorosan kondenzálhatjuk a mátrixhoz, vagy egy spacerrel, például alkil-aminnal, hexil-aminnal, diamino-dipropil-aminnal, etil-amin-szukcinamiddal [Persson & Lagerström, in Packings and stationary phases in chromatographic techniques, Unger, K.K., szerkeszt, Marcel Dekker Inc., 754 (1990)], vagy egy elágazó csápnak, amelyhez a ligandumok kapcsolódnak (előnyös példa a Fractogel™ EMD, melyet a német Merck cég állít elő).
A kondenzálási eljárás után a konjugált polipeptidet ismert módon eluáljuk. Ebben az összefüggésben lényeges, hogy a fizikokémiai körülményeket figyelembe vegyük, és elkerüljük ezzel a konjugált polipeptidek lebomlását. így, ha a kapcsolási módszer egy olyan konjugáló kötést foglal magában, amely egy bizonyos pHtartományon belül labilis, ez elkerülendő.
A kapcsolási eljárás során, ha a polipeptidet az adszorbensen rögzítjük, akkor a polipeptidet érintkezésbe hozhatjuk egy megfelelő blokkolószerrel abból a célból, hogy kizárjuk a konjugálásból a további helyeket. Ilyen blokkolószert előállíthatunk szerves kémiai szintézissel és ezenkívül bármelyik fent azonosított ligandummal konjugálhatjuk, amely a következő polimerek egyikéhez kapcsolódik, például monoalkil-végcsoporttal ellátott polialkilén-oxidok, polialkilén-oxidok kopolimerjei vagy blokk-kopolimerjei, polietilénglikol homopolimerek vagy polipropilénglikol homopolimerek. A blokkolószer hordozhat a polipeptidhez specifikus affinitással viszonyuló egységeket is.
Eluálás után az érintkező oldódó blokkolószer deszorbeálódik oly módon, hogy a megfelelő kémiai körülményeket alkalmazzuk. így például, ha a blokkolószer adszorbeálódott hidrofób kölcsönhatás eredményeképpen, akkor deszorbeálódhat is, ha csökkentjük az ionos erősséget, vagy egyszerűen, ha a hőmérsékletet csökkentjük. Ezután az oldódó blokkolószert elválasztjuk a konjugátumtól ismert körülmények között végzett gélpermeációs kromatografálással.
A találmány szerinti adszorbens mátrix bármilyen kereskedelmi gyanta lehet, amelyről ismeretes, hogy a biológiai molekulákkal kompatibilis. így a mátrix különböző erősen hidrofil mátrixok közül kerülhet ki, például lehet agaróz mátrix, például a Sepharose™ mátrixok széles változata, amelyet Pharmacia Biotech of Uppsala, Svédország cég árusít, továbbá lehetnek szerves polimer mátrixok, például TSK-GEL-ek, melyeket a Tosoh Corp., Tokió, Japán cég ad el, vagy nagy porozitású szerves polimer mátrixok, melyeket a Per Septive Biosystems of Boston, Amerikai Egyesült Államok cég árusít. Alkalmasak a membrán mátrixok is, például a Sartobind™, amelyet a Sartorius, Németország, és a MemSep™, amelyet a Millipore, USA cég árusít. A mátrix előnyösen egy agaróz mátrix. Megfelelő agaróz mátrixok a találmány során lehetnek a Sepharose™, ezenkívül Minileak™, amelyet Kem-En-Tec A/S, Koppenhága, Dánia árusít, és a Bio-Gel A, melyet a Bio-Rad, Brüsszel, Belgium cég árusít. A mátrix előnyösen térhálósított, ezzel gyors áramlást tesz lehetővé (FF), és ezáltal nagy termelési kapacitást tesz lehetővé. Még előnyösebben, a jelen találmány szerinti kromatográfiát Q Sepharose™ FF-gélen hajtjuk végre. Előnyösen alkalmazhatunk továbbá oligoetilénglikol, glicidilmetakrilát és pentaeritrol-dimetakrilát, például Fractogel™ kopolimerjeiből álló gyantákat (Merck, Németország), és cellulózt és porózus üveget.
Egy polipeptid és egy biokompatibilis polimer konjugátumai, amelyeket a találmány szerint állítunk elő, újak. A jelen találmány szerinti eljárással a konjugáció utáni polipeptidhatást a konjugáció előtti hatás legalább 30%-áig fenn lehet tartani, előnyösen legalább a konjugáció előtti aktivitás 50%-át, és még előnyösebben legalább 70%-át fenn lehet tartani.
A jelen találmány szerinti előállítható polipeptid és egy biokompatibilis polimer konjugátumai alkalmazhatók gyógyszerként. Különösen a VIII faktor, a von Willebrand-faktor vagy ezek kombinációja, vagy a IX faktor és egy biokompatibilis polimer konjugátumai, melyeket a találmány szerinti eljárással állítunk elő, alkalmazhatók gyógyszerként. Különösen előnyös a VIII faktor és egy biokompatibilis polimer konjugátumának
HU 221 208 Β1 az alkalmazása, ahol a konjugáció foka 1-15 monoalkil-végcsoporttal ellátott PEG/a VIII faktor molekula, előnyösen 2-10 monoalkil-végcsoporttal ellátott PEG/VIII faktor molekula, előnyösen 3-7 monoalkilvégcsoporttal ellátott PEG/VIII molekula. Ebben az összefüggésben a konjugált VIII faktort előnyösen rekombináns DNS-technikával állítjuk elő, előnyösen egy teljes hosszúságú koaguláló hatású VIII faktor rekombináns törlési származékát, és még előnyösebben egy rekombináns VIII SQ faktor törlési származékát (VIII SQ) alkalmazhatjuk.
A találmány szerinti konjugált polipeptideket előnyösen szubkután, intramuszkuláris, intradermális vagy intravénás adagolással alkalmazzuk. Különösen a konjugált VIII faktort használhatjuk gyógyszer előállítására hemophilia A kezelésére, és különösen az ilyen gyógyszer szubkután, intramuszkuláris, intradermális vagy intravénás adagolására. Továbbá, a konjugált vWf-et használhatjuk a von Willebrand-betegség kezelésére szolgáló gyógyszer előállítására, különösen szubkután, intramuszkuláris, intradermális vagy intravénás adagolásra. A VIII faktort és a von Willebrand-faktort, amelyek mindegyikét a találmány szerinti eljárással konjugáltuk, kombinációban is alkalmazhatjuk. A konjugált IX faktort használhatjuk hemophilia B kezelésére szolgáló gyógyszer előállítására is, különösen szubkután, intramuszkuláris, intradermális vagy intravénás adagolásra.
A találmány kiterjed továbbá a hemophilia A kezelésére szubkután, intramuszkuláris, intradermális vagy intravénás adagolással, amikor is a VIII faktor és egy biokompatibilis polimer konjugátumát adagoljuk, melyet a találmány szerint állítunk elő.
A találmány további részleteit a következő nem korlátozó jellegű példákkal illusztráljuk.
1. példa
Rekombináns Vili faktor előállítása
A rekombináns VIII faktor SQ (r-VIII SQ) előállítását lényegében a WO-A 9109122 számú nemzetközi szabadalmi leírás 1-3. példája szerint végeztük. Egy DHFR-hiányos CHO sejtvonalat (DG44 N.Y.) egy rVIII SQ gént tartalmazó expressziós vektorral és egy dihidrofolát-reduktáz-gélt tartalmazó expressziós vektorral elektroporáltuk. A szelektív táptalajokon végzett kiválasztás után túlélő telepeket megnagyobbítottuk lépcsőzetesen növekvő mennyiségű metotrexát növekedése révén. A kapott telepek szuper felülúszóját egyenként szkríneltük VIII faktor aktivitásra. Egy termelési kiónt választottunk ki, és ezt követően szérummentes szuszpenziónövekedéshez adaptáltuk egy definiált közegben, és végül egy nagyüzemi sejttenyésztési eljárást fejlesztettünk ki. Bizonyos időperiódusok után a felülúszót összegyűjtöttük és tovább tisztítottuk az alább részletezett módon.
A kondicionált táptalajt szűréssel derítettük, a pH-t beállítottuk, majd a szűrletet egy S Sepharose™ FF oszlopra vittük fel (az oszlop térfogata 3 liter). Mosás után a VIII faktort 5 mmol kalcium-kloridot és 0,02% Triton™ X- 100-at tartalmazó sópufferrel eluáltuk. Ezt a kationcserélő kromatográfiás lépést 2-8 °C-on végeztük. Az eluátumot, amely az S Sepharose™ FFlépésből származik (S eluátum), további tisztításig lefagyasztottuk.
Az S eluátum 700 ml-jét felolvasztottuk, és a hőmérsékletet szobahőmérsékletre állítottuk be. Vírusinaktiválást végeztünk úgy, hogy 30 percig inkubáltuk tri-n-butil-foszfáttal (TNBP) és Triton™ Χ-100-zal, amelynek végső koncentrációja 0,3 térfogat/térfogat%, illetve 1,0 térfogat/térfogat% volt. Egy 260 ml térfogatú monoklonális antitest (mAb) immunoaffinitás-oszlopot a megfelelő vírusinaktiváló vegyszereket tartalmazó S eluátum pufferrel egyensúlyoztuk. A VIII faktor oldatot ezután felvittük az mAboszlopra, melyet ezt követően mostunk. Az eluálást 50% etilénglikolt tartalmazó pufferrel végeztük.
Egy Q Sepharose™ oszlopot előre egyensúlyoztunk a nátrium-klorid nagy koncentrációjánál, majd olyan összetételű pufferrel egyensúlyoztuk, mint amilyennel az immunoaffinitás-oszlopot eluáltuk. Az mAb-eluátumot felvittük, és az oszlopot ezután az egyensúlyi pufferrel mostuk, majd fiziológiailag ionerősségű mosópufferrel mostuk. Az oszlopot eluáltuk úgy, hogy a nátrium-klorid-koncentrációt 0,6 mol-ra növeltük. A mosáshoz és a Q oszlop eluálásához detergenst nem használtunk. Egy Butyl Sepharose™ 4FF oszlopot egyensúlyoztunk 50 mmol hisztidint, 1,4 M ammónium-acetátot, 50 mmol kalcium-kloridot, 0,02 Tween™ 80-at tartalmazó pufferrel, a pH 6,8. Hozzáadtunk ammónium-acetátot a Q eluátumhoz, így a végső koncentráció 1 mól és Tween™ 80 0,02%. Ezt az oldatot felvittük 60 cm3/h lineáris áramlási sebességgel a butil-gél oszlopra. Ezután az oszlopot 5 oszloptérfogat egyensúlyozó pufferrel mostuk, majd 35 cm3/h lineáris áramlási sebességgel eluáltuk, 50 mmol hisztidint, 0,5 mól ammónium-acetátot, 50 mmol kalciumkloridot és 0,2% Tween 80-at tartalmazó pufferrel pH 6,8 értéken. A készítmény tisztasága igen nagyfokú, és a specifikus aktivitása 12 000-17 000 IU/mg protein.
Analízis
Az 1-8. példában a VIII faktor aktivitást kromogén kísérlettel analizáltuk (Chromogenix AB, Mölndal, Svédország), ha másképp nem jelöltük meg. A VIII faktor mennyiségét spektrofotometriásán A280-nál határoztuk meg, továbbá aminosavanalízissel. A polipeptidhez kapcsolt mPEG mennyiségét proton-NMR-módszerrel mértük [Dreborg, S. and Akerblom, E.B., Crit. Rew. Therap. Drug Carr. Sys. 6(4), 315-365 (1990)].
2. példa (összehasonlító példa) mPEG-szukcinát vegyes anhidridjével konjugált VIII faktor
A HIC eluátum-puffer összetételét, amelyet az 1. példa szerint állítottunk elő, gélpermeációs kromatográfiával cseréltük fel, melyet Superose 12 oszlopon végeztünk (Pharmacia Biotech, Uppsala, Svédország forgalmazza), melyet előzőleg a következő összetételű pufferrel egyensúlyoztunk: 0,25 mól HEPES, 4 mmol kalcium-klorid, pH = 7,8. Az r-VIII SQ aliquotumokhoz 35, 60 és 100-szoros mólfeleslegben
HU 221 208 Β1 (az rVIII faktorra vonatkoztatva) adagoltunk mPEGszukcinát vegyes anhidridet (molekulatömeg 3000).
Az elegy eket 1,5 óra hosszat hagytuk reagálni egy forgó készüléken szobahőmérsékleten. Az mPEGborostyánkősav feleslegének eltávolítására, és a konju- 5 gált rVIII heterogén populáció méret szerinti szétválasztására gélpermeációs kromatográfiát alkalmaztunk egy Superose 6 oszlopon (Pharmacia Biotech, Uppsala, Svédország forgalmazza). Minden összekapcsolási reakcióból külön analizáltuk az első és második proteincsúcs felének megfelelő frakciót (jegyzettel ellátott 1-es és 2-es elegy, az I. táblázatban). Az I. táblázat az mPEG-szukcinát vegyes anhidriddel konjugált r-VIH SQ eredményét mutatja.
I. táblázat
r-VIII SQ (mg) Hozzáadott mPEG mennyisége (mólfelesleg) Módosítás foka (mPEG/rVIII) Specifikus aktivitás (IU/mg) Specifikus aktivitás (a természetes r-VIII SQ %-a)
Természetes r-VIII SQ - 0 0 15 000 100
35*mPEG elegy 1 12 35 2,5 4200 28
35*mPEG elegy 2 1,2 35 1,2 6800 45
60*mPEG elegy 1 1,6 60 2,4 2000 13
60*mPEG elegy 2 1,6 60 nincs adat 4800 32
100*mPEG elegy 1 1,1 100 4,8 1300 9
100*mPEG elegy 2 1,1 100 3,8 2700 18
Az I. táblázatból világos, hogy az rVIII specifikus hatása drámaian csökkent még az ilyen alacsony konjugációfok mellett is.
3. példa
Q Sepharose™ FF gélre adszorbeált VIII faktor az mPEG-szukcinát vegyes anhidriddel történő összekapcsolás alatt
A reakcióképes lizineket VIII faktor molekula negatív töltéseivel vettük körül, és ezeket megvédtük az mPEGkonjugációtól úgy, hogy a VIII faktort egy anioncserélő gélre adszorbeáltuk. Q Sepharose™ FF-fel töltött oszlopot (Pharmacia Biotech of Uppsala, Svédország) a következő összetételű pufferrel egyensúlyoztunk: 50 mmol Lhisztidin, 0,15 mól nátrium-klorid, 4 mmol kalcium-klorid, pH 6,5, és ezt a VIII faktor adszorbeálására használtuk. Az 1. példa szerint előállított HIC eluátumot felvittük az oszlopra. Ahhoz, hogy az mPEG-összekapcsoláshoz megfelelő körülményeket kapjunk, az oszlopot lemostuk 0,25 M Hepes-ből 4 mmol kalcium-kloridból álló pufferrel, pH 7,8, mielőtt hozzáadtuk volna az mPEG-t. A gélt átvittük egy reakcióedénybe, a szuszpenzióhoz mPEG-szukcinát vegyes anhidridet (molekulatömeg 3000) adtunk, a VIII faktorhoz képest mólfeleslegnek megfelelő mennyiségben a II. táblázat szerint. A reakcióelegyet rotáció közben 1,5 óra hosszat inkubáltuk, ezután az oszlopot újra megtöltöttük, és konjugált rVIII faktort 50 mmol L-hisztidinnel, 0,6 mól nátrium-kloriddal, 4 mmol kalcium-kloriddal eluáltuk pH 6,8 értéken. Négy készítményt kaptunk, konstans mennyiségű r-VIII SQ bevitele esetén a gélmennyiségre vonatkoztatva. Valamennyi lépést szobahőmérsékleten végeztük. A II. táblázat mutatja a Q Sepharose™ FF gélre adszorbeált konjugált r-VIII SQ eredményeit.
II. táblázat
r-VIII SQ (mg) Hozzáadott mPEG mennyisége (mólfelesleg) Módosítás foka (mPEG/rVIII) Specifikus aktivitás (IU/mg) Specifikus aktivitás (a természetes r-VIII SQ %-a)
Természetes r-VIII SQ - 0 0 15 000 100
1. készítmény 1,9 300 3,9 8400 56
2. készítmény 1,9 370 4,4 7800 52
3. készítmény 1,9 430 5,6 6800 45
4. készítmény 1,9 530 9,5 2800 19
A II. táblázatból kitűnik, hogy a konjugált r-VIII SQ specifikus aktivitását lényegesen nagyobb fokban lehet megtartani, mint a 2. példában az r-VIII SQ szerint konjugált anyagét.
4. példa
Q Sepharose™ FF gélre adszorbeált FVIII mPEGtreziláttal történő összekapcsolás során
HU 221 208 Β1
A példában az adszorpció, az összekapcsolás és az r-VIII SQ Q Sepharose™ FF gélre történő eluálásának valamennyi lépését a 3. példa szerint hajtottunk végre. Az mPEG-trezilátot (móltömeg 5000) használtuk a Vili faktor konjugálására. A 111. táblázat mutatja a Q Sepharose™ FF gélre a találmány szerinti mPEG-treziláttal adszorbeált konjugált r-VIII SQ eredményeit.
III. táblázat
r-VIII SQ (mg) Hozzáadott mPEG mennyisége (mólfeleslcg) Módosítás foka (mPEG/rVIII) Specifikus aktivitás (IU/mg) Specifikus aktivitás (a természetes r-VIII SQ %-a)
Természetes r-VIII SQ - 0 0 15 000 100
1. készítmény 1,8 300 2,2 9600 64
2. készítmény 1,8 400 nincs adat 8300 55
3. készítmény 1,8 500 5,8 3400 23
A specifikus hatás ebben az esetben enyhén kevesebb, mint a 3. példában, valószínűleg az mPEG nagyobb molekulatömege következtében.
5. példa
VIII faktor adszorbeálása egy tapogató anioncserélő gélen az mPEG-szukcinát vegyes anhidriddel történő kondenzálás alatt
Egy Fractogel™ EMD TMAE-vel (Merck) töltött oszlopot használtunk az r-VIII SQ adszorbeálásra. Valamennyi lépést a 3. példa szerint hajtottuk végre. A IV. táblázat mutatja a tapogató anioncserélő gélre adszor25 beált r-VIII SQ konjugálását a találmány szerint egy mPEG-szukcinát vegyes anhidriddel.
IV. táblázat
r-VIII SQ (mg) Hozzáadott mPEG mennyisége (mólfeleslcg) Módosítás foka (mPEG/rVIII) Specifikus aktivitás (IU/mg) Specifikus aktivitás (a természetes r-VIII SQ %-a)
Természetes r-VIII SQ - 0 0 15 000 100
1. készítmény 2,0 300 nincs adat nincs adat
2. készítmény 2,0 500 nincs adat 2100 14
6. példa mPEG konjugált VIIIfaktor trombin aktiválása A konjugált r-VIII SQ trombin aktiválását a szakember számára jól ismert módon in vitro kísérlettel vizsgál- 45 tűk. A 3. példa szerint előállított mintát vizsgáltuk, amely 4 mPEG/r-VIII SQ származék képzési fokot eredményez. A konjugált r-VIII SQ-t humán trombinnal lehet aktiválni dózisfúggő eljárással. Ezt követően inaktiválás következik. Az I. táblázat mutatja a ha- 50 tás változásának görbéjét, ha hozzáadunk 1 egység trombint 1 egység konjugált r-VIII SQ-ra vonatkoztatva. Egy egylépéses megalvadási módszert végeztünk lényegében Mikaelsson és munkatársai, 1983, Blood 62, 1006. oldal szerint a reakcióelegyből kapott minták 55 azonnali megvizsgálására. Egy harmincszoros aktiválást értünk el 1 percen belül, amelyet inaktiválás követett. Az aktiválási és inaktiválási trombinnal kapott minták megegyeztek a VIII faktor trombin kölcsönhatásra irányuló kísérletek eredményeivel [Fulcerh és munka- θθ társai, 1983, Blood 61. oldal, 807, Andersson és munkatársai, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 2979. oldal, Eaton és munkatársai, 1986, Biochemistry, 25, 505. oldal, Rotblat és munkatársai, 1985, Biochemistry, 24. oldal, 4294)].
7. példa mPEG-ilezett Vili faktor stabilitás vizsgálatai egy sertésszövet-extraktumban
Ahhoz, hogy kiértékeljük az mPEG konjugálás VIII faktor stabilitására gyakorolt hatását, egy szubkután környezet reprezentatív oldatát használtuk, és in vitro PEG-ben sertésszövet-extraktumot használtunk. Az mPEG-konjugált VIII faktorból legalább két készítményt állítottunk elő a 3. példában leírt módon, és az extraktumban inkubáltuk. Az aliquotokat 0, 2, 4, 6 és 24 óra múlva analizáltuk koaguláló hatás szempontjából egy kromogén kísérlettel. Az első 6 óra alatt a konjugálás foka megfelelt a fennmaradó hatásnak.
HU 221 208 BI
V. táblázat
Fennmaradó aktivitás (%) 0 óra Fennmaradó aktivitás (%) 2 óra Fennmaradó aktivitás (%) 4 óra Fennmaradó aktivitás (%) 6 óra Fennmaradó aktivitás (%) 8 óra
Természetes r-VIII SQ kontroll 100 45 13 6 0
4,4 mPEG/rVIII 100 96 93 78 32
9,5 mPEG/rVIII 100 100 107 102 47
Az V. táblázat és a 2. ábra eredményei világosan mutatják, hogy az mPEG-konjugáció lényegesen fokozta a VIII faktor stabilitását.
8. példa mPEG-dezett VIIfaktor biohozzáférhetőségi tanulmánya cynomolgus majmokon Ahhoz, hogy az mPEG-konjugáció befolyását kiértékeljük a VIII faktor in vivő stabilitására, farmakokinetikai vizsgálatot kellett végezni. Két mPEG-gel konjugált VIII faktor készítményt állítottunk elő, a 3. példában 20 leírt módon meghatároztuk specifikus hatásukat a VI. táblázatban feltüntetett módon. A kapcsolási eljárással előállított származék nagyfokú homogenitásának eléréséhez minden készítmény ffakcionálását kétszer végeztük el gélpermeációs kromatografálással. A Superdex 25 200 PG XK 16/60 oszlopot (Pharmacia Biotech, Uppsala, Svédország) 19 mmol L-hisztidinnel, 0,31 mól nátrium-kloriddal, 3,4 mmol kalcium-kloriddal, 0,02% Tween 80-nal egyensúlyoztuk pH 7 értéken. A VIII faktor oldat térfogatcsökkentését a második gélpermeációs 30 kromatográfia előtt autoklávban Centriplus 30 koncentrátorokban végeztük, centrifugális ultraszűrő berendezéseket használtunk (30 kDa, Amicon Inc., MA, USA). Az oldatokat háromszor koncentráltuk 2500xg mellett 45 percig, az összeöntött frakciókat, melyeket a 2. 35 gélpermeációs kromatográfia után kaptunk, ezt követőleg egy pufferben hígítottuk, úgy, hogy a végső koncentráció beálljon; 19 mmol L-hisztidin, 0,31 mól nátrium-klorid, 3,4 mmol kalcium-klorid, 0,2 Tween 80, 17,5 mmol szacharóz, pH 7,0. A proteinoldatokat végül 0,22 Millex GV szűrőkön keresztül leszűrtük (Millipore, MA, USA), majd ezt követően autoklávos tartályokba 15 töltöttük. Az oldatokat -70 °C-on tároltuk felhasználásig. 6 nőstény cynomolgus majmot kezeltünk intravénás 1 készítmény 250 IU/kg mennyiséggel, és egy szubkután dózist alkalmaztunk az 1. és 2. készítményből különböző alkalmakkor 1500 IU/kg mennyiségben. Valamennyi oldatot injekciós vízzel hígítottunk 1:1 arányban az adagolás előtt. A szubkután adagolásra az injekciós helyet az állatból vagy jobb hátának területén választottuk ki, és az intravénás adagolásra pedig a bal vagy a jobb fejvivőerekbe adagoltuk. A vérmintákat valamennyi állatból a combcsonti vénából gyűjtöttük, a nátrium-citrátot mint az ossz térfogat 10%-át tartalmazó antikoagulánst tartalmazó kémcsövekbe az injekció után a következő időtartamokban:
Intravénás adagolás: 0 (predózis), 0,25, 1, 2, 4, 8, 24, 30,48 óra.
Szubkután adagolás: 0 (predózis), 3, 6, 9, 12, 15, 24, 30,48 óra.
A nemkonjugált VIII faktor farmakokinetikai vizsgálatát külön végeztük ugyanazon fajtán. A dózisokat, az adagolás módját és az eredményeket (átlagistandard eltérés (SD)) a VI. táblázat mutatja.
VI. táblázat
Specifikus hatás (IU/mg) Adagolás módja Dózis (IU/kg) Felezési idő (óra) Biohozzáfcrhctőscg (F‘>) (átlagiSD)
Nem konjugált rVIII SQ 15 000 I.V. 250 6,7 -
mPEG-rVIII 1. készítmény 10 000 I.V. 250 8,3
Nem konjugált rVIII SQ 15 000 S.C. 2500 - 0,053 (0,021)
mPEG-rVIII 1. készítmény 1000 S.C. 1500 - 0,22 (0,13)
mPEG-rVIII 2. készítmény 6700 S.D. 1500 - 0,19 (0,15)
I.V.=intravénás
S.C.—szubkután
AUC (S.C.) X dózis (I.V.) t)F =____1_-_____1__
AUC (I.V.) X dózis (S.C.) ahol AUC=a plazma koncentráció-idő görbe alatti terület.
A VI. táblázatból kitűnik, hogy mind a két mPEG-gel konjugált VIII faktor készítmény szubkután adagolása jelentősen magasabb biohozzáférhetőséget eredményezett a nemkonjugált r-VIII SQ szubkután adagolásával összevetve. A statisztikai analízis a Student t-teszt alkalmazásával igazolta, hogy a különbség szignifikáns volt.

Claims (24)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás egy javított in vivő működésű polipeptid előállítására a polipeptid védtelen célpontjainak megvédésével, azzal jellemezve, hogy
    a) a polipeptidet egy csoportspecifikus adszorbenst hordozó, szerves kémiai szintézissel előállított ligandumokkal való kölcsönhatással rögzítjük a polimer és a rögzített polipeptid reakcióképes aminosavai kondenzálásának megakadályozására a kölcsönhatás területén belül vagy azzal szomszédosán;
    b) egy biokompatibilis polimert aktiválunk;
    c) az aktivált biokompatibilis polimert a rögzített polipeptid külső helyeihez konjugáljuk; majd
    d) a konjugátumot az adszorbensről eluáljuk.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polipeptid koaguláló hatású vagy azt elősegítő hatású.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polipeptid VIII faktor, von Willebrand-faktor vagy ezek kombinációja, vagy IX faktor.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polipeptid teljes hosszúságú koaguláló hatású VIII faktor törölt származéka.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a VIII faktor törölt származéka egy rekombináns VIII faktor (r-VIII SQ) törölt származéka.
  6. 6. A 3-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a VIII faktor specifikus hatás aktivitása legalább 2000 IU/mg ossz protein a rögzítés előtt.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a VIII faktor specifikus aktivitása 5000-20 000 IU/ml ossz protein a rögzítés előtt.
  8. 8. A 3-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a VIII faktor aktivitása legalább 2000 IU/ml a rögzítés előtt.
  9. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a VIII faktor aktivitása 5000-50 000 IU/ml a rögzítés előtt.
  10. 10. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a biokompatibilis polimer monoalkil-végcsoporttal rendelkező polialkilén-oxidok homopolimerjeiből, kopolimerjeiből vagy blokk-kopolimerjeiből álló csoport lehet.
  11. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a monoalkil-végcsoporttal rendelkező polialkilén-oxid lehet polietilénglikol homopolimer vagy polipropilénglikol homopolimer csoport.
  12. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a monoalkil-végcsoporttal rendelkező polialkilén-oxid monometoxi-polietilénglikol (mPEG).
  13. 13. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a ligandum lehet anioncserélő vagy kationcserélő csoport, szulfhidrilcsoport, rögzített fémaffinitás-kromatográfiás csoport (IMAC), egyenes vagy elágazó láncú, telített vagy telítetlen szénhidrogénlánc vagy aromás csoport.
  14. 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az anioncserélő csoport lehet kvatemer amino-metil-, kvatemer amino-etil- vagy trimetil-aminoetil-csoport vagy ezek elegye.
  15. 15. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kovalens kötést a polipeptid aminocsoportjain, aktivált monometoxi-polietilénglikol- (mPEG) csoportból származó reagensekkel végezzük.
  16. 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az aktivált monoalkil-végcsoporttal ellátott polialkilén-oxid lehet mPEG-trezilát vagy mPEG-szukcinát vegyes anhidrid.
  17. 17. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárással kapott polipeptid és egy biokompatibilis polimer konjugátuma.
  18. 18. A 17. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy a polipeptid aktivitását a kötés előtti hatás legalább 30%-áig megtartja a konjugáció után.
  19. 19. A 18. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy a polipeptid aktivitását a konjugáció után a kötés előtti aktivitás legalább 50%-áig megtartja.
  20. 20. A VIII faktor, von Willebrand-faktor vagy ezek kombinációja vagy IX faktor és egy 3-16. igénypontok bármelyike szerinti biokompatibilis polimer konjugátuma gyógyszerként történő alkalmazásra.
  21. 21. Egy rekombináns VIII faktor SQ (r-VIII SQ) deléciós származéka és egy 20. igénypont szerinti biokompatibilis polimer konjugátuma, ahol a konjugáció foka 2-15 monoalkil-végcsoporttal ellátott PEG/rVIII SQ molekula.
  22. 22. A VIII faktor, a von Willebrand-faktor vagy ezek kombinációja vagy IX faktor és egy 3-16. igénypontok bármelyike szerinti biokompatibilis polimer konjugátumának alkalmazása gyógyszer előállítására hemophilia A, von Willebrand-betegség vagy hemophilia B betegség kezelésére.
  23. 23. A VIII faktor, a von Willebrand-faktor vagy ezek kombinációja vagy IX faktor és egy 22. igénypont szerinti biokompatibilis polimer konjugátumának alkalmazása gyógyszer előállítására szubkután, intramuszkuláris vagy intradermális adagolásra.
  24. 24. A VIII faktor, a von Willebrand-faktor vagy ezek kombinációja vagy IX faktor és egy 22. igénypont szerinti biokompatibilis polimer konjugátumának alkalmazása gyógyszer előállítására intravénás adagolásra.
HU9901203A 1995-09-29 1996-09-27 Conjugates of a polypeptide and a biocompatible polymer HU221208B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE9503380A SE9503380D0 (sv) 1995-09-29 1995-09-29 Protein derivatives
PCT/SE1996/001215 WO1997011957A1 (en) 1995-09-29 1996-09-27 Conjugates of a polypeptide and a biocompatible polymer

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP9901203A2 HUP9901203A2 (hu) 1999-07-28
HUP9901203A3 HUP9901203A3 (en) 2000-02-28
HU221208B1 true HU221208B1 (en) 2002-08-28

Family

ID=20399642

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9901203A HU221208B1 (en) 1995-09-29 1996-09-27 Conjugates of a polypeptide and a biocompatible polymer

Country Status (18)

Country Link
US (1) US6048720A (hu)
EP (3) EP1260582B1 (hu)
JP (1) JP3911023B2 (hu)
AT (3) ATE283351T1 (hu)
AU (1) AU706246B2 (hu)
BR (1) BR9610695A (hu)
CA (1) CA2231801C (hu)
DE (3) DE69634373T2 (hu)
DK (3) DK1258497T3 (hu)
ES (3) ES2236396T3 (hu)
HU (1) HU221208B1 (hu)
NO (2) NO321096B1 (hu)
NZ (1) NZ319322A (hu)
PL (1) PL185821B1 (hu)
PT (3) PT1258497E (hu)
SE (1) SE9503380D0 (hu)
WO (1) WO1997011957A1 (hu)
ZA (1) ZA968139B (hu)

Families Citing this family (171)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AT405740B (de) * 1996-12-13 1999-11-25 Immuno Ag Von willebrand-faktor-derivat sowie ein verfahren zur isolierung von proteinen
CZ298597B6 (cs) 1998-04-28 2007-11-21 Applied Research Systems Ars Holding N. V. Zpusob postupné vazby polyethylenglykolových skupin na polypeptid
US7425541B2 (en) * 1998-12-11 2008-09-16 Medarex, Inc. Enzyme-cleavable prodrug compounds
JP5149470B2 (ja) 1999-02-22 2013-02-20 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド 新規のアルブミンを含有していない第ｖｉｉｉ因子処方物
US6635676B2 (en) * 1999-04-28 2003-10-21 Regents Of The University Of Michigan Non-toxic antimicrobial compositions and methods of use
US7655252B2 (en) 1999-04-28 2010-02-02 The Regents Of The University Of Michigan Antimicrobial nanoemulsion compositions and methods
IT1318484B1 (it) * 2000-04-21 2003-08-25 Univ Roma Derivati di colina per il trattamento della malattia di alzheimer.
US20030211094A1 (en) 2001-06-26 2003-11-13 Nelsestuen Gary L. High molecular weight derivatives of vitamin k-dependent polypeptides
US6423826B1 (en) * 2000-06-30 2002-07-23 Regents Of The University Of Minnesota High molecular weight derivatives of vitamin K-dependent polypeptides
US7160540B2 (en) 2000-06-30 2007-01-09 Regents Of The University Of Minnesota Methods for detecting activity of clottings factors
WO2002004483A1 (en) * 2000-07-07 2002-01-17 Samokhin Gennady P Biologically active protein conjugates formed by first protecting active site
AU2002225681A1 (en) * 2000-11-15 2002-05-27 Globe Immune, Inc. Yeast-dentritic cell vaccines and uses thereof
JP2010209109A (ja) * 2001-06-25 2010-09-24 Regents Of The Univ Of Michigan 抗微生物ナノエマルジョンの組成物および方法
JP4444652B2 (ja) * 2001-07-11 2010-03-31 マキシゲン・ホールディングズ・リミテッド Ｇ−ｃｓｆ結合体
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US8008252B2 (en) 2001-10-10 2011-08-30 Novo Nordisk A/S Factor VII: remodeling and glycoconjugation of Factor VII
US7157277B2 (en) 2001-11-28 2007-01-02 Neose Technologies, Inc. Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII
CN102180944A (zh) * 2001-10-10 2011-09-14 诺和诺德公司 肽的重构和糖缀合
AU2004236174B2 (en) 2001-10-10 2011-06-02 Novo Nordisk A/S Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
SE0104186D0 (sv) * 2001-12-12 2001-12-12 Darcy Birse Method and device
CA2473526C (en) 2002-01-18 2013-10-22 Biogen Idec Ma Inc. Polyalkylene polymer compounds and uses thereof
US20030149246A1 (en) * 2002-02-01 2003-08-07 Russell John C. Macromolecular conjugates and processes for preparing the same
CA2475370A1 (en) * 2002-03-02 2003-09-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Conjugates of the c domain of human gelatinase a and polyethylene glycol, methods of purification and uses thereof
MXPA04012496A (es) 2002-06-21 2005-09-12 Novo Nordisk Healthcare Ag Glicoformos del factor vii pegilados.
US7659241B2 (en) 2002-07-31 2010-02-09 Seattle Genetics, Inc. Drug conjugates and their use for treating cancer, an autoimmune disease or an infectious disease
LT1596887T (lt) 2003-02-26 2022-04-25 Nektar Therapeutics Polimero-faktoriaus viii fragmento konjugatai
US7217794B2 (en) * 2003-04-02 2007-05-15 Daiamed, Inc. Compounds and methods for treatment of thrombosis
US8791070B2 (en) 2003-04-09 2014-07-29 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
CN1820024B (zh) * 2003-05-12 2011-06-22 阿费麦克斯公司 新的聚(乙二醇)修饰的化合物及其用途
US7947261B2 (en) * 2003-05-23 2011-05-24 Nektar Therapeutics Conjugates formed from polymer derivatives having particular atom arrangements
PT2644206T (pt) * 2003-05-23 2019-07-10 Nektar Therapeutics Derivados de peg contendo duas cadeias de peg
US9005625B2 (en) 2003-07-25 2015-04-14 Novo Nordisk A/S Antibody toxin conjugates
BR122018071808B8 (pt) 2003-11-06 2020-06-30 Seattle Genetics Inc conjugado
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US20060040856A1 (en) 2003-12-03 2006-02-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor IX
EP1694315A4 (en) * 2003-12-03 2009-10-28 Novo Nordisk As GLYCOPEGYLATED FACTOR IX
US20050171002A1 (en) * 2004-02-03 2005-08-04 Mohanty Dillip K. Polyoxyalkylene compound and method for making
EP1755652B1 (en) 2004-03-19 2010-11-24 Baxter International Inc. Factor ixa for the treatment of bleeding disorders
WO2005123140A2 (en) * 2004-06-08 2005-12-29 Alza Corporation Preparation of macromolecular conjugates by four-component condensation reaction
AU2014280936B2 (en) * 2004-06-30 2016-12-15 Nektar Therapeutics Polymer-factor ix moiety conjugates
KR101146160B1 (ko) * 2004-06-30 2012-07-16 넥타르 테라퓨틱스 중합체­인자 ｉｘ 부분의 접합체
US20080300173A1 (en) 2004-07-13 2008-12-04 Defrees Shawn Branched Peg Remodeling and Glycosylation of Glucagon-Like Peptides-1 [Glp-1]
JP4980915B2 (ja) * 2004-09-29 2012-07-18 ザ アドミニストレイターズ オブ ザ テューレイン エデュケイショナル ファンド Ｃ型肝炎ウイルスのインヒビター
DK2586456T3 (en) 2004-10-29 2016-03-21 Ratiopharm Gmbh Conversion and glycopegylation of fibroblast growth factor (FGF)
MX350293B (es) * 2004-11-12 2017-09-04 Bayer Healthcare Llc Modificacion dirigida al sitio del factor viii.
AU2012203813B2 (en) * 2004-11-12 2013-10-24 Bayer Healthcare Llc Site-directed modification of FVIII
AU2013203348B2 (en) * 2004-11-12 2016-03-03 Bayer Healthcare Llc Site-directed modification of FVIII
AU2016203693B2 (en) * 2004-11-12 2018-08-23 Bayer Healthcare Llc Site-directed modification of FVIII
JP2008519863A (ja) * 2004-11-12 2008-06-12 シアトル ジェネティクス インコーポレイティッド Ｎ末端にアミノ安息香酸単位を有するオーリスタチン
US7884075B2 (en) 2004-12-27 2011-02-08 Baxter International Inc. Polymer-factor VIII-von Willebrand factor-conjugates
EP1858543B1 (en) 2005-01-10 2013-11-27 BioGeneriX AG Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
US20080207505A1 (en) * 2005-01-12 2008-08-28 James Kenneth D Bna Conjugates and Methods of Use
EP2386571B1 (en) 2005-04-08 2016-06-01 ratiopharm GmbH Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
US20080255026A1 (en) * 2005-05-25 2008-10-16 Glycopegylated Factor 1X Glycopegylated Factor Ix
WO2007008848A2 (en) 2005-07-07 2007-01-18 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds having phenylalanine carboxy modifications at the c-terminus
CA2614436C (en) 2005-07-07 2016-05-17 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds having phenylalanine side-chain modifications at the c-terminus
US7395967B2 (en) * 2005-07-21 2008-07-08 University Of Washington Methods and systems for counterbalancing a scanning beam device
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
US7855279B2 (en) 2005-09-27 2010-12-21 Amunix Operating, Inc. Unstructured recombinant polymers and uses thereof
US20090048440A1 (en) 2005-11-03 2009-02-19 Neose Technologies, Inc. Nucleotide Sugar Purification Using Membranes
EP1816201A1 (en) 2006-02-06 2007-08-08 CSL Behring GmbH Modified coagulation factor VIIa with extended half-life
US7750116B1 (en) * 2006-02-18 2010-07-06 Seattle Genetics, Inc. Antibody drug conjugate metabolites
KR20080108147A (ko) 2006-03-31 2008-12-11 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 페질화된 인자 ｖｉｉｉ
US7985839B2 (en) 2006-03-31 2011-07-26 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
US7982010B2 (en) 2006-03-31 2011-07-19 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
US7645860B2 (en) 2006-03-31 2010-01-12 Baxter Healthcare S.A. Factor VIII polymer conjugates
EP2049144B8 (en) 2006-07-21 2015-02-18 ratiopharm GmbH Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences
US20100075375A1 (en) * 2006-10-03 2010-03-25 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates
LT2068907T (lt) * 2006-10-04 2018-01-10 Novo Nordisk A/S Glicerolio sujungti pegilinti sacharidai ir glikopeptidai
ES2521490T3 (es) 2006-12-15 2014-11-12 Baxter International Inc. Conjugado de factor VIIa - ácido (poli)siálico con una vida media in vivo prolongada.
WO2008077616A1 (en) 2006-12-22 2008-07-03 Csl Behring Gmbh Modified coagulation factors with prolonged in vivo half-life
EP2097108B1 (en) * 2006-12-27 2014-02-12 Nektar Therapeutics Factor ix moiety-polymer conjugates having a releaseable linkage
EP2114458B1 (en) 2006-12-27 2014-02-26 Nektar Therapeutics Von willebrand factor- and factor viii-polymer conjugates having a releasable linkage
CN101796063B (zh) 2007-04-03 2017-03-22 拉蒂奥法姆有限责任公司 使用糖聚乙二醇化g‑csf的治疗方法
RU2469739C2 (ru) * 2007-04-26 2012-12-20 БАЙЕР ХЕЛСКЕА ЛЛСи Стабилизация жидких растворов рекомбинантного белка для хранения в замороженном состоянии
US8747872B2 (en) 2007-05-02 2014-06-10 The Regents Of The University Of Michigan Nanoemulsion therapeutic compositions and methods of using the same
ES2551123T3 (es) 2007-06-12 2015-11-16 Ratiopharm Gmbh Proceso mejorado para la producción de azúcares de nucleótido
AU2008261261B2 (en) * 2007-06-13 2013-06-27 Csl Behring Gmbh Use of VWF stabilized FVIII preparations and of VWF preparations without FVIII for extravascular administration in the therapy and prophylactic treatment of bleeding disorders
ES2579323T3 (es) 2007-07-16 2016-08-09 Genentech, Inc. Anticuerpos anti-CD79B e inmunoconjugados y métodos de uso
AU2008276128B2 (en) 2007-07-16 2013-10-10 Genentech, Inc. Humanized anti-CD79b antibodies and immunoconjugates and methods of use
US20090035848A1 (en) * 2007-08-03 2009-02-05 Robert Hickey Moving bed biofilm reactor (mbbr) system for conversion of syngas components to liquid products
EP2222329A1 (en) * 2007-11-09 2010-09-01 Baxter International Inc. Modified recombinant factor viii and von willebrand factor and methods of use
CL2009000062A1 (es) 2008-01-31 2010-05-14 Genentech Inc Anticuerpo humanizado anti cd79b; con modificaciones de cisterna libre; inmunoconjugado que contiene dicho anticuerpo y una droga; polinucleotido que codifica el anticuerpo; vector, celula huesped; composicion farmaceutica y uso de dicha composicion para tratar cancer, preferentemente linfomas.
MX2010009154A (es) 2008-02-27 2010-09-09 Novo Nordisk As Moleculas conjugadas del factor viii.
CA2726942A1 (en) * 2008-06-04 2009-12-10 Bayer Healthcare Llc Fviii muteins for treatment of von willebrand disease
KR101507718B1 (ko) 2008-06-24 2015-04-10 체에스엘 베링 게엠베하 연장된 생체내 반감기를 갖는 인자 ｖｉｉｉ, 폰 빌레브란트 인자 또는 이들의 복합체
EP2349341B1 (en) 2008-10-15 2013-10-09 Baxter Healthcare SA Pegylation of recombinant blood coagulation factors in the presence of bound antibodies
KR20110093775A (ko) * 2008-11-03 2011-08-18 바이엘 헬스케어 엘엘씨 혈우병 치료 방법
NZ593190A (en) 2008-11-07 2013-01-25 Baxter Int Factor viii formulations
EP2376089B1 (en) 2008-11-17 2018-03-14 The Regents of the University of Michigan Cancer vaccine compositions and methods of using the same
LT2393828T (lt) 2009-02-03 2017-01-25 Amunix Operating Inc. Prailginti rekombinantiniai polipeptidai ir juos apimančios kompozicijos
KR101832937B1 (ko) 2009-07-27 2018-02-28 박스알타 인코퍼레이티드 혈액 응고 단백질 복합체
ES2590679T3 (es) 2009-07-27 2016-11-23 Lipoxen Technologies Limited Glicopolisialilación de proteínas diferentes a proteínas de coagulación de la sangre
SG10201401194VA (en) 2009-07-27 2014-07-30 Lipoxen Technologies Ltd Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
EP2470559B1 (en) 2009-08-24 2017-03-22 Amunix Operating Inc. Coagulation factor ix compositions and methods of making and using same
MX336830B (es) 2009-12-06 2016-02-03 Biogen Hemophilia Inc Polipeptidos hibridos y quimericos del factor viii-fc, y metodos de uso de los mismos.
WO2011123813A2 (en) 2010-04-02 2011-10-06 Amunix Operating Inc. Binding fusion proteins, binding fusion protein-drug conjugates, xten-drug conjugates and methods of making and using same
GB201007356D0 (en) 2010-04-30 2010-06-16 Leverton Licence Holdings Ltd Conjugated factor VIIa
WO2012006635A1 (en) 2010-07-09 2012-01-12 Biogen Idec Hemophilia Inc. Processable single chain molecules and polypeptides made using same
WO2012006623A1 (en) 2010-07-09 2012-01-12 Biogen Idec Hemophilia Inc. Systems for factor viii processing and methods thereof
WO2012079979A1 (en) * 2010-12-16 2012-06-21 Novo Nordisk A/S Aqueous factor viii solution
EA032056B1 (ru) 2010-12-22 2019-04-30 Баксалта Инкорпорейтид Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты, способы получения конъюгата терапевтического белка и производного жирной кислоты (варианты)
WO2012170969A2 (en) 2011-06-10 2012-12-13 Biogen Idec Ma Inc. Pro-coagulant compounds and methods of use thereof
EA029045B1 (ru) 2011-07-08 2018-02-28 Байоджен Хемофилия Инк. Химерные и гибридные полипептиды фактора viii и способы их применения
WO2013016454A1 (en) 2011-07-25 2013-01-31 Biogen Idec Hemophilia Inc. Assays to monitor bleeding disorders
LT2802668T (lt) 2012-01-12 2018-11-26 Bioverativ Therapeutics Inc. Imunogeninio atsako prieš faktorių viii individuose, kuriems skiriama faktoriaus viii terapija, sumažinimas
LT2804623T (lt) 2012-01-12 2019-12-10 Bioverativ Therapeutics Inc Chimeriniai viii faktoriaus polipeptidai ir jų panaudojimas
PL2814502T3 (pl) 2012-02-15 2018-02-28 Csl Behring Gmbh Warianty czynnika von Willebranda mające ulepszone powinowactwo do wiązania czynnika VIII
WO2013123457A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Biogen Idec Ma Inc. Recombinant factor viii proteins
RS63870B1 (sr) 2012-02-15 2023-01-31 Bioverativ Therapeutics Inc Sastavi faktora viii i postupci za pravljenje i upotrebu istih
CA2865578C (en) 2012-02-27 2023-01-17 Amunix Operating Inc. Xten conjugate compositions and methods of making same
IL235129B (en) * 2012-04-16 2022-06-01 Cantab Biopharmaceuticals Patents Ltd Therapeutic compounds for subcutaneous administration
US20150080309A1 (en) 2012-04-24 2015-03-19 Nova Nordisk A/S Compounds Suitable for Treatment of Haemophilia
US10202595B2 (en) 2012-06-08 2019-02-12 Bioverativ Therapeutics Inc. Chimeric clotting factors
CN104519897A (zh) 2012-06-08 2015-04-15 比奥根艾迪克Ma公司 促凝血化合物
EP3404105A1 (en) 2012-07-06 2018-11-21 Bioverativ Therapeutics Inc. Cell line expressing single chain factor viii polypeptides and uses thereof
ES2770501T3 (es) 2012-07-11 2020-07-01 Bioverativ Therapeutics Inc Complejo del factor VIII con XTEN y proteína del factor de Von Willebrand y sus usos
US10001495B2 (en) 2012-07-25 2018-06-19 Bioverativ Therapeutics Inc. Blood factor monitoring assay and uses thereof
US10391152B2 (en) 2012-10-18 2019-08-27 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of using a fixed dose of a clotting factor
US20150266944A1 (en) 2012-10-30 2015-09-24 Biogen Idec Ma Inc. Methods of Using FVIII Polypeptide
WO2014080251A1 (en) 2012-11-24 2014-05-30 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. Hydrophilic linkers and their uses for conjugation of drugs to cell binding molecules
HRP20231183T1 (hr) 2013-02-15 2024-01-05 Bioverativ Therapeutics Inc. Optimizirani gen faktora viii
TWI683666B (zh) 2013-03-15 2020-02-01 美商百歐維拉提夫治療公司 因子ｉｘ多肽調配物
JP6330026B2 (ja) 2013-03-15 2018-05-23 バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド 第ｖｉｉｉ因子ポリペプチド製剤
EP2796145B1 (en) 2013-04-22 2017-11-01 CSL Ltd. A covalent complex of von willebrand factor and faktor viii linked by a disulphide bridge
EP4368194A3 (en) 2013-06-28 2024-07-31 Bioverativ Therapeutics Inc. Thrombin cleavable linker with xten and its uses thereof
EP3875106A1 (en) 2013-08-08 2021-09-08 Bioverativ Therapeutics Inc. Purification of chimeric fviii molecules
TWI667255B (zh) 2013-08-14 2019-08-01 美商生物化學醫療公司 因子ｖｉｉｉ－ｘｔｅｎ融合物及其用途
EP3065769A4 (en) 2013-11-08 2017-05-31 Biogen MA Inc. Procoagulant fusion compound
WO2015085276A1 (en) 2013-12-06 2015-06-11 Biogen Idec Ma Inc. Population pharmacokinetics tools and uses thereof
SG11201605242YA (en) 2014-01-10 2016-07-28 Biogen Ma Inc Factor viii chimeric proteins and uses thereof
AU2015214245B2 (en) 2014-02-04 2020-09-10 Biogen Ma Inc. Use of cation-exchange chromatography in the flow-through mode to enrich post-translational modifications
ES2960619T3 (es) 2014-02-28 2024-03-05 Hangzhou Dac Biotech Co Ltd Enlazadores cargados y sus usos para la conjugación
BR112016030950A2 (pt) 2014-07-02 2018-03-27 Csl Ltd polipeptídeo modificado que se liga ao fator viii, complexo, composição farmacêutica, métodos para tratar uma coagulopatia, para produzir um polipeptídeo que compreende um vwf modificado e para aumentar a afinidade de ligação ao fator viii do vwf e a meia-vida do fator viii, uso de um polipeptídeo modificado ou de um complexo, polinucleotídeo, plasmídeo ou vetor, e, célula hospedeira.
EP3689910A3 (en) 2014-09-23 2020-12-02 F. Hoffmann-La Roche AG Method of using anti-cd79b immunoconjugates
MA40864A (fr) 2014-10-31 2017-09-05 Biogen Ma Inc Hypotaurine, gaba, bêta-alanine et choline pour la régulation de l'accumulation de sous-produits résiduaires dans des procédés de culture de cellules mammifères
CN107406493B (zh) 2015-03-06 2021-08-13 康诺贝林伦瑙有限公司 具有改善的半衰期的经修饰的血管性血友病因子
AU2016266627A1 (en) 2015-05-22 2018-01-18 CSL Behring Lengnau AG Truncated von Willebrand Factor polypeptides for treating hemophilia
CA2986625A1 (en) 2015-05-22 2016-12-01 Csl Behring Recombinant Facility Ag Methods for preparing modified von willebrand factor
CA2991973C (en) 2015-07-12 2021-12-07 Suzhou M-Conj Biotech Co., Ltd. Bridge linkers for conjugation of a cell-binding molecule
US9839687B2 (en) 2015-07-15 2017-12-12 Suzhou M-Conj Biotech Co., Ltd. Acetylenedicarboxyl linkers and their uses in specific conjugation of a cell-binding molecule
UA126016C2 (uk) 2015-08-03 2022-08-03 Біовератів Терапеутікс Інк. Злитий білок фактора іх
BR112018009717B1 (pt) 2015-11-13 2021-12-14 Takeda Pharmaceutical Company Limited Polinucleotídeo, vetor de vírus adeno-associado, partícula de um vírus adeno-associado, métodos para produzir uma partícula de vírus adeno-associado e para transduzir uma célula hospedeira, e, uso de uma partícula de vírus adeno-associado
JP6695426B2 (ja) 2015-11-13 2020-05-20 バクスアルタ インコーポレイテッド 組換えｆｖｉｉｉ変異型をコードする血友病ａ遺伝子治療用高発現ウイルスベクター
RU2018128582A (ru) 2016-01-07 2020-02-11 Цсл Беринг Ленгнау Аг Мутированный укороченный фактор фон виллебранда
CN108779165B (zh) 2016-01-07 2022-12-02 康诺贝林伦瑙有限公司 突变的冯·维勒布兰德因子
EP3411478B1 (en) 2016-02-01 2022-06-08 Bioverativ Therapeutics Inc. Optimized factor viii genes
WO2017222337A1 (ko) 2016-06-24 2017-12-28 재단법인 목암생명과학연구소 Fviii 및 vwf 인자를 포함하는 키메라 단백질 및 그 용도
EP3538134B1 (en) 2016-11-11 2021-12-29 CSL Behring Lengnau AG Truncated von willebrand factor polypeptides for extravascular administration in the treatment or prophylaxis of a blood coagulation disorder
DK3538133T3 (da) 2016-11-11 2021-04-19 CSL Behring Lengnau AG Trunkeret von willebrand faktor polypeptider til behandling af hæmofili
CN110099682B (zh) 2016-11-14 2023-03-31 杭州多禧生物科技有限公司 偶联连接体，含有此连接体的细胞结合分子-药物偶联物及其制备和应用
US20200085915A1 (en) 2016-12-02 2020-03-19 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of inducing immune tolerance to clotting factors
EP3548066A1 (en) 2016-12-02 2019-10-09 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of treating hemophilic arthropathy using chimeric clotting factors
KR20200035130A (ko) 2017-08-09 2020-04-01 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크. 핵산 분자 및 이의 용도
CA3090136A1 (en) 2018-02-01 2019-08-08 Bioverativ Therapeutics, Inc. Use of lentiviral vectors expressing factor viii
TW202014181A (zh) 2018-04-04 2020-04-16 美商希吉隆醫療公司 可植入顆粒及相關方法
TW202015723A (zh) 2018-05-18 2020-05-01 美商百歐維拉提夫治療公司 治療ａ型血友病的方法
WO2020018419A1 (en) 2018-07-16 2020-01-23 Baxalta Incorporated Gene therapy of hemophilia a using viral vectors encoding recombinant fviii variants with increased expression
MX2021001599A (es) 2018-08-09 2021-07-02 Bioverativ Therapeutics Inc Moleculas de acido nucleico y sus usos para la terapia genica no viral.
UY38389A (es) 2018-09-27 2020-04-30 Sigilon Therapeutics Inc Dispositivos implantables para terapia celular y métodos relacionados
WO2020150375A1 (en) 2019-01-16 2020-07-23 Baxalta Incorporated Viral vectors encoding recombinant fviii variants with increased expression for gene therapy of hemophilia a
TW202115127A (zh) 2019-06-19 2021-04-16 美商百歐維拉提夫治療公司 治療血友病及低骨質密度之方法及組成物
CN114981299A (zh) 2019-12-12 2022-08-30 武田药品工业株式会社 使用编码具有增加的表达的重组fviii变体的病毒载体的a型血友病的基因疗法
WO2022264040A1 (en) 2021-06-14 2022-12-22 Takeda Pharmaceutical Company Limited Gene therapy of hemophilia a using viral vectors encoding recombinant fviii variants with increased expression
JP2024532262A (ja) 2021-08-23 2024-09-05 バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド 最適化第ｖｉｉｉ因子遺伝子
WO2023056331A1 (en) 2021-09-30 2023-04-06 Bioverativ Therapeutics Inc. Nucleic acids encoding factor viii polypeptides with reduced immunogenicity
WO2024081309A1 (en) 2022-10-11 2024-04-18 Sigilon Therapeutics, Inc. Engineered cells and implantable elements for treatment of disease

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59172425A (ja) * 1983-03-18 1984-09-29 Nippon Chemiphar Co Ltd 新規な血液凝固因子誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血液凝固促進剤
US4970300A (en) * 1985-02-01 1990-11-13 New York University Modified factor VIII
SE8501050D0 (sv) * 1985-03-05 1985-03-05 Kabivitrum Ab Biologically active fragments of human antihemophilic factor and method for preparation thereof
DE3717210C2 (de) * 1987-05-22 1993-11-25 Diagen Inst Molekularbio Verfahren zur Modifizierung von Nukleinsäuren
US4904584A (en) * 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
SE465222C5 (sv) * 1989-12-15 1998-02-10 Pharmacia & Upjohn Ab Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning
WO1992016555A1 (en) * 1991-03-18 1992-10-01 Enzon, Inc. Hydrazine containing conjugates of polypeptides and glycopolypeptides with polymers
US5169627A (en) * 1991-10-28 1992-12-08 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Oral pharmaceutical composition containing a polyethylene glycol-immunoglobulin G conjugate for reconstitution of secretory immunity and method of reconstituting secretory immunity
GB9225448D0 (en) * 1992-12-04 1993-01-27 Erba Carlo Spa Improved synthesis of polymer bioactive conjugates
AU6029594A (en) * 1993-01-15 1994-08-15 Enzon, Inc. Factor viii - polymeric conjugates
US5621039A (en) * 1993-06-08 1997-04-15 Hallahan; Terrence W. Factor IX- polymeric conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
EP0871649A1 (en) 1998-10-21
ATE228531T1 (de) 2002-12-15
DE69625085T2 (de) 2003-07-17
PL325958A1 (en) 1998-08-17
ES2236396T3 (es) 2005-07-16
EP1258497A3 (en) 2002-11-27
US6048720A (en) 2000-04-11
PT1258497E (pt) 2005-06-30
DE69634373T2 (de) 2005-12-29
AU706246B2 (en) 1999-06-10
EP1258497B1 (en) 2005-02-16
SE9503380D0 (sv) 1995-09-29
DE69625085D1 (de) 2003-01-09
NO20051950L (no) 1998-03-27
CA2231801A1 (en) 1997-04-03
ATE289321T1 (de) 2005-03-15
CA2231801C (en) 2010-07-27
AU7151796A (en) 1997-04-17
NO981408D0 (no) 1998-03-27
NZ319322A (en) 1998-08-26
JPH11513378A (ja) 1999-11-16
WO1997011957A1 (en) 1997-04-03
ATE283351T1 (de) 2004-12-15
DK1258497T3 (da) 2005-06-06
DK0871649T3 (da) 2003-03-24
PT871649E (pt) 2003-04-30
ZA968139B (en) 1997-05-29
DK1260582T3 (da) 2005-03-29
DE69633952D1 (de) 2004-12-30
ES2238522T3 (es) 2005-09-01
PL185821B1 (pl) 2003-08-29
EP1260582B1 (en) 2004-11-24
NO981408L (no) 1998-03-27
EP0871649B1 (en) 2002-11-27
DE69633952T2 (de) 2006-03-02
JP3911023B2 (ja) 2007-05-09
PT1260582E (pt) 2005-03-31
EP1260582A1 (en) 2002-11-27
HUP9901203A3 (en) 2000-02-28
HUP9901203A2 (hu) 1999-07-28
DE69634373D1 (de) 2005-03-24
NO321096B1 (no) 2006-03-13
EP1258497A2 (en) 2002-11-20
BR9610695A (pt) 1999-07-06
ES2187676T3 (es) 2003-06-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3911023B2 (ja) ポリペプチドと生体適合性ポリマーとのコンジュゲート
CN105148287B (zh) Fviii的位点定向修饰
JPH06172201A (ja) 生物学的活性タンパク質性組成物
CA2748662A1 (en) Protein conjugate having an endopeptidase-cleavable bioprotective moiety
MXPA98002416A (es) Conjugados de un polipeptido y un polimero biocompatible
KR20180031775A (ko) 긴 반감기 응집 복합체와 관련된 방법 및 조성물
AU2016203693B2 (en) Site-directed modification of FVIII