DE3717210C2 - Verfahren zur Modifizierung von Nukleinsäuren - Google Patents
Verfahren zur Modifizierung von NukleinsäurenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Modifizierung
von Nukleinsäuren.
Die Behandlung von Biopolymeren mit Enzymen und bioche
mischen Reagenzien stellt eine zentrale Verfahrensweise
in der Biochemie und der Praxis der Molekularbiologie
dar. In biochemischen Laboratorien werden insbesondere
Proteine und Nukleinsäuren modifiziert. Die dazu nöti
gen Reaktionen werden zu einem großen Teil in homoge
ner, wäßriger Phase durchgeführt. Es sind auch Verfah
ren bekannt, bei denen das Substrat kovalent an eine
feste Matrix gebunden und dann durch entsprechende Rea
genzien modifiziert wird. Um die modifizierten Biopoly
mere anschließend wieder von der festen Matrix zu lö
sen, sind weitere Reaktionsschritte erforderlich, ins
besondere das Lösen von kovalenten Bindungen. Dabei
sind Nebenreaktionen, die zu Ausbeuteverlusten führen,
nicht zu vermeiden. Das an sich fortschrittliche und
wertvolle Verfahren gemäß dem Stand der Technik wird
dadurch allerdings in seiner Anwendungsbreite deutlich
eingeschränkt, da beim Ablösen des Substrates von der
Matrix auch in modifizierten Biopolymeren kovalente
Bindungen aufgebrochen werden können, was nicht nur die
Ausbeute beeinträchtigt, sondern auch zu Kontaminatio
nen führt und somit aufwendige Reinigungs- und Trennver
fahren notwendig macht.
Ähnlich liegen die Verhältnisse im molekularbiologi
schen Bereich, wo enzymatische Veränderungen von Biopo
lymeren, insbesondere Nukleinsäuren, eine dominierende
Rolle spielen. Diese Reaktionen werden bisher lediglich
in homogener Lösung durchgeführt.
Häufig ist es notwendig, enzymatische Reaktionen in
aufeinanderfolgenden Schritten durchzuführen, wobei für
jeden Schritt in der Regel eine andere gepufferte Lö
sung verwendet und das vorangehende Enzym entfernt wer
den muß. Bisher wurde daher zwischen diesen einzelnen
Schritten die Reaktionslösung jeweils mit Phenol ver
setzt, zentrifugiert, mit Chloroform versetzt, erneut
zentrifugiert und nach einer Ethanolfällung wiederum
zentrifugiert. Diese Schritte sind äußerst zeitaufwen
dig, führen zu Ausbeuteverlusten und erhöhen insgesamt
die Zahl der möglichen Fehler- und Kontaminationsquel
len. Es werden neben den enzymatischen Reaktionen auch
Modifizierungen auf biochemischem Wege durchgeführt,
wie beispielsweise Methylierungen.
Aus Chem. Ind. 34 (1982), 524-528 gehen fixierte
Enzymsysteme hervor, wie Glukoseisomerase, bei denen
Substrate wie Glukose umgesetzt werden, in dem diese an
immobilisierten Enzymen (Glukoseisomerase) vorbeigeführt
werden. Die Immobilisierung kann auch durch adsorbtive
Effekte bewirkt sein. Aus Chemical Engineering News
26. 08. 1985, Seiten 17 bis 32 geht hervor, das Affinitätschromatographie
eine wertvolle Technik zur Reinigung
von Enzymen, zum Studium von Zellwechselwirkungen
und zur Erforschung von Hormonrezeptoren darstellt.
Dort wird insbesondere auch auf die in der Merryfield-
Synthese üblichen Festphasen-Syntheseverfahren hingewiesen.
Aus Biotechnological Applications of Proteins
and Enzymes 1976, Seite 94 ist bekannt, ein reversibel
immobilisiertes Protein als Biopolymer mittels eines
zugeführten Enzyms zu modifizieren, wobei dann die
Produkte von der oberflächlich mit chemischen Gruppen
versehenen Matrix desorbiert werden. Die Adsorption
findet dort jedoch mittels einer Disulfidbindung, also
einer kovalenten Bindung, statt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfah
ren bereitzustellen, das die Modifizierung von Nukleinsäuren
in universell anwendbarer, einfacher Weise ermöglicht,
indem das Substrat nach der Reaktion ohne
weitere chemische Reaktion, also mittels physikalischer
Prozesse, weiterverwendet werden kann. Des weiteren
soll das erfindungsgemäße Verfahren aufwendige Reinigungs-,
Trenn- und Isolierungsverfahren überflüssig
machen bei mehrstufigen Modifizierungsreaktionen an den
Nukleinsäuren.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Ver
fahren zur Modifizierung von Nukleinsäuren, wobei die
zu modifizierenden Nukleinsäuren
- a) an einem Adsorbens reversibel selektiv immobilisiert,
- b) im adsorbierten Zustand mit Restriktionsenzymen und/oder Nukleinsäure modifizierenden Proteinen behandelt werden,
- c) danach gewünschtenfalls weiterverwendet und
- d) die Reaktionsprodukte vom Adsorbens desorbiert wer den.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Adsorbens
eine poröse Matrix, wobei die poröse Matrix oberflächlich
mit Ionenaustauschern, Chelatbildnern oder Affinitätsliganden
modifiziert ist. In einer anderen bevorzugten
Ausführungsform ist das Adsorbens mit reaktiven
chemischen Gruppen modifiziert, wobei an die reaktiven
chemischen Gruppen beispielsweise Affinitätsliganden
gebunden werden können. Affinitätsliganden im Sinne
dieser Erfindung sind Stoffe, die zu den zu modifizierenden
Nukleinsäuren eine reversible, spezifische
Wechselwirkung ausbilden und somit die zu modifizierenden
Nukleinsäuren reversibel immobilisieren können. In
der deutschen Patentanmeldung der Anmelderin P 36 39 949
wird ein Verfahren zur Trennung von langkettigen
Nukleinsäuren unterschiedlichster Provenienz vorgeschlagen.
Das dort eingesetzte Material ist eine
oberflächlich modifizierte, partikuläre poröse Matrix,
insbesondere auf Silicagelbasis mit einer Partikelgröße
von 15 bis 250 µm und einer Porengröße von 100 bis 2500 nm
(bekannt aus DE-OS 32 11 309 der Anmelderin).
Als Adsorbentien kommen ebenfalls Träger in Betracht,
die mit Anionenaustauschern wie DE-52 Cellulose (What
man, Katalog-Nr. 4057-050) oder Fractogel TSK DEAE-650
(Merck, Katalog-Nr. 14 989) beschichtet sind.
Es hat sich überraschenderweise herausgestellt, daß an
oben beschriebenen Materialien adsorbierte Nukleinsäuren
modifiziert werden können. Es lassen sich beispielswei
se endonukleolytische Spaltungen mit Restriktionsendo
nukleasen, Polymerasereaktionen etc. an
adsorptiv immobilisierten Nukleinsäuren durchführen.
Wenn die Nukleinsäure im immobilisierten Zustand
modifiziert wird, genügt das Entfernen der Lösung und
einmaliges Waschen
mit Puffer, bevor die folgende Enzymreaktion unter den
entsprechenden neuen Pufferbedingungen stattfinden
kann. Bei Verwendung von Ionenaustauschern zur Modifi
zierung von Nukleinsäuren mittels Restriktionsenzymen
wurde überraschenderweise gefunden, daß eine geringere
Ladungsdichte des Ionenaustauschermaterials zu einer
vollständigeren Verdauung (90 bis 95%) der Nukleinsäure
führt. Benutzt man hingegen ein Ionenaustauschermateri
al mit höherer Ladungsdichte, beispielsweise bekannt
aus DE-OS 32 11 309 der Anmelderin, resultiert eine nur
partielle enzymatische Verdauung der betreffenden Nukle
insäure.
Die Bereitstellung eines Verfahrens zur reproduzierba
ren partiellen Verdauung von Nukleinsäuren ist eine
weitere wertvolle Variante des erfindungsgemäßen Ver
fahrens. Nach der bekannten Verfahrensweise von Smith
und Birnstiel (Nucleic Acid Research 3, 2387, 1976)
werden partielle Verdauungen von endmarkierten Fragmen
ten zur Kartierung von Restriktionsenzymschnittstellen
verwendet. Die partiellen Verdauungen müssen über Enzym
kinetiken hergestellt werden, die vergleichsweise ar
beitsintensiv sind. Das erfindungsgemäße Verfahren er
öffnet die Möglichkeit, diese Methodik mit immobili
sierter DNS durchzuführen, wobei die Erstellung von
Kinetiken nicht erforderlich ist. Der notwendige Ar
beitsaufwand wird dadurch auf etwa 1/10 des herkömmli
chen beschränkt bei gleichzeitig hoher Reproduzierbar
keit und niedriger Fehleranfälligkeit in der Methodik.
Derartige Kartierungen gehören zu den im molekulargene
tischen Labor sehr häufig angewendeten Methoden und
gewinnen auch in der Diagnostik an Bedeutung.
Die selektive Adsorption der Nukleinsäuren ist
einerseits von der Wahl des Adsorbens als auch an
dererseits von der Wahl der Bedingungen in der Lösung
(Pufferbedingungen) abhängig. So kann beispielsweise
die zu modifizierende Nukleinsäure in Puffern mit nie
driger Ionenstärke adsorbiert werden. Dabei werden, wie
in der deutschen Patentanmeldung P 36 39 949 der Anmel
derin vorgeschlagen, nur langkettige Nukleinsäuren ad
sorbiert. Sie können dann nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren modifiziert werden. Ganz allgemein läßt das
erfindungsgemäße Verfahren aber auch die Prozessierung
von immobilisierten Nukleinsäuren mit Nukleinsäuren
modifizierenden Proteinen zu.
Eine Desorption der modifizierten Nukleinsäuren erfolgt
vorzugsweise durch Änderung der Pufferbedingungen (Io
nenstärke, pH, kompetitive Liganden etc.). Es ist aller
dings auch denkbar, daß insbesondere bei Verdauungsreak
tionen eine Ablösung des Reaktionsproduktes stattfinden
kann. In solchen Fällen kann sich die Desorption erübri
gen.
Neben den enzymatischen Reaktionen können auch biochemische
Veränderungen an den Nukleinsäuren in eleganter
Weise ausgeführt werden. Auch hier wird zunächst die Nukleinsäure
am Adsorbens immobilisiert. Dann werden die
spezifischen Bedingungen der biochemischen Reaktion im
einfachsten Fall durch Umpuffern (Pufferaustausch) ein
gestellt, woraufhin die entsprechende Reaktion durchge
führt wird. Es können so in geeigneter Weise Reaktionen
wie Methylierungen, Seitenkettenmodifizierungen sowie
die Einführung von radioaktiven Isotopen durchgeführt
werden. Auch eine enzymatische Einführung radioaktiv
markierter Komponenten ist an den immobilisierten Mole
külen durchführbar. Nukleinsäuren können im adsorbier
ten Zustand, insbesondere gebunden an Ionenaustauscher,
wie in der deutschen Patentanmeldung P 36 39 949 der
Anmelderin vorgeschlagen, Fractogel TSK DEAE-650 und
DE-52 Cellulose (Whatman) nach den üblichen Arbeitsan
weisungen (siehe Maniatis et al. 1982, Cold Spring Har
bor Laboratory, ISBN 0-87969-136-0, New York) enzyma
tisch behandelt werden. Vor Zugabe des Enzyms empfiehlt
es sich, mit Rinderserumalbumin (BSA) und dem später zu
verwendenden Puffer eventuell verbliebene Bindungsstel
len abzusättigen, so daß das anschließend hinzugesetzte
Enzym nicht adsorbiert wird. Auf diese Weise lassen
sich gängige Reaktionen der Nukleinsäurebiochemie
durchführen, zum Beispiel restriktionsendonukleolyti
sche Spaltungen von DNS, Polymerasereaktionen (ein
schließlich radioaktiver Markierungen wie Nicktransla
tion und Endmarkierungen mit Klenow-Polymerase), Methy
lierungen, Phosphatasebehandlungen. Überraschender
weise erlauben Anionenaustauscher mit niedriger Ladungs
dichte eine fast vollständige Reaktion (90%), während
Ionenaustauscher, die durch eine hohe Ladungsträgerdich
te gekennzeichnet sind, lediglich partielle (50 bis
70%) Umsetzung gestatten.
Generell wird im Anschluß an die enzymatische Reaktion
die jeweilige Lösung dekantiert und verworfen und dann
mit einer Lösung, enthaltend 0,5 M Natriumchlorid, ge
waschen. Wenn anschließend mit Wasser nachgewaschen
wird, kann eine Enzymreaktion durchgeführt werden (zum
Beispiel endonukleolytische Spaltung mit einem anderen
Enzym, welches anderer Pufferbedingungen bedarf).
Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich an festen Par
tikeln der porösen Matrix (Adsorbens) durchführen, wo
bei die Partikel entweder in wäßriger Phase suspen
diert (Batch-Verfahren) in Hohlkörpern definierter Ge
stalt (Kartuschen) befindlich oder auf flächigen Trä
gern fixiert sind. Die letztere Ausgestaltung des er
findungsgemäßen Verfahrens wird in der gleichzeitig
eingereichten, parallelen deutschen Patentanmeldung der
Anmelderin vorgeschlagen.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher
erläutert. Die Modifizierung der Biopolymeren findet in
den Beispielen in an flächige Träger fixierten Gefäßen
statt. Selbstverständlich ist es auch möglich, mit dem
sogenannten "Batch"-Verfahren zu arbeiten.
Der Bakterienaufschluß erfolgt nach der Alkaline Lysis
Method nach Maniatis et al. (1982, Cold Spring Harbor
Laboratory, ISBN 0-87969-136-0, New York). Anstelle der
Phenolisierung wird jedoch der Überstand auf 0,5 M Na
triumchlorid eingestellt und in ein beschichtetes Ep
pendorf-Reaktionsgefäß gegeben. Die Beschichtung des
Eppendorf-Gefäßes geschieht wie folgt:
Zunächst wird Vestoplast-508 in Chloroform suspendiert
(0,15 g/ml), so daß eine kolloidale Suspension ent
steht. Diese Klebstoffsuspension wird in das Reaktions
gefäß gegeben und sofort wieder dekantiert. Aufgrund
der Wechselwirkungen zwischen dem Matrixmaterial und
dem Klebstoff verbleibt ein dünner Film an der Innen
wandung des Gefäßes in einer etwa 20 µm dicken Schicht.
Durch Unterdruck (5 Minuten im Exsikkator) wird an
schließend das Chloroform entfernt. Die zu fixierenden
Anionenaustauscher wie Fractogel TSK DEAE-650 oder wie
die in der deutschen Patentanmeldung P 36 39 949 der
Anmelderin vorgeschlagenen Materialien werden in das
Gefäß gefüllt, welches anschließend auf 74°C erhitzt
wird und dabei seine klebenden Eigenschaften entwickelt.
Nach dem Abkühlen werden nicht fixierte Partikel des
Anionenaustauschers mittels Druckluft durch Wegblasen
entfernt. Nachdem der Bakterienaufschluß in ein auf
diese Weise präpariertes Eppendorf-Reaktionsgefäß gege
ben wurde, wird die Lösung nach 15 Minuten Inkubations
zeit dekantiert, das Reaktionsgefäß mit 2× je 1 ml 0,5
M Natriumchloridlösung gewaschen und dann 15 Minuten
bei Raumtemperatur mit 100 µl Elutionspuffer (1,2 M
Natriumchlorid, 4 M Harnstoff, 30 mM Natriumacetat, 15%
Ethanol) eluiert. Das Eluat wird mit 25 µl Wasser und
80 µl Isopropanol versetzt, 20 Minuten bei -70°C inku
biert und anschließend zentrifugiert. Die so isolierte
Plasmid-DNS ist in ihrer Reinheit mit HPLC-gereinigter
DNS vergleichbar und kann sämtlichen enzymatischen Be
handlungen unterworfen werden.
Ein Zellaufschluß eukaryotischer Zellen wird nach Ma
niatis et al. (1982, Cold Spring Harbor Laboratory,
ISBN 0-87969-136-0, New York) durchgeführt. Sobald die
Zellen lysiert sind, wird das grob gereinigte Lysat auf
0,5 M Natriumchlorid eingestellt und anschließend be
handelt wie im Bezugsbeispiel beschrieben.
Je nach der Aufschlußmethodik können auf diese Weise
extrem große DNS-Fragmente (50 bis 1000 kb) isoliert
werden.
Etwa 10 µg Gewebe (zum Beispiel Leber) werden in Mikro
titerplatten in 100 µl Daupuffer (4 M Harnstoff, 1%
Triton, 10 mM EDTA, 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Tris,
pH 8,0, 10 mM Dithiothreitol, 2 µg Proteinase K) 2
Stunden lang verdaut. Die Lösung wird mit 11 µl 5 M
Natriumchlorid versetzt und anschließend in Eppendorf-
Reaktionsgefäße gegeben, die inwendig bis zu einer Höhe
etwa 100 µl gemäß Bezugsbeispiel beschichtet sind. Nach
einer Adsorptionszeit von 30 Minuten wird die Lösung
dekantiert und das Reaktionsgefäß 2× mit je 500 µl 0,5
M Natriumchlorid gewaschen. Die Elution der adsorbier
ten chromosomalen DNS erfolgt mit 100 µl Elutionspuffer
(Bezugsbeispiel). Anschließend kann das Eluat gefällt
und dann entsprechend weiterverarbeitet werden. Die mit
dieser Methodik ermöglichte Gewinnung von Nukleinsäuren
mit mehr als 1000 kb Größe ist interessant für Chromo
somenkartierungen, die mit an seltenen Restriktionsstel
len schneidenden Restriktionsendonukleasen wie Not 1
durchgeführt werden (im Rahmen des sogenannten Chromo
some Walking mit anschließender Pulse-Field-Gelelektro
phorese (PFG)). Eine andere Möglichkeit besteht darin,
direkt, das heißt ohne Elution in der bereits beschrie
benen Weise Restriktionsspaltungen durchzuführen.
3 µg Plasmid, pBR 322, die nach dem Bezugsbeispiel iso
liert worden sind und an einem Anionenaustauscher immo
bilisiert wurden, werden mit Eco R1 endonukleolytisch
gespalten. Hierzu wird zunächst eine Rinderserumalbu
minlösung (2 mg/ml Eco RI Puffer) in das Reaktionsgefäß
gegeben, um verbliebene Bindungsstellen abzusättigen.
Nach 5 Minuten wird diese Lösung dekantiert und verwor
fen. Mit 3 Einheiten Eco R1 wird nun 30 Minuten in 100
mM Natriumchlorid, 50 mM Tris, pH 7,5, 10 mM Magnesium
chlorid und 1 mM Dithiothreitol verdaut. Etwa 90 bis
95% der gesamten Plasmidspaltstellen ist verdaut, wie
sich nach Elution mit anschließender Gelelektrophorese
nachweisen läßt.
Eine partielle Verdauung von immobilisierten Nuklein
säuren mit Eco R1 wird wie in Beispiel 2 durchgeführt
mit dem Unterschied, daß ein Ionenaustauschermaterial
wie in der deutschen Patentanmeldung P 36 39 949 der
Anmelderin vorgeschlagen wird. Dieses Ionenaustauscher
material zeichnet sich durch eine hohe Ladungsträger
dichte aus. Gelelektrophoretische Analyse im Anschluß
an die Desorption der Nukleinsäure vom Anionenaustau
scher zeigt, daß nur ca. 60% der DNS-Spaltstellen ver
daut wurden. Das gleiche Ergebnis kann auch mit Enzymen
wie Hpa 2 nachvollzogen werden, die mehrere Restrikti
onsstellen aufweisen, also öfter schneiden.
Claims (10)
1. Verfahren zur Modifizierung von Nukleinsäuren, wobei
die zu modifizierenden Nukleinsäuren
- a) an einem Adsorbens reversibel selektiv immobilisiert,
- b) im adsorbierten Zustand mit Restriktionsenzymen und/oder Nukleinsäuren modifizierenden Proteinen behandelt werden,
- c) danach gegebenenfalls weiter umgesetzt und
- d) die Reaktionsprodukte vom Adsorbens desorbiert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
das Adsorbens eine mit Ionenaustauschergruppen, Chelatbildnern
oder Affinitätsliganden modifizierte Matrix
ist.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß das Adsorbens eine poröse Matrix
ist und/oder mit reaktiven Gruppen, welche zur Immobilisierung
von Affinitätsliganden geeignet sind, modifiziert
ist oder bereits mit gekoppelten Affinitätsliganden
modifiziert ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß die Modifizierungsreaktionen an einem
Biopolymeren erfolgt, das an einem Ionenaustauscher mit
niedriger Ladungsdichte immobilisiert ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß die Modifizierungsreaktion an einem
Biopolymeren erfolgt, das an einem Ionenaustauscher mit
hoher Ladungsdichte immobilisiert ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch
gekennzeichnet, daß die Modifizierungsreaktion an den
Biopolymeren mittels Enzymen bewerkstelligt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch
gekennzeichnet, daß das Adsorbens in Form von Partikeln
vorliegt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch
gekennzeichnet, daß das Adsorbens in Form sphärischer
Partikel in flüssiger Phase aufgeschlämmt ist (Batch-
Verfahren).
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch
gekennzeichnet, daß die sphärischen Partikel auf einem
flächigen Träger aufgebracht sind.
10. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß
an der immobilisierten Nukleinsäure eine partielle enzymatische
Verdauung mit einem Restriktionsenzym durchgeführt
wird.
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DE3717210A Expired - Fee Related DE3717210C2 (de) | 1987-05-22 | 1987-05-22 | Verfahren zur Modifizierung von Nukleinsäuren |
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