DE3717210A1

DE3717210A1 - Verfahren zur modifizierung von biopolymeren

Info

Publication number: DE3717210A1
Application number: DE19873717210
Authority: DE
Inventors: Metin Dr Colpan; Ralf Dr Piotrowiak
Original assignee: DIAGEN INST MOLEKULARBIO
Current assignee: Qiagen GmbH
Priority date: 1987-05-22
Filing date: 1987-05-22
Publication date: 1988-12-01
Anticipated expiration: 2007-05-23
Also published as: DE3717210C2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Modifizierung von Biopolymeren, insbesondere ladungstragenden Biopo lymeren.

Die Behandlung von Biopolymeren mit Enzymen und bioche mischen Reagentien stellt eine zentrale Verfahrensweise in der Biochemie und der Praxis der Molekularbiologie dar. In biochemischen Laboratorien werden insbesondere Proteine und Nukleinsäuren modifiziert. Die dazu nöti gen Reaktionen werden zu einem großen Teil in homoge ner, wäßriger Phase durchgeführt. Es sind auch Verfah ren bekannt, bei denen das Substrat kovalent an eine feste Matrix gebunden und dann durch entsprechende Rea gentien modifiziert wird. Um die modifizierten Biopoly mere anschließend wieder von der festen Matrix zu lö sen, sind weitere Reaktionsschritte erforderlich, ins besondere das Lösen von kovalenten Bindungen. Dabei sind Nebenreaktionen, die zu Ausbeuteverlusten führen, nicht zu vermeiden. Das an sich fortschrittliche und wertvolle Verfahren gemäß dem Stand der Technik wird dadurch allerdings in seiner Anwendungsbreite deutlich eingeschränkt, da beim Ablösen des Substrates von der Matrix auch in modifizierten Biopolymeren kovalente Bindungen aufgebrochen werden können, was nicht nur die Ausbeute beeinträchtigt, sondern auch zu Kontaminatio nen führt und somit aufwendige Reinigungs- und Trennver fahren notwendig macht.

Ähnlich liegen die Verhältnisse im molekularbiologi schen Bereich, wo enzymatische Veränderungen von Biopo lymeren, insbesondere Nukleinsäuren, eine dominierende Rolle spielen. Diese Reaktionen werden bisher lediglich in homogener Lösung durchgeführt.

Häufig ist es notwendig, enzymatische Reaktionen in aufeinanderfolgenden Schritten durchzuführen, wobei für jeden Schritt in der Regel eine andere gepufferte Lö sung verwendet und das vorangehende Enzym entfernt wer den muß. Bisher wurde daher zwischen diesen einzelnen Schritten die Reaktionslösung jeweils mit Phenol ver setzt, zentrifugiert, mit Chloroform versetzt, erneut zentrifugiert und nach einer Ethanolfällung wiederum zentrifugiert. Diese Schritte sind äußerst zeitaufwen dig, führen zu Ausbeuteverlusten und erhöhen insgesamt die Zahl der möglichen Fehler- und Kontaminationsquel len. Es werden neben den enzymatischen Reaktionen auch Modifizierungen auf biochemischem Wege durchgeführt, wie beispielsweise Methylierungen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfah ren bereitzustellen, das die Modifizierung von Biopoly meren, insbesondere ladungstragenden Biopolymeren, in universell anwendbarer, einfacher Weise ermöglicht, indem das Substrat nach der Reaktion ohne weitere che mische Reaktion, also mittels physikalischer Prozesse, weiterverwendet werden kann. Des weiteren soll das erfindungsgemäße Verfahren aufwendige Reinigungs-, Trenn- und Isolierungsverfahren überflüssig machen bei mehrstufigen Modifizierungsreaktionen mit Biopolymeren, insbesondere ladungstragenden Biopolymeren.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Ver fahren, wobei die zu modifizierenden Biopolymeren

a) an einem Adsorbens selektiv immobilisiert,
b) im adsorbierten Zustand zur Reaktion gebracht,
c) danach gewünschtenfalls weiterverwendet und
d) die Reaktionsprodukte vom Adsorbens desorbiert wer den.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Adsorbens vorzugsweise eine poröse Matrix, wobei die poröse Ma trix oberflächlich mit chemischen Gruppen, insbesondere Ionenaustauschern, Chelatbildnern oder Affinitätsligan den modifiziert ist. In einer anderen bevorzugten Aus führungsform ist das Adsorbens mit reaktiven chemischen Gruppen modifiziert, wobei an die reaktiven chemischen Gruppen beispielsweise Affinitätsliganden gebunden wer den können. Affinitätsliganden im Sinne dieser Erfin dung sind Stoffe, die zu den zu modifizierenden Stoffen eine reversible, spezifische Wechselwirkung ausbilden und somit die zu modifizierenden Stoffe reversibel im mobilisieren können. In der deutschen Patentanmeldung der Anmelderin P 36 39 949 wird ein Verfahren zur Tren nung von langkettigen Nukleinsäuren unterschiedlichster Provenienz vorgeschlagen. Das dort eingesetzte Material ist eine oberflächlich modifizierte, partikuläre poröse Matrix, insbesondere auf Silicagelbasis mit einer Par tikelgröße von 15 bis 250 µm und einer Porengröße von 100 bis 2500 nm (bekannt aus DE-OS 32 11 309 der Anmel derin).

Als Adsorbentien kommen ebenfalls Träger in Betracht, die mit Anionenaustauschern wie DE-52 Cellulose (What man, Katalog-Nr. 4057-050) oder Fractogel TSK DEAE-650 (Merck, Katalog-Nr. 14 989) beschichtet sind.

Es hat sich überraschenderweise herausgestellt, daß an oben beschriebenen Materialien adsorbierte Polymeren modifiziert werden können. Es lassen sich beispielswei se endonukleolytische Spaltungen mit Restriktionsendo nukleasen, Polymerasereaktionen etc. an adsorptiv immo bilisierten Nukleinsäuren durchführen. Wenn die Nukle insäure im immobilisierten Zustand modifiziert wird, genügt das Entfernen der Lösung und einmaliges Waschen mit Puffer, bevor die folgende Enzymreaktion unter den entsprechenden neuen Pufferbedingungen stattfinden kann. Bei Verwendung von Ionenaustauschern zur Modifi zierung von Nukleinsäuren mittels Restriktionsenzymen wurde überraschenderweise gefunden, daß eine geringere Ladungsdichte des Ionenaustauschermaterials zu einer vollständigeren Verdauung (90 bis 95%) der Nukleinsäure führt. Benutzt man hingegen ein Ionenaustauschermateri al mit höherer Ladungsdichte, beispielsweise bekannt aus DE-OS 32 11 309 der Anmelderin, resultiert eine nur partielle enzymatische Verdauung der betreffenden Nukle insäure.

Die Bereitstellung eines Verfahrens zur reproduzierba ren partiellen Verdauung von Nukleinsäuren ist eine weitere wertvolle Variante des erfindungsgemäßen Ver fahrens. Nach der bekannten Verfahrensweise von Smith und Birnstiel (Nucleic Acid Research 3, 2387, 1976) werden partielle Verdauungen von endmarkierten Fragmen ten zur Kartierung von Restriktionsenzymschnittstellen verwendet. Die partiellen Verdauungen müssen über Enzym kinetiken hergestellt werden, die vergleichsweise ar beitsintensiv sind. Das erfindungsgemäße Verfahren er öffnet die Möglichkeit, diese Methodik mit immobili sierter DNS durchzuführen, wobei die Erstellung von Kinetiken nicht erforderlich ist. Der notwendige Ar beitsaufwand wird dadurch auf etwa 1/10 des herkömmli chen beschränkt bei gleichzeitig hoher Reproduzierbar keit und niedriger Fehleranfälligkeit in der Methodik. Derartige Kartierungen gehören zu den im molekulargene tischen Labor sehr häufig angewendeten Methoden und gewinnen auch in der Diagnostik an Bedeutung.

Die selektive Adsorption einer Gruppe von Biopolymeren ist einerseits von der Wahl des Adsorbens als auch an dererseits von der Wahl der Bedingungen in der Lösung (Pufferbedingungen) abhängig. So kann beispielsweise die zu modifizierende Nukleinsäure in Puffern mit nie driger Ionenstärke adsorbiert werden. Dabei werden, wie in der deutschen Patentanmeldung P 36 39 949 der Anmel derin vorgeschlagen, nur langkettige Nukleinsäuren ad sorbiert. Sie können dann nach dem erfindungsgemäßen Verfahren modifiziert werden. Ganz allgemein läßt das erfindungsgemäße Verfahren aber auch die Prozessierung von immobilisierten Nukleinsäuren mit Nukleinsäuren modifizierenden Proteinen zu.

Eine Desorption des modifizierten Biopolymeren erfolgt vorzugsweise durch Änderung der Pufferbedingungen (Io nenstärke, pH, kompetitive Liganden etc.). Es ist aller dings auch denkbar, daß insbesondere bei Verdauungsreak tionen eine Ablösung des Reaktionsproduktes stattfinden kann. In solchen Fällen kann sich die Desorption erübri gen.

In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung des erfin dungsgemäßen Verfahrens wird das Adsorbens zunächst mit einer Substanz belegt, welche eine Affinität zu den zu modifizierenden Biopolymeren besitzt, beispielsweise Protein A, das mit Immunglobulinen einen Komplex bil det, oder mono/polyklonale Antikörper, die dann ihrer seits im immobilisierten Zustand das korrespondierende Antigen binden.

Neben den enzymatischen Reaktionen können auch bioche mische Veränderungen an den Biopolymeren in eleganter Weise ausgeführt werden. Auch hier wird zunächst das Biopolymere am Adsorbens immobilisiert. Dann werden die spezifischen Bedingungen der biochemischen Reaktion im einfachsten Fall durch Umpuffern (Pufferaustausch) ein gestellt, woraufhin die entsprechende Reaktion durchge führt wird. Es können so in geeigneter Weise Reaktionen wie Methylierungen, Seitenkettenmodifizierungen sowie die Einführung von radioaktiven Isotopen durchgeführt werden. Auch eine enzymatische Einführung radioaktiv markierter Komponenten ist an den immoblisierten Mole külen durchführbar. Nukleinsäuren können im adsorbier ten Zustand, insbesondere gebunden an Ionenaustauscher, wie in der deutschen Patentanmeldung P 36 39 949 der Anmelderin vorgeschlagen, Fractogel TSK DEAE-650 und DE-52 Cellulose (Whatman) nach den üblichen Arbeitsan weisungen (siehe Maniatis et al. 1982, Cold Spring Har bor Laboratory, ISBN 0-87969-136-0, New York) enzyma tisch behandelt werden. Vor Zugabe des Enzyms empfiehlt es sich, mit Rinderserumalbumin (BSA) und dem später zu verwendenden Puffer eventuell verbliebene Bindungsstel len abzusättigen, so daß das anschließend hinzugesetzte Enzym nicht adsorbiert wird. Auf diese Weise lassen sich gängige Reaktionen der Nukleinsäurebiochemie durchführen, zum Beispiel restriktionsendonukleolyti sche Spaltungen von DNS, Polymerasereaktionen (ein schließlich radioaktiver Markierungen wie Nicktransla tion und Endmarkierungen mit Klenow-Polymerase), Methy lierungen, Phosphatasebehandlungen etc. Überraschender weise erlauben Anionenaustauscher mit niedriger Ladungs dichte eine fast vollständige Reaktion (90%), während Ionenaustauscher, die durch eine hohe Ladungsträgerdich te gekennzeichnet sind, lediglich partielle (50 bis 70%) Umsetzung gestatten.

Generell wird im Anschluß an die enzymatische Reaktion die jeweilige Lösung dekantiert und verworfen und dann mit einer Lösung, enthaltend 0,5 M Natriumchlorid, ge waschen. Wenn anschließend mit Wasser nachgewaschen wird, kann eine Enzymreaktion durchgeführt werden (zum Beispiel endonukleolytische Spaltung mit einem anderen Enzym, welches anderer Pufferbedingungen bedarf).

Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich an festen Par tikeln der porösen Matrix (Adsorbens) durchführen, wo bei die Partikel entweder in wässriger Phase suspen diert (Batch-Verfahren) in Hohlkörpern definierter Ge stalt (Kartuschen) befindlich oder auf flächigen Trä gern fixiert sind. Die letztere Ausgestaltung des er findungsgemäßen Verfahrens wird in der gleichzeitig eingereichten, parallelen deutschen Patentanmeldung der Anmelderin vorgeschlagen.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert. Die Modifizierung der Biopolymeren findet in den Beispielen in an flächige Träger fixierten Gefäßen statt. Selbstverständlich ist es auch möglich, mit dem sogenannten "Batch"-Verfahren zu arbeiten.

Bezugsbeispiel

Plasmidpräparation aus Escherichia coli Der Bakterienaufschluß erfolgt nach der Alkaline Lysis Method nach Maniatis et al. (1982, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-136-0, New York). Anstelle der Phenolisierung wird jedoch der Überstand auf 0,5 M Na triumchlorid eingestellt und in ein beschichtetes Ep pendorf-Reaktionsgefäß gegeben. Die Beschichtung des Eppendorf-Gefäßes geschieht wie folgt:

Zunächst wird Vestoplast-508 in Chloroform suspendiert (0,15 g/ml), so daß eine kolloidale Suspension ent steht. Diese Klebstoffsuspension wird in das Reaktions gefäß gegeben und sofort wieder dekantiert. Aufgrund der Wechselwirkungen zwischen dem Matrixmaterial und dem Klebstoff verbleibt ein dünner Film an der Innen wandung des Gefäßes in einer etwa 20 µm dicken Schicht. Durch Unterdruck (5 Minuten im Exsikkator) wird an schließend das Chloroform entfernt. Die zu fixierenden Anionenaustauscher wie Fractogel TSK DEAE-650 oder wie die in der deutschen Patentanmeldung P 36 39 949 der Anmelderin vorgeschlagenen Materialien werden in das Gefäß gefüllt, welches anschließend auf 74°C erhitzt wird und dabei seine klebenden Eigenschaften entwickelt. Nach dem Abkühlen werden nicht fixierte Partikel des Anionenaustauschers mittels Druckluft durch Wegblasen entfernt. Nachdem der Bakterienaufschluß in ein auf diese Weise präpariertes Eppendorf-Reaktionsgefäß gege ben wurde, wird die Lösung nach 15 Minuten Inkubations zeit dekantiert, das Reaktionsgefäß mit 2× je 1 ml 0,5 M Natriumchloridlösung gewaschen und dann 15 Minuten bei Raumtemperatur mit 100 µl Elutionspuffer (1,2 M Natriumchlorid, 4 M Harnstoff, 30 mM Natriumacetat, 15% Ethanol) eluiert. Das Eluat wird mit 25 µl Wasser und 80 µl Isopropanol versetzt, 20 Minuten bei -70°C inku biert und anschließend zentrifugiert. Die so isolierte Plasmid-DNS ist in ihrer Reinheit mit HPLC-gereinigter DNS vergleichbar und kann sämtlichen enzymatischen Be handlungen unterworfen werden.

Beispiel 1

Isolierung langkettiger, chromosomaler DNS aus Gewebe Ein Zellaufschluß eukaryotischer Zellen wird nach Ma niatis et al. (1982, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-136-0, New York) durchgeführt. Sobald die Zellen lysiert sind, wird das grob gereinigte Lysat auf 0,5 M Natriumchlorid eingestellt und anschließend be handelt wie im Bezugsbeispiel beschrieben.

Je nach der Aufschlußmethodik können auf diese Weise extrem große DNS-Fragmente (50 bis 1000 kb) isoliert werden.

Etwa 10 µg Gewebe (zum Beispiel Leber) werden in Mikro titerplatten in 100 µl Daupuffer (4 M Harnstoff, 1% Triton, 10 mM EDTA, 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Tris, pH 8,0, 10 mM Dithiothreitol, 2 µg Proteinase K) 2 Stunden lang verdaut. Die Lösung wird mit 11 µl 5 M Natriumchlorid versetzt und anschließend in Eppendorf- Reaktionsgefäße gegeben, die inwendig bis zu einer Höhe etwa 100 µl gemäß Bezugsbeispiel beschichtet sind. Nach einer Adsorptionszeit von 30 Minuten wird die Lösung dekantiert und das Reaktionsgefäß 2× mit je 500 µl 0,5 M Natriumchlorid gewaschen. Die Elution der adsorbier ten chromosomalen DNS erfolgt mit 100 µl Elutionspuffer (Bezugsbeispiel). Anschließend kann das Eluat gefällt und dann entsprechend weiterverarbeitet werden. Die mit dieser Methodik ermöglichte Gewinnung von Nukleinsäuren mit mehr als 1000 kb Größe ist interessant für Chromo somenkartierungen, die mit an seltenen Restriktionsstel len schneidenden Restriktionsendonukleasen wie Not 1 durchgeführt werden (im Rahmen des sogenannten Chromo some Walking mit anschließender Pulse-Field-Gelelektro phorese (PFG)). Eine andere Möglichkeit besteht darin, direkt, das heißt ohne Elution in der bereits beschrie benen Weise Restriktionsspaltungen durchzuführen.

Beispiel 2

3 µg Plasmid, pBR 322, die nach dem Bezugsbeispiel iso liert worden sind und an einem Anionenaustauscher immo bilisiert wurden, werden mit Eco R1 endonukleolytisch gespalten. Hierzu wird zunächst eine Rinderserumalbu minlösung (2 mg/ml Eco RI Puffer) in das Reaktionsgefäß gegeben, um verbliebene Bindungsstellen abzusättigen.

Nach 5 Minuten wird diese Lösung dekantiert und verwor fen. Mit 3 Einheiten Eco R1 wird nun 30 Minuten in 100 mM Natriumchlorid, 50 mM Tris, pH 7,5, 10 mM Magnesium chlorid und 1 mM Dithiothreitol verdaut. Etwa 90 bis 95% der gesamten Plasmidspaltstellen ist verdaut, wie sich nach Elution mit anschließender Gelelektrophorese nachweisen läßt.

Beispiel 3

Anwendung zur Herstellung partieller Verdauungen für analytische, präparative und diagnostische Zwecke Eine partielle Verdauung von immobilisierten Nuklein säuren mit Eco R1 wird wie in Beispiel 2 durchgeführt mit dem Unterschied, daß ein Ionenaustauschermaterial wie in der deutschen Patentanmeldung P 36 39 949 der Anmelderin vorgeschlagen wird. Dieses Ionenaustauscher material zeichnet sich durch eine hohe Ladungsträger dichte aus. Gelelektrophoretische Analyse im Anschluß an die Desorption der Nukleinsäure vom Anionenaustau scher zeigt, daß nur ca. 60% der DNS-Spaltstellen ver daut wurden. Das gleiche Ergebnis kann auch mit Enzymen wie Hpa 2 nachvollzogen werden, die mehrere Restrikti onsstellen aufweisen, also öfter schneiden.

Claims

1. Verfahren zur Modifizierung von Biopolymeren, insbeson dere ladungstragenden Biopolymeren, wobei die Biopoly meren

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Adsorbens eine Matrix ist, wobei die Matrix ober flächlich mit chemischen Gruppen versehen ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix oberflächlich mit Ionenaustauschergruppen modifiziert ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Adsorbens eine poröse Matrix ist und/oder mit reaktiven Gruppen, welche zur Immobi lisierung von Affinitätsliganden geeignet sind, modifi ziert ist oder bereits mit gekoppelten Affinitätsli ganden modifiziert ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Modifizierungsreaktion an einem Biopolymeren erfolgt, das an einem Ionenaustauscher mit niedriger Ladungsdichte immobilisiert ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Modifizierungsreaktion an einem Biopolymeren erfolgt, das an einem Ionenaustauscher mit hoher Ladungsdichte immobilisiert ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Modifizierungsreaktion an den Biopolymeren mittels Enzymen bewerkstelligt wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Adsorbens in Form von Partikeln vorliegt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Adsorbens in Form sphärischer Partikel in flüssiger Phase aufgeschlämmt ist (Batch- Verfahren).

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die sphärischen Partikel auf einem flächigen Träger aufgebracht sind.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß immobilisierte Nukleinsäuren mit Restriktionsenzymen geschnitten werden.

12. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß an der immobilisierten Nukleinsäure eine partielle en zymatische Verdauung mit einem Restriktionsenzym durch geführt wird.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß immobilisierte Nukleinsäuren mit nukleinsäure-modifizierenden Proteinen prozessiert wer den.