DE3717210A1 - Verfahren zur modifizierung von biopolymeren - Google Patents
Verfahren zur modifizierung von biopolymerenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Modifizierung
von Biopolymeren, insbesondere ladungstragenden Biopo
lymeren.
Die Behandlung von Biopolymeren mit Enzymen und bioche
mischen Reagentien stellt eine zentrale Verfahrensweise
in der Biochemie und der Praxis der Molekularbiologie
dar. In biochemischen Laboratorien werden insbesondere
Proteine und Nukleinsäuren modifiziert. Die dazu nöti
gen Reaktionen werden zu einem großen Teil in homoge
ner, wäßriger Phase durchgeführt. Es sind auch Verfah
ren bekannt, bei denen das Substrat kovalent an eine
feste Matrix gebunden und dann durch entsprechende Rea
gentien modifiziert wird. Um die modifizierten Biopoly
mere anschließend wieder von der festen Matrix zu lö
sen, sind weitere Reaktionsschritte erforderlich, ins
besondere das Lösen von kovalenten Bindungen. Dabei
sind Nebenreaktionen, die zu Ausbeuteverlusten führen,
nicht zu vermeiden. Das an sich fortschrittliche und
wertvolle Verfahren gemäß dem Stand der Technik wird
dadurch allerdings in seiner Anwendungsbreite deutlich
eingeschränkt, da beim Ablösen des Substrates von der
Matrix auch in modifizierten Biopolymeren kovalente
Bindungen aufgebrochen werden können, was nicht nur die
Ausbeute beeinträchtigt, sondern auch zu Kontaminatio
nen führt und somit aufwendige Reinigungs- und Trennver
fahren notwendig macht.
Ähnlich liegen die Verhältnisse im molekularbiologi
schen Bereich, wo enzymatische Veränderungen von Biopo
lymeren, insbesondere Nukleinsäuren, eine dominierende
Rolle spielen. Diese Reaktionen werden bisher lediglich
in homogener Lösung durchgeführt.
Häufig ist es notwendig, enzymatische Reaktionen in
aufeinanderfolgenden Schritten durchzuführen, wobei für
jeden Schritt in der Regel eine andere gepufferte Lö
sung verwendet und das vorangehende Enzym entfernt wer
den muß. Bisher wurde daher zwischen diesen einzelnen
Schritten die Reaktionslösung jeweils mit Phenol ver
setzt, zentrifugiert, mit Chloroform versetzt, erneut
zentrifugiert und nach einer Ethanolfällung wiederum
zentrifugiert. Diese Schritte sind äußerst zeitaufwen
dig, führen zu Ausbeuteverlusten und erhöhen insgesamt
die Zahl der möglichen Fehler- und Kontaminationsquel
len. Es werden neben den enzymatischen Reaktionen auch
Modifizierungen auf biochemischem Wege durchgeführt,
wie beispielsweise Methylierungen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfah
ren bereitzustellen, das die Modifizierung von Biopoly
meren, insbesondere ladungstragenden Biopolymeren, in
universell anwendbarer, einfacher Weise ermöglicht,
indem das Substrat nach der Reaktion ohne weitere che
mische Reaktion, also mittels physikalischer Prozesse,
weiterverwendet werden kann. Des weiteren soll das
erfindungsgemäße Verfahren aufwendige Reinigungs-,
Trenn- und Isolierungsverfahren überflüssig machen bei
mehrstufigen Modifizierungsreaktionen mit Biopolymeren,
insbesondere ladungstragenden Biopolymeren.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Ver
fahren, wobei die zu modifizierenden Biopolymeren
- a) an einem Adsorbens selektiv immobilisiert,
- b) im adsorbierten Zustand zur Reaktion gebracht,
- c) danach gewünschtenfalls weiterverwendet und
- d) die Reaktionsprodukte vom Adsorbens desorbiert wer den.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Adsorbens
vorzugsweise eine poröse Matrix, wobei die poröse Ma
trix oberflächlich mit chemischen Gruppen, insbesondere
Ionenaustauschern, Chelatbildnern oder Affinitätsligan
den modifiziert ist. In einer anderen bevorzugten Aus
führungsform ist das Adsorbens mit reaktiven chemischen
Gruppen modifiziert, wobei an die reaktiven chemischen
Gruppen beispielsweise Affinitätsliganden gebunden wer
den können. Affinitätsliganden im Sinne dieser Erfin
dung sind Stoffe, die zu den zu modifizierenden Stoffen
eine reversible, spezifische Wechselwirkung ausbilden
und somit die zu modifizierenden Stoffe reversibel im
mobilisieren können. In der deutschen Patentanmeldung
der Anmelderin P 36 39 949 wird ein Verfahren zur Tren
nung von langkettigen Nukleinsäuren unterschiedlichster
Provenienz vorgeschlagen. Das dort eingesetzte Material
ist eine oberflächlich modifizierte, partikuläre poröse
Matrix, insbesondere auf Silicagelbasis mit einer Par
tikelgröße von 15 bis 250 µm und einer Porengröße von
100 bis 2500 nm (bekannt aus DE-OS 32 11 309 der Anmel
derin).
Als Adsorbentien kommen ebenfalls Träger in Betracht,
die mit Anionenaustauschern wie DE-52 Cellulose (What
man, Katalog-Nr. 4057-050) oder Fractogel TSK DEAE-650
(Merck, Katalog-Nr. 14 989) beschichtet sind.
Es hat sich überraschenderweise herausgestellt, daß an
oben beschriebenen Materialien adsorbierte Polymeren
modifiziert werden können. Es lassen sich beispielswei
se endonukleolytische Spaltungen mit Restriktionsendo
nukleasen, Polymerasereaktionen etc. an adsorptiv immo
bilisierten Nukleinsäuren durchführen. Wenn die Nukle
insäure im immobilisierten Zustand modifiziert wird,
genügt das Entfernen der Lösung und einmaliges Waschen
mit Puffer, bevor die folgende Enzymreaktion unter den
entsprechenden neuen Pufferbedingungen stattfinden
kann. Bei Verwendung von Ionenaustauschern zur Modifi
zierung von Nukleinsäuren mittels Restriktionsenzymen
wurde überraschenderweise gefunden, daß eine geringere
Ladungsdichte des Ionenaustauschermaterials zu einer
vollständigeren Verdauung (90 bis 95%) der Nukleinsäure
führt. Benutzt man hingegen ein Ionenaustauschermateri
al mit höherer Ladungsdichte, beispielsweise bekannt
aus DE-OS 32 11 309 der Anmelderin, resultiert eine nur
partielle enzymatische Verdauung der betreffenden Nukle
insäure.
Die Bereitstellung eines Verfahrens zur reproduzierba
ren partiellen Verdauung von Nukleinsäuren ist eine
weitere wertvolle Variante des erfindungsgemäßen Ver
fahrens. Nach der bekannten Verfahrensweise von Smith
und Birnstiel (Nucleic Acid Research 3, 2387, 1976)
werden partielle Verdauungen von endmarkierten Fragmen
ten zur Kartierung von Restriktionsenzymschnittstellen
verwendet. Die partiellen Verdauungen müssen über Enzym
kinetiken hergestellt werden, die vergleichsweise ar
beitsintensiv sind. Das erfindungsgemäße Verfahren er
öffnet die Möglichkeit, diese Methodik mit immobili
sierter DNS durchzuführen, wobei die Erstellung von
Kinetiken nicht erforderlich ist. Der notwendige Ar
beitsaufwand wird dadurch auf etwa 1/10 des herkömmli
chen beschränkt bei gleichzeitig hoher Reproduzierbar
keit und niedriger Fehleranfälligkeit in der Methodik.
Derartige Kartierungen gehören zu den im molekulargene
tischen Labor sehr häufig angewendeten Methoden und
gewinnen auch in der Diagnostik an Bedeutung.
Die selektive Adsorption einer Gruppe von Biopolymeren
ist einerseits von der Wahl des Adsorbens als auch an
dererseits von der Wahl der Bedingungen in der Lösung
(Pufferbedingungen) abhängig. So kann beispielsweise
die zu modifizierende Nukleinsäure in Puffern mit nie
driger Ionenstärke adsorbiert werden. Dabei werden, wie
in der deutschen Patentanmeldung P 36 39 949 der Anmel
derin vorgeschlagen, nur langkettige Nukleinsäuren ad
sorbiert. Sie können dann nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren modifiziert werden. Ganz allgemein läßt das
erfindungsgemäße Verfahren aber auch die Prozessierung
von immobilisierten Nukleinsäuren mit Nukleinsäuren
modifizierenden Proteinen zu.
Eine Desorption des modifizierten Biopolymeren erfolgt
vorzugsweise durch Änderung der Pufferbedingungen (Io
nenstärke, pH, kompetitive Liganden etc.). Es ist aller
dings auch denkbar, daß insbesondere bei Verdauungsreak
tionen eine Ablösung des Reaktionsproduktes stattfinden
kann. In solchen Fällen kann sich die Desorption erübri
gen.
In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung des erfin
dungsgemäßen Verfahrens wird das Adsorbens zunächst mit
einer Substanz belegt, welche eine Affinität zu den zu
modifizierenden Biopolymeren besitzt, beispielsweise
Protein A, das mit Immunglobulinen einen Komplex bil
det, oder mono/polyklonale Antikörper, die dann ihrer
seits im immobilisierten Zustand das korrespondierende
Antigen binden.
Neben den enzymatischen Reaktionen können auch bioche
mische Veränderungen an den Biopolymeren in eleganter
Weise ausgeführt werden. Auch hier wird zunächst das
Biopolymere am Adsorbens immobilisiert. Dann werden die
spezifischen Bedingungen der biochemischen Reaktion im
einfachsten Fall durch Umpuffern (Pufferaustausch) ein
gestellt, woraufhin die entsprechende Reaktion durchge
führt wird. Es können so in geeigneter Weise Reaktionen
wie Methylierungen, Seitenkettenmodifizierungen sowie
die Einführung von radioaktiven Isotopen durchgeführt
werden. Auch eine enzymatische Einführung radioaktiv
markierter Komponenten ist an den immoblisierten Mole
külen durchführbar. Nukleinsäuren können im adsorbier
ten Zustand, insbesondere gebunden an Ionenaustauscher,
wie in der deutschen Patentanmeldung P 36 39 949 der
Anmelderin vorgeschlagen, Fractogel TSK DEAE-650 und
DE-52 Cellulose (Whatman) nach den üblichen Arbeitsan
weisungen (siehe Maniatis et al. 1982, Cold Spring Har
bor Laboratory, ISBN 0-87969-136-0, New York) enzyma
tisch behandelt werden. Vor Zugabe des Enzyms empfiehlt
es sich, mit Rinderserumalbumin (BSA) und dem später zu
verwendenden Puffer eventuell verbliebene Bindungsstel
len abzusättigen, so daß das anschließend hinzugesetzte
Enzym nicht adsorbiert wird. Auf diese Weise lassen
sich gängige Reaktionen der Nukleinsäurebiochemie
durchführen, zum Beispiel restriktionsendonukleolyti
sche Spaltungen von DNS, Polymerasereaktionen (ein
schließlich radioaktiver Markierungen wie Nicktransla
tion und Endmarkierungen mit Klenow-Polymerase), Methy
lierungen, Phosphatasebehandlungen etc. Überraschender
weise erlauben Anionenaustauscher mit niedriger Ladungs
dichte eine fast vollständige Reaktion (90%), während
Ionenaustauscher, die durch eine hohe Ladungsträgerdich
te gekennzeichnet sind, lediglich partielle (50 bis
70%) Umsetzung gestatten.
Generell wird im Anschluß an die enzymatische Reaktion
die jeweilige Lösung dekantiert und verworfen und dann
mit einer Lösung, enthaltend 0,5 M Natriumchlorid, ge
waschen. Wenn anschließend mit Wasser nachgewaschen
wird, kann eine Enzymreaktion durchgeführt werden (zum
Beispiel endonukleolytische Spaltung mit einem anderen
Enzym, welches anderer Pufferbedingungen bedarf).
Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich an festen Par
tikeln der porösen Matrix (Adsorbens) durchführen, wo
bei die Partikel entweder in wässriger Phase suspen
diert (Batch-Verfahren) in Hohlkörpern definierter Ge
stalt (Kartuschen) befindlich oder auf flächigen Trä
gern fixiert sind. Die letztere Ausgestaltung des er
findungsgemäßen Verfahrens wird in der gleichzeitig
eingereichten, parallelen deutschen Patentanmeldung der
Anmelderin vorgeschlagen.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher
erläutert. Die Modifizierung der Biopolymeren findet in
den Beispielen in an flächige Träger fixierten Gefäßen
statt. Selbstverständlich ist es auch möglich, mit dem
sogenannten "Batch"-Verfahren zu arbeiten.
Plasmidpräparation aus Escherichia coli
Der Bakterienaufschluß erfolgt nach der Alkaline Lysis
Method nach Maniatis et al. (1982, Cold Spring Harbor
Laboratory, ISBN 0-87969-136-0, New York). Anstelle der
Phenolisierung wird jedoch der Überstand auf 0,5 M Na
triumchlorid eingestellt und in ein beschichtetes Ep
pendorf-Reaktionsgefäß gegeben. Die Beschichtung des
Eppendorf-Gefäßes geschieht wie folgt:
Zunächst wird Vestoplast-508 in Chloroform suspendiert
(0,15 g/ml), so daß eine kolloidale Suspension ent
steht. Diese Klebstoffsuspension wird in das Reaktions
gefäß gegeben und sofort wieder dekantiert. Aufgrund
der Wechselwirkungen zwischen dem Matrixmaterial und
dem Klebstoff verbleibt ein dünner Film an der Innen
wandung des Gefäßes in einer etwa 20 µm dicken Schicht.
Durch Unterdruck (5 Minuten im Exsikkator) wird an
schließend das Chloroform entfernt. Die zu fixierenden
Anionenaustauscher wie Fractogel TSK DEAE-650 oder wie
die in der deutschen Patentanmeldung P 36 39 949 der
Anmelderin vorgeschlagenen Materialien werden in das
Gefäß gefüllt, welches anschließend auf 74°C erhitzt
wird und dabei seine klebenden Eigenschaften entwickelt.
Nach dem Abkühlen werden nicht fixierte Partikel des
Anionenaustauschers mittels Druckluft durch Wegblasen
entfernt. Nachdem der Bakterienaufschluß in ein auf
diese Weise präpariertes Eppendorf-Reaktionsgefäß gege
ben wurde, wird die Lösung nach 15 Minuten Inkubations
zeit dekantiert, das Reaktionsgefäß mit 2× je 1 ml 0,5
M Natriumchloridlösung gewaschen und dann 15 Minuten
bei Raumtemperatur mit 100 µl Elutionspuffer (1,2 M
Natriumchlorid, 4 M Harnstoff, 30 mM Natriumacetat, 15%
Ethanol) eluiert. Das Eluat wird mit 25 µl Wasser und
80 µl Isopropanol versetzt, 20 Minuten bei -70°C inku
biert und anschließend zentrifugiert. Die so isolierte
Plasmid-DNS ist in ihrer Reinheit mit HPLC-gereinigter
DNS vergleichbar und kann sämtlichen enzymatischen Be
handlungen unterworfen werden.
Isolierung langkettiger, chromosomaler DNS aus Gewebe
Ein Zellaufschluß eukaryotischer Zellen wird nach Ma
niatis et al. (1982, Cold Spring Harbor Laboratory,
ISBN 0-87969-136-0, New York) durchgeführt. Sobald die
Zellen lysiert sind, wird das grob gereinigte Lysat auf
0,5 M Natriumchlorid eingestellt und anschließend be
handelt wie im Bezugsbeispiel beschrieben.
Je nach der Aufschlußmethodik können auf diese Weise
extrem große DNS-Fragmente (50 bis 1000 kb) isoliert
werden.
Etwa 10 µg Gewebe (zum Beispiel Leber) werden in Mikro
titerplatten in 100 µl Daupuffer (4 M Harnstoff, 1%
Triton, 10 mM EDTA, 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Tris,
pH 8,0, 10 mM Dithiothreitol, 2 µg Proteinase K) 2
Stunden lang verdaut. Die Lösung wird mit 11 µl 5 M
Natriumchlorid versetzt und anschließend in Eppendorf-
Reaktionsgefäße gegeben, die inwendig bis zu einer Höhe
etwa 100 µl gemäß Bezugsbeispiel beschichtet sind. Nach
einer Adsorptionszeit von 30 Minuten wird die Lösung
dekantiert und das Reaktionsgefäß 2× mit je 500 µl 0,5
M Natriumchlorid gewaschen. Die Elution der adsorbier
ten chromosomalen DNS erfolgt mit 100 µl Elutionspuffer
(Bezugsbeispiel). Anschließend kann das Eluat gefällt
und dann entsprechend weiterverarbeitet werden. Die mit
dieser Methodik ermöglichte Gewinnung von Nukleinsäuren
mit mehr als 1000 kb Größe ist interessant für Chromo
somenkartierungen, die mit an seltenen Restriktionsstel
len schneidenden Restriktionsendonukleasen wie Not 1
durchgeführt werden (im Rahmen des sogenannten Chromo
some Walking mit anschließender Pulse-Field-Gelelektro
phorese (PFG)). Eine andere Möglichkeit besteht darin,
direkt, das heißt ohne Elution in der bereits beschrie
benen Weise Restriktionsspaltungen durchzuführen.
3 µg Plasmid, pBR 322, die nach dem Bezugsbeispiel iso
liert worden sind und an einem Anionenaustauscher immo
bilisiert wurden, werden mit Eco R1 endonukleolytisch
gespalten. Hierzu wird zunächst eine Rinderserumalbu
minlösung (2 mg/ml Eco RI Puffer) in das Reaktionsgefäß
gegeben, um verbliebene Bindungsstellen abzusättigen.
Nach 5 Minuten wird diese Lösung dekantiert und verwor
fen. Mit 3 Einheiten Eco R1 wird nun 30 Minuten in 100
mM Natriumchlorid, 50 mM Tris, pH 7,5, 10 mM Magnesium
chlorid und 1 mM Dithiothreitol verdaut. Etwa 90 bis
95% der gesamten Plasmidspaltstellen ist verdaut, wie
sich nach Elution mit anschließender Gelelektrophorese
nachweisen läßt.
Anwendung zur Herstellung partieller Verdauungen für
analytische, präparative und diagnostische Zwecke
Eine partielle Verdauung von immobilisierten Nuklein
säuren mit Eco R1 wird wie in Beispiel 2 durchgeführt
mit dem Unterschied, daß ein Ionenaustauschermaterial
wie in der deutschen Patentanmeldung P 36 39 949 der
Anmelderin vorgeschlagen wird. Dieses Ionenaustauscher
material zeichnet sich durch eine hohe Ladungsträger
dichte aus. Gelelektrophoretische Analyse im Anschluß
an die Desorption der Nukleinsäure vom Anionenaustau
scher zeigt, daß nur ca. 60% der DNS-Spaltstellen ver
daut wurden. Das gleiche Ergebnis kann auch mit Enzymen
wie Hpa 2 nachvollzogen werden, die mehrere Restrikti
onsstellen aufweisen, also öfter schneiden.
Claims (13)
1. Verfahren zur Modifizierung von Biopolymeren, insbeson
dere ladungstragenden Biopolymeren, wobei die Biopoly
meren
- a) an einem Adsorbens selektiv immobilisiert,
- b) im adsorbierten Zustand zur Reaktion gebracht,
- c) danach gewünschtenfalls weiterverwendet und
- d) die Reaktionsprodukte vom Adsorbens desorbiert wer den.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
das Adsorbens eine Matrix ist, wobei die Matrix ober
flächlich mit chemischen Gruppen versehen ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß
die Matrix oberflächlich mit Ionenaustauschergruppen
modifiziert ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß das Adsorbens eine poröse Matrix
ist und/oder mit reaktiven Gruppen, welche zur Immobi
lisierung von Affinitätsliganden geeignet sind, modifi
ziert ist oder bereits mit gekoppelten Affinitätsli
ganden modifiziert ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch
gekennzeichnet, daß die Modifizierungsreaktion an einem
Biopolymeren erfolgt, das an einem Ionenaustauscher mit
niedriger Ladungsdichte immobilisiert ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch
gekennzeichnet, daß die Modifizierungsreaktion an einem
Biopolymeren erfolgt, das an einem Ionenaustauscher mit
hoher Ladungsdichte immobilisiert ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch
gekennzeichnet, daß die Modifizierungsreaktion an den
Biopolymeren mittels Enzymen bewerkstelligt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch
gekennzeichnet, daß das Adsorbens in Form von Partikeln
vorliegt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch
gekennzeichnet, daß das Adsorbens in Form sphärischer
Partikel in flüssiger Phase aufgeschlämmt ist (Batch-
Verfahren).
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch
gekennzeichnet, daß die sphärischen Partikel auf einem
flächigen Träger aufgebracht sind.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch
gekennzeichnet, daß immobilisierte Nukleinsäuren mit
Restriktionsenzymen geschnitten werden.
12. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß
an der immobilisierten Nukleinsäure eine partielle en
zymatische Verdauung mit einem Restriktionsenzym durch
geführt wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch
gekennzeichnet, daß immobilisierte Nukleinsäuren mit
nukleinsäure-modifizierenden Proteinen prozessiert wer
den.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE3717210A DE3717210C2 (de) | 1987-05-22 | 1987-05-22 | Verfahren zur Modifizierung von Nukleinsäuren |
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DE3717210A DE3717210C2 (de) | 1987-05-22 | 1987-05-22 | Verfahren zur Modifizierung von Nukleinsäuren |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
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DE3717210A1 true DE3717210A1 (de) | 1988-12-01 |
DE3717210C2 DE3717210C2 (de) | 1993-11-25 |
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ID=6328134
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DE3717210A Expired - Fee Related DE3717210C2 (de) | 1987-05-22 | 1987-05-22 | Verfahren zur Modifizierung von Nukleinsäuren |
Country Status (1)
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