FR2716206A1 - Surfaces hautement spécifiques pour réactions biologiques, procédé pour leur préparation et procédé de dosage d'une molécule utilisant ces surfaces. - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne notamment une surface hautement spécifique pour réactions biologiques, caractérisée en ce qu'elle comporte un support présentant en surface au moins une couche compacte d'un composé organique présentant, à l'extérieur de la couche, un groupement exposé ayant, éventuellement après modification chimique, une affinité pour un type de molécule à activité biologique, les autres éléments de la couche ne présentant que peu ou pas d'affinité pour lesdites molécules dans les conditions de réaction.

Description

La présente invention concerne notamment des surfaces très hautement spécifiques utilisables en biologie ainsi que leurs applications et des procédés pour leur préparation.

On connait depuis longtemps la très grande spécificité et la très grande sélectivité de certaines réactions biologiques, notamment les réactions antigènes/anticorps, les réactions d'hybridation d'ADN ou d'ARN, les réactions interprotéines ou dc ter)c avidine/streptavidine//biotine, de même que les réactions des ligands et dc leurs récepteurs.

On sait maintenant tircr panie de ces spécificités, notamment pour mettre en évidence la présence ou l'absence de l'un des éléments du couple réactionnel dans un échantillon ou bien éventuellement pour séparer l'un des éléments du couple d'un milieu plus complexe.

Toutefois, lorsque l'on souhaite détecter la présence d'une molécule à très faible concentration dans un milieu très complexe, les procédés actuellement connus donnent parfois des résultats très aléatoires, compte tenu notamment du problèmc des bruits de fond intervenant lors des étapes de séparation et/ou de détection.

C'est pourquoi, ce qui sera appelé ci-après pêche moléculaire", c'est-à-dire la possibilité de pouvoir mettre en évidence chacune des molécules qui sont recherchées lorsqu'elles sont à des concentrations très faibles, n'a jusqu'ici pas été possible.

A titre d'exemple, I'anal! se d'un échantillon d'ADN passe par l'utilisation d'une sonde dite d' "hybridation" correspondant à la séquence complémentaire de la séquence recherchée. Dans ces conditions, le problème posé est d'isoler l'hybride du milieu et de détecter avec un bon apport signal/bruit (S/N) le nombre éx entuellement réduit de réactions positives.

C'est pourquoi on utilise maintenant, dans la plupart des cas, une étape intermédiaire destinée à amplifier la séquence que l'on cherche à détecter, par exemple en utilisant la méthode PCR ou des méthodes d'amplification conduisant aux mêmes résultats, dans ces conditions on augmente la concentration de la séquence à déterminer dans l'échantillon et cette détection est évidemment beaucoup plus commode.

Cependant, l'étape d'amplification est sensible aux contaminants et conduit à des erreurs qui lui sont propres.

Il serait donc préférable, dans la mesure du possible, de pouvoir détecter la présence de la séquence d'acide nucléique sans phase d'amplification.

On a proposé d'utiliser, de façon à mettre en évidence la réaction d'hybridation spécifique, une étape intermédiaire d'ancrage du produit d'hybridation sur une surface solide présentant certaines spécificités. Par exemple, il est possible d'utiliser certaines surfaces prétraitées permettant de fixer certaines protéines ou de l'ADN, qu'il ait été ou non modifié.

De telles surfaces sont commercialement disponibles (Covalink,
Costar, Estapor, Bangs, Dynal par exemple) sous forme de billes ou de puits présentant à leur suface des groupements COOH, NH2 ou OH par exemple.

On peut alors fonctionnaliser l'ADN avec un groupement réactif, amine par exemple, et procéder à une réaction avec ces surfaces. Ces méthodes nécessitent cependant une fonctionnalisation particulière de l'ADN à fixer.

On a également décrit une technique permettant l'ancrage sans traitement préalable de l'ADN. Ce procédé consiste à faire réagir le phosphate libre de l'extrémité 5' de la molécule avec une amine secondaire (surface NH Covalink).

On peut aussi fixer l'ADN à un groupement ou une protéine PO pour la faire réagir avec une suface recouverte d'un groupement ou une protéine P1, susceptible de réagir spécifiquement avec Po. Le couple Po/P1 peut être un couple de type biotine/streptavidine ou digoxigénine/anticorps dirigé contre la digoxigénine, (anti-DIG) par exemple.

De telles surfaces sont, cependant, dans la plupart des cas insuffisamment spécifiques (V. Lund et al., Nucl. Acids Res., 16, 1861 (1988)).

Ainsi, la présence d'interactions parasites, même faibles, de type adsorption non-spécifique conduit à des adsorptions efficaces pour des molécules longues, capables de contracter avec le solide un grand nombre de points d'interaction faible. Ces surfaces conduisent à des applications potentielles manquant de sensibilité et/ou avec un grand taux de bruit de fond dans le cas d'un petit nombre de molécules à pécher. De plus, certaines de ces surfaces présentent un fort taux de fluorescence parasite potentiellement genante lors de la phase de détection.

Pour ce qui concerne la détection proprement dite, en particulier pour la mise en évidence de l'ADN, le brevet Français 78 10975 décrit un procédé couplant la sonde à une enzyme qui permet la révélation à l'aide d'un substrat chromogène. II est, en outre, possible de quantifier la réaction par une mesure de colorimétrie.

Une telle technique n'est cependant pas adaptée directement à la détection de traces, c'est pourquoi, là aussi, elle doit être précédée dans la plupart des cas d'une étape d'amplification de la quantité d'acide nucléique recherchée, par exemple par ia méthode PCR
Ce procédé de détection dit "par sonde froide" a été développé pour éviter l'utilisation de marqueurs radioactifs qui donnent des résultats qui en sensibilité sont voisins mais qui évidemment présentent des problèmes de manipulation, compte tenu de la présence de produits radioactifs et des problèmes de temps de révélation longs si on cherche une grande sensibilité.

Pour certaines applications particulières, notamment des méthodes dérivées de l'imagerie ex-vivo, on a proposé une méthode directe d'observation de la réaction en couplant le produit de l'hybridation à des microbilles, notamment de PMMA, convenablement traitées chimiquement à leur surface. La méthode repose sur l'identification directe sous microscope à balayage électronique de la présence de ces microbilles d'un diamètre typique de 60 nm et de plus repose sur les techniques d'ancrage sur solides connues mais insuffisamment spécifiques, ainsi qu'il a été décrit plus haut.

Les techniques ci-dessus ne sont évidemment pas limitées à la détection d'acides nucléiques. Dans le meme esprit, on a proposé par exemple la détection d'anticorps. Il s'agit des tests de type ELISA que nous ne redécrirons pas ici et qui, pour résumer, permettent de coupler la présence d'un anticorps à un ancrage associé d'une molécule d'antigène sur un solide. A nouveau, les problèmes de spécificité et de réactions parasites se posent. La phase de détection peut se baser ensuite sur un couplage à une réaction chromogène ayant ses propres problèmes de sensibilité.

En résumé, les méthodes de la technique antérieure ou leurs combinaisons présentent un certain nombre d'inconvénients, notamment - soit d'être potentiellement dangereuses par mise en oeuvre de
produits radioactifs, - soit de nécessiter des temps de révélation trop longs, - soit d'être gênées par des problèmes spécifiques au niveau de la
phase d'amplification, - soit de passer par des surfaces solides insuffisamment spécifiques, - soit d'etre trop peu sensibles, - soit, enfin, de nécessiter en plus de la phase d'accrochage sur un
solide l'utilisation peu commode, évidemment, d'un microscope
électronique.

Enfin, dans la plupart des cas, les procédés connus ne permettent pas de reconnaitre sur une molécule donnée la position spécifique du motif recherché. Or ce type de reconnaissance est important lorsque l'on cherche à faire une cartographie, en particulier dans le cadre de la cartographie du génoxile, on cherche à connaitre dans un premier temps la position spatiale approximative par rapport à une extrémité de la molécule d'un gène donné sur un ADN ou un ARN.

La présente invention qui se propose de remédier aux inconvénients des procédés antérieurs repose sur l'utilisation de surfaces très hautement spécifiques qui lors de leur mise en oeuvre conduisent à des bruits de fond excessivement limités, en particulier du fait qu'elles éliminent les fixations parasites.

Plus particulièrement, la présente invention concerne une surface hautement spécifique pour réactions biologiques, caractérisée en ce qu'elle comporte un support présentant en surface au moins une couche compacte d'un composé organique présentant, à l'extérieur de la couche, un groupement exposé ayant, éventuellement après modification chimique, une affinité pour un type de molécule à activité biologique, les autres éléments de la couche ne présentant que peu ou pas d'affinité pour lesdites molécules dans les conditions de réaction.

Par "affinité", il faut entendre aussi bien une réactivité chimique qu'une absorption d'un type quelconque, ceci dans les conditions éventuelles de fixation des molécules sur le groupement exposé modifié ou non.

Par "support", on entend désigner aussi bien un support solide qu'un support constitué par un élément non solide tel qu'une particule liquide ou gazeuse présentant, notamment, une couche compacte telle que revendiquée.

La surface est compacte, c'est-àire qu'elle ne permet pas à la molécule à activité biologique d'avoir accès aux couches inférieures et/ou au support, ceci afin de minimiser les interactions non-spécifiques. Bien entendu, cette non-accessibilité est à prendre en compte dans les conditions éventuelles de fixation de la molécule à activité biologique.

Parmi les surfaces les plus intéressantes, il faut citer celles sur lesquelles le groupement exposé est un groupement comportant une double liaison -CH=CH2 qui peut être activée pour donner notamment -CHO, -COOH,
NH2 et -OH ou, bien entendu, utilisé tel quel.

Parmi les groupements non-réactifs éventuellement exposés, on peut citer ceux appartenant à la classe des hydrocarbures et fluorocarbones, ceux-ci seront présentés plus en détail dans ce qui suit.

Il est évidemment entendu, au titre des groupements nonréactifs, que l'on évitera tout particulièrement les groupements organiques comprenant notamment de l'oxygène, du chlore, ceux-ci étant connus pour induire des interactions non-spécifiques, par exemple une adsorption parasite.

Les surfaces selon la présente invention peuvent être obtenues par la mise en oeuvre de divers procédés. On peut citer à titre d'exemple (A) une couche de polymère carboné, éventuellement branché, d'au
moins 10 nmd'épaisseur, remplissant la fonction,
de présenter une classe de groupements réactifs tels que
définis ci-après,
le reste de la couche étant constitué de groupements hydro
ou fluorocarbonés; (B) des surfaces obtenues par dépôt ou ancrage d'une ou plusieurs
couches moléculaires, celles-ci peuvent être obtenues par la
formation de couches successives fixées par liaisons non-covalentes,
type film de Langmuir-Blodgett, ou par auto-assemblage moléculaire,
ceci permettant la formation d'une couche fixée par liaison
covalente.

Dans le premier cas, la surface peut être obtenue par polymérisation d'au moins un monomère générant en surface du polymère ledit groupement exposé, ou bien par dépolymérisation partielle de la surface d'un polymère pour générer ledit groupement exposé, ou encore par dépôt de polymère.

Dans ce procédé, I'un des monomères est de préférence à double liaison éthylénique, le polymère formé étant une polyoléfine ou un dérivé polyénique, notamment des surfaces de type caoutchouc synthétique, tel que le polybutadiène, le polyisoprène ou le caoutchouc naturel.

Dans le deuxième cas, la surface hautement spécifique pour réactions biologiques selon la présente invention comporte - sur un support, une couche sensiblement monomoléculaire et
compacte d'un composé organique de structure allongée ayant au
moins:
un groupement de fixation présentant une affinité pour le
support, et
un groupement exposé n'ayant pas ou peu d'affinité pour ledit
support et ledit groupement de fixation dans les conditions de
fixation, mais présentant éventuellement, après une
modification chimique suivant la fixation, une affinité pour
un type de molécule biologique.

Afin d'obtenir une couche compacte, les différents composés organiques sont, de préférence, susceptibles de réagir entre eux en dehors du groupement exposé pour créer des liaisons transversales, on obtient ainsi une couche monomoléculaire compacte grâce à laquelle le support devient totalement inaccessible pour des réactions parasites.

De préférence, le composé organique présente un groupement de fixation à une extrémité et un groupement exposé à l'autre extrémité. Il est bien entendu possible de prévoir des modes de réalisation différents dans lesquels, par exemple, le groupement de fixation serait situé au milieu de la molécule, celui-ci disposant à chacune de ses extrémités d'un groupement exposé.

Afin d'éviter les réactions parasites avec le composé organique ailleurs que sur le groupement exposé, on utilise de préférence des composés organiques pour lesquels entre les groupements exposés et le groupement de fixation la ou les chaines du composé organique sont sensiblement inertes, par exemple il s'agira de chaînes saturées telles que des chaînes paraffiniques.

Les surfaces peuvent s'analyser selon a) le support, b) la molécule ayant un groupement exposé et un groupement de
fixation sur le support, c) l'interaction entre le support et ladite molécule assurant la fixation.

La fixation peut être tout d'abord de type non-covalent, notamment de type hydrophile/hydrophile et hydrophobe/hydrophobe, comme dans les films de Langmufr-Blodgett (K.B. Blodgett, J. Arn. Chem. Soc.

57, 1007 (1935).

Dans ce cas, le groupement exposé ou le groupement de fixation seront, soit hydrophiles, soit hydrophobes, notamment des groupements alkyles ou halogénoalkyles tels que CH3, CF3, CHF3, CH2 F,
L'autre groupement étant hydrophile.

La fixation peut être également de type covalent, le groupement de fixation va alors réagir chimiquement sur le support.

Certaines surfaces de structure approchante ont déjà été mentionnées dans le domaine électronique, notamment lorsque les fixations sont covalentes, L Netzer et J. Sagiv, J. Am. Chem. Soc. 105, 674 (1983) et US
A-4 539061.

Parmi les groupements de fixation, il faut citer plus particulièrement les groupements de type silane, chlorosilane, silanol, éthoxysilane, silazane, phosphate, hydroxy, hydrazide, hydrazine, amine, amide, diazonium, pyridine, sulfate, sulfonique, carboxylique, boronique, halogène, halogénure d'acide, aldéhyde.

Tout particu!ièrement, comme groupement de fixation on préfèrera utiliser des groupements susceptibles de réagir transversalement avec un groupe équivalent, voisin, pour fournir les liaisons transversales, par exemple il s'agira de dérivés de type silane, notamment dichlorosilane, trichlorosilane, diéthoxysilane et triéthoxysilane.

Ces liaisons transversales peuvent aussi être effectuées à un point quelconque dans l'épaisseur de la monocouche. en la polymérisant à l'aide de groupements réactifs éventuellement présents sur la chaine entre le site de fixation et le groupement exposé. Ainsi, les groupements diacétyléniques sont connus pour permettre une polymérisation uni- ou bidimensionnelle de la monocouche.

Le choix du groupement de fixation dépendra évidemment de la nature du support, les groupements de type silane sont bien adaptés pour la fixation covalente sur le verre et la silice.

Pour ce qui concerne les groupements exposés, et quelle que soit la surface, ils seront choisis de préférence parmi les groupements éthyléniques, acétyléniques ou des radicaux aromatiques, les amines tertiaires ou secondaires, les esters, les nitriles, les aldéhydes, les halogènes.

Mais il pourra s'agir tout particulièrement du groupement éthylénique ; en effet, celui-ci peut être modifié chimiquement après fixation pour conduire, par exemple, à un groupement carboxylique ou des dérivés de groupements carboxyliques tels que des groupements alcools, aldéhydes, cétones, acides, amines primaires, secondaires ou tertiaires.

De préférence, les chaînes reliant le groupement exposé au groupement de fixation sont des chaines comportant au moins 1 atome de carbone, de préférence plus de 6 et en général de 3 à 30 atomes de carbone, ainsi même dans le cas de défaut de couverture du solide, des groupements inertes, et non pas le solide, sont exposés ; dans ce cas et lorsque l'on a formation d'un couplage latéral à l'intérieur même de la couche, que ce couplage soit ionique, de coordinance ou covalent, on obtient des couches hautement ordonnées obtenues par auto-assemblage, même si la surface initiale ne présente qu'un nombre réduit de sites d'ancrage actifs comparé au nombre de molécules obtenues dans une monocouche compacte.

Pour ce qui concerne le support lui-même, il peut être constitué d'une matière quelconque, mais on préfèrera utiliser de façon générale, dans le cas d'un solide, du verre, de la silice, un polymère ou de l'or avec ou sans prétraitement de la surface.

On peut avantageusement utiliser, dans le cas du verre ou de la silice, les techniques connues de fonctionnalisation de surface utilisant des dérivés silanes, par exemple : Si-OH + Cl3-Si-R-CH=CH2 donne Si-OSi-R-
CH=CH2, R consistant par exemple en (CH2 ). Une telle réaction est connue dans la littérature, avec utilisation de solvant ultra-purs. La réaction conduit à un tapis de molécules présentant leur extrémité C=C à la surface exposée à l'extérieur.

Dans le cadre de l'obtention de surface à très haute spécificité, la présente invention concerne aussi pour de telles réactions de greffage de molécule à double liaison C=C l'utilisation d'une phase gazeuse, permettant d'éviter l'utilisation de solvant.

Dans le cas de l'or, celui-ci étant éventuellement sous la forme d'une couche mince sur un substrat, les techniques connues de fonctionnalisation de surface utilisent des dérivés thiols, par exemple : Au +
HS-R-CH=CH2 donne Au-S-R-CH=CH2, R consistant par exemple en (CH2)e Une telle réaction est décrite en milieu liquide et conduit, de même que la réaction précédente trichlorosilane-silice, à un tapis de molécules présentant leur extrémité C=C à la surface exposée à l'extérieur.

Bien entendu la terminologie de support" englobe aussi bien une surface unique telle qu'une lame, mais également des particules qu'il s'agisse de poudre de silice ou de billes de polymère, et aussi des formes quelconques telles que barre, fibre ou support structuré, lesquelles peuvent d'ailleurs être rendues magnétiques, fluorescentes ou colorées, comme cela est connu dans différentes technologies de dosage.

De préférence, le support sera choisi pour être pas ou peu fluorescent lorsque la détection sera effectuée par fluorescence.

Les surfaces obtenues selon les modes (A) ou (B) ci-dessus présentent une grande spécificité grace à (i) la présence de sites réactifs spécifiques provenant, soit des groupes
exposés, soit de la molécule fixée (ii) un très faible taux d'interactions non-spécifiques, dû à l'absence de
liaisons parasites : liaisons coalentes, liaisons faibles de type
absorption, liaisons hydrophobes ; à titre de comparaison, les
surfaces commerciales Nunc, Costar, etc. présentent de nombreux
sites d'interactions non-spécifiques, I'ADN y étant ainsi ancré en de
nombreux points, alors que sur des surfaces selon la présente
invention on peut observer des molécules d'ADN ancrées uniquement
par leurs extrémités 5'; (iii) un très faible taux de fluorescence intrinsèque, lorsque cela est
requis, un bruit de fond de fluorescence (d'une aire typique de 100
x 100 p m) plus faible que le signal de fluorescence d'une seule
molécule à détecter; (iv) la possibilité de détecter des molécules isolées avec un rapport S/N
indépendant du nombre de molécules, qui est possible grâce à
différentes techniques à grand rapport S/N décrites plus bas et
basées sur l'identification de la présence d'un marqueur
macroscopique présentant une faible interaction non-spécifique
avec la surface.

les surfaces ainsi obtenues sont, de préférence, revêtues d'une molécule à activité biologique choisie parmi - les protéines, - les acides nucléiques, - les lipides, - les polysaccharides et leurs dérivés.

Parmi les protéines, il faut citer les antigènes et les anticorps, les ligands, les récepteurs, mais également des produits de type avidine ou streptavidine ainsi que les dérivés de ces composés.

Parmi les ARN et les ADN, il faut également citer les dérivés a, ss ainsi que les dérivés thio et les composés mixtes tels que les PNA.

On peut également fixer des composés mixtes tels que les glycopeptides et les lipopolysaccharides par exemple, ou bien d'autres éléments tels que virus, cellules notamment, ou composés chimiques tels que la biotine.

La fixation des molécules biologiques peut être covalente ou non-covalente, par exemple par absorption, liaisons hydrogènes, interactions hydrophobes, ioniques, par exemple, auquel cas on pourra procéder avantageusement à un pontage ( cross-linking") entre les molécules greffées par les méthodes connues ("Chemistry of Protein
Conjugation and Cross-linking", S.C. Wong, CRC Press (1991)) et ceci afin de renforcer leur cohésion.

Comme cela a été mentionné précédemment, il est possible d'avoir un groupement exposé qui permet la réaction directe avec les molécules à activité biologique, mais il est également possible de prévoir que le groupement exposé est traité, après fixation, pour être transformé, comme cela a été indiqué précédemment, en un radical hydroxy, amine, alcool, aldéhyde, cétone, COOH ou dérivé de ces groupements avant la fixation de la molécule biologique.

Lorsque de tels groupements ont été exposés, les techniques de fixation des protéines et/ou de I'ADN, par exemple, sont connues, il s'agit en effet de réactions mises en oeuvre pour des surfaces qui sont déjà utilisées dans le cadre des analyses biologiques, notamment pour les surfaces Costar et les surfaces Nunc ou des microbilles telles qu'Estapor, Bang et Dynal par exemple, sur lesquelles on ancre des molécules d'intérêt biologique, ADN,
ARN, PNA, protéines ou anticorps par exemple.

Dans le cas où le groupement exposé est un radical -CH=CH2 qui sera nommé ci-après surface C=C" ou surface à liaison éthylénique", il n'existe pas de document mentionnant l'ancrage direct, en particulier de l'ADN ou des protéines.

Dans le cadre de la présente invention, il a été démontré que ces surfaces présentent une réactivité pour des acides, non-ionisés tels que -COOH, -P03H2, alors qu'ils ne présentent que pas ou peu d'affinité pour les espèces anioniques correspondantes, cette particularité permet d'ancrer les acides nucléiques ou les protéines en utilisant des zone de pH et souvent avec une vitesse de réaction qui peut être contrôlée par le pH.

Ainsi, pour 1'ADN à pH 5,5, la réaction d'ancrage est totale en une heure (si pas limitée par la diffusion) et se produit par les extrémités 5'.

A pH 8, par contre, l'accrochage est très faible (vitesse de réaction de 5 à 6 rires de grandeur plus faibles). Cet effet d'accrochage pH dépendant et 5' spt;cifique) présente une amélioration par rapport aux autres surfaces qui necessitent une fonctionnalisation de l'ADN (biotine, DIG, NHS, ...) ou des reactifs spécifiques (carbodiimide, diméthle pimélidate) qui réalisent une liaison peptidique ou phosphorimide entre -NH2 et -COOH ou -POOH.

I1 va de soi que la présente invention concerne, dans le même csprit, I'accrochage éventuellement pH dépendant de toutes molécules d'intérêt biologique caractérisées en ce qu'elles présentent au moins un site rcactif avec un proton mobile.

De même ces surfaces C=C peuvent ancrer des protéines directement (protéine A, anti-DIG, anticorps, streptavidine, etc.). fi a été observé que (i) l'activité de la molécule peut être préservée et (ii) que la réactivité de la surface préparée (initialement C=C) est totalement occultée pour faire place à la seule réactivité de la molécule d'intérêt. Il est donc possible, à partir d'une réactivité chimique initiale relativement large, de passer à une surface possédant une réactivité très hautement spécifique, par exemple celle de sites spécifiques sur une protéine.

En greffant un anticorps spécifique sur la surface (par csemple anti-DIG), on crée une surface dont la réactivité est limitée à
L'antigène (par exemple le groupement DIG). Ceci indique que les groupements chimiques initiaux ont tous été occultés par les anticorps greffés.

On peut aussi greffer sur les surfaces réactives (chimiquement ou biochimiquement) d'autres molécules à activité biologique, notamment des virus ou d'autres composants : membranes, récepteurs membranaires, polysaccharides, PNA, notamment.

Il est également possible de fixer le produit d'une réaction d'intérêt biologique (par exemple la PCR) sur les surfaces préparées.

La présente invention concerne également les surfaces obtenues par la mise en oeuvre des procédés selon la présente invention et tous les procédés mettant en oeuvre ce type de surface, qu'il s'agisse de procédés permettant la mise en évidence et/ou la quantification de molécules biologiques, mais également la séparation de certaines molécules biologiques, notamment un prélèvement par mise en oeuvre des techniques de couplage antigène/anticorps et/ou ADN, ADN/ARN.

La présente invention concerne également des procédés de préparation des surfaces hautement spécifiques pour réactions biologiques tels que décrits précédemment pour l'obtention des couches selon (A) et (B) et, en particulier, le procédé caractérisé en ce que - on fixe sur un support une couche sensiblement monomoléculaire et
compacte d'un composé organique de structure allongée ayant au
moins:
un groupement de fixation présentant une affinité pour le
support, et
un groupement exposé n'ayant pas ou peu d'affinité pour ledit
support et le groupement de fixation dans les conditions de
fixation, mais présentant éventuellement après une
modification chimique suivant la fixation, une affinité pour
un type de molécule biologique.

La présente invention concerne également les applications des surfaces traitées à la détection de molécules isolées à l'aide de réactifs spécifiques et de méthodes de détection à rapport S/N indépendant du nombre de molécules détectées.

Ainsi de façon générale, la présente invention concerne un procédé de mise en évidence et/ou de dosage d'une molécule à activité biologique dans un échantillon, caractérisé en ce qu'on utilise une surface telle que décrite précédemment, sur laquelle se trouve fixée une molécule à activité biologique capable de reconnaître la molécule de l'échantillon, et en ce que la mise en évidence ou le dosage sont effectués grâce à un réactif fluorescent ou non détectant la présence de la molécule fixée.

Parmi les réactifs on distingue les réactifs fluorescents et les réactifs non-fluorescents.

Les réactifs fluorescents contiennent des molécules fluorescentes, choisies avec avantage pour etre des molécules longues de taille supérieure à 0,1 pm et réagissant de manière spécifique directement ou indirectement avec les surfaces prétraitées. Par exemple, mais sans pour autant s'y limiter, une molécule d'ADN double brin teintée à l'aide de sondes fluorescentes (ethidium bromide, YOYO, nucléotides fluorescents, etc.) pouvant s'ancrer directement sur une suface C=C, ou par une modification de la molécule (DIG, biotine, etc.) sur une surface présentant des protéines complémentaires (anti-DIG, streptavidine, etc.).

Les réactifs non-fluorescents consistent, notamment, en des billes ancrées par l'intermédiaire d'une molécule fixée de manière spécifique directement ou indirectement à une surface prétraitée. Grâce au traitement des surfaces, ces billes présentent une faible interaction nonspécifique avec la surface. Par exemple, mais sans pour autant s'y limiter, des billes Dynal recouvertes de sptreptavidine et ancrées par l'intermédiaire d'un ADN biotynilé à une surface selon la présente invention, présentant des sites capapbles de réagir avec l'autre extrémité de la molécule d'ADN.

Selon que la molécule recherchée est détectée directement par fluorescence ou indirectement à l'aide des réactifs cidessus, on par formes de la réalisation de la présente invention d'identifier individuellement le nombre de sites mazant réagi. Dans ce cas, la surface hautement spécifique est prise avantageusement pour présenter un taux très faible de fluorescence, notamment le support doit présenter une faible fluorescence.

Après ancrage du réactif fluorescent, la détection et le comptage du nombre éventuellement petit de réactions d'ancrage peut se faite avantageusement avec l'aide d'un microscope optique à fluorescence utilisant un objectif à grande ouverture numérique, permettant de repérer soit directement à l'oeil, soit après acquisition de signal, le nombre de molécules fluorescentes ancrées.

On peut avantageusement procéder à un balayage du champ d'observation pour explorer une plus grande surface que le seul champ fixe.

Dans la mise en oeuvre dite de mode Y de la présente invention, on détecte un réactif macroscopique de type bille (fluorescente, magnétique, colorée, par exemple).

Une telle technique est dérivée de Manning et al. en ce sens que la réaction est révélée par la présence ou l'absence de microbilles. La nouveauté du procédé est liée à l'utilisation: (i) de billes à réactivité spécifique, (ii) à l'utilisation de billes de tailles non pas nanoscopiques mais se
situant dans la gamme 0,1 zm-200 rm, décelables par une technique
macroscopique, et (iii) à l'absence de réaction non-spécifique entre billes et surface due à
l'utilisation du produit selon la présente invention.

Le nombre de ces billes macroscopiques caractérisant chacune une réaction d'ancrage est ensuite déterminé par une méthode physique macroscopique au rang desquelles, mais sans s'y limiter, on peut citer la diffusion de lumière sur les billes, la microscopie optique et la fluorescence des billes.

La spécificité de certaines réactions biologiques peut être limitée. Ainsi, dans le cadre de l'hybridation, les hybrides peuvent être imparfaits (réactions avec d'autres sites) tout en présentant un nombre réduit d'appariement et donc une qualité de liaison moindre. La présente invention couvre également l'utilisation possible d'une étape de test de la qualité des liaisons obtenues. Ce test permet de dissocier les produits appariés de façon non-spécifique faible, par absorption, forces h?brophobes, liaisons hydrogènes imparfaites, hybridation imparfaite, notamment.

C'est pourquoi, I'in\cntion concerne également dans un procédé de mise en évidence ou dc dosage tel que décrit précédemment, un procédé où l'on soumet le produit de réaction entre la molécule à activité biologique et la molécule de l'échantillon à une contrainte afin de détruire les mauvais appariements avant la détection.

Ce procédé offre, outre la possibilité de détruire les couples misappariés, la possibilité d'orienter les produits du couplage, ce qui facilite les mesures ou les observations.

On peut ainsi appliquer aux surfaces, après fixation des éléments complémentaires, une contrainte qui peut être constituée par l'utilisation simple ou combinée de - centrifugation, - gradient de champ magnétique appliqué aux réactifs non
fluorescents pris alors pour inclure des microbilles magnétisables ou
magnétiques, - agitation, - écoulement liquide, - passage de ménisque, - électrophorèse - variation de température, et/ou gradient de température.

On détermine alors par les techniques de détection faible bruit décrites ci-après le nombre de systèmes étant restés intègres ou s'étant détruits.

Il convient de remarquer que grâce aux surfaces selon la présente invention, il est possible d'orienter les molécules après leur fixation par passage du ménisque air/eau, notamment sur de l'ADN. Ainsi, on a remarqué que le passage du ménique air/eau sur de l'ADN en solution et ancré à la surface, résultait en une extension régulière des molécules ancrées. Elles se présentent alors à l'air libre sous forme de bâtonnets fluorescents allongés. Ces molécules allongées sont stables à l'air libre et peuvent être observées même après plusieurs semaines, sans présenter de dégradation apparente.

Ces observations remarquables et inattendues suggèrent une possibilité de compter le nombre de molécules d'ADN ancrées à la surface: d'une part, les surfaces étant très peu fluorescentes, le rapport signal/bruit (S/N) est bon, d'autre part, recherchant un objet très corrélé (forme de bâtonnets), il est très facile d'augmenter le rapport S/N. C'est-à-dire, ignorer les poussières, les inhomogénéités, qui ne présentent pas de corrélation spatiale particulière. Il faut noter qu'en solution, les molécules cn pelote fluctuent thermiquement, ce qui entraîne des variations très importantes de leur signal de fluorescence recueilli, en général, avec une faible profondeur de champ et limite leur observation. La présente invention couvre aussi cette technique d'alignement et d'immobilisation qui permet donc l'observation de molécules isolées avec un très grand rapport S/N.

Il est remarquable que ce rapport est indépendant du nombre de réactions d'ancrage. Le rapport S/N posé par la détection d'une molécule est le même que pour 10 000. De plus cette technique d'étirement permet de discriminer aisément entre des molécules de longueurs variées.

On peut avantageusement procéder aux étapes suivantes pour améliorer encore le rapport S/N - La molécule étant immobile, on peut intégrer son signal de
fluorescence.

- L'observation au microscope présente un champ réduit (typiquement
100 pm x 100 pm avec un objectif x 100 à immersion, N.A. = 1.25). Pour
un échantillon de 1 cm2 on peut soit procéder à un balayage, soit
envisager l'utilisation d'objectifs d'agrandissements moindres (x 10
ou x 20) mais d'ouverture numérique élevée.

- Les bâtonnets étant toujours parallèles, on peut envisager une
méthode de filtrage spatial optique pour augmenter encore le rapport
S/N.

- D'autres méthodes de fluorescence globale sont envisageables (EP #
103426).

- La linéarisation des molécules s'observe aussi bien dans le cadre
d'un greffage chimique (C=C) que dans le cas de liaisons de type
immunologique (DlG/anti-DIG).

- Une fois la surface à l'air libre, les molécules d'ADN sont stables
(restent intègres, même après plusieurs semaines) et fluorescentes.

On peut avantageusement utiliser cette propriété pour différer
l'étape d'ancrage de l'étape de repérage/comptage des molécules
ancrées, si cette détection se fait par exemple, mais sans s'y limiter,
par microscopie à fluorescence. Une telle utilisation est couverte par
la présente invention.

- Une technique de double (ou multi) fluorescence peut
éventuellement servir à améliorer le rapport S/N ou à détecter une
double fonctionnalité.

- I1 est possible d'étendre le ménisque air/eau utilisé id afin d'étirer la
molécule à d'autres systèmes tels que huile/eau ou
eau/surfactant/air, notamment.

On peut aussi utiliser une orientation dynamique des molécules en solution ancrées à une extrémité, par électrophorèse ou écoulement dans une ou plusieurs directions successives, une telle technique pouvant ainsi conduire à une détection synchrone de la présence de molécules dans une direction donnée, par analyse des variations temporelles du signal de fluorescence correspondant à une direction donnée (par exemple, mais sans sy limiter pour autant, par utilisation d'un filtre spatial optique convenablement disposé, permettant d'obtenir un signal préférentiel pour certaines orientations des molécules observées).

Néanmoins, les résultats observés montrent que cette technique, dans sa version la plus simple (étirement dans une seule direction, sans détection synchrone) est beaucoup moins performante que l'utilisation du ménisque.

Les surfaces et/ou les réactifs et/ou les techniques de détection décrits dans la présente invention peuvent être utilisés pour de nombreuses applications parmi lesquelles, mais sans s'y restreindre - I'identification d'un ou plusieurs éléments de séquençage d'ADN ou
d'ARN que l'on peut utiliser avec avantage pour le diagnostic de
pathogènes ou la cartographie génétique - la mesure de la taille de fragments d'ADN que l'on peut utiliser avec
avantage pour la cartographie génétique - I'amélioration de la sensibilité des techniques d'ELISA avec la
possibilité de détecter un faible nombre (éventuellement inférieur à
1 000) de réactions immunologiques.

L'identification de séquences d'ADN/ARN peut se faire d'abord par réaction dans le volume de la solution des molécules d'ADN/ARN avec des sondes complémentaires (par exemple par hybridation ou à l'aide de protéines spécifiques du segment recherché). Deux modes d'opération sont alors possibles.

Les descriptions qui vont suivre seront, pour certaines, faites en se référant aux figures annexées sur lesquelles - la figure 1 schématise la détection d'un pathogène dans une molécule
d'ADN fluorescente par hybridation avec une molécule ancre; - la figure 2 schématise la cartographie génétique par extension de
l'ADN et l'utilisation d'un ADN marqueur; - la figure 3 schématise la détection d'une réaction immunologique
(ELISA) à l'aide d'une molécule "drapeau" : un ADN fluorescent
utilisé comme marqueur de réaction - la figure 4 est une microphotographie de fluorescence montrant
l'extension d'ADN de phage A par l'avancée du ménisque, à gauche on
aperçoit des molécules d'ADN en solution étirées par l'écoulement
d'évaporation parallèle au ménisque, à droite des molécules d'ADN à
l'air libre après leur étirement perpendiculairement au ménisque - les figures 5(a) et 5(b) sont des microphotographies de fluorescence
montrant, respectivement, un ADN marqué à la digogixénine (DIG)
sur une surface recouverte d'anti-DIG et étiré par le ménisque, et, en
contrôle, un ADN non marqué sur une surface anti-DIG, on
remarquera la très grande spécificité des surfaces et l'absence
d'ancrage non-spécifique - la figure 6 est une microphotographie de fluorescence montrant une
surface commerciale NUNC, on remarquera les très grandes
inhomogénités de fluorescence qui rendent ces surfaces impossibles
à utiliser pour la détection fluorescente d'une seule molécule.

Dans le mode diagnostic", les sondes (les ancres") possèdent un groupement réactif (DIG, biotine, etc.) capable de s'ancrer de manière spécifique à une surface selon la présente invention (ayant par exemple comme site d'ancrage un anticorps anti-DIG ou la streptatividine). La détection de la réaction d'ancrage peut se faire directement par détection de la fluorescence de la molécule d'ADN teintée par des molécules fluorescentes (ethidium bromide, YOYO, nucléotides fluorescents) (figure 1). Elle peut aussi se faire indirectement par détection d'une molécule drapeau" : un réactif selon la présente invention capable de se fixer sur la molécule d'ADN/ARN (par exemple par hybridation, interaction protéine-ADN, etc.), mais ne présentant pas d'affinité pour les sites d'ancrage de la sonde.

Dans le mode cartographie", les sondes complémentaires sont directement couplées à un réactif fluorescent selon la présente invention.

Il peut s'agir par exemple d'un simple brin d'ADN complémentaire possédant des bases modifiées pour être fluorescentes ou d'un long double brin d'ADN teinté avec un fluorophore A et se terminant par un segment simple brin complémentaire de la séquence recherchée. Pour des sondes différentes, des fluorophores de différentes couleurs peuvent être utilisés.

On peut aussi, avec avantage, teindre la molécule d'ADN sur laquelle les sondes viennent s'hybrider avec un fluorophore d'une autre couleur.

L'hybride ADN-sondes est ancré en l'une de ses extrémités et étiré par une des méthodes décrites précédemment. La distance du point d'ancrage aux points d'hybridation,ou entre les points d'hybridations, est déterminée par la détection de la fluorescence de la sonde, suivant les méthodes décrites précédemment (figure 2).

Par exemple, sans pour autant s'y limiter, un ADN marqueur, d'environ 3 000 paires de bases et ayant en une de ses extrémités un segment simple brin complémentaire du gène recherché, est teinté avec un fluorophore A (par exemple YOYO1). Cet ADN est hybridé puis ligué avec l'ADN simple brin à cartographier, puis ce dernier est teinté avec un deuxième fluorophore B (POP1) (après réaction par random primming", pour le transformer en ADN double brin). La molécule est alors ancrée par une de ses extrémités (par exemple par liaison DlG/anti-DIG) et étirée par l'action du ménisque. La distance entre l'extrémité de la molécule et la postion du gène marqué, observable en microscopie par double fluorescence (2 couleurs A et B) permet d'établir la position du gène recherché avec une précision de l'ordre de 1 000 paires de bases (0,3 pm).

L'identification de séquences d'ADN/ARN peut aussi se faire par réaction entre la séquence recherchée et les sites réactifs d'une surface selon la présente invention (par exemple des oligonucléotides complémentaires ou le site de réaction d'une protéine spécifique du segment recherché). La détection dc la réaction d'ancrage peut alors se faire directement ou indirectement < à l'aide d'une molécule drapeau") comme décrit précédemment.

Il est bien entendu que l'identification de séquences d'ADN/ARN suivant la présente invention peut aussi bien servir à des fins de diagnostic (par exemple la détection de la présence ou l'absence d'un pathogène viral ou chromosomique) qu'à des fins de cartographie génétique. Elle peut être précédée d'une étape d'amplification par une méthode quelconque, notamment la PCR.

Par ailleurs, comme mentionné par K.R. Allan et al. (US 84 114), La cartographie génétique peut procéder par une mesure de la taille de fragments d'ADN. Or le couplage entre les surfaces selon la présente invention et les techniques originales d'étirement des molécules décrites plus haut (en particulier et avec avantage l'étirement par le ménisque) permet une mesure de la longueur des molécules étirées et cela sur un très petit échantillon (quelques milliers de molécules).

On peut, par exemple, mais sans sy restreindre, procéder de la manière suivante
Un échantillon d'ADN est fragmenté (à l'aide d'enzymes de restriction), teinté avec un fluorophore puis ancré sur une surface présentant des groupements réactifs (par exemple les surfaces C=C). Les molécules sont ensuite étirées par le ménisque et la taille des fragments étirés déterminée par microscopie optique à fluorescence avec une résolution et une taille limite de l'ordre de 1 000 bp (0,3 rm).

Les surfaces selon la présente invention peuvent être utilisées pour la mise en oeuvre des procédés connus permettant la mise en évidence et/ou la quantification d'un antigène ou d'un anticorps, notamment les méthodes ELISA mettant en oeuvre des systèmes enzymatiques ou des méthodes de type RIA mettant en oeuvre des marqueurs radioactifs. 11 s'agit la de technologies qui ne seront pas redécrites en détail.

On peut aussi et avantageusement utiliser les surfaces selon la présente invention comme support des réactions immunologiques d'un procédé ELISA possédant une étape d'ancrage d'un réactif selon la présente invention ( drapeau") sur l'un des réactifs de l'ELISA (figure 3). La détection peut naturellement se faire de façon globale par mesure de fluorescence. Il est possible aussi de procéder au comptage du nombre de réactions, ceci peut avantageusement s'effectuer suivant les méthodes de détection décrites dans la présente invention, en particulier l'extension par le ménisque, et ceci grâce au faible taux de fluorescence et d'interaction non-spécifique du produit de la présente inention. Ceci permet la détection d'un petit nombre de réaction, éventuellement inférieur à 1 000) avec un excellent rapport S/N.

On peut donc, par une modification mineure des méthodes
ELISA en sandwich (anticorps-antigène-anticorps modifié, par exemple biotynilé), venir greffer sur la surface un réactif selon la présente invention, par exemple de l'ADN fluorescent ancré à la streptavidine.

Toutes les variantes de la technique ELISA s'appliquent avec une sensibilité bien meilleure. Des techniques de mesure de fluorescence globale sont déjà utilisées pour déterminer la qualité des réactions d'ELISA.

Cependant, le procédé selon l'invention permet une détection bien meilleure car sensible au signal de fluorescence d'une seule molécule.

Bien entendu, il est possible d'utiliser ces surfaces comme surfaces de fixation d'au moins un produit d'une réaction d'intérêt biologique, à titre d'exemple sans pour autant s'y limiter, des produits de la réaction d'amplification, qu'il s'agisse de PCR ou d'une méthode apparentée et, enfin, il est possible d'utiliser ce type de surfaces comme suppon pour une chromatographie d'affinité, quelle soit préparative ou de détection.

Dans ce cas, on peut par exemple greffer une population d'oligonucléotides donnée sur des billes de silice qui constitueront la phase stationnaire d'une colonne de chromatographie.

L'étape de chromatographie doit permettre une spécificité particulière de la colonne vis à vis d'éluants, par exemple un mélange d'ADN dont certains présentent des séquences complémentaires ou très voisines de l'oligonucléotide greffé.

La présente invention concerne enfin l'utilisation des surfaces selon la présente invention dans des trousses de diagnostic ou de séparation.

D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples ci-après.

Matériels et méthodes
L'ADN-k et l'anticorps monoclonal (Anti-DIG) proviennent de
Boehringer-Mannheim. Les trichlorosilanes proviennent de Roth-Sochiel.

Les sondes nucléiques fluorescentes (YOYO1, YOYO3 et POP1) proviennent de Molecular Probes. Les lamelles de verre ultrapropres proviennent de Erie
Scientific (Lamelles (ESCO). Les particules magnétiques proviennent de
Dynal. Le microscope est un microscope inversé Diaphot de NIKKON, équipé d'une lampe Xenon pour l'épi-fluorescence et d'une caméra CCD intensifiée
Hamamatsu pour la visualisation.

Traitement de surface
Des lamelles de verre sont nettoyées pendant une heure par irradiation UV sous atmosphère d'oxygène (par formation d'ozone). Elles sont ensuite immédiatement déposées dans un dessicateur préalablement purgé de traces d'eau par un courant d'argon. Un volume d'environ 100 à 500 pi du trichlorosilane approprié (H2C=CH-(CH2)N-SiCI3 est introduit dans le dessicateur, d'où les surfaces sont retirées après environ 12 heures (n = 6) ou 1 heure (n = 1). Au sortir les surfaces sont nettes et non-mouillantes.

Les groupes fonctionnels de ces surfaces double liaison (H2C=CH-) peuvent être transformés en groupements carboxyles (-COOH) en trempant les lamelles traitées, comme décrit précédemment, pendant une dizaine de minutes dans une solution de 25 mg KMnO4, 750 mg NalO4 dans 1 1 d'eau, puis en les rinçant trois fois dans de l'eau ultrapure.

Les lamelles ainsi fonctionnalisées peuvent réagir avec des protéines. Un volume de 300 pi d'une solution aqueuse (20 ,ug/ml) de protéines (protéine A, streptavidine, etc.) est déposé sur une lamelle fonctionnalisée en groupement (H2C=CH-). Cette lamelle est incubée environ deux heures à température ambiante, puis rincée trois fois dans de l'eau ultrapure. Les surfaces ainsi traitées sont nettes et mouillantes. Les surfaces traitées à la protéine A peux en ensuite réagir avec un anticorps, par exemple anti-DIG, par incubation dans une solution de 20 pg/ml d'anticorps.

Ancrage d'ADN natif sur surface double liaison
Une goutte de 2 pl d'une solution d'ADN-A marqué par fluorescence (YOYO1, POPOl ou YOYO3. mais sans terminaison particulière) de concentration variable et dans différents tampons (nombre total de molécules < 107) est déposé sur une lamelle prétraitée (H2C=CH-) et recouverte d'une lamelle de verre non traitée (diamètre 15 mm). La préparation est incubée environ 1 heure à température ambiante dans une atmosphère saturée en vapeur d'eau. Dans un tampon de 0,05 M MES (pH = 5,5), on observe un ancrage quasi-général des molécules d'ADN. Par contre dans un tampon de 0,01 M Tris (pH = 8) il n'y a presqu'aucune molécule d'ancrée (rapport > 106. Cette dépendance peut permettre le contrôle de l'activation/désactivation des surfaces (vis-à-vis de l'ADN) par l'intermédiaire du pH.

Détection de l'ancrage Dar l'action du ménisque
En transférant la préparation précédante dans une atmosphère sèche, la solution en s'évaporant va étirer les molécules d'ADN, ancrées à la surface, perpendiculairement au ménisque. La force capillaire sur la molécule d'ADN (quelques dizaines de picoNewtons) est en effet suffisante pour étirer complètement la molécule (plus grande que les forces d'élasticité entropique), mais trop faible pour briser la liaison covalente entre l'extrémité de la molécule et la surface traitée. L'ADN étant marqué par fluorescence, on observe individuellement et aisément les molécules étirées (longueur totale environ 20 pm). L'ancrage entre la surface et l'ADN étant limité aux extrémités 5'-phosphate, on a pu aussi bien étirer des ADN de phage x, de YAC ou de E coli (longueur totale supérieure à 400 pm). Cette préparation d'ADN étirés, fluorescents et à l'air libre est stable pendant plusieurs jours et peut être observée de façon non destructive, par épifluorescence (microscope inversé Nikkon Diaphot avec objectif x100,
O.N.: 1.25).

détection de l'ancrage Dar électrophorèse
Une cellule électrophorétique est formée par un anneau de paraffine (épaisseur environ 100 pm) pris entre une lamelle traitée et une lamelle de verre non-traitée entre lesquelles deux électrodes de platine sont insérées. L'ensemble est rendu solidaire en fondant brièvement l'anneau de paraffine. Grace à deux ouvertures laissées dans l'anneau de paraffine on introduit la solution d'ADN dans cette cellule par capillarité, puis on scelle les deux ouvertures à la paraffine. On incube, comme précédemment, à température ambiante. En appliquant une faible tension (quelques volts) entre les deux électrodes de platine, on observe par fluorescence un mouvement des molécules d'ADN libre(quelques dizaines de microns par seconde) et une extension dans la direction de l'écoulement des molécules ancrées que l'on peut ainsi identifier aisément et individuellement par microscopie en épifluorescence.

Ancrage et détection spécifiques
En traitant les surfaces comme décrit précédemment avec un anticorps monoclonal spécifique, on peut contrôler très précisément leur spécificité. Ainsi, on a testé la spécificité de surfaces traitées anti-DIG vis-à vis d'ADN-x hybridés avec un oligonucléotide complémentaire d'une des extrémités Cos et possédant un groupement digoxigénine (DIG) et vis-à-vis d'ADN non hybridés. Dans le premier cas, on a observé une extension, par action du ménisque, quasi-générale des molécules ancrées. Dans le second cas, on n'a observé que quelques molécules d'ADN ( < 10) ancrées dans tout l'échantillon. On estime donc que la spécificité de la méthode selon l'invention est meilleure que 106.

Sensibilité de la détection
Afin de déterminer la sensibilité de la méthode de détection par extension du ménisque, on a déposé sur des surfaces double liaison des gouttes de 2,5 pl d'une solution d'ADN-s dans 0,05 M MES (pH = 5,5) contenant un total de 105, 104 et 1 000 molécules. L'ancrage s'effectue comme décrit précédemment. Les lamelles sont ensuite observées en microscopie par épifluorescence, pour déterminer la densité de molécules ancrées. Celle-ci correspond bien à celle estimée : environ 46 molécules d'ADN par champ de vision (100 pm x 100 pm) pour un total de 105 molécules d'ADN. Pour la plus faible concentration, on a pu observé une dizaine de molécules étendues par action du ménisque. Ce nombre est essentiellement limité par le grand nombre de champs de vision nécessaires à couvrir tout l'échantillon (environ 25 000), ce qui rend une recherche manuelle difficile, mais peut etre avantageusement effectuée automatiquement et avec un objectif plus faible, mais à plus grand champ. En conclusion, la sensibilité de la méthode selon l'invention permet une détection et un comptage individuel de moins de 1 000 molécules d'ADN.

Claims (67)

REVENDICATIONS

1) Surface hautement spécifique pour réactions biologiques, caractérisée en ce qu'elle comporte un support présentant en surface au moins une couche compacte d'un composé organique présentant, à l'extérieur de la couche, un groupement exposé ayant, éventuellement après modification chimique, une affinité pour un type de molécule à activité biologique, les autres éléments de la couche ne présentant que peu ou pas d'affinité pour lesdites molécules dans les conditions de réaction.

2) Surface selon la revendication 1, caractérisée en ce que le support est un support solide.

3) Surface hautement spécifique selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que la couche compacte ne permet pas à la molécule à activité biologique d'avoir accès aux couches inférieures et/ou au support.

4) Surface hautement spécifique selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle ne présente en surface que des groupements exposés présentant une affinité pour un type de molécule à activité biologique, les autres groupements éventuellement présents étant pratiquement non-réactifs.

5) Surface selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le groupement exposé est un groupement comportant une double liaison.

6) Surface selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée ce qu'elle est obtenue par polymérisation d'au moins un monomère générant en surface du polymère ledit groupement exposé.

7) Surface selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée ce qu'elle est obtenue par dépôt de polymère sur le support.

8) Surface selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé ce qu'elle est obtenue par dépolymérisation partielle de la surface d'un polymère pour générer ledit groupement exposé.

9) Surface selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisée ce que le polymère est un polymère à double liaison éthyléniqe.

10) Surface selon l'une des revendications 6 à 9, caractérisée en ce que le polymère est une polyoléfine ou un dérivé polyénique.

11) Surface hautement spécifique selon l'une des revendications l à 10, caractérisée en ce qu'elle comporte: - sur un support une couche sensiblement monomoléculaire et

compacte d'un composé organique de structure allongée ayant au

moins:

un groupement de fixation présentant une affinité pour le

support, et

un groupement exposé n'ayant pas ou peu d'affinité pour ledit

support et ledit groupement de fixation dans les conditions de

fixation, mais présentant éventuellement, après une

modification chimique suivant la fixation, une affinité pour

un type de molécule biologique.

12) Surface selon la revendication 11, caractérisée en ce que la fixation est de type non-covalente.

13) Surface selon la revendication 12, caractérisée en ce que la fixation est effectuée par des interactions hydrophiles ou hydrophobes.

14) Surface selon la revendication 13, caractérisée en ce que la couche sensiblement monomoléculaire et compacte est un film de Langmuir

Blodgett.

15) Surface selon l'une des revendications 11 à 14, caractérisée en ce que le groupement de fixation ou le groupement exposé sont choisis parmi les groupements alkyle et alkyle halogéné pour réaliser des liaisons hydrophobes.

16) Surface selon la revendication 15, caractérisée en ce que le groupement de fixation ou le groupement exposé sont choisis parmi : -CH3,

CF3, -CH2F, CHF2.

17) Surface selon la revendication 11, caractérisée en ce que la fixation est de type covalent.

18) Surface selon l'une des revendications l à 17, caractérisée en ce que les composés organiques sont susceptibles de réagir entre eux en dehors du groupement exposé pour créer des liaisons transversales.

19) Surface selon l'une des revendications 11 à 18, caractérisée en ce que le composé organique présente un groupement de fixation à une extrémité et un groupement exposé à l'autre extrémité.

20) Surface selon l'une des revendications 11 à 18, caractérisée en ce que entre les groupements exposés et de fixation la ou les chaînes du composé organique sont sensiblement inertes.

21) Surface selon la revendication 20, caractérisée en ce que les chaînes du composé organique sensiblement inertes sont des chaînes saturées.

22) Surface selon l'une des revendicatons l à 21, caractérisée en ce que le composé organique est constitué d'une chaîne essentiellement paraffinique comportant un groupement de fixation et un groupement expose.

23) Surface selon l'une des revendications il à 22, caractérisée en ce que le groupement de fixation est choisi parmi les groupements de type silane, éthoxysilane, silanol, silazane, phosphate, hydroxy, hydrazide, hydrazine, amine, amide, diazonium, pyridine, sulfate, sulfonique, carboxylique, boronique, halogène, halogénure d'acide et aldéhyde.

24) Surface selon la revendication 23, caractérisée en ce que le groupement de fixation est susceptible de réagir transversalement avec un groupe équivalent voisin pour créer des liaisons transversales.

25) Surface selon l'une des revendications 23 et 24, caractérisée en ce que le groupement de fixation est choisi parmi les silanes, dichlorosilanes, trichlorosilanes, diéthoxysilanes et triéthoxysilanes.

26) Surface selon l'une des revendications l à 25, caractérisée en ce que le groupement exposé est choisi parmi les radicaux éthyléniques, acétyléniques, ou des radicaux aromatiques, les amines primaires, secondaires ou tertiaires, les esters, les nitriles, les aldéhydes, les halogéno, les cétones.

27) Surface selon la revendication 26, caractérisée en ce que le groupement exposé est un radical éthylénique.

28) Surface selon l'une des revendications l à 27, caractérisée en ce que la ou les chaînes reliant le groupement exposé et le groupement de fixation sont des chaînes comportant au moins l atome de carbone, de préférence de 3 à 30 atomes de carbone.

29) Surface selon l'une des revendications l à 28, caractérisée en ce que le support est constitué par du verre, de la silice, un polymère ou de l'or.

30) Surface selon l'une des revendications 1 à 29, caractérisée en ce que le support est sous forme de plaque ou de fibre, ou sous forme de particules.

31) Surface selon la revendication 30, caractérisée en ce que lesdites particules sont magnétiques, fluorescentes ou colorées.

32) Surface selon l'une des revendications 1 à 31, caractérisée en ce que le support ne présente que peu ou pas de fluorescence.

33) Surface selon l'une des revendications 1 à 31, caractérisée en ce que la molécule à activité biologique est choisie parmi - les protéines, - les acides nucléiques, - les lipides, - les polysaccharides et leurs dérivés.

34) Surface selon l'une des revendications 1 à 33, caractérisée en ce que la molécule à activité biologique est un composé chimique présentant une activité biologique.

35) Surface selon l'une des revendications 1 à 34, caractérisée en ce que la molécule à activité biologique est choisie parmi: - les protéines, - l'ADN, - l'ARN et leurs dérivés.

36) Surface selon la revendication 35, caractérisée en ce que la molécule à activité biologique est choisie parmi - les anticorps, - les antigènes, - les ADN et ARN; - les ligands ou leurs récepteurs ainsi que leurs dérivés.

37) Surface selon l'une des revendications 35 et 36, caractérisée en ce que le groupement exposé est traité pour être transformé en groupement -CHO, -CoeH, NH2 ou OH ou leurs dérivés réactifs avant la fixation de la molécule à activité biologique.

38) Procédé de préparation d'une surface hautement spécifique pour réactions biologiques selon l'une des revendications 1 à 37, caractérisé en ce que - on fixe sur un support solide une couche sensiblement

monomoléculaire et compacte d'un composé organique de structure

allongée ayant au moins:

un groupement de fixation présentant une affinité pour le

support, et

un groupement exposé n'ayant pas ou peu d'affinité pour ledit

support et le groupement de fixation dans les conditions de

fixation, mais présentant éventuellement, après une

modification chimique suivant la fixation, une affinité pour

un type de molécule à activité biologique.

39) Surface revetue d'une molécule à activité biologique, caractérisée en ce qu'elle comporte une surface hautement spécifique pour réactions biologiques selon l'une des revendications 1 à 38 sur laquelle est fixée ladite molécule à activité biologique par le groupement exposé.

40) Surface selon la revendication 39, caractérisée en ce que la molécule à activité biologique est choisie parmi - les protéines, - les acides nucléiques, - les lipides, - les polysaccharides et leurs dérivés.

41) Surface selon la revendication 39, caractérisée en ce que la molécule biologique est un composé chimique présentant une activité biologique.

42) Surface selon la revendication 40, caractérisée en ce que la molécule à activité biologique est choisie parmi - les protéines, - l'ADN, - l'ARN et leurs dérivés.

43) Surface selon la revendication 40, caractérisée en ce que la molécule à activité biologique est choisie parmi - les anticorps, - les antigènes, - les ADN et ARN; - les ligands ou leurs récepteurs ainsi que leurs dérivés.

44) Surface selon la revendication 40, caractérisée en ce que l'ADN fixé comporte la séquence complémentaire d'une séquence d'ADN à isoler d'un échantillon.

45) Surface selon la revendication 40, caractérisée en ce que la protéine fixée est capable de reconnaitre et fixer spécifiquement une protéine à isoler d'un échantillon.

46) Surface selon l'une des revendications 40 et 41, caractérisée en ce que ladite molécule à activité biologique est choisie parmi la biotine, l'avidine, la streptavidine ou leurs dérivés.

47) Procédé d'identification de la présence d'un ADN ou d'un

ARN mettant en oeuvre une surface selon l'une des revendications 1 à 46.

48) Procédé d'identification de la présence d'une protéine ou d'un anticorps mettant en oeuvre une surface selon l'une des revendications 1 à 46.

49) Procédé de mise en évidence et/ou de dosage d'une molécule à activité biologique dans un échantillon, caractérisé en ce qu'on utilise une surface selon l'une des revendications 39 à 46 sur laquelle se trouve fixée une molécule à activité biologique capable de reconnaître la molécule de l'échantillon, et en ce que la mise en évidence ou le dosage sont effectués grâce à un réactif fluorescent ou non détectant la présence de la molécule fixée.

50) Procédé selon la revendication 49, caractérisée en ce que la surface est à faible fluorescence et en ce que le réactif est fluorescent.

51) Procédé selon la revendication 49, caractérisée en ce que le réactif est constitué par des billes.

52) Procédé selon l'une des revendications 49 à S1, caractérisé en ce que la détection est faite par microscopie.

53) Procédé selon l'une des revendications 49 à 52, caractérisé en ce qu'on soumet le produit de réaction entre la molécule à activité biologique et la molécule de l'échantillon à une contrainte afin de détruire les mauvais appariements avant la détection.

54) Procédé de mise en évidence d'une séquence d'ADN ou d'une protéine dans un échantillon, caractérisé en ce que - on utilise une surface hautement spécifique selon l'une des

revendications 1 à 46: - on met l'échantillon en contact avec la surface dans des conditions de

formation de l'hybride ADN/ADN, ADN/ARN ou protéine/protéine.

des molécules ainsi orientées.

pour orienter les molécules et on effectue la mesure ou l'observation

- l'hybride étant marqué, on l'étire par tout moyen physico-chimique

55) Procédé selon l'une des revendications 53 et 54, caractérisé en ce qu'on étire l'hybride ou produit de réaction par passage d'un ménisque dans le sens de l'étirement.

56) Procédé selon la revendication 53, caractérisé en ce que le ménisque est un ménisque air/eau.

57) Procédé selon l'une des revendications 53 et 54, caractérisé en ce que l'étirement est effectué par un champ électrique agissant sur les molécules ou un champ magnétique agissant sur une particule magnétisable ou magnétique.

58) Procédé selon l'une des revendications 53 et 54, caractérisé en ce que l'étirement est effectué par voie mécanique.

59) Procédé selon l'une des revendications 53 à 58, caractérisé en ce que l'ADN fixé et l'ADN de l'échantillon sont "colorés" de façon différente et en ce que, après étirement, on mesure la position de la séquence complémentaire par rapport à l'extrémité de l'ADN de l'échantillon.

60) Procédé selon la revendication 59 destiné à la cartographie des gènes.

61) Procédé selon l'une des revendications 49 à 60, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une méthode ELISA ou RIA.

62) Procédé selon l'une des revendications 49 à 60, caractérisé en ce que l'échantillon est le produit d'une amplification d'acide nucléique.

63) Procédé de fixation d'un acide nucléique ou d'une protéine sur une surface présentant des doubles liaisons dans lequel on réalise la fixation dans une zone de pH de fixation.

64) Procédé de fixation de l'ADN sur une surface présentent des groupements à double liaison éthylénique, caractérisé en ce qu'on met l'ADN en présence de la surface à un pH inférieur à 8.

65) Procédé de fixation selon la revendication 63, caractérisé en ce que la réaction est conduite à un pH compris entre 5 et 6 puis est stoppée à pH 8.

66) Trousse de diagnostic, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une surface hautement spécifique selon l'une des revendications 1 à46.

67) Trousse de diagnostic selon la revendication 66, caractérisée en ce qu'elle comporte, en outre, un réactif fluorescent ou un réactif comportant des billes.