ES2206494T3 - Procedimiento de alineacion de macromoleculas mediante el paso de un menisco y aplicaciones. - Google Patents

Procedimiento de alineacion de macromoleculas mediante el paso de un menisco y aplicaciones.

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ES2206494T3 ES95909818T ES95909818T ES2206494T3 ES 2206494 T3 ES2206494 T3 ES 2206494T3 ES 95909818 T ES95909818 T ES 95909818T ES 95909818 T ES95909818 T ES 95909818T ES 2206494 T3 ES2206494 T3 ES 2206494T3
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Aaron Bensimon
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Pasteur de Lille
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Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO DE ALINEAMIENTO DE MACROMOLECULA(S) SOBRE LA SUPERFICIE (S) DE UN SOPORTE, CARACTERIZADO POR QUE SE HACE DESPLAZARSE SOBRE DICHA SUPERFICIE (S) LA LINEA TRIPLE S/A/B (MENISCO) QUE RESULTA DEL CONTACTO DE UN SOLVENTE (A) CON LA SUPERFICIE (S) Y UN MEDIO (B), TENIENDO DICHAS MACROMOLECULAS UNA PARTE, PARTICULARMENTE UN EXTREMO, ANCLADO SOBRE LA SUPERFICIE (S), ESTANDO LA OTRA PARTE, PARTICULARMENTE EL OTRO EXTREMO, EN SOLUCION EN EL SOLVENTE (A). LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A UN PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACION, DE MEDICION DE DISTANCIA INTRAMOLECULAR, DE SEPARACION Y/O DE DOSIFICACION DE UNA MACROMOLECULA EN UNA MUESTRA EN LA QUE SE PONE EN PRACTICA UN PROCEDIMIENTO DE ALINEAMIENTO SEGUN LA INVENCION.

Description

Procedimiento de alineación de macromoléculas mediante el paso de un menisco y aplicaciones.
La presente invención se refiere a un método de alineación de macromoléculas tales como polímeros o macromoléculas de actividad biológica, principalmente ADN, o unas proteínas. La presente invención se refiere igualmente a la aplicación de dicho método en unos procedimientos de puesta de manifiesto, de medición de la distancia intramolecular, de separación y/o de dosificación de una macromolécula en una muestra.
El control de la conformación de macromoléculas representa una apuesta industrial importante, por ejemplo en la fabricación de capturadores o de ensamblajes moleculares controlados o incluso en los problemas de detección y de análisis. Puede resultar interesante presentar una conformación molecular alargada. A título de ejemplo, en el caso en que los polímeros se implantan sobre un sustrato, se ha propuesto extenderlos mediante la acción de un campo eléctrico, de un derrame o con la ayuda de unas pinzas ópticas. En particular, en biología, la alineación del ADN -por electroforesis (Zimmerman y Cox Nucl. Acid. Res. 22, p 492, 1994), derrame libre (Parra y Windle, Nature Genetics, 5, p 17, 1993 y el documento WO 93/22463) o en un gel (Schwartz et al. Science 262, p 110, 1993 y el documento USP 33531) o con la ayuda de unas pinzas ópticas (Perkins et al, Science 264, p 819, 1994 y asimismo en el documento USP 5079169)- abre numerosas posibilidades en la cartografía, o en la detección de patógenos.
Tales métodos únicamente permiten en general una alineación imperfecta, o incluso transitoria - es decir que se presenta una relajación de la molécula, una vez ha desaparecido la tensión. En el caso de las pinzas ópticas, el método es pesado, limitado a una sola molécula a la vez, y delicado de poner en funcionamiento por unas personas no cualificadas.
Se ha propuesto (I. Parra y B. Windle y el documento WO 93/22463) una técnica particular de alineación del ADN por derrame después de la lisis de la célula, tras el secado. La alineación obtenida es muy imperfecta y no homogénea y se observan numerosos pilones no alineados.
La presente invención se refiere a un método original y simple para alinear unas macromoléculas sobre la superficie S de un soporte, caracterizado porque se hace desplazar sobre dicha superficie S la línea triple S/A/B (menisco) resultante de un contacto de un solvente A con la superficie S y un medio B, presentando dichas moléculas una parte, principalmente un extremo, anclada sobre la superficie S, estando la otra parte, principalmente el otro extremo, en solución en el solvente A.
Se observa según la presente invención, que el simple paso de un menisco sobre unas moléculas en las que una parte está anclada sobre un sustrato, estando el resto de la molécula libremente en solución, permite alinearlas uniformemente perpendicularmente al menisco en movimiento, dejándolas adsorbidas sobre la superficie de detrás del menisco. Dicho fenómeno se denomina en la presente memoria "cardadura molecular".
Más precisamente, el estirado de la parte libre de la molécula se realiza mediante el paso de la línea triple S/A/ B, constituyendo el menisco entre la superficie S, el solvente A y un medio B que puede ser un gas (en general el aire) u otro solvente.
En una forma de realización particular, el menisco es un menisco agua-aire, es decir que el solvente A es una solución acuosa y el medio B es aire.
Además, es posible extender el menisco aire/agua aquí utilizado con el fin de estirar la molécula a otros sistemas tales como aceite/agua o agua/surfactante/aire, principalmente.
El desplazamiento del menisco puede llevarse a cabo mediante cualquier medio de desplazamiento relativo de los fluidos A y B en relación con la superficie S. En una forma de realización, la superficie S se puede retirar del solvente A o inversamente, el solvente A se puede retirar de la superficie S.
En particular, el menisco se puede desplazar con la ayuda de un medio mecánico, neumático, principalmente aspirando o insuflando un gas, o hidráulico principalmente empujando o aspirando el solvente A o el medio B.
De este modo, el desplazamiento del menisco puede llevarse a cabo por evaporación progresiva del solvente A.
Cuando el desplazamiento del menisco se realiza por vía mecánica, se puede realizar o bien por translación de la interfase A/B, o bien por translación de la superficie S.
En una forma de realización particular, el solvente se coloca entre dos soportes en los que por lo menos uno corresponde a dicho soporte de la superficie S y el menisco se desplaza por ejemplo por evaporación.
Se entiende en la presente memoria por "soporte", cualquier sustrato cuya cohesión sea suficiente para resistir el peso del menisco.
El soporte puede estar constituido por lo menos en la superficie, por un polímero orgánico o inorgánico, un metal principalmente oro, un óxido o sulfuro de metal, un elemento semiconductor o un óxido de un elemento semiconductor, tal como un óxido de silicio o una combinación de los mismos, tal como vidrio o cerámica.
Se menciona más particularmente el vidrio, el silicio oxidado en la superficie, el grafito, la mica y el sulfuro de molibdeno.
Como "soporte", se puede utilizar un soporte único tal como una lámina, unas bolas, principalmente de polímero, pero también cualquier forma, tales como una barra, una fibra o un soporte estructurado, y asimismo unas partículas, ya se traten de polvos, principalmente de polvos de sílice, que pueden por otra parte convertirse en magnéticas fluorescentes o coloreados como se ha conocido en las diferentes tecnologías de dosificación.
El soporte se presenta ventajosamente en forma de placas. Preferentemente, el soporte muestra poco o no muestra fluorescencia en absoluto.
Unas macromoléculas, tales como cualesquiera polímeros, o polímeros biológicos tales como ADN, ARN o proteínas, pueden estar ancladas mediante cualesquiera métodos sobre el soporte.
La macromolécula a alinear se puede seleccionar de entre las macromoléculas biológicas tales como las proteínas, principalmente los anticuerpos, antígenos, ligandos o sus receptores, los ácidos nucleicos, ADN, ARN o PNA, los lípidos, los polisacáridos y sus derivados.
Se ha observado según la presente invención, que la fuerza de estirado actúa localmente en el vecindario inmediato del menisco. Es independiente de la longitud de la molécula, del número de moléculas ancladas, y en una gran gama, de la velocidad del menisco. Dichas características son particularmente interesantes para alinear las moléculas de forma homogénea y reproducible.
Es posible, según la presente invención, añadir unos elementos tensioactivos en el solvente A y/o el medio B, que modifican las propiedades de las interfases. Según la presente invención, el estirado se puede en efecto controlar mediante la adición de tensioactivos, o mediante el tratamiento adecuado de la superficie.
Una atracción muy grande superficie-macromolécula (por ejemplo un nivel muy elevado de adsorción) puede molestar la alineación de las moléculas por el menisco, quedando las mismas adsorbidas en la superficie en un estado no necesariamente estirado. Preferentemente, la superficie presenta una débil tasa de adsorción de dicha macromolécula, de manera que solo las moléculas ancladas se alinearan, las otras se arrastraran por le menisco.
Sin embargo, se puede actuar sobre las diferencias de adsorción entre una parte de la macromolécula principalmente sus extremos y sus otras partes (en particular para unas moléculas largas, tales como el ADN o el colágeno) para anclar por adsorción las moléculas por una parte, principalmente su(s) extremo(s) únicamente, encontrándose el resto de la molécula libremente en solución, sobre una muy gran variedad de superficies y los alinea mediante el paso del menisco tal como se ha descrito anteriormente.
La adsorción de una macromolécula sobre una superficie se puede controlar holgadamente con la ayuda del pH o del contenido del medio iónico del medio o de una tensión eléctrica aplicada sobre la superficie. Se cambian de este modo las cargas superficiales y las interacciones electrostáticas (repulsivas o atractivas) entre la superficie y la molécula, lo cual permite pasar de un estado de adsorción completo de la molécula sobre la superficie a una ausencia total de adsorción. En estos dos casos extremos, existe una serie de parámetros de control o la adsorción se realiza preferentemente por el extremo de las moléculas y que se utilizará por lo tanto, ventajosamente, para anclarlos en la superficie, y posteriormente alinearlos mediante el paso del menisco.
Las moléculas, una vez alineadas, se adhieren fuertemente a la superficie. En el caso del ADN, se han podido observar por fluorescencia, muchos meses después de la alineación.
La presente invención es por lo tanto muy diferente del método propuesto por Parra y Windle, porque según la presente invención, sus moléculas se anclan en la superficie y después son uniformemente alineados mediante el paso del menisco, mientras que en el método de Parra y Windle se utiliza un derrame hidrodinámico para estirar de forma no homogénea las moléculas que van a adsorberse inespecíficamente en la superficie.
Otras técnicas pueden asimismo conducir al estirado y la alineación de moléculas. Así, se puede obtener una orientación dinámica de las moléculas en solución ancladas en un extremo, mediante electroforesis o mediante un derrame hidráulico. Sin embargo, los resultados observados muestran que estas técnicas son mucho menos rentables que la utilización del menisco.
Por "anclaje" de la macromolécula sobre la superficie se debe entender una fijación resultante de una reactividad química tanto por unión covalente como por unión no covalente, tal como una unión resultante de interacciones físico-químicas, tales como la adsorción tal como se ha descrito anteriormente.
Dicho anclaje de la macromolécula se puede realizar directamente sobre (o con) la superficie, o indirectamente, es decir mediante el intercambio de una unión así como otra molécula, principalmente otra molécula de actividad biológica. Cuando el anclaje se lleva a cabo de forma directa, la macromolécula se puede anclar químicamente sobre dicha unión, o interacciona de forma físico-química sobre dicha unión, en particular cuando dicha unión intermedia es una molécula con una actividad biológica que reconoce e interacciona con dicha macromolécula.
En una forma de realización, la macromolécula y dicha unión son ambas unas moléculas con actividad biológica que interaccionan, tales como antígeno y anticuerpo respectivamente, ácidos nucleicos complementarios o lípidos. En tales casos, la fijación no covalente de la macromolécula consiste en una unión de tipo antígeno-anticuerpo, ligando receptor, hibridación entre fragmentos de ácidos nucleicos complementarios o interacción hidrófoba o hidrófila entre lípidos.
Se aprovecha asimismo la muy alta especificidad y la muy alta selectividad de determinadas reacciones biológicas, principalmente las reacciones antígenos/anticuerpos, las reacciones de hibridación del ADN o del ARN, las reacciones interproteínas o del tipo avidina/estreptavidina/biotina, así como las reacciones de los ligandos y de sus receptores.
De este modo, para llevar a cabo el anclaje directo o indirecto de la macromolécula sobre la superficie S se puede utilizar una superficie sólida que presentan determinadas especificidades. Resulta en particular posible utilizar determinadas superficies pretratadas que permiten fijar determinadas proteínas o del ADN, haya sido o no modificado.
Tales superficies están disponibles comercialmente (Covalink, Costar, Estapor, Bangs, Dynal por ejemplo) bajo diferentes formas que presentan en su superficie unos grupos COOH, NH_{2}u OH, por ejemplo.
Se puede por lo tanto funcionalizar el ADN con un grupo reactivo, amina por ejemplo, y proceder a una reacción con dichas superficies. Dichos métodos necesitan sin embargo una funcionalización particular del ADN a fijar.
Se ha descrito asimismo una técnica que permite el anclaje sin tratamiento previo del ADN. Dicho procedimiento consiste en hacer reaccionar un fosfato libre del extremo 5' de la molécula de ADN con una amina secundaria de la superficie (superficie NH Covalink).
El anclaje por adsorción se puede llevar a cabo por adsorción del extremo de la molécula controlando la carga de la superficie con la ayuda del pH, del contenido iónico del medio o de la aplicación de una tensión eléctrica sobre la superficie teniendo en cuenta las diferencias de adsorción entre los extremos de la molécula y su parte intermedia. Según la presente invención, se ha anclado asimismo a título de ejemplo unas moléculas de ADN no funcionalizadas sobre unas superficies recubiertas de moléculas terminadas en un grupo vinilo o amina tales como vidrio, recubiertas de moléculas de tipo silano terminadas en unos grupos vinilo o amina o incluso unas láminas de vidrio limpiadas anteriormente en un baño ácido. En el último caso, la superficie de vidrio presenta en efecto unos grupos SiOH.
En todos estos casos, la franja de pH en la que ADN se ancla, se selecciona por encontrarse entre un estado de adsorción completo y una ausencia de adsorción, dicha última se sitúa a un pH más básico. Se entiende que dicha técnica es muy general y se puede entender por la persona experta en la técnica de muy diversos tipos de superficies.
Se puede asimismo funcionalizar el ADN con un primer grupo reactivo o una proteína P_{0} para hacerla reaccionar con una superficie recubierta de un segundo grupo reactivo o de una proteína P_{1}, susceptibles de reaccionar específicamente entre ellos (o ellas) respectivamente, es decir por ejemplo, P_{1} con P_{0}. El par P_{0}/P_{1} puede ser un par de tipo biotina/estreptavidina (Zimmermann y Cox) o Digoxigenina/Anticuerpo dirigido contra la Digoxigenina (anti-DIG), por ejemplo (Smith et al, Science 258, 1122(1992)).
Preferentemente, las superficies de anclaje presentarán una baja tasa de fluorescencia para no interferir en la detección de las moléculas después de su alineación, en particular si se hace mediante fluorescencia.
Según la presente invención, se utilizará preferentemente un soporte sólido que presenta en las condiciones de reacción una superficie que presenta una afinidad por una parte de la macromolécula únicamente, el resto se queda libre en solución.
En una forma de realización, se utiliza un soporte sólido que presenta en la superficie por lo menos una capa de un compuesto orgánico que presenta, en el exterior de la capa, un grupo expuesto que presenta una afinidad por un tipo de molécula con actividad biológica que puede ser dicha molécula por sí misma o una molécula que la reconoce y/o interacciona con ella.
El soporte puede presentar por lo tanto una superficie recubierta con un grupo reactivo o una molécula con actividad biológica.
Por "afinidad", se debe entender en la presente memoria una reactividad química así como una absorción de un tipo cualquiera, todo ello en las condiciones eventuales de fijación de las moléculas sobre el grupo expuesto modificado o no.
En una forma de realización, la superficie es esencialmente compacta, es decir que limita el acceso de la macromolécula con actividad biológica a las capas inferiores y/o al soporte, todo ello con el fin de minimizar las interacciones no específicas.
Se pueden asimismo utilizar unas superficies recubiertas de un grupo expuesto reactivo (por ejemplo NH_{2}, COOH, OH, CHO) o de una macromolécula con actividad biológica (por ejemplo: de las proteínas tales como la estreptavidina o anticuerpos, ácidos nucleicos tales como oligonucleótidos, lípidos de polisacáridos y sus derivados) capaces de fijar una parte eventualmente modificada de la molécula.
De este modo, unas superficies recubiertas de estreptavidina o de un anticuerpo siguiendo unos procedimientos conocidos ("Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking", S.C.Wong, CRC Press (1991)) son capaces de fijar una macromolécula que presenta en un lugar particular una biotina o un antígeno.
Asimismo, unas superficies tratadas de forma que presentan unos oligonucleótidos de hebra simple pueden servir para anclar en ellos unos ADN/ARN que presentan una secuencia complementaria.
De entre las superficies que presentan un grupo reactivo expuesto, se mencionan aquéllas sobre las que el grupo expuesto es un grupo COOH,-CHO, NH_{2},-OH o un grupo vinilo que presenta un doble enlace -CH=CH utilizado tal cual o que se puede activar para proporcionar los grupos -CHO, -COOH, -NH_{2} o OH.
Los soportes en las superficies altamente específicas según la presente invención se pueden obtener mediante la utilización de diversos procedimientos. Se pueden mencionar, a título de ejemplo:
(A)
una capa de polímero carbonado eventualmente ramificado, de por lo menos 1 nm de grosor que presenta unos grupos reactivos tal como se han definido anteriormente y,
(B)
unas superficies obtenidas por depósito o anclaje sobre un soporte sólido de una o diversas capas moleculares, pudiéndose obtener dichas capas mediante la formación de capas sucesivas fijadas por enlaces no covalentes, a título de ejemplo no limitativo, las películas de Langmuir-Blodgett, o mediante auto-ensamblaje molecular, permitiendo la formación de una capa fijada por enlace covalente.
En el primer caso, la superficie se puede obtener mediante polimerización de por lo menos un monómero generando en la superficie del polímero dicho grupo expuesto, o bien mediante la despolimerización parcial de la superficie de un polímero para generar dicho grupo expuesto, o incluso por deposición del polímero.
En este procedimiento, el polímero formado presenta unos enlaces vinilo tal como un derivado poliénico, principalmente unas superficies de tipo caucho sintético, tal como polibutadieno, poliisopreno o caucho natural.
En el segundo caso, la superficie altamente específica presenta:
-
sobre un soporte, una capa sensiblemente monomolecular de un compuesto orgánico de estructura lineal que presenta por lo menos:
-
un grupo de fijación que presenta una afinidad por el soporte, y
-
un grupo expuesto que no presenta o presenta poca afinidad por dicho soporte y dicho grupo de fijación en las condiciones de fijación, pero que presenta eventualmente , después de una modificación química después de la fijación, una afinidad por un tipo de molécula biológica.
La fijación puede ser al principio de tipo no covalente, principalmente de tipo hidrófilo/hidrófilo y hidrófobo/hidrófobo, como en las películas de Langmuir- Blodgett (K.B. Blodgett, J. Am. Chem. Soc. 57, 1007 (1935)).
En este caso, el grupo expuesto o el grupo de fijación serán, o bien hidrófilos, o bien hidrófobos, principalmente unos grupos alquilo o halogenoalquilos tales como CH_{3}, CF_{3}, CHF_{3}, CH_{2}F, siendo el otro grupo hidrófilo.
La fijación puede ser asimismo de tipo covalente, en cuyo caso el grupo de fijación se hace reaccionar químicamente sobre el soporte.
Se han mencionado con anterioridad en el campo electrónico determinadas superficies de estructura similar, principalmente cuando las fijaciones son covalentes, L. Netzer y J. Sagiv, J. Am. Chem. Soc., 105, 674 (1983) y el documento US-A-4 539 061.
De entre los grupos de fijación, se deben citar más particularmente los grupos de tipo alcóxido de metal o de semiconductor, por ejemplo silano, principalmente clorosilano, silanol, metoxi y etoxisilano, silazano, así como los grupos fosfato, hidroxi, hidracida, hidracina, amina, amida, diazoniom, piridina, sulfato, sulfónico, carboxílico, borónico, halógeno, halogenuro de ácido, aldehído.
Más particularmente, como grupo de fijación será preferible utilizar unos grupos susceptibles de reaccionar transversalmente con un grupo equivalente, vecino, para proporcionar los enlaces transversales, por ejemplo se tratará de derivados de tipo alcóxido de metal o de semiconductor, por ejemplo silano, principalmente diclorosilano, triclorosilano, dimetoxisilano o dietoxisilano y trimetoxi o trietoxisilano.
La selección del grupo de fijación dependerá evidentemente de la naturaleza del soporte; los grupos de tipo silano se adaptan bien para la fijación covalente sobre el vidrio y el sílice.
Por lo que se refiere a los grupos expuestos, y sea cual sea su superficie, se seleccionaran preferentemente de entre los grupos etilénicos, acetilénicos o de los radicales aromáticos, las aminas primarias, terciarias o secundarias, los ésteres, los nitrilos, los aldehídos, los halógenos. Pero se podrá tratar más particularmente del grupo vinilo; en efecto, dicho grupo puede o bien modificarse químicamente después de la fijación para conducir, por ejemplo, a un grupo carboxílico o unos derivados de grupos carboxílicos tales como unos grupos alcoholes, aldehídos, cetonas, ácidos, aminas primarias, secundarias o terciarias, o bien conducir a un anclaje directo pH dependiente de las macromoléculas biológicas tales como los ácidos nucleicos y proteínas sin modificación química de la superficie o de las macromoléculas.
Preferentemente, las cadenas que unen el grupo expuesto en el grupo de fijación son unas cadenas que presentan por lo menos 1 átomo de carbono, preferentemente más de 6 y en general de 3 a 30 átomos de carbono.
Por lo que se refiere al propio soporte, es preferible utilizar de forma general, vidrio, sílice oxidado en superficie, un polímero u oro con o sin un pretratamiento de la superficie.
Se puede utilizar ventajosamente, en el caso del vidrio o del sílice, las técnicas conocidas de funcionalización de la superficie utilizando unos derivados silano, por ejemplo: Si-OH + Cl_{3} - Si-R-CH=CH_{2} proporciona Si-O - Si-R-CH=CH_{2} R consiste por ejemplo en (CH_{2})_{4}. Una reacción tal es conocida en la literatura, con la utilización de solventes ultra puros. La reacción conduce a una serie de moléculas que presentan su extremo C=C en la superficie expuesta en el exterior.
En el caso del oro, este se encuentra eventualmente en forma de una capa delgada sobre un sustrato, las técnicas conocidas de funcionalización de la superficie utilizan unos derivados tioles, por ejemplo: Au + HS-R-CH=CH_{2} proporciona Au-S-R-CH=CH_{2}, R consistente por ejemplo en (CH_{2})_{4}. Una reacción tal se describe en un medio líquido y conduce, así como en la reacción anterior triclorosilano-sílice, a un tapiz de moléculas que presentan su extremo C=C en la superficie expuesta al exterior.
Evidentemente, el término "soporte" incluye tanto una superficie tal como una lámina, pero asimismo unas partículas ya sean de polvo de sílice o de bolas de polímero, y también unas formas cualquiera tales como una barra, fibra o soporte estructurado, que pueden además convertirse en magnéticas, fluorescentes o coloreadas, como es conocido en las diferentes tecnologías de dosificación.
Preferentemente, el soporte se seleccionará por no ser o ser poco fluorescente cuando la detección se lleva a cabo mediante fluorescencia.
Las superficies obtenidas según las formas (A) o (B) anteriores presentan:
(i)
una muy débil tasa de fluorescencia intrínseca, cuando esta es necesaria, un ruido de fondo de fluorescencia (de un aspecto típico de 100 x 100 \mum) más débil que la señal de fluorescencia de una sola molécula a detectar;
(ii)
la posibilidad de detectar unas moléculas aisladas con una proporción S/N independiente del número de moléculas, que es posible gracias a diferentes técnicas que presentan una gran proporción S/N descritas más adelante y basadas en la identificación de la presencia de un marcador macroscópico que presenta una débil interacción no específica con la superficie.
Las superficies obtenidas de este modo son, preferentemente, revestidas de una macromolécula con una actividad biológica seleccionadas de entre:
- las proteínas,
- los ácidos nucleicos,
- los lípidos,
- los polisacáridos y sus derivados,
De entre las proteínas, hay que citar los antígenos y los anticuerpos, los ligandos, los receptores, pero asimismo unos productos de tipo avidina o estreptavidina así como los derivados de dichos compuestos.
De entre los ARN y los ADN, hay que citar igualmente los derivados \alpha, \beta así como los derivados tio y los compuestos mixtos tales como los PNA.
Se pueden asimismo fijar unos compuestos mixtos tales como los glicopéptidos y los lipopolisacáridos por ejemplo, o bien otros elementos tales como los virus, células principalmente, o compuestos químicos tales como la biotina.
La fijación de las macromoléculas biológicas puede ser covalente o no covalente, por ejemplo por adsorción, enlaces hidrógeno, interacciones hidrófobas, iónicos, por ejemplo en cualquier caso se podrá proceder ventajosamente a un entrecruzamiento ("cross-linking") entre las moléculas implantadas mediante los métodos conocidos ("Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking", S.C.Wong, CRC Press (1991)) y esto con el fin de reforzar la cohesión.
Tal como se ha mencionado anteriormente, es posible presentar un grupo expuesto que permite la reacción directa con las moléculas con actividad biológica, pero es asimismo posible prever que el grupo expuesto sea tratado, después de la fijación, para ser transformado, tal como se ha indicado anteriormente, en un radical hidroxi, amina, alcohol, aldehído, cetona, COOH o derivado de dichos grupos antes de la fijación de la molécula biológica.
Cuando tales grupos se han expuesto, siendo las técnicas de fijación de las proteínas y/o del ADN por ejemplo conocidas, se trata en efecto de reacciones utilizadas para las superficies que ya se han utilizado en el marco de los análisis biológicos, principalmente para las superficies Costar y las superficies Nunc o de la microbolas tales como Estapor, Bang y Dynal por ejemplo, sobre las que se anclan unas moléculas de interés biológico, ADN, ARN, PNA, proteínas o anticuerpos por ejemplo.
En el caso en que el grupo expuesto es un radical -CH=CH_{2} que se denomina en lo sucesivo "superficie C=C" o "superficie de unión etilénica", no existe ningún documento que menciona el anclaje directo, en particular en ADN o de las proteínas.
En el marco de la presente invención, se ha demostrado que dichas superficies presentan una reactividad fuertemente pH dependiente. Dicha particularidad permite anclar los ácidos nucleicos o las proteínas utilizando unas zonas de pH y muy frecuentemente a una velocidad de reacción que se puede controlar mediante el pH.
Se puede llevar a cabo un anclaje del ADN por su extremo sobre una superficie que presenta unos grupos de doble enlace etilénica colocando el ADN en presencia de la superficie a un pH inferior a 8.
En particular, la reacción se lleva a cabo a un pH comprendido entre 5 y 6 y posteriormente se detiene a un pH 8.
De este modo, para el ADN a un pH 5,5, la reacción de anclaje es total en una hora (si no se limita por la difusión) y se produce por los extremos. A un pH 8, por el contrario, el anclaje es muy débil (velocidad de la reacción de 5 a 6 ordenes de magnitud más débiles). Dicho efecto de anclaje pH dependiente y específico de los extremos, presenta una mejora en relación con otras superficies que necesitan una funcionalización del ADN (biotina, DIG, NHS, ...) o de unos reactivos específicos (carbodiimida, dimetil pimelidato) que realizan un enlace peptídico o fosforimido entre NH_{2} y -COOH o -POOH.
Se puede asimismo llevar a cabo el anclaje de ADN por adsorción de sus extremos únicamente sobre una superficie recubierta de polilisina o de un grupo silano terminado en un grupo amino.
Para realizar el anclaje del ADN mediante su extremo sobre una superficie recubierta por un grupo amino, se coloca el ADN en presencia de la superficie a un pH entre 8 y 10.
Asimismo se puede llevar a cabo el anclaje del ADN por su extremo sobre una superficie de vidrio tratada previamente en un baño de ácido, colocando el ADN en presencia de dicha superficie a un pH entre 5 y 8.
Se debe asimismo entender que la presente invención se refiere, con el mismo espíritu, al anclaje eventualmente pH dependiente de todas las macromoléculas de interés biológico.
Asimismo dichas superficies se pueden anclar en las proteínas directamente (proteína A, anti-DIG, anticuerpos, estreptavidina, etc.). Se ha observado que (i) la actividad de la molécula se puede preservar y (ii) que la reactividad de la superficie preparada (inicialmente C=C) se oculta totalmente para dar paso solamente a la reactividad de la molécula de interés. Es, por tanto, posible a partir de una reactividad inicial relativamente elevada, pasar a una superficie que presenta una reactividad muy altamente específica, por ejemplo de los sitios específicos sobre una proteína.
Anclando un anticuerpo específico sobre la superficie (por ejemplo anti-DIG), se crea una superficie cuya reactividad se limita al antígeno (por ejemplo el grupo DIG). Esto indica que los grupos químicos iniciales se han ocultado todos mediante los anticuerpos implantados.
Se puede asimismo implantar sobre las superficies reactivas (químicamente o bioquímicamente) de otras moléculas con actividad biológica, principalmente de los virus y de otros componentes: membranas, receptores de membrana, polisacáridos, PNA, principalmente.
Es asimismo posible fijar el producto de una reacción de interés biológico (por ejemplo la PCR) sobre las superficies preparadas.
El procedimiento según la presente invención permite la puesta de manifiesto y/o la cuantificación de moléculas biológicas, pero asimismo la medición de distancia intramolecular, la separación de determinadas moléculas biológicas, principalmente una extracción por la utilización de las técnicas de acoplamiento antígeno/anticuerpo y/o ADN/ARN.
En particular, la presente invención tiene por objeto un procedimiento de puesta de manifiesto de una macromolécula consistente en una secuencia de ADN o de una proteína en una muestra, según la presente invención, caracterizado porque:
-
se coloca una muestra correspondiente al solvente A, en el que dicha macromolécula se encuentra en solución, en contacto con la superficie del soporte en unas condiciones de formación de un híbrido ADN/ADN, ADN/ARN o de formación de un producto de reacción proteína/proteína,
-
el híbrido o una macromolécula de marcaje del híbrido o del producto de la reacción se ancla en una parte, encontrándose el resto libre en solución, se estira por desplazamiento del menisco creado mediante el contacto del solvente con la superficie para orientar los híbridos o dichas macromoléculas de marcaje y se realiza la medición o la observación de híbridos o dichas macromoléculas de marcaje orientadas de este modo.
Ventajosamente, el ADN fijado y el ADN de la muestra se colorean de forma diferente y después del estirado se mide la posición de la secuencia complementaria en relación con el extremo del ADN de la muestra.
De forma adecuada se pueden utilizar los métodos de detección ELISA o FISH.
La muestra de ADN puede ser el producto o el sustrato de una amplificación enzimática del ADN tal como PCR, es decir que se puede llevar a cabo la amplificación del ADN una vez se ha anclado y alineado según el procedimiento de la invención o antes de su anclaje y su alineación.
El paso del menisco, estirando linealmente las moléculas, en forma de bastoncillos, las hace más fácilmente detectables si están marcadas. Por el contrario, dichas moléculas alargadas son estables al aire libre y se pueden observar incluso después de varios meses, sin presentar degradación aparente.
En el momento de la rehidratación, las moléculas de ADN pueden permanecer absorbidas y alargadas. Además, es posible proceder a una hibridación sobre la molécula alargada.
Además, al presentar una señal correlacionada y de orientación uniforme por su estirado, dichas moléculas son distintas del ruido del entorno. Es por lo tanto fácil ignorar los polvos, las inhomogeneidades, que no presentan una correlación espacial particular. La alineación es asimismo interesante porque en solución, las moléculas en pelota fluctúan térmicamente, lo que implica unas variaciones muy importantes de su señal de fluorescencia recogida preferentemente con una débil profundidad de campos y limita su observación. La presente invención permite, por tanto, la observación de moléculas aisladas con una muy gran relación señal sobre el ruido. (S/N).
Resulta destacable que dicha relación sea independiente del número de moléculas ancladas. La proporción S/N determinada por la detección de una molécula es la misma que para 10.000. Además, dicha técnica de estirado permite discriminar holgadamente entre unas moléculas de longitudes variables.
Se puede proceder ventajosamente a las etapas siguientes para mejorar todavía más la proporción S/N:
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La molécula está inmóvil, se puede integrar su señal de fluorescencia.
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La observación al microscopio presenta un campo reducido (típicamente 100 \mum x 100 \mum con un objetivo de inmersión x 100, N.A=1,25). Para una muestra de 1 cm^{2} se puede o bien proceder a un barrido, o bien prever la utilización de objetivos de agrandamiento menor (x 10 o x 20) pero de apertura numérica elevada.
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Los bastoncillos son siempre paralelos, se puede prever un método de filtrado espacial óptico para aumentar todavía más la proporción S/N.
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Son previsibles otros métodos de fluorescencia global, tales como los descritos en la solicitud de patente europea EP 103426.
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La alineación de las moléculas se observa tanto en el marco de un anclaje físico-químico como en el caso de los enlaces de tipo inmunológico (DIG/anti- DIG).
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Una vez la superficie está al aire libre, las moléculas de ADN son estables (permanecen íntegras, incluso después de diversas semanas) y fluorescentes. Se puede utilizar ventajosamente dicha propiedad para diferenciar la etapa del anclaje de la etapa de localización/recuento de las moléculas ancladas, si dicha detección se realiza por ejemplo, pero sin limitarse, mediante microscopia en fluorescencia. Tal utilización está cubierta por la presente invención.
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Una técnica de doble (o multi) fluorescencia puede servir eventualmente para mejorar la proporción S/N o para detectar una doble funcionalidad.
Las moléculas estiradas se pueden revelar mediante diferentes métodos enzimológicos u otros, tales como la fluorescencia o la utilización de sondas calientes o frías. Su detección se puede realizar mediante la medición de una señal global (por ejemplo la fluorescencia) o mediante la observación individual de moléculas por microscopia óptica de fluorescencia, microscopia electrónica, métodos con sondas locales (STM, AFM, etc..).
Así, de forma general, la presente invención permite la puesta de manifiesto, la separación y/o la dosificación de una molécula en una muestra, mediante un procedimiento caracterizado porque se utiliza una superficie capaz de fijar específicamente dicha molécula, y porque la puesta en evidencia, la separación o la dosificación se llevan a cabo gracias a un reactivo, fluorescente o no, que detecta la presencia de la molécula fijada.
De entre los reactivos, se distinguen los reactivos fluorescentes y los reactivos no fluorescentes.
Los reactivos fluorescentes contienen unas moléculas fluorescentes, seleccionadas ventajosamente para ser unas moléculas largas de tamaño superior a 0,1 \mum y que reaccionan de forma específica directamente o indirectamente con las superficies pretratadas. Por ejemplo, pero sin por ello limitarse a la misma, una molécula de ADN de doble hebra teñida con la ayuda de sondas fluorescentes (bromuro de etidio, YOYO, nucleótidos fluorescentes, etc...) que puede anclarse mediante uno o diversos extremos sobre una superficie que presenta eventualmente un grupo de tipo vinilo, amina u otro, principalmente mediante una elección juiciosa del pH o del contenido iónico del medio o mediante la aplicación de una tensión eléctrica sobre la superficie.
Es asimismo posible utilizar una funcionalización particular de la molécula (DIG, biotina, etc...) para anclarla en uno o diversos puntos sobre una superficie que presenta unos sitios complementarios (anti-DIG, estreptavidina).
Los reactivos no fluorescentes que permiten la detección de moléculas alineadas previamente según la presente invención, pueden consistir principalmente en unas bolas o micropartículas ancladas por el intermediario de otra molécula fijada de manera específica directamente o indirectamente en la molécula alineada y que solamente presentan una débil interacción no específica con la superficie.
Por ejemplo, se pueden citar unas bolas Dynal recubiertas de estreptavidina que permiten el anclaje sobre el ADN biotinilado, alineado según la presente invención.
Según si la molécula investigada se detecta directamente por fluorescencia o indirectamente con la ayuda de reactivos anteriores, se hablará de "detección directa" o "mediante bandera".
Con el fin de limitar los problemas asociados con los tiempos de reacción demasiado lentos, se pueden reducir ventajosamente los tiempos de difusión de los reactivos hacia la superficie utilizando unos pequeños volúmenes de reacción. Por ejemplo, pero sin limitarse a ello, conduciendo la reacción en un volumen de algunos microlitros determinado mediante la separación de dos superficies de las que una se trata para presentar unos sitios reactivos y la otra es inerte o tratada para no presentar unos sitios reactivos, en las condiciones de la reacción.
La detección del número de moléculas alineadas se puede realizar sobre un pequeño número de moléculas (típicamente 1 a 1.000), mediante un ensayo físico macroscópico débil de ruido, no necesitándose ni microscopio electrónico ni radioactividad ni necesariamente PCR.
Los procedimientos de alineación y de detección según la presente invención son susceptibles de ser utilizados por unas personas que presenten una experiencia de laboratorio reducida.
La especificidad de determinadas reacciones biológicas se puede limitar. De este modo, en el marco de la hibridación, los híbridos pueden ser imperfectos (reacciones con otros sitios) presentando un número reducido de emparejamiento y por lo tanto una calidad de enlace menor. La presente invención cubre igualmente la posible utilización de una etapa de ensayo de la calidad de los enlaces obtenidos. Dicho ensayo permite disociar los productos emparejados de forma no específica débil, por adsorción, fuerzas hidrófobas, enlaces de hidrógeno imperfectos, hibridación imperfecta, principalmente.
Por ello, la invención se refiere igualmente a un procedimiento de puesta de manifiesto o de dosificación tal como se ha descrito anteriormente, en cuyo procedimiento se somete el producto de reacción entre la molécula con actividad biológica y la molécula de la muestra a una tensión con el fin de destruir los malos emparejamientos antes de la detección.
Este procedimiento ofrece, además la posibilidad de destruir los pares no apareados y la posibilidad de orientar los productos del acoplamiento, lo cual facilita las mediciones o las observaciones.
Se puede aplicar de este modo a las superficies, después de la fijación de los elementos complementarios, una tensión que puede estar constituido a través de la utilización simple o combinada de:
-
centrifugación,
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gradiente de campo magnético aplicado a los reactivos no fluorescentes tomados por lo tanto para incluir unas microbolas magnetizables o magnéticas,
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agitación,
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derrame líquido,
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paso del menisco,
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electroforesis,
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variación de temperatura, y/o gradiente de temperatura.
Se determina entonces, por medio de las técnicas de detección de ruido débil descritas anteriormente, el número de sistemas que quedan integradas o son destruidas.
Las técnicas de alineación y de detección descritas según la presente invención se pueden utilizar para diversas aplicaciones, de entre las cuales se mencionan, pero sin limitarse a ellas:
-
la identificación de uno o diversos elementos de secuencia de ADN o de ARN que se puede utilizar ventajosamente para el diagnóstico de patógenos o la cartografía física de un genoma. En particular, las técnicas descritas anteriormente permiten la obtención de una cartografía física directa sobre el ADN genómico, sin pasar por una etapa de clonación. Se entiende que la molécula cardada se estira en relación con su longitud cristalográfica, procediéndose a unas mediciones relativas. Es asimismo posible medir el tamaño de los fragmentos de ADN y la distancia entre fragmentos con una resolución del orden de 200 nm para unos métodos ópticos o del orden de 1 nm para la utilización de métodos de campo próximo tales como AFM o STM para visualizar y medir la distancia entre sondas sobre el ADN alineado.
Esto conduce naturalmente a:
1)
la detección de deleciones, adiciones o translocaciones de secuencias genómicas, en particular en el diagnóstico de enfermedades genéticas (por ejemplo la miopatía de Duchesne);
2)
la identificación de promotores de diferentes genes mediante la medición de la distancia entre las secuencias reguladoras y las expresadas;
3)
la localización de proteínas reguladoras mediante la identificación de su posición, la longitud del ADN o de la posición de su secuencia marcada;
4)
la secuenciación parcial o total mediante la medición de la distancia con la ayuda de microscopias de campo próximo (por ejemplo AFM o ATM) entre unas sondas híbridas que pertenecen a una base de oligonucleótidos de longitud determinada.
-
la amplificación enzimática in situ sobre unos ADN alineados.
-
la mejora de la sensibilidad de las técnicas de ELISA con la posibilidad de detectar un número bajo (eventualmente inferior a 1000) de reacciones inmunológicas.
De este modo, se puede proceder a una cartografía física directamente sobre un ADN genómico sin pasar por una etapa de clonación. El ADN genómico se extrae, se purifica, eventualmente digerido por uno o diversos enzimas de restricción y a continuación es cardado sobre unas superficies según el procedimiento de la presente invención.
La posición y el tamaño del gen investigado sobre el ADN genómico entonces se determinan por hibridación con unas sondas específicas de dicho gen, principalmente extraídas de partes del ADN complementario (cDNA) del producto de dicho gen investigado.
De forma similar, hibridando un ADN genómico cardado, posteriormente desnaturalizado con un cDNA total marcado por fluorescencia o cualquier otro marcador que permite localizar el híbrido, se identifica la posición, el tamaño y el número de exones del gen en cuestión, de los que se deducen su tamaño y su organización genética (exones, intrones, secuencias reguladoras).
Siendo la posición del gen determinada tal como se ha descrito anteriormente, o conocida, es por lo tanto posible identificar por hibridación las secuencias flanqueantes del gen. Para ello, se procederá, ventajosamente, por hibridación con unas sondas marcadas, procedentes por ejemplo de una librería de oligonucleótidos, para identificar dos o diversas sondas que se hibridan a una y otra parte del gen.
A partir de dicha determinación, es por tanto posible mediante las técnicas de amplificación enzimática, por ejemplo la PCR in situ (Nuovo G.J. PCR in situ hydridization: protocoles and applications, Raven Press (1992)) amplificar el fragmento delimitado por las sondas flanqueantes que pueden servir de cebos de la reacción, fragmento que puede contener el gen investigado con sus regiones reguladoras que pueden estar tejidas o el desarrollo específico y que por tanto se pueden aislar y purificar.
Se puede asimismo proceder mediante la polimerización in situ sobre unos cebos extraídos del cDNA del gen en cuestión para extraer unos fragmentos de ADN complementarios de las regiones flanqueantes del gen tal como ha mencionado Mortimer et al. (Yeast 5, 321, 1989). Dichos fragmentos pueden por lo tanto servir en la preparación de cebos para un procedimiento de amplificación enzimática del gen y de sus secuencias flanqueantes.
Se pueden asimismo utilizar los métodos citados por A. Thierry y B. Dujon (Nucl. Acid Research 20 5625 (1992)) para insertar por recombinación homóloga o de forma aleatoria de los sitios específicos conocidos de endonucleasa en un ADN genómico o un fragmento de ADN genómico. La cardadura de dicho ADN permite la identificación del gen de interés y de los sitios específicos insertados, mediante los métodos de hibridación in situ descritas anteriormente. A partir de dicha identificación y preferentemente si los sitios de interés son unas regiones de interés próximas al gen, se utilizarán como cebo de una reacción de amplificación enzimática (in situ u otra) del gen en cuestión y de sus secuencias flanqueantes.
La amplificación del gen investigado se realiza por tanto mediante las técnicas de amplificación enzimática conocidas, tales como PCR sobre el fragmento amplificado tal como se ha descrito anteriormente utilizando unos cebos accesibles por los exones que constituyen el cDNA, o de los cebos correspondientes a unas secuencias flanqueantes.
Mediante la cardadura del ADN genómico u otro, es asimismo posible determinar por hibridación la presencia o ausencia de secuencias reguladoras de un gen particular proximal, a partir del que se determinaran las posibles familias de proteínas reguladoras de dicho gen (por ejemplo: helice-loop-helice, zinc-finger, leucina-zipper).
Las reacciones específicas entre secuencias particulares de ADN /ARN /PNA y otra molécula (ADN, ARN, proteína) se pueden llevar a cabo antes o después de alineación de las moléculas según la presente invención.
De este modo, en el marco del diagnóstico genético y de la cartografía física, se utilizan ventajosamente los métodos conocidos de FISH (Pinkel et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83, 2934 (1986)) para hibridar unos oligonucleótidos de hebra simple marcadas con ADN inicialmente alineado, posteriormente desnaturalizado. La revelación de los híbridos se llevará a cabo mediante las técnicas conocidas (fluorescencia, microbolas, etc....) con una resolución en la medición de las distancias desde 0,2 \mum (en óptica) a 1 nm (en microscopio de campo próximo ; AFM, STM, etc...)
Alternativamente, se pueden hibridar en primer lugar unos ADN marcadores fluorescentes con el ADN de hebra simple en solución, y a continuación se alinea dicha construcción mediante la acción del menisco después de transformarlo en un ADN de doble hebra y anclado en una superficie adecuada.
Se puede asimismo utilizar la presente invención para la detección de la presencia de un patógeno. Por ejemplo, se podrá proceder de dos formas diferentes dependiendo de si la reacción de reconocimiento (hibridación, unión de la proteína) se produzca antes o después de la alineación por el menisco.
De este modo, por ejemplo, uno o diversos oligonucleótidos sondas se anclan en una o diversas regiones de una superficie. La hibridación del ADN potencialmente patogénico se realiza in situ en unas condiciones astringentes de modo que sólo ancla las moléculas hibridadas. Su detección y cuantificación se realizan después de la alineación por el menisco según la presente invención.
Alternativamente, el ADN potencialmente patogénico se alinea primero, y posteriormente se desnaturaliza e híbrida con un oligonucleótido sonda en unas condiciones astringentes. La detección del híbrido se lleva a cabo entonces mediante los métodos conocidos notablemente de FISH, tal como se ha descrito anteriormente.
De una forma similar, se puede detectar la presencia (o la ausencia) de un pequeño número de moléculas, tales como unas proteínas, unos lípidos, unos azúcares o unos antígenos. Se procederá ventajosamente, a una modificación menor de las técnicas de ELISA, el método de detección habitual se sustituye mediante la detección de una molécula fluorescente alineada según la presente invención y acoplada a uno de los reactivos de la reacción de ELISA.
Por otra parte, como ha mencionado K.R. Allan et al. (US 84 114), la cartografía genética puede proceder mediante una medición del tamaño de los fragmentos de ADN. Sin embargo, las técnicas originales de estirado de moléculas descritas anteriormente (el estirado por el menisco) permite una medición de la longitud de las moléculas estiradas, y ello sobre una muestra muy pequeña (algunos miles de moléculas).
Se puede, por ejemplo, pero sin limitarse a ello, proceder de la forma siguiente:
Una muestra de ADN se fragmenta (con la ayuda de restricción), se tiñe con un fluoróforo y seguidamente se ancla sobre una superficie. Las moléculas se estiran a continuación por el menisco y el tamaño de los fragmentos estirados se determina por microscopia óptica de fluorescencia con una resolución y un tamaño límite de 1.000 bp (0,3 \mum).
Con dicho fin, pero asimismo si se quieren alinear unas moléculas muy largas (\geq 10 \mum) se utilizaran ventajosamente unas técnicas conocidas por limitar la degradación de largas macromoléculas en el momento de su manipulación (por cizalladura hidrodinámica).
De este modo tal como ha mencionado por D.C. Schwartz, se procederá ventajosamente, a una condensación de las moléculas con la ayuda de un agente condensador (por ejemplo la espermina o un alcohol) en el momento de su manipulación. Eventualmente, su condensación se llevará a cabo en el momento del contacto del solvente A con la superficie de anclaje S.
Con el fin de reducir la degradación de las macromoléculas en el momento del estirado por el menisco, se utilizarán unas técnicas de translación del menisco que minimizan la cizalladura hidrodinámica. Por ejemplo, pero sin por ello restringirse, retirando muy lentamente (\leq 200 \mu/sec) la superficie S, de un volumen consecuente (\geq 100 \mul) del solvente A.
La presente invención resulta útil para obtener una superficie que presenta uno o diversos tipos de macromoléculas alineadas obtenidas según la presente invención. En particular, se puede obtener una superficie o un apilamiento de superficies que presentan unas propiedades eléctricas u ópticas anisotropas.
La presente invención tiene asimismo por objeto un procedimiento de alienación y de puesta de manifiesto del ADN en el que el ADN se estira mediante un procedimiento de alienación según la invención, posteriormente se desnaturaliza y después se hibrida con unas sondas específicas para determinar la posición o el tamaño de una o diversas secuencias específicas.
La presente invención presenta asimismo por objeto un procedimiento de cartografía física de un gen sobre un ADN genómico en el que el ADN se alinea o se pone de manifiesto según un procedimiento de la invención.
En particular, la posición y el tamaño del gen investigado sobre el ADN genómico, se determinan por hibridación con unas sondas específicas de dicho gen a cartografiar.
La presente invención resulta asimismo útil para preparar:
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un estuche útil para la utilización de un procedimiento de cartografía según la invención, constituido por el ADN genómico total de un huésped de referencia,
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un soporte que presenta una superficie que permite el anclaje y la alineación del ADN del paciente de acuerdo con el procedimiento de la invención,
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unas sondas específicas del o de los gen(es) a cartografiar y de los reactivos para la hibridación y la detección del ADN.
La presente invención tiene asimismo por objeto un procedimiento de alineación y puesta de manifiesto del ADN en el que el ADN se estira y después se desnaturaliza y posteriormente se hibrida con unas sondas específicas para determinar la presencia o ausencia de una o diversas secuencias de ADN en dicho ADN alineado.
La presente invención permite la utilización de un procedimiento de diagnóstico de una patología ligada a la presencia o ausencia de una secuencia de ADN específico de la patología en el que se utiliza un procedimiento de alineación según la invención.
La presente invención resulta asimismo útil para preparar un estuche útil para la utilización de un procedimiento de diagnóstico según la invención caracterizado porque presenta un soporte cuya superficie permite el anclaje y la alienación del ADN del paciente según un procedimiento de la invención, unas sondas específicas del gen implicado en la patología investigada y de los reactivos para la hibridación y la detección del ADN.
La presente invención es asimismo útil para preparar un estuche útil para la utilización de un procedimiento de diagnóstico según la invención caracterizado porque presenta un soporte cuya superficie presenta unas sondas específicas del gen implicado en una patología, en particular del ADN patógeno eventualmente marcado, alineados según el procedimiento de la presente invención y eventualmente desnaturalizados; los reactivos para preparar y marcar el ADN del paciente en vista a su hibridación (por ejemplo la fotobiotina, el kit de "nick-translation" o de "random priming") y de los reactivos para la hibridación y la detección del ADN siguiendo las técnicas de hibridación in situ tal como se han descrito anteriormente.
Se entiende que unas sondas cardadas relativas a unos patógenos diferentes pueden estar presentes sobre diferentes soportes o sobre el mismo soporte. La identificación del patógeno correspondiente puede hacerse después de la hibridación, ya sea espacialmente (las diferentes sondas se separan espacialmente por ejemplo por anclaje fotoquímico antes de su cardadura) o bien por una diferencia del espectro de fluorescencia de los diferentes híbridos, resultantes de un marcaje diferencial anterior de las sondas.
Por último, la presente invención tiene como objeto un procedimiento de preparación de un gen en el que se identifica la posición de dicho gen sobre el ADN genómico alineado mediante el procedimiento según la invención con la ayuda de una sonda específica de dicho gen se amplifica por amplificación enzimática, principalmente PCR in situ la secuencia de dicho gen y eventualmente sus secuencias flanqueantes.
La presente invención permite por lo tanto utilizar un procedimiento de sustitución de un gen en el genoma de una célula eucariota mediante la inserción dirigida de un gen extraño con la ayuda de un vector que contiene dicho gen extraño preparado según el procedimiento de preparación del gen anterior.
La inserción dirigida se puede llevar a cabo según las técnicas descritas en el documento WO90/11354 transfectando unas células eucariotas con un vector que contiene dicho ADN extraño a inserir flanqueado por dos secuencias genómicas que juntan el sitio de inserción deseado en el gen receptor. El ADN de la inserción puede implicar o bien una secuencia codificante, o bien una secuencia reguladora. Las secuencias flanqueantes se seleccionan con el fin de permitir por recombinación homóloga, según el caso, o bien la expresión de la secuencia codificante del ADN de inserción bajo el control de las secuencias reguladoras del gen receptor, o bien la expresión de una secuencia codificante del gen receptor bajo el control de la secuencia reguladora del ADN de inserción.
Los genes genómicos y los cDNA obtenidos utilizando el procedimiento de localización de los genes según la invención se pueden insertar en unos vectores de expresión capaces de insertar en una célula huésped procariota, eucariota o viral. Las proteínas polipeptídicas y péptidos derivados se incluyen en la presente invención.
La descripción que sigue, se presenta refiriéndose a las figuras adjuntas en las que:
- la figura 1 esquematiza la detección de un patógeno en una molécula de ADN fluorescente mediante hibridación con una molécula ancla;
- la figura 2 esquematiza la cartografía genética por extensión del ADN y la utilización de un ADN marcador;
- la figura 3 esquematiza la detección de una reacción inmunológica (ELISA) con la ayuda de una molécula "bandera", un ADN fluorescente utilizado como marcador de la reacción;
- la figura 4 es una microfotografía de fluorescencia que muestra la extensión del ADN de fago \lambda mediante el avance del menisco, a la izquierda se perciben unas moléculas de ADN en solución estiradas mediante el derrame de evaporación paralelo al menisco, a la derecha de las moléculas de ADN al aire libre después de su estirado perpendicularmente al menisco;
- las figuras 5(a) y 5(b) son unas microfotografías de fluorescencia que muestran, respectivamente, un ADN marcado con la digoxigenina (DIG) sobre una superficie recubierta de anti-DIG y estirada por el menisco, y, en control, un ADN no marcado sobre una superficie anti-DIG, se resaltará la especificidad muy grande de las superficies y la ausencia de anclaje no específico;
- la figura 6 representa el esquema del esparcimiento del ADN mediante el paso del menisco. El ADN en solución se ancla sobre una superficie tratada. La solución de ADN está recubierta por una lámina redonda no tratada;
- la figura 7 representa unos histogramas de la longitud de las moléculas de ADN \lambda cardadas sobre unas superficies de vidrio:
a) recubiertas de moléculas silanos terminadas en un grupo amino,
b) recubiertas de polilisina,
c) limpiadas en una mezcla de agua oxigenada/ácido sulfúrico.
- la figura 8 representa unas moléculas de ADN cardadas sobre unas superficies de vidrio recubiertas de polilisina. Se observa que las moléculas unidas por sus dos extremos forman unos bucles,
- la figura 9 representa unos YACs cardados por encogimiento de una lámina tratada con una solución de dichas moléculas,
- la figura 10 muestra la identificación de la presencia y del tamaño de un cósmido sobre un YAC por hibridación in situ.
En el modo "diagnóstico", las sondas (los "anclajes") presentan un grupo reactivo (DIG, biotina, etc..) capaz de anclarse de forma específica en una superficie según la presente invención (presentando por ejemplo como sitio de anclaje un anticuerpo anti-DIG o la estreptavidina). La detección de la reacción de anclaje se puede hacer directamente mediante la detección de la fluorescencia de la molécula de ADN teñida por unas moléculas fluorescentes (bromuro de etidio, YOYO, nucleótidos fluorescentes) (figura 1). Se puede asimismo hacer indirectamente la detección de una "molécula bandera": un reactivo capaz de fijarse sobre la molécula de ADN/ARN (por ejemplo por hibridación, interacción proteína-ADN, etc..), pero que no presenta afinidad por los sitios de anclaje de la sonda.
En el modo "cartografía" se pueden utilizar las técnicas de hibridación in situ (FISH). Es asimismo posible prever otras técnicas, por ejemplo hibridando en solución del ADN con unas sondas que presentan unos reactivos fluorescentes según la presente invención. La detección de la posición de unas sondas se hace después de la alineación de la molécula según la presente invención.
Ejemplo 1 Materiales y métodos
El ADN-\lambda y el anticuerpo monoclonal (anti-DIG) proceden de Boehringer-Mannheim. Los triclorosilanos proceden de Roth-Sochiel. Las sondas nucleicas fluorescentes (YOYO1, YOYO3 y POPO1) proceden de Molecular Probes. Las láminas de vidrio ultralimpias proceden de Erie Scientific (Laminas (ESCO). Las partículas magnéticas proceden de Dynal. El microscopio es un microscopio invertido Diaphot de NIKKON, equipado con una lámpara Xenon para la epifluorescencia y con una cámara CCD intensificada Hamamatsu para la visualización.
Tratamiento de superficie
Unas láminas de vidrio se limpian durante una hora por irradiación UV bajo una atmósfera de oxígeno (por formación de ozono). A continuación se depositan inmediatamente en un desecador previamente purgado de trazas de agua por una corriente de argón. Un volumen de aproximadamente 100 a 500 \mul del triclorosilano adecuado (H_{2}C=CH-(CH_{2})N-SiCl_{3}) se introduce en el desecador, del que se retiran las superficies después de aproximadamente 12 horas (n=6) o 1 hora (n=1). Al salir las superficies están limpias y no húmedas.
Los grupos funcionales de dichas superficies de doble enlace (H_{2}C=CH-) se pueden transformar en grupos carboxilo (-COOH) sumergiendo las láminas tratadas, tal como se ha descrito anteriormente, durante una decena de minutos en una solución de 25 mg KMnO_{4}, 750 mg NaIO_{4} en 1l de agua, posteriormente se aclaran tres veces en agua ultrapura.
Las láminas así funcionalizadas pueden reaccionar con unas proteínas. Un volumen de 300 \mul de una solución acuosa (20 \mug/ml) de proteínas (proteína A, estreptavidina, etc...) se deposita sobre una lámina funcionalizada en grupos (H_{2}C=CH-). Dicha lámina se incuba aproximadamente dos horas a temperatura ambiente, posteriormente se aclara tres veces en agua ultrapura. Las superficies así tratadas son nítidas y húmedas. Las superficies tratadas con la proteína A pueden reaccionar a continuación con un anticuerpo, por ejemplo anti-DIG, por incubación en una solución de 20 \mug/ml de anticuerpo.
Por otra parte, sobre las superficies que presentan unos grupos carboxilos, se pueden implantar unos oligonucleótidos que presentan un extremo amina (-NH_{2}), 200 \mul de una solución MES (20 mM, pH 5,5), Carbodiimida (1 mg/ml) y 5 \mul de oligo-aminado (10 pmol/140 \mul) se depositan sobre una superficie carboxilada e incubadas durante aproximadamente 8 horas a temperatura ambiente. La lámina se aclara finalmente tres veces en NaOH (0,4 M) y después cuatro veces en agua ultrapura. Las láminas preparadas de este modo pueden hibridar unos ADN complementarios de oligonucleótido anclado.
Anclaje de ADN nativo sobre una superficie doble enlace
Una gota de 2 \mul de una solución de ADN-\lambda marcada por fluorescencia (YOYO1, POPO1 o YOYO3, pero sin terminación particular) de concentración variable y en diferentes tampones (número total de moléculas < 10^{7}) se deposita sobre una lámina pretratada (C=C) y se recubre de una lámina de vidrio no tratado (diámetro 18 mm). La preparación se incuba aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente en una atmósfera saturada de vapor de agua. En un tampón de 0,05 M MES (pH=5,5) se observa un anclaje casi-general de las moléculas de ADN. Al contrario en un tampón de 0,01 M Tris (pH=8) no hay casi ninguna molécula de anclaje (relación > 10^{6}). Dicha dependencia puede permitir el control de la activación/desactivación de las superficies (en relación con el ADN) por el intermediario del pH.
La acción del menisco sobre la molécula se limita al vecindario inmediato del mismo. La parte de la molécula en solución antes del menisco fluctúa libremente y la parte que se mantiene pegada sobre la superficie detrás del menisco es insensible a un cambio de dirección del menisco. La tasa de extensión de la molécula es por lo tanto uniforme e independiente de su tamaño.
Alineación y detección del anclaje por la acción del menisco
Transfiriendo la preparación anterior en una atmósfera seca, la solución al evaporarse estiraba las moléculas de ADN, ancladas en la superficie, perpendicularmente al menisco. La fuerza capilar sobre la molécula de ADN (algunas decenas de picoNewtons) es en efecto suficiente para estirar completamente la molécula (más grande que las fuerzas de la elasticidad entrópica), pero muy débil para romper el enlace entre el extremo de la molécula y la superficie tratada. El ADN marcado con fluorescencia, se observa individualmente y holgadamente las moléculas estiradas (longitud total aproximadamente 22 \mum). El anclaje entre la superficie y el ADN se limita a los extremos, se ha podido asimismo estirar unos ADN del fago \lambda, de YAC o de E.Coli (longitud total superior a 400 \mum). Dicha preparación de ADN estirada, fluorescentes y al aire libre es estable durante varios días y se puede observar de forma no destructiva, por epifluorescencia (microscopio invertido Nikkon Diaphot con un objetivo x100, O.N.: 1,25).
Anclaje y detección específicas
Tratando las superficies tal como se ha descrito anteriormente con un anticuerpo monoclonal específico, se puede controlar muy precisamente su especificidad. De este modo, se ha ensayado la especificidad de superficies tratadas anti-DIG frente al ADN-\lambda hibridado con un oligonucleótido complementario de uno de los extremos Cos y que presenta un grupo digoxigenina (DIG) y frente al ADN no hibridado. En el primer caso, se ha observado una extensión, por acción del menisco, casi-general de las moléculas ancladas. En el segundo caso, sólo se han observado algunas moléculas de ADN (<10) ancladas en toda la muestra. Se estima por lo tanto que la especificidad del método según la invención es mejor que 10^{6}.
Unos ADN-\lambda se han hibridado asimismo con unos oligonucleótidos complementarios de uno de los COS y fijadas sobre unas superficies carboxiladas, tal como se ha descrito anteriormente. Las condiciones de hibridación (agua pura a una temperatura de 40ºC) no fueron astringentes, porque en las condiciones astringentes (elevada salinidad) la fluorescencia de las sondas YOYO1 desaparece y los ADN hibridados no se pueden ver. Los ADN hibridados de este modo se han podido alinear mediante el paso del menisco.
Sensibilidad de la detección
Con el fin de determinar la sensibilidad del método de detección por extensión del menisco, se ha depositado sobre unas superficies de doble enlace de las gotas de 2,5 \mul de una solución de ADN-\lambda en 0,05 M MES (pH=5,5) que contiene un total de 10^{5}, 10^{4} y 1000 moléculas. El anclaje y la alineación se realizan tal como se ha descrito anteriormente. Las láminas se observan a continuación en un microscopio por epifluorescencia, para determinar la densidad de las moléculas cardadas. Todo ello corresponde a la estimada: aproximadamente 4-6 moléculas de ADN por campo de visión (100 \mum x 100 \mum) para un total de 10^{5} moléculas de ADN. Para la concentración más débil, se pueden observar una decena de moléculas extendidas por acción del menisco. Dicho número se limita esencialmente por el gran número de campos de visión necesarios para cubrir toda la muestra (aproximadamente 25 000), lo que representa una investigación manual difícil, pero que puede ser ventajosamente realizada automáticamente o también con un objetivo más débil, pero a un campo mucho mayor. En conclusión, la sensibilidad del método según la invención permite una detección y un recuento individual de menos de 1000 moléculas de ADN.
Dependencia del estirado sobre el tratamiento de la superficie
El histograma de las longitudes de ADN-\lambda, injertadas sobre unas superficies diferentes, posteriormente alineadas por el paso del menisco muestra un pico bien definido, pero diferente para las diferentes superficies. Así sobre unas superficies recubiertas de un silano que se termina en un grupo vinilo el ADN se estira hasta aproximadamente 22 \mum (ver anteriormente) para unas superficies silanizadas con un grupo amino (-NH_{2}) , el histograma presenta un pico a 21 \mum (Fig. 7 (a)) y sobre vidrio limpio a aproximadamente 18,5 \mum (Fig. 7 (c)).
El estirado depende por lo tanto del tratamiento de la superficie.
Ejemplo 2 Cardadura de las moléculas de ADN sobre diferentes superficies
Se observa la cardadura molecular del ADN sobre unas superficies de vidrio tratadas de diferentes formas. Se juega sobre la diferencia de adsorción entre los extremos de la molécula y el resto de la misma. Adsorbiendo unos polímeros cargados positivamente sobre una superficie de vidrio se favorece una adsorción de las moléculas de ADN cargadas negativamente, sin embargo cuando dicha carga es grande la molécula de ADN se engancha sobre toda su longitud y la cardadura es imposible. Pero es posible modificar la carga de los polímeros adsorbidos sobre el vidrio modificando las condiciones de pH, en efecto, las cargas positivas se encuentran por ejemplo sobre unos grupos NH_{2} que pasan al estado protonado NH^{+3} para un pH inferior a la pK de la base correspondiente. En un pH básico las cargas desaparecen y la superficie ya no atrae el ADN. Controlando finamente el pH hemos observado que las moléculas de ADN en solución pasaban de un estado en el que se pegan completamente a la superficie a una fase intermedia en la que sólo se anclan por sus extremos y después a una fase en la que la superficie ya no presenta afinidad por el ADN. En la fase intermedia, la cardadura molecular se puede efectuar.
Se han estudiado unas superficies recubiertas por un silano terminado en un grupo NH_{2} para las que se observa un pegado total a un pH <8, una cardadura para 8,5 <pH <9,5. El número de moléculas cardadas es máximo a un pH=8,5 se divide por 2 a un pH=9 y por 4 a un pH=9,5. Se ha determinado asimismo la extensión relativa sobre dicha superficie que corresponde a 1,26 tal como se puede ver sobre el histograma 2 de la figura 7 que representa unos histogramas de la longitud de las moléculas de ADN-\lambda cardadas sobre unas superficies de vidrio:
a) recubiertas de silano terminadas en un grupo amino,
b) recubiertas de polilisina,
c) limpiadas en una mezcla agua oxigenada/ácido sulfúrico.
Se ha observado asimismo unas superficies recubiertas de polilisina que presentan unas características de enganches similares en pH : dominio de cardadura 8,5 y presentan una extensión relativa más débil: 1,08. Se puede tener un ejemplo típico en la figura 8 que representa unas moléculas de ADN cardadas sobre unas superficies de vidrio recubiertas de polilisina. Se destaca que las moléculas unidas por sus dos extremos forman unos bucles.
Finalmente, se ha encontrado el mismo comportamiento sobre dichas superficies recientemente limpiadas con una mezcla de agua oxigenada/ácido sulfúrico concentrado. Dichas superficies son muy húmedas y se contaminan rápidamente, sin embargo se ha observado un dominio de cardadura entre 5,5 < pH <7,4 mientras que el dominio de adsorción fuerte se sitúa a un pH=4,5. La extensión relativa de las moléculas corresponde a 1,12.
Ejemplo 3 Alineación uniforme y direccional del YAC
Se calienta a una temperatura de 68ºC, 1 \mug de YAC teñido previamente en su bloque de agarosa con la ayuda de una sonda fluorescente YOYO1, se agariza, posteriormente se diluye en 10 ml de MES (50 mM pH 5,5). Dos láminas silanisadas (superficies C=C) se incuban durante \approx 1,5 h en dicha solución y posteriormente se retiran a aproximadamente 170 \mum/sec. Las moléculas de YAC se alienan todas paralelamente en la dirección de retirada de las láminas (Fig, 9). La integridad de las moléculas alineadas de este modo es mejor que por evaporación después de la deposición entre dos láminas.
Hibridación de un cósmido sobre un YAC cardado
Un YAC teñido tal como se ha descrito anteriormente se ancla sobre una superficie C=C (entre dos láminas) y posteriormente se alinea con el menisco, en el momento de la evaporación de la solución. Las sondas (cósmidos) se marcan mediante la incorporación de un nucleótido biotinilado mediante la técnica de "randon priming". Las sondas marcadas (100 ng) y 5 \mug de ADN de esperma de salmón (\approx 500 bps) se purifican por precipitación en acetato de Na y etanol, posteriormente desnaturalizados en formamida.
Los YAC cardados se desnaturalizan entre dos láminas con 120 \mul de solución desnaturalizante (formamida 70%, 2 x SSC) sobre una placa calefactora a una temperatura de 80ºC durante 3 minutos. Las sondas (20 ng) desnaturalizadas previamente se depositan sobre la lámina en una solución de hibridación (formamida 55%, 2 x SSC, 10% dextrano sulfato) recubiertas de una lámina que se sella con caucho líquido (cemento caucho). La hibridación se lleva a cabo una noche a una temperatura de 37ºC en una cámara húmeda.
La revelación de los híbridos se hace siguiendo los protocolos conocidos para las hibridaciones in situ sobre los cromosomas descondensados (D. Pinkel et al., PNAS USA 83, 2934 (1986) y PNAS USA 85, 9138 (1988)).
Al microscopio, en fluorescencia se observan por lo tanto unos segmentos hibridados tales como el que se muestra en la Fig. 10. Dicho ejemplo demuestra la posibilidad de detectar la presencia de un gen sobre una molécula de ADN, que se puede utilizar con unos fines de diagnóstico o de cartografía física del genoma.

Claims (43)

1. Procedimiento de alineación de macromolécula(s) sobre la superficie S de un soporte, caracterizado porque se hace desplazar sobre dicha superficie S la línea de triple S/A/B (menisco) resultante del contacto de un solvente A con la superficie S y un medio fluido o gaseoso B, presentando dichas macromoléculas una parte, principalmente un extremo, anclado sobre la superficie S, encontrándose la otra parte, principalmente el otro extremo, en solución en el solvente A.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el desplazamiento del menisco se realiza por evaporación del solvente A.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el desplazamiento del menisco se realiza por desplazamiento relativo de la interfase A/B en relación con la superficie S.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque para desplazar el menisco, la superficie S se retira del solvente A o el solvente A se retira de la superficie S.
5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el menisco es un menisco agua-aire.
6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el soporte está constituido por lo menos en la superficie por un polímero orgánico o inorgánico, un metal, un óxido o un sulfuro de metal, un elemento semiconductor tal como el sílice o un óxido de elemento semiconductor, o una de sus combinaciones.
7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el soporte está constituido por lo menos en la superficie por vidrio, sílice oxidado en la superficie, oro, grafito, sulfuro de molibdeno o mica.
8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el soporte se encuentra en forma de placa, de bola, de fibra o de partículas.
9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el solvente A en el cual se encuentran en solución las macromoléculas a alinear se coloca entre dos soportes, de los cuales uno por lo menos corresponde a dicho soporte de la superficie S, y el menisco es desplazado por evaporación.
10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el anclaje de la macromolécula se lleva a cabo por interacción fisicoquímica, principalmente adsorción o por enlace covalente, o bien directamente entre la superficie y la macromolécula, o bien indirectamente entre la superficie y otra molécula que reconoce y/o que interacciona con dicha macromolécula.
11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque se utiliza un soporte que presenta en la superficie un grupo reactivo expuesto que presenta una afinidad por dicha macromolécula o una molécula con actividad biológica capaz de reconocer dicha macromolécula.
12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque la superficie está recubierta por un grupo seleccionado de entre los grupos vinilo, amina, carboxilo, aldehído o hidróxilo.
13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 10 ó 12, caracterizado porque la superficie presenta:
-
sobre un soporte una capa sensiblemente monomolecular de un compuesto orgánico de estructura alargada que presenta por lo menos:
-
un grupo de fijación que presenta una afinidad por el soporte, y
-
un grupo expuesto que no presenta o presenta poca afinidad por dicho soporte y dicho grupo de fijación en las condiciones de fijación, pero que presenta eventualmente, después de una modificación química que sigue a la fijación, una afinidad por dicha macromolécula o una molécula con actividad biológica.
14. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque se realiza el anclaje de una parte de una macromolécula por adsorción sobre una superficie, poniendo dicha macromolécula en presencia de dicha superficie en una zona de pH o de contenido iónico del medio determinado o aplicando una tensión eléctrica determinada sobre la superficie de anclaje.
15. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque el pH para realizar el anclaje se selecciona de entre una franja comprendida entre un pH que favorece un estado de adsorción completo y un pH que favorece una ausencia de adsorción.
16. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque se realiza el anclaje de un ácido nucleico o de una proteína por adsorción sobre una superficie que presenta unos grupos que presentan unos dobles enlaces etilénicos o unos grupos amino, poniendo el ácido nucleico o la proteína en presencia de la superficie en una zona de pH o de contenido iónico del medio, determinada.
17. Procedimiento según la reivindicación 16, caracterizado porque se realiza el anclaje del ADN no funcionalizado por adsorción sobre unas superficies recubiertas de moléculas terminadas en un grupo vinilo o amino.
18. Procedimiento según la reivindicación 17, caracterizado porque se realiza el anclaje del ADN por su extremo sobre una superficie que presenta unos grupos de dobles enlaces etilénicos, poniendo el ADN en presencia de la superficie a un pH inferior a 8.
19. Procedimiento según la reivindicación 18, caracterizado porque la reacción es conducida a un pH comprendido entre 5 y 6 y posteriormente detenida a un pH 8.
20. Procedimiento según la reivindicación 17, caracterizado porque se realiza el anclaje del ADN por su extremo sobre una superficie recubierta de polilisina o de un grupo silano terminado en un grupo amino.
21. Procedimiento según la reivindicación 17, caracterizado porque se realiza el anclaje del ADN por su extremo sobre una superficie recubierta por un grupo amino poniendo el ADN en presencia de la superficie a un pH comprendido entre 8 y 10.
22. Procedimiento según la reivindicación 17, caracterizado porque se realiza el anclaje del ADN por su extremo sobre una superficie de vidrio tratada previamente en un baño de ácido, poniendo el ADN en presencia de dicha superficie a un pH entre 5 y 8.
23. Procedimiento de puesta de manifiesto, de separación y/o de dosificación de una macromolécula en una muestra, caracterizado porque se utiliza un procedimiento de alineación según una de las reivindicaciones 1 a 22, en el cual se encuentra fijada sobre la superficie S una molécula con actividad biológica capaz de reconocer dicha macromolécula de la muestra y porque la puesta de manifiesto, la separación o la dosificación se realizan gracias a un reactivo fluorescente o no que detecta la presencia de la molécula fijada o dicha macromolécula.
24. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 23, caracterizado porque dichas macromoléculas y molécula con actividad biológica se seleccionan de entre las proteínas, los ácidos nucléicos, los lípidos, los polisacáridos y sus derivados.
25. Procedimiento según la reivindicación 23, caracterizado porque dichas macromoléculas y molécula con actividad biológica se seleccionan de entre los anticuerpos, los antígenos, los ADN y ARN, los ligandos y sus receptores así como sus derivados.
26. Procedimiento según las reivindicaciones 23 a 25, caracterizado porque el ADN fijado presenta la secuencia complementaria de una secuencia de ADN a aislar de una muestra.
27. Procedimiento según las reivindicaciones 23 a 25, caracterizado porque la proteína fijada es capaz de reconocer y fijar específicamente una proteína a aislar de una muestra.
28. Procedimiento según las reivindicaciones 23 a 25, caracterizado porque dicha molécula con actividad biológica se selecciona de entre la biotina, la avidina, la estreptavidina, sus derivados o un sistema antígeno-anticuerpo.
29. Procedimiento según las reivindicaciones 23 a 25, caracterizado porque la superficie presenta una fluorescencia débil y porque el reactivo es fluorescente.
30. Procedimiento según las reivindicaciones 23 a 25, caracterizado porque el reactivo está constituido por unas bolas.
31. Procedimiento según una de las reivindicaciones 23 a 25, caracterizado porque la detección se realiza por microscopia óptica o en unos campos próximos.
32. Procedimiento según una de las reivindicaciones 23 a 25, caracterizado porque se somete el producto de reacción entre la molécula con actividad biológica y la macromolécula de la muestra a una tensión con el fin de destruir los malos emparejamientos antes de la detección.
33. Procedimiento de puesta de manifiesto de una macromolécula que consiste en una secuencia de ADN o de una proteína en una muestra, según una de las reivindicaciones 23 a 32, caracterizado porque:
-
se coloca una muestra correspondiente al solvente A, en el que dicha macromolécula se encuentra en solución, en contacto con la superficie del soporte en unas condiciones de formación de un híbrido ADN/ADN, ADN/ARN o de formación de un producto de reacción proteína/proteína,
-
estando el híbrido o una macromolécula de marcaje del híbrido o del producto de la reacción anclado por una parte, encontrándose el resto libre en solución, se estira por desplazamiento del menisco creado por medio del contacto del solvente con la superficie para orientar los híbridos o dichas macromoléculas de marcaje y se realiza la medición o la observación de los híbridos o de dichas macromoléculas de marcaje orientadas de este modo.
34. Procedimiento según una de las reivindicaciones 23 a 33, caracterizado porque el ADN fijado y el ADN de la muestra se "colorean" de forma diferente y, después del estirado, se mide la posición de la secuencia complementaria con respecto al extremo del ADN de la muestra.
35. Procedimiento según una de las reivindicaciones 23 a 34, caracterizado porque se utiliza un método de detección de ELISA o FISH.
36. Procedimiento según una de las reivindicaciones 23 a 35, caracterizado porque la muestra es el producto o el sustrato de una amplificación enzimática de ácido nucleico.
37. Procedimiento según una de las reivindicaciones 23 a 36, caracterizado porque el ADN se estira, posteriormente se desnaturaliza y después se hibrida con unas sondas específicas para determinar la posición o el tamaño de una o de varias secuencias de ADN determinadas.
38. Procedimiento de cartografía física de un gen sobre un ADN genómico en el cual el ADN se alinea y/o se pone de manifiesto según un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 37.
39. Procedimiento según la reivindicación 38, caracterizado porque la posición y el tamaño del gen investigado sobre el ADN genómico se determinan por hibridación con unas sondas específicas de dicho gen a cartografiar.
40. Procedimiento según una de las reivindicaciones 33 a 36, caracterizado porque el ADN se estira, después se desnaturaliza y después se hibrida con unas sondas específicas para determinar la presencia o la ausencia de una o de varias secuencias de ADN determinadas.
41. Procedimiento de diagnóstico de una patología ligada a la presencia o la ausencia de una secuencia de ADN determinada específica de dicha patología en el cual se utiliza un procedimiento según la reivindicación 40.
42. Procedimiento de preparación de un gen a partir de ADN genómico caracterizado porque se identifica la posición de dicho gen sobre el ADN genómico alineado por medio del procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 36 con la ayuda de una sonda específica de dicho gen y se procede a la amplificación enzimática de la secuencia de dicho gen y/o de sus secuencias flanqueantes y se aísla el producto amplificado.
43. Utilización de un gen obtenido mediante un procedimiento según la reivindicación 42 para preparar una construcción de ADN útil en un procedimiento de sustitución de un gen en el genoma de una célula eucariota por inserción dirigida con un gen extraño, siendo dicho gen extraño obtenido por medio del procedimiento según la reivindicación 42.
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