JP3741718B2 - 生物反応について高度に特異的な表面、それらの作製方法、およびそれらの使用方法 - Google Patents
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Description
ある生物反応、特に抗原/抗体反応、DNAまたはRNAハイブリッド形成反応、タンパク質間またはアビジン/ストレプトアビジン/ビオチンタイプ反応、並びにリガンドとそのレセプターとの反応の非常に高い特異性および非常に高い選択性は、長期間にわたり知られていた。
特にサンプル中で反応ペアの要素の一方の存在または不存在を検出するために、あるいはペアの要素の一方をより複雑な媒体から分離するために、これらの特異性を利用する方法が現在知られている。
しかしながら、非常に複雑な媒体中で非常に低濃度の分子の存在を検出することが望まれるとき、現在知られる方法では非常に予測しえない結果を時々生じ、特に分離および/または検出段階中に生じるバックグラウンドノイズの問題を生じる。
その結果、以下で“分子フィッシング(molecular fishing)”と呼ばれるもの、即ち探査分子の各々についてそれらが非常に低い濃度で存在するときに検出することができる見込みは、これまで不可能であった。
例えば、DNAサンプルの分析では、対象配列と相補的な配列に相当するいわゆる“ハイブリッド形成”プローブの使用を要する。これらの条件下において、提起される問題は、媒体からハイブリッドを単離すること、更に少数の陽性反応を良好なシグナル/ノイズ(S/N)比で検出することである。
その結果、求める配列を増幅させるための中間段階が例えば同様の結果を導くPCR法または増幅法を用いてほとんどの場合に現在用いられる。これらの条件下において、調べられる配列の濃度はサンプル中で増加されて、その検出は明らかにかなり容易になる。
しかしながら、増幅段階は汚染物に敏感であり、それに特異的なエラーを起こす。
したがって、増幅期なしに核酸配列の存在を検出しうることが、できるかぎり好ましいであろう。
特異的ハイブリッド形成反応を検出するために、ある特異性を有する固体表面上にハイブリッド形成産物を固定する中間段階を用いることが提案された。例えば、あるタンパク質またはDNAを結合させることができるある前処理表面を用いることは、それが修飾されていてもまたは修飾されていなくとも可能である。
このような表面は、例えばそれらの表面にCOOH、NH2またはOH基を有したビーズまたはウェルの形で市販されている(例えば、Covalink,Costar,Estapor,Bangs,Dynal)。
このような基を得るために、後でCOOHまたはOH基を有するように酸化されるビニル基を有した中間段階を用いることも提案された。(USA 4,539,061およびEP 435 785)。
次いで反応基、例えばアミンでDNAを官能化させて、これら表面と反応を行わせることが可能である。しかしながら、これらの方法では結合されるDNAの特異的官能化を要する。
DNAの事前処理なしに固定する技術も記載されている。この方法は分子の5′末端の遊離リン酸を二級アミン(NH Covalink表面)と反応させることからなる。
P0と特異的に反応できる基またはタンパク質P1でコートされた表面と反応させるために、基またはタンパク質P0にDNAを結合させることも可能である。P0/P1ペアには下記タイプのペアがある:例えばビオチン/ストレプトアビジンまたはジゴキシゲニン/ジゴキシゲニンに対する抗体(抗DIG)。
しかしながら、このような表面はほとんどの場合で十分に特異的でない(V.Lund et al.,Nucl.Acids Res.,16,1861(1988))。このため、非特異的吸着タイプの望ましくなくしかも弱い相互作用の存在は、多数の弱い相互作用箇所を固体とともに形成できる長い分子のときに効率的吸着を導く。これらの表面は、少数の分子を探し出す場合に感受性を欠いたおよび/または高レベルのバックグラウンドノイズを有した、潜在的適用例である。更に、これら表面の一部では検出期に潜在的に破壊されやすい高レベルの望ましくない蛍光を有する。
検出自体、特にDNAの検出について、フランス特許78 10975では発色原基質により顕在化できる酵素とプローブをカップリングさせる方法について記載している。加えて、比色測定によりその反応を定量することが可能である。
しかしながら、このような技術は微量物質の検出に直接適用されず、そのためここでもほとんどの場合において所望量の核酸の増幅段階、例えばPCR法が先行するべきである。
このいわゆる“コールドプローブによる”検出方法は、感度の点で近い結果を出すが、放射性産物の存在による取扱い問題と、高感度が望まれるならば長い顕在時間の問題とを明らかに提起する、放射線マーカーの使用を避けるために開発された。
ある特異的適用、特に半ビボ画像化に由来する方法では、適切に表面で化学処理されたマイクロビーズ、特にPMMAにハイブリッド形成産物をカップリングさせることにより反応を観察する直接法が提案された。その方法は典型的直径60nmのこれらマイクロビーズの存在の走査型電子顕微鏡下における直接的同定に基づき、しかも上記のように固体上に固定する上で公知だが不十分な特異的技術に基づいている。
上記技術は、明らかに核酸の検出に限定されない。同様の目的で、抗体の検出が提案された。それらはELISAタイプ試験であり、ここでは記載されていないが、要約すると、固体上にある抗原の分子の関連的固定に抗体の存在をカップリングさせることができる。同じく、特異性と望ましくない反応の問題が存在する。検出期も感度問題をそれ自体有する発色原反応へのカップリングに基づいている。
要するに、従来の方法またはそれらの組合せはいくつかの欠点、特に
-放射性産物の使用のために潜在的に危険であること
-または、長すぎる顕在化時間を要すること
-または、増幅期のレベルで特異的問題により破壊されること
-または、十分に特異性でない固体表面を要すること
-または、弱すぎる感度であること
-または、最後に、固体への結合段階に加えて、非常に便利でないことが明らかな電子顕微鏡の使用を要すること
を有している。
最後に、ほとんどの場合において、公知の方法では望ましいユニットの特定位置を所定分子上で認識することができない。現在、このタイプの認識は、特にゲノムマッピングの枠組み内でマッピングを行うことが望まれるとき、例えば、DNAまたはRNAにおける所定遺伝子の分子の一端からの大体の空間的位置を認識することが望まれるときに重要である。
従来の方法の欠点を克服するために提案された本発明は非常に高度な特異的表面の使用に基づいており、これは特にそれらが望ましくない結合をなくすという事実のために、それらの使用中は過度に制限されたバックグラウンドノイズを出すにすぎない。
更に具体的には、本発明は生物反応について高度に特異的な表面に関し、それは特にpHまたはイオン含有率のある反応条件下で生物活性を有する一の分子と親和性を有するエチレン性二重結合をもつ露出基、特にビニル基、を層の外側に有した有機化合物の少くとも1つの本質的にコンパクトな層を表面に有する支持体を含み、層の他の要素は上記反応条件下で上記分子と本質的に接近できないことで特徴付けられる。
“親和性”とは何らかのタイプの化学反応および吸着の双方とここでは理解されるべきであり、これは上記生体分子の結合条件下における。
“支持体”とは、固体支持体と、特に上記のようなコンパクト層を有した液体または気体粒子のような非固体要素からなる支持体双方を表す。
表面は“本質的にコンパクト”であり、即ちそれは内層および/または支持体への生物活性を有する分子の接近を制限し、表面のコーティング欠陥は許容できると理解される。
生物反応についてこれらの高度に特異的な表面は、溶液に接近できる二重結合を有する表面基、特にビニル(-CH=CH2、以下C=C表面)、を有した支持体を含んでいる。それらは媒体のpHまたはイオン含有率のある条件下で生物学的対象の分子(DNA、RNA、PNA、タンパク質、脂質、糖)を直接固定することができる。特に、これらの表面では表面またはつなぎとめられる生体分子の特別な化学的修飾を要しない。ビニル基を有する表面のこのような使用について言及した文献は全くない。
“固定する(anchoring)”とは、化学反応に基づく共有結合または何らかのタイプの吸着のような物理化学的相互作用に基づく非共有結合による結合であるとここでは理解され、これらは上記生体分子の結合用媒体のpHまたはイオン含有率の条件下における。
本発明による表面は、様々な方法を用いて得ることができる。例えば
(A)・エチレン性二重結合をもつ基
・炭化水素またはフルオロカーボン基からなる層の残部
を有する、少くとも1nm厚の、場合により分岐した含炭素ポリマー層
(B)固体上に1以上の分子層を沈着させるかまたは固定することにより
得られる表面(後者はLangmuir-Blodgettフィルムタイプの非共有結合により結合された連続層の形成によるか、または共有結合により結合された層を形成させる分子自己集合により得られる)
が挙げられる。
第一の場合に、表面は、エチレン性二重結合をもつ上記基をポリマーの表面に形成する、少くとも1種のモノマーの重合、または上記基を形成するためのポリマーの表面の部分的脱重合、またはポリマーの沈着によって得られる。
この方法において、形成されたポリマーはポリエン誘導体のようなビニル結合、特にポリブタジエン、ポリイソプレンまたは天然ゴムのような合成ゴムタイプの表面を有している。
第二の場合において、本発明による生物反応について高度に特異的な表面は
-支持体上に、少くとも
・支持体に親和性を有する結合基、および
・結合条件下で上記支持体および上記結合基に親和性をほとんどまたは全く有しないが、一のタイプの生体分子と親和性を有するエチレン性二重結合をもつ露出基
を有した長い構造の有機化合物の実質的に単分子で、かつコンパクトな層を有する。
本質的にコンパクトな層を得るために、様々な有機化合物が架橋を作るように露出基以外で互いに反応できることが好ましい。こうして“本質的に”コンパクトな単分子層が得られ、それにより支持体は望ましくない反応に近付かないかまたはほとんど近付かなくなる。
好ましくは、有機化合物は一端に結合基および他端に露出基を有している。例えば結合基が分子の中間に位置した様々な態様について考慮することは勿論可能であるが、後者はその端部の各々に露出基を有している。
表面は
a)支持体
b)支持体上における露出基および結合基を有した分子
c)結合を確実にする支持体と上記分子との相互作用
に基づき分析することができる。
結合には、まず第一に、Langmuir-Blodgettフィルムのような、特に親水性/親水性および疎水性/疎水性タイプの非共有タイプがある(K.B.Blodgett,J.Am.Chem.Soc.,57,1007(1935)およびUS 5,102,798)。
この場合に、結合基は親水性または疎水性のいずれか、特にCH3、CF3、CHF3、CH2Fのようなアルキルまたはハロアルキル基である。
結合は共有タイプでもよく、結合基はこの場合に支持体と化学反応する。
類似構造のある表面は、特に結合が共有であるときに、電子工学分野で既に挙げられている(L.Netzer and J.Sagiv,J.Am.Chem.Soc.,105,674(1983)およびUS-A-5 539 061)。
当業者は、広範囲の基を利用できる。非制限例としては、シラン、シランクロリド、エトキシシラン、メトキシシランのような金属アルコキシドタイプの基が挙げられる。
結合基は、明らかに用いられる支持体の機能として選択される。本発明による支持体は、少くとも表面で、ポリマー、金属、酸化金属、半導体元素、酸化ケイ素のような半導体元素の酸化物またはそれらの1組合せからなる。ガラスおよび表面酸化ケイ素が特に挙げられる。
結合基の中では、金属アルコキシドタイプの基、例えばシラン、クロロシラン、クロロシラン、シラノール、メトキシシラン、エトキシシラン、シラザン、ホスフェート、ヒドロキシル、ヒドラジド、ヒドラジン、アミン、アミド、ジアゾニウム、ピリジン、サルフェート、スルホネート、カルボキレート、ボロネート、ハロゲン、酸ハライド、アルデヒドが更に具体的に挙げられる。
最も具体的には、結合基として、隣接相当基と交差反応して架橋を作ることができる基の使用が好ましい。例えば、これにはシランタイプの誘導体、特にジクロロシラン、トリクロロシラン、ジメトキシシラン、トリメトキシシラン、ジエトキシシランおよびトリエトキシシランがある。
これらの架橋は、結合部位と露出基との間にある鎖中に存在する反応基によりそれを重合させることにより、単層のどの深さ箇所で行うこともできる。こうして、ジアセチレン基は単層の一次元または二次元重合を行えることが知られている。
結合基の選択は明らかに支持体の性質に依存しており、シランタイプ基がガラスおよびシリカ上での共有結合によく適している。
好ましくは、露出基を結合基に結合させる鎖は、少くとも1つの炭素原子、好ましくは6以上、一般的に3〜30の炭素原子を有する鎖である。イオン、配位又は共有結合のいずれであろうと層内部に実際に側鎖カップリングの形成があるときには、初期表面がコンパクト単層で得られる分子の数と比較して限られた数の活性固定部位だけを有していたとしても、自己集合により高度秩序層が得られる。
シラン誘導体を用いた表面官能化の公知技術〔例えば、Si-OH+Cl3-Si-R-CH=CH2でSi-O-Si-R-CH=CH2を得る(Rは例えば(CH2)4からなる)〕は、ガラスまたはシリカの場合で有利に使用できる。このような反応は文献で公知であり、超高純度溶媒を用いる。その反応では外部に露出したC=C末端を表面に有する分子の層を形成する。
高度に特異的な表面の生産枠組み内において、本発明はC=C二重結合のある分子をグラフト化させるこのような反応の関係で、溶媒の使用を避けることを可能にする気相の使用にも関する。
金の場合において、後者は場合により基体上で薄層の形をとるが、表面官能化について公知の技術ではチオール誘導体を用い、例えばAu+HS-R-CH=CH2でAu-S-R-CH=CH2を得る(Rは例えば(CH2)4である)。このような反応は液体媒体で記載されており、先のトリクロロシラン-シリカ反応のように、外側に露出したC=C末端を表面に有する分子の層を形成する。
勿論、“支持体”という用語は、スライドのような単一表面だけでなく、シリカ粉末またはポリマービーズと、更に棒、繊維または構造支持体のような何らかの形態もカバーしており、これらは様々なアッセイ技術で知られるように更に磁気、蛍光または着色化できる。
好ましくは、支持体は、検出が蛍光で行われるとき、蛍光性でないかまたはほとんど蛍光性でないように選択される。
上記方式(A)または(B)に従い得られた表面は、露出基または結合分子由来の特異的反応部位の存在により高い特異性を有している。
加えて、方式(A)または(B)に従い得られた表面は、下記の予想外の顕著な特徴を有している:
(i)非常に低いレベルの非特異的相互作用を伴う、分子の特異的官能化を要しない、その末端によるDNAの特異的で高度pH依存的な固定
(ii)特別な化学的修飾なしに、生物学的対象のタンパク質および他の分子をそれらに固定する可能性
(iii)抗原(例えばジゴキシゲニン)またはリガンド(例えばビオチン)に特異的な表面を作製する可能性
(iv)必要時に非常に低い固有蛍光レベル、検出される単一分子の蛍光シグナルよりも低い蛍光バックグラウンドノイズ(100×100μmの典型的面積当たり)
(v)表面との弱い非特異的相互作用を有する肉眼的マーカーの存在を同定することに基づく、以下で記載される様々な技術により高いS/N比で可能な、分子の数と無関係なS/N比で単離された分子を検出する可能性
こうして得られた表面は、
-タンパク質
-核酸
-脂質
-多糖およびその誘導体
から選択される、生物活性を有する分子でコートされることが好ましい。
タンパク質の中では、抗原および抗体、リガンド、レセプターだけでなく、アビジンまたはストレプトアビジンタイプの産物と、更にこれら化合物の誘導体が挙げられる。
RNAおよびDNAの中では、α、β誘導体、更にチオ誘導体と、PNAのような混合化合物が挙げられる。
例えば糖ペプチドおよびリポ多糖のような混合化合物、またはウイルス、特に細胞のような他の要素、またはビオチンのような化学化合物も結合させることができる。
生体分子の結合は共有でも、あるいは例えば吸着、水素結合、疎水性またはイオン相互作用による非共有でもよく、その場合には公知方法(″Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking″,S.C.Wong,CRC Press(1991))によりつなぎとめられた(grafted)分子間で架橋を有利に行うことができ、これはそれらの付着性を高める。
以下で“C=C表面”または“エチレン性結合のある表面”と称される-CH=CH2基を有した露出基の場合には、特にDNAまたはタンパク質の直接固定が可能である。本発明の枠組み内で、これらの表面は高度にpH依存性である反応性を有することが証明された。この特徴は、既定のpH領域を用いて、特にそれらの末端で核酸またはタンパク質を固定することを可能にするが、反応速度はしばしばpHでコントロールできる。
このため、pH5.5でDNAの場合、固定反応は(それが核酸で制限されないならば)1時間で完了し、末端を介して生じる。他方pH8だと、結合は非常に小さい(大きさ5〜6程度で反応速度が小さい)。末端に特異的なこのpH依存性結合効果は、-NH2と-COOHまたは-POOHとでペプチドまたはホスホルイミド結合鎖を形成するDNA(ビオチン、DIG、NHSなど)または特異的試薬(カルボジイミド、ジメチルピメリデート)の官能化を要する他の表面と比較したときの改善である。
本発明による表面は、タンパク質(プロテインA、抗DIG、抗体、ストレプトアビジンなど)を直接固定することができる。(i)分子の活性が保存され、(ii)作製表面(初めはC=C)の反応性が対象分子だけの反応性を優先して完全に遮蔽されることが観察された。したがって、比較的高い初期反応性から出発して、非常に高度に特異的な反応性を有する表面、例えばタンパク質上の特異的部位のものに移行することが可能である。
表面に特異的抗体(例えば抗DIG)を固定すると、反応性が抗原(例えばDIG基)に限定された表面が作られる。これは、初期化学期が固定された抗体ですべて遮蔽されていることを示している。
生物活性のある他の分子、特にウイルスまたは他の成分、特に膜、膜レセプター、多糖、PNAを反応性(化学的または生化学的)表面上に固定することも可能である。
生物学的対象の反応(例えばPCR)産物を作製された表面上に結合させることも可能である。
本発明は、本発明による方法を用いて得られた表面と、このタイプの表面を用いるすべての方法にも関し、それらには生体分子の検出および/または定量と、更には抗原/抗体および/またはDNA、DNA/RNAカップリング技術を用いたある生体分子、特にサンプルの分離を行う方法がある。
本発明は、(A)および(B)による層の形成について前記されたような生物学的反応について高度に特異的な表面を作製する方法、特に
-少くとも
・支持体に親和性を有する結合基、および
・結合条件下で上記支持体および結合基に親和性をほとんどまたは全く有しないが、一のタイプの生体分子と親和性を有する、エチレン性二重結合をもつ露出基
を有した長い構造の有機化合物の実質的に単分子で、かつコンパクトな層という点で特徴付けられる方法にも関する。
本発明は、特異的試薬および検出される分子の数と無関係なS/N比での検出方法によって、単離される分子の検出に向けた処理表面の適用にも関する。
このため、一般的には、本発明はサンプル分子を認識できる生物活性を有する分子が結合するようになる上記のような表面が用いられ、しかも検出またはアッセイが結合分子の存在を検出する試薬、蛍光またはその他を用いて行われるという点で特徴付けられる、サンプル中で生物活性を有する分子を検出および/またはアッセイするための方法に関する。
試薬の中には、蛍光試薬および非蛍光試薬がある。
蛍光試薬は、有利には0.1μm以上のサイズの長い分子となるように選択されて、前処理表面と特異的、直接または間接的に反応する蛍光分子を含有している。例えば、限定することを意図するものではなく、C=C表面上に直接固定することができる蛍光プローブ(臭化エチジウム、YOYO、蛍光ヌクレオチドなど)によるか、相補的タンパク質(抗DIG、ストレプトアビジンなど)を有した表面上にある分子(DIG、ビオチンなど)の修飾により染色された二本鎖DNA分子が挙げられる。
非蛍光試薬は、前処理表面と特異的、直接または間接的に結合された分子を介して固定されたビーズから特になる。表面処理により、これらのビーズは表面と弱い非特異的相互作用を示す。例えば、限定することを意図するものではなく、ストレプトアビジンでコートされ、本発明による表面にビオチニル化DNAを介して固定された、DNA分子の他端と反応できる部位を有したDynalビーズが挙げられる。
望ましい分子が蛍光で直接または上記試薬で間接的に検出されるかどうかに応じて、検出は“直接検出”または“フラッグ(flag)検出”として記載される。
極端に遅い反応時間に伴う問題を制限するために、表面への試薬の拡散時間は有利には小さな反応容量を用いて減少させることができる。例えば、限定することを意図するものではなく、一方が本発明による反応部位を有するように処理されて、他方が不活性であるかまたは反応部位を有しないように処理された2つの表面間のスペースにより決められる数μlの容量で反応を行うことによる。
生じた特異的反応の数の検出は、電子顕微鏡も放射能も必然的なPCRも要しない、低ノイズの肉眼的な物理的試験により少数の分子(典型的には1〜1000)で行える。
検出方法は、限定された実験経験のみを有する者により行うことができる。
試薬に応じて、本発明の2つの実施法(方式Xおよび方式Y)が試薬を固定する少数の反応の低ノイズ肉眼検出のために使用できる。
本発明のいわゆるX方式の実施において、生じた特異的反応の数の試験は蛍光技術により直接得られ、本発明の一部態様では反応した部位の数を個別に確認することを可能にする。この場合に、高度に特異的な表面は非常に低い蛍光レベルを有するようにしておくことが有利である。特に、支持体は低い蛍光を有しているべきである。
蛍光試薬を固定した後、おそらく少数のつなぎとめ反応の検出および計数は広い開口数のレンズを用いて蛍光光学顕微鏡で有利に行うことができ、固定された蛍光分子の数を目で直接またはシグナル捕捉後に確認することが可能である。
固定視野のみよりも大きな表面を探査するために観察の視野の走査を有利に行うことが可能である。
本発明のいわゆるY方式の実施では、ビーズタイプ(例えば、蛍光、磁気、着色)肉眼的試薬が検出される。
このような技術は、反応がマイクロビーズの存在または不存在により顕在化されるという意味で、Manning et alに由来している。一態様において、新たな方法は
(i)特異的反応性を有するビーズの使用
(ii)大きさがナノ範囲ではなく、0.1〜200μm範囲に位置する、肉眼的技術により検出できるビーズの使用、および
(iii)本発明による生成物の使用によるビーズと表面との非特異的反応の不存在からなる。
次いで、各々が固定反応を特徴付けるこれら肉眼的ビーズの数が肉眼的な物理的方法により調べられる。限定することを意図するものではなく、その中ではビーズ上における光の拡散、ビーズの光学顕微鏡および蛍光が挙げられる。
ある生体反応の特異性は制限される。このため、ハイブリッド形成の枠組み内で、ハイブリッドは不完全(他の部位との反応)であり、対合数の減少とひいては結合性質の低下を起こすことがある。本発明は得られる結合性質を試験する段階の使用可能性もカバーしている。この試験では、特に吸着、疎水力、不完全水素結合、不完全ハイブリッド形成により弱く非特異的に対合した生成物を解離させることを可能にする。
その結果、本発明は、上記のような検出またはアッセイ法において、生物活性を有する分子とサンプル分子との反応産物が検出前にミスマッチ(mismatch)を壊すためにストレスに付される方法にも関する。
この方法では、ミスマッチペアを壊す可能性に加えて、測定または観察を容易にするカップリング産物を配向させる可能性も提供する。
このため、相補的要素の結合後、
-遠心
-磁気化しうるまたは磁気マイクロビーズを含有するようにさせた非蛍光試薬に適用される磁場の勾配
-撹拌
-液流
-メニスカス通過
-電気泳動
-温度差および/または温度勾配
の単独または組合せ使用からなるストレスを表面に適用することが可能である。
次いで一体性を維持したまたは壊れるようになった系の数が、下記低ノイズ検出技術により調べられる。
本発明による表面を用いて、特にDNA上において空気/水メニスカスの通過により少くとも1箇所でそれらの結合後に分子を配向させることが可能なことに留意すべきである。このため、表面上に固定されたDNAについて溶液中における空気/水メニスカスの通過で固定分子の均一な伸長を起こすことが観察された。それらはこの場合に長い蛍光ロッドの形で開放空気中に出現する。これらの長い分子は開放空気中で安定であり、見掛け上の分解を示さずに数週間後でも観察できる。
これらの顕著で予想外な観察は、表面に固定されたDNA分子の数を計測できる可能性を示唆しており、一方で表面は高度に蛍光性でないためシグナル/ノイズ(S/N)比は良好であり、他方で高度に相関した対象(ロッド形状)を探すためにS/N比を増加させることが非常に容易である。即ち、特別な空間的相関を有しない不均一性、ダストを無視するためである。溶液中で、ランダムコイル形状の分子は熱的にゆらいでいるため、一般的に視野の浅いところで集められたそれらの蛍光シグナルについて非常に高いバリエーションを生じ、それらの観察を制限してしまうことに注目すべきである。本発明は、この整列および固定技術もカバーしており、したがって非常に高いS/N比で単離された分子の観察を行える。
この比率は固定された分子の数と無関係であることが注目される。1分子の検出により示されたS/N比は、10,000に関する場合と同様である。更に、この伸長技術は様々な長さの分子間で容易に識別することを可能にする。
S/N比を更に改善するために、有利には下記段階に進むことが可能である:
-分子は定着されて、その蛍光シグナルは積分することができる。
-顕微鏡観察では減少した視野を与える(×100液浸レンズで典型的には100×100μm、N.A.=1.25)。1cm2サンプルの場合には、走査が行われるか、または高い開口数の低倍率レンズ(×10または×20)の使用を考えることが可能である。
-ロッドはいつも平行であるため、S/N比を更に増加させるために光学空間的ロ過法を考えることが可能である。
-他のグローバルな蛍光法も考えられる(EP # 103426)。
-分子の直線化は化学的つなぎとめ(C=C)の枠組み内および免疫タイプ結合(DIG/抗DIG)の場合の双方で観察される。
-表面が開放空気中にあると、DNA分子は安定(それらは数週間後でもそれらの一体性を維持している)かつ蛍光性である。この性質は、この検出が例えば制限する意味ではなく蛍光顕微鏡で行われるならば、固定段階および固定られた分子の位置決め/計数段階を延期するために有利に用いることができる。このような使用は本発明によりカバーされる。
-二重(またはマルチ)蛍光技術は、S/N比を改善するために、あるいは二重またはマルチ官能化を検出するために、可能ならば用いることができる。
-特に油/水または水/界面活性剤/空気のような他の系に分子を伸長させるために、ここで用いられる空気/水メニスカスを延長させることが可能である。
1以上の連続方向での電気泳動またはフローにより、一端で固定された溶液中にある分子の動的配向を用いることが可能である。このため、所定方向に対応した蛍光シグナルの時間的バリエーションの分析により(例えば、制限する意味ではなく、観察される分子のある配向に優先的シグナルを与える適切に配列された光学空間的フィルターを用いることにより)、所定方向で分子の存在の同調的検出を行うことがこのような技術により可能である。
しかしながら、観察された結果は、この技術がその最も簡単なバージョンのとき(同調的検出なしに単一方向に伸長させる)メニスカスの使用よりもかなり効率が低いことを示している。
本発明で記載された表面および/または試薬および/または検出技術は多数の適用例で使用でき、その中には、限定することを意味するものではなく、以下のものがある:
-病原体の診断または遺伝子マッピングについて有利に使用できるDNAまたはRNAの配列決定のための1以上の要素の同定
-遺伝子マッピングについて有利に使用できるDNA断片のサイズの測定
-少数(おそらく1000以下)の免疫反応を検出できる可能性を有したELISA技術の感度の改善
DNA/RNA配列の同定は、最初にDNA/RNA分子を相補的プローブと溶液容量中で反応させることにより(例えば、ハイブリッド形成によりまたは望ましいセグメントに特異的なタンパク質により)行える。2つの操作がこの場合に可能である。
以下の記載は、一部、添付図面を参考にして行われる:
-図1は、つなぎとめ分子とのハイブリッド形成による蛍光DNA分子での病原体の検出について概略的に表している。
-図2は、マーカーDNAを用いたDNAの伸長による遺伝子マッピングについて概略的に表している。
-図3は、反応マーカーとして用いられる蛍光DNA、“フラッグ”分子による免疫反応(ELISA)の検出について概略的に表している。
-図4は、メニスカスの進行によるλファージDNAの伸長について示した蛍光顕微鏡写真であり、メニスカスに平行な蒸発流により伸長された溶液中のDNA分子は左側にみられ、メニスカスに垂直に伸長された後における開放空気中のDNA分子は右側にみられる。
-図5(a)および5(b)は抗DIGでコートされた表面上でジゴキシゲニン(DIG)で標識されてメニスカスにより伸長されたDNAと、コントロールとして抗DIG表面上の未標識DNAと各々示した蛍光顕微鏡写真であり、表面の非常に高い特異性と非特異的つなぎとめの不存在が注目される。
-図6はNUNCのような慣用的市販表面を示した蛍光顕微鏡写真であり、単一分子の蛍光検出に用いることをこれらの表面で不可能にさせる非常に高い蛍光不均一性に注目すべきである。
“診断”方式において、プローブ(“アンカー(固定)”)は(例えば、固定部位として抗DIG抗体またはストレプトアビジンを有する)本発明による表面に特異的に固定することができる反応基(DIG、ビオチンなど)を有している。固定反応の検出は、蛍光分子(臭化エチジウム、YOYO、蛍光ヌクレオチド)により染色されたDNA分子の蛍光の検出により直接行える(図1)。それは(例えばハイブリッド形成、タンパク質-DNA相互作用などにより)DNA/RNA分子に結合できるが、プローブの固定部位に親和性を有しない本発明による試薬、“フラッグ分子”に検出により間接的に行うこともできる。
“マッピング”方式において、相補的プローブは本発明による蛍光試薬と直接カップリングすることができる。例えば、蛍光性となるように修飾された塩基を有する単一相補的DNA鎖、あるいは発蛍光団Aで染色されて望ましい配列と相補的な一本鎖セグメントで終わる長い二本DNA鎖がある。異なるプローブの場合には、異なる色の発蛍光団も用いてよい。プローブが異なる色の発蛍光団とハイブリッド形成したDNA分子を有利に染色することも可能である。DNA-プローブハイブリッドはその末端の一方に固定され、上記方法の1つにより伸長される。固定点からハイブリッド形成箇所までのまたはハイブリッド形成箇所間の距離は、上記方法によりプローブの蛍光を検出することにより調べられる(図2)。
例えば、限定する意味ではなく、望ましい遺伝子に相補的な一本鎖セグメントをその末端の一方に有した約3000塩基対のマーカーDNAは、発蛍光団A(例えばYOYO1)で染色される。このDNAはハイブリッド形成され、その後マッピングされる一本鎖DNAと結合され、次いで後者は(それを二本鎖DNAに変換するためランダムプライミングにより反応させた後)第二発蛍光団B(POPO1)で染色される。次いで分子はその末端の1つで(例えばDIG/抗DIG結合により)固定され、メニスカスの作用で伸長される。二重蛍光顕微鏡(2つのカラーAおよびB)で観察できる、分子の端部と標識遺伝子の位置との距離から、1000塩基対程度(0.3μm)の精度で望ましい遺伝子の位置を確認することができる。
DNA/RNA配列の同定は、望ましい配列と本発明による表面の反応部位(例えば、相補的オリゴヌクレオチドまたは望ましいセグメントに特異的なタンパク質の反応部位)との反応により行うこともできる。固定反応の検出は、この場合に、上記のように直接的にまたは間接的に(“フラッグ分子”による)行うことができる。
本発明によるDNA/RNA配列の同定は、診断目的(例えば、ウイルスまたは染色体病原体の存在または不在の検出)および遺伝子マッピング目的の双方に役立つことがよく理解される。それはいずれかの方法により増幅段階、特にPCRの前に行える。
更に、K.R.Allan et al(US 84 114)で言及されたように、遺伝子マッピングはDNA断片のサイズを測定することにより行える。今後は、本発明による表面と上記分子を伸長させる新規技術(特に有利には、メニスカスによる伸長)との組み合わせから、伸長分子の長さを測定することができ、これは非常に小さなサンプル(数千分の1の分子)の場合である。
例えば、制限する意味ではなく、下記の手法でその方法を実施することが可能である:
DNAサンプルは(制限酵素により)断片化され、発蛍光団で染色され、その後反応基を有する表面(例えば、C=C表面)上に固定される。次いで分子はメニスカスにより伸長され、伸長された断片のサイズは最大サイズで1000bp程度(0.3μm)の解像度のある蛍光光学顕微鏡観察で調べられる。
本発明による表面では、抗原または抗体の検出および/または定量を行う公知の方法、特に酵素系を用いるELISA法または放射能マーカーを用いるRIAタイプ法を行うことができる。これらの技術は詳細には記載しない。
ELISA試薬の1つに本発明による試薬(“フラッグ”)を固定する段階を有したELISA法の免疫反応用の支持体として本発明による表面を用いることも可能かつ有利である(図3)。検出は当然ながら蛍光の測定によりグローバルに行える。反応の数を計測することも可能であり、これは本発明で記載された検出方法に従い、特にメニスカスによる伸長で有利に行われるが、これは本発明の生成物の低レベルの蛍光および非特異的相互作用のためである。これにより優れたS/N比でおそらく1000以下の少数の反応を検出できる。
したがって、本発明による試薬、例えばストレプトアビジンにつなぎとめられた蛍光DNAを表面上に固定化させることは、サンドイッチELISA法(抗体-抗原-修飾抗体、例えばビオチニル化)にわずかな修正を加えると可能である。
ELISA技術のすべての変法がかなり良い感度で適用できる。グローバルな蛍光測定のための技術は、ELISA反応の質を調べるために既に用いられている。しかしながら、本発明による方法では単一分子からの蛍光シグナルに感受性であるためもっと良い検出を行える。
勿論、生物学的対象の反応の少くとも1つの産物、例えば限定する意味ではなく、PCRまたは関連方法のような増幅反応の産物の結合用表面としてこれらの表面を用いることが可能であり、最後にプレパラティブまたは検出用のようなアフィニティクロマトグラフィー用の支持体としてこのタイプの表面を用いることが可能である。
この場合には、例えば、クロマトグラフィーカラムの固定相を構成するシリカビーズ上に所定集団のオリゴヌクレオチドを固定化することが可能である。
クロマトグラフィー段階では、溶離剤、例えば一部が相補的配列またはグラフト化オリゴヌクレオチドに非常に近い配列を有したDNA混合物についてカラムに特徴的な特異性を与えておくべきである。
本発明は、最後に、診断または分離キットでの本発明による表面の使用に関する。
本発明の他の特徴および利点は下記例から明らかになる。
物質および方法
λDNAおよびモノクローナル抗体(抗DIG)はBoehringer-Mannheimから得た。トリクロロシランはRoth-Sochielから得た。蛍光核酸プローブ(YOYO1、YOYO3およびPOPO1)はMolecular Probeから得た。超清浄ガラスカバースリップはErie Scientific(ESCO)カバースリップから得た。磁気粒子はDynalから得た。顕微鏡はNIKKONのDiaphot逆相顕微鏡であり、エピ蛍光のためにキセノンランプと視覚化のためにHamamatsu増感CCDカメラを備えている。
表面処理
ガラスカバースリップを(オゾンの形成により)酸素雰囲気下でUV照射により1時間かけて清浄化させる。次いでそれらをアルゴン流で微量の水が予めパージされたデシケーター中に直ちに入れる。容量約100〜500μlの適切なトリクロロシラン(H2C=CH-(CH2)N-SiCl3)をデシケーター中に導入し、そこから表面を約12時間(n=6)または1時間(n=1)後に除去する。取出し後、表面は清潔で非湿潤である。
こうして官能化されたカバースリップはタンパク質と反応できる。容量300μlのタンパク質(プロテインA、ストレプトアビジンなど)の水溶液(20μg/ml)を(H2C=CH-)基で官能化されたカバースリップに沈着させる。このカバースリップを室温で約2時間インキュベートし、その後超純水で3回すすぐ。こうして処理された表面は清潔で湿潤している。プロテインAで処理された表面は、抗体20μg/mlの溶液中でインキュベートすることにより、抗体、例えば抗DIG抗体と反応させることができる。
二重結合表面上への天然DNAの固定
様々な濃度で異なる緩衝液中の蛍光標識λDNA溶液(YOYO1、POPO1またはYOYO3、但し特異的末端標識なし)1滴2μl(分子総数<107)を前処理カバースリップ(H2C=CH)上に沈着させ、未処理ガラスカバースリップ(径15mm)でカバーする。プレパレーションを水蒸気で飽和させた雰囲気中室温で約1時間インキュベートする。0.05M MES緩衝液(pH=5.5)では、DNA分子の事実上全般的な固定が観察される。逆に、0.01M Tris緩衝液(pH=8)では、固定された分子は実際上ない(比率>106)。この依存性から、pHで(DNAに関する)表面の活性化/不活化をコントロールすることができる。
メニスカスの作用による固定の検出
先のプレパレーションを乾燥雰囲気に移すことにより、溶液は蒸発で表面上に固定されたDNA分子をメニスカスに垂直に伸長させる。DNA分子の毛管力(数十のピコニュートン)は分子を完全に伸長させる上で実際に十分であるが(エントロピー弾性力よりも大きい)、分子の末端と処理表面との結合を壊すには弱すぎる。蛍光標識されたDNA、伸長分子(全長約22μm)は個別に容易に観察できる。表面とDNAとの固定は末端に制限されているため、λファージ、YACまたはE.coliのDNAを伸長させることが可能であった(全長400μm以上)。伸長された蛍光性の開放空気中にあるこのDNAプレパレーションは数日間安定であり、エピ蛍光(×100レンズのNikkon Diaphot逆相顕微鏡、O.N.:1.25)により非分解的方法で観察することができる。
電気泳動による固定の検出
電気泳動セルを処理カバースリップと未処理ガラスカバースリップとの間にはさまれたパラフィンリング(厚さ約100μm)により形成し、両者の間には2本の白金電極を挿入する。そのアセンブリーはパラフィンリングを簡単に溶融することにより一緒にしっかりと保つ。DNA溶液はパラフィンリングに残された2つの開口部から毛管現象によりこのセル中に導入し、その後パラフィンにある双方の開口部を密閉する。インキュベートを室温で上記のように行う。2本の白金電極間で低電圧(数ボルト)をかけると、遊離DNA分子の移動(1秒間当たり数十分の1μ)と固定分子の流れの方向への伸長が蛍光により観察され、こうしてエピ蛍光顕微鏡測定により容易かつ個別に同定できる。
特異的固定および検出
特異的モノクローナル抗体で上記のように表面を処理することにより、それらの特異性を非常に正確にコントロールすることができる。このため、抗DIG処理表面の特異性は、Cos末端の一方に相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成してジゴキシゲニン基(DIG)を有したλDNAと、非ハイブリッド形成DNAに関して試験した。第一の場合に、固定分子の事実上全般的な伸長がメニスカスの作用により観察された。第二の場合では、わずかな固定DNA分子(<10)だけが全サンプルで観察された。したがって、本発明による方法の特異性は106以上であると評価される。
検出の感度
メニスカスの伸長により検出方法の感度を調べるために、全部で105、104および1000分子を含有した0.05M MES(pH=5.5)中λDNAの溶液2.5μlを二重結合表面上に沈着させた。固定は上記のように行う。次いでカバースリップは、固定分子の密度を調べるために、エピ蛍光顕微鏡で観察する。後者は実際に評価すると、全部で105DNA分子について視野(100×100μm)当たり約4〜6DNA分子に相当する。最低濃度のときには、メニスカスの作用により伸長された約10分子を観察することができた。この数は全サンプルをカバーする上で必要な多数の視野により本質的に制限され(約25,000)、マニュアルサーチを困難にするが、それはもっと弱いレンズで、但しより大きな視野で自動的に有利に行える。結論として、本発明による方法の感度だと1000DNA分子以下の検出および個別的計測を行える。
Claims (52)
- ある反応条件下で生物活性を有する一のタイプの分子と親和性を有するエチレン性二重結合をもつ露出基を層の外側に有する有機化合物からなる少くとも1つの本質的にコンパクトな層を表面に有する支持体を含み、層の他の要素が上記反応条件下で上記分子と本質的に接近できないことを特徴とする、生物反応について高度に特異的な表面。
- 支持体が固体支持体である、請求項1に記載の表面。
- 露出基がビニル基である、請求項1または2に記載の高度に特異的な表面。
- エチレン性二重結合をもつポリマーの表面に露出基を形成する少くとも一のモノマーの重合、支持体上でのポリマーの沈着、または上記基を形成するためのポリマーの表面の部分的脱重合により得られる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の表面。
- ポリマーがポリオレフィンまたはポリエン誘導体である、請求項4に記載の表面。
- -支持体上に、少くとも
・支持体に親和性を有する結合基、および
・結合条件下で上記支持体および上記結合基に親和性をほとんどまたは全く有しないが、一のタイプの生体分子と親和性を有する、エチレン性二重結合をもつ露出基
を有する長い構造の有機化合物の実質的に単分子で、かつコンパクトな層
を有する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の高度に特異的な表面。 - 結合が非共有タイプである、請求項6に記載の表面。
- 結合が親水性または疎水性相互作用により行われる、請求項7に記載の表面。
- 生体分子を媒体のpHまたはイオン含有率のある条件下において表面上で吸着により直接固定することができる、請求項8に記載の表面。
- 結合基が疎水結合を有するようにアルキルおよびハロゲン化アルキル基から選択される、請求項6〜9のいずれか一項に記載の表面。
- 結合基が-CH3、-CF3、-CH2F、-CHF2から選択される、請求項10に記載の表面。
- 結合が共有タイプである、請求項6に記載の表面。
- 有機化合物が架橋を形成するために露出基以外で互いに反応することができる、請求項1〜12のいずれか一項に記載の表面。
- 有機化合物が一端に結合基および他端に露出基を有する、請求項6〜13のいずれか一項に記載の表面。
- 結合基が金属アルコキシドタイプ、例えばシラン、クロロシラン、メトキシシランおよびエトキシシラン、シラノール、シラザン、ホスフェート、ヒドロキシル、ヒドラジド、ヒドラジン、アミン、アミド、ジアゾニウム、ピリジン、サルフェート、スルホネート、カルボキレート、ボロネート、ハロゲン、酸ハライド、アルデヒドタイプの基から選択される、請求項6〜14のいずれか一項に記載の表面。
- 結合基がモノ、ジまたはトリクロロシラン、モノ、ジまたはトリエトキシシランおよびモノ、ジまたはトリメトキシシランのようなシランから選択される、請求項15に記載の表面。
- 露出基が結合基に直接、または少くとも1つの炭素原子、好ましくは3〜30の原子により連結されている、請求項1〜16のいずれか一項に記載の表面。
- 支持体が、少くとも表面で、ポリマー、金属または酸化金属、半導体元素、半導体元素の酸化物、特に酸化ケイ素、あるいはそれらの組合せからなる、請求項1〜17のいずれか一項に記載の表面。
- 支持体が少くとも表面でガラスおよびシリカからなる、請求項1〜18のいずれか一項に記載の表面。
- 支持体がプレート、ビーズ、繊維または粒子の形態である、請求項1〜19のいずれか一項に記載の表面。
- 粒子が磁気、蛍光または着色を有する、請求項20に記載の表面。
- 生物活性を有する分子が
-タンパク質
-核酸
-脂質
-多糖およびその誘導体
から選択される、請求項1〜20のいずれか一項に記載の表面。 - 生物活性を有する分子が生物活性を有する化学化合物である、請求項1〜22のいずれか一項に記載の表面。
- 生物活性を有する分子が
-タンパク質
-DNA
-RNAおよびその誘導体
から選択される、請求項1〜23のいずれか一項に記載の表面。 - 生物活性を有する分子が
-抗体
-抗原
-DNAおよびRNA
-リガンドまたはそれらのレセプターと、その誘導体
から選択される、請求項24に記載の表面。 - 請求項1〜25のいずれか一項に記載された生物学的反応について高度に特異的な表面を作製する方法であって、
-・支持体に親和性を有する結合基、および
・結合条件下で上記支持体および上記結合基に親和性をほとんどまたは全く有しないが、生物活性を有する一のタイプの分子と親和性を有する露出基
を少くとも有した長い構造の有機化合物の実質的に単分子で、かつ本質的にコンパクトな層
を固体支持体上に結合することを特徴とする方法。 - 生物活性を有する分子でコートされた表面であって、
請求項1〜25のいずれか一項に記載された生物学的反応について高度に特異的な表面を有し、その上に生物活性のある上記分子が結合されていることを特徴とする表面。 - 生物活性を有する分子が
-タンパク質
-核酸
-脂質
-多糖およびその誘導体
から選択される、請求項27に記載の表面。 - 結合されたDNAがサンプルから単離されるDNA配列と相補的な配列を含んでいる、請求項28に記載の表面。
- 結合されたタンパク質がサンプルから単離されるタンパク質を特異的に認識し、かつそれに結合することができる、請求項28に記載の表面。
- 生物活性を有する分子がビオチン、アビジン、ストレプトアビジンまたはそれらの誘導体から選択される、請求項28または29に記載の表面。
- 請求項1〜25および27〜31のいずれか一項に記載された表面を用いてDNAまたはRNAの存在を確認する方法。
- 請求項1〜25および27〜31のいずれか一項に記載された表面を用いてタンパク質または抗体の存在を確認する方法。
- サンプル中で生物活性を有する分子を検出および/またはアッセイする方法であって、
サンプル分子を認識できる生物活性を有する分子が結合されている請求項27〜31のいずれか一項に記載された表面が用いられ、かつ結合された分子の存在を検出する検出またはアッセイが試薬、蛍光またはその他を用いて行われることを特徴とする方法。 - 表面が低い蛍光を有し、かつ試薬が蛍光性である、請求項34に記載の方法。
- 試薬がビーズからなる、請求項35に記載の方法。
- 検出が顕微鏡で行われる、請求項34〜36のいずれか一項に記載の方法。
- 生物活性を有する分子とサンプル分子との反応産物が検出前にミスマッチを壊すようにストレスに付される、請求項34〜37のいずれか一項に記載の方法。
- サンプル中でDNA配列またはタンパク質を検出する方法であって、-請求項1〜25および27〜31のいずれか一項に記載された高度に特異的な表面が用いられ、-サンプルがDNA/DNA、DNA/RNAまたはタンパク質/タンパク質
ハイブリッドを形成するための条件下で表面と接触され、
-ハイブリッドが標識されたら、分子を配向させるために、および配向された分子の測定または観察を行うために物理化学的手段により伸長される
ことを特徴とする方法。 - ハイブリッドまたは反応産物が伸長方向におけるメニスカスの通過により伸長される、請求項38または39に記載の方法。
- メニスカスが空気/水メニスカスである、請求項40に記載の方法。
- 伸長が分子に作用する電場あるいは磁気化しうるまたは磁気粒子に作用する磁場により行われる、請求項38または39に記載の方法。
- 伸長が機械的に行われる、請求項38または39に記載の方法。
- 結合DNAおよびサンプルDNAが別々に“着色”され、伸長後にサンプルDNAの末端に対する相補的配列の位置が測定される、請求項38〜43のいずれか一項に記載の方法。
- 遺伝子のマッピングに関する、請求項44に記載の方法。
- ELISAまたはRIA法である、請求項44または45に記載の方法。
- サンプルが核酸増幅の産物である、請求項44または45に記載の方法。
- 二重結合を有する表面に核酸またはタンパク質を結合させる方法であって、
固定が、DNAまたはタンパク質の吸着によって、特に一端において既定pH領域でDNAまたはタンパク質を表面と接触させることによって、実施されることを特徴とする方法。 - DNAが8以下のpHで表面と接触させられる、請求項48に記載のエチレン性二重結合のある基を有した表面にDNAを結合させる方法。
- 反応が5〜6のpHで行われ、その後pH8で停止される、請求項49に記載の結合方法。
- 請求項1〜25および27〜31のいずれか一項に記載された少くとも一の高度に特異的な表面を含むことを特徴とする、診断キット。
- 蛍光試薬またはビーズ含有試薬を更に含む、請求項51に記載の診断キット。
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