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Die Erfindung betrifft ein Verfahren
zur Ausrichtung von Makromolekülen,
wie Polymeren, oder Makromolekülen
mit biologischer Aktivität,
insbesondere DNA, oder Proteinen. Die Erfindung betrifft gleichfalls
die Anwendung dieser Methode in Verfahren zum Nachweis, zur Messung
des intramolekularen Abstands, zur Trennung und/oder zur quantitativen
Bestimmung eines Makromoleküls
in einer Probe.
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Die Konformation von Makromolekülen zu kontrollieren,
stellt einen bedeutenden industriellen Einsatz dar, beispielsweise
bei der Herstellung von Fängermolekülen oder
kontrollierten Molekülzusammenlagerungen
oder ferner bei Nachweis- und Analyseproblemen. Es kann interessant
sein, über
eine langgestreckte Molekülkonformation
zu verfügen.
Als Beispiel wurde in dem Falle, wo Polymere auf ein Substrat aufgepfropft
sind, vorgeschlagen, diese durch Einwirkung eines elektrischen Felds,
eine Strömung
oder mit Hilfe von optischen Zangen zu strecken. Insbesondere auf
dem Gebiet der Biologie eröffnet
die Ausrichtung von DNA – durch
Elektrophorese (Zimmerman und Cox, Nucl. Acid Res. 22, S. 492, 1994),
freie Strömung
(Parra und Windle, Nature Genetics, 5, S. 17, 1993 und WO 93/22463)
oder in einem Gel (Schwartz et al., Science 262, S. 110, 1993, und
U.S.-Patent 33531) oder mit Hilfe von optischen Zangen (Perkins
et al., Science 264, S. 819, 1994, und auch U.S.-Patent 5079169)
zahlreiche Möglichkeiten
bei der Kartierung oder beim Nachweis von Pathogenen.
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Diese Methoden erlauben im allgemeinen
lediglich eine unvollkommene oder ferner vorübergehende Ausrichtung – d. h.,
dass eine Relaxation des Moleküls
auftritt, sobald der äußere Zwang
verschwunden ist. In dem Falle von optischen Zangen ist die Methode
schwerfällig,
auf ein einziges Molekül
zu einem Zeitpunkt beschränkt
und durch nicht qualifiziertes Personal schwierig auszuführen.
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Es wurde eine besondere Technik zur
Ausrichtung von DNA durch Strömung
nach einer Zelllyse, dann Trocknung, vorgeschlagen (I. Parra und
B. Windle und WO 93/22463). Die erhaltene Ausrichtung ist sehr unvollkom men
und inhomogen und es werden zahlreiche, nicht ausgerichtete Bündel oder Knäuel beobachtet.
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Die Erfindung hat ein originäres und
einfaches Verfahren zur Ausrichtung von Makromolekülen auf
der Oberfläche
S eines Trägers
zum Gegenstand, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man auf
der Oberfläche
S die Tripel-Linie S/A/B/ (Meniskus), welche aus dem Kontakt eines
Lösemittels
A mit der Oberfläche
S und einem Medium B resultiert, sich verschieben lässt, wobei
die Makromoleküle
einen Abschnitt, insbesondere ein Ende, haben, der auf der Oberfläche S verankert
ist, wobei der andere Abschnitt, insbesondere das andere Ende, sich
in Lösung
in dem Lösemittel
A befindet.
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Es wurde gemäß der Erfindung beobachtet, dass
allein die Passage eines Meniskus über Moleküle, von denen ein Abschnitt
auf einem Substrat verankert ist, wobei der Rest des Moleküls frei
in Lösung verbleibt,
es erlaubt, diese gleichförmig
senkrecht zu dem in Bewegung befindlichen Meniskus auszurichten,
wobei diese adsorbiert auf der Oberfläche hinter dem Meniskus verbleiben.
Dieses Phänomen
wird hier als "Molekülkämmen" ("peignage moleculaire") bezeichnet.
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Genauer erfolgt das Strecken des
freien Abschnitts des Moleküls
durch die Passsage der Tripel-Linie S/A/B, welche den Meniskus zwischen
der Oberfläche
S, dem Lösemittel
A und einem Medium B, welches ein Gas (im allgemeinen Luft) oder
ein anderes Lösemittel
sein kann, bildet.
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In einer besonderen Ausführungsweise
ist der Meniskus ein Wasser-Luft-Meniskus,
d. h. dass das Lösemittel
A eine wässrige
Lösung
ist und das Medium B Luft ist.
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Außerdem ist es möglich, den
Luft/Wasser-Meniskus, der hier eingesetzt wird, um das Molekül zu strecken,
um andere Systeme, wie insbesondere Öl/Wasser oder Wasser/Tensid/Luft,
zu erweitern.
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Die Verschiebung des Meniskus kann
durch ein jegliches Mittel zur Verschiebung bezüglich der Fluide A und B bezogen
auf die Oberfläche
S erfolgen. In einer Ausführungsweise
kann die Oberfläche S
von dem Lö semittel
A zurückgezogen
werden oder umgekehrt, das Lösemittel
A kann von der Oberfläche
S zurückgezogen
werden.
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Der Meniskus kann insbesondere mit
Hilfe eines mechanischen, insbesondere pneumatischen Mittels, indem
ein Gas angesaugt oder abgeblasen wird, oder insbesondere hydraulischen
Mittels, indem das Lösemittel
A oder das Medium B nach vorne gedrückt oder angesaugt wird, verschoben
werden.
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So kann die Verschiebung des Meniskus durch
fortschreitende Verdampfung des Lösemittels A erfolgen.
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Wenn die Verschiebung des Meniskus
auf mechanischem Wege erfolgt, kann sie entweder durch Parallelverschiebung
der Grenzfläche
A/B oder durch Parallelverschiebung der Oberfläche S erfolgen.
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In einer besonderen Ausführungsweise
wird das Lösemittel
zwischen zwei Trägern
plaziert, von denen wenigstens einer dem Träger mit der Oberfläche S entspricht,
und der Meniskus wird beispielsweise durch Verdampfung verschoben.
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Man versteht hier unter "Träger" ein jegliches Substrat,
dessen Zusammenhalt ausreichend ist, um der Passage des Meniskus
zu widerstehen.
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Der Träger kann wenigstens an der
Oberfläche
aus einem organischen oder anorganischen Polymer, einem Metall,
insbesondere Gold, einem Metalloxid oder -sulfid, einem Halbleiterelement
oder einem Halbleiterelementoxid, wie einem Oxid von Silicium, oder
einer Kombination von diesen, wie Glas oder einer Keramik, gebildet
werden.
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Man kann insbesondere Glas, an der
Oberfläche
oxidiertes Silicium, Graphit, Glimmer und Molybdänsulfid aufführen.
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Als "Träger" kann man einen einzigen
Träger,
wie einen Streifen, Kugeln, insbesondere aus Polymer, aber auch
irgendwelche Formen, wie Stäbe,
Fasern oder einen strukturierten Träger, und gleichfalls Teilchen,
unabhängig
davon, ob es sich um Pulver handelt, insbesondere Siliciumdioxidpulver,
die außerdem
magnetisch, fluoreszierend gemacht oder gefärbt sein können, wie dies im Bereich der
verschiedenen Techniken der quantitativen Bestimmung bekannt ist,
einsetzen.
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Der Träger liegt vorteilhafterweise
in Form von Platten vor. Der Träger
weist vorzugsweise lediglich wenig oder gar keine Fluoreszenz auf.
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Makromoleküle, wie irgendwelche Polymere, oder
biologische Polymere, wie DNA, DNA oder Proteine, können durch
irgendwie geartete Methoden auf einem Träger verankert werden.
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Das auszurichtende Makromolekül kann unter
den biologischen Makromolekülen,
wie den Proteinen, insbesondere den Antikörpern, Antigenen, Liganden
oder deren Rezeptoren, den Nukleinsäuren, DNA, DNA oder PNA, den
Lipiden, den Polysacchariden und deren Derivaten, ausgewählt werden.
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Es wurde gemäß der Erfindung beobachtet, dass
die Streckkraft örtlich
in der unmittelbaren Umgebung des Meniskus wirkt. Sie ist unabhängig von der
Länge des
Moleküls,
der Anzahl von verankerten Molekülen
und, in einem breiten Bereich, von der Geschwindigkeit des Meniskus.
Diese Merkmale sind besonders interessant, um die Moleküle auf homogene
und reproduzierbare Weise auszurichten.
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Man kann gemäß der Erfindung grenzflächenaktive
Elemente dem Lösemittel
A und/oder dem Medium B zusetzen, die die Eigenschaften der Grenzflächen modifizieren
werden. Gemäß der Erfindung
kann das Strecken tatsächlich
durch die Zugabe von grenzflächenaktiven
Mitteln oder Tensiden oder durch eine adäquate Oberflächenbehandlung kontrolliert
werden.
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Eine zu große Anziehung zwischen Oberfläche und
Makromolekül
(beispielsweise ein zu hohes Adsorptionsniveau) kann die Ausrichtung
der Moleküle
durch den Meniskus behindern, indem diese an der Oberfläche in einem
Zustand, welcher nicht notwendigerweise gestreckt ist, adsorbiert
bleiben. Die Oberfläche
weist vorzugsweise einen geringen Adsorptionsgrad bezogen auf das
Makromolekül
auf derart, dass allein die verankerten Moleküle ausgerichtet werden, wobei
die anderen durch den Meniskus mitgerissen werden.
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Indessen kann man mit den Adsorptionsunterschieden
zwischen einem Abschnitt des Makromoleküls, insbesondere dessen Enden,
und dessen anderen Abschnitten (insbesondere für lange Moleküle, wie
DNA oder Kollagen) spielen, um durch Adsorption die Moleküle durch
einen Abschnitt, insbesondere deren Ende(n), allein, wobei der Rest
des Moleküls
frei in Lösung
verbleibt, auf einer sehr großen
Vielzahl von Oberflächen
zu verankern und diese durch Passage des Meniskus, wie zuvor beschrieben,
auszurichten.
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Die Adsorption eines Makromoleküls auf einer
Oberfläche
kann leicht mit Hilfe des pH oder des Ionengehalts des Mediums oder
einer elektrischen Spannung, mit welcher die Oberfläche beaufschlagt wird,
kontrolliert werden. Man verändert
beispielsweise die Oberflächenladungen
und die elektrostatischen Wechselwirkungen (abstoßende oder
anziehende) zwischen der Oberfläche
und dem Molekül, was
es erlaubt, von einem Zustand vollständiger Adsorption des Moleküls auf der
Oberfläche
zu einem vollständigen
Fehlen von Adsorption zu gelangen. Zwischen diesen beiden extremen
Fällen
existiert ein Spektrum von Kontrollparametern, wo die Adsorption bevorzugt
durch das Ende der Moleküle
erfolgt und welche man folglich mit Vorteil einsetzen wird, um diese
auf der Oberfläche
zu verankern und diese dann durch die Passage des Meniskus auszurichten.
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Die Moleküle, sind sie einmal ausgerichtet, haften
stark an der Oberfläche.
Im Falle von DNA konnten diese durch Fluoreszenz mehrere Monate nach
ihrer Ausrichtung beobachtet werden.
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Die Erfindung unterscheidet sich
folglich sehr stark von dem von Parra und Windle vorgeschlagenen
Verfahren, denn die Moleküle
werden gemäß der Erfindung
auf der Oberfläche
verankert, dann durch die Passage des Meniskus gleichförmig ausgerichtet,
wohingegen in dem Verfahren von Parra und Windle eine hydrodynamische
Strömung
eingesetzt wird, um die Moleküle
auf inhomogene Weise zu Strecken, die auf nicht-spezifische Weise
an der Oberfläche
adsorbieren werden.
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Andere Techniken können ebenfalls
zur Streckung und Ausrichtung von Molekülen führen. So kann eine dynamische
Orientierung von in Lösung befindlichen,
an einem Ende verankerten Molekülen durch
Elektrophorese oder durch hydraulische Strömung erhalten werden. Gleichwohl
zeigen die beobachteten Ergebnisse, dass diese Techniken viel weniger
leistungsfähig
sind als die Verwendung des Meniskus.
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Unter "Verankerung" des Makromoleküls auf der Oberfläche soll
man eine aus einer chemischen Reaktivität resultierende Anheftung ebenso
gut durch ein kovalentes Verbindungsglied wie durch ein nicht-kovalentes
Verbindungsglied, wie eine Bindung, welche aus physikalisch-chemischen
Wechselwirkungen resultiert, wie die Adsorption, wie vorstehend
beschrieben, verstehen.
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Diese Verankerung des Makromoleküls kann direkt
auf (oder mit) der Oberfläche
oder indirekt, d. h. durch das Zwischenglied eines Verbindungsglieds (Linkers),
wie eines anderen Moleküls,
insbesondere eines anderen Moleküls
mit biologischer Aktivität,
erfolgen. Wenn die Verankerung auf indirekte Weise erfolgt, kann
das Makromolekül
chemisch auf das Verbindungsglied aufgepfropft werden oder auf physikalisch-chemische Weise mit
dem Verbindungsglied wechselwirken, insbesondere wenn das zwischengeschaltete
Verbindungsglied ein Molekül
mit biologischer Aktivität
ist, welches das Makromolekül
erkennt und mit diesem wechselwirkt.
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Bei einer Ausführungsweise sind das Makromolekül und das
Verbindungsglied alle beide Moleküle mit biologischer Aktivität, die Wechselwirken,
wie Antigen bzw. Antikörper,
komplementäre
Nukleinsäuren
oder Lipide. In diesen Fällen
besteht die nicht-kovalente Anheftung des Makromoleküls in einer
Bindung vom Typ Antigen-Antikörper,
Ligand-Rezeptor, Hybridisierung
zwischen komplementären
Nukleinsäurefragmenten
oder hydrophobe oder hydrophile Wechselwirkung zwischen Lipiden.
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Man zieht so Nutzen aus der sehr
großen Spezifität und der
sehr großen
Selektivität
von bestimmten biologischen Reaktionen, insbesondere den Antigen/Antikörper-Reaktionen,
den DNA- oder DNA-Hybridisierungsreaktionen, den Inter-Protein-Reaktionen
oder Reaktionen vom Typ Avidin/ Streptavidin/Biotin ebenso wie den
Reaktionen von Liganden und von deren Rezeptoren.
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So kann man, um die direkte oder
indirekte Verankerung des Makromoleküls auf der Oberfläche S zu
bewirken, eine feste Oberfläche
einsetzen, welche bestimmte Spezifitäten aufweist. Es ist insbesondere
möglich,
bestimmte vorbehandelte Oberflächen einzusetzen,
welche es erlauben, bestimmte Proteine oder DNA, unabhängig davon,
ob sie modifiziert worden ist oder nicht, anzuheften.
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Solche Oberflächen sind (beispielsweise Covalink,
Costar, Estapor, Bangs, Dynal) in verschiedenen Formen, die auf
ihrer Oberfläche
beispielsweise COOH-, NH2- oder OH-Gruppen
aufweisen, kommerziell erhältlich.
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Man kann die DNA dann mit einer reaktiven Gruppe,
Amin zum Beispiel, funktionalisieren und eine Reaktion mit diesen
Oberflächen
vornehmen. Diese Methoden erfordern indessen eine spezielle Funktionalisierung
der anzuheftenden DNA.
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Es wurde gleichfalls eine Technik
beschrieben, die die Verankerung von DNA ohne vorab erfolgende Behandlung
erlaubt. Dieses Verfahren besteht darin, ein freies Phosphat des
5'-Endes des DNA-Moleküls mit einem
sekundären
Amin der Oberfläche
(NH-Oberfläche
Covalink) reagieren zu lassen.
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Die Verankerung durch Adsorption
kann durch Adsorption des Endes des Moleküls erfolgen, indem die Oberflächenladung
mit Hilfe des pH, des Ionengehalts des Mediums oder der Anwendung
einer elektrischen Spannung auf die Oberfläche kontrolliert wird unter
Berücksichtigung
der Adsorptionsunterschiede zwischen den Enden des Moleküls und seinem
dazwischenliegenden Abschnitt. Gemäß der Erfindung wurden auf
diese Weise beispielsweise nicht-funktionalisierte DNA-Moleküle auf Oberflächen, welche
mit Molekülen
bedeckt waren, deren Ende eine Vinyl- oder Amingruppe bildete, wie
Moleküle
von Polylysin, oder unterschiedlichen Oberflächen, wie Glas, die mit Molekülen vom
Silan-Typ, deren Ende Vinyl- oder Amingruppen bildeten, bedeckt waren,
oder ferner vorab in einem Säurebad
gereinigten Glasplättchen
verankert. In diesem letzteren Falle weist die Oberfläche des
Glases tatsächlich
SiOH-Gruppen auf.
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In allen diesen Fällen wird der pH-Bereich, innerhalb
von welchem die DNA verankert wird, so gewählt, dass er zwischen einem
Zustand vollständiger
Adsorption und einem Fehlen von Adsorption, wobei dieser Letztere
bei einem basischeren pH vorliegt, liegt. Es versteht sich, dass
diese Technik sehr allgemein ist und durch den Fachmann auf diesem Gebiet
auf sehr zahlreiche Arten von Oberflächen ausgedehnt werden kann.
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Man kann die DNA auch mit einer ersten
reaktiven Gruppe oder einem Protein P0 funktionalisieren,
um diese(s) mit einer Oberfläche,
die mit einer zweiten reaktiven Gruppe oder einem Protein P1, welche(s) in der Lage ist, jeweils spezifisch
miteinander zu reagieren, d. h. beispielsweise P1 mit
P0, bedeckt ist, reagieren zu lassen. Das
Paar P0/P1 kann
beispielsweise ein Paar vom Typ Biotin/Streptavidin (Zimmerman und
Cox) oder Digoxigenin/gegen Digoxigenin gerichteter Antikörper (anti-DIG) (Smith et al., Science
258, 1122 (1992)) sein.
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Die Verankerungsoberflächen weisen
vorzugsweise einen niedrigen Fluoreszenzgrad auf, damit sie den
Nachweis der Moleküle
nach deren Ausrichtung nicht behindern, insbesondere wenn dieser durch
Fluoreszenz erfolgt.
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Gemäß der Erfindung wird man vorzugsweise
einen festen Träger
einsetzen, welcher unter den Reaktionsbedingungen eine Oberfläche aufweist, welche
eine Affinität
für nur
einen Teil des Makromoleküls
aufweist, wobei der Rest von diesem frei in Lösung verbleibt.
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Bei einer Ausführungsweise setzt man einen festen
Träger
ein, welcher an der Oberfläche
wenigstens eine Schicht aus einer organischen Verbindung aufweist,
welche auf der Außenseite
der Schicht eine exponierte Gruppe oder Gruppierung mit einer Affinität für einen
Molekültyp
mit biologischer Aktivität,
der das Makromolekül
selbst oder ein Molekül,
welches dieses erkennt und/oder mit diesem wechselwirkt, sein kann,
präsentiert.
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Der Träger kann folglich eine Oberfläche aufweisen,
die mit einer reaktiven Gruppe oder einem Molekül mit biologischer Aktivität bedeckt
ist.
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Unter "Affinität" soll man hier ebenso eine chemische
Reaktivität
wie auch eine Adsorption irgendeiner Art, dies unter den etwaigen
Bedingungen einer Anheftung der Moleküle an die modifizierte oder nicht-modifizierte exponierte
Gruppe oder Gruppierung, verstehen.
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Bei einer Ausführungsweise ist die Oberfläche im wesentlichen
kompakt, d. h. sie begrenzt den Zugang des Makromoleküls mit biologischer
Aktivität zu
den inneren Schichten und/oder zu dem Träger, dies um die nicht-spezifischen
Wechselwirkungen zu minimieren.
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Man kann auch Oberflächen einsetzen,
welche bedeckt sind mit einer exponierten reaktiven Gruppierung
(beispielsweise NH2, COOH, OH, CHO) oder
einem Makromolekül
mit biologischer Aktivität (beispielsweise:
Proteine, wie Streptavidin oder Antikörper, Nukleinsäuren, wie
Oligonukleotide, Lipide, Polysaccharide und deren Derivate), welche
s) in der Lage ist, einen gegebenenfalls modifizierten Abschnitt
des Moleküls
anzuheften.
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Beispielsweise sind Oberflächen, die
mit Streptavidin oder einem Antikörper gemäß bekannten Verfahren ("Chemistry of Protein
Conjugation and Cross-linking",
S.C. Wong, CRC Press (1991)) bedeckt sind, in der Lage, ein Makromolekül zu binden, welches
an einer besonderen Stelle ein Biotin oder ein Antigen aufweist
bzw. präsentiert.
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Ebenso können Oberflächen, die derart behandelt
worden sind, dass sie einzelsträngige
Oligonukleotide präsentieren,
dazu dienen, daran DNA/RNA-Moleküle,
welche eine komplementäre Sequenz
aufweisen, zu verankern.
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Unter den Oberflächen, welche eine reaktive exponierte
Gruppierung umfassen, kann man jene aufführen, bei denen die exponierte
Gruppe eine Gruppierung -COOH, -CHO, -NH2,
-OH oder eine Vinylgruppe, welche eine Doppelbindung -CH=CH2 umfasst, welche als solche eingesetzt wird
oder die aktiviert werden kann, um insbesondere die Gruppen -CHO,
-COOH, -NH2 oder -OH zu ergeben, ist.
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Die Träger mit hoch spezifischen Oberflächen gemäß der Erfindung
können
durch das Ausführen
von verschiedenen Verfahren erhalten werden. Man kann als Beispiel
aufführen:
- (A) eine Schicht von kohlenstoffhaltigem, gegebenenfalls
verzweigtem Polymer mit einer Dicke von wenigstens 1 nm, welche
reaktive Gruppen, wie nachfolgend definiert, aufweist, und
- (B) Oberflächen,
welche durch Abscheidung oder Verankerung von einer oder mehreren
Molekülschichten
auf einem festen Träger
erhalten werden, wobei diese durch die Bildung von aufeinanderfolgenden
Schichten, die durch nicht-kovalente Bindungen angeheftet werden,
als nicht einschränkendes
Beispiel die Langmuir-Blodgett-Filme, oder durch selbsttätige Molekülzusammenlagerung,
wobei dies die Bildung einer durch kovalente Bindungen angehefteten
Schicht erlaubt, erhalten werden können.
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In dem ersten Falle kann die Oberfläche durch
Polymerisation von wenigstens einem Monomer, welches an der Oberfläche des
Polymers die exponierte Gruppierung erzeugt, oder ebenso durch partielle
Depolymerisation der Oberfläche
eines Polymers, um die exponierte Gruppierung zu erzeugen, oder
ferner durch Abscheidung von Polymer erhalten werden.
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In diesem Verfahren weist das gebildete
Polymer Vinylbindungen auf, wie ein Polyen-Derivat, insbesondere
Oberflächen
von Typ synthetischen Kautschuks, wie Polybutadien, Polyisopren
oder Naturkautschuk.
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In dem zweiten Falle umfasst die
hoch spezifische Oberfläche:
- – auf
einem Träger
eine im wesentlichen monomolekulare Schicht einer organischen Verbindung von
langgestreckter Struktur, welche wenigstens aufweist:
- eine Anheftungsgruppe, die eine Affinität für den Träger aufweist, und
- eine exponierte Gruppierung, die keine oder nur geringe Affinität für den Träger und
die Anheftungsgruppe unter den Anheftungsbedingungen aufweist, aber
gegebenenfalls, nach einer chemischen Modifizierung nach der Anheftung,
eine Affinität
für einen
biologischen Molekültyp
aufweist.
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Die Anheftung kann zuallererst vom
nicht-kovalenten Typ, insbesondere vom Typ hydrophil/hydrophil und
hydrophob/hydrophob, wie in den Filmen von Langmuir-Blodgett (K.
B. Blodgett, J. Am. Chem. Soc. 57, 1007 (1935), sein.
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In diesem Falle wird die exponierte
Gruppierung oder die Anheftungsgruppe, seien sie hydrophil, seien
sie hydrophob, insbesondere Alkyl- oder Halogenalkylgruppen, wie CH3, CF3, CH F3, CH2F, sein, wobei
die andere Gruppe hydrophil ist.
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Die Anheftung kann gleichfalls vom
kovalenten Typ sein; die Anheftungsgruppe wird dann auf dem Träger chemisch
reagieren.
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Bestimmte Oberflächen mit nahekommender Struktur
wurden bereits auf dem Gebiet der Elektronik erwähnt, insbesondere wenn die
Anheftungen kovalent sind, L. Netzer und J. Sagiv, J. Am. Chem. Soc.
105, 674 (1983) und US-A-4 539 061.
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Unter den Anheftungsgruppen kann
man insbesondere die Gruppierungen vom Metall- oder Halbleiteralkoxid-Typ,
beispielsweise Silan, insbesondere Chlorsilan, Silanol, Methoxy-
und Ethoxysilan, Silazan, wie auch die Phosphat-, Hydroxy-, Hydrazid-,
Hydrazin-, Amin-, Amid-, Diazonium-, Pyridin-, Sulfat-, Sulfonsäure-, Carbonsäure-, Boronsäure-, Halogen-,
Säurehalogenid-,
Aldehydgruppen aufführen.
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Als Anheftungsgruppe wird man insbesondere
bevorzugt Gruppen einsetzen, welche in der Lage sind, in Querrichtung
mit einer äquivalenten,
in der Nachbarschaft befindlichen Gruppe zu reagieren, um die quer
verlaufenden Bindungen bereitzustellen; es wird sich beispielsweise
um Derivate vom Metall- oder Halbleiteralkoxid-Typ, beispielsweise
Silan, insbesondere Dichlorsilan, Trichlorsilan, Dimethoxysilan oder
Diethoxysilan und Trimethoxy- oder Triethoxysilan, handeln.
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Die Wahl der Anheftungsgruppe wird
selbstverständlich
von der Natur des Trägers
abhängen; die
Gruppierungen vom Silan-Typ sind für die kovalente Anheftung auf
Glas und Siliciumdioxid gut angepasst.
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Was die exponierten Gruppierungen
angeht, werden diese, und unabhängig
von der Oberfläche, vorzugsweise
unter den ethylenischen, acetylenischen Gruppierungen oder aromatischen
Resten, den primären,
tertiären
oder sekundären
Aminen, den Estern, den Nitrilen, den Aldehyden, den Halogenen ausgewählt. Es
kann sich aber insbesondere um die Vinylgruppe handeln; tatsächlich kann
diese entweder nach der Anheftung chemisch modifiziert werden, um
beispielsweise zu einer Carboxylgruppe oder Derivaten von Carboxylgruppen,
wie Alkohol-, Aldehyd-, Keton-, Säure-, primären, sekundären oder tertiären Amingruppen,
zu gelangen, oder zu einer direkten pH-abhängigen Verankerung der biologischen Makromoleküle, wie
Nukleinsäuren
und Proteinen, ohne chemische Modifizierung der Oberfläche oder der
Makromoleküle
führen.
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Die Ketten, die die exponierte Gruppierung mit
der Anheftungsgruppe verbinden, sind vorzugsweise Ketten, welche
wenigstens 1 Kohlenstoffatom, vorzugsweise mehr als 6 und im allgemeinen
3 bis 30 Kohlenstoffatome umfassen.
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Was den Träger selbst betrifft, setzt
man allgemein bevorzugt Glas, an der Oberfläche oxidiertes Silicium, ein
Polymer oder Gold mit oder ohne Vorbehandlung der Oberfläche ein.
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Man kann vorteilhafterweise im Falle
von Glas oder Siliciumdioxid die bekannten Oberflächenfunktionalisierungstechniken,
welche Silanderivate einsetzen, beispielsweise: Si-OH + Cl3-Si-R-CH=CH2 liefert
Si-O-Si-R-CH=CH2, wobei R beispielsweise aus (CH2)4 besteht, einsetzen.
Eine solche Reaktion ist in der Literatur bekannt, mit einer Verwendung
von ultrareinen Lösemitteln.
Die Reaktion führt
zu einem Teppich von Molekülen,
die ihr C=C-Ende auf der Oberfläche
exponiert nach Außen
präsentieren.
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In dem Falle von Gold, wobei dieses
gegebenenfalls in Form einer dünnen
Schicht auf einem Substrat vorliegt, setzen die bekannten Techniken zur
Oberflächenfunktionalisierung
Thiolderivate, beispielsweise: Au + HS-R-CH=CH2 liefert Au-S-R-CH=CH2, wobei R beispielsweise aus (CH2)4 besteht, ein.
Eine solche Umsetzung ist in flüssigem Medium
beschrieben worden und führt,
ebenso wie die vorangegangene Trichlorsi lan-Siliciumdioxid-Reaktion,
zu einem Teppich von Molekülen,
welche ihr C=C-Ende auf der Oberfläche exponiert nach Außen präsentieren.
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Selbstverständlich umfasst die Terminologie des "Trägers" ebenso eine einzige
Oberfläche,
wie einen dünnen
Streifen, aber gleichfalls Teilchen, unabhängig davon, ob es sich um Siliciumdioxidpulver oder
Polymerkugeln handelt, und auch irgendwelche Formen, wie Stäbe, Fasern
oder einen strukturierten Träger,
die außerdem
magnetisch, fluoreszierend gemacht oder gefärbt sein können, wie dies im Rahmen der
verschiedenen Techniken der quantitativen Bestimmung bekannt ist.
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Der Träger wird vorzugsweise so ausgewählt, dass
er nicht oder nur wenig fluoreszierend ist, wenn der Nachweis durch
Fluoreszenz erfolgt.
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Die gemäß den obigen Modalitäten (A)
und (B) erhaltenen Oberflächen
weisen auf:
- (i) ein sehr geringes Ausmaß von eigener
Fluoreszenz, wenn dies erforderlich ist, einen geringeren Fluoreszenz-Hintergrund
(einer typischen Fläche von
100 × 100 μm) als das
Fluoreszenzsignal eines einzelnen nachzuweisenden Moleküls;
- (ii) die Möglichkeit,
isolierte Moleküle
mit einem S/N-Verhältnis
unabhängig
von der Anzahl von Molekülen
nachzuweisen, was dank unterschiedlicher Techniken mit hohem S/N-Verhältnis, welche
weiter unten beschrieben werden und auf der Identifizierung des
Vorhandenseins eines makroskopischen Markers, welcher eine schwache nicht-spezifische
Wechselwirkung mit der Oberfläche
aufweist, beruhen, möglich
ist.
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Die so erhaltenen Oberflächen sind
vorzugsweise mit einem Makromolekül mit biologischer Aktivität bedeckt,
das ausgewählt
ist unter:
- – den Proteinen,
- – den
Nukleinsäuren,
- – den
Lipiden,
- – den
Polysacchariden und deren Derivaten.
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Unter den Proteinen kann man die
Antigene und die Antikörper,
die Liganden, die Rezeptoren, aber gleichfalls Produkte vom Typ
Avidin oder Streptavidin wie auch die Derivate dieser Verbindungen aufführen.
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Unter den RNAs und DNAs kann man
gleichfalls die α,β-Derivate
wie auch die Thio-Derivate und die gemischten Verbindungen, wie
die PNA, aufführen.
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Man kann gleichfalls gemischte Verbindungen,
wie beispielsweise die Glycopeptide und die Lipopolysaccharide,
oder ebenso andere Elemente, wie insbesondere Viren, Zellen, oder
chemische Verbindungen, wie Biotin, anheften.
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Die Anheftung der biologischen Makromoleküle kann
kovalent oder nicht-kovalent,
beispielsweise durch Adsorption, Wasserstoffbrückenbindungen, beispielsweise
hydrophobe, ionische Wechselwirkungen, in welchem Falle man vorteilhafterweise eine
Brückenbildung
("cross-linking", Vernetzung) zwischen
den aufgepfropften Molekülen
durch die bekannten Methoden ("Chemistry
of Protein Conjugation and Cross-linking", S.C. Wong, CRC Press (1991)) vornehmen
könnte,
und dies, um ihren Zusammenhalt zu verstärken, erfolgen.
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Wie dies zuvor erwähnt worden
ist, ist es möglich, über eine
exponierte Gruppierung zu verfügen,
die die direkte Reaktion mit den Molekülen mit biologischer Aktivität erlaubt,
aber es ist gleichfalls möglich,
vorzusehen, dass die exponierte Gruppe nach der Anheftung behandelt
wird, um, wie dies zuvor bereits angegeben worden ist, in einen
Hydroxy-, Amin-, Alkohol-, Aldehyd-, Keton-, COOH-Rest oder ein
Derivat dieser Gruppen vor der Anheftung des biologischen Moleküls umgewandelt
zu werden.
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Wenn solche Gruppen exponiert worden sind,
sind die Techniken zur Anheftung von beispielsweise Proteinen und/oder
DNA bekannt; es handelt sich tatsächlich um Reaktionen, die an
Oberflächen ausgeführt werden,
die bereits im Rahmen der biologischen Analysen eingesetzt werden,
insbesondere an Costar-Oberflächen
und Nunc-Oberflächen
oder Mikrokugeln, wie Estapor, Bang und Dynal zum Beispiel, auf
welchen man Moleküle
von biologischem Interesse, beispielsweise DNA, RNA, PNA, Proteine oder
Antikörper,
verankert.
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In dem Falle, wo die exponierte Gruppierung ein
Rest -CH=CH2 ist, welche nachfolgend als "Oberflächen-C=C" oder "Oberfläche mit
ethylenischer Bindung" bezeichnet
wird, existiert kein Dokument, welches die direkte Verankerung insbesondere
von DNA oder Proteinen erwähnt.
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Im Rahmen der Erfindung wurde gezeigt, dass
diese Oberflächen
eine stark pH-abhängige
Reaktivität
aufweisen. Diese Besonderheit erlaubt es, die Nukleinsäuren oder
die Proteine zu verankern, indem pH-Bereiche eingesetzt werden, und häufig mit einer
Reaktionsgeschwindigkeit, die durch den pH gesteuert werden kann.
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Man kann die Verankerung von DNA
durch ihr Ende auf einer Oberfläche,
welche Gruppen mit ethylenischer Doppelbindung aufweist, ausführen, indem
die DNA bei einem pH unter 8 mit der Oberfläche in Kontakt gebracht wird.
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Die Reaktion wird insbesondere bei
einem pH zwischen 5 und 6 ausgeführt,
dann bei pH 8 gestoppt.
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So ist für DNA bei pH 5,5 die Verankerungsreaktion
in einer Stunde vollständig
abgelaufen (wenn sie nicht durch die Diffusion begrenzt wird) und erfolgt
durch die Enden. Im Gegenzug ist bei pH 8 die Verankerung sehr gering
(Reaktionsgeschwindigkeit um 5 bis 6 Größenordnungen geringer). Dieser pH-abhängige und
für die
Enden spezifische Verankerungseffekt bedingt eine Verbesserung bezogen auf
die anderen Oberflächen,
die eine Funktionalisierung der DNA (Biotin, DIG, NHS, ...) oder
spezielle Reagenzien (Carbodiimid, Dimethylpimelidat), die eine
Peptid- oder Phosphorimidbindung zwischen -NH2 und
-COOH oder -POOH realisieren, erfordern.
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Man kann die Verankerung von DNA
auch durch Adsorption von deren Enden allein auf einer Oberfläche, welche
mit Polylysin oder einer Silangruppe, deren Ende eine Amingruppe
bildet, bedeckt ist, realisieren.
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Um die Verankerung von DNA durch
ihr Ende auf einer mit einer Amingruppe bedeckten Oberfläche zu realisieren,
bringt man die DNA bei einem pH zwischen 8 und 10 mit der Oberfläche in Kontakt.
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Ebenso kann man die Verankerung von
DNA durch ihr Ende auf einer zuvor in einem Säurebad behandelten Glasoberfläche ausführen, indem
man die DNA bei einem pH zwischen 5 und 8 mit der Oberfläche in Kontakt
bringt.
-
Es versteht sich von selbst, dass
die Erfindung in dem gleichen Sinne die gegebenenfalls pH-abhängige Verankerung
aller Makromoleküle
von biologischem Interesse impliziert.
-
Ebenso können diese Oberflächen Proteine direkt
verankern (Protein A, anti-DIG, Antikörper, Streptavidin u.s.w.).
Es ist beobachtet worden, dass (i) die Aktivität des Moleküls bewahrt werden kann und
(ii) dass die Reaktivität
der hergestellten Oberfläche
(anfänglich
C=C) vollständig
verborgen wird, um einzig der Reaktivität des Moleküls von Interesse Platz zu lassen.
Es ist folglich möglich,
ausgehend von einer anfänglich
relativ breiten Reaktivität
zu einer Oberfläche
zu gelangen, welche eine sehr hoch spezifische Reaktivität, beispielsweise
jene für
spezielle Stellen auf einem Protein, aufweist.
-
Indem ein spezifischer Antikörper auf
der Oberfläche
verankert wird (beispielsweise anti-DIG), erzeugt man eine Oberfläche, deren
Reaktivität
auf das Antigen (beispielsweise die DIG-Gruppierung) beschränkt ist.
Dies zeigt, dass die anfänglichen
chemischen Gruppierungen durch die aufgepfropften Antikörper allesamt
verborgen worden sind.
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Man kann auf den (chemisch oder biochemisch)
reaktiven Oberflächen
auch andere Moleküle mit
biologischer Aktivität,
insbesondere Viren oder andere Bestandteile: insbesondere Membranen, Membranrezeptoren,
Polysaccharide, PNA, verankern.
-
Es ist gleichfalls möglich, das
Produkt aus einer Reaktion von biologischem Interesse (beispielsweise
der PCR) auf den hergestellten bzw. vorbereiteten Oberflächen anzuheften.
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Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt den Nachweis
und/oder die Quantifizierung von biologischen Molekülen, aber
gleichfalls die Messung von intramolekularen Abständen, die
Trennung von bestimmten biolo gischwen Molekülen, insbesondere eine Entnahme
durch Ausführen
der Antigen/Antikörper-
und/oder DNA-RNA-Kopplungs-Techniken.
-
Die Erfindung hat insbesondere ein
Verfahren zum Nachweis eines Makromoleküls, bestehend aus einer DNA-Sequenz
oder einem Protein, in einer Probe gemäß der Erfindung zum Gegenstand,
das dadurch gekennzeichnet ist, dass:
- – man die
Probe, entsprechend dem Lösemittel
A, in welchem sich das Makromolekül in Lösung befindet, in Kontakt mit
der Oberfläche
des Trägers bringt
unter Bedingungen für
die Bildung eines DNA/DNA-, DNR/RNA-Hybrids oder für die Bildung
des Produkts aus der Protein/Protein-Reaktion,
- – man,
wobei das Hybrid oder ein Markierungs-Makromolekül des Hybrids oder des Reaktionsprodukts
in einem Abschnitt verankert ist, wobei der Rest sich frei in Lösung befindet,
dieses streckt durch Verschieben des Meniskus, der durch den Kontakt
des Lösemittels
mit der Oberfläche
erzeugt wird, um die Hybride oder die Markierungs-Makromoleküle zu orientieren,
und man die Messung oder die Beobachtung der so orientierten Hybride
oder Markierungs-Makromoleküle vornimmt.
-
Vorteilhafterweise sind die angeheftete
DNA und die DNA der Probe auf unterschiedliche Weise gefärbt und
man misst nach dem Strecken die Lage der komplementären Sequenz
bezogen auf das Ende der DNA der Probe.
-
In geeigneter Weise kann man die
ELISA- oder FISH-Nachweismethoden einsetzen.
-
Die DNA-Probe kann das Produkt oder
das Substrat einer enzymatischen DNA-Amplifizierung, wie der PCR,
sein, d. h. man kann die Amplifizierung der DNA, ist diese einmal
gemäß dem Verfahren
der Erfindung verankert und ausgerichtet, oder vor ihrer Verankerung
und ihrer Ausrichtung ausführen.
-
Die Passage des Meniskus, wobei die
Moleküle
linear in Form von Stäbchen
gestreckt werden, macht diese viel leichter nachweisbar, wenn sie
markiert sind. Außerdem
sind diese langgestreckten Moleküle
an der frischen Luft stabil und können sogar nach mehreren Monaten
noch beobachtet werden, ohne dass sie einen offensichtlichen Abbau
zeigen.
-
Während
einer Rehydratisierung können
die DNA-Moleküle
adsorbiert und langgestreckt bleiben. Außerdem ist es möglich, an
dem langgestreckten Molekül
eine Hybridisierung vorzunehmen.
-
Außerdem unterscheiden sich diese
Moleküle
vom umgebenden Hintergrund, da sie durch ihre Streckung ein korreliertes
Signal mit einer gleichförmigen
Orientierung aufweisen. Es ist folglich leicht, die Stäube, die
Inhomogenitäten,
die keine besondere räumliche
Korrelation aufweisen, zu ignorieren. Die Ausrichtung ist ebenfalls
interessant, da in Lösung
die in Form von Knäueln
vorliegenden Moleküle thermisch
fluktuieren, was sehr bedeutende Variationen ihres vorzugsweise
mit einer geringen Schärfentiefe
gesammelten Fluoreszenzsignals mit sich bringt und deren Beobachtung
begrenzt. Die Erfindung erlaubt folglich die Beobachtung von isolierten
Molekülen
mit einem sehr hohen Signal-Rausch (S/N)-Verhältnis.
-
Es ist bemerkenswert, dass dieses
Verhältnis
von der Anzahl von verankerten Molekülen unabhängig ist. Das S/N-Verhältnis, das
bei dem Nachweis eines Moleküls
auftritt, ist das gleiche wie für 10000.
Außerdem
erlaubt diese Strecktechnik, leicht zwischen Molekülen unterschiedlicher
Längen
zu unterscheiden.
-
Man kann vorteilhafterweise die folgenden Schritte
vornehmen, um das S/N-Verhältnis
weiter zu verbessern:
- – Da das Molekül unbeweglich
ist, kann man sein Fluoreszenzsignal integrieren.
- – Die
Beobachtung mit dem Mikroskop präsentiert einen
kleinen Bereich (typischerweise 100 μm × 100 μm mit einem Immersionsobjektiv
mit hundertfacher Vergrößerung,
N.A. = 1,25). Für
eine 1 cm2-Probe kann man entweder eine Abtastung vornehmen,
oder die Verwendung von Objektiven mit geringerer Vergrößerung (10-fach
oder 20-fach), aber mit hoher numerischer Apertur in Betracht ziehen.
- – Da
die kleinen Stäbchen
stets parallel vorliegen, kann man eine Methode einer optischen
räumlichen
Filterung in Betracht ziehen, um das S/N-Verhältnis weiter zu verbessern.
- – Es
sind andere globale Fluoreszenzmethoden denkbar wie jene, die in
der Europäischen
Patentanmeldung 103426 beschrieben worden sind.
- – Die
Linearisierung der Moleküle
beobachtet man im Rahmen einer physikalisch-chemischen Verankerung
ebenso wie im Falle von Bindungen vom immunologischen Typ (DIG/anti-DIG).
- – Befindet
sich die Oberfläche
einmal an der frischen Luft, sind die DNA-Moleküle stabil (bleiben unversehrt,
sogar nach mehreren Wochen) und fluoreszierend. Man kann diese Eigenschaft
in vorteilhafter Weise einsetzen, um den Verankerungsschritt von
dem (Positions)Bestimmungs-/Zählungsschritt
der verankerten Moleküle zeitlich
zu trennen, wenn dieser Nachweis beispielsweise, aber ohne sich
darauf zu beschränken,
durch Fluoreszenzmikroskopie erfolgt. Eine solche Verwendung wird
durch die Erfindung mit abgedeckt.
- – Eine
Doppel- (oder Mehrfach)-Fluoreszenztechnik kann gegebenenfalls dazu
dienen, das S/N-Verhältis
zu verbessern oder eine doppelte oder mehrfache Funktionalität nachzuweisen.
-
Die gestreckten Moleküle können durch
verschiedene enzymologische oder andersartige Methoden, wie Fluoreszenz
oder die Verwendung von radioaktiven (heißen) oder nicht-radioaktiven
(kalten) Sonden, nachgewiesen werden. Ihr Nachweis kann durch Messung
eines globalen Signals (beispielsweise der Fluoreszenz) oder durch
individuelle Beobachtung der Moleküle durch optische Fluoreszenzmikroskopie,
Elektronenmikroskopie, Methoden mit lokalen Sonden (STM, AFM u.s.w.)
erfolgen.
-
So erlaubt die Erfindung allgemein
den Nachweis, die Trennung und/oder die quantitative Bestimmung
eines Moleküls
in einer Probe durch ein Verfahren, welches dadurch gekennzeichnet
ist, dass man eine Oberfläche
einsetzt, welche in der Lage ist, das Molekül spezifisch zu binden, und
dass der Nachweis, die Trennung oder die quantitative Bestimmung
dank eines fluoreszierenden oder nicht fluoreszierenden Reagens,
welches die Anwesenheit des gebundenen oder angehefteten Moleküls nachweist,
bewirkt werden.
-
Unter den Reagenzien unterscheidet
man die fluoreszierenden Reagenzien und die nicht-fluoreszierenden
Reagenzien.
-
Die fluoreszierenden Reagenzien enthalten fluoreszierende
Moleküle,
welche mit Vorteil so ausgewählt
werden, dass sie lange Moleküle
mit einer Größe über 0,1 μm sind und
auf spezifische Weise direkt oder indirekt mit den vorbehandelten
Oberflächen
reagieren. Beispielsweise, aber ohne sich deshalb darauf zu beschränken, kann
ein doppelsträngiges
DNA-Molekül,
das mit Hilfe von fluoreszierenden Sonden (Ethidiumbromid, YOYO,
fluoreszierenden Nukleotiden u.s.w.) gefärbt worden ist, sich direkt durch
ein oder mehrere Enden auf einer Oberfläche, welche gegebenenfalls
eine Gruppe vom Typ Vinyl, Amin oder eines andersartigen Typs aufweist,
verankern, insbesondere durch eine kluge Wahl des pH oder des Ionengehalts
des Mediums oder durch Anlegen einer elektrischen Spannung an die
Oberfläche.
-
Es ist gleichfalls möglich, eine
besondere Funktionalisierung des Moleküls (DIG, Biotin u.s.w.) einzusetzen,
um dieses an einer oder mehreren Stellen auf einer Oberfläche, welche
komplementäre Stellen
(anti-DIG, Streptavidin u.s.w.) aufweist, zu verankern.
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Die nicht-fluoreszierenden Reagenzien,
welche den Nachweis vor vorab ausgerichteten Molekülen gemäß der Erfindung
erlauben, können
insbesondere aus Kugeln oder Mikroteilchen bestehen, welche durch
das Zwischenglied eines anderen Moleküls, welches auf spezifische
Weise direkt oder indirekt an das ausgerichtete Molekül angeheftet
worden ist und lediglich eine schwache nicht-spezifische Wechselwirkung
mit der Oberfläche
zeigt, verankert werden.
-
Man kann beispielsweise die mit Streptavidin bedeckten
Dynal-Kugeln aufführen,
die die Verankerung auf biotinylierter DNA, welche gemäß der Erfindung
ausgerichtet worden ist, erlauben.
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Je nachdem, ob das gesuchte Molekül direkt durch
Fluoreszenz oder indirekt mit Hilfe der obigen Reagenzien nachgewiesen
wird, wird man von "direktem
Nachweis" oder "mittels einer Markierung" sprechen.
-
Um die mit zu langen Reaktionszeiten
verbundenen Probleme zu begrenzen, kann man vorteilhafterweise die
Diffusionszeiten der Reagenzien in Richtung der Oberfläche verringern,
indem kleine Reaktionsvolumen eingesetzt werden. Beispielsweise,
aber ohne sich darauf zu beschränken,
führt man die
Reaktion in einem Volumen von einigen Mikrolitern, welches bestimmt
wird durch den Raum zwischen zwei Oberflächen, von denen eine behandelt ist,
so dass sie reaktive Stellen präsentiert,
und die andere inert oder behandelt worden ist, damit sie unter
den Reaktionsbedingungen keine reaktiven Stellen aufweist, aus.
-
Der Nachweis der Anzahl von ausgerichteten
Molekülen
kann an einer kleinen Anzahl von Molekülen (typischerweise 1 bis 1000)
durch einen makroskopischen physikalischen Test mit geringem Hintergrund,
welcher weder ein Elektronenmikroskop noch Radioaktivität noch notwendigerweise
die PCR erfordert, erfolgen.
-
Die Verfahren zur Ausrichtung und
zum Nachweis gemäß der Erfindung
können
durch Personal, welches lediglich geringe Laborerfahrung hat, ausgeführt werden.
-
Die Spezifität von bestimmten biologischen Reaktionen
kann begrenzt sein. So können
im Rahmen der Hybridisierung die Hybride unvollkommen sein (Reaktionen
mit anderen Stellen), indem sie eine geringere Anzahl von Paarbildungen
und folglich eine schlechtere Bindungsqualität aufweisen. Die Erfindung
deckt gleichfalls den möglichen
Einsatz eines Schritts eines Tests der Qualität der erhaltenen Bindungen
ab. Dieser Test erlaubt, die auf nicht-spezifische, schwache Weise
durch insbesondere Adsorption, hydrophobe Kräfte, unvollkommene Wasserstoffbrückenbindungen,
unvollkommene Hybridisierung gepaarten Produkte zu dissoziieren.
-
Aus diesem Grund betrifft die Erfindung gleichfalls
im Rahmen eines Verfahrens zum Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung,
wie zuvor beschrieben, ein Verfahren, wo man das Reaktionsprodukt
zwischen dem Molekül
mit biologischer Aktivität
und dem Molekül
der Probe einer Beanspruchung aussetzt, um vor dem Nachweis die
schlechten Paarungen zu zerstören.
-
Dieses Verfahren bietet außer der
Möglichkeit,
die fehlgepaarten Paare zu zerstören,
die Möglichkeit,
die Kopplungsprodukte zu orientieren, was die Messungen oder die
Beobachtungen erleichtert.
-
Man kann so die Oberflächen nach
Anheftung der komplementären
Elemente einer Beanspruchung aussetzen, die gebildet werden kann
durch die einzelne oder kombinierte Verwendung von:
- – Zentrifugation,
- – Magnetfeldgradient,
welcher auf die nicht-fluoreszierenden Reagenzien, die dann so ausgewählt sind,
dass sie magnetisierbare oder magnetische Mikrokugeln umfassen,
angewendet wird,
- – Bewegung/Rühren,
- – Flüssigkeitsströmung,
- – Meniskus-Passage,
- – Elektrophorese
- – Variation
von Temperatur und/oder Temperaturgradient.
-
Man bestimmt dann durch die oben
beschriebenen Nachweistechniken mit geringem Hintergrund die Anzahl
von Systemen, die unversehrt geblieben oder zerstört worden
sind.
-
Die beschriebenen erfindungsgemäßen Ausrichtungs-
und Nachweistechniken können
für zahlreiche
Anwendungen eingesetzt werden, darunter, aber ohne sich darauf zu
beschränken:
- – die
Identifizierung von einem oder mehreren DNA- oder RNA-Sequenzelementen,
das bzw. die man mit Vorteil für
die Diagnose von Pathogenen oder die physische Kartierung eines
Genoms einsetzen kann. Die oben beschriebenen Techniken erlauben
insbesondere die Erzielung einer direkten physischen Kartierung
an genomischer DNA, ohne dass diese eine Klonierungsschritt durchläuft. Es
versteht sich, dass man, da das gekämmte Molekül bezogen auf seine kristallographische
Länge gestreckt
worden ist, diesbezügliche
Messungen vornimmt. Es ist so möglich,
die Größe von DNA-Fragmenten und den
Abstand zwischen Fragmenten mit einer Auflösung in der Größenordnung
von 200 nm für
optische Methoden oder in der Größenordnung
von 1 nm durch die Verwendung von Nahfeldmethoden, wie AFM oder
STM, um den Abstand zwischen Sonden auf der ausgerichteten DNA sichtbar
zu machen und zu messen, zu messen.
-
Dies führt natürlicherweise zu:
- 1) dem Nachweis von Deletionen, Additionen oder Translokationen
von genomischen Sequenzen, insbesondere im Rahmen der Diagnose von
genetisch bedingten Krankheiten (beispielsweise Duchenne-Muskeldystrophie);
- 2) der Identifizierung von Promotoren von verschiedenen Genen
durch die Messung des Abstands zwischen den regulatorischen Sequenzen und
jener, die exprimiert wird;
- 3) der Lokalisierung von regulatorischen Proteinen durch die
Identifizierung von deren Lage entlang der DNA oder der Lage von
deren Zielsequenz;
- 4) der partiellen oder vollständigen Sequenzierung durch
Messung des Abstands mit Hilfe von Nahfeldmikroskopiemethoden (beispielsweise AFM
oder STM) zwischen hybridisierten Sonden, welche zu einer Grundlage
von Oligonukleotiden von gegebener Länge gehören.
- – Der
enzymatischen in situ-Amplifizierung an ausgerichteten DNAs.
- – Der
Verbesserung der Empfindlichkeit der ELISA-Techniken mit der Möglichkeit,
eine geringe Anzahl (gegebenenfalls unter 1000) von immunologischen
Reaktionen nachzuweisen.
-
So kann man eine physische Kartierung
direkt an einer genomischen DNA vornehmen, ohne dass diese einen
Klonierungsschritt durchläuft.
Die genomische DNA wird extrahiert, gereinigt, gegebenenfalls durch
ein oder mehrere Restriktionsenzyme geschnitten, dann auf Oberflächen gemäß dem Verfahren
der Erfindung gekämmt.
-
Die Lage und die Größe des gesuchten
Gens auf der genomischen DNA werden dann durch Hybridisierung mit
für das
Gen spezifischen Sonden, welche insbesondere aus Abschnitten von
zu dem Produkt des gesuchten Gens komplementärer DNA (cDNA) extrahiert werden,
bestimmt.
-
Auf ähnliche Weise identifiziert
man, indem man eine gekämmte,
dann denaturierte genomische DNA mit gesamter, durch Fluoreszenz
oder einen jeglichen anderen Marker, welcher es erlaubt, das Hybrid
zu lokalisieren, markierter cDNA hybridisiert, die Lage, die Größe und die
Anzahl der Exons des fraglichen Gens, woraus man dessen Größe und seine
genetische Organisation (Exons, Introns, regulatorische Sequenzen)
ableitet.
-
Nachdem die Lage des Gens bestimmt
worden ist, wie oben beschrieben, oder bekannt ist, ist es dann
möglich,
durch Hybridisierung die flankierenden Sequenzen des Gens zu identifizieren.
Dafür wird man
mit Vorteil eine Hybridisierung mit markierten Sonden, welche beispielsweise
aus einer Bibliothek von Oligonukleotiden stammen, vornehmen, um
zwei oder mehrere Sonden zu identifizieren, die auf der einen und
der anderen Seite des Gens hybridisieren.
-
Ausgehend von dieser Bestimmung ist
es dann durch die Techniken enzymatischer Amplifizierung, beispielsweise
der in situ-PCR (Nuovo, G.J., PCR in situ hybridization: protocoles
and applications, Raven Press (1992)), möglich, das durch die flankierenden
Sonden, die als Primer der Reaktion dienen können, begrenzte Fragment zu
amplifizieren, welches Fragment das gesuchte Gen mit seinen regulatorischen
Regionen, die gewebe- oder entwicklungsspezifisch sein können und
die man dann isolieren und reinigen kann, enthalten kann.
-
Man kann auch eine in situ-Polymerisation an
den aus der cDNA des fraglichen Gens extrahierten Primern vornehmen,
um zu den flankierenden Regionen des Gens komplementäre DNA-Fragmente
zu extrahieren, wie von Mortimer et al. (Yeast 5, 321, 1989) erwähnt wurde.
Diese Fragmente können dann
zur Herstellung von Primern für
ein enzymatisches Amplifizierungsverfahren des Gens und seiner flankierenden
Fragmente dienen.
-
Man kann auch die von A. Thierry
und B. Dujon (Nucl. Acid Research 20, 5625 (1992)) aufgeführten Methoden,
um durch homologe oder zufallsgesteuerte Rekombination spezifische
bekannte Endonukleasestellen in eine genomische DNA oder ein Fragment
von genomischer DNA einzuführen,
einsetzen. Das Kämmen
dieser DNA erlaubt die Identifizierung des Gens von Interesse und
der insertierten spezifischen Stellen durch die oben beschriebenen
in situ-Hybridisierungsmethoden. Ausgehend von dieser Identifizierung
und bevorzugt, wenn die Stellen von Interesse Regionen von Interesse
sind, die nahe bei dem Gen liegen, wird man diese als Primer für eine enzymatische
Amplifizierungsreaktion (in situ oder andersartig) des fraglichen
Gens und seiner flankierenden Sequenzen einsetzen.
-
Die Amplifizierung des gesuchten
Gens erfolgt dann durch die bekannten enzymatischen Amplifizierungstechniken,
wie PCR, an dem, wie zuvor beschrieben, amplifizierten Fragment,
indem Primer, welche durch die die cDNA bildenden Exons zugänglich sind,
oder Primer, welche flankierenden Sequenzen entsprechen, eingesetzt
werden.
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Durch das Kämmen von genomischer oder andersartiger
DNA ist es auch möglich,
durch Hybridisierung das Vorhandensein oder das Fehlen von regulatorischen
Sequenzen eines bestimmten proximalen Gens zu bestimmen, ausgehend
von welchen man die möglichen
Familien von regulatorischen Proteinen dieses Gens (beispielsweise:
Helix-Schleife-Helix, Zinkfinger, Leucin-Zipper) bestimmen wird.
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Die spezifischen Reaktionen zwischen
speziellen DNA/RNA/PNA-Sequenzen und einem anderen Molekül (DNA,
RNA, Protein) können
vor oder nach Ausrichtung der Moleküle gemäß der Erfindung erfolgen.
-
So setzt man im Rahmen der genetischen Diagnostik
und der physischen Kartierung mit Vorteil die bekannten FISH-Verfahren
(Pinkel et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 83, 2934 (1986)) ein,
um markierte einzelsträngige
Oligonukleotide mit zuvor ausgerichteter, dann denaturierter DNA
zu hybridisieren. Die Sichtbarmachung der Hybride wird durch bekannte
Techniken (Fluoreszenz, Mikrokugeln u.s.w.) mit einer Auflösung nach
Maßgabe
der Abstände, welche
von 0,2 μm
(optisch) bis 1 nM (mittels Nahfeldmikroskopie; AFM, STM u.s.w.)
gehen, erfolgen.
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Alternativ kann man zunächst fluoreszierende
Marker-DNAs mit einzelsträngiger
DNA in Lösung hybridisieren,
dann diese Konstruktionen durch die Einwirkung des Meniskus ausrichten,
nachdem man sie in doppelsträngige
DNA umgewandelt und an einer adäquaten
Oberfläche
verankert hat.
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Man kann die Erfindung auch für den Nachweis
des Vorhandensein eines Pathogens einsetzen. Als Beispiel kann man
auf zwei unterschiedliche Weisen vorgehen, je nachdem, ob die Erkennungsreaktion
(Hybridisierung, Anheftung von Protein) vor oder nach der Ausrichtung
durch den Meniskus stattfindet.
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So werden beispielsweise ein oder
mehrere Oligonukleotid-Sonden an einer oder mehreren Regionen einer
Oberfläche
verankert. Die Hybridisierung der potentiell pathogenen DNA erfolgt
in situ unter stringenten Bedingungen derart, dass lediglich hybridisierte
Moleküle
verankert werden. Deren Nachweis und Quantifizierung erfolgen nach
Ausrichtung durch den Meniskus gemäß der Erfindung.
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Alternativ wird die potentiell pathogene
DNA zunächst
ausgerichtet, dann denaturiert und mit einer Oligonukleotid-Sonde
unter stringenten Bedingungen hybridisiert. Der Nachweis des Hybrids
erfolgt dann durch die bekannten Methoden, insbesondere FISH, wie
oben beschrieben.
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Auf eine ähnliche Weise kann man das
Vorhandensein (oder das Fehlen) einer geringen Anzahl von Molekülen, wie
Proteinen, Lipiden, Zuckern oder Antigenen, nachweisen. Man wird
mit Vorteil eine geringfügige
Modifizierung der ELISA-Techniken vornehmen, wobei die übliche Nachweismethode
durch den Nachweis eines gemäß der Erfindung
ausgerichteten und an eines der Reagenzien der ELISA-Reaktion gekoppelten
fluoreszierenden Moleküls
ersetzt wird.
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Außerdem kann, wie von K. R.
Allan et al. (U.S. 84 114) erwähnt,
die genetische Kartierung durch eine Messung der Größe von DNA-Fragmenten
erfolgen. Nun erlauben die weiter oben beschriebenen originären Techniken
zum Strecken der Moleküle
(das Strecken durch den Meniskus) eine Messung der Länge der
gestreckten Moleküle
und dies an einer sehr kleinen Probe (einige Tausend Moleküle).
-
Man kann beispielsweise, aber ohne
sich darauf zu beschränken,
auf die folgende Weise vorgehen:
Eine DNA-Probe wird fragmentiert
(mit Hilfe von Restriktionsenzymen), mit einem Fluorophor gefärbt, dann
auf einer Oberfläche
verankert. Die Moleküle werden
dann durch den Meniskus gestreckt und die Größe der gestreckten Fragmente
durch optische Fluoreszenzmikroskopie mit einer Auflösung und
einer Größengrenze
in der Größenordnung
von 1000 bp (0,3 μm)
bestimmt.
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Mit diesem Ziel, aber auch, wenn
man sehr lange Moleküle
(≥ 10 μm) ausrichten
möchte,
wird man mit Vorteil Techniken einsetzen, die dafür bekannt
sind, den Abbau von langen Makromolekülen während ihrer Handhabung (durch
hydrodynamische Scherung) zu begrenzen.
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Wie dies von D.C. Schwartz erwähnt worden ist,
wird man mit Vorteil eine Kondensation der Moleküle mit Hilfe eines Kondensationsmittels
(beispielsweise Spermin oder ein Alkohol) während deren Handhabung vornehmen.
Gegebenenfalls wird deren Dekondensation während des Kontakts des Lösemittels
A mit der Verankerungsoberfläche
S erfolgen.
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Um den Abbau von Makromolekülen während des
Streckens durch den Meniskus zu verringern, wird man Techniken zur
Parallelverschiebung des Meniskus einsetzen, die die hydrodynamische Scherung
minimieren. Beispielsweise, aber ohne sich deswegen darauf zu beschränken, indem
man die Oberfläche
S sehr langsam (≤ 200 μ/s) von einem folgerichtigen
Volumen (≥ 100 μl) des Lösemittels
A zurückzieht.
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Die Erfindung ist nützlich,
um eine Oberfläche
zu erhalten, welche einen oder mehrere Typen von ausgerichteten
Makromolekülen,
welche gemäß der Erfindung
erhalten werden, aufweist. Man kann insbesondere eine Oberfläche oder
eine Stapelung von Oberflächen
erhalten, welche elektrische oder optische anisotrope Eigenschaften
aufweist.
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Die Erfindung hat auch ein Verfahren
zur Ausrichtung und zum Nachweis von DNA zum Gegenstand, in welchem
die DNA durch ein erfindungsgemäßes Ausrichtungsverfahren
gestreckt wird, dann denaturiert wird, dann mit spezifischen Sonden hybridisiert
wird, um die Lage oder die Größe von einer
oder mehreren speziellen Sequenzen zu bestimmen.
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Die Erfindung hat gleichfalls ein
Verfahren zur physischen Kartierung eines Gens auf einer genomischen
DNA zum Gegenstand, in welchem die DNA gemäß einem Verfahren der Erfindung
ausgerichtet oder nachgewiesen wird.
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Insbesondere werden die Lage und
die Größe des gesuchten
Gens auf der genomischen DNA durch Hybridisierung mit für das zu
kartierende Gen spezifischen Sonden bestimmt.
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Die Erfindung ist gleichfalls nützlich für die Herstellung
- – eines
Kits, welcher für
die Ausführung
eines erfindungsgemäßen Kartierungsverfahrens
nützlich ist,
welcher gebildet wird aus vollständiger
genomischer DNA eines Referenzwirts,
- – eines
Trägers
(einem Träger),
welcher eine Oberfläche
aufweist, welche die Verankerung und die Ausrichtung der DNA des
Patienten gemäß dem Verfahren
der Erfindung erlaubt,
- – von
für das
oder die zu kartierende(n) Gen(e) spezifischen Sonden und Reagenzien
(für das oder
die zu kartierende(n) Gen(e) spezifische Sonden und Reagenzien)
für die
Hybridisierung und den Nachweis der DNA.
-
Die Erfindung hat gleichfalls ein
Verfahren zur Ausrichtung und zum Nachweis von DNA zum Gegenstand,
in welchem die DNA gestreckt, dann denaturiert, dann mit spezifischen
Sonden hybridisiert wird, um das Vorhandensein oder das Fehlen von
einer oder mehreren DNA-Sequenzen in der ausgerichteten DNA zu bestimmen.
-
Die Erfindung erlaubt die Ausführung eines Verfahrens
zur Diagnose einer Pathologie, welche mit dem Vorhandensein oder
dem Fehlen einer für die
Pathologie spezifischen DNA-Sequenz verbunden ist, in welchem man
ein erfindungsgemäßes Ausrichtungsverfahren
einsetzt.
-
Die Erfindung ist gleichfalls nützlich,
um einen Kit herzustellen, welcher für das Ausführen eines erfindungsgemäßen Diagnoseverfahrens
nützlich
ist, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er einen Träger, dessen
Oberfläche
die Verankerung und die Ausrichtung der DNA eines Patienten gemäß einem Verfahren
der Erfindung erlaubt, für
das an der gesuchten Pathologie beteiligte Gen spezifische Sonden
und Reagenzien für
die Hybridisierung und den Nachweis der DNA umfasst.
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Die Erfindung ist gleichfalls nützlich,
um einen Kit herzustellen, welcher für das Ausführen eines erfindungsgemäßen Diagnoseverfahrens
nützlich
ist, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er einen Träger, dessen
Oberfläche
für das
an einer Pathologie beteiligte Gen spezifische Sonden, insbesondere
gegebenenfalls markierte, pathogene DNA, welche gemäß dem Verfahren
der Erfindung ausgerichtet und gegebenen falls denaturiert worden
sind, aufweist; Reagenzien zur Präparation und Markierung der DNA
des Patienten in Hinblick auf deren Hybridisierung (beispielsweise
Photobiotin, "Nick-Translations"- oder "Random Priming"-Kit) und Reagenzien für die Hybridisierung
und den Nachweis der DNA gemäß den oben
beschriebenen in situ-Hybridisierungstechniken umfasst.
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Es versteht sich, dass gekämmte Sonden, welche
sich auf unterschiedliche Pathogene beziehen, auf unterschiedlichen
Trägern
oder auf ein und demselben Träger
vorhanden sein können.
Die Identifizierung des entsprechenden Pathogens kann nach der Hybridisierung
entweder räumlich
(die unterschiedlichen Sonden sind räumlich beispielsweise durch
photochemische Verankerung vor deren Kämmen getrennt) oder durch einen
Unterschied des Fluoreszenzspektrums der verschiedenen Hybride,
welches aus einer vorab erfolgten differenziellen Markierung der
Sonden resultiert, erfolgen.
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Schließlich hat die Erfindung ein
Verfahren zur Herstellung eines Gens zum Gegenstand, bei welchem
man die Lage dieses Gens auf durch das erfindungsgemäße Verfahren
ausgerichteter genomischer DNA mit Hilfe einer für das Gen spezifischen Sonde
identifiziert und man die Sequenz dieses Gens und gegebenenfalls
dessen flankierende Sequenzen durch enzymatische Amplifizierung,
insbesondere PCR, amplifiziert.
-
Die Erfindung erlaubt folglich, ein
Verfahren zum Ersetzen eines Gens in dem Genom einer eukaryotischen
Zelle durch gezielte Insertion eines Fremdgens mit Hilfe eines Vektors,
welcher dieses Fremdgen, das gemäß dem obigen
Verfahren zur Herstellung eines Gens hergestellt worden ist, enthält, auszuführen.
-
Die gezielte Insertion kann gemäß den in WO
90/11354 beschriebenen Techniken ausgeführt werden, indem man eukaryotische
Zellen mit einem Vektor, welcher die zu insertierende fremde DNA flankiert
von zwei genomischen Sequenzen, die neben der gewünschten
Insertionsstelle in dem Empfängergen
liegen, enthält,
transfiziert. Die zu insertierende DNA kann entweder eine kodierende
Sequenz oder eine regulatorische Sequenz umfassen. Die flankierenden
Sequenzen werden so ausgewählt,
um durch homologe Rekombination je nach Fall entweder die Expression
der kodie renden Sequenz der zu insertierenden DNA unter der Kontrolle
der regulatorischen Sequenzen des Empfängergens oder die Expression
einer kodierenden Sequenz des Empfängergens unter der Kontrolle
von regulatorischen Sequenzen der zu insertierenden DNA zu erlauben.
-
Die genomischen Gene und die cDNAs,
die erhalten werden, indem man das Verfahren zur Lokalisierung von
Genen gemäß der Erfindung
einsetzt, können
in Expressionsvektoren insertiert werden, die in der Lage sind,
sich in eine prokaryotische, eukaryotische oder virale Wirtszelle
zu insertieren. Die sich davon ableitenden Proteine, Polypeptide
und Peptide werden von der Erfindung mit umfasst.
-
Die folgende Beschreibung erfolgt
unter Bezugnahme auf die beigefügten
Figuren, in denen:
-
die 1 den
Nachweis eines Pathogens in einem fluoreszierenden DNA-Molekül durch
Hybridisierung mit einem verankerten Molekül schematisch darstellt;
-
die 2 die
genetische Kartierung durch Streckung der DNA und Verwendung einer
Marker-DNA schematisch darstellt;
-
die 3 den
Nachweis einer immunologischen Reaktion (ELISA) mit Hilfe eines "Markierungs"moleküls schematisch
darstellt: als Reaktionsmarker wird eine fluoreszierende DNA eingesetzt;
-
die 4 eine
Fluoreszenzmikrophotographie ist, welche die Streckung von DNA des
Phagen λ durch
Vorwärtsbewegung
des Meniskus zeigt; links sieht man DNA-Moleküle in Lösung, welche durch Verdunstungsströmung parallel
zu dem Meniskus gestreckt worden sind, rechts DNA-Moleküle an der
frischen Luft nach deren Streckung senkrecht zu dem Meniskus;
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die 5(a) und 5(b) Fluoreszenzmikrophotographien
sind, die eine mit Digoxigenin (DIG) markierte DNA auf einer mit
anti-DIG bedeckten Oberfläche,
und welche durch den Meniskus getreckt worden ist, bzw. als Kontrolle
eine nicht-markierte DNA auf einer anti-DIG-Oberfläche zeigen;
man wird die sehr große
Spezifität
der Oberflächen
und das Fehlen einer nicht-spezifischen Verankerung feststellen;
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die 6 das
Schema der Streckung von DNA durch Passage des Meniskus darstellt.
Die in Lösung
befindliche DNA wird auf einer behandelten Oberfläche verankert.
Die DNA-Lösung
ist mit einem runden, nicht-behandelten Plättchen abgedeckt;
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die 7 Histogramme
der Länge
der gekämmten λ-DNA-Moleküle auf Glasoberflächen:
- a) welche mit Silanmolekülen bedeckt sind, deren Ende
durch eine Amingruppe gebildet wird,
- b) welche mit Polylysin bedeckt sind;
- c) welche in einer Mischung von Wasserstoffperoxid/Schwefelsäure gereinigt
worden sind,
repräsentiert.
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die 8 gekämmte DNA-Moleküle auf mit Polylysin
bedeckten Glasoberflächen
repräsentiert. Man
stellt fest, dass die durch ihre beiden Enden angehefteten Moleküle Schleifen
bilden.
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die 9 YACs
repräsentiert,
welche durch Zurückziehen
eines behandelten Plättchens
von einer Lösung
dieser Moleküle
gekämmt
worden sind.
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die 10 die
Identifizierung des Vorhandenseins und der Größe eines Cosmids auf einem YAC
durch in situ-Hybridisierung zeigt.
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In dem Modus "Diagnostik" weisen die Sonden (die "Anker") eine reaktive Gruppe
(DIG, Biotin u.s.w.) auf, welche in der Lage ist, sich auf spezifische
Weise auf einer erfindungsgemäßen Oberfläche (welche
beispielsweise als Verankerungsstelle einen anti-DIG-Antikörper oder
Streptavidin aufweist) zu verankern. Der Nachweis der Verankerungsreaktion
kann direkt durch Nachweis der Fluoreszenz des durch fluoreszierende
Moleküle
(Ethidiumbromid, YOYO, fluoreszierende Nukleotide) gefärbten DNA-Moleküls erfolgen
(1). Er kann auch indirekt
durch Nachweis eines "Markierungsmoleküls": eines Reagens,
welches in der Lage ist, sich an das DNA/RNA-Molekül (beispielsweise
durch Hybridisierung, Protein-DNA-Wechselwirkung u.s.w.) anzuheften,
aber keine Affinität
für die
Verankerungsstellen der Sonde aufweist, erfolgen.
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In dem Modus "Kartierung" kann man die in situ-Hybridisierungstechniken
(FISH) einsetzen. Es ist auch möglich,
andere Techniken in Betracht zu ziehen, beispielsweise indem DNA
in Lösung
mit Sonden, welche fluoreszierende Reagenzien aufweisen, gemäß der Erfindung
hybridisiert wird. Der Nachweis der Lage der Sonden erfolgt nach
der Ausrichtung des Moleküls
gemäß der Erfindung.
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BEISPIEL 1
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Materialien
und Methoden
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λ-DNA
und der monoklonale Antikörper
(Anti-DIG) stammen von Boehringer-Mannheim. Die Trichlorsilane stammen
von Roth-Sochiel. Die fluoreszierenden Nukleinsäuresonden (YOYO1, YOYO3 und
POPO1) stammen von Molecular Probes. Die ultrareinen Glasplättchen stammen
von Erie Scientific (Plättchen
(ESCO). Die magnetischen Teilchen stammen von Dynal. Das Mikroskop
ist ein umgekehrtes Diaphot-Mikroskop von NIKKON, welches mit einer Xenon-Lampe
für die
Epifluoreszenz und einer verstärkten
Hamamatsu-CCD-Kamera für
die Visualisierung ausgerüstet
ist.
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Oberflächenbehandlung
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Glasplättchen werden eine Stunde durch UV-Bestrahlung
unter Sauerstoffatmosphäre
(durch Bildung von Ozon) gereinigt. Sie werden dann unverzüglich in
einen Exsiccator, aus welchem vorab Spuren von Wasser durch einen
Argonstrom herausgespült
worden sind, gelegt. Ein Volumen von ungefähr 100 bis 500 μl des geeigneten
Trichlorsilans (H2C=CH-(CH2)N-SiCl3) wird in
den Exsiccator eingeführt,
aus welchem die Oberflächen
nach ungefähr 12
h (n = 6) oder 1 h (n = 1) herausgenommen werden. Beim Herausnehmen
sind die Oberflächen
sauber und nicht-benetzend.
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Die funktionellen Gruppen dieser
Oberflächen
mit Doppelbindung (H2C=CH-) können zu
Carboxylgruppen (-COOH) umgewandelt werden, indem die, wie zuvor
beschrieben, behandelten Plättchen während ungefähr 10 min
in eine Lösung
von 25 mg KMnO4, 750 mg NaIO4 in
1 l Wasser eingetaucht werden, dann dreimal in ultrareinem Wasser
gespült
werden.
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Die so funktionalisierten Plättchen können mit
Proteinen reagieren. Ein Volumen von 300 μl einer wässrigen Lösung (20 μg/ml) von Proteinen (Protein
A, Streptavidin u.s.w.) wird auf ein mit (H2C=CH-)-Gruppen
funktionalisiertes Plättchen
aufgetragen. Dieses Plättchen
wird ungefähr
zwei Stunden bei Umgebungstemperatur inkubiert, dann dreimal in
ultrareinem Wasser gespült.
Die so behandelten Oberflächen
sind sauber und benetzend. Die mit Protein A behandelten Oberflächen können dann
mit einem Antikörper,
beispielsweise anti-DIG, durch Inkubation in einer Lösung von
20 μg/ml
Antikörper
reagieren.
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Außerdem kann man auf die Oberflächen, die
Carboxylgruppen aufweisen, Oligonukleotide aufpfropfen, welche ein
Amin-Ende (-NH2) aufweisen. 200 μl einer MES-Lösung (50
mM, pH 55), Carbodiimid (1 mg/ml) und 5 ml aminiertes Oligo (10
pmol/140 μl)
werden auf eine carboxylierte Oberfläche aufgetragen und ungefähr 8 h bei
Umgebungstemperatur inkubiert. Das Plättchen wird schließlich dreimal
in NaOH (0,4 M), dann viermal in ultrareinem Wasser gespült. Die
so hergestellten Plättchen
können
mit zu dem verankerten Oligonukleotid komplementären DNAs hybridisieren.
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Verankerung von nativer
DNA auf Oberflächen
mit Doppelbindung
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Ein 2 μl-Tropfen einer Lösung von
durch Fluoreszenz (YOYO1, POPO1 oder YOYO3, aber ohne besondere
Beendigung) markierter λ-DNA
von variabler Konzentration und in unterschiedlichen Puffern (Gesamtanzahl
von Molekülen < 107)
wird auf ein vorbehandeltes (C=C-) Plättchen aufgetragen und mit
einem nicht behandelten Glasplättchen
(Durchmesser 18 mm) bedeckt. Die Zubereitung wird ungefähr 1 h bei
Umgebungstemperatur in einer wasserdampfgesättigten Atmosphäre inkubiert.
In einem 0,05 M MES-Puffer (pH = 5,5) beobachtet man eine praktisch
vollständige
Verankerung der DNA-Moleküle.
Im Gegenzug gibt es in einem 0,01 M Tris-Puffer (pH = 8,0) nahezu keinerlei verankertes
Molekül
(Verhältnis > 106).
Diese Abhängigkeit
kann die Kontrolle der Aktivierung/Desaktivierung der Oberflächen (gegenüber der
DNA) durch das Zwischenglied des pH erlauben.
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Die Wirkung des Meniskus auf das
Molekül ist
auf die unmittelbare Umgebung von diesem begrenzt. Der in Lösung befindliche
Teil des Moleküls vor
dem Meniskus fluktuiert frei und der an der Oberfläche angeheftet
bleibende Teil hinter dem Meniskus ist für eine Richtungsänderung
des Meniskus unempfindlich. Der Ausdehnungs- oder Streckungsgrad
des Moleküls
ist folglich gleichförmig
und unabhängig
von dessen Größe.
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Ausrichtung und Nachweis
der Verankerung durch Einwirkung des Meniskus
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Indem man die vorangegangene Zubereitung
in eine trockene Atmosphäre überführt, wird
die daraus verdunstende Lösung
die DNA-Moleküle,
die an der Oberfläche
verankert sind, senkrecht zum Meniskus strecken. Die auf das DNA-Molekül einwirkende
Kapillarkraft (einige Zehn Pikonewton) ist tatsächlich ausreichend, um das
Molekül
vollständig
zu strecken (größer als
die Entropieelastizitätskräfte), aber zu
gering, um die Bindung zwischen dem Ende des Moleküls und der
behandelten Oberfläche
zu zerreißen.
Da die DNA durch Fluoreszenz markiert ist, beobachtet man individuell
und leicht die gestreckten Moleküle
(gesamte Länge
ungefähr
22 μm).
Da die Verankerung zwischen der Oberfläche und der DNA auf die Enden
beschränkt
ist, konnte man gleichermaßen
gut DNAs des Phagen λ,
von YAC oder von E. coli (gesamte Länge über 400 μm) strecken. Dieses Präparat von
gestreckten, fluoreszierenden und an der frischen Luft befindlichen
DNAs ist mehrere Tage lang stabil und kann auf nicht zerstörerische Weise
durch Epifluoreszenz (umgekehrtes Nikkon-Diaphot-Mikroskop mit einem
Objektiv mit hundertfacher Vergrößerung,
O.N.: 1,25) beobachtet werden.
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Spezifische(r) Verankerung
und Nachweis
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Indem man die Oberflächen, wie
zuvor beschrieben, mit einem spezifischen monoklonalen Antikörper behandelt,
kann man sehr genau deren Spezifität kontrollieren. So wurde die
Spezifität
von mit anti-DIG behandelten Oberflächen gegenüber λ-DNAs, welche mit einem Oligonukleotid,
welches zu einem der Cos-Enden komplementär war, hybridisiert worden
waren und eine Digoxigenin (DIG)-Gruppierung aufwiesen, und gegenüber nicht hybridisierten
DNAs getestet. In dem ersten Fall wurde eine praktisch allgemeine
Streckung der verankerten Moleküle
durch Einwirkung des Meniskus beobachtet. In dem zweiten Fall wurden
lediglich einige verankerte DNA-Moleküle (< 10) in der gesamten Probe beobachtet.
Man schätzt
folglich, dass die Spezifität
der erfindungsgemäßen Methode
besser als 106 ist.
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λ-DNAs
wurden auch mit Oligonukleotiden, die zu einem der COS-Enden komplementär waren und
an carboxylierte Oberflächen,
wie oben beschrieben, angeheftet waren, hybridisiert. Die Hybridisierungsbedingungen
(reines Wasser bei 40°C) waren
nicht stringent, da unter stringenten Bedingungen (hoher Salzgehalt)
die Fluoreszenz der YOYO1-Sonden verschwindet und die hybridisierten DNAs
nicht gesehen werden können.
Die so hybridisierten DNAs konnten ebenfalls durch Passage des Meniskus
ausgerichtet werden.
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Nachweisempfindlichkeit
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Um die Empfindlichkeit der Nachweismethode
durch Meniskus-Streckung zu bestimmen, wurden auf Oberflächen mit
Doppelbindung 2,5 μl-Tropfen
einer λ-DNA-Lösung in
0,05 M MES (pH = 5,5), enthaltend insgesamt 105,
104 und 1000 Moleküle, aufgetragen. Die Verankerung
und die Ausrichtung erfolgen, wie zuvor beschrieben. Die Plättchen werden dann
im Mikroskop durch Epifluoreszenz beobachtet, um die Dichte von
gekämmten
Molekülen
zu bestimmen. Diese entspricht jener, die abgeschätzt wurde, gut:
ungefähr
4–6 DNA-Moleküle pro Beobachtungsfeld
(100 μm × 100 μm) bei einer
Gesamtmenge von 105 DNA-Molekülen. Bei
der geringsten Konzentration konnten ungefähr 10 DNA-Moleküle beobachtet werden,
die durch die Einwirkung des Meniskus gestreckt wurden. Diese Anzahl
wird im wesentlichen durch die große Anzahl von Sichtfeldern,
welche erforderlich sind, um die gesamte Probe abzudecken (ungefähr 25000),
begrenzt, was eine manuelle Untersuchung schwierig macht, aber vorteilhaft
automatisch und mit einem schwächeren
Objektiv, aber mit einem größeren Feld
ausgeführt
werden kann. Als Schlussfolgerung erlaubt die Empfindlichkeit der
erfindungsgemäßen Methode
einen individuellen Nachweis und eine individuelle Zählung von
weniger als 1000 DNA-Molekülen.
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Abhängigkeit der Streckung von
der Oberflächenbehandlung
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Das Histogramm der Längen von λ-DNA-Molekülen, welche
auf unterschiedliche Oberflächen aufgepfropft,
dann durch Passage des Meniskus ausgerichtet wurden, zeigt einen
gut definierten Peak, der aber für
die verschiedenen Oberflächen unterschiedlich
ist. So wird die DNA auf Oberflächen, die
mit einem Silan, welches Enden in Form einer Vinylgruppe aufweist,
bedeckt sind, bis zu ungefähr
22 μm gestreckt
(siehe oben); für
silanisierte Oberflächen
mit einer Amingruppe (-NH2) weist das Histogramm
einen Peak bei 21 μm
(7(a)) und auf sauberem
Glas bei ungefähr
18,5 μm
(7(c)) auf.
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Die Streckung hängt folglich von der Oberflächenbehandlung
ab.
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BEISPIEL 2
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Kämmen von DNA-Molekülen auf
unterschiedlichen Oberflächen
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Es wurde das Molekülkämmen von
DNA auf auf unterschiedliche Weise behandelten Glasoberflächen beobachtet.
Man spielt mit dem Adsorptions unterschied zwischen den Enden des
Moleküls
und dem Rest von jenem. Indem positiv geladene Polymere auf einer
Glasoberfläche
adsorbiert werden, begünstigt
man eine Adsorption der negativ geladenen DNA-Moleküle; wenn diese Ladung indessen hoch
ist, wird das DNA-Molekül über seine
gesamte Länge
angeheftet und das Kämmen
ist unmöglich.
Es ist aber möglich,
die Ladung der auf dem Glas adsorbierten Polymere zu modifizieren,
indem die pH-Bedingungen modifiziert werden; tatsächlich werden
die positiven Ladungen beispielsweise durch NH2-Gruppen
getragen, die bei einem pH unterhalb des pK der entsprechenden Base
in den protonierten Zustand NH3
+ übergehen.
Bei basischem pH verschwinden die Ladungen und die Oberfläche zieht
keine DNA mehr an. Indem man den pH fein kontrollierte, wurde beobachtet,
dass die DNA-Moleküle
in Lösung
von einem Zustand, wo sie an der Oberfläche vollständig angeheftet sind, zu einer
Zwischenphase, wo sie lediglich durch ihre Enden angeheftet sind,
dann zu einer Phase, wo die Oberfläche keine Affinität für die DNA
mehr aufweist, übergehen.
In der Zwischenphase ist das Molekülkämmen ausführbar.
-
Es wurden mit einem Silan, welches
Enden in Form einer NH2-Gruppe aufweist,
bedeckte Oberflächen
untersucht, bei denen man eine vollständige Anheftung bei pH < 8, ein Kämmen für 8,5 < pH < 9,5 beobachtet.
Die Anzahl von gekämmten
Molekülen ist
bei pH = 8,5 maximal, sie ist bei pH = 9 durch zwei geteilt und
bei pH = 9,5 durch 4. Es wurde auch die relative Streckung auf dieser
Oberfläche
bestimmt, die 1,26 entspricht, wie man dies sehen kann in dem Histogramm
2 der 7, welche Histogramme
der Länge
der λ-DNA-Moleküle, welche
auf Glasoberflächen:
- a) welche mit Silanmolekülen bedeckt sind, deren Ende
durch eine Amingruppe gebildet wird,
- b) welche mit Polylysin bedeckt sind;
- c) welche in einer Mischung von Wasserstoffperoxid/Schwefelsäure gereinigt
worden sind,
gekämmt
worden sind, repräsentiert.
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Man hat auch mit Polylysin bedeckte
Oberflächen
berücksichtigt,
die ähnliche
pH-Verankerungseigenschaften aufweisen: Kämmbereich 8,5, und eine relativ
geringere Streckung zeigen: 1,08. Man kann ein typisches Beispiel
in 8 ersehen, welches
auf mit Polylysin bedeckten Glas oberflächen gekämmte DNA-Moleküle repräsentiert.
Man stellt fest, dass die durch ihre beiden Enden angehefteten Moleküle Schleifen
bilden.
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Schließlich wurde das gleiche Verhalten
auf in einer Mischung von Wasserstoffperoxid/konzentrierter Schwefelsäure frisch
gereinigten Glasoberflächen
gefunden. Diese Oberflächen
sind sehr benetzend und verschmutzen schnell, indessen wurde ein Kämmbereich
zwischen 5,5 < pH < 7,4 beobachtet, wohingegen
der Bereich starker Adsorption bei pH = 4,5 liegt. Die relative
Ausdehnung oder Streckung der Moleküle entspricht 1,12.
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BEISPIEL 3
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Gleichförmige und
gerichtete Ausrichtuung von YAC
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1 μl
von vorab in ihrem Agaroseblock mit Hilfe einer fluoreszierenden
YOYO1-Sonde gefärbten YAC
wird bei 68°C
erwärmt,
mit Agarase behandelt, dann in 10 ml MES (50 mM, pH 5,5) verdünnt. Zwei silanisierte
Plättchen
(Oberflächen-C=C)
werden ≈ 1,5
h in dieser Lösung
inkubiert, dann mit ungefähr 170 μm/s zurückgezogen.
Die YAC-Moleküle
werden allesamt parallel zu der Richtung des Zurückziehens der Plättchen ausgerichtet
(9). Die Unversehrtheit
der so ausgerichteten Moleküle
ist besser als durch Verdampfung nach Abscheidung zwischen zwei
Plättchen.
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Hybridisierung eines Cosmids
an ein gekämmtes YAC
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Ein wie zuvor beschrieben gefärbtes YAC wird
auf einer Oberfläche
mit C=C (zwischen zwei Plättchen)
verankert, dann durch den Meniskus im Verlauf der Verdampfung der
Lösung
ausgerichtet. Die Sonden (Cosmide) werden durch Einbau eines biotinylierten
Nukleotids durch die "random
priming"-Technik
markiert. Die markierten Sonden (100 ng) und 5 μg beschallte (≈ 500 bps)
Lachssperma-DNA werden durch Präzipitation
in Naacetat und Ethanol gereinigt, dann in Formamid denaturiert.
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Die gekämmten YACs werden zwischen
zwei Plättchen
mit 120 μl
Denaturierungslösung
(70% Formamid, 2 × SSC)
auf einer Heizplatte bei 80°C
3 min denaturiert. Die zuvor denaturierten Sonden (20 ng) werden
auf das Plättchen
in einer Hybridisierungslösung
(55% Formamid, 2 × SSC,
10% Dextransulfat) aufgetragen, mit einem Plättchen abgedeckt, welches mit flüssigem Gummi
(Kautschukkitt) verklebt bzw. versiegelt wird. Die Hybridisierung
erfolgt eine Nacht bei 37°C
in einer feuchten Kammer.
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Die Sichtbarmachung der Hybride erfolgt
gemäß den bekannten
Protokollen für
die in situ-Hybridisierungen an dekondensierten Chromosomen (D. Pinkel
et al., PNAS USA 83, 2934 (1986) und PNAS USA 85, 9138 (1988)).
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Bei einer Fluoreszenzmikroskopie
beobachtet man dann hybridisierte Abschnitte, wie jenen, der in
der 10 gezeigt ist.
Dieses Beispiel zeigt die Möglichkeit,
das Vorhandensein eines Gens auf einem DNA-Molekül nachzuweisen, die zu Zwecken
einer Diagnose oder einer physischen Kartierung des Genoms eingesetzt
werden kann.