JP2010539468A - 表面結合分子を有する固体基質およびこの基質を生成および使用する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2007年9月17日に出願された米国仮特許出願第60/973,079号の優先権の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
本発明は、少数の分子、例えば10個以下の分子を凸面に、例えば頂点に含む固体基質と、その生成方法および使用方法とに関する。
当初、原子間力顕微鏡(AFM)は、固体表面トポグラフィーを観察するために開発された。現在、AFMは、薬物スクリーニングなど、生体分子間の相互作用の測定を含むがこれらに限定することのない広範な用途に使用されている。生体分子間の相互作用を測定する能力は、生体分子間の様々な会合および解離現象の特定を可能にする、強力な分析ツールである。例えばAFMは、細胞表面の特定のリガンドの位置および分布を見出すのに時々使用される。蛍光顕微鏡および放射性同位体は細胞表面のリガンドの分布を特定するのに使用されてきたが、これらの方法は、数十から数百の集塊リガンドの分布をミクロンサイズの規模でしか示すことができない。これとは対照的に、AFMによる生体分子間の相互作用力の測定は、より正確かつ詳細な分析をもたらし、ナノサイズのリガンド個々の位置を追跡可能にしかつ個々の生命現象の観察を可能にする。
本発明のいくつかの態様は、固体基質表面を修飾するための方法と、それを使用するための方法を提供する。具体的には、本発明の方法では、凸面を含む固体基質上に、プローブ、受容体、リガンド、または任意のその他の材料もしくは分子を修飾または結合させる。本明細書で使用される「凸面」という用語は、外側にまたは一般には表面の水平面上方に突出しまたは膨れた任意の表面を指す。凸面は、漸進的な曲率、鋭い突出、またはこれらの任意の組合せにすることができる。典型的には、本発明の方法により修飾された固体基質は、限定するものではないが走査型プローブ顕微鏡(SPM)、原子間力顕微鏡(AFM)、電気力顕微鏡(EFM)、磁力顕微鏡(MFM)、および数個の分子、即ち10個以下の分子、典型的には5個以下の分子、しばしば3個以下の分子、より頻繁には単一分子を分析することが可能なその他の分析デバイスなどの、分析デバイスで使用されるものである。
第1の固体基質表面の凸面に受容体を結合させて、複数の受容体を含む受容体結合基質を生成するステップと;
この受容体結合基質と、第2の固体基質の表面に結合されたリガンドとを、受容体−リガンド複合体結合固体基質を生成するのに十分な条件下で接触させるステップであって、複数の受容体の一部だけがリガンドと複合体を形成しているステップと;
この受容体−リガンド複合体を修飾して、表面修飾固体基質を生成するステップと
を含む。
二本鎖オリゴヌクレオチドを変性させて、一本鎖オリゴヌクレオチド結合基質を生成するステップと;
一本鎖オリゴヌクレオチドに、
(i)表面結合された標識二本鎖オリゴヌクレオチドを含む表面修飾固体基質を生成するのに十分な条件下で、相補的標識オリゴヌクレオチドを;または
(ii)表面結合二本鎖オリゴヌクレオチドに結合される酵素または触媒を含む表面修飾固体基質を生成するのに十分な条件下で、酵素または触媒を含む相補的オリゴヌクレオチドを
ハイブリダイズするステップとを含む。
中心原子と;
リンカーを通して中心原子に結合されかつ受容体に結合された官能基と;
中心原子に結合され、かつ第1の固体支持体の表面に結合された複数の末端を有するベース部分と
を含む。
(式中、
m、a、b、およびcのそれぞれは、独立して0または1であり;
xは、cが0の場合またはcが1の場合に1であり、xは、1からQ4−1の酸化状態までの整数であり;
yは、bが0の場合またはbが1の場合に1であり、yは、1からQ3−1の酸化状態までの整数であり;
zは、aが0の場合またはaが1の場合に1であり、zは、1からQ2−1の酸化状態までの整数であり;
nは、1からQ1−1の酸化状態までの整数であり;
Q1は、少なくとも3の酸化状態を有する中心原子であり;
Q2、Q3、およびQ4のそれぞれは、独立して、少なくとも3の酸化状態を有する分岐原子であり;
R1、R2、R3、R4、およびR5のそれぞれは、独立してリンカーであり;
Zは、受容体に結合された官能基であり;
Yのそれぞれは、独立して、前記ベース部分の末端にある官能基であり、
但し、複数のYは、n、x、y、およびzの積が少なくとも3であることを条件として、前記固体支持体の前記第1の表面に結合される)。
(i)固体基質の凸面に結合されたssDNAとハイブリダイズすることが可能な第1のDNA部分と;
(ii)その他の固体基質表面に結合されたssDNAとハイブリダイズすることが可能な第2のDNA部分と;
(iii)任意選択でプローブまたは標識と
を含む。
シランカップリング剤N−(3−(トリエトキシシリル)プロピル)−O−ポリエチレンオキシド
シランカップリング剤N−(3−(トリエトキシシリル)プロピル)−O−ポリエチレンオキシドウレタン(TPU)を、Gelestから購入した。その他の化学薬品全ては、Sigma−Aldrich製の試薬級のものであった。UV級溶融シリカプレートを、CVI Laserから購入した。研磨したSi(100)ウェーハ(ドーパント:リン;抵抗率:1.5〜2.1Ω・cm)をMEMC Electronic Materialsから購入した。脱イオン水(18MΩ・cm)は、蒸留水をBarnstead E−pure 3−Moduleシステムに通すことによって得られた。全ての短オリゴヌクレオチドはBionics(韓国)から購入した。
シリコンウェーハおよび溶融シリカプレート(デンドロン表面被覆率分析用;データは図示せず)を、ピラニア溶液[濃H2SO4:30%H2O2=7:3(v/v)]中で4時間超音波処理した。次いで基質を脱イオン水で完全に洗浄し、その後、脱イオン水、濃アンモニア溶液、および30%過酸化水素の混合物[5:1:1(v/v/v)]に、Teflonビーカ内で浸漬した。ビーカを水浴中に置き、80℃に10分間加熱した。基質を溶液から取り出し、脱イオン水で完全に濯いだ。基質を、脱イオン水、濃HCl、および30%H2O2の混合物[6:1:1(v/v/v)]が入っているTeflonビーカ内に再び置いた。ビーカを80℃に10分間加熱した。基質を溶液から取り出し、脱イオン水で完全に洗浄した。清浄な基質を真空チャンバ(30〜40mTorr)内で約30分間乾燥し、直ぐに次のステップで使用した。
ピラミッド型チップを有する標準的な長方形のシリコンカンチレバー(SICON、Applied NanoStructures;k=0.2N/m)を、まず80%硝酸溶液に浸漬することによって酸化し、次いで80℃に20分間加熱した。カンチレバーを溶液から取り出し、脱イオン水で完全に洗浄した。清浄なカンチレバーを真空チャンバ(30〜40mTorr)内で約30分間乾燥し、直ぐに次のステップで使用した。
シリコン/シリカ基質およびカンチレバーを、シランカップリング剤(0.20mL)を含有する無水トルエン(20mL)中に、窒素雰囲気中で4時間浸漬し、トルエンで洗浄し、次いで30分間110℃で加熱した。基質を、トルエン、トルエン−メタノール[1:1(v/v)]、およびメタノールに順次浸漬し、各洗浄溶液中で3分間超音波処理した。カンチレバーを、トルエンおよびメタノールで順次、完全に濯いだ。得られた基質およびカンチレバーを真空中(30〜40mTorr)で乾燥した。
上述のヒドロキシル化基質およびカンチレバーを、27−酸デンドロン(1.0mM)、カップリング剤、1,3−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)(29.7mM)、および4−ジメチルアミノピリジン(DMAP)(2.9mM)を含む塩化メチレン溶液中に、12〜24時間浸漬した。この作業で使用される27−酸デンドロン、9−アントリルメチル−3−({[トリス({[(1−{トリス[(2−{[(トリス{[2−カルボキシエトキシ]メチル}−メチル)アミノ]カルボニル}エトキシ)メチル]メチル}アミノ)カルボニル]−2−エトキシ}メチル)メチル]−アミノ}カルボニル)プロピルカルバメート(または27−酸、図16B)を、公知の手順に従い調製した。これらの化合物を最小量のジメチルホルムアミド(DMF)に溶解し、その後、塩化メチレンに添加した。反応後、基質を、塩化メチレン、メタノール、および水に順次浸漬し、各洗浄ステップで3分間超音波処理した。カンチレバーを、塩化メチレン、メタノール、および水で順次、完全に濯いだ。基質およびカンチレバーをメタノールで洗浄し、真空乾燥(30〜40mTorr)した。
デンドロン修飾カンチレバーおよび基質を、トリフルオロ酢酸(TFA)(1.0M)を含有する塩化メチレン溶液中で2時間撹拌した。反応後、20%(v/v)ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)を含む塩化メチレン溶液中に10分間浸漬した。基質を、塩化メチレンおよびメタノール中でそれぞれ3分間、超音波処理し、カンチレバーを、塩化メチレンおよびメタノールで順次、完全に濯いだ。基質およびカンチレバーを真空乾燥(30〜40mTorr)した。
上述のアミン末端基質およびカンチレバーを、ジ(N,N’−スクシニミジル)カーボネートまたはN,N’−ジスクシニミジルカーボネート(DSC)(25mM)およびDIPEA(1.0mM)を含有するアセトニトリル溶液中に、窒素雰囲気中で4時間浸漬した(図16A)。反応後、基質およびカンチレバーを、ジメチルホルムアミド中に30分間置き、メタノールで洗浄した。基質およびカンチレバーを真空乾燥(30〜40mTorr)した。
上述のNHS−係留基質およびカンチレバーを、DNA溶液(5.0mM MgCl2を含む25mM NaHCO3緩衝液(pH8.5)中、40μM)中に12時間浸漬した。DNA分子は、基質に固定された活性化NHS−エステルと反応する末端アミノ基を有する(図16A)。反応後、基質およびカンチレバーを、37℃で1時間、ハイブリダイゼーション緩衝溶液(2×SSPE緩衝液(pH7.4)、7.0mMドデシル硫酸ナトリウムを含有する)中で撹拌し、水で完全に濯いで非特異的に結合したオリゴヌクレオチドを除去した。基質およびカンチレバーを真空乾燥(30〜40mTorr)した。
シリコン基質およびカンチレバーを、トルエンに溶かした0.1%(v/v)APDES溶液と3時間反応させた(図16C)。シリル化後、基質およびカンチレバーを、デンドロンなしで行ったこと以外は上述のように処理した。
先に報告された、金標識DNAの合成方法を採用した。例えば、Alivisatosら、Nature、1996年、382巻、609〜611頁; Lowethら、Angew. Chem. Int. Ed.、1999年、111巻、1925〜1929頁;およびFuら、J. Am. Chem. Soc.、2004年、126巻、10832〜10833頁を参照されたい。このように、ビス(パラ−スルホナトフェニル)フェニルホスフィン脱水二カリウム塩(1mg)を金ナノ粒子(AuNP)溶液(10mL)に添加し、この溶液を22℃で一晩インキュベートした。次いでAuNPを、溶液の色が青く変わるまで、NaClを添加することによって沈殿させた。遠心分離後、上澄みを完全に除去し、AuNPを0.5×TBE緩衝液中に再分散させた。AuNPの濃度は2μMであった。次いでAuNP溶液を、トレート化DNA溶液と1:1のモル比で混合し、22℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、単一DNA固定化AuNPだけを、ランニング緩衝液として0.5×TBE緩衝液を用いた3%アガロースゲル電気泳動によって分離した。図17。単一リンカーDNA固定化AuNPに対応するバンドを、ゲルからスライスし、0.5×TBE緩衝液で満たされた透析膜中に置いた。別の操作後、膜中の溶液を慎重に回収し、DNA固定化AuNPを遠心分離によって濃縮した。これらの濃縮されたAuNP標識DNA分子を、50mM NaClを含有する0.5×TBE緩衝液中に再分散させた。AuNP標識DNA溶液の最終濃度は、約100nMであった。各溶液の濃度を、UV−可視分光法によって推定した。
全ての単一リンカーDNA捕獲実験は、NanoWizard AFM(JPK Instrument)を用いて行った。全てのAFM実験は、50mM NaClを含有する新しい0.5×TBE緩衝液(pH8.0)で、室温で実施した。各AFMチップを、1点で5回にわたり、繰り返し近付けかつ遠ざけ、全体で5点についてスキャンした。チップ速度は、0.2μm/秒に固定した。
一本鎖DNA(ssDNA)を選択的に溶解することができる大豆ヌクレアーゼを、実験で使用される酵素として選択した。S1ヌクレアーゼはこの酵素に取って代わることができるが、ssDNAを選択的に溶解することができる任意の酵素を使用することができる。AFMチップには、
dsDNAおよびssDNAの混合物を、同様の条件下で大豆ヌクレアーゼに曝して、ssDNAおよびdsDNAとの間の選択性を決定した。二本鎖DNAは、相補的ssDNAを上記ssDNAの1つとハイブリダイズすることによって形成した。dsDNAは、その主鎖がssDNAの場合よりも大きく負に帯電しているので、検出(即ち、保持)時間はssDNAの場合よりも短かった。ssDNAおよびdsDNAの保持時間を、図8Aに示す。図8B〜8Eは、それぞれ、酵素を添加した後の15分、30分、45分および60分でのHPLD分析結果である。図8A〜8Eからわかるように、dsDNAは溶解しないままであり、ssDNAだけが選択的に溶解した。
抗原−抗体相互作用を使用した単一分子によるAFMチップの修飾
上記実施例1および2に例示されたDNA−DNA相互作用を使用する方法に加え、AFMチップの頂点は、抗原−抗体相互作用を使用して単一分子により修飾される(図10)。シリコン(Si)ウェーハを、メソ空間技法を使用してデンドロンで修飾した後、デンドロンを、架橋反応を通してウサギ抗BSA(ウシ血清アルブミン)に結合する。残されたウサギ抗BSA溶液を洗い落としたら、Siウェーハに結合されたウサギ抗BSAおよび溶液中のBSAが、BSAを含有する溶液にマトリックスを浸漬することによって抗原−抗体反応を通して互いに特異的に結合するようにする。Siウェーハの場合と同様に、AFMチップはまずデンドロンによって修飾され、架橋を通してウサギ抗BSAによって再び修飾される。SiウェーハおよびAFMチップがAFM装置に導入され、次いでAFMチップをSi表面に近付くようにする。接近させる反復試行を通して、Siウェーハ表面に固定化されたBSAは、抗原−抗体反応を通してAFMチップに移される。次いで得られたAFMチップを、ウサギ抗BSAを含有する溶液に曝し、その結果、頂点に唯一の抗原−抗体−抗原複合体を有するAFMチップが得られる。
AFMチップ上の金属ナノロッド
多くの金属イオンは、静電相互作用および配位共有結合を通してdsDNAに結合することができる。結合された金属イオンは、還元プロセスを通して金属粒子に還元することができる。例えば、J. Mater. Chem.、2004年、14巻、611〜616頁を参照されたい。還元することができる適切な金属イオンには、限定するものではないが銅、白金、および銀が含まれる。金属還元法などの利点の1つは、ナノワイヤの厚さを、還元時間を調節することによって制御できることである。
AFMチップ上のインターカレーター−金属触媒
様々な有機化合物および金属は、dsDNA間で結合する。これらの材をインターカレーターと呼ぶ。これらには、シクロホスファミド、メルファラン、ブスルファン、クロラムブシル、マイトマイシン、シスプラチン、ブレオムチン、イリノテカン、ミトキサントロン、ダクチノマイシンなどの様々な化合物が含まれる。これら材料の利点は、様々な誘導体および豊かな適用可能性を有することである。
AFMチップに固定化された磁性粒子
この実施例は、AFMチップの頂点に磁性粒子を固定化するための方法を例示する。図13を参照されたい。
表面での部位特異的酵素または触媒反応
図14に示されるように、タンパク質キナーゼは、AFMチップに結合されたssDNA(上記実施例1および2の手順に従って調製された)とタンパク質キナーゼに結び付けられたDNAとをハイブリダイズすることによって、AFMチップの頂点に結合することができる。
単一分子結合
この実施例は、DNAに結び付けられているナノ粒子をAFMチップの頂点に導入するための方法を例示する。図15を参照されたい。
Claims (26)
- 第1の固体基質表面の凸面に受容体を結合させて、複数の受容体を含む受容体結合基質を生成するステップと;
該受容体結合基質と、第2の固体基質の表面に結合されたリガンドとを、受容体−リガンド複合体結合固体基質を生成するのに十分な条件下で接触させるステップであって、該複数の受容体の一部のみが該リガンドと複合体を形成しているステップと;
該受容体−リガンド複合体を修飾して、表面修飾固体基質を生成するステップと
を含む、固体基質表面を修飾するための方法。 - 約3個以下の受容体が前記リガンドと複合体を形成する、請求項1に記載の方法。
- 一つの受容体のみが前記リガンドと複合体を形成する、請求項2に記載の方法。
- 前記受容体−リガンド複合体が、二本鎖オリゴヌクレオチド、抗原−抗体複合体、オリゴペプチド−小分子複合体、またはオリゴペプチド−オリゴペプチド複合体である、請求項1に記載の方法。
- 前記受容体−リガンド複合体が、二本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項4に記載の方法。
- 前記受容体−リガンド複合体を修飾する前記ステップが:
前記二本鎖オリゴヌクレオチドと金属イオンとを、二本鎖オリゴヌクレオチド−金属イオン複合体を形成するのに十分な条件下で接触させるステップと;
表面結合金属ナノロッドを含む前記表面修飾固体基質を生成するのに十分な条件下で、該金属イオンを還元するステップと
をさらに含む、請求項5に記載の方法。 - 前記受容体−リガンド複合体を修飾する前記ステップが、前記二本鎖オリゴヌクレオチドとインターカレーター−金属触媒複合体とを、インターカレーター−金属触媒が内部にインターカレートされている表面結合二本鎖オリゴヌクレオチドを含む表面修飾固体基質を生成するのに十分な条件下で接触させるステップをさらに含む、請求項5に記載の方法。
- 前記受容体−リガンド複合体を修飾する前記ステップが:
前記二本鎖オリゴヌクレオチドを変性させて、一本鎖オリゴヌクレオチド結合基質を生成するステップと;
該一本鎖オリゴヌクレオチドに、
(i)表面結合標識二本鎖オリゴヌクレオチドを含む表面修飾固体基質を生成するのに十分な条件下で、相補的標識オリゴヌクレオチド;または
(ii)表面結合二本鎖オリゴヌクレオチドに結合される酵素または触媒を含む表面修飾固体基質を生成するのに十分な条件下で、酵素または触媒を含む相補的オリゴヌクレオチド
をハイブリダイズするステップと
を含む、請求項5に記載の方法。 - 前記二本鎖オリゴヌクレオチドを変性させる前記ステップの前に、結合されていない一本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも一部を前記固体基質表面から切断するステップをさらに含む、請求項8に記載の方法。
- 前記受容体結合基質と、第2の固体基質の表面に結合されたリガンドとを接触させる前記ステップが:
該第1の固体基質表面結合ssDNAと、該第2の固体基質表面に結合されたssDNAにハイブリダイズするリンカーssDNAとを、前記受容体−リガンド複合体結合固体基質を生成するのに十分な条件下で接触させるステップを含み、該リンカーssDNAは:
(i)該第1の固体基質の表面に結合されたssDNAとハイブリダイズすることが可能な第1のDNA部分と;
(ii)該第2の固体基質表面に結合されたssDNAとハイブリダイズすることが可能な第2のDNA部分と;
(iii)任意選択でプローブと
を含む、請求項5に記載の方法。 - 前記リンカーssDNAがプローブを含む、請求項10に記載の方法。
- 前記受容体−リガンド複合体が抗原−抗体複合体である、請求項4に記載の方法。
- 前記受容体−リガンド複合体を修飾する前記ステップが、前記抗原−抗体複合体と第2の抗体とを、抗原−抗体−第2抗体の表面結合複合体を含む表面修飾固体基質を生成するのに十分な条件下で接触させるステップを含む、請求項12に記載の方法。
- 前記受容体−リガンド複合体を修飾する前記ステップが、抗体−抗原−酵素連結2次抗体の表面結合複合体を含む表面修飾固体基質を生成するのに十分な条件下で、酵素連結2次抗体を添加するステップをさらに含む、請求項13に記載の方法。
- 前記受容体−リガンド複合体を修飾する前記ステップが、抗体−抗原−金属連結2次抗体の表面結合複合体を含む表面修飾基質を生成するのに十分な条件下で、金属連結2次抗体を添加するステップをさらに含む、請求項13に記載の方法。
- 前記受容体が、表面結合リンカーを介して前記第1の固体基質に結合される、請求項1に記載の方法。
- 前記表面結合リンカーが:
中心原子と;
リンカーを通して該中心原子に結合され、かつ受容体に結合されている官能基と;
該中心原子に結合され、かつ前記固体支持体の前記第1の表面に結合された複数の末端を有するベース部分と
を含む、請求項16に記載の方法。 - 前記表面結合リンカーが、式:
m、a、b、およびcのそれぞれは、独立して0または1であり;
xは、cが0の場合またはcが1の場合に1であり、xは、1からQ4−1の酸化状態までの整数であり;
yは、bが0の場合またはbが1の場合に1であり、yは、1からQ3−1の酸化状態までの整数であり;
zは、aが0の場合またはaが1の場合に1であり、zは、1からQ2−1の酸化状態までの整数であり;
nは、1からQ1−1の酸化状態までの整数であり;
Q1は、少なくとも3の酸化状態を有する中心原子であり;
Q2、Q3、およびQ4のそれぞれは、独立して、少なくとも3の酸化状態を有する分岐原子であり;
R1、R2、R3、R4、およびR5のそれぞれは、独立してリンカーであり;
Zは、受容体に結合された官能基であり;
Yのそれぞれは、独立して、前記ベース部分の末端にある官能基であり、
ここで、複数のYは、n、x、y、およびzの積が少なくとも3であることを条件として、前記固体支持体の前記第1の表面に結合される)
を有する、請求項17に記載の方法。 - Zが、N、O、S、P、およびこれらの組合せからなる群から選択されたヘテロ原子を含む、請求項18に記載の方法。
- 前記第1の固体基質が原子間力顕微鏡チップである、請求項1に記載の方法。
- 凸面を含む、解析的分析を行うように適応させた固体基質であって、複数の受容体と、第2の固体基質の表面に結合したリガンドとを接触させたときに、複数の受容体の一部のみがリガンドと複合体を形成するように、該凸面が、該リガンドと複合体を形成するように適応させた受容体を含む複数の表面結合デンドロンを含む、固体基質。
- 前記固体基質が原子間力顕微鏡チップである、請求項21に記載の固体基質。
- 前記デンドロンが、式:
m、a、b、およびcのそれぞれは、独立して0または1であり;
xは、cが0の場合またはcが1の場合に1であり、xは、1からQ4−1の酸化状態までの整数であり;
yは、bが0の場合またはbが1の場合に1であり、yは、1からQ3−1の酸化状態までの整数であり;
zは、aが0の場合またはaが1の場合に1であり、zは、1からQ2−1の酸化状態までの整数であり;
nは、1からQ1−1の酸化状態までの整数であり;
Q1は、少なくとも3の酸化状態を有する中心原子であり;
Q2、Q3、およびQ4のそれぞれは、独立して、少なくとも3の酸化状態を有する分岐原子であり;
R1、R2、R3、R4、およびR5のそれぞれは、独立してリンカーであり;
Zは、前記受容体に結合された官能基であり;
Yのそれぞれは、独立して、前記ベース部分の末端にある官能基であり、
ここで、複数のYは、n、x、y、およびzの積が少なくとも3であることを条件として、前記固体支持体の前記第1の表面に結合される)
を有する、請求項21に記載の固体基質。 - 前記受容体が、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、抗体、抗原、受容体、酵素、アプタマー、またはその他の生物学的にもしくは医薬品として活性な化合物である、請求項21に記載の固体基質。
- 凸面と、該凸面の頂点に結合された3個以下のプローブ分子とを含む、原子間力顕微鏡で使用するのに適切な物品。
- 前記凸面が単一プローブ分子を含む、請求項25に記載の物品。
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