CN107843736A - 一种胶体金早孕检测试剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种胶体金早孕检测试剂，所述胶体金早孕检测试剂主要由两部分组成，分别是链接一抗和二抗的金标液；本发明还公开了一种胶体金早孕检测试剂的制备方法，主要包括如下纳米金球的制备、纳米金球的BSPP修饰以及纳米金球的抗体修饰三个步骤；本发明采用带巯基的分子对胶体金进行初步修饰，制得稳定性超强的金标液，同时胶体金分别链接一抗和二抗，分别得到金标液一和金标液二，利用此方法制得的金标液稳定性高、反应迅速、灵敏度高、不消耗大量试纸耗材、成本低，可低温保存，冻融效果好。
Description
技术领域
本发明涉及早孕测试技术领域，尤其涉及一种胶体金早孕检测试剂及其制备方法。
背景技术
金作为重金属材料在公元前5世纪首次被提取出来，当金被分成低于100 nm大小的金纳米粒子金时变得更加珍贵。金纳米粒子(gold nanoparticle)即指金的微小颗粒，其直径在1～100 nm，金纳米粒子具有较高的电子云密度、介电特性和催化作用，具有很好的生物相容性，能与多种生物大分子结合，且不影响其生物活性。直径在纳米级别的金纳米粒子，基本单元都是微小尺寸的粒子，具有很多宏观金所没有的物理特性，例如光学效应、表面效应、小尺寸效应、介电限域效应、宏观量子隧道效应以及一些其他的特殊效应。金纳米粒子的特殊效应使得金纳米粒子广泛应用于材料、医学检验、疾病治疗等研究领域。
胶体金是一种常用的标记技术，是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术，有其独特的优点。近年已在各种生物学研究中广泛使用。在临床使用的免疫印迹技术几乎都使用其标记；同时在流式、电镜、免疫、分子生物学以至生物芯片中都可能例用到。1971年是Faulk 和Taytor将胶体金引入免疫化学，此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法，在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。
人绒毛膜促性腺激素（HCG）是由受孕妇女体内胎盘产生的一种糖蛋白类激素，早孕检测试纸采用双抗体夹心一步法技术，以胶体金为指示标记，检测尿液中的HCG浓度，来确诊妇女是否受孕。早孕试纸在使用过程中，通常将尿液滴在试纸上的检测孔中，如在试纸的对照区出现一条有色带（有的试纸显红色，有的试纸显蓝色，常见的为红色），表示阴性，说明未怀孕；反之，如在检测区出现明显的色带，则表示阳性，说明已经妊娠。目前最常见的早孕试纸是采用双抗体的方法，利用硝酸纤维素膜、金标垫和样品垫等组合而成，实现人绒毛膜促性腺激素的检测。
常规的早孕检测产品都是以试纸条的形式存在的，试纸条的保存需要一定的条件，试纸条出现损坏和变性都会影响检测的结果，同时试纸条它的生产需要多种耗材和昂贵的生产设备。
发明内容
本发明就是基于上述不足，提出一种胶体金早孕检测试剂及其制备方法，本发明采用带巯基的分子对胶体金进行修饰，制得稳定性超强的金标液，同时胶体金分别链接一抗和二抗，分别得到金标液一和金标液二，利用此方法制得的金标液稳定性高、反应迅速、灵敏度高、不消耗大量试纸耗材、成本低，可低温保存，冻融效果好。
为达到上述技术目的，本发明采用了一种胶体金早孕检测试剂，所述胶体金早孕检测试剂主要由两部分组成，分别是链接一抗和二抗的金标液。
作为本发明之优选，所述链接一抗和二抗的金标液分别为金标液一和金标液二。
在上述基础上，本发明还公开了一种胶体金早孕检测试剂的制备方法，主要包括如下步骤：
（1）纳米金球的制备：实验所用到的玻璃仪器均用王 水（盐酸：硝酸=3:1）浸泡4小时，多次冲洗干净后，待用，将0.8-1.0m l%（质量分数）氯金酸加入到100ml超纯水中，加热至沸腾状态，然后在快速搅拌状态下迅速加入2.0-2.4ml 1%（质量分数）的三水合柠檬酸钠，持续搅拌15-20mins，得到酒红色纳米金球溶液；
（2）纳米金球的BSPP修饰：取100ml的圆底烧瓶，将冷却至室温的纳米金球溶液加入其中，然后加入500-1000倍的BSPP，室温条件下，放置过夜，即得到BSPP稳定修饰的纳米金球溶液；
（3）纳米金球的抗体修饰：将BSPP修饰的纳米金球利用高速离心机，离心10-20mins，除掉液体，复融于质量分数0.5%的SDS溶液中，分成两份，以抗体与纳米金球按照100:1-1000:1的比例分别进行添加一抗和二抗，然后逐渐加入氯化钠溶液至最终达到0.1M，然后放置3-5 hours，离心除掉溶液中多余的抗体，重新溶解于0.2X TBE溶液中，即得到纳米金球的抗体修饰溶液。
优选的，所述步骤（1）中氯金酸质量分数为1%，所述三水合柠檬酸钠的质量分数为1%。
优选的，所述步骤（3）中，离心机的离心转速为5000-8000rcf。
采用上述制备方法后，本发明具有如下优点：
（1）本发明的一种超稳定的胶体金早孕检测试剂，具有非常好的稳定性，能够承受数十次的冻融循环而不破坏抗体与BSPP复合修饰的纳米金球的性质；
（2）在将两份抗体修饰的纳米金球混合后，加入孕妇晨尿，3-6mins左右即出现溶液聚集，即可显示早孕检测呈阳性；
（3）本发明的两种抗体修饰的纳米金球，分别储存于两个小型无色透明容器中，低温冷冻保存，使用前室温融化，然后分别滴加1-2滴于混合凹池中，混匀，加入待测样品，即可检测样品的HCG阳性还是阴性；
（4）本发明的抗体修饰纳米金球，稳定性好,反应灵敏，便于保存，同时节约生产制造成本，节能减排。
附图说明
图1所示的是本发明产品的使用过程步骤图。
具体实施方式
下面采用具体实施方式对本发明作进一步的说明。
一种胶体金早孕检测试剂，所述胶体金早孕检测试剂主要由两部分组成，分别是链接一抗和二抗的金标液，优选链接一抗和二抗的金标液分别为滴金标液一和金标液二，下面展开具体讲述。
本发明的胶体金早孕检测试剂主要由两部分组成，分别是链接一抗和二抗的金标液，金标液稳定性高，能够承受多次冻融而不破坏金标的性能。在使用时，分别滴加一滴金标液一和金标液二于指定小型透明凹槽内，再滴加一滴待测孕妇尿液，经观察，大概约3-5mins后，即可观察到红色透明液体发生反应聚集，变成无色透明液体。本发明利用二水合双(对磺酰苯基)苯基膦二钾盐（BSPP）对新制备的纳米金球进行修饰，得到稳定存在的胶体金液体，然后在利用一抗和二抗分别对胶体金进行二次修饰，得到金标液一和金标液二，金标液一和金标液二采用1%SDS缓冲液进行溶解，增强稳定性。本发明的产品稳定性极强，能够抵抗较高的外界干扰，同时本产品能够抵抗数次冻融破坏，本身的性能不发生较大改变，不影响检测结果。本发明可直接使用，操作简便，反应迅速灵敏，成本低，在胶体金快速检测领域具有极大的应用价值。
在上述基础上，本发明还公开了胶体金早孕检测试剂的制备方法，下面通过几个实施例来加以说明（请结合图1）。
实施例1
一种胶体金早孕检测试剂的制备方法，主要包括如下步骤：
（1）纳米金球的制备：实验所用到的玻璃仪器均用王水（盐酸：硝酸=3:1）浸泡4小时，多次冲洗干净后，待用，将0.8-1.0ml氯金酸加入到100ml超纯水中，加热至沸腾状态，然后在快速搅拌状态下迅速加入2.0-2.4ml的三水合柠檬酸钠，持续搅拌15-20mins，得到酒红色纳米金球溶液；
（2）纳米金球的BSPP修饰：取100ml的圆底烧瓶，将冷却至室温的纳米金球溶液加入其中，然后加入500-1000倍的BSPP，室温条件下，放置过夜，即得到BSPP稳定修饰的纳米金球溶液；
（3）纳米金球的抗体修饰：将BSPP修饰的纳米金球利用高速离心机，离心10-20mins，除掉液体，复融于质量分数0.5%的SDS溶液中，分成两份，以抗体与纳米金球按照100:1-1000:1的比例分别进行添加一抗和二抗，然后逐渐加入氯化钠溶液至最终达到0.1M，然后放置3-5 hours，离心除掉溶液中多余的抗体，重新溶解于0.2X TBE溶液中，即得到纳米金球的抗体修饰溶液。
在本发明中，优选步骤（1）中氯金酸质量分数为1%，优选三水合柠檬酸钠的质量分数为1%。
在本发明中，优选步骤（3）中，离心机的离心转速为5000-8000rcf。
实施例2
一种胶体金早孕检测试剂的制备方法，主要包括如下步骤：
（1）纳米金球的制备：实验所用到的玻璃仪器均用王水（盐酸：硝酸=3:1）浸泡6小时，多次冲洗干净后，待用，将1.0-1.2ml氯金酸加入到120ml超纯水中，加热至沸腾状态，然后在快速搅拌状态下迅速加入2.4-2.8ml的三水合柠檬酸钠，持续搅拌18-25mins，得到酒红色纳米金球溶液；
（2）纳米金球的BSPP修饰：取100ml的圆底烧瓶，将冷却至室温的纳米金球溶液加入其中，然后加入1000-1100倍的BSPP，室温条件下，放置过夜，即得到BSPP稳定修饰的纳米金球溶液；
（3）纳米金球的抗体修饰：将BSPP修饰的纳米金球利用高速离心机，离心15-25mins，除掉液体，复融于质量分数0.8%的SDS溶液中，分成两份，以抗体与纳米金球按照1000:1-1200:1的比例分别进行添加一抗和二抗，然后逐渐加入氯化钠溶液至最终达到0.2M，然后放置3-5 hours，离心除掉溶液中多余的抗体，重新溶解于0.4X TBE溶液中，即得到纳米金球的抗体修饰溶液。
在本发明中，优选步骤（1）中氯金酸质量分数为2%，优选三水合柠檬酸钠的质量分数为2%。
在本发明中，优选步骤（3）中，离心机的离心转速为8500-9000rcf。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种胶体金早孕检测试剂，其特征在于，所述胶体金早孕检测试剂主要由两部分组成，分别是链接一抗和二抗的金标液。
2.如权利要求1所述的一种胶体金早孕检测试剂，其特征在于，所述链接一抗和二抗的金标液分别为金标液一和金标液二。
3.一种如权利要求1所述的胶体金早孕检测试剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
纳米金球的制备：实验所用到的玻璃仪器均用王水（盐酸：硝酸=3:1）浸泡4小时，多次冲洗干净后，待用，将0.8-1.0ml氯金酸加入到100ml超纯水中，加热至沸腾状态，然后在快速搅拌状态下迅速加入2.0-2.4ml的三水合柠檬酸钠，持续搅拌15-20mins，得到酒红色纳米金球溶液；
纳米金球的BSPP修饰：取100ml的圆底烧瓶，将冷却至室温的纳米金球溶液加入其中，然后加入500-1000倍的BSPP，室温条件下，放置过夜，即得到BSPP稳定修饰的纳米金球溶液；
纳米金球的抗体修饰：将BSPP修饰的纳米金球利用高速离心机，离心10-20mins，除掉液体，复融于质量分数0.5%的SDS溶液中，分成两份，以抗体与纳米金球按照100:1-1000:1的比例分别进行添加一抗和二抗，然后逐渐加入氯化钠溶液至最终达到0.1M，然后放置3-5hours，离心除掉溶液中多余的抗体，重新溶解于0.2X TBE溶液中，即得到纳米金球的抗体修饰溶液。
4.如权利要求3所述的胶体金早孕检测试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中氯金酸质量分数为1%，所述三水合柠檬酸钠的质量分数为1%。
5.如权利要求3所述的胶体金早孕检测试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，离心机的离心转速为5000-8000rcf。
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