FR2802550A1 - Biopuces, preparation et utilisations - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne des biopuces, leur préparation et leurs utilisations. Elle concerne notamment des biopuces comprenant des acides nucléiques immobilisés sur un support au moyen de bras en forme d'arborescence et/ ou de bras portant une charge négative et/ ou directement sur des supports portant une charge négative. Les méthodes et biopuces selon la présente invention peuvent être utilisées pour la détection ou l'analyse de l'expression de gènes, pour la recherche de gènes d'intérêt, ou pour des applications diagnostiques, par exemple.
Description
BIOPUCES, PREPARATION ET UTILISATIONS
La présente invention concerne le domaine de la biologie et de la génétique.
Elle concerne en particulier de nouvelles compositions et méthodes pour la préparation de biopuces et leurs utilisations. Elle concerne notamment des biopuces comprenant des populations d'acides nucléiques particulières et/ou préparées à partir de molécules d'ancrages ou de supports particuliers. Les méthodes et biopuces selon la présente invention peuvent être utilisées pour la détection ou l'analyse de l'expression de gènes, pour la recherche de gènes
d'intérêt, ou pour des applications diagnostiques, par exemple.
Les puces à ADN (" DNA microarrays ") ou, plus généralement, les puces à acides nucléiques (" biopuces ") sont des systèmes miniaturisés d'analyse génétique à grande échelle, permettant par exemple d'étudier l'activité transcriptionnelle d'un grand nombre de gènes (analyse de l'expression génique), de déterminer la séquence d'un grand nombre de fragments d'ADN (dont les analyses de polymorphismes génétiques), etc. Leur principe général consiste à: - Fixer de façon ordonnée des fragments d'acides nucléiques sur un support, et ceci de manière miniaturisée afin de pouvoir fixer un grand nombre de fragments différents sur une surface réduite. La biopuce est l'ensemble constitué par le support et les fragments d'acides nucléiques fixés sur ce support. Dans la présente invention, les acides nucléiques fixés sur la biopuce sont désignés sous le nom de "cibles". Chaque acide nucléique (ou groupe d'acides nucléiques) correspondant à une séquence d'ADN ou d'ARN spécifique, est fixé à un endroit précis du support
(" spot >").
- Hybrider sur la puce une population d'acides nucléiques à analyser (quelle que soit leur nature et leur origine biologique). Nous désignons ici les acides nucléiques à analyser sous le nom de "sondes". Lors de l'hybridation, les acides nucléiques présents dans la sonde vont se fixer de façon spécifique aux cibles présentes sur la puce, dont la séquence nucléique est similaire à tout ou partie de la séquence de ces sondes, Mesurer la quantité de sondes spécifiquement hybridées sur chacune des cibles de la puce. Cette mesure peut être effectuée soit par marquage fluorescent ou radioactif préalable des sondes et lecture de la quantité de marquage présente après hybridation sur chaque cible, soit par d'autres types de mesure de la quantité d'hybridation sonde-cible pour chaque cible (telles que, par exemple et de façon non exhaustive, la mesure de micro-courants induits par la formation d'une capacité électrique sonde-cible double brin, ou la mesure directe de la masse moléculaire de
sonde fixée sur chaque cible).
Un certain nombre de biopuces ont été décrites dans l'art antérieur.
Cependant, ces biopuces présentent un certain nombre d'inconvénients ou de io limitations liés notamment à la nature des acides nucléiques cibles utilisés et/ou aux conditions de préparation des biopuces, qui rendent leur production et leurs
utilisation difficiles.
Ainsi, la technologie de puces à acides nucléiques simple brin développée par la société Affymetrix consiste à synthétiser des oligonucléotides directement sur le support de la puce, par photolithographie et synthèse d'ADN en phase solide. Ce principe, qui peut être obtenu avec d'autres méthodes de synthèse, est communément désigné par l'expression " synthèse in situ". Cependant, à ce jour, ce principe ne permet pas de synthétiser avec une efficacité suffisante des oligonucléotides de plus de 25 bases de long, et l'utilisation de tels oligonucléotides (longs de 25 bases ou moins) entraîne la présence de nombreuses hybridations non spécifiques des sondes, et par conséquent une mauvaise reproductibilité des
expériences utilisant ce système.
A cet égard, il est connu que la spécificité de l'hybridation entre deux fragments d'acides nucléiques (par exemple le complexe sonde-cible pour les biopuces) dépend des conditions dans lesquelles la réaction d'hybridation est faite, de la composition en bases de ces acides nucléiques, de leur similitude ou identité de séquence, et de la longueur de séquence identique. Ainsi, plus la longueur de séquence identique entre les deux fragments est grande, plus l'hybridation est spécifique. Cependant, au delà d'une certaine longueur, variable en fonction des séquences, mais en général de l'ordre de plus de 1000 bases, les structures moléculaires secondaires peuvent gêner le rendement de la réaction d'hybridation (repliement des molécules sur elles-mêmes, voire hybridation des molécules sur elles-mêmes). Il serait donc utile de disposer de technologies permettant de produire des biopuces comportant tout type d'acides nucléiques, dans des conditions compatibles avec une lecture efficace et sensible des hybridations. Toutefois, la fixation des acides nucléiques sur les supports de biopuces reste problématique à ce jour, en raison notamment des problèmes d'encombrement stérique et des
modes physico-chimique actuels de fixation sur les supports.
La question de l'encombrement stérique lié au dépôt d'un grand nombre de molécules sur une surface très petite ("spot" de chaque dépôt sur la puce) est importante. Il faut en effet que les molécules déposées (cibles) soient en nombre et en densité suffisants pour permettre la mesure de l'hybridation sur celles-ci des i5 molécules d'acides nucléiques à analyser (sondes). Cependant, il ne faut pas que cette densité soit telle que l'accès des molécules sondes aux molécules cibles soit
gêné par l'encombrement spatial des cibles.
Par ailleurs, les conditions de fixation des cibles sur la biopuce sont également importantes. En effet, il faut que cette fixation soit stable, idéalement de type covalent, sans toutefois diminuer la capacité des cibles à être hybridées sur les sondes. De ce point de vue, il faut idéalement que la fixation des cibles soit
effectuée par l'une des extrémités de la cible (5' ou 3') et non sur leur longueur.
Enfin, pour des questions à la fois d'encombrement stérique et de disponibilité des cibles sur toute leur longueur, mais aussi de faisabilité technique, la question n'est pas résolue de savoir s'il vaut mieux fixer directement les cibles sur le support de la puce ou s'il vaut mieux les y fixer par l'intermédiaire d'un "bras" (molécule
polymère, quelle que soit sa nature et sa taille).
La présente invention apporte maintenant des solutions avantageuses aux difficultés et aux limitations des techniques et produits de l'art antérieur. Ces solutions portent notamment sur les conditions de fixation des cibles sur le support, ainsi que sur la nature et/ou les caractéristiques physico-chimiques des molécules de fixation utilisées. L'invention décrit également des biopuces sur lesquelles des populations particulières de molécules cibles sont déposées, notamment des
populations d'acides nucléiques cibles de taille définie.
La présente invention décrit notamment une nouvelle approche de fixation d'acides nucléiques cibles sur des supports de biopuces. Elle peut être mise en oeuvre avec tout type d'acides nucléiques cibles tels que définis ci-après, et avec tout type de supports, tels que définis ci-après. Elle peut en outre être mise en oeuvre aussi bien avec des acides nucléiques cibles synthétisés directement sur le support de la biopuce (synthèse in situ) ou synthétisés indépendamment puis fixés
io sur la biopuce dans un second temps.
Plus particulièrement, selon un premier aspect, la présente invention réside dans l'utilisation, pour fixer les cibles sur la puce, de bras (ou molécules " espaceur" ou " linker ") ayant une structure spatiale (structure primaire ou secondaire de la molécule) en forme d'arborescence. En particulier, I'invention concerne, de manière générale, I'utilisation de toute molécule dont la structure spatiale est organisée selon un principe d'arborescence, que celle-ci soit à un ou plusieurs degrés de liberté, comme "bras" de fixation de cibles sur un support de biopuce. Ainsi, un premier objet de la présente invention réside dans une biopuce, caractérisée en ce qu'elle comprend des acides nucléiques immobilisés sur un
support au moyen de bras en forme d'arborescence.
Un autre aspect de la présente invention réside dans une biopuce composée d'acides nucléiques simple-brin fixés sur un support, dans laquelle les acides nucléiques simple-brin ont une longueur comprise entre 25 et 100 nucléotides
environ, de préférence entre 30 et 60 nucléotides environ.
Un autre aspect de l'invention réside également dans une biopuce comprenant des acides nucléiques immobilisés sur un support portant une charge électrique négative uniforme ou au moyen de bras portant une charge électrique négative. L'invention concerne également la préparation et l'utilisation des biopuces telles que définies ci-dessus, pour des analyses génétiques, du séquençage, la recherche de gènes, le diagnostic, etc. Pour permettre une meilleure compréhension de la présente invention, les définitions suivantes sont fournies. Sauf indications particulières, les autres termes techniques employés dans la présente demande doivent être interprétés selon leur
sens habituel.
Biopuce: Une biopuce s'entend au sens de l'invention de tout support sur lequel sont déposés des acides nucléiques cibles. Généralement, les acides nucléiques sont immobilisés sur le support, de préférence par liaison covalente. Ils peuvent être immobilisés directement sur le support, ou de manière indirecte, par l'intermédiaire de " bras ". Il peut s'agir de biopuces pour lesquelles les cibles ont été préalablement produites puis fixées sur le support, ou pour lesquelles les cibles sont synthétisées directement sur le support (y compris par photolithographie et synthèse d'ADN en phase solide). Les biopuces selon l'invention peuvent comprendre un nombre faible ou très élevé de cibles, et la taille de la surface totale
du support occupée par les cibles peut être variable.
D'une manière générale, le terme " bras " (ou " espaceur " ou " linker ") désigne toute molécule, utilisable pour fixer des acides nucléiques cibles à un support. Il s'agit de molécules incapables de former, de manière spécifique, des hybrides avec des acides nucléiques sondes. Il s'agit donc préférentiellement de molécules de nature essentiellement non nucléique. Dans la constitution des biopuces de l'invention, un seul type de " bras " ou encore " espaceur" ou " linker " peut être utilisé par biopuce ou, des mélanges de bras de structure différente. Toutefois, on préfère généralement utiliser un type unique de bras sur une seule biopuce, de façon à obtenir un signal homogène. A titre d'exemple, la molécule de bras peut être un polymère organique de nature protéique, glucidique
ou lipidique, ou un polymère non organique de synthèse.
Dans le contexte de la présente invention, les acides nucléiques " cibles "
présents sur le support de la biopuce peuvent être de nature et d'origine diverses.
Ainsi, il peut s'agir d'acides nucléiques simple ou double-brin, d'origine naturelle, synthétique et/ou semi-synthétique. En particulier, il peut s'agir d'oligonucléotides de synthèse, de produits de PCR, de gènes ou fragments de gènes, de plasmides, d'ADNc simple ou double-brin, d'ARN, etc. Il peut s'agir de populations d'acides nucléiques isolées à partir d'échantillons biologiques, tels que des biopsies, des échantillons de cellules, tissus ou organes mammifères, notamment humain, des échantillons d'origine végétale, animale, virale ou bactérienne, etc. S'agissant d'oligonucléotides, ils sont définis plus particulièrement comme des fragments d'acides nucléiques simple brin de longueur comprise entre 25 et 100 nucléotides,
que ceux-ci soient de nature ADN ou ARN.
Le support de la biopuce peut être de nature variée. Ainsi, il peut s'agir de tout support adapté à recevoir, de manière directe ou indirecte, des acides nucléiques cibles. En particulier, le support peut comporter une surface plane et/ou bombée, et être de nature solide ou semi-solide. Par ailleurs, le support peut avoir une forme et une dimension variables. On peut citer notamment les supports circulaires, rectangulaires, carrés, etc. La surface du support est préférentiellement comprise entre 300 et 3000 mm2, de préférence entre 400 et 1800 mm2. A titre d'exemple, on peut citer comme matériau entrant dans la constitution des supports le verre, silice (notamment la silice du verre après déprotection par l'ammoniaque),
poly-lysine, amino-silanes et/ou silanes amino-réactifs.
Comme indiqué ci-avant, un premier objet de la présente invention réside dans une biopuce, caractérisée en ce qu'elle comprend des acides nucléiques
immobilisés sur un support au moyen de bras en forme d'arborescence.
Ce principe, nouveau à notre connaissance, présente l'intérêt de pouvoir limiter les difficultés liées à l'encombrement stérique des molécules. En effet, le fait de fixer les acides nucléiques cibles au bout de l'arborescence de tels "bras" permet d'augmenter la surface de présentation de ces cibles aux acides nucléiques sondes étudiés (voir Figure 1). Par ailleurs, cela permet de diminuer le nombre de molécules à fixer directement sur le support des puces à ADN (seuls les troncs de ces "bras" sont fixés). Ceci permet donc d'obtenir une forte densité d'acides nucléiques cibles sur chaque "spot" de la puce tout en ayant un encombrement stérique de ces cibles diminué par rapport aux situations o les cibles sont soit directement fixées sur le support, soit fixées sur le support par l'intermédiaire d'un
"bras" linéaire.
Plusieurs natures physiques de bras ont été proposées dans l'art antérieur pour la fixation d'oligonucléotides sur des supports. On peut citer, de façon non io limitative, des oligoéthylène glycols linéaires de 26 à 105 atomes de longueur, sélectionnés pour leur capacité à être liés de façon covalente à l'une des extrémités de l'oligonucléotide d'une part, et d'autre part à être fixés de façon covalente à divers supports de biopuce. Toutefois, à ce jour, tous les bras qui ont été proposés présentent une structure primaire linéaire. La présente invention réside dans la mise en évidence que des bras non linéaires peuvent être utilisés pour fixer les
acides nucléiques aux supports, notamment des bras en forme d'arborescence.
Dans un mode plus particulier, le bras est un polymère ayant une
organisation spatiale en arborescence, de préférence de forme oblongue.
Avantageusement, le bras est un polymère ramifié, ayant un ou plusieurs niveaux
de ramification.
Le bras arborescent peut être préparé à partir de molécules de synthèse ou organiques. Il peut s'agir notamment de polymères de synthèse (artificiels) ou organiques (existant dans la nature), leurs dérivés, ou des composés mixtes,
comportant une partie organique et une partie synthétique.
Ainsi, dans un mode particulier de mise en oeuvre, le bras selon l'invention
comprend un polymère synthétique.
Dans un autre mode de mise en oeuvre, le bras selon l'invention comprend
un polymère organique.
S'agissant de composés organiques existant dans la nature, ceux-ci peuvent
être purifiés à partir d'extraits biologiques ou synthétisées artificiellement.
A titre d'exemple, le polymère organique peut être un polymère de sucres.
Un exemple spécifique d'une telle molécule est la molécule de glycogène, notamment de glycogène endogène chez l'être humain. Cette molécule est un polymère de sucres dont, à partir d'un tronc commun, de nombreuses ramifications s'étendent, elles-mêmes polymères de sucres. Un objet particulier de la présente demande concerne donc l'utilisation de glycogène ou de dérivés du glycogène dans
ce but.
Dans un autre mode de réalisation particulier, le polymère peut aussi être un polymère d'acides aminés, ou de tout type de molécules possédant des io groupements amine réactifs à une attaque nucléophilique ou d'autres types de
groupements chimiques pouvant être liés de façon covalente à un acide nucléique.
Pour la mise en oeuvre de l'invention, le tronc de la molécule servant de bras de fixation est fixé sur le support de la puce, de préférence de manière covalente, et les acides nucléiques cibles sont fixés (ou synthétisés directement) au bout de plusieurs ou de toutes les arborescences de la molécule, de préférence de manière covalente. La Figure 1 donne une représentation dans l'espace d'une biopuce construite au moyen d'un tel bras, en comparaison avec les biopuces fabriquées avec des bras linéaires. Préférentiellement, un type unique de molécules de bras est utilisé sur une même biopuce, à une densité qui peut être adaptée par l'homme du métier. Toutefois, il est entendu que des molécules de structure et/ou de
longueur et/ou de forme différentes peuvent être utilisées sur une même biopuce.
Les acides nucléiques peuvent, à titre d'exemple, être fixés sur le bras par l'intermédiaire d'un groupement amine qui soit réactif à une attaque nucléophilique, quelle que soit la nature de cette attaque. Par exemple, un groupement amine N3 peut être lié de façon covalente avec un acide nucléique sous l'action d'une exposition à la lumière. D'une façon plus générale, le bras polymère contient préférentiellement, en bout de chaîne de ses bras, un groupe chimique activable, quel que soit celui-ci, qui ait la capacité à être lié de façon covalente avec un groupe phosphate (ou autre) en bout de chaîne d'un acide nucléique. Ce groupe chimique activable peut être présent lors de la synthèse du polymère ou lui être ajouté dans un second temps. Il peut être actif d'emblée lors de la synthèse du polymère ou lors de sa fixation sur le polymère, ou bien être activé chimiquement
dans un second temps.
Un certain nombre de modes chimiques d'établissement de liaison covalente entre un nucléotide ou un acide nucléique d'une part, et un support de nature non nucléique d'autre part, ont été décrits dans l'art antérieur, par exemple pour la synthèse d'oligonucléotides in vitro ou pour la fixation d'oligonucléotides sur un support métallique. Ces techniques peuvent être utilisées dans le cadre de la présente invention pour fixer des acides nucléiques sur une puce à ADN, notamment en les fixant par l'intermédiaire de bras tels que définis ci-avant. Ceci io inclut la possibilité d'effectuer cette fixation par l'intermédiaire d'un système du type streptavidine. La fixation du bras sur le support peut se faire par l'intermédiaire d'un groupe chimique activable, en bout de tronc, qui puisse interagir avec des molécules du
support de façon à créer une liaison, idéalement de type liaison covalente.
Comme indiqué ci-avant, I'utilisation de bras arborescents selon la présente invention offre de nombreux avantages en termes de densité d'acides nucléiques cibles. Par exemple, dans le cas de "spots" de 20 pm de diamètre: - Dans le cas "A" de la fixation des cibles sur le support par l'intermédiaire de bras de fixation non arborescents (rapport moléculaire stochiométrique bras/cibles = 1), ou de la fixation fixation directe des cibles sur le support, la surface de présentation des cibles (surface à laquelle les sondes vont accéder pour être
hybridées aux cibles) est de: (Tr) X (rayon)2 = (Tr) x 0 2 = a (.m2).
- Dans le cas "B" de la fixation des cibles sur le support par l'intermédiaire de bras arborescents, on peut estimer que chaque bras forme une structure hémisphérique au niveau de la surface de présentation des cibles (surface de fixation des cibles sur le bras), soit, en d'autres termes, que la surface totale de présentation des cibles est de:
(1/2) x (4) x (r) x (rayon)2 = 2 x (r) x 2 = 2 x a (Pm2).
Cela revient donc à doubler la surface de présentation du cas "A", pour une densité de cibles constante. Ou inversement, pour une même quantité de cibles par "spot", de diminuer d'un facteur 2 leur densité et donc d'améliorer l'accessibilité des cibles pour les sondes (diminution de l'encombrement stérique). Par extension, si la surface des bras arborescents est de forme oblongue, la surface de présentation
des cibles est d'autant plus augmentée.
Par ailleurs, la densité de fixation des cibles sur des bras arborescents est, a priori, d'autant plus forte que celle obtenue par fixation directe des cibles sur le support de la puce ou par fixation des cibles par l'intermédiaire de bras linéaires (non arborescents) car, pour un même nombre de cibles fixées par "spot" de la puce, I'encombrement stérique des bras eux-mêmes à la surface du support de la
1o puce est inférieur dans le cas de bras arborescents par rapport aux bras linéaires.
Par conséquent, en réalité, la densité des cibles doit pouvoir être augmentée de plus d'un facteur 2 selon ce principe, ou l'encombrement stérique des cibles être
diminué de plus d'un facteur 2.
Cet aspect de l'invention permet donc à la fois, d'une part d'augmenter la densité de cibles par "spot" de la puce (et par conséquent d'augmenter la sensibilité de détection lors de la mesure de l'hybridation des sondes sur les cibles), et d'autre part simultanément de diminuer l'encombrement stérique des cibles (et par conséquent de favoriser l'hybridation des sondes sur les cibles, ce qui
augmente aussi la sensibilité de détection).
Comme indiqué ci-avant, les biopuces comprenant ce type de bras peuvent être composées d'un support comportant une surface plane et/ou bombée, de nature solide ou semi-solide. En outre, ces supports peuvent comprendre des
matériaux tels que verre, silice, poly-lysine, amino-silanes et/ou silanes amino-
réactifs, ou des supports chargés négativement, comme il sera décrit en détails dans la suite du texte. D'autre part, les acides nucléiques cibles immobilisés sur les arborescences des bras peuvent également être de nature, de composition et d'origine variées. Ainsi, il peut s'agir d'acides nucléiques simple ou double-brin, d'origine naturelle, synthétique et/ou semi-synthétique. En particulier, il peut s'agir d'oligonucléotides de synthèse, de produits de PCR, de gènes ou fragments de gènes, de plasmides (ou autres vecteurs tels que cosmides, YAC, phages, etc.), d'ADNc simple ou double-brin ou d'ARN. De même, la longueur des acides nucléiques peut être variée. Toutefois, on préfère cependant que les acides nucléiques aient une longueur inférieure à environ 1000 bases (ou paires de bases). Dans un mode particulier de mise en oeuvre, les acides nucléiques cibles sont constitués d'acides nucléiques simple-brin, notamment d'acides nucléiques
simple-brin ayant une longueur inférieure à 1000 bases.
Dans un mode particulier de mise en oeuvre, les acides nucléiques cibles io sont constitués d'ARN simple brin, de préférence ayant une longueur inférieure à 1000 bases. Il peut s'agir notamment d'ARN totaux ou d'ARNm, prélevés à partir d'un échantillon biologique. La présente invention décrit en effet pour la première fois l'utilisation d'ARN simple-brins comme cibles sur une biopuce. Ceci constitue
un autre objet particulier de la présente demande.
Dans une autre variante de l'invention, il s'agit d'ADN simple-brin, ou de
mélanges d'ADN et d'ARN simple-brins.
Dans un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, les acides nucléiques cibles simple-brin ont une longueur comprise entre 25 et 100
nucléotides environ, de préférence entre 30 et 60 nucléotides environ.
A cet égard, un objet particulier de la présente invention réside également dans une biopuce composée d'acides nucléiques simple-brin fixés sur un support, les acides nucléiques simple-brin ayant une longueur comprise entre 25 et 100 nucléotides environ, de préférence entre 30 et 60 nucléotides. L'invention réside également dans l'utilisation, comme acides nucléiques cibles, d'une population (de fragments) d'acides nucléiques simple brin ayant une longueur comprise entre 30 et 60 nucléotides environ, désignés dans la présente demande par l'expression
"oligonucléotides longs".
Selon une première variante particulière, les acides nucléiques simplebrin
sont des ADN simple-brin de longueur comprise entre 30 et 60 nucléotides environ.
Selon une autre variante particulière, les acides nucléiques simple-brin sont
des ARN simple-brin de longueur comprise entre 30 et 60 nucléotides environ.
Avantageusement, il s'agit d'acides nucléiques produits par synthèse chimique in vitro, selon les techniques connues de l'homme du métier (synthétiseurs). Ces oligonucléotides sont ensuite, dans un deuxième temps
immobilisés sur le support.
L'utilisation (de fragments) d'acides nucléiques de telle longueur permet, par opposition aux produits disponibles actuellement, d'obtenir une hybridation io spécifique des sondes sur leurs cibles correspondantes sur les biopuces. En effet, comme indiqué précédemment, I'utilisation d'oligonucléotides longs de 25 bases ou moins, tels que décrits dans l'art antérieur, entraîne la présence de nombreuses hybridations non spécifiques des sondes, et par conséquent une mauvaise reproductibilité des expériences utilisant ce système. L'utilisation selon l'invention d'oligonucléotides plus longs, notamment d'une longueur comprise entre 30 et 60 nucléotides, peut au contraire permettre d'obtenir une spécificité absolue d'hybridation. Les oligonucléotides longs peuvent, une fois synthétisés, être fixés sur le support de la biopuce, de manière ordonnée. Cette fixation peut être soit directe (fixation de l'oligonucléotide long directement sur le support), soit indirecte (fixation covalente de l'oligonucléotide long sur un "bras" tel que défini et décrit ci-avant, ce bras étant fixé sur le support). L'intérêt de fixer l'oligonucléotide long de façon indirecte est d'augmenter l'accessibilité des sondes à la séquence de l'oligonucléotide, par rapport à la situation de fixation directe o l'encombrement stérique est plus important. Cependant, la fixation directe de l'oligonucléotide long est possible et peut permettre une spécificité d'hybridation suffisante pour l'utilisation reproductible des biopuces à oligonucléotides. Quel que soit le mode de fixation (directe ou indirecte), les oligonucléotides sont fixés par une de leurs extrémités (5' ou 3') et non sur toute leur longueur, afin de donner aux sondes une bonne accessibilité aux oligonucléotides. Par ailleurs, dans le cas d'une fixation indirecte, deux choix sont possibles: soit les oligonucléotides longs sont fixés par une de leurs extrémités sur le bras, et les complexes oligonucléotide-bras sont ensuite déposés de façon ordonnée sur le support et fixés à celui-ci, soit le bras est d'abord fixé au support, et les oligonucléotides longs sont ensuite déposés de
manière ordonnée sur le complexe bras-support et fixés aux bras.
Dans ce mode de mise en oeuvre, le type de support et de bras utilisés peuvent être comme décrits ci-avant. L'utilisation de ce type de biopuces à oligonucléotides longs synthétisés chimiquement selon la présente invention offre certains avantages, par rapport à l'utilisation de cibles simple brin plus courtes et/ou de cibles double brin et plus longues produites par PCR: Tout d'abord, le fait que la cible soit de nature simple brin permet d'améliorer le rendement de la réaction d'hybridationde la sonde sur la cible. En effet, si la cible est de nature double brin, un nombre important de cibles vont s'hybrider sur elles-mêmes lors de cette réaction (le deuxième brin de la cible est en compétition
avec la sonde pour l'hybridation).
Ensuite, la synthèse chimique directe des cibles est de gestion plus simple que la synthèse des cibles par PCR. Dans le premier cas, seule la connaissance des séquences des cibles que l'on veut disposer sur la puce est nécessaire, alors que dans le second cas il est nécessaire de disposer matériellement d'acides nucléiques contenant ces séquences (en général sous forme de clones) afin de
pratiquer leur amplification spécifique par PCR.
D'autre part, l'amplification par PCR produit une population d'acides nucléiques double brin hétérogène avec, dans l'immense majorité des cas, la présence de fragments contaminants, même si ces fragments sont minoritaires dans le produit final de la réaction. Ceci entraîne la présence d'hybridations sondes-cibles aspécifiques et par conséquent un bruit de fond lors de la mesure des taux d'hybridation. A l'inverse, la synthèse directe des cibles simple brin permet d'obtenir des fragments d'acides nucléiques de séquence très homogène et permet à terme d'obtenir des cibles plus pures et par conséquent moins d'hybridation sonde-cible aspécifique. Cette spécificité est d'autant plus assurée lorsque les biopuces comportent des bras, arborescents ou non, chargés électriquement
comme il sera décrit plus loin.
Enfin, la synthèse chimique des sondes simple brin est automatisable de manière à obtenir des cibles purifiées, alors que les cibles double brin produites par
PCR doivent être purifiées avant leur fixation sur le support.
Les biopuces à oligonucléotides synthétiques longs selon l'invention représentent donc un avantage technique important par rapport aux produits et aux procédés décrits dans l'art antérieur. Cet avantage est d'autant plus grand lorsque ces biopuces comportent des bras arborescents ou des bras ou supports chargés électriquement En effet, la présente invention décrit en outre de nouvelles approches pour contrôler l'arrangement spatial des acides nucléiques et/ou des bras sur la biopuce, de manière à favoriser les conditions de présentation, et donc d'hybridation des sondes sur les cibles. En particulier, la présente invention montre à présent qu'il est is possible de déterminer (et de modifier) les caractéristiques électriques des bras (que ceux-ci soient des polymères organiques de nature protéique, glucidique ou lipidique, ou des polymères non organiques de synthèse) ou des supports de biopuce, de façon à améliorer les conditions d'hybridation, notamment la sélectivité
et la sensibilité des biopuces.
Cet aspect de l'invention peut être mis en oeuvre sur toutes les natures possibles de bras de fixation d'oligonucléotides sur les supports de biopuces, que leur structure primaire soit linéaire ou arborescente, et quelle que soit la nature du
support de la puce.
Ainsi, il est connu que les acides nucléiques sont chargés négativement (du fait que ce sont des acides faibles qui sont, dans les conditions habituelles, dans des environnements de pH supérieur à leur pKa; leurs fonctions acides sont situées sur les groupements phosphates qui assurent la liaison entre les sucres des nucléotides). Les interactions entre séquences d'acides nucléiques peuvent être, en simplification, schématisées comme suit: d'une part, ces séquences peuvent être hybridées entre elles par l'établissement de liaisons hydrogène et de forces de Van der Waals entre des bases complémentaires (ce qui peut être considéré comme une affinité entre elles), d'autre part elles peuvent se repousser du fait de leurs charges négatives au niveau des groupes phosphate. Pour obtenir une hybridation stable entre deux molécules simple brin d'acides nucléiques, il faut que l'attraction liée aux liaisons hydrogène et de Van der Waals soit supérieure à la répulsion liée aux charges négatives, ce qui est le cas lorsque le nombre de bases complémentaires adjacentes est suffisant pour obtenir une attraction supérieure à la répulsion. Un autre paramètre qui entre en compte est celui des contraintes atomiques de repliement des molécules (structures secondaires et tertiaires). Ces principes généraux concernant les acides nucléiques sont aussi valides au sein 1o d'une même molécule simple brin d'acide nucléique, quelle que soit sa longueur. Ils permettent d'expliquer la capacité ou non d'une telle molécule à s'hybrider ou non sur elle-même. En ce qui concemrne les bras de fixation des cibles sur le support de la puce, eux aussi sont soumis à des contraintes atomiques de structure secondaire et d'encombrement stérique, mais ils ne présentent pas de phénomène d'attraction et d'hybridation tels que ceux décris pour les acides nucléiques. Ces contraintes s'exerçant sur les bras sont aussi influencées par le fait que des brins
d'acides nucléiques soient fixés à leur(s) extrémité(s).
Un des problèmes posés par la fabrication des biopuces, que les cibles fixées soient des oligonucléotides simple brin (quelle que soit leur longueur) ou des ADN double brin (qu'il s'agisse de plasmides entiers ou de produits de réaction de polymérisation en chaîne (PCR)), est celui de l'accessibilité de ces cibles aux molécules sondes que l'on veut analyser et que l'on veut hybrider de façon spécifique sur leurs cibles correspondantes. Cette accessibilité conditionne le rendement des réactions d'hybridation et par conséquent la sensibilité et la spécificité de l'analyse des sondes. Cette accessibilité à l'hybridation sonde-cible est diminuée notamment par l'encombrement stérique des cibles fixées sur la puce, par les interactions entre cibles situées à proximité les unes des autres en raison de l'encombrement stérique (hybridations partielles) et par les structures secondaires de celles-ci (repliements intra-moléculaires des cibles). Les difficultés liées à l'encombrement stérique sont générées par la nécessité de disposer les cibles avec une forte densité sur chaque "spot" de la puce si l'on veut pouvoir détecter de faibles taux d'acides nucléiques spécifiques (sensibilité de détection) et diminuer les effets de saturation des capacités d'hybridation qui risquent de gêner la quantification des signaux d'hybridation. C'est pourquoi un principe général est de déposer des quantités moléculaires de cibles telles qu'elles soient en large
excès par rapport aux molécules correspondantes des sondes.
La présente invention permet de remédier à ces inconvénients. Elle décrit en effet l'utilisation de bras ou de supports particuliers, réduisant les interférences ioniques entre les cibles, et assurant ainsi une meilleure hybridation, y compris lorsque les cibles sont présentes à des densités élevées. Plus particulièrement, la io présente demande montre qu'il est possible d'utiliser, pour fixer les cibles sur le support des biopuces, des bras de fixation ayant une charge électrique négative ou
des supports chargés négativement.
Ainsi, un autre objet de l'invention réside dans une biopuce comprenant des acides nucléiques immobilisés sur un support au moyen de bras portant une charge électrique négative. Un autre objet de l'invention réside dans une biopuce comprenant des acides nucléiques immobilisés sur un support portant une charge électrique négative uniforme La présente invention réside également dans l'utilisation de molécules chargées négativement ou de supports chargés négativement, pour la préparation
de biopuces.
L'utilisation de bras de fixation qui soient chargés négativement de façon uniforme, dans les conditions expérimentales d'hybridation des sondes sur les cibles, permet avantageusement d'obtenir les phénomènes suivants: Les bras exercent des forces électriques de répulsion vis à vis des bras adjacents, ce qui a pour conséquence de diminuer à la fois leurs repliements propres et leur encombrement stérique, notamment au niveau de leurs extrémités fixées sur les cibles; - Les bras exercent des forces électriques de répulsion vis à vis des cibles qui sont fixées à leurs extrémités, ce qui a pour conséquence de pousser les cibles à se disposer vers "l'extérieur", c'est-à-dire à s'éloigner du support de la puce, les rendant plus accessibles aux sondes; - Ces contraintes mutuelles de répulsion ont pour conséquence de limiter les interactions attractives entre sondes adjacentes en les éloignant les unes des autres, les rendant plus accessibles aux sondes et diminuant les risques d'attractions mutuelles liées aux forces de Van der Waals ou aux liaisons hydrogène; Ce champ électrique négatif exercé du coté des cibles fixé aux bras a tendance à défaire les structures secondaires des cibles (c'est-à-dire à les linéariser) et par conséquent à diminuer le repliement des cibles sur elles-mêmes, les rendant plus accessibles aux sondes; - La couche située près du support de la puce et formée par les bras est globalement chargée de façon négative, ce qui a pour conséquence d'exercer une force de répulsion électrique vis à vis des sondes (elles- mêmes chargées négativement) et donc de diminuer les phénomènes d'hybridations aspécifiques sondes-cibles. Ceci permet de diminuer les phénomènes de bruit de fond lors de l'analyse des résultats d'hybridation, et par conséquent d'augmenter à la fois la sensibilité et la spécificité des analyses pratiquées par la technologie des puces à ADN. Cet aspect particulier de l'invention apporte donc une amélioration technologique claire aux méthodes de l'art, assurant meilleures sélectivité et
sensibilité aux biopuces.
Bien entendu, cet aspect de l'invention n'est pas limité aux biopuces dans lesquelles des bras sont utilisés. Au contraire, il s'applique également à l'utilisation d'un support de puce chargé négativement de façon uniforme, dans les situations o les cibles sont directement fixées sur le support sans bras intermédiaires. Ceci est valable que l'établissement des charges négatives sur le support soit effectué préalablement ou après la fixation des cibles sur le support. Ceci est un principe différent de celui qui consiste à déposer les cibles sur des micro-électrodes auxquelles on peut appliquer un courant électrique, car dans ce dernier cas la
charge électrique du support n'est pas homogène.
Dans cet aspect de l'invention, les biopuces peuvent comporter tout type de population d'acides nucléiques cibles telles que définies ci-avant, et les bras chargés négativement peuvent également comporter une forme en arborescence,
telle que mentionnée ci-avant.
La présente invention réside également dans l'utilisation des biopuces telles que décrites ci-avant, dans un but expérimental, thérapeutique, diagnostic. En particulier, I'invention concerne l'utilisation des biopuces décrites ci-avant - pour étudier la régulation de l'expression génétique, ou - pour la recherche de gènes ou fragments de gènes, ou pour l'identification de cibles, ou encore
- pour le diagnostic génétique.
Dans ces applications, les biopuces sont mises en contact avec une population d'acides nucléiques " sondes ", généralement préalablement marquée, puis le profil d'hybridation des sondes sur la biopuce est déterminé, selon les techniques connues de l'homme du métier. Un objet de l'invention réside donc également dans un procédé d'analyse de polynucléotides, comprenant la mise en contact d'une population de polynucléotides, préférentiellement marqués, avec une
biopuce selon l'invention, et la mise en évidence de la formation d'hybrides.
Il est entendu que la présente invention n'est pas limitée aux modes spécifiques de réalisation décrits ci-avant, mais s'étend également aux variantes
d'exécution entrant dans les connaissance normales de l'homme du métier.
Claims (29)
1. Biopuce, caractérisée en ce qu'elle comprend des acides nucléiques immobilisés sur un support au moyen de bras en forme d'arborescence.
2. Biopuce selon la revendication 1, caractérisée en ce que le bras est un polymère
ayant une organisation spatiale en arborescence.
3. Biopuce selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le bras est un
polymère ramifié, ayant un ou plusieurs niveaux de ramification.
4. Biopuce selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que le bras est un
polymère synthétique.
5. Biopuce selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que le bras est un
polymère organique.
6. Biopuce selon la revendication 5, caractérisée en ce que le bras est un polymère
de sucres, par exemple le glycogène ou un dérivé du glycogène.
7. Biopuce selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en
ce que les acides nucléiques sont fixés de manière covalente aux extrémités de
l'arborescence des bras.
8. Biopuce selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en
ce que les bras sont fixés au support, de manière covalente, par la partie tronc de
la molécule.
9. Biopuce selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en
ce que le support comporte une surface plane et/ou bombée.
10. Biopuce selon la revendication 9 caractérisée en ce que le support est un
support solide ou semi-solide.
11. Biopuce selon la revendication 10 caractérisée en ce que le support est composé de verre, silice, poly-lysine, amino-silanes et/ou silanes amino-réactifs.
12. Biopuce selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée
en ce que les acides nucléiques sont des acides nucléiques simple ou double-brin,
d'origine naturelle, synthétique et/ou semi-synthétique.
13. Biopuce selon la revendication 12 caractérisée en ce que les acides nucléiques sont choisis parmi les oligonucléotides de synthèse, les produits de PCR, les gènes ou fragments de gènes, des plasmides, des ADNc simple ou double-brin ou des ARN.
14. Biopuce selon la revendication 13 caractérisée en ce que les acides nucléiques sont des acides nucléiques simple-brin, notamment des molécules d'acides nucléiques simple-brin de longueur comprise entre 25 et 100 nucléotides environ,
de préférence entre 30 et 60 nucléotides environ.
15. Utilisation d'un polymère (notamment d'un polymère de sucres) ayant une organisation spatiale en forme d'arborescence, pour la fixation d'acides nucléiques
sur des supports.
16. Biopuce, caractérisée en ce qu'elle est composée d'acides nucléiques simple-
brin fixés sur un support, et en ce que les acides nucléiques simple-brin ont une
longueur comprise entre 30 et 60 nucléotides environ.
17. Biopuce selon la revendication 16, caractérisée en ce que les acides nucléiques simple-brin sont des ADN simple-brin de longueur comprise entre 30 et 60
nucléotides environ.
18. Biopuce selon la revendication 16, caractérisée en ce que les acides nucléiques simple-brin sont des ARN simple-brin de longueur comprise entre 30 et 60
nucléotides environ.
19. Biopuce selon l'une des revendications 16 à 18, caractérisée en ce que les
acides nucléiques simple-brin sont des acides nucléiques produits par synthèse
chimique in vitro.
20. Biopuce selon l'une des revendications 16 à 19, caractérisée en ce que les
io acides nucléiques simple-brin sont fixés sur le support par l'intermédiaire d'un bras.
21. Biopuce selon l'une des revendications 16 à 19, caractérisée en ce que les
acides nucléiques simple-brin sont directement fixés sur le support.
22. Biopuce selon l'une des revendications 16 à 20, caractérisée en ce que le
support est défini comme dans les revendications 9 à 11.
23. Biopuce selon la revendication 20 ou 21, caractérisée en ce que le bras ou le
support ont une charge électrique négative.
24. Biopuce caractérisée en ce qu'elle comprend des acides nucléiques immobilisés sur un support au moyen de bras portant une charge électrique négative.
25. Biopuce caractérisée en ce qu'elle comprend des acides nucléiques
immobilisés sur un support portant une charge électrique négative uniforme.
26. Utilisation d'une biopuce selon l'une des revendications 1 à 14 et 16 à 25 pour
étudier la régulation de l'expression génétique.
27. Utilisation d'une biopuce selon l'une des revendications 1 à 14 et 16 à 25 pour
la recherche de gènes ou fragments de gènes.
28. Utilisation d'une biopuce selon l'une des revendications 1 à 14 et 16 à 25 pour
l'identification de cibles.
29. Utilisation d'une biopuce selon l'une des revendications 1 à 14 et 16 à 25 pour
le diagnostic génétique.
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