CA2406948A1 - Biopuces, preparation et utilisations - Google Patents
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- YFCPZYIKHYLAEJ-UHFFFAOYSA-N CC(C(C(C(C(CO)O)O)O)NC(C)=O)C(CCCC1)(CCCCC1NC(CC(C(C)=O)NC)=O)O Chemical compound CC(C(C(C(C(CO)O)O)O)NC(C)=O)C(CCCC1)(CCCCC1NC(CC(C(C)=O)NC)=O)O YFCPZYIKHYLAEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
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Abstract
La présente invention concerne des biopuces, leur préparation et leurs utilisations. Elle concerne notamment des biopuces comprenant des acides nucléiques immobilisés sur un support au moyen de bras en forme d'arborescen ce et/ou de bras portant une charge négative et/ou directement sur des supports portant une charge négative. Les méthodes et biopuces selon la présente invention peuvent être utilisées pour la détection ou l'analyse de l'expression de gènes, pour la recherche de gènes d'intérêt, ou pour des applications diagnostiques, par exemple.
Description
BIOPUCES, PREPARATION ET UTILISATIONS
La présente invention concerne le domaine de la biologie et de la génétique.
Elle concerne en particulier de nouvelles compositions et méthodes pour la préparation de biopuces et leurs utilisations. Elle concerne notamment des biopuces comprenant des populations d'acides nucléiques particulières et/ou préparées à partir de molécules d'ancrages ou de supports particuliers. Les méthodes et biopuces selon la présente invention peuvent être utilisées pour la détection ou l'analyse de l'expression de gènes, pour la recherche de gènes d'intérét, ou pour des applications diagnostiques, par exemple.
Les puces à ADN (« DNA microarrays ») ou, plus généralement, tes puces à
acides nucléiques (« biopuces ») sont des systèmes miniaturisés d'analyse génétique à grande échelle, permettant par exemple d'étudier l'activité
transcriptionnelle d'un grand nombre de gènes (analyse de l'expression génique), de déterminer la séquence d'un grand nombre de fragments d'ADN (dont les analyses de polymorphismes génétiques), etc. Leur principe général consiste à:
- Fixer de façon ordonnée des fragments d'acides nucléiques sur un support, et ceci de manière miniaturisée afin de pouvoir fixer un grand nombre de fragments différents sur une surface réduite. La biopuce est l'ensemble constitué par le support et les fragments d'acides nucléiques fixés sur ce support. Dans la présente invention, les acides nucléiques fixés sur la biopuce sont désignés sous le nom de "cibles". Chaque acide nucléique (ou groupe d'acides nucléiques) correspondant à
une séquence d'ADN ou d'ARN spécifique, est fixé à un endroit précis du support (« spot »). Préférentiellement, les biopuces ont une densité supérieure à 500 spots par cm2, de préférence supérieure à 1000 spots par cm2 et encore plus préférentiellement supérieure à 5000 spots par cm2.
- Hybrider sur la puce une population d'acides nucléiques à analyser (quelle que soit leur nature et leur origine biologique). Nous désignons ici les acides nucléiques à analyser sous le nom de "sondes". Lors de l'hybridation, les acides nucléiques présents dans la sonde vont se fixer de façon spécifique aux cibles présentes sur la puce, dont la séquence nucléique est similaire à tout ou partie de la séquence de ces sondes,
La présente invention concerne le domaine de la biologie et de la génétique.
Elle concerne en particulier de nouvelles compositions et méthodes pour la préparation de biopuces et leurs utilisations. Elle concerne notamment des biopuces comprenant des populations d'acides nucléiques particulières et/ou préparées à partir de molécules d'ancrages ou de supports particuliers. Les méthodes et biopuces selon la présente invention peuvent être utilisées pour la détection ou l'analyse de l'expression de gènes, pour la recherche de gènes d'intérét, ou pour des applications diagnostiques, par exemple.
Les puces à ADN (« DNA microarrays ») ou, plus généralement, tes puces à
acides nucléiques (« biopuces ») sont des systèmes miniaturisés d'analyse génétique à grande échelle, permettant par exemple d'étudier l'activité
transcriptionnelle d'un grand nombre de gènes (analyse de l'expression génique), de déterminer la séquence d'un grand nombre de fragments d'ADN (dont les analyses de polymorphismes génétiques), etc. Leur principe général consiste à:
- Fixer de façon ordonnée des fragments d'acides nucléiques sur un support, et ceci de manière miniaturisée afin de pouvoir fixer un grand nombre de fragments différents sur une surface réduite. La biopuce est l'ensemble constitué par le support et les fragments d'acides nucléiques fixés sur ce support. Dans la présente invention, les acides nucléiques fixés sur la biopuce sont désignés sous le nom de "cibles". Chaque acide nucléique (ou groupe d'acides nucléiques) correspondant à
une séquence d'ADN ou d'ARN spécifique, est fixé à un endroit précis du support (« spot »). Préférentiellement, les biopuces ont une densité supérieure à 500 spots par cm2, de préférence supérieure à 1000 spots par cm2 et encore plus préférentiellement supérieure à 5000 spots par cm2.
- Hybrider sur la puce une population d'acides nucléiques à analyser (quelle que soit leur nature et leur origine biologique). Nous désignons ici les acides nucléiques à analyser sous le nom de "sondes". Lors de l'hybridation, les acides nucléiques présents dans la sonde vont se fixer de façon spécifique aux cibles présentes sur la puce, dont la séquence nucléique est similaire à tout ou partie de la séquence de ces sondes,
2 - Mesurer la quantité de sondes spécifiquement hybridées sur chacune des cibles de la puce. Cette mesure peut étre effectuée soit par marquage fluorescent ou radioactif préalable des sondes et lecture de la quantité de marquage présente après hybridation sur chaque cible, soit par d'autres types de mesure de la quantité
d'hybridation sonde-cible pour chaque cible (telles que, par exemple et de façon non exhaustive, la mesure de micro-courants induits par la formation d'une capacité
électrique sonde-cible double brin, ou la mesure directe de la masse moléculaire de sonde fixée sur chaque cible).
Un certain nombre de biopuces ont été décrites . dans l'art antérieur.
Cependant, ces biopuces présentent un certain nombre d'inconvénients ou de limitations liés notamment à la nature des acides nucléiques cibles utilisés et/ou aux conditions de préparation des biopuces, qui rendent leur production et leurs utilisation difficiles.
Ainsi, la technologie de puces à acides nucléiques simple brin développée par la société Affymetrix consiste à synthétiser des oligonucléotides directement sur le support de la puce, par photolithographie et synthèse d'ADN en phase solide. Ce principe, qui peut étre obtenu avec d'autres méthodes de synthèse, est communément désigné par l'expression « synthèse in situ". Cependant, à ce jour, ce principe ne permet pas de synthétiser avec une efficacité suffisante des oligonucléotides de plus de 25 bases de long, et l'utilisation de tels oligonucléotides (longs de 25 bases ou moins) entraine la présence de nombreuses hybridations non spécifiques des sondes, et par conséquent une mauvaise reproductibilité
des expériences utilisant ce système.
A cet égard, il est connu que la spécificité de l'hybridation entre deux fragments d'acides nucléiques (par exemple le complexe sonde-cible pour les biopuces) dépend des conditions dans lesquelles la réaction d'hybridation est faite, de la composition en bases de ces acides nucléiques, de leur similitude ou identité
de séquence, et de la longueur de séquence identique. Ainsi, plus la longueur de séquence identique entre les deux fragments est grande, plus l'hybridation est spécifique. Cependant, au delà d'une certaine longueur, variable en fonction des
d'hybridation sonde-cible pour chaque cible (telles que, par exemple et de façon non exhaustive, la mesure de micro-courants induits par la formation d'une capacité
électrique sonde-cible double brin, ou la mesure directe de la masse moléculaire de sonde fixée sur chaque cible).
Un certain nombre de biopuces ont été décrites . dans l'art antérieur.
Cependant, ces biopuces présentent un certain nombre d'inconvénients ou de limitations liés notamment à la nature des acides nucléiques cibles utilisés et/ou aux conditions de préparation des biopuces, qui rendent leur production et leurs utilisation difficiles.
Ainsi, la technologie de puces à acides nucléiques simple brin développée par la société Affymetrix consiste à synthétiser des oligonucléotides directement sur le support de la puce, par photolithographie et synthèse d'ADN en phase solide. Ce principe, qui peut étre obtenu avec d'autres méthodes de synthèse, est communément désigné par l'expression « synthèse in situ". Cependant, à ce jour, ce principe ne permet pas de synthétiser avec une efficacité suffisante des oligonucléotides de plus de 25 bases de long, et l'utilisation de tels oligonucléotides (longs de 25 bases ou moins) entraine la présence de nombreuses hybridations non spécifiques des sondes, et par conséquent une mauvaise reproductibilité
des expériences utilisant ce système.
A cet égard, il est connu que la spécificité de l'hybridation entre deux fragments d'acides nucléiques (par exemple le complexe sonde-cible pour les biopuces) dépend des conditions dans lesquelles la réaction d'hybridation est faite, de la composition en bases de ces acides nucléiques, de leur similitude ou identité
de séquence, et de la longueur de séquence identique. Ainsi, plus la longueur de séquence identique entre les deux fragments est grande, plus l'hybridation est spécifique. Cependant, au delà d'une certaine longueur, variable en fonction des
3 CA 02406948 2002-06-14 pCT~R00/03572 séquences, mais en général de l'ordre de plus de 1000 bases, les structures moléculaires secondaires peuvent gêner le rendement de la réaction d'hybridation (repliement des molécules sur elles-mêmes, voire hybridation des molécules sur elles-mêmes).
II serait donc utile de disposer de technologies permettant de produire des biopuces comportant tout type d'acides nucléiques, dans des conditions compatibles avec une lecture efficace et sensible des hybridations. Toutefois, la fixation des acides nucléiques sur les supports de biopuces reste problématique à
ce jour, en raison notamment des problèmes d'encombrement stérique et des modes physico-chimique actuels de fixation sur les supports.
La question de l'encombrement stérique lié au dépôt d'un grand nombre de molécules sur une surface très petite ("spot" de chaque dépôt sur la puce) est importante. II faut en effet que les molécules déposées (cibles) soient en nombre et en densité suffisants pour permettre la mesure de l'hybridation sur celles-ci des molécules d'acides nucléiques à analyser (sondes). Cependant, il ne faut pas que cette densité soit telle que l'accès des molécules sondes aux molécules cibles soit gêné par l'encombrement spatial des cibles.
Par ailleurs, les conditions de fixation des cibles sur la biopuce sont également importantes. En effet, il faut que cette fixation soit stable, idéalement de type covalent, sans toutefois diminuer la capacité des cibles à être hybridées sur les sondes. De ce point de vue, il faut idéalement que la fixation des cibles soit effectuée par l'une des extrémités de la cible (5' ou 3') et non sur leur longueur.
Enfin, pour des questions à la fois d'encombrement stérique et de disponibilité des cibles sur toute leur longueur, mais aussi de faisabilité technique, la question n'est pas résolue de savoir s'il vaut mieux fixer directement les cibles sur le support de la puce ou s'il vaut mieux les y fixer par l'intermédiaire d'un "bras" (molécule polymère, quelle que soit sa nature et sa taille).
La présente invention apporte maintenant des solutions avantageuses aux difficultés et aux limitations des techniques et produits de l'art antérieur.
Ces solutions portent notamment sur les conditions de fixation des cibles sur le support,
II serait donc utile de disposer de technologies permettant de produire des biopuces comportant tout type d'acides nucléiques, dans des conditions compatibles avec une lecture efficace et sensible des hybridations. Toutefois, la fixation des acides nucléiques sur les supports de biopuces reste problématique à
ce jour, en raison notamment des problèmes d'encombrement stérique et des modes physico-chimique actuels de fixation sur les supports.
La question de l'encombrement stérique lié au dépôt d'un grand nombre de molécules sur une surface très petite ("spot" de chaque dépôt sur la puce) est importante. II faut en effet que les molécules déposées (cibles) soient en nombre et en densité suffisants pour permettre la mesure de l'hybridation sur celles-ci des molécules d'acides nucléiques à analyser (sondes). Cependant, il ne faut pas que cette densité soit telle que l'accès des molécules sondes aux molécules cibles soit gêné par l'encombrement spatial des cibles.
Par ailleurs, les conditions de fixation des cibles sur la biopuce sont également importantes. En effet, il faut que cette fixation soit stable, idéalement de type covalent, sans toutefois diminuer la capacité des cibles à être hybridées sur les sondes. De ce point de vue, il faut idéalement que la fixation des cibles soit effectuée par l'une des extrémités de la cible (5' ou 3') et non sur leur longueur.
Enfin, pour des questions à la fois d'encombrement stérique et de disponibilité des cibles sur toute leur longueur, mais aussi de faisabilité technique, la question n'est pas résolue de savoir s'il vaut mieux fixer directement les cibles sur le support de la puce ou s'il vaut mieux les y fixer par l'intermédiaire d'un "bras" (molécule polymère, quelle que soit sa nature et sa taille).
La présente invention apporte maintenant des solutions avantageuses aux difficultés et aux limitations des techniques et produits de l'art antérieur.
Ces solutions portent notamment sur les conditions de fixation des cibles sur le support,
4 ainsi que sur la nature et/ou les caractéristiques physico-chimiques des molécules de fixation utilisées. L'invention décrit également des biopuces sur lesquelles des populations particulières de molécules cibles sont déposées, notamment des populations d'acides nucléiques cibles de taille définie.
La présente invention décrit notamment une nouvelle approche de fixation d'acides nucléiques cibles sur des supports de biopuces. Elle peut étre mise en oeuvre avec tout type d'acides nucléiques cibles tels que définis ci-après, et avec tout type de supports, tels que définis ci-après. Elle peut en outre étre mise en oeuvre aussi bien avec des acides nucléiques cibles synthétisés directement sur le support de la biopuce (synthèse in situ) ou synthétisés indépendamment puis fixés sur la biopuce dans un second temps. En outre, elle peut également être mise en oeuvre avec des molécules d'intérêt autres que des polynucléotides.
Plus particulièrement, selon un premier aspect, la présente invention réside dans l'utilisation, pour fixer les cibles sur la puce, de bras (ou molécules « espaceur » ou « linker ») ayant une structure spatiale (structure primaire ou secondaire de la molécule) en forme d'arborescence. En particulier, l'invention concerne, de manière générale, l'utilisation de toute molécule dont la structure spatiale est organisée selon un principe d'arborescence, que celle-ci soit à
un ou plusieurs degrés de liberté, comme "bras" de fixation de cibles sur un support de biopuce.
Ainsi, un premier objet de la présente invention réside dans une biopuce, caractérisée en ce qu'elle comprend des acides nucléiques immobilisés sur un support au moyen de bras en forme d'arborescence.
Un autre aspect de la présente invention réside dans une biopuce composée d'acides nucléiques simple-brin fixés sur un support, dans laquelle les acides nucléiques simple-brin ont une longueur comprise entre 25 et 100 nucléotides environ, de préférence entre 30 et 60 nucléotides environ.
Un autre aspect de l'invention réside également dans une biopuce comprenant des acides nucléïques immobilisés sur un support portant une charge électrique négative uniforme ou au moyen de bras portant une charge électrique négative.
La présente invention décrit notamment une nouvelle approche de fixation d'acides nucléiques cibles sur des supports de biopuces. Elle peut étre mise en oeuvre avec tout type d'acides nucléiques cibles tels que définis ci-après, et avec tout type de supports, tels que définis ci-après. Elle peut en outre étre mise en oeuvre aussi bien avec des acides nucléiques cibles synthétisés directement sur le support de la biopuce (synthèse in situ) ou synthétisés indépendamment puis fixés sur la biopuce dans un second temps. En outre, elle peut également être mise en oeuvre avec des molécules d'intérêt autres que des polynucléotides.
Plus particulièrement, selon un premier aspect, la présente invention réside dans l'utilisation, pour fixer les cibles sur la puce, de bras (ou molécules « espaceur » ou « linker ») ayant une structure spatiale (structure primaire ou secondaire de la molécule) en forme d'arborescence. En particulier, l'invention concerne, de manière générale, l'utilisation de toute molécule dont la structure spatiale est organisée selon un principe d'arborescence, que celle-ci soit à
un ou plusieurs degrés de liberté, comme "bras" de fixation de cibles sur un support de biopuce.
Ainsi, un premier objet de la présente invention réside dans une biopuce, caractérisée en ce qu'elle comprend des acides nucléiques immobilisés sur un support au moyen de bras en forme d'arborescence.
Un autre aspect de la présente invention réside dans une biopuce composée d'acides nucléiques simple-brin fixés sur un support, dans laquelle les acides nucléiques simple-brin ont une longueur comprise entre 25 et 100 nucléotides environ, de préférence entre 30 et 60 nucléotides environ.
Un autre aspect de l'invention réside également dans une biopuce comprenant des acides nucléïques immobilisés sur un support portant une charge électrique négative uniforme ou au moyen de bras portant une charge électrique négative.
5 L'invention concerne également la préparation et l'utilisation des biopuces telles que définies ci-dessus, pour des analyses génétiques, du séquençage, la recherche de gènes, le diagnostic, etc.
Pour permettre une meilleure compréhension de la présente invention, les définitions suivantes sont fournies. Sauf indications particulières, les autres termes techniques employés dans la présente demande doivent étre interprétés selon leur sens habituel.
Biopuce : Une biopuce s'entend au sens de l'invention de tout support sur lequel sont déposés des acides nucléiques cibles. Généralement, les acides nucléiques sont immobilisés sur le support, de préférence par liaison covalente. Ils peuvent être immobilisés directement sur le support, ou de manière indirecte, par l'intermédiaire de « bras ». II peut s'agir de biopuces pour lesquelles les cibles ont été préalablement produites puis fixées sur le support, ou pour lesquelles les cibles sont synthétisées directement sur le support (y compris par photolithographie et synthèse d'ADN en phase solide). Les biopuces selon l'invention peuvent comprendre un nombre faible ou très élevé de cibles, et la taille de la surface totale du support occupée par les cibles peut être variable.
D'une manière générale, le terme « bras » (ou « espaceur » ou « linker ») désigne toute molécule, utilisable pour fixer des acides nucléiques cibles à
un support. II s'agit de molécules incapables de former, de manière spécifique, des hybrides avec des acides nucléiques sondes. II s'agit donc préférentiellement de molécules de nature essentiellement non nucléique. Dans la constitution des biopuces de l'invention, un seul type de « bras » ou encore « espaceur » ou « linker » peut être utilisé par biopuce ou, des mélanges de bras de structure différente. Toutefois, on préfère généralement utiliser un type unique de bras sur WO 01/44503 CA 02406948 2002-06-14 pCT/FR00/03572
Pour permettre une meilleure compréhension de la présente invention, les définitions suivantes sont fournies. Sauf indications particulières, les autres termes techniques employés dans la présente demande doivent étre interprétés selon leur sens habituel.
Biopuce : Une biopuce s'entend au sens de l'invention de tout support sur lequel sont déposés des acides nucléiques cibles. Généralement, les acides nucléiques sont immobilisés sur le support, de préférence par liaison covalente. Ils peuvent être immobilisés directement sur le support, ou de manière indirecte, par l'intermédiaire de « bras ». II peut s'agir de biopuces pour lesquelles les cibles ont été préalablement produites puis fixées sur le support, ou pour lesquelles les cibles sont synthétisées directement sur le support (y compris par photolithographie et synthèse d'ADN en phase solide). Les biopuces selon l'invention peuvent comprendre un nombre faible ou très élevé de cibles, et la taille de la surface totale du support occupée par les cibles peut être variable.
D'une manière générale, le terme « bras » (ou « espaceur » ou « linker ») désigne toute molécule, utilisable pour fixer des acides nucléiques cibles à
un support. II s'agit de molécules incapables de former, de manière spécifique, des hybrides avec des acides nucléiques sondes. II s'agit donc préférentiellement de molécules de nature essentiellement non nucléique. Dans la constitution des biopuces de l'invention, un seul type de « bras » ou encore « espaceur » ou « linker » peut être utilisé par biopuce ou, des mélanges de bras de structure différente. Toutefois, on préfère généralement utiliser un type unique de bras sur WO 01/44503 CA 02406948 2002-06-14 pCT/FR00/03572
6 une seule biopuce, de façon à obtenir un signal homogène. A titre d'exemple, la molécule de bras peut être un polymère organique de nature protéique, glucidique ou lipidique, ou un polymère non organique de synthèse.
Dans le contexte de la présente invention, les acides nucléiques « cibles présents sur le support de la biopuce peuvent être de nature et d'origine diverses.
Ainsi, il peut s'agir d'acides nucléiques simple ou double-brin, d'origine naturelle, synthétique et/ou semi-synthétique. En particulier, il peut s'agir d'oligonucléotides de synthèse, de produits de PCR, de gènes ou fragments de gènes, de plasmides, d'ADNc simple ou double-brin, d'ARN, etc. II peut s'agir de populations d'acides nucléiques isolées à partir d'échantillons biologiques, tels que des biopsies, des échantillons de cellules, tissus ou organes mammifères, notamment humain, des échantillons d'origine végétale, animale, virale ou bactérienne, etc.
S'agissant d'oligonucléotides, ils sont définis plus particulièrement comme des fragments d'acides nucléiques simple brin de longueur comprise entre 25 et 100 nucléotides, que ceux-ci soient de nature ADN ou ARN.
Le support de la biopuce peut être de nature variée. Ainsi, il peut s'agir de tout support adapté à recevoir, de manière directe ou indirecte, des acides nucléiques cibles. En particulier, le support peut comporter une surface plane et/ou bombée, et être de nature solide ou semi-solide. Par ailleurs, le support peut avoir une forme et une dimension variables. On peut citer notamment les supports circulaires, rectangulaires, carrés, etc. La surface du support est préférentiellement comprise entre 300 et 3000 mm2, de préférence entre 400 et 1800 mm2. A titre d'exemple, on peut citer comme matériau entrant dans la constitution des supports le verre, silice (notamment la silice du verre après déprotection par l'ammoniaque), poly-lysine, amino-silanes et/ou silanes amino-réactifs.
Les figures annexées illustrent des modes de réalisation de l'invention et décrivent plus particulièrement Figure N°1 : Utilisation de bras de fixation des cibles arborescents ;
Utilisation de de bras de fixation des cibles non arborescents WO 01/44503 CA 02406948 2002-06-14 pCT/FR00/03572
Dans le contexte de la présente invention, les acides nucléiques « cibles présents sur le support de la biopuce peuvent être de nature et d'origine diverses.
Ainsi, il peut s'agir d'acides nucléiques simple ou double-brin, d'origine naturelle, synthétique et/ou semi-synthétique. En particulier, il peut s'agir d'oligonucléotides de synthèse, de produits de PCR, de gènes ou fragments de gènes, de plasmides, d'ADNc simple ou double-brin, d'ARN, etc. II peut s'agir de populations d'acides nucléiques isolées à partir d'échantillons biologiques, tels que des biopsies, des échantillons de cellules, tissus ou organes mammifères, notamment humain, des échantillons d'origine végétale, animale, virale ou bactérienne, etc.
S'agissant d'oligonucléotides, ils sont définis plus particulièrement comme des fragments d'acides nucléiques simple brin de longueur comprise entre 25 et 100 nucléotides, que ceux-ci soient de nature ADN ou ARN.
Le support de la biopuce peut être de nature variée. Ainsi, il peut s'agir de tout support adapté à recevoir, de manière directe ou indirecte, des acides nucléiques cibles. En particulier, le support peut comporter une surface plane et/ou bombée, et être de nature solide ou semi-solide. Par ailleurs, le support peut avoir une forme et une dimension variables. On peut citer notamment les supports circulaires, rectangulaires, carrés, etc. La surface du support est préférentiellement comprise entre 300 et 3000 mm2, de préférence entre 400 et 1800 mm2. A titre d'exemple, on peut citer comme matériau entrant dans la constitution des supports le verre, silice (notamment la silice du verre après déprotection par l'ammoniaque), poly-lysine, amino-silanes et/ou silanes amino-réactifs.
Les figures annexées illustrent des modes de réalisation de l'invention et décrivent plus particulièrement Figure N°1 : Utilisation de bras de fixation des cibles arborescents ;
Utilisation de de bras de fixation des cibles non arborescents WO 01/44503 CA 02406948 2002-06-14 pCT/FR00/03572
7 Figure N°2 : Uridine diphosphate glucose (UDPGIuc), selon Harper biochimie, R.K.
Murray, D.K. Granner, P.A. Mayes, V.W. Rodwell, Editeur Mc Graw-Hill International (UK) Ltd..
Figure N°3 : Liaison N au sein d'une glycoprotéine.
Figure N°4 : Liaison O au sein d'une glycoprotéine.
Figure N°5 : Ancrage des sondes de capture sur la biopuce par l'intermédiaire de molécules de glycogène (échelle non respectée).
Figure N°6 : Ancrage des sondes de capture sur la biopuce par l'intermédiaire de molécules de glycogène (échelle non respectée).
Figure N°7 : Structure de la molécule de glycogène en un point de ramification, selon Harper Biochimie.
Figure N°8 : Amylopectine montrant la ramification 1 -~ 6, selon Harper Biochimie.
Figure N°9 : Représentation schématique de l'agrécane du cartilage nasal bovin, selon Harper Biochimie.
Figure N°10: Représentation schématique de polymères d'immunoglobulines humaines. Les chaînes polypeptidiques sont représentées par des lignes épaisses ;
les ponts disulfure reliant les différentes chaînes polypeptidiques sont représentées par des lignes fines.
Comme indiqué ci-avant, un premier objet de la présente invention réside dans une biopuce, caractérisée en ce qu'elle comprend des acides nucléiques immobilisés sur un support au moyen de bras en forme d'arborescence.
WO 01/44503 CA 02406948 2002-06-14 pCT/FR00/03572
Murray, D.K. Granner, P.A. Mayes, V.W. Rodwell, Editeur Mc Graw-Hill International (UK) Ltd..
Figure N°3 : Liaison N au sein d'une glycoprotéine.
Figure N°4 : Liaison O au sein d'une glycoprotéine.
Figure N°5 : Ancrage des sondes de capture sur la biopuce par l'intermédiaire de molécules de glycogène (échelle non respectée).
Figure N°6 : Ancrage des sondes de capture sur la biopuce par l'intermédiaire de molécules de glycogène (échelle non respectée).
Figure N°7 : Structure de la molécule de glycogène en un point de ramification, selon Harper Biochimie.
Figure N°8 : Amylopectine montrant la ramification 1 -~ 6, selon Harper Biochimie.
Figure N°9 : Représentation schématique de l'agrécane du cartilage nasal bovin, selon Harper Biochimie.
Figure N°10: Représentation schématique de polymères d'immunoglobulines humaines. Les chaînes polypeptidiques sont représentées par des lignes épaisses ;
les ponts disulfure reliant les différentes chaînes polypeptidiques sont représentées par des lignes fines.
Comme indiqué ci-avant, un premier objet de la présente invention réside dans une biopuce, caractérisée en ce qu'elle comprend des acides nucléiques immobilisés sur un support au moyen de bras en forme d'arborescence.
WO 01/44503 CA 02406948 2002-06-14 pCT/FR00/03572
8 Ce principe, nouveau à notre connaissance, présente l'intérêt de pouvoir limiter les difficultés liées à l'encombrement stérique des molécules. En effet, le fait de fixer les acides nucléiques cibles au bout de l'arborescence de tels "bras"
permet d'augmenter la surface de présentation de ces cibles aux acides nucléiques sondes étudiés (voir Figure 1 ). Par ailleurs, cela permet de diminuer le nombre de molécules à fixer directement sur le support des puces à ADN (seuls les troncs de ces "bras" sont fixés). Ceci permet donc d'obtenir une forte densité d'acides nucléiques cibles sur chaque "spot" de la puce tout en ayant un encombrement stérique de ces cibles diminué par rapport aux situations où les cibles sont soit directement fixées sur le support, soit fixées sur le support par l'intermédiaire d'un "bras" linéaire.
Plusieurs natures physiques de bras ont été proposées dans l'art antérieur pour la fixation d'oligonucléotides sur des supports. On peut citer, de façon non limitative, des oligoéthylène glycols linéaires de 26 à 105 atomes de longueur, sélectionnés pour leur capacité à être liés de façon covalente à l'une des extrémités de l'oligonucléotide d'une part, et d'autre part à être fixés de façon covalente à
divers supports de biopuce. Toutefois, à ce jour, tous les bras qui ont été
proposés présentent une structure primaire linéaire et/ou sont de nature synthétique (voir WO
00/43539 et WO 99/10362). La présente invention réside dans la mise en évidence que des bras non linéaires peuvent être utilisés pour fixer les acides nucléiques aux supports, notamment des bras en forme d'arborescence, à base de préférence d'un polymère d'origine biologique.
Dans un mode plus particulier, le bras est un polymère ayant une organisation spatiale en arborescence, de préférence de forme oblongue.
Avantageusement, le bras est un polymère ramifié, ayant un ou plusieurs niveaux de ramification.
Le bras arborescent peut être préparé à partir de différentes molécules organiques, notamment de polymères organiques (existant dans la nature), leurs dérivés, ou de composés mixtes, comportant une partie organique et une partie synthétique.
WO 01/44$03 CA 02406948 2002-06-14 pCT/FR00/03$72
permet d'augmenter la surface de présentation de ces cibles aux acides nucléiques sondes étudiés (voir Figure 1 ). Par ailleurs, cela permet de diminuer le nombre de molécules à fixer directement sur le support des puces à ADN (seuls les troncs de ces "bras" sont fixés). Ceci permet donc d'obtenir une forte densité d'acides nucléiques cibles sur chaque "spot" de la puce tout en ayant un encombrement stérique de ces cibles diminué par rapport aux situations où les cibles sont soit directement fixées sur le support, soit fixées sur le support par l'intermédiaire d'un "bras" linéaire.
Plusieurs natures physiques de bras ont été proposées dans l'art antérieur pour la fixation d'oligonucléotides sur des supports. On peut citer, de façon non limitative, des oligoéthylène glycols linéaires de 26 à 105 atomes de longueur, sélectionnés pour leur capacité à être liés de façon covalente à l'une des extrémités de l'oligonucléotide d'une part, et d'autre part à être fixés de façon covalente à
divers supports de biopuce. Toutefois, à ce jour, tous les bras qui ont été
proposés présentent une structure primaire linéaire et/ou sont de nature synthétique (voir WO
00/43539 et WO 99/10362). La présente invention réside dans la mise en évidence que des bras non linéaires peuvent être utilisés pour fixer les acides nucléiques aux supports, notamment des bras en forme d'arborescence, à base de préférence d'un polymère d'origine biologique.
Dans un mode plus particulier, le bras est un polymère ayant une organisation spatiale en arborescence, de préférence de forme oblongue.
Avantageusement, le bras est un polymère ramifié, ayant un ou plusieurs niveaux de ramification.
Le bras arborescent peut être préparé à partir de différentes molécules organiques, notamment de polymères organiques (existant dans la nature), leurs dérivés, ou de composés mixtes, comportant une partie organique et une partie synthétique.
WO 01/44$03 CA 02406948 2002-06-14 pCT/FR00/03$72
9 Dans un mode particulier de mise en oeuvre, le bras selon l'invention comprend un polymère organique d'origine biologique. Le composé biologique utilisé pour la préparation du bras peut étre un sucre, un polypeptide, une glycoprotéine, un glycopolypeptide, une immunoglobuline, etc. éventuellement sous forme isolée, complexée ou multimérisée, le cas échéant fonctionnalisé ou modifié, notamment au moyen de molécules ou polymères synthétiques, ou de groupes chimiques réactifs.
S'agissant de composés organiques existant dans la nature, ceux-ci peuvent étre purifiés à partir d'extraits biologiques ou synthétisées artifïciellement.
Selon un premier mode avantageux de mise en oeuvre, le polymère organique est un polymère de sucres ou polysaccharides.
L'utilisation de tels polymères de sucres pour la préparation de biopuces ou, plus généralement, l'immobilisation d'acides nucléiques, présente de multiples intéréts et avantages, liés notamment à leurs propriétés chimiques et à leur structure primaire et secondaire.
Ainsi, les polysaccharides sont hydrophiles, ce qui est une condition favorable à
l'hybridation des sondes sur les cibles et notamment à celle des sondes de nature nucléotidique (ADN, ARN) ou dérivée (PNA). En effet, ces dernières sont hydrophiles et leur hybridation se fait en solution aqueuse. Un polymère d'ancrage hydrophobe risquerait donc de gêner l'hybridation en ayant un effet répulsif sur la solution d'hybridation.
D'autre part, les polysaccharides, notamment ceux décrits, ont des radicaux permettant la création de liaisons covalentes en bouts de chaîne (à toutes les extrémités), du fait de la présence de fonctions hydroxyles (OH). Les liaisons covalentes, peuvent étre, par exemple, des liaisons phosphate (C-P-C ou C-P-P-C
ou C-Pn-C) telles qu'il en existe dans les sucres nucléotidiques ou dans les polynucléotides donneurs de sucres qui interviennent dans la synthèse des polysaccharides et des glycoprotéines. Un exemple possible d'ancrage est basé
sur les étapes de la synthèse naturelle du glycogène et notamment la réaction du glucose-1-phosphate avec l'uridine triphosphate (UTP) en présence de l'enzyme UDPGIuc-pyrophosphorylase pour former l'uridine diphosphate glucose (UDPGIuc, WO 01/44503 CA 02406948 2002-06-14 pCT/FR00/03572 Figure n°2). II peut encore s'agir de liaisons azote (C-N-C-C) telles qu'elles existent dans les glycoprotéines (voir Figure n°3), de liaisons oxygène (C-O-C) comme c'est également le cas dans certaines glycoprotéines ou dans la structure même des polysaccharides (voir Figure n°4). Cette propriété permet donc d'établir de façon 5 simple des liaisons covalentes entre les polysaccharides et d'autres polymères (tels que, par exemple, des protéines, d'autres polysaccharides, ou des acides nucléiques).
La formation dans la nature de complexes « sucres nucléotidiques », par exemple
S'agissant de composés organiques existant dans la nature, ceux-ci peuvent étre purifiés à partir d'extraits biologiques ou synthétisées artifïciellement.
Selon un premier mode avantageux de mise en oeuvre, le polymère organique est un polymère de sucres ou polysaccharides.
L'utilisation de tels polymères de sucres pour la préparation de biopuces ou, plus généralement, l'immobilisation d'acides nucléiques, présente de multiples intéréts et avantages, liés notamment à leurs propriétés chimiques et à leur structure primaire et secondaire.
Ainsi, les polysaccharides sont hydrophiles, ce qui est une condition favorable à
l'hybridation des sondes sur les cibles et notamment à celle des sondes de nature nucléotidique (ADN, ARN) ou dérivée (PNA). En effet, ces dernières sont hydrophiles et leur hybridation se fait en solution aqueuse. Un polymère d'ancrage hydrophobe risquerait donc de gêner l'hybridation en ayant un effet répulsif sur la solution d'hybridation.
D'autre part, les polysaccharides, notamment ceux décrits, ont des radicaux permettant la création de liaisons covalentes en bouts de chaîne (à toutes les extrémités), du fait de la présence de fonctions hydroxyles (OH). Les liaisons covalentes, peuvent étre, par exemple, des liaisons phosphate (C-P-C ou C-P-P-C
ou C-Pn-C) telles qu'il en existe dans les sucres nucléotidiques ou dans les polynucléotides donneurs de sucres qui interviennent dans la synthèse des polysaccharides et des glycoprotéines. Un exemple possible d'ancrage est basé
sur les étapes de la synthèse naturelle du glycogène et notamment la réaction du glucose-1-phosphate avec l'uridine triphosphate (UTP) en présence de l'enzyme UDPGIuc-pyrophosphorylase pour former l'uridine diphosphate glucose (UDPGIuc, WO 01/44503 CA 02406948 2002-06-14 pCT/FR00/03572 Figure n°2). II peut encore s'agir de liaisons azote (C-N-C-C) telles qu'elles existent dans les glycoprotéines (voir Figure n°3), de liaisons oxygène (C-O-C) comme c'est également le cas dans certaines glycoprotéines ou dans la structure même des polysaccharides (voir Figure n°4). Cette propriété permet donc d'établir de façon 5 simple des liaisons covalentes entre les polysaccharides et d'autres polymères (tels que, par exemple, des protéines, d'autres polysaccharides, ou des acides nucléiques).
La formation dans la nature de complexes « sucres nucléotidiques », par exemple
10 lors de l'une des étapes intermédiaires de la synthèse naturelle du glycogène comme donneur de glucose (dans ce cas précis, la liaison sucre-nucléotide est une liaison diphosphate, aboutissant à l'uridine diphosphate glucose, avec une liaison glucose-ribose, voir Figure n°2) illustre ce type d'interaction et l'établissement de liaisons covalentes entre des sucres et des acides nucléiques. A titre d'exemple, la liaison polysaccharide-polynucléotide peut faire intervenir des liens de type 1 -~ 5, sucre1-sucre2, le sucre 1 étant à l'extrémité du polysaccharide, le sucre 2 étant celui du nucléotide se trouvant à l'extrémité 5' du polynucléotide.
Un autre avantage de l'utilisation de polysaccharides selon l'invention découle de leur structure primaire et secondaire. En effet, les polysaccharides utilisés dans la présente invention sont polyramifiés (voir Figure n°5). Par ailleurs, leur taille (21 nm de diamètre pour le glycogène) est tout à fait adaptée au format miniaturisé
des puces à ADN, et l'écart entre les embranchements (environ 13 résidus de glucose en ce qui concerne le glycogène naturel) permet d'éviter, de manière avantageuse, un encombrement stérique trop important des cibles fixées sur les extrémités du polymère ramifié. Un embranchement tous les 2 à 5 résidus, risquerait, en effet, de gêner l'hybridation des sondes. D'autre part, les polysaccharides, comme le glycogène, ont une forme sphérique adaptée aux surfaces, selon l'invention, de présentation des sondes (voir Figures 5 et 6).
Enfin, l'utilisation de polymères à base de sucres permet également de fixer, de façon covalente et grâce à l'une des liaisons chimiques telles que décrites précédemment, les sucres au support de la puce, soit par l'une quelconque de WO 01/44503 CA 02406948 2002-06-14 pCT/FR00/03572
Un autre avantage de l'utilisation de polysaccharides selon l'invention découle de leur structure primaire et secondaire. En effet, les polysaccharides utilisés dans la présente invention sont polyramifiés (voir Figure n°5). Par ailleurs, leur taille (21 nm de diamètre pour le glycogène) est tout à fait adaptée au format miniaturisé
des puces à ADN, et l'écart entre les embranchements (environ 13 résidus de glucose en ce qui concerne le glycogène naturel) permet d'éviter, de manière avantageuse, un encombrement stérique trop important des cibles fixées sur les extrémités du polymère ramifié. Un embranchement tous les 2 à 5 résidus, risquerait, en effet, de gêner l'hybridation des sondes. D'autre part, les polysaccharides, comme le glycogène, ont une forme sphérique adaptée aux surfaces, selon l'invention, de présentation des sondes (voir Figures 5 et 6).
Enfin, l'utilisation de polymères à base de sucres permet également de fixer, de façon covalente et grâce à l'une des liaisons chimiques telles que décrites précédemment, les sucres au support de la puce, soit par l'une quelconque de WO 01/44503 CA 02406948 2002-06-14 pCT/FR00/03572
11 leurs extrémités, soit, préférentiellement, par leur noyau. Cette liaison peut étre une liaison directe sur le support ou une liaison indirecte par l'intermédiaire d'une molécule d'ancrage, une telle molécule pouvant être, notamment, de nature protéique. Ainsi, dans le cas du glycogène naturel, celui-ci est lié de façon covalente par son noyau à une protéine, la glycogénine (en l'occurrence ici par un résidu tyrosine). Dans ce cas de figure, le polysaccharide est donc utilisé
dans ces applications sous forme d'une glycoprotéine.
Un exemple spécifique d'une telle molécule est la molécule de glycogène, notamment de glycogène endogène chez l'être humain. Cette molécule est un polymère de sucres dont, à partir d'un tronc commun, de nombreuses ramifications s'étendent, elles-mémes polymères de sucres. Un objet particulier de la présente demande concerne donc l'utilisation de glycogène ou de dérivés du glycogène dans ce but.
Le glycogène possède toutes les propriétés citées ci-dessus. Elle est disponible commercialement et peu coûteuse (Voir Figures n° 5, 6 et 7 : puce-glycogène-polynucléotide). Une molécule de glycogène peut présenter plus de 60 extrémités glucidiques libres, permettant donc de fixer plus de 60 sondes, ce qui correspond à
une capacité de fixation très importante, et très difficile à obtenir par synthèse artificielle de polymères, tout en gardant un encombrement spatial limité qui soit compatible avec l'utilisation prévue selon l'invention.
D'autres exemples de tels composés à base de sucres biologiques sont l'amylopectine ou tout autre polymère dérivé de la structure de l'amidon (voir Figure n°8), les glycosaminoglycanes (notamment les mucopolysaccharides), ainsi que tout autre polysaccharide, quels que soient le ou les sucres entrant dans sa composition (galactose, glucose, mannose, fucose, xylose, N'acétylgalactosamine, N-acétylglucosamine, etc.), pouvant présenter une structure ramifiée.
Le polymère ou composé organique arborescent peut encore être un polymère à base de glycoprotéines. De telles molécules existent dans la nature et ont pour propriété d'avoir une structure présentant un noyau protéique, autour duquel peuvent étre liés de façon covalente des polysaccharides (liaison O- ou N-en fonction des acides aminés qui servent de résidu et sur lesquels la chaîne WO 01/44503 CA 02406948 2002-06-14 pCT/FR00/03572
dans ces applications sous forme d'une glycoprotéine.
Un exemple spécifique d'une telle molécule est la molécule de glycogène, notamment de glycogène endogène chez l'être humain. Cette molécule est un polymère de sucres dont, à partir d'un tronc commun, de nombreuses ramifications s'étendent, elles-mémes polymères de sucres. Un objet particulier de la présente demande concerne donc l'utilisation de glycogène ou de dérivés du glycogène dans ce but.
Le glycogène possède toutes les propriétés citées ci-dessus. Elle est disponible commercialement et peu coûteuse (Voir Figures n° 5, 6 et 7 : puce-glycogène-polynucléotide). Une molécule de glycogène peut présenter plus de 60 extrémités glucidiques libres, permettant donc de fixer plus de 60 sondes, ce qui correspond à
une capacité de fixation très importante, et très difficile à obtenir par synthèse artificielle de polymères, tout en gardant un encombrement spatial limité qui soit compatible avec l'utilisation prévue selon l'invention.
D'autres exemples de tels composés à base de sucres biologiques sont l'amylopectine ou tout autre polymère dérivé de la structure de l'amidon (voir Figure n°8), les glycosaminoglycanes (notamment les mucopolysaccharides), ainsi que tout autre polysaccharide, quels que soient le ou les sucres entrant dans sa composition (galactose, glucose, mannose, fucose, xylose, N'acétylgalactosamine, N-acétylglucosamine, etc.), pouvant présenter une structure ramifiée.
Le polymère ou composé organique arborescent peut encore être un polymère à base de glycoprotéines. De telles molécules existent dans la nature et ont pour propriété d'avoir une structure présentant un noyau protéique, autour duquel peuvent étre liés de façon covalente des polysaccharides (liaison O- ou N-en fonction des acides aminés qui servent de résidu et sur lesquels la chaîne WO 01/44503 CA 02406948 2002-06-14 pCT/FR00/03572
12 polysaccharidique est fixée) (voir Figures n° 3 et 4). Ces polysaccharides peuvent être fixés en nombre variable, et notamment en nombre supérieur à 2. Une même glycoprotéine peut présenter plusieurs polysaccharides différant en longueur, en nombre de résidus entre les ramifications et en nature chimique des résidus (pentoses, hexoses etc.) sans que ceci n'affecte le principe général de leur utilisation dans ces applications. La structure générale de ces molécules peut être ramifiée. Dans ce cas de figure, les sondes de capture (ADN, ARN, PNA..) sont fixées de façon covalente à l'extrémité des chaînes de polysaccharides. La liaison de la glycoprotéine sur le support de la puce peut se faire soit au niveau du noyau protéique, soit au niveau d'une chaîne polysaccharidique, mais, dans ce cas, préférentiellement au niveau du noyau protéique, et de façon encore plus préférée par une liaison O- ou N- avec un résidu d'acide aminé, soit à une molécule intermédiaire d'ancrage elle même directement fixée sur le support, soit directement au support.
Ces molécules possèdent les propriétés requises pour leur application dans le cadre des biopuces selon l'invention, comme c'est le cas du complexe glycogène-glycogénine précédemment évoqué.
Dans le cas d'autres glycoprotéines, les caractéristiques spatiales peuvent varier (taille de la molécule, nombre de ramifications, et nombre de résidus entre les ramifications), mais elles restent dans les mêmes ordres de grandeur (facteur 10) que ceux cités pour le glycogène ou l'aggrégane, et sont donc compatibles avec leur utilisation pour des biopuces.
La présente invention fonctionne également avec des glycoprotéines présentant plusieurs chaines polysaccharidiques, dans le cas de figure où ces chaînes ne sont pas elles mêmes ramifiées, mais où la structure externe de la molécule reste globalement sphérique et possède, en périphérie, de nombreux sites de fixation de sondes (structure générale de type « oursin »), et une taille moléculaire du même ordre de grandeur que celle du glycogène ou de l'aggrégane.
Des exemples particuliers de tels composés sont les protéoglycannes, protéines renfermant des glycosaminoglycannes liés de façon covalente. Dans ces VVE 01/44503 CA 02406948 2002-06-14 pCT/FR00/03572
Ces molécules possèdent les propriétés requises pour leur application dans le cadre des biopuces selon l'invention, comme c'est le cas du complexe glycogène-glycogénine précédemment évoqué.
Dans le cas d'autres glycoprotéines, les caractéristiques spatiales peuvent varier (taille de la molécule, nombre de ramifications, et nombre de résidus entre les ramifications), mais elles restent dans les mêmes ordres de grandeur (facteur 10) que ceux cités pour le glycogène ou l'aggrégane, et sont donc compatibles avec leur utilisation pour des biopuces.
La présente invention fonctionne également avec des glycoprotéines présentant plusieurs chaines polysaccharidiques, dans le cas de figure où ces chaînes ne sont pas elles mêmes ramifiées, mais où la structure externe de la molécule reste globalement sphérique et possède, en périphérie, de nombreux sites de fixation de sondes (structure générale de type « oursin »), et une taille moléculaire du même ordre de grandeur que celle du glycogène ou de l'aggrégane.
Des exemples particuliers de tels composés sont les protéoglycannes, protéines renfermant des glycosaminoglycannes liés de façon covalente. Dans ces VVE 01/44503 CA 02406948 2002-06-14 pCT/FR00/03572
13 molécules, les protéines forment le « noyau protéique » de la molécule, et les glycosaminoglycannes forment ses ramifications. Préférentiellement, l'invention porte sur l'utilisation de l'aggrécane. L'aggrécane (voir figure n°9), est une glycoprotéine présente de façon naturelle notamment dans les cartilages. Elle peut se présenter sous la forme naturelle de multiples molécules de protéoglycannes agrégées sur un motif (polymère) central, tel que l'acide hyaluronique, cette agrégation pouvant se faire, par l'intermédiaire de liaisons covalentes ou non, avec le polymère central, et aboutissant à la formation d'une « super molécule »
multi-ramifiée, dont les propriétés générales de structure sont compatibles avec l'invention, et dont les extrémités libres, qui sont des sucres, peuvent étre liées aux cibles. Enfin, les protéoglycannes sont globalement chargés de façon négative, ce qui peut favoriser la spécificité de l'hybridation sonde-cible dans le cas où
celles-ci sont des acides nucléiques (ADN, ARN).
Dans un autre mode de réalisation particulier, le polymère peut aussi être un polymère d'acides aminés, ou de tout type de molécules possédant des groupements amine réactifs à une attaque nucléophile ou d'autres types de groupements chimiques pouvant être liés de façon covalente à un acide nucléique.
Le polymère organique peut ainsi étre un polymère à base de protéines ou de complexes protéiques (formés de plusieurs sous-unités, elles-mémes reliées entre elles par des liaisons covalentes telles que des liens disulfure), qui présentent une structure de type ramifiée.
Un exemple particulier de composé polypeptidique est représenté par les immunoglobulines (1g), que celles-ci soient sous forme simple ou sous forme de complexes (comme dans le cas des immunoglobulines de type A, voir Figure n°10).
Les immunoglobulines, molécules naturelles, sont faciles à produire en grande quantité après sélection de clones adéquats (immunoglobulines monoclonales).
Dans cette application, les immunoglobulines sont utilisées en tant que molécules d'ancrage des sondes de capture. Les sondes sont liées aux extrémités Fab des immunoglobulines, soit par une liaison de type antigène-anticorps classique, dans le cas où l'immunoglobuline est dirigée contre une portion de la sonde, soit, de WO 01/44503 CA 02406948 2002-06-14 pCT/FR00/03572
multi-ramifiée, dont les propriétés générales de structure sont compatibles avec l'invention, et dont les extrémités libres, qui sont des sucres, peuvent étre liées aux cibles. Enfin, les protéoglycannes sont globalement chargés de façon négative, ce qui peut favoriser la spécificité de l'hybridation sonde-cible dans le cas où
celles-ci sont des acides nucléiques (ADN, ARN).
Dans un autre mode de réalisation particulier, le polymère peut aussi être un polymère d'acides aminés, ou de tout type de molécules possédant des groupements amine réactifs à une attaque nucléophile ou d'autres types de groupements chimiques pouvant être liés de façon covalente à un acide nucléique.
Le polymère organique peut ainsi étre un polymère à base de protéines ou de complexes protéiques (formés de plusieurs sous-unités, elles-mémes reliées entre elles par des liaisons covalentes telles que des liens disulfure), qui présentent une structure de type ramifiée.
Un exemple particulier de composé polypeptidique est représenté par les immunoglobulines (1g), que celles-ci soient sous forme simple ou sous forme de complexes (comme dans le cas des immunoglobulines de type A, voir Figure n°10).
Les immunoglobulines, molécules naturelles, sont faciles à produire en grande quantité après sélection de clones adéquats (immunoglobulines monoclonales).
Dans cette application, les immunoglobulines sont utilisées en tant que molécules d'ancrage des sondes de capture. Les sondes sont liées aux extrémités Fab des immunoglobulines, soit par une liaison de type antigène-anticorps classique, dans le cas où l'immunoglobuline est dirigée contre une portion de la sonde, soit, de WO 01/44503 CA 02406948 2002-06-14 pCT/FR00/03572
14 manière préférentielle par une liaison covalente de type acide aminé (de 1'1g) -sucre (du polynucléotide).
II est entendu que l'homme du métier peut sélectionner d'autres composés d'origine biologique ayant les caractéristiques requises pour une utilisation dans la présente invention, à savoir la possibilité de créer de multiples liaisons avec une molécule d'intérêt (il peut s'agir par exemple d'acides nucléiques), une forme en arborescence assurant une excellente disponibilité et permettant d'augmenter la densité, et une absence d'interférence avec la réaction d'hybridation.
Pour la mise en oeuvre de l'invention, le tronc de la molécule servant de bras de fixation est fixé sur le support de la puce, de préférence de manière covalente, et les acides nucléiques cibles sont fixés (ou synthétisés directement) au bout de plusieurs ou de toutes les arborescences de la molécule, de préférence de manière covalente. La Figure 1 donne une représentation dans l'espace d'une biopuce construite au moyen d'un tel bras, en comparaison avec les biopuces fabriquées avec des bras linéaires. Préférentiellement, un type unique de molécules de bras est utilisé sur une méme biopuce, à une densité qui peut étre adaptée par l'homme du métier. Toutefois, il est entendu que des molécules de structure et/ou de longueur et/ou de forme différentes peuvent étre utilisées sur une méme biopuce.
Les acides nucléiques peuvent, à titre d'exemple, être fixés sur le bras par l'intermédiaire d'un groupement amine qui soit réactif à une attaque nucléophile, quelle que soit la nature de cette attaque. Par exemple, un groupement amine peut étre lié de façon covalente avec un acide nucléique sous l'action d'une exposition à la lumière. D'une façon plus générale, le bras polymère contient préférentiellement, en bout de chaîne de ses bras, un groupe chimique activable, quel que soit celui-ci, qui ait la capacité à étre lié de façon covalente avec un groupe phosphate (ou autre) en bout de chaîne d'un acide nucléique. Ce groupe chimique activable peut étre présent lors de la synthèse du polymère ou lui être ajouté dans un second temps. II peut étre actif d'emblée lors de la synthèse du polymère ou lors de sa fixation sur le polymère, ou bien étre activé
chimiquement dans un second temps.
WO 01/44503 CA 02406948 2002-06-14 pCT~R00/03572 Un certain nombre de modes chimiques d'établissement de liaison covalente entre un nucléotide ou un acide nucléique d'une part, et un support de nature non nucléique d'autre part, ont été décrits dans l'art antérieur, par exemple pour la synthèse d'oligonucléotides in vitro ou pour la fixation d'oligonucléotides sur un 5 support métallique. Ces techniques peuvent être utilisées dans le cadre de la présente invention pour fixer des acides nucléiques sur une puce à ADN, notamment en les fixant par l'intermédiaire de bras tels que définis ci-avant.
Ceci inclut la possibilité d'effectuer cette fixation par l'intermédiaire d'un système du type streptavidine.
10 La fixation du bras sur le support peut se faire par l'intermédiaire d'un groupe chimique activable, en bout de tronc, qui puisse interagir avec des molécules du support de façon à créer une liaison, idéalement de type liaison covalente.
Comme indiqué ci-avant, l'utilisation de bras arborescents selon la présente
II est entendu que l'homme du métier peut sélectionner d'autres composés d'origine biologique ayant les caractéristiques requises pour une utilisation dans la présente invention, à savoir la possibilité de créer de multiples liaisons avec une molécule d'intérêt (il peut s'agir par exemple d'acides nucléiques), une forme en arborescence assurant une excellente disponibilité et permettant d'augmenter la densité, et une absence d'interférence avec la réaction d'hybridation.
Pour la mise en oeuvre de l'invention, le tronc de la molécule servant de bras de fixation est fixé sur le support de la puce, de préférence de manière covalente, et les acides nucléiques cibles sont fixés (ou synthétisés directement) au bout de plusieurs ou de toutes les arborescences de la molécule, de préférence de manière covalente. La Figure 1 donne une représentation dans l'espace d'une biopuce construite au moyen d'un tel bras, en comparaison avec les biopuces fabriquées avec des bras linéaires. Préférentiellement, un type unique de molécules de bras est utilisé sur une méme biopuce, à une densité qui peut étre adaptée par l'homme du métier. Toutefois, il est entendu que des molécules de structure et/ou de longueur et/ou de forme différentes peuvent étre utilisées sur une méme biopuce.
Les acides nucléiques peuvent, à titre d'exemple, être fixés sur le bras par l'intermédiaire d'un groupement amine qui soit réactif à une attaque nucléophile, quelle que soit la nature de cette attaque. Par exemple, un groupement amine peut étre lié de façon covalente avec un acide nucléique sous l'action d'une exposition à la lumière. D'une façon plus générale, le bras polymère contient préférentiellement, en bout de chaîne de ses bras, un groupe chimique activable, quel que soit celui-ci, qui ait la capacité à étre lié de façon covalente avec un groupe phosphate (ou autre) en bout de chaîne d'un acide nucléique. Ce groupe chimique activable peut étre présent lors de la synthèse du polymère ou lui être ajouté dans un second temps. II peut étre actif d'emblée lors de la synthèse du polymère ou lors de sa fixation sur le polymère, ou bien étre activé
chimiquement dans un second temps.
WO 01/44503 CA 02406948 2002-06-14 pCT~R00/03572 Un certain nombre de modes chimiques d'établissement de liaison covalente entre un nucléotide ou un acide nucléique d'une part, et un support de nature non nucléique d'autre part, ont été décrits dans l'art antérieur, par exemple pour la synthèse d'oligonucléotides in vitro ou pour la fixation d'oligonucléotides sur un 5 support métallique. Ces techniques peuvent être utilisées dans le cadre de la présente invention pour fixer des acides nucléiques sur une puce à ADN, notamment en les fixant par l'intermédiaire de bras tels que définis ci-avant.
Ceci inclut la possibilité d'effectuer cette fixation par l'intermédiaire d'un système du type streptavidine.
10 La fixation du bras sur le support peut se faire par l'intermédiaire d'un groupe chimique activable, en bout de tronc, qui puisse interagir avec des molécules du support de façon à créer une liaison, idéalement de type liaison covalente.
Comme indiqué ci-avant, l'utilisation de bras arborescents selon la présente
15 invention offre de nombreux avantages en termes de densité d'acides nucléiques cibles. Par exemple, dans le cas de "spots" de 28 pm de diamètre:
- Dans le cas "A" de la fixation des cibles sur le support par l'intermédiaire de bras de fixation non arborescents (rapport moléculaire stochiométrique bras/cibles = 1 ), ou de la fixation directe des cibles sur le support, la surface de présentation des cibles (surface à laquelle les sondes vont accéder pour étre hybridées aux cibles) est de: (rr) x (rayon)2 = (rr) x 8 2 = a (Nm2) - Dans le cas "B" de la fixation des cibles sur le support par l'intermédiaire de bras arborescents, on peut estimer que chaque bras forme une structure hémisphérique au niveau de la surface de présentation des cibles (surface de fixation des cibles sur le bras), soit, en d'autres termes, que la surface totale de présentation des cibles est de:
(1/2) x (4) x (~rr) x (rayon)2 = 2 x (rr) x A 2 = 2 x a (pm2).
Cela revient donc à doubler la surface de présentation du cas "A", pour une densité de cibles constante. Ou inversement, pour une même quantité de cibles par "spot", de diminuer d'un facteur 2 leur densité et donc d'améliorer l'accessibilité des cibles pour les sondes (diminution de l'encombrement stérique). Par extension, si la WO 01/44503 CA 02406948 2002-06-14 pCT/FR00/03572
- Dans le cas "A" de la fixation des cibles sur le support par l'intermédiaire de bras de fixation non arborescents (rapport moléculaire stochiométrique bras/cibles = 1 ), ou de la fixation directe des cibles sur le support, la surface de présentation des cibles (surface à laquelle les sondes vont accéder pour étre hybridées aux cibles) est de: (rr) x (rayon)2 = (rr) x 8 2 = a (Nm2) - Dans le cas "B" de la fixation des cibles sur le support par l'intermédiaire de bras arborescents, on peut estimer que chaque bras forme une structure hémisphérique au niveau de la surface de présentation des cibles (surface de fixation des cibles sur le bras), soit, en d'autres termes, que la surface totale de présentation des cibles est de:
(1/2) x (4) x (~rr) x (rayon)2 = 2 x (rr) x A 2 = 2 x a (pm2).
Cela revient donc à doubler la surface de présentation du cas "A", pour une densité de cibles constante. Ou inversement, pour une même quantité de cibles par "spot", de diminuer d'un facteur 2 leur densité et donc d'améliorer l'accessibilité des cibles pour les sondes (diminution de l'encombrement stérique). Par extension, si la WO 01/44503 CA 02406948 2002-06-14 pCT/FR00/03572
16 surface des bras arborescents est de forme oblongue, la surface de présentation des cibles est d'autant plus augmentée.
Par ailleurs, la densité de fixation des cibles sur des bras arborescents est, a priori, d'autant plus forte que celle obtenue par fixation directe des cibles sur le support de la puce ou par fixation des cibles par l'intermédiaire de bras linéaires (non arborescents) car, pour un méme nombre de cibles fixées par "spot" de la puce, l'encombrement stérique des bras eux-mêmes à la surface du support de la puce est inférieur dans le cas de bras arborescents par rapport aux bras linéaires.
Par conséquent, en réalité, la densité des cibles doit pouvoir être augmentée de plus d'un facteur 2 selon ce principe, ou l'encombrement stérique des cibles doit étre diminué de plus d'un facteur 2.
Cet aspect de l'invention permet donc à la fois, d'une part d'augmenter la densité de cibles par "spot" de la puce (et par conséquent d'augmenter la sensibilité de détection lors de la mesure de l'hybridation des sondes sur les cibles), et d'autre part simultanément de diminuer l'encombrement stérique des cibles (et par conséquent de favoriser l'hybridation des sondes sur les cibles, ce qui augmente aussi la sensibilité de détection).
Comme indiqué ci-avant, les biopuces comprenant ce type de bras peuvent être composées d'un support comportant une surface plane et/ou bombée, de nature solide ou semi-solide. En outre, ces supports peuvent comprendre des matériaux tels que verre, silice, poly-lysine, amino-silanes et/ou silanes amino-réactifs, ou des supports chargés négativement, comme il sera décrit en détails dans la suite du texte. D'autre part, les acides nucléiques cibles immobilisés sur les arborescences des bras peuvent également être de nature, de composition et d'origine variées. Ainsi, il peut s'agir d'acides nucléiques simple ou double-brin, d'origine naturelle, synthétique et/ou semi-synthétique. En particulier, il peut s'agir d'oligonucléotides de synthèse, de produits de PCR, de gènes ou fragments de gènes, de plasmides (ou autres vecteurs tels que cosmides, YAC, phages, etc.), d'ADNc simple ou double-brin ou d'ARN. De même, la longueur des acides nucléiques peut étre variée. Toutefois, on préfère cependant que les acides WO 01/44503 CA 02406948 2002-06-14 pCT~R00/03572
Par ailleurs, la densité de fixation des cibles sur des bras arborescents est, a priori, d'autant plus forte que celle obtenue par fixation directe des cibles sur le support de la puce ou par fixation des cibles par l'intermédiaire de bras linéaires (non arborescents) car, pour un méme nombre de cibles fixées par "spot" de la puce, l'encombrement stérique des bras eux-mêmes à la surface du support de la puce est inférieur dans le cas de bras arborescents par rapport aux bras linéaires.
Par conséquent, en réalité, la densité des cibles doit pouvoir être augmentée de plus d'un facteur 2 selon ce principe, ou l'encombrement stérique des cibles doit étre diminué de plus d'un facteur 2.
Cet aspect de l'invention permet donc à la fois, d'une part d'augmenter la densité de cibles par "spot" de la puce (et par conséquent d'augmenter la sensibilité de détection lors de la mesure de l'hybridation des sondes sur les cibles), et d'autre part simultanément de diminuer l'encombrement stérique des cibles (et par conséquent de favoriser l'hybridation des sondes sur les cibles, ce qui augmente aussi la sensibilité de détection).
Comme indiqué ci-avant, les biopuces comprenant ce type de bras peuvent être composées d'un support comportant une surface plane et/ou bombée, de nature solide ou semi-solide. En outre, ces supports peuvent comprendre des matériaux tels que verre, silice, poly-lysine, amino-silanes et/ou silanes amino-réactifs, ou des supports chargés négativement, comme il sera décrit en détails dans la suite du texte. D'autre part, les acides nucléiques cibles immobilisés sur les arborescences des bras peuvent également être de nature, de composition et d'origine variées. Ainsi, il peut s'agir d'acides nucléiques simple ou double-brin, d'origine naturelle, synthétique et/ou semi-synthétique. En particulier, il peut s'agir d'oligonucléotides de synthèse, de produits de PCR, de gènes ou fragments de gènes, de plasmides (ou autres vecteurs tels que cosmides, YAC, phages, etc.), d'ADNc simple ou double-brin ou d'ARN. De même, la longueur des acides nucléiques peut étre variée. Toutefois, on préfère cependant que les acides WO 01/44503 CA 02406948 2002-06-14 pCT~R00/03572
17 nucléiques aient une longueur inférieure à environ 1000 bases (ou paires de bases).
Dans un mode particulier de mise en oeuvre, les acides nucléiques cibles sont constitués d'acides nucléiques simple-brin, notamment d'acides nucléiques simple-brin ayant une longueur inférieure à 1000 bases.
Dans un mode particulier de mise en oeuvre, les acides nucléiques cibles sont constitués d'ARN simple brin, de préférence ayant une longueur inférieure à
1000 bases. II peut s'agir notamment d'ARN totaux ou d'ARNm, prélevés à partir d'un échantillon biologique. La présente invention décrit en effet pour la première fois l'utilisation d'ARN simple-brins comme cibles sur une biopuce. Ceci constitue un autre objet particulier de la présente demande.
Dans une autre variante de l'invention, il s'agit d'ADN simple-brin, ou de mélanges d'ADN et d'ARN simple-brins.
Dans un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, les acides nucléiques cibles simple-brin ont une longueur comprise entre 25 et 100 nucléotides environ, de préférence entre 30 et 60 nucléotides environ.
A cet égard, un objet particulier de la présente invention réside également dans une biopuce composée d'acides nucléiques simple-brin fixés sur un support, les acides nucléiques simple-brin ayant une longueur comprise entre 25 et 100 nucléotides environ, de préférence entre 30 et 60 nucléotides. L'invention réside également dans l'utilisation, comme acides nucléiques cibles, d'une population (de fragments) d'acides nucléiques simple brin ayant une longueur comprise entre et 60 nucléotides environ, désignés dans la présente demande par l'expression "oligonucléotides longs".
Selon une première variante particulière, les acides nucléiques simple-brin sont des ADN simple-brin de longueur comprise entre 30 et 60 nucléotides environ.
WO 01/44503 CA 02406948 2002-06-14 pCT/FR00/03572
Dans un mode particulier de mise en oeuvre, les acides nucléiques cibles sont constitués d'acides nucléiques simple-brin, notamment d'acides nucléiques simple-brin ayant une longueur inférieure à 1000 bases.
Dans un mode particulier de mise en oeuvre, les acides nucléiques cibles sont constitués d'ARN simple brin, de préférence ayant une longueur inférieure à
1000 bases. II peut s'agir notamment d'ARN totaux ou d'ARNm, prélevés à partir d'un échantillon biologique. La présente invention décrit en effet pour la première fois l'utilisation d'ARN simple-brins comme cibles sur une biopuce. Ceci constitue un autre objet particulier de la présente demande.
Dans une autre variante de l'invention, il s'agit d'ADN simple-brin, ou de mélanges d'ADN et d'ARN simple-brins.
Dans un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, les acides nucléiques cibles simple-brin ont une longueur comprise entre 25 et 100 nucléotides environ, de préférence entre 30 et 60 nucléotides environ.
A cet égard, un objet particulier de la présente invention réside également dans une biopuce composée d'acides nucléiques simple-brin fixés sur un support, les acides nucléiques simple-brin ayant une longueur comprise entre 25 et 100 nucléotides environ, de préférence entre 30 et 60 nucléotides. L'invention réside également dans l'utilisation, comme acides nucléiques cibles, d'une population (de fragments) d'acides nucléiques simple brin ayant une longueur comprise entre et 60 nucléotides environ, désignés dans la présente demande par l'expression "oligonucléotides longs".
Selon une première variante particulière, les acides nucléiques simple-brin sont des ADN simple-brin de longueur comprise entre 30 et 60 nucléotides environ.
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18 Selon une autre variante particulière, les acides nucléiques simple-brin sont des ARN simple-brin de longueur comprise entre 30 et 60 nucléotides environ.
Avantageusement, il s'agit d'acides nucléiques produits par synthèse chimique in vitro, selon les techniques connues de l'homme du métier (synthétiseurs). Ces oligonucléotides sont ensuite, dans un deuxième temps immobilisés sur le support.
L'utilisation (de fragments) d'acides nucléiques de telle longueur permet, par opposition aux produits disponibles actuellement, d'obtenir une hybridation spécifique des sondes sur leurs cibles correspondantes sur les biopuces. En effet, comme indiqué précédemment, l'utilisation d'oligonucléotides longs de 25 bases ou moins, tels que décrits dans l'art antérieur, entraine la présence de nombreuses hybridations non spécifiques des sondes, et par conséquent une mauvaise reproductibilité des expériences utilisant ce système. L'utilisation selon l'invention d'oligonucléotides plus longs, notamment d'une longueur comprise entre 30 et nucléotides, peut au contraire permettre d'obtenir une spécificité absolue d'hybridation.
Les oligonucléotides longs peuvent, une fois synthétisés, étre fixés sur le support de la biopuce, de manière ordonnée. Cette fixation peut étre soit directe (fixation de l'oligonucléotide long directement sur le support), soit indirecte (fixation covalente de l'oligonucléotide long sur un "bras" tel que défini et décrit ci-avant, ce bras étant fixé sur le support). L'intérêt de fixer l'oligonucléotide long de façon indirecte est d'augmenter l'accessibilité des sondes à la séquence de l'oligonucléotide, par rapport à la situation de fixation directe où
l'encombrement stérique est plus important. Cependant, la fixation directe de l'oligonucléotide long est possible et peut permettre une spécificité d'hybridation suffisante pour l'utilisation reproductible des biopuces à oligonucléotides. Quel que soit le mode de fixation (directe ou indirecte), les oligonucléotides sont fixés par une de leurs extrémités (5' ou 3') et non sur toute leur longueur, afin de donner aux sondes une bonne accessibilité aux oligonucléotides. Par ailleurs, dans le cas d'une fixation indirecte, deux choix sont possibles: soit les oligonucléotides longs sont fixés par une de leurs extrémités sur le bras, et les complexes oligonucléotide-bras sont WO 01/44503 CA 02406948 2002-06-14 pCT/FR00/03572
Avantageusement, il s'agit d'acides nucléiques produits par synthèse chimique in vitro, selon les techniques connues de l'homme du métier (synthétiseurs). Ces oligonucléotides sont ensuite, dans un deuxième temps immobilisés sur le support.
L'utilisation (de fragments) d'acides nucléiques de telle longueur permet, par opposition aux produits disponibles actuellement, d'obtenir une hybridation spécifique des sondes sur leurs cibles correspondantes sur les biopuces. En effet, comme indiqué précédemment, l'utilisation d'oligonucléotides longs de 25 bases ou moins, tels que décrits dans l'art antérieur, entraine la présence de nombreuses hybridations non spécifiques des sondes, et par conséquent une mauvaise reproductibilité des expériences utilisant ce système. L'utilisation selon l'invention d'oligonucléotides plus longs, notamment d'une longueur comprise entre 30 et nucléotides, peut au contraire permettre d'obtenir une spécificité absolue d'hybridation.
Les oligonucléotides longs peuvent, une fois synthétisés, étre fixés sur le support de la biopuce, de manière ordonnée. Cette fixation peut étre soit directe (fixation de l'oligonucléotide long directement sur le support), soit indirecte (fixation covalente de l'oligonucléotide long sur un "bras" tel que défini et décrit ci-avant, ce bras étant fixé sur le support). L'intérêt de fixer l'oligonucléotide long de façon indirecte est d'augmenter l'accessibilité des sondes à la séquence de l'oligonucléotide, par rapport à la situation de fixation directe où
l'encombrement stérique est plus important. Cependant, la fixation directe de l'oligonucléotide long est possible et peut permettre une spécificité d'hybridation suffisante pour l'utilisation reproductible des biopuces à oligonucléotides. Quel que soit le mode de fixation (directe ou indirecte), les oligonucléotides sont fixés par une de leurs extrémités (5' ou 3') et non sur toute leur longueur, afin de donner aux sondes une bonne accessibilité aux oligonucléotides. Par ailleurs, dans le cas d'une fixation indirecte, deux choix sont possibles: soit les oligonucléotides longs sont fixés par une de leurs extrémités sur le bras, et les complexes oligonucléotide-bras sont WO 01/44503 CA 02406948 2002-06-14 pCT/FR00/03572
19 ensuite déposés de façon ordonnée sur le support et fixés à celui-ci, soit le bras est d'abord fixé au support, et les oligonucléotides longs sont ensuite déposés de manière ordonnée sur le complexe bras-support et fixés aux bras.
Dans ce mode de mise en oeuvre, le type de support et de bras utilisés peuvent être comme décrits ci-avant. L'utilisation de ce type de biopuces à
oligonucléotides longs synthétisés chimiquement selon la présente invention offre certains avantages, par rapport à l'utilisation de cibles simple brin plus courtes et/ou de cibles double brin et plus longues produites par PCR
Tout d'abord, le fait que la cible soit de rature simple brin permet d'améliorer le rendement de la réaction d'hybridation de la sonde sur la cible. En effet, si la cible est de nature double brin, un nombre important de cibles vont s'hybrider sur elles-mémes lors de cette réaction (le deuxième brin de la cible est en compétition avec la sonde pour l'hybridation).
Ensuite, la synthèse chimique directe des cibles est de gestion plus simple que la synthèse des cibles par PCR. Dans le premier cas, seule la connaissance des séquences des cibles que l'on veut disposer sur la puce est nécessaire, alors que dans le second cas il est nécessaire de disposer matériellement d'acides nucléiques contenant ces séquences (en général sous forme de clones) afin de pratiquer leur amplification spécifique par PCR.
D'autre part, l'amplification par PCR produit une population d'acides nucléiques double brin hétérogène avec, dans l'immense majorité des cas, la présence de fragments contaminants, méme si ces fragments sont minoritaires dans le produit final de la réaction. Ceci entraine la présence d'hybridations sondes-cibles aspécifiques et par conséquent un bruit de fond lors de la mesure des taux d'hybridation. A l'inverse, la synthèse directe des cibles simple brin permet d'obtenir des fragments d'acides nucléiques de séquence très homogène et permet à terme d'obtenir des cibles plus pures et par conséquent moins d'hybridation sonde-cible aspécifique. Cette spécificité est d'autant plus assurée lorsque les biopuces comportent des bras, arborescents ou non, chargés électriquement comme il sera décrit plus loin.
WO 01/44503 CA 02406948 2002-06-14 pCT/FR00/03572 Enfin, la synthèse chimique des sondes simple brin est automatisable de manière à obtenir des cibles purifiées, alors que les cibles double brin produites par PCR doivent être purifiées avant leur fixation sur le support.
5 Les biopuces à oligonucléotides synthétiques longs selon l'invention représentent donc un avantage technique important par rapport aux produits et aux procédés décrits dans l'art antérieur. Cet avantage est d'autant plus grand lorsque ces biopuces comportent des bras arborescents ou des bras ou supports chargés électriquement.
En effet, la présente invention décrit en outre de nouvelles approches pour contrôler l'arrangement spatial des acides nucléiques et/ou des bras sur la biopuce, de manière à favoriser les conditions de présentation, et donc d'hybridation des sondes sur les cibles. En particulier, la présente invention montre à présent qu'il est possible de déterminer (et de modifier) les caractéristiques électriques des bras (que ceux-ci soient des polymères organiques de nature protéique, glucidique ou lipidique, ou des polymères non organiques de synthèse) ou des supports de biopuce, de façon à améliorer les conditions d'hybridation, notamment la sélectivité
et la sensibilité des biopuces.
Cet aspect de l'invention peut être mis en oeuvre sur toutes les natures possibles de bras de fixation d'oligonucléotides sur les supports de biopuces, que leur structure primaire soit linéaire ou arborescente, et quelle que soit la nature du support de la puce.
Ainsi, il est connu que les acides nucléiques sont chargés négativement (du fait que ce sont des acides faibles qui sont, dans les conditions habituelles, dans des environnements de pH supérieur à leur pKa; leurs fonctions acides sont situées sur les groupements phosphates qui assurent la liaison entre les sucres des nucléotides). Les interactions entre séquences d'acides nucléiques peuvent être, en simplification, schématisées comme suit: d'une part, ces séquences peuvent être hybridées entre elles par l'établissement de liaisons hydrogène et de forces de Van der Waals entre des bases complémentaires (ce qui peut être considéré
WO 01/44503 CA 02406948 2002-06-14 pCT~R00/03572 comme une affinité entre elles), d'autre part elles peuvent se repousser du fait de leurs charges négatives au niveau des groupes phosphate. Pour obtenir une hybridation stable entre deux molécules simple brin d'acides nucléiques, il faut que l'attraction liée aux liaisons hydrogène et de Van der Waals soit supérieure à
la répulsion liée aux charges négatives, ce qui est le cas lorsque le nombre de bases complémentaires adjacentes est suffisant pour obtenir une attraction supérieure à
la répulsion. Un autre paramètre qui entre en compte est celui des contraintes atomiques de repliement des molécules (structures secondaires et tertiaires).
Ces principes généraux concernant les acides nucléiques sont aussi valides au sein d'une même molécule simple brin d'acide nucléique, quelle que soit sa longueur. Ils permettent d'expliquer la capacité ou non d'une telle molécule à s'hybrider ou non sur elle-même. En ce qui concerne les bras de fixation des cibles sur le support de la puce, eux aussi sont soumis à des contraintes atomiques de structure secondaire et d'encombrement stérique, mais ils ne présentent pas de phénomène d'attraction et d'hybridation tels que ceux décris pour les acides nucléiques.
Ces contraintes s'exerçant sur les bras sont aussi influencées par le fait que des brins d'acides nucléiques soient fixés à leurs) extrémité(s).
Un des problèmes posés par la fabrication des biopuces, que les cibles fixées soient des oligonucléotides simple brin (quelle que soit leur longueur) ou des ADN double brin (qu'il s'agisse de plasmides entiers ou de produits de réaction de polymérisation en chaine (PCR)), est celui de l'accessibilité de ces cibles aux molécules sondes que l'on veut analyser et que l'on veut hybrider de façon spécifique sur leurs cibles correspondantes. Cette accessibilité conditionne le rendement des réactions d'hybridation et par conséquent la sensibilité et la spécificité de l'analyse des sondes. Cette accessibilité à l'hybridation sonde-cible est diminuée notamment par l'encombrement stérique des cibles fixées sur la puce, par les interactions entre cibles situées à proximité les unes des autres en raison de l'encombrement stérique (hybridations partielles) et par les structures secondaires de celles-ci (repliements intra-moléculaires des cibles). Les difficultés liées à l'encombrement stérique sont générées par la nécessité de disposer les cibles avec une forte densité sur chaque "spot" de la puce si l'on veut pouvoir détecter de faibles taux d'acides nucléiques spécifiques (sensibilité de détection) et WO 01/44503 CA 02406948 2002-06-14 pCT/FR00/03572 diminuer les effets de saturation des capacités d'hybridation qui risquent de gêner la quantification des signaux d'hybridation. C'est pourquoi un principe général est de déposer des quantités moléculaires de cibles telles qu'elles soient en large excès par rapport aux molécules correspondantes des sondes.
La présente invention permet de remédier à ces inconvénients. Elle décrit en effet l'utilisation de bras ou de supports particuliers, réduisant les interférences ioniques entre les cibles, et assurant ainsi une meilleure hybridation, y compris lorsque les cibles sont présentes à des densités élevées. Plus particulièrement, la présente demande montre qu'il est possible d'utiliser, pour fixer les cibles sur le support des biopuces, des bras de fixation ayant une charge électrique négative ou des supports chargés négativement.
Ainsi, un autre objet de l'invention réside dans une biopuce comprenant des acides nucléiques immobilisés sur un support au moyen de bras portant une charge électrique négative. Un autre objet de l'invention réside dans une biopuce comprenant des acides nucléiques immobilisés sur un support portant une charge électrique négative uniforme La présente invention réside également dans l'utilisation de molécules chargées négativement ou de supports chargés négativement, pour la préparation de biopuces.
L'utilisation de bras de fixation qui soient chargés négativement de façon uniforme, dans les conditions expérimentales d'hybridation des sondes sur les cibles, permet avantageusement d'obtenir les phénomènes suivants:
- Les bras exercent des forces électriques de répulsion vis à vis des bras adjacents, ce qui a pour conséquence de diminuer à la fois leurs repliements propres et leur encombrement stérique, notamment au niveau de leurs extrémités fixées sur les cibles ;
- Les bras exercent des forces électriques de répulsion vis à vis des cibles qui sont fixées à leurs extrémités, ce qui a pour conséquence de pousser les cibles à se disposer vers "l'extérieur", c'est-à-dire à s'éloigner du support de la puce, les rendant plus accessibles aux sondes ;
WO 01/44503 CA 02406948 2002-06-14 pCT/FR00/03572 - Ces contraintes mutuelles de répulsion ont pour conséquence de limiter les interactions attractives entre sondes adjacentes en les éloignant les unes des autres, les rendant plus accessibles aux sondes et diminuant les risques d'attractions mutuelles liées aux forces de Van der Waals ou aux liaisons hydrogène ;
- Ce champ électrique négatif exercé du coté des cibles fixé aux bras a tendance à défaire les structures secondaires des cibles (c'est-à-dire à les linéariser) et par conséquent à diminuer le repliement des cibles sur elles-mêmes, les rendant plus accessibles aux sondes ;
- La couche située près du support de la puce et formée par les bras est globalement chargée de façon négative, ce qui a pour conséquence d'exercer une force de répulsion électrique vis à vis des sondes (elles-mêmes chargées négativement) et donc de diminuer les phénomènes d'hybridations aspécifiques sondes-cibles. Ceci permet de diminuer les phénomènes de bruit de fond lors de l'analyse des résultats d'hybridation, et par conséquent d'augmenter à la fois la sensibilité et la spécificité des analyses pratiquées par la technologie des puces à
ADN.
Cet aspect particulier de l'invention apporte donc une amélioration technologique claire aux méthodes de l'art, assurant meilleures sélectivité et sensibilité aux biopuces.
Bien entendu, cet aspect de l'invention n'est pas limité aux biopuces dans lesquelles des bras sont utilisés. Au contraire, il s'applique également à
l'utilisation d'un support de puce chargé négativement de façon uniforme, dans les situations où les cibles sont directement fixées sur le support sans bras intermédiaires.
Ceci est valable que l'établissement des charges négatives sur le support soit effectué
préalablement ou après la fixation des cibles sur le support. Ceci est un principe différent de celui qui consiste à déposer les cibles sur des micro-électrodes auxquelles on peut appliquer un courant électrique, car dans ce dernier cas la charge électrique du support n'est pas homogène.
WO 01/44503 CA 02406948 2002-06-14 pCT/FR00/03572 Dans cet aspect de l'invention, les biopuces peuvent comporter tout type de population d'acides nucléiques cibles telles que définies ci-avant, et les bras chargés négativement peuvent également comporter une forme en arborescence, telle que mentionnée ci-avant.
La présente invention réside également dans un procédé de préparation des biopuces, telles que décrites ci-avant, comprenant l'immobilisation (ou la fixation) des acides nucléiques sur un support au moyen de bras en forme d'arborescence comprenant un polymère d'origine biologique.
Le procédé de préparation peut comprendre une première étape de fixation du bras en forme d'arborescence sur le support, suivie d'une deuxième étape de fixation de la molécule cible au bras en forme d'arborescence. Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, le procédé de préparation de la biopuce peut comprendre une première étape de fixation de la molécule cible au bras en forme d'arborescence puis une deuxième étape de fixation du complexe, obtenu lors de la première étape,au support.
La présente invention réside également dans l'utilisation des biopuces telles que décrites ci-avant, dans un but expérimental, thérapeutique, diagnostic. En particulier, l'invention concerne l'utilisation des biopuces décrites ci-avant - pour étudier la régulation de l'expression génétique, ou - pour la recherche de gènes ou fragments de gènes, ou - pour l'identification de cibles, ou encore - pour le diagnostic génétique.
Dans ces applications, les biopuces sont mises en contact avec une population d'acides nucléiques « sondes », généralement préalablement marquée, puis le profil d'hybridation des sondes sur la biopuce est déterminé, selon les techniques connues de l'homme du métier. Un objet de l'invention réside donc également dans un procédé d'analyse de polynucléotides, comprenant la mise en contact d'une population de polynucléotides, préférentiellement marqués, avec une biopuce selon l'invention, et la mise en évidence de la formation d'hybrides.
WO 01/44503 CA 02406948 2002-06-14 pCT~R00/03572 II est entendu que la présente invention n'est pas limitée aux modes spécifiques de réalisation décrits ci-avant, mais s'étend également aux variantes d'exécution entrant dans les connaissance normales de l'homme du métier.
Dans ce mode de mise en oeuvre, le type de support et de bras utilisés peuvent être comme décrits ci-avant. L'utilisation de ce type de biopuces à
oligonucléotides longs synthétisés chimiquement selon la présente invention offre certains avantages, par rapport à l'utilisation de cibles simple brin plus courtes et/ou de cibles double brin et plus longues produites par PCR
Tout d'abord, le fait que la cible soit de rature simple brin permet d'améliorer le rendement de la réaction d'hybridation de la sonde sur la cible. En effet, si la cible est de nature double brin, un nombre important de cibles vont s'hybrider sur elles-mémes lors de cette réaction (le deuxième brin de la cible est en compétition avec la sonde pour l'hybridation).
Ensuite, la synthèse chimique directe des cibles est de gestion plus simple que la synthèse des cibles par PCR. Dans le premier cas, seule la connaissance des séquences des cibles que l'on veut disposer sur la puce est nécessaire, alors que dans le second cas il est nécessaire de disposer matériellement d'acides nucléiques contenant ces séquences (en général sous forme de clones) afin de pratiquer leur amplification spécifique par PCR.
D'autre part, l'amplification par PCR produit une population d'acides nucléiques double brin hétérogène avec, dans l'immense majorité des cas, la présence de fragments contaminants, méme si ces fragments sont minoritaires dans le produit final de la réaction. Ceci entraine la présence d'hybridations sondes-cibles aspécifiques et par conséquent un bruit de fond lors de la mesure des taux d'hybridation. A l'inverse, la synthèse directe des cibles simple brin permet d'obtenir des fragments d'acides nucléiques de séquence très homogène et permet à terme d'obtenir des cibles plus pures et par conséquent moins d'hybridation sonde-cible aspécifique. Cette spécificité est d'autant plus assurée lorsque les biopuces comportent des bras, arborescents ou non, chargés électriquement comme il sera décrit plus loin.
WO 01/44503 CA 02406948 2002-06-14 pCT/FR00/03572 Enfin, la synthèse chimique des sondes simple brin est automatisable de manière à obtenir des cibles purifiées, alors que les cibles double brin produites par PCR doivent être purifiées avant leur fixation sur le support.
5 Les biopuces à oligonucléotides synthétiques longs selon l'invention représentent donc un avantage technique important par rapport aux produits et aux procédés décrits dans l'art antérieur. Cet avantage est d'autant plus grand lorsque ces biopuces comportent des bras arborescents ou des bras ou supports chargés électriquement.
En effet, la présente invention décrit en outre de nouvelles approches pour contrôler l'arrangement spatial des acides nucléiques et/ou des bras sur la biopuce, de manière à favoriser les conditions de présentation, et donc d'hybridation des sondes sur les cibles. En particulier, la présente invention montre à présent qu'il est possible de déterminer (et de modifier) les caractéristiques électriques des bras (que ceux-ci soient des polymères organiques de nature protéique, glucidique ou lipidique, ou des polymères non organiques de synthèse) ou des supports de biopuce, de façon à améliorer les conditions d'hybridation, notamment la sélectivité
et la sensibilité des biopuces.
Cet aspect de l'invention peut être mis en oeuvre sur toutes les natures possibles de bras de fixation d'oligonucléotides sur les supports de biopuces, que leur structure primaire soit linéaire ou arborescente, et quelle que soit la nature du support de la puce.
Ainsi, il est connu que les acides nucléiques sont chargés négativement (du fait que ce sont des acides faibles qui sont, dans les conditions habituelles, dans des environnements de pH supérieur à leur pKa; leurs fonctions acides sont situées sur les groupements phosphates qui assurent la liaison entre les sucres des nucléotides). Les interactions entre séquences d'acides nucléiques peuvent être, en simplification, schématisées comme suit: d'une part, ces séquences peuvent être hybridées entre elles par l'établissement de liaisons hydrogène et de forces de Van der Waals entre des bases complémentaires (ce qui peut être considéré
WO 01/44503 CA 02406948 2002-06-14 pCT~R00/03572 comme une affinité entre elles), d'autre part elles peuvent se repousser du fait de leurs charges négatives au niveau des groupes phosphate. Pour obtenir une hybridation stable entre deux molécules simple brin d'acides nucléiques, il faut que l'attraction liée aux liaisons hydrogène et de Van der Waals soit supérieure à
la répulsion liée aux charges négatives, ce qui est le cas lorsque le nombre de bases complémentaires adjacentes est suffisant pour obtenir une attraction supérieure à
la répulsion. Un autre paramètre qui entre en compte est celui des contraintes atomiques de repliement des molécules (structures secondaires et tertiaires).
Ces principes généraux concernant les acides nucléiques sont aussi valides au sein d'une même molécule simple brin d'acide nucléique, quelle que soit sa longueur. Ils permettent d'expliquer la capacité ou non d'une telle molécule à s'hybrider ou non sur elle-même. En ce qui concerne les bras de fixation des cibles sur le support de la puce, eux aussi sont soumis à des contraintes atomiques de structure secondaire et d'encombrement stérique, mais ils ne présentent pas de phénomène d'attraction et d'hybridation tels que ceux décris pour les acides nucléiques.
Ces contraintes s'exerçant sur les bras sont aussi influencées par le fait que des brins d'acides nucléiques soient fixés à leurs) extrémité(s).
Un des problèmes posés par la fabrication des biopuces, que les cibles fixées soient des oligonucléotides simple brin (quelle que soit leur longueur) ou des ADN double brin (qu'il s'agisse de plasmides entiers ou de produits de réaction de polymérisation en chaine (PCR)), est celui de l'accessibilité de ces cibles aux molécules sondes que l'on veut analyser et que l'on veut hybrider de façon spécifique sur leurs cibles correspondantes. Cette accessibilité conditionne le rendement des réactions d'hybridation et par conséquent la sensibilité et la spécificité de l'analyse des sondes. Cette accessibilité à l'hybridation sonde-cible est diminuée notamment par l'encombrement stérique des cibles fixées sur la puce, par les interactions entre cibles situées à proximité les unes des autres en raison de l'encombrement stérique (hybridations partielles) et par les structures secondaires de celles-ci (repliements intra-moléculaires des cibles). Les difficultés liées à l'encombrement stérique sont générées par la nécessité de disposer les cibles avec une forte densité sur chaque "spot" de la puce si l'on veut pouvoir détecter de faibles taux d'acides nucléiques spécifiques (sensibilité de détection) et WO 01/44503 CA 02406948 2002-06-14 pCT/FR00/03572 diminuer les effets de saturation des capacités d'hybridation qui risquent de gêner la quantification des signaux d'hybridation. C'est pourquoi un principe général est de déposer des quantités moléculaires de cibles telles qu'elles soient en large excès par rapport aux molécules correspondantes des sondes.
La présente invention permet de remédier à ces inconvénients. Elle décrit en effet l'utilisation de bras ou de supports particuliers, réduisant les interférences ioniques entre les cibles, et assurant ainsi une meilleure hybridation, y compris lorsque les cibles sont présentes à des densités élevées. Plus particulièrement, la présente demande montre qu'il est possible d'utiliser, pour fixer les cibles sur le support des biopuces, des bras de fixation ayant une charge électrique négative ou des supports chargés négativement.
Ainsi, un autre objet de l'invention réside dans une biopuce comprenant des acides nucléiques immobilisés sur un support au moyen de bras portant une charge électrique négative. Un autre objet de l'invention réside dans une biopuce comprenant des acides nucléiques immobilisés sur un support portant une charge électrique négative uniforme La présente invention réside également dans l'utilisation de molécules chargées négativement ou de supports chargés négativement, pour la préparation de biopuces.
L'utilisation de bras de fixation qui soient chargés négativement de façon uniforme, dans les conditions expérimentales d'hybridation des sondes sur les cibles, permet avantageusement d'obtenir les phénomènes suivants:
- Les bras exercent des forces électriques de répulsion vis à vis des bras adjacents, ce qui a pour conséquence de diminuer à la fois leurs repliements propres et leur encombrement stérique, notamment au niveau de leurs extrémités fixées sur les cibles ;
- Les bras exercent des forces électriques de répulsion vis à vis des cibles qui sont fixées à leurs extrémités, ce qui a pour conséquence de pousser les cibles à se disposer vers "l'extérieur", c'est-à-dire à s'éloigner du support de la puce, les rendant plus accessibles aux sondes ;
WO 01/44503 CA 02406948 2002-06-14 pCT/FR00/03572 - Ces contraintes mutuelles de répulsion ont pour conséquence de limiter les interactions attractives entre sondes adjacentes en les éloignant les unes des autres, les rendant plus accessibles aux sondes et diminuant les risques d'attractions mutuelles liées aux forces de Van der Waals ou aux liaisons hydrogène ;
- Ce champ électrique négatif exercé du coté des cibles fixé aux bras a tendance à défaire les structures secondaires des cibles (c'est-à-dire à les linéariser) et par conséquent à diminuer le repliement des cibles sur elles-mêmes, les rendant plus accessibles aux sondes ;
- La couche située près du support de la puce et formée par les bras est globalement chargée de façon négative, ce qui a pour conséquence d'exercer une force de répulsion électrique vis à vis des sondes (elles-mêmes chargées négativement) et donc de diminuer les phénomènes d'hybridations aspécifiques sondes-cibles. Ceci permet de diminuer les phénomènes de bruit de fond lors de l'analyse des résultats d'hybridation, et par conséquent d'augmenter à la fois la sensibilité et la spécificité des analyses pratiquées par la technologie des puces à
ADN.
Cet aspect particulier de l'invention apporte donc une amélioration technologique claire aux méthodes de l'art, assurant meilleures sélectivité et sensibilité aux biopuces.
Bien entendu, cet aspect de l'invention n'est pas limité aux biopuces dans lesquelles des bras sont utilisés. Au contraire, il s'applique également à
l'utilisation d'un support de puce chargé négativement de façon uniforme, dans les situations où les cibles sont directement fixées sur le support sans bras intermédiaires.
Ceci est valable que l'établissement des charges négatives sur le support soit effectué
préalablement ou après la fixation des cibles sur le support. Ceci est un principe différent de celui qui consiste à déposer les cibles sur des micro-électrodes auxquelles on peut appliquer un courant électrique, car dans ce dernier cas la charge électrique du support n'est pas homogène.
WO 01/44503 CA 02406948 2002-06-14 pCT/FR00/03572 Dans cet aspect de l'invention, les biopuces peuvent comporter tout type de population d'acides nucléiques cibles telles que définies ci-avant, et les bras chargés négativement peuvent également comporter une forme en arborescence, telle que mentionnée ci-avant.
La présente invention réside également dans un procédé de préparation des biopuces, telles que décrites ci-avant, comprenant l'immobilisation (ou la fixation) des acides nucléiques sur un support au moyen de bras en forme d'arborescence comprenant un polymère d'origine biologique.
Le procédé de préparation peut comprendre une première étape de fixation du bras en forme d'arborescence sur le support, suivie d'une deuxième étape de fixation de la molécule cible au bras en forme d'arborescence. Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, le procédé de préparation de la biopuce peut comprendre une première étape de fixation de la molécule cible au bras en forme d'arborescence puis une deuxième étape de fixation du complexe, obtenu lors de la première étape,au support.
La présente invention réside également dans l'utilisation des biopuces telles que décrites ci-avant, dans un but expérimental, thérapeutique, diagnostic. En particulier, l'invention concerne l'utilisation des biopuces décrites ci-avant - pour étudier la régulation de l'expression génétique, ou - pour la recherche de gènes ou fragments de gènes, ou - pour l'identification de cibles, ou encore - pour le diagnostic génétique.
Dans ces applications, les biopuces sont mises en contact avec une population d'acides nucléiques « sondes », généralement préalablement marquée, puis le profil d'hybridation des sondes sur la biopuce est déterminé, selon les techniques connues de l'homme du métier. Un objet de l'invention réside donc également dans un procédé d'analyse de polynucléotides, comprenant la mise en contact d'une population de polynucléotides, préférentiellement marqués, avec une biopuce selon l'invention, et la mise en évidence de la formation d'hybrides.
WO 01/44503 CA 02406948 2002-06-14 pCT~R00/03572 II est entendu que la présente invention n'est pas limitée aux modes spécifiques de réalisation décrits ci-avant, mais s'étend également aux variantes d'exécution entrant dans les connaissance normales de l'homme du métier.
Claims (30)
1. Biopuce, caractérisée en ce qu'elle comprend des acides nucléiques immobilisés sur un support au moyen de bras en forme d'arborescence comprenant un polymère d'origine biologique.
2. Biopuce selon la revendication 1, caractérisée en ce que le bras est un polymère ramifié, ayant un ou plusieurs niveaux de ramification.
3. Biopuce selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le bras est un polymère organique.
4. Biopuce selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le bras est un polymère de sucres, par exemple le glycogène ou un dérivé du glycogène ou l'amylopectine.
5. Biopuce selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le bras est un polymère ramifié comprenant une répétition de monomères de galactose, glucose, mannose, fucose, xylose, N-acétylgalactosamine et/ou N-acétylglucosamine.
6. Biopuce selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le bras est un glycopolypeptide, par exemple l'aggrécane.
7. Biopuce selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le bras est un composé polypeptidique, par exemple une immunoglobuline.
8. Biopuce selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les acides nucléiques sont fixés de manière covalente aux extrémités de l'arborescence des bras.
9. Biopuce selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les bras sont fixés au support, de manière covalente, par la partie tronc de la molécule.
10. Biopuce selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le support comporte une surface plane et/ou bombée.
11. Biopuce selon la revendication 10, caractérisée en ce que le support est un support solide ou semi-solide.
12. Biopuce selon 1a revendication 11, caractérisée en ce que le support est composé de verre, silice, poly-lysine, amino-silanes et/ou silanes amino-réactifs.
13. Biopuce selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les acides nucléiques sont des acides nucléiques simple ou double-brin, d'origine naturelle, synthétique et/ou semi-synthétique.
14. Biopuce selon la revendication 13, caractérisée en ce que les acides nucléiques sont choisis parmi les oligonuctéotides de synthèse, les produits de PCR, les gènes ou fragments de gènes, des plasmides. des ADNc simple ou double-brin ou des ARN.
15. Biopuce selon la revendication 14, caractérisée en ce que les acides nucléiques sont des acides nucléiques simple-brin, notamment des molécules d'acides nucléiques simple-brin de longueur comprise entre 25 et 100 nucléotides environ, de préférence entre 30 et 60 nucléotides environ.
16. Utilisation d'un polymère de sucres dérivés du glycogène ayant une organisation spatiale en forme d'arborescence, pour la fixation d'acides nucléiques sur des supports.
28~
28~
17. Biopuce selon la revendication 13, caractérisée en ce que les acides nucléiques sont des acides nucléiques simple-brin ayant une longueur comprise entre 30 et nucléotides environ.
18. Biopuce selon la revendication 17, caractérisée en ce que les acides nucléiques simple-brin sont des ADN simple-brin de longueur comprise entre 30 et 60 nucléotides environ.
19. Biopuce selon la revendication 17, caractérisée en ce que les acides nucléiques simple-brin sont des ARN simple-brin de longueur comprise entre 30 et 60 nucléotides environ.
20. Biopuce selon l'une des revendications 17 à 19, caractérisée en ce que les acides nucléiques simple-brin sont des acides nucléiques produits par synthèse chimique in vitro.
21. Biopuce selon l'une des revendications 17 à 20, caractérisée en ce qu'elle comprend des ARN immobilisés sur un support solide ou semi-solide au moyen de bras en forme d'arborescence comprenant un polymère d'origine biologique.
22. Biopuce selon l'une des revendications 17 à 20, caractérisée en ce qu'elle comprend des acides nucléiques produits de PCR immobilisés sur un support solide ou semi-solide au moyen de bras en forme d'arborescence comprenant un polymère d'origine biologique.
23. Biopuce selon l'une quelconque des revendications 1 à 15 et 17 à 22, caractérisée en ce que le bras porte une charge électrique négative.
24. Biopuce selon l'une quelconque des revendications 1 à 15 et 17 à 22, caractérisée en ce que le support porte une charge électrique négative uniforme.
25. Utilisation d'une biopuce selon l'une des revendications 1 à 15 et 17 à
24, pour étudier la régulation de l'expression génétique.
24, pour étudier la régulation de l'expression génétique.
26. Utilisation d'une biopuce selon l'une des revendications 1 à 15 et 17 à
24, pour la recherche de gènes ou fragments de gènes.
24, pour la recherche de gènes ou fragments de gènes.
27. Utilisation d'une biopuce selon l'une des revendications 1 à 15 et 17 à
24, pour l'identification de cibles.
24, pour l'identification de cibles.
28. Utilisation d'une biopuce selon l'une des revendications 1 à 15 et 17 à
24, pour le diagnostic génétique.
24, pour le diagnostic génétique.
29. Procédé de préparation d'une biopuce selon l'une des revendications 1 à 15 et 17 à 24, caractérisé en ce qu'il comprend:
a) une étape de fixation du bras en forme d'arborescence surle support, et, b) une étape de fixation de la molécule cible au bras en forme d'arborescence obtenu en a).
a) une étape de fixation du bras en forme d'arborescence surle support, et, b) une étape de fixation de la molécule cible au bras en forme d'arborescence obtenu en a).
30. Procédé de préparation d'une biopuce selon l'une des revendications 1 à 15 et 17 à 24, caractérisé en ce qu'il comprend:
a) une étape de fixation de la molécule cible au bras en forme d'arborescence, b) une étape de fixation du complexe obtenu en a) sur le support.
a) une étape de fixation de la molécule cible au bras en forme d'arborescence, b) une étape de fixation du complexe obtenu en a) sur le support.
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