WO2003068712A2 - Procede de preparation de biopuces a adn et leurs applications - Google Patents

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WO2003068712A2
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Pierre Nassoy
Marie-Claude Potier
M. Luc Talini
Nathalie Gibelin
Jean Rossier
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Cnrs (Centre National De La Recherche Scientifique)
Institut Curie
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Definitions

  • the present invention relates to a process for the preparation of an activated biochip for the covalent attachment of oligonucleotide probes to a solid support by means of a spacer compound of the NHS-PEG-VS type, as well as the biochips capable of be obtained by such a process.
  • the invention also includes methods for detecting nucleic acids in a sample or methods for screening for compounds capable of specifically binding to oligonucleotide probes in which the biochips according to the invention are used.
  • the present invention also relates to kits for the detection, quantitative or qualitative analysis of nucleic acids in a sample, comprising such biochips as well as the use of the latter as affinity matrix for the purification of nucleic acid. , for nucleic acid sequencing, for the qualitative or quantitative analysis of gene expression or even for the study and detection of genetic polymorphism.
  • nucleic acids such as biochips, or DNA chips (also called “micro- or macroarrays”, or even “DNA chip”)
  • biochips can in particular be produced from a support, generally solid, functionalized on which have been fixed by covalent bond and localized given nucleic acids (nucleic probes) and on which nucleic probes will be specifically fixed respectively by pairing ( or specific hybridization) or by recognition of an affinity site the nucleic acids which it is desired to detect or identify in the biological sample.
  • a support generally solid, functionalized on which have been fixed by covalent bond and localized given nucleic acids (nucleic probes) and on which nucleic probes will be specifically fixed respectively by pairing ( or specific hybridization) or by recognition of an affinity site the nucleic acids which it is desired to detect or identify in the biological sample.
  • polymer brushes which makes it possible to increase the grafting density .
  • These polymers can be obtained from hydroxyethyl methacrylate, acrylamide, or vinyl pyrrolidone;
  • the international patent application published under the number WO 00/36145 describes, for its part, a method of manufacturing DNA chips, comprising the polymerization on a metal layer type substrate, of a copolymer of pyrrole and of functionalized pyrrole, fixing a crosslinking agent on the functionalized pyrrole, then fixing a biological probe (such as an oligonucleotide).
  • the crosslinking agent can be bifunctional, and for example have an ester function of N-hydroxysuccinimide and a maleimide function;
  • PCR ranging from 200 to a few thousand base pairs, are the subject of great interest.
  • burrs syndromes of fluorescence around the spots after hybridization
  • biochip whose protocol allowing the immobilization of the oligonucleotide probes on a support, such as glass, for the manufacture of these biochips is a simple protocol (minimum of stages, if possible of "light” chemistry), rapid (this point is all the more important as the volumes used on each "spot” are very small and evaporate quickly, it is therefore essential that the covalent grafting be rapid and that excess probes can be easily removed from the surface (without leaving streaks)) and reproducible.
  • the subject of the present invention is a method for preparing an activated biochip for the covalent attachment of oligonucleotide probes, said biochip comprising a solid support previously functionalized with a thiol or amine function, characterized in that it comprises a step of covalent fixing under the appropriate conditions on said functionalized support of an NHS-PEG-VS spacer compound of formula (I):
  • n is an integer chosen such that the molecular mass of the NHS-PEG-VS compound of formula (I) is between 500 and 5000, preferably between 2000 and 4000, more preferably close to 3400.
  • activated biochip in the present description, a solid support as defined below, on which will have been fixed by covalent bonding the spacer compounds of formula (I) capable of interacting with the nucleic probes , but not yet coated with said probes.
  • nucleic acid nucleic probe, nucleic or nucleic acid sequence, polynucleotide, oligonucleotide, polynucleotide sequence, nucleotide sequence, terms which will be used interchangeably in the present description, is intended to denote a precise sequence of nucleotides, modified or not, allowing to define a fragment or a region of a nucleic acid, with or without unnatural nucleotides, and which can correspond as well to double stranded DNA, single stranded DNA, a PNA (for “Peptid Nucleic Acid”) or LNA (for "Locked Nucleic Acid”) as transcripts of said DNAs such as TARN.
  • PNA for “Peptid Nucleic Acid”
  • LNA for “Locked Nucleic Acid
  • oligonucleotide probe or nucleic probe is intended to denote here the functionalized oligonucleotide which will be deposited (or “spotted”) and fixed by covalent bond to said spacer compound on the functionalized solid support, this as opposed to the target nucleic acid derived from the biological sample that one seeks to detect or identify.
  • the method for preparing an activated biochip according to the invention is characterized in that said solid support is selected from glass solid supports, plastic, Nylon ®, Kevlar ®, silicone , in silicon, or in polyoses or poly (hetero-oses), such as cellulose, preferably in glass.
  • This support can be of any shape (flat blade, microbeads, ).
  • the process for preparing an activated biochip according to the invention is characterized in that said solid glass support is functionalized by silanization.
  • the method for preparing an activated biochip according to the invention is characterized in that said solid support is functionalized with an amino function when said oligonucleotide probes intended to be fixed are functionalized with a terminal thiol function .
  • the method for preparing an activated biochip according to the invention is characterized in that said solid support is functionalized with a thiol function when said oligonucleotide probes intended to be fixed are functionalized with a terminal amino function .
  • said solid support in particular made of glass, is functionalized with a thiol function
  • the present invention also relates to a process for the preparation of a deactivated biochip for the covalent attachment of oligonucleotide probes functionalized with a terminal amine function, characterized in that it comprises the following stages: a) activation of the biochip by a process for the preparation of an activated biochip for the covalent attachment of oligonucleotide probes functionalized with a terminal amino function; and b) hydrolysis in the presence of an aqueous solution, preferably of pure water, of the free NHS functions of the NHS-PEG-VS spacer compounds of formula (I) fixed on the solid support.
  • the present invention also relates to a process for the preparation of a regenerated biochip for the covalent attachment of oligonucleotide probes functionalized with a terminal amine function, characterized in that it comprises the following steps:
  • EDC 1-ethyl-3 [3 (dimethylamino) propyl] carbodiimide hydrochloride
  • NHS carbodiimide hydrochloride
  • the process for preparing an activated, deactivated or regenerated biochip according to the invention is characterized in that it comprises a step in which the biochip obtained is frozen, dried or lyophilized, preferably dried under an inert atmosphere, such as under nitrogen, and away from humidity.
  • the present invention relates to a process for the preparation of a biochip coated with oligonucleotide probes, characterized in that it comprises the following steps: ⁇ ) the preparation of a biochip activated or regenerated by a process according to the invention; ⁇ ) deposition and fixation by covalent bond under the appropriate conditions: - either of said oligonucleotide probes previously functionalized with a thiol function, if said solid support has been functionalized with an amino function, or
  • oligonucleotide probes previously functionalized with an amino function, if said solid support has been functionalized with a thiol function; and optionally, ⁇ ) elimination of the oligonucleotide probes not fixed on the support by at least one step of rinsing the support under appropriate conditions, preferably in deionized water.
  • the present invention further relates to a process for preparing a biochip comprising a solid support previously functionalized with a thiol function, then activated by deposition of NHS-PEG-VS of formula (I) and coated with oligonucleotide probes according to invention, characterized in that it further comprises the following step: ⁇ ) deactivation in the presence of amino compounds under the appropriate conditions of the NHS functions of the spacer compound which has not interacted with the amino functions of the oligonucleotide probes.
  • said compound allowing the deactivation of the NHS functions of the spacer compound in step ⁇ ) is chosen from amino compounds having a primary amine, preferably ethanolamine or methoxy-PEG-NH 2 , in particular such as available for the latter from Shearwater
  • the present invention also relates to a process for preparing a biochip comprising a solid support previously functionalized with an amine function then activated by deposition of NHS-PEG-VS of formula (I) and coated with oligonucleotide probes, characterized in that that it further comprises the following step: ⁇ ) the reduction, under appropriate conditions, of surface charges in the presence of anionic compounds or which are capable of establishing covalent bonds with the amino groups and lead to a neutral or negative species under the appropriate conditions, preferably in the presence of methyl N-succinimidyl adipate (MSA).
  • MSA methyl N-succinimidyl adipate
  • the present invention also relates to a process for the preparation of a biochip coated with oligonucleotide probes according to the invention, characterized in that it comprises a step in which the biochip obtained is stored away from humidity, light and / or in an inert atmosphere.
  • said oligonucleotide probes are single-stranded DNAs or RNAs, preferably DNAs or RNAs, the size of which is between 15 and 7000 bp, preferably between 20 and 1000 bp, between 20 and 500 bp, between 20 and 250 bp, between 20 and 100 bp, between 20 and 80 bp or between 35 and 80 bp.
  • probe DNAs or RNAs can be obtained by chemical synthesis, or from genomic DNA, RNA, or mRNA, or their fragments, extracted from cells, in particular for cDNAs after reverse transcription of these RNAs, or also in the form of a PCR fragment obtained by RT-PCR from these RNAs, or by PCR from these genomic DNAs (“RT-PCR” for a method called reverse transcription followed by a polymerization chain reaction).
  • the methods for preparing a biochip coated with oligonucleotide probes according to the invention are characterized in that said oligonucleotide probes are deposited in the form of spots whose average diameter is between 20 ⁇ m and 500 ⁇ m, preferably between 50 ⁇ m and 200 ⁇ m, and, where appropriate, in that the average distance between the center of each of the spots of oligonucleotide probes is between 80 ⁇ m and 400 ⁇ m.
  • the methods for preparing a biochip coated with oligonucleotide probes according to the invention are characterized in that the number of said spots of oligonucleotide probes is between 2 and 10 5 , preferably between 2 and 10 4 , 2 and 10 3 , 2 and 4 10 2 , 2 and 10 2 , even more preferably between 50 and 10 3 and between 50 and 4 10 2 per cm 2 .
  • the subject of the present invention is a biochip comprising a solid support previously functionalized with a thiol or amino function, characterized in that it comprises an NHS-PEG-VS spacer compound of formula (I):
  • PEG denotes poly (ethylene glycol) of formula HO- (CH 2 CH 2 O) n CH 2 CH 2 -OH, where n is an integer chosen such that the molecular mass of the NHS-PEG-VS compound of formula (I) is between 500 and 5000, preferably between 200 and 4000 and close to 3400, said spacer compound being fixed on said solid support by a covalent bond resulting either from the interaction between the thiol function of said functionalized support and the vinyl sulfone function of the spacer compound of formula (I) or either from the interaction between the amino function of said functionalized support and the NHS function of the spacer compound of formula (I).
  • the biochip according to the invention is characterized in that it further comprises at least one oligonucleotide probe, previously functionalized with a thiol or amine function, attached to said solid support by a covalent bond resulting either from the interaction between the free NHS function of said spacer compound of formula (I) and an amine function of said oligonucleotide probe, or either of the interaction between the free vinyl sulfone function of the spacer compound of formula (I) and a thiol function of said oligonucleotide probe.
  • the biochip according to the invention is characterized in that said fixed oligonucleotide probes are DNAs or single-stranded RNAs, preferably DNAs or RNAs, the size of which is between 15 and 7000 bp, preferably between 20 and 1000 bp, between 20 and 500 bp, between 20 and 250 bp, between 20 and 100 bp, between 20 and 80 bp or between 35 and 80 bp.
  • said fixed oligonucleotide probes are DNAs or single-stranded RNAs, preferably DNAs or RNAs, the size of which is between 15 and 7000 bp, preferably between 20 and 1000 bp, between 20 and 500 bp, between 20 and 250 bp, between 20 and 100 bp, between 20 and 80 bp or between 35 and 80 bp.
  • the biochip according to the invention is characterized in that said oligonucleotide probes are deposited in the form of spots whose diameter is between 20 ⁇ m and 500 ⁇ m, preferably between 50 ⁇ m and 200 ⁇ m and, if necessary , in that the average distance between the center of each of the spots of oligonucleotide probes is between 80 ⁇ m and 400 ⁇ m.
  • the biochip according to the invention is characterized in that the number of said spots of oligonucleotide probes is between 2 and 10 5 , preferably between 2 and 10 4 , 2 and 10 3 , 2 and 4 10 2 , 2 and 10 2 , even more preferably between 50 and 10 3 and between 50 and 4 10 2 per cm2.
  • the biochip according to the invention is characterized in that said solid support is chosen from solid supports made of glass, plastic, Nylon, Kevlar, silicone, silicon, polyoses or polyhetero-oses, preferably glass, preferably silanized.
  • the present invention also relates to an activated, deactivated, regenerated biochip, or else coated with oligonucleotide probes, capable of being obtained by a method according to the invention.
  • the present invention includes the use of a biochip according to the invention for the detection of nucleic acids in a sample.
  • the present invention relates to a kit or necessary for the detection, qualitative or quantitative analysis of nucleic acids in a sample, characterized in that it comprises a biochip according to the invention.
  • the present invention also relates to a method for the detection of nucleic acids in a sample, characterized in that it comprises the following steps: a) the deposition of the sample containing the target nucleic acids whose presence on a biochip coated with oligonucleotide probes according to the invention, under conditions allowing specific hybridization of these target nucleic acids with said oligonucleotide probes; b) if necessary, rinsing the biochip obtained in step a) under the appropriate conditions in order to remove the nucleic acids from the sample not captured by hybridization; and c) detecting the nucleic acids captured on the biochip by hybridization.
  • these are preferably conditions of high stringency in particular as defined below or as cited, without being limited to, in the examples below. -after.
  • Hybridization under conditions of high stringency means that the conditions of temperature and ionic strength are chosen in such a way that they allow hybridization to be maintained between two complementary DNA or RNA / DNA fragments.
  • conditions of high stringency of the step Hybridization for the purpose of defining the hybridization conditions described above are advantageously the following.
  • DNA-DNA or DNA-RNA hybridization is carried out in two stages: (1) prehybridization at 42 ° C for 3 hours in phosphate buffer (20 mM, pH 7.5) containing 5 x SSC (1 x SSC corresponds to a 0.15 M NaCl + 0.015 M sodium citrate solution), 50% formamide, 7% sodium dodecyl sulfate (SDS), 10 x Denhardt's, 5% dextran sulfate and 1% salmon sperm DNA; (2) actual hybridization for 20 hours at a temperature depending on the size of the probe (ie: 42 ° C, for a probe of size> 100 nucleotides) followed by 2 washes of 20 minutes at 20 ° C in 2 x SSC + 2% SDS, 1 wash for 20 minutes at 20 ° C in 0.1 x SSC + 0.1% SDS.
  • / last wash is carried out in 0.1 x SSC + 0.1% SDS for 30 minutes at 60 ° C for a probe of size> 100 nucleotides.
  • the high stringency hybridization conditions described above for a polynucleotide of defined size can be adapted by the skilled person for oligonucleotides of larger or smaller size, according to the teaching of Sambrook et al. (1989, Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor).
  • the invention also includes a method for the detection of nucleic acids in a sample according to the invention, characterized in that the nucleic acids whose presence is sought to be detected are marked beforehand at one of their ends with a marker capable of generating directly or indirectly a detectable signal, preferably detectable by fluorescence.
  • the invention also includes a method for the detection of nucleic acids according to the present invention, characterized in that the nucleic acids whose presence is sought to be detected are marked beforehand for at least two of them by a different marker.
  • said markers are chosen from cyanine derivatives, preferably chosen from sulfonated cyanine derivatives, in particular compounds Cy5 or Cy3, nanocrystals (Migyong Han et al, Nature Biotechnology, 19, 631-635, 2001 ) or nanoparticles (Genicon Science company).
  • the present invention also relates to the use of a biochip according to the invention as an affinity matrix or for the purification of nucleic acid.
  • the present invention also relates to the use of a biochip according to the invention for the sequencing of nucleic acid, for the qualitative or quantitative analysis of gene expression or also for the study and detection of polymorphisms genetics (also called SNP's for “Single Nucleotide Polymorphism” or SNIPS).
  • DNA probes corresponding to known genes are deposited on the biochips according to the invention.
  • Each deposit or spot may contain several thousand oligonucleotide probes corresponding to the same gene and from one spot to another the oligonucleotide probes will correspond to another gene, or to a gene having a different polymorphism.
  • Genomic DNAs, or messenger RNAs, or their fragments, from the tissue or cell which it is desired to study may be extracted and then labeled with fluorochromes (the DNAs or mRNAs may in particular be transformed into complementary DNAs (cDNAs) by reverse transcription. , and, where appropriate, multiplied by PCR or RT-PCR techniques).
  • fluorochromes the DNAs or mRNAs may in particular be transformed into complementary DNAs (cDNAs) by reverse transcription. , and, where appropriate, multiplied by PCR or RT-PCR techniques).
  • DNAs, cDNAs, or RNAs will then be deposited on the biochip coated with oligonucleotide probes and, if necessary, bind by specific hybridization with the previously deposited oligonucleotide probes which correspond to them.
  • the applications of these DNA biochips are therefore numerous, such as transcription studies, diagnosis (search for mutation), search for therapeutic targets, genetic mapping of individuals.
  • the invention relates to a method for screening for compounds or cells capable of binding specifically to a given oligonucleotide, characterized in that it comprises the following steps: a) bringing said compound into contact to be tested on a biochip according to the invention, under the conditions allowing the possible specific fixation of said compound or of said cell to be tested with said given oligonucleotide, said biochip comprising at least one spot of oligonucleotide probes containing said given oligonucleotides fixed on its solid support and, where appropriate, said compound or said cell being labeled with a label capable of directly or indirectly generating a detectable signal; b) elimination by at least one washing step under the appropriate conditions of the compounds or cells to be tested not specifically bound to said given given oligonucleotide
  • the present invention relates to a diagnostic or research instrument or device comprising a biochip according to the invention.
  • Fifiures 1 A to ID Grafting of oligonucleotides functionalized by an amino group (NH 2 -terminated)
  • Figure 1 A glass surface (Si-OH silanols).
  • Figure 1B glass surface functionalized with mercaptosilanes (SH- terminated).
  • Figure 1C grafting of heterobifunctional PEG (NHS-PEG-VS).
  • the NHS ends remain free and reactive;
  • Figure ID fixation of oligonucleotides functionalized by an amino group (NH -terminated).
  • the surface is firstly silanized (functionalization) so as to obtain SH (thiol at the surface) functions.
  • SH thiol at the surface
  • the VS function of the heterobifunctional PEG which is then deposited (activation) will react with the thiols on the surface to form a covalent bond.
  • the oligonucleotides carrying an amino function at one of their ends are finally deposited. This amino function will react with the NHS function of the heterobifunctional PEG to form a covalent bond.
  • GOLD SEAL glass slides are used. These slides are cleaned using a mixture of sulfuric acid-hydrogen peroxide (70/30, v / v) with a volume of 300 ml for 15 minutes (Piranha mixture).
  • the slides are rinsed with pure water and then with methanol.
  • the silanization bath is composed of:
  • the slides are immersed for 2 hours in this bath.
  • the slides are then rinsed with pure methanol and then dried with argon, finally the slides are placed for 15 minutes in an oven at 94 ° C.
  • Example 2 Support for oligonucleotide probes functionalized by a thiol group: Method 2
  • the slides are, as for the experimental protocol of Example 1, washed with the Piranha mixture.
  • the composition of the silanization bath changes:
  • composition of the solution (for one slide): - 2 mg of NHS -PEG -VS MW 3400 Shearwater Polymers;
  • Carbonate-Bicarbonate (CB) buffer pH 8.4.
  • the pH of 8.4 is optimal for the chemical reaction between the NHS function of PEG and the NH2 functions of the silanized surface.
  • the solution is deposited on the surface of the slide to be treated for 45 minutes.
  • Example 3 Support deactivated then regenerated for oligonucleotide or peptide probes functionalized with an amino group
  • the NHS function is sensitive to humidity and deactivates within a few days. To remedy this, a method has been developed which consists in deactivating the function in a stable form and then regenerating it when the oligonucleotide probes are deposited.
  • the slides are first prepared as for method 1. Then the NHS function is hydrolyzed by immersing the slides in a bath of pure water until the moment of deactivation. The NHS function is transformed into carboxylate (COO " ). B) Regeneration
  • Example 4 Passivation (or “capping”) of the regions of the support having active NHS groups of the spacer compound which have not interacted with the probes for method 1 1.
  • Passivation or “capping” of the regions of the support having active NHS groups of the spacer compound which have not interacted with the probes for method 1 1.
  • the regions around these deposits always have active groups of NHS or VS type depending on the method used. This is particularly troublesome for method 1 as described in example 1 for which the active NHS group is reactive with the amino groups.
  • these amino groups are found in certain nucleotide bases. These amino groups are, in particular for the bases, much less reactive than the primary amino groups which serve as a hooking function for the oligonucleotides.
  • the base amines do not compete (or very little) with the terminal amines of the functionalized oligonucleotide probes.
  • the target nucleic acids such as the cDNAs, which are deposited on the support only have the amines constituting their bases. There is therefore a risk of a reaction between the base amines of the target nucleic acids and the NHS remaining around the deposits of the oligonucleotide probes, which has the effect of increasing the background noise. It is therefore preferable to deactivate these NHS sites that are still active.
  • the slides are placed for 15 min in the blocking solution at 50 ° C: - rinsing with milliQ water for 4 min;
  • Protocol 2 using a monofunctional PEG as an agent for deactivating NHS groups which have not interacted with the probes.
  • a monofunctional PEG having an amino group at one of its ends is used. This amino group reacts with NHS by forming a covalent bond. The surface around the spots on which the probes have been placed is then covered with PEG.
  • a solution is prepared containing: - 2 ml of phosphate buffer (HPO 4 / H2PO 4 ) 150 mM at pH 8.2; and
  • the slide is immersed in this solution for 45 minutes, then it is rinsed with pure water and dried with argon.
  • thiolated compounds for example N-ethylmaleimide, iodoacetate derivatives (sodium tetrathionate, Ellman reagent), aziridines, acryloyl derivatives, can be used.
  • Oligonucleotide probes of 50 bases corresponding to fragments of mouse genes were deposited on functionalized glass slides on which the spacer compound NHS-PEG-VS was previously fixed. Three nucleic acid sequences were used:
  • the oligonucleotides are deposited using a "spotter” from the company GeneMachines (OmniGrid). This spotter is a spotter with tip (Majer Precision) which allows deposits of a few ni. Between each deposit, the tip is washed to avoid contamination from one deposit to another.
  • spotter from the company GeneMachines (OmniGrid). This spotter is a spotter with tip (Majer Precision) which allows deposits of a few ni. Between each deposit, the tip is washed to avoid contamination from one deposit to another.
  • the blades according to the present invention are prepared according to method 1 and method 2. The results obtained with these blades were compared with those obtained under the same conditions of use with blades marketed by the company SurModics (SurModics, Inc., Eden Prairie, MN) under the reference “3D-LINK TM activated slides” (Lot DN01B058 package N ° 19), activated slides capable of fixing NH functionalized nucleotide probes having a free amine function (“amine-binding slides”).
  • the blades of the SurModics Company are known to be the most efficient of the commercial blades currently available.
  • the oligonucleotides are resuspended in pure water (milliQ) at a concentration of 0.5 mM.
  • concentration of the oligonucleotide solutions is adjusted to 5 ⁇ M for the values of pH 6.8; 7.7; and 8.3 in 150 mM phosphate buffer, in a total volume of 12 ⁇ l.
  • the biochips thus coated with oligonucleotide probes are hybridized with a solution containing the target oligonucleotides of sequences complementary to the deposited oligonucleotide probes.
  • Three target oligonucleotides of sequences complementary to the oligonucleotide probes thus spotted were mixed:
  • target oligonucleotides carry a 5 'fluorochrome (Cy5). These complementary target oligonucleotides are first resuspended in pure water at a concentration of 50 ⁇ M.
  • each complementary target oligonucleotide ie a total of 3 ⁇ l.
  • a mixture of the three target oligonucleotides carrying a fluorochrome is obtained
  • the slides are rinsed as below.
  • the slides are first placed in a 4X SSC solution in order to drop the slides, then:
  • the scanner used has two settings for reading: - the setting of the excitation intensity (LASER); and
  • the intensity of these two adjustments is expressed in an arbitrary unit. At the most the two values are at 100. For certain slides these maximum values saturate the fluorescence signal, it is then necessary to decrease the intensities of the LASER and / or of the PMT.
  • Hybridization experiment on a biochip prepared according to method 1 pH test.
  • NH 2 functionalized olignucleotide probes (“oligo NH2”) and non-functionalized were deposited at different pH values.
  • the chip was hybridized with a mixture of target oligonucleotides complementary to those deposited, fluorescently labeled. 2 matrices of 54 spots were deposited.
  • the fluorescence intensity reports obtained for the functionalized and non-functionalized oligonucleotide probes show the very good selectivity of the support for the functionalized oligonucleotide probes which are grafted by covalent bond.
  • the signal to noise ratio is excellent (5,000), the background noise being very low.
  • the spots are of very good size with a very small dispersion of the diameters (low wettability) especially for the oligonucleotide probes functionalized with amino groups.
  • the scanner was set to 100/100.
  • the results of the experiment are presented in Table 2 below.
  • Oligonucleotide probes functionalized with an SH group (“Oligo SH”) and non-functionalized (“Oligo non-functionalized”) were deposited in solution at different pH values.
  • the chip was hybridized with a mixture of target oligonucleotides complementary to the deposited probes, fluorescently labeled.
  • the oligonucleotide probes functionalized with an SH group are better fixed than the non-functionalized oligonucleotide probes but the selectivity of the support is less strong than for the slides obtained with method 1.
  • the pH has little influence on grafting.
  • the scanner setting is 100/100.
  • Oligonucleotide probes functionalized with an amino group (“Oligo NH2”) and nonfunctionalized (“Oligo nonfunctionalized”) were deposited in solution at different pH values.
  • the biochip has been hybridized with a mixture target oligonucleotides complementary to the deposited probes, fluorescently labeled.
  • the intensity of the fluorescence is low compared to the intensities measured on the slides according to the present invention, especially since the scanner settings are very different for the two experiments.
  • the grafting seems more effective in basic medium (pH 8.3).
  • the signal to noise ratio appears acceptable but much less important than for the blades according to the invention obtained by method 1 (7 times less). It is the advantage of having a good fluorescence signal which makes it possible to reduce the intensity of the excitation and detection LASER and thus to reduce the background noise.
  • spot diameters are quite wide (greater wettability of the “SURMODICS” blades than that of the blades according to the present invention).
  • the slides are prepared according to method 1 and compared to Surmodics slides.
  • Three oligonucleotide sequences (the same as in Example 6) and for each sequence two types of modified oligonucleotides (functionalized NH2 and not functionalized) are deposited.
  • Each oligonucleotide is deposited for 5 concentration values (2; 5; 10; 20; and 40 ⁇ M).
  • Each sample is spotted twice.
  • 2 matrices of 2 x 3 x 5 x 2 45 spots of oligonucleotides will have been deposited.
  • a double deposit of buffer is carried out in order to eliminate any risk of contamination.
  • the scanner setting is 90/95.
  • the results of the experiments are given in Table 4 below.
  • NH 2 functionalized olignucleotide probes (“oligo NH2”) and non-functionalized were deposited at different concentrations.
  • the chip was hybridized with a mixture of target oligonucleotides complementary to those deposited, marked 0 in fluorescence. 2 matrices of 45 spots were deposited.
  • the scanner setting is 90/95.
  • the experimental results are given in Table 5 below.
  • the intensities are lower than for the slides of method 1.
  • the Surmodics blades have a fluorescence signal 4 times higher (31,000 against 7200) and a signal-to-noise ratio 5 times higher for a concentration of oligonucleotides 8 times lower (5 ⁇ M).
  • the slides according to the invention make it possible to use fewer oligonucleotides than the Surmodics slides for a higher signal intensity.
  • the size of the spots on the Surmodics blades is larger than for the blades according to the invention with a fairly narrow distribution.
  • biochips obtained by the preparation methods according to the invention prove to be particularly effective compared to other commercial supports, in particular compared to supports of the “Surmodics” type which refer to the subject.

Abstract

La présente invention est relative à un procédé de préparation d'une biopuce activée pour la fixation covalente de sondes oligonucléotidiques sur un support solide par l'intermédiaire d'un composé espaceur de type NHS-PEG-VS, ainsi que les biopuces susceptibles d'être obtenues par un tel procédé. L'invention comprend également des méthodes de détection d'acides nucléiques dans un échantillon ou des méthodes de criblage de composés capables de se fixer spécifiquement sur des sondes oligonucléotidiques dans lesquelles sont mises en oeuvre les biopuces selon l'invention. La présente invention a aussi pour objet des kits de détection, d'analyse quantitative ou qualitative d'acides nucléiques dans un échantillon, comprenant de telles biopuces ainsi que l'utilisation de ces dernières comme matrice d'affinité pour la purification d'acide nucléique, pour le séquençage d'acide nucléique, pour l'analyse qualitative ou quantitative de l'expression de gènes ou encore pour l'étude et la détection de polymorphisme génétique.

Description

NOUVEAU PROCEDE DE PREPARATION DE BIOPUCES A ADN ET LEURS APPLICATIONS
La présente invention est relative à un procédé de préparation d'une biopuce activée pour la fixation covalente de sondes oligonucléotidiques sur un support solide par l'intermédiaire d'un composé espaceur de type NHS-PEG-VS, ainsi que les biopuces susceptibles d'être obtenues par un tel procédé. L'invention comprend également des méthodes de détection d'acides nucléiques dans un échantillon ou des méthodes de criblage de composés capables de se fixer spécifiquement sur des sondes oligonucléotidiques dans lesquelles sont mises en œuvre les biopuces selon l'invention. La présente invention a aussi pour objet des kits de détection, d'analyse quantitative ou qualitative d'acides nucléiques dans un échantillon, comprenant de telles biopuces ainsi que l'utilisation de ces dernières comme matrice d'affinité pour la purification d'acide nucléique, pour le séquençage d'acide nucléique, pour l'analyse qualitative ou quantitative de l'expression de gènes ou encore pour l'étude et la détection de polymorphisme génétique.
De nombreuses techniques ou dispositifs d'analyse d'échantillons biologiques ont été développés ces dernières années, en particulier pour l'analyse en parallèle de grandes quantités d'acides nucléiques ou de protéines, notamment suite à l'essor de la génomique ou de la protéomique.
Parmi ces techniques ou dispositifs, les supports permettant de réaliser l'analyse à haut débit d'acides nucléiques, tels que les biopuces, ou puces à ADN (dénommés aussi « micro- ou macroarrays », ou encore « DNA chip ») ont fait l'objet de nombreuses études. Ces biopuces peuvent être en particulier réalisées à partir d'un support, généralement solide, fonctionnalisé sur lequel ont été fixés par liaison covalente et localisés des acides nucléiques donnés (sondes nucléiques) et sur lesquelles des sondes nucléiques vont se fixer spécifiquement respectivement par appariement (ou hybridation spécifique) ou par reconnaissance d'un site d'affinité les acides nucléiques que l'on cherche à détecter ou identifier dans l'échantillon biologique. Parmi les documents décrivant les techniques relatives aux biopuces à ADN, on peut citer en particulier :
- l'article de revue de Wang J. (Nucleic Acids Research, 28, 16, 3011-3016, 2000), qui présente un résumé faisant le point sur les principales techniques connues relatives aux puces à ADN, et le document Schubhart et al. (Nucleic Acids Research, 28, 10, e47, 2000) qui dresse une liste des problèmes auxquels sont confrontés les concepteurs de ces puces ;
- le document brevet délivré sous le N° US 6,030,782, qui décrit un greffage avec une surface mercaptosilanisée, d'acides nucléiques modifiés par un groupe sulhydryle ou disulfure, et l'article de Bamdad (Biophysical Journal, 75, 1997-2003, 1998), qui décrit l'obtention de surfaces présentant des ADN par incorporation de molécules composites, les ADN-thiols, dans des monocouches auto-assemblées (« self- assembled monolayers ou SAMs ») ;
- la demande internationale de brevet publiée sous le N° W0 00/43539 qui propose d'immobiliser des molécules, telles que des oligonucléotides, par le biais de polymères polyfonctionnels (« polymer brushes ») ce qui permet d'augmenter la densité de greffage. Ces polymères peuvent être obtenus à partir de méthacrylate d'hydroxyéthyle, d'acrylamide, ou de vinyl pyrrolidone ;
- la demande internationale de brevet publiée sous le N° WO 00/36145 décrit de son côté une méthode de fabrication de puces à ADN, comprenant la polymérisation sur un substrat de type couche métallique, d'un copolymère de pyrrole et de pyrrole fonctionnalisé, la fixation d'un agent de réticulation sur le pyrrole fonctionnalisé, puis la fixation d'une sonde biologique (telle qu'un oligonucleotide). L'agent de réticulation peut être bifonctionnel, et par exemple présenter une fonction ester de la N- hydroxysuccinimide et une fonction maléimide ;
- la demande internationale de brevet publiée sous le N° WO 98/20020 qui décrit également l'immobilisation à haute densité d'acides nucléiques sur des supports solides, cette fois-ci par mise en contact d'un acide nucléique contenant un groupement thiol avec un support présentant un groupe réagissant avec ce thiol, éventuellement par l'intermédiaire d'un agent de réticulation ; - l'article de Penchovsky et al. (Nucleic Acids Research, 28, 22, e98, 2000), qui décrit une méthode d'immobilisation d'oligonucléotides sur des billes de latex aminées, à l'aide d'un agent de réticulation qui réagit sous l'action de la lumière ; et
- les demandes internationales de brevet publiées sous les N° WO 99/16907, WO 00/40593 et WO 00/44939 de la société Surmodics (qui produit des lames pour le dépôt d'oligonucléotides fonctionnalisés avec une aminé). Ces demandes décrivent notamment la fixation d'acides nucléiques sur des surfaces telles le verre, par l'intermédiaire d'un squelette polymérique auquel sont fixés un ou plusieurs groupements « photochimiquement actifs » d'un côté du polymère (pour le greffage sur la surface) et « thermochimiquement actifs » de l'autre côté (pour le greffage avec l'acide nucléique fonctionnalisé).
En ce qui concerne l'utilisation d'un poly(éthylène glycol) (PEG) hétérobifonctionnel, notons la demande de brevet internationale publiée sous le N° WO
95/13312 de la société Shearwater Polymers (devenue Nektar) qui mentionne l'utilisation thérapeutique d'un tel agent espaceur pour le greffage d'agents thérapeutiques sur des protéines.
Parmi les biopuces déjà réalisées ou en cours de réalisation, celles permettant à la fois de pouvoir être revêtues aussi bien de sondes nucléiques à séquences courtes
(quelques dizaines de bases) simple brin, pouvant être synthétisées chimiquement, que de séquences beaucoup plus longues, double brin, comme celles issues de produits de
PCR, allant de 200 à quelques milliers de paires de bases, font l'objet d'un grand intérêt.
En effet, pour les oligonucléotides de courte séquence, on ne peut pas utiliser par exemple les supports recouverts de polylysine, les acides nucléiques s'adsorbant à plat sur la polylysine et l'accès à la séquence lors de l'hybridation étant difficile voire impossible si le brin déposé est court. Il faut donc pouvoir greffer l' oligonucleotide court par une de ces extrémités afin de libérer l'accès à la séquence lors de l'hybridation ultérieure avec l'acide nucléique cible.
Il existe quelques supports commerciaux qui permettent ce greffage par liaison covalente. En général, les résultats obtenus avec ces biopuces ne sont pas totalement satisfaisants :
- le bruit de fond est trop important ; - le signal d'hybridation est trop faible ;
- il y a présence de bavures (traînées de fluorescence autour des spots après hybridation) ;
- les propriétés de mouillage des surfaces ne sont pas satisfaisantes (les dépôts s'étalent jusqu'à se recouvrir d'un spot à l'autre, des hétérogénéités sous forme d'anneaux apparaissent) ce qui ne permet pas d'agir sur la densité de greffage ou d'obtenir lors du dépôt des spots de bonne taille (de diamètre moyen allant de 50 à 200 μm) ;
- l'absence d'un bras espaceur pour donner de la mobilité à la sonde greffée. Pour cela, il serait souhaitable de pouvoir également disposer d'une biopuce dont le support permet après fixation de ne pas affecter la structure tertiaire (conformation tridimensionnelle) et de donner suffisamment de mobilité pour qu'une hybridation spécifique entre acides nucléiques simple brin puisse se réaliser.
Enfin, il serait souhaitable de pouvoir également disposer d'une biopuce dont le protocole permettant de réaliser l'immobilisation des sondes oligonucléotides sur un support, tel que du verre, en vue de la fabrication de ces biopuces soit un protocole simple (minimum d'étapes, si possible de chimie "légère"), rapide (ce point est d'autant plus important que les volumes utilisés sur chaque "spot" sont très faibles et s'évaporent rapidement, il est donc indispensable que le greffage covalent soit rapide et que les sondes en excès puissent être facilement éliminées de la surface (sans laisser de traînées)) et reproductible.
Il apparaît au regard des biopuces testées et décrites dans les documents déjà publiés qu'aucune de ces biopuces ne correspond à ces critères.
Ainsi, il reste de pouvoir disposer d'une biopuce présentant ces caractéristiques. Ceci est justement l'objet de la présente invention.
Les inventeurs ont de manière surprenante mis en évidence que l'utilisation d'un composé espaceur hétérobifonctionnel NHS-PEG-VS de formule (I) ci-après, fixé par liaison covalente sur un support solide préalablement fonctionnalisé, permettait d'obtenir des biopuces répondant à cette attente. Ainsi, la présente invention a pour objet un procédé de préparation d'une biopuce activée pour la fixation covalente de sondes oligonucléotidiques, ladite biopuce comprenant un support solide préalablement fonctionnalisé avec une fonction thiol ou aminé, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de fixation covalente dans les conditions appropriées sur ledit support fonctionnalisé d'un composé espaceur NHS- PEG-VS de formule (I) :
Figure imgf000007_0001
dans laquelle PEG désigne le poly(éthylène glycol) de formule
HO-(CH2CH2O)„CH2CH2-OH, où n est un nombre entier choisi de telle sorte que la masse moléculaire du composé NHS-PEG-VS de formule (I) est comprise entre 500 et 5000, de préférence entre 2000 et 4000, de manière plus préférée voisine de 3400.
Par le terme « biopuce activée », on entend désigner dans la présente description, un support solide tel que défini ci-après, sur lequel auront été fixés par liaison covalente les composés espaceurs de formule (I) capables d'interagir avec les sondes nucléiques, mais non encore revêtu de cesdites sondes. Par acide nucléique, sonde nucléique, séquence nucléique ou d'acide nucléique, polynucléotide, oligonucleotide, séquence de polynucléotide, séquence nucléotidique, termes qui seront employés indifféremment dans la présente description, on entend désigner un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment ou une région d'un acide nucléique, comportant ou non des nucléotides non naturels, et pouvant correspondre aussi bien à un ADN double brin, un ADN simple brin, un PNA (pour « Peptid Nucleic Acid ») ou LNA ( pour « Locked Nucleic Acid ») que des produits de transcription desdits ADNs tels que TARN.
Par sonde oligonucléotidique ou sonde nucléique, on entendra désigner ici F oligonucleotide fonctionnalisé qui sera déposé (ou « spotté ») et fixé par liaison covalente audit composé espaceur sur le support solide fonctionnalisé, ceci par opposition à l'acide nucléique cible issu de l'échantillon biologique que l'on cherche à détecter ou à identifier. Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de préparation d'une biopuce activée selon l'invention est caractérisé en ce que ledit support solide est choisi parmi les supports solides en verre, en plastique, en Nylon®, en Kevlar®, en silicone, en silicium, ou encore en polyoses ou poly(hétéro-oses), tel que la cellulose, de préférence en verre.
Ce support pourra être de forme quelconque (lame plane, microbilles, ...).
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, le procédé de préparation d'une biopuce activée selon l'invention est caractérisé en ce que ledit support solide en verre est fonctionnalisé par silanisation. Dans un mode de réalisation également préféré, le procédé de préparation d'une biopuce activée selon l'invention est caractérisé en ce que ledit support solide est fonctionnalisé avec une fonction aminé lorsque lesdites sondes oligonucléotidiques destinées à être fixées sont fonctionnalisées avec une fonction thiol terminale.
Lorsque ledit support solide, notamment en verre, est fonctionnalisé avec une fonction aminé, on préfère réaliser cette fonctionnalisation en présence d'un aminosilane, de préférence le N-(2-aminoéthyl)-3-amino-propyltriméthoxysilane. Dans un mode de réalisation également préféré, le procédé de préparation d'une biopuce activée selon l'invention est caractérisé en ce que ledit support solide est fonctionnalisé avec une fonction thiol lorsque lesdites sondes oligonucléotidiques destinées à être fixées sont fonctionnalisées avec une fonction aminé terminale.
Lorsque ledit support solide, notamment en verre, est fonctionnalisé avec une fonction thiol, on préfère réaliser cette fonctionnalisation en présence de mercaptosilane, de préférence le (3-mercaptopropyl)-triméthoxysilane.
La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'une biopuce désactivée pour la fixation covalente de sondes oligonucléotidiques fonctionnalisées avec une fonction aminé terminale caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) l'activation de la biopuce par un procédé de préparation d'une biopuce activée pour la fixation covalente de sondes oligonucléotidiques fonctionnalisées avec une fonction aminé terminale; et b) l'hydrolyse en présence d'une solution aqueuse, de préférence d'eau pure, des fonctions NHS libres des composés espaceurs NHS-PEG-VS de formule (I) fixés sur le support solide.
La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'une biopuce régénérée pour la fixation covalente de sondes oligonucléotidiques fonctionnalisées avec une fonction aminé terminale, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
A) la désactivation la biopuce par le procédé ci-avant de préparation d'une biopuce désactivée selon l'invention ; B) la régénération en présence de l-éthyl-3[3(diméthylamino)propyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) et de NHS des groupements carboxylates obtenus à l'extrémité libre desdits composés espaceurs après hydrolyse des fonctions NHS libres initialement présentes, et, le cas échéant, C) au moins une étape de lavage de la biopuce obtenue à l'étape B), de préférence en eau déionisée.
Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de préparation d'une biopuce activée, désactivée ou régénérée selon l'invention, est caractérisé en ce qu'il comprend une étape dans laquelle la biopuce obtenue est congelée, séchée ou lyophilisée, de préférence séchée sous atmosphère inerte, telle que sous azote, et à l'abri de l'humidité. Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet un procédé de préparation d'une biopuce revêtue de sondes oligonucléotidiques, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : α) la préparation d'une biopuce activée ou régénérée par un procédé selon l'invention ; β) le dépôt et la fixation par liaison covalente dans les conditions appropriées : - soit desdites sondes oligonucléotidiques préalablement fonctionnalisées avec une fonction thiol, si ledit support solide a été fonctionnalisé avec une fonction aminé, ou
- soit desdites sondes oligonucléotidiques préalablement fonctionnalisées avec une fonction aminé, si ledit support solide a été fonctionnalisé avec une fonction thiol ; et, le cas échéant, γ) l'élimination des sondes oligonucléotidiques non fixées sur le support par au moins une étape de rinçage du support dans des conditions appropriées, de préférence en eau déionisée.
La présente invention est en outre relative à un procédé de préparation d'une biopuce comprenant un support solide préalablement fonctionnalisé avec une fonction thiol, puis activé par dépôt de NHS-PEG-VS de formule (I) et revêtue de sondes oligonucléotidiques selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'étape suivante : δ) la désactivation en présence de composés aminés dans les conditions appropriées des fonctions NHS du composé espaceur n'ayant pas interagi avec les fonctions aminés des sondes oligonucléotidiques.
Dans un mode de réalisation préféré, ledit composé permettant la désactivation des fonctions NHS du composé espaceur à l'étape δ) est choisi parmi les composés aminés possédant une aminé primaire, de préférence Péthanolamine ou le méthoxy- PEG-NH2, notamment tel que disponible pour ce dernier auprès de la société Shearwater
Polymers (USA).
La présente invention est en outre relative à un procédé de préparation d'une biopuce comprenant un support solide préalablement fonctionnalisé avec une fonction aminé puis activé par dépôt de NHS-PEG-VS de formule (I) et revêtue de sondes oligonucléotidiques, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'étape suivante : δ) la réduction, dans les conditions appropriées, des charges de surface en présence de composés anioniques ou susceptibles d'établir des liaisons covalentes avec les groupements aminés et conduire à une espèce neutre ou négative dans les conditions appropriées, de préférence en présence de méthyl N-succinimidyl adipate (MSA).
La présente invention est aussi relative à un procédé de préparation d'une biopuce revêtue de sondes oligonucléotidiques selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend une étape dans laquelle la biopuce obtenue est conservée à l'abri de l'humidité, de la lumière et/ou en atmosphère inerte. De préférence, lesdites sondes oligonucléotidiques sont des ADNs ou ARNs monobrins, de préférence des ADNs ou des ARNs, dont la taille est comprise entre 15 et 7 000 pb, de préférence entre 20 et 1 000 pb, entre 20 et 500 pb, entre 20 et 250 pb, entre 20 et 100 pb, entre 20 et 80 pb ou entre 35 et 80 pb.
Ces ADNs ou ARNs sondes peuvent être obtenus par synthèse chimique, ou à partir d'ADN génomique, d'ARN, ou d'ARNm, ou de leurs fragments, extrait de cellules, notamment pour les ADNc après réverse transcription de ces ARNs, ou encore sous forme de fragment PCR obtenus par RT-PCR à partir de ces ARNs, ou par PCR à partir de ces ADNs génomiques (« RT-PCR » pour méthode dite de réverse transcription suivie d'une réaction de polymérisation en chaîne).
De préférence encore, les procédés de préparation d'une biopuce revêtue de sondes oligonucléotidiques selon l'invention, sont caractérisés en ce que lesdites sondes oligonucléotidiques sont déposées sous la forme de spots dont le diamètre moyen est compris entre 20 μm et 500 μm, de préférence entre 50 μm et 200 μm, et, le cas échéant, en ce que la distance moyenne entre le centre de chacun des spots de sondes oligonucléotidiques est comprise entre 80 μm et 400 μm. De préférence encore, les procédés de préparation d'une biopuce revêtue de sondes oligonucléotidiques selon l'invention, sont caractérisés en ce que le nombre desdits spots de sondes oligonucléotidiques est compris entre 2 et 105, de préférence entre 2 et 104, 2 et 103, 2 et 4 102, 2 et 102, de manière encore plus préférée entre 50 et 103 et entre 50 et 4 102 par cm2. Sous un nouvel aspect, la présente invention a pour objet une biopuce comprenant un support solide préalablement fonctionnalisé avec une fonction thiol ou aminé, caractérisée en ce qu'elle comprend un composé espaceur NHS-PEG-VS de formule (I) :
Figure imgf000011_0001
dans laquelle PEG désigne le poly(éthylène glycol) de formule HO-(CH2CH2O)nCH2CH2-OH, où n est un nombre entier choisi de telle sorte que la masse moléculaire du composé NHS-PEG-VS de formule (I) est comprise entre 500 et 5000, de préférence comprise entre 200 et 4000 et voisin de 3400, ledit composé espaceur étant fixé sur ledit support solide par une liaison covalente résultant soit de l'interaction entre la fonction thiol dudit support fonctionnalisé et la fonction vinylsulfone du composé espaceur de formule (I) ou soit de l'interaction entre la fonction aminé dudit support fonctionnalisé et la fonction NHS du composé espaceur de formule (I).
. De préférence, la biopuce selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins une sonde oligonucléotidique, préalablement fonctionnalisée avec une fonction thiol ou aminé, fixée sur ledit support solide par une liaison covalente résultant soit de l'interaction entre la fonction NHS libre dudit composé espaceur de formule (I) et une fonction aminé de ladite sonde oligonucléotidique, ou soit de l'interaction entre la fonction vinylsulfone libre du composé espaceur de formule (I) et une fonction thiol de ladite sonde oligonucléotidique.
De préférence également, la biopuce selon l'invention est caractérisée en ce que lesdites sondes oligonucléotidiques fixées sont des ADNs ou ARNs monobrins, de préférence des ADNs ou des ARNs, dont la taille est comprise entre 15 et 7 000 pb, de préférence entre 20 et 1 000 pb, entre 20 et 500 pb, entre 20 et 250 pb, entre 20 et 100 pb, entre 20 et 80 pb ou entre 35 et 80 pb.
De préférence également, la biopuce selon l'invention est caractérisée en ce que lesdites sondes oligonucléotidiques sont déposées sous la forme de spots dont le diamètre est compris entre 20 μm et 500 μm, de préférence entre 50 μm et 200 μm et, le cas échéant, en ce que la distance moyenne entre le centre de chacun des spots de sondes oligonucléotidiques est compris entre 80 μm et 400 μm.
De préférence également, la biopuce selon l'invention est caractérisée en ce que le nombre desdits spots de sondes oligonucléotidiques est compris entre 2 et 105, de préférence entre 2 et 104, 2 et 103, 2 et 4 102, 2 et 102, de manière encore plus préférée entre 50 et 103 et entre 50 et 4 102 par cm2. De préférence également, la biopuce selon l'invention est caractérisée en ce que ledit support solide est choisi parmi les supports solides en verre, en plastique, en Nylon , en Kevlar , en silicone, en silicium, en polyoses ou polyhétéro-oses, de préférence en verre, de préférence silanisé. La présente invention a aussi pour objet une biopuce activée, désactivée, régénérée, ou encore revêtue de sondes oligonucléotidiques, susceptible d'être obtenue par un procédé selon l'invention.
Sous encore un autre aspect, la présente invention comprend l'utilisation d'une biopuce selon l'invention pour la détection d'acides nucléiques dans un échantillon. Sous encore un autre aspect, la présente invention est relative à un kit ou nécessaire pour la détection, l'analyse qualitative ou quantitative d'acides nucléiques dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend une biopuce selon l'invention.
La présente invention a également pour objet un procédé pour la détection d'acides nucléiques dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) le dépôt de l'échantillon contenant les acides nucléiques cibles dont on cherche à détecter la présence sur une biopuce revêtue de sondes oligonucléotidiques selon l'invention, dans des conditions permettant l'hybridation spécifique de ces acides nucléiques cibles avec lesdites sondes oligonucléotidiques; b) le cas échéant, le rinçage de la biopuce obtenue à l'étape a) dans les conditions appropriées afin d'éliminer les acides nucléiques de l'échantillon non capturés par hybridation ; et c) la détection des acides nucléiques capturés sur la biopuce par hybridation.
Par conditions permettant l'hybridation spécifique d'acides nucléiques cibles avec lesdites sondes oligonucléotidiques, il s'agit de préférence de conditions de forte stringence notamment telles que définies ci-après ou telles que citées, sans s'y limiter, dans les exemples ci-après.
Une hybridation dans des conditions de forte stringence signifie que les conditions de température et de force ionique sont choisies de telle manière qu'elles permettent le maintien de l'hybridation entre deux fragments d'ADN ou d'ARN/ADN complémentaires. A titre illustratif, des conditions de forte stringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les conditions d'hybridation décrits ci-dessus, sont avantageusement les suivantes.
L'hybridation ADN- ADN ou ADN-ARN est réalisée en deux étapes : (1) préhybridation à 42°C pendant 3 heures en tampon phosphate (20 mM, pH 7,5) contenant 5 x SSC (1 x SSC correspond à une solution 0,15 M NaCl + 0,015 M citrate de sodium), 50 % de formamide, 7 % de sodium dodécyl sulfate (SDS), 10 x Denhardt's, 5 % de dextran sulfate et 1 % d'ADN de sperme de saumon ; (2) hybridation proprement dite pendant 20 heures à une température dépendant de la taille de la sonde (i.e. : 42°C, pour une sonde de taille > 100 nucléotides) suivie de 2 lavages de 20 minutes à 20°C en 2 x SSC + 2 % SDS, 1 lavage de 20 minutes à 20°C en 0,1 x SSC + 0,1 % SDS. Le
/ dernier lavage est pratiqué en 0,1 x SSC + 0,1 % SDS pendant 30 minutes à 60°C pour une sonde de taille > 100 nucléotides. Les conditions d'hybridation de forte stringence décrites ci-dessus pour un polynucléotide de taille définie, peuvent être adaptées par l'homme du métier pour des oligonucléotides de taille plus grande ou plus petite, selon l'enseignement de Sambrook et al. (1989, Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor).
L'invention comprend également un procédé pour la détection d'acides nucléiques dans un échantillon selon l'invention, caractérisé en ce que les acides nucléiques dont on cherche à détecter la présence sont préalablement marqués à une de leur extrémité par un marqueur capable de générer directement ou indirectement un signal détectable, de préférence détectable par fluorescence.
L'invention comprend également un procédé pour la détection d'acides nucléiques selon la présente invention, caractérisé en ce que les acides nucléiques dont on cherche à détecter la présence sont préalablement marqués pour au moins deux d'entre eux par un marqueur différent.
De préférence, lesdits marqueurs sont choisis parmi des dérivés de la cyanine, de préférence choisis parmi les dérivés sulfonatés de la cyanine, notamment les composés Cy5 ou Cy3, les nanocristaux (Migyong Han et al, Nature Biotechnology, 19, 631-635, 2001) ou les nanoparticules (société Genicon Science). La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une biopuce selon l'invention comme matrice d'affinité ou pour la purification d'acide nucléique. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une biopuce selon l'invention pour le séquençage d'acide nucléique, pour l'analyse qualitative ou quantitative de l'expression de gènes ou encore pour l'étude et la détection de polymorphismes génétiques (aussi appelés SNP's pour « Single Nucleotide Polymorphism » ou SNIPS).
Par exemple, mais sans s'y limiter, on dépose sur les biopuces selon l'invention des sondes d'ADN correspondant à des gènes connus. Chaque dépôt ou spot pourra contenir plusieurs milliers de sondes oligonucléotidiques correspondant à un même gène et d'un spot à l'autre les sondes oligonucléotidiques correspondront à un autre gène, ou à un gène présentant un polymorphisme différent.
Les ADNs génomiques, ou ARN messagers, ou leurs fragments, du tissu ou de la cellule que l'on souhaite étudier pourront être extraits puis marqués avec des fluorochromes (les ADNs ou ARNm pourront notamment être transformés en ADN complémentaires (ADNc) par réverse transcription, et, le cas échéant, multipliés par les techniques de PCR ou RT-PCR).
Ces ADNs, ADNc, ou ARNs seront ensuite déposés sur la biopuce revêtue de sondes oligonucléotidiques et, le cas échéant, se lier par hybridation spécifique avec les sondes oligonucléotidiques préalablement déposées qui leur correspondent. On va ensuite détecter sur chaque spot, la quantité de signal, notamment de fluorescence, correspondant ainsi à la quantité d'acides nucléiques cibles hybrides, qui sera notamment proportionnelle à la quantité initiale d'ARNm extraits, si les ADNs cibles déposés sont des ADNc complémentaires d'ARNm transcrits. On pourra ainsi mesurer l'activité de transcription de la cellule pour certains gènes. Les applications de ces biopuces à ADN sont par conséquent nombreuses, telles que les études de la transcription, le diagnostic (recherche de mutation), recherche de cibles thérapeutiques, cartographie génétique des individus.
On pourra notamment se référer pour les applications générales de ces biopuces aux nombreux documents déjà publiés sur ce sujet, documents dans lesquels les méthodes mises en œuvres pour ces applications à partir de biopuces activées, ou régénérées, comme celles de la présente invention sont parfaitement explicitées. Sous encore un autre aspect, l'invention, est relative à une méthode de criblage de composés ou cellules capables de se fixer spécifiquement sur un oligonucleotide donné, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) la mise en contact dudit composé à tester sur une biopuce selon l'invention, dans les conditions permettant la fixation spécifique éventuelle dudit composé ou de ladite cellule à tester avec ledit oligonucleotide donné, ladite biopuce comprenant au moins un spot de sondes oligonucléotidiques contenant lesdits oligonucléotides donnés fixés sur son support solide et, le cas échéant, ledit composé ou ladite cellule étant marqué par un marqueur capable de générer directement ou indirectement un signal détectable ; b) l'élimination par au moins une étape de lavage dans les conditions appropriées des composés ou cellules à tester non fixés spécifiquement sur ledit oligonucleotide donné ; et c) la sélection du composé ou de ladite cellule spécifiquement fixé sur ledit oligonucleotide donné, le cas échéant, par la sélection du composé ou de ladite cellule dont le signal a été détecté au niveau du spot contenant ledit oligonucleotide donné.
Sous enfin un dernier aspect, la présente invention a pour objet un instrument ou dispositif de diagnostic ou de recherche comprenant une biopuce selon l'invention.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples et les figures dont les légendes sont représentées ci- après.
LEGENDES DES FIGURES
Fifiures 1 A à ID : Greffage d'oligonucléotides fonctionnalisés par un groupement aminé (NH2-terminés)
Figure 1 A : surface de verre (silanols Si-OH).
Figure 1B : surface de verre fonctionnalisée avec des mercapto-silanes (SH- terminés).
Figure 1C : greffage de PEG hétérobifonctionnel (NHS-PEG-VS). Les extrémités NHS restent libres et réactives; Figure ID : fixation d'oligonucléotides fonctionnalisés par un groupement aminé (NH -terminés).
Exemple 1. Support pour sondes oligonucléotidiques fonctionnalisées par un groupement aminé : Méthode 1
1. Principe
Utilisation d'un PEG hétérobifonctionnel portant les fonctions NHS et VS.
La surface est dans un premier temps silanisée (fonctionnalisation) de façon à obtenir des fonctions SH (thiol en surface). La fonction VS du PEG hétérobifonctionnel qui est ensuite déposé (activation) va réagir avec les thiols de la surface pour former une liaison covalente. Les oligonucléotides portant une fonction aminé à l'une de leurs extrémités sont finalement déposés. Cette fonction aminé va réagir avec la fonction NHS du PEG hétérobifonctionnel pour former une liaison covalente.
2. Protocole expérimental a) Silanisation
Des lames de verre GOLD SEAL sont utilisées. Ces lames sont nettoyées à l'aide d'un mélange d'acide sulfurique-eau oxygénée (70/30, v/v) d'un volume de 300 ml pendant 15 minutes (mélange Piranha).
Les lames sont rincées à l'eau pure puis au méthanol. Le bain de silanisation est composé de :
- 60 ml de méthanol pur pour synthèse (SDS réf.: 0930221) ;
- 510 μl d'acide acétique ;
- 2,55 ml d'eau pure ; et
- 1,275 ml de (3-Mercaptopropyl)-triméthoxysilane (SIGMA, EE No. 224-588- 5).
Les lames sont plongées 2 heures dans ce bain.
Les lames sont ensuite rincées au méthanol pur puis séchées à l'argon, enfin les lames sont placées 15 minutes dans une étuve à 94°C.
Les lames sont stockées sous vide dans un dessiccateur. b) Application du PEG hétérobifonctionnel Préparation d'une solution de PEG hétérobifonctionnel dans du tampon PBS lx (phosphate salin) à pH 7. Cette valeur de pH est optimale pour la réaction entre les thiols de la surface et la fonction VS du PEG.
Pour une lame : - 2 mg de NHS-PEG-VS, MW 3400 (Shearwater Polymers) ; et
- 2 ml de PBS lx.
La solution est déposée sur la surface de la lame à traiter pendant 45 minutes. Les lames sont ensuite rincées avec de l'eau déionisée et séchées à l'argon. Exemple 2. Support pour sondes oligonucléotidiques fonctionnalisées par un groupement thiol : Méthode 2
1. Principe
C'est le même principe que pour la méthode 1 sauf qu'ici la surface des lames est silanisée avec des fonctions aminés. Ainsi, la fonction NHS du PEG va réagir avec ces groupements de surface et le groupement VS restant pourra réagir avec des oligonucléotides possédant une fonction thiol terminale.
2. Protocole expérimental a) Silanisation
Les lames sont, comme pour le protocole expérimental de l'exemple 1, lavées avec le mélange Piranha. La composition du bain de silanisation change :
- 60 ml de méthanol pur pour synthèse (SDS réf.: 0930221) ;
- 510 μl d'acide acétique ;
- 2,55 ml d'eau pure ;
- 1,275 ml de Silane : N-[3-(Triméthoxysilyl)propyl]diéthylènetriamine, 97 % (ALDRICH 10,488-4).
La solution est déposée sur la surface de la lame à traiter pendant 45 minutes. Les lames sont ensuite rincées avec de l'eau déionisée et séchées à l'argon. b) Application du PEG hétérobifonctionnel
Composition de la solution (pour une lame) : - 2 mg de NHS -PEG -VS MW 3400 Shearwater Polymers ;
- 2 ml de tampon Carbonate-Bicarbonate (CB), pH 8,4. Le pH de 8,4 est optimal pour la réaction chimique entre la fonction NHS du PEG et les fonctions NH2 de la surface silanisée.
La solution est déposée sur la surface de la lame à traiter pendant 45 minutes.
Les lames sont ensuite rincées avec de l'eau déionisée et séchées à l'Argon. Exemple 3. Support désactivé puis régénéré pour sondes oligonucléotidiques ou peptidiques fonctionnalisées par un groupement aminé
1. Principe
La fonction NHS est sensible à l'humidité et se désactive en quelques jours. Pour remédier à cela, il a été mis au point une méthode qui consiste à désactiver la fonction sous une forme stable puis à la régénérer au moment du dépôt des sondes oligonucléotidiques .
2. Protocole expérimental a) Désactivation
Les lames sont d'abord préparées comme pour la méthode 1. Puis on hydrolyse la fonction NHS en plongeant les lames dans un bain d'eau pure jusqu'au moment de la désactivation. La fonction NHS se transforme en carboxylate (COO"). b) Régénération
Le protocole de Patel et al. (Langmuir, 13:06485-6490, 1997) est appliqué ici. Brièvement : On prépare dans de l'eau pure une solution composée de :
- 15 mM de NHS (Fluka), de préférence dissous préalablement dans du DMSO (on peut également utiliser du sulfo-NHS à la place du NHS qui est soluble dans l'eau) ; et
- 5 mM d'EDC. Les lames sont ensuite plongées dans la solution pendant 10 minutes.
On rince ensuite les lames à l'eau pure et on les sèche à l'argon. Exemple 4. Passivation (ou « capping ») des régions du support présentant des groupements NHS actifs du composé espaceur n'ayant pas interagi avec les sondes pour la méthode 1 1. Principe Après le dépôt des oligonucléotides (« spotting »), les régions autour de ces dépôts possèdent toujours des groupements actifs de type NHS ou VS suivant la méthode utilisée. Cela est en particulier gênant pour la méthode 1 telle que décrite dans l'exemple 1 pour laquelle le groupement actif NHS est réactif avec les groupements aminés. Or, ces groupements aminés se retrouvent dans certaines bases nucléotidiques. Ces groupements aminés sont, notamment pour les bases, beaucoup moins réactifs que les groupements aminés primaires qui servent de fonction d'accroché pour les oligonucléotides. Ainsi, lors du dépôt, les aminés des bases n'entrent pas en compétition (ou très peu) avec les aminés terminales des sondes oligonucléotidiques fonctionnalisées. Par contre, lors de l'hybridation, les acides nucléiques cibles, tels que les ADNc, que l'on dépose sur le support ne possèdent que les aminés constitutives de leurs bases. Il risque donc d'y avoir une réaction entre les aminés des bases des acides nucléiques cibles et les NHS restant autour des dépôts des sondes oligonucléotidiques ce qui a pour conséquence d'augmenter le bruit de fond. Il est donc préférable de désactiver ces sites NHS encore actifs.
2. Protocole de passivation des supports pour la méthode 1 telle que décrite dans l'exemple 1
2.1 Protocole 1 utilisant de l'éthanolamine comme agent de désactivation des groupements NHS n'ayant pas interagi avec les sondes. Solution de capping :
- 40 ml de tampon phosphate (HPO^ffiPO^ pH = 8,2 150mM ; - 1 ml d'éthanolamine ;
- 2 ml de SDS 10 % ; et
- on complète avec de l'eau milliQ jusqu'à 200 ml. Solution de lavage :
- 100 ml 20 X SSC ;
- 5 ml SDS 10 % ; et
- on complète à 500 ml avec de l'eau milliQ.
Les lames sont placées pendant 15 min dans la solution de blocage à 50°C : - rinçage à l'eau milliQ pendant 4 min ;
- lavage des lames avec la solution de lavage pendant 15 min ; - rinçage à l'eau milliQ pendant 6 min ; et
- centrifugation à 800 tr/min (50 g) pendant 3 min.
2.2 Protocole 2 utilisant un PEG monofonctionnel comme agent de désactivation des groupements NHS n'ayant pas interagi avec les sondes. Pour ce deuxième protocole un PEG monofonctionnel possédant un groupement aminé à l'une de ses extrémités est utilisé. Ce groupement aminé réagit avec les NHS en formant une liaison covalente. La surface autour des spots sur lesquels ont été déposées les sondes est alors recouverte de PEG.
On prépare une solution contenant : - 2 ml de tampon phosphate (HPO4/H2PO4) 150 mM à pH 8,2 ; et
- 2 mg de méthoxy-PEG-NH (Shearwater Polymers).
La lame est plongée dans cette solution pendant 45 minutes, puis elle est rincée à l'eau pure et séchée à l'argon.
Exemple 5. Passivation des régions du support présentant des groupements VS actifs du composé espaceur n'ayant pas interagi avec les sondes pour la méthode 2
Comme il n'y a pas de fonction thiol dans les bases constitutives des acides nucléiques, tel que l'ADN, il n'est donc pas nécessaire de désactiver les sites VS libres pour le dépôt de sondes oligonucléotidiques. Seul un rinçage à l'eau pure est réalisé afin d'éliminer ici les oligonucléotides qui ne se sont pas greffés.
De manière générale, tous les composés thiolés et par exemple le N- éthylmaléimide, les dérivés iodoacétates (sodium tétrathionate, réactif d'Ellman), les aziridines, les dérivés acryloyls, peuvent être utilisés.
Toutefois, afin d'isoler ou de réduire les charges de surfaces dans la méthode 2, il est préférable de déposer avant spotting des sondes, dans les conditions appropriées, des composés anioniques ou susceptibles d'établir des liaisons covalentes avec les groupements aminés et conduire à une espèce neutre ou négative dans les conditions appropriées, tel que par exemple suivant le protocole ci-après en utilisant le méthyl N- succinimidyl adipate (MSA). Protocole utilisant le MSA comme agent de neutralisation des charges de surfaces dans la méthode 2. On dépose sur la surface une solution de MSA dans du PBS 1 x pH 7,4 (1 mg de MSA pour 1 ml de PBS). La surface est recouverte d'une lame de plastique. La solution de MSA est laissée en contact avec la surface pendant 1 heure. Ensuite rinçage à l'eau pure et séchage à l'azote. Exemple 6. Expériences d'hybridation des lames avec une solution de sondes oligonucléotidiques : influence du pH sur le greffage des oligonucléotides
1. Principe des expériences
Des sondes oligonucléotidiques de 50 bases correspondant à des fragments de gènes de souris ont été déposées sur des lames de verre fonctionnalisées sur lesquelles le composé espaceur NHS-PEG-VS a été préalablement fixé. Trois séquences nucléiques ont été utilisées :
GTGCCTCACGGTGGTTGCCATCACTGTCTTCATGTTCGAGTATTTCAGCC (SEQ ID N° 1) ;
TTTTGAGATCTGGCTTCATTTCGACGCTGACGGAAGTGGTTACCTGGAAG (SEQ ID N° 2) ; et
AACGCCCATCTTAAAATCGACGCCTGTCTCTCCCCCATTGCTCTTACCAG (SEQ ID N° 3).
Pour chaque séquence sonde, trois types d'oligonucléotides ont été déposés :
- fonctionnalisé NH2 en 3' ; - fonctionnalisé SH en 3' ; et
- non fonctionnalisé.
Les lames ainsi obtenues ont été comparées aux lames de différentes sociétés.
2. Matériel
Les oligonucléotides sont déposés à l'aide d'un « spotteur » de la société GeneMachines (OmniGrid). Ce spotteur est un spotteur à pointe (Majer Précision) qui permet de faire des dépôts de quelques ni. Entre chaque dépôt la pointe est lavée afin d'éviter les contaminations d'un dépôt à l'autre.
Les lames sont ensuite lues après hybridation à l'aide d'un scanner (ScanArray 3000 GSI) et les images sont analysées à l'aide du logiciel Imagene 4.1 (Biodiscovery). 3. Expériences d'hybridation d'oligonucléotides sur les lames pour oligonucléotides aminés a) Préparation des lames
Les lames selon la présente invention sont préparées selon la méthode 1 et la méthode 2. Les résultats obtenus avec ces lames ont été comparés à ceux obtenus dans les mêmes conditions d'utilisation avec des lames commercialisées par la Société SurModics (SurModics, Inc., Eden Prairie, MN) sous la référence « 3D-LINK™ activated slides » (Lot DN01B058 paquet N° 19), lames activées capables de fixer des sondes nucléotidiques fonctionnalisées NH possédant une fonction aminé libre (« amine-binding slides »). Les lames de la Société SurModics sont connues comme étant les plus performantes des lames commerciales actuellement disponibles. Pour la comparaison de méthodes chimiques permettant d'immobiliser de manière covalente des oligonucléotides sur des lames de verre, on pourra par exemple se référer à l'article de Lindroos et al. (Nucleic Acids Research, 29, 13, e69, 2001) qui compare 8 méthodes différentes, dont un certain nombre de lames commercialisées.
Trois séquences sondes d'oligonucléotides et pour chacune de ces séquences sondes trois types d'oligonucléotides modifiés (fonctionnalisé NH2, fonctionnalisé SH, non fonctionnalisé) ont été déposés, chaque solution d'oligonucléotides pour différentes valeurs de pH (6,8 ; 7,7 ; et 8,3). Chaque échantillon est spotté deux fois. Ainsi, sur chaque lame, 3 x 3 x 3 x 2 = 54 spots d'oligonucléotides sont déposés. Cette matrice de spots a été déposée deux fois sur la lame. De plus entre chaque oligonucleotide un double dépôt de tampon est réalisé afin d'éliminer tout risque de contamination. b) Préparation des oligonucléotides
Les oligonucléotides sont resuspendus dans de l'eau pure (milliQ) à la concentration de 0,5 mM. La concentration des solutions d'oligonucléotides est ajustée à 5 μM pour les valeurs de pH 6,8 ; 7,7 ; et 8,3 en tampon phosphate 150 mM, dans un volume total de 12 μl. c) Préparation de la solution d'hybridation d'oligonucléotides
Les biopuces ainsi revêtues de sondes oligonucléotidiques sont hybridées avec une solution contenant les oligonucléotides cibles de séquences complémentaires des sondes oligonucléotidiques déposées. Trois oligonucléotides cibles de séquences complémentaires des sondes oligonucléotidiques ainsi spottées ont été mélangés :
GGCTGAAATACTCGAACATGAAGACAGTGATGGCAACCACCGTGAGGCAC (SEQ ID N° 4) ; CTTCCAGGTAACCACTTCCGTCAGCGTCGAAATGAAGCCAGATCTCAAAA (SEQ ID N° 5) ; et
CTGGTAAGAGCAATGGGGGAGAGACAGGCGTCGATTTTAAGATGGGCGTT (SEQ ID N° 6).
Ces oligonucléotides cibles portent un fluorochrome (Cy5) en 5'. Ces oligonucléotides cibles complémentaires sont d'abord resuspendus dans de l'eau pure à la concentration de 50 μM.
Puis le mélange suivant est préparé :
- 497 μl d'eau pure ; et
- 1 μl de chaque oligonucleotide cible complémentaire (soit au total 3 μl). On obtient un mélange des trois oligonucléotides cibles portant un fluorochrome
(Cy5) en 5' à la concentration de 0,1 μM pour chacun de ces oligonucléotides cibles. On prépare ensuite la solution d'hybridation :
- lμl de la solution d'oligonucléotides cibles complémentaires à 0,1 μM pour chacun ; - 15,8 μl d'eau pure ;
- 3,6 μl de 20 X SSC (pH 7) ; et
- 0,6 μl de SDS 10 %, soit une solution à la concentration de 5 nM par oligonucleotide cible complémentaire. d) Hybridation Les biopuces revêtues de sondes oligonucléotidiques sont hybridées avec la solution d'oligonucléotides cibles complémentaires décrite précédemment.
On dépose 12 μl de solution oligonucléotides cibles sur chaque biopuce. On recouvre d'une lamelle plastique et les biopuces sont placées dans une chambre d'hybridation (GeneMachines). La chambre est maintenue dans un bain marie à 60°C pendant une nuit. e) Rinçage Solution 1 :
- 50 ml 20X SSC ; - 5 ml SDS 10 % ; et
- qsp 500 ml d'eau milliQ. Solution 2 :
- 5 ml 20X SSC ; et
- qsp 500 ml d'eau milliQ. Solution 3 :
- 2,5 ml 20X SSC ; et - qsp 500 ml d'eau milliQ.
Après hybridation, les lames sont rincées comme ci-après. Les lames sont d'abord placées dans une solution 4X SSC afin de faire tomber les lamelles, puis :
- rinçage pendant 2 x 5 min dans la solution 1 ; - rinçage 1 min dans la solution 2 ; et
- rinçage 1 min dans la solution 3.
4. Résultats des expériences d'hybridation
4.1 Réglage du scanner
Le scanner utilisé possède deux réglages pour la lecture : - le réglage de l'intensité d'excitation (LASER) ; et
- le réglage de la puissance du photomultiplicateur (PMT, servant à la mesure d'intensité de fluorescence).
L'intensité de ces deux réglages s'exprime dans une unité arbitraire. Au maximum les deux valeurs sont à 100. Pour certaines lames ces valeurs maximales saturent le signal de fluorescence, il faut alors diminuer les intensités du LASER et/ou du PMT.
4.2 Lames pour sondes oligonucléotidiques fonctionnalisées avec un groupement aminé : Méthode 1
Pour un réglage LASER/PMT à 100/100, le signal obtenu est saturé pour tous les spots d'oligonucléotides sondes déposés (signal supérieur à 65 000). Ces réglages ont été ainsi diminués à 75/68. Les résultats des expériences sont donnés dans le tableau 1 ci-après.
TABLEAU 1
Figure imgf000026_0001
Légende du Tableau 1 : Expérience d'hybridation sur une biopuce préparée selon la méthode 1 : test de pH.
Des sondes olignucléotidiques fonctionnalisées NH2 (« oligo NH2 ») et non fonctionnalisées ont été déposées à différentes valeurs de pH. La puce a été hybridée avec un mélange d'oligonucléotides cibles complémentaires de ceux déposés, marqués en fluorescence. 2 matrices de 54 spots ont été déposées.
Les rapports des intensités de fluorescence obtenues pour les sondes oligonucléotidiques fonctionnalisées et non fonctionnalisées montrent la très bonne sélectivité du support pour les sondes oligonucléotidiques fonctionnalisées qui se greffent par liaison covalente.
Le rapport signal sur bruit est excellent (5 000), le bruit de fond étant très faible. Les spots sont de très bonne taille avec une très faible dispersion des diamètres (faible mouillabilité) surtout pour les sondes oligonucléotidiques fonctionnalisées avec des groupements aminés.
Enfin, la réaction de greffage est particulièrement efficace à pH basique (8,3). 4.3 Lames pour sondes oligonucléotidiques fonctionnalisées avec un groupement thiol : Méthode 2
Le scanner a été réglé sur 100/100. Les résultats de l'expérience sont présentés dans le tableau 2 ci-après.
TABLEAU 2
Figure imgf000027_0001
Légende du Tableau 2 : Expérience d'hybridation sur une puce préparée d'après la méthode 2 : test de pH
Des sondes oligonucléotidiques fonctionnalisées avec un groupement SH (« Oligo SH ») et non fonctionnalisées (« Oligo non fonctionnalisé ») ont été déposées en solution à différentes valeurs de pH. La puce a été hybridée avec un mélange des oligonucléotides cibles complémentaires des sondes déposées, marqués en fluorescence. Les sondes oligonucléotidiques fonctionnalisées avec un groupement SH se fixent mieux que les sondes oligonucléotidiques non fonctionnalisées mais la sélectivité du support est moins forte que pour les lames obtenues avec la méthode 1. Le pH influence assez peu le greffage.
Le rapport signal sur bruit est assez bon. 4.4 Lames obtenues auprès du fournisseur Surmodics pour sondes oligonucléotidiques fonctionnalisées avec un groupement aminé
Le réglage du scanner est 100/100.
Résultats : voir tableau 3 ci-après.
TABLEAU 3
Figure imgf000028_0001
Légende du Tableau 3 : Expérience d'hybridation sur une biopuce spottée sur une lame Surmodics : test de pH
Des sondes oligonucléotidiques fonctionnalisées avec un groupement aminé (« Oligo NH2 ») et non fonctionnalisées (« Oligo non fonctionnalisé ») ont été déposées en solution à différentes valeurs de pH. La biopuce a été hybridée avec un mélange d'oligonucléotides cibles complémentaires des sondes déposées, marqués en fluorescence.
L'intensité de la fluorescence est faible comparativement aux intensités mesurées sur les lames selon la présente invention, d'autant plus que les réglages du scanner sont très différents pour les deux expériences.
La sélectivité du support vis-à-vis des sondes oligonucléotidiques fonctionnalisées avec un groupement aminé apparaît bonne, les sondes oligonucléotidiques non fonctionnalisées se fixent peu.
Le greffage semble plus efficace en milieu basique (pH 8,3). Le rapport signal sur bruit apparaît acceptable mais bien moins important que pour les lames selon l'invention obtenues par la méthode 1 (7 fois moins). C'est l'intérêt d'avoir un bon signal de fluorescence qui permet de diminuer l'intensité du LASER d'excitation et de la détection et ainsi de diminuer le bruit de fond.
Enfin, les diamètres des spots sont assez larges (mouillabilité plus importante des lames « SURMODICS » que celle des lames selon la présente invention).
Une faible mouillabilité permet non seulement d'avoir une meilleure définition des spots mais également de réduire la distance moyenne entre deux spots, ce qui permet en particulier d'augmenter le nombre de spots de sondes déposés par cm .
Exemple 7. Expériences d'hybridation des lames avec une solution de sondes oligonucléotidiques : influence de la concentration des oligonucloétides
1. Principe des expériences
Dans cette expérience, les mêmes séquences que pour l'exemple 6 sont utilisées. Dans ces expériences, on fait varier la concentration de ces séquences lors du dépôt.
2. Matériel Le même matériel que celui indiqué dans l'exemple 6 est utilisé.
3. Expérience d'hybridation d'oligonucléotides sur les lames pour oligonucléotides aminés a) Préparation des lames
Les lames sont préparées selon la méthode 1 et comparées aux lames Surmodics. Trois séquences d'oligonucléotides (les mêmes que pour l'exemple 6) et pour chaque séquence deux types d'oligonucléotides modifiés (fonctionnalisé NH2 et non fonctionnalisé) sont déposés. Chaque oligonucleotide est déposé pour 5 valeurs de concentration (2 ; 5 ; 10 ; 20 ; et 40 μM). Chaque échantillon est spotté deux fois. Ainsi, sur chaque lame, 2 matrices de 2 x 3 x 5 x 2 = 45 spots d'oligonucléotides auront été déposées. De plus, entre chaque oligonucleotide un double dépôt de tampon est effectué afin d'éliminer tout risque de contamination. b) Préparation des oligonucléotides
Le pH des solutions à déposer est fixé à 8,2 à l'aide de tampon phosphate 150 mM. La concentration des oligonucléotides sondes est ajustée pour les 5 valeurs en complétant le mélange avec de l'eau milliQ. c) Préparation de la solution d'hybridation
Même solution et même protocole que pour l'exemple 6. d) Hybridation Même protocole que pour l'exemple 6.
4. Résultats des expériences
4.1 Lames pour sondes oligonucléotidiques fonctionnalisées avec un groupement aminé : Méthode 1
Le réglage du scanner est à 90/95. Les résultats des expériences sont donnés dans le tableau 4 ci-après.
TABLEAU 4
Figure imgf000031_0001
Légende du Tableau 4 : Expérience d'hybridation sur une biopuce préparée selon la méthode 1 : test de concentration.
Des sondes olignucléotidiques fonctionnalisées NH2 (« oligo NH2 ») et non fonctionnalisées ont été déposées à différentes concentrations. La puce a été hybridée avec un mélange d'oligonucléotides cibles complémentaires de ceux déposés, marqués 0 en fluorescence. 2 matrices de 45 spots ont été déposées.
Cette expérience montre que la concentration optimale pour le dépôt des oligos est comprise entre 5 et 10 μM. Une très bonne sélectivité des lames à ces concentrations est retrouvée car les oligos non fonctionnalisés se fixent moins (rapport 2 pour les intensités). 5 Le rapport signal sur bruit est très bon pour ces concentrations optimales (1000).
Les spots sont de taille régulière. 4.2 Lames obtenues auprès du fournisseur Surmodics pour sondes oligonucléotidiques fonctionnalisées avec un groupement aminé
Le réglage du scanner est à 90/95. Les résultats d'expérience sont donnés dans le tableau 5 ci-après.
TABLEAU 5
Figure imgf000032_0001
Légende du Tableau 5 : Expérience d'hybridation sur une biopuce spottée sur une lame 0 Surmodics : test de concentration.
Les intensités sont plus faibles que pour les lames de la méthode 1.
Le meilleur rapport signal sur bruit est obtenu pour la plus forte concentration et vaut 265. 5 Comparées avec les lames selon l'invention, les lames Surmodics présentent un signal de fluorescence 4 fois supérieur (31000 contre 7200) et un rapport signal sur bruit 5 fois supérieur pour une concentration en oligonucléotides 8 fois inférieure (5 μM).
Ainsi, les lames selon l'invention permettent d'utiliser moins d'oligonucléotides que les lames Surmodics pour une intensité de signal supérieure. La taille des spots les lames Surmodics est plus large que pour les lames selon l'invention avec une distribution assez étroite.
Les biopuces obtenues par les procédés de préparation selon l'invention, notamment selon la méthode 1, s'avèrent particulièrement performantes par rapport aux autres supports commerciaux, notamment par rapport aux supports de type « Surmodics » qui font référence en la matière.
Finalement, les expériences réalisées avec les lames obtenues par les procédés selon la présente invention, notamment selon la méthode 1, mettent en évidence :
- un greffage très efficace (le signal d'hybridation est très fort), - un bruit de fond très faible,
- des propriétés de mouillage excellentes (les spots sont homogènes et réguliers),
- l'utilisation de moins d'oligonucléotides sondes que pour les lames Surmodics.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation d'une biopuce activée pour la fixation covalente de sondes oligonucléotidiques, ladite biopuce comprenant un support solide préalablement fonctionnalisé avec une fonction thiol ou aminé, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de fixation covalente dans les conditions appropriées sur ledit support fonctionnalisé d'un composé espaceur NHS-PEG-VS de formule (I) :
Figure imgf000034_0001
dans laquelle PEG désigne le poly(éthylène glycol) de formule HO-(CH2CH2O)„CH2CH2-OH, où n est un nombre entier choisi de telle sorte que la masse moléculaire du composé NHS-PEG-VS de formule (I) est comprise entre 500 et 5000, de préférence entre 200 et 4000, de manière plus préférée voisine de 3400, ledit composé espaceur étant fixé sur ledit support solide par une liaison covalente résultant soit de l'interaction entre la fonction thiol dudit support fonctionnalisé et la fonction VS (vinylsulfone) du composé espaceur de formule (I), ou soit de l'interaction entre la fonction aminé dudit support fonctionnalisé et la fonction NHS (N-hydroxysuccinimide) du composé espaceur de formule (I).
2. Procédé de préparation d'une biopuce activée selon la revendication 1, caractérisé en ce que la masse moléculaire du composé NHS-PEG-VS de formule (I) est voisine de 3400.
3. Procédé de préparation d'une biopuce activée selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit support solide est choisi parmi les supports solides en verre, en plastique, en Nylon®, en Kevlar®, en silicone, en silicium ou en polyoses, de préférence en verre.
4. Procédé de préparation d'une biopuce selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit support solide en verre est fonctionnalisé par silanisation.
5. Procédé de préparation d'une biopuce activée selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ledit support solide est fonctionnalisé avec une fonction aminé lorsque lesdites sondes oligonucléotidiques destinées à être fixées sont fonctionnalisées avec une fonction thiol terminale.
6. Procédé de préparation d'une biopuce activée selon la revendication 5, caractérisé en ce que ledit support solide est fonctionnalisé en présence d'un aminosilane, de préférence le N-(2-aminoéthyl)-3-amino-propyltriméthoxysilane.
7. Procédé de préparation d'une biopuce activée selon la revendication 6, caractérisé en ce que ledit support solide est fonctionnalisé avec une fonction thiol lorsque lesdites sondes oligonucléotidiques sont fonctionnalisées avec une fonction aminé terminale.
8. Procédé de préparation d'une biopuce activée selon la revendication 7, caractérisé en ce que ledit support solide est fonctionnalisé en présence de mercaptosilane, de préférence le (3-mercaptopropyl)-triméthoxysilane.
9. Procédé de préparation d'une biopuce désactivée pour la fixation covalente de sondes oligonucléotidiques fonctionnalisées avec une fonction aminé terminale, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) P activation de la biopuce par un procédé de préparation d'une biopuce activée selon la revendication 7 ou 8 ; et b) l'hydrolyse en présence d'une solution aqueuse, de préférence d'eau pure, des fonctions NHS libres des composés espaceurs NHS-PEG-VS de formule (I) fixés sur le support solide.
10. Procédé de préparation d'une biopuce régénérée pour la fixation covalente de sondes oligonucléotidiques fonctionnalisées avec une fonction aminé terminale, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
A) la désactivation la biopuce par un procédé de préparation d'une biopuce désactivée selon la revendication 9 ;
B) la régénération de la biopuce obtenue à l'étape A) en présence de 1-éthyl- 3[3(diméthylamino)propyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) et de NHS des groupements carboxylates obtenus à l'extrémité libre desdits composés espaceurs après hydrolyse des fonctions NHS libres initialement présentes, et, le cas échéant, C) au moins une étape de lavage de la biopuce obtenue à l'étape B), de préférence en eau déionisée.
11. Procédé de préparation d'une biopuce activée, désactivée ou régénérée selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend une étape dans laquelle la biopuce obtenue est congelée, séchée ou lyophilisée.
12. Procédé de préparation d'une biopuce revêtue de sondes oligonucléotidiques, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : α) la préparation d'une biopuce activée par un procédé selon l'une des revendications 1 à 8 ou la préparation d'une biopuce régénérée par un procédé selon la revendication 10 ; β) le dépôt et la fixation par liaison covalente dans les conditions appropriées desdites sondes oligonucléotidiques préalablement fonctionnalisées avec une fonction thiol, si ledit support solide a été fonctionnalisé avec une fonction aminé, ou desdites sondes oligonucléotidiques préalablement fonctionnalisées avec une fonction aminé, si ledit support solide a été fonctionnalisé avec une fonction thiol; et, le cas échéant, γ) l'élimination des sondes oligonucléotidiques non fixées sur le support par au moins une étape de rinçage du support dans des conditions appropriées, de préférence en eau déionisée.
13. Procédé de préparation d'une biopuce comprenant un support solide préalablement fonctionnalisé avec une fonction thiol et revêtue de sondes oligonucléotidiques selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'étape suivante : δ) la désactivation en présence de composés aminés dans les conditions appropriées des fonctions NHS du composé espaceur n'ayant pas interagit avec les fonctions aminés des sondes oligonucléotidiques.
14. Procédé de préparation d'une biopuce selon la revendication 13, caractérisé en ce que ledit composé permettant la désactivation des fonctions NHS du composé espaceur à l'étape δ) est choisi parmi les composés aminés possédant une aminé primaire, de préférence l'éthanolamine ou le méthoxy-PEG-NH2.
15. Procédé de préparation d'une biopuce selon la revendication 12 comprenant un support solide préalablement fonctionnalisé avec une fonction aminé et revêtue de sondes oligonucléotidiques, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'étape suivante : δ) la réduction, dans les conditions appropriées, des charges de surface en présence de composés anioniques ou susceptibles d'établir des liaisons covalentes avec les groupements aminés et conduire à une espèce neutre ou négative dans les conditions appropriées, de préférence en présence de méthyl N-succinimidyl adipate (MSA).
16. Procédé de préparation d'une biopuce revêtue de sondes oligonucléotidiques selon l'une des revendications 12 à 15, caractérisé en ce qu'il comprend une étape dans laquelle la biopuce obtenue est conservée à l'abri de l'humidité, de la lumière et/ou en atmosphère inerte.
17. Procédé de préparation d'une biopuce activée, désactivée, régénérée ou revêtue de sondes selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que lesdites sondes nucléotidiques sont des ADNs ou ARNs.
18. Procédé de préparation d'une biopuce selon la revendication 17, caractérisé en ce que lesdites sondes oligonucléotidiques sont des ADNs ou ARNs monobrins.
19. Procédé de préparation d'une biopuce selon la revendication 17 ou 18, caractérisé en ce que lesdites sondes oligonucléotidiques sont des ADNs ou ARNs dont la taille est comprise entre 15 et 7 000 pb.
20. Procédé de préparation d'une biopuce selon l'une des revendications 12 à 19, caractérisé en ce que lesdites sondes oligonucléotidiques sont déposées sous la forme de spots dont le diamètre est compris entre 20 μm et 500 μm.
21. Procédé de préparation d'une biopuce selon la revendication 20, caractérisé en ce que le nombre desdits spots de sondes oligonucléotidiques est compris entre 2 et 105.
22. Biopuce comprenant un support solide préalablement fonctionnalisé avec une fonction thiol ou aminé, caractérisée en ce qu'elle comprend un composé espaceur
NHS-PEG-VS de formule (I) :
Figure imgf000038_0001
dans laquelle PEG désigne le poly(éthylène glycol) de formule
HO-(CH2CH2O)nCH2CH2-OH, où n est un nombre entier choisi de telle sorte que la masse moléculaire du composé NHS-PEG-VS de formule (I) est comprise entre 500 et 5000, de préférence comprise entre 200 et 4000, de manière plus préférée voisine de 3400, ledit composé espaceur étant fixé sur ledit support solide par une liaison covalente résultant soit de l'interaction entre la fonction thiol dudit support fonctionnalisé et la fonction vinylsulfone du composé espaceur de formule (I) ou soit de l'interaction entre la fonction aminé dudit support fonctionnalisé et la fonction NHS du composé espaceur de formule (I).
23. Biopuce selon la revendication 22, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins une sonde oligonucléotidique, préalablement fonctionnalisée avec une fonction thiol ou aminé, fixée sur ledit support solide par une liaison covalente résultant soit de l'interaction entre la fonction NHS libre dudit composé espaceur de formule (I) et une fonction aminé de ladite sonde oligonucléotidique, ou soit de l'interaction entre la fonction vinylsulfone libre du composé espaceur de formule (I) et une fonction thiol de ladite sonde oligonucléotidique.
24. Biopuce selon la revendication 23, caractérisée en ce que lesdites sondes oligonucléotidiques fixées sont des ADNs ou ARNs monobrins.
25. Biopuce selon la revendication 23 ou 24, caractérisée en ce que lesdites sondes oligonucléotidiques fixées sont des ADNs ou ARNs dont la taille est comprise entre 15 et 7 000 pb.
26. Biopuce selon l'une des revendications 22 à 25, caractérisée en ce que lesdites sondes oligonucléotidiques sont déposées sous la forme de spots dont le diamètre est compris entre 20 μm et 500 μm.
27. Biopuce selon l'une des revendications 22 à 26, caractérisée en ce que le nombre de spots de sondes oligonucléotidiques déposés sur la biopuce est compris entre 2 et l05.
28. Biopuce selon l'une des revendications 22 à 27, caractérisée en ce que ledit support solide est choisi parmi les supports solides en verre, en plastique, en
Nylon®, en Kevlar®, en silicone, ou en silicium, de préférence en verre silanisé.
29. Biopuce activée, désactivée, ou régénérées susceptible d'être obtenue par un procédé selon l'une des revendications 1 à 11.
30. Biopuce revêtue de sondes oligonucléotidiques ou de sondes peptidiques, susceptible d'être obtenue par un procédé selon l'une des revendications 12 à 21.
31. Utilisation d'un biopuce selon l'une des revendications 22 à 30 pour la détection d'acides nucléiques dans un échantillon.
32. Kit pour la détection, l'analyse qualitative ou quantitative d'acides nucléiques dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend une biopuce selon l'une des revendications 22 à 30.
33. Procédé pour la détection d'acides nucléiques dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) le dépôt de l'échantillon contenant les acides nucléiques dont on cherche à détecter la présence sur une biopuce revêtue de sondes oligonucléotidiques selon l'une des revendications 22 à 28 et 30, dans des conditions permettant l'hybridation spécifique de ces acides nucléiques cibles avec lesdites sondes oligonucléotidiques ; b) le cas échéant, le rinçage de la biopuce obtenue à l'étape a) dans les conditions appropriées afin d'éliminer les acides nucléiques de l'échantillon non capturés par hybridation ; et c) la détection des acides nucléiques capturés sur la biopuce par hybridation.
34. Procédé pour la détection d'acides nucléiques dans un échantillon selon la revendication 33, caractérisé en ce que les acides nucléiques dont on cherche à détecter la présence sont préalablement marqués à une de leur extrémité par un marqueur capable de générer directement ou indirectement un signal détectable, de préférence détectable par fluorescence.
35. Procédé pour la détection d'acides nucléiques selon la revendication 34, caractérisé en ce que les acides nucléiques dont on cherche à détecter la présence sont préalablement marqués pour au moins deux d'entre eux par un marqueur différent.
36. Procédé pour la détection d'acides nucléiques selon la revendication 34 ou 35, caractérisé en ce que lesdits marqueurs sont choisis parmi des dérivés de la cyanine, de préférence choisis parmi les dérivés sulfonatés de la cyanine, notamment les composés Cy5 ou Cy3, les nanocristaux ou les nanoparticules.
37. Utilisation d'une biopuce selon l'une des revendications 22 à 28 et 30 comme matrice d'affinité.
38. Utilisation d'une biopuce selon l'une des revendications 22 à 28 et 30 pour la purification d'acide nucléique.
39. Utilisation d'une biopuce selon l'une des revendications 22 à 30 pour le séquençage d'acide nucléique.
40. Utilisation d'une biopuce selon l'une des revendications 22 à 30 ou 39 pour la détection et/ou l'étude de polymorphisme génétique, notamment de SNP.
41. Utilisation d'une biopuce selon l'une des revendications 22 à 28 et 30 pour l'analyse qualitative ou quantitative de l'expression de gènes.
42. Méthode de criblage de composés ou cellules capables de se fixer spécifiquement sur un oligonucleotide donné, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) la mise en contact dudit composé à tester sur une biopuce selon l'une des revendications 22 à 28 et 30, dans les conditions permettant la fixation spécifique éventuelle dudit composé ou de ladite cellule à tester avec ledit oligonucleotide donné, ladite biopuce comprenant au moins un spot de sondes oligonucléotidiques contenant respectivement lesdits oligonucléotides donnés fixés sur son support solide et, le cas échéant, ledit composé ou ladite cellule étant marqué par un marqueur capable de générer directement ou indirectement un signal détectable ; b) l'élimination par au moins une étape de lavage dans les conditions appropriées des composés ou cellules à tester non fixés spécifiquement ledit oligonucleotide donné ; et c) la sélection du composé ou de ladite cellule spécifiquement fixé sur ledit oligonucleotide donné, le cas échéant, par la sélection du composé ou de ladite cellule dont le signal a été détecté au niveau du spot contenant ledit oligonucleotide donné.
43. Instrument ou dispositif de diagnostic comprenant une biopuce selon l'une des revendications 22 à 30.
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