FR2835829A1 - Nouveau procede de preparation de biopuces a adn ou a proteines et leurs applications - Google Patents

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Abstract

La présente invention est relative à un procédé de préparation d'une biopuce activée pour la fixation covalente de sondes oligonucléotidiques ou peptidiques sur un support solide par l'intermédiaire d'un composé espaceur de type NHS-PEG-VS, ainsi que les biopuces susceptibles d'être obtenues par un tel procédé. L'invention comprend également des méthodes de détection d'acides nucléiques ou de peptides dans un échantillon ou des méthodes de criblage de composés capables de se fixer spécifiquement sur des sondes oligonucléotidiques ou peptidiques dans lesquelles sont mises en oeuvre les biopuces selon l'invention. La présente invention a aussi pour objet des kits de détection, d'analyse quantitative ou qualitative d'acides nucléiques ou de peptides dans un échantillon, comprenant de telles biopuces ainsi que l'utilisation de ces dernières comme matrice d'affinité pour la purification d'acide nucléique ou de peptides, pour le séquençage d'acide nucléique, pour l'analyse qualitative ou quantitative de l'expression de gènes ou encore pour l'étude et la détection de polymorphisme génétique.

Description

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La présente invention est relative à un procédé de préparation d'une biopuce activée pour la fixation covalente de sondes oligonucléotidiques ou peptidiques sur un support solide par l'intermédiaire d'un composé espaceur de type NHS-PEG-VS, ainsi que les biopuces susceptibles d'être obtenues par un tel procédé. L'invention comprend également des méthodes de détection d'acides nucléiques ou de peptides dans un échantillon ou des méthodes de criblage de composés capables de se fixer spécifiquement sur des sondes oligonucléotidiques ou peptidiques dans lesquelles sont mises en oeuvre les biopuces selon l'invention. La présente invention a aussi pour objet des kits de détection, d'analyse quantitative ou qualitative d'acides nucléiques ou de peptides dans un échantillon, comprenant de telles biopuces ainsi que l'utilisation de ces dernières comme matrice d'affinité pour la purification d'acide nucléique ou de peptides, pour le séquençage d'acide nucléique, pour l'analyse qualitative ou quantitative de l'expression de gènes ou encore pour l'étude et la détection de polymorphisme génétique.
De nombreuses techniques ou dispositifs d'analyse d'échantillons biologiques ont été développés ces dernières années, en particulier pour l'analyse en parallèle de grandes quantités d'acides nucléiques ou de protéines, notamment suite à l'essor de la génomique ou de la protéomique.
Parmi ces techniques ou dispositifs, les supports permettant de réaliser l'analyse à haut débit d'acides nucléiques ou de protéines, tels que les biopuces, ou puces, à ADN ou à protéines (dénommés aussi micro-ou macroarrays , ou encore DNA ou protein chip ) ont fait l'objet de nombreuses études.
Ces biopuces peuvent être en particulier réalisées à partir d'un support, généralement solide, fonctionnalisé sur lequel ont été fixés par liaison covalente et localisés des acides nucléiques donnés (sondes nucléiques) ou des peptides donnés (sondes peptidiques) et sur lesquelles sondes nucléiques ou peptidiques vont se fixer spécifiquement respectivement par appariement (ou hybridation spécifique) ou par reconnaissance d'un site d'affinité les acides nucléiques ou les protéines que l'on cherche à détecter ou identifier dans l'échantillon biologique.
Parmi les documents décrivant les techniques relatives aux biopuces, à ADN ou à protéines, on peut citer en particulier :
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- l'article de revue de Wang J. (Nucleic Acids Research, 28,16, 3011-3016, 2000), qui présente un résumé faisant le point sur les principales techniques connues relatives aux puces à ADN, et le document Schubhart et al. (Nucleic Acids Research, 28,10, e47,2000) qui dresse une liste des problèmes auxquels sont confrontés les concepteurs de ces puces ; - le document brevet délivré sous le NI US 6,030, 782, qui décrit un greffage avec une surface mercaptosilanisée, d'acides nucléiques modifiés par un groupe sulhydryle ou disulfure, et l'article de Bamdad (Biophysical Journal, 75,1997-2003, 1998), qui décrit l'obtention de surfaces présentant des ADN par incorporation de molécules composites, les ADN-thiols, dans des monocouches auto-assemblées ( selfassembled monolayers ou SAMs ) ; - la demande internationale de brevet publiée sous le NI WO 00/43539 qui propose d'immobiliser des molécules, telles que des oligonucléotides, par le biais de polymères poly fonctionnels ( polymer brushes ) ce qui permet d'augmenter la densité de greffage. Ces polymères peuvent être obtenus à partir de méthacrylate d'hydroxyéthyle, d'acrylamide, ou de vinyl pyrrolidone ; - la demande internationale de brevet publiée sous le NI WO 00/36145 décrit de son côté une méthode de fabrication de puces à ADN, comprenant la polymérisation sur un substrat de type couche métallique, d'un copolymère de pyrrole et de pyrrole fonctionnalisé, la fixation d'un agent de réticulation sur le pyrrole fonctionnalisé, puis la fixation d'une sonde biologique (telle qu'un oligonucléotide). L'agent de réticulation peut être bifonctionnel, et par exemple présenter une fonction ester de la Nhydroxysuccinimide et une fonction maléimide ; - la demande internationale de brevet publiée sous le NI WO 98/20020 qui décrit également l'immobilisation à haute densité d'acides nucléiques sur des supports solides, cette fois-ci par mise en contact d'un acide nucléique contenant un groupement thiol avec un support présentant un groupe réagissant avec ce thiol, éventuellement par l'intermédiaire d'un agent de réticulation ; - l'article de Penchovsky et al. (Nucleic Acids Research, 28,22, e98,2000), qui décrit une méthode d'immobilisation d'oligonucléotides sur des billes de latex aminées, à l'aide d'un agent de réticulation qui réagit sous l'action de la lumière ; et
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- les demandes internationales de brevet publiées sous les ? WO 99/16907, WO 00/40593 et WO 00/44939 de la société Surmodics (qui produit des lames pour le dépôt d'oligonucléotides fonctionnalisés avec une amine). Ces demandes décrivent notamment la fixation d'acides nucléiques sur des surfaces telles le verre, par l'intermédiaire d'un squelette polymérique auquel sont fixés un ou plusieurs groupements photochimiquement actifs d'un côté du polymère (pour le greffage sur la surface) et thermochimiquement actifs de l'autre côté (pour le greffage avec l'acide nucléique fonctionnalisé).
En ce qui concerne l'utilisation d'un poly (éthylène glycol) (PEG) hétérobifonctionnel, notons la demande de brevet internationale publiée sous le ? WO 95/13312 de la société Shearwater Polymers qui mentionne l'utilisation thérapeutique d'un tel agent espaceur pour le greffage d'agents thérapeutiques sur des protéines.
Parmi les biopuces déjà réalisées ou en cours de réalisation, celles permettant à la fois de pouvoir être revêtues aussi bien de sondes nucléiques à séquences courtes (quelques dizaines de bases) simple brin, pouvant être synthétisées chimiquement, que de séquences beaucoup plus longues, double brin, comme celles issues de produits de PCR, allant de 200 à quelques milliers de paires de bases, font l'objet d'un grand intérêt.
En effet, pour les oligonucléotides de courte séquence, on ne peut pas utiliser par exemple les supports recouverts de polylysine, les acides nucléiques s'adsorbant à plat sur la polylysine et l'accès à la séquence lors de l'hybridation étant difficile voire impossible si le brin déposé est court. Il faut donc pouvoir greffer l'oligonucléotide court par une de ces extrémités afin de libérer l'accès à la séquence lors de l'hybridation ultérieure avec l'acide nucléique cible.
Il existe quelques supports commerciaux qui permettent ce greffage par liaison covalente. En général, les résultats obtenus avec ces biopuces ne sont pas totalement satisfaisants : - le bruit de fond est trop important ; - le signal d'hybridation est trop faible ; - il y a présence de bavures (traînées de fluorescence autour des spots après hybridation) ;
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- les propriétés de mouillage des surfaces ne sont pas satisfaisantes (les dépôts s'étalent jusqu'à se recouvrir d'un spot à l'autre, des hétérogénéités sous forme d'anneaux apparaissent) ce qui ne permet pas d'agir sur la densité de greffage ou d'obtenir lors du dépôt des spots de bonne taille (environ de diamètre moyen allant de 50 à 200 um) ; - l'absence d'un bras espaceur pour donner de la mobilité à la sonde greffée.
D'autre part, une même biopuce permettant en outre d'immobiliser à la fois, séparément ou simultanément, des sondes nucléiques et peptidiques serait également d'un grand intérêt.
Pour cela, il serait souhaitable de pouvoir également disposer d'une biopuce dont le support permet après fixation de ne pas affecter la structure tertiaire des protéines et de donner suffisamment de mobilité pour qu'une reconnaissance spécifique de type interaction clé-serrure entre protéines ou peptides puisse être efficace, ou qu'une hybridation spécifique entre acides nucléiques simple brin puisse se réaliser.
Enfin, il serait souhaitable de pouvoir également disposer d'une biopuce dont le protocole permettant de réaliser l'immobilisation des sondes oligonucléotides ou peptidiques sur un support, tel que du verre, en vue de la fabrication de ces biopuces soit un protocole simple (minimum d'étapes, si possible de chimie"légère"), rapide (ce point est d'autant plus important que les volumes utilisés sur chaque"spot"sont très faibles et s'évaporent rapidement, il est donc indispensable que le greffage covalent soit rapide et que les sondes en excès puissent être facilement éliminées de la surface (sans laisser de tramées)) et reproductible.
Il apparaît au regard des biopuces testées et décrites dans les documents déjà publiés qu'aucune de ces biopuces ne correspond à ces critères.
Ainsi, il reste de pouvoir disposer d'une biopuce présentant ces caractéristiques.
Ceci est justement l'objet de la présente invention.
Les inventeurs ont de manière surprenante mis en évidence que l'utilisation d'un composé espaceur hétérobifonctionnel NHS-PEG-VS de formule (1) ci-après, fixé par liaison covalente sur un support solide préalablement fonctionnalisé, permettait d'obtenir des biopuces répondant à cette attente.
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Ainsi, la présente invention a pour objet un procédé de préparation d'une biopuce activée pour la fixation covalente de sondes oligonucléotidiques ou peptidiques, ladite biopuce comprenant un support solide préalablement fonctionnalisé avec une fonction thiol ou amine, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de fixation covalente dans les conditions appropriées sur ledit support fonctionnalisé d'un composé espaceur NHS-PEG-VS de formule (1) :
Figure img00050001

dans laquelle PEG désigne le poly (éthylène glycol) de formule HO- (CH2CH20) nCH2CH2-OH, où n est un nombre entier choisi de telle sorte que la masse moléculaire du composé NHS-PEG-VS de formule (1) est comprise entre 500 et 5000, de préférence entre 2000 et 4000, de manière plus préférée voisine de 3400.
Par le terme biopuce activée , on entend désigner dans la présente description, un support solide tel que défini ci-après, sur lequel auront été fixés par liaison covalente les composés espaceurs de formule (1) capables d'interagir avec les sondes nucléiques ou peptidiques, mais non encore revêtu de cesdites sondes.
Par acide nucléique, sonde nucléique, séquence nucléique ou d'acide nucléique, polynucléotide, oligonucléotide, séquence de polynucléotide, séquence nucléotidique, termes qui seront employés indifféremment dans la présente description, on entend désigner un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment ou une région d'un acide nucléique, comportant ou non des nucléotides non naturels, et pouvant correspondre aussi bien à un ADN double brin, un ADN simple brin, un PNA (pour Peptid Nucleic Acid ) ou LNA (pour Locked Nucleic Acid ) que des produits de transcription desdits ADNs tels que l'ARN.
Par sonde oligonucléotidique ou sonde nucléique, on entendra désigner ici l'oligonucléotide fonctionnalisé qui sera déposé (ou spotté ) et fixé par liaison covalente audit composé espaceur sur le support solide fonctionnalisé, ceci par
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opposition à l'acide nucléique cible issu de l'échantillon biologique que l'on cherche à détecter ou à identifier.
Dans la présente description, les termes polypeptides, séquences polypeptidiques, ou peptidiques, peptides et protéines désignent de manière interchangeable un enchaînement précis d'acides aminés, modifiés ou non, permettant de définir un fragment ou une région d'un polypeptide comportant ou non des acides aminés non naturels.
Par sonde peptidique, on entendra désigner ici le peptide pouvant être, le cas échéant, fonctionnalisé qui sera déposé et fixé par liaison covalente audit composé espaceur sur le support solide fonctionnalisé, ceci par opposition au peptide cible issu de l'échantillon biologique que l'on cherche à détecter ou à identifier.
Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de préparation d'une biopuce activée selon l'invention est caractérisé en ce que ledit support solide est choisi parmi les supports solides en verre, en plastique, en Nylon, en Kevlar, en silicone, en silicium, ou encore en polyoses ou poly (hétéro-oses), tel que la cellulose, de préférence en verre.
Ce support pourra être de forme quelconque (lame plane, microbilles,...).
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, le procédé de préparation d'une biopuce activée selon l'invention est caractérisé en ce que ledit support solide en verre est fonctionnalisé par silanisation.
Dans un mode de réalisation également préféré, le procédé de préparation d'une biopuce activée selon l'invention est caractérisé en ce que ledit support solide est fonctionnalisé avec une fonction amine lorsque lesdites sondes oligonucléotidiques ou lesdites sondes peptidiques destinées à être fixées sont fonctionnalisées avec une fonction thiol terminale, ou, le cas échéant, lorsque lesdites sondes peptidiques destinées à être fixées possèdent une fonction thiol libre.
Lorsque ledit support solide, notamment en verre, est fonctionnalisé avec une fonction amine, on préfère réaliser cette fonctionnalisation en présence d'un aminosilane, de préférence le N- (2-aminoéthyl)-3-amino-propyltriméthoxysilane.
Dans un mode de réalisation également préféré, le procédé de préparation d'une biopuce activée selon l'invention est caractérisé en ce que ledit support solide est fonctionnalisé avec une fonction thiol lorsque lesdites sondes oligonucléotidiques ou
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lesdites sondes peptidiques destinées à être fixées sont fonctionnalisées avec une fonction amine terminale, ou, le cas échéant, lorsque lesdites sondes peptidiques destinées à être fixées possèdent une fonction amine libre, telle que celle que l'on peut trouver sur les résidus lysines.
Lorsque ledit support solide, notamment en verre, est fonctionnalisé avec une fonction thiol, on préfère réaliser cette fonctionnalisation en présence de mercaptosilane, de préférence le (3-mercaptopropyl)-triméthoxysilane.
La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'une biopuce désactivée pour la fixation covalente de sondes oligonucléotidiques ou sondes peptidiques fonctionnalisées avec une fonction amine terminale, ou, le cas échéant, de sondes peptidiques possédant une fonction amine libre, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) l'activation de la biopuce par un procédé de préparation d'une biopuce activée pour la fixation covalente de sondes oligonucléotidiques ou sondes peptidiques fonctionnalisées avec une fonction amine terminale, ou, le cas échéant, de sondes peptidiques possédant une fonction amine libre selon l'invention ; et b) l'hydrolyse en présence d'une solution aqueuse, de préférence d'eau pure, des fonctions NHS libres des composés espaceurs NHS-PEG-VS de formule (I) fixés sur le support solide.
La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'une biopuce régénérée pour la fixation covalente de sondes oligonucléotidiques ou sondes peptidiques fonctionnalisées avec une fonction amine terminale, ou, le cas échéant, de sondes peptidiques possédant une fonction amine libre, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : A) la désactivation la biopuce par le procédé ci-avant de préparation d'une biopuce désactivée selon l'invention ; B) la régénération en présence de l-éthyl-3 [3 (diméthylamino) propyl] carbodiimide hydrochloride (EDC) et de NHS des groupements carboxylates obtenus à l'extrémité libre desdits composés espaceurs après hydrolyse des fonctions NHS libres initialement présentes, et, le cas échéant,
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C) au moins une étape de lavage de la biopuce obtenue à l'étape B), de préférence en eau déionisée.
Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de préparation d'une biopuce activée, désactivée ou régénérée selon l'invention, est caractérisé en ce qu'il comprend une étape dans laquelle la biopuce obtenue est congelée, séchée ou lyophilisée, de préférence sous atmosphère inerte, telle que sous azote, et à l'abri de l'humidité.
Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet un procédé de préparation d'une biopuce revêtue de sondes oligonucléotidiques ou de sondes peptidiques, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) la préparation d'une biopuce activée ou régénérée par un procédé selon l'invention ; ss) le dépôt et la fixation par liaison covalente dans les conditions appropriées : - soit desdites sondes oligonucléotidiques préalablement fonctionnalisées avec une fonction thiol, ou desdites sondes peptidiques, le cas échéant préalablement fonctionnalisées avec une fonction thiol, si ledit support solide a été fonctionnalisé avec une fonction amine, ou - soit desdites sondes oligonucléotidiques préalablement fonctionnalisées avec une fonction amine ou desdites sondes peptidiques, le cas échéant préalablement fonctionnalisées avec une fonction amine, si ledit support solide a été fonctionnalisé avec une fonction thiol ; et, le cas échéant, y) l'élimination des sondes oligonucléotidiques non fixées sur le support par au moins une étape de rinçage du support dans des conditions appropriées, de préférence en eau déionisée.
La présente invention est en outre relative à un procédé de préparation d'une biopuce comprenant un support solide préalablement fonctionnalisé avec une fonction thiol, puis activé par dépôt de PEG de formule (1) et revêtue de sondes oligonucléotidiques ou de sondes peptidiques selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'étape suivante : 8) la désactivation en présence de composés aminés dans les conditions appropriées des fonctions NHS du composé espaceur n'ayant pas interagi avec les fonctions amines des sondes oligonucléotidiques ou des sondes peptidiques.
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Dans un mode de réalisation préféré, ledit composé permettant la désactivation des fonctions NHS du composé espaceur à l'étape 8) est choisi parmi les composés aminés possédant une amine primaire, de préférence l'éthanolamine ou le méthoxyPEG-NH2, notamment tel que disponible pour ce dernier auprès de la société Shearwater Polymers (USA).
La présente invention est en outre relative à un procédé de préparation d'une biopuce comprenant un support solide préalablement fonctionnalisé avec une fonction amine puis activé par dépôt de PEG de formule (1) et revêtue de sondes oligonucléotidiques ou de sondes peptidiques, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'étape suivante : 8) la réduction, dans les conditions appropriées, des charges de surface en présence de composés anioniques ou susceptibles d'établir des liaisons covalentes avec les groupements amines et conduire à une espèce neutre ou négative dans les conditions appropriées, de préférence en présence de méthyl N-succinimidyl adipate (MSA).
La présente invention est aussi relative à un procédé de préparation d'une biopuce revêtue de sondes oligonucléotidiques ou de sondes peptidiques selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend une étape dans laquelle la biopuce obtenue est conservée à l'abri de l'humidité, de la lumière et/ou en atmosphère inerte.
De manière particulièrement préférée, dans les procédés de préparation d'une biopuce activée, désactivée, régénérée ou revêtue de sondes selon l'invention, lesdites sondes sont des sondes oligonucléotidiques.
De préférence, lorsque lesdites sondes sont des sondes oligonucléotidiques, celles-ci sont des ADNs ou ARNs monobrins, de préférence des ADNs ou des ARNs, dont la taille est comprise entre 15 et 7 000 pb, de préférence entre 20 et 1 000 pb, entre 20 et 500 pb, entre 20 et 250 pb, entre 20 et 100 pb, entre 20 et 80 pb ou entre 35 et 80 pb.
Ces ADNs ou ARNs sondes peuvent être obtenus par synthèse chimique, ou à partir d'ADN génomique, d'ARN, ou d'ARNm, ou de leurs fragments, extrait de cellules, notamment pour les ADNc après réverse transcription de ces ARNs, ou encore sous forme de fragment PCR obtenus par RT-PCR à partir de ces ARNs, ou par PCR à
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partir de ces ADNs génomiques ( RT-PCR pour méthode dite de réverse transcription suivie d'une réaction de polymérisation en chaîne).
De préférence encore, les procédés de préparation d'une biopuce revêtue de sondes oligonucléotidiques ou de sondes peptidiques selon l'invention, sont caractérisés en ce que lesdites sondes oligonucléotidiques ou lesdites sondes peptidiques sont déposées sous la forme de spots dont le diamètre moyen est compris entre 20 um et 500 lit, de préférence entre 50 lem et 200 um, et, le cas échéant, en ce que la distance
Figure img00100001

moyenne entre le centre de chacun des spots de sondes oligonucléotidiques ou de sondes peptidiques est comprise entre 80 um et 400 um.
De préférence encore, les procédés de préparation d'une biopuce revêtue de sondes oligonucléotidiques ou de sondes peptidiques selon l'invention, sont caractérisés en ce que le nombre desdits spots de sondes oligonucléotidiques ou de sondes peptidiques est compris entre 2 et 105, de préférence entre 2 et 104, 2 et 103, 2 et 4 102, 2 et 102, de manière encore plus préférée entre 50 et 103 et entre 50 et 4 102 par cm2.
Sous un nouvel aspect, la présente invention a pour objet une biopuce comprenant un support solide préalablement fonctionnalisé avec une fonction thiol ou amine, caractérisée en ce qu'elle comprend un composé espaceur NHS-PEG-VS de formule (1) :
Figure img00100002

dans laquelle PEG désigne le poly (éthylène glycol) de formule HO- (CH2CH20) nCH2CH2-OH, où n est un nombre entier choisi de telle sorte que la masse moléculaire du composé NHS-PEG-VS de formule (1) est comprise entre 500 et 5000, de préférence comprise entre 200 et 4000 et voisin de 3400, ledit composé espaceur étant fixé sur ledit support solide par une liaison covalente résultant soit de l'interaction entre la fonction thiol dudit support fonctionnalisé et la fonction vinylsulfone du composé espaceur de formule (1) ou soit de l'interaction entre
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la fonction amine dudit support fonctionnalisé et la fonction NHS du composé espaceur de formule (1).
De préférence, la biopuce selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins une sonde oligonucléotidique préalablement fonctionnalisée ou une sonde peptidique, le cas échéant, préalablement fonctionnalisée avec une fonction thiol ou amine, fixée sur ledit support solide fonctionnalisé par une liaison covalente résultant soit de l'interaction entre la fonction NHS libre dudit composé espaceur de formule (1) et une fonction amine de ladite sonde oligonucléotidique ou de ladite sonde peptidique, ou soit de l'interaction entre la fonction vinylsulfone libre du composé espaceur de formule (1) et une fonction thiol de ladite sonde oligonucléotidique ou de ladite sonde peptidique.
De préférence également, la biopuce selon l'invention est caractérisée en ce que lorsque lesdites sondes fixées sont des sondes oligonucléotidiques, celles-ci sont des ADNs ou ARNs monobrins, de préférence des ADNs ou des ARNs, dont la taille est comprise entre 15 et 7 000 pb, de préférence entre 20 et 1 000 pb, entre 20 et 500 pb, entre 20 et 250 pb, entre 20 et 100 pb, entre 20 et 80 pb ou entre 35 et 80 pb.
De préférence également, la biopuce selon l'invention est caractérisée en ce que lesdites sondes oligonucléotidiques ou lesdites sondes peptidiques, sont déposées sous la forme de spots dont le diamètre est compris entre 20 um et 500 nm, de préférence entre 50 lam et 200 um et, le cas échéant, en ce que la distance moyenne entre le centre de chacun des spots de sondes oligonucléotidiques ou de sondes peptidiques est compris entre 80 um et 400 um.
De préférence également, la biopuce selon l'invention est caractérisée en ce que le nombre desdits spots de sondes oligonucléotidiques ou de sondes peptidiques est compris entre 2 et 105, de préférence entre 2 et 104, 2 et 103, 2 et 4 102, 2 et 102, de manière encore plus préférée entre 50 et 103 et entre 50 et 4 102 par cm2.
De préférence également, la biopuce selon l'invention est caractérisée en ce que ledit support solide est choisi parmi les supports solides en verre, en plastique, en Nylon&commat;, en Kevlare, en silicone, en silicium, en polyoses ou polyhétéro-oses, de préférence en verre, de préférence silanisé.
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La présente invention a aussi pour objet une biopuce activée, désactivée, régénérée, ou encore revêtue de sondes oligonucléotidiques ou de sondes peptidiques, susceptible d'être obtenue par un procédé selon l'invention.
Sous encore un autre aspect, la présente invention comprend l'utilisation d'une biopuce selon l'invention pour la détection d'acides nucléiques ou de peptides dans un échantillon.
Sous encore un autre aspect, la présente invention est relative à un kit ou nécessaire pour la détection, l'analyse qualitative ou quantitative d'acides nucléiques ou de peptides dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend une biopuce selon l'invention.
La présente invention a également pour objet un procédé pour la détection d'acides nucléiques ou de peptides dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) le dépôt de l'échantillon contenant les acides nucléiques ou les peptides cibles dont on cherche à détecter la présence sur une biopuce revêtue de sondes oligonucléotidiques ou de sondes peptidiques selon l'invention, dans des conditions permettant l'hybridation spécifique de ces acides nucléiques cibles avec lesdites sondes oligonucléotidiques ou la fixation spécifique par affinité entre les peptides cibles avec lesdites sondes peptidiques ; b) le cas échéant, le rinçage de la biopuce obtenue à l'étape a) dans les conditions appropriées afin d'éliminer les acides nucléiques de l'échantillon non capturés par hybridation ou d'éliminer les peptides de l'échantillon non capturés par affinité ; et c) la détection des acides nucléiques capturés sur la biopuce par hybridation ou la détection des peptides capturés sur la biopuce par affinité.
Par conditions permettant l'hybridation spécifique d'acides nucléiques cibles avec lesdites sondes oligonucléotidiques, il s'agit de préférence de conditions de forte stringence notamment telles que définies ci-après ou telles que citées, sans s'y limiter, dans les exemples ci-après.
Une hybridation dans des conditions de forte stringence signifie que les conditions de température et de force ionique sont choisies de telle manière qu'elles
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permettent le maintien de l'hybridation entre deux fragments d'ADN ou d'ARN/ADN complémentaires. A titre illustratif, des conditions de forte stringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les conditions d'hybridation décrits ci-dessus, sont avantageusement les suivantes.
L'hybridation ADN-ADN ou ADN-ARN est réalisée en deux étapes : (1) préhybridation à 42 C pendant 3 heures en tampon phosphate (20 mM, pH 7,5) contenant 5 x SSC (1 x SSC correspond à une solution 0,15 M NaCl + 0, 015 M citrate
Figure img00130001

de sodium), 50 % de formamide, 7 % de sodium dodécyl sulfate (SDS), 10 x Denhardt's, 5 % de dextran sulfate et 1 % d'ADN de sperme de saumon ; (2) hybridation proprement dite pendant 20 heures à une température dépendant de la taille de la sonde (i. e. : 42 C, pour une sonde de taille > 100 nucléotides) suivie de 2 lavages de 20 minutes à 20 C en 2 x SSC + 2 % SDS, 1 lavage de 20 minutes à 20 C en 0, 1 x SSC + 0, 1 % SDS. Le dernier lavage est pratiqué en 0, 1 x SSC + 0, 1 % SDS pendant 30 minutes à 60 C pour une sonde de taille > 100 nucléotides. Les conditions d'hybridation de forte stringence décrites ci-dessus pour un polynucléotide de taille définie, peuvent être adaptées par l'homme du métier pour des oligonucléotides de taille plus grande ou plus petite, selon l'enseignement de Sambrook et al. (1989, Molecular cloning : a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor).
Par conditions permettant la fixation spécifique par affinité entre les peptides cibles avec lesdites sondes peptidiques, il s'agit de préférence de conditions favorisant la reconnaissance du peptide cible par la sonde peptidique, notamment telles que bien connues par l'homme de l'art utilisant les biopuces à protéines, ou des conditions standards utilisées pour les réactions de type antigène/anticorps, lorsque lesdits antigène et/ou anticorps sont de nature peptidique. Ces conditions bien connues de l'homme de l'art ne seront pas développées ici.
L'invention comprend également un procédé pour la détection d'acides nucléiques dans un échantillon selon l'invention, caractérisé en ce que les acides nucléiques dont on cherche à détecter la présence sont préalablement marqués à une de leur extrémité par un marqueur capable de générer directement ou indirectement un signal détectable, de préférence détectable par fluorescence.
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L'invention comprend également un procédé pour la détection d'acides nucléiques selon la présente invention, caractérisé en ce que les acides nucléiques dont on cherche à détecter la présence sont préalablement marqués pour au moins deux d'entre eux par un marqueur différent.
De préférence, lesdits marqueurs sont choisis parmi des dérivés de la cyanine, de préférence choisis parmi les dérivés sulfonatés de la cyanine, notamment les composés Cy5 ou Cy3, les nanocristaux (Migyong Han et al, Nature Biotechnology, 19, 631-635, 2001) ou les nanoparticules (société Genicon Science).
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une biopuce selon l'invention comme matrice d'affinité ou pour la purification d'acide nucléique ou de peptides.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une biopuce selon l'invention pour le séquençage d'acide nucléique, pour l'analyse qualitative ou quantitative de l'expression de gènes ou encore pour l'étude et la détection de polymorphismes génétiques (aussi appelés SNP's pour Single Nucleotide Polymorphism ou SNIPS).
Par exemple, mais sans s'y limiter, on dépose sur les biopuces selon l'invention des sondes d'ADN correspondant à des gènes connus. Chaque dépôt ou spot pourra contenir plusieurs milliers de sondes oligonucléotidiques correspondant à un même gène et d'un spot à l'autre les sondes oligonucléotidiques correspondront à un autre gène, ou à un gène présentant un polymorphisme différent.
Les ADNs génomiques, ou ARN messagers, ou leurs fragments, du tissu ou de la cellule que l'on souhaite étudier pourront être extraits puis marqués avec des fluorochromes (les ADNs ou ARNm pourront notamment être transformés en ADN complémentaires (ADNc) par réverse transcription, et, le cas échéant, multiplier par les techniques de PCR ou RT-PCR).
Ces ADNs, ADNc, ou ARNs seront ensuite déposés sur la biopuce revêtue de sondes oligonucléotidiques et, le cas échéant, se lier par hybridation spécifique avec les sondes oligonucléotidiques préalablement déposées qui leur correspondent. On va ensuite détecter sur chaque spot, la quantité de signal, notamment de fluorescence,
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correspondant ainsi à la quantité d'acides nucléiques cibles hybridés, qui sera notamment proportionnelle à la quantité initiale d'ARNm extraits, si les ADNs cibles déposés sont des ADNc complémentaires d'ARNm transcrits. On pourra ainsi mesurer l'activité de transcription de la cellule pour certains gènes.
Les applications de ces biopuces à ADN sont par conséquent nombreuses, telles que les études de la transcription, le diagnostic (recherche de mutation), recherche de cibles thérapeutiques, cartographie génétique des individus.
De la même manière, on pourra effectuer des études de traduction de gènes à partir d'extraits protéiques issus de tissus ou de cellules donnés, en utilisant les biopuces à protéines selon l'invention, notamment en revêtant lesdites biopuces de peptides présentant des épitopes spécifiques de protéines dont on cherche à détecter ou quantifier l'expression. On pourra notamment se référer pour les applications générales de ces biopuces aux nombreux documents déjà publiés sur ce sujet, documents dans lesquels les méthodes mises en oeuvres pour ces applications à partir de biopuces activées, ou régénérées, comme celles de la présente invention sont parfaitement explicitées.
Sous encore un autre aspect, l'invention, est relative à une méthode de criblage de composés ou cellules capables de se fixer spécifiquement sur un oligonucléotide ou un peptide donné, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) la mise en contact dudit composé à tester sur une biopuce selon l'invention, dans les conditions permettant la fixation spécifique éventuelle dudit composé ou de ladite cellule à tester avec ledit oligonucléotide ou ledit peptide donné, ladite biopuce comprenant au moins un spot de sondes oligonucléotidiques ou peptidiques contenant respectivement lesdits oligonucléotides ou lesdits peptides donnés fixés sur son support solide et, le cas échéant, ledit composé ou ladite cellule étant marqué par un marqueur capable de générer directement ou indirectement un signal détectable ; b) l'élimination par au moins une étape de lavage dans les conditions appropriées des composés ou cellules à tester non fixés spécifiquement sur ledit oligonucléotide ou ledit peptide donné ; et c) la sélection du composé ou de ladite cellule spécifiquement fixé sur ledit oligonucléotide ou ledit peptide donné, le cas échéant, par la sélection du composé ou de
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ladite cellule dont le signal a été détecté au niveau du spot contenant ledit oligonucléotide ou ledit peptide donné.
Sous enfin un dernier aspect, la présente invention a pour objet un instrument ou dispositif de diagnostic ou de recherche comprenant une biopuce selon l'invention.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples et les figures dont les légendes sont représentées ciaprès.
LEGENDES DES FIGURES Figures 1A à 1D : Greffage d'oligonucléotides fonctionnalisés par un groupement aminé (NH2-tenninés)
Figure 1A : surface de verre (silanols Si-OH).
Figure 1B : surface de verre fonctionnalisée avec des mercapto-silanes (SHterminés).
Figure 1C : greffage de PEG hétérobifonctionnel (NHS-PEG-VS). Les extrémités NHS restent libres et réactives ;
Figure 1 D : fixation d'oligonucléotides fonctionnalisés par un groupement aminé (NH2-terminés).
Exemple 1. Support pour sondes oligonucléotidiques ou peptidiques fonctionnalisées par un groupement amine ou, le cas échéant, pour sondes peptidiques à groupements amines libres : Méthode 1 1. Principe
Utilisation d'un PEG hétérobifonctionnel portant les fonctions NHS et VS.
La surface est dans un premier temps silanisée (fonctionnalisation) de façon à obtenir des fonctions SH (thiol en surface). La fonction VS du PEG hétérobifonctionnel qui est ensuite déposé (activation) va réagir avec les thiols de la surface pour former une liaison covalente. Les oligonucléotides portant une fonction amine à l'une de leurs extrémités ou les peptides à groupements amines libres sont finalement déposés. Cette fonction amine va réagir avec la fonction NHS du PEG hétérobifonctionnel pour former une liaison covalente.
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2. Protocole expérimental a) Silanisation
Des lames de verre GOLD SEAL sont utilisées. Ces lames sont nettoyées à l'aide d'un mélange d'acide sulfurique-eau oxygénée (70/30, v/v) d'un volume de 300 ml pendant 15 minutes (mélange Piranha).
Les lames sont rincées à l'eau pure puis au méthanol.
Le bain de silanisation est composé de : - 60 ml de méthanol pur pour synthèse (SDS réf. : 0930221) ; - 510 ni d'acide acétique ; - 2, 55 ml d'eau pure ; et - 1, 275 ml de (3-Mercaptopropyl)-triméthoxysilane (SIGMA, EE No. 224-588- 5).
Les lames sont plongées 2 heures dans ce bain.
Les lames sont ensuite rincées au méthanol pur puis séchées à l'argon, enfin les lames sont placées 15 minutes dans une étuve à 94 C.
Les lames sont stockées sous vide dans un dessiccateur. b) Application du PEG hétérobifonctionnel
Préparation d'une solution de PEG hétérobifonctionnel dans du tampon PBS 1x (phosphate salin) à pH 7. Cette valeur de pH est optimale pour la réaction entre les thiols de la surface et la fonction VS du PEG.
Pour une lame : - 2 mg de NHS-PEG-VS, MW 3400 (Shearwater Polymers) ; et - 2 ml de PBS 1 x.
La solution est déposée sur la surface de la lame à traiter pendant 45 minutes.
Les lames sont ensuite rincées avec de l'eau désionisée et séchées à l'argon.
Exemple 2. Support pour sondes oligonucléotidiques ou peptidiques fonctionnalisées par un groupement thiol ou, le cas échéant, pour sondes peptidiques à groupements thiol libres : Méthode 2 1. Principe
C'est le même principe que pour la méthode 1 sauf qu'ici la surface des lames est silanisée avec des fonctions amines. Ainsi, la fonction NHS du PEG va réagir avec
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ces groupements de surface et le groupement VS restant pourra réagir avec des oligonucléotides possédant une fonction thiol terminale.
2. Protocole expérimental a) Silanisation
Les lames sont, comme pour le protocole expérimental de l'exemple 1, lavées avec le mélange Piranha.
La composition du bain de silanisation change : - 60 ml de méthanol pur pour synthèse (SDS réf. : 0930221) ; - 510 III d'acide acétique ; - 2, 55 ml d'eau pure ; - 1, 275 ml de Silane : N- [3- (Triméthoxysilyl) propyl] diéthylènetriamine, 97 % (ALDRICH 10,488-4).
La solution est déposée sur la surface de la lame à traiter pendant 45 minutes.
Les lames sont ensuite rincées avec de l'eau déionisée et séchées à l'argon.
Figure img00180001

b) Application du PEG hétérobifonctionnel
Composition de la solution (pour une lame) : - 2 mg de NHS-PEG-VS MW 3400 Shearwater Polymers ; - 2 ml de tampon Carbonate-Bicarbonate (CB), pH 8,4.
Le pH de 8,4 est optimal pour la réaction chimique entre la fonction NHS du PEG et les fonctions NH2 de la surface silanisée.
La solution est déposée sur la surface de la lame à traiter pendant 45 minutes.
Les lames sont ensuite rincées avec de l'eau déionisée et séchées à l'Argon.
Exemple 3. Support désactivé puis régénéré pour sondes oligonucléotidiques ou peptidiques fonctionnalisées par un groupement amine ou, le cas échéant, pour sondes peptidiques à groupements amines libres 1. Principe
La fonction NHS est sensible à l'humidité et se désactive en quelques jours. Pour remédier à cela, il a été mis au point une méthode qui consiste à désactiver la fonction sous une forme stable puis à la régénérer au moment du dépôt des sondes oligonucléotidiques ou peptidiques.
2. Protocole expérimental
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a) Désactivation
Les lames sont d'abord préparées comme pour la méthode 1. Puis on hydrolyse la fonction NHS en plongeant les lames dans un bain d'eau pure jusqu'au moment de la désactivation. La fonction NHS se transforme en carboxylate (COO). b) Régénération
Le protocole de Patel et al. (Langmuir, 13 : 06485-6490,1997) est appliqué ici.
Brièvement :
On prépare dans de l'eau pure une solution composée de : - 15 mM de NHS (Fluka) ; et - 5 mM d'EDC.
Les lames sont ensuite plongées dans la solution pendant 10 minutes.
On rince ensuite les lames à l'eau pure et on les sèche à l'argon.
Exemple 4. Passivation (ou capping ) des régions du support présentant des groupements NHS actifs du composé espaceur n'ayant pas interagi avec les sondes pour la méthode 1 1. Principe
Après le dépôt des oligonucléotides ou des sondes peptidiques ( spotting ), les régions autour de ces dépôts possèdent toujours des groupements actifs de type NHS ou VS suivant la méthode utilisée. Cela est en particulier gênant pour la méthode 1 telle que décrite dans l'exemple 1 pour laquelle le groupement actif NHS est réactif avec les groupements amines. Or, ces groupements amines se retrouvent dans certaines bases nucléotidiques ou dans la plupart des peptides. Ces groupements amines sont, notamment pour les bases, beaucoup moins réactifs que les groupements amines primaires qui servent de fonction d'accroche pour les oligonucléotides. Ainsi, lors du dépôt, les amines des bases n'entrent pas en compétition (ou très peu) avec les amines terminales des sondes oligonucléotidiques fonctionnalisées. Par contre, lors de l'hybridation, les acides nucléiques cibles, tels que les ADNc, que l'on dépose sur le support ne possèdent que les amines constitutives de leurs bases. Il risque donc d'y avoir une réaction entre les amines des bases des acides nucléiques cibles ou des peptides cibles et les NHS restant autour des dépôts des sondes oligonucléotidiques ou
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peptidiques ce qui a pour conséquence d'augmenter le bruit de fond. Il est donc préférable de désactiver ces sites NHS encore actifs.
2. Protocole de passivation des supports pour la méthode 1 telle que décrite dans l'exemple 1
2.1 Protocole 1 utilisant de l'éthanolamine comme agent de désactivation des groupements NHS n'ayant pas interagi avec les sondes.
Solution de capping : - 40 ml de tampon phosphate (HP04/H2P04) pH = 8,2 150mM ; - 1ml d'éthalnolamine ; - 2mldeSDS 10% ; et - on complète avec de l'eau milliQ jusqu'à 200 ml.
Solution de lavage : - 100 ml 20 X SSC ; - 5mlSDS10% ; et - on complète à 500 ml avec de l'eau milliQ.
Les lames sont placées pendant 15 min dans la solution de blocage à 50 C : - rinçage à l'eau milliQ pendant 4 min ; - lavage des lames avec la solution de lavage pendant 15 min ; - rinçage à l'eau milliQ 3 pendant 6min ; et - centrifugation à 800 tr/min (50 g) pendant 3 min.
2.2 Protocole 2 utilisant un PEG monofonctionnel comme agent de désactivation des groupements NHS n'ayant pas interagi avec les sondes.
Pour ce deuxième protocole un PEG monofonctionnel possédant un groupement amine à l'une de ses extrémités est utilisé. Ce groupement aminé réagit avec les NHS en formant une liaison covalente. La surface autour des spots sur lesquels ont été déposées les sondes est alors recouverte de PEG.
On prépare une solution contenant : - 2 ml de tampon phosphate (HP04/H2P04) 150 mM à pH 8,2 ; et - 2 mg de méthoxy-PEG-NH2 (Shearwater Polymers).
La lame est plongée dans cette solution pendant 45 minutes, puis elle est rincée à l'eau pure et séchée à l'argon.
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Exemple 5. Passivation des régions du support présentant des groupements VS actifs du composé espaceur n'ayant pas interagi avec les sondes pour la méthode 2
Comme il n'y a pas de fonction thiol dans les bases constitutives des acides nucléiques, tel que l'ADN, il n'est donc pas nécessaire de désactiver les sites VS libres pour le dépôt de sondes oligonucléotidiques. Seul un rinçage à l'eau pure est réalisé afin d'éliminer ici les oligonucléotides qui ne se sont pas greffés.
Pour les peptides cibles pouvant présenter des groupements thiols capables de réagir avec les sites VS libres pour le dépôt de sondes peptidiques, l'homme de l'art connaît les agents capables de désactiver les groupements VS n'ayant pas réagi avec les sondes peptidiques et leur protocole d'utilisation. De manière générale, tous les composés thiolés et par exemple le N-éthylmaléimide, les dérivés iodoacétate (sodium tétrathionate, réactif d'Ellman), les aziridines, les dérivés acryloyl.
Toutefois, afin d'isoler ou de réduire les charges de surfaces dans la méthode 2, il est préférable de déposer avant spotting des sondes, dans les conditions appropriées, des composés anioniques ou susceptibles d'établir des liaisons covalentes avec les groupements amines et conduire à une espèce neutre ou négative dans les conditions appropriées, tel que par exemple suivant le protocole ci-après en utilisant le méthyl Nsuccinimidyl adipate (MSA).
Protocole utilisant le MSA comme agent de neutralisation des charges de surfaces dans la méthode 2.
On dépose sur la surface une solution de MSA dans du PBS 1 x pH 7,4 (1 mg de MSA pour 1 ml de PBS). La surface est recouverte d'une lame de plastique. La solution de MSA est laissée en contact avec la surface pendant 1 heure. Ensuite rinçage à l'eau pure et séchage à l'azote.
Exemple 6. Expériences d'hybridation des lames avec une solution de sondes oligonucléotidiques : influence du pH sur le greffage des oligonucléotides 1. Principe des expériences
Des sondes oligonucléotidiques de 50 bases correspondant à des fragments de gènes de souris ont été déposées sur des lames de verre fonctionnalisées sur lesquelles le
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composé espaceur NHS-PEG-VS a été préalablement fixé. Trois séquences nucléiques ont été utilisées : GTGCCTCÀCGGTGGTTGCCATCACTGTCTTCATGTTCGAGTATTTCAGCC (SEQ ID NO 1) ; TTTTGAGATCTGGCTTCATTTCGACGCTGACGGAAGTGGTTACCTGGAAG (SEQ ID NO 2) ; et AACGCCCATCTTAAAATCGACGCCTGTCTCTCCCCCATTGCTCTTACCAG (SEQ ID NO 3).
Pour chaque séquence sonde, trois types d'oligonucléotides ont été déposés : - fonctionnalisé NH2 en 3' ; - fonctionnalisé SH en 3' ; et - non fonctionnalisé.
Les lames ainsi obtenues ont été comparées aux lames de différentes sociétés.
2. Matériel
Les oligonucléotides sont déposés à l'aide d'un spotteur de la société GeneMachines (OmniGrid). Ce spotteur est un spotteur à pointe (Majerprecisions) qui permet de faire des dépôts de quelques nl. Entre chaque dépôt la pointe est lavée afin d'éviter les contaminations d'un dépôt à l'autre.
Les lames sont ensuite lues après hybridation à l'aide d'un scanner (ScanArray 3000 GSI) et les images sont analysées à l'aide du logiciel Imagene 4.1 (Biodiscovery).
3 Expériences d'hybridation d'oligonucléotides sur les lames pour oligonucléotides aminés a) Préparation des lames
Les lames selon la présente invention sont préparées selon la méthode 1 et la méthode 2. Les résultats obtenus avec ces lames ont été comparés à ceux obtenus dans les mêmes conditions d'utilisation avec des lames commercialisées par la Société SurModics (SurModics, Inc., Eden Prairie, MN) sous la référence 3D-LINK7 activated slides (Lot DN01B058 paquet NO 19), lames activées capables de fixer des sondes nucléotidiques fonctionnalisées NH2 ou peptidiques possédant une fonction amine libre ( amine-binding slides ). Les lames de la Société SurModics sont connues comme étant les plus performantes des lames commerciales actuellement disponibles.
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Pour la comparaison de méthodes chimiques permettant d'immobiliser de manière covalente des oligonucléotides sur des lames de verre, on pourra par exemple se référer à l'article de Lindroos et al. (Nucleic Acids Research, 29,13, e69,2001) qui compare 8 méthodes différentes, dont un certain nombre de lames commercialisées.
Trois séquences sondes d'oligonucléotides et pour chacune de ces séquences sondes trois types d'oligonucléotides modifiés (fonctionnalisé NH2, fonctionnalisé SH, non fonctionnalisé) ont été déposés, chaque solution d'oligonucléotides pour différentes valeurs de pH (6,8 ; 7,7 ; et 8,3). Chaque échantillon est spotté deux fois. Ainsi, sur chaque lame, 3 x 3 x 3 x 2 = 54 spots d'oligonucléotides sont déposés.
Cette matrice de spots a été déposée deux fois sur la lame.
De plus entre chaque oligonucléotide un double dépôt de tampon est réalisé afin d'éliminer tout risque de contamination. b) Préparation des oligonucléotides
Les oligonucléotides sont resuspendus dans de l'eau pure (milli) à la concentration de 0,5 mM.
La concentration des solutions d'oligonucléotides est ajustée à 5 uM pour les
Figure img00230001

valeurs de pH 6, 8 ; 7, 7 ; et 8, 3 en tampon phosphate 150 mM, dans un volume total de 12 nul. c) Préparation de la solution d'hybridation d'oligonucléotides
Les biopuces ainsi revêtues de sondes oligonucléotidiques sont hybridées avec une solution contenant les oligonucléotides cibles de séquences complémentaires des sondes oligonucléotidiques déposées.
Trois oligonucléotides cibles de séquences complémentaires sondes oligonucléotidiques ainsi spottées ont été mélangés : GGCTGAAATACTCGAACATGAAGACAGTGATGGCAACCACCGTGAGGCAC (SEQ ID NO 4) ; CTTCCAGGTAACCACTTCCGTCAGCGTCGAAATGAAGCCAGATCTCAAAA (SEQ ID NO 5) ; et
Figure img00230002

CTGGTAAGAGCAATGGGGGAGAGACAGGCGTCGATTTTAAGATGGGCGTT (SEQ ID NO 6).
Ces oligonucléotides cibles portent un fluochrome (Cy5) en 5'.
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Ces oligonucléotides cibles complémentaires sont d'abord resuspendus dans de l'eau pure à la concentration de 50 uM.
Puis le mélange suivant est préparé : - 497 u. l d'eau pure ; et - 1 gel de chaque oligonucléotide cible compléméntaire (soit au total 3 ul).
On obtient un mélange des trois oligonucléotides cibles portant un fluochrome (Cy5) en 5'à la concentration de 0,1 uM pour chacun de ces oligonucléotides cibles.
On prépare ensuite la solution d'hybridation : - lui de la solution d'oligonucléotides cibles complémentaires à 0,1 uM pour chacun ; - 15, 8 ul d'eau pure ; - 3, 6 ul de 20 X SSC (pH 7) ; et - 0, 6 ul de SDS 10 %, soit une solution à la concentration de 5 nM par oligonucléotide cible compléméntaire. d) Hybridation
Les biopuces revêtues de sondes oligonucléotidiques sont hybridées avec la solution d'oligonucléotides cibles complémentaires décrite précédemment.
On dépose 12 III sur chaque biopuce placée dans une chambre d'hybridation (GeneMachines).
La chambre est maintenue dans un bain marie à 60 C pendant une nuit. e) Rinçage
Solution 1 : - 50 ml 20X SSC ; - 5 ml SDS 10 % ; et - qsp 500 ml d'eau milliQ.
Solution 2 : - 5 ml 20X SSC ; et - qsp 500 ml d'eau milliQ.
Solution 3 : - 2, 5 ml 20X SSC ; et - qsp 500 ml d'eau milliQ.
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Après hybridation, les lames sont rincées comme ci-après.
Les lames sont d'abord placées dans une solution 4X SSC afin de faire tomber les lamelles, puis : - rinçage dans la solution 1 2 x 5 min ; - rinçage 1 min dans la solution 2 ; et - rinçage 1 min dans la solution 3.
4. Résultats des expériences d'hybridation
4.1 Réglage du scanner
Le scanner utilisé possède deux réglages pour la lecture : - le réglage de l'intensité d'excitation (LASER) ; et - le réglage de la puissance du photomultiplicateur (PMT, servant à la mesure d'intensité de fluorescence).
L'intensité de ces deux réglages s'exprime dans une unité arbitraire. Au maximum les deux valeurs sont à 100.
Pour certaines lames ces valeurs maximales saturent le signal de fluorescence, il faut alors diminuer les intensités du LASER et/ou du PMT.
4.2 Lames pour sondes oligonucléotidiques fonctionnalisées avec un groupement aminé : Méthode 1
Pour un réglage LASER/PMT à 100/100, le signal obtenu est saturé pour tous les spots d'oligonucléotides sondes déposés (signal supérieur à 65 000). Ces réglages ont été ainsi diminués à 75/68.
Les résultats des expériences sont donnés dans le tableau 1 ci-après.
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Figure img00260001

TABLEAU 1
Figure img00260002
<tb>
<tb> Intensité <SEP> Bruit <SEP> de <SEP> Rapport <SEP> Diamètre <SEP> Ecart <SEP> type <SEP> des
<tb> Rapport
<tb> moyenne <SEP> de <SEP> fond <SEP> autour <SEP> moyen <SEP> ( m) <SEP> diamètres
<tb> signal/bruit
<tb> fluorescence <SEP> du <SEP> spot <SEP> n=6 <SEP> n=6
<tb> oligoNH2 <SEP> 18900+/-6550 <SEP> 6, <SEP> 4+/-0, <SEP> 5 <SEP> 3000+/-1000 <SEP> 96 <SEP> 10
<tb> pH=6, <SEP> 8
<tb> oligo <SEP> 22400+/-5700 <SEP> 7+/-0, <SEP> 45 <SEP> 3200+/-800 <SEP> 105 <SEP> 4
<tb> pH=7, <SEP> 7
<tb> oligo <SEP> 34500+/-1600 <SEP> 6, <SEP> 7+/-0, <SEP> 6 <SEP> 5200+/-450 <SEP> 103 <SEP> 3
<tb> pH=8, <SEP> 3
<tb> oligo <SEP> non
<tb> fonctionnalisé <SEP> 4300+/-1500 <SEP> 5, <SEP> 6+/-0, <SEP> 2 <SEP> 800+/-250 <SEP> 93 <SEP> 7
<tb> pH=6,8
<tb> oligo <SEP> non
<tb> fonctionnalisé <SEP> 6500+/-1900 <SEP> 6, <SEP> 0+/-0, <SEP> 4 <SEP> 1000 <SEP> +/- <SEP> 1100 <SEP> 93 <SEP> 7,5
<tb> pH=7, <SEP> 7
<tb> oligo <SEP> non
<tb> fonctionnalisé <SEP> 8000 <SEP> +/- <SEP> 2600 <SEP> 6, <SEP> 0+/-0, <SEP> 2 <SEP> 1300+/-400 <SEP> 101 <SEP> 8,5
<tb> pH=8,3
<tb>
Légende du Tableau 1 : Expérience d'hybridation sur une biopuce préparée selon la méthode 1 : test de pH.
Des sondes olignuc1éotidiques fonctionnalisées NH2 ( oligo NH2 ) et non fonctionnalisées ont été déposées à différentes valeurs de pH. La puce a été hybridée avec un mélange d'oligonucléotides cibles complémentaires de ceux déposés, marqués en fluorescence. 2 matrices de 54 spots ont été déposées.
Les rapports des intensités de fluorescence obtenues pour les sondes oligonucléotidiques fonctionnalisées et non fonctionnalisées montrent la très bonne sélectivité du support pour les sondes oligonucléotidiques fonctionnalisées qui se greffent par liaison covalente.
Le rapport signal sur bruit est excellent (5 000), le bruit de fond étant très faible.
Les spots sont de très bonne taille avec une très faible dispersion des diamètres (faible mouillabilité) surtout pour les sondes oligonucléotidiques fonctionnalisées avec des groupements aminés.
Enfin, la réaction de greffage est particulièrement efficace à pH basique (8,3).
<Desc/Clms Page number 27>
4.3 Lames pour sondes oligonucléotidiques fonctionnalisées avec un groupement thiol : Méthode 2
Le scanner a été réglé sur 100/100. Les résultats de l'expérience sont présentés dans le tableau 2 ci-après.
TABLEAU 2
Figure img00270001
<tb>
<tb> Intensité <SEP> Bruit <SEP> de <SEP> Rapport <SEP> Diamètre <SEP> Ecart <SEP> type <SEP> des
<tb> Rapport
<tb> moyenne <SEP> de <SEP> fond <SEP> autour <SEP> moyen <SEP> ( m) <SEP> diamètres
<tb> signal/bruit
<tb> fluorescence <SEP> du <SEP> spot <SEP> n=6 <SEP> n=6
<tb> oligo <SEP> SH <SEP> 60600 <SEP> 500 <SEP> 120 <SEP> 155 <SEP> 5, <SEP> 5
<tb> pH=6, <SEP> 8
<tb> oligo <SEP> SH <SEP> 62700 <SEP> 525 <SEP> 120 <SEP> 157 <SEP> 8
<tb> pH=7, <SEP> 7
<tb> oligo <SEP> SH <SEP> 61300 <SEP> 463 <SEP> 130 <SEP> 157 <SEP> 10
<tb> pH=8,3
<tb> oligo <SEP> non
<tb> fonctionnalisé <SEP> 36500 <SEP> 390 <SEP> 94 <SEP> 160 <SEP> 11
<tb> pH=6, <SEP> 8
<tb> oligo <SEP> non
<tb> fonctionnalisé <SEP> 44000 <SEP> 470 <SEP> 94 <SEP> 156 <SEP> 10
<tb> pH=7,7
<tb> oligo <SEP> non
<tb> fonctionnalisé <SEP> 50500 <SEP> 425 <SEP> 120 <SEP> 160 <SEP> 10
<tb> pH=8,3
<tb>
Légende du Tableau 2 : Expérience d'hybridation sur une puce préparée d'après la méthode 2 : test de pH
Des sondes oligonucléotidiques fonctionnalisées avec un groupement SH ( Oligo SH ) et non fonctionnalisées ( Oligo non fonctionnalisé ) ont été déposées en solution à différentes valeurs de pH. La puce a été hybridée avec un mélange des oligonucléotides cibles complémentaires des sondes déposées, marqués en fluorescence.
Les sondes oligonucléotidiques fonctionnalisées avec un groupement SH se fixent mieux que les sondes oligonucléotidiques non fonctionnalisées mais la sélectivité du support est moins forte que pour les lames obtenues avec la méthode 1. Le pH influence assez peu le greffage.
<Desc/Clms Page number 28>
Le rapport signal sur bruit est assez bon.
4.4 Lames obtenues auprès du fournisseur Surmodics pour sondes oligonucléotidiques fonctionnalisées avec un groupement aminé
Le réglage du scanner est 100/100.
Résultats : voir tableau 3 ci-après.
TABLEAU 3
Figure img00280001
<tb>
<tb> Intensité <SEP> Bruit <SEP> de
<tb> Intensité <SEP> Bruit <SEP> de <SEP> Rapport <SEP> Diamètre <SEP> Ecart <SEP> type
<tb> moyenne <SEP> de <SEP> fond <SEP> autour
<tb> signal/bruit <SEP> moyen <SEP> (um) <SEP> des <SEP> diamètres
<tb> fluorescence <SEP> du <SEP> spot
<tb> oligo <SEP> NH2 <SEP> 19000 <SEP> +/- <SEP> 13500 <SEP> 60 <SEP> +/- <SEP> 10 <SEP> 310 <SEP> +/- <SEP> 175 <SEP> 133 <SEP> 10
<tb> pH=6,8
<tb> oligo <SEP> 44000 <SEP> +/- <SEP> 10500 <SEP> 65 <SEP> +/- <SEP> 10 <SEP> 700 <SEP> +/- <SEP> 200 <SEP> 127 <SEP> 10
<tb> pH=7, <SEP> 7
<tb> oligo <SEP> 5000 <SEP> +/- <SEP> 11600 <SEP> 70 <SEP> +/- <SEP> 10 <SEP> 700 <SEP> +/- <SEP> 150 <SEP> 125 <SEP> 8,5
<tb> pH=8, <SEP> 3
<tb> oligo <SEP> non
<tb> fonctionnalisé <SEP> 6400 <SEP> +/- <SEP> 7200 <SEP> 80 <SEP> +/- <SEP> 40 <SEP> 80 <SEP> +/- <SEP> 160 <SEP> 182 <SEP> 79
<tb> pH=6,8
<tb> oligo <SEP> non
<tb> fonctionnalisé <SEP> 7500 <SEP> +/- <SEP> 9000 <SEP> 80 <SEP> +/- <SEP> 50 <SEP> 75 <SEP> +/- <SEP> 70 <SEP> 160 <SEP> 40
<tb> pH=7,7
<tb> oligo <SEP> non
<tb> fonctionnalisé <SEP> 7300+/-9300 <SEP> 50+/-15 <SEP> 30+/-130 <SEP> 215 <SEP> 74
<tb> pH=8, <SEP> 3
<tb>
Légende du Tableau 3 : Expérience d'hybridation sur une biopuce spottée sur une lame Surmodics : test de pH
Des sondes oligonucléotidiques fonctionnalisées avec un groupement aminé
Figure img00280002

( Oligo NH2 ) et non fonctionnalisées ( Oligo non fonctionnalisé ) ont été déposées en solution à différentes valeurs de pH. La biopuce a été hybridée avec un mélange d'oligonucléotides cibles complémentaires des sondes déposées, marqués en fluorescence.
L'intensité de la fluorescence est faible comparativement aux intensités mesurées sur les lames selon la présente invention, d'autant plus que les réglages du scanner sont très différents pour les deux expériences.
<Desc/Clms Page number 29>
La sélectivité du support vis-à-vis des sondes oligonucléotidiques fonctionnalisées avec un groupement aminé apparaît bonne, les sondes oligonucléotidiques non fonctionnalisées se déposent peu.
Le greffage semble plus efficace en milieu basique (pH 8,3).
Le rapport signal sur bruit apparaît acceptable mais bien moins important que pour les lames selon l'invention obtenues par la méthode 1 (7 fois moins). C'est l'intérêt d'avoir un bon signal de fluorescence qui permet de diminuer l'intensité du LASER d'excitation et de la détection et ainsi de diminuer le bruit de fond.
Enfin, les diamètres des spots sont assez larges (mouillabilité plus importante des lames SURMODICS que celle des lames selon la présente invention).
Une faible mouillabilité permet non seulement d'avoir une meilleure définition des spots mais également de réduire la distance moyenne entre deux spots, ce qui permet
Figure img00290001

2 en particulier d'augmenter le nombre de spots de sondes déposés par cm2.
Exemple 7. Expériences d'hybridation des lames avec une solution de sondes oligonucléotidiques : influence de la concentration des oligonucloétides 1. Principe des expériences
Dans cette expérience, les mêmes séquences que pour l'exemple 6 sont utilisées.
Dans ces expériences, on fait varier la concentration de ces séquences lors du dépôt.
2. Matériel
Le même matériel que celui indiqué dans l'exemple 6 est utilisé.
3. Expérience d'hybridation d'oligonucléotides sur les lames pour oligonucléotides aminés a) Préparation des lames
Les lames sont préparées selon la méthode 1 et comparées aux lames Surmodics.
Trois séquences d'oligonucléotides (les mêmes que pour l'exemple 6) et pour chaque séquence deux types d'oligonucléotides modifiés (fonctionnalisé NH2 et non fonctionnalisé) sont déposés. Chaque oligonucléotide est déposé pour 5 valeurs de concentration (2 ; 5 ; 10 ; 20 ; et 40 aM). Chaque échantillon est spotté deux fois. Ainsi, sur chaque lame, 2 matrices de 2 x 3 x 5 x 2 = 45 spots d'oligonucléotides auront été déposées.
<Desc/Clms Page number 30>
De plus, entre chaque oligonucléotide un double dépôt de tampon est effectué afin d'éliminer tout risque de contamination. b) Préparation des oligonucléotides
Le pH des solutions à déposer est fixé à 8,2 à l'aide de tampon phosphate 150mM.
La concentration des oligonucléotides sondes est ajustée pour les 5 valeurs en complétant le mélange avec de l'eau milliQ. c) Préparation de la solution d'hybridation
Même solution et même protocole que pour l'exemple 6. d) Hybridation
Même protocole que pour l'exemple 6.
4. Résultats des expériences
4.1 Lames pour sondes oligonucléotidiques fonctionnalisées avec un groupement aminé : Méthode 1
Le réglage du scanner est à 90/95.
Les résultats des expériences sont donnés dans le tableau 4 ci-après.
TABLEAU 4
Figure img00300001
<tb>
<tb> Intensité <SEP> Bruit <SEP> de <SEP> fond <SEP> Rapport <SEP> Diamètre <SEP> Ecart <SEP> type
<tb> autour <SEP> des <SEP> spots <SEP> signal/bruit <SEP> moyen <SEP> ( m) <SEP> des <SEP> diamètres
<tb> fluorescence
<tb> oligo <SEP> NH2 <SEP> à
<tb> 18000 <SEP> +/- <SEP> 1700 <SEP> 26 <SEP> +/- <SEP> 5 <SEP> 700 <SEP> +/- <SEP> 200 <SEP> 126 <SEP> 13
<tb> 40 <SEP> uM
<tb> oligo <SEP> 24000+/-5000 <SEP> 25+/-6 <SEP> 1000+/-350 <SEP> 116 <SEP> 5
<tb> 20 <SEP> uM
<tb> oligo <SEP> NH2 <SEP> à <SEP> 30000 <SEP> +/- <SEP> 1500 <SEP> 36 <SEP> +/- <SEP> 14 <SEP> 900 <SEP> +/- <SEP> 250 <SEP> 112 <SEP> 4
<tb> 10 <SEP> ils
<tb> oligo <SEP> 31000 <SEP> +/- <SEP> 3000 <SEP> 24 <SEP> +/- <SEP> 3 <SEP> 1250 <SEP> +/- <SEP> 200 <SEP> 112 <SEP> 4
<tb> 5 <SEP> u. <SEP> M
<tb> oligo <SEP> 12000 <SEP> +/- <SEP> 3500 <SEP> 25 <SEP> +/- <SEP> 4 <SEP> 500 <SEP> +/- <SEP> 200 <SEP> 111 <SEP> 5
<tb> 2 <SEP> M
<tb> oligo <SEP> à <SEP> 40 <SEP> M <SEP> 7500 <SEP> +/- <SEP> 2000 <SEP> 27 <SEP> +/- <SEP> 3 <SEP> 300 <SEP> +/- <SEP> 90 <SEP> 123 <SEP> 4
<tb> oligo <SEP> à <SEP> 20 <SEP> uM <SEP> 10000 <SEP> +/-3000 <SEP> 26 <SEP> +/-3 <SEP> 400 <SEP> +/-90 <SEP> 119 <SEP> 5
<tb> oligo <SEP> 14000 <SEP> +/- <SEP> 4000 <SEP> 24 <SEP> +/- <SEP> 5 <SEP> 600 <SEP> +/- <SEP> 300 <SEP> 115 <SEP> 5
<tb> oligo <SEP> 13500 <SEP> +/- <SEP> 5000 <SEP> 30 <SEP> +/- <SEP> 4 <SEP> 450 <SEP> +/- <SEP> 200 <SEP> 110 <SEP> 0
<tb> oligo <SEP> à <SEP> 000 <SEP> +/- <SEP> 2500 <SEP> 28 <SEP> +/- <SEP> 7 <SEP> 400 <SEP> +/- <SEP> 100 <SEP> 112 <SEP> 4
<tb>
<Desc/Clms Page number 31>
Légende du Tableau 4 : Expérience d'hybridation sur une biopuce préparée selon la méthode 1 : test de concentration.
Des sondes olignucléotidiques fonctionnalisées NH2 ( oligo NH2 ) et non fonctionnalisées ont été déposées à différentes concentration. La puce a été hybridée avec un mélange d'oligonucléotides cibles complémentaires de ceux déposés, marqués en fluorescence. 2 matrices de 45 spots ont été déposées.
Cette expérience montre que la concentration optimale pour le dépôt des oligos est comprise entre 5 et 10 uM. Une très bonne sélectivité des lames à ces concentrations est retrouvée car les oligos non fonctionnalisés se déposent moins (rapport 2 pour les intensités).
Le rapport signal sur bruit est très bon pour ces concentrations optimales (1000).
Les spots sont de taille régulière.
4.2 Lames obtenues auprès du fournisseur Surmodics pour sondes oligonucléotidiques fonctionnalisées avec un groupement aminé
Le réglage du scanner est à 90/95. Les résultats d'expérience sont donnés dans le tableau 5 ci-après.
TABLEAU 5
Figure img00310001
<tb>
<tb> Intensité <SEP> Bruit <SEP> de
<tb> Intensité <SEP> Bruit <SEP> de <SEP> Rapport <SEP> Diamètre <SEP> Ecart <SEP> type
<tb> moyenne <SEP> de <SEP> fond <SEP> autour
<tb> moyenne <SEP> de <SEP> fond <SEP> autour <SEP> signal/bruit <SEP> moyen <SEP> (um) <SEP> des <SEP> diamètres
<tb> fluorescence <SEP> des <SEP> spots
<tb> oligo <SEP> 7200 <SEP> +/- <SEP> 2800 <SEP> 30 <SEP> +/- <SEP> 8 <SEP> 265 <SEP> +/- <SEP> 100 <SEP> 171 <SEP> 7
<tb> 40 <SEP> M
<tb> oligo <SEP> 400 <SEP> +/- <SEP> 1500 <SEP> 25 <SEP> +/- <SEP> 7 <SEP> 170 <SEP> +/- <SEP> 70 <SEP> 158 <SEP> 7
<tb> 20 <SEP> M
<tb> oligo <SEP> NH2 <SEP> à <SEP> 2700+/-1000 <SEP> 22+/-3 <SEP> 125+/-60 <SEP> 160 <SEP> 8
<tb> 10 <SEP> M
<tb> oligo <SEP> Nh2 <SEP> à <SEP> 1800 <SEP> +/- <SEP> 800 <SEP> 23 <SEP> +/- <SEP> 6 <SEP> 80 <SEP> +/- <SEP> 40 <SEP> 155 <SEP> 5
<tb> 5 <SEP> M
<tb> oligo <SEP> NH2 <SEP> à <SEP> 1100 <SEP> +/- <SEP> 500 <SEP> 21 <SEP> +/- <SEP> 1 <SEP> 50 <SEP> +/- <SEP> 20 <SEP> 152 <SEP> 4
<tb> 2 <SEP> M
<tb> oligo <SEP> à <SEP> 40 <SEP> M <SEP> 1000 <SEP> +/- <SEP> 250 <SEP> 22 <SEP> +/- <SEP> 3 <SEP> 50 <SEP> +/- <SEP> 10 <SEP> 160 <SEP> 10
<tb> oligo <SEP> à <SEP> 20 <SEP> M <SEP> 500 <SEP> +/- <SEP> 130 <SEP> 21 <SEP> +/- <SEP> 3 <SEP> 25 <SEP> +/- <SEP> 8 <SEP> 158 <SEP> 7
<tb> oligo <SEP> à <SEP> 10 <SEP> M <SEP> 200 <SEP> +/- <SEP> 70 <SEP> 26 <SEP> +/- <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> +/- <SEP> 3 <SEP> 158 <SEP> 9
<tb> oligo <SEP> à <SEP> 5 <SEP> M <SEP> 100+/-25 <SEP> 21+/-3 <SEP> 5+/-1 <SEP> 157 <SEP> 7, <SEP> 5
<tb> oligo <SEP> à <SEP> 2 <SEP> M <SEP> 50 <SEP> +/-10 <SEP> 22 <SEP> +/-4 <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> +/-0, <SEP> 5 <SEP> 155 <SEP> 7, <SEP> 6
<tb>
<Desc/Clms Page number 32>
Légende du Tableau 5 : Expérience d'hybridation sur une biopuce spottée sur une lame Surmodics : test de concentration.
Les intensités sont plus faibles que pour les lames de la méthode 1.
Le meilleur rapport signal sur bruit est obtenu pour la plus forte concentration et vaut 265.
Comparées avec les lames selon l'invention, les lames Surmodics présentent un signal de fluorescence 4 fois supérieur (31000 contre 7200) et un rapport signal sur bruit 5 fois supérieur pour une concentration en oligonucléotides 8 fois inférieure (5 u. M).
Ainsi, les lames selon l'invention permettent d'utiliser moins d'oligonucléotides que les lames Surmodics pour une intensité de signal supérieure.
La taille des spots les lames Surmodics est plus large que pour les lames selon l'invention avec une distribution assez étroite.
Les biopuces obtenues par les procédés de préparation selon l'invention, notamment selon la méthode 1, s'avèrent particulièrement performantes par rapport aux autres supports commerciaux, notamment par rapport aux supports de type Surmodics qui font référence en la matière.
Finalement, les expériences réalisées avec les lames obtenues par les procédés selon la présente invention, notamment selon la méthode 1, mettent en évidence : - un greffage très efficace (le signal d'hybridation est très fort), - un bruit de fond très faible, - des propriétés de mouillage excellentes (les spots sont homogènes et réguliers), - l'utilisation de moins d'oligonucléotides sondes que pour les lames Surmodics.

Claims (43)

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation d'une biopuce activée pour la fixation covalente de sondes oligonucléotidiques ou peptidiques, ladite biopuce comprenant un support solide préalablement fonctionnalisé avec une fonction thiol ou amine, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de fixation covalente dans les conditions appropriées sur ledit support fonctionnalisé d'un composé espaceur NHS-PEG-VS de formule (1) :
Figure img00330001
dans laquelle PEG désigne le poly (éthylène glycol) de formule HO- (CH2CH20) nCH2CH2-OH, où n est un nombre entier choisi de telle sorte que la masse moléculaire du composé NHS-PEG-VS de formule (1) est comprise entre 500 et 5000, de préférence entre 200 et 4000, de manière plus préférée voisine de 3400, ledit composé espaceur étant fixé sur ledit support solide par une liaison covalente résultant soit de l'interaction entre la fonction thiol dudit support fonctionnalisé et la fonction VS (vinylsulfone) du composé espaceur de formule (1), ou soit de l'interaction entre la fonction amine dudit support fonctionnalisé et la fonction NHS (N-hydroxysuccinimide) du composé espaceur de formule (1).
2. Procédé de préparation d'une biopuce activée selon la revendication 1, caractérisé en ce que la masse moléculaire du composé NHS-PEG-VS de formule (1) est voisine de 3400.
3. Procédé de préparation d'une biopuce activée selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit support solide est choisi parmi les supports solides en verre, en plastique, en Nylon, en Kevlar, en silicone, en silicium ou en polyoses, de préférence en verre.
4. Procédé de préparation d'une biopuce selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit support solide en verre est fonctionnalisé par silanisation.
<Desc/Clms Page number 34>
5. Procédé de préparation d'une biopuce activée selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ledit support solide est fonctionnalisé avec une fonction amine lorsque lesdites sondes oligonucléotidiques ou lesdites sondes peptidiques destinées à être fixées sont fonctionnalisées avec une fonction thiol terminale, ou, le cas échéant, lorsque lesdites sondes peptidiques destinées à être fixées possèdent une fonction thiol libre.
6. Procédé de préparation d'une biopuce activée selon la revendication 5, caractérisé en ce que ledit support solide est fonctionnalisé en présence d'un aminosilane, de préférence le N- (2-aminoéthyl)-3-amino-propyltriméthoxysilane.
7. Procédé de préparation d'une biopuce activée selon la revendication 6, caractérisé en ce que ledit support solide est fonctionnalisé avec une fonction thiol lorsque lesdites sondes oligonucléotidiques ou, le cas échéant, lesdites sondes peptidiques destinées à être fixées sont fonctionnalisées avec une fonction amine terminale.
8. Procédé de préparation d'une biopuce activée selon la revendication 7, caractérisé en ce que ledit support solide est fonctionnalisé en présence de mercaptosilane, de préférence le (3-mercaptopropyl)-triméthoxysilane.
9. Procédé de préparation d'une biopuce désactivée pour la fixation covalente de sondes oligonucléotidiques ou sondes peptidiques fonctionnalisées avec une fonction amine terminale, ou, le cas échéant, de sondes peptidiques possédant une fonction amine libre, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) l'activation de la biopuce par un procédé de préparation d'une biopuce activée selon la revendication 7 ou 8 ; et b) l'hydrolyse en présence d'une solution aqueuse, de préférence d'eau pure, des fonctions NHS libres des composés espaceurs NHS-PEG-VS de formule (1) fixés sur le support solide.
10. Procédé de préparation d'une biopuce régénérée pour la fixation covalente de sondes oligonucléotidiques ou sondes peptidiques fonctionnalisées avec une fonction amine terminale, ou, le cas échéant, de sondes peptidiques possédant une fonction amine libre, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
<Desc/Clms Page number 35>
3 [3 (diméthylamino) propyl] carbodiimide hydrochloride (EDC) et de NHS des groupements carboxylates obtenus à l'extrémité libre desdits composés espaceurs après hydrolyse des fonctions NHS libres initialement présentes, et, le cas échéant, C) au moins une étape de lavage de la biopuce obtenue à l'étape B), de préférence en eau déionisée.
A) la désactivation la biopuce par un procédé de préparation d'une biopuce désactivée selon la revendication 9 ; B) la régénération de la biopuce obtenue à l'étape A) en présence de 1-methyl-
11. Procédé de préparation d'une biopuce activée, désactivée ou régénérée selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend une étape dans laquelle la biopuce obtenue est congelée, séchée ou lyophilisée.
12. Procédé de préparation d'une biopuce revêtue de sondes oligonucléotidiques ou de sondes peptidiques, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) la préparation d'une biopuce activée par un procédé selon l'une des revendications
1 à 8 ou la préparation d'une biopuce régénérée par un procédé selon la revendication 10 ; ss) le dépôt et la fixation par liaison covalente dans les conditions appropriées desdites sondes oligonucléotidiques préalablement fonctionnalisées avec une fonction thiol, ou desdites sondes peptidiques, le cas échéant préalablement fonctionnalisées avec une fonction thiol, si ledit support solide a été fonctionnalisé avec une fonction amine, ou desdites sondes oligonucléotidiques préalablement fonctionnalisées avec une fonction amine ou desdites sondes peptidiques, le cas échéant préalablement fonctionnalisées avec une fonction amine, si ledit support solide a été fonctionnalisé avec une fonction thiol ; et, le cas échéant, y) l'élimination des sondes oligonucléotidiques non fixées sur le support par au moins une étape de rinçage du support dans des conditions appropriées, de préférence en eau déionisée.
13. Procédé de préparation d'une biopuce comprenant un support solide préalablement fonctionnalisé avec une fonction thiol et revêtue de sondes
<Desc/Clms Page number 36>
oligonucléotidiques ou de sondes peptidiques selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'étape suivante : 8) la désactivation en présence de composés aminés dans les conditions appropriées des fonctions NHS du composé espaceur n'ayant pas interagit avec les fonctions amines des sondes oligonucléotidiques ou des sondes peptidiques.
14. Procédé de préparation d'une biopuce selon la revendication 13, caractérisé en ce que ledit composé permettant la désactivation des fonctions NHS du composé espaceur à l'étape 8) est choisi parmi les composés aminés possédant une amine primaire, de préférence l'éthanolamine ou le méthoxy-PEG-NH2.
15. Procédé de préparation d'une biopuce selon la revendication 12 comprenant un support solide préalablement fonctionnalisé avec une fonction amine et revêtue de sondes oligonucléotidiques ou de sondes peptidiques, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'étape suivante : 8) la réduction, dans les conditions appropriées, des charges de surface en présence de composés anioniques ou susceptibles d'établir des liaisons covalentes avec les groupements amines et conduire à une espèce neutre ou négative dans les conditions appropriées, de préférence en présence de méthyl N-succinimidyl adipate (MSA).
16. Procédé de préparation d'une biopuce revêtue de sondes oligonucléotidiques ou de sondes peptidiques selon l'une des revendications 12 à 15, caractérisé en ce qu'il comprend une étape dans laquelle la biopuce obtenue est conservée à l'abri de l'humidité, de la lumière et/ou en atmosphère inerte.
17. Procédé de préparation d'une biopuce activée, désactivée, régénérée ou revêtue de sondes selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que lesdites sondes sont des sondes nucléotidiques.
18. Procédé de préparation d'une biopuce selon la revendication 17, caractérisé en ce que lesdites sondes oligonucléotidiques sont des ADNs ou ARNs monobrins.
19. Procédé de préparation d'une biopuce selon la revendication 17 ou 18, caractérisé en ce que lesdites sondes oligonucléotidiques sont des ADNs ou ARNs dont la taille est comprise entre 15 et 7 000 pb.
<Desc/Clms Page number 37>
20. Procédé de préparation d'une biopuce selon l'une des revendications 12 à 19, caractérisé en ce que lesdites sondes oligonucléotidiques ou lesdites sondes peptidiques sont déposées sous la forme de spots dont le diamètre est compris entre
Figure img00370001
20 um et 500 gm.
21. Procédé de préparation d'une biopuce selon la revendication 20, caractérisé en ce que le nombre desdits spots de sondes oligonucléotidiques ou de sondes peptidiques est compris entre 2 et 105.
22. Biopuce comprenant un support solide préalablement fonctionnalisé avec une fonction thiol ou amine, caractérisée en ce qu'elle comprend un composé espaceur NHS-PEG-VS de formule (I) :
Figure img00370002
dans laquelle PEG désigne le poly (éthylène glycol) de formule HO- (CH2CH20) nCH2CH2-OH, où n est un nombre entier choisi de telle sorte que la masse moléculaire du composé NHS-PEG-VS de formule (I) est comprise entre 500 et 5000, de préférence comprise entre 200 et 4000, de manière plus préférée voisine de 3400, ledit composé espaceur étant fixé sur ledit support solide par une liaison covalente résultant soit de l'interaction entre la fonction thiol dudit support fonctionnalisé et la fonction vinylsulfone du composé espaceur de formule (I) ou soit de l'interaction entre la fonction amine dudit support fonctionnalisé et la fonction NHS du composé espaceur de formule (I).
23. Biopuce selon la revendication 22, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins une sonde oligonucléotidique préalablement fonctionnalisée ou une sonde peptidique, le cas échéant, préalablement fonctionnalisée avec une fonction thiol ou amine fixée sur ledit support solide par une liaison covalente résultant soit de l'interaction entre la fonction NHS libre dudit composé espaceur de formule (I) et une fonction amine de ladite sonde oligonucléotidique ou de ladite sonde peptidique, ou soit
<Desc/Clms Page number 38>
de l'interaction entre la fonction vinylsulfone libre du composé espaceur de formule (1) et une fonction thiol de ladite sonde oligonucléotidique ou de ladite sonde peptidique.
24. Biopuce selon la revendication 23, caractérisée en ce que lesdites sondes oligonucléotidiques fixées sont des ADNs ou ARNs monobrins.
25. Biopuce selon la revendication 23 ou 24, caractérisée en ce que lesdites sondes oligonucléotidiques fixées sont des ADNs ou ARNs dont la taille est comprise entre 15 et 7 000 pb.
26. Biopuce selon l'une des revendications 22 à 25, caractérisée en ce que lesdites sondes oligonucléotidiques ou lesdites sondes peptidiques, sont déposées sous la forme de spots dont le diamètre est compris entre 20 um et 500 um.
27. Biopuce selon l'une des revendications 22 à 26, caractérisée en ce que le nombre de spots de sondes oligonucléotidiques ou de sondes peptidiques déposé sur la
Figure img00380001
5 biopuce est compris entre 2 et 105.
28. Biopuce selon l'une des revendications 22 à 27, caractérisée en ce que ledit support solide est choisi parmi les supports solides en verre, en plastique, en Nylon, en Kevlar, en silicone, ou en silicium, de préférence en verre silanisé.
29. Biopuce activée, désactivée, ou régénérées susceptible d'être obtenue par un procédé selon l'une des revendications 1 à 11.
30. Biopuce revêtue de sondes oligonucléotidiques ou de sondes peptidiques, susceptible d'être obtenue par un procédé selon l'une des revendications 12 à 21.
31. Utilisation d'un biopuce selon l'une des revendications 22 à 30 pour la détection d'acides nucléiques ou de peptides dans un échantillon.
32. Kit pour la détection, l'analyse qualitative ou quantitative d'acides nucléiques ou de peptides dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend une biopuce selon l'une des revendications 22 à 30.
33. Procédé pour la détection d'acides nucléiques cibles ou de peptides cibles dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) le dépôt de l'échantillon contenant les acides nucléiques ou les peptides cibles dont on cherche à détecter la présence sur une biopuce revêtue de sondes oligonucléotidiques ou de sondes peptidiques selon l'une des revendications 22 à 28 et 30, dans des conditions permettant l'hybridation spécifique de ces acides nucléiques
<Desc/Clms Page number 39>
cibles avec lesdites sondes oligonucléotidiques ou la fixation spécifique par affinité entre les peptides cibles avec lesdites sondes peptidiques ; b) le cas échéant, le rinçage de la biopuce obtenue à l'étape a) dans les conditions appropriées afin d'éliminer les acides nucléiques de l'échantillon non capturés par hybridation ou d'éliminer les peptides de l'échantillon non capturés par affinité ; et c) la détection des acides nucléiques capturés sur la biopuce par hybridation ou la détection des peptides capturés sur la biopuce par affinité.
34. Procédé pour la détection d'acides nucléiques dans un échantillon selon la revendication 33, caractérisé en ce que les acides nucléiques dont on cherche à détecter la présence sont préalablement marqués à une de leur extrémité par un marqueur capable de générer directement ou indirectement un signal détectable, de préférence détectable par fluorescence.
35. Procédé pour la détection d'acides nucléiques selon la revendication 34, caractérisé en ce que les acides nucléiques dont on cherche à détecter la présence sont préalablement marqués pour au moins deux d'entre eux par un marqueur différent.
36. Procédé pour la détection d'acides nucléiques selon la revendication 34 ou 35, caractérisé en ce que lesdits marqueurs sont choisis parmi des dérivés de la cyanine, de préférence choisis parmi les dérivés sulfonatés de la cyanine, notamment les composés Cy5 ou Cy3, les nanocristaux ou les nanoparticules.
37. Utilisation d'une biopuce selon l'une des revendications 22 à 28 et 30 comme matrice d'affinité.
38. Utilisation d'une biopuce selon l'une des revendications 22 à 28 et 30 pour la purification d'acide nucléique ou de peptides.
39. Utilisation d'une biopuce selon l'une des revendications 22 à 30 pour le séquençage d'acide nucléique.
40. Utilisation d'une biopuce selon l'une des revendications 22 à 30 ou 39 pour la détection et/ou l'étude de polymorphisme génétique, notamment de SNP.
41. Utilisation d'une biopuce selon l'une des revendications 22 à 28 et 30 pour l'analyse qualitative ou quantitative de l'expression de gènes.
<Desc/Clms Page number 40>
42. Méthode de criblage de composés ou cellules capables de se fixer spécifiquement sur un oligonucléotide ou un peptide donné, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) la mise en contact dudit composé à tester sur une biopuce selon l'une des revendications 22 à 28 et 30, dans les conditions permettant la fixation spécifique éventuelle dudit composé ou de ladite cellule à tester avec ledit oligonucléotide ou ledit peptide donné, ladite biopuce comprenant au moins un spot de sondes oligonucléotidiques ou peptidiques contenant respectivement lesdits oligonucléotides ou lesdits peptides donnés fixés sur son support solide et, le cas échéant, ledit composé ou ladite cellule étant marqué par un marqueur capable de générer directement ou indirectement un signal détectable ; b) l'élimination par au moins une étape de lavage dans les conditions appropriées des composés ou cellules à tester non fixés spécifiquement ledit oligonucléotide ou ledit peptide donné ; et c) la sélection du composé ou de ladite cellule spécifiquement fixé sur ledit oligonucléotide ou ledit peptide donné, le cas échéant, par la sélection du composé ou de ladite cellule dont le signal a été détecté au niveau du spot contenant ledit oligonucléotide ou ledit peptide donné.
43. Instrument ou dispositif de diagnostic comprenant une biopuce selon l'une des revendications 22 à 30.
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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7361767B2 (en) * 2003-11-14 2008-04-22 3M Innovative Properties Company N-sulfonyldicarboximide containing tethering compounds
US7943388B2 (en) 2003-11-14 2011-05-17 3M Innovative Properties Company Acoustic sensors and methods
US7423155B2 (en) 2003-11-14 2008-09-09 3M Innovative Properties Company N-sulfonyldicarboximide containing tethering compounds
EP1700107B1 (fr) * 2003-12-30 2011-09-14 3M Innovative Properties Company Capteurs acoustiques and procedes
US7342082B2 (en) 2004-12-17 2008-03-11 3M Innovative Properties Company Soluble polymers as amine capture agents and methods
US7402678B2 (en) 2004-12-17 2008-07-22 3M Innovative Properties Company Multifunctional amine capture agents
US7544756B2 (en) * 2005-09-30 2009-06-09 3M Innovative Properties Company Crosslinked polymers with amine binding groups
US7544754B2 (en) 2005-09-30 2009-06-09 3M Innovative Properties Company Crosslinked polymers with amine binding groups
US7544755B2 (en) 2005-09-30 2009-06-09 3M Innovative Properties Company Crosslinked polymers with amine binding groups
WO2008039998A2 (fr) * 2006-09-28 2008-04-03 President And Fellows Of Harvard College Procédés de séquençage d'adn
WO2010151714A2 (fr) * 2009-06-24 2010-12-29 Life Technologies Corporation Réseaux moléculaires
EP2790724A4 (fr) * 2011-12-13 2015-08-05 Immunogen Inc Utilisation de n-hydroxysuccinimide pour améliorer la stabilité d'un conjugué
WO2014058570A1 (fr) 2012-09-17 2014-04-17 Alltech Associates, Inc. Milieu de chromatographie et dispositifs associés
MY195756A (en) 2012-09-17 2023-02-09 Grace W R & Co Functionalized Particulate Support Material and Methods of Making and Using the Same
JP6853670B2 (ja) 2014-01-16 2021-04-07 ダブリュー・アール・グレース・アンド・カンパニー−コーンＷ Ｒ Ｇｒａｃｅ ＆ Ｃｏ−Ｃｏｎｎ 親和性クロマトグラフィー媒体及びクロマトグラフィーデバイス
JP6914189B2 (ja) 2014-05-02 2021-08-04 ダブリュー・アール・グレース・アンド・カンパニー−コーンＷ Ｒ Ｇｒａｃｅ ＆ Ｃｏ−Ｃｏｎｎ 官能化担体材料並びに官能化担体材料を作製及び使用する方法
ES2896897T3 (es) 2015-06-05 2022-02-28 Grace W R & Co Agentes de clarificación para el bioprocesamiento de adsorbentes y métodos para producir y usar los mismos
WO2020119706A1 (fr) * 2018-12-12 2020-06-18 深圳华大生命科学研究院 Biopuce, procédé de fabrication et application correspondants
WO2022061455A1 (fr) * 2020-09-22 2022-03-31 Mcmaster University Interface de biodétection à surface imprégnée de lubrifiant, procédés de préparation et utilisations associées

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995034326A1 (fr) * 1994-06-14 1995-12-21 Tadahiko Kohno Reactifs de couplage de derives de polyethyleneglycol et composes formes avec ces derniers
WO1997041897A1 (fr) * 1996-05-09 1997-11-13 Virion Systems, Inc. Vaccins a base de conjugues proteine/polysaccharide prepares a l'aide de vinylsulfones homobifonctionnelles et heterobifonctionnelles
EP1106603A2 (fr) * 1999-12-06 2001-06-13 Fuji Photo Film Co., Ltd. Puce d'ADN et support réactif solide
WO2002042426A2 (fr) * 2000-11-10 2002-05-30 University Of Utah Research Foundation Systeme de transporteur pour apport specifique de genes au niveau de la paroi arterielle

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE272224T1 (de) * 1997-11-17 2004-08-15 Max Planck Gesellschaft Konfokales spektroskopiesystem und -verfahren
JPH11242189A (ja) * 1997-12-25 1999-09-07 Olympus Optical Co Ltd 像形成法、像形成装置

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995034326A1 (fr) * 1994-06-14 1995-12-21 Tadahiko Kohno Reactifs de couplage de derives de polyethyleneglycol et composes formes avec ces derniers
WO1997041897A1 (fr) * 1996-05-09 1997-11-13 Virion Systems, Inc. Vaccins a base de conjugues proteine/polysaccharide prepares a l'aide de vinylsulfones homobifonctionnelles et heterobifonctionnelles
EP1106603A2 (fr) * 1999-12-06 2001-06-13 Fuji Photo Film Co., Ltd. Puce d'ADN et support réactif solide
WO2002042426A2 (fr) * 2000-11-10 2002-05-30 University Of Utah Research Foundation Systeme de transporteur pour apport specifique de genes au niveau de la paroi arterielle

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications", SHEARWATER CORPORATION - CATALOG 2001, XP002220431, Retrieved from the Internet <URL:www.shearwatercorp.com> [retrieved on 20021111] *
LUNDBERG, BO B. ET AL: "Conjugation of an anti-B-cell lymphoma monoclonal antibody, LL2, to long-circulating drug-carrier lipid emulsions", JOURNAL OF PHARMACY AND PHARMACOLOGY (1999), 51(10), 1099-1105, XP008010201 *
NAH J-W ET AL: "Artery wall binding peptide-poly(ethylene glycol)-grafted-poly(l-lysi ne)-based gene delivery to artery wall cells", JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS B.V. AMSTERDAM, NL, vol. 78, no. 1-3, 17 January 2002 (2002-01-17), pages 273 - 284, XP004329825, ISSN: 0168-3659 *
PERRET, EMILIE ET AL: "Versatile decoration of glass surfaces to probe individual protein-protein interactions and cellular adhesion", LANGMUIR (2002), 18(3), 846-854, 10 January 2002 (2002-01-10), XP002220430 *
WANG, TONG ET AL: "Protein stretching III: force-extension curves of tethered bovine carbonic anhydrase B to the silicon substrate under native, intermediate and denaturing conditions", JAPANESE JOURNAL OF APPLIED PHYSICS, PART 1: REGULAR PAPERS, SHORT NOTES & REVIEW PAPERS (1999), 38(6B), 3912-3917, XP001092793 *

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