DE102010014840A1

DE102010014840A1 - DNase-beschichtete magnetische Partikel

Info

Publication number: DE102010014840A1
Application number: DE102010014840A
Authority: DE
Inventors: Johan De Bondt; Gerbert Schaap; Paul Borm; Viorel Rusu
Original assignee: MagnaMedics GmbH
Current assignee: Magtivio Bv Nl
Priority date: 2010-04-13
Filing date: 2010-04-13
Publication date: 2011-10-13
Anticipated expiration: 2030-04-14
Also published as: WO2011128086A1; DE102010014840B4

Abstract

Die Erfindung betrifft DNase-beschichtete magnetische Partikel mit einer Größe von ≥ 10 nm bis ≤ 800 μm, Suspensionen umfassend die erfindungsgemäßen Partikel als auch Verfahren, die auf der Nutzung der erfindungsgemäßen Partikel und/oder Suspensionen beruhen.

Description

Die Erfindung betrifft DNase-beschichtete magnetische Partikel (Beads) mit einer Teilchengröße von ≥ 10 nm bis ≤ 800 μm, die zum Beispiel verwendet werden können um in einer kontrollierten Art und Weise nicht-bakterielle DNS aus einer Probe, die sowohl bakterielle als auch eukaryotische Zellen enthält, zu verdauen. Die Anwesenheit von eukaryotischer DNS (Desoxyribonukleinsäure) neben prokaryotischer DNS kann, z. B. bei PCR und RT-PCR-Anwendungen, die Ergebnisse in der Detektion von prokaryotischer (bevorzugt bakterieller) DNS stören. Darum ist die Entfernung von eukaryotischer DNS aus einer Probe mit eukaryotischer und prokaryotischer DNS nötig.
DE 10035953 A1 gibt eine Zusammenfassung von Anwendungen bekannter magnetischer Partikel wie Silica-Partikel mit zum Teil einstellbaren Poren- und Teilchengrößen sowie adaptierbarem Magnetgehalt. Magnetische Partikel werden als chromatographische Medien speziell für die Nukleinsäure-Aufreinigung, für die Immobilisierung von Nukleinsäuren und Enzymen in Reinigungsschritten, als Speichermedien, für den Einsatz im Immunoassay und für die Gelpermeationschromatographie eingesetzt. Weitere Magnetpartikel, die ein magnetisches Kernmaterial enthalten und mit einem anorganischen Oxid beschichtet sind, werden in EP 0343 934 offenbart. Polymerpartikel, die mit einer weiteren ein magnetisches Material enthaltenden Polymerschicht beschichtet sind, auf der ein dritter zur Interaktion mit Biomolekülen befähigter Polymerüberzug aufgetragen ist, sind in der PCT Anmeldung FR 97/00912 beschrieben.
Magnetische Hybridpartikel, die aus einem Polymerkern bestehen, welcher zunächst mit einem Ferrofluid beschichtet und anschließend mit einem funktionellen Polyacrylat beschichtet wurde, sind Gegenstand der US-Patentschrift 5,648,124 .
WO 98/58257 offenbart 0.1 bis 500 μm große magnetische Partikel zum Trennen von biologischen Gemischen, die Perlglanzfarbpigmente mit magnetischen Eigenschaften und einen biologischen Polymerüberzug aufweisen. Der Polymerüberzug kann ein Protein sein, jedoch handelt es sich dabei um Proteine zum Binden von Komponenten in Immuno-Assays.
Keines dieser Dokumente offenbart oder impliziert die Beschichtung von magnetischen Partikeln mit DNase zum Reinigen von spezifischer DNS in einer Probe, die DNS aus verschiedenen Quellen enthält.
Deoxyribonuklease ist ein Enzym, dass die hydrolytische Spaltung von Phosphodiester-Bindungen in DNS katalysiert. Es gibt zwei Haupttypen von Deoxyribonuklease: DNase I und DNase II. Allerdings wird meist in der Molekularbiologie DNase I verwendet. Mit Protein-Engineering-Ansätzen zum Austausch von einzelnen Aminosäuren im aktiven Zentrum von DNAse konnte in den letzten Jahren Varianten von Deoxyribonuklease-Wildtypen hergestellt werden, deren katalytische Leistung um mehr als das Zehnfache gegenüber dem Wildtyp DNase verbessert ist. Deoxyribonuklease kann von vielen Anbieter wie Sigma Aldrich (p/n-D5319 500UG) oder BioLabs (p/n M0303S) käuflich erworben werden.
Deoxyribonuklease wird in vielen molekularbiologischen Techniken wie Isolierung von RNS aus einer DNS/RNS-Gemisch nach Zell-Lyse, PCR und RT-PCR-Anwendungen, DNS-freies Wasser für die Molekularbiologie oder Isolierung von bakterieller DNS aus menschlichen, klinischen Proben eingesetzt.
Einige kommerziell erwerbbare Isolationskits für genomische DNS aus Bakterien, Pilzen und Hefen sind zum Beispiel: Masterpure DNA-Aufreinigung Kit (Epicentre Technologies, Madison, Wisconsin), DNA-reine Hefe Genomic Kit (CPG Inc., Lincoln Park, NJ), Qiamp DNA Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland), High Pure PCR Template-Erstellung Kit (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland), und Magna Pure LC DNA Isolation Kit III (Bakterien, Pilze).
In den ersten beiden Kits wird nach Lyse der Zellen und Fällung von Proteinen DNS durch Fällung mit Isopropanol abgetrennt, getrocknet und die DNS-Pellets resuspendiert. In den Qiamp und High Pure Kits wird die freigesetzte DNS an eine Kieselgel-Membran und folgend an einen Glasfaser-Filter gebunden und jeweils vor der Elusion gewaschen. In der Magna Pure Anwendung wird die DNS, die durch den Einsatz von Lysepuffer freigesetzt wird, an glasüberzogene, magnetische Kügelchen gebunden, die das Instrument durch mehrere Waschschritte führt. Schließlich wird die DNS eluiert und die Perlen werden verworfen. Weitere Kits von MolYsis, Molzym GmbH & Co. KG, Bremen, Deutschland, Pureprove, SIRS-Lab GmbH, Jena, Deutschland und Looxter/VYOO von Damen und Herren Lab werden zur selektive Isolierung von bakterieller DNA aus menschlichen klinischen Proben genutzt, wobei menschliche DNS weitgehend beseitigt werden kann, während nachweisbaren Konzentrationen der bakteriellen DNS aus den Proben erhalten wurden. In keiner dieser Ansätze/Kits werden DNase beschichteten magnetischen Partikel verwendet sondern freie DNase.
Der Nachweis des bakteriellen Inhalts einer bestimmten Probe, irrelevant aus welcher Quelle (z. B. klinische, Lebensmittel- oder Umweltproben), ist nicht so einfach. So ist zum Beispiel in klinischen mikrobiologischen Laboratorien der Goldstandard zum Nachweis und zur Identifizierung von Erregern bei Patienten, bei denen systemischen Infektionen vermutet werden, die Blutkultur. Bei einer Blutkultur, einer mikrobiologischen Untersuchung des Blutes, wird versucht die Krankheitserreger (meist Bakterien), die sich im Blut befinden, kulturell anzuzüchten. Diese Technik ist auch die Grundlage der ISO-Normen. Allerdings ist diese Technik dafür bekannt, viele Nachteile zu haben, insbesondere im Hinblick auf nicht-kultivierbare Organismen, geringe Abundanz (längere Lag-Phase) der möglichen Erreger und Antibiotika-Behandlungen von Patienten. Außerdem dauert es in der Regel 3 bis 5 Tage, um ein Ergebnis aus Blutkulturen zu erhalten, die oft zu spät ist, um die richtige Antibiotika-Therapie einzuleiten.
Amplification-basierte Methoden wie PCR-Ergebnisse erlauben eine schnellere Art und Weise. Allerdings sind ihre Empfindlichkeit bis dato nicht besser und manchmal schlechter, als Kultur-basierten Methoden.
Somit gibt es in all diesen oben aufgezählten Methoden Limitierungen und Nachteile. Typischerweise muss bei diesen Methoden frei eingesetzte DNase nach dem Verdau von störender DNS durch zeitaufwendige Zentrifugationsschritte vor nachgelagerten Anwendungen entfernt werden. Weiterhin sind Protokolle für die Verdauung von störender DNS unter Verwendung freier DNase schwer zu automatisieren.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass im Stand der Technik DNase erst zeitaufwendig entfernt werden muss, bevor z. B. bakterielle DNS in weiteren Schritten vervielfältigt und/oder analysiert oder anderweitig verwendet wird.
Es besteht demnach eine klare Nachfrage in der Gesundheitsversorgung für die schnelle Isolierung von PCR-fertige DNS aus pathogenen grampositiven oder gramnegativen Bakterien in verschiedenen biologischen Proben.
Diese Aufgabe wird durch die DNase-beschichteten magnetischen Partikel der vorliegenden Erfindung gelöst. Die erfindungsgemäßen Partikel ermöglichen eine vereinfachte und schnelle Aufreinigung von, z. B. bakterieller DNS aus einer Probe mit eukaryotischer DNS durch eine einfache, magnetische Abtrennung der an die Partikel gebundenen DNase nach der Verdauung der störenden eukaryotischen DNS.
Entsprechend besteht ein Aspekt der vorliegenden Erfindung in DNase-beschichteten magnetischen Partikeln (Beads) mit einer Teilchengröße von ≥ 10 nm bis ≤ 800 μm, bevorzugt mit einer Teilchengröße von ≥ 100 nm bis ≤ 20 μm, besonders bevorzugt mit einer Teilchengröße von ≥ 0.5 bis ≤ 2 μm und ganz besonders bevorzugt von ≥ 900 nm bis ≤ 1,3 μm. In einer bevorzugten Ausführungsform besitzen die erfindungsgemäßen Partikel eine Teilchengröße von ≥ 500 nm bis ≤ 2 μm und der mittlere Durchmesser der erfindungsgemäßen Partikel (d 0,9) beträgt zwischen ≥ 900 nm und ≤ 1,3 μm. Es ist zu verstehen, dass die Teilchengrößen und mittleren Durchmesser der erfindungsgemäßen Partikel jeden Wert zwischen den angegebenen Größen annehmen können.
In bevorzugten Ausführungsformen sind die Kerne der erfindungsgemäßen Partikel mit einer oder mehreren DNasen vom Typ I beschichtet, oder mit einer oder mehreren DNasen vom Typ II beschichtet, oder mit einer oder mehreren DNasen vom Typ I und einer oder mehreren DNasen vom Typ II beschichtet, bevorzugt, wobei eine oder mehrere DNase(n) stabiler als der entsprechende Wildtyp ist (sind), eine höhere Aktivität gegen eukaryotische oder bakterielle DNS als der entsprechende Wildtyp aufweist (aufweisen) oder eine höhere Spezifität gegen eukaryotische oder bakterielle DNS als der entsprechende Wildtyp aufweist (aufweisen). Zum Beispiel ist Turbo^TM DNase, die eine stark erhöhte Aktivität aufweist eine derartige bevorzugte DNase-Form.
In einer weitere bevorzugten Ausführungsform ist DNase auf die Kerne der erfindungsgemäßen Partikel über einen Abstandshalter (Spacer), bevorzugt Gelatine, BSA, PEG oder Tosyl, immobilisiert.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Suspension aus erfindungsgemäßen Partikeln.
In einer bevorzugten Ausführungsform liegt die Konzentration der erfindungsgemäßen Partikel in der erfindungsgemäßen Suspension im Bereich von etwa 0,1 und etwa 100 mg/ml, bevorzugt im Bereich von etwa 0,1 und etwa 50 mg/ml, und besonders bevorzugt im Bereich von etwa 1 und etwa 20 mg/ml.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegt die DNase-Konzentration durch die erfindungsgemäßen Partikel in der Suspension im Bereich von etwa 100 und etwa 20.000 U/ml, bevorzugt im Bereich von etwa 100 und etwa 10.000 U/ml, besonders bevorzugt im Bereich von etwa 300 und etwa 2000 U/ml, und ganz besonders bevorzugt im Bereich von etwa 300 und etwa 600 U/ml liegt.
In ebenfalls einer bevorzugten Ausführungsform liegt der pH-Bereich der Suspension im Bereich von etwa pH 4 und etwa pH 8, bevorzugt im Bereich von etwa 4,5 und etwa 8,5.
In noch einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Suspension zusätzlich divalente Kationen, vorzugsweise Mg²⁺ und/oder Mn²⁺.
Ein dritter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Partikel oder der erfindungsgemäßen Suspension zum Abbau von DNS in einer (vorzugsweise biologischen) Probe oder Matrix.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind erfindungsgemäße Partikel oder eine erfindungsgemäße Suspension Bestandteil eines bakteriellen DNS Isolation Kits.
Entsprechend handelt ein vierter Aspekt der vorliegenden Erfindung von einem Kit umfassend mindestens ein erfindungsgemäßes DNase-beschichtetes magnetisches Partikel oder mindestens eine erfindungsgemäße Suspension oder alle Komponenten zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Suspension wie erfindungsgemäße Partikel und zum Beispiel Puffersubstanzen.
Letztlich ist ein fünfter Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Entfernen von DNS aus biologischen Proben, das die folgenden Schritte umfasst: a) Verdauen von genomischer DNS in einer Probe unter Verwendung der erfindungsgemäßen Partikel oder Suspension, b) Entfernen der erfindungsgemäßen Partikel aus dem Reaktionsgemisch.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Probe eukaryotische DNS und virale DNS und/oder virale RNA und/oder prokaryotische DNS und/oder DNS aus Pilzen (wie Hefe) und/oder bakterielle DNS und/oder RNS und die zu verdauende DNS ist eukaryotische DNS, bevorzugt menschliche DNS, und die zu isolierende/aufzureinigende DNS ist prokaryotische, besonders bevorzugt bakterielle, DNS oder bakterielle RNS.
In einer weitere bevorzugten Ausführungsform ist die durch das Verfahren zu isolierende/aufzureinigende DNS DNS aus Prokaryoten, bevorzugt aus gram positiven oder gram negativen Bakterien; oder DNS aus Pilzen, bevorzugt Hefe.
In einer weitere bevorzugten Ausführungsform ist die durch das Verfahren zu isolierende/aufzureinigende RNS RNS aus Prokaryoten, bevorzugt aus gram positiven oder gram negativen Bakterien, oder Viren.
Der Verdau des erfindungsgemäßen Verfahrens findet bevorzugt im Bereich von etwa 5 und etwa 40°C, besonders bevorzugt im Bereich von etwa 20 und etwa 37°C statt.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht eine Erhöhung der Empfindlichkeit in der bakteriellen DNS-Isolation (oder RNS-Isolation) und Identifikation aus verschiedensten Proben. Gleichzeitig ermöglichen die erfindungsgemäßen Partikel, Suspensionen und Methoden eine schnellere und vereinfachte Abtrennung von DNase nach dem Verdau potentiell störender DNS aus einer Probe, d. h. die Aspekte der vorliegenden Erfindung ermöglichen ein Entfernen von spezifischen DNS aus biologischen Proben, die sowohl störende als auch zum Beispiel DNS von Interesse enthalten, ohne weitere Kontamination mit DNase. Das Entfernen von DNS erfolgt durch Verdau mit DNase der erfindungsgemäßen Partikel.
Mit Hilfe der erfindungsgemäßen DNase-beschichteten magnetischen Partikel kann die Isolierung von PCR-bereiter prokaryotische DNS vereinfacht werden, und in einer kürzeren Zeit erreicht werden als mit Methoden des Standes der Technik, bei denen zunächst Bakterien aus einer Probe isoliert werden müssen. Zudem ermöglicht die Verwendung von den erfindungsgemäßen DNase-beschichteten magnetischen Partikeln einfachere, automatisierte und sichere Protokolle welche ein völlig automatisiertes Entfernen von DNase nach erfolgter Verdauung von unerwünschter DNS aus einer Probe ermöglichen ohne auf Zentrifugationsschritte oder Adsorptionsschritte wie sie aus dem Stand der Technik bekannt sind, zurückgreifen zu müssen.
Diese Protokolle sind speziell ein Vorteil in klinische Anwendungen für die Nachweis von pathogenen DNS in menschlichen Proben (z. B. Vollblut).
Die erfindungsgemäßen Partikel, Suspensionen und Verfahren der Isolation prokaryotischer DNS erlauben die Kombination von effizienter Lyse der Zellen einer Probe mit einem bestimmten Lysepuffer zur Extraktion von genomischer DNS aus eukaryotischen Zellen mit der gesamten Verdauung von eukaryotischer DNS mit Hilfe der erfindungsgemäßen DNase-beschichteten magnetische Partikel.
Nach abgeschlossener Verdauung der eukaryotischen DNS können die magnetischen Partikel der vorliegenden Erfindung einfach magnetisch entfernt werden, so dass das Reaktionsgemisch nach dem Verdauungsschritt durch die erfindungsgemäßen Partikel nun die Bakterien-DNS von Interesse und daneben Zelltrümmer und DNS-Fragmente resultierend aus der früheren Lyse und dem DNS-Verdauungsschritt enthält.
Der Fachmann wird verstehen, dass die Ausdrücke „ein„ und „eine„, wenn sie in der vorliegenden Anmeldung gebraucht werden, je nach Sachverhalt „ein (1)„, „mindestens ein (1)„ oder „ein (1) oder mehr„ bedeuten kann.
Die erfindungsgemäßen Partikel bestehen aus einem Kern, der mit DNase beschichtet ist. Dabei kann DNase direkt auf dem Kern immobilisiert sein oder, bevorzugt, durch Platzhalter (Spacer) mit dem Kern der Partikel verbunden sein.
Der Kern der DNase-beschichteten, magnetischen Partikel der vorliegenden Erfindung ist an sich bekannt. Ohne limitierend zu sein können solche magnetischen Partikel zum Beispiel aus Silika und/oder einer Vielzahl unterschiedlicher Polymere, wie zum Beispiel Polystyrol, vernetztes Polystyrol, Polyacryl, Polymilchsäure, Polyglykolsäure, Poly (Lactidcoglycolide), Polyanhydride, Poly(Methylmethacrylat), Poly(Ethylen-Co-Vinyl-Acetat), Polysiloxane, polymere Kieselsäure, Latex, Dextran-Polymere und Epoxidharze, wobei Silika bevorzugt ist, und einem magnetischen Füllstoff hergestellt werden.
Bei besagten magnetische Füllstoffe handelt es sich, ohne limitierend zu sein, zum Beispiel um Eisen, Eisensilikone, Nickel, Kobalt oder Legierungen jedes dieser Metalle mit Molybdän, Chrom, Kupfer, Vanadium, Mangan, Aluminium oder Titan, Eisen-Oxide (Fe₃O₄ oder gamma Fe₂O₃) in reiner Form oder in Verbindung oder Vermischung mit andere Oxiden wie Oxiden von Kobalt, Mangan, Zink, Barium oder seltenen Erden, oder Chromdioxid.
Zum Beispiel liegen die magnetischen Füllstoff üblicherweise in Form von Partikeln vor, die hinreichend fein sind, dass sie in die Polymer-Partikel des Kerns aufgenommen werden können. In der Regel sind die magnetischen Füllstoffe 0,005 bis 10 pm groß. Die magnetischen Partikel werden in der Regel durch Mischen der magnetischen Füllstoff mit dem Polymer und/oder Silika durch konventionelle Methoden der Masse-, Lösungs-, Emulsions- oder Suspensionspolymerisation hergestellt, können aber auch auf jedem anderen dem Fachmann bekannten Weg hergestellt werden, wie zum Beispiel Beschichten eines Silikakerns mit einem magnetischen Material, dass dann, optional, wiederum mit einer weiteren Schicht wie zum Beispiel einem Polymer, beschichtet wird.
Dem Fachmann ist geläufig, wie verschiedene magnetische Kerne in Abhängigkeit von den zu verwendenden Materialen hergestellt werden können. Kerne zur Herstellung der erfindungsgemäßen Partikel sind nicht auf die hier beschriebenen Möglichkeiten beschränkt, vielmehr sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik weitere, mögliche magnetische Kerne bekannt, die ebenfalls geeignet sind erfindungsgemäße DNase-beschichtete magnetische Partikel herzustellen. Viele magnetische Kerne im Sinne der vorliegenden Erfindung sind zum Beispiel in DE 10035953 A1 beschrieben. Diese Kerne sind ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst.
Bei dem Begriff „DNase„ wie in der vorliegenden Anmeldung gebraucht fallen alle nukleolytischen Enzyme (d. h. Nukleasen, EC-Klasse 3.1), die DNS zerkleinern. Typische Restriktions-Enzyme sind dem Fachmann bekannt. Bevorzugt handelt es sich bei DNasen jedoch um Deoxyribonukleasen, die die hydrolytische Spaltung von Phosphodiester-Bindungen im DNS-Rückrat katalysiert. Deoxyribonukleasen verdauen Einzel- und Doppelstrang-DNS zu einer Mischung aus Mono- und Oligonukleotiden, die jeweils einen 5'-Phosphat und einen 3'-OH Terminus aufweisen. Die vorliegende Erfindung umfasst sowohl den Einsatz von DNase-Wildtypen als auch den Einsatz von zum Beispiel rekombinanter DNase oder durch „enzyme engineering„ hergestellte Varianten, die zum Beispiel eine erhöhte katalytische Leistung bezogen auf den jeweiligen Wildtyp aufweisen und/oder eine höhere Selektivität bezüglich DNS aus verschiedenen Quellen wie bakterielle DNS, Pilz-DNS oder DNS aus Säugetieren (z. B. menschliche DNS). Es gibt zwei Haupttypen von Deoxyribonukleasen, die als DNase I und DNase II bekannt sind. Die katalytische Aktivität der DNase I ist abhängig von der Anwesenheit/Abwesenheit zweiwertigen Ionen. Zum Beispiel hydrolysiert DNase I in Anwesenheit von Mg2 + zufällig und unabhängig einen Strang einer doppelsträngigen DNS. In Gegenwart von Mn2 + werden beide Stränge gespalten.
Unter dem Begriff „Verdauung„ bzw. „Verdau„ im Sinn der vorliegenden Anmeldung wird die enzymatische Fragmentierung von Oligonukleotiden (DNS) aus einer spezifischen Quelle (zum Beispiel nicht-bakterielle DNS) in Nukleotideinheiten (Mono bzw. kleinere Oligonukleotide) mittels DNase von DNase-beschichteter magnetischer Partikelen der vorliegenden Erfindung verstanden, wobei die entstehenden Nukleotideinheiten nicht von einer DNS-Polymerase in einem nachfolgenden PCR-Schritt (PCR – Polymerase Chain Reaction) erkannt werden, bzw. nicht vervielfältigt werden. Dem Fachmann ist bekannt, welche Polymerasen in einer PCR-Schritt eingesetzt werden können.
Dem Fachmann sind zudem Verfahren zum Messen von DNS-Degradierung (Verdau), zum Beispiel mittels Agarosegelen, bekannt.
Unter der spezifischen Aktivität von DNase wird die Fähigkeit des Enzyms verstanden 1 μmol doppelsträngige DNS (dsDNS) pro Minute unter Standardbedingungen zu spalten.
DNase Aktivität kann zum Beispiel wie im Folgenden bestimmt werden: Inkubation einer Probe mit 100,000 cpm 32p-DNS plus 80 ig/ml nicht-radioaktiver Lachssperma DNS in DNase Puffer (10 mM Tris-HCl pH 7,4 mM MgCl₂, 4 mM CaCl₂) für 45 min bei 37°C. Die Reaktion wird durch Zugabe eines halben Volumens der nicht-radioaktiven DNS (2 mg/ml) und einem Volumen eiskalter 20% Trichloressigsäure abgebrochen. Nach 10 min auf 4°C wird das Reaktionsgemisch 10 min bei 12.000 g zentrifugiert, ein Aliquot des Überstandes wird gemessen. Die gemessenen Ausschläge der säurelöslichen DNS Fragmente im Überstand reflektieren die DNase-Aktivität.
Die Kerne der erfindungsgemäßen Partikel können mit einer DNase oder mit verschiedenen DNasen in unterschiedlichen oder gleichen Aktivitätsanteilen beschichtet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Kerne der erfindungsgemäßen Partikel mit einer oder mehreren DNasen vom Typ I beschichtet. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die Kerne der erfindungsgemäßen Partikel mit einer oder mehreren DNasen vom Typ II beschichtet. In einer dritten bevorzugten Ausführungsform sind die Kerne der erfindungsgemäßen Partikel mit einer oder mehreren DNasen vom Typ I und einer oder mehreren DNasen vom Typ II beschichtet sind. Dabei können die verschiedenen DNasen aus derselben Lebensform oder unterschiedlichen Lebensformen stammen. Zum Beispiel kann eine DNase menschlichen Ursprungs oder eine Variante einer menschlichen DNase sein und eine weitere DNase kann aus einem anderen Säugetier, einer Pflanze oder einem Pilz stammen oder eine Variante einer derartigen DNase sein.
Die Beschichtung der Kerne der erfindungsgemäßen Partikel mit DNase erfolgt durch Immobilisierung von DNase an der Kernoberfläche. Die Immobilisierung der DNase kann entweder direkt oder über eine Verlinkung mittels eines Abstandshalters (Spacers) erreicht werden, wobei eine Beschichtung mittels Immobilisierung von DNase über einen Spacer eine bevorzugte Ausführungsform ist.
Die Immobilisierung umfasst dabei sowohl die kovalent Bindung von DNase an die Kernoberfläche bzw. an einen Spacer als auch die Bindung der DNase an die Kernoberfläche oder einen Spacer durch, z. B., hydrophobe Wechselwirkungen. Bevorzugt wird DNase jedoch kovalent an die Kernoberfläche oder den Spacer gebunden.
Immobilisierung bedeutet in diesem Zusammenhang, dass während eines Verdauungsschrittes und unter den Bedingungen eines Verdauungsschrittes von DNS durch die immobilisierte DNase und dem anschließenden Entfernen der erfindungsgemäßen Partikel mehr als 95%, 98%, 99%, 99.5% bevorzugt mehr als 99,9% und besonders bevorzugt 99,99% ganz besonders bevorzugt 100% der DNase an den Kernen/Spacern der erfindungsgemäßen Partikel gebunden bleibt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist DNase durch einen Spacer mit dem Kern der erfindungsgemäßen Partikel verbunden. Ohne daran gebunden zu sein wird davon ausgegangen, dass die Spacer die biologische Aktivität der gebundenen DNase beeinflussen, da so eine sehr gute Verfügbarkeit der aktiven Zentren des Enzyms erreicht wird. Dabei scheint die Länge der Spacer eine Rolle zu spielen. Auch wird davon ausgegangen, dass durch den Einsatz von Spacern die unspezifische Bindung von DNS und Zellrückständen aus Bakterien, Hefe, Pilzen oder Eukaryonten an die Kernoberfläche der erfindungsgemäßen Partikel vermindert werden kann. Bevorzugt wird die Bindung an die Kernoberfläche der erfindungsgemäßen Partikel durch Spacer zu über 80%, 90%, 95%, besonders bevorzugt zu über 99%, und ganz besonders bevorzugt zu 100% verhindert. Besonders bevorzugt wird DNase auf die Kernoberfläche über Block-Spacer wie große Proteine (zum Beispiel BSA) immobilisiert.
Als Spacer im Sinne der vorliegenden Erfindung gelten zum Beispiel Verbindungen mit einer oder mehreren bifunktionellen Reaktionsgruppen zu verstehen, wie beispielsweise: (1) Diamine der Formel NH₂-R1-NH₂, wobei R1 eine C₂-C₂₀-Alkylgruppe sein kann, (2) Aminosäuren, mit der allgemeinen Formel NH₂-R2-CO₂H, wobei R2 eine C₁-C₂₀-Alkylgruppe sein kann und (3) Dialdehyde, mit der Formel OHC-R3-CHO, wobei R3 eine C₁-C₂₀-Alkylgruppe sein kann. Zwei oder mehr Verbindungsgruppen können gekoppelt werden, um die Spacer-Länge zu erhöhen. Beispiele für geeignete Spacer umfassen 6-Aminocapronsäure, 1,6-Diaminohexan, 1,12-Diaminododecan, Glutaraldehyd, und Mixturen daraus. Weitere bevorzugte Spacer sind Gelatine, tosyl (CH₃C₆H₄SO₂), PEG (Polyethylenglycol), PEO (Polyethylenoxid), POE (Polyoxiethylen) und große Proteine mit einer Größe größer 30 kDa, bevorzugt größer 45 kDa besonders bevorzugt größer 60 kDa wie zum Beispiel BSA.
In einer bevorzugte Ausführungsform der Erfindung besitzen Spacer mindestens eine Länge von 10, 20, 50 oder 100 Kohlenstoffatome oder Spacer sind Proteine, wobei diese Proteine bevorzugt eine Größe von über 5 kDa, über 10 kDa, über 20 kDa, über 30 kDa, besonders bevorzugt über 50 kDa aufweisen, oder Spacer sind Polymere, wobei die Polymere bevorzugt eine Größe von über 1; 2,5; 5; 10; 15; 20 oder 30 kDa aufweisen.
In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst der Kern eine funktionalisierte Oberfläche mit einer Vielzahl von reaktiven, funktionellen Gruppen. Die DNase ist somit direkt kovalent an eine funktionelle Gruppe an der Oberfläche, oder einem Spacer der entsprechenden Länge, der kovalent an eine oder mehrere dieser funktionellen Gruppe gebunden ist, gebunden. Nach ausgiebigem Waschen des Trägers mit einer funktionalisierten Oberfläche, wird die biologisch aktive Einheit (DNase) oder ein Spacer, an den später die biologisch aktive Einheit (DNase) gebunden wird (vorzugsweise kovalent), an eine funktionelle Gruppe der Kernoberfläche (vorzugsweise kovalent) gebunden.
Dem Fachmann bereitet es keine Schwierigkeiten entsprechende Kupplungsreaktionen für die Immobilisierung von DNase durchzuführen.
Bekannte und akzeptierte Verfahren zur Immobilisierung sind zum Beispiel: (1) die Verwendung von wasserlöslichen Carbodiimiden bei der Reaktion von einer Carboxylgruppe auf der funktionalisierten Kernoberfläche und einem frei zugänglichen Amino-Gruppe auf der DNase, um wahrscheinlich eine stabile Amidbindung zu formen; (2) die Verwendung von bifunktionellen Aldehyden (z. B. Glutaraldehyd) die als Spacer eine Amino-Gruppe auf der Kernoberfläche und eine frei zugänglichen Amino-Gruppe auf der DNase verbinden; (3) die Verwendung von Bromcyan in der Reaktion einer Hydroxylgruppe auf der Kernoberfläche mit einer Aminogruppe auf einem Spacer oder einer DNase bzw. einer Hydroxylgruppe auf einem Spacer und einer Aminogruppe auf einer DNase; (4) der Einsatz von EDS/NHS EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide/N-hydroxysuccinimide) oder (5) der Einsatz von Tosyl-Gruppen.
Vorzugsweise haben die erfindungsgemäßen DNase-beschichteten magnetischen Partikel der vorliegenden Erfindung eine Teilchengröße von ≥ 10 nm bis ≤ 800 μm, bevorzugt eine Teilchengröße von ≥ 100 nm bis ≤ 20 μm, besonders bevorzugt eine Teilchengröße von ≥ 500 nm bis ≤ 2 μm und ganz besonders bevorzugt eine Teilchengröße von ≥ 900 nm bis ≤ 1,3 μm. In einer bevorzugten Ausführungsform besitzen die erfindungsgemäßen Partikel eine Teilchengröße von ≥ 500 nm bis ≤ 2 μm und der mittlere Durchmesser von 90% der erfindungsgemäßen Partikel (d 0,9) liegt zwischen ≥ 900 nm und ≤ 1,3 μm. Die Größe der Partikel kann unter Verwendung der üblichen Techniken manipuliert werden und zum Beispiel mittels Laser Diffraktometrie bestimmt werden. Vorzugsweise haben die Partikel Kugelform.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Suspensionen aus den erfindungsgemäßen DNase-beschichteten magnetischen Partikeln.
Vorzugsweise, liegt der pH-Wert dieser Suspensionen sowohl vor als auch nach Zugabe der Suspension zu einer Probe oder der Probe zu einer Suspension im Bereich von etwa pH 2 und etwa pH 10, mehr bevorzugt im Bereich von etwa pH 4,5 und etwa pH 8,5 und besonders bevorzugt im Bereich von etwa pH 6 und etwa pH 8. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen liegt der pH Wert der Suspensionen am pH Optimum zumindest einer der immobilisierten DNasen.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der pH-Wert einer erfindungsgemäßen Suspension durch einen Puffer eingestellt. Im Hinblick auf die absolute Konzentration einer Puffersubstanz in einer erfindungsgemäßen Suspension für die erfolgreiche Durchführung von zum Beispiel Verdau eukaryotischer DNS wird der Fachmann erkennen, dass es keine strenge Regel geben kann, obwohl es in der Regel zu verstehen ist, dass die Konzentration einer Puffersubstanz hoch genug sein sollte, um eine ausreichende Pufferung des pH-Wertes der Suspension bei Zugabe einer Probe zu der Suspension oder bei der Zugabe der Suspension zu einer Probe zu erreichen, aber gleichzeitig so niedrig wie möglich sein sollte um spätere Ansätze der zum Beispiel von eukaryotischer DNS befreiten Reaktionsgemisch (bestehend aus einer Probe und einer erfindungsgemäßen Suspension) so wenig wie möglich zu beeinflussen.
Mit den oben genannten Grundsätzen im Auge, liegt die Konzentration von mindestens einer Puffersubstanz in einer erfindungsgemäßen Suspension vor Zugabe einer Probe in bevorzugten Ausführungsformen im Bereich von etwa 1 mM und etwa 1 M, etwa 10 mM und etwa 1 M, etwa 10 mM und etwa 500 mM, etwa 10 mM und etwa 250 mM, bevorzugt im Bereich von etwa 100 mM und etwa 250 mM. Der Fachmann wird verstehen, dass nach Vermischen einer Probe und einer erfindungsgemäßen Suspension die Pufferkonzentration eine Mindestkonzentration nicht unterschreiten sollte um eine ausreichende Pufferkapazität und einen stabilen pH-Wert des Reaktionsgemisches noch zu gewährleisten. Entsprechend liegt die Konzentration mindestens einer Puffersubstanz nach Vermischen einer Probe und einer erfindungsgemäßen Suspension im Bereich von etwa 1 mM und etwa 1 M, etwa 10 mM und etwa 1 M, etwa 10 mM und etwa 500 mM, etwa 10 mM und etwa 250 mM, bevorzugt im Bereich von etwa 100 mM und etwa 250 mM.
Besonders bevorzugte Puffer für erfindungsgemäße Suspensionen sind Acetat, TRIS (eine flüchtige Puffersubstanz), PBS und Bicarbonat. Weitere bevorzugte Puffer sind zum Beispiel Ameisensäure, Essigsäure, Pikolinsäure, Diacetyl Aceton, o-, m- und p-Kresolen, o-, m-, p-Cl-Phenole, Hydroxy-Pyridin, Isonikotinsäureamid, verschiedene Pyridine, Carbinolen, Diethanolamin, Benzylamin, Pyridin-Ethanol und Dimethylaminopropionitril. Die Liste bevorzugter Puffer enthält flüchtige Puffersubstanzen, die zum Beispiel durch Vakuumzentrifugation nach beendeter Verdauung leicht aus dem Reaktionsgemisch entfernt werden können. Es versteht sich, dass die vorstehende Liste nicht erschöpfend sein soll oder in irgendeiner Weise limitierend sein soll, der Fachmann ist in der Lage zahlreichen andere möglichen Buffersubstanzen zu finden, die zum Beispiel nicht leicht flüchtig sind.
Zusätzlich zu Puffersubstanzen können erfindungsgemäße Suspensionen auch weitere Stoffe umfassen wie essentielle Ionen. Solche Ionen können kationisch oder anionisch sein und zum Beispiel der Stabilisierung oder Aktivitätserhöhung von DNase oder anderen Verbindungen dienen. Bevorzugt sind divalente Kationen wie Ca¹⁺, Fe²⁺, Cu²⁺, Mn²⁺ und/oder Mg²⁺, ganz besonders bevorzugt sind Mn²⁺ und/oder Mg²⁺.
Zusätzlich kann eine erfindungsgemäße Suspension in einer Ausführungsform gleichzeitig als Lyse-Lösung fungieren. In diesem Fall enthält die Suspension zusätzlich alle nötigen Komponenten um eine Lyse von Zellen durchzuführen. Dem Fachmann ist in diesem Fall bekannt, welche Zusätze nötig sind.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Kit zur Durchführung eines DNS-Verdaues. Dieses Kit umfasst mindestens ein erfindungsgemäßes Partikel oder mindestens eine erfindungsgemäße Suspension oder alle Komponenten zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Suspension.
In einer bevorzugten Ausführungsform befinden sich alle Komponenten zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Suspension in einzelnen, abgeschlossenen Behältnissen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegen die erfindungsgemäßen Partikel bereits in Form einer Suspension in einem abgeschlossenen Behältnis im Kit vor, wobei die Suspension entweder benutzungsfertig (ready to use) ist oder in Form eines Konzentrates vorliegt, das im folgenden um zum Beispiel einen Faktor 1, 2, 4, 8, 16, 20, 50, 100, 250, 500 oder 1000 verdünnt werden muss. Dem Kit können auch weitere Additive in abgeschlossenen Behältnissen zugefügt sein, die einer Suspension umfassend die erfindungsgemäßen Partikel zugesetzt werden können. Alternativ können sich derartige Additive bereits in der Suspension in einem abgeschlossenen Behältnis befinden.
Wahlweise enthält ein Kit zusätzlich Komponenten zur Lyse von Zellen und/oder einen Magneten bzw. ein Gerät zur Erzeugung eines magnetischen Feldes zur Entfernung der erfindungsgemäßen Partikel aus der Reaktionslösung.
In einer weiteren Ausführungsform enthält ein Kit wahlweise zusätzlich Anweisungen für die Nutzung der erfindungsgemäßen Partikel/Suspension für den Verdau von DNS, bevorzugt von eukaryotischer DNS, und/oder Anweisungen zum Abtrennen der erfindungsgemäßen Partikel.
DNS kann prokaryotischen (Bakterien und Archaeen) oder eukaryotischen (von Pflanzen, Tieren und Pilzen) Ursprungs sein. DNS im Sinn der vorliegenden Erfindung ist eine Polynukleotidkette, die von einer DNS-Polymerase in einem PCR-Schritt erkannt und vervielfältigt werden kann. In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird unter DNS genomische DNS verstanden.
Durch Wahl der entsprechenden DNasen, die als Beschichtung der erfindungsgemäßen DNase-beschichteten magnetischen Partikel dienen, ist es so im allgemeinen möglich spezifisch Bakterien-, und/oder Hefe-, und/oder Pilz-DNS von anderer DNS wie zum Beispiel menschlicher DNS zu isolieren oder bakterielle und/oder virale RNS von DNS zu isolieren.
Die Ausdrücke „Isolieren„ bzw. „Aufreinigen„ von spezifischer DNS wie in der vorliegenden Anmeldung benutzt, beziehen sich auf das Entfernen von anderer DNS aus einem Reaktionsgemisch als der spezifischen DNS von Interesse. Die Entfernung erfolgt durch Verdau der anderen DNS.
Die erfindungsgemäßen Partikel dienen besonders bevorzugt dem kontrollierten Verdau von nicht-prokaryotischer (bevorzugt nicht-bakterieller) DNS in einer Probe umfassend prokaryotische DNS und eukaryotische DNS und. Das heißt; nicht-bakterielle DNS (bevorzugt eukaryotische DNS, besonders bevorzugt menschliche DNS) in einer Probe mit gemischter DNS wird durch die erfindungsgemäßen Partikel verdaut. In einem optional folgenden Schritt können die erfindungsgemäßen Partikel durch einen Magneten oder ein Gegenstand, der ein magnetisches Feld erzeugt, aus dem Reaktionsgemisch entfernt werden.
In weiteren Ausführungsformen können Pilz-DNS, bevorzugt Hefe-DNS von anderer DNS wie bakterieller DNS oder Säugetier-DNS, besonders bevorzugt menschlicher DNS, isoliert werden.
Die erfindungsgemäßen Partikel können jedoch auch zur Isolierung/Aufreinigung von RNS wie zum Beispiel viraler und/oder bakterieller RNS eingesetzt werden indem DNS, vorzugsweise tierische (besonders bevorzugt menschliche DNS) durch die erfindungsgemäßen Partikel verdaut wird.
In einer weiteren Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Partikel zur Herstellung von DNS-freiem Wasser genutzt werden. Es bereitet dem Fachmann dabei keine Schwierigkeiten eine DNase-Kombination zum Beschichten zu wählen, die den gewünschten Effekt hervorbringt.
Bei den Proben, aus denen mit den erfindungsgemäßen Partikeln DNS verdaut wird, kann es sich um biologische Proben wie Umweltproben, Nahrungsproben oder klinische Proben handeln. Bevorzugt handelt es sich bei den klinischen Proben um Vollblut, Blutserum, Lymphflüssigkeit oder Urin. Eine Probe kann vor der Zugabe der erfindungsgemäßen Partikeln/Suspensionen mit anderen Verfahren wie zum Beispiel einem Lyseverfahren behandelt worden sein oder zum Beispiel ohne weitere Verfahren mit einer erfindungsgemäßen Suspension vermischt werden. In der letzten Ausführungsform erfolgt die Lyse durch die erfindungsgemäße Suspension.
Entsprechend handelt ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung von einem Verfahren zum Entfernen von DNA aus einer Probe, bevorzugt aus einer biologischen Probe, umfassend die Schritte:

a) Verdauen von genomischer DNS in einer Probe unter Verwendung der erfindungsgemäßen DNase-beschichteten magnetischen Partikel oder einer erfindungsgemäßen Suspension; und
b) Magnetisches Entfernen der erfindungsgemäßen Partikel aus dem Reaktionsgemisch.

Der Verdau von DNS wird bevorzugt im Bereich von etwa 5 und etwa 40°C, besonders bevorzugt im Bereich von etwa 20 und etwa 37°C, durchgeführt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Probe vor Schritt a) einer Lyse zur Zerstörung von Zellen unterzogen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Lyse von Zellen in Gegenwart der erfindungsgemäßen DNase-beschichteten magnetischen Partikel.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird in Schritt a) jede in der Probe vorhandene DNS verdaut. Dies ist zum Beispiel erwünscht, wenn es sich bei der Probe um Wasser handelt, dass in DNS-freies Wasser umgewandelt werden soll.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen soll vorzugsweise nur DNS aus bestimmten Quellen (zum Beispiel menschliche DNS) verdaut werden, während DNS aus anderen Quellen wie zum Beispiel Bakterien, Viren oder Pilze (zum Beispiel Hefe) essentiell unverdaut bleiben.
Unter dem Begriff „essentiell unverdaut„ im Sinne der vorliegenden Erfindung wird verstanden, dass nach dem Verdauungsschritt mit den erfindungsgemäßen Partikeln mehr als 50%, mehr als 70%, mehr als 80%, bevorzugt mehr als 90%, mehr bevorzugt mehr als 95%, besonders bevorzugt mehr als 99%, ganz besonders bevorzugt 100% der nicht zu entfernenden DNS (das heißt der zu isolierenden/aufzureinigenden DNS) in dem Reaktionsgemisch vorliegt bezogen auf die Menge zu isolierender/aufzureinigender DNS in der Probe vor Zusatz der erfindungsgemäßen Partikel. Dies kann zum Beispiel durch Vergleiche von DNS-Banden in Agarosegelen festgestellt werden.
Bei der durch die erfindungsgemäßen Partikel zu verdauenden genomischen DNS handelt es sich im Falle von zu isolierender/aufzureinigender bakterieller oder viraler DNS bevorzugt um DNS aus Säugetieren (besonders bevorzugt um menschlicher DNS). Entsprechend ist eine bevorzugte Ausführungsform des obigen Verfahrens ein Verfahren zum Entfernen von eukaryotischer DNS (bevorzugt von DNS aus Säugetieren, besonders bevorzugt von menschlicher DNS) aus einer biologischen Probe, die eukaryotische DNS und virale DNS und/oder virale RNS und/oder prokaryotische DNS und/oder prokaryotische RNS und/oder DNS aus Pilzen (wie Hefe) und/oder bakterielle DNS enthält aus einer biologischen Probe, umfassend die Schritte:

a') Verdauen von eukaryotischer DNS, bevorzugt von DNS aus Säugetieren, besonders bevorzugt von menschlicher DNS, in einer Probe enthaltend eukaryotische DNS und mindestens eine der folgenden DNS oder RNS ausgewählt aus einer Gruppe aus viraler DNS, viraler RNS, prokaryotischer DNS, prokaryotischer RNS, DNS aus Pilzen, DNS aus Hefe, bakterielle DNS, gram positive bakterielle DNS, gram negative bakterielle DNS unter Verwendung der erfindungsgemäßen DNase-beschichteten magnetischen Partikel oder einer erfindungsgemäßen Suspension; und
b) Magnetisches entfernen der erfindungsgemäßen Partikel aus dem Reaktionsgemisch.

Der Fachmann wird verstehen, dass in anderen bevorzugten Ausführungsformen eine andere als eukaryotische DNS (zum Beispiel viraler DNS, prokaryotische DNS, DNS aus Pilzen, DNS aus Hefe, bakterielle DNS, gram positive bakterielle DNS oder gram negative bakterielle DNS) aus einer Probe bevorzugt entfernt werden soll um eine oder mehrere DNS aus anderen Quellen zu isolieren/aufzureinigen.
Optional können bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung vor Durchführung von Schritt a) eine Probe einer Lyse unterzogen werden. Ebenfalls optional können die Verfahren der vorliegenden Erfindung direkt nach Schritt b) (oder nach Schritt b) und weiteren Schritten wie Aufreinigungsschritten, Konzentrierungsschritten oder Umpufferungsschritten) als Schritt c) eine PCR oder RT-PCR-Anwendung enthalten.
Die erfindungsgemäßen Partikel können nach dem Verdau der DNS quantitativ entfernt werden, das heißt, mindestens 99% bevorzugt mindestens 99,9% und besonders bevorzugt mindestens 99,99% bzw. 100% aller erfindungsgemäßen Partikel werden durch Einsatz eines Magneten oder ein ein magnetisches Feld erzeugenden Apparat aus dem Reaktionsgemisch entfernt. Dem Fachmann ist bekannt, wie magnetische Partikel aus einem Reaktionsgemisch unter Einsatz von Magnetismus entfernt werden können. Zum Beispiel können magnetische Separatoren ohne weiteres von Bioclone Inc. bezogen werden.
Durch das quantitative Entfernen der erfindungsgemäßen Partikel aus dem Reaktionsgemisch (präziser: aus dem flüssigen Überstand) sind weitere Anwendungen wie zum Beispiel PCR oder RT-PCR, die sensitiv gegenüber DNS-Degradation sind, vollständig gegen DNase Aktivität geschützt.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung beruht auf einem Verfahren zum Verdau von DNS aus einer Probe bzw. Matrix durch die erfindungsgemäßen DNase-beschichteten magnetischen Partikel oder erfindungsgemäßen Suspensionen. Bei diesem Verfahren wird entweder nur ein Teil der vorhandenen DNS, bevorzugt mehr als 5%, mehr als 10%, mehr als 20%, mehr als 30%, mehr als 40%, mehr als 50%, mehr als 75%, mehr als 90%, mehr als 95%, mehr als 99%, oder die gesamte in der Probe/Matrix vorliegende DNS verdaut (100%).
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

DE 10035953 A1 [0002, 0042]
EP 0343934 [0002]
FR 97/00912 [0002]
US 5648124 [0003]
WO 98/58257 [0004]

Claims

DNase-beschichtete magnetische Partikel mit einer Teilchengröße von ≥ 10 nm bis ≤ 800 μm, bevorzugt mit einer Teilchengröße von ≥ 100 nm bis ≤ 20 μm, besonders bevorzugt mit einer Teilchengröße von ≥ 900 nm bis ≤1,3 μm.
DNase-beschichtete magnetische Partikel gemäß Anspruch 1, wobei die Partikel eine Teilchengröße zwischen ≥ 500 nm und ≤ 2 μm besitzen, bevorzugt wobei die Partikel eine Teilchengröße zwischen ≥ 500 nm und ≤ 2 μm besitzen und der d 0,9 der Partikel zwischen 900 nm und 1,3 μm liegt.
DNase-beschichtete magnetische Partikel gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Partikel mit einer oder mehreren DNasen vom Typ I beschichtet sind, oder die Partikel mit einer oder mehreren Dnasen vom Typ II beschichtet sind, oder die Partikel mit einer oder mehreren Dnasen vom Typ I und einer oder mehreren Dnasen vom Typ II beschichtet sind, bevorzugt, wobei eine oder mehrere DNase(n) stabiler als der entsprechende Wildtyp ist(sind), eine höhere Aktivität gegen eukaryotische oder bakterielle DNS als der entsprechende Wildtyp aufweist (aufweisen) oder eine höhere Spezifität gegen eukaryotische oder bakterielle DNS als der entsprechende Wildtyp aufweist (aufweisen).
DNase-beschichtete magnetische Partikel gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die DNase auf den magnetischen Kern der Partikel über einen Spacer, bevorzugt Gelatine, BSA, PEG oder Tosyl, immobilisiert ist.
Eine Suspension enthaltend Partikel gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche.
Die Suspension gemäß Anspruch 5, wobei die Konzentrationen der Partikel im Bereich von etwa 0,1 und etwa 100 mg/ml, bevorzugt im Bereich von etwa 0,1 und etwa 50 mg/ml, und besonders bevorzugt im Bereich von etwa 1 und etwa 20 mg/ml liegt.
Die Suspension gemäß Ansprüchen 5 und 6, wobei die Dnase-Konzentration durch die DNase-beschichteten Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 in der Suspension im Bereich von etwa 100 und etwa 20.000 U/ml, bevorzugt im Bereich von etwa 100 und etwa 10.000 U/ml, besonders bevorzugt im Bereich von etwa 300 und etwa 2000 U/ml, und ganz besonders bevorzugt im Bereich von etwa 300 und etwa 600 U/ml liegt.
Die Suspension gemäß Ansprüchen 5 bis 7, wobei der pH-Bereich der Suspension im Bereich von etwa pH 4 und etwa pH 8 liegt.
Die Suspension aus Partikel gemäß Ansprüchen 5 bis 8, zusätzlich enthaltend divalente Kationen, vorzugsweise Mg2+ und/oder Mn2+.
Verwendung der DNase-beschichtete magnetische Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder einer Suspension gemäß einem der Ansprüche 5 bis 9 zum Abbau von DNS in biologischen Proben, bevorzugt, wobei die Partikel oder die Suspension als Bestandteil eines bakteriellen DNS-Isolationskits vorliegen/vorliegt.
Ein Kit umfassend mindestens ein DNase-beschichtetes magnetisches Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder mindestens eine Suspension gemäß einem der Ansprüche 5 bis 9 oder alle Komponenten zur Herstellung einer Suspension gemäß einem der Ansprüche 5 bis 9.
Verfahren zum Entfernen von DNS aus einer Probe, bevorzugt einer biologischen Proben, umfassend die Schritte: a) Verdauen von genomischer DNS in einer Probe unter Verwendung der DNase-beschichteten magnetischen Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder einer Suspension gemäß einem der Ansprüche 5 bis 9; und b) Magnetisches Entfernen der DNase-beschichteten magnetischen Partikel aus dem Reaktionsgemisch; und, optional c) Eine PCR oder RT-PCR-Anwendung mit dem Reaktionsgemisch.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei die Probe eukaryotische DNS und virale DNS und/oder virale RNA und/oder prokaryotische DNS und/oder DNS aus Pilzen (wie Hefe) und/oder bakterielle DNS enthält und die zu verdauende DNS eukaryotische DNS ist, bevorzugt wobei die zu verdauende DNS menschliche DNS ist, und die zu isolierende/aufzureinigende DNS prokaryotische, besonders bevorzugt bakterielle, DNS ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 oder 13, wobei die zu isolierende/aufzureinigende DNS DNS aus Prokaryoten, bevorzugt gram positiven oder gram negativen Bakterien; oder DNS aus Pilzen, bevorzugt Hefe, ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche bis, wobei Schritt a) im Bereich von etwa 5 und etwa 40°C, bevorzugt im Bereich von etwa 20 und etwa 37°C, durchgeführt wird.